KR20090126256A - 인간 거대세포바이러스(ｈｃｍｖ)의 재조합 항원 - Google Patents

인간 거대세포바이러스(ｈｃｍｖ)의 재조합 항원 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HCMV 감염에 대한 인간 B-세포 반응에 관여하는 HCMV 단백질의 항원 부위들을 동정하고, 키메릭 융합 산물의 형태로 상기와 같은 항원 부위들을 결합시키기 위한 방법, 및 진단제 및 면역제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
HCMV 감염, 진단제, 면역제

Description

인간 거대세포바이러스(ＨＣＭＶ)의 재조합 항원{RECOMBINANT ANTIGENS OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS(HCMV)}
본 발명은 동물 또는 인체에 직접 적용되지 않는 진단 수단의 기술적인 제조 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 인간 거대세포바이러스 감염의 검출 및 진단뿐만 아니라 상기 감염의 치료 및 예방을 위한, 약학 및 진단 분야에서 산업적인 용도에 적합한 화합물, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법, 및 상기 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다.
조기 진단은, 특히 환자 삶의 상당한 개선과 건강 관리 시스템 및 환자 모두에 동반되는 절감을 허용하므로, 모든 치료 분야에 우선적이고 매우 바람직한 목표이다. 본 발명의 특정한 경우에서, 조기 진단은 임산부, 특히 태아의 건강이 우려되는 임산부, 및 감염 환자, 특히 면역성이 손상된 환자의 잠재적이거나 현존하는 거대세포바이러스 감염의 경우 매우 중요한 문제이다.
인간 거대세포바이러스(HCMV)는 헤르페스비리다에 과의 매우 숙주 특이적인 바이러스인 인간 헤르페스바이러스-5의 전문적인 명칭이다. 형태학적으로, HCMV는 대략 165 유전자를 암호화하는 235 kbp의 이중 가닥 DNA 게놈을 갖는 과에서 가장 큰 바이러스이다(Dolan et al., 2004, J. Gen. Virol. 85:1301-1312). 모든 헤르페스바이러스들처럼 HCMV는 숙주에서 잠복기 및 재활성화를 겪는다. 상기 바이러스는 인간 집단에서 우세하며, 상기 숙주에서 50 내지 90% 재활성화된다. 상기 바이러스는 인간 집단에서 우세하며, 사회경제적인 인자 및 지리학적 위치에 따라, 성인의 50 내지 90%가 50 세까지 혈청양성으로 된다(Gandhi and Khanna, 2004, Lancet Infect. 4:725-738). 인간은 HCMV의 유일한 저장소이다. HCMV에 의한 1 차 감염은 일반적으로 무증상이며 면역적격 숙주에서 자기 제한적이나, 주기적인 재활성화 및 점막 부위로부터 바이러스의 발산을 갖는 평생 보균자 상태를 생성시킨다. 대조적으로, 면역억제된 성인에서 잠복 바이러스의 재활성화는 매우 심각한 결과를 갖는 폐렴을 생성시킬 수도 있다(Gandhi et al., 2003, Blood Rev. 17:259-264). 더욱이, 임신 중 1차 감염에 걸리면 자연유산에 이르거나 선천적으로 감염된 신생아에서 심각한 태아 질병에 이를 수 있다(Revello and Gema, Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15:680-715).
HCMV 감염의 문제에 대한 광범위한 고찰을 위해서 독자는 특정 의학 문헌을 참조한다.
HCMV 감염의 진단은, 혈액 또는 체액 중 상기 바이러스 및/또는 바이러스 산물을 단리하고, PCR에 의해 특정 뉴클레오타이드 서열을 검출하고, 상기 감염에 반응하여 숙주에 의해 생산된 특이적인 항-HCMV 항체를 검출함으로써 확립된다(Revello and Gema, Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15:680-715).
임상의들의 주요 도전은 임산부의 1차 HCMV 감염의 진단 및 그 신생아의 선 천적인 감염의 진단이다. 상기 두 경우 모두, 양호한 시간 내에 적합한 치료를 실행하고 태아 및 신생아에 대한 가능한 손상을 피하기 위해서, 상기 바이러스 감염이 임산부의 수태 전에 또는 후에 걸렸는지의 여부를 입증하는 것이 매우 중요하다. 더욱이, 이는 모태에서 태아로의 수직 감염이 발생한 경우 필수적인 결정요소이다.
