CN101657467B - 人类巨细胞病毒中和抗体及其用途 - Google Patents

人类巨细胞病毒中和抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对人类巨细胞病毒具有特异性并以高亲和力结合的中和抗体以及产生这种抗体的无限增殖化B细胞。发明的抗体还具有中和感染的高效力。本发明还涉及所述抗体所结合的表位的表征以及所述抗体和所述表位在筛选方法以及疾病的诊断和治疗中的用途。

Description

人类巨细胞病毒中和抗体及其用途
本文引用的所有文件通过引用全文并入。
技术领域
本发明涉及对人类巨细胞病毒具有特异性的抗体、具有这一特异性的合适的单克隆抗体和产生这种单克隆抗体的无限增殖化B细胞。本发明还涉及所述抗体所结合的表位以及所述抗体和所述表位在筛选方法以及疾病的诊断、预防和治疗中的用途。
背景技术
人类巨细胞病毒(hCMV)是一种广泛分布的病原体，其可在免疫抑制的成人中以及感染胎儿时导致严重的病状并且与慢性疾病例如动脉粥样硬化相关。hCMV感染包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和造血细胞在内的多种细胞类型[1]。正在被开发为候选疫苗的hCMV的体外繁殖减毒株已经丧失了对内皮细胞的嗜性但保留了感染成纤维细胞的能力[2]。最近，两种病毒糖蛋白复合物已经显示控制hCMV的细胞嗜性。成纤维细胞的感染需要gH、gL和gO的复合体，而gH、gL和由UL131-UL128基因编码的蛋白质的复合体是造成内皮细胞、上皮细胞和树突细胞的感染的原因[2-8]。
超免疫球蛋白已经被商品化用于与移植相关的hCMV疾病的预防，并且最近的证据表明它们在孕妇中具有疗效[9]。这一治疗方法受到低量可被转移的中和抗体的限制，并且由于这一原因，高度期望获得具有高中和能力的人类抗体(例如人类单克隆抗体)。然而，hCMV中和抗体的靶还有待于确定。先前的工作将gB和gH鉴别为可能的靶。但是，gH的人源化抗体(MSL109)在临床试验中并没有显示出任何显著的作用[10，11]。迄今为止所描述的所有中和抗体都具有低的中和能力，因为它们仅在高浓度时中和hCMV感染。例如，抗体MSL-109在10μg/ml的浓度时仅表现出50％的中和活性，这是一个可解释体内作用缺乏的事实[11]。典型地，将成纤维细胞用作靶细胞来测量抗hCMV抗体的中和效力。然而，已知hCMV通过感染其他细胞类型例如内皮细胞、上皮细胞和白细胞而导致病理学。似乎没有任何可获得的能够高效力地中和非成纤维细胞靶细胞的感染的单克隆抗体。最近所描述的UL128和UL130的中和抗体在中和内皮细胞的感染上也表现出非常低的效力[7]。
因此，需要生产抗hCMV的中和抗体以及阐明这种抗体所结合的靶。
发明内容
本发明基于中和hCMV感染和在中和hCMV感染中具有特别高的效力的抗体和抗体片段的生产。这样的抗体是所需的，因为只需低浓度的抗体以中和给定量的病毒。这在施用较低量的抗体的同时促进较高水平的防御。人类单克隆抗体和分泌这种抗体的无限增殖化B细胞克隆也包括在本发明的范围内。
发明人已发现，针对UL130和UL131A的组合的抗体在中和hCMV中是特别有效的。所述组合可以是UL130和UL131A的复合物，其形成被抗体识别的表位，或抗体可以针对UL130和UL131A中的一个，其他蛋白质的存在是特异性所必需的。
本发明还涉及抗体所结合的表位的表征和所述表位在提高免疫应答中的用途。
本发明还涉及与本发明的抗体和它们所结合的表位相关的各种方法和用途。
本发明的抗体
本发明提供在中和hCMV中具有特别高的效力的单克隆抗体或重组抗体。本发明还提供这些重组抗体或单克隆抗体的片段，特别是保留了所述抗体的抗原结合活性的片段，例如保留对hCMV蛋白UL130和UL131A具有特异性的至少一个互补决定区(CDR)的片段。
在本说明书中，“在中和hCMV中的高效力”意指本发明的抗体分子在标准测定中以比本领域已知的抗体低得多的浓度中和hCMV，例如与MSL-109相比。
优选地，本发明的抗体分子可在浓度为0.16μg/ml或以下(即0.15、0.125、0.1、0.075、0.05、0.025、0.02、0.016、0.015、0.0125、0.01、0.0075、0.005、0.004或以下)，优选0.016μg/ml或以下(10-8或以下，优选10-9M或以下，优选10-10M或以下，即10-11M、10-12M、10-13M或以下的抗体浓度)时进行中和。这意味着对于体外的hCMV的临床分离株达到50％中和来说，与中和同样滴度的hCMV所需的MSL-109的浓度相比，仅需要非常低的浓度的抗体。优选地，感染内皮细胞、上皮细胞和树突细胞的hCMV的临床分离株达到50％中和所需的本发明的抗体的浓度比使用MSL-109时所需的浓度低50倍或更多倍(即75、100、150、200或更多倍)。可使用如本领域中所描述的标准中和测定来测量效力。
本发明的抗体能够中和hCMV。优选地，根据本发明的抗体预防成纤维细胞或内皮细胞的感染。更优选地，根据本发明的抗体预防内皮细胞的感染。优选地，根据本发明的抗体预防成纤维细胞和内皮细胞两者的感染。本发明的抗体优选地还预防树突细胞和上皮细胞(例如视网膜细胞)的感染。
基于适当的配制，可将这些抗体用作预防剂或治疗剂，或用作诊断工具。
“中和抗体”是能够中和病原体在宿主中引起和/或维持感染的能力的抗体。本发明提供中和单克隆人类抗体，其中所述抗体识别来自人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原。
优选地，根据本发明的抗体具有对UL130和UL131A的组合的特异性。
优选地，根据本发明的抗体是在本文被称为1F11或2F4的单克隆抗体。这些抗体最初分离自hCMV感染的供体，并通过被称为1F11或2F4的无限增殖化B细胞克隆生产。这些抗体已经显示出能中和内皮细胞、上皮细胞、视网膜细胞和树突细胞的hCMV感染。此外，从不同的hCMV感染的供体分离的抗体5A2和9A11显示出对UL130和UL131A的组合的相同的特异性以及中和内皮细胞、上皮细胞、视网膜细胞和树突细胞的hCMV感染的能力。这些抗体分别通过被称为5A2和9A11的无限增殖化B细胞克隆生产。
1F11由具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链组成。2F4由具有SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的轻链组成。抗体重链的CDR被分别称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。相似地，抗体轻链的CDR被分别称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。根据IMGT编号系统[12，13，14]将CDR氨基酸的位置确定为：CDR1-IMGT位置27至38、CDR2-IMGT位置56至65和CDR3-IMGT位置105至117。
5A2由具有SEQ ID NO：39所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的轻链组成。
这些抗体的CDR的氨基酸序列示于表1中。
表1
  1F11   2F4  5A2
  CDRH1   GFTFSSYA(SEQ ID NO：1)   GFSFNTYG(SEQ ID NO：11)  GGTFSSYV(SEQ ID NO：33)
  CDRH2   ISFDGDNK(SEQ ID NO：2)   IWDDGSKM(SEQ ID NO：12)  IIPIFNTA(SEQ ID NO：34)
