JPS63502722A - Ｈｃｍｖの糖タンパク質類、それらに対する抗体類及びｈｃｍｖワクチンの産生法、並びにそれらのための組換えベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＣＭＶの　タンパク　、それらに・する−　びＨＣＭＶワクチンの　生性、並 びにそれらのための　えベクター 光皿■分互 本発明は、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ　）に関し、そしてそのウィル スの糖タンパク質の産生、それらのワクチンの可能性及びＨＣＭＶ特異性抗体の 産生に関する。

光貝生１景 ＨＣＭＶは、かなり重要なヒト病原菌であり、そしてそれに対する有効なワクチ ンが必要である。従来の実験的なワクチンは、弱められた非病原性形ウィルスに 基づがれて来たが、しかし、所望としない副作用が存在する。本発明は、組換え ＤＮＡ技法を用いての、ＨＣＭＶに対するワクチンの製造への他のアプローチを 提供する。

他のヘルペスウィルスのように、ＨＣＭＶは、多重糖タンパク質を特定する（１ 　、２）。これらの特徴化は、ポリクローナル血清及びモノクローナル抗体を用 いての、ＣＭＶにより感染された細胞及び精製されたピリオンの研究を含む（２ 〜１０）、１つの糖タンパク質が、一部精製され、そしてギアら、ＨＣＭＶによ り特定化された糖タンパク質の合計数は、不明確であり、そして個々の糖タンパ ク質のワクチン可能性は知られていない。ＨＣＭＶにより感染された細胞からの 個々の糖タンパク質の精製は、脅威的期待を有する。なぜならば、そのウィルス はゆっくりと増殖し、そして感染の間、宿主タンパク質の合成を止めないからで ある。

主所夏！立 本発明は、本明細書でｇＢ及びｇＨとして言及されている２種の糖タンパク質を コードするＨＣＭＶのＤＮＡの同定及び発現に基づかれる。ｇＢタンパク質は、 Ｌ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムの旧 ｎｄＩＩＩＦフラグメント中のＤＮＡによってコードされている。ｇＨタンパク 質は、Ｌ／Ｄ境界からの２２８〜２４５６塩基の間に存在する、旧ｎｄｌｌ［Ｌ フラグメント中のＤＮＡによってコードされる。

本発明の１つの観点によれば、ヒトにＨＣＭＶ中相性抗体を高めることができる １又はそれよりも多（の抗原決定基を組込むポリペプチドを、組換えＤＮＡベク ターからの適切な宿主生物中に発現することを含んで成る方法が提供され、ここ で前記決定基（又は決定基類）は、Ｆ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩基の 間に存在する、ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄｌＩ［Ｆフラグメント中のＤＮＡによっ てコードされたタンパク質の部分に対応し、そして／又はＬ／Ｄ境界からの２２ ８〜２４５６塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄｌＩＩＬフラグメン ト中のＤＮＡによってコードされたタンパク質の部分に対応する。

本発明の第２の観点は、そのようなポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換 えウィルスベクターを提供することであり、前記ベクターは、ヒトを感染するこ とができ、そして免疫原形にそのポリペプチドを発現する。

本発明の第３の観点は、そのようなポリペプチドを合成することを含んで成る方 法を提供する。

本発明の第４の観点は、そのようなポリペプチド又は上記のような組換えウィル スベクターにより宿主動物を免疫化し、そして前記ポリペプチドに対して特異的 な抗血清をその宿主動物から抽出することを含んで成るＨＣＭＶ単一特異性抗血 清の調製方法を提供する。ＨＣＭＶ−特異性モツクローナル抗体は、そのような 免疫化された動物からの細胞から調製され得る。

本発明の第５の観点は、抗体とＨＣＭＶポリペプチドとを接触し、そしてそのポ リペプチドから結合した抗体を分離することを含んで成る、ＨＣＭＶ−特異性抗 体を精製する方法を提供する。

本発明の第６の観点は、サンプルとＨＣＭＶポリペプチドとを接触せしめ、そし てそのポリペプチドに結合する抗体を検出することを含んで成る、臨床サンプル 中のＨＣＭＶ特異性抗体を検出するための方法を提供する。

本発明の第７の観点は、そのような検出方法を行なうためのキットを提供するこ とであり、そして該キットは、臨床サンプルとの接触のために適切な形の前記ポ リペプチド及び前記ポリペプチドに結合するＨＣＭＶ特異性抗体を検出するため の手段を含んで成る。

免疫応答を導びく、ＨＣＭＶの表面糖タンパク質を同定し、そして哺乳類ベクタ ー中にその対応する配列の遺伝物質を導入することによって、ＨＣＭＶに対する ワクチンの基礎を形成することができる、免疫学的に活性的なタンパク質を産生 ずることがズきる。

組換えウィルスワクチンに関しては、その同定されたＨＣＭＶゲノムフラグメン トが単離され、そして従来の遺伝子工学技法により適切な哺乳類ウィルスベクタ ー中に導入され、そして削孔類宿主中にそのプラスミドをトランスフェクトする ことができる。

適切なベクターは、哺乳類細胞及びウィルス、たとえばポックスウィルス（特に 好ましくはワクシニアウィルス）及びウシ乳頭腫ウィルスを含む。

外来性ＤＮＡの発現は、組換えウィルスベクターにより細胞又は動物を感染する ことによって得られる。たとえば、組換えウィルス、たとえばワクシニアウィル スは、生ワクチンとして使用され得る。さらに、組換えベクターにより感染され た細胞を用いて、ワクチンとして使用するために外来性ＤＮＡの生成物を調製す ることができる。

１つの好ましい技法において、■ＣＭＶゲノムの糖タンパク質−コードフラグメ ントが、プラスミドｐＧＳ６２中に導入され、そして次に、ワクシニアウィルス により感染された哺乳類細胞中にそのプラスミドをトランフェクトすることによ って、ワクシニアウィルス中にトランスファーされる。

ＨＣＭＶのＤＮＡが、それによって産生されるタンパク質の機能に有意に影響を 及ぼさないで、種々の方法により変性され得ることは明らかであろう。たとえば 、タンパク質のトランスメンプランは、膜アンカー配列を含むＣ−末端のための ＤＮＡコードを除去することによって分泌形に転換され得る。

そのような変性は、本発明の請求の範囲内に存在する。

型皿ｑ皿生笠脱肌 第１図は、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉのための適切な切断を示す原型方向における ＨＣＭＶゲノム株ＡＤ１６９の地図であり、ＨＣＭＶ　ｇＢ及びＦＩＣＭＶ　ｇ Ｈをコードする遺伝子の位置及び方向も示している。

第２図は、第１図に同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子（ＣＭＶとして命名されて いる）の推定上の翻訳生成物と単純ヘルペスウィルスのタイプ１の糖タンパク質 Ｂ　（Ｈ３Ｖとして命名されている）及び可能性あるエプスタイン−バーウィル スの糖タンパク質（ＥＢＶとして命名されている）の推定上の翻訳生成物との比 較である。可能性あるグリコジル化部位は下線を引かれ、そして推定上の疎水性 シグナル領域及びアンカー領域は実線で囲まれている。

第３回は、）ＩｃＭＶ　ｇＢの推定上のアミン酸配列を示す、ＨＣＭＶｇＢをコ ードする遺伝子を含む、ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄＩ［ｒＦフラグメントのＸｍａ 　ｍ制限酵素フラグメントのＤＮＡ配列である。