임신 중 혈청전환 및 신생아의 선천적 감염의 진단은 일반적으로 다양한 부류의 항-HCMV 면역글로불린(IgG, IgM, IgG의 결합활성)의 존재를 검출하고 모체 대 그 아기의 면역 프로파일의 비교를 시도함으로써 수행된다. 그러나, 이용 가능한 상업적인 분석은 모든 환자에서 감염의 정확한 진단을 허용하기에 충분한 감도 및 특이성을 제공하지 않는다. 더욱이, 대부분의 현재 이용 가능한 면역분석들은 HCMV-감염된 섬유모세포 배양물로부터 유래한 불충분하게 한정된 바이러스 항원을 사용하며 혈청 면역글로불린을 검출하는 능력들이 다양할 수도 있다. 최종적으로, HCMV 혈청진단과 관련하여 또 다른 문제는 골드 스탠다드(gold standard)의 결여로 인한 결과의 진정한 분류이다. 따라서, 특이적이고, 민감하고 혁신적인 진단제의 입수가 바람직하다.
다수의 연구들이 HCMV의 다양한 상이한 항원 단백질들을 발견하였으며 상응하는 유전자 서열들이 또한 측정되었다.
백신 형태로, 진단 및 치료 목적 모두에 가장 흥미로운 단백질들 중에서, 우리는 바이러스성의 큰 인산화된 외피 단백질인 pp150을 언급해야만 하는데, 이는 HCMV에 대해 항체 양성인 것으로 알려진 혈청에 의해 가장 확실하게 검출되는 것으 로 나타났다. 상기 단백질과 엡스타인-바 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 및 헤르페스 단순 바이러스의 단백질들 간에 서열 상동성이 없는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 다른 바이러스 단백질들과의 교차 반응 위험이 감소되는 것으로 밝혀졌다.
HCMV 항원은 오랫동안 공지되어 왔으며 특히 다양한 방식으로 수득되는 항원 혼합물로서 입수할 수 있다. 예를 들어, 그레이저(Greijer)와 동료들(Greijer et al., J. Clin. Microbiol. 1999, 37:179-188)은 HCMV IgM의 특이적이고 매우 민감한 조기 검출을 위한 pp52(UL44) 및 pp150(UL32)으로부터 유도된 펩타이드들의 특정 조합을 보고한 반면, pp150(UL32), gB(UL55), 및 pp28(UL99)로부터의 펩타이드들의 조합은 HCMV IgG와 최적의 특이적인 반응성을 제공하는 것으로 선택되었다. 이들 펩타이드 조합에 의해 획득된 결과들을 근거로, 신규의 매우 특수한 혈청진단 분석이 고안되었다. 상기 분석은 비리온 항원-기재 ELISA의 "골드 스탠다드"를 사용하여 획득된 결과에 비해, IgG 및 IgM에 대해 각각 98.9 및 96.4%의 감도를 가졌다.
상기 연구의 결과로부터, 매우 한정된 합성 펩타이드의 특정 조합이 현행 혈청진단에 사용되는 복합 HCMV 비리온 추출물을 대체할 수 있다는 결론이 내려졌다.
최근 10년 동안, 여러 연구들이 HCMV 감염의 혈청학적 진단 및 치료학적 적용(예를 들어 백신)을 위한 재조합 항원의 용도를 보고하였다.
이들 항원은 모두 세균 및 포유동물 세포에서의 단백질 발현을 이용하는 분자 생물학 기법에 의해 획득됨이 강조되어야 한다. 상기 인용된 문헌들 중 어느 것도 병원체의 항원 단편을 획득하기 위해 람다 파지(파지 디스플레이) 중에서 HCMV의 게놈으로부터 유래하는 cDNA 단편의 발현/노출 라이브러리 기법을 개시하지 않는다.
국제 특허 출원 WO03/010198은 상기 람다 박테리오파지의 단백질 D(pD)의 아미노 말단 부분과의 분자 융합으로서 DNA 발현 및 단백질 노출의 벡터를 개시한다. λKM4라 불리는 상기 벡터는 외래 DNA 단편에 의해 암호화된 재조합 단백질이 상기 박테리오파지 자체의 단백질과의 융합 산물로서 발현되고 이어서 캡시드 상에서 노출된다는 점에서 발현 실험에 사용되는 것(예를 들어 λgt11을 참조하시오)과 다르다. 상기 접근법에 따르면, 상기 파지는 그의 개방 판독 프레임(ORF)이 pD와 일치하는 경우에만 상기 표면상에서 상기 단백질 단편을 노출한다. 상기 라이브러리에서 클로닝된 DNA 단편들의 크기는 200 내지 1000 뉴클레오타이드 염기 쌍(bp) 범위의 중간 크기 집단을 나타내도록 선택되며, 통계학적 이유로, 상기 프레임 외 서열의 대부분은 상기 파지의 표면상에서 번역 및 결과적으로 노출을 허용하지 않는 정지 코돈을 함유한다.
