KR20090127256A - 인간 사이토메갈로바이러스 중화 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 사이토메갈로바이러스 중화 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스에 대해 특이성을 나타내고 높은 친화력으로 결합하는 중화 항체 및 그러한 항체를 생산하는 불멸화 B 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 항체는 감염의 중화에 높은 효능을 갖는다. 또한, 본 발명은 항체가 결합하는 에피토프 및 스크리닝 방법 및 질환의 진단 및 치료에서 항체와 에피토프의 용도에 관한 것이다.
인간 사이토메갈로바이러스, 중화 항체, 에피토프, 불멸화 B 세포

Description

인간 사이토메갈로바이러스 중화 항체 및 이의 용도{HUMAN CYTOMEGALOVIRUS NEUTRALISING ANTIBODIES AND USE THEREOF}
본원에 인용되는 모든 문헌은 그들의 개시내용이 모두 본원에 참조로 편입된다.
기술분야
본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스에 대한 특이성을 갖는 항체, 적합하게는 그러한 특이성을 지니는 모노클로날 항체 및 그러한 모노클로날 항체를 생산하는 불멸화 B 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체가 결합하는 에피토프, 및 스크리닝 방법 및 질환의 진단, 예방 및 치료에서 상기 항체와 에피토프의 용도에 관한 것이다.
인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)는 면역억제된 성인 및 태아의 감염시 중병을 초래할 수 있는 광범위하게 분포하는 병원체이며, 아테롬성 동맥 경화증과 같은 만성 질환과 관련되어 있다. hCMV는 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 및 조혈세포를 포함한 다양한 유형의 세포를 감염시킨다[1]. 후보 백신으로 개발되고 있는, hCMV의 시험관내에서(in vitro) 증식된 약독화 균주는 내피세포에 대한 향성(向性)을 상실한 반면에, 섬유아세포 감염능을 보유한다[2]. 최근에는 두 바이러스 당단 백질 복합체가 hCMV의 세포 향성을 통제하는 것으로 밝혀졌다. gH, gL과 gO의 복합체는 섬유아세포의 감염에 요구되는 반면에, gH, gL과, ULl31-ULl28 유전자에 의해 코딩된 단백질의 복합체는 내피세포, 상피세포 및 수지상세포의 감염을 담당한다[2-8].
고면역글로불린은 이식과 관련한 hCMV 질환의 예방용으로 이미 상용화되었고, 최근의 증거는 그러한 글로불린이 임산부에 치료효과가 있음을 시사한다[9]. 이러한 치료적 접근은 전달될 수 있는 중화 항체의 양이 적다는 점 때문에 제약이 따르고, 이러한 이유로 해서 높은 중화능을 지닌 인간 항체(인간 모노클로날 항체와 같은)의 안정공급이 매우 바람직할 것이다. 그러나, hCMV 중화 항체의 표적을 확립해야하는 문제가 남아있다. 이전의 연구노력으로 gB 및 gH가 가능성이 있는 표적으로 동정되었다. 그러나, gH에 대한 인간화된 항체(MSL 109)는 임상시험에서 어떠한 유의미한 효과도 나타내지 않았다[10, 11]. 현재까지 전해지는 모든 중화 항체는 매우 낮은 중화능을 지녔으며, 따라서 이들은 고농도에서만 hCMV 감염을 중화시킨다. 예를 들면, 항체 MSL-109는 10 μg/ml의 농도에서 겨우 50% 중화 활성을 나타내었으며, 이러한 사실은 생체내 효과의 결여를 설명해 줄 수 있다[11]. 항-hCMV 항체의 중화능은 통상적으로 표적 세포로 섬유아세포를 사용하여 측정된다. 그러나, hCMV는 내피세포, 상피세포 및 백혈구와 같은 다른 세포 유형을 감염시킴으로써 병리를 일으키는 것으로 알려져 있다. 비-섬유아세포 표적 세포의 감염을 고효능으로 중화할 수 있는 임의의 모노클로날 항체가 이용가능한 것으로 보이지는 않는다. 최근에 기술된 UL128 및 UL130에 대한 중화 항체도 내피세포 감염 의 중화에 매우 낮은 효능을 나타내었다[7].
따라서, hCMV에 대한 중화 항체의 생산 및 이러한 항체가 결합하는 표적의 규명이 요구된다.
발명의 개시
본 발명은 hCMV 감염을 중화시키고 hCMV 감염의 중화에 특히 높은 효능을 갖는 항체 및 항체 단편의 생산에 기초한다. 이러한 항체는 소정량의 바이러스를 중화시키는데 낮은 농도만이 요구되기 때문에 바람직하다. 이러한 점은 좀더 소량의 항체를 투여하면서도 더 높은 수준의 보호를 조장한다. 인간 모노클로날 항체 및 그러한 항체를 분비하는 불멸화 B 세포 클론 역시도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명자들은 UL130과 UL131A의 조합체에 대한 항체가 hCMV의 중화에 특히 효과적임을 발견하였다. 조합체는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 형성하는 UL130과 UL131A의 복합체일 수 있거나, 항체는 UL130과 UL131A 중 하나에 대한 것일 수 있으며, 특이성을 띠기 위해서는 타 단백질의 존재가 필요하다.
또한, 본 발명은 항체가 결합하는 에피토프의 특성규명, 및 면역반응의 도출에 있어서 상기 에피토프의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 및 이들이 결합하는 에피토프를 수반하는 다양한 방법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명의 항체
본 발명은 hCMV의 중화에 특히 높은 효능을 갖는 모노클로날 또는 재조합 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 재조합 또는 모노클로날 항체의 단편, 특히 항체의 항원-결합 활성을 보유한 단편, 예를 들면, hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 대하여 특이성을 띠는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 보유하는 단편을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "hCMV 중화에 높은 효능"이란 본 발명의 항체 분자가 표준 분석법에서 당업계에 공지된 항체보다, 예를 들어, MSL-109와 비교하여, 훨씬 낮은 농도에서 hCMV를 중화시킴을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 0.16 ㎍/ml 이하(즉, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.016, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004 이하), 바람직하게는 0.016 ㎍/ml 이하(10-8 이하, 바람직하게는 10-9 M 이하, 바람직하게는 10-10 M 이하, 즉, 10-11M, 10-12M, 10-13M 이하의 항체 농도)의 농도에서 중화시킬 수 있다. 이는 hCMV의 동일 역가의 중화에 요구되는 MSL-109의 농도와 비교하여, 시험관내에서 hCMV의 임상 분리주의 50% 중화에 매우 낮은 농도의 항체만이 요구됨을 의미한다. 바람직하게는, hCMV의 임상 분리주에 의한 내피세포, 상피세포 및 수지상세포의 감염을 50% 중화시키는 데 요구되는 본 발명 항체의 농도는 MSL-109에 의해 요구되는 것보다 50배 이상(즉, 75, 100, 150, 200배 이상) 더 낮다. 효능은 당업계에 기술된 표준 중화법을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 항체는 hCMV를 중화시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 섬유아세포 또는 내피세포의 감염을 방지한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 내피세포의 감염을 방지한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 섬유아세포와 내피세포 모두의 감염을 방지한다. 또한, 본 발명의 항체는 바람직하게는 망막세포와 같은 상피세포 및 수지상세포의 감염도 방지한다.
이들 항체는 적절한 제형에 따라 예방제 또는 치료제로, 또는 진단 도구로 사용될 수 있다.
"중화 항체"는 숙주에서 감염을 개시하고/거나 영속시키는 병원체의 능력을 중화시킬 수 있는 항체이다. 본 발명은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)로부터의 항원을 인식하는 중화 모노클로날 인간 항체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 UL130와 UL131A의 조합체에 대하여 특이성을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 본원에서 1F11 또는 2F4로 언급되는 모노클로날 항체이다. 이들 항체는 hCMV 감염 도너로부터 최초로 분리되었으며, 1F11 또는 2F4로 언급되는 불멸화 B 세포 클론에 의해 생성된다. 이들 항체는 내피세포, 상피세포, 망막세포 및 수지상세포의 hCMV 감염을 중화시키는 것으로 나타났다. 또한, 상이한 hCMV 감염 도너로부터 분리된, 항체 5A2 및 9A11는 UL130와 UL131A의 조합체에 대한 동일한 특이성 및 내피, 상피, 망막 및 수지상세포의 hCMV 감염 중화능을 보인다. 이들 항체는 각각 5A2 및 9A11로 언급되는 불멸화 B 세포 클론에 의해 생성된다.
1F11는 서열번호: 7에 열거한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 8에 열거한 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성된다. 2F4는 서열번호: 17에 열거한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 18에 열거한 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성된다. 항체 중쇄의 CDR은 각각 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로 언급된다. 이와 유사하게, 항체 경쇄의 CDR은 각각 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로 언급된다. CDR 아미노산의 위치는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 다음과 같이 규정된다[12, 13, 14]: CDR1 - IMGT 위치 27 내지 38, CDR2 - IMGT 위치 56 내지 65, 및 CDR3 - IMGT 위치 105 내지 117.
