BRPI0720464A2

BRPI0720464A2 - Anticorpos contra citomegalovírus humano (hcmv)

Info

Publication number: BRPI0720464A2
Application number: BRPI0720464-7A2A
Authority: BR
Inventors: Ada Funaro; Giorgio Gribaudo; Santo Landolfo
Original assignee: Ribovax Biotechnologies Sa
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2014-01-14
Also published as: DK2126049T3; AU2007331463A1; PT2126049E; US8153129B2; PL2126049T3; CA2672703C; EP2126049B1; NO20092671L; JP2010512736A; JP5351041B2; ATE503769T1; CN101627115B; WO2008071806A1; KR20090114364A; IL199366A; US20100040602A1; EA018701B1; CA2672703A1; AU2007331463B2; CN101627115A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção "ANTICORPOS CONTRA CITOMEGALOVÍRUS HUMANO (HCMV)".

CAMPO DA TÉCNICA A invenção refere-se a novas seqüências de

anticorpos isolados de células B humanas tendo atividades biológicas específicas para um vírus que infectam células humanas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O Citomegalovírus Humano (hCMV) é um

herpesvírus disseminado, altamente específico à espécie, que causa uma morbidade e mortalidade significativas em indivíduos imunossuprimido ou imunologicamente imaturos.

Muitas análises recentes analisam a biologia e as manifestações clínicas do hCMV (Landolfo S et al., 2003; Gandhi M e Khanna R, 2004; Soderberg-Naucler C, 2006). Este patógeno viral contamina a maioria da população em todo o mundo e é adquirido na infância, seguindo o contato com um fluido corporal, pois o vírus entra através de células endoteliais e células epiteliais do sistema alimentar ou respiratório superior, ou através do sistema urogenital. Soropositividade ao hCMV é mais prevalente em países subdesenvolvidos ou em áreas geográficas de baixa renda.

Seguindo uma infecção primária, o hCMV pode persistir em células hospedeiras específicas da linhagem mielóide em um estado latente, replicando-se e disseminando-se em muitos tipos diferentes de células (células hematopoéticas, células epiteliais, células endoteliais, ou fibroblastos) e escapando do sistema imunológico hospedeiro. A infecção por hCMV é geralmente assintomática em pessoas saudáveis, pois a infecção e a disseminação do hCMV é mantida sob controle pelo sistema imunológico, mas a limpeza total de hCMV é raramente obtida. Na realidade, o vírus hCMV desenvolveu mecanismos eficientes que permitem que o genoma viral permaneça em sítios selecionados em um estado latente. Qualquer situação que enfraquece as funções

imunológicas, como condições de estresse ou tratamentos médicos específicos, pode levar a reativação do hCMV. Manifestações clínicas de hCMV (como retinite, enterocolite, pneumotite, gastrite, ou hepatite) podem ocorrer após a infecção, reinfecção ou reativação viral primária. Cerca de 10% das crianças são infectadas com a idade de 6 meses, após a transmissão pelas suas mães através da placenta, durante o parto, ou pela amamentação.

O vírion do hCMV consiste de um nucleocapsídeo icosaedral que contém um genoma de DNA linear, de 230 kb, de cadeia dupla. A expressão do genoma de hCMV é controlada por uma complexa cascata de eventos transcricionais que levam à síntese de mais de 200 proteínas envolvidas em uma grande variedade de atividades biológicas envolvidas na infecção, latência e replicação viral (Britt W e Mach M, 1996). As proteínas estruturais formam a membrana de vírion, que é extremamente complexa e ainda incompletamente indefinida. Esta inclui glicoproteínas que são homólogas de proteínas estruturais identificadas em outros herpesviridae e que podem formar complexos de proteína ligados por dissulfeto no interior do vírion: gCI (incluindo apenas gB), gCII (incluindo gM e gN) e gCIII (incluindo gH, gL e gO). Os genes gB, gH e gN também têm sido usados para genotipar linhagens de hCMV (Coaquette A et ai, 2004; Dar L, 2007). As glicoproteínas gN e gM são as mais

abundantes e, juntas das gH e gB, têm sido mostradas como essenciais para a interação inicial entre a membrana de hCMV e a superfície da célula hospedeira, e consequentemente para a produção do hCMV infeccioso. Por esta razão, os compostos tendo como alvo gB, gH, gN e/ou gM podem inibir eficientemente a infecção por hCMV bloqueando a entrada de vírions circulantes de hCMV para o interior das células, seguida por infecção, reinfecção e reativação de hCMV.

O tratamento de infecções por hCMV é difícil porque há poucas opções terapêuticas disponíveis. Os compostos médicos atualmente disponíveis que inibem a replicação viral (Ganciclovir, Cidofivir, Foscarnet, Maribavir e outros fármacos em desenvolvimento) produzem um significante aperfeiçoamento clínico, mas podem sofrer de pouca biodisponibilidade oral, baixa potência, a emergência de resistência do hCMV (devida a mutações nos alvos virais), e toxidades que limitam as doses (De Clercq Ε, 2003; Baldanti F e Gerna G, 2003; Gilbert C e Boivin G, 2005).

Novos meios para se prevenir e tratar a infecção por hCMV são necessários, especialmente para indivíduos imunologicamente comprometidos, em ambientes de transplantes, e na prevenção pré-natal. De fato, o hCMV é um patógeno oportunista clinicamente relevante em pacientes portadores de HIV e em receptores de transplante de órgãos, onde contribui para a perda de enxerto independentemente da rejeição de enxerto, resultando em morbidade e mortalidade (Puius Y e Snydman D, 2007). O número crescente de receptores de medula óssea e de transplantes de órgãos sólidos aumentam a probabilidade das manifestações clínicas do hCMV, como a retinite por hCMV (Wiegand T e Young L, 2006). Além disso, o hCMV é a maior causa infecciosa de defeitos de nascimento (como perda da audição, desenvolvimento atrasado, ou retardamento mental) que se devem a uma infecção congênita ou pré-natal por hCMV transmitida por uma mãe infectada por hCMV (Griffiths P e Walter S, 2005).

Portanto, é importante fornecer fármacos para

tratamentos preventivos, profiláticos, específicos para hCMV, por exemplo, para a prevenção de doença de hCMV em receptores de transplantes (Hebart H e Einsele H, 2004; Kalil A et al., 2005; Snydman D, 2006), em pacientes desenvolvendo neuropatologias relacionadas a hCMV (Griffiths P, 2004) ou em gravidezes de risco (Schleiss M, 2003), para prevenir a transmissão vertical e a infecção por hCMV que oferece risco de vida a fetos e recém- nascidos.

Além disso, composições farmacêuticas contra o hCMV podem ser úteis para o tratamento de outras, mais disseminadas doenças (como doenças autoimunes e cardiovasculares, ou alguns tipos de câncer), onde o hCMV é um possível co-fator e/ou pode ser reativado durante tratamentos imunossupressores. Por exemplo, o hCMV é agora um patógeno humano de importância crescente para distúrbios como complicações duradouras em invasividade de tumor ou evasão imunológica, como a infecção por hCMV pode ter efeitos onco- modulatórios na apoptose, diferenciação e migração celular. Em doenças auto-imunes ou vasculares, a infecção por hCMV pode alterar as reações inflamatórias e imunológicas (Cinatl J et al., 2004; Soderberg-Naucler C, 2006b).

Uma maneira alternativa para se prevenir a infecção por hCMV é a vacinação, no escopo de fornecer a proteção em um conjunto de populações pacientes de alto risco. No entanto, a correlação entre a vacinação e a resposta imunológica resultante não é integralmente entendida, e uma estratégia otimizada de vacina para hCMV (usando um específico antígeno candidato ou vacinas de vida atenuada) parece depender na população paciente escolhida como alvo para a proteção. Portanto, estratégias de vacinação profilática ainda estão sob avaliação (McLean G et al., 2006; Schleiss M, 2005). Em vista das presentes limitações de estratégias farmacológicas para infecções por hCMV, o conhecimento crescente da relação hCMV-hospedeiro - e em particular na resposta imunológica específica ao hCMV - tornam as terapias com base imunológica boas alternativas para substituir, ou complementar, terapias existentes para o tratamento bem- sucedido de complicações associadas ao hCMV (Ghandhi M e Khanna R, 2004). Recentemente, uma proteção duradoura do curso letal da infecção por CMV em ratos imunodeficientes foi obtida pela transferência de células B de memória específicas ao vírus, sugerindo que tais células possam ter uma utilidade terapêutica (Klenovsek K et ai., 2007).

Uma alternativa mais fácil para terapias baseadas em células pode ser a imunoterapia passiva, consistindo na administração a indivíduos de composições farmacêuticas compreendendo anticorpos terapêuticos com uma atividade neutralizante definida contra um antígeno viral ou humano (por exemplo, o hCMV).

Esta abordagem terapêutica foi projetada nas características biológicas e de ligação de antígenos de anticorpos e fragmentos de anticorpos dirigidos contra alvos terapêuticos virais ou humanos (Dunman P e Nesin M, 2003; Keller M e Stiehm E, 2000). A imunoterapia passiva foi introduzida na prática clínica, expandindo rapidamente as oportunidades para o tratamento de uma ampla variedade de doenças (incluindo doenças infecciosas, doenças imunologicamente mediadas, e câncer). Esta abordagem por ser particularmente eficaz em pacientes cujos sistemas imunológicos são incapazes de produzir anticorpos nos volumes e/ou com a especificidade necessária para bloquear e/ou eliminar a molécula alvejada (Chatenoud L, 2005;

Laffly E e Sodoyer R, 2005).

No campo da terapia para hCMV, esta abordagem é executada através da administração intravenosa de preparações de imunoglobulina humana que são obtidas através da combinação de plasma humano com altas concentrações de anticorpos anti-hCMV, e comercializada para usos clínicos (sob o nome de Cytotect ou CytoGam). No entanto, estes produtos são apenas uma solução parcialmente satisfatória para bloquear a infecção por hCMV. Na realidade, este tratamento é usado em pacientes com imunidade comprometida, principalmente para tratamento preventivo e profilático onde antivirais são freqüentemente co-administrados (Marasco W e Sui J, 2007; Nigro G et al., 2005; Bonaros N et al., 2004; Kocher A et al., 2003; Kruger R et al., 2003). Além disso, questões de segurança e a escassez de tais preparações são uma preocupação crescente, como relatado na literatura (Bayry J et al., 2007; Hamrock D, 2006).

Os anticorpos humanos recombinantes que têm alta afinidade com antígenos expressos na membrana de hCMV e são capazes de neutralizar a infecção representariam fármacos mais apropriados para a imunização passiva. Na realidade, muitas das glicoproteínas de hCMV evocam fortes respostas imunológicas do hospedeiro, incluindo a produção de anticorpos neutralizantes de vírus, ainda que a estequiometria das proteínas da membrana sejam variáveis e possam ser alteradas para escapar da resposta imunológica do hospedeiro. Esta resposta é considerada como sendo um componente chave da imunidade do hospedeiro e representa uma meta tanto para o desenvolvimento do anticorpo quando da vacina.