  CDRH3   AREELVGLMPPYYNYGLDV(SEQ ID NO：3)   ARDEGAIMLHAMTDYGLDV(SEQ ID NO：13)  ARDFLSGPMEMPGGYYGLDV(SEQ ID NO：35)
  CDRL1   SSNIGNNF(SEQ ID NO：4)   NLGDEF(SEQ ID NO：14)  QSVLYSSNNKNY(SEQ IDNO：36)
  CDRL2   DND(SEQ ID NO：5)   QDS(SEQ ID NO：15)  WAS(SEQ ID NO：37)
  CDRL3   ETWDGSLNPAVV(SEQ IDNO：6)   QAWDSSTAHYV(SEQ IDNO：16)  QQYYSTPIT(SEQ IDNO：38)
本发明还包括包含重链的抗体，所述重链包含来自1F11或2F4的一或多个(即，一个、两个或所有三个)重链CDR(SEQ ID NO：1-3或11-13)。本发明还包括包含重链的抗体，所述重链包含来自5A2的一或多个(即，一个、两个或所有三个)重链CDR(SEQ ID NO：33-35)。
优选地，根据本发明的抗体包含重链，所述重链包含(i)SEQ ID NO：1所示的CDRH1、SEQ ID NO：2所示的CDRH2和SEQ ID NO：3所示的CDRH3，或(ii)SEQ ID NO：11所示的CDRH1、SEQ ID NO：12所示的CDRH2和SEQ ID NO：13所示的CDRH3。根据本发明的进一步优选的抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：33所示的CDRH1、SEQ ID NO：34所示的CDRH2和SEQ ID NO：35所示的CDRH3。
本发明还包括包含轻链的抗体，所述轻链包含来自1F11或2F4的一或多个(即，一个、两个或所有三个)轻链CDR(SEQ ID NO：4-6或14-16)。本发明还包括包含轻链的抗体，所述轻链包含来自5A2的一或多个(即，一个、两个或所有三个)轻链CDR(SEQ ID NO：36-38)。
优选地，根据本发明的抗体包含轻链，所述轻链包含(i)SEQ ID NO：4所示的CDRL1、SEQ ID NO：5所示的CDRL2和SEQ ID NO：6所示的CDRL3，或(ii)SEQ ID NO：14所示的CDRL1、SEQ ID NO：15所示的CDRL2和SEQ ID NO：16所示的CDRL3。根据本发明的进一步优选的抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：36所示的CDRL1、SEQ ID NO：37所示的CDRL2和SEQ ID NO：38所示的CDRL3。
优选地，根据本发明的抗体包含具有SEQ ID NO：7、17或39中所示序列的重链。优选地，根据本发明的抗体包含具有SEQ ID NO：8、18或40中所示序列的轻链。
也可存在包含来自1F11的一或多个CDR和来自2F4的一或多个CDR的杂交抗体分子。优选地，这种杂交抗体包含来自1F11的三个CDR和来自2F4的三个CDR。因此，优选的杂交抗体包含i)来自1F11的三个轻链CDR和来自2F4的三个重链CDR，或ii)来自1F11的三个重链CDR和来自2F4的三个轻链CDR。或者，这种杂交体可含有来自5A2的一或多个CDR。
本发明还包括编码本发明的轻链和重链以及CDR中的一部分或全部的核酸序列。优选的根据本发明的核酸序列包括SEQ ID NO：9(编码1F11重链可变区)、SEQ ID NO：10(编码1F11轻链可变区)、SEQ ID NO：19(编码2F4重链可变区)和SEQ ID NO：20(编码2F4轻链可变区)。优选的编码各种CDR的核酸序列包括SEQ ID NO：21(编码1F11CDRH1)、SEQ ID NO：22(编码1F11 CDRH2)、SEQ ID NO：23(编码1F11 CDRH3)、SEQ ID NO：24(编码1F11 CDRL1)、SEQ ID NO：25(编码1F11 CDRL2)、SEQ ID NO：26(编码1F11 CDRL3)、SEQ ID NO：27(编码2F4 CDRH1)、SEQ ID NO：28(编码2F4CDRH2)、SEQ ID NO：29(编码2F4 CDRH3)、SEQ ID NO：30(编码2F4CDRL1)、SEQ ID NO：31(编码2F4 CDRL2)和SEQ ID NO：32(编码2F4CDRL3)。进一步优选的根据本发明的核酸序列包括SEQ ID NO：41(编码5A2重链可变区)、SEQ ID NO：42(编码5A2轻链可变区)、SEQ ID NO：43(编码5A2 CDRH1)、SEQ ID NO：44(编码5A2 CDRH2)、SEQ ID NO：45(编码5A2 CDRH3)、SEQ ID NO：46(编码5A2 CDRL1)、SEQ ID NO：47(编码5A2CDRL2)、SEQ ID NO：48(编码5A2 CDRL3)。由于遗传密码的冗余，将存在这些序列的变体，它们编码相同的氨基酸序列。
变体抗体也包括在本发明的范围内。因此，本申请中所列的序列的变体也包括在本发明的范围内。如上所述，这些变体可起因于遗传密码的简并性。或者，可由于转录或翻译中的错误而产生天然变体。本申请还公开了2F4的变体。该变体在2F4重链氨基酸序列(SEQ ID NO：17)的C末端还额外包含两个丝氨酸残基。因此，2F4的这一变体由具有SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的轻链组成。编码所述变体重链的核酸序列如SEQ ID NO：50所示。因此，包含所述2F4变体重链(SEQ ID NO：49)的抗体包括在本发明的范围内。
具有改善的亲和力的抗体序列的其他变体可使用本领域内已知的方法获得，并且包括在本发明的范围内。例如，氨基酸取代可用于获得具有进一步改善的亲和力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善用于生产抗体的表达系统中翻译的效率。
优选地，这种变体抗体序列将与本申请中所列的序列享有70％或更高(即，80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列相同性。优选地，根据参考序列(即，本申请中所列的序列)的全长来计算这一序列相同性。优选地，如本申请所称的百分比相同性，是使用BLAST 2.1.3版本、使用由NCBI(国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)规定的缺省参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚分(gap open penalty)＝11和空位延伸罚分(gap extension penalty)＝1]确定的。
进一步包括在本发明范围内的是包含根据本发明的核酸序列的载体，例如表达载体。使用这种载体转化的细胞也包括在本发明的范围内。
本发明还涉及与能够结合单克隆抗体1F11或2F4的表位结合的单克隆抗体。本发明还涉及与能够结合单克隆抗体5A2的表位结合的单克隆抗体。
单克隆抗体和重组抗体在鉴定和纯化它们所针对的各个多肽和其他抗原中是特别有用的。本发明的抗体具有额外的效用，它们在免疫测定、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中可被用作试剂。在这些应用中，可用分析上可检测的试剂例如放射性同位素、荧光分子或酶来标记抗体。所述抗体还可用于抗原的分子鉴定和表征(表位作图)。