5A2는 서열번호: 39에 열거된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 40에 열거된 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성된다.
이들 항체의 CDR의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112009047733557-PCT00001
또한, 본 발명은 1F11 또는 2F4로부터의 하나 이상(즉, 1, 2 또는 3개 전부)의 중쇄 CDR(서열번호: 1-3 또는 11-13)를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 또한 본 발명에는, 5A2로부터의 하나 이상(즉, 1, 2 또는 3개 전부)의 중쇄 CDR(서열번호: 33-35)을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체도 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 (i) CDRH1에 대한 서열번호: 1, CDRH2에 대한 서열번호: 2 및 CDRH3에 대한 서열번호: 3, 또는 (ii) CDRH1에 대한 서열번호: 11, CDRH2에 대한 서열번호: 12 및 CDRH3에 대한 서열번호: 13를 포함하는 중쇄를 포함한다. 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 항체는 CDRH1에 대한 서열번호: 33, CDRH2에 대한 서열번호: 34 및 CDRH3에 대한 서열번호: 35를 포함하는 중쇄를 포함한다.
또한, 본 발명은 1F11 또는 2F4로부터의 하나 이상(즉, 1, 2 또는 3개 전부)의 경쇄 CDR(서열번호: 4-6 또는 14-16)을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 또한 본 발명에는 경쇄 5A2로부터의 하나 이상(즉, 1, 2 또는 3개 전부)의 경쇄 CDR(서열번호: 36-38)을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 (i) CDRL1에 대한 서열번호: 4, CDRL2에 대한 서열번호: 5 및 CDRL3에 대한 서열번호: 6, 또는 (ii) CDRL1에 대한 서열번호: 14, CDRL2에 대한 서열번호: 15 및 CDRL3에 대한 서열번호: 16을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 항체는 CDRL1에 대한 서열번호: 36, CDRL2에 대한 서열번호: 37 및 CDRL3에 대한 서열번호: 38을 포함하는 경쇄를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 서열번호: 7, 17 또는 39에 열거된 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 서열번호: 8, 18 또는 40에 열거된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
1F11로부터의 하나 이상의 CDR 및 2F4로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 하이브리드 항체 분자도 존재할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 하이브리드 항체는 1F11로부터의 3개의 CDR 및 2F4로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 따라서, 바람직한 하이브리드 항체는 i) 1F11로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 2F4로부터의 3개의 중쇄 CDR을 포함하거나, 또는 ii) 1F11로부터의 3개의 중쇄 CDR 및 2F4로부터의 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 이와 달리, 이러한 하이브리드는 5A2로부터의 하나 이상의 CDR을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 경쇄와 중쇄 및 CDR의 일부 또는 전부를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 핵산 서열은 서열번호: 9(1F11 중쇄 가변 영역 코딩), 서열번호: 10(1F11 경쇄 가변 영역 코딩), 서열번호: 19(2F4 중쇄 가변 영역 코딩), 및 서열번호: 20(2F4 경쇄 가변 영역 코딩)을 포함한다. 다양한 종류의 CDR을 코딩하는 바람직한 핵산 서열은 서열번호: 21(1F11 CDRH1 코딩), 서열번호: 22(1F11 CDRH2 코딩), 서열번호: 23(1F11 CDRH3 코딩), 서열번호: 24(1F11 CDRL1 코딩), 서열번호: 25(1F11 CDRL2 코딩), 서열번호: 26(1F11 CDRL3 코딩), 서열번호: 27(2F4 CDRH1 코딩), 서열번호: 28(2F4 CDRH2 코딩), 서열번호: 29(2F4 CDRH3 코딩), 서열번호: 30(2F4 CDRL1 코딩), 서열번호: 31(2F4 CDRL2 코딩) 및 서열번호: 32(2F4 CDRL3 코딩)를 포함한다. 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 핵산 서열은 서열번호: 41(5A2 중쇄 가변 영역 코딩), 서열번호: 42(5A2 경쇄 가변 영역 코딩), 서열번호: 43(5A2 CDRH1 코딩), 서열번호: 44(5A2 CDRH2 코딩), 서열번호: 45(5A2 CDRH3 코딩), 서열번호: 46(5A2 CDRL1 코딩), 서열번호: 47(5A2 CDRL2 코딩), 서열번호: 48(5A2 CDRL3 코딩)을 포함한다. 유전 암호의 중복성에 기인하여, 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 서열들의 변이체가 존재하게 된다.
변이체 항체 역시 본 발명의 범위 안에 포함된다. 따라서, 본원에 열거된 서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 안에 포함된다. 이러한 변이체는 전술한 바와 같이 유전 암호의 축퇴성에 기인할 수 있다. 이와 달리, 전사 또는 해독에서의 오류로 인해 천연 변이체가 발생할 수 있다. 2F4의 변이체 또한 본원에 개시된다. 이러한 변이체는 2F4 중쇄 아미노산 서열(서열번호: 17)의 C-말단에 부가적인 두 개의 세린 잔기를 포함한다. 따라서, 2F4의 이러한 변이체는 서열번호: 49에 열거된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 18에 열거된 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 구성된다. 변이체 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 서열번호: 50에 열거하였다. 따라서, 2F4 변이체 중쇄(서열번호: 49)를 포함하는 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
향상된 친화력을 갖는 항체 서열의 또 다른 변이체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있으며, 본 발명의 범위 안에 포함된다. 예를 들면, 아미노산 치환을 이용하여 친화력이 더욱 향상된 항체를 수득할 수 있다. 이와 달리, 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화를 이용하여 항체 생산을 위한 발현 시스템에서의 해독 효율을 향상시킬 수 있다.
바람직하게는, 이러한 변이체 항체 서열은 본원에 열거된 서열과 70% 이상(즉, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% 이상)의 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는. 이러한 서열 동일성은 참조 서열(즉, 본원에 열거된 서열)의 전장에 관하여 계산된다. 바람직하게는, 본원에서 언급되는 %동일성은 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 및 gap extension penalty=1]에 의해 명시된 기본 매개변수를 사용하는 BLAST version 2.1.3을 이용하여 측정된다.
또한 본 발명의 범위 안에는 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는, 벡터, 예를 들면 발현 벡터도 포함된다. 이러한 벡터로 형질전환된 세포도 본 발명의 범위 안에 포함된다.
또한, 본 발명은 모노클로날 항체 1F11 또는 2F4에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모노클로날 항체 5A2에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
모노클로날 및 재조합 항체는 이들에 대한 개개의 폴리펩타이드 또는 다른 항원의 동정 및 정제에 특히 유용하다. 본 발명의 항체는 면역학적 측정, 방사면역 측정(RIA) 또는 효소면역 측정(ELISA)에 시약으로 활용될 수 있다는 점에서 부가적인 유용성이 있다. 이러한 적용에서, 항체는 방사성 동위 원소, 형광 분자 또는 효소와 같은 분석적으로 검출가능한 시약으로 표지될 수 있다. 항체는 또한 항원의 분자적 동정 및 특성규명(에피토프 맵핑)에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 처리 부위로 전달하기 위한 약물에 또는 검출가능한 표지물에 커플링시켜 hCMV로 감염된 세포와 같은 해당 세포를 포함하는 부위의 이미지 형성을 촉진시킬 수 있다. 약물 및 검출가능한 표지물에 항체를 커플링시키는 방법은 검출가능한 표지물을 사용하는 이미지 형성 방법과 같이 당업계에 익히 공지되어 있다. 표지된 항체는 광범위의 표지물을 활용하는 다양한 종류의 분석법에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체와 해당 에피토프(hCMV 에피토프)간의 항체-항원 복합체 형성의 검출은 검출가능한 물질을 항체에 부착시킴으로써 촉진될 수 있다. 적당한 검출 수단에는 방사성핵종, 효소, 조효소, 형광 물질, 화학발광 물질, 색원체, 효소 물질 또는 보인자, 효소 억제제, 보결 분자단 복합체, 유리기, 입자, 염료 등의 사용이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되며; 적합한 보결 분자단 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리쓰린이 포함되며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생물발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린이 포함되며; 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 포함된다. 이러한 표지된 시약은 방사면역 측정, 효소면역 측정, 즉, ELISA, 형광면역 측정 등의 다양한 종류의 익히 공지된 측정법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 15-18 참조.
본 발명에 따른 항체는 사이톡신, 치료제, 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성 동위 원소와 같은 치료성분에 접합시킬 수 있다. 방사성 동위 원소의 예로는 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 등이 포함되며, 이에 국한되지 않는다. 이러한 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 조절하는데 사용될 수 있으며; 약물 성분은 종래의 화학적 치료제에 국한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들면, 약물 성분은 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들면, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소가 포함될 수 있다.
그러한 치료 성분을 항체와 접합하기 위한 기술은 익히 공지되어 있다. 예를 들면 하기 문헌 참조: Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurds, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; and Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158.