Anticorpos humanos monoclonais são os anticorpos mais preferíveis para aplicações clínicas, devido às limitações intrínsecas de anticorpos monoclonais murinos. No entanto, o desenvolvimento de anticorpos humanos previamente identificados para o tratamento de hCMV (Matsumoto Y et al., 1986) foi interrompido, pois nenhum benefício clínico foi observado em estudos que avaliaram a eficácia de tais anticorpos, por exemplo, em transplantes hematopoéticos de células germinais (Boeckh M et al., 2001), ou em retinites (Gilpin A et al., 2003). Estas tentativas falhas justificam os estudos posteriores focados na seleção de anticorpos humanos monoclonais que neutralizem com maior eficiência a ampla variedade de linhagens de hCMV. O tratamento de infecções por CMV

teria o benefício de ter composições farmacêuticas mais fortes compreendendo anticorpos humanos monoclonais que são purificados a partir de células B humanas mantidas em cultura ou produzidas como proteínas recombinantes que são expressas por seqüências humanas introduzidas nas linhas celulares de mamíferos. REVELAÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece novas seqüências de anticorpos que ligam e neutralizam o hCMV, e que podem ser usadas para detectar, tratar, inibir, prevenir e/ou atenuar uma infecção por hCMV ou uma doença relacionada a hCMV.

Células B humanas foram obtidas de um indivíduo soropositivo a hCMV e imortalizadas. A população policlonal de células B humanas imortalizadas foi dividida para gerar subculturas que foram testadas para a presença de anticorpos (Imunoglobulinas G, IgG) na cultura celular sobrenadante neutralizando a infectividade por hCMV ín vitro. Em particular, o tipo de atividade neutralizante, o isotipo, e a clonalidade foram determinados para o anticorpo secretado pela subcultura nomeada 26A1. O anticorpo foi purificado em afinidades tanto com a cultura celular sobrenadante original quanto como um anticorpo humano monoclonal recombinante, confirmando a atividade neutralizante específica ao hCMV usando modelos in vitro para a infecção por hCMV. Este anticorpo pode ser usado para caracterizar antígenos neutralizante

na membrana de hCMV.

As seqüências de DNA que codificam as regiões variáveis do anticorpo secretado pela subcultura 26Al foram amplificadas, clonadas, e seqüenciadas. As seqüências de proteína correspondentes foram analisadas para identificar as Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) que são responsáveis pela atividade biológica específica ao hCMV. Estas seqüências podem ser usadas para produzir proteínas tendo propriedades de ligação e neutralização específicas para hCMV, na forma de anticorpos completos, fragmentos de anticorpos, ou qualquer outro formato de proteína funcional (por exemplo, peptídeos bioativos, proteínas de fusão) usando tecnologias apropriadas para produzir proteínas recombinantes.

As composições tendo utilidade terapêutica, profilática e/ou diagnostica na administração de infecção por hCMV e distúrbios relacionados a hCMV podem ser preparadas usando-se as proteínas da invenção, tanto como proteínas recombinantes quanto como anticorpos naturais purificados de culturas celulares originadas a partir da subcultura 26A1. Tais composições podem ser usadas para suplementar ou substituir os tratamentos de hCMV atuais baseados em compostos antivirais e/ou preparações intravenosas de imunoglobulinas (IVIg).

Modalidades adicionais da presente invenção serão fornecidas na Descrição Detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: (A) Representação esquemática do antígeno CG3 que foi agregado e usado em um teste ELISA específico a gB como descrito na literatura (Rothe M et al., 2001). A fusão de interlinhagens recombinantes do antígeno CG3 corresponde a uma combinação do gB Domínio Antigênico 2 (AD2; SEQ ID NO: 1 e 2) a partir das linhagens de hCMV AD169 (SwissProt Acc. No. P06473; aminoácidos 27-84) e Towne (SwissProt Acc. No. P13201; aminoácidos 27-84). A região AD2 contém um sítio (aminoácidos 70-81, sublinhado) que é conservado em diferentes linhagens virais e que foi mostrado como sendo reconhecido por neutralizar anticorpos (Qadri I et al., 1992; KropffB et al., 1993). (B) Representação esquemática do antígeno gH incluído na proteína de fusão gH(Ag)-GST usada para o teste ELISA específico a gH. O antígeno recombinante gH(Ag)-GST corresponde a uma fusão em quadro entre a região terminal do amino gH (aminoácidos 16-144; SEQ ID NO: 3) da linhagem de hCMV VRl 814 (Revello M et al., 2001) e Glutathione-S-Transferase (GST). A extensão de amino de gH contém um sítio de ligação de anticorpos linear (aminoácidos 34- 43; sublinhado) que é reconhecido por neutralizar anticorpos (Urban M et al., 1992).

Figura 2: panorama do processo de seleção para identificar e caracterizar subculturas (poços) que contêm anticorpos IgG ligando e neutralizando o hCMV. As subculturas foram obtidas imortalizando-se células B de um paciente portador do hCMV (CMV7) usando-se o processo de imortalização baseado em EBV revelado em PCT/EP2005/056871. Os sobrenadantes que mostraram atividade neutralizante foram, então, tamisados usando-se um ELISA específico a gB e GH. O número de poços positivos para cada teste de tamisação é indicado nos ovais de cor cinza.

Figura 3: a atividade neutralizante de hCMV do anticorpo natural 26A1, conforme purificado por cromatografia com afinidade usando-se a Proteína A do sobrenadante de cultura celular derivada da subcultura 26A1 mantida em um meio isento de soro. A curva responsiva à dose foi executada no teste de neutralização de hCMV incluindo tanto fibroblastos embriônicos humanos (HELF) juntos da linhagem de hCMV AD169 (1,000 PFU/reação; IC50 0.82 μg/ml), ou células endoteliais de veia de cordão umbilical humano (HUVEC) junto com a linhagem de hCMV VR1814 (1,000 PFU/reação; IC50 0.67 μ^ιηΐ).

Figura 4: Atividade de ligação específica a (A) gH(Ag) e (B) antígeno CG3 de sobrenadantes contendo IgG a partir de subculturas de células B humanas imortalizadas. O ELISA foi executado usando-se apenas o meio de cultura celular (meio, controle negativo), ou o sobrenadante das subculturas 26A1, IF7 (identificadas nas células imortalizadas obtidas do doador de CMV5, como descrito no pedido de patente EP07111741), e 8C10 (identificada nas células imortalizadas obtidas do doador de CMV7, como descrito no pedido de patente EP07115410). A linha pontilhada representa o valor limiar (O.D. = 0.1) para se considerar positiva uma subcultura.

Figura 5: (A) Alinhamento do DNA (caso mais baixo, 393 pares de base) e da seqüência consensual de proteína (caso mais alto, 131 aminoácidos) da região variável para a cadeia pesada de 26A1 IgG (VH 26A1; SEQ ID NO: 4 e 5). (B) A seqüência consensual de proteína para VH 26Al com a indicação dos CDRs previstos (HCDR1, HCDR2 e HCDR3; sublinhado; SEQ ID NO: 6, 7 e 8). Os aminoácidos alternativos que foram codificados pelas seqüências de DNA clonadas em plasmida de E. coli transformantes isolados são indicados abaixo da seqüência consensual de proteína.

Figura 6: (A) Alinhamento do DNA (caso mais baixo, 330 pares de base) e da seqüência consensual de proteína (caso mais alto, 110 aminoácidos) da região variável para a cadeia leve de 26A1 IgG (VH 26A1; SEQ ID NO: 9 e 10). (B) A seqüência consensual de proteína para VL 26A1 com a indicação de CDRs previstos de VL 26A1 (LCDR1, LCDR2, e LCDR3; sublinhado; SEQ ID NO: 11, 12 e 13). Figura 7: Alinhamento do DNA (caso mais

baixo, 1449 pares de base; SEQ ID NO: 14) e seqüência consensual de proteína (caso mais alto, 482 aminoácidos) da pesada cadeia de anticorpos monoclonais humanos recombinantes 26Al (SEQ ID NO: 15). O mais provável sítio de clivagem para peptídeos de sinal é entre as posições 19 e 20 (VLS-QV), como determinado usando-se o programa de previsão online SignalP 3.0 (Bendtsen J et al., 2004). A seqüência original identificada no cDNA gerado das células na subcultura 26Al está sublinhada (ver Fig. 5). Os aminoácidos 153-482 correspondem à região constante da cadeia pesada do IgGl humano (SwissProt Acc. No. PO1857).

Figura 8: Alinhamento do DNA (caso mais baixo, 705 pares de base; SEQ ID NO: 16) e seqüência consensual de proteína (caso mais alto, 234 aminoácidos) da cadeia pesada do recombinante humano 26Al IgG (SEQ ID NO: 17). O mais provável sítio de clivagem para peptídeos de sinal é entre as posições 16 e 17 (CTG-SV), como determinado usando- se o programa de previsão online SignalP 3.0 (Bendtsen J et al., 2004). A seqüência original identificada em células da subcultura 26A1 está sublinhada (ver Fig. 5). Os aminoácidos 1-19 e 131- 234 correspondem a 1-19 e 131-234 da cadeia lambda do Ig humano (SwissProt Acc. No. Q8N355).

Figura 9: A atividade neutralizante de hCMV do anticorpo humano recombinante 26Al comparada ao anticorpo natural de Proteína A-purificado 26A1. A atividade foi testada usando-se células HELF e a linhagem de hCMV AD16 em um teste de microneutralização (A; 1000 PFU/reação, 72 horas pós- infecção) ou em um teste de redução de placa (B).

Figura 10: A atividade neutralizante do hCMV do anticorpo humano monoclonal recombinante 26A1 comparada ao anticorpo natural de Proteína A-purificado. A atividade foi testada usando-se células humanas HUVEC e a linhagem de hCMV VRl 814 em um teste de microneutralização (A; 1000 PFU/reação), ou usando-se células humanas HELF e a linhagem de hCMV AL-I em um teste de redução de placa (B; 1000 PFU/reação).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os métodos descritos em PCT/EP2005/056871 permitem a imortalização eficiente de células B humanas específicas a isotipo obtidas de um indivíduo, cujo sangue contém anticorpos tendo atividades biológicas (por exemplo, a ligação e/ou a neutralização de um alvo humano ou viral), no escopo de obter populações policlonais de células que secretam anticorpos apresentando tais atividades biológicas. Testes de tamisação extensivos podem, então, ser executados usando-se sobrenadantes de subculturas obtidas através destes métodos seguindo um único passo de clonagem a uma baixa densidade celular (por exemplo, 50, 20 células ou menos por poço). Dessa maneira, é possível obter populações policlonais de células B imortalizadas nas quais um grande repertório de subculturas que secretam o IgG pode ser caracterizado e consequentemente um número de IgG humanos monoclonais tendo a especificidade de ligação desejada para antígenos e/ou a atividade biológica pode ser identificado.

No presente caso, uma população policlonal de células B humanas imortalizadas, que secretam o IgG, foi obtida do sangue de um paciente com hCMV cujo soro apresentou, como atividade biológica, uma forte atividade neutralizante de hCMV. A população policlonal foi usada para gerar, em um único passo de subclonagem a 20 células por poço e em condições apropriadas de cultura, milhares de subculturas que continham células B humanas imortalizadas. A atividade biológica específica, então, foi testada no sobrenadante de centenas de culturas celulares de crescimento eficiente no escopo de selecionar aquelas que apresentavam a atividade mais forte, e então se determinando o isotipo e, se possível, o epítope do anticorpo secretado.

Uma das subculturas mais promissoras, nomeada 26A1, foi usadas tanto para purificar o anticorpo humano natural de culturas de larga escala quanto para isolar o DNA codificando tal anticorpo das células B imortalizadas. A seqüência de DNA foi usada para produzir o anticorpo natural humano como um anticorpo humano recombinante. O anticorpo monoclonal humano recombinante 26Al e o natural foram usados para a execução de testes biológicos mais extensivos e para a determinação de sua utilidade potencial em aplicações clínicas relacionadas a hCMV.

