PT2487187E - Anticorpos neutralizantes de citomegalovírus humano e sua utilização - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "Anticorpos neutralizantes de citomegalovírus humano e sua utilização"
CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a anticorpos possuindo especificidade para o citomegalovírus humano, adequadamente a anticorpos monoclonais possuindo essa especificidade e a células B imortalizadas que produzem tais anticorpos monoclonais. São aqui descritos os epitopos a que os anticorpos se ligam assim como a utilização dos anticorpos e dos epitopos em métodos de rastreio, bem como em diagnóstico, profilaxia e terapia de doenças.
ESTADO DA TÉCNICA 0 citomegalovírus humano (hCMV) é um patogénio amplamente distribuído que pode causar patologia grave em adultos imunossuprimidos e após infecção do feto e tem sido implicado em doenças crónicas tais como a aterosclerose. 0 hCMV infecta vários tipos celulares incluindo fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais e hematopoéticas [1]. Estirpes atenuadas propagadas in vitro de hCMV, que estão a ser desenvolvidas como vacinas candidatas, perderam o tropismo para células endoteliais, mantendo a capacidade de infectar fibroblastos [2]. Recentemente, foi mostrado que dois complexos de glicoproteínas virais controlam o tropismo celular do hCMV. É necessário um complexo de gH, gL e gO para infecção de fibroblastos, enquanto um complexo de gH, gL e proteína codificadas pelos genes UL131-UL128 são responsáveis pela infecção de células endoteliais, células epiteliais e células dendríticas [2-8].
Globulinas hiperimunes são já comercializadas para a profilaxia de doenças de hCMV associadas a transplante e provas recentes indicam que têm efeito terapêutico em mulheres grávidas [9]. Esta abordagem terapêutica está limitada pela baixa quantidade de anticorpo neutralizante que pode ser transferida e por esta razão a disponibilidade de anticorpos humanos (tais como anticorpos monoclonais humanos) com elevada capacidade de neutralização seria altamente desejável. No entanto, o alvo de anticorpos neutralizantes de hCMV ainda não foi estabelecido. Trabalhos anteriores identificaram gB e gH como potenciais alvos. No entanto, um anticorpo humanizado para gH (MSL 109) não apresentou qualquer efeito significativo num ensaio clínico [10,11]. Todos os anticorpos neutralizantes descritos até agora tinham baixa capacidade neutralizante uma vez gue neutralizam a infecção de hCMV apenas a concentrações elevadas. Por exemplo, o anticorpo MSL-109 apresentou uma actividade de neutralização de apenas 50% a uma concentração de 10 g/ml, um facto gue pode explicar a falta de um efeito in vivo [11]. A potência de neutralização de anticorpos anti-hCMV é tipicamente medida usando fibroblastos como células alvo. No entanto, sabe-se gue hCMV causa patologia através da infecção de outros tipos celulares, tais como células endoteliais, epiteliais e leucócitos. Não parece haver guaisguer anticorpos monoclonais disponíveis que sejam capazes de neutralizar com elevada potência a infecção de células alvo sem serem fibroblastos. Os anticorpos neutralizantes recentemente descritos para UL128 e UL130 mostraram também muito baixa potência na neutralização de infecção de células endoteliais [7].
Um anticorpo monoclonal humano contra CMV, designado SDZ MSL 109 é produzido pela linha celular de hibridomas EV 2-7 com o número de acesso na NCACC 85 100 803 [43].
Existe portanto a necessidade de produção de anticorpos neutralizantes contra hCMV, bem como a elucidação do alvo ao gual tais anticorpos se ligam.
DIVULGAÇÃO DO INVENTO O invento baseia-se na produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos gue neutralizam a infecção de hCMV, e que têm uma potência particularmente elevada na neutralização da infecção de hCMV. Tais anticorpos são desejáveis, uma vez que são necessárias apenas baixas concentrações para neutralizar uma dada quantidade de vírus. Isto facilita níveis mais elevados de protecção ao mesmo tempo que se administram menores quantidades de anticorpo.
Anticorpos monoclonais humanos e os clones de células B imortalizadas que segregam tais anticorpos estão também incluídos dentro do âmbito do invento.
Os inventores constataram que anticorpos dirigidos a uma combinação de UL130 e UL131A são particularmente eficazes na neutralização de hCMV. A combinação pode ser um complexo de UL130 e UL131A formando um epitopo reconhecido pelo anticorpo ou um anticorpo pode ser dirigido a uma de UL130 e UL131A, sendo a presença da outra proteína necessária para a especificidade.
Por conseguinte, o invento proporciona um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a citomegalovírus humano (hCMV), e que é específico para uma combinação das proteínas UL130 e UL131A do hCMV, sendo que a combinação forma o epitopo reconhecido pelo referido anticorpo ou fragmento de ligação, e que neutraliza a infecção de células endoteliais, células epiteliais, células da retina e células dendríticas por hCMV, em que o anticorpo ou fragmento compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuindo sequências de aminoácidos pelo menos 85% idênticas a SEQ ID NO:7 e 8, respectivamente, SEQ ID NO:17 e 18 respectivamente, SEQ ID NO:39 e 40 respectivamente ou SEQ ID NO: 49 e 18, respectivamente. O invento proporciona também um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a citomegalovírus humano (hCMV) e neutraliza a infecção de células endoteliais, células epiteliais, células da retina e células dendríticas por hCMV, e que é específico para uma combinação de proteínas UL130 e UL131A de hCMV, sendo que a combinação forma o epitopo reconhecido pelo referido anticorpo ou fragmento de ligação, em que o anticorpo ou fragmento (a) compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e 8 respectivamente, SEQ ID NO:17 e 18 respectivamente, SEQ ID NO:39 e 40 respectivamente ou SEQ ID NO:49 e 18 respectivamente; (b) compreende as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO:l, 2 e 3 respectivamente, e as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO:4, 5 e 6 respectivamente; (c) compreende as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO:11, 12 e 13 respectivamente, e as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO:14, 15 e 16 respectivamente; ou (d) compreende as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO:33, 34 e 35 respectivamente, e as sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO: 36, 37 e 38 respectivamente, para utilização num método de tratamento ou prevenção da infecção por hCMV.
Anticorpos do Invento 0 invento proporciona anticorpos monoclonais ou recombinantes possuindo potência particularmente elevada na neutralização de hCMV. 0 invento proporciona também fragmentos destes anticorpos recombinantes ou monoclonais, particularmente os fragmentos que retêm a actividade de ligação ao antigénio dos anticorpos, por exemplo que retêm pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) especifica para as proteínas UL130 e UL131A de hCMV.
Neste fascículo, por "elevada potência na neutralização de hCMV" entenda-se que uma molécula de anticorpo do invento neutraliza hCMV num ensaio padrão a uma concentração muito menor que os anticorpos conhecidos na técnica, por exemplo em comparação com MSL-109.
De preferência, a molécula de anticorpo do presente invento pode neutralizar a uma concentração de 0,16 pg/ml ou menor (i.e. 0,15, 0,125, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025, 0,02, 0,016, 0,015, 0,0125, 0,01, 0,0075, 0,005, 0,004 ou menor), de preferência 0,016 g/ml ou menor (uma concentração de anticorpo de 10~8 ou menor, de preferência 10~9 M ou menor, de preferência 10~10 M ou menor, i.e. 10-11 Μ, 10~12 Μ, 10~13 M ou menor). Isto significa que são necessárias apenas concentrações muito baixas de anticorpo para uma neutralização de 50% de um isolado clínico de hCMV in vitro em comparação com a concentração de MSL-109 necessária para neutralização do mesmo título de hCMV. De preferência, a concentração de anticorpo do invento necessária para 50% de neutralização da infecção de células endoteliais, células epiteliais e células dendríticas por um isolado clínico de hCMV é 50 vezes ou mais (i.e. 75, 100, 150, 200 ou mais) inferior à exigida por MSL-109. A potência pode ser medida usando um ensaio padrão de neutralização tal como descrito na técnica.
Os anticorpos do invento são capazes de neutralizar hCMV. Um anticorpo de acordo com o invento previne a infecção de células endoteliais. Preferivelmente, um anticorpo de acordo com o invento previne a infecção tanto de fibroblastos como de células endoteliais. Os anticorpos do invento previnem também a infecção de células dendríticas e células epiteliais tais como células da retina.
Estes anticorpos podem ser utilizados como agentes profilácticos ou terapêuticos após formulação apropriada, ou como ferramenta de diagnóstico.
Um "anticorpo de neutralização" é um gue pode neutralizar a capacidade desse patogénio para iniciar e/ou perpetuar uma infecção num hospedeiro. O invento proporciona um anticorpo monoclonal humano neutralizante, em gue o anticorpo reconhece um antigénio de citomegalovírus humano (hCMV).
De preferência, um anticorpo de acordo com o invento tem especificidade para uma combinação de UL130 e UL131A.
De preferência, um anticorpo de acordo com o invento é um anticorpo monoclonal agui referido como 1F11 ou 2F4. Estes anticorpos foram isolados inicialmente a partir de um dador infectado com hCMV, e são produzidos pelos clones de células B imortalizadas referidos como 1F11 ou 2F4. Tem-se mostrado gue estes anticorpos neutralizam a infecção por hCMV de células endoteliais, células epiteliais, células da retina e células dendríticas. Além disso, os anticorpos 5A2 e 9A11, isolados a partir de um dador infectado com hCMV diferente, apresentam a mesma especificidade para uma combinação de UL130 e UL131A e a capacidade para neutralizar a infecção por hCMV de células endoteliais, epiteliais, da retina e dendríticas. Estes anticorpos são produzidos pelos clones de células B imortalizadas referidos como 5A2 e 9A11, respectivamente. 1F11 consiste numa cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO: 7 e numa cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO:8. 2F4 consiste numa cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO: 17 e numa cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO:18. As CDR das cadeias pesadas dos anticorpos são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente. Semelhantemente, as CDR das cadeias leves dos anticorpos são referidas como CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente. As posições dos aminoácidos das CDR são definidas de acordo com o sistema de numeração de IMGT [12, 13, 14] como: CDR1 -Posições IMGT 27 a 38, CDR2 - Posições IMGT 56 a 65 e CDR3 -Posições IMGT 105 a 117. 5A2 consiste numa cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO: 39 e numa cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO:40.