이와 달리, 항체는 문헌 19에 기재된 바와 같이 항체 이형접합체를 형성하기 위하여 2차 항체에 접합시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와 표지물간에는 링커가 사용될 수도 있다[20]. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성 요오드, 인듐, 이트륨, 또는 당업계에 공지된 기타 방사성 입자로 직접 표지될 수 있다[21]. 처리는 동시에 또는 후속하여 투여된 접합 및 비-접합 항체와의 처리의 병행으로 이루어질 수 있다[22, 23].
본 발명의 항체는 고체 지지체에 부착될 수 있다.
추가적으로, 항체는, 예를 들면, 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위하여 폴리머에 공유결합시켜 화학적으로 변형될 수 있다. 바람직한 폴리머, 및 이들을 펩타이드에 부착시키는 방법은 문헌 24-27에 실려있다. 바람직한 폴리머는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성이고, 하기의 일반식을 갖는다:
R(O--CH2 --CH2)n O--R
상기 식에서, R은 수소일 수 있거나, 또는 알킬 또는 알칸올 기와 같은 보호기일 수 있다.
바람직하게는, 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 가지며, 더욱 바람직하게는 메틸이다. 부호 n은 양의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 1,000, 더욱 바람직하게는 2 내지 500이다. PEG는 바람직한 평균 분자량이 1,000 내지 40,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 20,000, 가장 바람직하게는 3,000 내지 12,000이다. 바람직하게는, PEG는 적어도 하나의 하이드록시 기를 가지며, 더욱 바람직하게는 하이드록시 기는 말단 하이드록시 그룹이다. 이 하이드록시 기는 바람직하게는 억제제 상의 유리 아미노 기와 반응하도록 활성화되는 기이다. 그러나, 반응성 기의 유형과 양은 본 발명의 공유결합된 PEG/항체를 달성하도록 변화될 수 있음이 이해될 것이다.
수용성 폴리옥시에틸화 폴리올 역시도 본 발명에 유용하다. 이러한 폴리올에는 폴리옥시에틸화 솔비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 폴리옥시에틸화 글리세롤(POG)이 포함된다. POG가 바람직하다. 바람직한 이유 중 하나는 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 골격이, 예를 들면, 모노-, 디-, 트리글리세라이드에 있어서 동물과 인간에서 자연적으로 발생하는 동일한 골격이기 때문이다. 따라서, 이러한 분기(branching)가 반드시 체내에서 이물질로 간주되지는 않을 것이다. POG는 PEG와 동일한 범위의 바람직한 분자량을 갖는다. POG에 대한 구조는 문헌 28에, POG/IL-2 접합체에 대한 논의는 문헌 24에서 찾을 수 있다.
순환 반감기를 증가시키기 위한 또 다른 약물 전달 시스템은 리포좀이다. 리포좀 전달 시스템의 제조방법은 문헌 29, 30 및 31에 논의되어 있다. 다른 약물 전달 시스템도 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 32 및 33에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 순수한 형태로 제공된다. 통상적으로, 항체는 다른 폴리펩타이드가 실질적으로 존재하지 않는, 예를 들면, 조성물의 90%(중량 기준) 미만, 일반적으로 60% 미만, 더욱 일반적으로는 50% 미만이 다른 폴리펩타이드로 구성되는 조성물에 존재하게 될 것이다.
본 발명의 항체는 비-인간(또는 이종) 숙주, 예를 들면, 마우스에서 면역원성일 수 있다. 특히, 항체는 비-인간 숙주에서는 면역원성이지만, 인간 숙주에서는 면역원성이 아닌 이디오토프(idiotope)를 가질 수 있다. 인간 용도의 본 발명의 항체는 마우스, 염소, 토끼, 래트, 비-영장 포유류 등과 같은 숙주로부터 수득될 수 없고, 인간화에 의해 또는 제노마우스(xeno-mice)로부터 수득될 수 없는 것들이 포함된다.
본 발명의 항체는 임의의 아이소타입(예를 들면, IgA, IgG, IgM, α, γ 또는 μ중쇄)일 수 있지만, 일반적으로는 IgG일 것이다. IgG 아이소타입에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다.
항체의 생산
본 발명에 따른 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법 중 하나로 제조될 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용한 모노클로날 항체의 제조를 위한 일반적인 방법론은 익히 공지되어 있다[34,35]. 바람직하게는, 문헌 36에 기재된 대안의 EBV 불멸화 방법이 사용된다.
문헌 36에 기재된 방법을 사용하여, 본 발명의 항체를 생산하는 B-세포를 폴리클로날 B 세포 활성제의 존재하에 EBV로 형질전환시킬 수 있다. EBV에 의한 형질전환은 표준 기술이며, 폴리클로날 B 세포 활성제를 포함하도록 용이하게 적응시킬 수 있다.
세포 성장 및 분화의 부가적인 자극제를 형질전환 단계 중에 첨가하여 효율을 더욱 증진시킬 수도 있다. 이러한 자극제는 IL-2 및 IL-15와 같은 사이토카인일 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, IL-2를 불멸화 단계 중에 첨가하여 불멸화의 효율을 더욱 향상시킬 수 있지만, 이의 사용이 필수적인 것은 아니다.
이어서, 이들 방법을 사용하여 생성된 불멸화 B 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양할 수 있으며, 그로부터 항체를 분리한다.
모노클로날 항체는 필요하다면, 여과, 원심분리, 및 HPLC 또는 친화 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피법을 이용하여 좀더 정제될 수 있다. 제약등급 항체 생산기술을 포함한 모노클로날 항체 정제기술은 당업계에 익히 공지되어 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 단편은 펩신 또는 파파인 같은 효소로의 소화를 포함하는 방법에 의해, 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 이와 달리, 모노클로날 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄 서열 부분의 클로닝 및 발현에 의해 수득될 수도 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유도된 단일쇄 Fv 단편(scFv)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체로부터의 CDR을 포함하는 scFv를 포함한다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 모노머와 다이머 및 단일쇄 항체, 예를 들면, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 펩타이드 링커에 의해 연결되는 단일쇄 Fv도 본 발명에 포함된다.
분자생물학의 표준기술을 사용하여 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 목적하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 완전하게 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 유발법 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술이 필요에 따라 사용될 수 있다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들면, E. coli, 및 기타 미생물 시스템이 부분적으로는, Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편, 특히 Fv 단편 및 단일쇄 항체 단편, 예를 들면, 단일쇄 Fvs의 발현용으로 사용될 수 있다. 진핵세포, 예를 들면, 포유류 숙주 세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자를 포함한 거대 항체 분자의 생산용으로 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO, HEK293T, PER.C6, 골수종 또는 하이브리도마 세포이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및 항체 분자를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자의 생산방법을 제공한다.
항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 포함할 수 있으며, 그런 경우에, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드-코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키도록 사용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄 모두를 포함하는 생성물의 생산을 위해서는, 세포주는 두 종류의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제 1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제 2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 이와 달리, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터가 사용될 수도 있다.
또 다른 방법으로는, 본 발명에 따른 항체는 i) 본 발명에 따른 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 단계, 및 ii) 발현된 항체 생성물을 분리하는 단계에 의해 생산될 수 있다. 부가적으로, 상기 방법은 iii) 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
B 세포의 스크리닝 및 분리
형질전환된 B 세포를 목적하는 항원 특이성의 항체를 생산하는 세포들에 대해 스크리닝하며, 이어서 개개의 B 세포 클론이 양성 세포로부터 생성될 수 있다.
스크리닝 단계는 방사면역 측정, 조직 또는 세포(형질감염된 세포 포함)의 염색, 중화법 또는 목적하는 항원 특이성의 확인을 위한 당업계에 공지된 다수의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 분석법은 단순 항원 인식에 기초하여 선택할 수 있거나, 또는 목적하는 기능에 추가로 기초하여, 예를 들면, 단순히 항원-결합 항체를 선택하기 보다는 중화 항체를 선택하고, 시그널링 캐스케이드, 형태, 성장 속도, 다른 세포에 영향을 미치는 능력, 다른 세포에 의한 영향에 대한 반응과 같은 표적화 세포의 특징을 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해, 또는 다른 시약에 의해 또는 조건, 분화 상태 등의 변화에 의해 선택될 수 있다.
양성 세포의 혼합물로부터 개별 클론을 분리하는 클로닝 단계는 제한 희석법, 현미조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 당업계 공지된 다른 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 클로닝은 한계 희석법을 사용하여 수행된다.
본 발명의 불멸화 B 세포 클론은 다양한 방식으로, 예를 들면, 모노클로날 항체의 공급원으로서, 해당 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산(DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구목적 등으로 사용될 수 있다.