Os exemplos mostram como o sobrenadante de cultura celular, o anticorpo humano natural, e o anticorpo humano recombinante apresentam a mesma atividade biológica determinada no soro sangüíneo original e na população policlonal de células C humanas imortalizadas EBV. Estas evidências confirmam que os métodos descritos em PCT/EP2005/056871 permitem a identificação, a caracterização, e a produção de anticorpos humanos monoclonais recombinantes e naturais, específicos a isotipo, biologicamente ativos. Na realidade, o processo completo de crescimento e imortalização celular em condições de cultura celular dá acesso ao repertório de anticorpos humanos em uma maneira direta, eficiente e rápida. Além disso, as células resultadas do processo podem ser congeladas e tamisadas em um momento diferente, ou em paralelo, para diferentes atividades biológicas e/ou antígenos.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece proteínas compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência do HCDR3 (CDR3 da região variável de cadeia pesada) do anticorpo de 26Al (SEQ ID NO: 8). Junto com o HCDRl e o HCDR2 (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7), este HCDR3 é incluído na região variável da cadeia pesada do anticorpo 26A1 (VH 26A1; Fig. 5; SEQ ID NO: 5). Esta seqüência é codificada pela seqüência de DNA (Fig. 5A;

SEQ ID NO: 4) que foi ampliada e clonada usando-se células obtidas da subcultura original que secreta o anticorpo 26A1. Portanto, uma proteína da invenção pode conter, junto com o HCDR3 do anticorpo 26A1 (SEQ ID NO: 8), a seqüência do HCDRl (SEQ ID NO: 6) e/ou do HCDR2 (SEQ ID NO: 7) do anticorpo 26A1 (Fig. 5B). Tal proteína pode compreender uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência inteira da região variável da cadeia pesada do anticorpo 26Al.

O anticorpo 26Al também contém uma região variável de uma cadeia leve para a qual, usando-se a mesma abordagem, as seqüências de DNA (SEQ ID NO: 9) e de proteína (SEQ ID NO: 10), juntas com os LCDRs específicos (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13), foram determinadas (Figura 6). Portanto, uma proteína da invenção pode adicionalmente compreender uma ou mais seqüências selecionadas do grupo consistindo de únicos LCDRs do anticorpo 26Al (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13), os quais podem ser fornecidos como uma seqüência de proteína compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com a VL 26A1 (Fig. 6B; SEQ ID NO: 10). Isto se aplica em particular quando um anticorpo humano recombinante, compreendendo tanto a seqüência natural VL 26A1 quanto a VH 26Al como cadeias pesadas e leves (na conformação natural de um completo tetramérico compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, ou uma única proteína como variante recombinante do anticorpo natural), é desejado.

Onde quer que um nível de identidade seja

indicado, este nível de identidade deve ser determinado na extensão integral da seqüência relevante da invenção.

O HCDR3 do anticorpo 26 Al pode ser considerado como caracterizando a porção de ligação de antígenos de um anticorpo humano específico que é capaz de ligar e neutralizar o hCMV, como mostrado nos Exemplos. Ainda que muitos ou todos os CDRs de um anticorpo sejam geralmente requisitados para a obtenção de uma superfície de ligação de antígenos, o HCDR3 é o CDR que mostra a maior diferença entre os anticorpos não apenas no que diz respeito a seqüência mas também com respeito a extensão. Tais diversidades são componentes fundamentais de regiões de ligação para o reconhecimento de essencialmente qualquer antígeno pelo sistema imunológico humoral (Xu e David, 2000; Barrios Y et al., 2004; Bond C et al., 2003). Alternativamente, combinações de CDRs podem ser ligadas umas às outras em proteínas muito curtas que retêm as propriedades originais de ligação, como recentemente analisado (Ladner R, 2007).

Portanto, as proteínas neutralizantes de hCMV podem ser geradas usando-se o HCDR3 do anticorpo 26Al como componente de ligação de hCMV, em combinação ou não com outros CDRs do anticorpo 26A1, que pode ser expresso no interior de uma estrutura de proteína de anticorpo (Knappik A et al., 2000), ou no interior de uma estrutura de proteína sem relação com anticorpos (Kiss C et al., 2006).

A região variável das cadeias leve e pesada

formando o anticorpo 26A1 (ou porções selecionadas, como HCDRs e LCDRs isolados) pode ser incluída em qualquer outro formato de proteína para fragmentos de anticorpos funcionais, como descrito na literatura sob diferentes nomes como Scfv (variável de fragmento de cadeia única), Fab (heterodímero de cadeia pesada/leve variável), diacorpo, peptacorpo, VHH (domínio variável de anticorpo de cadeia pesada), cadeias pesadas ou leves isoladas, anticorpos biespecíficos, e outras variantes de anticorpos engenhadas para aplicações não-clínicas (Jain M et al., 2007; Laffy E e Sodoyer R, 2005).

Anticorpos alternativos podem ser gerados usando-se as seqüências do anticorpo 26Al através de um processo de rearranjo de domínio variável de cadeia leve (VL). Na realidade, muitos anticorpos diferentes podem ser gerados e testados para atividades específicas a hCMV usando-se um único domínio variável de cadeia pesada VH (como o do anticorpo 26A1) combinado com uma biblioteca de domínios VL, no escopo de determinar combinações VH/VL com propriedades aperfeiçoadas em termos de afinidade, estabilidade, e/ou produção recombinante (Ohlin M et al., 1996; Rojas G et al., 2004; Watkins N et al., 2004). Novas abordagens para o desenvolvimento de novos peptídeos bioativos também mostraram a viabilidade de se sintetizar peptídeos derivados de CDR que contêm L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, que mantêm a atividade original, e que podem ter um perfil farmacológico mais apropriado (Smith J et al., 1995; Levi M et al., 2000; Wijkhuisen A et al., 2003).

Portanto, o HCDR3 do anticorpo 26A1, assim como seqüências altamente similares com o HCDR3 do anticorpo 26A1, proteínas de fusões que os contêm, e peptídeos sintéticos derivados dos mesmos (por exemplo, contendo L-aminoácidos, D-aminoácidos, na conformação normal ou retro-inversa), podem ser testados e usados como proteínas neutralizantes e de ligação de hCMV.

Além disso, sabe-se que anticorpos podem ser modificados em posições específicas a fim de se ter anticorpos com características aperfeiçoadas, em particular para aplicações clínicas (como melhor perfil farmacocinético ou maior afinidade para um antígeno). Estas mudanças podem ser feitas nos CDRs e/ou na estrutura do anticorpo 26Al e a seqüência pode ser escolhida aplicando-se qualquer das tecnologias dedicadas para o projeto racional de anticorpos que faz uso de maturação de afinidade e outros processos (Kim S et al., 2005; Jain M et al., 2007).

As proteínas da invenção podem ser fornecidas como anticorpos em geral, como anticorpos monoclonais humanos integrais tendo um isotipo específico. O isotipo IgG, por exemplo, é o formato de anticorpo de quase todos os anticorpos terapêuticos aprovados (Laffy E e Sodoyer R, 2005). No entanto, porções de ligação de antígenos isoladas de um IgGl neutralizante de hCMV foram transferidas em uma seqüência IgA humana e o anticorpo resultante é capaz de inibir a infecção por HIV também (Mantis N et al., 2007).

A proteína da invenção também pode ser fornecida como fragmentos de anticorpos, peptídeos bioativos, ou proteínas de fusão. Todas estas moléculas alternativas devem manter, se não realçar, as propriedades neutralizantes e de ligação de hCMV originais que foram determinadas para o anticorpo 26A1. No caso de proteínas de fusão, as seqüências de proteína heterólogas podem ser localizadas na posição terminal C ou N para a seqüência derivada do 26A1, sem afetar a expressão correta e a atividade biológica do componente específico a hCMV (por exemplo, um fragmento de anticorpo).

O termo "seqüência de proteína heteróloga" indica uma seqüência de proteína que não é naturalmente presente na posição terminal C ou N para o componente específico a hCMV (por exemplo, um fragmento de anticorpo). A seqüência de DNA que codifica essa proteína é geralmente fundida por tecnologias recombinantes de DNA e compreende uma seqüência que codifica pelo menos 5 aminoácidos.

Tal seqüência de proteína heteróloga é geralmente escolhida para fornecer propriedades adicionais ao fragmento de anticorpo específico a hCMV para diagnóstico específico e/ou usos terapêuticos. Exemplos de tais propriedades adicionais incluem: melhores meios para detecção e purificação, componentes adicionais de ligação ou ligas biológicas, ou modificação pós-translacional de uma proteína de fusão (por exemplo, fosforilação, glicosilação, ubiquinação, SUMOilação, ou clivagem endoproteolítica).

Alternativamente (ou adicionalmente à fusão com uma seqüência de proteína heterológa), a atividade de uma proteína da invenção pode ser aperfeiçoada com a conjugação com compostos diferentes como agentes terapêuticos, estabilizantes, ou diagnósticos. Exemplos destes agentes são rótulos detectáveis (por exemplo, um radioisotipo, um composto fluorescente, uma toxina, um átomo de metal, um composto quimiluminescente, um composto bioluminescente, ou uma enzima) que podem ser ligados usando-se ligantes químicos ou polímeros. A atividade biológica específica a hCMV pode ser aperfeiçoada pela fusão com outra proteína terapêutica, como uma proteína ou um polímero que altere o metabolismo e/ou a estabilidade em aplicações terapêuticas ou diagnosticas. Meios para se escolher e se projetar

componentes de proteína, ligas, e ligantes apropriados, assim como métodos e estratégias para a construção, purificação, detecção e uso de proteínas de fusão são fornecidos na literatura (Nilsson J et al., 1997; 'Application of Chimeric Genes and Hybrid Proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137) e estão comumente disponíveis em laboratórios clínicos e de pesquisa. Por exemplo, a proteína de fusão pode conter seqüências reconhecidas por anticorpos comerciais (incluindo etiquetas como etiquetas de polihistidina, FLAG, c-Myc, ou HA) que podem facilitar a identificação in vivo e/ou in vitro da proteína de fusão, ou sua purificação.

Outras seqüências de proteína podem ser identificadas pela análise direta de fluorescência (como no caso da Proteína Verde Fluorescente), ou por enzimas e substratos específicos (por exemplo, usando-se sítios proteolíticos). A estabilidade de anticorpos específicos a hCMV, fragmentos de anticorpos, peptídeos bioativos, e proteínas de fusão pode ser aperfeiçoada com a fusão com uma proteína transportadora, como a proteína de revestimento de fago (cp3 ou cp8), Proteína de Ligação de Maltose (MBP), Albumina de Soro Bovino (BSA), ou Glutationa-S-Tranferase(GST).

O antígeno de hCMV específico que é reconhecido pelo anticorpo 26A1 não foi determinado usando-se um painel de epítopes neutralizantes de hCMV conhecidos em antígenos virais (ver Fig. 1, 2 e 4). Consequentemente, este anticorpo IgG pode ser usado para definir um epítope neutralizante de hCMV e as proteínas que ligam tal antígeno (por exemplo, na forma dos anticorpos, fragmentos de anticorpos, peptídeos bioativos, proteína de fusão, ou quaisquer proteínas naturais/recombinantes) que deve ser capaz de neutralizar a infecção por hCMV através do reconhecimento de tal epítope. No passado, os testes ELISA e Western Blot que usavam proteínas truncadas específicas a hCMV ou peptídeos sintéticos também foram usados (Greijer A et al., 1999; Ohlin M et al., 1993) e dessa maneira os anticorpos direcionados a hCMV foram definidos de acordo com seus antígenos, sendo glicoproteína H (WO 94/16730, WO 94/09136, WO 92/11018), glicoproteína B (EP248909, WO 93/21952) ou glicoproteína M/glicoproteína N (Shimamura M et al., 2006). Além disso, outros componentes do vírion de hCMV não apenas afetam o tropismo viral, mas podem ser alvos de anticorpos neutralizantes de hCMV, tal como no caso do pUL130 e pUL128 (Wang D e Shenk T, 2005). Assim, o antígeno/epítopo CMV reconhecido pelos anticorpos 26Al pode ser identificado por diferentes ensaios in vitro baseados na literatura citada acima. Uma modalidade adicional da presente invenção

é o anticorpo IgGl humano secretado pela subcultura 26A1, o qual pode ser fornecido como um anticorpo natural a Proteína A purificada que aglutina e neutraliza hCMV. Este anticorpo IgGl pode ser usado para identificar proteínas concorrentes que também podem aglutinar e neutralizar hCMV. Proteínas similares são fornecidas na descrição acima e nos Exemplos, em particular como anticorpos humanos recombinantes e fragmentos de anticorpos.