明確には、これは、ＨＣＭＶゲノムの原型方向に存在する方向に対して反対の方 向に示される。

第４図は、プラスミドｐＧｓ６２中への第３図の配列の導入を例示するものであ り、これからそれは、ワクシニアウィルス中にトランスファーされ得る。濃い線 は、ＨＣＭＶのＤＮＡを示し；そして薄い線はプラスミドＤＮＡを示す。開放の ボックスは、ワタシニア旧ｎｄｌＩ［Ｊフラグメントから取られたワタシニアＤ ＮＡを示し、そしてＴＫ遺伝子のコード配列を含み、この中にワタシニアプロモ ーターＰがトランスロケーションされている。

第５図は、ＨＣＭＶｇＨのためのコード配列を拡張するＳｍａ　！−）ｌｉｎｄ ＩＩＩＬフラグメントのＤＮＡ配列を示す。第３に関するように、これは、ＨＣ ＭＶゲノムの原型方向に存在する方向に対して反対の方向に示されている。ＨＣ ＭＶ　ｇＨの推定上のアミノ酸配列が、−文字のアミノ酸コードでＤＮＡ配列の 上に示されている。クローニングに使用されるＳｍａ　Ｉ　（ＣＣＣＧＧＧ）及 びＨｉｎｄＩＩＩ　（ＡＡＧＣＴＴ）のための制限酵素認識配列が下線を引かれ 、そしてその可能性あるグリコジル化部位も下線を引かれている。旧ｎｄＩＩ［ 部位は、ゲノム中の旧ｎｄＩ［［フラグメントＬ及びＤの間の境界を示す。推定 上の疎水性シグナル領域及びアンカー領域は、実線で囲まれている。

本発明は、さらに次の例によって例示されるであろう。

■ 上の　タンパク　゛　云　の５ １（Ｃ１’ｌＶゲノム内に可能な糖タンパク質遺伝子を同定するために、ＨＣＭ Ｖ株、ＡＤ１６９のゲノムの個々のクローン化された制限フラグメントが、参考 文献（１１）に記載のＭ１３／ジデオキシヌクレオチド鎖終結法又は参考文献（ １２）のＢａｎｋｉｅｒ及びＢａｒｒｅｌ　１によって記載された策略及び方法 を用いて、配列決定された。次にその得られた配列を、可能性あるタンパク質コ ード配列及びＲＮＡポリマラーゼ■転写シグナルについて分析した。次に可能性 あるタンパク質コード配列の推定される翻訳生成物を、糖タンパク質の特徴、す なわちＮ−末端の疎水性シグナルペプチド、Ｃ−末端に近い疎水性トランスメン プラン配列及び外部ドメインにおける可能性あるＮ−グリコジル化部位の存在に ついて試験した。

これらの基準を用いて、ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄＩＩ［Ｆフラグメントの１６２ ５５〜１８９７２塩基間に及びＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄＩ［［Ｌフラグメントの ２２８〜２４５６塩基間にそれぞれ存在する２種の推定上の糖タンパク質遺伝子 を同定した。ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄｌＩ［フラグメント地図は、第１図に示さ れている。第１図において、垂直な点線は、それぞれ長い及び短いユニーク領域 を示す。

大文字は、旧ｎｄＩ［ｒによる切断によって産生されたフラグメントを言及する 一参考文献（１３）を参照のこと。糖タンパク質遺伝子Ｂ及びＨの位置及び配向 は、それぞれ旧ｎｄＩ［［制限フラグメン）Ｆ及びＬに示されている。糖タンパ ク質Ｂのコード領域は、ＤＮＡ配列の相補的鏡上の旧ｎｄＩ［［Ｆ／Ｄ境界から の塩基１３７８〜４０９５間に存在し；そして糖タンパク質Ｈのコード領域は、 ＤＮＡ配列の相補的鏡上の旧ｎｄＩ［［Ｌ／Ｄ境界からの塩基２２８〜２４５６ 間に存在する。

ＨＣＭＶの　タンパク　Ｂ 指摘された読み取り枠における糖タンパク質Ｂ遺伝子の第一次翻訳生成物は、１ ６個の可能性あるＮ−結合性グリコシル化部位を含む、９０６個のアミノ酸ポリ ペプチドである。シグナル配列として機能する、Ｎ−末端に近い疎水性配列及び アンカー配列として機能する、そのＣ−末端での疎水性アミノ酸の延長が存在す る。この遺伝子の推定される翻訳生成物を、他のヒトヘルペスウィルスの糖タン パク質遺伝子と比較した。この調査は、単純ヘルペスウィルス（ＩＳＶ）及びエ プスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）の糖タンパク’Ｉｔ　Ｂ　（ｇＢ）と相同 であることを表わしく参考文献１４）；水痘・帯状ヘルペスウィルス（ＶＺＶ） はまた、相同な糖タンパク質遺伝子を有する。この理由のために、この読み枠に よってコードされたタンパク質は、ＨＣＭＶのｇＢとして実質的に言及される。

その推定される翻訳生成物ＨＣＭＶ　ｇＢとＩＳＶ　１及びＥＢＶのそれらとの 比較は、第２図に示されている。推定されるＨＣＭＶ［タンパク質配列は、ＥＢ Ｖ及びＩＳＶ　１に見られるそれらのものと整合されている。それらの配列は、 １文字のアミノ酸コードで示され、そして相同アミノ酸の最適な整合をできるだ け生成するために、整合され、そして点線により対合された。

はとんど相同しない領域、たとえば末端では、その整合は任意である。糖タンパ ク質の特徴を有する、Ｎ−末端で及びＣ−末端の近くでの疎水性アミノ酸の領域 は実線で囲まれ、そして可能性あるＮ−結合性グリコシル化配列（Ｎ’″Ｔ又は Ｎ”Ｓ　；　＊はいづれかのアミノ酸である）が下線を引かれている。

第２図は）ＩＳＶ−１、ＥＢＶ及びＨＣＭＶのｇＢタンパク質の良好な整合を示 し、そしてそれらのタンパク質は、最少の保存性を示すＮ−及びＣ−末端を伴っ て、それらの長さの大部分で相同じあることを示す。すべての３種のタンパク質 において、１２１位で、等しくマツチされたアミノ酸が存在することが見うけら れる。ＥＢＶのｇＢの部分として取る場合、これは、そのタンパク質の１４％以 上が好ましくは保存されることを意味する。さらに、推定上のシグナル配列とア ンカー配列との間に存在するすべての１０個のシスティン残基は、好ましくは整 合され、そしてそれらのタンパク質の細胞外部分が類似する全部の構造体を有す ることができることを示唆する。

これらの３種のウィルスタンパク質の間の相同性の程度は、推定上のＨＣＭＶ１ ％ｉタンパク質が糖タンパク質Ｂの相同体であるという確信のある証拠を提供す る。その糖タンパク質の特性のもう１つの証拠は、第２図に示されているその特 徴的な疎水性領域及び可能性あるＮ−グリコジル化部位によって提供される。

）ＩＣＭＶのｇＢの性質を調べるために、そしてこのタンパク質に対する抗血清 を高めるために、ＨＣＭＶゲノムの旧ｎｄｍＦフラグメントから遺伝子を切り出 し、そして組換えワクシニアウィルス中に発現せしめた。このベクター系は、真 核性ウィルス糖タンパク質遺伝子の発現のために適切である。なぜならばそのタ ンパク質は、正しくプロセスされ、そしてその感染された細胞膜中に挿入される からである。さらに、感染性組換えウィルスは、ワクチン接種された動物中にお いて外来性タンパク質に対する単一特異性抗血清を高めるために使用され得る。