본 발명은 불멸화 B 메모리 림프구를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 림프구는 hCMV에 특이적인 높은 중화 효능을 갖는 항체를 생산하고, 여기에서 항체는 ≥5 pg/세포/일의 비율로 생산된다. 또한, 본 발명은 불멸화 B 메모리 림프구의 클론을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 클론은 hCMV에 특이적인 높은 친화력을 갖는 모노클로날 항체를 생산하고, 여기에서 항체는 ≥10N ng/클론/일의 비율로 생산된다. 바람직하게는, 상기 클론은 hCMV 감염의 중화에 높은 효능을 지닌 모노클로날 항체를 생산한다.
본 발명에 따른 바람직한 불멸화 B 세포 클론은 1F11 및 2F4이다. 또 다른 바람직한 클론은 5A2 및 9A11이다.
에피토프
전술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 이들이 결합하는 에피토프의 맵핑에 이용될 수 있다. 본 출원인은 내피세포, 상피세포, 망막세포 및 수지상세포의 hCMV 감염을 중화시키는 항체 1F11, 2F4, 5A2 및 9A11가 UL130과 UL131A의 조합체 상에서 발견되는 에피토프 쪽으로 지향됨을 발견하였다. 비록 본 출원인은 이러한 이론에 구애받기를 원치 않지만, 항체 1F11 및 2F4는 이들 두 단백질에 의해 형성된 입체구조 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다. 또한, 5A2 및 9A11도 UL130와 UL131A에 의해 형성된 입체구조 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다.
1F11, 2F4, 5A2, 및 9A11는 섬유아세포의 감염을 중화시키지 않는다는 사실에 근거하여, 이들 항체는 인간 모노클로날 항체 10C6, 5F1, 6B4 및 7H3에 대한 상이한 에피토프를 인식하는 것으로 생각된다. 또한, 모노클로날 항체 10C6, 5F1, 7H3 및 6B4는 gB의 기능성 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다.
이들 항체에 의해 인식되는 에피토프는 다수의 용도를 가질 수 있다. 정제형 또는 합성형의 에피토프 및 미모토프(mimotope)는 면역반응의 도출(즉, 백신으로서, 또는 다른 사용목적을 위한 항체의 사용)에 또는 에피토프 또는 미모토프와 면역반응하는 항체에 대한 환자 혈청의 스크리닝에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 에피토프 또는 미모토프, 또는 이러한 에피토프 또는 미모토프를 포함하는 항원은 면역반응 도출용 백신으로 사용된다. 본 발명의 항체는 또한 백신 품질의 모니터링, 특히 백신 중의 항원이 정확한 면역원성 에피토프를 정확한 입체구조로 함유하는지를 체크하기 위한 방법에도 사용될 수 있다.
에피토프는 또한 이에 결합하는 리간드를 위한 스크리닝에도 사용될 수 있다. 이러한 리간드는 바람직하게는 에피토프를 차단하고, 그에 따라 감염을 예방한다. 이러한 리간드는 본 발명의 범위 안에 포함된다.
재조합 발현
본 발명의 불멸화 메모리 B 림프구는 또한 후속 재조합 발현을 위한 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산의 공급원으로 사용될 수 있다. 재조합원으로부터의 발현은, 예를 들면 안정성, 재현성, 배양의 용이함 등의 이유로 해서, B 세포 또는 하이브리도마로부터의 발현보다 제약학적 목적으로 더 일반적이다.
따라서, 본 발명은 (i)　해당 항체를 코딩하는 B 세포 클론으로부터 하나 이상의 핵산(예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄 유전자)를 수득하는 단계; 및 (ii) 수득된 핵산을 발현 숙주에 삽입하여 그 숙주에서 해당 항체의 발현을 허용하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
이와 유사하게, 본 발명은 (i)　해당 항체를 코딩하는 B 세포 클론으로부터 핵산(들)을 서열분석하는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터의 서열정보를 이용하여 발현 숙주에 삽입하기 위한 핵산(들)을 제조하여 그 숙주에서 해당 항체의 발현을 허용하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 숙주 세포를 해당 모노클로날 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 핵산은 본 발명의 불멸화 B 세포 클론으로부터 유도되는 핵산인 재조합 세포의 제조방법을 제공한다. 따라서, 핵산(들)을 먼저 제조한 다음, 이를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 절차는 상이한 장소(예를 들면,　상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 상이한 시간에 수행될 수 있다.
이어서, 본 발명의 재조합 세포는 발현 및 배양 목적으로 사용될 수 있다. 이들은 대규모 약제생산용 항체의 발현에 특히 유용하다. 이들 재조합 세포는 또한 약학 조성물의 활성 성분으로도 사용될 수 있다. 정치 배양, 롤러 바틀 배양, 복수배양(腹水培養), 중공섬유형 생물반응기 카트리지, 모듈식 미니 발효조, 교반 탱크, 미립담체 배양, 세라믹 코어 관류 등을 포함한(이에 국한되지 않음) 임의의 적당한 배양 기술이 사용될 수 있다.
B 세포로부터 면역글로불린 유전자를 수득하고 서열분석하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 37 참조).
발현 숙주는 바람직하게는, 효모 및 동물 세포, 특히 포유류 세포(예를 들면, CHO 세포, PER.C6 세포[Crucell; 문헌 38] 또는 HKB-11 세포[Bayer; 문헌 39 & 40]와 같은 인간 세포, 골수종 세포 [41 & 42] 등), 및 식물 세포를 포함한 진핵 세포이다. 바람직한 발현 숙주는 본 발명의 항체를, 특히 그 자체로는 인체에서 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로 당화시킬 수 있다. 무혈청 배지에서 발육할 수 있는 발현 숙주가 바람직하다. 동물-유래 생성물의 존재 없이 배양배지에서 발육할 수 있는 발현 숙주가 바람직하다.
발현 숙주는 배양되어 세포주를 생성할 수 있다.
본 발명은 (i) 본 발명에 따른 불멸화 B 세포 클론을 제조하는 단계; 및 (ii) B 세포 클론으로부터 해당 항체를 코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 해당 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들면, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 불멸화 B 세포 클론을 제조하는 단계; 및 (ii) 해당 항체를 코딩하는 B 세포 클론으로부터 핵산을 서열분석하는 단계를 포함하는, 해당 항체를 코딩하는 핵산 서열을 수득하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 B 세포로부터 수득되는 B 세포 클론으로부터 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 해당 항체를 코딩하는 핵산 분자(들)을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, B 세포 클론을 먼저 수득한 다음, 이로부터 핵산(들)을 제조하는 절차는 상이한 장소(예를 들면,　상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에 수행될 수 있다.
본 발명은 (i)　해당 항체를 발현하는 선택된 B 세포 클론으로부터 하나 이상의 핵산(예를 들면, 중쇄 및 경쇄 유전자)을 수득 및/또는 서열분석하는 단계; (ii) 상기 핵산(들)을 삽입하거나 이를 사용하여 해당 항체를 발현할 수 있는 발현 숙주를 제조하는 단계; (iii) 발현 숙주를 해당 항체가 발현되는 조건하에서 배양 또는 계대배양하는 단계; 및, 임의로, (iv) 해당 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체(예를 들면, 제약학적 용도를 위한)를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 발현 숙주 세포 집단을 해당 항체가 발현되는 조건하에서 배양 또는 계대배양하는 단계, 및 임의로, 해당 항체를 정제하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 발현 숙주 세포 집단은 (i) 전술한 바와 같이 제조된 B 메모리 림프구의 집단에 의해 생산되는 항체를 코딩하는 핵산(들)을 제공하는 단계, (ii) 핵산(들)을 해당 항체를 발현할 수 있는 발현 숙주에 삽입하는 단계, 및 (iii) 상기 삽입된 핵산을 포함하는 발현 숙주를 배양 또는 계대배양하여 상기 발현 숙주 세포 집단을 생산하는 단계에 의해 제조되는, 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 재조합 발현 숙주를 먼저 제조한 다음, 이를 배양하여 항체를 발현시키는 절차는 상이한 장소(예를 들면,　상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에 수행될 수 있다.
약학 조성물
제품 Herceptin™(trastuzumab), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™(Palivizumab), Zenapax™(daclizumab) 등을 포함하여, 약제의 활성 성분으로서 항체의 사용은 이제 널리 보급되어 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 및/또는 이러한 항체를 코딩하는 핵산 및/또는 이러한 항체 및/또는 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프를 발현하는 불멸화 B 세포를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 또한 투여를 허용하기 위하여 약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체로는 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독하지 않아야 한다. 적합한 담체는 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자와 같은 크고 느리게 대사되는 마크로입자일 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같은 무기산 염, 또는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염이 사용될 수 있다.
치료 조성물 중의 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 부가적으로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질이 그러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 흡수를 위해, 약학 조성물이 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제 및 현탁액제로서 제형될 수 있게 해준다.
