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Abstract

MéTODO PARA IMORTALIZAçãO DE UMA POPULAçãO DE CéLULAS, POPULAçãO DE CéLULAS, POPULAçãO DE CéLULAS OLIGOCLONAL OU MONOCLONAL, CULTURA CELULAR, SOBRENADANTE DE UMA CULTURA CELULAR, BIBLIOTECA DE DNAS, USO DE UMA POPULAçãO DE CéLULAS, CULTURA CELULAR SOBRENADANTE OU BIBLIOTECA DE DNAS, KIT PARA IDENTIFICAR E PRODUZIR UM ANTICORPO MONOCLONAL, MéTODO PARA PRODUZIR UMA CULTURA CELULAR, E MéTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO MONOCLONAL. A presente invenção proporciona métodos para a imortalização de células que secretam anticorpos de um ou mais isotipos específicos. As populações de células policlonais, oligoclonais e monoclonais, obtidas por uso dos métodos da invenção, podem ser triadas com base nas atividades funcional e/ou de ligação dos anticorpos que secretam, por exemplo, dirigidas a antígenos de origem humana ou viral tendo interesse médico, em condições de cultura celular. Usando-se esses métodos, as células B humanas, que secretam anticorpos ligando-se a citomegalovírus, vírus simplex da herpes ou proteína HSP60, foram imortalizadas eficientemente com vírus Epstein-Barr.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA IMORTALIZAÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS, POPULAÇÃO DE CÉLULAS, POPULAÇÃO DE CÉLULAS OLIGOCLONAL OU MONOCLONAL, CULTURA CELULAR, SOBRENADANTE DE UMA CULTURA CELULAR, BIBLIOTECA DE DNAS, USO DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS, CULTURA CELULAR, SOBRENADANTE OU BIBLIOTECA DE DNAS, KIT PARA IDENTIFICAR E PRODUZIR UM ANTICORPO MONOCLONAL, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CULTURA CELULAR, E MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO MONOCLONAL".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a processos para obtenção de células imortalizadas que secretam anticorpos, em particular aqueles de origem humana, e que secretam anticorpos tendo alta especificidade para antígenos de interesse médico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os anticorpos são proteínas que ocorrem naturalmente produzidas por sistemas imunes, para combater antígenos de proteínas e de não proteínas e disparar uma resposta defensiva para eliminá-los.

Recentemente, uma abordagem inteiramente terapêutica (denominada imunoterapia passiva ou seroterapia passiva) foi formada nas características de ligação de antígenos de anticorpos dirigidos a moléculas humanas ou não. A imunoterapia passiva consiste da administração de composições farmacêuticas, compreendendo anticorpos terapêuticos com uma especificidade de antígeno definida para uma molécula patogênica (por exemplo, uma toxina, uma proteína, um vírus, um parasita, ou uma célula), a pacientes cujo sistema imune é incapaz de produzi-los nas quantidades e/ou com a especificidade requerida para bloquear e/ou eliminar o patógeno (Dunman PM e Nesin m, 2003; Keller MA e Stiehm ER, 2000).

Essa abordagem foi introduzida com sucesso em prática clínica no início da década de 1980, e desde então o uso de anticorpos terapêuticos rapidamente expandiu as oportunidades para o tratamento de uma ampla variedade de doenças, incluindo doenças infecciosas, doenças mediadas imunes e câncer, resultando em crescimento constante do setor de anticorpos monoclonais terapêuticos (Chatenoud L, 2005; Pavlou A e Belsey M, 2005; Laffy E e Sodoyer R, 2005).

Os anticorpos terapêuticos adequados para imunoterapia passiva são aqueles homogêneos, e de especificidade e atividades bem definidas. Essas propriedades podem ser determinadas mais precisa e confiavelmente para um anticorpo monoclonal (isto é, um anticorpo secretado por um único clone de células secretando anticorpos) em vez de para um anticorpo policlonal (isto é, uma mistura complexa de anticorpos secretados por diferentes clones de células secretórias de anticorpos).

Desde a década de 1970, diferentes tecnologias foram desenvolvidas para isolar, propagar e manter grandes conjuntos de linhas celulares, cada uma delas derivada de uma única cultura celular monoclonal secretando um anticorpo monoclonal (mAb), a ser testado, usando os ensaios adequados, para identificar aqueles tendo as propriedades desejadas.

Dois importantes aspectos técnicos são comuns a todos esses processos:

a) como proporcionar o anticorpo em quantidades suficientes para os ensaios funcionais, que são necessários para identificar e caracterizar o anticorpo, antes de conduzir quaisquer experimentação in vivo;

b) como garantir que o próprio anticorpo terapêutico não é reconhecido como um antígeno pelo sistema imune do paciente, dando partida à eliminação do anticorpo terapêutico e/ou às reações inflamatórias imunes que podem ser perigosas para o paciente.

O primeiro aspecto é relacionado com a dificuldade na propagação e na manutenção de células secretórias de anticorpos em cultura, em um tempo suficiente para que se tenha o material biológico para testar. Essa inconveniência foi resolvida por qualquer uma de imortalização e manutenção na cultura das células secretórias de anticorpos primárias, nas quais os ácidos nucléicos codificando os anticorpos foram inicialmente gerados e expressos, ou por uso de técnicas de DNA recombinante, para isolar os ácidos nucléicos codificadores de anticorpos dessas células, e transferência delas para as células imortalizadas, nas quais podem ser expressas e mantidas.

No passado, as células secretórias de anticorpos primárias eram imortalizadas em condições de cultura celular, ou por fusão delas com célula já imortalizadas (formando células híbridas ou hibridomas que podem ser mantidos mais facilmente), ou por uso de agentes (tais como vírus), que alteram o mecanismo celular das células secretórias de anticorpos primárias, de um modo que as células se propagam quase que indefinidamente.

O problema de garantir a segurança do paciente foi resolvido no passado ou fazendo-se uso de células e ácidos nucléicos de origem humana para produzir anticorpos, ou por modificação dos genes codificando anticorpos não humanos, que têm um potencial imunogênico, com seqüência de origem humana, um processo de "humanização" conduzido usando tecnologias de DNA recombinante.

Em conclusão, a imunoterapia passiva pode conferir uma proteção rápida e eficiente contra infecções e outras patologias. No entanto, cada processo para isolar, triar e produzir anticorpos monoclonais inteiramente compatíveis com o tratamento em seres humanos sofre de um tipo diferente de dificuldade, como revisto sucintamente abaixo.

A tecnologia de hibridomas, descrita primeiro por Kohler e Milstein (Kohler G e Milstein C, 1975), propiciou o isolamento de clones em crescimento contínuo de células secretórias de anticorpos, após serem fundidos a um tipo celular imortalizado adequado. Os hibridomas foram derivados de células secretórias de anticorpos humanos (Olsson L e Kaplan H, 1980), mas o processo para produzir hibridomas não provou ser robusto, devido à falta de parceiros de fusão de mieloma ou linfoblasto humano adequados e à instabilidade de homoibridomas humanos / humanos e heteroibridomas humanos / de murino.

A humanização de anticorpos de murinos pode ser feita por enxerto da região de ligação do antígeno do anticorpo monoclonal de murino na espinha dorsal de uma molécula de anticorpo humano, produzindo uma molécula quimérica, e por substituição de resíduos de murinos específicos com outros aminoácidos humanos, para reduzir a antigenicidade por abordagens moleculares (Hwang W e Foote J, 1005; Carter P, 2006).

Há vários anticorpos "humanizados" atualmente em uso ou em ensaios clínicos. No entanto, esses anticorpos ainda contêm de 5 - 10% de seqüências de proteínas de murinos (ou não inteiramente humanas), e podem elicita uma resposta imune que limita a eficiência terapêutica desses medicamentos. Além disso, o processo de humanização é intenso em trabalho e resulta, em algumas vezes, em variações na ligação de anticorpos.

Portanto, esse processo foi usado em grande parte com células secretórias de anticorpos originárias em roedores imunizados com o antígeno relevante. Supondo que as seqüências de origem de murinos podem ser imunogênicas em seres humanos, os mAbs resultantes podem elicitar respostas antimurino humanas, tendo uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos prejudicada, e/ou ser rapidamente eliminados do corpo. Além do mais, mesmo anticorpos idênticos de regiões variáveis podem apresentar diferentes propriedades funcionais e imunogênicas (Torres M et al., 2005).

As abordagens principais para a produção de anticorpos monoclonais inteiramente humanos são baseados na clonagem e na expressão de genes de imunoglobulina humanos usando tecnologias de DNA recombinante.

Em um primeiro caso, as bibliotecas de fragmentos de seqüências de anticorpos codificando seqüências de DNA, incluindo regiões de ligação de antígenos, podem ser amplificadas de tecidos humanos e inseridas em fago bacteriano, propiciando a "exibição" de fragmentos de ligação de antígenos na superfície do fago e a triagem subseqüente. Os anticorpos monoclonais contra patógenos humanos foram produzidos, partindo do grande repertório de anticorpos derivado de pacientes, que foram clonados e triados usando tecnologias de exibição dè fagos (Mancini N et al., 2004).

No entanto, como empregado sob a maior parte das circunstâncias, essas bibliotecas podem ser ineficazes para identificar anticorpos terapêuticos, uma vez que os genes de anticorpos não são selecionados como o sistema imune faz in vivo, por um lado, para eliminar as seqüências no repertório de anticorpos humanos, que podem elicitar uma resposta imune, e, por outro lado, para selecionar as seqüências de anticorpos resultantes da maturação de afinidade. Desse modo, a maturação de afinidade in vitro complexa e outras tecnologias propiciando alterações de seqüências diretas são necessárias para aperfeiçoar os anticorpos dessas bibliotecas (Hoet R et al., 2005).

Em um segundo caso, camundongos transgênicos expressando genes de anticorpos podem ser imunizados com antígenos de interesse, para produzir células de murinos expressando anticorpos inteiramente humanos (Kellerman S e Green L, 2002). Essa metodologia tem uma vantagem em relação às metodologias de exibição de fagos tradicionais, porque os anticorpos são selecionados in vivo e podem conter uma maior freqüência de anticorpos de alta afinidade. No entanto, o sistema imune de camundongos agindo no meio físico deles pode não gerar anticorpos humanos com a especificidade adequada para um uso terapêutico efetivo.

Desse modo, o anticorpo terapêutico ideal para imunoterapia passiva é um anticorpo monoclonal humano, que é derivado de células imunes humanas, que tenham sido maturadas em um ser humano. No entanto, a seleção e a produção desses anticorpos é um processo intenso em tempo e complexo, uma vez que os processos convencionais para a produção e isolamento de populações de células humanas imortalizadas, viáveis, que secretam anticorpos em cultura celular, são ineficientes.

Os processos de desenvolvimento e a proliferação de células B humanas, propiciando especificidade de antígenos e respostas a longo prazo in vivo, e meios para estudar o processo in vitro de uso das células obtidas do sistema imune foram revistos intensamente (Banchereau J e Rousset, F, 1992; Crotty S e Ahmed R, 2004; Carsetti R, 2004; McHeyzer-Williams L e McHeyzer-Williams M, 2005). No entanto, o isolamento de células B humanas expressando mAbs de interesse foi prejudicado pela incapacidade técnica de produzir linhas celulares secretórias de anticorpos humanos estáveis, mesmo quando atividades de ligação ou neutralização relevantes podem ser detectadas.

Muitas populações diferentes de células secretórias de anticorpos podem ser isoladas de doadores humanos tendo perfis específicos (por exemplo, indivíduos naturais, vacinados, infectados mais ou menos recentemente e soropositivos) e de diferentes tecidos (por exemplo, sangue, amídalas, baço, nós linfáticos), em que as células B residem e exercem as suas atividades (Viau M e Zouali M, 2005).

A identificação de anticorpos monoclonais humanos requer a triagem intensa das populações de células B imortalizadas, em que cada célula secreta um anticorpo monoclonal específico em quantidades suficientes para a sua caracterização em condições de culturas celulares (Cole S et al., 1984; James K e Bell G, 1987; Borrebaeck C, 1989). No entanto, as tecnologias para a seleção, ativação e imortalização de células secretórias de anticorpos estão ainda sofrendo de problemas técnicos (rendimento do anticorpo, eficiência de imortalização, superrepresentação de certos isotipos, estabilidade e crescimento celular), levando a um número insuficiente de células e de anticorpos secretados disponíveis para os ensaios de triagem.

Em vista da dificuldade na obtenção de hibridomas estáveis de células secretórias de anticorpos humanas, um processo, que tem sido muito usado para a produção e isolamento de células secretórias de anticorpos, é a imortalização de células B humanas com vírus Epstein Barr (EBV), que é também conhecido por induzir ativação e proliferação de células B policlonais (Sugimoto M et al., 2004; Bishop G e Busch LK, 2002).

As células secretórias de anticorpos têm sido produzidas por imortalização com EBV, usando diferentes fontes de células B humanas, tal como o sangue periférico de indivíduos saudáveis pré-selecionados usando um antígeno marcado (Casali P et al., 1986), nós linfáticos, baço ou sangue periférico de pacientes (Yamaguchi H et al., 1987; Posner M et al., 1991; Raff H et al., 1988; Steenbakkers P et al., 1993; Steenbakkers P et al., 1994), amídalas (Evans L et al., 1988) ou fluidos pleurais (Wallis Ret al., 1989).

No entanto, em vista da baixa capacidade de transformação, baixa capacidade de clonagem e a instabilidade e heterogeneidade inerentes de células B humanas infectadas com EBV, células secretórias B de anticorpos valiosas são freqüentemente perdidas durante esse procedimento (Chan M et al., 1986; James K e Bell G, 1987), obrigando que um procedimento de fusão celular adicional seja aplicado após infecção de EBV (Bron D et al., 1984; Yamaguchi H et al., 1987; Posner M et al., 1991). De fato, alguns autores concluíram que o melhor processo para a produção de culturas celulares monoclonais humanas secretórias de anticorpos IgG estáveis era baseado na fusão de linfócitos humanos com uma linha celular de mieloma (Niedbala W e Stott D, 1998; Li J el al., 2006), a despeito das dificuldades técnicas com os hibridomas humanos discutidos acima.

Vários esforços foram dirigidos para o aperfeiçoamento do processo de imortalização, por exemplo, por combinação de diferentes abordagens (imortalização com vírus oncogênico, transformação com oncogenes, minieletrofusão, heterofusão camundongo - humana) em um único processo (US 4997764; Steenbakkers P et al., 1993); Dessain SK et al., 2004). Os anticorpos monoclonais humanos foram isolados de células B, que tinham sido ativadas e imortalizadas (na presença ou na ausência de um antígeno), e por combinação de várias manipulações em cultura celular (Borrebaeck C et al., 1988; Davenport C et al., 1992; Laroche-Traineau J et al., 1994; Morgenthaler N et al., 1996; Niedbala W e Kurpisz M, 1993; Mulder A et al., 1993; WO 91/09115; Hur D et al., 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677; WO 88/01642; WO 90/02795; WO 96/40252; WO 02/46233).

Em geral, a literatura dos processos para isolamento e imortalização de células que secretam anticorpos, especialmente de origem humana, não proporciona um entendimento claro de como elaborar todo o processo para a obtenção de um maior repertório de células secretórias de anticorpos imortalizadas, partindo da purificação de células que expressam anticorpos de amostras biológicas, até a triagem dos anticorpos que são secretados em condições de cultura celular.

Seria evidentemente vantajoso proporcionar processos para estabelecer processos mais otimizados, nos quais, por aplicação de meios e condições específicos em cultura celular, para aperfeiçoar a seleção e a viabilidade das células secretórias de anticorpos de uma maneira independente de antígenos (mas tendo isotipos específicos de interesse), uma análise de alta produtividade dos anticorpos secretados pode ser feita na maior população possível de células secretórias de anticorpos imortalizadas mantidas em condições de cultura celular. Esse processo vai também decretar os processos fazendo uso de abordagens moleculares para clonar genes de anticorpos, porque a população de células B, das quais os anticorpos tendo um isotipo de interesse são clonados, pode ser repetidamente analisada para a detecção de células secretórias de anticorpos com uma atividade desejada e armazenada em um estado viável para análise futura.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na observação de que as condições e os meios para seleção, estimulação e imortalização de células secretórias de anticorpos não foram selecionados e combinados de uma maneira efetiva na literatura, para aperfeiçoar a viabilidade celular em condições de cultura e as suas sensibilidades a agentes de imortalização.

De fato, verificou-se surpreendentemente que as combinações específicas dessas condições e meios não apenas aperfeiçoam a imortalização celular, mas melhoram consideravelmente a produtividade e a reprodutibilidade de todo ò processo para geração, em uma maneira independente de antígenos, populações de células imortalizadas que secretam anticorpos de isotipos específicos em altas quantidades e que podem ser armazenados em um estado viável.

Os processos da invenção proporcionam, efetivamente, populações policlonais de células, que podem ser usadas e mantidas como bibliotecas de células específicas de isotipos, secretórias de anticorpos. Usando-se essa abordagem, as populações oligoclonais ou monoclonais específicas de células que secretam, em condições de cultura celular, anticorpos tendo diferentes atividades funcionais e/ou de ligação podem ser detectados e isolados a qualquer momento desejado (Figura 1).

A presente invenção proporciona um processo para a imortalização de uma população de células que secreta anticorpos de um ou mais isotipos específicos, compreendendo as seguintes etapas:

a) seleção da população de células que secreta anticorpos de uma ou mais amostras biológicas, de uma maneira independente de antígenos e com base na expressão de pelo menos um marcador superficial celular;

b) estimulação da dita população de células selecionadas com pelo menos um agente estimulante em condições de cultura celular;

c) eliminação do dito agente estimulante da cultura celular;

d) seleção da população de células estimulada que expressa anticorpos dos ditos isotipos específicos da dita cultura celular;

e) exposição da dita população de células estimulada ao agente de imortalização em condições de cultura celular; e f) eliminação do dito agente de imortalização da dita cultura celular,

em que o agente de imortalização é um agente de imortalização viral.

Além disso, as seguintes etapas podem ser conduzidas após a etapa (f):

g) manter a população de células obtidas da dita cultura celular em condições de cultura celular; e

h) determinar o número, a viabilidade e/ou a atividade de proliferação da população de células que secreta anticorpos dos ditos isotipos específicos na dita cultura celular.

Esse processo esquemático pode ser integrado e adaptado por aplicação de condições e meios adicionais relativos a:

- a identificação de amostras de doadores ou biológicas das quais as células podem ser isoladas;

- os meios específicos para seleção, estimulação e/ou imortalização de células secretórias de anticorpos;

- as condições de cultura celular que propiciam a manutenção, o crescimento e a proliferação da população de células secretórias de anticorpos imortalizadas em condições de cultura celular; - os meios para determinar o número, a viabilidade e/ou a atividade de proliferação da população de células que secreta anticorpos dos ditos isotipos específicos na dita cultura celular; e

- as propriedades desejadas do anticorpo e dos ensaios relacionados que são selecionados para triagem das células secretórias de anticorpos imortalizadas.

Os processos da invenção proporcionam meios e condições para otimização da seleção, estimulação, imortalização e clonagem de células secretórias de anticorpos, no âmbito de obtenção da maior diversidade e número dessas células que podem ser mantidas como uma população de células imortalizadas em condições de cultura celular. De fato, a população de células resultante pode ser considerada como uma biblioteca de células imortalizadas que secretam anticorpos e que pode ser submetida ao ou aos ensaios de triagem desejados, imediatamente após sua produção de acordo com os processos da invenção, ou, parcial ou totalmente, congelada e usada posteriormente em um ou mais ensaios de triagem.

A população de células obtida pelos processos da invenção pode ser dividida em populações de células oligoclonais ou monoclonais, que secretam anticorpos em condições de cultura celular e, em particular, que secretam anticorpos monoclonais com especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas. De fato, o sobrenadante dessas culturas celulares é usado para detectar a ou as culturas contendo os anticorpos tendo tais especificidade de antígeno e/ou atividade biológica. Essas especificidade de antígeno e/ou atividade biológica podem ser dirigidas a qualquer antígeno de ser humano, de mamífero, viral, bacteriano, vegetal, parasita, orgânico ou inorgânico de interesse.

O isolamento bem-sucedido dessa população de células depende do crescimento dessas células, do ensaio usado para fazer a triagem delas e da freqüência das células B específicas de antígeno no material de partida (geralmente sangue periférico de um doador ou de um conjunto de doadores). De fato, as células secretórias de anticorpos imortalizadas devem ser cultivadas sob condições que permitem as máximas proliferação celular e secreção de imunoglobulina, bem como o uso direto de sobrenadantes de culturas celulares para detecção da atividade desejada. Se necessário, a população de células pode ser ainda dividida para triagem de conjuntos de células mostrando especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas, até que uma ou mais culturas celulares, cada uma delas secretando um anticorpo monoclonal tendo as especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas no sobrenadante celular, sejam isoladas.