O mecanismo de neutralização do hCMV, que está associado ao epítopo viral reconhecido pelo anticorpo 26Al e as outras proteínas definidas acima, pode ser caracterizado usando os ensaios disponíveis para proteínas e/ou cepas hCMV estruturais específicas, como mostrado na literatura usando painéis de soro humano (Navarro D e outros, 1997; Klein M e outros, 1999; Weber B e outros, 1993; Rasmussen L e outros, 1991; Marshal G e outros, 2000) ou de anticorpos monoclonais (Schppel K e outros, 1996; Simpson J e outros, 1993; Gicklhorn D e outros, 2003).

Ácidos nucléicos são objetos adicionais das invenções codificando qualquer de anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas de fusão, peptídeos bioativos, ou HCDRs isolados e LCDRs definidos acima. Os exemplos fornecem tais seqüências em particular como codificação das regiões variáveis completas das cadeias pesada (SEQ ID No.:4) e leve (SEQ ID No.:9) do 26Al (Figuras 5A e 6A). Estas seqüências de DNA (ou partes selecionadas, tais como aquelas codificando os HCDRs e LCDRs específicos, Figuras 5 e 6) podem ser transferidas em vetores para expressá-las em um dos formatos alternativos para anticorpos (por exemplo, completo, maturado por afinidade, ou CDR-enxertado ou fragmentos de anticorpo) ou proteínas de fusão. Estes ácidos nucléicos podem compreender uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID No.:4, com ou sem uma seqüência adicional compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID No.:9, dependendo de, se seqüências apenas da cadeia pesada de 26A1 ou se ambas as cadeias pesada e leve são necessárias. Quando um anticorpo inteiramente humano é desejável, o anticorpo poderia adicionalmente compreender uma região constante de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de regiões constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. Preferencialmente, a região constante de cadeia pesada é um IgA, IgGl (como no anticorpo 26A1 natural caracterizado a partir da subcultura 26A1), IgG2, ou IgG4 humano. As seqüências de ácido nucléico codificando regiões variáveis completas de cadeias pesadas e leves de 26A1 têm sido clonadas e caracterizadas por meio de reações PCR e vetores contendo produtos resultantes de PCR, as quais têm usado para transformar células E coli. Tais seqüências podem ser transferidas (em parte ou integralmente) para outro vetor, em particular na expressão cassete de um vetor ou de vetores distintos onde eles são ligados operavelmente a seqüências regulatórias apropriadas (por exemplo, promotores, terminadores de transcrição).

O anticorpo monoclonal 26Al humano, ou quaisquer outras seqüências de proteínas derivadas de tal anticorpo, podem ser expressas como uma proteína recombinante usando tais vetores para transformar a célula hospedeira apropriada. As células hospedeiras compreendendo os ácidos nucléicos da invenção podem ser células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas e poderiam permitir a secreção das proteínas recombinantes desejadas. Métodos para produção de tais proteínas incluem, cultivar células hospedeiras transformadas com os vetores de expressão compreendendo suas seqüências de código sob condições adequadas para expressão da proteína e recuperação da proteína da cultura da célula hospedeira. Os vetores poderiam incluir um promotor, um sítio aglutinador ribosoma (se necessário), os códons de início/fim, e a seqüência de líder/secreção, que pode dirigir a expressão de um transcrito mono ou bicistrônico para a proteína desejada. Os vetores poderiam permitir a expressão das proteínas recombinantes nas células hospedeiras procarióticas e eucarióticas. Uma linhagem de células substancialmente enriquecidas em tais células pode então ser isolada para fornecer uma linhagem de células estável.

Os ácidos nucléicos e células hospedeiras podem ser usados para produzir uma proteína da invenção pela aplicação de tecnologias de DNA recombinante comuns. Brevemente, as seqüências de DNA desejadas podem ser ou extraídas pela digestão do vetor de clonagem inicial com enzimas de restrição, ou amplificadas usando o tal vetor como um padrão para uma Reação de Cadeia Polimerase (PCR) e os primers PCR para ampliação específica de regiões integralmente variáveis das cadeias pesadas e leves ou apenas partes delas (por exemplo, a seqüência HCDR3). Estes fragmentos de DNA podem então ser transferidos para vetores mais apropriados para a expressão dentro de células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, como descrito em livros e revisões de como clonar a produzir proteínas recombinantes, incluindo títulos da série "A Praticai Approach" publicada pela Oxford Univ. Press("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).

Para hospedeiros euearióticos (por exemplo, leveduras, células de insetos ou mamíferos), diferentes seqüências regulatórias transcricionais e translacionais podem ser empregadas, dependendo da natureza do hospedeiro. Elas podem ser derivadas de fontes virais, tais como adenovírus, vírus Papilloma bovino, vírus Simian ou semelhantes, onde os sinais regulatórios são associados com um gene particular que tem um alto nível de expressão. Exemplos são o promotor TK do vírus Herpes, o promotor precoce SV40, o promotor de gene levedura gal4, etc. Os sinais regulatórios de iniciação transcricional podem ser selecionados o que permite a repressão e ativação transiente (ou constitutiva) e a modulação da expressão do gene. A seqüência codificando a proteína

recombinante pode ser adaptada e reclonada para fazer modificações no nível de DNA apenas àquelas podem ser determinadas, por exemplo, usando software para selecionar a seqüência de DNA na qual a utilização do códon e os sítios de restrição são os mais apropriados para clonar e expressar uma proteína recombinante em vetores específicos e células hospedeiras (Grote A e outros, 2005; Carton J e outros, 2007).

Durante etapas adicionais de clonagem, seqüências de proteína podem ser adicionadas em conexão ao formato de anticorpo desejado (ScfV, Fab, fragmento de anticorpo, anticorpo inteiramente humano, etc.), ou a inserção, substituição, ou eliminação de um ou mais amino ácidos internos. Estas tecnologias podem também ser usadas para caracterização estrutural e funcional adicional e otimização das propriedades terapêuticas das proteínas em geral, e dos anticorpos em particular (KIM S e outros, 2005), ou para gerar vetores permitindo sua distribuição estável in vivo (Fang J e outros, 2005). Por exemplo, anticorpos recombinantes também podem ser modificados no nível de estrutura e/ou atividade pela escolha de uma região Fc específica para ser fundida às regiões variáveis (Furebring C e outros, 2002; Logtenberg T, 2007), pela geração de cadeia simples de fragmentos de anticorpos (Gilliland L e outros, 1996), e pela adição de seqüências de peptídeo estabilizantes, (WO 01/49713), polímeros ou rádioquímicos para resíduos modificados quimicamente (Chapman A e outros, 1999). O código de seqüência de DNA para proteína

recombinante, uma vez inserido não homologamente ou homologamente em um epissómico adequado ou vetor integrador, pode ser introduzido em células hospedeiras apropriadas por um meio adequado (transformação, transfecção, conjugação, fusão protoplástica, eletroporação, precipitação cálcio fosfato, micro- injeção direta, etc.) para transformá-las. Fatores importantes a serem considerados quando selecionando um vetor particular incluem: a facilidade com que células hospedeiras que contém o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas, o número de cópias desejado do vetor, e se o vetor é capaz de "transportar" entre células hospedeiras de diferentes espécies. As células que têm sido transformadas estavelmente pela introdução de DNA podem ser selecionadas por também introduzir um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras que contém o vetor de expressão.

O marcador pode também propiciar resistência biocida por fototrofia para um hospedeiro auxotrófico, por exemplo, antibióticos, ou metais pesados tal como cobre, ou semelhantes, e pode ser separável ou reprimido se necessário. O gene marcador selecionável pode tanto ser diretamente ligado a seqüências de DNA do gene para ser expresso, como introduzido na mesma célula por co-transfecção. Elementos reguladores transcricionais adicionais também podem ser necessários para expressão ótima.

As células hospedeiras podem ser ou procarióticas ou eucarióticas. Entre as células hospedeiras procarióticas, as pditas são B. subtilis e E. coli. Entre as células hospedeiras eucarióticas, as pditas são leveduras, células de insetos ou mamíferos. Em particular, células tais como de humanos, macacos, camundongos, insetos (usando sistemas de expressão baseado em baculovírus) e células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (como mostrado nos exemplos), fornecem modificações pós-translacionais às moléculas de proteína, incluindo correto enovelamento ou certas formas de glicosilação em sítios corretos. As células de levedura também podem realizar modificações peptídeo translacionais incluindo a glicosilação. Existe uma quantidade de estratégias de DNA recombinante que utilizam seqüências de promotores fortes e grande quantidade de cópias de plasmídeos que podem ser utilizados para a produção das proteínas desejadas na levedura. A levedura reconhece as seqüências líderes nos produtos de gene de mamífero clonado e secreta seqüências líderes de comportamento peptídeo (por exemplo, pré-peptídeos).

As linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de células imortalizadas da American Type Culture Collection (ATCC) incluindo, mas não limitada a, células de ovário de hamster Chinês (CHO), HeLa, rim de bebê hamster (BHK), rim de macaco (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, Per.Có, melanoma de Bowes e carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e uma quantidade de outras linhagens de células. No sistema baculovírus, os materiais para sistemas de expressão de células baculovírus/inseto são comercialmente disponíveis em forma de kit (por exemplo, comercializado pela Invitrogen).

Para produção de alto rendimento de longo termo de um polipeptídeo recombinante, é pdita expressão estável. Por exemplo, linhagens de células que expressam estavelmente o polipetídeo de interesse podem ser transformadas usando vetores de expressão que podem conter origem de replicação viral e/ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável no mesmo ou em um vetor separado. Seguindo a introdução do vetor, pode ser permitido as células crescer por um ou mais dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para um meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência a seleção, e sua presença permite o crescimento e recuperação de células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Os clones resistentes das células transformadas podem proliferar usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Uma linhagem de células substancialmente enriquecidas dentro das tais células pode então ser isolada para fornecer uma linhagem de células estável.