투여를 위한 바람직한 형태는 예를 들면, 주사 또는 주입에 의해, 예를 들면 일시 주사 또는 연속 주입에 의한, 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유탁액 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 성분을 함유할 수 있다. 이와 달리, 항체 분자는 적당한 멸균액과의 사용 전에 재구성을 위해 건조 형태로 존재할 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상에 직접 투여될 수 있다. 조성물은 인간 대상에의 투여를 위해 적응되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 복강내, 수막강내, 심실내, 경피, 피부통과, 국소, 피하, 비내, 장내, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함한(이에 국한되지 않음) 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하기 위하여 피하분사기도 사용될 수 있다. 통상적으로, 치료 조성물은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주사 가능 약물 형태로 제조될 수 있다. 주사 전 액상 비히클 중의 용액 또는 현탁액용으로 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 투여에 의해 달성되거나, 또는 조성물은 조직의 간질공으로 전달될 것이다. 조성물은 또한 병변 부위에 투여될 수 있다. 투약 처치는 단회 투여 스케쥴 또는 복수회 투여 스케쥴일 수 있다. 공지의 항체-기반 약제는 투여 빈도, 예를 들면, 약물이 일, 주, 월 단위 등으로 투여되어야 하는지와 관련한 지침을 제공한다. 빈도와 복용량은 또한 증상의 중증도에 좌우될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주사 가능 약물 형태로 제조될 수 있다. 주사 전 액상 비히클 중의 용액 또는 현탁액용으로 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다(예를 들면, SynagisTM 및 HerceptinTM과 같은, 방부제를 함유하는 멸균수로 재구성하기 위한 동결건조 조성물). 조성물은 국소 투여용으로, 예를 들면, 연고, 크림 또는 파우더로서 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여용으로, 예를 들면, 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽(임의로 향미제 첨가)으로서 제조될 수 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 폐 투여용으로, 예를 들면, 흡입제로서 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 페서리로서 제조될 수 있다. 조성물은 비내, 이내 또는 안내 투여용으로, 예를 들면, 점적제로서 제조될 수 있다. 조성물은 배합된 조성물이 환자에 투여하기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충제를 구비하여 키트 형태로 제공될 수 있다.
조성물 중의 활성 성분이 항체 분자임이 감지될 것이다. 이와 같이, 항체는 위장관에서의 분해에 노출되기 쉽다. 따라서, 조성물을 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여하고자 하는 경우, 조성물은 항체를 분해로부터 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되고 나면 항체를 방출하는 제제를 함유해야 할 필요가 있을 것이다.
약학적으로 허용가능한 담체에 대한 상세한 논의는 문헌(Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472)으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 5.5 내지 8.5, 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 바람직하게는 약 7의 pH를 갖는다. pH는 완충제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 조성물은 멸균성 및/또는 무-발열원성이다. 조성물은 인간에 대하여 등장성일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 밀봉 용기로 공급된다.
약학 조성물은 하나 이상의 본 발명의 항체 및/또는 하나 이상의 본 발명의 불멸화 B 세포 및/또는 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 유효량, 즉, 목적하는 질환 또는 증상을 치료하거나, 호전시키거나, 또는 예방하기에 충분하거나, 또는 검출 가능한 치료 효과를 발휘하기에 충분한 양을 포함할 것이다. 치료 효과는 신체적 증상의 감소도 포함한다. 특정 대상에 대한 정확한 유효량은 대상의 크기와 건강상태, 증상의 특성과 정도, 및 투여를 위해 선택되는 치료제 또는 이의 조합에 따라 좌우될 것이다. 주어진 상황에 대한 유효량은 일상적인 실험에 의해 결정되고 임상의의 판단 범위 안에 있다. 본 발명의 목적상, 유효 용량은 일반적으로, 투여되는 개체에서 본 발명 조성물이 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 것이다. 공지의 항체-기반 약제는 이와 관련한 지침을 제공하며, 예를 들면, HerceptinTM은 21　mg/ml 용액의 정맥내 주입에 의해 투여되며, 이때 초기 부하 용량을 4 mg/kg체중으로 하고, 주간 유지량을 2 mg/kg체중으로 한다; RituxanTM은 주당 375 mg/m2의 용량으로 투여된다.
조성물은, 특히, 항체가 상이한 항원(또는 동일 항원내 상이한 에피토프)에 결합하는 경우에, 상가적(additive) 또는 상승적(synergistic) 치료 효과를 제공하기 위하여 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5 등)의 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 1종의 항체는 UL130-UL131A 조합체(또는 복합체)에 결합할 수 있는 반면에, 다른 한 종은 gH에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 1종의 항체는 UL130-UL131A 조합체(또는 복합체)에 결합할 수 있고, 반면에 다른 한 종은 gB에 결합할 수 있다. 따라서, 1종의 항체는 섬유아세포의 감염을 매개하는 메커니즘에 대해 표적화될 수 있고, 반면에 다른 한 종의 항체는 내피세포의 감염을 매개하는 메커니즘에 대해 표적화될 수 있다. 최적의 임상 효과를 위해서는, hCMV 감염과 유지의 두 메커니즘 모두를 다루는 것이 또한 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체는 다른 치료제와, 예를 들면, 화학요법 화합물, 방사선 요법 등과(병행하여 또는 개별적으로) 투여될 수도 있다. 바람직한 치료 화합물로는 갠시클로비어, 포스카르넷 및 시도포비어와 같은 항바이러스 화합물이 포함된다. 이러한 병행요법은, 단독 투여시의 개별 치료제에 비해, 치료 효능에 있어 상가적 또는 상승적 개선을 제공한다. 용어 "상승작용"이란 각각의 개별 활성 약제의 개별 효과의 합보다 큰, 두 종 이상의 활성 약제의 복합효과를 기술하기 위하여 사용된다. 따라서, 두 종 이상의 활성 약제의 복합효과가 활성 또는 과정의 "상승적 저해"를 초래하는 경우, 활성 또는 과정의 저해가 각각의 개별 활성 약제의 저해 효과의 합보다 큰 것으로 의도된다. 용어 "상승적 치료 효과"란 치료 효과(임의의 다수 파라미터에 의해 측정)가 각각의 개별 요법으로 관찰되는 개별 치료 효과의 합보다 큰, 두 종 이상의 요법의 병행으로 관찰되는 치료 효과를 의미한다.
항체는 이전에 hCMV 감염에 대한 치료에 반응을 보이지 않은, 즉, 항-hCMV 치료에 굴절성인 것으로 나타난 환자에 투여될 수 있다. 이러한 치료는 항바이러스제에 의한 전처리를 포함한다. 이러한 치료 불감응성은 예를 들면, hCMV의 항바이러스 내성 균주로의 감염에 기인할 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 본 발명의 조성물에서, 항체는 바람직하게는 조성물 내 총 단백질의 적어도 50 중량%(예를 들면, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상)를 구성한다. 항체는 따라서 정제된 형태이다.
본 발명은 (i) 본 발명의 항체를 제조하는 단계; 및 (ii) 정제된 항체를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하고, 여기에서 항체는 본 발명의 형질전환된 B 세포로부터 수득된 모노클로날 항체인, 약제를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 모노클로날 항체를 먼저 수득한 다음, 약제를 제조하는 절차는 상이한 장소(예를 들면,　상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에 수행될 수 있다.
치료 목적을 위한 항체 또는 B 세포의 전달에 대한 다른 방도로, 핵산(통상적으로 DNA)을 해당 모노클로날 항체(또는 이의 활성 단편)을 코딩하는 대상에 투여함으로써, 핵산이 대상 자체에서(in situ) 발현되어 목적하는 치료 효과를 제공하도록 할 수 있다. 적합한 유전자 요법 및 핵산 전달 벡터는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 면역원성 조성물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 hCMV 단백질 UL130과 UL131A의 조합체 상에서 발견되는 에피토프를 포함하는 항원을 포함하는 백신 조성물이다. 또 다른 조성물은 (i) hCMV 단백질 UL130과 UL131A의 조합체 상에서 발견되는 에피토프를 포함하는 항원, 및 (ii) hCMV gB 상에서 발견되는 에피토프를 포함하는 항원을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방성(즉, 감염의 예방) 또는 치료성(즉, 감염의 치료)일 수 있지만, 통상적으로는 예방성일 것이다.
조성물은 특히 복수회 투여 포맷으로 포장될 경우, 항균제를 포함할 수 있다.
조성물은 세제, 예를 들면, Tween 80과 같은 Tween(폴리솔베이트)를 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로 저수준, 예를 들면, 0.01% 미만의 수준으로 존재한다.
조성물은 긴장성을 제공하기 위하여 나트륨 염(예를 들면, 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 10±2 mg/ml NaCl의 농도가 일반적이다.
조성물은, 특히 조성물을 동결시킬 경우 또는 조성물이 동결건조된 물질로부터 재구성되는 물질을 포함하는 경우, 당 알코올(예를 들면, 만니톨) 또는 디사카라이드(예를 들면, 수크로스 또는 트레할로스)를, 예를 들면, 약 15 내지 30 mg/ml(예를 들면, 25 mg/ml)로 포함할 수 있다. 동결건조용 조성물의 pH는 동결건조에 앞서 6.1 근처로 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역조절제 중 하나 이상은 보조제를 포함한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 세포-매개성 면역반응과 체액성 면역반응 모두를 도출하여 hCMV 감염을 효과적으로 처리할 것이다. 이러한 면역반응은 바람직하게는 장기-지속성(예를 들면, 중화) 항체 및 hCMV에 노출시 신속하게 반응할 수 있는 세포-매개성 면역을 유도할 것이다.