Um anticorpo monoclonal com especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas pode ser, portanto, produzido por expansão da cultura celular, e purificação do anticorpo monoclonal dos sobrenadantes dessa cultura celular. Adicionalmente, o DNA codificando o anticorpo monoclonal pode ser depois isolado e usado para a expressão recombinante do anticorpo em células hospedeiras.

Outros objetos da presente invenção são populações de células secretórias de anticorpos imortalizadas mantidas em condições de cultura celular (em particular, culturas celulares policlonais, oligoclonais e monoclonais de células secretórias de anticorpos), obtidas pelos processos da invenção, que podem ser usadas para identificar e produzir anticorpos monoclonais tendo as especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas. Os anticorpos podem ser purificados diretamente das culturas celulares ou produzidos como proteínas recombinantes usando as seqüências de DNA codificando-os e isoladas da cultura celular específica. Além disso, as bibliotecas de DNA compreendendo seqüências de DNA que codificam seqüências de anticorpos de um ou mais isotipos específicos, podem ser preparadas usando ácidos nucléicos isolados de uma população de células da invenção, em particular de uma população de células que foi mostrada como secretando anticorpos tendo qualquer tipo de ligação e/ou atividade biológica de interesse.

Outros objetos da presente invenção são relacionados ao uso da população de células, das culturas celulares, dos sobrenadantes das culturas celulares e das bibliotecas de DNA obtidas pelos processos da invenção de células secretórias de anticorpos, para identificação e produção de anticorpos monoclonais. Esses produtos obtidos pelos processos da invenção podem ser também incluídos em kits para identificar e produzir um anticorpo monoclonal tendo as especificidade de antígeno e/ou atividade biológica desejadas, ou usados para determinar as características da resposta imune, específica de isotipo a um antígeno, um vírus, uma célula bacteriana, uma toxina, uma célula parasita, ou uma vacina autólogo ou heterólogo em um indivíduo (ou em uma população de indivíduos).

As populações de células e as culturas celulares obtidas pelos processos da invenção podem ser incluídas nos processos para a produção de culturas celulares que secretam anticorpos monoclonais no sobrenadante de cultura celular, e que podem ser expandidas no âmbito da purificação de anticorpos monoclonais.

Os exemplos proporcionam meios para aplicar os processos da invenção no âmbito da geração de populações imortalizadas com EBV de células B humanas, para obtenção, da mesma amostra biológica, de populações de células monoclonais ou oligoclonais expressando anticorpos IgG humanos específicos de antígenos ou vírus.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Representação esquemática de um processo para isolamento e expressão de anticorpos monoclonais, incluindo os processos da invenção para obtenção de células secretórias de anticorpos imortalizadas.

Figura 2: Efeito na proliferação de células B primárias cultivadas na presença de IL-2 (1.000 U/mL) apenas ou combinadas com CpG2006, LPS, SAC ou CD401L. As células B positivas a CD22 humanas foram purificadas por separação magnética de PBMCs reunidas de cinco doadores. As células B foram cultivadas por 4 dias na presença das concentrações indicadas de compostos. H-Timidina foi adicionada à cultura apenas no último dia, incubando as células com nucleotídeo marcado por 8-12 horas. As amostras cultivadas com meio apenas, meio com OL-2, ou meio com CpG2006 estiveram presentes em todos os experimentos. Os efeitos da combinação de IL-2 com os agentes estimulantes LPS (A), SAC (B) e CD40L (C) foram examinados como indicado. Os valores de contagens por minuto (com) são indicados como meios de reservatórios de triplicata. Os valores com absolutos diferentes entre (A), (B) e (C) são devido às diferenças na atividade específica das bateladas de 3H-Timidina usadas para cada experimento.

Figura 3: Efeito dependente de dose dè CpG2006 na proliferação de células B positivas a CD22 humanas. As células B positivas a CD22 humanas foram purificadas por separação magnética de PBMCs reunidas de cinco doadores. As células B foram cultivadas por com a concentração indicada de CpG2006 e IL-2 (1.000 U/mL) por 2 dias. O número de células viáveis (A) foi determinado microscopicamente por exclusão de corante de azul de tripano. Em paralelo, dez mil eventos de cada condição de cultura indicada foram analisados por citometria de fluxo (B), medindo ambos o percentual de células viáveis (barras pretas) e células de blásticas (células com mais altas difusão para a frente e ortogonal, barras brancas).

Figura 4: Análise baseada em FACS de viabilidade e formação de blastos de células B positivas a CD22 ou CD19 purificadas por separação magnética de PBMCs reunidas de cinco doadores. A análise foi feita antes (A) ou depois (B) de uma cultura de 4 dias com uma combinação de CpG2006 (1 μg/mL) e IL-2 (1.000 U/mL) (B). Em cada painel, 10.000 eventos foram analisados por difusão para a frente (eixo horizontal) e difusão ortogonal (eixo vertical), como uma medida dos tamanho e granulação, respectivamente. As células B viáveis são encerradas na região RI. As células mortas com difusão para a frente mais baixa são alinhadas com o eixo vertical, fora de RI. As células sofrendo diferenciação blástica têm difusões mais altas para a frente e ortogonal.

Figura 5: Cinética de proliferação celular e viabilidade celular em células B estimuladas com um agente estimulante (uma combinação de CpG2006 e IL-2). As células B positivas a CD22 foram selecionadas por separação magnética de PBMCs reunidas de cinco doadores. As células foram cultivadas na presença de Cp2006 (1 μg/mL) e IL-2 (1.000 U/mL) para os pontos de tempo indicados. A proliferação foi determinada por incorporação de H-timidina.

Figura 6: Efeitos da combinação de CpG2006 e IL-2 na imortalização mediada por EBV de células B humanas. (A) As células B positivas a CD22 foram purificadas de um grupo de 5 doadores por seleção de contas magnéticas e cultivadas por 2 dias apenas no meio (barras pretas) ou em um meio contendo CpG2006 (1 μg/mL) e IL-2 (1.000 U/mL) (barras brancas). As células foram depois lavadas e as células positivas a IgM foram exauridas por classificação celular, as células negativas a IgM foram imortalizadas por cultura de um dia para o outro com um sobrenadante a 50% v/v contendo EBV no meio de cultura celular. O meio de cultura celular que continha EBV foi removido e as células foram cultivadas em um meio contendo IL-2 (1.000 U/min) e PBMCs alogênicas irradiadas, como uma camada de alimentação para o número indicado de dias. (B) As células B positivas a CD22, negativas a IgM foram purificadas de um grupo de 5 doadores por seleção de contas magnéticas e imortalizadas por cultura com um meio de cultura a 30% v/v de EBV, na ausência (barras pretas) ou na presença (barras brancas) de CpG2006 (1 μg/mL) e IL-2 (1.000 U/mL), usando PBMCs alogênicas irradiadas como a camada de alimentação. Em ambos (A) e (Β), o número de linfoblastos viáveis (células grandes) foi avaliado microscopicamente por exclusão de corante azul de tripano.

Figura 7: Fenótipo de células B positivas a CD22, negativas a IgM após 2 dias de pré-estimulação com CpG2006 e IL-2, e cultura por 10 dias (com IL-2 e camada de alimentação de PBMCs alogênicas irradiadas na ausência de EBV e CpG2006). (A) Dez mil eventos foram analisados por análise de representação gráfica de pontos FACS, na qual o eixo vertical representa o nível de fluorescência de IgM e o eixo horizontal indica a difusão para a frente (como uma medida do tamanho das células). As válvulas blásticas viáveis, com altos níveis de difusão para a frente, ficam todas contidas dentro dos quadrantes à direita. As células negativas a IgM são indicadas nos dois quadrantes inferiores, com as células blásticas viáveis que não expressam anticorpos de IgM (e, expressando, em grande parte, anticorpos de IgG) estando presentes no quadrante à direita de fundo. (B) Análise de imunodifusão conduzida usando os sobrenadantes das células B negativas a IgM, positivas a CD22, imortalizadas com EBV, como estimuladas e selecionadas de acordo com (A). O meio exaurido foi concentrado 5 vezes antes do ensaio. O ensaio avaliou a presença de imunoglobulinas humanas secretadas totais (ahlg), IgM humano (ahlgM) e IgG humano (ahlgG) no sobrenadante de cultura celular usando anticorpos específicos de isotipos. Figura 8: Comparação das populações policlonais de células obtidas de acordo com os processos BÁSICO, COMBINADO e SEQÜENCIAL. (A) Visão geral do procedimento para preparação das populações de células policlonais de acordo com os processos BÁSICO, COMBINADO e SEQÜENCIAL. (B) As populações são comparadas em termos de número de células total (medido por citometria de fluxo) e da fração de células viáveis (medida por exclusão de iodeto de propídio e citometria de fluxo, como descrito em materiais e métodos).

Figura 9: As células B negativas a IgM, positivas a CD22 foram preparadas usando os protocolos BÁSICO, COMBINADO e SEQÜENCIAL, como descrito na Figura 8 e no Exemplo 2. As populações de células resultantes foram analisadas por citometria de fluxo (por exclusão de iodeto de propídio; painel esquerdo) e, em particular, para aquelas células encerradas sob R2, para expressão de CD23 (usando imunofluorescência direta; painel direito) ao final da cultura de 10 dias. O nível de expressão de CD23 nessas células, que são essencialmente linfoblastos viáveis, é indicado como fluorescência logarítmica no eixo horizontal (alta, média), e o número de células expressando uma determinada quantidade de CD23 é mostrado no eixo vertical. O nível de fluorescência considerado como negativo (neg) foi determinado usando um anticorpo de controle negativo de mesmo isotipo, marcado. Figura 10: Análise de secreção de Ig em culturas celulares, que foram preparadas usando os processos BÁSICO, COMBINADO e SEQÜENCIAL. Os sobrenadantes isentos de células foram colhidos após 10 dias de cultura (consultar a Figura 8A) e a concentração de IgG foi medida em diluições seriais de sobrenadantes, usando um kit comercial ELISA de IgG humana total. A quantidade absoluta de IgG em cada sobrenadante foi medida por comparação com uma curva padrão de IgG humana purificada, proporcionada pelo fabricante do kit ELISA, em que a faixa linear atingiu um platô a ~ 150 μg/mL. Todas as diluições do sobrenadante do processo seqüencial resultaram em medidas além da faixa linear da curva padrão, e pode ser extrapolada dessas medidas apenas que a concentração de IgG total está além de 200 μg/mL. Por essa razão, o resultado é ilustrado com uma linha pontilhada.

Figura 11: Representação esquemática de um processo geral para identificar células B humanas secretando anticorpos de IgG que ligam e/ou neutralizam citomegalovírus humano (CMV), compreendendo os processos da invenção para imortalização de células secretórias de anticorpos, tais como células B humanas.

Figura 12: Identificação de culturas de células B humanas secretando IgG, imortalizadas por EBV, que tenham sido obtidas usando o processo descrito na Figura 11 para o isolamento de anticorpos de IgG tendo diferentes atividades. (A) Sobrenadantes de culturas de células B imortalizadas com EBV de um doador soropositivo a CMV foram incubadas com os isolados indicados de citomegalovírus humano (CMV) e depois adicionados às células humanas indicadas. AD169 é uma cepa de laboratório de CMV humano. VRl 814 é um isolado clínico de CMV humano. HET,F são fibroblastos de pulmão embriônicos humanos e HUVEC são células endoteliais de veia umbilical humanas. A atividade de neutralização de anticorpo de IgG humana, contendo sobrenadantes de cultura celular, selecionada é expressa em termos de atividade de infecção de CMV (representativa de pelo menos dois ensaios). Os dados foram obtidos por medida de manchamento imuno-histológico para antígeno precoce imediato (IEA) de CMV. O controle negativo era apenas meio de cultura celular. (B) Sobrenadantes de culturas de células B imortalizadas com EBV foram reunidos (5 sobrenadantes / grupo) e testados em um kit ELISA para detectar anticorpos de IgG se ligando a proteína HSP60 humana. Os dados indicam os valores médios de recipientes em duplicata. A linha indica o valor de referência (3 vezes os níveis observados apenas com o meio de cultura celular - RPMI-1640 e FCS 10%). As amostras de controle positivo (um anticorpo anti-humano de camundongo comercial a HSP60, nas concentrações indicadas) e uma amostra de controle negativo (mlgG, um IgG de camundongo não específico) foram reveladas com IgG anticamundongo. Todas as outras amostras de controle (dois controles negativos apenas com meio ou uma IgG humana não relacionada, hlgG) e as amostras contendo os sobrenadantes das culturas celulares foram reveladas com um anticorpo de IgG anti- humana comercial.

Figura 13: Visão geral do procedimento para a preparação de populações de células secretórias de anticorpos imortalizadas de acordo com os processos da invenção, partindo do sangue de um doador humano apresentando atividade de neutralização de CMV. As populações oligoclonais e monoclonais de células imortalizadas foram identificadas de acordo com as propriedades dos anticorpos identificados nos sobrenadantes da cultura celular: secretando anticorpos que se ligam ao extrato de proteínas CMV total (como testado usando um kit, BEIA-CMV ELISA), que se ligam aos antígenos específicos (testados usando fragmentos das proteínas CMV gB e gH), e/ou que neutralizam a infecção de CMV em um ensaio in vitro.

Figura 14: Identificação de culturas de células B humanas secretórias de IgG, imortalizadas com EBV, que foram obtidas usando o processo descrito na Figura 13 para isolar anticorpos de IgG se ligando a proteínas de CMV. As células B positivas a IgG, positivas a CD22 de um doador de CMV tendo atividade de neutralização no soro foram preparadas usando o protocolo SEQÜENCIAL descrito no Exemplo 2. O sobrenadante da cultura celular de 10 dias (cultura de massa CMV5), gerado por uso da população resultante, foi coletado e armazenado a 4°C e testado com o kit BEIA - CMV ELISA descrito em materiais e métodos. Depois, a cultura celular foi dividia em 20 células / reservatório em lâminas de 96 reservatórios e cultivada na presença de células de alimentação de PBMCs alogênicas irradiadas, CpG2006 e IL-2 por 4 semanas. Os sobrenadantes isentos de células, que foram preparados de recipientes contendo populações de células se proliferando ativamente, foram triados com o kit BEIA - CMV ELISA. O controle positivo (calibrador 2, AU/mL) foi incluído com o kit ELISA e usado de acordo com as instruções do fabricante. O controle negativo era apenas meio (IMDM com L-glutamina, NEAE, FCS 10%, CpG2006 e IL-2). Os resultados de 20 culturas celulares representativas são apresentados. A linha horizontal mostra o valor de corte de 2 vezes para o ensaio.

Figura 15: Seqüência de proteínas de regiões variáveis na cadeia pesada (A; VH; SEQ ID NO:3) e cadeia leve (B; VL; SEQ ID NO:8) para o anticorpo secretado pelas células no reservatório 9G8 (consultar a Figura 14). As seqüências de CDR para as cadeia pesada (HCDR1, SEQ ID NO: 4; HDCR2, SEQ ID NO: 5; HCDR3, SEQ ID NO: 6) e leve (LCDR1, SEQ ID NO: 9; LDCR2, SEQ ID NO: 10; LCDR3, SEQ ID NO: 11) são previstas com base nas diferentes metodologias comparando seqüências de anticorpos conhecidas, tal como V-Quest, proporcionada pela IMGT (Giudicelli V. et al., disponível em http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/index.html) e são descritas. Dez mil células dessa cultura celular foram usadas para f

determinação das duas seqüências usando protocolos usuais. As células foram pelotizadas e mRNA foi extraído para produzir o cDNA por amplificação RACE5 usando iniciadores VH e VL para a degeneração. As seqüências foram depois clonadas em plasmídeos usados para a transformação de células bacterianas. As seqüências de DNA de consenso codificando as regiões variáveis na cadeia pesada (SEQ ID NO:2) e cadeia leve (SEQ ID N0:7) foram determinadas usando as seqüências de pelo menos 4 clones de células bacterianas independentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona processos para aperfeiçoar a eficiência, por meio dos quais células secretórias de anticorpos imortalizadas podem ser produzidas e tríadas com base nas especificidade de antígeno e/ou atividade biológica dos anticorpos secretados.

Em particular, os exemplos mostram como a atividade de proliferação, a viabilidade e a secreção de anticorpos de células B humanas, em condições de cultura celular, que são imortalizadas usando vírus Epstein-Barr, podem ser aperfeiçoadas por aplicação de combinações adequadas de meios e condições em células primárias isoladas de doadores. Verificou-se que a seleção de meios e condições específicos relacionados com a seleção e a estimulação de células tem efeitos de acentuação inesperados e importantes para maiores diversidade e número de células secretórias de anticorpos imortalizadas, que podem ser posteriormente triadas diretamente usando os sobrenadantes de culturas celulares.

Os exemplos também mostram que a seleção inicial das células das amostras biológicas pode ser baseada em ou mais -marcadores superficiais de células, seguida por uma fase de estimulação na qual as células são expostas a um ou mais agentes estimulantes. No entanto, os agentes estimulantes exercem as suas atividades máximas, sem afetai* as viabilidade e proliferação celulares, apenas se aplicados em razões de concentrações adequadas em populações selecionadas especificamente, de células por um período de tempo adequado. Além do mais, uma distinção temporal e física clara entre as etapas de estimulação e imortalização deve ser feita, sendo evidente que os efeitos negativos da exposição simultânea das células aos agentes estimulantes e de imortalização.

Em particular, os exemplos mostram como esses elementos podem ser combinados para estabelecer processos eficientes e reprodutíveis para a imortalização com EBV de células B humanas negativas a IgM (ou positivas a IgG'), que podem ser subseqüentemente clonadas e triadas, usando os seus sobrenadantes de culturas celulares e de acordo com as características de ligação e/ou funcionais dos anticorpos que produzem (tal como neutralização de infecção de citomegalovírus em células humanas), e, finalmente, que podem ser depois isoladas e clonadas para caracterização e produção posterior dos anticorpos como proteínas recombinantes.

As abordagens seqüenciais envolvendo as etapas separadas de seleção e ativação de células, antes da imortalização, foram descritas na literatura apenas em conjunto com as populações de células específicas de antígenos, que foram, previamente, imunizadas in vitro, usando, freqüentemente, fusão com células de mieloma além (ou em vez( de um agente de imortalização viral.

Desse modo, as populações iniciais de células B foram ou exauridas de tipos de células específicos, usando um agente citotóxico, e depois expostas ao antígeno combinado com citocinas e fatores de crescimento (Borrebaeck C et ai., 1988; Davenport C et al., 1992; Laroche-Traineu J et al., 1994), ou expostas a um procedimento de aplicação de lâminas ou superfícies de plástico revestidas com antígeno específico de antígeno, e depois expandidas por uma camada de células de alimentação, antes de serem selecionadas (Steenbakers P et al., 1993; Steenbakers P et al., 1994).

As populações de células secretórias de anticorpos foram imortalizadas por uso de ima imortalização com EBV usual, ou por uso de transformação mediada por EBV ou oncogênio (US 4997764), imortalização com EBV ou ativação celular não específica, combinadas, seguida por fusão com uma linha celular de mieloma (Niebdala W e Stott D, 1998; WO 02/46233), seleção de células expressando anticorpos tendo um isotipo específico após imortalização com EBV (Morgenthaler N et ai., 1996), ou seleção de células seguida por uso de imortalização com EBV na presença de um agente ativador de células B (WO 91/09115; Hur D et al, 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677).

No entanto, nenhum desses documentos proporciona um processo efetivo associando os meios e condições para obtenção de seleção e ativação celulares, antes da imortalização, e a eficiência de um processo de imortalização viral que proporciona, em particular, populações de células policlonais, que podem ser usadas extensiva e diretamente para identificar populações de células oligoclonais ou monoclonais expressando anticorpos tendo isotipo de atividade biológica desejados.

O objeto principal da presente invenção consiste em um processo para imortalização de uma população de células que secreta anticorpos de ou mais isotipos específicos, compreendendo as seguintes etapas: a) seleção da população de células que expressa anticorpos de uma ou mais amostras biológicas, de uma maneira independente de antígenos e com base na expressão de pelo menos um marcador superficial celular;

b) estimulação da dita população de células selecionadas com pelo menos um agente estimulante em condições de cultura celular;

c) eliminação do dito agente estimulante da

cultura celular;

d) seleção da população de células estimulada que expressa anticorpos dos ditos isotipos específicos da dita cultura celular;

e) exposição da dita população de células estimulada ao agente de imortalização em condições de cultura celular; e

f) eliminação do dito agente de imortalização da dita cultura celular,

em que o agente de imortalização é um agente de imortalização viral .

Esse processo pode ser integrado com uma série de etapas adicionais, que são relacionadas à análise e ao uso da população de células, que é obtida por aplicação desse processo (Figura 1). Em particular, as seguintes duas etapas devem ser conduzidas após a etapa (f), uma vez que são importantes para estabelecer culturas celulares compreendendo essa população de células:

g) manter a população de células obtidas da dita cultura celular em condições de cultura celular; e

h) determinar o número, a viabilidade e/ou a atividade de proliferação da população de células que secreta anticorpos dos ditos isotipos específicos na dita cultura celular.