As sequências de aminoácidos das CDR destes anticorpos são mostradas na Tabela 1.
0 anticorpo do invento compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuindo sequências de aminoácidos pelo menos 85% idênticas a SEQ ID NO:7 e 8, respectivamente, SEQ ID N0:17 e 18, respectivamente, SEQ ID NO:39 e 40, respectivamente, ou SEQ ID NO:49 e 18, respectivamente. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais (i.e. uma, duas ou as três) CDR da cadeia pesada de 1F11 ou 2F4 (SEQ ID NO: 1-3 ou 11-13) . O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais (i.e. uma, duas ou as três) CDR da cadeia pesada de 5A2 (SEQ ID NO:33-35).
Preferivelmente, um anticorpo de acordo com o invento compreende uma cadeia pesada compreendendo (i) SEQ ID NO:l para CDRH1, SEQ ID NO:2 para CDRH2 e SEQ ID NO:3 para CDRH3, ou (ii) SEQ ID NO: 11 para CDRH1, SEQ ID NO: 12 para CDRH2 e SEQ ID NO:13 para CDRH3. Um outro anticorpo preferido de acordo com o invento compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 33 para CDRH1, SEQ ID NO: 34 para CDRH2 e SEQ ID NO:35 para CDRH3. O anticorpo pode compreender uma cadeia leve compreendendo uma ou mais (i.e. uma, duas ou as três) CDR da cadeia leve de 1F11 ou 2F4 (SEQ ID NO: 4-6 ou 14-16) . O anticorpo pode compreender uma cadeia leve compreendendo uma ou mais (i.e. uma, duas ou as três) CDR da cadeia leve de 5A2 (SEQ ID NO:36-38).
Preferivelmente, um anticorpo de acordo com o invento compreende uma cadeia leve compreendendo (i) SEQ ID NO:4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 para CDRL2 e SEQ ID NO: 6 para CDRL3, ou (ii) SEQ ID NO:14 para CDRL1, SEQ ID NO: 15 para CDRL2 e SEQ ID NO:16 para CDRL3. Um outro anticorpo preferido de acordo com o invento compreende uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:36 para CDR1, SEQ ID NO:37 para CDRL2 e SEQ ID NO:38 para CDRL3.
Preferivelmente, um anticorpo de acordo com o invento compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:1 para CDRH1, SEQ ID NO:2 para CDRH2 e SEQ ID NO :3 para CDRH3, e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 para CDRL2 e SEQ ID NO: 6 para CDRL3; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:11 para CDRH1, SEQ ID NO: 12 para CDRH2 e SEQ ID NO: 13 para CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 14 para CDRL1, SEQ ID NO:15 para CDRL2 e SEQ ID NO:16 para CDRL3; ou (iii) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 33 para CDRH1, SEQ ID NO:34 para CDRH2 e SEQ ID NO:35 para CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 36 para CDRL1, SEQ ID NO: 37 para CDRL2 e SEQ ID NO: 38 para CDRL3.
De preferência, um anticorpo de acordo com o invento compreende uma cadeia pesada possuindo a sequência referida em SEQ ID NO: 7, 17 ou 39. De preferência um anticorpo de acordo com o invento compreende uma cadeia leve possuindo a sequência referida em SEQ ID NO:8, 18 ou 40.
Podem também existir moléculas de anticorpo híbridas que compreendem uma ou mais CDR de 1F11 e uma ou mais CDR de 2F4. Preferivelmente, estes anticorpos híbridos compreendem três CDR de 1F11 e três CDR de 2F4. Assim, os anticorpos híbridos preferidos compreendem i) as três CDR da cadeia leve de 1F11 e as três CDR da cadeia peasada de 2F4, ou ii) as três CDR da cadeia pesada de 1F11 e as três CDR da cadeia leve de 2F4. Em alternativa, estes híbridos podem conter uma ou mais CDR de 5A2 . O invento inclui também sequências de ácido nucleico codificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo do presente invento. Sequências de ácido nucleico preferidas de acordo com o invento incluem SEQ ID NO:9 (codificando a região variável de cadeia pesada de 1F11), SEQ ID NO:10 (codificando a região variável de cadeia leve de 1F11), SEQ ID NO:19 (codificando a região variável de cadeia pesada de 2F4), e SEQ ID NO:20 (codificando a região variável de cadeia leve de 2F4). As sequências de ácido nucleico preferidas codificando as várias CDR incluem SEQ ID NO:21 (codificando CDRH1 de 1F11), SEQ ID NO:22 (codificando CDRH2 de 1F11), SEQ ID NO: 23 (codificando CDRH3 de 1F11), SEQ ID NO:24 (codificando CDRL1 de 1F11), SEQ ID NO:25 (codificando CDRL2 de 1F11), SEQ ID NO:2 6 (codificando CDRL3 de 1F11), SEQ ID NO:27 (codificando CDRH1 de 2F4), SEQ ID NO:28 (codificando CDRH2 de 2F4), SEQ ID NO:29 (codificando CDRH3 de 2F4), SEQ ID NO:3 0 (codificando CDRL1 de 2F4), SEQ ID NO:31 (codificando CDRL2 de 2F4) e SEQ ID NO:32 (codificando CDRL3 de 2F4) . Outras sequências de ácido nucleico preferidas de acordo com o invento incluem SEQ ID NO:41 (codificando a região variável de cadeia pesada de 5A2), SEQ ID NO:42 (codificando a região variável de cadeia leve de 5A2), SEQ ID NO:43 (codificando CDRH1 de 5A2), SEQ ID NO:44 (codificando CDRH2 de 5A2), SEQ ID NO:45 (codificando CDRH3 de 5A2), SEQ ID NO: 4 6 (codificando CDRL1 de 5A2), SEQ ID NO:47 (codificando CDRL2 de 5A2), SEQ ID NO:48 (codificando CDRL3 de 5A2). Devido à redundância do código genético, existirão variantes destas sequências que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.
Anticorpos variantes estão também incluídos no âmbito do invento. Assim variantes das sequências referidas no pedido estão também incluídas no âmbito do invento. Tais variantes podem surgir devido à degenerescência do código genético, tal como mencionado acima. Alternativamente, variantes naturais podem ser produzidas devido a erros de transcrição ou tradução. É também aqui divulgada uma variante de 2F4. Esta variante compreende dois resíduos de serina adicionais na extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2F4 (SEQ ID NO: 17) . Assim, esta variante de 2F4 consiste numa cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO: 49 e numa cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos referida em SEQ ID NO:18. A sequência de ácido nucleico codificando a variante da cadeia pesada é referida em SEQ ID NO:50. Assim, anticorpos compreendendo a cadeia pesada variante de 2F4 (SEQ ID NO:49) estão incluídos no âmbito do invento.
Outras variantes das sequências de anticorpo possuindo afinidade melhorada podem ser obtidas utilizando métodos conhecidos na técnica e estão incluídas no âmbito do invento. Por exemplo, podem ser utilizadas substituições de aminoácidos para obter anticorpos com afinidade ainda melhor. Alternativamente, pode ser utilizada optimização de codões da sequência nucleotídica para melhorar a eficiência da tradução em sistemas de expressão para a produção do anticorpo.
Estas sequências de anticorpos variantes partilharão 85% ou mais (i.e. 85, 90, 95, 97, 98, 99% ou mais) de identidade da sequência com as sequências referidas no pedido. De preferência, tal identidade de sequência é calculada em relação a toda a sequência de referência (i.e. a sequência referida no pedido). De preferência, a percentaqem de identidade, tal como aqui referida, é tal como determinado utilizando BLAST versão 2.1.3 utilizando os parâmetros por defeito especificados pelo NCBI (o National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum matriz 62; penalização de intervalo aberto=ll e penalização de prolongamento de intervalo=l].
Ainda incluídos no âmbito do invento estão vectores, por exemplo vectores de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento. As células transformadas com tais vectores estão também incluídas no âmbito do invento. São também aqui descritos anticorpos monoclonais que se ligam a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal 1F11 ou 2F4. São também aqui descritos anticorpos monoclonais que se ligam a um epitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal 5A2.
Anticorpos monoclonais e recombinantes são particularmente úteis na identificação e purificação dos polipéptidos individuais ou outros antigénios contra os quais são dirigidos. Os anticorpos do invento têm uma utilidade adicional por poderem ser empregues como reagentes em imunoensaios, radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA). Nestas aplicações, os anticorpos podem ser marcados com um reagente analiticamente detectável tal como um radioisótopo, uma molécula fluorescente ou uma enzima. Os anticorpos podem também ser utilizados para a identificação e caracterização molecular (mapeamento de epitopos) de antigénios.