내과적 처리 및 용도
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 hCMV 감염의 치료, hCMV 감염의 예방 또는 hCMV 감염의 진단용으로 사용될 수 있다.
진단방법은 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 예를 들면, 타액선, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌 또는 피부로부터 취한 조직 샘플일 수 있다. 진단방법은 또한 항원/항체 복합체의 검출을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, (i) 본 발명에 따른 항체, (ii) 본 발명에 따른 불멸화 B 세포 클론, (iii) 1F11 또는 2F4 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프, 또는 (iv) 5A2 또는 9A11 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 항체, (ii) 1F11 또는 2F4 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프, 또는 (iii) 5A2 또는 9A11 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 hCMV 감염의 예방 또는 치료용 약물의 제조에 있어서, (i) 본 발명에 따른 항체, (ii) 본 발명에 따른 불멸화 B 세포 클론, (iii) 1F11 또는 2F4 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프, (iv) 1F11 또는 2F4 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체, (v) 5A2 또는 9A11 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프, 또는 (vi) 5A2 또는 9A11 중 하나에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 약물로서 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자의 치료 및/또는 환자에서의 진단용 약물의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 및/또는 이러한 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 단백질의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상을 치료하고/하거나 대상에서 진단을 수행하는 방법을 제공한다. 대상은 바람직하게는 인간이다. 치료적 처치의 효능을 체크하는 한가지 방법은 본 발명 조성물의 투여 후 질환의 증상을 모니터링하는 단계를 포함한다. 처치는 단회 투여 스케쥴 또는 복수회 투여 스케쥴일 수 있다. 본 발명은 CMV 감염에 유용하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 불멸화 B 세포 클론, 에피토프 또는 조성물은 특히 hCMV 감염의 우려가 있거나 이에 감수성인 대상군에 투여된다. 그러한 대상군은 HIV를 앓고 있거나 또는 장기이식 환자와 같이 면역억제 요법을 받고 있는 대상과 같은 면역저하(immunocompromised) 환자를 포함한다.
본 발명의 항체는 수동면역법에 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 바의 항체 및 이의 단편은 hCMV 감염 진단용 키트에도 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 모노클로날 항체 1F11 또는 2F4에 결합할 수 있는 에피토프는 보호성 항-hCMV 항체의 존재를 검출함으로써 백신접종 처치의 효능을 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 모노클로날 항체 5A2 또는 9A11에 결합할 수 있는 에피토프는 보호성 항-hCMV 항체의 존재를 검출함으로써 백신접종 처치의 효능을 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 바의 항체 및 이의 단편은 또한 목적하는 면역원성을 띠는 백신 제조를 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 모노클로날 항체를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하고, 여기에서 모노클로날 항체는 본 발명의 발현 숙주로부터 수득되는 모노클로날 항체인, 약제를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 모노클로날 항체를 먼저 수득한 다음(예를 들면, 항체의 발현 및/또는 항체의 정제), 항체를 의약 담체(들)과 혼합하는 절차는 상이한 장소(예를 들면,　상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에 수행될 수 있다.
본 발명의 형질전환된 B 세포로 출발하여, 배양, 계대배양, 클로닝, 서브-클로닝, 서열분석, 핵산 제조 등의 다양한 단계를 수행함으로써 형질전환된 B 세포에 의해 발현된 항체를 불멸화시킬 수 있으며, 이때 각각의 단계에서는 임의의 최적화가 이루어진다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 항체를 코딩하는 핵산에 적용되는 최적화(예를 들면, 친화력 성숙 또는 최적화)의 기술을 추가로 포함한다. 본 발명은 그러한 단계 동안 사용되고 제조되는 모든 세포, 핵산, 벡터, 서열, 항체 등을 포함한다.
이들 방법 모두에서, 발현 숙주에 사용된 핵산은 특정 핵산 서열을 삽입, 결실 또는 수정하기 위하여 단계 (ii)와 (iii) 사이에서 조작될 수 있다. 이러한 조작처리로부터 생기는 변화는 제한부위 도입을 위한 변화, 코돈 사용빈도를 수정하기 위한 변화, 전사 및/또는 해독 조절 서열의 첨가 또는 최적화를 위한 변화 등을 포함하며, 이에 국한되지는 않는다. 또한, 핵산을 변화시켜 코딩된 아미노산을 변경하는 것도 가능하다. 예를 들면, 항체의 아미노산 서열에 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)의 아미노산 치환, 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)의 아미노산 삽입을 도입하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 이펙터(effector) 기능, 항원-결합 친화력, 해독후 변형, 면역원성 등을 수정할 수 있고, 공유결합군(예를 들면, 표지물)의 부착을 위한 아미노산을 도입할 수 있거나 또는 태그(예를 들면, 정제 목적으로)를 도입할 수 있다. 돌연변이는 특정 부위에 도입될 수 있거나, 또는 무작위로 도입된 다음, 선택(예를 들면, 분자 진화)을 수행할 수 있다.
일반
용어 "포함하는(comprising)"는 "포함하는(including)"과 "이루어진(consisting)"을 모두 포함하며, 예를 들면, X를 포함하는(comprising) 조성물은 X만으로 이루어질 수 있거나 또는 어떤 부가성분, 예를 들면, X + Y를 포함할 수 있다.
용어 "실질적으로(substantially)"는 "완전히(completely)"룰 배제하지 않으며, 예를 들면, Y가 실질적으로 존재하지 않는 조성물은 Y가 완전히 존재하지 않을 수 있다. 필요에 따라, 용어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 x에 관하여 용어 "약(about)"은 예를 들면, x±10%를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "질환(disease)"은 일반적으로 동의어로 의도되며, 용어 모두가 정상적인 기능작동을 손상시키고, 통상적으로 특징적인 징후로 발현되며, 인간 또는 동물에 삶의 존속이나 질의 단축을 가져오는 인간 또는 동물의 신체 또는 이의 기관들 중 하나의 비정상적인 상태를 반영한다는 점에서 용어 "이상(disorder)" 및 "증상(condition)"(의학적 상태에서와 같이)과 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 환자의 "치료"에 대한 언급은 예방과 치료를 포함하도록 의도된다. 용어 "환자"는 인간을 포함한 모든 포유류를 의미한다. 환자의 예는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지, 및 토끼를 포함한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
도 1은 인간 모노클로날 항체 (1) 1F11와 (2) 2F4는 hCMV 단백질의 복합체를 침전시키는 반면에, 무관계한 IgG는 hCMV 단백질의 복합체를 침전시키지 않음을 증명하는 SDS-PAGE 결과를 도시한다.
도 2는 인간 모노클로날 항체 (A) 1F11와 2F4, 및 (B) 5A2와 9A11는 UL130 및 UL131A 유전자 산물에 의해 생성된 입체구조 에피토프를 인식함을 증명하는 FACS 분석 결과를 도시한다.
도 3은 1F11 및 2F4의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. CDR 서열은 볼드체로 나타내었다.
도 4는 인간 모노클로날 항체 7H3, 10C6, 5F1 및 6B4가 hCMV 단백질 gB 상의 에피토프를 인식함을 증명하는 FACS 분석 결과를 도시한다.
도 5는 5A2의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. CDR 서열은 볼드체로 나타내었다.
실시예 1: B 세포의 클로닝 및 hCMV 중화 활성에 대한 스크리닝
혈청에 고-hCMV 중화 항체 역가를 갖는 두 도너를 동정하였다. 메모리 B 세포를 분리하고, 문헌 36에 기재된 바와 같이 EBV와 CpG를 사용하여 불멸화하였다. 간단히 말하면, 메모리 B 세포를 CD22 비드를 사용하여 음성 선택에 의해 분리한 다음, 특이적 항체 및 세포 분류를 이용하여 IgM+, IgD+ IgA+ B 세포를 제거하였다. 분류된 세포(IgG+)를 CpG 2006와 방사선 처리된 동종이계(allogeneic) 단핵구의 존 재하에 EBV로 불멸화 하였다. 각각 50개의 메모리 B 세포를 함유하는 복제 배양액(replicate culture)을 20개의 96-웰 U자형 바닥 플레이트에 셋업하였다. 2주 후에 배양 상등액을 수집하고, 별도의 분석법으로 그들의 섬유아세포 또는 상피세포의 hCMV 감염 중화능에 대해 시험하였다. B 세포 클론을 문헌 36에 기재된 바와 같이 양성 폴리클로날 배양액으로부터 분리하였다. 선택된 클론의 상등액내 IgG 농도를 IgG-특이적 ELISA를 이용하여 측정하였다.