O texto e as figuras proporcionam outros detalhes de como os processos da invenção podem ser aplicados, em particular, em células B humanas isoladas de amostras de sangue periférico, para proporcionar culturas celulares secretando anticorpos de interesse.

De fato, os processos da invenção propiciam a obtenção, por um lado, de populações de células que representam, eficientemente, de uma maneira independente de antígenos, a heterogeneidade do repertório de anticorpos dos isotipos desejados expressos nas células primárias retiradas dos indivíduos e capturadas pela imortalização viral.

Por outro lado, as populações de alta proliferação e mais uniformemente viáveis de células secretórias de anticorpos imortalizadas, que são obtidas pelos processos da invenção, permitem uma análise mais profunda desse repertório de anticorpos por meio de diferentes produtos biológicos, que podem ser obtidos ou em condições de cultura celular (por exemplo, populações de células, sobrenadantes de culturas celulares contendo altas proporções de anticorpos) ou como outras entidades moleculares (por exemplo, bibliotecas de DNAs preparados usando ácidos nucléicos extraídos de populações de células oligoclonais).

Além do mais, os processos da invenção proporcionam a possibilidade de obter anticorpos e células imortalizadas suficientes, que secretam os anticorpos a serem diretamente caracterizados nas culturas celulares geradas por divisão da população policlonal de células secretórias de anticorpos imortalizadas (recém-preparadas ou preparadas de antemão, congeladas e descongeladas) em grupos contendo estatisticamente 20 ou menos células e crescidas em condições usuais. O número mais baixo de etapas de clonagem (virtualmente, uma única, em vez das duas ou mais etapas usuais) abrevia o tempo para a identificação de células, que secretam anticorpos de interesse, limitando o risco de perda delas em etapas de subclonagem, e aceleração da caracterização de anticorpos em diferentes ensaios in vivo ou in vitro. Isso é de importância particular para o isolamento de anticorpos específicos para alvos terapêuticos que podem ser atingidos mais rapidamente e com maior sucesso.

Portanto, os processos da invenção podem ser adaptados e integrados em processos mais complexos, para identificar e produzir anticorpos monoclonais de isotipos i

específicos, que são resumidos no texto (consultar, em particular, o Exemplo 3), e nas figuras (consultar em particular as Figuras 1, 11 e 13).

As definições e outros detalhes relativos aos meios e às condições aplicáveis aos processos da invenção são proporcionados nos parágrafos apresentados a seguir, juntamente com a descrição dos possíveis usos dos ditos processos e dos produtos que podem ser obtidos usando os ditos processos (populações de células, culturas de células, sobrenadantes da cultura celular, e anticorpos, em particular anticorpos monoclonais humanos).

O termo "população" de células se refere, em geral, a qualquer grupo de células (células secretórias de anticorpos, no presente caso), que são isoladas usando os mesmos " critérios ou geradas usando os mesmos processos. Por exemplo, as populações de células são aquelas resultantes de uma etapa de seleção (por exemplo, classificação de células), um tratamento (por exemplo, com agentes estimulantes ou de imortalização viral), ou a divisão de uma cultura ou uma população de células em grupos menores tendo, estatisticamente, a mesma quantidade de células (por exemplo, quando da subclonagem de uma cultura celular ou preparação de pequenos frascos de células imortalizas, que vão ser congeladas para manutenção de longo prazo). Uma população de células deve ser viável, mas não exercendo necessariamente uma atividade biológica específica (por exemplo, crescimento, proliferação ou secreção de anticorpos), como acontece em condições de cultura celular.

O termo "cultura" de células se refere a uma população de células, que é mantida em um vaso (por exemplo, o recipiente de uma lâmina, uma cápsula Petri, um balão, uma garrafa) e, no âmbito da produção de células, executa atividades biológicas (por exemplo, crescimento, proliferação ou secreção de anticorpos) e/ou tratamento com compostos específicos (por exemplo, agentes estimulantes ou de imortalização viral). Essas condições experimentais (isto é, condições de cultura celular) incluem o uso de incubadoras, mantidas a uma temperatura e a uma atmosfera (juntamente com o uso de meio de cultura celular) selecionadas adequadamente para o crescimento e a proliferação das células.

Uma cultura celular é, portanto, composta de células conjuntamente com o meio de cultura celular (compreendendo soros, fatores de crescimento, citocina, nutrientes, etc.), e, como no caso de células secretórias de anticorpos, de células adicionais que são também cultivadas para suportar o crescimento e a proliferação da população de células (as denominadas "células de alimentação"). Após uns poucos dias ou semanas, a composição de meio de cultura celular é alterada não apenas pelo consumo das células, mas também pela grande variedade de moléculas cujas células secretam, ou simplesmente as liberam quando entram na apoptose ou morte. Desse modo, o meio de cultura celular é regularmente substituído por um outro, ou pode ser parcialmente removido para análise do teor do meio de cultura celular. O meio de cultura celular usado (definido na literatura como "sobrenadante" da cultura celular, bem como meio de cultura celular "exaurido" ou "condicionado") pode ser coletado em pontos de tempo fixos, para determinar, por exemplo, o teor e a atividade dos anticorpos que tenham sido secretados pela população de células nas condições de cultura celular. Essas informações, juntamente com os dados de viabilidade e de proliferação dessas células, devem ser usadas para definir o estado e o possível uso da cultura celular (por exemplo, para isolamento de mRNA, em ensaios de triagem, para purificar os anticorpos monoclonais, para coleta de células a serem congeladas, etc.).

O termo "policlonal" se refere a uma cultura ou uma população de células, que expressa um número elevado de diferentes anticorpos (por exemplo, IO3, IO4, IO5 ou mais), cada um deles expresso por uma única ou um grupo de células dentro da cultura ou população. Em particular, aplica-se a uma cultura ou população de células obtida pelos processos da invenção (desde que gerados de uma maneira independente de antígenos de células presentes em uma amostra biológica), que não é dividida em culturas ou populações, ou, no máximo, dividas em culturas ou populações inicialmente de 50 ou mais células (por exemplo, 200, 500, 1.000 ou mais células), como pode-se determinar estatisticamente com base na diluição da cultura ou população policlonal original.

O termo "oligoclonal" se refere a uma cultura ou uma população de células resultante da divisão de uma cultura ou população de células em culturas ou populações contendo inicialmente menos de 50 células (40, 20, 10, 5, 1 ou menos de 1 célula), como se pode determinar estatisticamente com base na diluição da cultura ou população original.

As culturas ou populações oligoclonais, que resultam da divisão de uma cultura ou população de células em culturas ou populações contendo inicialmente 20 células ou menos, são de importância particular. De fato, se uma única característica biológica, bastante predominante for detectada na cultura celular resultante (por exemplo, um anticorpo identificado como uma proteína secretada no sobrenadante da cultura celular, usando um ensaio biológico ou como um gene trasncrito no mRNA isolado da cultura usando RT-PCR), essa cultura celular pode ser considerada como uma cultura celular monoclonal.

Uma "cultura celular monoclonal" é uma cultura celular compreendendo apenas (ou uma grande maioria de) células idênticas entre si, sendo originada pela proliferação (e, opcionalmente, diferenciação) de uma única célula (clone), pelo menos como se pode avaliar com base em uma característica biológica específica (por exemplo, secreção de um anticorpo específico), que foi usada para selecionar a cultura celular. Desse modo, um anticorpo, uma população de células ou uma cultura celular derivado dessa cultura pode ser indicado como sendo "monoclonal", ainda que outras atividades experimentais possam ser necessárias para estabelecer a capacidade de clonagem de uma maneira mais precisa.

O termo "imortalizada" se refere, em geral, às culturas e populações de células oriundas dos processos da invenção, após exposição da população de células selecionada e estimulada ao agente de imortalização viral. Ainda que a imortalização viral possa ser associada com a presença de produtos virais específicos (por exemplo, proteínas, trasncritos), as células são definidas como imortalizadas quando apresentam crescimento e proliferação contínuos em condições de cultura celular. Como mostrado nos exemplos, as células B humanas primárias, que são obtidas de uma amostra biológica e expressam anticorpos, foram usadas com sucesso para obtenção de populações de células policlonais, que foram depois usadas para gerar culturas celulares oligoclonais contendo pelo menos 1O4 células. Quando a cultura é iniciada de 100, 50, 20 ou mesmo células, esse número total de células é compatível apenas com um número de divisões de células (10 ou mais divisões de células), que, em geral, células imortalizadas podem conduzir em condições de cultura celular. O termo "células secretórias de anticorpos" se refere às células primárias que contêm os genes para expressar anticorpos e que têm a capacidade de secretá-los no espaço extracelular (por exemplo, no sangue in vivo ou no sobrenadante da cultura celular in vitro).

O termo "células secretórias de anticorpos imortalizadas" se refere a células secretórias de anticorpos que, seguinte à exposição a um agente de imortalização viral, crescem, se proliferam e secretam anticorpos em condições de cultura celular, ou pelo menos por um período de tempo e/ou por um número de divisões de células bastante superior àquele observado se as células não forem expostas ao agente de imortalização viral. Em particular, as populações de células policlonais obtidas pelos processos da invenção são enriquecidas em linfoblastos crescentes, viáveis, que são as células secretórias de anticorpos imortalizadas que vão depois formar as populações de células oligoclonais e monoclonais em condições de cultura celular.

O termo "agente estimulante" se refere a um composto, ou uma combinação específica de compostos, capaz de produzir uma resposta de estimulação mediada por células secretórias de anticorpos, induzindo um estado de proliferação e blástico dessas células e formando linfoblastos (grandes células viáveis, medidas por microscopia e por difusão para a frente / ortogonal em FACS) em condições de cultura celular. O termo "fase de estimulação" se refere ao período de tempo durante o qual as células secretórias de anticorpos selecionadas são expostas ao agente estimulante.

O termo "agente de imortalização viral" se refere a qualquer tipo de partícula viral, DNA, ou proteína, que propicie a geração de células imortalizadas de células primárias isoladas de amostras biológicas. No presente caso, as células primárias são células secretórias de anticorpos, em particular, células B humanas, para as quais diferentes agentes de imortalização virais foram identificados.

O termo "fase de imortalização" se refere ao período de tempo durante o qual as células secretórias de anticorpos selecionadas e estimuladas são expostas ao agente de imortalização viral.

Uma etapa preliminar para conduzir os processos da invenção é a identificação de indivíduos ou tecidos dos quais podem ser isoladas amostras biológicas contendo células secretórias de anticorpos.

Como indicado em ANTECEDENTES DA INVENÇÃO, as células que expressam e secretam anticorpos foram isoladas e imortalizadas de diferentes tecidos e órgãos, incluindo, sangue, amídalas, baço, fluidos biológicos (tais como fluidos cerebroespinais ou pleurais), nós linfáticos, e outros órgãos linfáticos. As células que podem ser imortalizadas usando os processos da invenção devem ser extraídas desses tecidos e órgãos de mamíferos. Obviamente, as células de origem humana são as preferidas para a produção de culturas celulares secretando anticorpos monoclonais humanos tendo uso terapêutico ou diagnóstico. Não obstante, os processos podem ser aplicados em células secretórias de anticorpos, não humanas (células de roedores ou de origem similar, por exemplo).

Muitos diferentes tipos de populações de células secretórias de anticorpos primárias podem ser isolados de doadores humanos, tendo perfis que podem ser preferíveis de acordo com o estado do doador de células imune, bem como o isotipo e a atividade do anticorpo que é buscado.

Os processos da invenção podem ser aplicados para a identificação de anticorpos monoclonais expressos por células B humanas selecionadas de doadores, tais como os pacientes expostos a um agente infeccioso ou tendo formas específicas de câncer ou doença auto-imune. Desse modo, o doador pode ser natural, vacinado, afetado por uma ou mais doenças ou infecções, já exposto e/ou resistente a tratamentos terapêuticos específicos, apresentando um índice ou estado clínico, exposto inadvertidamente a patógeno, etc.

Os soros de doadores podem ser usados comò tais para uma determinação inicial da soropositividade deles a um antígeno, uma vez que a especificidade e a manutenção por longo prazo das respostas imunes adaptativas (mesmo anos após a última exposição a esse antígeno) podem permitir uma determinação qualitativa, que é suficiente para seleção dos doadores. As natureza e sensibilidade do ensaio de triagem usado são críticas na identificação do doador mais adequado e, de preferência, o ensaio usado para triar o soro do doador deve ser o mesmo que aquele usado para triar os sobrenadantes das células B secretórias de anticorpos imortalizadas e elaborado para detectar um anticorpo com a atividade funcional desejada (isto é, prevenção de entrada viral em células, ou ligação a um antígeno associado a tumor).

No contexto clínico, a seleção do tecido ou do órgão do qual as células são purificadas pode ser ditada da disponibilidade das células em uma quantidade suficiente para executar todo o processo. Tendo em vista de que as células podem ser obtidas de amostras clínicas humanas em pequenas quantidades e/ou preparadas em locais diferentes daqueles nos quais os processos de imortalização podem ser conduzidos, as células podem ser obtidas de amostras congeladas e/ou de amostras obtidas de vários indivíduos, que tenham sido agrupadas para proporcionar material de partida suficiente.

Desse modo, uma triagem preliminar pode ser feita em um painel de doadores-candidatos, usando amostras contendo células secretórias de anticorpos (tais como sangue ou soro periférico integral). Em particular, as células mononucleares podem ser isoladas de sangue ou tecidos linfáticos usando técnicas de separação usuais, para isolar células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), tal como configuração de gradiente. Após e/ou antes dessa etapa de separação, as amostras de soros (ou plasma), os sobrenadantes de culturas celulares, ou as células (obtidas de diferentes pacientes, de diferentes tecidos, e/ou em diferentes pontos de tempo) podem ser pré-triadas usando tecnologias usuais para detectar a presença de anticorpos e células secretórias de anticorpos (por exemplo, ensaios ELISA, BIACORE, manchamento ocidental, FACS, SERPA, disposições de antígenos, neutralização de infecção viral em um sistema dè cultura celular, ou ELISPOT).

A literatura proporciona vários exemplos dessas tecnologias mostrando, por exemplo, o uso de ELISPOT para a caracterização da resposta imune em doadores vacinados (Crotty S et al., 2004), o uso de microdisposições de antígenos como ferramentas diagnosticas para pacientes recém-infectados (Mezzasoma L et al., 2002) e outras tecnologias para medir as respostas imunes específicas de antígenos (Kern F et al., 2005). A seleção dos doadores pode ser também baseada na associação da soropositividade para vírus específico com alterações relacionadas com oncogênese (Butel J, 2000).

Essa análise qualitativa preliminar de resposta de anticorpos ao alvo terapêutico (avaliado no nível da atividade total ou específica de isotipo) deve permitir a identificação dos doadores tendo células B expressando títulos de anticorpos mais altos dirigidos ao antígeno purificado desejado (por exemplo, uma proteína recombinante humana específica relacionada a um câncer ou a uma proteína viral específica), uma mistura de antígenos relacionados (por exemplo, obtidos de preparação viral purificada parcialmente), ou um bioensaio (por exemplo, neutralização de infecção viral).

Uma vez que um ou mais doadores são selecionados, a fonte de células B pode ser baço, sangue, nós linfáticos, medula óssea, tumor infiltrando linfócitos, linfócitos de sítios de infecção / inflamação crônicas. No entanto, o sangue periférico é usualmente mais fácil de obter de doadores, para armazenar e monitorar para a resposta sorológica contra um antígeno por um período de tempo definido.

Por exemplo, partindo de 5 - 50 mL de sangue periférico, aproximadamente 10 - 100 milhões de PBMCs (células mononucleares de sangue periférico) podem ser purificadas, um número de célula que deve permitir a obtenção de uma população suficientemente grande de células secretórias de anticorpos a serem tríadas, após serem imortalizadas usando os processos da invenção.

Após o isolamento das PBMCs das amostras biológicas, uma seleção específica de células secretórias de anticorpos pode ser conduzida, usando um dos muitos processos descritos na literatura, com base na expressão de marcadores superficiais de células nas suas superfícies e, se adequado, de outras proteínas, bem como a atividade de proliferação, o estado metabólico e/ou morfológico das células.

Em particular, várias tecnologias para a purificação de células secretórias de anticorpos de amostras humanas fazem uso de diferentes meios e condições para seleção positiva ou negativa. Essas células são selecionadas mais fácil e eficientemente por separação física daqueles expressando os marcadores superficiais específicos para as células, que expressam e secretam anticorpos (por exemplo, células B humanas). Os protocolos específicos podem ser encontrados na literatura (consultar Callard R e Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, pg.17-31).

A seleção é usualmente conduzida usando anticorpos eu se ligam especificamente àqueles dessas proteínas superficiais de células e que podem ser ligados a suportes sólidos (por exemplo, microcontas ou lâminas plásticas) ou marcados com um fluorocromo, que pode ser detectado usando agentes classificadores de células ativados por fluorescência (FACS). Por exemplo, as células B humanas foram selecionadas com base nas suas afinidades pelos suportes (tais como microcontas) ligando CD19, CD27, e/ou as microcontas CD22, ou pela falta de afinidade de ligação para os anticorpos específicos para certos isotipos, antes da imortalização com EBV (Li H et ai., 1995, Bemasconi N et al., 2003; Traggiai E et ai, 2004). No entanto, a seleção do marcador celular pode ser relevante para a eficiência do processo de imortalização, provavelmente devido aos sinais intracelulares que são disparados pelo processo de seleção e que podem alterar o crescimento e a viabilidade das células. De fato, os exemplos do presente pedido de patente mostram que o CD22, que é uma célula B restrita a proteína de transmembrana, que controla as rotas de transdução de sinais relativos ao reconhecimento de antígeno e ativação de célula B (Nitschke L, 2005), aparece como uma molécula preferida para a seleção inicial de células B. Uma vez que a população positiva a CD22 contém células que expressam anticorpos tendo diferentes isotipos e especificidades, outros marcadores superficiais de células podem ser usados para selecionar as células, antes ou depois da fase de estimulação.

Alternativa ou adicionalmente, um enriquecimento específico de células secretórias de anticorpos pode ser obtido por aplicação de uma seleção baseada em cd27 além da seleção baseada em CD22. O CD27 é conhecido por ser um marcador para células B humanas, que tem genes de regiões variáveis mudadas somaticamente (Borst J et al., 2005). Marcadores adicionais, tais como CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45 ou CD69 podem ser usados para ou exaurir ou enriquecer a população de células desejada. Desse modo, dependendo da história de exposição ao antígeno do doador (por exemplo, viral, bacteriano, parasita), o título do anticorpo, uma decisão pode ser tomada como se usar células B enriquecidas com CD22, totais ou ainda subpopulações de células B enriquecidas, tais como células B positivas a CD27.

Após a seleção das células, mas antes da fase de imortalização, a população de células deve ser exposta a um agente estimulante adequado. No contexto da presente invenção, três grandes categorias de compostos são consideradas como agentes estimulantes aplicáveis, que podem ser usados, especialmente em combinação.

Um primeiro grupo de agentes estimulantes é representado por um ativador da resposta imune inata, tal como um agonista de um receptor similar a Toll, que é expresso em células B. Os receptores similares a Toll (TLR) são conhecidos por desempenharem um papel importante no reconhecimento de oligonucleotídeos bacterianos e outros compostos elicitando ativação policlonal de uma ampla gama de células envolvidas em ambas as imunidades inata e adquirida (Akira S e Takeda K, 2004; Peng S, 2005). Essa rota de respostas imunes inatas mediadas em parte pelos receptores Toll é uma das respostas mais precoces pelo corpo a organismos invasores, e desempenha um papel importante na criação do meio físico adequado e em meio de citocina necessários para elicitar a resposta potente e específica mediada pelas células B e T da resposta imune adaptativa (Gay et al., 2006). Essa sensibilidade de linhas celulares e de células primárias humanas é devido a alguns receptores similares a Toll (TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRl 0), cada um deles tendo perfis de expressão específicos, ligantes e requisitos de reconhecimento preferidos.

Em particular, TLR9 humano reconhece oligonucleotídeos, mais especificamente, oligonucleotídeos baseados em CpG (Hemmi H et al., 2000). A ativação mediada por TLR9 por compostos baseados em CpG, tal como um conhecido como CpG2006, dispara as alterações no equilíbrio de oxirredução celular e a indução de rotas de sinalização celular, incluindo as cinases de proteínas ativadas por mitógeno (MAPKs) e NF capa B, seguida pela produção de citocinas, interferons e quimiocinas pró-inflamatórios. (Takeshita F et al., 2001; Hartmann G et al., 2000; Hartmann G e Krieg A, 2000; Ulevitch R, 2004). Os subconjuntos de células B naturais e de memória têm propriedades específicas de proliferação e diferenciação, em resposta a estímulos policlonais, tais como oligonucleotídeos CpG, como uma conseqüência da regulação rigorosa da expressão de TLRs (Bernasconi N et al., 2003, Bernasconi N et al., 2002; Bourke E et al., 2003). Os oligonucleotídeos CpG induzem a ativação de imunidade inata e podem proteger contra o desafio letal contra uma ampla gama de patógenos (Krieg A, 2000). Por exemplo, aqueles oligonucleotídeos contendo o motivo chamado CpG-B são ativadores especialmente potentes de células B primárias (Krieg A et al., 1995; Gursel M et al., 2002; Klinman D, 2004; Eaton-Bassiri A et al., 2004).