可将本发明的抗体与药物结合以便递送至治疗部位，或与可检测的标记结合以促进包含感兴趣的细胞(例如感染hCMV的细胞)的部位的成像。用于将抗体与药物和可检测的标记结合的方法是本领域内熟知的，使用可检测的标记成像的方法同样是本领域内熟知的。使用各种各样的标记，可将标记的抗体用于各种各样的测定。可通过将可检测的物质与抗体结合来检测本发明的抗体和感兴趣的表位(hCMV表位)之间的抗体-抗原复合物的形成。适合的检测方法包括使用标记，例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂(fluorescers)、化学发光剂(chemiluminescers)、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、粒子、染料以及类似物。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适合的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于许多熟知的测定，例如放射免疫测定、酶免疫测定例如ELISA、荧光免疫测定、以及类似测定。参见例如，参考文献15-18。
根据本发明的抗体可与治疗部分(例如细胞毒素、治疗剂、或放射性金属离子或放射性同位素)偶联。放射性同位素的实例包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111、及类似物。这种抗体偶联物可用于修饰给定的生物反应；药物部分不应被理解为限于经典的化学治疗剂。例如，所述药物部分可以是具有所需的生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括例如，毒素如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素。
用于将所述治疗部分与抗体偶联的技术是熟知的。参见例如Arnon等人(1985)″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in CancerTherapy(癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体)″，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Reisfeld等人编辑(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256页；Hellstrom等人(1987)″Antibodies for DrugDelivery(用于药物递送的抗体)″，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)，Robinson等人编辑(第二版；Marcel Dekker，Inc.)，第623-653页；Thorpe(1985)″Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review(癌症治疗中细胞毒素剂的抗体载体：综述)″，Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications(单克隆抗体′84：生物学应用和临床应用)，Pinchera等人编辑，第475-506页(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；″Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy(癌症治疗中放射性标记的抗体的治疗使用的分析、结果和未来的远景)″，Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)，Baldwin等人编辑(Academic Press，New York，1985)，第303-316页；和Thorpe等人(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
或者，可将抗体与第二抗体偶联以形成如参考文献19中所描述的抗体异源偶联物(antibody heteroconjugate)。此外，可在标记和本发明的抗体之间使用连接体(linker)[20]。可直接用放射性碘、铟、钇或本领域已知的其他放射性粒子来标记抗体或其抗原结合片段[21]。治疗可由用同时或顺序施用的偶联和非偶联抗体治疗的组合组成[22，23]。
可将本发明的抗体与固体支持物结合。
此外，可通过与聚合物的共价偶联对抗体进行化学修饰以例如增加它们的循环半衰期。优选的聚合物和将它们与肽结合的方法示于参考文献24-27中。优选的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温可溶于水并且具有通式：R(O--CH2--CH2)nO--R，其中R可以是氢或保护基(例如烷基或链烷醇基)。优选地，保护基具有1个和8个之间的碳，更优选地，保护基是甲基。符号n是正整数，优选地在1和1,000之间，更优选地在2和500之间。PEG具有1,000和40,000之间，更优选地2,000和20,000之间，最优选地3,000和12,000之间的优选平均分子量。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选地该羟基是末端羟基。这一羟基优选被活化以与抑制剂上的自由氨基反应。然而，应当理解的是，可改变反应基团的类型和量以获得共价偶联的PEG/本发明的抗体。
在本发明中，水溶性的聚氧乙烯多元醇也是有用的。它们包括聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油(POG)、以及类似物。POG是优选的。一个原因是因为聚氧乙烯甘油的甘油主链是以单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯的形式天然存在于例如动物和人类中的相同的主链。因此，这一分支在体内并不必然被视为外来制剂(foreign agent)。POG具有与PEG相同的范围内的优选分子量。POG的结构示于参考文献28中，并且可在参考文献24中找到对POG/IL-2偶联物的讨论。
增加循环半衰期的另一个药物递送系统是脂质体。参考文献29、30和31中讨论了制备脂质体递送系统的方法。其他的药物递送系统是本领域已知的并且描述于例如参考文献32和33中。
优选地，以纯化形式提供本发明的抗体。典型地，所述抗体将存在于基本上不含其他多肽的组合物中，例如其中组合物的少于90％(按重量计)，通常少于60％，更通常少于50％由其他多肽组成。
在非人类(或异种)宿主中，例如在小鼠中，本发明的抗体可以是有免疫原性的。尤其是，所述抗体可具有在非人类宿主中有免疫原性而在人类宿主中没有免疫原性的独特位。用于人类使用的本发明的抗体包括不能从诸如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等的宿主获得的和不能通过人源化或从异种小鼠(xeno-mice)获得的那些抗体。
本发明的抗体可是任何同种型(例如IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，但是通常是IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。
抗体的生产