No caso de imunoglobulina humana totalmente recombinante, uma etapa importante é a seleção do isotipo específico e região constante. Os vetores especificamente designados para expressar anticorpos com o isotipo e subtipo desejados (por exemplo, humano IgA, IgGl, IgG2, ou IgG4) são largamente descritos na literatura. Então os anticorpos integrais ou as proteínas de fusão podem ser expressos como proteínas recombinantes em organismos procarióticos (por exemplo, Escherichia coli, Sorensen H e Mortensen K, 2005: Venturi M e outros, 2002), plantas (MA J e outros, 2005), ou células eucarióticas, que permitem um alto nível de expressão como células transientes ou transformadas estáveis (Dinni D e James D, 2005). Isto poderia ser requerido em particular quando a caracterização dos anticorpos tem que ser executada usando ensaios mais sofisticados, incluindo ensaios in vivo, onde a vida média do anticorpo pode ser determinada. As células hospedeiras podem ser selecionadas adicionalmente com base no nível de expressão da proteína recombinante. Adicionalmente quando a proteína é expressa, especialmente como um anticorpo, em células hospedeiras eucarióticas (linhagens de células mamíferas em particular), diferentes vetores e sistemas de expressão têm sido projetados para gerar grupos estáveis de linhagens de células transfectadas (aldrich T e outros, 2003; Bianchi A e McGrew J, 2003). Expressões estáveis, otimizadas de alto nível de anticorpos recombinantes têm sido obtidas (Schlatter S e outros, 2005), também graças a otimização das condições de cultura de células (Grunberg J e outros, 2003; Yoon S e outros, 2004) e por clones selecionados ou de engenharia com altos níveis de produção de anticorpos e secreção (Bonm E e outros, 2004; Butler M, 2005).

O anticorpo, fragmentos de anticorpo, o peptídeo bioativo, a proteína de fusão, e qualquer outra proteína definida acima como sendo capaz de aglutinar e neutralizar hCMV pode ser purificada usando as tecnologias bem estabelecidas que permitem o isolamento ou de proteínas não/recombinantes a partir da cultura de células ou a partir de preparados sintéticos. Estas tecnologias poderiam fornecer uma quantidade suficiente de proteína (da faixa de micrograma a miligrama) para executar uma caracterização mais extensiva e validação para usos profilático, diagnóstico, e terapêutico relacionados com hCMV. Para este propósito, os preparados de proteínas recombinante ou natural podem ser testados em ensaios in vitro ou in vivo (bioquímicos, ensaios baseados em tecidos ou células, modelos de doenças confirmados em roedores ou primatas, métodos biofísicos para medições de afinidade, mapeamento de epítopo, etc.), em particular usando qualquer daqueles revelado nos Exemplos ou na literatura para estudo de patogênese e imunobiologia hCMV.

Os anticorpos, como preparados purificados a

partir de células humanas B sobrenadantes ou expressados com proteínas recombinantes, podem ser adicionalmente validados usando ensaios in vitro baseados em órgãos ou células conhecidos na literatura (Eggers M e outros, 1998; Lam V e outros, 2006; Reinhardt B e outros, 2003; Forthal D e outros, 2001; Goodrum F e outros, 2002). Além disso, podem ser feitos testes pré-clínicos relevantes em animais infectados por hCMV, em particular em modelos onde células hospedeiras humanas podem ser transplantadas (Barry P e outros, 2006; Gosselin J e outros, 2005; Thomsen M e outros, 2005).

A purificação das proteínas recombinantes da invenção pode ser realizada por qualquer método convencional conhecido para este propósito, por exemplo, qualquer procedimento envolvendo extração, precipitação cromatográfica, ou semelhantes. Em particular, métodos para purificação podem fazer uso de matrizes gel imobilizadas dentro de uma coluna (Nisnevitch M e Firer M, 2001; Huse K e outros, 2002; Horenstein A e outros, 2003), explorando a forte afinidade dos anticorpos por substratos como Proteína A, Proteína G, ou substratos sintéticos (verdoliva A e outros, 2002; Roque A e outros, 2004), ou por antígenos específicos ou epítopos (Murray A e outros, 2002; Jensen L e outros, 2004). Após a lavagem, a proteína é eluída do gel por uma mudança no pH ou força iônica. Alternativamente, HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pode ser usada. A eluição pode ser realizada usando um solvente baseado em água e acetonitrila comumente empregado para purificação de proteína.

O anticorpo, os fragmentos de anticorpo, os peptídeos bioativos, as proteínas de fusão, e qualquer outro composto definido acima usando seqüências de anticorpos 26A1 podem ser usados para detectar, tratar, inibir, prevenir, e/ou atenuar a infecção hCMV. Para este propósito, tais compostos podem ser usados para preparar compostos de diagnóstico, terapêutica, ou profilático para o gerenciamento da infecção hCMV.

Em particular tais componentes podem ser

usados para preparar compostos farmacêuticos, junto com qualquer veículo ou portador farmaceuticamente aceitável. Estes compostos podem adicionalmente compreender qualquer agente terapêutico ou profilático adicional, tal como vacinas, anticorpo neutralizante de hCMV, preparados de imunoglobulina intravenosa, compostos imunomodulantes, e/ou compostos antivirais. A literatura fornece alguns exemplos destes compostos agindo na replicação do hCMV (Foscarnet, Vangaciclovir, Fomivirsen, ou Ganciclovir) e já testados em humanos, sozinhos ou em combinação com preparados de imunoglobulina intravenosa (De Clercq E, 2003; Nigro G e outros, 2005). Além disso, a literatura recente sugere que os anticorpos monoclonais humanos podem ser usados para suplementar (e substituir, se possível) tratamentos presentes, tais como preparados de imunoglobulina intravenosa e/ou compostos antivirais, dando a oportunidade para reduzir a freqüência e/ou a dosagem daqueles compostos farmacêuticos (Barry J e outros, 2007).

Estes compostos podem compreender um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo bioativo, uma proteína de fusão, e qualquer outro composto definido acima com base na seqüência e atividade da seqüência anticorpo monoclonal 26A1 humano. Os compostos podem adicionalmente compreender um anticorpo neutralizante de hCMV diferente, um preparado de imunoglobulinas intravenosas (IVIg) e/ou composto antiviral. O anticorpo neutralizante de hCMV diferente poderia ser caracterizado por um epítopo diferente, tal como aqueles descritos na literatura ou nos pedidos de patente EP07114782, EP07115410, e EP07111741 (10B7, 810, e 1F7, respectivamente) que estão associados ao gH, gB, ou outros antígenos de hCMV. De fato, a literatura mostra muitos exemplos nos quais, quando dois ou mais anticorpos direcionados a um alvo viral ou humano são combinados em uma composição farmacêutica, a composição resultante pode ter uma eficácia terapêutica melhorada graças não apenas a um efeito aditivo, mas a um efeito sinérgico específico (Logtenberg T, 2007). As composições compreendendo qualquer das proteínas (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas de fusão, peptídeos bioativos) e dos ácidos nucléicos definidos acima podem ser usadas e administradas para um indivíduo com diagnóstico, terapêutica, ou propósito profilático relacionado a hCMV. Estas composições podem ser administradas como meios de imunização passiva específica para hCMV que fornecem compostos terapêuticos (em particular anticorpos terapêuticos ou fragmentos de anticorpos terapêuticos) que, por alvejarem vírions hCMV, podem inibir a propagação do vírus no paciente tratado, e potencialmente bloquear o surto de uma infecção viral na população.

Dependendo do uso específico, a composição poderia fornecer o composto para o paciente humano (em particular uma mulher grávida ou qualquer outro indivíduo que esteja infectado por hCMV ou considerado em risco por hCMV devido a contato com um indivíduo infectado por hCMV) por um período de tempo maior ou menor. Para este propósito, a composição pode ser administrada, em dosagens única ou múltipla e/ou usando dispositivos apropriados, através de vias diferentes: intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, mucosal, por um nebulizador ou um inalador, como colírio, em materiais de matriz não/biodegradável, ou usando sistemas de distribuição de droga em partículas. Em particular, o composto pode permitir administração tópica ou ocular, que representa uma abordagem útil dada a presença do hCMV na mucosa e olho. Além disso, anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser efetivamente quando topicamente aplicado a feridas (Streit M e outros, 2006), córnea (Brereton H e outros, 2005) ou vagina (Castle P e outros, 2002).

Uma composição farmacêutica da Invenção

poderia fornecer uma quantidade efetiva terapeuticamente e profilaticamente do composto para o paciente que permite ao composto exercer sua atividade por um período de tempo suficiente. O efeito desejado é melhorar o status do paciente de hCMV pelo controle da infecção do hCMV, reativação, e/ou re- infecção, e pela redução pelo menos das manifestações clínicas da infecção do hCMV, tais como retinite ou pneumonite (Landolfo S e outros, 2003). Por exemplo, a composição poderia ser administrada a uma quantidade efetiva de em torno de 0,005 a em torno de 50 mg/kg.peso corporal, dependendo da via de administração, do número de doses administradas, e do status do indivíduo.

No caso das composições tendo usos diagnósticos, o composto poderia ser detectado usando tecnologias usualmente estabelecidas em laboratórios clínicos e de pesquisa para detecção de vírus em amostras biológicas (por exemplo, ELISA ou outro ensaio serológico), ou, quando administrado para um paciente in vivo, pelo menos 1, 2, 5, 10, 24, ou mais horas após a administração. A detecção do hCMV pode ser executada, usando as proteínas da invenção, em substituição ou acoplado a meios conhecidos e procedimentos que têm sido estabelecidos para monitorar populações em risco de infecção por hCMV crônica ou aguda de ambos hospedeiros imunocompetente e imunocomprometido, onde uma correlação entre o dado gerado in vitro e o status clínico existe (Gilbert G, 2002; Gerna G e Lilleri D, 2006; Lazzarotto T e outors, 2007).

Um método para tratamento, profilaxia, ou diagnóstico de hCMV, ou de doença relacionada com hCMV pode compreender a administração de uma proteína ou de um ácido nucléico como definido acima. O método pode adicionalmente compreender a administração de um anticorpo diferente neutralizante de hCMV, um preparado de imunoglobulina intravenosa (IVIg) e/ou composto antiviral.

O desenvolvimento clínico e uso deveriam ser baseados na farmacocinética e farmacodinâmica do anticorpo (Lobo E e outros, 2004; Arizono H e outros, 1994), nos dados de segurança pré-clínica e clínica (Tabrizi Me Riskos L, 2007), e na conformidade com exigências internacionais para a produçÃo e controle de qualidade de anticorpos monoclonais para serem usados para terapia e diagnóstico in vivo em humanos (Harris R e outros, 2004).

As proteínas da invenção podem ser também usadas para a preparação de uma composição para detectar, tratar, inibir, prevenir, e/ou atenuar outras, mais doenças muito difundidas (tais como doenças cardiovasculares e auto-imunes, ou alguns tipos de câncer) que podem ser definidos como doenças relacionadas com hCMV ou associadas com hCMV. Nestas condições, o hCMV é considerado como um cofator possível visto que é bem sabido que este vírus está associado com processos inflamatórios celulares/imunológicos ( pela simulação da expressão de receptores Fc, moléculas de adesão celular, chemoquinas e citoquinas), atividades auto-imunes (por exemplo, arterioesclerose, restenose) e com alterações aos caminhos de apresentação do antígeno (pela inibição da expressão do MHC classes i e II) levando a apoptóse, diferenciação, e migração da célula, por exemplo, em vasos sangüíneos e em células proliferando ativamente (Cinatl J e outros, 2004; Soderberg- Naucler C, 2006).

Além disso, a infecção hCMV tem sido também descoberta associada a alteração do metabolismo celular (Munger J e outros, 2007), depressão (Phillips A e outros, 2007), ou fator de risco para eventos trombóticos (Fridlender Z e outros, 2007). A reativação do hCMV e complicações relacionadas tem também sido descoberta em pacientes com câncer (Sandherr M e outros, 2006; Han X, 2007) ou pacientes afetados por doenças inflamatórias no tecido conjuntivo (Yoda Y e outros, 2006) e em geral em pacientes sob tratamentos imunodepressivo tais como corticóides (Yamashita M e outros, 2006), ou quimioterapia e outros regimes imunosupressivos baseados em anticorpos (0'Brien S e outros, 2006; Scheinberg P e outros, 2007).