Várias categorias que são ativas como os agonistas para um receptor similar a Toll foram identificadas (Coban C et al., 2005; Kandimalla ER et al., 2005; Hayashi E et al., 2005; Bourke E et al., 2003; Ambach A et al., 2004; Sen G et al., 2004) e tecnologias de triagem específicas são disponíveis, também para a determinação da produção diferencial de classes e subclasses de imunoglobulina (Henault M et al., 2005; Cognasse F. et al., 2005).

Um segundo grupo de agentes estimulantes é representado pelas citocinas, em particular, as interleucinas conhecidas como tendo essas atividades imunoestimulantes (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL- 13) e que foram comparadas na literatura (consultar Callard R e Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31).

Um terceiro grupo de agentes estimulantes é representado por agonistas de receptores de membranas celulares da família de receptores TNF, em particular, aqueles ativando à rota NF-kB e a proliferação em células B, tais como APRlL, BAFF, or CD40L (Schneider P, 2005; He B et al., 2004; Craxton A et al., 2003; Tangye S et al., 2003). E importante apontar que a seleção e a concentração do agente estimulante, das suas combinações, bem como o comprimento da fase de estimulação, tem que ser escolhidas para obter um efeito ótimo em ambas a estimulação celular e a expressão de proteínas, permitindo, ou acentuando, a imortalização das células secretórias de anticorpos.

Os exemplos mostram que agentes os estimulantes úteis, em particular quando o agente de imortalização viral é vírus Epstein-Barr, podem ser selecionados entre as seguintes combinações de compostos:

a) uma combinação de um oligonucleotídeo à base de CpG e uma citocina; e

b) uma combinação de um agonista de um receptor de membrana celular da família de receptores TNF e uma citocina.

Com base nas suas propriedades estimulantes, o CpG tem sido usado simultaneamente com o EB V, para produzir células B imortalizadas (Traggiai et al., 2004; WO 04/76677), como tem sido feito com os ligantes de CD40 ou anticorpos agonistas contra CD40 (WO 91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L et al., 1997; Imadome K et al., 2003).

No entanto, uma abordagem similar afeta negativamente a manutenção e a triagem das células B imortalizadas, uma vez que os ativadores policlonais, tal como CpG2006, são conhecidos como tendo efeitos potentes em vários tipos de células, que podem estar presentes durante a clonagem e/ou depois do processo de triagem na cultura celular (Hartmann G e Krieg A, 2000; Hartmann G et al., 2000). Em particular, os CpGs são indutores potentes de citocinas, tais como IL-2 e IFN- gama, por células mononucleares, e a presença de citocinas deve ser evitada em bioensaios subseqüentes, particularmente quando da triagem para anticorpos antivirais (Klinman D et al., 1996, Fearon K et al., 2003; Abel K et al., 2005). Os exemplos mostram como uma resposta otimizada de células B positivas a CD22 humanas a uma combinação de CpG2006 e IL-2 é obtida por uso de concentrações específicas de compostos, e que vários outros agentes estimulantes conhecidos (por exemplo, LPS ou S AC) não proporcionam essa resposta .

O período de tempo durante o qual as células secretórias de anticorpos selecionadas são expostas aos agentes estimulantes é de grande importância para estabelecer os processos efetivos para imortalização dessas células. De fato, os exemplos mostram que uma combinação de agentes estimulantes (CpG2006 e IL-2) exerce um efeito máximo na viabilidade e na proliferação celulares, em particular, dentro de um período de tempo específico (por exemplo, de cerca de 2 a cerca de 4 dias de estimulação). No entanto, combinações alternativas de agentes estimulantes e período de tempo podem ser igualmente efetivas para imortalização com EBV, ou para outros agentes de imortalização.

A combinação de agentes estimulantes pode ser incorporada ao meio de cultura celular, antes da, durante a ou seqüencialmente com a fase de imortalização (por exemplo, adicionando-se um primeiro agente estimulante imediatamente depois da seleção de célula inicial e um segundo agente estimulante horas ou dias depois), se isso provar ser útil para obter uma melhor resposta das células secretórias de anticorpos.

Os agentes estimulantes podem ser adicionados diretamente no meio de cultura celular de soluções-padrão diluídas, ou após serem formulados adequadamente, por exemplo, usando lipossomos ou outros compostos que podem aperfeiçoar a apreensão deles e atividade imunoestimulante (Gursel I et al., 2001). Os agentes estimulantes podem ser também fixados em matrizes sólidas (microcontas ou diretamente nas lâminas de cultura celular), permitindo também uma remoção mais efetiva.

Em vista das observações feitas acima na importância da aplicação dos agentes estimulantes, por um período de tempo específico e em uma etapa específica dos processos da invenção, as células secretórias de anticorpos devem ser depois manipuladas de um modo que o agente estimulante seja eliminado eficientemente, para evitar qualquer efeito negativo na imortalização e na manutenção em condições de cultura celular posteriores.

Desse modo, as células podem ser lavadas com meio fresco por uma ou mais vezes e, opcionalmente, mantidas no meio de cultura celular normal (por exemplo, de 1 até 6 dias), para diluir e eliminar ainda mais qualquer efeito remanescente dos agentes estimulantes, que podem ser ainda inibidos por adição de compostos específicos à cultura celular.

Os processos da invenção são aplicados em células que são ainda selecionadas com base no isotipo do anticorpo expresso, após estimulação das células e antes da exposição das ditas células selecionadas e estimuladas ao agente de imortalização (isto é, entre a fase de estimulação e a fase de imortalização).

A seleção baseada em isotipo das células deve ser conduzida por aplicação de meios para seleção positiva (propiciando o isolamento das células específicas) ou negativa (propiciando a eliminação de células indesejadas). Por exemplo, supondo que a maior parte dos anticorpos terapêuticos aprovados para uso farmacêutico são IgG (Laffy E e Sodoyer R, 2005), apenas uma população de células positivas a IgG estimuladas podem ser selecionadas positivamente (por FACS ou separadores de células magnéticos) ou por exaustão das células que expressam IgM da população de células, e enriquecendo, conseqüentemente, as células que expressam IgG. As tecnologias de separação para as células secretórias de anticorpos usando separadores de células magnéticas ou ativadas por fluorescência são conhecidas na literatura (Li H et ai, 1995; Traggiai E et al., 2004). Dependendo da fonte de células secretórias de anticorpos e do seu uso final, a depleção (ou enriquecimento) de células expressando IgD ou IgA também pode ser desejada.

Uma abordagem similar pode ser usada para isolar as células com base na subclasse específica, se tal seleção precisa for desejada (por exemplo, distinção de células B humanas que expressam os anticorpos IgGl5 IgG2, IgG3 ou IgG4).

A população de células selecionada e estimulada, que expressa anticorpos tendo isotipos específicos, está então pronta para ser imortalizada por uso de um agente de imortalização viral. A literatura mostra que diferentes agentes de imortalização podem ser usados em células secretórias de anticorpos, e, algumas vezes, ainda combinados em um único processo, para obter células secretórias de anticorpos imortalizadas.

Entre os agentes de imortalização virais, um vírus que infecta e imortaliza as células secretórias de anticorpos deve ser usado de preferência nos processos da invenção. Os vírus tendo tal preferência são comumente conhecidos como vírus linfotróficos e são agrupados na classe de herpesvírus. Os elementos dessa família de vírus infectam os linfócitos de uma maneira específica de espécie, e são associados com os distúrbios linfoproliferativos e com o desenvolvimento de várias malignidades (Nicholas J, 2000; Rickinson A, 2001). O EBV (vírus Epstein-B arrr, também conhecido como herpesvírus 4) e o HHV-8 (herpesvírus humano 8, também conhecido com KSHV, Herpesvírus associado com Sarcoma de Kaposi) infectam e imortalizam os linfócitos humanos. Os MHV- 68 (herpesvírus de murino 68), HVS (herpesvírus Samiri), RRV (Rhadinovírus Resus), LCV (Linfocriptovírus de primata), EHV-2 (Herpesvírus Eqüino 2), HVA (Herpesvírus Ateies) e AHV-I (Herpesvírus de Alcelafina 1) são outros herpesvírus linfotróficos, oncogênicos, tendo algumas características genéticas comuns conservadas entre eles e efeitos patogênicos similares em diferentes células hospedeiras de mamíferos. Esses vírus podem ser usados quando os processos da invenção são aplicados em células secretórias de anticorpos obtidas desses mamíferos.

No entanto, não os vírus integrais podem imortalizar as células B, uma vez que os constructos de DNA recombinante, que contêm as proteínas virais específicas obtidas por esses vírus específicos e outros vírus, têm sido usados com sucesso para a imortalização de células B (Damania B 2004; Kilger E et al., 1998). Os vetores similares contendo genes virais podem ser transduzidos em células, algumas vezes fazendo uso de sistemas retrovirais ou partículas similares a vírus no empacotamento de linhas celulares, que proporcionam todos os fatores necessários para a transformação dessas partículas, também podem ser usados nos processos da invenção.

A fase de imortalização pode durar entre uma e várias horas, até 2 a 4 dias, ainda que os exemplos mostrem que uma fase de imortalização mais longa possa ser nociva para a viabilidade celular, e, no caso do EBV, pelo menos 4 horas podem ser suficientes para estabelecer as populações de linfoblastos policlonais (grandes células viáveis, medidas por microscopia e/ou FACS, consultar a Figura 9), que proporcionam as células secretórias de anticorpos imortalizadas.

Os exemplos mostram que as células B humanas podem ser imortalizadas eficientemente usando sobrenadantes de EBV, se primeiro selecionadas para expressão de CD22, depois estimuladas por um tempo adequado (de cerca de 2 dias a cerca de 4 dias) e com uma combinação adequada de agentes estimulantes (CpG2006 e IL-2) e, finalmente, selecionadas com base em um isotipo preferido (positivas a IgG ou enriquecidas; negativas a IgM ou exauridas).

A imortalização mediada por EBV de células B requer a expressão do receptor superficial de células, CD21, que é considerado como o receptor de EBV principal. O CD21 está presente na maior parte de subpopulações de células B e regula as respostas das células B por formação de um complexo com CD19 e o receptor de antígenos de células B (Fearon D e Carroll M, 2000). No entanto, o CD-21 é perdido da superfície da célula após longa ativação das células e, ao mesmo tempo, se transformam em células de plasma. Desse modo, a capacidade para transformar as células com EBV pode ser auxiliada pela adição dos agentes estimulantes de células B, mas as condições devem garantir que o CD21 seja mantido na superfície da célula, propiciando uma imortalização com EBV de alta eficiência.

A presente invenção mostra que as populações de células secretórias de anticorpos imortalizadas podem ser obtidas eficientemente. De fato, as populações de culturas celulares enriquecidas em células B, que são selecionadas e imortalizadas, têm uma maior probabilidade de produzir anticorpos terapêuticos úteis, enquanto mantendo as suas capacidades de crescer, quando imortalizadas com vírus EBV em um estado latente, não lítico. Diferentemente de outros processos nos quais as células B podem ser estimuladas para secretar IgG, o processo de imortalização permite que a população seja "capturada" em um estado alta capacidade de proliferação e de secreção de IgG. O sobrenadante da população de células B imortalizadas pode ser analisado para a presença de anticorpos com a atividade desejada. A população de células B imortalizadas pode ser então clonada para isolar os clones das células secretórias de anticorpos, submetida a abordagens moleculares para isolar os genes dos anticorpos ou armazenada em um estado congelado para futura análise.

A imortalização mediada por EBV é um processo complexo envolvendo a imortalização de células B, devido às proteínas que são expressas por EBV, seguida pela imortalização regulada pela interação entre o EBV e as proteínas das células hospedeiras (Sugimoto M et al., 2004; Bishop G e Busch LK, 2002). De fato, o processo de imortalização pode ser seguido por media da expressão de proteínas e transcritos de EBV específicos, tais como EBNA2, EBNAl5 LMP2, LMP1, ou EBERs (Thorley-Lawson DA, 2001).

A proporção de EBV a ser adicionada à cultura celular pode ser aquela indicada comum ente na literatura (10%, 20%, 30% ou mais), mas parece que os processos podem funcionar adequadamente em condições nas quais a quantidade do sobrenadante de EBV é relativamente alta (50% v/v), mas a exposição é relativamente curta (de cerca de 4 a cerca de 24 horas).

E, no entanto, importante que o agente de imortalização viral seja eliminado (de modo similar ao que é indicado para o agente estimulante), por exemplo, por lavagem e cultura da população de células em meio de cultura celular fresco.

Os sobrenadantes de EBV, que podem ser usados nos processos da invenção, podem ser produzidos por uso de técnicas comuns para a infecção de culturas celulares humanas ou de roedores com qualquer uma das cepas de laboratório, parcialmente extinta ou recombinante de EBV (bem como vetores baseados em mini-EBV e outros baseados em EBV), e separação das células infectadas dos sobrenadantes enriquecidos em EBV (Speck P et ai, 1999; Oh HM et ai., 2003; Bass H e Darke C, 2004; Radons J et al., 2005; US5798230). As evidências experimentais apresentadas nos exemplos sugerem que uma abordagem similar pode ser usada com outros agentes de imortalização. A combinação adequada dos meios de seleção para a purificação de células secretórias de anticorpos de amostras biológicas e em condições de cultura celular, de agentes estimulantes, como definido acima, e de uma fase de estimulação mantida dentro de uma faixa de horas ou dias (mas sempre separada da fase de imortalização) pode aperfeiçoar a imortalização mediada não apenas por EBV, mas também por outros agentes de imortalização virais, tal como a infecção com outros vírus oncogênicos e/ou a transformação mediada por oncogenes.

Após eliminação do agente de imortalização da cultura celular, a população de células resultante é particularmente enriquecida (quando comparada com a de outros processos) em linfoblastos de proliferação, viáveis (consultar a Figura 9), sem as células agonizantes, ou diferenciadas, que são não apenas inúteis para o estabelecimento de culturas celulares oligoclonais e monoclonais, mas também liberam substâncias (tais como citocinas, intermediário de oxigênio reativo) no meio de cultura celular, que podem afetar negativamente o crescimento, a proliferação e/ou a secreção de anticorpos das células selecionadas e estimuladas.

Nesse sentido, uma população de células policlonal, obtida de acordo com os processos da invenção, é particularmente útil, bem como as populações de células oligoclonais ou monoclonais (contendo células secretórias de anticorpos imortalizadas), que são obtidas por divisão dessa população policlonal.

Essas populações de células podem ser usadas para uma série de aplicações, em particular, relacionadas com o isolamento, a caracterização e a produção de anticorpos.

Por exemplo, uma biblioteca de DNAs compreendendo seqüências de DNAs que codificam anticorpos de um ou mais diferentes isotipos, em que a dita biblioteca de DNAs é preparada usando ácidos nucléicos isolados dessa população de células. Usando-se técnicas de biologia molecular comuns, o mRNA ou o DNA genômico pode ser extraído de uma amostra de células, retrotranscrevendo (se necessário) e amplificando especificamente todas as seqüências presentes na amostra, que codificam um anticorpo, na sua totalidade ou apenas parcialmente (por exemplo, apenas as regiões variáveis que se ligam a um antígeno), como descrito na literatura para animais ou hibridomas imunizados, no âmbito da expressão dessas seqüências como proteínas recombinantes a serem tríadas (Gilliland LK et al., 1996; Lightwood D et al., 2006).

Portanto, os processos da invenção proporcionam populações de células, culturas celulares, sobrenadantes de culturas celulares e bibliotecas de DNAs, que podem ser usados para identificar e produzir anticorpos monoclonais tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica.

Alternativamente, esses produtos biológicos, se obtidos de células secretórias de anticorpos por um indivíduo, podem ser usados para determinar as características da resposta imune, específica de isotipo a um antígeno análogo ou heterólogo, um vírus, uma célula bacteriana, uma toxina, um parasita ou uma vacina no indivíduo específico (por exemplo, identificação dos anticorpos produzidos predominantemente e/ou os antígenos reconhecidos predominantemente pelo sistema imune no indivíduo).

Tendo em vista o grande uso e a estabilidade (como amostras congeladas) desses produtos biológicos (isto é, populações de células, culturas celulares, sobrenadantes de culturas celulares e bibliotecas de DNAs da invenção), podem ser compreendidos em kits para a identificação e a produção de um anticorpo monoclonal tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica.

A presente invenção proporciona populações de células secretórias de anticorpos imortalizadas policlonais, obtidas por uso dos processos descritos acima. Essas populações de células podem ser usadas em um processo para a produção de uma cultura celular secretando um anticorpo monoclonal com as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica, compreendendo as seguintes etapas de:

a) divisão de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou de uma cultura celular de acordo com a reivindicação 6 em culturas celulares, cada uma delas contendo 50 ou mais células;

b) triagem do sobrenadante das ditas culturas celulares para detectar aquelas apresentando as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica;

c) divisão das culturas celulares apresentado as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica nas culturas celulares ou populações de células; e

d) repetição das etapas (b) e (c) nas ditas culturas celulares, até que uma ou mais culturas celulares, cada uma delas secretando um anticorpo monoclonal tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica no sobrenadante da cultura celular, sejam isoladas. Alternativamente, essas populações de células podem ser usadas em um processo para produzir uma cultura celular secretando um anticorpo monoclonal com as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica, compreendendo as seguintes etapas de:

a) triagem do sobrenadante de culturas celulares obtido por múltiplas populações de acordo com a reivindicação 6, para detectar uma ou mais que secretam anticorpos tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica;

b) determinação da seqüência do anticorpo secretado por cada uma das culturas celulares, que apresenta a dita atividade no sobrenadante; e

c) isolamento das culturas celulares que secretam um anticorpo monoclonal no sobrenadante da cultura celular tendo tal atividade.

Para conduzir corretamente esses processos, as populações de células policlonais, oligoclonais e monoclonais têm que ser mantidas em condições de cultura celular adequadas, para medir as suas propriedades, em particular as relativas às atividades de ligação de antígenos e/ou funcional do anticorpo que secretam no sobrenadante da cultura celular.

Nesse sentido, a seleção das condições de cultura celular, após a fase de imortalização, é de importância particular para suportar as viabilidade, proliferação e secreção de anticorpos das células secretórias de anticorpos imortalizadas.

Nesse contexto, a seleção das condições de cultura celular pode ser determinante para estabelecer, selecionar e crescer as culturas celulares oligoclonais e monoclonais. Nesse âmbito, os grupos de células secretórias de anticorpos podem ser mantidos em um meio de cultura celular contendo um ou mais agentes estimulando o crescimento de células B.

No caso de imortalização mediada por EBV, a infecção de EBV deve ser mantida em um estágio latente, para acentuar a viabilidade, a proliferação e a produção de IgG das células. No entanto, a seleção de condições de cultura celular específicas pode acentuar a eficiência de clonagem e a seleção das culturas celulares monoclonais de interesse, como revisto no passado (James K e Bell G, 1987).

Um primeiro aspecto importante é a camada de alimentação, usada para a cultura das células secretórias de anticorpos após a fase de imortalização, quando as células são cultivadas a uma baixa densidade. A camada de alimentação pode ser constituída por preparações de células de sangue periférico não alogênicas, irradiadas, linhas celulares linfoblásticas ou fibroblásticas, linfócitos do sangue de cordão, ou diferentes tipos de células embriônicas. Um exemplo de uma linha celular tendo essas propriedades é o de linhas celulares de EL5-B5, de timomas de EL4 mutante, que suportam eficientemente o crescimento e a proliferação de células B (IfVersen P et ai., 1993; Wen et al., 1987).

Um segundo aspecto importante é como as células são mantidas em cultura, usando um recipiente. Diferentes procedimentos e materiais podem ser usados, incluindo cultura estacionária (em reservatórios ou balões), cultura de suspensão homogênea (em reator agitado contínuo ou garrafas em rolamento), ou cultura imobilizada (em fibras ocas ou outros suportes).

Um terceiro aspecto importante é a seleção do meio de cultura celular para manter a viabilidade e o crescimento das células, quando tanto da execução dos processos da invenção, quando da cultura das células, após a fase de imortalização. Especialmente, nesse último período, a seleção do meio de cultura celular (tal como IMDM ou RPMI-1640) e dos nutrientes das células (por exemplo, aminoácidos, soro) é importante para acentuar os crescimento e réplica da população de células, mesmo quando cultivada a uma baixa densidade celular, como nas culturas celulares oligoclonais.