可通过本领域已知的方法中的一种制备根据本发明的单克隆抗体。使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法学是广为人知的[34，35]。优选地，使用参考文献36中描述的可选择的EBV无限增殖化方法。
使用参考文献36中所描述的方法，可在多克隆B细胞激活剂存在的情况下用EBV转化生产本发明的抗体的B细胞。用EBV转化是标准技术并且能够容易地适应于包括多克隆B细胞激活剂。
在转化步骤期间可加入额外的细胞生长和分化的刺激剂以进一步增加效率。这些刺激剂可以是细胞因子例如IL-2和IL-15。在一个特别优选的方面，在无限增殖化步骤期间加入IL-2以进一步提高无限增殖化的效率，但是它的使用并不是必须的。
然后，可使用本领域内已知的方法培养使用这些方法生产的无限增殖化B细胞并且从其分离抗体。
如果需要，可使用过滤、离心和各种层析方法(例如HPLC或亲和层析法)进一步纯化单克隆抗体。纯化单克隆抗体的技术，包括生产药物级抗体的技术，是本领域熟知的。
通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)进行消化和/或通过经由化学还原断裂二硫键的方法，可从单克隆抗体获得本发明的单克隆抗体的片段。或者，可通过克隆和表达重链或轻链的序列的一部分获得单克隆抗体的片段。抗体“片段”包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片段。本发明还包括衍生自本发明的单克隆抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)，例如本发明包括包含来自本发明抗体的CDR的scFv。本发明还包括重链或轻链单体和二聚体以及单链抗体，例如其中重链和轻链的可变结构域由肽接头连接的单链Fv。
可将分子生物学的标准技术用于制备编码本发明的抗体或本发明的抗体的片段的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术来全部地或部分地合成所需的DNA序列。可适当地使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。
可将任何适合的宿主细胞/载体系统用于表达编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列。可将细菌例如大肠杆菌(E.coli)和其他微生物系统部分地用于表达抗体片段例如Fab和F(ab′)2片段、特别是Fv片段和单链抗体片段例如单链Fv。可将真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统用于生产较大的抗体分子(包括完整的抗体分子)。适合的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293T、PER.C6、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供用于生产根据本发明的抗体分子的方法，该方法包括在适于导致来自编码本发明的抗体分子的DNA的蛋白质的表达的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，以及分离抗体分子。
所述抗体分子可仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下只需将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。对于同时包含重链和轻链的产物的生产，可用两种载体转染细胞系，第一种载体编码轻链多肽，而第二种载体编码重链多肽。或者，可使用单一载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
或者，根据本发明的抗体可通过以下步骤来生产：i)在细胞中表达根据本发明的核酸序列，以及ii)分离表达的抗体产物。此外，该方法可包括iii)纯化所述抗体。
B细胞的筛选和分离
筛选转化的B细胞中生产具有所需抗原特异性的抗体的那些，然后可从阳性细胞产生单株B细胞克隆。
可通过ELISA、通过组织或细胞(包括转染的细胞)染色、中和测定或本领域内已知的用于鉴定所需的抗原特异性的众多其他方法中的一种实施筛选步骤。测定可在单一抗原识别的基础上进行选择或可在所需功能的额外的基础上进行选择，例如，选择中和抗体而不是仅抗原结合抗体，选择能够改变靶细胞的特征的抗体，靶细胞的特征例如是它们的信号级联、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其他细胞的能力、它们对其他细胞或其他试剂或条件的改变的影响的响应、它们的分化状态等。
可使用有限稀释、显微操作、经由细胞分选或本领域已知的其他方法的单细胞沉积进行从阳性细胞的混合物中分离单株克隆的克隆步骤。优选地，使用有限稀释进行克隆。
可以各种方式(例如作为单克隆抗体的来源、作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源、用于研究等)使用本发明的无限增殖化B细胞克隆。
本发明提供包含无限增殖化B记忆淋巴细胞的组合物，其中淋巴细胞产生对hCMV具有特异性的高中和效力的抗体，其中以每天每细胞≥5pg产生所述抗体。本发明还提供包含无限增殖化B记忆淋巴细胞的克隆的组合物，其中所述克隆产生对hCMV具有特异性的高亲和力的单克隆抗体，并且其中以每天每克隆≥10N ng产生所述抗体。优选地，所述克隆产生在中和hCMV感染中具有高效力的单克隆抗体。
优选的根据本发明的无限增殖化B细胞克隆是1F11和2F4。进一步优选的克隆是5A2和9A11。
表位
如上所述，本发明的抗体可用于测定它们所结合的表位的位置。本申请人发现，中和内皮细胞、上皮细胞、视网膜细胞和树突细胞的hCMV感染的抗体1F11、2F4、5A2和9A11针对在UL130和UL131A的组合上发现的表位。尽管本申请人并不希望被这一理论束缚，但相信抗体1F11和2F4与由这两种蛋白质形成的构象表位结合。还相信5A2和9A11也与由UL130和UL131A形成的这一构象表位结合。
由于1F11、2F4、5A2和9A11不中和成纤维细胞的感染的事实，假设这些抗体识别对于人类单克隆抗体10C6、5F1、6B4和7H3来说不同的表位。此外，相信单克隆抗体10C6、5F1、7H3和6B4结合gB的功能表位。
这些抗体所识别的表位可以有许多用途。纯化或合成形式的表位和模拟表位可用于提高免疫应答(即作为疫苗，或用于生产用于其他用途的抗体)或用于筛选患者血清中与表位或模拟表位免疫反应的抗体。优选地，将这种表位或模拟表位、或包含这种表位或模拟表位的抗原用作提高免疫应答的疫苗。还可以在监测疫苗质量尤其是检查疫苗中的抗原含有以正确构象存在的正确的免疫原性表位的方法中使用本发明的抗体。
所述表位在筛选与所述表位结合的配体时也是有用的。这种配体优选封闭表位并因此预防感染。这种配体包括在本发明的范围内。
重组表达
本发明的无限增殖化记忆B淋巴细胞还可用作用于随后的重组表达的抗体基因的克隆的核酸的来源。对于制药目的而言，来自重组来源的表达比来自B细胞或杂交瘤的表达更普遍，例如由于稳定性、再现性、培养容易等原因。
因此，本发明提供一种用于制备重组细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)从编码感兴趣的抗体的B细胞克隆获得一或多种核酸(例如重链和/或轻链基因)；以及(ii)将所述核酸插入表达宿主中，以便使得在该宿主中表达所述感兴趣的抗体。