第３図に示されたコード配列は、下記のようにしてワクシニアウィルス中に導入 された。第２及び３図に示された配列は、コードセンス配列において通常使用さ れる５′から３′形で示される。これは、第１図に示されるＨＣＭＶゲノムの原 型の方向に対して反対の方向である。ＨＣＭＶのｇＢのアミノ酸配列が、−文字 のアミノ酸コードを用いて、ＤＮＡ配列の上に示されている。

ＨＣＭＶの　Ｂを　る　えワクシニアウィルスの昔１、莱−整 ワクシニアウィルス中における外来性遺伝子の発現は、ワクシニアのプロモータ ーの使用に依存する（参考文献１５を参照のこと）。これは、ワクシニアのプロ モーターのユニークな性質及びＲＮＡポリマラーゼ■によって転写されるプロモ ーターを認識しないワクシニアＤＮＡポリマラーゼの存在のためである。ワクシ ニアウィルス中における外来性遺伝子の発現を促進するように計画されているい くつかのプラスミドが、構成されている（参考文献１６〜１８を参照のこと）。

それらは、ワクシニアプロモーター及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子内でト ランスローケートされた下流の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次に、外来 性タンパク質のコード配列は、ワクシニアプロモーターの下流に位置を定められ 、そして４７ｅＭで相同組換え法によりワクシニアゲノム中に挿入され得る（参 考文献１７を参照のこと）。ワクシニアプロモーターのコード配列と外来性タン パク質のコード配列との間の連結部が、その外来性遺伝子の翻訳開始コドンを使 用するために製造されるならば、確実な外来性タンパク質が、製造される。

１（ＣＭＶのｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列及び隣接するＤＮＡの検査は、制限 エンドヌクレアーゼＸｍａ　ｍ部位の存在を示し、そのｇＢコード配列の上流に １４８個のヌクレオチド及びその下流に２５１個のヌクレオチドを有した。さら に、上流のＸｍａ　ｍ部位とｇＢ読み取り枠を開始するＡＴＧコドンとの間に可 能性ある翻訳開始コドンは存在しなかった。従って、この策略は、３．ＩＫｂの フラグメントとしてＨＣＭν旧ｎｄＩ［ＩＦフラグメントからｇＢ遺伝子を切り 出し、そしてこのフラグメントをプラスミド挿入ベクターｐＧＳ６２　（ｐＧｓ ２０の誘導体−参考文献１７を参照のこと−ここでワクシニアプロモーターの上 流のＥｃｏＲ１部位が欠失されている）の３ｍａ　ｒ部位にクローン化すること であった。この方法において、ｇＢ遺伝子は、ワクシニアウィルスの複製サイク ルを通して発現されるワクシニアプロモーターの制御下にあるであろう。所望の フラグメントの直接的な単離は、ＨＣＭＶ　）Ｉｉｎｄｌ　Ｆフラグメントの大 きなサイズ及び他のＸｍａ　ｍ部位の存在のために困難であった。

２、災−狂 さらに詳しくは、第３図のコード配列が、第４図に例示されている次の一連の操 作によってワクシニアウィルス中に導入された。

ａ）切断されたｐＡＴ１５３　（参考文献１９を参照のこと）中にクローン化さ れたＨｉｎｄＩ［［Ｆフラグメントを、ＢａｍＨＩにより消化し、そして電気泳 動によりその生成物を分離した後、８．５Ｋｂのフラグメントを単離し、そして 自己連結せしめ、プラスミドｐｓＢ１（またｐＳＣＢ　１として知られている） を得た。ｐＳＢ　１は、ｐＡＴ１５３の３．５　Ｋｂ　）ｆｉｎｄ　Ｉ［Ｉ　／ 　ＢａｍＨＩフラグメント中にクローン化された５　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ　／　 Ｂａｍ旧フラグメントを含む。

ｂ　）　ｐＳＢ　１をＩｌａｍ旧及び旧ｎｄＩ［［により消化し、そして５．Ｏ ＫｂのＨＣＭＶフラグメントを単離し、そしてＸｍａ　ｍにより消化した。

その得られた３、ＩＫｂのＸｍａ　ｍフラグメントを単離し、５′突出部をＥ、 コリのＤＮＡポリマラーゼ■クレノウフラグメントにより修復し、そしてその修 復されたフラグメントをプラスミドｐＧＳ６２の５ＩＩｌａ１部位に連結した。

ｐＧＳ６２は、ワクシニアのプロモーター要素によって妨げられるワクシニアウ ィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含む。Ｓｍａ　１部位での外来性遺 伝子の挿入は、プラスミドをもたらし、ここでその外来性ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子 は、ワクシニアプロモーター（Ｐ）の制御下にあり、そしてチミジンキナーゼの コード配列を端に有する。

その得られたプラスミドｐＳＢ　２内のｇＢ遺伝子の方向は、便利なマーカーと して３’ＸｍａＩ［［部位からのユニークＥｃｏＲＴ部位存在の９１１ヌクレオ チドを用いて決定された。

組換えプラスミドは、サイズの増大により同定され、そして３．１に挿入体の方 向は、ＥｃｏＲＩによる消化によって決定された。ワクシニアのプロモーターに 関して、正しい方向にＸｍａ　ｍフラグメントを含むプラスミドを同定し、そし てｐＳＢ　２（またｐＳＣＢ　２として知られている）と命名した。

参考文献１７に記載の方法を用いて、ＣＶ−１細胞を、ワクシニアウィルスによ り感染せしめ、そしてｐＳＢ　２によりトランスフェクトした。その組換えウィ ルスは、ワタシニアＴＫ遺伝子の挿入不活性化のためにＴＫ−であり、そしてこ の表現型は、容易に単離するための手段を提供した。ＴＫ−ウィルスは、５−ブ ロモデオキシウリジンの存在下で１４３−　ＴＫ−細胞上にプレートすることに よって、その得られた子孫から選択され、そしてそのようなウィルスクローンは 、ｐＳＢ　１とのハイブリダイゼーションによりＨＣＭＶ特異性ＤＮＡ挿入体の 存在についてスクリーンされた。ウィルスの増殖及び精製の後、組換えウィルス のゲノムを、制限エンドヌクレアーゼによる消化及びサザン法によって分析した 。その結果は、ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子が旧ｎｄＩＩＩＪフラグメント内のワタシ ニアＴＫ遺伝子中に挿入されたことを確証し、そして他のゲノムの再配列が生じ なかったことを示した。その組換えウィルスをＨＣＭＶ　ｇｓ−ｖ′Ａｃと命名 した。

えワクシニアウィルスによるＨＣＦＩｖＢのＨＣＭＶ　ｇＢの発現を試験するた めに、精製された）ＩＣＭＶに対して生ぜしめられた多価のウサギ血清を用いて 、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣ又はＷＴワクシニアにより感染された細胞からの、３ ５Ｓによりラベルされたポリペプチドを免疫沈殿せしめた。