A invenção será agora descrita por meio dos exemplos seguintes, os quais não deveriam ser interpretados com de alguma forma limitando a presente invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de culturas de células secretando anticorpos monoclonais humanos que neutralizam a infectividade do hCMV Materiais & métodos

Seleção de doadores humanos que apresentam anticorpos IgG neutralizando o hCMV no soro sangüíneo

Estes ensaios específicos de hCMV têm sido executados como descrito na PCT/EP2005/056871 ou na literatura, como sumarizado abaixo.

Os anticorpos neutralizantes de hCMV foram detectados de acordo com um ensaio de microneutralização de hCMV baseado em Fibroblastos de Pulmão de Embrião humano (células HELF) e cepa AD169 do hCMV (Uma cepa de hCMV de laboratório da ATCC, cod. VR-538).

O ensaio de microneutralização do hCMV foi também executado com a cepa endoteliotrópica VRl 814 do hCMV, um derivativo de um isolamento clínico recuperado de uma zaragatoa cervical de uma mulher grávida Revello M e outros, 2001), e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Estas células foram obtidas pelo tratamento enzimático de veias do cordão umbilical e cultivadas em meio de crescimento endotelial (EGM-2, Cambrex Bio Science) suplementado com Soro Bovino Fetal (FBS) 2%, fator de crescimento endotelial vascular recombinante humano (VEGF), fator de crescimento fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento epidérmico humano (hEGF), fator de crescimento de insulina (IGFI), hidrocortisona, ácido ascórbico, heparina, gentamicina e anfotericina Β, (1 μg/ml cada). Experimentos foram executados com células na passagem 2-6.

O uso de células HELF e HUVEC para estudar

infecção e replicação hCVM usando cepas clínicas e de laboratório tem sido descrita em muitos artigos (Gerna G e outros, 2002). No caso presente, as células foram dispostas (2,0- 2,5x104/cuba) em cubas de fundo plano de uma placa de 96 cubas em 100 μΐ de Meio de Crescimento, que contém Meio Essencial Mínimo (MEM; Gibco-BRL) com 10% Soro Fetal de Bezerro (FCS), 1 mM Piruvato de sódio (NaP), e GPS (2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina e 100 μg/ml streptomicina). As células foram cultivadas por 24 horas a 37°C. Cinqüenta μΐ de amostras contendo anticorpos

(soro humano, células de cultura sobrenadante, ou de IgG natural ou recombinante purificado por Proteína A nas concentrações indicadas) foram incubadas com a cepa de laboratório AD169 do hCMV [500 unidades formadoras de placa (pfu) em 50 μΐ de MEM com 5% de FCS, o volume total da mistura foi de 100 μΐ] por 1 hora a 37°C. A mistura do preparado de anticorpos e vírus foi então adicionada às monocamadas de células HELF (por cepas AD169 e AL-I do hCMV) ou monocamadas de células HUVEC (por VRl 814 do hCMV) e incubadas por 1 hora. O Meio de Crescimento foi descartado das monocamadas de células e substituído por mistura anticorpo-vírus. As placas foram então centrifugadas a 2.000 g por 30 minutos e incubadas por 90 minutos a 37°C em 5% CO2. Meio de Crescimento (100 μΐ) foi adicionado e as culturas foram mantidas no incubador por 72 horas adicionais.

O efeito das células B sobrenadantes na

infectividade do hCMV foi medida por Antígenos Precoces Intermediários de hCMV coloridos (IEA, IEl + IE2) por imunoperoxidase indireta colorida. As monocamadas de células foram fixadas com solução acetona/metanol (armazenado a - 20°C) por 1 minuto e então lavadas com PB S. As células foram permeabilizadas em 0,1% Triton X-100 em PBS com 1% H2O2, 5 minutos no gelo, e então lavadas com PBS. A peroxidase endógena foi bloqueada com PBS com 50% de metanol e 0,6% H2O2, 30 minutos a temperatura ambiente no escuro e então lavada com PBS. Cinqüenta μΐ de Agente Bloqueador de Proteína (Ultra Tech HRP 500-600 Test, Straptavidin-Biotin Universal Detection System, PN IM2391) foram adicionados por 10 minutos à temperatura ambiente, e então lavadas logo com PBS. Foi adicionado anti hCMV IEA (clone E13, Argene Biosoft, ref. 11-003) de camundongo às cubas por 60 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavadas, as células foram incubadas com 50 μΐ de conjugado de biotina, anti-humano secundário IgG (Ultra Tech HRP 500-600 Test, Straptavidin-Biotin Universal Detection System, PN IM2391) ou conjugado de peroxidase de cabra anti- camundongo IgG (Ultratech HRP), por 10 minutos. Foi adicionado substrato DAB (Merck, No 1.02924.0001) em 0,1% H2O2 por 30-45 minutos a 20°C no escuro e a reação parada pela diluição com PBS. Os núcleos IEA-positivos foram contados sob o microscópio.

O meio apenas ou a cultura de células sobrenadantes contendo anticorpos IgG irrelevantes foram usados como um controle negativo. Um preparado comercial de IgG humano, purificado do soro de pacientes hCMV soropositivos (Cytotect, Biotest), foi usado como um controle positivo com diluições progressivas, começando em 125 μg/ml. A positividade foi definida como > 40% de inibição de células IEA-positivas, comparado às cubas de controle negativo.

O ponto final de 50% de inibição, calculado usando o método Reed-Münch será considerado a Concentração de Neutralização (NT): NT = diluição de anticorpo recíproca [inibição >50%] χ [(% inibição maior do que 50% - 50%)/([(% inibição maior do que 50% - % inibição menor do que 50%)]

Seleção de doadores humanos baseada na presença no soro, de IgG que se ligam a regiões do envoltório de glicoproteínas gB ou gH do hCMV

Os ensaios de aglutinação específica de hCMV têm sido executados com descrito na PCT/EP2005/056871 ou indicado pelo Fabricante, e validado com uma mistura comercial de anticorpos IgG específicos para CMV (Cytotec, Biotest). O soro foi testado em uma ELISA específica para IgG humano aglutinando proteínas vírion hCMV que são comercialmente disponíveis (BEIA-CMV IgG Quant; Bouty, cod. 21465) e uma ELISA IgG gB (AD2) hCMV, também comercialmente disponível (CG3 antigen Biotest AG, cod. 807035; Figura IA).

Brevemente, fitas quebráveis cobertas com uma mistura de proteína de hCMV inativada (derivada da cepa de laboratório AD169) foram colocadas em microplacas e incubadas com células sobrenadantes B diluídas 1:81 (10 μΐ de sobrenadantes adicionado a 800 μΐ de diluentes de amostra do sistema BEIA), e a placa incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Após um ciclo de lavagem, o anticorpo IgG anti-humano monoclonal pré-diluído conjugado com peroxidase de rábano (100 μΐ) foi adicionada e a placa foi incubada à temperatura ambiente por 15 minutos. A reação foi interrompida usando a Solução de Interrupção (100 μΐ/cuba) e a densidade ótica foi medida em bicromatismo a 450/620 nanômetros.

Produção da cultura de células B humanas imortalizadas

As células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMCs) foram obtidas de um paciente recuperado de uma infecção hCMV aguda (CMV7), selecionado devido a presença de anticorpos neutralizantes de hCMV no soro. O processo de imortalização EBV ao qual as PBMCs do paciente CMV7 foram subseqüentemente expostas tem sido executado de acordo com os ensinamentos da PCT/EP2005/056871. Brevemente, as PBMCs foram purificadas do sangue periférico por centrifugação gradiente de densidade convencional no Ficoll/Hypaque. As células CD22-positivas foram isoladas das PBMC frescas (>90% pureza) com granulado revestido de CD22 anti-humano pela técnica VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.) como descrito pelo fabricante. As células purificadas foram estimuladas com uma combinação de CpG2006 (Coley, ^g/ml) e IL-2 (Roche, 200U/ml). Após 4 dias de estimulação, as células foram lavadas com meio de cultura fresco (RPMI-1640) e as células B foram altamente enriquecidas em células IgG-positivas com granulado revestido de IgG anti-humano pelo uso da técnica VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.), seguindo as instruções do fabricante.

As células selecionadas e estimuladas foram suspensas e mantido em meio de cultura de células RPMI-1640 com 10% (v/V) FCS (Soro Fetal de Bezerro), ImM piruvato de sódio, 100 μg/ml de streptomicina e 100 U/ml de penicilina, em placas de 24 cubas a 37°C e 5% de C02. A imortalização EBV foi executada usando células sobrenadantes B95.8 (1:1 v/v por 16 horas).

Ao fim do processo, as células imortalizadas foram lavadas com meio de cultura fresco (RPMI 1640 adicionado com 10% Soro Fetal de Bezerro) e postas em cultura por 3 semanas a uma densidade de 1,5 χ IO6 células/ml em placas de 24 cubas com uma camada de alimentador (PBMC alogênico irradiado classificado a 5 χ IO5 células/cuba), sem CpG2006 (e não com CPG2006 como descrito no PCT/EP2006/069780 para o processo iniciado a partir dos PBMCs obtidos do doador CMV50). Seleção de subculturas de células B humanas imortalizadas que secretam anticorpos neutralizantes de hCMV

Cinqüenta dias após a exposição a EBV, a atividade neutralizante de hCMV foi confirmada na cultura de células expandida policlonal com o ensaio de microneutralização baseado em AD169/HELF descrito acima. Então as células foram classificadas a 20 células/cuba em PBMCs alogênicos (50.000/cuba) irradiados (30 Gy) em ΙΟΟμΙ IMDM adicionado com 10% FCS e aminoácidos não essenciais (NEAA, diluído IX de uma solução de estoque comercial 100X; EuroClone) na ausência de CpG2006 e IL-2. Um total de 4224 subculturas foram geradas e, após duas semanas, 50 μΐ do mesmo meio foi adicionado. Após 1-2 semanas adicionais de cultura, os sobrenadantes de células de cultura que apresentaram crescimento e células agregadas foram testados em paralelo usando o ensaio de neutralização de hCMV baseado nas células HELF e cepa Ad 169 do hCMV.

Os sobrenadantes de culturas de células que apresentaram atividade neutralizante de hCMV foram testados usando as ELISAs para detectar ligação de IgG humano a regiões do envoltório de glicoproteínas gB do hCMV, ou total proteínas do hCMV descritas acima.