Os anticorpos do invento podem ser ligados a um fármaco para distribuição num local de tratamento ou ligados a um marcador detectável para facilitar a imagiologia de um local compreendendo células de interesse, tais como células infectadas com hCMV. Os métodos para ligação de anticorpos a fármacos e marcadores detectáveis são bem conhecidos na técnica, tal como o são métodos para imagiologia utilizando marcadores detectáveis. Os anticorpos marcados podem ser empregues numa ampla variedade de ensaios, empregando uma ampla variedade de marcadores. A detecção da formação de um complexo anticorpo-antigénio entre um anticorpo do invento e um epitopo de interesse (um epitopo de hCMV) pode ser facilitada através da ligação de uma substância detectável ao anticorpo. Meios de detecção adequados incluem a utilização de marcadores tais como radionuclideos, enzimas, coenzimas, substâncias fluorescentes, quimioluminescentes, cromogénios, substratos enzimáticos ou cofactores, inibidores de enzimas, complexos de grupos prostéticos, radicais livres, partículas, corantes e semelhantes. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, -galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína-diclorotriazinilamina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioactivo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Tais reagentes marcados podem ser usados numa variedade de ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, p. ex., ELISA, imunoensaios fluorescentes e semelhantes. Ver, por exemplo, referências 15-18.
Um anticorpo de acordo com o invento pode ser conjugado com uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico, ou um ião de metal radioactivo ou radioisótopo. Exemplos de radioisótopos incluem, mas não se limitam a, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111, e semelhantes. Tais conjugados de anticorpos podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica; a molécula do fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou um polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria.
As técnicas para conjugação de tal porção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Arnon et al., (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), págs 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," em Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), págs. 623-653; Thorpe (1985) "Antibodies Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. págs. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Itália, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibodies in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), págs. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158.
Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, tal como descrito na referência 19. Além disso, podem ser utilizados ligadores entre os marcadores e os anticorpos do invento [20] . Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, podem ser directamente marcados com iodo, índio, ítrio radioactivo ou outra partícula radioactiva conhecida na técnica [21] . O tratamento pode consistir numa combinação de tratamento com anticorpos conjugados e não conjugados administrados simultaneamente ou subsequentemente [22,23] .
Os anticorpos do invento podem ser ligados a um suporte sólido.
Além disso, os anticorpos podem ser modificados quimicamente através de conjugação covalente a um polímero para, por exemplo, aumentar a sua semivida em circulação. Polímeros preferidos e métodos para ligá-los aos péptidos são mostrados nas referências 24-27. Polímeros preferidos são polióis polioxietilados e polietilenoglicol (PEG). PEG é solúvel em água à temperatura ambiente e tem a fórmula geral: R (O-CH2-CH2) nO-R onde R pode ser hidrogénio, ou um grupo protector tal como um grupo alquilo ou alcanol. De preferência, o grupo protector tem entre 1 e 8 carbonos, de maior preferência é metilo. 0 símbolo n é um número inteiro positivo, de preferência entre 1 e 1000, de maior preferência entre 2 e 500. O PEG tem um peso molecular médio preferido entre 1000 e 40 000, de maior preferência entre 2000 e 20 000, ainda de maior preferência entre 3000 e 12 000. De preferência, PEG tem pelo menos um grupo hidroxilo, de maior preferência é um grupo hidroxilo terminal. É este grupo hidroxilo que é de preferência activado para reagir com um grupo amino livre no inibidor. No entanto, será entendido que o tipo e a quantidade dos grupos reactivos podem ser variados para alcançar um PEG/anticorpo covalentemente conjugado do presente invento.
Polióis polioxietilados solúveis em água são também úteis no presente invento. Incluem sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) e semelhantes. É preferido o POG. Uma razão é porque a estrutura de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma estrutura que ocorre naturalmente em, por exemplo, animais e humanos em mono, di e triglicéridos. Portanto, esta ramificação não seria necessariamente vista como um agente estranho no corpo. O POG tem um peso molecular preferido no mesmo intervalo que PEG. A estrutura para POG é apresentada na referência 28, e uma discussão de conjugados POG/IL-2 verifica-se na referência 24.
Outro sistema de distribuição de fármacos para aumentar a semivida em circulação é o lipossoma. Métodos de preparação de sistemas de distribuição de lipossomas são discutidos nas referências 29, 30 e 31. Outros sistemas de distribuição de fármacos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas referências 32 e 33.
Os anticorpos do invento são de preferência proporcionados na forma purificada. Tipicamente, o anticorpo estará presente numa composição que é substancialmente livre de outros polipéptidos, p. ex. em que menos de 90% (em peso), usualmente menos de 60% e mais usualmente menos de 50% da composição são compostos de outros polipéptidos.
Os anticorpos do invento podem ser imunogénicos em hospedeiros não humanos (ou heterólogos), p. ex. em ratinhos.
Em particular, os anticorpos podem ter um idiotopo que seja imunogénico em hospedeiros não humanos, mas não num hospedeiro humano. Anticorpos do invento para utilização humana incluem os que não podem ser obtidos a partir de hospedeiros tais como ratinhos, cabras, coelhos, ratos, mamíferos não primatas, etc. e não podem ser obtidos através de humanização ou de xeno-ratinhos.
Os anticorpos do invento podem ser de qualquer isotipo (e.g. IgA, IgG, IgM i.e. uma cadeia pesada , ou μ) , mas serão geralmente IgG. Dentro do isotipo IgG, os anticorpos podem ser da subclasse IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos do invento podem ter uma cadeia leve ou uma
Produção de anticorpos
Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser produzidos através de um dos métodos conhecidos na técnica. A metodologia geral para produzir anticorpos monoclonais utilizando tecnologia de hibridoma é bem conhecida [34, 35] . De preferência, é usado o método de imortalização de EBV alternativo descrito na referência 36.
Utilizando o método descrito na referência 36, células B produtoras do anticorpo do invento podem ser transformadas com EBV na presença de um activador de células B policlonais. A transformação com EBV é uma técnica padrão e pode ser facilmente adaptada para incluir activadores de células B policlonais.
Estimulantes de crescimento e diferenciação celulares adicionais podem ser adicionados durante o passo de transformação para melhorar ainda mais a eficiência. Estes estimulantes podem ser citocinas, tais como IL-2 e IL-15. Num aspecto particularmente preferido, IL-2 é adicionada durante o passo de imortalização para melhorar mais a eficiência da imortalização, mas a sua utilização não é essencial.
As células B imortalizadas produzidas usando estes métodos podem então ser cultivadas utilizando métodos conhecidos na técnica e anticorpos isolados a partir destas.
Os anticorpos monoclonais podem ainda ser purificados, se desejado, utilizando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos tais como HPLC ou cromatografia de afinidade. As técnicas para purificação de anticorpos monoclonais, incluindo técnicas de produção de anticorpos de grau farmacêutico, são bem conhecidas na técnica.
Os fragmentos dos anticorpos monoclonais do invento podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais através de métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou clivagem de pontes dissulfureto através de redução química. Alternativamente, fragmentos dos anticorpos monoclonais podem ser obtidos através de clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. "Fragmentos" de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. 0 invento engloba também fragmentos Fv de cadeia única (scFv) derivados das cadeias pesada e leve de um anticorpo monoclonal do invento p. ex. o invento inclui um scFv compreendendo as CDR de um anticorpo do invento. Estão também incluídos monómeros e dímeros de cadeias pesadas ou leves bem como anticorpos de cadeia única, p. ex. Fv de cadeia única em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve estão unidos através de um ligador peptídico. Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de ADN codificando os anticorpos ou fragmentos de anticorpo do presente invento. As sequências de ADN desejadas podem ser sintetizadas completamente ou parcialmente utilizando técnicas de síntese de oligonucleótidos. Podem ser utilizadas técnicas de mutagénese dirigida ao local e reacção em cadeia da polimerase (PCR) conforme apropriado.
Qualquer sistema de célula hospedeira/vector adequado pode ser usado para expressão das sequências de ADN codificando as moléculas de anticorpo do presente invento ou fragmentos destas. Sistemas bacterianos, por exemplo E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser utilizados, em parte, para expressão de fragmentos de anticorpo tais como Fab e F(ab')2, e especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia única, por exemplo, Fv de cadeia única. Podem ser utilizados sistemas de expressão de células hospedeiras eucarióticas, p. ex. de mamífero, para produção de moléculas de anticorpo maiores, incluindo moléculas de anticorpo completas. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, HEK293T, PER.C6, de mieloma ou hibridoma.
Uma molécula de anticorpo de acordo com o presente invento pode ser produzida através de um processo compreendendo a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector do presente invento sob condições adequadas conduzindo à expressão de proteína a partir de ADN codificando a molécula de anticorpo do presente invento, e isolamento da molécula de anticorpo.
Para produção de produtos compreendendo ambas as cadeias pesada e leve, a linha celular pode ser transfectada com dois vectores, um primeiro vector codificando um polipéptido de cadeia leve e um segundo vector codificando um polipéptido de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser utilizado um único vector, o vector incluindo sequências codificando polipéptidos da cadeia leve e da cadeia pesada.
Alternativamente, os anticorpos de acordo com o invento podem ser produzidos através de i) expressão de uma sequência de ácido nucleico de acordo com o invento numa célula, e ii) isolamento do produto anticorpo expresso. Adicionalmente, o método pode incluir iii) a purificação do anticorpo.