발명의 요약
본 발명에 이르러 상기 친화성 선택 및 파지 디스플레이 기법의 조합이, 특히 감염된 개인의 혈청 패널과 함께 HCMV DNA 단편의 파지 디스플레이 라이브러리 상에 친화성 선택을 적용함으로써 HCMV의 특이 항원 단편들을 동정하는 방법을 제공하는 것으로 밝혀졌다. DNA 단편은 상기 HCMV 바이러스의 게놈 DNA의 효소적 절단에 의해 수득된다. 상기 방법에 의해, 매우 큰 라이브러리(즉 다수의 상이한 서열들을 발현하는)로부터 항원 단편을 동정하는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 상 기와 같이 동정된 항원 단편을 진단 및 치료 목적에 사용할 수 있다. 또한, 재조합 키메릭 단백질 형태의 HCMV 단백질의 항원 부위의 조합은 상기 개별적인 항원 단편의 항원 성질을 보유하고 상기 조합이 사용되는 진단 분석의 수행성능을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 상기와 같이 생성된 상응하는 키메릭 단백질을 진단 및 치료 목적에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 감염된 개인으로부터의 혈청 패널과 함께 HCMV DNA 단편의 파지 디스플레이 라이브러리 상에 친화성 선택을 적용함으로써, HCMV 단백질의 항원 단편을 동정하는 방법이다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 공지된 HCMV 항원이 진단제로서의 용도에 유효함을 확인하고 또한 공지된 항원에서, 인간의 면역 반응을 촉발하는 에피토프를 동정하는 것을 가능하게 하고, 이 부분은 본 발명의 추가의 목적이며; 또한 앞서 알려지지 않은 HCMV 단백질의 항원 작용을 확인할 수 있게 하며; 마지막으로 본 발명에 따른 방법은 또한 본 발명의 더욱 또 다른 목적을 구성하는, HCMV 유전자 산물의 신규의 항원 단편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급한 방법에 의해 단리되고 특성화되며, 단일 재조합 단백질로서 사용되거나 또는 "항원 혼합물"로서 병용되거나, 또는 키메릭 항원으로부터 추가의 유전 공학에 의해 사용되는 항원 단편이다. 본 발명은 또한 상기 항원 부위 중에 함유된 에피토프로 확장된다.
진단제로서 상기 재조합 단백질(상기 항원 단편 및 상기 선택된 항원의 2 개 이상의 항원 부위들을 결합시켜 획득한 키메릭 항원)의 용도 및 예를 들어 효소 연 계된 면역분석 또는 키트 또는 다른 지지물의 형태로 상기 단백질을 함유하는 관련된 진단 보조제가 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.
제형의 제조를 위한 활성제로서, 및 특히 인간 감염의 예방 및 치유에 유용한 백신 형태의 상기 항원 단편 및 키메릭 항원의 용도는 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급한 항원 단편 및 키메릭 항원을 암호화하는 유전자 서열, 특히 HCMV 감염의 예방 및 치료를 위한 약제로서, 예를 들어 유전자 요법으로서의 그의 용도이다. 본 발명은 또한 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 상기 언급한 단편의 서열들과 하이브리드화하는 유전자 서열로 확장된다.
상기 및 다른 목적들은 또한 실시예 및 도면에 의해, 하기에 상세히 예시될 것이다.
본 발명의 주목적은 HCMV 유전자 산물의 재조합 항원 단편의 제공 및 HCMV 단백질의 상이한 항원 부위들의 융합을 통해 획득되는 재조합 키메릭 항원의 제공, 및 선택적인 진단 및 치료 수단을 개발하기 위한 상기와 같이 수득된 재조합 산물의 용도이다.
상기 보고된 바와 같은 문헌에 공지된 다른 유형의 항원 또는 항원 단편에 비해, 본 발명의 키메릭 항원 사용의 주요 이점은 하기와 같으며, 이는 상기 항원을 상기 감염의 검출을 위해 혈청 샘플을 사용하는 진단 면역분석에 사용할 때 자명하다:
-감염된 세포로부터 용해되고 완전한-세포 추출물로서 제조된, 전체 HCMV 항원의 용도에 대해서, 상기 재조합 키메릭 항원은 다른 비-바이러스성 물질의 존재로 인한 비특이적인 반응을 피하고 보다 양호한 복제 가능성을 제공하는 이점을 갖는다.