类似地，本发明提供一种用于制备重组细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)对来自B细胞克隆的编码感兴趣的抗体的核酸进行测序；以及(ii)使用来自步骤(i)的序列信息制备用于插入表达宿主的核酸，以便使得在该宿主中表达感兴趣的抗体。
本发明还提供一种制备重组细胞的方法，该方法包括用编码感兴趣的单克隆抗体的一或多种核酸转化宿主细胞的步骤，其中所述核酸是衍生自本发明的无限增殖化B细胞克隆的核酸。因此，用于首先制备所述核酸和之后使用其转化宿主细胞的程序可在不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行。
之后，可将本发明的这些重组细胞用于表达和培养目的。它们对于用于大规模药物生产的抗体的表达是尤其有用的。它们还可被用作药物组合物的活性成分。可使用任何适合的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水液、中空纤维型生物反应器盒(hollow-fiber type bioreactorcartridge)、模块化小型发酵罐、搅拌罐、微载体培养、陶瓷芯灌注(ceramiccore perfusion)等。
用于获得来自B细胞的免疫球蛋白基因并对其进行测序的方法是本领域中熟知的(例如参见参考文献37)。
表达宿主优选是真核细胞，包括酵母细胞和动物细胞(尤其是哺乳动物细胞(例如CHO细胞、人类细胞例如PER.C6[Crucell；参考文献38]或HKB-11[Bayer；参考文献39和40]细胞、骨髓瘤细胞[41&42]等))以及植物细胞。优选的表达宿主可以对本发明的抗体进行糖基化，尤其是用其本身在人类不具有免疫原性的碳水化合物结构进行糖基化。可在无血清培养基中生长的表达宿主是优选的。可在不存在动物来源的产品的培养基中生长的表达宿主是优选的。
可培养表达宿主以产生细胞系。
本发明提供一种用于制备编码感兴趣的抗体的一或多种核酸分子(例如重链和轻链基因)的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备根据本发明的无限增殖化B细胞克隆；(ii)从所述B细胞克隆获得编码感兴趣的抗体的核酸。本发明还提供用于获得编码感兴趣的抗体的核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备根据本发明的无限增殖化B细胞克隆；(ii)对来自所述B细胞克隆的编码感兴趣的抗体的核酸进行测序。
本发明还提供一种制备编码感兴趣的抗体的核酸分子的方法，该方法包括从B细胞克隆获得核酸的步骤，所述B细胞克隆从本发明的转化的B细胞获得。因此，用于首先获得所述B细胞克隆和之后从其制备核酸的程序可在完全不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行。
本发明提供一种用于制备抗体(例如用于药物应用)的方法，该方法包括以下步骤：(i)从选择的表达感兴趣的抗体的B细胞克隆获得一或多种核酸(例如重链和轻链基因)和/或对其进行测序；(ii)将所述核酸插入或使用所述核酸制备能够表达感兴趣的抗体的表达宿主；(iii)在表达感兴趣的抗体的条件下培养或传代培养所述表达宿主；以及，任选地，(iv)纯化所述感兴趣的抗体。
本发明还提供一种制备抗体的方法，该方法包括以下步骤：在表达感兴趣的抗体的条件下培养或传代培养表达宿主细胞群，以及任选地，纯化感兴趣的抗体，其中所述表达宿主细胞群已经通过以下步骤制备：(i)提供编码由如上所述制备的B记忆淋巴细胞群产生的所选择B细胞的感兴趣的抗体的核酸，(ii)将所述核酸插入能够表达感兴趣的抗体的表达宿主，以及(iii)培养或传代培养包含所述插入的核酸的表达宿主，以产生所述表达宿主细胞群。因此，用于首先制备重组表达宿主和之后培养重组表达宿主以表达抗体的程序可在完全不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行。
药物组合物
目前，抗体作为药物的活性成分的应用是广泛的，包括产品HerceptinTM(trastuzumab)、RituxanTM、CampathTM、RemicadeTM、ReoProTM、MylotargTM、ZevalinTM、Omalizumab、SynagisTM(Palivizumab)、ZenapaxTM(daclizumab)等。
本发明因此提供一种药物组合物，其含有本发明的抗体和/或编码这种抗体的核酸和/或表达这种抗体的无限增殖化B细胞和/或被本发明的抗体识别的表位。所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体以允许施用。载体本身不应诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生并且不应是有毒的。适合的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐；或有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可额外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质例如润湿剂或乳化剂或者pH缓冲物质可存在于所述组合物中。所述载体使得所述药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂和悬浮液，以供患者摄取。
优选的施用形式包括适合于胃肠外施用的形式，例如通过注射或灌注，诸如通过弹丸注射或连续灌注。当产品用于注射或灌注时，它可采用于含油或含水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以含有配方制剂(formulatory agent)例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述抗体分子可以是干燥形式的，以便在使用前用适当的无菌液体重构。
一旦配制，可将本发明的组合物直接施用于对象。优选地，所述组合物适于施用给人类对象。
可通过许多途径来施用本发明的药物组合物，所述途径包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用无针注射器施用本发明的药物组合物。典型地，可将该治疗组合物制备为可注射的形式，或是液体溶液或是悬浮液。还可制备适于在注射前溶于或悬浮于液体载体中的固体形式。
通常，组合物的直接递送将通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射完成或者被递送至组织的间质间隙。还可将组合物施用至病变处。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物提供了与施用频率有关的指导，例如是否应该每天、每周、每月等递送药物。频率和剂量还可取决于症状的严重性。
本发明的组合物可以制备成各种形式。例如可将所述组合物制备为可注射的形式，或是液体溶液或是悬浮液。还可制备适于在注射前溶于或悬浮于液体载体中的固体形式(例如冻干组合物，如SynagisTM和HerceptinTM，以便用含有防腐剂的无菌水重构)。可将组合物制备成用于局部施用，例如制备成软膏、乳膏或粉末。可将所述组合物制备成用于口服施用，例如制备成片剂或胶囊、制备成喷雾剂、或制备成糖浆(任选地是调味的)。可将所述组合物制备成用于肺部施用，例如利用细粉末或喷雾剂制成吸入剂。可将所述组合物制备成栓剂或阴道栓剂。可将所述组合物制备成用于鼻内、耳或眼施用，例如制备成滴剂。所述组合物可以是试剂盒形式，其被设计成使得仅在施用给患者前重构的组合的组合物。例如，可以带有无菌水或无菌缓冲液的试剂盒形式提供冻干的抗体。