Alternativamente, antígenos baseados em gB ou gH foram gerados com proteínas de fusão Transferase-S- Glutationo (GST). No caso do antígeno gB(Ag)-GST, a região imunodominante gB da cepa C194 do hCMV foi fundida ao GST (Biodesign, Cat. No. Rl 8102; GS-4B Sepharose Affmity purified, 1 mg/ml). No caso do antígeno gH(Ag)-GST, o fragmento da glicoproteína gH da linhagem VRl 814 de HCMV foi clonado por PCR, fundido ao gene GST, produzido em E. coli e purificado de lisado celular bacteriano com base na afinidade de GST. O antígeno gH (AG)-GST recombinante corresponde a uma fusão em alinhamento entre a região amino terminal gH (aminoácidos 16-144; Figura 1B) da linhagem VR1814 de hCMV e GST. Foi usado apenas GST como um controle negativo. Esses ensaios Elisa foram realizados aplicando-

se um protocolo ELISA comum em um formato de 96 poços com poças modificações. Em resumo, o antígeno é diluído a 2 μg/mL em PBS e 50 ^L desta solução de proteína (contendo 100 ng da proteína de fusão expressada em bactéria) foi usada para revestir placas de poliestireno EIA (nunc; Cat N0 469949). O revestimento das placas ELISA foi realizado durante a noite a 4°C, e a seguir, após eliminar a solução de proteína, as placas foram lavadas quatro vezes com 150 de Tampão de Lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20). Um tratamento para bloqueio de ligação não específica foi realizado dispensando-se 100 μΕ de PBS contendo 1% de leite em cada poço durante 1 hora a 37°C. Após quatro ciclos de lavagem com 50 μΕ de Tampão de Lavagem, 50 μΕ dos sobrenadantes das culturas de célula foi incubado em cada poço durante 2 horas a 37°C, usando-se 50 μΕ/poço do meio de cultura celular como controle negativo. Após quatro ciclos de lavagens, 50 \iL do anticorpo secundário [IgG anti-humano de cabra (Fc especifico)conjugado com peroxidase de rábano de cabalo, diluído 1:30.000 em tampão de lavagem, Sigma, Cat. n° AO170] foram colocados em cada poço e as placas foram incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Após quatro ciclos de lavagem adicionais, desenvolveu-se a reação enzimática adicionando-se 05 μΐ. de Substrato-TMB (3,3',5,5- tetrametilbenzidina; Sigma, Cat. n° T0440) em cada poço por mais 30 minutos a temperatura ambiente. A reação cromogênica foi interrompida administrando-se 100 μΙ. de solução de finalização (ácido sulfúrico IN) para cada poço sendo lida a densidade óptica a 450 nm.

Resultados

Foram obtidos PBMCs humanos de um paciente com hCMV (CMV7) apresentando um título de neutralização de hCMV significativa no soro (5% de neutralização a uma diluição 1:105 ) juntamente com uma forte reatividade em um ensaio ELISA (positivo a diluição de 1:64 de uma amostra é considerado positivo pela presença de IgG anti-gB a diluições de 1A ou maiores) com base na ligação dos domínios AD2 da glicoproteína B, um dos antígenos de hcMV melhor caracterizados por induzirem anticorpos neutralizantes do soro (Qadri I et al., 1992; KropffB et al., 1993) e clonado dentro do antígeno CG3 (Figura IA). Além disso, os soros CMV7 foram positivos em um outro ensaio ELISA usando as proteínas de vírion de hCMV total, onde foi medida uma atividade de 74 AU/mL (uma amostra é considerada positiva pela presença de IgG anti-hCMV quando o resultado é de pelo menos 10 AU/mL).

Células B do paciente CMV7 foram usadas para gerar uma cultura de célula policlonal imortalizada, altamente enriquecida em células B que secretam IgG usando o método de imortalização com base em EBV descrito em PCT/EP2005/056871 e PCT/EP2006/069780. Comparadoaeste último documento, que descreve a seleção de anticorpos anti- hCMV de um outro doador (CMV5), prepararam-se as subculturas da população policlonal, grosseira de células imortalizadas, na ausência de CpG2006 sendo os sobrenadantes primeiramente selecionados quanto a presença de anticorpos neutralizando infectividade por hCMV pelo ensaio de microneutralização e apenas após quatro anticorpos ligarem-se a antígenos de hCMV selecionados

O ensaio de microneutralização de hCMV foi aplicado apenas a subculturas, que provaram estar desenvolvendo-se ativamente com grupos de células de 3 semanas de cultura. Os sobrenadantes dos 324 poços foram primeiro analisados no ensaio de neutralização de hCMV, 20 sobrenadantes dentre estes foram vistos reduzir a capacidade de infecção de da linhagem AD169 de hCMV em pelo menos 40%. Quando se caracterizou as atividades de ligação a hCMV nesses poços, apenas dois foram encontrados positivos para gB(seja como antígeno de CG3 ou uma proteína de fusão gB(Ag)-GST) nenhum para gH (como uma proteína de fusão gH(Ag)-GST; Figura 1B) e 18 poços a nenhum destes (Figura 2).

Devido ao baixo numero de células inicialmente semeadas em cada poço (20 células/ poço) cada subcultura apresentando atividade de neutralização para hCmV, deveriam do mesmo modo, produzir anticorpos monoclonais (ou seja, secretados por células originadas por clonagem por uma única célula imortalizada específica), especialmente dado à baixa freqüência de células na população celular policlonal imortalizada que se espera crescer e secretar IgG neutralizante de hCMV. Outras atividades experimentais foram planejadas para confirmar esta suposição.

EXEMPLO 2 - CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO 26Al Materiais e Métodos

Expansão e caracterização da subcultura 26Al

As células da subcultura original de 26Al foram expandidas em PBMC alogênico irradiado em meio IMDM (adicionado com 10% de FCS e NEAA) sendo a atividade de neutralização de hCMV confirmada pelo menos duas vezes durante esta etapa de expansão usando o ensaio de microneutralização de hCMV, conforme descrito o Exemplo 1 (ver a Tabela 1)(.

A quantidade de anticorpo secretada pela subcultura 26A1 foi determinada a 24, 48 e 72 horas usando um kit ELISA de igG humano quantitativo comercial (Immunotek; cod. 0801182; Zeptometriz Corp), de acordo com as instruções do fabricante. A subclasse do anticorpo 26A1 foi determinada usando um ensaio comercial (combi-Kit ELISA subclasse IgG humano PeliClass; cod. n°RDI-M1551cib, RDI Division of Fitzgerald Industries Intl.).

A cultura celular foi expandida gradualmente, semeando-se as células contidas em 1 poço de uma placa de 96 poços 1 χ IO5) em u poço de uma placa de 48 poços em PBMC alogênico irradiado em IMDM adicionado com 5% de FCS. Após 5 a 7 dias, as células foram expandidas em um poço de uma placa de 24 poços na ausência da camada alimentadora em IMDM adicionado com 5% de FCS. A seguir as células (5 χ 105/mL) foram colocada em uma placa de 6 poços na ausência da camada alimentadora em 50% de IMDM e 50% de Hibridoma- SFM (Gibco, cod. 12045-084) adicionado com 2,5% de FCS. As células foram cultivadas nessas condições por pelo menos uma semana. Células de crescimento exponencial foram a seguir lavadas e cultivada em Frascos T75 em Hibridoma-SFM a uma concentração variando desde 5 χ IO5 a 106/mL. O sobrenadante da cultura celular foi coletado, sendo o IgG quantificado e purificado em colunas de Proteína A, dialisado contra tampão PBS e filtrado (0,2 μΜ).

Caracterização de anticorpo secretado pela

subcultura 26AI

O BEIA-CMV, com base em gB, e ensaios

ELISA com base em gH foram descritos no Exemplo 1 (Figura 1 e 2) O ensaio HSV foi realizado de acordo com a literatura (Laquerre S et al., 1998).

O ensaio de redução de placa de hCMV foi realizado usando a linhagem AD169 de hCMV. Em resumo, o vírus foi diluído a 1000 PFU/reação. Iguais quantidades 0,1 mL de vírus e cada anticorpo ou sobrenadante de cultura celular foram misturados e incubados a 37°C durante uma hora. As misturas foram adicionadas a monocamada de células HELF (em placas de 24 poços), e deixada adsorver por 1 hora a 37°C. A seguir a mistura anticorpo-vírus foi removida adicionando-se sobrecamada de metilcelulose a 1% - MEM - FCS a 2% para as células infectadas. As placas serão contadas como uma medida da infectividade no dia 10 ou 12 pós-infecção.

O sobrenadante de cultura celular 26Al foi testado em células HELF ou HUVEC de imunofluorescência ou não infectadas. Resumidamente, as células ()7 χ 104/mL) foram semeadas laminas de vidro com camada finíssima superposta revestidas de gelatina em placas de 24 poços em MEM adicionado com 10% de FCS sendo a seguir crescido até semi- confluência. AS células foram a seguir lavadas duas vezes com PBS quente, fixadas com uma mistura pré-resfriada (a -20°C) de 50% de acetona / 50% metanol durante 1 minuto a temperatura ambiente sendo lavadas com PBs. As células fixadas foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 20 minutos em gelo, lavada com PBS e incubada por 15 minutos a temperatura ambiente, com uma solução de bloqueio (PBS mais FCS a 2%). Alternativamente, as células fixadas não foram permeabilizadas para se determinar a capacidade dos anticorpos em reconhecer os componentes da superfície celular. Neste caso, as células fixadas foram lavada com PBS, incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente com uma solução de bloqueio (PBS adicionado com FCS a 2%) e incubada com sobrenadante de cultura celular 26A1 (80 μΐ) por 2 horas a 37°C. As células foram a seguir lavadas com PBS quente (3 X) e incubadas com 80 μΐ, de F(ab')2 IgG anti-humano de coelho conjugado a FITC (Jackson ImmunoResearch) para acompanhar o desenvolvimento do manchamento de IgG humano com a cor verde. Os anticorpos secundários foram diluídos 1:50 em PBS adicionado com Tween 80 a 0,05% e adicionados para as células durante 1 hora a 37°C no escuro. A seguir, as células foram lavadas com PBS quente (3X) contra-manchadas com iodeto de propídio (0,25 μg / mL) em PBS; Sigma) As lâminas com camada superposta foram montadas em laminas de microscópio usando o Mounting Médium (Vector Laboratories). As imagens foram registradas com um microscópio de varredura a laser confocal invertido Olympus Fluoview-IX70.

Caracterização de DNA de IgG de 2 6AI / seqüência de proteína e expressão recombinante

Uma alíquota da cultura de célula, resultante da expansão da cultura de célula 26Al inicial, foi usada para sequenciamento das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) do anticorpo 26Al de acordo com a tecnologia estabelecida por Fusion Antibodies Ltd. Pellets, de células congeladas (contendo pelo menos 50.000 células) que foram usadas para extração total de RNA. O cDNA correspondente foi produzido por transcrição reversa com um iniciador oligo(dT). As reações da PCR foram ajustadas para amplificar a região VH usando uma mistura de iniciadores específicos para IgG, e a região VL com uma mistura de iniciadores IgK/λ. Os produtos da PcR de duas reações de amplificação foram clonados usando um sítio de restrição Eco RI em um vetor de sequenciamento (pCR2.1; Invitrogen) e empregados para transformar células de E. coli TOP10.

Pelo menos dez colônias selecionadas obtidas das duas transformações foram coletadas e analisadas para sequenciamento. As seqüências de DNA resultantes foram alinhadas e traduzidas em seqüência de proteína gerando um DNA de consenso e seqüência de proteína para VH 26A1 (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente) e VL 2641 (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente). As seqüências de proteína VG26A1 e VL 26Al foram comparadas e alinhadas com seqüências presentes em base de dados de domínio publico (usando base de dados GenomeQuest, GeneSec, e EBI). Os CDRs caracterizando as seqüências de proteína (SEQ ID NO: 5, 7 e 8) de VH 26Al e (SEQ ID NO: 11, 12 e 13) de VL26A1 foram prognosticados tomando-se a base de dados IMGT (Giudicelli V et al., 2004). O anticorpo monoclonal 26Al recombinante humano foi expresso em células eucarióticas por clonagem da seqüências da região variável de cadeia pesada e leve de 26Al de consenso no mesmo vetor de expressão, já contendo as correspondentes regiões constantes (para cadeia pesada de IgGl humano e cadeia Lambda de Ig humano) e um vetor promotor duplo permitindo a expressão de ambas as cadeias de anticorpo, a seqüência completa de anticorpo monoclonal 26Al humano recombinante no vetor foi confirmada pelo sequenciamento de DNA e usada para transfectar, momentaneamente células DG44 CHO (Derouazi M et al. 2006) que foram adaptadas para desenvolver em cultura de suspensão isenta de soro e semeadas a 1 χ IO6 células por mL em um frasco giratório de 125 mL. A transfecção foi realizada com uma mistura de 300 μg de vetor de expressão com 900 μg de polietilenoimina de 25 kDa linear. As células foram incubadas a 37°C em 5% de CO2 durante 6 dias no frasco giratório antes da coleta do meio. O anticorpo recombinante foi purificado usando uma coluna de Proteína G em uma unidade de cromatografia Akta Prime seguindo o programa padrão do fabricante.