ＣＶ−１細胞を、ＷＴワクシニア又は組換えＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣノイづれか により、細胞当り３０のプラーク形成単位（ｐｆｕ）で感染せしめた。感染後３ 時間で、それらの細胞を、メチオニンを含まない培地により洗浄し、そして次に ３０分間、メチオニンを含まない培地中でインキュベートした。その細胞を、１ ０オのラベルされていないメチオニンを含む培地中、１００μＣｉ　／　ｒｎｌ の３５Ｓ−メチオニンによりラベル化した。ＰＢＳにより洗浄した後、その細胞 を、氷上で１ｏ分間、ＲＩＰＡ緩衝液（０，０５ＭのＴｒｉｓ−ＨｃＪ　ｐＨ７ ，２，０，１５ＭのＮａＣｌ！、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％Ｓ ＯＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００，５ｔｒｉ　／　ｍｌのＤＮａｓｅ　、　２ ｍＨのＰＭＳＦ　）により分解した。その分解物を４°Ｃで６０分間、３１．０ ０Ｏｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ５０．１０−クー）で遠心分離し、そしてそ の得られた上清液のアリコートを、ＨＣＭＶにより高度免疫化されたウサギがら の非免疫性ウサギ血清（又は血清類）と共にインキュベートした（２０分間、室 温で）。免疫複合体をプロティンＡセファロースにより沈殿せしめ（２時間、室 温で）、溶離し、煮沸し、そして１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動せ しめた。そのゲルをメタノール／酢酸中に固定し、そしてフルオログラフィーエ ンハンサ−（Ａｍｐｌｉｆｙ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に含浸せしめ、そして オートラジオグラフを調製した。ＨＳＶ−１により感染された細胞からのタンパ ク質の分子量マーカーを、主要キャブジッド抗原（１５７ＫＤ）、糖タンハク質 Ｂ　（１２８ＫＤ）及びＶＰ１６　（６６ＫＤ）　ニ対するモノクローナル抗体 により沈殿せしめた。

免疫血清を用いて、約１４５ＫＤのポリペプチドを、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣに より感染された細胞（ＷＴワクシニアにより感染された細胞ではない）から免疫 沈殿せしめた。他のポリペプチドを、プル免疫ウサギ血清とのそれらの反応性に よって示されているように、非特異的に沈殿せしめた。

次に、ＨＣＭＶに対して生ぜしめられ、そして４ｙ　ビトロで中和化活性を有す ることを示されたネズミモノクローナル抗体を、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣニより 感染された細胞中ニＨＣＭＶ　ｇＢ生成物を認識するためのそれらの能力につい て試験した。ＣＶ−１細胞の単層上での、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣによって形成 されたプラークを、メタノールにより固定し、そして次に、モノクローナル抗体 及び続いて、　１′Ｉによりラベルされたスタフィロコーカス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ）のプロティンＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋）又はペルオキシダー ゼ接合性ウサギ抗−マウス免疫グロブリン（ＤａＫｏ）のいづれかと共にインキ ュベートした。モノクローナル抗体によって認識された抗原を含むウィルスプラ ークを、プロティンＡ結合抗体の場合、オートラジオグラフ上での黒い点として 又はペルオキシダーゼ接合性抗グロブリンと反応した単層へのＨｚＯｚ及びアミ ノ−エチルカルバゾールの添加に従っての“赤いプラーク”として可視化した。

試験された１０種のモノクローナル抗体のうち４種は、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣ （ＷＴワタシニアではない）により形成されたプラークを認識することを示した 。ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣを示すモノクローナル抗体を結した、そのウィルスに よって形成されたプラークのすべては、純粋なものであり、ＷＴワクシニアによ り汚染されていないことが注目すべきである。類似する結論が、ブロモデオキシ ウリジンの存在及び不在下でＴＫ−１４３細胞上でウィルスによりプラークし、 そしてサザン法によるゲノムＤＮＡの分析によって得られた。

ＷＴワタシニア、組換えＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣ又は感染されていないＣＶ−１ 細胞からの細胞分解物を、調製し、そして上記のようにしてモノクローナル抗体 ３７　、３９又は５９により免疫沈殿化せしめた。

プロティンＡを結合することができた３種のモノクローナル抗体がまた、３ＳＳ −メチオニンによりラベルされた感染性細胞抽出物も免疫沈殿化せしめた。モノ クローナル抗体３７及び３９が、ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣ（但しＷＴワタシニア 又は感染されていない細胞ではない）により感染された細胞からのタンパク質を 免疫沈殿せしめたことは、免疫染色データと一致した。

モノクローナル抗体５９は、ＨＣＭＶ感染性を中和することができるけれども、 この抗体はＨＣＭＶ　ｇＢを認識しなかった。この抗体の目標タンパク質は知ら れていない。１４５ＫＤのタンパク質の他に、約５５ＫＤのより低分子量のタン パク質がまた、両モノクローナル抗体により検出された。これは、両モノクロー ナル抗体により認識されたエピトープが５５ＫＤ及び１４５ＫＤの両タンパク質 上に存在し、又はこれらのタンパク質が物理的に関連し、そして結果的に同時沈 殿することを示唆する。

ＨＣＭＶにより感染された細胞中に合成されたｇＢとＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣに より感染された細胞からのｇＢとを直接的に比較するために、ＭＲＣ−５細胞を 、５ｐｆｕ／細胞でＨＣＭＶ株、ＡＤ１６９により感染せしめ、又は偽感染せし めた。７２〜９８時間後、感染からの細胞を、３５Ｓ−メチオニン（２８μＣｉ 　／　ｍ！　）によリラベルし、そして分解物を調製し、そして、上記のように してモノクローナル抗体３９又は４７のいづれかにより免疫沈殿せしめた。ＷＴ ワタシニア、組換えｇＢ−ＶＡＣにより感染された又は感染されていないＣＶ− １細胞を、上記のようにして放射性ラベルし、分解し、そしてモノクローナル抗 体３９により免疫沈殿せしめた。

両システムにおいて合成された１４５ＫＤ種は明確に同時移動し、そして成熟し た５５ＫＤ種もまた、類似するサイズのワクシニアバンドの非特異的な沈殿がこ れをより不明確にしたけれども、明確に同時移動した。これらの２種の種類の他 に、さらに６６ＫＤバンドがまた、ＨＣＭＶにより感染された細胞分解物にも見 られた。これは、ｇＢには無関係であると思われる。

なぜならば、プロティンＡを結合しなかったもう１つのモノクローナル抗体（４ ７）が、非特異的にこのバンドをもたらしたからである。そのサイズは、それが たくさんの６６ＫＤのＨＣＭＶマトリックスタンパク質であることを示唆した。

ヒト　庁血パはＨＣｌ１ＶＢを切−する）ＩＣＭＶ　ｇＢに対して向けられた抗 体が、ヒトにおける一次ＨＣＭＶ感染の間、産生されるかどうかを調べるために 、−次ＨＣＭＶ感染の前及び後で、心臓の移植を受けた患者から採取された血清 が、組換ワクシニアウィルスによって合成されたＨＣＭＶ　ｇＢを認識する能力 について試験された。

Ｈ３−ＶＡＣ又はＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣノイづれかにより感染されたＣＶ−１ 細胞を、上記のようにして調製された、３ＳＳ−メチオニン細胞分解物によりラ ベルした。次に、分解物を、ウサギプレー免疫、続いてウサギ抗−ＨＣＭＶ又は ）ＩＣＭＶによる感染の前に採取されたヒト血清、続いてＨＣＭＶによる感染の 後の血清のいづれかにより連続的に処理した。免疫複合体がプロティンＡセファ ロースにより沈殿せしめられ、そして上記のようにしてポリアクリルアミドゲル 上で分離された。