바이러스 중화 분석을 위해, hCMV 임상 분리주의 적정된 양을 동일 부피의 배양 상등액과, 또는 중화 항체를 함유하는 인간 혈청의 희석액과 혼합하였다. 실온에서 1시간 배양 후, 혼합물을 96-웰 평평한 바닥 플레이트내 내피세포(예를 들면, HUVEC 세포) 또는 섬유아세포의 융합성 단층에 첨가하고, 37℃에서 2일간 배양하였다. 상등액은 버리고, 세포를 냉-메탄올로 고정하여, 마우스 모노클로날 항체와 hCMV 초기 항원의 혼합물로 염색한 다음, 플루오레신-표지 염소 항-마우스 Ig로 염색하였다. 플레이트를 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 중화 항체의 부재하에서는 감염된 세포는 현미경 시야당 약 1000개인 반면, 포화 농도의 중화 항체 존재하에서는 감염이 완전히 억제되었다. 중화 역가는 hCMV 감염의 50% 감소를 제공하는 항체의 농도(㎍/ml)로서 표시한다.
하기의 표 2는 3종의 상이한 유형의 항체가 동정됨을 나타낸다. 섬유아세포의 감염을 중화시킬 수 있는 항체, 내피세포의 감염을 중화시킬 수 있는 항체, 및 양자 모두의 감염을 중화시킬 수 있는 항체. 이러한 결과는 상이한 종류의 단백질이 특정 세포 유형쪽으로의 향성에 관여한다는 이전의 데이터와 일치한다[7]. 내 피세포의 중화 외에도, 1F11 및 2F4는 망막세포와 같은 상피세포, 및 수지상세포(데이터 나타내지 않음)의 감염도 중화시키는 것으로 관찰되었다.
Figure 112009047733557-PCT00002
일부 항체는 0.3 내지 0.5 ㎍/ml 범위의 IgG 농도에서 섬유아세포와 내피세포 모두의 감염을 중화시켰다. 다른 항체(1F11, 5A2, 9A11 및 2F4)는 섬유아세포의 hCMV 감염을 중화시키지는 못했지만, 내피세포의 감염은 중화시켰고, 0.001 내지 0.004 ㎍/ml 범위의 지극히 낮은 농도에서도 중화시켰다(이전에 알려진 항체보다 1000배 이상 더 강력).
초기의 특성규명 이래로, 5F1는 gH보다는 gB의 에피토프에 결합함이 측정되었음에 주목하라. 이러한 사실은 7H3, 10C6 및 6B4에 대해 관찰된 바와 같이 gB 차단이 섬유아세포 감염의 중화를 허용함을 증명하는 결과와 일치한다.
실시예 2: 모노클로날 항체에 의해 인식된 표적 항원의 동정
인간 MRC-9 섬유아세포를 hCMV 임상 분리주로 감염시켰다. 3일 후에 세포를 35S 메티오닌과 시스테인으로 대사적으로 표지하였다. 용해물의 사전 제거 후, 인간 모노클로날 항체 1F11 및 2F4를 첨가하고, 단백질 A 비드를 첨가하여 면역복합체를 침전시킨 다음, SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 1). 무관계한 특이성을 갖는 인간 모노클로날 IgG 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 수득된 결과는 인간 모노클로날 항체 1F11 및 2F4가 CMV 단백질의 복합체를 침전시킴을 보여준다.
인간 모노클로날 항체의 특이성을 맵핑하기 위하여, 시그널 펩타이드가 결여된 헤마글루티닌(HA)-표지 UL128Δ1-27, UL130Δ1-25 및 UL131AΔ1-18 hCMV 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 작제하였다. HEK293T 세포를 이들 벡터 각각 단독으로 또는 함께 형질감염시켰다. 36 시간 후, 세포를 고정하고, 투과성이 되게 만들고, 항-HA 항체(형질감염의 효율에 대한 대조군)와 모노클로날 항체로 염색한 다음, 염소 항-인간 IgG로 염색하였다. 무관계한 특이성을 갖는 HuMab IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 2A는 인간 모노클로날 항체 1F11 및 2F4가 UL130 및 UL131A 유전자 산물에 의해 생성된 입체구조 에피토프를 인식함을 보여준다. 도 2B는 인간 모노클로날 항체 5A2 및 9A11가 UL130 및 UL131A 유전자 산물에 의해 생성된 입체구조 에피토프를 인식함을 보여준다.
결론
상기 결과는 인간 내피세포의 hCMV 감염을 높은 효능과 선택성으로 중화시킬 수 있는 두 인간 모노클로날 항체를 규정한다. 인식된 에피토프를 동정하기 위하여, 항체를 hCMV-감염 세포로부터의 단백질을 면역침전시키는 능력에 대해 시험하였다(도 1). 인간 Mabs 1F11 및 2F4는 약 15, 33 내지 35 및 약 100 KDa의 겉보기 분자량을 갖는 수 종의 단백질을 침전시켰다. 이러한 패턴은 gH, gL 및 UL128, UL130 및 아마도 UL131A을 함유하는 복합체의 침전과 부합한다.
이들 항체의 표적을 좀더 잘 규정하기 위하여, HA-표지 UL128, UL130 및 UL131A를 코딩하는 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포를 염색하는 그들의 능력을 특성규명하였다. 2A에 도시된 바와 같이, 1F11 및 2F4는 UL130와 UL131A를 함께 발현하는 세포만을 염색시켰으며, 이러한 결과는 이들 항체가 두 유전자 산물에 의해 결정된 입체구조 에피토프를 인식함을 시사한다. 이러한 결론은 이들 항체가 웨스턴 블럿에서, 환원, 변성 조건하에서 수행된 감염 또는 형질감염된 세포의 용해물과 반응하지 않는다는 사실에 의해 지지된다(데이터 나타내지 않음).
이와 유사한 결과가 5A2 및 9A11에 대해서도 관찰되었다. 도 2b는 이들 항체가 UL130과 UL131A를 함께 발현하는 세포만을 염색시켰음을 보여주며, 이러한 결과는 이들 항체가 두 유전자 산물에 의해 결정된 입체구조 에피토프를 인식함을 시사한다.
실시예 3: 모노클로날 항체에 의해 인식된 표적 항원의 추가 동정
섬유아세포의 감염을 중화하는 인간 모노클로날 항체의 특이성을 맵핑하기 위하여, 전장 gB를 코딩하는 발현 벡터을 작제하였다. HEK293T 세포를 상기 벡터로 형질감염시켰다. 36 시간 후, 세포를 고정하고, 투과성이 되게 만들고, 인간 모노클로날 항체(HuMab)로 염색한 다음, 염소 항-인간 IgG로 염색하였다. 도 4는 모노클로날 항체 7H3, 10C6, 5F1, 및 6B4(그러나 무관계한 특이성을 띠는 IgG 항체는 제외)가 gB로 형질감염된 세포를 특이적으로 염색시켰음을 보여주며, 이러한 결과는 이들 항체가 gB의 에피토프를 인식함을 시사한다. 주목할만한 것은, 모노클로날 항체 10C6, 5F1 및 6B4는 섬유아세포 및 내피세포의 감염을 중화시키는 반면에, 모노클로날 항체 7H3은 섬유아세포의 감염을 중화시킨다는 것이다(그러나 내피세포의 감염은 아님). 이러한 개념은 모노클로날 항체 10C6, 5F1, 및 6B4가 모노클로날 항체 7H3에 의해 결합된 에피토프와는 별개인 gB의 기능성 에피토프에 결합함을 시사한다.
본 발명은 단지 예로서 기술되었으며, 본 발명의 범위와 취지 안에 들어오면서 다양한 수정이 가해질 수 있음이 이해된다.