-HCMV 항원의 단일 항원 부위의 용도에 대해서, 상기 재조합 키메릭 항원은 상기 항원이 사용되는 분석의 감도를 개선시키는 이점을 보인다. 즉 그의 사용은 거짓 음성 반응의 발생을 감소시키거나 없앤다.
-단일 항원 부위의 혼합물 또는 수집물의 산업적인 적용성 및 생산에 대해서, 이점은 각각의 단일 단편을 별도로 생산하고 이를 후속적으로 경제적이고 재현 가능한 방법에 의해 조립하기보다는 3 개 이상의 항원 부위를 함유하는 단일의 가공 구조물을 생산하는 것이 훨씬 더 용이하다는 것이다.
상기 및 다른 이점들을 실시예 부분에 나타낸다.
본 발명은 HCMV DNA로부터 제조된 DNA 단편의 발현/노출 라이브러리의 제작, HCMV에 의해 감염된 환자의 혈청에 의한 상기와 같은 라이브러리의 선택, 상기 항원 단편의 특성화, 및 선택적인 진단 및 치료 수단의 개발을 위한 상기 단편의 용도를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게는 친화성 선택과 파지 디스플레이의 능력을 겸비한다. 파지 디스플레이가 의미하는 것은, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 작은 단백질 도메인들이 상응하는 유전 정보를 함유하는 박테리오파지의 표면상에 노출되어 있는 발현/노출 라이브러리의 선택에 근거한 전략이다. 병원성 미생물로부터 유래하는 DNA를 사용하여 제작한, 파지-디스플레이 유형의 라이브러리는 친화성 선택의 이용을 가능하게 하며, 상기 선택은 특정 혈청(상기 병원체와 반응성인)을, 캡시드 상에서 상기 병원체의 단백질 부분을 발현하고 상응하는 유전 정보를 함유하는 박테리오파지의 수거물과 함께 배양함을 기본으로 한다. 상기 혈청 중에 존재하는 항체와 특이적으로 결합하는 박테리오파지는 쉽게 회수되며, 고체 지지체(예를 들어 자기 비드)에 결합된 채로(항체 자체에 의해) 남아있고; 대조적으로 비특이적인 것들은 씻겨나간다. 직접 선별, 즉 주어진 혈청의 항체에 결합하는 단일 파지 클론의 능력에 대한 분석을 말기 단계에서만 수행하며, 이때 상기 라이브러리의 복잡성(즉 상이한 서열 수)이, 엄밀하게는 상기 선택의 결과로서 실질적으로 감소한다.
특히 본 발명은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 및 그의 혼합물로 이루어진 인간 거대세포바이러스(HCMV) 항원을 포함한다.
또 다른 실시태양에 따라 본 발명은 HCMV 단백질의 3 개 이상의 상이한 항원 부위들의 융합을 함유하는 키메릭 재조합 항원을 포함하며, 여기에서 상기 항원 부위는 HCMV-특이 항체에 결합하는 B-세포 에피토프이고; 바람직하게는 상기 HCMV-특이 항체는 HCMV에 감염된 환자의 혈청으로부터 추출된다.
바람직하게는 본 발명의 키메릭 항원에서, 상기 3 개의 상이한 항원 부위는 공유 결합 또는 펩타이드 링커에 의해 결합되며; 보다 바람직하게 상기 3 개의 상이한 항원 부위 각각은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 특정 실시태양에 따라 상기 키메릭 항원은 서열식별번호: 16의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
"폴리펩타이드"란 용어는 4 개 이상의 연속된 아미노산, 대개 20 내지 500 개의 연속된 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 쇄에 통상적으로 적용된다.
본 발명에 언급된 "에피토프"란 용어는 T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체 또는 항체에 의해 인식되고 결합되는 항원 분자의 부분(즉 항체를 생산할 수 있고 상기 항체가 결합하게 되는 큰 분자 상의 결정인자)에 관한 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 용어는 천연 분자 또는 천연 항원 결정인자를 모방할 수 있는 합성 분자의 항원 결정인자를 포함하고자 한다.
상기 천연 항원 결정인자를 모방하는 분자를 또한 "미모토프(mimotope)"라 칭할 수 있으며, 상기 용어를 항원의 1 차 서열의 인접된 구획에 의해 형성되지 않는 에피토프와 관련하여 호환적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 에피토프는 9 내지 40 아미노산 길이의 폴리펩타이드 쇄이다.