Finalmente, um quarto aspecto importante é a adição de agentes promotores de crescimento de células B específicos no meio de cultura celular, tais como quaisquer daqueles usados na fase de estimulação, como resumido acima (por exemplo, oligonucleotídeos baseados em CpG, interleucinas(, ou qualquer outro composto conhecido por ter efeitos promotores de crescimento similares em células secretórias de anticorpos imortalizadas, em particular após imortalização com EBV, tal como 4-hidroxinonenal (Ranjan D et al., 2005), formas de tioredoxina (Wendel-Hansen V et aL, 1994), ligante CD40 solúvel ou anticorpos agonísticos contra CD40 (WO 91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L et al., 1997; ImadomeK et al., 2003), or ciclosporina (Tanner JE e Menezes J, 1994; Chen Cet al., 2001).

A seleção do agente promotor de crescimento de células B, bem como do período de tempo no qual o agente é aplicado (por exemplo, apenas nos dias imediatamente depois da imortalização das células), dependem apenas do tipo de ensaio de triagem que é usado posteriormente. Se tal agente puder interferir, no caso de ensaios baseados em células, por modificação da resposta das células-alvo, os sobrenadantes das culturas celulares não podem ser usados diretamente no ensaio, a menos que o agente específico seja eliminado ou substituído do meio de cultura celular. Alternativamente, os anticorpos podem ser, pelo menos parcialmente, purificados dos sobrenadantes de culturas celulares (por exemplo, por precipitação, diálise e/ou purificação por afinidade de proteínas). Prefere-se, no entanto, prosseguir com os ensaios de triagem o mais breve possível, após nucleação dos conjuntos de células, e sem a necessidade de eliminar os agentes promotores de crescimento de células B (ou qualquer outro elemento presente no sobrenadante de culturas celulares) por estabelecimento de condições adequadas, que não elicitam os problemas nos ensaios de triagem, por lavagem das células, ou por mudança do meio de cultura celular.

As células produtoras de anticorpos são isoladas, estimuladas e imortalizadas de acordo com os processos da invenção, e depois podem ser mantidas em culturas de massa por um número de dias variável (por exemplo, de um até 10 dias, ou por períodos de tempo mais longos, tal como de 2 a 4 semanas), antes de serem subdivididos em vários grupos, cada um deles representando uma população de células, que é cultivada separadamente (por exemplo, em lâminas de 6, 12, 24, 32 ou 96 reservatórios).

Essa população de células policlonal, em massa, mantida em condições de cultura celular, pode ser testada por uso dos ensaios já conduzidos em soros, para selecionar o doador, ou qualquer outro ensaio relevante para uso futuro das células, para confirmar a presença de células. Além do mais, algumas alíquotas da população de células policlonal podem ser colocadas em pequenos frascos e armazenadas como células congeladas (como feito normalmente para linhas celulares de mamíferos estabelecidas), que vão ser depois de novo descongeladas e cultivadas.

Os grupos de células são múltiplos e podem ser de 10 até várias centenas (ou mesmo milhares, como mostrado no Exemplo 3), cada um deles contendo, estatisticamente, 10, 1O2, 1O3, 1O4 ou mais células. Os exemplos mostram como as culturas celulares secretando anticorpos podem ser estabelecidas, partindo de populações contendo, estatisticamente, 5, 20, 50 e 100 células. Após um número variável de dias (por exemplo, de um até 10 dias, ou por períodos de tempo mais longo, tais como de 2 a 4 semanas), esses grupos de células devem ter anticorpos secretados em uma proporção suficiente para caracterização deles, por exemplo, por uso de sobrenadantes de culturas celulares (diretamente ou após uma purificação parcial dos anticorpos contidos neles) em um ensaio baseado em células ou qualquer outro de ligação.

As culturas celulares, que contêm pelo menos 1O3, 1O4 ou 1O5 células, podem secretar uma proporção de anticorpos que fica acumulada no sobrenadante das culturas celulares (por exemplo, entre um e 300 μg/mL do total ou mais), que pode ser facilmente medida com kits ELISA comerciais, e que é geralmente suficiente para a condução de análise similar in vitro. Além do mais, 1O5, 1O4, 1O3 ou mesmo menos células são suficientes para obter a seqüência do anticorpo secretado por extração, amplificação, clonagem e seqüenciamento do mRNA associado dessas células (como mostrado no Exemplo 3).

Desse modo, alíquotas do sobrenadante de culturas celulares podem ser depois tríadas para as suas atividades de ligação e/ou funcional em uma maneira de alta produtividade, para identificar o ou os reservatórios positivos apresentando a atividade desejada, usando, possivelmente, uma análise responsiva a dose com sobrenadantes de culturas diluídas em série ou de preparações de anticorpos purificadas parcialmente (por exemplo, obtidas por cromatografia de afinidade em colunas de proteínas A) em experimentos em paralelo.

Os grupos de células positivos (isto é, aqueles mostrando as especificidade de antígenos e/ou atividade biológica) podem ser depois usados para gerar uma nova série de grupos de células, para restringir ainda mais a triagem ao nível da ou das culturas celulares, e, conseqüentemente, isolar as culturas celulares secretando um anticorpo monoclonal tendo as especificidade e atividade desejadas, pelo menos no nível do ensaio de triagem inicial. Os anticorpos monoclonais selecionados devem ser depois reavaliados usando outros ensaios funcionais mais demandantes e caracterizados no nível de isotipo e de seqüência VH/VL, após isolamento deles de clones imortalizados por EB V, usando as tecnologias de DNA recombinante aplicáveis em células B.

Essa caracterização inicial, se corroborada por outros dados obtidos usando modelos relevantes e experimentação clínica, pode levar à identificação do anticorpo monoclonal purificado dos ditos sobrenadantes (ou depois expresso como uma proteína recombinante), como tendo usos diagnósticos e/ou terapêuticos. Em particular, se a população de células original, que tenha sido imortalizada de acordo com os processos da invenção, for uma população de células B humanas positiva a IgG5 esse anticorpo monoclonal é um anticorpo IgG monoclonal humano, que pode ser usado diretamente para o tratamento de infecções e doenças em seres humanos.

Um escalonamento da produção de anticorpos pode ser conduzida usando sistemas de células de mamíferos, bacterianas ou vegetais, nos quais as seqüências clonadas codificando todas as cadeias pesadas e leves (ou apenas as suas regiões de ligação com antígenos) dos anticorpos selecionados são clonadas usando vetores e expressas como proteínas recombinantes.

Os processos da invenção proporcionam culturas celulares oligoclonais e monoclonais de células secretórias de anticorpos, que podem ser isoladas com base nas especificidade de antígenos e/ou atividade biológica, como se pode determinar, por exemplo, por triagem do sobrenadante de culturas celulares, obtido das populações de células secretórias de anticorpos policlonais originais e das culturas celulares oligoclonais ou monoclonais de células secretórias de anticorpos. Essas células podem ser depois usadas para identificar e produzir um anticorpo monoclonal tendo as atividades de especificidade de antígenos e/ou biológica. Nesse âmbito, as tecnologias específicas são receptivas a automação, propiciando que a produtividade de anticorpos, a partir de várias culturas celulares monoclonais, seja aumentada significativamente (Chambers R, 2005).

Os ensaios de triagem, que vão ser usados com os sobrenadantes de culturas celulares e preparações purificadas, devem ser selecionados e estabelecidos para detectar os anticorpos de interesse com a maior precisão possível. Os ensaios de triagem devem conter e ter controles positivo e negativo adequados (por exemplo, outros anticorpos originados de outros ensaios ou de origem comercial) e devem ser também sensíveis o suficiente para medir as atividade de ligação e/ou funcional, na faixa de concentrações que é adequada ao uso desejado do anticorpo (por exemplo, para uso diagnóstico, terapêutico ou profilático).

Por exemplo, se houver previsão de uso do anticorpo como um composto terapêutico, o ensaio deve indicar que uma atividade significativa seja detectável com uma concentração de anticorpo de 100, 10, ou 1 μg/mL (ou mais baixa). Não obstante, nesse estágio inicial da caracterização do anticorpo, a atividade medida pelo ensaio é geralmente suficientemente sensível para ser somente previsível, de algum modo, de uma atividade que é terapeuticamente útil. Ensaios adicionais em IgG purificado ou recombinante são mais críticos em relação à eficiência terapêutica e à dose associada a ser possivelmente administrada. Os ensaios de triagem devem ser estabelecidos para determinar as especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica, para as quais os anticorpos são dirigidos, e podem usar auto/aloantígenos (compostos antigênicos / alergênicos humanos, de mamíferos, bacterianos, virais, parasitas, orgânicos, químicos e quaisquer outros), que tenham sido purificados e incluídos em um ensaio baseado em células ou bioquímico proporcionando uma demonstração da especificidade da interação com um antígeno, ou de um efeito em células, tecidos, vírus ou modelos de animais.

Alternativamente, os ensaios podem ser também estabelecidos para a determinação de especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica para alvos não purificados, biológicos, complexos, tais como células ou tecidos (por exemplo, migração em células endoteliais, crescimento celular oncogênico, etc.).

Os resultados desses ensaios conduzidos em populações de células policlonais ou, ainda melhor, oligoclonais, em condições de cultura celular, podem ser usados para selecionar as populações que devem ser armazenadas em pequenos frascos congelados ou usadas para construir bibliotecas de DNAs compreendendo seqüências de DNAs, que codificam anticorpos de um ou mais isotipos específicos. Várias tecnologias foram descritas na literatura para triagem de anticorpos in vitro, que podem ser relevantes para usos específicos de anticorpos monoclonais, e que permitem também uma caracterização precisa e de alta produtividade dos anticorpos. Juntamente com as tecnologias mais clássicas, tais como imunoprecipitação, manchamento ocidental, ELISA e imunofluorescência, abordagens mais elaboradas fazem uso de culturas de células / órgãos pequenas, nanopartículas de aparas ou multicoloridas para os ensaios de triagem efetivos (Bradbury A et al., 2003; Haab BB, 2005; LaI SP et al., 2002; Olivo P, 1996; Potera C, 2005; WO 05/82926; WO 05/003379; WO 05/83064,; WO 05/76013).

Dependendo da origem, das células secretórias de anticorpos dos ensaios de triagem usados para a seleção de culturas celulares monoclonais específicas e caracterização dos anticorpos monoclonais, muitos diferentes usos desses anticorpos podem ser considerados, tais como ferramentas diagnosticas (para infecções virais, bacterianas ou parasitas, tumores, ou tipagem celular), como ferramentas profiláticas ou terapêuticas (em particular, para o tratamento de infecções malignas, distúrbios mediados imunes ou inflamatórios, ou no controle de pacientes transplantados), para investigações no sistema imune, e, em geral, antígenos de relevância clínica. Desse modo, esses anticorpos, em particular os antígenos monoclonais humanos, podem ser usados para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo monoclonal ou um fragmento dele, e um veículo farmaceuticamente aceitável, para a manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente, e para a diagnose de doenças infecciosas, oncogênicas, auto-imunes ou alérgicas em seres humanos.

A presente invenção também proporciona um processo para a produção de anticorpo monoclonal, compreende as seguintes etapas:

a) expansão de uma cultura celular produzida por um método descrito acima; e

b) purificação do anticorpo monoclonal dos sobrenadantes da dita cultura celular.

Em particular, uma vantagem distinta da imortalização com EBV é que as culturas celulares, após condução da caracterização inicial e da validação do anticorpo secretado, podem ser usadas diretamente para purificar uma quantidade suficiente de anticorpo (da faixa de microgramas a miligramas), para conduzir caracterização e validação do anticorpo mais intensas, usando ensaios in vitro ou in vivo (outros ensaios baseados em tecido ou células, bioquímicos, modelos de doenças estabelecidos em roedores, métodos biofísicos para medidas de afinidade, mapeamento de epítopos, etc.).

Nesse âmbito, a cultura celular original, após controle da capacidade de clonagem da dita cultura, pode ser ainda otimizada por adaptação do meio de cultura e das condições para manter crescimento celular e aperfeiçoar a expressão e a secreção de anticorpos (Ling N, 2000). O anticorpo pode ser então purificado dos sobrenadantes da cultura celular, por aplicação de tecnologias conhecidas da literatura para o isolamento de anticorpos de misturas complexas de proteínas usando cromatografia de afinidade (Nisnevitch M e Firer MA, 2001; Huse K et al., 2002). Esses processos para a purificação de anticorpos podem ser baseados na afinidade geral dos anticorpos para substratos, tais como proteína A, proteína G ou substratos sintéticos (Verdoliva A et al., 2002; Roque AC et al., 2004; Danczyk R et al., 2003), bem como por cromatografia de afinidade baseada em antígenos ou epítopos (Murray A et al., 2002; Sun L et al., 2003; Jensen LB et al., 2004). Outros dispositivos de separação preparatórios para os anticorpos foram elaborados, por exemplo, com base em eletroforese (Thomas TM et al., 2003).

Obviamente, uma cultura celular monoclonal pode ser também usada para identificar as seqüências de DNAs que codificam o anticorpo monoclonal, por amplificação e clonagem delas em um vetor, antes de prosseguir para a expressão do anticorpo recombinante nas células hospedeiras adequadas. A seqüência de proteínas dos anticorpos secretados pelas culturas celulares clonais selecionadas, usando tecnologias de DNA recombinante, que são conhecidas na literatura (Poul MA et al., 1995; Jovelin F et al., 1995; Heinrichs A et al., 1995; Dattamajumdar AK et al., 1996; Norderhaug L et al, 1997; Chardes T et al., 1999; Jarrin A e Andrieux A, 1999; Essono S et al., 2003).

Essas tecnologias também podem ser usadas para caracterização e otimização estruturais e funcionais adicionais de anticorpos terapêuticos (Kim SJ et al., 2005), ou para a geração de vetores propiciando a transferência in vivo estável de anticorpos monoclonais (Fang J et al., 2005).

Sucintamente, mRNA pode ser produzido da cultura celular e retrotranscrito em uma biblioteca de cDNAs, que pode ser usada como um modelo para uma Reação da Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo degenerar os iniciadores para amplificar, especificamente, as cadeias pesadas e leves integrais, ou apenas parte dessas cadeias (tais como as regiões variáveis). No caso no qual apenas as regiões variáveis (responsável pela ligação de antígenos) são isoladas, essas seqüências podem ser clonadas em um vetor, permitindo a fusão dessa seqüência em regiões constantes (Fc) do isotipo desejado (por exemplo, IgG humano gama 1). Os fragmentos de DNA amplificados por PCR podem ser diretamente seqüenciados ou clonados, usando adaptadores ou sítios de restrição, em vetores para seqüenciamento da seqüência de codificação, que pode ser adaptada e reclonada em outros vetores, para expressão dos anticorpos como proteínas recombinantes. O mRNA das populações de células policlonais ou oligoclonais das células também pode ser usado para construir bibliotecas de cDNA, específicas para células secretórias de anticorpos de isotipos específicos, que podem ser disponibilizadas, por exemplo, como bibliotecas de exibição de fagos, bibliotecas bacterianas, bibliotecas de levedura, ou qualquer outro formato de biblioteca biológica, que possa ser usada para replicar e manter o DNA, em particular o DNA codificando proteínas. Por exemplo, uma biblioteca de seqüências de anticorpos recombinantes pode ser gerada usando o mRNA extraído de uma ou mais populações de células oligoclonais, usadas para a produção de anticorpos em células hospedeiras bacterianas ou eucarióticas, e depois para triagem desses anticorpos com o objetivo de identificar um ou mais anticorpos que têm especificidade de antígenos e/ou atividade biológica desejadas.

Uma vez clonados e caracterizados, os anticorpos podem ser expressos como proteínas recombinantes em organismos procarióticos (por exemplo, E. coli; Sorensen H e Mortensen K, 2005; Venturi et al., 2002), vegetais (Ma JK et ai, 2005), ou células eucarióticas, em particular, linhas celulares de roedores ou outras eucarióticas (por exemplo, CHO, COS, HEK293), que propiciam um alto nível de expressão, como células transformadas transientes ou estáveis (Schmidt F, 2004). Isso vai ser necessário em particular quando a caracterização dos anticorpos tiver que ser feita usando ensaios mais sofisticados, incluindo os ensaios in vivo. As células hospedeiras podem ser ainda selecionadas com base no nível de expressão recombinante do anticorpo monoclonal clonado.

Nesse âmbito, as seqüências de anticorpos clonados podem ser modificadas por uso de PCR ou outras tecnologias de DNA recombinante apenas no nível de DNA (por exemplo, eliminando ou adicionando sítios de restrição, otimizando o uso de códons, adaptando as seqüência regulatórias de transcrição e/ou translação) ou em ambos os níveis de DNA e de proteína (por exemplo, adição de outras seqüências de proteínas ou modificação de aminoácidos internos). Além do mais, os fragmentos (Fv, Fab, F(ab)' ou F(ab)M) ou proteínas de fusão baseadas nesses anticorpos podem ser produzidos usando tecnologias de DNA recombinante.

Por exemplo, os anticorpos recombinantes também podem ser modificados no nível de estrutura e/ou atividade, por seleção de uma região Fc específica, a ser fundida nas regiões variáveis (Furebring C et al., 2002), por adição de seqüências de peptídios estabilizantes, (WO 01/49713), por geração de fragmentos de anticorpos de cadeia única recombinantes (Gilliland LK et al., 1996), ou por adição de substância radioquímicas ou polímeros a resíduos modificados quimicamente (Chapman A et al., 1999). Diferentes sistemas vetores têm sido usados para gerar grupos estáveis de linhas celulares transfectadas (Aldrich TL et al., 2003; Bianchi A e McGrew JT, 2003). A expressão estável, otimizada, de alto nível de anticorpos recombinantes foi obtida (Schlatter S et ai., 2005; Dinnis D e James D, 2005; Kretzmer G, 2002), devido à otimização das condições de cultura celular (Grunberg J et al., 2003; Yoon SK et al., 2004) e por seleção ou engenharia de clones com níveis mais altos de produção de anticorpos (Bohm E et al., 2004; Borth N, 2002; Chen K et al., 2001; Butler M, 2005).

A purificação de anticorpos não recombinantes de culturas celulares pode ser feita por uso das tecnologias descritas e outras indicadas na literatura (Hale G et al., 2004; Horenstein AL et al., 2003). No entanto, o desenvolvimento e ò uso clínicos devem ser baseados na caracterização das farmacocinética e farmacodinâmica (Lobo E et al., 2004) e na obediência aos requisitos internacionais para a produção e o controle de qualidade de anticorpos monoclonais de murinos, humanos e trabalhados por engenharia, para uso terapêutico e diagnóstico in vivo em seres humanos (documento EUDRA 3AB4a).

EXEMPLOS Exemplo 1: Efeitos dos processos para purificação e estimulação de células nas viabilidade e proliferação de células B em condições de cultura celular

Materiais & Métodos

Isolamento e manutenção de células B humanas

Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) frescas foram purificadas de sangue periférico por centrifugação de gradiente de densidade convencional em Ficol / Hypaque. Dependendo do experimento, as células foram depois processadas usando PBMCs de um único doador ou PBMCs agrupados de cinco diferentes doadores, para avaliar uma resposta média às diferentes condições experimentais e limitar as diferenças devido à variabilidade dos doadores.

As células B humanas foram isoladas de PBMCs por classificação de células imunomagnéticas usando a técnica VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.), como descrito pelo fabricante. Em suma, as PBMCs foram suspensas em PBS (solução salina tamponada com fosfato) suplementada com BSA (albumina bovina sérica) 0,5% e EDTA (etilenodiamino- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetracetato) 2 mM e incubadas com diferentes anticorpos conjugados com microcontas (dirigidos a CD19, a CD 22 ou a CD27). As células ligadas a microcontas foram depois lavadas e passadas por uma coluna para a seleção positiva delas (coluna LS; Miltenyi cód. 30-042-401), sob um campo magnético. As células foram depois liberadas das microcontas usando o reagente de liberação MultiSort MACS (20 nL/mL) a 4°C por 10 minutos, seguindo as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec Inc.).

As células B positivas a IgG foram obtidas por seleção negativa de células positivas a IgM por classificação celular ou por seleção magnética de células positivas a IgG, por uso da técnica VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.), seguindo as instruções do fabricante. Para a classificação celular, as células B positivas a CD22 (com ou sem estimulação prévia) foram incubadas com concentrações ótimas de FITC de IgM anti- humano (Becton Dickinson n° 555782) por 1 hora em gelo. As células foram lavadas intensamente com PB S, depois classificadas em células positivas a IgM e negativas a IgM, sob condições estéreis, usando um classificador celular de alta velocidade (classificador celular MoFlo® de alto desempenho).

As células selecionadas foram suspensas e mantidas em um meio de cultura celular RPMI-1640 suplementado com FCS (soro fetal de bezerro) desativado termicamente a 10% (v/v), piruvato de sódio a 1 mM, estreptomicina a 100 ug/mL e penicilina a 100 U/mL e cultivadas em lâminas de 24 reservatórios a 37°C e 5% de CO2.