참고문헌 (문헌의 내용은 본원에 참조로 편입된다)
Figure 112009047733557-PCT00003
Figure 112009047733557-PCT00004
SEQUENCE LISTING <110> HUMABS LLC <120> HUMAN CYTOMEGALOVIRUS NEUTRALISING ANTIBODIES AND USE THEREOF <130> P045812WO <150> GB 0700133.2 <151> 2007-01-04 <160> 50 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRH1 amino acid sequence <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRH2 amino acid sequence <400> 2 Ile Ser Phe Asp Gly Asp Asn Lys 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRH3 amino acid sequence <400> 3 Ala Arg Glu Glu Leu Val Gly Leu Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Asp Val <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRL1 amino acid sequence <400> 4 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Phe 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRL2 amino acid sequence <400> 5 Asp Asn Asp 1 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F11 CDRL3 amino 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<210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 CDRL2 amino acid sequence <400> 37 Trp Ala Ser 1 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 CDRL3 amino acid sequence <400> 38 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr 1 5 <210> 39 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 heavy chain amino acid sequence <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asn Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Val 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Leu Ser Gly Pro Met Glu Met Pro Gly Gly Tyr Tyr 100 105 110 Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 light chain amino acid sequence <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 41 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 heavy chain nucleotide sequence <400> 41 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgtta tccactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatggggggg atcatcccta tctttaatac agcaaactac 180 gcacagaagg tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga 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5A2 CDRH3 nucleotide sequence <400> 45 gcgagggatt ttctatcagg tcctatggaa atgcccggcg gctactacgg tttggacgtc 60 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 CDRL1 nucleotide sequence <400> 46 cagagtgttt tatacagttc caacaataag aactac 36 <210> 47 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 CDRL2 nucleotide sequence <400> 47 tgggcatct 9 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5A2 CDRL3 nucleotide sequence <400> 48 cagcaatatt atagtactcc tatcacc 27 <210> 49 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant 2F4 heavy chain amino acid sequence <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Lys Met Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Gly Ala Ile Met Leu His Ala Met Thr Asp Tyr Gly 100 105 110 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 50 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant 2F4 heavy chain nucleotide sequence <400> 50 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcaat acatatggga tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatgggatg atggaagtaa aatgtaccat 180 gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacactgtat 240 ctccaaatga acagtctgag agccgaggat acggctgtgt attactgtgc gagagacgag 300 ggtgcaataa tgctgcacgc catgactgac tacggtttgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acagtcaccg tctcctca 378

Claims (68)

  1. 인간 사이토메갈로바이러스의 중화에 높은 효능을 갖는 중화 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 10-8M 이하의 친화력을 갖는 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, hCMV의 임상 분리주의 50% 중화에 요구되는 항체의 농도가 0.1 ㎍/ml 이하인 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, MSL109의 친화력보다 적어도 50배를 초과하는 hCMV에 대한 친화력을 갖는 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 hCMV 단백질 UL130/UL131A의 조합체에 대해 특이성을 띠는 항체.
  6. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 내지 6, 11 내지 16 또는 33 내지 38 중 하나 이상을 포함하는 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 내지 3, 11 내지 13 또는 33 내지 35 중 하 나 이상을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  8. 제 1 항에 있어서, CDRH1에 대한 서열번호: 1, CDRH2에 대한 서열번호: 2 및 CDRH3에 대한 서열번호: 3을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  9. 제 1 항에 있어서, CDRH1에 대한 서열번호: 11, CDRH2에 대한 서열번호: 12 및 CDRH3에 대한 서열번호: 13을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  10. 제 1 항에 있어서, CDRH1에 대한 서열번호: 33, CDRH2에 대한 서열번호: 34 및 CDRH3에 대한 서열번호: 35를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  11. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 4 내지 6, 14 내지 16 또는 36 내지 38 중 하나 이상을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  12. 제 1 항에 있어서, CDRL1에 대한 서열번호: 4, CDRL2에 대한 서열번호: 5 및 CDRL3에 대한 서열번호: 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  13. 제 1 항에 있어서, CDRL1에 대한 서열번호: 14, CDRL2에 대한 서열번호: 15 및 CDRL3에 대한 서열번호: 16을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  14. 제 1 항에 있어서, CDRL1에 대한 서열번호: 36, CDRL2에 대한 서열번호: 37 및 CDRL3에 대한 서열번호: 38을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  15. 제 8 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호: 7에 열거된 서열을 갖는 항체.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호: 17에 열거된 서열을 갖는 항체.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호: 39에 열거된 서열을 갖는 항체.
  18. 제 12 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호: 8에 열거된 서열을 갖는 항체.
  19. 제 13 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호: 18에 열거된 서열을 갖는 항체.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호: 40에 열거된 서열을 갖는 항체.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 모노클로날 항체인 항체.
  22. 제 15 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 1F11인 항체.
  23. 제 16 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 2F4인 항체.
  24. 제 17 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 5A2인 항체.
  25. 제 7 항 또는 제 11 항에 따른 항체에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 단편.
  27. 제 26 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편인 단편.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열번호: 9, 10, 19, 20, 21 내지 32, 또는 41 내지 48 중 어느 하나를 포함하는 핵산 분자.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  31. 제 30 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  32. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 발현하는 불멸화 B 세포 클론.
  33. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체에 결합하는 에피토프.
  34. 제 33 항에 따른 에피토프를 포함하는 면역원성 폴리펩타이드.
  35. (i) 제 10 항에 따른 불멸화 B 세포 클론을 배양하는 단계; 및
    (ii) 항체를 분리하는 단계를 포함하는,
    제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 핵산, 제 32 항에 따른 불멸화 B 세포 클론 또는 제 34 항에 따른 면역원성 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체 또는 단편 및 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체 또는 단편을 포함하는 약학 조성물.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  39. 치료 또는 진단에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 핵산, 제 32 항에 따른 불멸화 B 세포 클론 또는 제 34 항에 따른 면역원성 폴리펩타이드.
  40. (i) hCMV 감염 치료용 약물의 제조, 또는 (ii) 백신에 있어서, 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 제 28 항 또는 제 29 항에 따른 핵산, 제 32 항에 따른 불멸화 B 세포 클론 또는 제 34 항에 따른 면역원성 폴리펩타이드의 용도.
  41. hCMV 감염 치료용 약물의 제조에 있어서, 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 항체 또는 단편 및 제 2 에피토프에 특이적인 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 제 2 항체 또는 단편의 용도.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 상기 환자가 hCMV에 대한 기존 치료에 굴 절성인(refractive) 용도.
  43. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 상기 환자가 미리 투여되거나, 나중에 투여되거나 또는 항바이러제와 동시에 투여되는 용도.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 항바이러제가 갠시클로비어, 포스카르넷 또는 시도포비어 중에서 선택되는 용도.
  45. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 상기 환자가 면역저하된 용도.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 환자가 HIV를 보유하거나 장기이식 환자인 용도.
  47. 제 37 항 또는 제 41 항에 있어서, 상기 제 1 항체 또는 단편이 UL130/UL131A 복합체에 대해 특이성을 나타내는 조성물 또는 용도.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 제 2 항체 또는 단편이 gH에 대해 특이성을 나타내는 조성물 또는 용도.
  49. 제 36 항 내지 제 38 항 또는 제 47 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 또는 제 28 항 또는 제 29 항의 핵산을 포함하는, hCMV 감염 진단용 키트.
  51. (i)　제 32 항에서 정의된 B 세포 클론으로부터 핵산을 서열분석하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)로부터의 서열정보를 이용하여 발현 숙주에 삽입하기 위한 핵산을 제조하여 그 숙주에서 해당 항체의 발현을 허용하는 단계를 포함하는,
    재조합 세포를 제조하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 핵산은 제한부위의 도입, 코돈 사용빈도의 변화, 및/또는 전사 및/또는 해독 조절 서열의 최적화를 위하여 단계 (i)와 (ii) 사이에서 조작되는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 상기 발현 숙주가 진핵 세포인 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 진핵 세포가 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 동물 세포가 포유류 세포인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 동물 세포가 CHO 또는 인간 세포인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 인간 세포가 PER.C6 세포, HEK293T 세포 또는 HKB-11 세포인 방법.
  58. 제 51 항의 방법에 의해 수득 가능한 발현 숙주를 해당 항체가 발현되는 조건하에서 배양 또는 계대배양하는 단계; 및 선택적으로,
    (iv) 해당 항체를 정제하는 단계를 포함하는,
    제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 방법.
  59. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 사용하여 폴리펩타이드 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하는,
    hCMV에 대항하여 면역반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 스크리닝하는 방법.
  60. 백신 중의 항원이 정확한 에피토프를 정확한 입체구조로 함유하는지를 체크함으로써 항-hCMV 백신의 품질을 모니터링하기 위한, 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편의 용도.
  61. 제 40 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 내피세포, 망막세포와 같은 상피세포 및 수지상세포와 같은 골수성 세포의 감염을 방지하는 용도.
  62. 제 1 항에 있어서, hCMV의 임상 분리주에 의한 내피세포, 상피세포 및 수지상세포의 감염의 50% 중화에 요구되는 항체의 농도가 0.1 ㎍/ml 이하인 항체.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 항체의 농도가 0.01 ㎍/ml 이하인 항체.
  64. 제 62 항에 있어서, 상기 상피세포가 망막세포인 항체.
  65. 제 62 항에 있어서, 상기 항체가 hCMV 단백질 UL130/UL131A의 조합체에 대해 특이성을 띠는 항체.
  66. (i) 치료에, (ii) hCMV 감염 치료용 약물의 제조에, 또는 (iii) 백신으로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체에 특이적으로 결합하는 에피토프.
  67. hCMV 감염을 중화시킬 수 있는 리간드의 스크리닝을 위한, 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항체에 특이적으로 결합하는 에피토프.
  68. 제 1 항에 있어서, hCMV의 임상 분리주에 의한 내피세포, 상피세포 및 수지상세포의 감염의 50% 중화에 요구되는 항체의 농도는 MSL-109에 의해 요구되는 것보다 50배 이상 더 낮은 항체.
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