Rastreio e isolamento de células B Células B transformadas são rastreadas quanto às que são produtoras de anticorpos com a especificidade para o antigénio desejada, e os clones de células B individuais podem depois ser produzidos a partir das células positivas. 0 passo de rastreio pode ser realizado através de ELISA, através de coloração de tecidos ou células (incluindo células transfectadas), um ensaio de neutralização de um ou de vários outros métodos conhecidos na técnica para identificação da especificidade para o antigénio desejada. 0 ensaio pode seleccionar com base no simples reconhecimento do antigénio ou pode seleccionar numa base adicional de uma função desejada, p. ex. para seleccionar anticorpos neutralizantes, em vez de apenas anticorpos que se liguem ao antigénio, para seleccionar anticorpos que possam mudar as características de células alvo, tais como as suas cascatas de sinalização, a sua forma, a sua taxa de crescimento, a sua capacidade de influenciar outras células, a sua resposta à influência por outra células ou por outros reagentes ou por uma alteração das condições, o seu estado de diferenciação, etc. 0 passo de clonagem para separação de clones individuais a partir da mistura de células positivas pode ser realizado utilizando diluição limitante, micromanipulação, deposição de uma única célula através de separação de células ou outro método conhecido na técnica. De preferência, a clonagem é realizada utilizando diluição limitante.
Os clones de células B imortalizadas podem ser usados de vários modos, p. ex. como uma fonte de anticorpos monoclonais, como uma fonte de ácido nucleico (ADN ou ARNm) codificando um anticorpo monoclonal de interesse, para investigação, etc.
Uma composição pode compreender linfócitos B de memória imortalizados, em que os linfócitos produzem anticorpos com elevada potência neutralizante específica para hCMV, e em que os anticorpos são produzidos a >5 pg por célula por dia. Uma composição pode compreender clones de um linfócito B de memória imortalizado, em que os clones produzem um anticorpo monoclonal com uma elevada afinidade específico para hCMV, e em que o anticorpo é produzido a >10w ng por clone por dia. De preferência, os referidos clones produzem um anticorpo monoclonal com uma elevada potência de neutralização da infecção por hCMV.
Clones de células B imortalizadas preferidos de acordo com o invento são 2F4 e 1F11. Outros clones preferidos são 5A2 e 9A11.
Epitopos
Os anticorpos do invento podem ser utilizados para mapear os epitopos a que se ligam. Os Requerentes constataram que os anticorpos 1F11, 2F4, 5A2 e 9A11 que neutralizam a infecção de hCMV de células endoteliais, células epiteliais, células da retina e células dendríticas são dirigidos a um epitopo verificado numa combinação de UL130 e UL131A. Embora o Requerente não deseje ficar vinculado a esta teoria, acredita-se que os anticorpos 1F11 e 2F4 se ligam a um epitopo conformacional formado por essas duas proteínas. Acredita-se também que 5A2 e 9A11 se ligam também a um tal epitopo conformacional formado por UL130 e UL131A.
Devido ao facto de 1F11, 2F4, 5A2 e 9A11 não neutralizarem a infecção de fibroblastos, postula-se que estes anticorpos reconhecem um epitopo diferente dos anticorpos monoclonais humanos 10C6, 5F1, 6B4 e 7H3. Além disso, crê-se que os anticorpos monoclonais 10C6, 5F1, 7H3 e 6B4 se ligam a um epitopo funcional de gB.
Os epitopos reconhecidos por estes anticorpos podem ter várias utilizações. Os epitopos e mimotopos na forma purificada ou sintética podem ser utilizados para criar respostas imunitárias (i.e. como uma vacina, ou para a produção de anticorpos para outras utilizações) ou para o rastreio de soros de pacientes quanto a anticorpos que reajam imunologicamente com os epitopos ou mimotopos. De preferência, um tal epitopo ou mimotopo, ou antigénio compreendendo um tal epitopo ou mimotopo, é utilizado como vacina para a criação de uma resposta imunitária. Os anticorpos do invento podem também ser utilizados num método para monitorizar a qualidade de vacinas em particular para verificar que o antigénio numa vacina contém o epitopo imunogénico correcto na conformação correcta.
Os epitopos podem também ser úteis para o rastreio de ligandos que se ligam aos referidos epitopos. Tais ligandos bloqueiam de preferência os epitopos e assim previnem a infecção.
Expressão recombinante
Os linfócitos B de memória imortalizados aqui descritos podem também ser utilizados como fonte de ácido nucleico para a clonagem de genes de anticorpo para subsequente expressão recombinante. A expressão a partir de fontes recombinantes é mais comum para fins farmacêuticos que a expressão a partir de células B ou hibridomas, p. ex. por razões de estabilidade, reprodutibilidade, facilidade de cultura, etc.
Assim, um método para a preparação de uma célula recombinante pode compreender os passos de (i) obtenção de um ou mais ácidos nucleicos (p. ex. genes da cadeia pesada e/ou leve) a partir do clone de células B que codifica o anticorpo de interesse; e (ii) inserção do ácido nucleico num hospedeiro de expressão para permitir a expressão do anticorpo de interesse nesse hospedeiro.
De forma semelhante, um método para a preparação de uma célula recombinante pode compreender os passos de: (i) sequenciação do ácido ou ácidos nucleicos a partir do clone de células B que codifica o anticorpo de interesse; e (ii) utilização da informação da sequência do passo (i) para preparar o ácido ou ácidos nucleicos para inserção num hospedeiro de expressão para permitir a expressão do anticorpo de interesse nesse hospedeiro.
Um método de preparação de uma célula recombinante pode compreender o passo de transformação de uma célula hospedeira com um ou mais ácidos nucleicos que codifiquem um anticorpo monoclonal de interesse, em que os ácidos nucleicos são ácidos nucleicos que foram derivados de um clone de células B imortalizadas do invento. Assim, os procedimentos para primeiro preparar o ácido ou os ácido nucleicos e depois sua utilização para transformar uma célula hospedeira podem ser realizados em momentos diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (p. ex. em diferentes países).
Estas células recombinantes podem então ser utilizadas para fins de expressão e cultura. Elas são particularmente úteis para a expressão de anticorpos para produção farmacêutica em larga escala. Elas podem também ser usadas como o ingrediente activo de uma composição farmacêutica. Qualquer técnica de cultura adequada pode ser utilizada, incluindo, mas não se limitado a, cultura estática, cultura em frasco rolante, fluido de ascites, cartucho biorreactor do tipo fibra oca, minifermentador modular, tanque de mistura, cultura em microtransportador, perfusão em núcleo cerâmico, etc.
Os métodos para obtenção e sequenciação de genes de imunoglobulina a partir de células B são bem conhecidos na técnica, p. ex. ver referência 37. 0 hospedeiro de expressão é de preferência uma célula eucariótica, incluindo células de levedura e animais, particularmente células de mamífero (p. ex. células CHO, células humanas tais como células PER.C6 [Crucell; referência 38] ou HKB-11 [Bayer; referências 39 e 40], células de mieloma [41 & 42], etc.), bem como células vegetais. Os hospedeiros de expressão preferidos podem glicosilar o anticorpo do invento, particularmente com estruturas de hidratos de carbono que não sejam elas mesmas imunogénicas em humanos. Hospedeiros de expressão que possam crescer em meios isentos de soro são preferidos. Hospedeiros de expressão que possam crescer em cultura sem a presença de produtos de origem animal são preferidos. O hospedeiro de expressão pode ser cultivado para dar uma linha celular.
Um método para preparação de uma ou mais moléculas de ácido nucleico (p. ex. genes de cadeia pesada e leve) que codifiquem um anticorpo de interesse, pode compreender os passos de: (i) preparação de um clone de células B imortalizadas, tal como aqui descrito; (ii) obtenção a partir do clone de células B do ácido nucleico que codifica o anticorpo de interesse. Um método para obtenção de uma sequência de ácido nucleico que codifique um anticorpo de interesse, pode compreender os passos de: (i) preparação de um clone de células B imortalizadas tal como aqui descrito; (ii) sequenciação do ácido nucleico do clone de células B que codifica o anticorpo de interesse.
Um método de preparação de uma molécula ou de moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo de interesse, pode compreender o passo de obtenção do ácido nucleico a partir de um clone de células B que foi obtido a partir de uma célula B transformada como aqui descrito. Assim os procedimentos para primeiro obter o clone de células B e depois preparar o ácido ou os ácidos nucleicos a partir dele podem ser realizados a momentos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (p. ex. em paises diferentes).
Um método para preparação de um anticorpo (p. ex. para utilização farmacêutica) pode compreender os passos de: (i) obtenção e/ou sequenciação de um ou mais ácidos nucleicos (p. ex. genes de cadeia pesada e leve) a partir do clone de células B seleccionado expressando o anticorpo de interesse; (ii) inserção do ácido ou dos ácidos nucleicos em ou utilizando o ácido ou os ácidos nucleicos para preparar um hospedeiro de expressão que possa expressar o anticorpo de interesse; (iii) cultura ou subcultura do hospedeiro de expressão sob condições em que o anticorpo de interesse seja expresso; e, opcionalmente, (iv) purificação do anticorpo de interesse.
Um método de preparação de um anticorpo pode compreender os passos de: cultura ou subcultura de uma população de células hospedeiras de expressão sob condições em que o anticorpo de interesse seja expresso e, opcionalmente, purificação do anticorpo de interesse, em que a referida população de células hospedeiras de expressão foi preparada através de (i) proporcionar ácido ou ácidos nucleicos codificando um anticorpo de interesse de células B seleccionado que é produzido por uma população de linfócitos B de memória preparados tal como descrito acima, (ii) inserir o ácido ou os ácidos nucleicos num hospedeiro de expressão que possa expressar o anticorpo de interesse, e (iii) cultura ou subcultura de hospedeiros de expressão compreendendo os referidos ácidos nucleicos inseridos para produzir a referida população de células hospedeiras de expressão. Assim, os procedimentos para primeiro preparar o hospedeiro de expressão recombinante e depois cultivá-lo para expressar o anticorpo podem ser realizados em momentos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (p. ex. em paises diferentes).