Estimulação de células B em cultura celular CpG2006 (Sf-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-S'; SEQ ID NO: 1) foi comprado do Coley Pharmaceutical Group. Interleueina humana recombinante 2 (IL-2) foi obtida da Rocha. Interleucina humana recombinante 4 (IL-4) foi obtida da Peprotech. O ligante CD40 humano recombinante (fragmento solúvel compreendendo os aminoácidos 108 - 261) foi obtido da R & D Systems. A cepa de Staphylococcus aureus Cowan (SAC) e os lipopolissacarídeos (LPS) foram comprados da Sigma.

Medida da proliferação de células B por apreensão em H-timidina

As células (2 χ 106/mL) foram semeadas em uma lâmina de 96 reservatórios (50 jiL/reservatório) em amostras em triplicata nas condições de cultura indicadas e marcadas com

H-timidina (NET-027X Timidina, metil- H; atividade específica C1/mmol; Perkin Elmer), que foi adicionada (0,5 μCi/ΓβββΓναίόπο) 8-16 horas antes do final do experimento. A apreensão de H-timidina foi medida por colheita de células em filtros de fibra de vidro, que foram contadas usando um contador beta (Wallach Instrument).

Análise de expressão de marcador superficial por FACS

As células (3 χ 105/amostra) foram suspensas em PBS com 0,5% de albumina sérica bovina e incubadas por 30 minutos a 4°C com os anticorpos monoclonais selecionados contra CD22 marcado com FITC. Após lavagem, a fluorescência foi analisada usando-se um citômetro de fluxo FACSCalibur e software CellQuest (Becton Dickinson). A atividade de ligação de fundo dos anticorpos monoclonais foi estimada por meio de anticorpos monoclonais negativos de mesmo isotipo. O número de células analisadas foi de 10.000.

Classificação das células com base em FACS

A classificação das células foi conduzida usando um classificador de células de alto desempenho MoFloR (Dako). A seleção negativa de IgG expressando células foi conduzida partindo-se das células (10 /mL), que foram incubadas com IgM-FITC monoclonal anti-humano (10 μΙ,/ΙΟ6 células; Becton Dickinson cat. n° 555782) ou IgM-FITC policlonal anti- humano (2 μίνίΟ6 células; Jackson, cat. n° 309-096-043) por 1 hora a 4°C. As células foram depois lavadas e suspensas (10-20 χ 106/mL) em tampão de classificação (PB S com EDTA 5 mM, Hepes 25 mM e FCS 1%). As células foram encerradas com base em parâmetros morfológicos (RI). As células positivas a CD22, negativas a IgM foram selecionadas dentro da área RL

Resultados

A literatura proporciona informações comparativas insuficientes no efeito das diferentes abordagens para purificação e estimulação de células B nas viabilidade e proliferação celulares em condições de cultura celular. Interleucina 2 (IL-2) foi usada como um composto de referência, ocasionando os efeitos de promoção de crescimento bem descritos dessa citocina em células B humanas primárias em cultura celular (Banchereau J e Rousset F, 1992). Uma primeira comparação foi feita usando células B primárias que foram purificadas de PBMCs humanos com base na expressão superficial de CD22 nas suas superfícies, e depois co- estimuladas com os estimulantes de células B policlonais bem conhecidos: CpG2006, lipopolissacarídeos (LPS), ligante CD40 (CD40L) solúvel, e cepa de Staphylococcus aureus Cowan (SAC).

Uma resposta de dose positiva na proliferação celular foi medida quando LPS, SAC e CD-40L foram adicionados em cultura celular, juntamente com IL-2, em um ensaio de apreensão em 3H-timidina de 4 dias. No entanto, à combinação de CpG2006, adicionada em concentrações geralmente descritas na literatura (Bernasconi N et al., 2003; Traggiai E et al., 2004), mostra que esse composto, quando combinado com IL-2, tem um potencial marcadamente mais alto para induzir proliferação de células B em cultura celular (Figura 2). Os resultados dos efeitos de indução de proliferação, similares àqueles obtidos com uma combinação de CpG2006 e IL-2, foram obtidos nesse ensaio por combinação de CD40L solúvel (a uma concentração de menos que 0,5 μg/mL) com outra citocina, IL-4 (pelo menos 20 ng/mL), sugerindo que essa combinação de compostos pode ser usada como um agente estimulante nos processos da invenção, uma vez que a cinética e os efeitos ótimos na seção de IgG são determinados.

Em vista da intensidade do efeito identificado com uma combinação de IL-2 e CpG2006, uma titulação de CpG2006 para proliferação de células B e formação de blastos ótimas foi conduzida usando uma faixa de concentrações de CpG2006 de 0 a 2,5 μg/mL, enquanto mantendo uma concentração constante de IL-2.

Uma proliferação induzida por CpG2006 significativa de células B humanas positivas a CD22 foi detectada em concentrações tão baixas quanto 0,15 μg/mL, com um platô obtido a 0,3 μg/mL (Figura 3A). Quando as mesmas populações de células foram analisadas por FACS, para o percentual de células viáveis e blastos (grandes células com alta difusão para a frente), a concentração de CpG2006 ótima parece ser ligeiramente maior (entre 0,6 e 1,25 μg/mL), uma vez que um percentual mais alto de células blásticas é gerado nessas concentrações (Figura 3B).

Essa evidência na combinação de CpG2006 / IL-2, enquanto confirmando os resultados prévios, indicando que os efeitos estimulatórios das células B de CpG2006 podem ser obtidos em concentrações abaixo de 1 μg/mL, mostra que a proliferação e a formação de blastos de células B positivas a CD22 estimuladas podem ser obtidas em uma gama de concentrações de CpG2006 (0,3 - 1 μg/mL).

Nesses experimentos, IL-2 foi adicionada a uma concentração constante (1.000 U/mL), mas uma resposta a dose similar pode ser conduzida com IL-2 a diferentes concentrações, enquanto que a concentração de CpG2006 fica constante, para definir ainda mais a concentração ótima de IL-2 capaz de induzir proliferação de células B humanas e formação de blastos, na presença de CpG2006. Experimentos subseqüentes também mostraram que a IL-2 pode ser usada em uma gama de concentrações entre 100 U/mL e 1.000 U/mL).

Desse modo, além da seleção dos agentes estimulantes de células B policlonais, a determinação da concentração na qual os compostos específicos devem ser usados (sozinhos ou em combinação) é importante para obtenção do efeito desejado na proliferação celular. A responsividade e a proliferação de células B a ativadores e citocinas baseados em CpG2006 foram mostradas para células positivas a CD19 / CD27 (Bernasconi et al., 2002; Jung J et al., 2002). No entanto, pelo menos alguns dos efeitos negativos de CpG2006 na viabilidade de células B conhecidos na literatura (Hartmann et al., 2000; Klinmann D et al., 1996; Fearon K et al., 2003) parecem ser reduzidos por aplicação de condições, concentrações e combinação de compostos específicas. O processo para a purificação de células B primárias de amostras biológicas pode ser um outro elemento, a ser considerado para o estabelecimento de um processo no qual o potencial de viabilidade e proliferação dessas células B primárias não é arriscado pelas condições de cultura celular e nas manipulações in vitro na presença de agentes estimulantes.

Dois marcadores superficiais celulares são descritos predominantemente na literatura como sendo úteis para a seleção positiva de células B humanas, usando, por exemplo, suportes sólidos: CD19 e CD22. O protocolo de estimulação combinando IL-I e CpG2006 foi aplicado em células B humanas com microcontas específicas de CD19 ou CD22.

Uma análise baseada em FACS de viabilidade celular e formação de blastos foi conduzida antes e depois da estimulação. A comparação entre essas duas abordagens para a purificação celular mostrou claramente que, imediatamente após a purificação, a população de células positiva a CD22 é mais homogênea do que a população positiva a CD19 (Figura 4A). Essa resposta celular à abordagem de purificação e ainda mais evidente após 4 dias de estimulação (Figura 4B), quando a população positiva a CD22 tinha uma maior freqüência de células viáveis e uma proporção muito maior de grandes células ativadas do que tinha a população positiva a CD19. A maior viabilidade das células B purificadas com microcontas carregadas com anticorpos específicos de CD22, em vez de com os anticorpos específicos de CD19, pode ser devido aos diferentes efeitos a jusante no potencial de crescimento dessas células, que são exercidos por dois diferentes meios de seleção.

Além do mais, as células B positivas a CD22 podem ser selecionadas e estimuladas por aplicação de meios de seleção adicionais, tais como microcontas, para a seleção positiva de células expressando IgG, ou qualquer outro subconjunto de células B relevante, tais como as células B de memória positivas a CD27.

Uma vez mostrado que a seleção de meios para ambas a estimulação e a seleção de célula afetam a viabilidade e a proliferação celulares, um outro, que pode ser envolvido, é a cinética da viabilidade celular e da resposta de proliferação de células B humanas, positivas a CD22 à estimulação isolada ou combinada com IL-2 e CpG2006.

A viabilidade e a proliferação celulares foram medidas 2, 4 e 6 dias após início da estimulação, mostrando que o efeito combinado de CpG2006 (1 μg/mL) e IL-2 (1.000 U/mL) proporciona uma cinética distinta. A incorporação máxima de H- timidina, induzida apenas por CpG2006, é observada como precoce como 2 dias em cultura e diminui rapidamente depois. A cinética da resposta de proliferação celular a apenas IL-2 é mais gradual, com o aumento da incorporação de H-timidina até o 6o dia de cultura. No entanto, a estimulação combinada com CpG2006 e IL-2 proporciona uma cinética de incorporação de 3H- timidina similar àquela de CpG2006, mas com um efeito acentuador surpreendente no 2° dia, que continua até o 4° dia e diminui no 6° dia de cultura (Figura 5). Em paralelo, o número total de células viáveis nas culturas estimuladas com CpG2006 e IL-2 foi medido, mostrando de novo um maior número de células viáveis nos 2° e 4° dias.

Desse modo, a vantagem de combinar os dois agentes estimulantes é claramente mais importante quando, especialmente no 4° dia de cultura, um equilíbrio entre os efeitos disparados separadamente por IL-2 e CpG2006, tendo cinéticas de direções opostas, pode ser obtido. Esses dados também sugerem a possibilidade de que efeitos similares, ou ainda melhores nas proliferação e viabilidade celulares podem ser exercidos nas células secretórias de anticorpos, não apenas por adição dos agentes estimulantes simultaneamente, mas também seqüencialmente (isto é, um no início da fase de estimulação e o outro após algumas horas ou dias).

Exemplo 2: Efeito de métodos para purificação e estimulação celulares em viabilidade e proliferação, e secreção de anticorpos de células B imortalizadas com uso de EBV

Materiais & métodos Seleção e análise de proliferação e viabilidade de células B

A seleção de células B humanas, a estimulação e a análise delas foram conduzidas como indicado no Exemplo 1, a menos que indicado de outro modo.

Análise de expressão de marcador superficial por FACS

As células positivas a CD21 foram detectadas por imunofluorescência e citometria de fluxo, usando um conjugado anti-CD21-PE (Caltag Laboratories, cat. n° MHCD2104, batelada 04061206), como indicado acima para CD22.

Preparação de sobrenadantes de vírus Epstein- Barr (EBV)

As células de linfomas marmorados B95-8 ATCC No. CRL-1612; 5 χ 105/ml) foram crescidas em meio de cultura celular RPMI-1640 suplementado com FCS (meio completo) a 10% por 4 dias.

As células B95-8 crescendo exponencialmente foram estimuladas com ésteres de forbol a 100 nM (por exemplo, PMA; Sigma) por 2 horas (Oh HN et al., 2003), depois lavadas intensamente com HBSS (solução salina equilibrada de Hank; Sigma), para remover PMA em solução. As células B95-9 estimuladas com PMA foram cultivadas em meio de cultura celular RPMI-1640 completo, adicionado com FCS a 10% por 48 horas, e sobrenadante foi coletado, centrifugado e filtrado por uma membrana de 0,22 μιη.

A eficiência da imortalização foi avaliada em 3 preparações distintas de células B positivas a CD22 de diferentes doadores de sangue. Em todos os casos, observou-se uma imortalização rápida e linhas de linfoblastóides policlonais foram obtidas mostrando uma rápida replicação. A imortalização conduzida em paralelo com uma batelada de vírus preparada sob condições convencionais, na ausência de estimulação com PMA, mostrou uma replicação mais lenta.

Imortalização mediada com EBV de células B estimuladas, negativas a IgM, positivas a CD22, humanas

Após 4 dias de estimulação com IL-2 (1.000 U/mL) e CpG2006 (1 μg/mL), as células negativas a IgM, positivas a CD22 foram lavadas intensamente com meio fresco, para remover os agentes estimulantes, antes de serem expostas aos sobrenadantes de EBV.

A imortalização em massa das células foi conduzida por incubação delas (106/mL) com sobrenadante de EBV (50% v/v de RPMI-1640 adicionado com FCS a 10%), por um mínimo de 4 horas até 18 horas, e depois lavadas com meio Jfresco. A proliferação e a viabilidade das células, que são tratadas com sobrenadante de EBV a 50%, por 4 a 18 horas, são comparáveis com as proliferação e viabilidade de células que são tratadas com sobrenadante de EBV a 30% por 7 dias.

As células são depois concentradas (106/mL em RPMI-1640 adicionado com FCS a 10% e IL-2, 1.000 U/mL) e cultivadas em 0,5 χ 10^5 PBMCs alogenéicas, irradiadas (3.000 rad) por reservatório em uma lâmina de 24 reservatórios por um período de 8 a 16 dias.

Comparação qualitativa e quantitativa do resultado de diferentes métodos para a imortalização de células B humanas usando EBV

As células B humanas foram isoladas como células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) positivas a CD22, reunidas de 5 doadores normais por seleção magnética, como descrito no Exemplo 1, e depois divididas em três conjuntos de células, cada um deles exposto a um diferente método baseado em EBV para imortalização de células B.

No método BÁSICO, a fração positiva a IgG

dessas células foi selecionada por classificação celular, usando um classificador de células de alta velocidade MoFlo (MoFlo Cytomation) e FITC de IgM anti-humano (Becton Dickinson). Depois, 8 χ 10^5 células positivas a IgG, positivas a CD22 foram cultivadas por 12 horas com sobrenadante de EBV (preparado como descrito acima), lavadas e cultivadas na densidade de 1,5 χ 10^6 células/mL por 10 dias a 37°C em meio de IMDM (Gibco- BRL) suplementado com L-glutamina, aminoácidos não essenciais (NEAE) e FCS a 10%, na presença de camada de alimentação de PBMCs alogenéicas irradiadas.

No método COMBINADO, 8 χ 10^5 células positivas, positivas a CD22 a IgG foram isoladas como no método BÁSICO de depois cultivadas na densidade de 1,5 χ 10^6 células/mL com CpG2006 (1 μg/mL) e sobrenadante de EBV (preparado como descrito acima) em meio de IMDM (Gibco- BRL) suplementado com L-glutamina, NEAE e FCS a 10% por 10 dias, na presença de camada de alimentação de PBMCs alogenéicas irradiadas.

No método SEQÜENCIAL, as PBMCs positivas a CD22 foram primeiro pré-estimuladas com uma combinação de CpG2006 (1 μg/mL) e IL-2 (200 U/mL), em meio de IMDM (Gibco-BRL) suplementado com L-glutamina, NEAE e FCS a 10% por 4 dias a 37°C. As células foram depois lavadas com PBS e as células positivas a IgG enriquecidas por seleção magnética, como descrito acima. As células pré-estimuladas (8 χ 10^5 PBMCs positivas a CD22) foram depois infectadas com sobrenadante de EBV (como no método BÁSICO) por 12 horas a 37°C, lavadas e cultivadas a 1,5 χ 10^6 células/mL em meio de IMDM (com L-glutamina, NEAE e FCS a 10%) por 10 dias a 37°C, na presença de camada de alimentação de PBMCs alogenéicas irradiadas. Medida do número de células e, da viabilidade celular por iodeto de propídio e citometria de fluxo

O número total de células B foi medido por contagem microscópica, e a viabilidade delas por medida da exclusão do iodeto de propídio de corante fluorescente, com intercalação de DNA, usando-se um citômetro de fluxo de bancada FACSCalibur e software CellQuest (Becton Dickinson Biosciences). Sucintamente, as células foram expostas à temperatura ambiente a iodeto de propídio (PI; Sigma; 2,5 μg/mL de concentração final em PB S) e analisadas por citometria de fluxo em um período de 30 minutos. As células viáveis foram definidas como aquelas com uma alta difusão para a frente e ortogonal, característica de linfócitos e linfoblastos, e excluindo PI. As células que foram manchadas com PI, e tendo uma baixa difusão para a frente, representam as células e fragmentos mortos.

Análise de expressão superficial de CD23

A expressão de CD23 foi medida em linfoblastos viáveis, que foram encerrados eletronicamente por FACS, usando imunofluorescência direta (área R2) e citometria de fluxo com conjungado CD23 - PE anti-humano (Becton Dickinson, catálogo n° 555711), como descrito para o Exemplo 1.

Medida de IgG secretada A secreção de IgG humana total em sobrenadantes de cultura foi medida por uso de ELISA (Immuno- Tek/Zeptometrics, cat. n0 ZMC 0801182), de acordo com as instruções do fabricante. Sucintamente, os sobrenadantes dè cultura foram coletados das culturas e armazenados a 4°C. As amostras de sobrenadantes foram diluídas em série e comparadas com a curva padrão de IgG humana purificada, incluída com o kit ELISA. A medida reflete a quantidade total de IgG acumulada nas culturas por um período de cultura de 10 dias.

Resultados

Uma vez que o âmbito de todo o processo é para gerar células humanas secretórias de anticorpos, imortalizadas, em grande parte, no modo direto, EBV foi selecionado como o agente de imortalização, sendo bastante direto estabelecer e aplicar o uso de sobrenadante de células infectadas por esse vírus. No entanto, é bem conhecido que apenas uma fração das células expostas ao EBV está de fato infectada, possivelmente devido à expressão limitada de CD21, um receptor presente na superfície da célula que o vírus usa para introduzir as células (Jondal e Klein, 1973; Nemerow et al., 1985; Boyd e Fecondo, 1988). Portanto, foi importante verificar se a expressão de CD21 foi afetada de modo positivo ou negativo pelos meios e condições selecionados, para a estimulação e a purificação de células descritas acima. Nesse âmbito, a cinética de proliferação de populações de células B selecionadas com base em diferentes marcadores celulares (apenas positivos a CD22, positivos a CD22 e positivos a CD27, positivos a CD22 e IgG, positivos a CD22 e negativos a IgM), seguinte a uma estimulação de 4 dias com IL-2 (1.000 U/mL) e CpG2006 (1 μg/mL), e medida da proporção de células positivas a CD22 em diferentes pontos de tempo. Em todos os experimentos, o CD21 foi expresso em mais de 90% das células viáveis e em proliferação, confirmando também a possibilidade de uso de uma abordagem de seleção dupla, no contexto dos métodos da invenção.

Portanto, após demonstração do forte efeito positivo na atividade de proliferação celular exercida pelos meios e condições selecionados para estimulação e purificação celular, testou-se como essa abordagem pode proporcionar também um aperfeiçoamento em como as células B respondem a um agente de imortalização. De fato, é bem conhecido que, seguinte à exposição de células B a EBV, uma fração substancial das células para de crescer e morre dentro da primeira semana de cultura, seguido pelo recomeço da proliferação pelas células imortalizadas com EBV (James K e Bell G, 1987). Desse modo, seria de grande importância entender se uma proporção adequada de células B humanas adequadamente estimuladas e selecionadas não apenas pode ser imortalizada com EBV, mas também se essas células B imortalizadas são mais capazes de superar o período crítico seguinte à imortalização com EB V.

As células B negativas a IgM, positivas a CD22, humanas, com ou sem estimulação prévia com CpG2006 e IL-2, foram expostas a sobrenadante de EBV de um dia para o outro, lavadas e cultivadas com meio incluindo IL-2 (1.000 U/mL) em uma camada de alimentação de PBMCs alogenéicas irradiadas. A proliferação dessas células foi medida durante os dias seguintes. Desse modo, pode-se demonstrar que o pré-tratamento de células B com CpG2006 e IL-2 resulta em uma melhoria nas velocidade e grau de proliferação recomeçada de células B, seguinte à imortalização com EBV. Isso é mais claramente demonstrado no 7º dia seguinte à exposição a sobrenadantes de EBV, quando quase 50% a mais de células estão presentes em culturas pré- estimuladas, quando comparadas com as células que não foram pré-estimuladas (Figura 6A). Essa observação foi confirmada também quando células B positivas a CD22 não foram esgotadas adicionalmente de células positivas a IgM.