Resultados

Dentre as subculturas contendo células em crescimento e secretando IgG, os sobrenadantes da cultura celular, dentre poucos, continham anticorpos que neutralizam infecção por hCMV, porém não apresentaram uma ligação significativa aos antígenos recombinante específicos gB e gH testados por ELISA (Figura 1 e 2). Em particular, a subcultura 26Al que secreta um IgGl5 demonstrou a atividade de neutralização a hCMV mais forte e com mais capacidade de reprodução, sendo escolhida para uma caracterização molecular e biológica mais detalhada.

A ligação de IgG presente no sobrenadante da subcultura 26Al a hCMV foi confirmada usando um ELISA contendo uma mistura de proteínas hCMV (BEIA-CMV). Ao mesmo tempo, este sobrenadante demonstrou uma atividade de neutralização de hCMV significativa conterá diferentes cepas de hCMV em dois sistemas de célula hospedeira humana (como se vê na Tabela 1). Esta atividade não foi observada, quando se usou o sobrenadante em um ensaio de neutralização específica para HS V.

Além disso, a subcultura 26Al foi expandida e

ainda subclonada a 10 células/ poço a fim de confirmar sua capacidade de monoclonagem em termos de expressão de IgGl humano, de neutralização de hCMV. De fato, dentre os poços que mostraram crescimento celular, todos apresentaram uma atividade de neutralização variando de 50 a 98% no ensaio com base em AD169 original, confirmando os resultados obtidos com a subcultura 26a! original.

As células na subcultura 26Al original foram usadas para expandir gradualmente, a produção de IgG, gerando progressivamente, culturas maiores, das quais pode-se purificar o IgG e ser submetido a teste em ensaios de hCMV. Culturas maiores foram geradas por expansão gradual de cultura de 26Al e eliminar algumas exigências para crescimento em cultura celular (tais como camada introdutória, Soro Bovino Fetal). Com o uso desta abordagem, demonstrou-se que, maiores culturas de célula geradas da subcultura do 26Al original secretam IgGl a uma concentração de aproximadamente 16 μg/mL IO6 de células. Essas maiores culturas demonstraram uma duplicação do tempo de 4 dias, mesmo na ausência da camada introdutória, e a atividade de neutralização de hCMV manteve-se na cultura por mais de 2 meses.

Os ensaios de neutralização de hCMV foram repetidos com o anticorpo 26A1, na forma de IgG humano purificada por cromatografia de afinidade da maior cultura de célula. O IgG de 26Al foi submetido a teste em experimentos dose-resposta para se avaliar a concentração exigida para 505 de inibição (concentração inibidora 50, ou IC50), de infectividade por hCMV, utilizando dois ensaios com diferentes combinações de cepas hCMV e células alvo humanas. Os resultados mostraram que, a potente atividade de neutralização de igG de 26A1 natural purificado com Proteína A não é específica para tipo de célula nem para linhagem do vírus, podendo ser avaliada quantitativamente pelo proporcionar valores IC50 de aproximadamente 1 μg/mL e um efeito de neutralização aproximando-se de 100% em ambos os ensaios (Figura 3). Quando se compara a atividade de neutralização

de IgG de 26A1 natural purificado com Proteína A, com aquela de uma preparação comercial de IgG hiper-imune (IVIg) contra hCMV (Cytotect, Biotest) contra o isolado clínico em células HUVEC, o IC50 de 26A1 é 25 vezes menor do que o exigido para esta preparação comercial, demonstrando assim, a potente atividade de neutralização do anticorpo 26A1.

De modo a excluir o fato da atividade de neutralização presente no sobrenadante da subcultura 26Al ser devido à ligação a uma molécula superficial da célula, o sobrenadante foi testado em ensaio de imunofluorescência com células HELF ou HUVEC não infectadas. Este ensaio demonstrou que, o IgGl produzido pela cultura de 26Al não se liga a células humanas não infectadas. Quando o mesmo sobrenadante celular é testado em ensaio ELISA contra antígenos hCMV relevantes, o anticorpo não liga essas proteínas (figura 4) indicando que, o anticorpo 26Al reconhece, do mesmo modo, um outro antígeno não determinado na cápsula viral de hCMV induzindo a produção de anticorpos de neutralização.

A capacidade de monoclonagem do anticorpo neutralizante de hCMV secretado nas culturas de célula derivadas de 26Al foi ainda confirmada por sequenciamento de produtos da PCR específicos para IgG obtidos desta cultura celular. Precipitados de célula foram preparados para extração de rNA e transcrição reversa usando células originadas da subcultura 26A1. O cDNA resultante foi a seguir usado para amplificação de seqüências VH e vL usando iniciadores específicos para as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de IgG humana, respectivamente. Os produtos da PCR foram a seguir clonados em plasmídeos que foram usados para transformar células bacterianas. Os transformantes bacterianos foram aleatoriamente coletados e usados para sequenciamento dos produtos da PcR clonados. Todos os clones demonstraram a mesma seqüência de DNA, salvo pequenas diferenças, possivelmente, devido a erro induzido pela PCR, permitindo a determinação das seqüências de consenso e CDRs para as regiões variáveis de cadeia pesada (Figura 5) e cadeia leve (Figura 6) do anticorpo monoclonal 26Al humano.

As seqüências codificando as regiões Vh e Vl do anticorpo 26Al podem ser novamente clonadas em vetores de expressão para a apropriada expressão das regiões variáveis de 26A1 como um fragmento de anticorpo (Fab ou ScFv) ou dentro de um anticorpo recombinante totalmente humano, com um isotipo e subclasse específicos (por exemplo, IgA, IgGl ou IgG4). Esses anticorpos recombinantes podem então ser analisados para confirmar a atividade de neutralização de hCMV específica nos devidos ensaios.

O anticorpo monoclonal 26Al recombinante

humano foi produzido em células eucarióticas como um IgGl recombinante humano por clonagem do DNA codificando a cadeia pesada (Figura 7) e cadeia leve (Figura 8) em um vetor de expressão apropriado, que foi usado para transfectar células CHO em experimentos de expressão transitórios. O anticorpo monoclonal 26A1 recombinante humano foi purificado por afinidade por sobrenadantes de cultura de célula e analisado em diferentes ensaios para neutralização de hCMV. Os testes foram realizados com sistema de células AD169/HELF em ambos os ensaios de microneutralização e redução de placa. O anticorpo 5 monoclonal 26Al recombinante humano neutralizou, eficazmente a infectividade por hCMV de um modo comparável com o anticorpo 26A1 natural purificado com Proteína A com um IC50 calculado de aproximadamente 1 μg/mL (Figura 9). Também foram feitos testes em ensaios de neutralização e redução de placa 10 com base nas diferentes combinações de linhagens de hCMV e células alvo, todos confirmando a eficácia comparável do anticorpo monoclonal 26A1 humano, tanto natural como recombinante (Figura 10).

Portanto, o anticorpo 26Al na forma de anticorpo monoclonal humano, tanto natural como recombinante é um anticorpo que pode ser de utilidade na condução clínica de infecção por hCMV e de uma doença relacionada a hCMV.

Tabela 1

Linhagem hCMV Linha de célula Inibição de infecção Humana por hCMV usando sobrenadante de cultura de célula 26Ala ADl 69“ HELF H---I---I---h VRl 814° HELF ++ AL-Id HELF +++ VR1814C HUVEC ++++ a +, ++, +++ e ++++ corresponde a 20 a 40%, 41 a 60%, 61 a 80% e mais do que 80% de inibição de infecção por hCNMV, respectivamente

linhagem laboratorial de hCMV (proveniente de ATCC, código VR-538)

0 um derivado trópico de célula endotelial de um isolado clínico recuperado de um esfregaço cervical de uma mulher grávida infectada com hCMV (Revello M et al., 2001)

d derivado de um isolado clínico recuperado de

um fluido de lavagem bronco-alveolar de um receptor de transplante de pulmão infectado com hCMV (Luganini A et al., não publicado)

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Claims

1. Proteína, caracterizada por compreender uma seqüência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:8.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita proteína compreender ainda, SEQ ID NO:6e/ou SEQ ID NO: 7.

3. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela dita proteína compreender uma seqüência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 5.

4. Proteína, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, caracterizada pela dita proteína compreender ainda, uma ou mais seqüências selecionadas dentre o grupo que consiste d: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:13.

5. Proteína, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela dita proteína compreender uma seqüência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 10.

6. Proteína, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, caracterizada pela dita proteína ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo bioativo, ou uma proteína de fusão.

7. Proteína, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo dito anticorpo ser um anticorpo recombinante humano.

8. Proteína, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo dito anticorpo compreender uma cadeia pesada com uma seqüência de proteína pelo menos 90% idêntica com a SEQ ID NO: 15, e uma cadeia leve com uma seqüência de proteína pelo menos 90% idêntica com a SEQ ID NO: 17.

9. Proteína, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fragmento de anticorpo ser uma variável de heterodímero de cadeia pesada/leve, ou uma variável de fragmento de cadeia simples.

10. Proteína, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato da dita proteína ligar-se e neutralizar Citomegalovírus humano (hCMV).

11. Anticorpo IgGl humano caracterizado por ser secretado pela subcultura 26A1.

12. Proteína, caracterizada por competir com o anticorpo IgGl de acordo com a reivindicação 11, para ligação e neutralização de hCMV.

13. Proteína, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela dita proteína ser uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 9.

14. Ácido nucléico, caracterizada por codificar uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações precedentes.

15. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito ácido nucléico compreender uma seqüência que tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

16. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender adicionalmente uma seqüência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 9.

17. Vetor, caracterizado por compreender um ácido nucléico de acordo com quaisquer reivindicações 14 a 16.

18. Célula hospedeira procariótica ou eucariótica, caracterizada por compreender um ácido nucléico de acordo com quaisquer reivindicações 14 a 17.

19. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelas ditas células secretarem uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 12.

20. Uso de um ácido nucléico de acordo com quaisquer reivindicações 14 a 17, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado por ser para a produção de uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 12.

21. Uso de uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser para a preparação de uma composição, para detectar, tratar, inibir, prevenir e/ou melhorar a infecção por hCMV ou uma doença relacionada a hCMV.

22. Composição terapêutica, profilática ou de diagnóstico, para infecção por hCMV ou para uma doença relacionada a hCMV, caracterizada por compreender uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 12, ou um ácido nucléico de acordo com quaisquer reivindicações 14 a 17.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pela composição destinar-se a administração ocular ou tópica.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada por compreender ainda, um anticorpo de neutralização de hCMV diferente, uma preparação de imunoglobulina intravenosa e/ou um composto antiviral.

25. Método para tratamento, profilaxia, ou diagnose de infecção por hCMV, ou de uma doença relacionada a hCMV, caracterizado por compreender a administração de uma proteína de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 13, ou um ácido nucléico de acordo com quaisquer reivindicações 14 a 17.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por compreender ainda, a administração de um anticorpo de neutralização de hCMV diferente, preparação de imunoglobulinas intravenosas e/ou um composto antiviral.