Composições farmacêuticas A utilização de anticorpos como ingrediente activo de produtos farmacêuticos está agora generalizada, incluindo os produtos Herceptin™ (trastuzumab), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™ (Palivizumab), Zenapax™ (daclizumab), etc. 0 invento proporciona assim uma composição farmacêutica contendo os anticorpos do invento. São também aqui descritas composições farmacêuticas contendo ácido nucleico codificando tais anticorpos e/ou células B imortalizadas que expressam tais anticorpos e/ou os epitopos reconhecidos pelos anticorpos do invento. Uma composição farmacêutica pode também conter um transportador farmaceuticamente aceitável para permitir a administração. 0 transportador não deve induzir ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Transportadores adequados podem ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tais como proteínas, polipéptidos, lipossomas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inactivas.
Podem ser utilizados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes ou substâncias de tamponamento do pH, podem estar presentes em tais composições. Tais transportadores permitem gue as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líguidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente.
Formas preferidas de administração incluem formas adequadas para administração parentérica, p. ex. através de injecção ou infusão, por exemplo através de injecção de bolo ou infusão contínua. Quando o produto é para injecção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes da utilização com um líquido estéril apropriado.
Uma vez formuladas, as composições do invento podem ser administradas directamente ao sujeito. É preferido que as composições sejam adaptadas para administração a sujeitos humanos.
As composições farmacêuticas do presente invento podem ser administradas através de qualquer uma de várias vias incluindo, mas não se limitando à via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, entérica, sublingual, intravaginal ou rectal. Podem também ser utilizados hiposprays para administrar as composições farmacêuticas do invento. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões. Formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção podem também ser preparadas. A distribuição directa das composições será geralmente realizada através de injecção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou distribuída ao espaço intersticial de um tecido. As composições podem também ser administradas numa lesão. A dosagem de tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla. Os produtos farmacêuticos à base de anticorpos conhecidos proporcionam orientações relativas à frequência de administração, p. ex. se um produto farmacêutico deve ser distribuído diariamente, semanalmente, mensalmente, etc. A frequência e dosagem podem também depender da gravidade dos sintomas. As composições do invento podem ser preparadas de várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção podem também ser preparadas (p. ex. uma composição liofilizada, como Synagis™ e Herceptin™, para reconstituição com água estéril contendo um conservante). A composição pode ser preparada para administração tópica, p. ex. como uma pomada, um creme ou um pó. A composição pode ser preparada para administração oral, p. ex. como um comprimido ou uma cápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, p. ex. como um inalador, utilizando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, auricular ou ocular, p. ex. como gotas. A composição pode estar na forma de estojo, concebido de modo a que uma composição combinada seja reconstituída imediatamente antes da administração a um paciente. Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser fornecido em forma de estojo com água estéril ou um tampão estéril.
Será notado que o ingrediente activo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será susceptível de degradação no tracto gastrointestinal. Assim, se a composição for para administrar por uma via utilizando o tracto gastrointestinal, a composição terá de conter agentes que protejam o anticorpo contra a degradação, mas que libertam o anticorpo uma vez que este tenha sido absorvido a partir do tracto gastrointestinal.
Uma discussão aprofundada de transportadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 20a edição, ISBN: 0683306472.
As composições farmacêuticas do invento têm geralmente um pH entre 5,5 e 8,5, de preferência entre 6 e 8, e de maior preferência cerca de 7. O pH pode ser mantido através da utilização de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou isenta de pirogénios. A composição pode ser isotónica em relação a seres humanos. As composições farmacêuticas do invento são de preferência fornecidas em recipientes hermeticamente fechados.
As composições farmacêuticas incluirão uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos do invento, i.e. uma quantidade que seja suficiente para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição desejada, ou para exibir um efeito terapêutico detectável. São também aqui descritas composições farmacêuticas que incluem uma quantidade eficaz de uma ou mais células B imortalizadas aqui descritas e/ou um polipéptido compreendendo um epitopo que se liga a um anticorpo do invento. Efeitos terapêuticos incluem redução dos sintomas físicos. A quantidade eficaz exacta para qualquer sujeito em particular dependerá do seu tamanho e da sua saúde, da natureza e extensão da condição, e dos produtos terapêuticos ou da combinação de produtos terapêuticos seleccionados para administração. A quantidade eficaz para uma dada situação é determinada por experimentação de rotina e está no âmbito do julgamento de um clínico. Para fins do presente invento, uma dose eficaz será geralmente desde cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg das composições do presente invento no indivíduo a que é administrada. Os produtos farmacêuticos à base de anticorpos conhecidos proporcionam orientações a este respeito, p. ex. Herceptin™ é administrado através de infusão intravenosa de uma solução a 21 mg/ml, com uma dose de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal e uma dose de manutenção semanal de 2 mg/kg de peso corporal; Rituxan™ é administrado semanalmente a 375 mg/m2; etc.
As composições podem incluir mais do que um (p. ex. 2, 3, 4, 5, etc.) anticorpo do invento, particularmente quando tais anticorpos se ligam a diferentes antigénios (ou a diferentes epitopos no mesmo antigénio) para proporcionar um efeito terapêutico aditivo ou sinérgico. Por exemplo, um anticorpo pode ligar-se à combinação UL130-UL131A (ou complexo) enquanto outro pode ligar-se a gH. Num outro exemplo, um anticorpo pode ligar-se à combinação UL130-UL131A (ou complexo), enquanto outro pode ligar-se a gB. Assim, um anticorpo pode ser dirigido para o mecanismo que medeia a infecção de fibroblastos, enquanto o outro anticorpo pode ser dirigido para o mecanismo que medeia a infecção de células endoteliais. Para um efeito clinico óptimo pode bem ser vantajoso abordar ambos os mecanismos de infecção e manutenção de hCMV.
Os anticorpos do invento podem ser administrados (combinados ou separadamente) com outros produtos terapêuticos p. ex. com compostos quimioterapêuticos, com radioterapia, etc. Compostos terapêuticos preferidos incluem compostos antivirais, tais como ganciclovir, foscarnet e cidofovir. Tal terapia de combinação proporciona uma melhoria aditiva ou sinérgica da eficácia terapêutica em relação aos agentes terapêuticos individuais quando administrados sozinhos. 0 termo "sinergia" é usado para descrever um efeito combinado de dois ou mais agentes activos que é maior do que a soma dos efeitos individuais de cada respectivo agente activo. Assim, sempre que o efeito combinado de dois ou mais agentes resulta em "inibição sinérgica" de uma actividade ou de um processo, entenda-se que a inibição da actividade ou do processo é maior do que a soma dos efeitos inibidores de cada respectivo agente activo. 0 termo "efeito terapêutico sinérgico" refere-se a um efeito terapêutico observado com a combinação de duas ou mais terapias, em que o efeito terapêutico (medido através de qualquer um de vários parâmetros) é maior do que a soma dos efeitos terapêuticos individuais observados com as respectivas terapias individuais.
Os anticorpos podem ser administrados aos pacientes que não tenham mostrado anteriormente qualquer resposta a tratamento para infecção de hCMV, i.e. mostram ser refractários a tratamento anti-hCMV. Tal tratamento pode incluir tratamento prévio com um agente antiviral. Isto pode ser devido a, por exemplo, infecção com uma estirpe de hCMV resistente a antiviral.
Em composições do invento que incluem anticorpos do invento, os anticorpos constituem de preferência pelo menos 50% em peso (p. ex. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) da proteína total na composição. Os anticorpos estão assim na forma purificada.
Um método de preparação de uma composição farmacêutica pode compreender os passos de: (i) preparação de um anticorpo do invento; e (ii) mistura do anticorpo purificado com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
Um método de preparação de uma composição farmacêutica pode compreender o passo de mistura de um anticorpo com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de uma célula B transformada aqui descrita. Assim, os procedimentos para primeiro obter o anticorpo monoclonal e depois preparar a composição farmacêutica podem ser realizados a tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (p. ex. em diferentes países).
Como alternativa à distribuição de anticorpos ou células B para fins terapêuticos, é possível distribuir o ácido nucleico (tipicamente ADN) a um sujeito que codifica o anticorpo monoclonal (ou seu fragmento activo) de interesse, de modo a que o ácido nucleico possa ser expresso no sujeito in situ para proporcionar um efeito terapêutico desejado. Terapia génica adequada e vectores de distribuição de ácidos nucleicos adequados são conhecidos na técnica. São também aqui descritas composições imunogénicas, que de preferência são composições de vacina compreendendo um antigénio compreendendo um epitopo verificado numa combinação das proteínas de hCMV UL130 e UL131A. Composições alternativas podem compreender (i) um antigénio compreendendo um epitopo verificado numa combinação das proteínas de hCMV UL130 e UL131A, e (ii) um antigénio compreendendo um epitopo verificado na gB de hCMV. As vacinas podem ser profilácticas (i.e. para prevenir infecção) ou terapêuticas (i.e. para tratar infecção), mas serão tipicamente profilácticas.
As composições podem incluir um antimicrobiano, particularmente se embaladas num formato de dose múltipla.
As composições podem compreender detergente, p. ex. um Tween (polissorbato), tal como Tween 80. Os detergentes estão geralmente presentes a niveis baixos, p. ex. <0,01%.
As composições podem incluir sais de sódio (p. ex. cloreto de sódio) para dar tonicidade. Uma concentração de NaCl de 10±2 mg/ml é tipica.