ＨＣＭＶに対してひき起こされたウサギ血清を、陽性の対照として使用した。ヒ ト血清はまた、持前の天然痘ワクチンのために、ワクシニアウィルスに対する抗 体を含む傾向があるので、免疫沈殿法が、ＨＣＭＶによ、る感染の前及び続いて 後で採取された血清を用いて同じ細胞分解物に対して連続的に行なわれた。これ らのデータは、１４５ＫＤのポリペプチドが、ＨＣＭＶ感染の後（但しその前で はない）、採取されたヒト血清によって、ｇＢ−ＶＡＣにより感染された細胞分 解物から免疫沈殿せしめられたことを示す。１４５ＫＤのタンパク質もまた、ウ サギ抗−ＨＣＭＶ血清によって沈殿せしめられた。さらに対照として、同じヒト 血清が、もう１つの組換えワクシニアウィルスＨ３−ＶＡＣニヨって発現された インフルエンザウィルスＡ　／ＮＴ／６０／６８からインフルエンザウィルスハ エマグラチニン（ＨＡ　）　ヲ認ｉする能力について試験された。そのインフル エンザＨＡは、ＨＣＭＶ感染の前に採取されたヒト血清によって免疫沈殿せしめ られ、そしてＨＣＭＶ惑染の感染採取された血清によってはそれほどでもなかっ た。これらのデータは、心臓移植を受けた患者がＨ３サブタイプのインフルエン ザウィルス惑染を前に経験したことを示す。さらに、ＨＣＭＶ　ｇＢは、ＨＣＭ Ｖ感染の後採取された血清によって単に沈殿せしめられるけれども、ＨＣＭＶ感 染の前に採取された血清によるインフルエンザＨＡの沈殿は、ＨＣＭＶタンパク 質の沈殿の特異性を確証する。ＨＣＭＶに対する抗体の成長が、Ｍｉ織拒絶を妨 げるために心臓移植の間の免疫抑制にもかかわらず、生じたこともまた有意であ る。ヒト免疫血清はまた、旦　ビトロでＨＣ？ＩＶ感染性を中和することもでき る。免疫抑制の間、ＨＣＭＶ感染を経験した、心臓移植を受けた患者から採取さ れたいくかつの他の血清がまた、ＨＣＭＶｇＢの類似する沈殿をもたらした。

ＨＣ？ｌｖＢは感染された　面上で　される組換えワクシニアウィルスにより感 染された細胞中において合成されたＨＣＭＶ　ｇＢが細胞表面免疫螢光に輸送さ れるかどうかを試験するために、研究が行なわれた。

ＣＶ−１細胞を、ガラス性カバースリップ上で増殖せしめ、そして１０　ｐｆｕ ／細胞でＷＴワクシニアウィルス又は）ｌＣＩ’ｌＶ−ｇｌｌｌ−ＶＡＣのいづ れかにより感染せしめた。感染後４８時間の細胞を、２％パラホルムアルデヒド の等張溶液により固定した。

４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中でのインキュベーションの後 、単層を、４°Ｃで一晩、腹水を含む、モノクローナル抗体３７の１　／４００ 希釈溶液と反応せしめた。

広範な洗浄の後、結合した抗体を、４％ＢＳＡ及び２％正常ウサギ血清を含むＰ ＢＳにより１／２０に希釈された、フルオレセイン接合性ウサギ抗−マウス免疫 グロブリン（ＤａＫｏ）により検出した。螢光を、×４００でｕ、ｖ、照射によ り観察した。

ＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣにより感染された細胞は、陽性の表面螢光を示したが、 しかしＷＴにより感染された細胞は、目だった反応性は示さなかった。感染され た細胞膜上の染色のパターンは、通常、粒状の外観を示し、細胞膜におけるＨＣ ＭＶ　ｇＢの集まり又は凝集を示唆した。

ＨＣＭＶＢ−ｖＡＣによるウサギのワクチン接種換えワクシニアウィルスによっ て発現されたＨＣＭＶ　ｇＢに対して生ぜしめられた抗−血清がＨＣＭＶ感染性 を中和することができるかどうかを決定するために、２匹のウサギの第１表に示 されるようにして組換え生ウィルスによりワクチン接種した。

ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　。

２匹のウサギを、それぞれの横腹上の１つの部位中に、精製された感染性ＨＣＭ Ｖ　ｇＢ−ＶＡＣ１０’ｐｆｕにより皮下免疫接種した。

４６日後、両動物を、同じ用量の組換え生ワクチンにより再ワクチン接種した。

第３のウサギは、インフルエンザウィルスの核タンパク質遺伝子を発現するＴＫ −組換えワクシニアウィルスを受け、そしてまた再ワクチン接種された。第１表 に示された日に、ウサギから得られた血清サンプルを、−（７ビトロで）ＩＣＭ Ｖ感染性を中和するそれらの能力について試験した。血清センプルを、補体を不 活性化するために５６°Ｃで３０分間、インキュベートし、そして次に、血清希 釈溶液（１：１０又は１：５０）の１体積とＨＣＭＶ株ＡＤ１６９（７５０ｐｆ ｕ）の等体積とを混合し、そして３７°Ｃで３０分間インキュベートした。新し いウサギ血清を補体源として添加し、５％の最終濃度にし、そしてその混合物を ３０°Ｃでさらに３０分間インキュベートし、その後、残留ウィルスをＭＲＣ− ５細胞に対して検定した。プラークが１０日後、計数され、そしてその結果は、 プラーク数の％減少として第１表に示されている。ウサギ１及び２からの血清は 、外因性補体の存在下でＨＣＭＶの感染性を中和する抗体を含んだ。異なったＴ Ｋ−組換えワクシニアウィルスと共にインキュベートされた第３ウサギは、その ような抗体を持たなかった。

従ってＨＣＭＶ　ｇＢ−ＶＡＣによりワクチン接種された２匹の動物は、４７　 ビトロでＨＣＭＶを中和する抗体を増殖せしめるが、但しインフルエンザウィル スの該タンパク質を発現するもう１つのＴＫ−組換えワクシニアウィルスにより 免疫化された第３ウサギはそうでなかった。これらのウサギ血清による）１ｃＭ Ｖ惑染性の中和は、補体に依存した。なぜならば熱により不活性化にされた血清 は、外因性補体の添加なしに、ＨＣＭＶプラーク数を減じなかった。２回目のワ クチン接種の前及び後での抗体のレベルを試験するもう１つの実験は、両動物が 再ワクチン接種の後、抗体力価を高めたことを示した。ウサギ１は、１１６日目 １ｌその抗体レベルを維持し、そしてこの時点で、１：５０の希釈度でＨＣＭＶ プラーク形成を７０％減じた。

ウサギ２における抗体レベルは、時間と共に減少したが、しかし１１６日目１ｌ ：５０の希釈度でＨＣＭＶプラーク形成を２４％、なお滅じた。

詰−揄 推定上のコード配列は、ワクシニアに発現された真のＨＣＭＶタンパク質とコー ドする。ワクシニアに発現したタンパク質は、ＨＣＭＶにより感染された細胞に 見られるタンパク質と電気泳動により同一であることがわかった。そのタンパク 質は次の特性を有する。それは、抗体を中和するための目的である（なぜならば 、それは、中和性抗体によって認識されるからである）。それは、ＨＣＭＶ　ｇ Ｂ−ＶＡＣにより感染された細胞の表面上に存在し、そしてそれはＨＣ１’ｌＶ 粒子中に存在する。

−次生成物は、１４５．０００の見掛分子量を有し、そして５５．０００の分子 量の生成物に加工される。それは、組換えウィルスにより感染された細胞中にお ける発現を通してウサギ免疫系に放される場合、ＨＣＭＶ感染を中和する抗体の 産生を誘発することができる。

上記例は、ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９を使用したけれども、他の菌株も、機能的に同 価値があり、そしてまた使用され得る。

ＨＣＭＶＯ声タンパク　Ｈ 第５図に示されているような遺伝子の推定上のアミノ酸配列とＥＢＶ及びＨ５Ｖ −１遺伝子のアミノ酸配列との比較は、これらのウィルスの糖タンパク質Ｈが相 同であることを示した。