Os métodos apresentados acima descreveram os benefícios do uso de ativadores de células B policlonais, durante (e não apenas antes) da imortalização delas usando sobrenadantes de EBV, sem uma etapa para a eliminação dos ativadores da cultura celular (WO 91/09115; Hur D et al., 2005; Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677). Desse modo, o número de células nas culturas de células B negativas a IgM, positivas a CD22, que foram expostas por 7 dias a sobrenadantes de EBV, na presença ou na ausência de CpG2006 (1 μg/mL) foi examinado. No entanto, a presença de CpG2006 e de IL-2, durante a imortalização com EBV5 resultou em menores números de célula B viáveis, como pode-se concluir por contagem microscópica das células (Figura 6B). Essa redução já é significativa, quando comparada com as células expostas a sobrenadantes de EBV apenas, mas é ainda mais importante quando os dados obtidos com a fase de pré-estimulação separada são considerados (Figura 6A).

Esses dados sugerem que uma fase de estimulação distinta, iia qual as culturas de células B humanas são tratadas com agentes estimulantes (usados sozinhos ou em combinação, tal como com CpG2006 e IL-2), exerce um efeito benéfico em todo o processo de seleção de células B e imortalização usando EBV. Esse efeito positivo pode ser ainda aperfeiçoado por uso de combinações específicas adicionais de agentes estimulantes (concentrações reduzidas de CpG2006 e/ou IL-2, por exemplo) e/ou por limitação da fase de estimulação a um período de tempo (por exemplo, entre 2 e 4 dias), no qual as células B mostram ótimas atividade de proliferação e expressão de marcadores relevantes (tal como CD21). A remoção dos agentes estimulantes, antes da fase de imortalização, é útil para a obtenção dos melhores resultados desse método, sendo o crescimento e a viabilidade de células B positivas a CD22 afetados negativamente pela presença contínua e ampla dos agentes estimulantes combinados com os sobrenadantes de EBV.

Os dados apresentados acima permitem que se demonstre não apenas a possibilidade de aplicação do processo a um subconjunto específico de células B humanas, com base na expressão de marcadores superficiais celulares (CD21, CD23, CD24, CD27, e/ou CD22, por exemplo), mas também a praticabilidade de aplicar outros critérios de seleção relativos ao anticorpo secretado pelas células B. No presente caso, o uso de tecnologias para eliminação de células expressando anticorpos de um isotipo específico (IgM), antes de prosseguir para a imortalizacão.

De fato, uma análise baseada em FACS de células B imortalizadas com EB V, esgotadas de IgM, estimuladas com CpG2006 / IL-2, positivas a CD22, que foi conduzida 10 dias depois da infecção com EBV, confirmou que quase que a totalidade das células viáveis (indicadas por uma maior difusão para a frente nos dois quadrantes à direita) continua a ser negativa a IgM (quadrante direito de fundo), um fenótipo que é mais desejável para a geração de anticorpos terapêuticos (Figura 7A). Uma outra demonstração que as culturas de células B, específicas de isotipo, imortalizadas, humanas podem ser geradas e mantidas usando os processos da invenção, foi obtida por teste dos sobrenadantes das células B descritas acima em um ensaio de imunodifusão, como conduzido na literatura por imunodifusão (Mancini G et al., 1965), confirmando que essas células B são essencialmente células secretórias de IgG (Figura 7B).

Esse efeito positivo inesperado de acoplamento de estimulação específica de células B e seleção de células B com base em isotipo, antes da imortalização com EBV, pode ser ainda aperfeiçoado por inclusão de outros meios de seleção de células B.

A eficiência dessa abordagem pode ser medida com base na eficiência de clonagem de células B negativas a IgM5 estimuladas com CpG2006 / IL-2, positivas a CD22. As células obtidas são expandidas in vitro, na presença de CpG2006 e IL-2, por 2 a 4 dias, depois enriquecidas para a subpopulação positiva a IgG por seleção negativa baseada em IgM. As células B negativas a IgM, positivas a CD22 são infectadas com EBV e clonadas por diluição limitante em lâminas de 96 reservatórios, 1 a 4 semanas após infecção. A eficiência de clonagem da cultura em massa pode ser avaliada por contagem do número de reservatórios contendo células em crescimento, a cada diluição testada da cultura em massa (por exemplo, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200), ou a cada concentração de células por reservatório (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, ou mais células por reservatórios).

Uma das considerações mais importantes, quando da execução de imortalização com EBV, é manter a viabilidade das células a serem usadas para clonagem subseqüente. Esse é particularmente o caso quando da tentativa de identificar células B específicas de antígenos, que podem estar presentes a uma freqüência muito baixa (< 1:1.000) no sangue periférico. E bem estabelecido que o EBV é um estimulador de células B policlonal mas que a exposição de células B a EBV resulta em um período inicial de morte celular na cultura (Sugimoto M et al., 2004).

Outros dados sustentando a invenção foram gerados por comparação dos resultados dos três métodos de imortalização celular mediada por EBV5 aplicada na mesma população de partida de células mononucleares de sangue periférico positivas a CD22 (PBMC), agrupadas de 5 doadores normais (Figura 8A).

No método BÁSICO, uma abordagem muito simples foi usada, na qual as células positivas a IgG, positivas a CD22 foram expostas apenas a sobrenadante contendo EBV por 12 horas, lavadas e cultivadas por 10 dias no meio de cultura celular adequado e nas células de alimentação. No método COMBINADO, as células positivas a IgG, positivas a CD22 foram expostas simultaneamente a EBV e a agentes ativadores policlonais (CpG2006 e IL-2) em cultura celular por 10 dias, de modo similar ao que é descrito na literatura de uso desses compostos simultaneamente (Traggiai E et al., 2004; Tsuchiyama L et al., 1997). Para o método SEQÜENCIAL, esse é um modo possível de aplicar os métodos da invenção, as células positivas a CD22 foram primeiro expostas à combinação de CpG2006 e IL-2 e lavadas. Depois, as células positivas a IgG foram purificadas e as células positivas a IgG, positivas a CD22 expostas por 12 horas a sobrenadante contendo EBV, lavadas e cultivadas por 10 dias, de novo nos meios de cultura celular e nas células de alimentação adequados.

Uma vez que o número absoluto de células positivas a IgG, positivas a CD22 foi normalizado para todas as condições no início de exposição a EBV, os dados resultantes da análise de culturas celulares e de sobrenadantes medidos ao final de 10 dias de cultura devem proporcionar uma comparação precisa dos três métodos. De fato, ambos os métodos BÁSICO e SEQÜENCIAL proporcionam um aumento no número total de células, resultando em aproximadamente 2 vezes (200%) do número de partida de células, mais significativo do que foi obtido usando o método COMBINADO, resultando em 1,5 vez (150%). Mais significativamente, quando o número de células viáveis for determinado, a população de células obtida usando o método SEQÜENCIAL mostrou um número acentuado de células viáveis, comparado com ambos do método BÁSICO e, ainda mais intensamente, do método COMBINADO (Figura 8B).

Depois, mais análise qualitativa das populações de células, que foram obtidas usando os três métodos, foi conduzida usando critérios diferentes. A análise por FACS mostra que, à parte de todas as populações de células serem aquelas que expressam IgG, a composição delas é diferente, como um todo, e, em particular, na área correspondente aos linfoblastos viáveis, que estão crescendo e dividindo-se (sendo negativos para manchamento com iodeto de propídio e com uma difusão para a frente maior; área R2 na Figura 9). A população de células que é obtida usando o método SEQÜENCIAL parece significativamente mais concentrada nessa área, quando comparada com aquela obtida usando o método BÁSICO e, ainda mais surpreendentemente, àquela obtida usando o método COMBINADO. As células com níveis mais altos de fluorescência, devido ao acúmulo de iodeto de propídio, estão mortas ou estão morrendo, e ambas as populações obtidas usando os métodos BÁSICO e COMBINADO acumularam muito mais células desse tipo, que não vão estar disponíveis para qualquer outro ensaio adicional de subclonagem ou triagem (Figura 9, painel esquerdo).

A população de linfoblastos viáveis presente nas amostras também foi analisada para a expressão de CD23, um marcador superficial celular que está presente a um baixo nível pela maior parte de células B de sangue periférico, mas cuja expressão é comumente acentuada por ativação (Azim T e Crawford D, 1988). E importante colocar em evidência esse índice, uma vez que uma correlação direta entre a expressão de CD23 e a secreção de IgG demonstrada em populações de células B imortalizadas com EBV (Wroblewski J et al., 2002). O nível de expressão de CD23 é mostrado em uma escala logarítmica no eixo horizontal e o número de células expressando uma determinada proporção de CD23 é mostrado no eixo vertical (Figura 9, painel direito). E evidente que ambos os métodos BÁSICO e SEQÜENCIAL induzem um alto nível de expressão de CD23 em uma proporção de células muito maior do que o observado na população de células obtida com o método COMBINADO, quando muito poucas células expressando altos níveis de CD23 são evidentes, e um acúmulo de células, que são negativas ou de baixa expressão de CD23, ocorre.

A análise qualitativa da população de células, de acordo com os três métodos descritos acima do mesmo grupo de células B primárias, proporciona informações importantes relativas aos aspectos positivos específicos dos métodos da invenção. De fato, confirmou-se que a separação de imortalização com EBV de estimulação policlonal, em vez de ter as células expostas aos dois tipos de agentes simultaneamente, proporciona uma população de células com viabilidade, expressão de cD23 e potencial de proliferação aperfeiçoados. Além do mais, a análise por FACS mostra que os métodos da invenção proporcionam uma população de células que, em alguns aspectos, lembra uma população de células obtida pelo método BÁSICO, mas tendo uma maior freqüência de células similares a blastos, viáveis (consultar a Figura 9, painel esquerdo). Esse aspecto parede ter efeitos importantes e surpreendentes adicionais em um elemento principal para comparar os diferentes métodos: a proporção de IgG, que as populações de células acumulam no sobrenadante de cultura celular, em um período relativamente curto de cultura celular (8 - 10 dias). E evidente que qualquer aperfeiçoamento nos níveis de secreção de IgG nos sobrenadantes dessas culturas afeta positivamente a triagem delas para anticorpos, uma vez que pode abreviar o período de tempo para isolamento de culturas celulares oligoclonais ou monoclonais expressando esses anticorpos.

A comparação do IgG total, que é acumulado em culturas celulares obtidas usando os três métodos na mesma população de células inicial, que tenha sido normalizada quantitativamente, antes da exposição a EBV, confirma ainda as vantagens do método SEQÜENCIAL, com base nos métodos da invenção. De fato, se os métodos BÁSICO e COMBINADO proporcionam uma concentração similar de IgG total (80 - 100 μg/mL), o sobrenadante de células resultante do processo SEQÜENCIAL proporciona células expressando IgG total, a um nível bem além da faixa linear do kit ELISA 150 μg/mL), para todos os fatores de diluição testados (Figura 10A).

Desse modo, não apenas uma população de células policlonal obtida de acordo com os métodos da invenção é produzida de células se proliferando ativamente e viáveis, mas também expressa os níveis de IgG total que são suficientes para conduzir muitos diferentes ensaios de triagem, sem qualquer interferência possível de compostos, tais como agentes estimulantes policlonais, acelerando, finalmente, o processo para determinação da presença de células expressando os anticorpos IgG de interesse.

Exemplo 3: Seleção, estimulação, imortalização e triagem de células B humanas expressando anticorpos de IgG ligando ou neutralizando alvos terapêuticos

Materiais & métodos

Geração de células B imortalizadas humanas expressando anticorpos de IgG

A visão geral do procedimento é proporcionada na Figura 11. As condições e os meios foram aqueles definidos nos Exemplos 1 e 2.

Ensaio de microneutralização com CMV

Fibroblastos de pulmão de embrião humano (HELF) são depositados (2,0 - 2,5 χ 104/reservatório) em reservatórios de fundo plano de uma lâmina de 96 reservatórios em 100 μΙ, de meio essencial mínimo (MEM) de Eagle, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FCS)5 1 mM de piruvato de sódio (NaP), 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (GPS) e cultivados por 24 horas a 37°C. Cinqüenta μL, de sobrenadante de cada cultura / clone de célula B são incubados com a cepa de laboratório CMV (AD169; 500 pfu em 50 μL, de MEM com 5% FCS; o volume total da mistura é de 100 μL,) em reservatórios de fundo redondo de uma lâmina de 96 reservatórios por 1 hora a 37°C. O meio das culturas HELF são descartados e substituídos pela mistura viral. As lâminas são depois centrifugadas a 2.000 g por 30 minutos e incubadas por 90 minutos a 37°C em CO2. O meio é depois descartado, 100 μL, de meio crescido são adicionados e as culturas são mantidas na incubadora por mais 72 horas.

O efeito de sobrenadantes de células B na atividade de infecção de CMV é medido por manchamento do Antígeno Precoce Intermediário (IEA) com CMV, por manchamento com imunoperoxidase de células HELF. As monocamadas de células são fixadas com uma solução de acetona a 50% e metanal a 50% (armazenada a -20°C) por 1 minuto à temperatura ambiente (RT), depois lavadas com PBS. As células são permeabilizadas em Triton X-100 a 0,1% em PBS com H2O2 a 1%, 5 minutos em gelo e depois lavadas com PBS. A peroxidase endógena é bloqueada com PBS com metanal a 50% e H2O2 a 0,6%, 30 minutos à RT no escuro, depois lavada com PBS. Cinqüenta μL, de Agente de Bloqueio de Proteínas (Ultra Tech HRP 500-600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; PN IM2391) foram adicionados por 10 minutos à RT, depois lavados com PBS. As concentrações ótimas de anticorpo primário (CMV IEA anti-humano; Argene Biosoft; n° de ref. 11- 003) são adicionadas aos reservatórios por 60 minutos à RT. Os reservatórios são lavados, depois 50 μΐ, de Anticorpo Secundário Biotinilado (Ultra Tech HRP 500-600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; n° de ref. PN IM2391) são adicionados aos reservatórios por 10 minutos à RT. Os reservatórios são depois intensamente lavados com PBS e substrato de DAB (MERCK; n° de ref. 1.02924.0001) em H2O2 a 0,1% adicionado por 30 - 45 minutos à RT no escuro. A reação é interrompida por diluição com PBS e os núcleos positivos a IEA são contados microscopicamente.

Os sobrenadantes de células B também foram testados usando células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVEC) e a cepa CMV clínica VRl 814.

Como um controle negativo, os sobrenadantes de células B, contendo anticorpos de IgG irrelevantes, foram usados. Como um controle positivo, uma preparação comercial de anticorpos de IgG humano, derivados do soro de pacientes e específicos para CMV (Cytotect; Biotest), foi usada (usando diluições progressivas, partindo de 125 μg/mL).

Ensaios baseados em ELISA para detecção de proteínas de ligação com CMV

Um primeiro ensaio foi conduzido usando um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) quantitativo comercial, para a detecção de anticorpos de IgG específicos ligando-se a um extrato de proteínas de CMV em soro ou plasma humano. O kit de ELISA comercial (kit BEIA CMV IgG Quan; Bouty) foi usado de acordo com as instruções do fabricante e validado com uma mistura comercial de anticorpos IgG específicos para CMV (Cytotect; Biotest), usado a 50 UImL.

Sucintamente, as tiras quebráveis cobertas com uma mistura de proteínas de CMV desativada (derivada da cepa de laboratório AD169) são revestidas em microlâminas e incubadas com sobrenadantes de células B diluídas 1:81 (10 μί, de sobrenadantes adicionados a 800 μΙ, de diluentes de amostras do sistema BEIA), e a lâmina incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Após um ciclo de lavagem, um conjungado de anticorpos de IgG anti-humanos monoclonais pré-diluidos com peroxidase da raiz forte (100 μΙ,) é adicionado e uma lâmina é incubada à temperatura ambiente por mais de 30 minutos. Após um segundo ciclo de lavagem, uma solução de substrato - TMB pré-diluída (100 μΐ) é adicionada e a lâmina é incubada à temperatura ambiente por mais 15 minutos. A reação é interrompida usando a Solução de Interrupção (100 μΐ/reservatório), e a densidade óptica é medida em bicromatismo a 450 / 620 nanômetros.

Ensaios adicionais foram conduzidos usando ELISA, estabelecidos em laboratório usando peptídios específicos ou proteínas CMV recombinantes imobilizadas em superfícies sólidas.

A região imunopredominante gB de antígeno CMV recombinante foi produzida como uma proteína de fusão recombinante, juntamente com Glutationa-S-Transferase (GST), e purificada por afinidade (purificação por afinidade de GST: Biodesign Int. cat. N0 Rl 8102), ou como um peptídio. A região imunopredominante gH de antígeno CMV recombinante (cepa VRl 814) era uma reservatório produzido em E. coli e purificado de lisado de células bacterianas com base na afinidade de GST. Três ensaios ELISA foram conduzidos por aplicação de um protocolo ELISA comum em um formato de 96 reservatórios com pequenas modificações. Sucintamente, o antígeno é diluído em PBS a 2 μg/mL em PB S, e 50 μΕ dessa solução de proteína são usados por uma incubação de um dia para o outro a 4°C. A solução de proteínas é eliminada e os reservatórios são lavados quatro vezes com 100 μΕ de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20). Um tratamento para bloqueio de ligação não específica foi conduzido depois por dispensação de 100 μί, de PBS contendo 1% de leite em cada reservatória e incubando a lâmina por 1 hora a 37°C. Após condução de quatro ciclos de lavagem com 150 μΕ de tampão de lavagem, uma alíquota de 50 μΕ de cultura celular foi dispensada em cada reservatório, usando como controle negativo 50 μΕ/reservatório do meio de cultura celular. Após uma incubação de 2 horas a 37°C, a lâmina foi lavada quatro vezes com 150 μί, de tampão de lavagem, antes da dispensação de 50 μL, de um anticorpo de IgG anti-humano marcado com peroxidase da raiz forte (anticorpo de IgG anti- humano caprino, específico de Fc; Sigma, cat. n° AO170), que foi diluído 1:30.000 em tampão de lavagem em cada reservatório. Após uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente, a lâmina foi lavada quatro vezes com 150 μg de tampão de lavagem, antes de dispensar 50 μίν^εη^ΐόπο de solução de substrato - TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; Sigma cat. np T0440). Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, a reação cromogênica foi interrompida com 100 pL/reservatório de solução de interrupção (ácido sulfurico 1 N) e a densidade óptica foi medida a 450 nm.

Ensaio de ligação de HSP60, com base em

ELISA

O ELISA para a detecção de anticorpos ligando HSP-60 foi estabelecido por uso de tiras de reservatórios de EIA/RIA, que são revestidas com 50 mL de proteína HSP60 humana recombinante (Stressgen), diluídos em NaHCO3 0,1 M pH 9,6 a 1 μg/mL, e mantidos de um dia para o outro à temperatura ambiente. As tiras são lavadas 3 vezes com PBS com 0,05% de Tween-20 a um pH de 7,4, e os sítios de ligação específica são bloqueados com PBS com 1% de BSA e 5% de sacarose, por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 4 lavagens, as tiras foram incubadas por 3 horas à temperatura ambiente com um painel de anticorpos primários: um HSP60 anti- humano (diluído em PBS com 1% de BSA a 1% a 5 ou 10 . g/mL; Santa Cruz Biologicals), um controle negativo de isotipo de IgG de camundongo (5 . g/mL em PBS com 1% de BSA), um anticorpo de IgG recombinante humano não relacionado (Herceptin, 5 μg/mL), apenas meio de cultura celular, e sobrenadantes de células B secretórias de IgG humano imortalizadas com EBV. Após 4 lavagens, as tiras foram incubadas com IgG anticamundongo conjugado com peroxidase da raiz forte (Dako), diluído com PBS com 1% de BSA por 1 hora à temperatura ambiente. Após 4 lavagens, a solução de substrato - TMB é adicionada às tiras e deixada desenvolver uma reação de formação de cor à temperatura ambiente. A lâmina é lida a 450 nm.

Resultados

Os métodos da invenção foram testados em células B humanas, obtidas de doadores cujos sangues provaram conter anticorpos se ligando e/ou neutralizando vírus humanos, em particular citomegalovírus humano (CMV), um herpevírus beta, provocando defeitos de nascença e altamente patogênico para paciente imunocomprometidos (Landolfo S et al., 2003).

O CMV é um bom exemplo de um alvo viral de interesse clínico, que pode ser neutralizado por anticorpos secretados naturalmente por células B humanas selecionadas, estimuladas e imortalizadas de acordo com os métodos da invenção, como resumido sucintamente na Figura 11. Além do mais, entre as diferentes estratégias diferentes para CMV, a administração de globulina imune a CMV intravenosa (comercializada com o nome de Cytotect ou CytoGam) representa uma solução apenas parcialmente satisfatória para bloquear infecção de CMV, em particular, em pacientes imunocomprometidos nos quais antivirais potentes são freqüentemente co-administrados (Bonaros NE et ai., 2004; Kocher AA et al., 2003; Kruger RM et al., 2003). Essas preparações são caracterizadas para usos clínicos, mas são simplesmente derivadas de plasma agrupado humano, com altos títulos de anticorpos anti-CMV. O tratamento de infecções de CMV vai se beneficiar por ter preparações mais potentes, compreendendo anticorpos monoclonais humanos purificados, obtidos pela expressão em células de mamíferos aprovadas para fins regulatórios.