As composições podem compreender um álcool de açúcar (p. ex. manitol) ou um dissacárido (p. ex. sacarose ou trealose), p. ex. em torno de 15-30 mg/ml (p. ex. 25 mg/ml), particularmente se forem para liofilizar ou se incluem material gue foi reconstituído a partir de material liofilizado. O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado a cerca de 6,1 antes da liofilização.
As composições agui descritas podem também compreender um ou mais agentes imunorreguladores. De preferência, um ou mais dos agentes imunorreguladores incluem um adjuvante.
As composições agui descritas desencadearão, de preferência, tanto uma resposta imunitária mediada por células como uma resposta imunitária humoral, para tratar eficazmente uma infecção de hCMV. Esta resposta imunitária induzirá de preferência anticorpos de longa duração (p. ex. de neutralização) e uma imunidade mediada por células, gue pode responder rapidamente após exposição a hCMV.
Tratamentos e utilizações médicos
Os anticorpos do invento ou seus fragmentos podem ser utilizados para o tratamento de infecção de hCMV, para a prevenção de infecção de hCMV ou para diagnóstico da infecção de hCMV.
Os métodos de diagnóstico podem incluir o contacto de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo com uma amostra. Tais amostras podem ser amostras de tecido retiradas, por exemplo, de glândulas salivares, pulmão, figado, pâncreas, rim, ouvido, olho, placenta, aparelho digestivo, coração, ovários, pituitária, supra-renais, tiróide, cérebro ou pele. Os métodos de diagnóstico podem também incluir a detecção de um complexo antigénio/anticorpo. (i) Um anticorpo de acordo com o invento, (ii) um clone de células B imortalizadas aqui descrito, (iii) um epitopo capaz de se ligar a um de 1F11 ou 2F4, ou (iv) um epitopo capaz de se ligar a um de 5A2 ou 9A11, pode ser para utilização em terapia.
Um método de tratamento de um paciente pode compreender a administração a esse paciente de (i) um anticorpo de acordo com o invento, (ii) um epitopo capaz de se ligar a um de 1F11 ou 2F4, ou (iii) um epitopo capaz de se ligar a um de 5A2 ou 9A11. (i) Um anticorpo de acordo com o invento, (ii) um clone de células B imortalizadas aqui descrito, (iii) um epitopo que se liga a um de 1F11 ou 2F4, (iv) um anticorpo que se liga a um epitopo capaz de se ligar a um de 1F11 ou 2F4, (v) um epitopo capaz de se ligar um de 9A11 ou 5A2, ou (vi) um anticorpo que se liga a um epitopo capaz de se ligar a um de 9A11 ou 5A2, pode ser utilizado no fabrico de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de infecção de hCMV.
Uma composição do invento pode ser para utilização como medicamento. Um anticorpo do invento e/ou uma proteína compreendendo um epitopo ao qual um tal anticorpo se liga podem ser utilizados no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente e/ou diagnóstico de um paciente. Um método para tratamento de um sujeito e/ou realização de diagnóstico num sujeito, pode compreender o passo de administração a este de uma composição do invento. 0 sujeito é de preferência um ser humano. Um modo de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve a monitorização dos sintomas da doença após a administração da composição do invento. 0 tratamento pode ser um programa de dose única ou um programa de múltiplas doses. Os anticorpos do invento são úteis para infecção de CMV.
De preferência, um anticorpo ou uma composição de acordo com o invento é administrado a grupos de sujeitos particularmente em risco de, ou susceptíveis a, infecção de hCMV. Tais grupos de sujeitos incluem sujeitos imunocomprometidos, tais como os que sofrem de HIV ou submetidos a terapia imunossupressora, tais como pacientes de transplantes.
Os anticorpos do invento podem ser utilizados em imunização passiva.
Os anticorpos e seus fragmentos, tal como descrito no presente invento, podem também ser utilizados num estojo para o diagnóstico de infecção de hCMV.
Os epitopos capazes de se ligar ao anticorpo monoclonal 1F11 ou 2F4 aqui descrito podem ser utilizados num estojo para monitorização da eficácia dos procedimentos de vacinação através da detecção da presença de anticorpos anti-hCMV protectores.
Os epitopos capazes de se ligar ao anticorpo monoclonal 5A2 e 9A11 aqui descrito podem ser utilizados num estojo para monitorizar a eficácia dos procedimentos de vacinação através da detecção da presença de anticorpos anti-hCMV protectores.
Os anticorpos e seus fragmentos tal como aqui descritos podem também ser usados num estojo para a monitorização do fabrico de vacinas com a imunogenicidade desejada.
Um método de preparação de uma composição farmacêutica pode compreender o passo de mistura de um anticorpo monoclonal com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de um hospedeiro de expressão do invento. Assim, os procedimentos para primeiro a obtenção do anticorpo monoclonal (p. ex. a sua expressão e/ou purificação) e depois a sua mistura com o ou os transportadores farmacêuticos podem ser realizados em tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (p. ex. em países diferentes).
Começando com uma célula B transformada aqui descrita, os vários passos de cultura, subcultura, clonagem, subclonagem, sequenciação, preparação de ácido nucleico, etc., podem ser realizados de modo a perpetuar o anticorpo expresso pela célula B transformada, com optimização opcional em cada passo. Numa concretização preferida, os métodos acima compreendem ainda técnicas de optimização (p. ex. maturação de afinidade ou optimização) aplicadas aos ácidos nucleicos codificando o anticorpo. As células, os ácidos nucleicos, os vectores, as sequências, os anticorpos, etc. podem ser utilizados e preparados durante tais passos.
Em todos estes métodos, o ácido nucleico utilizado no hospedeiro de expressão pode ser manipulado entre os passos (ii) e (iii) para inserir, eliminar ou alterar certas sequências de ácido nucleico. As mudanças de tal manipulação incluem, mas não se limitam a, mudanças para introduzir locais de restrição, alterar a utilização dos codões, adicionar ou optimizar sequências reguladoras da transcrição e/ou tradução, etc. É também possível modificar o ácido nucleico para alterar os aminoácidos codificados. Por exemplo, pode ser útil introduzir uma ou mais (p. ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substituições de aminoácidos, uma ou mais (p. ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) supressões de aminoácidos e/ou uma ou mais (p. ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.j inserções de aminoácidos na sequência de aminoácidos do anticorpo. Tais mutações pontuais podem modificar as funções efectoras, a afinidade de ligação ao antigénio, modificações pós-tradução, a imunogenicidade etc., podem introduzir aminoácidos para a ligação de grupos covalentes (p. ex. marcadores) ou pode introduzir etiquetas (p. ex. para fins de purificação) . As mutações podem ser introduzidas em locais específicos ou podem ser introduzidas de forma aleatória, seguido por selecção (p. ex. evolução molecular).
Geral 0 termo "compreendendo" engloba "incluindo" bem como "consistindo" p. ex. uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, p. ex. X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" p. ex. uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição do invento. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%. 0 termo "doença" tal como aqui é utilizado destina-se a ser geralmente sinónimo, e é utilizado alternadamente com o termo "distúrbio" e "condição" (tal como em condição médica), por todos reflectirem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma das suas partes que prejudica o funcionamento normal, ser tipicamente manifestada através de sinais e sintomas distintivos, e fazer com que o ser humano ou animal tenha uma duração ou qualidade de vida menor.
Tal como aqui utilizada, a referência a "tratamento" de um paciente destina-se a incluir prevenção e profilaxia. 0 termo "paciente" significa todos os mamíferos incluindo seres humanos. Exemplos de pacientes incluem seres humanos, vacas, cães, gatos, cavalos, cabras, ovelhas, porcos e coelhos. De preferência, o paciente é um ser humano.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um SDS-PAGE que demonstra que os anticorpos monoclonais humanos (1) 1F11 e (2) 2F4 precipitam complexos de proteínas de hCMV, enquanto IgG irrelevante não. A Figura 2 mostra uma análise FACS que demonstra que os anticorpos monoclonais humanos (A) 1F11 e 2F4 e (B) 5A2 e 9A11 reconhecem um epitopo conformacional constituído pelos produtos génicos UL130 e UL131A. A Figura 3 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos das cadeias pesada e leve de 1F11 e 2F4. As sequências de CDR estão a negrito. A Figura 4 mostra uma análise FACS que demonstra que os anticorpos monoclonais humanos 7H3, 10C6, 5F1 e 6B4 reconhecem um epitopo na proteína gB de hCMV. A Figura 5 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos das cadeias pesada e leve de 5A2. As sequências de CDR estão a negrito.
MODOS DE REALIZAÇÃO DO INVENTO
Exemplo 1: Clonagem de células B e rastreio da actividade neutralizante de hCMV
Foram identificados dois dadores com elevados títulos de anticorpos neutralizantes de hCMV no soro. Células B de memória foram isoladas e imortalizadas utilizando EBV e CpG, tal como descrito na referência 36. Resumidamente, células B de memória foram isoladas através de selecção negativa utilizando contas de CD22, seguido de remoção de células B IgM+, IgD+, IgA+, utilizando anticorpos específicos e separação de células. As células separadas (IgG+) Foram imortalizadas com EBV na presença de CpG 2006 e células mononucleares alogeneicas irradiadas. Foram criadas culturas replicadas, cada uma contendo 50 células B de memória em vinte placas de 96 poços de fundo em U. Após duas semanas os sobrenadantes das culturas foram recolhidos e testados quanto à sua capacidade para neutralizar infecção de hCMV tanto de fibroblastos como de células epiteliais em ensaios separados. Clones de células B foram isolados a partir de culturas policlonais positivas tal como descrito na referência 36. As concentrações de IgG no sobrenadante dos clones seleccionados foram determinadas utilizando um ELISA específico de IgG.