従って、このＨＣＭＶ遺伝子は、ＨＣＭＶ　ｇＨとして言及される。

ＨＣＭｖＨを　する且　えワクシニアウィルスのＨＣＭＶ　ｇＨ遺伝子を、次の ようにしてプラスミドベクターｐＧＳ６２中にクローン化した。１１４００個の 塩基対のＨｉｎｄｎ［Ｌフラグメントを、旧ｎｄＩ［［による消化によってプラ スミドｐＡＴ１５３／ＨｉｎｄｎＩＬから切り出し、そしてＥ、コリのＤＮＡポ リマラーゼクレノウフラグメントによる処理によってそれらの末端を平滑末端化 した。次に、そのＤＮＡを、第５図に示されるようにＣＭＶ　ｇＨ遺伝子の翻訳 開示部位の上流に９６個のヌクレオチドを切断するＳｍａ　Ｉにより消化した。

ＨＣＭＶ　ｇＨコード配列を含む２．５ＫｂのＤＮＡフラグメントを単離し、そ してユニークＳｍａ　１部位でプラスミドｐＧＳ６２中に連結した。得られたプ ラスミドｐＳＢ　３は、ワクシニアプロモーターの下流に正しく位置を定められ た）ＩＣＭＶ　ｇＨ遺伝子を含むことが示された。前記方法は、）ＩＣＭＶ　ｇ Ｂ遺伝子のために使用される方法に本質的に類似した。

ＨＣＭＶ　ｇＨ遺伝子をまた、その同じワクシニアプロモーターの下流のユニー クＳｍａ　Ｉ部位でプラスミドｐｓｃ１１　（参考文献１６）中に挿入した。こ のプラスミドはｐＳＢ　４と呼ばれた。プラスミド５ＣＩＩは、β−ガラクトシ ダーゼ遺伝子の発現を導びく第２のワクシニアプロモーターを含む。従って、同 時にＨＣＭνｇＨ遺伝子を得る組換えウィルスはまた、β−ガラクトシダーゼ遺 伝子もまた獲得する。これは、Ｘ−ガルの存在下でそれらの青色の力により、こ れらの組換えウィルスによって形成されたプラークの急速な同定を可能にする。

プラスミドｐｓＢ　３及びｐＳＢ　４を用いて、ＨＣＭＶ　ｇＨ遺伝子を含むＴ Ｋ−組換えワクシニアウィルスを構成した。それらのウィルスは、それぞれＨＣ ＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣ（ＧＳ６２）及びＨＣＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣ（ＳＣＩＩ）と呼 ばれた。これらのウィルスは、プラーク精製され、そして次に、より多くのスト ックが確立される方法（参考文献１７）を用いて、増殖され、そして精製された 。それらのウィルスのゲノムＤＮＡの分析は、推定されるように、ＨＣＭＶ　ｇ Ｈ遺伝子がワクシニア旧ｎｄＩＩＩＪフラグメントを有するＴＫ遺伝子中に挿入 されたことを示した。

ＨＣＭｖ　Ｈ′　云　の ＨＣＭＶ　ｇＨ遺伝子の生成物を、次のようにして、ＨＣ１’ｌＶ　ｇｌ（−Ｖ ＡＣにより感染された細胞によって同定した：（１）　ＣＶ−１細胞の単層を、 ＷＴワタシニア（ＷＴ）又は組換えワクシニアウィルスＣＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣ（ ＧＳ６２）もしくはＣＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣ（ＳＣＩＩ）のいづれかにより感染せ しめた。感染された細胞を、感染後３〜６時間で３ＳＳ−メチオニンにより放射 性ラベルし、そして分解物を、感染後６時間でその感染された細胞から調製した 。これらの分解物を、非特異的なウサギ血清、精製されたＨＣＭＶピリオンに対 して発現されたウサギ血清又は抗−ＨＣＭＶモノクローナル抗体１６　（ＨＣＭ Ｖ　１６）のいづれかにより免疫沈殿せしめた。約８６ＫＤのポリペプチドを、 ウサギ抗−１（Ｃ？ｌＶ血清を用いて、ｇＨ−ＶＡＣ（ＳＣＩ　１）及びｇＨ− ＶＡＣ（ＧＳ６２）により感染された細胞から免疫沈殿せしめた。このペプチド は、ＷＴワクシニアにより感染された細胞からは沈殿せしめられなかった。

ＨＳ　Ｖ　塘タンパク質りからの合成ペプチドに対して発現されたウサギ血清は 、このバンドを沈殿せしめなかった。しかしながら、類似するサイズのポリペプ チドは、ウサギ抗−ＨＣＭＶ血清を用いて、ＨＣＭＶにより感染されたＭＲＣ− ５細胞から沈殿せしめられた。

（２）抗−ＨＣＭＶ−Ｅ／クローナル１６はまた、ｇＨ−ＶＡＣ（但しＷＴでは ない）により感染された細胞から８６ＫＤのバンドを免疫沈殿せしめた。ＨＣＭ Ｖ　ｇＢを認識するモノクローナルＨＣＭＶ３７は、対照として、８６ＫＩｌの タンパク質を沈殿せしめなかった。

（３）　ＨＣＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣにより感染された細胞中に合成されたＨＣＭＶ 　ｇＨの細胞位置が免疫螢光法によって調べられた。これは、ｇＨポリペプチド が抜脱に輸送され、そしてまた、拡散的に細胞質中において検出可能であったこ とを示した。もし細胞が初めに透過されなければ、ＨＣＭＶ　ｇＨ−ＶＡＣによ り感染された細胞上に螢光は存在しなかった。

モノクローナルＨＣＭＶ　１６は、ＨＣＭＶ感汎　を　するＨＣＭＶ　ｇ）ｌが 、ウィルス感染性の抗体仲介性中和のための巨的物であるかどうかを調べるため に、ＨＣＭＶをモノクローナル）１ｃＭＶ　１６と共にインキュベートし、そし て残る感染性をｌ’１ＲＣ−５細胞に対して検定した。１：４０００の希釈度で さえ、モノクローナルＨＣＭＶ　１６は、不ｌ　ビトロでＨＣＭＶ感染性を５０ ％以上減じた。この中和は、外因性補体に依存しなかった。明らかに、ＨＣＭＶ 　ｇ）！遺伝子の生成物は、ウィルスの中和化のための目標物であり、そして従 って、今後のＨＣＭＶワクチンに可能性を有する。

慧−揄 １１ｃＭＶの旧ｎｄＩＩ［Ｌフラグメント内にマツピングされたＨＣＭＶＩタン パク質遺伝子のＤＮＡ配列が決定され、そして組換えワクシニアウィルスに発現 された。その遺伝子生成物は、組換えワクシニアにより感染された細胞における 抜脱に輸送される、８６）［Ｄのポリペプチドとして同定された。ＨＣＭＶによ り感染された細胞において、それはまた、細胞表面膜にも存在する。このタンパ ク質を！　識するモノクローナル抗体は、４７ビトロで）ＩＣ？ｌＶの感染性を 効果的に中和する。これは、ＨＣＭＶワクチンにおいて、この８６ＫＯの糖タン パク質の可能性ある役割を示す。

前記説明は、組換えワクシニアウィルスにより感染された細胞中におけるＨＣＭ Ｖタンパク質の産生及び感染防御抗体の出現を宿主に引き起こすワクチンとして 作用するための前記ウィルスの可能性に対して、例によりとりくんで来たが、本 発明は、当業者の能力内で容易に、種々の異なった技法により修飾することがで きることは明らかであろう。これらは、次のとおりに例示される。