应当理解的是，所述组合物中的活性成分将是抗体分子。就这一点而言，它将易于在胃肠道中降解。因此，如果将通过使用胃肠道的途径施用所述组合物，那么所述组合物将需要含有保护抗体使之免于降解但一旦其从胃肠道被吸收就释放抗体的制剂。
药学上可接受的载体的详尽讨论在Gennaro(2000)Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿：制药的科学和实践)，第20版，ISBN：0683306472中可获得。
本发明的药物组合物通常具有5.5和8.5之间的，优选6和8之间的更优选约7的pH。可通过使用缓冲剂来维持pH。所述组合物可以是无菌的和/或无热原的。所述组合物可以是就人类而言等渗的。优选地，在密封的容器中提供本发明的药物组合物。
药物组合物将包括有效量的一或多种本发明的抗体和/或一或多种本发明的无限增殖化B细胞和/或包含与本发明的抗体结合的表位的多肽，即足以治疗、缓解或预防预期疾病或病症或表现出可检测的疗效的量。疗效还包括体征的减少。对于任何特定的对象来说，精确的有效量将取决于他们的身材和健康状况、病症的性质和程度、以及选择用于施用的疗法或疗法的组合。对于给定的情况来说，有效量是通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。对于本发明的目的来说，在施用本发明的组合物的个体中，有效剂量将通常是从约0.01mg/kg至约50mg/kg，或从约0.05mg/kg至约10mg/kg的本发明的组合物。已知的基于抗体的药物在这方面提供了指导，例如以4mg/kg体重的最初负荷剂量和2mg/kg体重的每周维持剂量，通过静脉内灌注21mg/ml的溶液施用HerceptinTM；每周以375mg/m2施用RituxanTM；等。
组合物可包括超过一种(例如2、3、4、5种等)本发明的抗体，尤其是当这些抗体与不同的抗原(或与相同抗原上的不同表位)结合以提供加和的或协同的疗效时。例如，一种抗体可与UL130-UL131A组合(或复合物)结合，而另一种抗体可与gH结合。在另一个实例中，一种抗体可与UL130-UL131A组合(或复合物)结合，而另一种抗体可与gB结合。因此，可将一种抗体靶向介导成纤维细胞感染的机制，而可将另一种抗体靶向介导内皮细胞感染的机制。对于最佳的临床效果来说，应对hCMV感染和维持的两种机制可能是非常有利的。
本发明的抗体可与其他的疗法，例如与化疗化合物、与放射疗法等(组合或独立地)施用。优选的治疗化合物包括抗病毒化合物，例如更昔洛韦、膦甲酸和西多福韦。相比于单独施用的单种治疗剂，这种组合治疗在治疗效力上提供加和的或协同的改进。术语“协同”用于描述两种或更多种活性制剂组合作用，其大于每一种相应的活性制剂的单独作用的总和。因此，当两种或更多种制剂的组合作用导致活性或过程的“协同抑制”时，所期望的是，对活性或过程的抑制大于每一种相应的活性制剂的抑制作用的总和。术语“协同疗效”是指用两种或更多种疗法的组合所观察到的疗效，其中所述(如通过许多参数中的任一种所测量的)疗效大于用相应的单独的疗法所观察到的单独的疗效的总和。
可给之前已显示对hCMV感染的治疗无响应，即已显示对抗hCMV治疗具有抗性的那些患者施用抗体。这种治疗可包括之前的使用抗病毒剂的治疗。这可归因于例如感染有hCMV的抗病毒抗性株。
在包括本发明的抗体的本发明组合物中，所述抗体按重量计优选地构成所述组合物中总蛋白质的至少50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)。所述抗体因此是纯化的形式。
本发明提供了一种制备药物的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；以及(ii)将纯化的抗体与一或多种药学上可接受的载体混合。
本发明还提供了一种制备药物的方法，该方法包括将抗体与一或多种药学上可接受的载体混合的步骤，其中所述抗体是从本发明的转化的B细胞获得的单克隆抗体。因此，用于首先获得单克隆抗体和之后制备药物的程序可在完全不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行。
或者，为了递送抗体或B细胞用于治疗目的，可以将编码感兴趣的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(通常是DNA)递送至对象，使得所述核酸可以在对象中原位表达以提供所需的疗效。适合的基因疗法和核酸递送载体是本领域已知的。
本发明的组合物可以是免疫原性组合物，并且更优选地是包含抗原的疫苗组合物，所述抗原包在hCMV蛋白UL130和UL131A的组合上发现的表位。可选择的组合物可包含(i)包含在hCMV蛋白UL130和UL131A的组合上发现的表位的抗原，以及(ii)包含在hCMV gB上发现的表位的抗原。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但典型地将是预防性的。
组合物可以包括抗微生物剂，尤其是如果以多剂量形式包装时。
组合物可包含洗涤剂(detergent)，例如吐温(聚山梨酯)，诸如吐温80。洗涤剂通常以低水平(例如＜0.01％)存在。
组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生张力。10±2mg/ml的NaCl的浓度是典型的。
组合物可包含例如约15-30mg/ml(例如25mg/ml)的糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)，尤其是如果组合物有待被冻干或者如果组合物包括已经从冻干物质重构的物质时。可在冻干前将用来冻干的组合物的pH调节至约6.1。
本发明的组合物还可包含一或多种免疫调节剂。优选地，所述免疫调节剂中的一或多种包括佐剂。
本发明的组合物将优选地引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答以便有效地应对hCMV感染。这一免疫应答将优选地诱导长效的(例如中和)抗体和在暴露于hCMV时能够快速应答的细胞介导的免疫性。
医学治疗和用途
本发明的抗体或其片段可用于治疗hCMV感染、用于预防hCMV感染或用于诊断hCMV感染。
诊断方法可包括将抗体或抗体片段与样品接触。这种样品可以是取自例如唾液腺、肺、肝、胰、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑或皮肤的组织样品。所述诊断方法还可包括抗原/抗体复合物的检测。
因此，本发明提供了(i)根据本发明的抗体，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能够与1F11或2F4中的一个结合的表位；或(iv)能够与5A2或9A11中的一个结合的表位，以用于治疗。
本发明还提供一种治疗患者的方法，该方法包括给该患者施用(i)根据本发明的抗体，(ii)能够与1F11或2F4中的一个结合的表位，或(iii)能够与5A2或9A11中的一个结合的表位。
本发明还提供(i)根据本发明的抗体，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能够与1F11或2F4中的一个结合的表位，(iv)与能够结合1F11或2F4中的一个的表位结合的抗体，(v)能够结合5A2或9A11中的一个的表位，或(vi)与能够结合5A2或9A11中的一个的表位结合的抗体在制备用于预防或治疗hCMV感染的药物中的用途。