Para o ensaio de neutralização virai, uma quantidade titulada de um isolado clínico de hCMV foi misturada com igual volume de sobrenadante de cultura ou com diluições de soro humano contendo anticorpos neutralizantes. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, a mistura foi adicionada a monocamadas confluentes de células endoteliais (p. ex. células HUVEC) ou fibroblastos em placas de 96 poços de fundo raso e incubou-se a 37°C durante dois dias. 0 sobrenadante foi descartado, as células foram fixadas com metanol frio e coradas com uma mistura de anticorpos monoclonais de ratinho para antigénios iniciais de hCMV, seguido de um anticorpo de cabra anti-Ig de ratinho marcado com fluoresceína. As placas foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência.
Na ausência de anticorpos neutralizantes, as células infectadas foram 1000/campo, enquanto que na presença de concentrações saturantes de anticorpos neutralizantes, a infecção foi completamente inibida. 0 título de neutralização é indicado como sendo a concentração de anticorpo (pg/ml) que proporciona uma redução de 50% da infecção de hCMV. A Tabela 2 mostra que foram identificados três tipos diferentes de anticorpos. Aqueles que podem neutralizar a infecção de fibroblastos, aqueles que podem neutralizar a infecção de células endoteliais e aqueles que podem neutralizar a infecção de ambos. Isto está de acordo com dados anteriores de que diferentes proteínas são responsáveis por tropismo para um determinado tipo de célula [7]. Além da neutralização de células endoteliais, observou-se que 1F11 e 2F4 neutralizam a infecção de células epiteliais, tais como células da retina, e de células dendríticas (dados não mostrados).
* Sem neutralização na concentração mais elevada testada (i.e. >2 yg/ml). Λ Cytotect (Biotest) é um banco de IgG hiperimune de hCMV.
Alguns anticorpos neutralizaram a infecção tanto dos fibroblastos como das células endoteliais a concentrações de IgG variando de 0,3 a 0,5 pg/ml. Outros anticorpos (1F11, 5A2, 9A11 e 2F4) não conseguiram neutralizar a infecção de hCMV de fibroblastos, mas neutralizaram a infecção de células endoteliais e fazem-no a concentrações extremamente baixas variando de 0,001 a 0, 004 g/ml (mais de 1000 vezes mais potente do que os anticorpos anteriormente conhecidos).
Note-se que desde a caracterização inicial, foi determinado que 5F1 se liga a um epitopo de gB em vez de gH.
Isto é consistente como os resultados que demonstram que o bloqueio de gB permite a neutralização de infecção de fibroblastos tal como observado para 7H3, 10C6 e 6B4.
Exemplo 2: Identificação dos antigénios alvo reconhecidos pelos anticorpos monoclonais
Fibroblastos MRC-9 humanos foram infectados com um isolado clínico de hCMV. Após 3 dias, as células foram marcadas metabolicamente com Metionina e Cisteína com 35S.
Após depuração prévia do lisado foram adicionados anticorpos monoclonais humanos 1F11 e 2F4 e os imunocomplexos foram precipitados através da adição de contas de Proteína A e resolvidos em SDS-PAGE (Figura 1) . Um anticorpo IgG monoclonal humano com especificidade irrelevante foi utilizado como controlo negativo. Os resultados mostram que os anticorpos monoclonais humanos 1F11 e 2F4 precipitam complexos de proteínas de CMV.
Para mapear a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos, foram construídos vectores de expressão codificando as proteínas de hCMV UL128 1-27, UL130 1-25 e UL131A 1- etiquetadas com hemaglutinina (HA) sem péptidos sinal. Células HEK293T foram transfectadas com estes vectores, isoladamente ou em combinação. Após 36 h, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo anti-HA (para controlo da eficiência da transfecção) e com os anticorpos monoclonais, seguido por um de cabra anti-IgG humana. Um IgG HuMab com especificidade irrelevante foi utilizado como controlo negativo. A Figura 2A mostra que os anticorpos monoclonais humanos 1F11 e 2F4 reconhecem um epitopo conformacional produzido pelos produtos génicos UL130 e UL131A. A Figura 2B mostra que os anticorpos monoclonais humanos 5A2 e 9A11 reconhecem um epitopo conformacional produzido pelos produtos génicos UL130 e UL131A.
Conclusões
Os resultados acima definem dois anticorpos monoclonais humanos que são capazes de neutralizar com elevada potência e selectividade a infecção de hCMV de células endoteliais humanas. Para identificar o epitopo reconhecido, os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para imunoprecipitar proteínas de células infectadas com hCMV (Figura 1) . Os mAb 1F11 e 2F4 humanos precipitaram várias proteínas com pesos moleculares aparentes de 15, 33-35 e 100 KDa. Estes padrões são compatíveis com a precipitação de um complexo contendo gH, gL e UL128, UL130 e possivelmente UL131A.
Para melhor definir o alvo destes anticorpos caracterizámos a sua capacidade de corar células HEK293T transfectadas com vectores codificando UL128, UL130 e UL131A etiquetadas com HA. Tal como mostrado na Figura 2A, 1F11 e 2F4 coraram apenas células co-expressando UL130 e UL131A, sugerindo que reconhecem um epitopo conformacional determinado pelos dois produtos génicos. Esta conclusão é apoiada pelo facto de estes anticorpos não reagirem num western blot com lisados de células infectadas ou transfectadas executados sob condições redutoras, desnaturantes (dados não mostrados).
Resultados semelhantes foram observados para 5A2 e 9A11. A Figura 2b mostra que estes anticorpos coraram apenas células co-expressando UL130 e UL131A, sugerindo que reconhecem um epitopo conformacional determinado pelos dois produtos génicos.
Exemplo 3: Posterior identificação dos antigénios alvo reconhecidos pelos anticorpos monoclonais
Para mapear as especificidades de anticorpos monoclonais humanos que neutralizam a infecção de fibroblastos, foi construído um vector de expressão codificando gB inteira. Células HEK293T foram transfectadas com este vector. Após 36 h, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com anticorpos monoclonais humanos (HuMab) seguido de anticorpo de cabra anti-IgG humano. A Figura 4 mostra que os anticorpos monoclonais 7H3, 10C6, 5F1 e 6B4 (mas não um anticorpo IgG com especificidade irrelevante) coraram especificamente células transfectadas com gB, indicando que reconhecem um epitopo de gB. Note-se que os anticorpos monoclonais 10C6, 5F1 e 6B4 neutralizam a infecção de fibroblastos e células endoteliais, enquanto o anticorpo monoclonal 7H3 neutraliza a infecção de fibroblastos (mas não de células endoteliais). Esta noção sugere que os anticorpos monoclonais 10C6, 5F1, e 6B4 se ligam a um epitopo funcional de gB, que é distinto do epitopo ao qual se liga o anticorpo monoclonal 7H3.
Será entendido que o invento foi descrito meramente a título de exemplo.