（ｉ）第３及び６図に与えられたＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づいて、ＩＩｃＭ Ｖ　ｇＢ及びｇＨタンパク質をコードするＤＮＡを、当業界において良く知られ た方法によって得ることができる。たとえば、所望のアミノ酸配列をコードする ＤＮＡを合成することができる。他方、そのＤＮＡは、対象の配列を同定するた めに制限することにより、続いてラベルされたオリゴヌクレオチドプローブとの ハイブリダイゼーションにより、ウィルスゲノムから得られる。また、ｃＤＮＡ は、ウィルスｍＲＮＡからの逆転写、続いてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ ーションプローブによりスクリーニングすることによって得られる。

（ｉｉ　）　ＨＣＭＶタンパク質は、組換えＤＮＡベクターにより形質転換され た微生物又は細胞培養物に発現される。適切なベクター及び発現システムは、広 く知られていて、そしてたとえば細菌、たとえばＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　 、酵母、たとえばサツカロマイセス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳類細胞培養物、たとえばＣＯ８又はＣＨＯ 細胞にタンパク質を発現するために使用される。微生物発現（たとえば細菌及び 酵母）の場合、）ＩｃＭＶのタンパク質ＤＮＡは、発現ベクター中への挿入の前 、５′フランキング領域を除去するために、通常操作され、そのコード領域は、 ＨＣＭＶタンパク質遺伝子のＡＴＧ又はそのコード配列と読み枠を合わせて人工 的に導入されるＡＴＧのいづれかである出発コドンから翻訳される。コード配列 の５′頭域、たとえば疎水性シグナル領域を除去することが所望される場合、後 者が、特に使用されるであろう。その疎水性３′アンカー領域もまた、所望によ り除去され得る。なぜならば、それは臨界の抗原決定基を含まない傾向にあるか らである。その組換えベクターは、複数のＨＣＭＶタンパク質コード配列、たと えばタンデム反復でのｇＢ又はｇＨのコード配列又はタンデムでのｇＢ及びｇＨ の両者のコード配列を含むことができる。発現ベクターのサイズを減じるために は、それぞれの糖タンパク質のコード配列の一部のみを、それが所望の抗原決定 基を正しくコードする限り、導入することができる。

（ｉｉｉ　）　ＨＣＭＶタンパク質、又は所望とする抗原決定基を含むその一部 がまた、タンパク質合成の既知方法を用いて、化学的手段によって合成され得る 。

（ｉｖ）Ｌかしながら、生成されたＨＣＭＶタンパク質は、適切な動物をＨＣＭ Ｖタンパク質により免疫化し、そのタンパク質に対する抗体の産生を可能にし、 そして次にその動物がら抗血清を抽出することによって、単一特異性血清として 、ＨＣＭＶ−特異性抗体を産生ずるために使用され得る。

（ｖ）ＨＣＭＶタンパク質は、そのタンパク質による動物、通常マウスの免疫化 、続いて分離され、そしてクローン化され得る抗体産生ハイブリドーマを形成す るために、腫瘍細胞とその動物からの肺臓細胞との融合の標準技法によって、Ｈ ＣＭＶ　−る。これらのクローンから、モノクローナル抗体が収穫され得る。通 常、抗体のパネルが産生される。なぜならば、それぞれの）ＩＣＭシタンパク質 は、複数の抗体の産生を予期されるであろうからである。

（Ｖｉ）ＨＣＭＶタンパク質はまた、適切な支持体、たとえばアフィニティ力う ム上に固定されたタンパク質と抗体とを接触し、そして次にたとえば溶ＡＩする ことによってそのタンパク質から結合した抗体を分離することによって、ＨＣＭ Ｖ−特異性抗体を精製するためにも使用され得る。

（Ｖｉ）　ＨＣＭＶタンパク質はまた、ＨＣＭＶ抗体のための検定においても使 用され得る。種々の従来の検定方法が、たとえばＥＬＩＳＡ。

ＲＩＡ又は免疫螢光法に基づいて使用され得る。典型的には、ＨＣＭＶタンパク 質は、支持体上に固定され、次にヒトからの臨床的サンプルと接触され得る。洗 浄した後、その支持体は、固定されたＨＣＭＶタンパク質によって見出されたい づれかのＨＣＭＶ抗体に結合する、ラベルされた抗−ヒ）ＩｇＧと接触せしめら れる。

（ｖｆｆｌ）　ＨＣＭＶタンパク質はまた、ワクチン配合において通常使用され る種類の適切なアジュバント又は賦形剤と共にそれを混合することによって、ワ クチンとしても使用され得る。このワクチンの形は、たとえば免疫抑制された個 人においては、組換えワクチンよりもより適切であろう。

皇二」Ｌ二幻−献 １、　５ｔｉｎｓｋｉ、Ｍ、（１９７６）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９．５９４ −６０９゜２、Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｌ、、　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｍ、＋　Ｔａｔｓｕ ｎｏ、Ｍ　ａｎｄ　Ｄｏｎｄｅｒｏ、Ｄ。

（１９８４）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３９．７３−８６゜３、Ｐｅｒｅｉｒａ 、Ｌ、＋　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｃｒｅｍｅｒ＋Ｎ、（１９８２）　 Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、、３６．　９３３−９４２゜４、Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｌ、、　Ｈｏｆ ｆｍａｎ、Ｍ、、　Ｇａ１ｌｏ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｃｒｅｍｅｒ、Ｎ。

（１９８２）　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　３６．９２４−９３２゜５、 Ｂｒ１ｔｔ、Ｗ、Ｊ、　（１９８４）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３５．３６９− ３７８゜６、Ｎｏｗａｋ、Ｂ、＋　５ｕｌｌｉｖａｎ＋Ｃ０＋　Ｓａｒｎｏｗ、 Ｐ、、　Ｔｈｏｍａｓ、Ｒ，。

Ｂｒ１ｃｏｕｔ＋Ｆ、＋　Ｎ１ｃｏｌａｓ、Ｊ、Ｃ，、Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉ ｎ、Ｂ、　ａｎｄＬｅｖｉｎｅ、Ａ、Ｊ、　（１９８４）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 　１３２．３２５−３３８゜７、Ｌａｗ、に、Ｍ、＋　Ｗｉｌｔｏｎ−５ｍｉｔ ｈ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｆａｒｒａｒ、Ｇ、Ｈ，（１９８５）Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　１７．２５５−２６６゜８、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、Ｌ、、　Ｍｕｌｌ ｅｎａｘ、Ｊ、＋　Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍｅｒｉｇａｎ。

Ｔ、Ｃ，（１９８５）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５５．２７４−２８０゜９、Ｒａ ｓｍｕｓｓｅｎル＋ｊ　Ｍｕｌｌｅｎａｘ、Ｊ、、　Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｍ、　ａｎ ｄ　Ｍｅｒｉｇａｎ＋Ｔ、Ｃ，（１９８５）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１４５．１ ８６−１９０゜１０、　Ｂｒ１ｔｔ、Ｗ、Ｊ、　ａｎｄ　Ａｕｇｅｒ＋Ｄ、　（ １９８６）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、＋　５８＋１８５−１９１゜ １１、　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，＋　Ｂａｒｒｅｌｌ 、Ｂ、Ｇ、、　Ｓ＋ｍ１ｔｈ、Ａ、Ｊ、Ｈｏａｎｄ　Ｒｏｅ、Ｂ、Ａ、　（１９ ８０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４３．１６１−１７８゜１２、　Ｂ ａｎｋｉｅｒ、Ａ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｌｌ＋Ｂ、Ｇ、　（１９８３）、 Ｓｈｏｔｇｕｎ　ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　 ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