本发明提供用作药物的本发明的组合物。本发明还提供本发明的抗体和/或包含这种抗体所结合的表位的蛋白质在制备用于治疗患者和/或在患者中进行诊断的药物中的用途。本发明还提供用于治疗对象和/或对对象进行诊断的方法，该方法包括给他们施用本发明的组合物的步骤。所述对象优选是人类。检查治疗性处理的效力的一种方法包括在施用本发明的组合物后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。本发明对于CMV感染是有用的。
优选地，将根据本发明的抗体、无限增殖化B细胞克隆、表位或组合物施用给对象(尤其是处于hCMV感染的风险中或易受hCMV感染的对象)的组。这些对象组包括免疫受损的对象，例如患有HIV或经历免疫抑制治疗的那些，诸如移植患者。
可在被动免疫中使用本发明的抗体。
还可在用于诊断hCMV感染的试剂盒中使用本发明中所描述的抗体及其片段。
可在用于通过检测保护性抗hCMV抗体的存在来监测接种疫苗程序的效力的试剂盒中使用能够结合本发明中所描述的单克隆抗体1F11或2F4的表位。
可在用于通过检测保护性抗hCMV抗体的存在来监测接种疫苗程序的效力的试剂盒中使用能够结合本发明中所描述的单克隆抗体5A2或9A11的表位。
还可在用于监测具有所希望的免疫原性的疫苗的制造的试剂盒中使用本发明中所描述的抗体及其片段。
本发明还提供了一种制备药物的方法，该方法包括将单克隆抗体与一或多种药学上可接受的载体混合的步骤，其中所述单克隆抗体是从本发明的表达宿主获得的单克隆抗体。因此，用于首先获得单克隆抗体(例如表达它和/或纯化它)和之后将其与药学载体混合的程序可在完全不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行。
从本发明的转化的B细胞开始，可进行培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等各种步骤，以便使通过转化的B细胞表达的抗体永存，且在每个步骤伴随任选的优化。在一个优选的实施方式中，前述方法进一步包括应用于编码所述抗体的核酸的优化(例如亲和力成熟或优化)的技术。本发明包括在这些步骤期间使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，可在步骤(ii)和(iii)之间操纵表达宿主中使用的核酸以插入、缺失或修改某些核酸序列。来自这些操纵的改变包括但不限于引入限制位点、修改密码子用法、增加或优化转录和/或翻译调节序列等的改变。改变核酸以改变编码的氨基酸也是可能的。例如，向抗体的氨基酸序列中引入一或多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)个氨基酸取代、一或多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)个氨基酸缺失和/或一或多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)个氨基酸插入可能是有用的。这种点突变可更改效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可引入用于共价基团(例如标记)的结合的氨基酸或者可引入标记物(例如用于纯化目的的标记物)。可在特定的位点引入突变或者可随机地引入突变随后进行选择(例如分子进化)。
概述
术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”以及“由......组成(consisting)”，例如，“包含”X的组合物可全部由X组成或可包括其他的某些物质(例如X+Y)。
“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上无”Y的组合物可完全无Y。必要时，可从本发明的定义中略去“基本上”。
与数值x相关的术语“约”意指例如x±10％。
如本文所用，术语“疾病”与术语“病患(disorder)”和“病症(condition)”是一般同义的，并可互换使用(如在医学病症中)，它们都反映人类或动物体或者它的部分中的一个的损害正常功能性的异常状况，通常表现为区别体征和症状，并导致人类或动物寿命减少或生活质量下降。
如本文所用，提到患者的“治疗”意指包括防止(prevention)和预防(prophylaxis)。术语“患者”意指包括人类的所有哺乳动物。患者的实例包括人类、牛、犬、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。优选地，所述患者是人类。
附图简述
图1显示SDS-PAGE，其证明人类单克隆抗体(1)1F11和(2)2F4沉淀hCMV蛋白的复合物，而不沉淀不相关的IgG。
图2显示FACS分析，其证明人类单克隆抗体(A)1F11和2F4以及(B)5A2和9A11识别由UL130和UL131A基因产物形成的构象表位。
图3显示1F11和2F4的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。CDR序列是粗体的。
图4显示FACS分析，其证明人类单克隆抗体7H3、10C6、5F1和6B4识别hCMV蛋白gB上的表位。
图5显示5A2重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。CDR序列是粗体的。
实施本发明的方式
实施例1：B细胞的克隆和hCMV中和活性的筛选
鉴定血清中两个具有高hCMV中和抗体滴度的供体。如参考文献36中所描述，分离记忆B细胞并用EBV和CpG使其无限增殖化。简单地说，通过使用CD22珠的阴性选择分离记忆B细胞，之后使用特异性抗体除去IgM+、IgD+、IgA+B细胞并进行细胞分选。在CpG2006和辐照异基因单核细胞存在的条件下用EBV将所分选的细胞(IgG+)无限增殖化。在二十个96孔U底平板中建立每个含有50个记忆B细胞的复制式培养物。两周后，收集培养物上清液并在分别的测定中测试它们中和成纤维细胞或上皮细胞的hCMV感染的能力。如参考文献36中所述，从阳性多克隆培养物分离B细胞克隆。使用IgG特异性ELISA确定所选择的克隆的上清液中的IgG浓度。
对于病毒中和测定来说，将滴定量的临床hCMV分离株与相同体积的培养物上清液或与含有中和抗体的人类血清的稀释物混合。室温孵育1小时后，将混合物加入到96孔平底板中内皮细胞(例如HUVEC细胞)或成纤维细胞的汇合单层并在37℃孵育两天。弃掉上清液，将细胞用冷的甲醇固定并用小鼠抗hCMV早期抗原的单克隆抗体的混合物染色，之后用荧光素标记的山羊抗小鼠Ig染色。用荧光显微镜对平板进行分析。在没有中和抗体存在的情况下，感染的细胞是～1000/视野，而在存在饱和浓度的中和抗体情况下，感染被完全抑制。中和滴度被表示为引起hCMV感染减少50％的抗体的浓度(μg/ml)。
表2显示已经鉴定了三种不同类型的抗体。可以中和成纤维细胞的感染的那些抗体、可以中和内皮细胞的感染的那些抗体以及可以中和两种感染的那些抗体。这与之前不同蛋白质负责对特定细胞类型的嗜性的数据[7]一致。除了内皮细胞的中和外，还观察到1F11和2F4中和上皮细胞(例如视网膜细胞)和树突细胞的感染(数据未显示)。
表2
Figure G2008800071531D00221
*在所测试的最高浓度(即＞2μg/ml)无中和。
^Cytotect(Biotest)是hCMV超免疫IgG的池。
一些抗体以从0.3μg/ml至0.5μg/ml范围内的IgG浓度中和成纤维细胞和内皮细胞两者的感染。其他的抗体(1F11、5A2、9A11和2F4)不能中和成纤维细胞的hCMV感染，但中和内皮细胞的感染并且是以从0.001μg/ml至0.004μg/ml范围内的极低浓度进行中和(比之前已知的抗体强效超过1000倍)。