REFERÊNCIAS
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> HUMABS LLC
<120> ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE CITOMEGALOVÍRUS HUMANO E SUA UTILIZAÇÃO
<130> P045812WO <150> GB 0700133.2 <151> 2007-01-04 <160> 50 <170> SeqWin99, versão 1.02
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Ala Arq Glu Glu Leu Vai Gly Ceu Met Pro Pro Tyr Tyr fisn Tyr Gly 1 5 10 15
Lsu Asp Vai
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Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Phe 1 5
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Gin V3I Gin. Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10' 15
Ser Vai Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Plie Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 30 40 Cl
Ser Leu lie Ser Fhe Asp Gly Asp Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai S0 ’ "55 50
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 5er Ser Gin Lys Thr Leu Phe 65 70 75 00
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arq Val Glu Asp Thr Ala Lie Tyr Tyr Cys 35 BO 95
Ala Art) Glu Glu Leu Val Gly Leu Met Pro Pro Tyr Tyr Asr. Tyr Gly loo 105 no
Leu Asp Val Trp Gly Glr_ Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
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Gin Ser Val Leu Thr Gin Fro Pro 3er Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15
Lya Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30
Fh-e Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 'i:hr Ala Fro Lys Leu Leu 35 4 C 45
Tie Tyr Asp Asn Asp Ary Arg Pro Ser Gly lie Pro Aep Arg ?he Ser 50 55 GO
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Val lie Thr Gly Leu Gin
55 70 75 BO
Thr- Gly Asp Glu Al.a Asp Tyr Tyr Cys Glu Tlir Trp Asp Gly Ser T.au 05 90 95
Asti Pro Ala Val Val Fhe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu i no 105 no
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(jagçtgeage tggtygagtc tygggga.ggc ytggrcoage ctggyaggtc cgtgagactc CO tcctgtytgy cctctggatt caccttuagt tcctatgcta tgcaotgggt ceyccaggeL 1Ξ0
ccgçgcaagg ggctggaatg ggtgtcactt atatcctttg atggagacaa taaatactat 1BQ gcagactucy tyagyyyccg attcacEiatc tune gag are gttucuayas. gecgcl uttt 210 ct.gcaaatga a cagccr.gag agttgaggac acgrr.tatat attactgt.gr: gagagaggag 300 ttaytcggat tgatgcctcc ctactauaat tatcgtttgy acgtctgggg ucaaggyacc 3S0
acggtcaccg tctcctca 37G
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cagtctgtgt tgacgcagcc yccctcagtg tcLgcggcce caggacagaa ggtcaccatc 6C tcctgctctg gaagcagctc caanattgga aat.aattttg tatcctggta ccagcaactc .120
cccggaacag ccctcaaaci, cetcatttat qacaatgais gg^gacectt: agggattcct ISO gacccattcjL ctggctccaa gtc.tgacacg tcagccancc tggtcatcac. cggactccag 240 actgçggacg aggccgatta ctactgcgaa aaatgggatg gcagcctgaa tcctgctgtg 300 gtattcggcg gagggaccag gctgaecgtc cta 333
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Gly phe Ser Phe Asn Thr Tyr Gly 1 5
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Ils Trp Asp ftsp Giy Ser lyg Met i 5
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Ala Arg Asp Glu Gly Ala lie Mat teu His Ala Met Thr Aap Tyr Gly
1 5 10 IS
Leu Asp Vai
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Gin Asp Ser 1
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Gin Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala His 'lyr val 1 5 10
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Gin Val Gin Leu Val Glu Sen Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg I.eu Ser Cys A .Is Ale Ser Gly Php. Ser Phe Asn Thr Tyr 20 25 " 30
Gly Mat His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Giy Leu Gin Trp Val 35 40 Ί 5
Ala Val lie Trp Asp Asp Gly Ser Lys Met Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 SO
Lys Giy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asr_ Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
S5 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr A.la Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Glu Gly Ala lie Met Leu His Ala Met Thr Asp Tyr Gly 100 105 110
Leu Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120
<210 > 18 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2F4 <400> 18
Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ser Pro Gly Gin 15 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn leu Gly Asp Glu Phs Ala 30 25 30
Cys Trp Tyr Gin Girt Lys Pro Gly Gin Ser Pro Vai Leu Vai lie Tyr 35 43 45
Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 G0
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Us Arg Gly Thr Gin Ala Met 6b 70 75 BC- Ακρ Glu Ala Asp Tyr Tyr: Cys Glu Ala Trp Asp Ser Ser: Thr Ala His 85 90 95
Tyr Vai Phe Sly Thr Gly Thr Lys Vai Thr vai Leu 100 105
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caggtgeaçc tggtggagLc Lgggggaggc çtgytccagc ctgggaggtc ccLgagaclc ÉO tcctgtgoag cgtntggatt eagttírcaat acatatggga tgcactgggt cegccaggct 120
ccaggcaaçg ggctggagtg ggtggcsgtt atatgggatg atgçaagtaa aatçtaccat 1BQ 'J1 'j'J-: i.gaayyycug -ill'1. :.-)I :: I ccagayans :: —I- H¢---:-:-1 (Ji 240 ctccaaatga acagtr.tgag agncgaggat arrggctgt.gt·. atr.act.gtgc gsgagacgag 300 ggtgcaetaa tgetguacgc catgaetgac lacggttxçg acgtctgggg ecaagggacc: 360 acagtcaccg tct 373
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<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência nucleotidica de CDRH1 de 1F11 <400> 21 ggattcacct tcagttccta tgct 24
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Gly Gly Thr Ehe Ser Ser Tyr Vai 1 5
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He lie Pro He Phe Asr. Thr Ala 1 5
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Ala Arg Asp Phc Leu Ser Gly Pro Met Glu Met Pro Sly Sly Tyr Tyr IE 10 lb
Gly Leu Asp Val 27
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Gin Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn tys Ann Tyr 1 5 10
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Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro lie Thr 1 5
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Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 10 15
Ser Val lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Sec Tyr 20 25 30
Val lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Mst 35 '10 15
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Asn Thr Ala Asn, Tyr Ala Gin Lys Val 50 55 GO
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
55 70 75 BC
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys B5 33 35
Ala Arg Asp Phe Leu Ser Gly Pro Met Glu Met Pro Gly Gly Tyr Tyr 1.00 105 110
Gly Lou Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
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Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 3er Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ssr Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gl.n Glu Lys Pro Gly Glu 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 " 55 GO
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tvr Tyr Cys Gin Gin 95 90 " 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie 1.00 1 05 110
Lys
<210> 41 <211> 381 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência nucleotídica da cadeia pesada de 5A2 <4 Ο Ο > 41 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcatgg cttct.ggagg caccttcagc agctatgtta tccactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatggggggg atcatcccta tctttaatac agcaaactac 130 gcaeeg&agg tccagggcag agi canga tt anuyr.ggacij aatcnacgag cacagcctac 2L:0 atggsgctga gcagcctgag atctgaagac actçccatat attact.gtgc gagggatttt ΊΟΟ ctatcaggtc ctatggaaat gcccggcgqc tactacggtl tgyacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctc.ctc a 3B1
<210> 42 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência nucleotídica da cadeia leve de 5A2 <400> 42 gacatcgtga tgacccaçtc tccagactcc ctygctgtgt ctetgggcga gagggc;cacc 60 atcaactgca agtccagcca gagLgtttta tacagtteca acaataagaa etacttagct 120 tggtE.ccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgq 1B0 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 ateageagee tgcaggctga aga.tgt.çgca gttt.at.tact gtcagcaata ttatagtact 300 cctatcacct tcgqccaaqg gacacgactg gagattaaa 339
<210> 43 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência nucleotídica de CDRH1 de 5A2 <400> 43 ggaggcacct teageageta tgtt 24
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Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr lyr 20 25 30
Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 4 0 45
Ala Vai lie Trp Asp Asp Gly Ser l-y3 Met Tyr His Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ils Ser Arg Asp Ann. Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 00
Leu Gin Me-t Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 9θ" 55
Ala Arg Asp Glu Gly Ala IIe Met Leu His Ala Met Thr Asp Tyr Gly 100 105 110
Leu Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 1.20 12S
<210> 50 <211> 378 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência nucleotidica da cadeia pesada de 2F4 variante <400> 50 eaggtgcagc tggLggaqtc tgggggaggc gtygtceaçc etgygaggLe cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt cagtítcaat acatatggga tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatgççatg atggaagtaa aatgtaccat 180 gcygauLecg tyaaggyucy at tracestc Lccagagaua a f. Lccaaaaa cacactytat 240 r.hccaaatgs acagtntgag agnegaggar, acggct.gtgh att.actgtgc gagagacrgag 300 ggtgcaataa tgctgcacgc catçactyac Lacygtttgg aegtctgggg ucaagggacu 350 acaqtcaccg tctectca 376
Lisboa, 2015-01-19

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a citomegalovirus humano (hCMV), e que é especifico para uma combinação das proteínas UL130 e UL131A de hCMV, sendo que a combinação forma um epitopo reconhecido pelo referido anticorpo ou fragmento de ligação, e que neutraliza a infecção de células endoteliais, células epiteliais, células da reina e células dendríticas por hCMV, em que o anticorpo ou fragmento compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuindo sequências de aminoácidos pelo menos 85% idênticas a SEQ ID NO: 7 e 8 respectivamente, SEQ ID N0:17 e 18 respectivamente, SEQ ID NO:39 e 40 respectivamente ou SEQ ID NO:49 e 18 respectivamente.
  2. 2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 1 em que o anticorpo compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:l para CDRH1, SEQ ID NO:2 para CDRH2 e SEQ ID NO:3 para CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 para CDRL2 e SEQ ID NO: 6 para CDRL3; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:11 para CDRH1, SEQ ID NO:12 para CDRH2 e SEQ ID NO: 13 para CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 14 para CDRL1, SEQ ID NO: 15 para CDRL2 e SEQ ID NO:16 para CDRL3; ou (iii) uma cadeia pesada compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO: 33 para CDRH1, SEQ ID NO: 34 para CDRH2 e SEQ ID NO: 35 para CDRH3 e uma cadeia leve compreendendo um polipéptido com SEQ ID NO:36 para CDRL1, SEQ ID NO:37 para CDRL2 e SEQ ID NO:38 para CDRL3.
  3. 3. Anticorpo ou fragmento da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, em que o referido anticorpo ou fragmento se liga a um epitopo conformacional formado pelas proteínas UL130 e UL131.
  4. 4. Anticorpo ou fragmento de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo de cadeia única, Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou scFV.
  5. 5. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores.
  6. 6. Vector de expressão compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5.
  7. 7. Célula transformada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 6.
  8. 8. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações 1-4 e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitáveis.
  9. 9. Composição farmacêutica da reivindicação 8, compreendendo ainda um segundo anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que neutraliza a infecção por hCMV.
  10. 10. Composição farmacêutica da reivindicação 8 compreendendo um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio como definido na reivindicação 1, e um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a uma proteína gH de hCMV ou uma proteína gB de hCMV.
  11. 11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, para utilização num método de tratamento ou prevenção de infecção por hCMV.
  12. 12. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga a citomegalovírus humano (hCMV) e neutraliza a infecção de células endoteliais, células epiteliais, células da retina e células dendríticas por hCMV, e que é específico para uma combinação de proteínas UL130 e UL131A de hCMV, sendo que a combinação forma o epitopo reconhecido pelo referido anticorpo ou fragmento de ligação, em que o anticorpo ou fragmento (a) compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e 8 respectivamente, SEQ ID NO:17 e 18 respectivamente, SEQ ID NO: 39 e 40 respectivamente ou SEQ ID NO: 49 e 18 respectivamente; (b) compreende sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO: 1, 2 e 3 respectivamente, e sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO: 4, 5 e 6 respectivamente; (c) compreende sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente, e sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou (d) compreende sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia pesada tal como expostas em SEQ ID NO: 33, 34 e 35 respectivamente, e sequências de CDR 1, 2 e 3 da cadeia leve tal como expostas em SEQ ID NO: 36, 37 e 38 respectivamente, para utilização num método de tratamento ou prevenção de infecção por hCMV.
  13. 13. Método para a produção de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 compreendendo (i) a cultura de uma célula de acordo com a reivindicação 7 e (ii) o isolamento de anticorpos. Lisboa, 2015-01-19
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