As células B humanas expressando anticorpos neutralizantes de CMV podem ser obtidos de doadores selecionados com base em um ou mais ensaios de triagem imunológicos (tal como mancha imune, ELISA ou ELISPOT), ou em microdisposições de antígenos, que são disponíveis de fontes comerciais (Sorin Biomedica, Itália; BioMerieux, França). As células B humanas foram isoladas das amostras clínicas de doadores selecionados proporcionando altos títulos de anticorpos anti-CMV no sangue, como medido por ELISA, ELISPOT ou ensaio de neutralização. As células foram depois submetidas aos métodos da invenção (Figura 11). A população resultante de células B humanas, imortalizadas com EBV, negativas a IgM, positivas a CD22 foi triada usando, direta ou indiretamente, os sobrenadantes de culturas celulares derivadas por subclonagem da população original para detectar aquelas contendo anticorpos de neutralização de CMV e/ou de ligação com CMV. As células B originais produzindo esses anticorpos podem ser depois isoladas em etapas de subclonagem subseqüentes, no âmbito de clonagem e seqüenciamento do DNA codificando esses anticorpos.

Um primeiro tipo de ensaio de triagem primário foi aplicado em mais de 400 subculturas em lâminas de 96 reservatórios, cada reservatório contendo aproximadamente cem células B. Os sobrenadantes desses reservatórios foram triados em uma etapa de microneutralização de CMV, para a capacidade de bloquear a infecção de células humanas com uma cepa de laboratório (AD169) ou uma cepa clínica (VR1814) de CMV humano. Quatro das 453 culturas de células B tríadas mostraram uma atividade de neutralização significativa em repetidos experimentos, usando um isolado de CMV de laboratório, e um, em particular, mostrou uma neutralização de um isolado de CMV clínico em ensaios repetidos (Figura 12A).

Um segundo tipo de ensaio de triagem primário foi aplicado em uma população de células B, obtida de um doador soropositivo a CMV diferente, e de novo submetida aos métodos da invenção. Nesse caso, a reatividade específica a CMV foi detectada usando um ELISA comercialmente disponível, que é mais sensível. As subculturas positivas a CMV, tais como aquelas caracterizadas acima, podem ser usadas para iniciar o processo dè subclonagem no âmbito da identificação das culturas celulares e seqüências correspondentes aos anticorpos responsáveis pelas atividades de neutralização de ou ligação com CMV detectadas usando os ensaios de triagem primários.

Esses anticorpos, como as preparações purificadas de sobrenadantes de câmara de filtração ou expressos como proteínas recombinantes, podem ser ainda validados usando ensaios in vitro baseados em células ou órgãos conhecidos na literatura (Reinhardt B et al., 2003; Forthal DN et al., 2001; Goodrum FD et al., 2002). Além do mais, os testes pré-clínicos relevantes podem ser feitos em animais infectados por CMV, em particular, em modelos nos quais as células hospedeiras pode ser transplantadas em roedores imunocomprometidos (Gosselin J et al., 2005; Thomsen M et al., 2005). Os antígeno / epítopo de CMV reconhecido por esses anticorpos podem ser identificados por diferentes ensaios in vitro, baseados, por exemplo, em ELISA ou manchamento ocidental, usando proteínas truncadas ou peptídios sintéticos específicos de CMV3 ou em competição com outros anticorpos específicos de CMV, cujos antígeno / epítopo são conhecidos (Greijer A et al., 1999; Schoppel K et al., 1996; OhlinMet al., 1993).

Outros ensaios de triagem podem ser conduzidos usando sobrenadantes de culturas celulares testados para a neutralização ou a ligação de citomegalovírus humano. De fato, a disponibilidade de um grande repertório de células secretórias de IgG permite a identificação de vários IgG humanos tendo especificidade de ligação para distintos epítopos oü antígenos de CMV, que podem ser associados à infecção com CMV. Por exemplo, é conhecido que o sangue de pacientes com aterosclerose contém altos níveis de anticorpos reconhecendo um fragmento da proteína de choque térmico humana 60 (HSP60), que é similar às proteínas de CMV. Em particular, uma dessas proteínas, chamada US28, é expressa na superfície das células endoteliais, e os anticorpos que se ligam a essa proteína podem induzir a apoptose das células endoteliais, sugerindo a idéia que a infecção com CMV pode disparar uma resposta auto-imune implicada em patogênese de aterosclerose (Bason C et al., 2003).

Portanto, 65 grupos de sobrenadantes de culturas celulares (cada um deles contendo sobrenadante de 5 reservatórios das células imortalizadas com EBV, produzidas partindo-se de células B primárias obtidas de um indivíduo soropositivo a CMV), foram triados para imunorreatividade com HSP60, usando um ELISA fazendo uso de HSP60 recombinante humana. Seis grupos mostraram uma reatividade estatisticamente diferente 3 vezes acima da de fundo no ELISA em repetidos experimentos (Figura 12B). Essas culturas de células secretórias de anticorpos podem ser subclonadas em grupos de células, repetindo o processo de triagem e subclonagem, até que as culturas celulares secretando anticorpos de IgG monoclonais humanos, que se ligam àHSP60 humana, sejam isoladas.

Um segundo tipo de ensaio de triagem primário foi aplicado a uma população de células B, de um doador soropositivo de CMV específico, e de novo submetido aos métodos da invenção. Nesse caso, a reatividade específica a CMV foi detectada em paralelo, usando um painel de diferentes testes no âmbito de seleção, de uma única população de células B primárias, populações de células imortalizadas oligoclonais ou monoclonais, cada uma delas expressando os anticorpos contra os distintos epítopos específicos de CMV, e, desse modo, proporcionando uma representação global da reação imune à infecção com CMV em um indivíduo (Figura 13).

A população de células imortalizadas com EBV policlonal foi dividida em aproximadamente 4.000 grupos, para estabelecer as culturas celulares, cada uma delas contendo estatisticamente 20 células, em lâminas de 96 reservatórios, em que cada reservatório contém uma população de células oligoclonal. No entanto, em vista da baixa freqüência de células produzindo anticorpos específicos para um antígeno definido, quaisquer dessas culturas celulares para as quais uma IgG específica de CMV é detectada no sobrenadante é provável de ser uma cultura celular monoclonal expressando um anticorpo monoclonal humano.

Os testes iniciais avaliaram as propriedades de ligação com CMV dos anticorpos produzidos pela cultura celular oligoclonal / monoclonal, que são específicos para uma mistura de proteínas de CMV ou antígenos específicos conhecidos como sendo reconhecidos por anticorpos neutralizadores de CMV. Depois, aqueles sendo positivos a pelo menos um desses ensaios foram ainda avaliados em um ensaio de microneutralização de CMV.

Dois antígenos de CMV específicos foram selecionados para a triagem inicial das populações de células oligoclonais / monoclonais: as glicoproteínas de envelope gB e gH. Essas proteínas, que desempenham papéis cruciais em ambas a fixação e a fusão, são os alvos para os anticorpos neutralizadores de CMV humanos, para os quais informações mais detalhadas são disponíveis. Os soros de indivíduos soropositivos, bem como os anticorpos monoclonais dirigidos contra essas glicoproteínas, inibem a infecção de HCMV de culturas celulares in vitro. O papel efetivo dos anticorpos dirigidos contra gB e gH para a contribuição para a capacidade neutralizadora de vírus de soros humanos foi mostrado claramente pela correlação entre os títulos anti-gB e anti-gH, e a atividade neutralizadora global de soros humanos convalescentes, bem como pela queda significativa da capacidade neutralizadora dos soros, após adsorção de anticorpos específicos de gB e gH (revista em " Cytomegaloviruses. Molecular Biology and Immunology. Reddehase, M. (ed.) Norfolk: Caister Academic Press (2006), e em particular Boehme K e Compton Tp. 111-130, Mach M pp.265-283).

Como resumido na Figura 13, usando as culturas celulares oligoclonais, nas quais as células se proliferaram ativamente (aproximadamente 35% dos reservatórios totais nos quais as células foram cultivadas), foi possível identificar os reservatórios que continham IgG reativa com proteína de CMV5 pelo menos em um dos ensaios específicos para as proteínas de CMV (gB- ou gH-ELISA) ou para um extrato de proteínas de CMV (BEIA CMV ELISA). Em particular, alguns reservatórios continham IgG humana, que neutraliza a infecção de CMV in vitro.

Entre as oito culturas celulares oligoclonais que foram positivas apenas no BEIA CMV ELISA, o reservatório denominado 9G8 continha uma IgG humana, que era altamente positiva para reatividade com CMV (Figura 14). Uma amostra contendo dez mil células do reservatório 9G8 foi usada para gerar cDNA, e as seqüências para as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de IgG humano foram amplificadas especificamente por PCR. Os produtos das reações de amplificação foram clonados e seqüenciados e confirmaram que 9G8 é uma cultura celular monoclonal secretando um novo IgG humano se ligando a CMV, tendo regiões variáveis específicas (Figura 15). O DNA codificando a região variável do anticorpo também foi usado para determinar as seqüências de CDR específicas, que, sozinhas ou na combinação proporcionada por 9G8, podem ser usadas para gerar anticorpos se ligando a CMV.

Desse modo, um processo compreendendo os métodos da invenção, para imortalização de células secretórias de anticorpos, o que pode permitir a identificação de novas seqüências de VH e VL de culturas celulares oligoclonais, geradas diretamente da população de células policlonal que foi imortalizada. Anticorpos, tal como 9G8, ou qualquer proteína contendo um ou mais CDRs desse anticorpo (por exemplo, HCDR3 apenas; HCDR1, HCDR2, e HCDR3; LCDR1, LCDR2, e LCDR3) pode ser útil em aplicações experimentais e clínicas relativas a CMV, em particular, para detecção de CMV em amostras biológicas.

Os métodos da invenção também foram usados para imortalizar células B primárias, obtidas de indivíduos soropositivos a HIV-1, HSV-I e/ou HSV-2. Por exemplo, seis indivíduos soropositivos a HSV-I/HIV-I foram selecionados, porque os seus plasmas apresentam altos títulos de anticorpos de IgG se ligando a proteínas de HSV-1, usando um kit ELISA comercial (Bouty BEIA HSV-I; cat ° 20921). As PBMCs desses indivíduos foram agrupadas e imortalizadas, por uso do mesmo método descritò acima para as PBMCs obtidas do CMV5 do doador.

As 70 bilhões de PBMCs iniciais levaram a uma população de 1,9 milhão de células negativas a IgM, positivas a CD22, que ainda secretaram uma proporção de anticorpos de IgG específicos de HSV-1, suficiente para ser detectada no sobrenadante da cultura celular, não apenas usando o kit ELISA, mas também usando um ensaio in vitro para detecção de anticorpos neutralizando infecção de HSV-1, que é baseada em vírus mutante nulo, no qual a seqüência de codificação gC foi substituída pelo gene IacZ (Laquerre S et al., 1998).

Essa população de células policlonal foi, em parte, usada em ensaios de triagem para a identificação de células secretórias dos anticorpos tendo atividade de neutralização de HSV-1, por cultivo de centenas de culturas celulares oligoclonais, cada uma delas contendo estatisticamente 50 - 100 células, imediatamente após a preparação da cultura celular. Além disso, alíquotas de cultura celular, obtidas após a imortalização, foram congeladas em pequenos frascos, como feito comumente com as linhas celulares de mamíferos estabelecidas. Alguns desses pequenos frascos foram descongelados após alguns meses, as células foram cultivadas por uns poucos dias como a cultura celular policlonal, e depois usadas para preparação de milhares de culturas celulares oligoclonais, cada uma delas contendo estatisticamente 5 células.

O ensaio de neutralização de HSV-I foi conduzido em ambos os tipos de culturas celulares oligoclonais, (isto é, obtidas por cultura imediata de 50 - 100 células por reservatório, ou obtidas por cultura de 5 células por reservatório, após descongelamento dos pequenos frascos contendo alíquotas da população de células policlonal original), e ambos os processos levaram à identificação de culturas celulares oligoclonais expressando anticorpos de IgG humanos, que neutralizam HSV-I in vitro.

Em particular, as células que secretam anticorpos neutralizadores de HSV-1, obtidos do processo descrito imediatamente acima, foram identificadas em mais de 20 dessas culturas celulares oligoclonais. Ainda que os anticorpos possam provar ser idênticos em várias dessas culturas celulares, o grande número de reservatórios positivos e a possibilidade de identificar diretamente as seqüências desses anticorpos por tecnologia RT-PCR proporcionam um meio para testar as muitas culturas celulares oligoclonais alternativas (possivelmente, crescendo a diferentes velocidades) para seleção posterior. De fato, não apenas a seqüência dos anticorpos pode ser identificada e caracterizada, mas os anticorpos monoclonais de interesse podem ser purificados diretamente, para testar a atividade, sem a necessidade de clonar e expressar os mesmos como proteínas recombinantes, acelerando a identificação de anticorpos monoclonais humanos de maior interesse.

Conclusões

Os resultados apresentados nos exemplos mostram as vantagens múltiplas dos métodos da invenção dos aperfeiçoamentos significativos em relação à técnica anterior.

A seqüência adequada das etapas de seleção, estimulação e imortalização proporciona populações de células policlonais úteis, que, sendo isoladas com base no isotipo, mas independentemente das propriedades de ligação dos antígenos específicas dos anticorpos secretados por elas, pode ser usada para a detecção de anticorpos tendo diferentes propriedades das células obtidas de um único doador, ou de grupos de doadores.

De fato, os métodos da invenção proporcionam populações de células policlonais, oligoclonais ou monoclonais, que podem ser triadas e selecionadas por uso de diferentes critérios, que são aplicados em paralelo ou em série. Como mostrado no Exemplo 2, a diversidade do repertório de anticorpos em uma pessoa é capturada pelos métodos da invenção, de uma maneira que um grande número de células viáveis e em proliferação, que secretam anticorpos em altos níveis, adequadas para uma longa análise de triagem, é proporcionado. Além do mais, a composição mais uniforme da população de células resultante proporciona acesso, sem a necessidade para seleção ou classificação adicional das células, a um painel extremamente amplo (se não completo) de diversidade de anticorpos, que é proporcionado por um doador de uma maneira imparcial. Como mostrado na triagem consecutiva para anti-CMV e anti-HSP60, se um ensaio específico é conduzido em soro, para propiciar a seleção do doador paras as células a serem imortalizadas, a população de células resultante pode ser posteriormente usada para dissecar a resposta imune na busca por anticorpos tendo um grande espectro de propriedades.

Além do mais, é possível gerar e usar, diretamente, as culturas celulares cultivadas a uma densidade celular muito baixa, para a identificação de anticorpos monoclonais. As culturas celulares resultantes também podem ser mantidas e tríadas em paralelo, ou por aplicação de diferentes condições de culturas celulares (por exemplo, células de alimentação, meio, fatores de crescimento), ou para testar um painel de antígenos e atividades biológicas (como mostrado para as células obtidas do doador CMV5), mas sempre partindo de uma única população de células.

Finalmente, essa abordagem é adequada para gerar populações policlonais de células secretórias de anticorpos imortalizados, que podem ser usadas para ambas a condução e seleção entre centenas ou milhares de culturas celulares oligoclonais e uma maneira automática, e para gerar uma série de pequenos frascos a serem congelados, cada um deles contendo uma alíquota da população de células obtida pelos métodos da invenção.

Em particular, essas células podem ser consideradas como uma biblioteca de células secretórias de anticorpos, que podem ser descongeladas e testadas como desejado, como mostrado no exemplo fazendo uso de células obtidas de um doador soropositivo a HSV-1, no âmbito da análise mais demorada, ou reanálise, da população de células imortalizadas para a especificidade de anticorpo desejada. Desse modo, a identificação e a produção de anticorpos monoclonais tendo as propriedades desejadas podem ser obtidas, mesmo para alvos que não eram considerados (ou nem mesmo conhecidos), quando o doador foi selecionado ou quando as populações de células foram imortalizadas e armazenadas em alíquotas congeladas. REFERÊNCIAS

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Claims (16)

1. Método para imortalização de uma população de células, que secreta anticorpos de um ou mais isotipos específicos, caracterizado pelo feto de que compreende as seguintes etapas: a) seleção da população de células que expressa anticorpos de uma ou mais amostras biológicas, de uma maneira independente de antígenos e com base na expressão de pelo menos um marcador superficial celular; b) estimulação da dita população de células selecionadas com pelo menos um agente estimulante em condições de cultura celular; c) eliminação do dito agente estimulante da cultura celular; d) seleção da população de células estimulada que expressa anticorpos de um ou mais isotipos específicos da dita cultura celular; e) exposição da dita população de células estimulada ao agente de imortalização em condições de cultura celular; e f) eliminação do dito agente de imortalização da dita cultura celular, em que o agente de imortalização é um agente de imortalização viral.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células da etapa (a) é células B humanas, e o marcador superficial celular é CD22, CD19 ou CD27.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou -2, caracterizado pelo fato de que o dito agente redutor de água é selecionado de: a) uma combinação de um oligonucleotídeo à base de CpG e uma citocina; e b) uma combinação de um agonista de um receptor de membrana celular da família de receptores TNF e uma citocina, e o agente de imortalização é um vírus Epstein- Barr.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população de células da etapa d) expressa anticorpos de IgG.

5. População de células, caracterizada pelo fato de que é obtida por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

6. População de células oligoclonal ou monoclonal, caracterizada pelo fato de que é obtida por divisão de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 em culturas celulares contendo estatisticamente 20 ou menos dessas células.

7. Cultura celular, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou 6.

8. Sobrenadante, caracterizado pelo fato de que é de uma cultura celular de acordo com a reivindicação 7.

9. Biblioteca de DNAs, caracterizada pelo fato de que compreende seqüências de DNAs, que codificam anticorpos de um ou mais isotipos específicos, em que a dita biblioteca de DNAs é preparada usando ácidos nucléicos isolados de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou 6.

10. Uso de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou 6, de uma cultura celular de acordo com a reivindicação 7, de um sobrenadante de acordo com a reivindicação 8, ou de uma biblioteca de DNAs de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é para identificar e produzir um anticorpo monoclonal, tendo a especificidade de ligação de antígenos e/ou atividade biológica.

11. Uso de culturas celulares de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou 6, de uma cultura celular de acordo com a reivindicação 7, de um sobrenadante de acordo com a reivindicação 8, ou de uma biblioteca de DNAs de acordo com a reivindicação 9, que são obtidas de células secretórias de anticorpos proporcionadas por um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é para determinar as características da resposta imune, específica de isotipo para um antígeno autólogo ou heterólogo, um vírus, uma célula bacteriana, uma toxina, uma célula parasita ou uma vacina no dito indivíduo.

12. kit para identificar e produzir um anticorpo monoclonal tendo as especificidade de ligação de antígenos e/ou atividade biológica desejadas, caracterizado pelo fato de que compreende uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou 6, uma cultura celular de acordo com a reivindicação 7, um sobrenadante de acordo com a reivindicação -8, ou uma biblioteca de DNAs de acordo com a reivindicação 9.

13. Método para produzir uma cultura celular, que secreta um anticorpo monoclonal tendo especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica desejadas, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) divisão de uma população de células de acordo com a reivindicação 5 ou de uma cultura celular de acordo com a reivindicação 6 em culturas celulares, cada uma delas contendo 50 ou mais células; b) triagem do sobrenadante das ditas culturas celulares para detectar aquelas apresentando as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica; c) divisão das culturas celulares apresentado as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica nas culturas celulares ou populações de células; e d) repetição das etapas (b) e (c) nas ditas culturas celulares, até que uma ou mais culturas celulares, cada uma delas secretando um anticorpo monoclonal tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica no sobrenadante da cultura celular, sejam isoladas.

14. Método para produzir uma cultura celular, que secreta um anticorpo monoclonal tendo especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica desejadas, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) triagem do sobrenadante de culturas celulares obtido por múltiplas populações de acordo com a reivindicação 6, para detectar uma ou mais que secretam anticorpos tendo as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica; b) determinação da seqüência do anticorpo secretado por cada uma das culturas celulares, que apresenta a dita atividade no sobrenadante; e c) isolamento das culturas celulares que secretam um anticorpo monoclonal no sobrenadante da cultura celular tendo tal atividade.

15. Método para produzir um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que compreende: a) expansão de uma cultura celular produzida por um método de acordo com a reivindicação 13 ou 14; e b) purificação do anticorpo monoclonal dos sobrenadantes da dita cultura celular.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, caracterizado pelo fato de que as desejadas especificidade de ligação com antígenos e/ou atividade biológica são dirigidas a um antígeno de ser humano, de mamífero, viral, bacteriano, vegetal, orgânico ou inorgânico.