注意，由于最初的表征，已经确定5F1与gB而非gH的表位结合。这与证实如在7H3、10C6和6B4上所观察到的封闭gB允许中和成纤维细胞的感染的结果是一致的。
实施例2：单克隆抗体所识别的靶抗原的鉴定
用临床hCMV分离株感染人类MRC-9成纤维细胞。3天后，用35S甲硫氨酸和半胱氨酸对细胞进行代谢标记。预清除裂解产物后，加入人类单克隆抗体1F11和2F4，并通过加入蛋白A珠对免疫复合物进行沉淀且在SDS-PAGE上解析(图1)。将具有不相关特异性的人类单克隆IgG抗体用作阴性对照。结果显示人类单克隆抗体1F11和2F4沉淀CMV蛋白的复合物。
为了绘制人类单克隆抗体的特异性，构建了编码血凝素(HA)标记的缺少信号肽的UL128Δ1-27、UL130Δ1-25和UL131AΔ1-18hCMV蛋白的表达载体。用这些载体单独或组合转染HEK293T细胞。36小时后将细胞固定、透化并用抗HA抗体(以控制转染效率)和单克隆抗体以及随后用山羊抗人IgG染色。将具有不相关特异性的HuMab IgG用作阴性对照。图2A显示人类单克隆抗体1F11和2F4识别由UL130和UL131A基因产物形成的构象表位。图2B显示人类单克隆抗体5A2和9A11识别由UL130和UL131A基因产物形成的构象表位。
结论
上面的结果确定了两种能够以高效力和选择性中和人类内皮细胞的hCMV感染的人类单克隆抗体。为了鉴定所识别的表位，测试了所述抗体免疫沉淀来自hCMV感染的细胞的蛋白质的能力(图1)。人类Mab 1F11和2F4沉淀具有～15、33-35和～100KDa的表观分子量的几种蛋白质。这些模式与含有gH、gL和UL128、UL130和可能的UL131A的复合物的沉淀相一致。
为了更好地确定这些抗体的靶，表征了它们对用编码HA标记的UL128、UL130和UL131A的载体转染的HEK293T细胞进行染色的能力。如图2A中所示，1F11和2F4仅对共表达UL130和UL131A的细胞进行染色，表明它们识别由这两种基因产物决定的构象表位。这一结论得到了这些抗体在用感染或转染细胞的裂解产物在还原的、变性的条件下进行的蛋白质印迹中不反应的事实的支持(数据未显示)。
对于5A2和9A11，观察到了相似的结果。图2b显示这些抗体仅对共表达UL130和UL131A的细胞进行染色，暗示它们识别由这两种基因产物决定的构象表位。
实施例3：单克隆抗体所识别的靶抗原的进一步鉴定
为了绘制中和成纤维细胞感染的人类单克隆抗体的特异性，构建编码全长gB的表达载体。用这一载体转染HEK293T细胞。36小时后，将细胞固定、透化并用人类单克隆抗体(HuMab)并随后用羊抗人IgG进行染色。图4显示单克隆抗体7H3、10C6、5F1和6B4(而不是具有不相关特异性的IgG抗体)特异性地染色用gB转染的细胞，表明它们识别gB的表位。值得注意的是，单克隆抗体10C6、5F1和6B4中和成纤维细胞和内皮细胞的感染，然而单克隆抗体7H3中和成纤维细胞(而非内皮细胞)的感染。这一观点暗示单克隆抗体10C6、5F1和6B4与和单克隆抗体7H3结合的表位不同的gB的功能性表位结合。
应当理解，本发明仅通过实施例的方式进行了描述，可在保持本发明的范围和精神的前提下进行修饰。
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Figure IYZ000006035617200011
Figure IYZ000006035617200021
Figure IYZ000006035617200031
Figure IYZ000006035617200041
Figure IYZ000006035617200051
Figure IYZ000006035617200061
Figure IYZ000006035617200071
Figure IYZ000006035617200091
Figure IYZ000006035617200101
Figure IYZ000006035617200111
Figure IYZ000006035617200141

Claims (14)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
(a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3分别所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13分别所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16分别所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或者
(c)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35分别所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38分别所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，包含
(a)分别由SEQ ID NO:7和8所示的重链和轻链；
(b)分别由SEQ ID NO:17和18所示的重链和轻链；或者
(c)分别由SEQ ID NO:39和40所示的重链和轻链。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对hCMV蛋白UL130和UL131A的组合具有特异性，其中所述抗体抑制人类巨细胞病毒(hCMV)对细胞的感染。
4.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中对hCMV达到50%抑制所需的抗体浓度为0.3μg/ml或更低。
5.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中对hCMV达到50%抑制所需的抗体浓度为0.01μg/ml或更低。
6.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合由UL130和UL131A这两种蛋白形成的构象表位。
7.权利要求1-6之一的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人类抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
8.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人类单克隆抗体1F11，其重链如SEQ ID NO:7所示，其轻链如SEQ ID NO:8所示。
9.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6之一的抗体或其抗原结合片段。
10.权利要求9的核酸，其包含SEQ ID NO:9、10、19、20、21-32和41-48中的任一序列所示的核苷酸序列。
11.一种分离的细胞，其包含权利要求9或10的核酸分子。
12.一种组合物，其包含权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的稀释剂或载体。
13.权利要求12的组合物，其还包含中和hCMV感染的第二抗体或其抗原结合片段。
14.权利要求13的组合物，其中所述第二抗体对hCMV蛋白gB具有特异性。
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