Ｖｏｌｕｍｅ　Ｂ５０８．　ｐｌ）、１−３４．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｒｅｌａｎｄ　Ｌｔｄ。

１３、Ｏｒａｍ、Ｊ、Ｄ、、Ｄｏｗｎｉｎｇ、Ｒ，Ｇ、、Ａｋｒｉｇｇ＋Ａ−＋ 　Ｄｏｌｌｅｒｙ、Ａ、Ａ、。

Ｄｕｇｇｌｅｂｙ、Ｃ，Ｊ、＋　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｇ、Ｗ、Ｇ、ａｎｄ　Ｇ ｒｅｅｎａｗａｙ、Ｐ、Ｊ。

（１９８２）　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、５９．　１１１−１２９゜１４、 Ｐｅ１ｌｅｔ＋Ｐ、Ｅ、、Ｂｉｇｇｉｎ、Ｍ、Ｄ、＋　Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、Ｇ 、ａｎｄ　Ｒｏｉｚｍａｎ。

Ｂ、（１９８５）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５６．　８０７−８１３゜１５、　Ｓｍ１ ｔｈ、Ｇ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２． １２０−１２６＋（１９８４）。

１６、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｓ、、Ｂｒｅｃｋｌｉｎｇ、に、ａｎｄ　Ｍｏ ５ｓ、Ｂ、（１９８５）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、互、３４０３−３４０９゜１７、　Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ 、、　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、　ａｎｄ　１１ｏｓｓ＋Ｂ、　（１９８４）　Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ。

虹、８５７−８６４゜ １８、Ｂｏｙｌｅ、Ｄ、Ｂ、、Ｃｏｕｐｅｒ、Ｂ、Ｅ、Ｈ，ａｎｄ　Ｂｏｔｈ、 Ｇ、Ｗ、（１９８５）国際調査報告 ＋１１＋−−ｎ−−−＋ａ＊＊−１＝−ｍ−、ＰＣＴ／ＧＢ８７１００１６４ｉ −ＪｎＩＥ　ＸτＯ、（Ｅ　ＩＮＴＥＲ？詰Ｔｌ０ＮＡＬ　ＳＥ、”５ＲＣｐ、 ＲＥ？ＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥ％’ＪＡＴＩＯＮＡＬ　Ａ？ＰｔＪＣＡＴＩＯＮ　 Ｎｏ、　ＰｃＴ／ＣＢ　Ｅ１７１００１６４　（ＳＡ　１６４５２）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトにおいてＨＣＭＶ中和性抗体を産生することができる、１又はそれより も多くの抗原決定基を組込むポリペプチドを、適切な宿主生物における組換えＤ ＮＡベクターから発現することを含んで成る方法であって、前記決定基（又は決 定基類）がＦ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩基の間に存在する、ＨＣＭＶ ゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＦフラグメントにおけるＤＮＡによってコードされたタ ンパク質の一部及び／又はＬ／Ｄ境界からの２２８〜２４５６塩基の間に存在す る、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＬフラグメントにおけるＤＮＡによってコ ードされたタンパク質の一部に相当することを特徴とする方法。
2. ２．前記ポリペプチドを、ヒトにおけるＨＣＭＶに対するワクチン中に導入する 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ヒトにおいてＨＣＭＶ中和性抗体を産生することができる、１又はそれより も多くの抗原決定基を組込むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えウィ ルスベクターであって、前記決定基（又は決定基類）が、Ｆ／Ｄ境界からの１３ ７８〜４０９５塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＦフラグ メントにおけるＤＮＡによってコードされたタンパク質の一部及び／又はＬ／Ｄ 境界からの２２８〜２４５６塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩ ＩＩＬフラグメントにおけるＤＮＡによってコードされたタンパク質の一部に相 当し、前記ベクターがヒトを感染せしめることができ、そして前記ポリペプチド を免疫原形で発現することができることを特徴とする組換えウィルスベクター。
4. ４．請求の範囲第３項記載の組換えウィルスベクターを組込む、ＨＣＭＶに対す るワクチン。
5. ５．ヒトにおいてＨＣＭＶ中和性抗体を産生することができる、１又はそれより も多くの抗原決定基を組込むポリペプチドをコードするＤＮＡ単離体であって、 前記決定基（又は決定基類）が、Ｆ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩基の間 に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＦフラグメントにおけるＤＮＡに よってコードされたタンパク質の一部及び／又はＬ／Ｄ境界からの２２８〜２４ ５６塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＬフラグメントにお けるＤＮＡによってコードされたタンパク質の一部に相当することを特徴とする ＤＮＡ単離体。
6. ６．ヒトにおいてＨＣＭＶ中和性抗体を産生することができる、１又はそれより も多くの抗原決定基を組込むポリペプチドを合成することを含んで成る方法であ って、前記決定基（又は決定基類）が、Ｆ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩 基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＦフラグメントにおけるＤ ＮＡによってコードされたタンパク質の一部及び／又はＬ／Ｄ境界からの２２８ 〜２４５６塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＬフラグメン トにおけるＤＮＡによってコードされたタンパク質の一部に相当することを特徴 とする方法。
7. ７．ＨＣＭＶ単一特異性抗血清を調製するための方法であって、請求の範囲第１ 項又は第６項記載の方法によって調製されたポリペプチド又は請求の範囲第３項 記載の組換えウィルスベクターにより宿主動物を免疫接種し、そして前記宿主動 物から前記ポリペプチドに特異的な抗血清を抽出することを含んで成る方法。
8. ８．請求の範囲第１項又は第６項記載の方法によって調製されたポリペプチド又 は請求の範囲第３項記載の組換えウィルスベクターにより宿主動物を免疫接種し 、そしてこのようにして免疫接種された動物の細胞からＨＣＭＶ特異性モノクロ ーナル抗体を調製することを含んで成る方法。
9. ９．ＨＣＭＶ特異性抗体を精製するための方法であって、ヒトにおいてＨＣＭＶ 中和性抗体を産生することができる、１又はそれよりも多くの抗原決定基を組込 むポリペプチドと抗体とを接触せしめ、前記決定基（又は決定基類）が、Ｆ／Ｄ 境界からの１３７８〜４０９５塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩＦフラグメントにおけるＤＮＡによってコードされたタンパク質の一部及 び／又はＬ／Ｄ境界からの２２８〜２４５６塩基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノ ムのＨｉｎｄＩＩＩＬフラグメントにおけるＤＮＡによってコードされたタンパ ク質の一部に相当し、そして結合した抗体を前記ポリペプチドから分離すること を含んで成る方法。
10. １０．臨床的なサンプル中におけるＨＣＨＶ特異性抗体を検出する方法であって 、ヒトにおいてＨＣＨＶ中和性抗体を産生することができる、１又はそれよりも 多くの抗原決定基を組込むポリペプチドと前記サンプルとを接触せしめ、前記決 定基（又は決定基類）が、Ｆ／Ｄ境界からの１３７８〜４０９５塩基の間に存在 する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＦフラグメントにおけるＤＮＡによって コードされたタンパク質の一部及び／又はＬ／Ｄ境界からの２２８〜２４５６塩 基の間に存在する、ＨＣＭＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＬフラグメントにおけるＤ ＮＡによってコードされたタンパク質の一部に相当し、そして前記ポリペプチド に結合する抗体を検出することを含んで成る方法。
11. １１．請求の範囲第１０項記載の方法を行なうためのキットであって、臨床的な サンプルとの接触のために適切な形で前記ポリペプチド及び前記ポリペプチドに 結合するＨＣＣＭＶ特異性抗体を検出するための手段を含んで成るキット。