본 발명에 사용된 "항원 단편" 또는 "항원 부위"란 용어는 에피토프를 함유하는 항원 분자의 부위에 관한 것이다.
본 발명에 따라 항원 단편은 약 50 내지 약 500 아미노산 길이, 바람직하게는 100 내지 200 아미노산 길이의 폴리펩타이드 쇄이다.
본 발명에 사용된 "키메릭 구조물" 또는 "융합된 구조물"이란 용어는 이전에 정의된 아미노산 서열들 중 하나 이상을 함유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서 상기 폴리펩타이드는 본 발명의 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열과, HCMV 유전자 산물의 면역우세 에피토프를 함유하고 세균 세포에서 유전자 발현 및 복제에 필요한 필수 핵산 서열을 또한 함유하는 다른 항원 단편을 결합시킴으로써 생산된 핵산 서열에 의해 암호화된다.
우선적으로는, 상기 다른 항원 단편을 본 발명에 개시된 항원 단편과 같은 HCMV의 파지-디스플레이 라이브러리 및/또는 문헌에 공지된 HCMV의 항원 부위들로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 키메릭 항원을 공지된 방법을 사용하여 가공할 수 있다. 상기 융합은 직접적이거나(하나의 아미노산 서열의 C-말단이 단일 공유 결합을 통해 다른 것의 N-말단에 결합된다) 또는 가요성 링커 도메인, 예를 들어 인간 IgG의 경첩 부위, 또는 다양한 길이 및 조합의 작은 아미노산들, 예를 들어 글리신, 세린, 쓰레오닌 또는 알라닌으로 이루어진 폴리펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 링커는 일정 간격으로 세린 또는 쓰레오닌에 의해 중단된 폴리글리신 반복부일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 3 개의 글리신 잔기 및 2 개의 세린 잔기에 의해 구성되어, 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SGGGS 링커)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 정의한 바와 같은 키메릭 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15 및 서열식별번호: 16으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 3 개 이상의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
엄격한 하이브리드화 조건 하에서 상기 언급한 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 하나와 함께 청구항 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 임의의 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열이 또한 상기에 의해 암호화된 키메릭 재조합 항원과 함께 본 발명의 범위 내에 포함된다.
바람직하게는 상기 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열이다.
본 발명의 재조합 항원을 적합한 발현 벡터를 사용하여, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 클로닝 및 발현에 의해 제조할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 항원을 암호화하는 DNA 분자를 당해 분야에 널리 공지된 기법(문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory maunal, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]을 참조하시오)에 의해 적합하게 제작된 발현 벡터에 삽입한다. 상기와 같은 벡터들은 본 발명의 또 다른 목적이다.
목적하는 단백질(이 경우 항원 단편 및 키메릭 항원)을 발현할 수 있기 위해서, 발현 벡터는 상기 단백질의 유전자 발현 및 생산을 허용하는 방식으로 상기 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA에 결합된 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 특정한 뉴클레오타이드 서열을 포함해야 한다. 먼저 상기 유전자를 전사하기 위해서, RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 프로모터가 선행되어야 하며, 상기 프로모터에 폴리머라제가 결합하고 따라서 상기 전사 과정이 개시된다. 상이한 효율(강한 프로모터 및 약한 프로모터)로 작용하는, 다양한 상기와 같은 프로모터들이 사용 중에 있다.
진핵 숙주의 경우, 상기 숙주의 성질에 따라 상이한 전사 및 번역 조절 서열들을 사용할 수 있다. 상기 숙주는 바이러스 공급원, 예를 들어 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유래할 수 있으며, 이때 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특정 유전자와 관련이 있다. 예로서 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이 있다. 억제 및 활성화를 허용하는 전사 개시 조절 신호를 선택할 수 있으며, 따라서 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 숙주들은 모두 본 발명의 추가의 목적이다.
본 발명의 재조합 항원을 암호화하는 핵산 분자를, 결합된 핵산 분자가 융합 단백질을 암호화하도록 이종 서열에 연결시킬 수 있다. 상기와 같이 결합된 핵산 분자들은 본 발명의 실시태양 내에 포함된다. 예를 들어, 상기 분자들을, 친화성 크로마토그래피의 오직 한 단계에 의해서만 상기 재조합 항원의 정제를 허용하는 단백질을 암호화하는 DNA에 결합시킬 수 있다. 상기 결합/융합된 단백질은 예를 들어 글루타치온 설포 트랜스퍼라제(GST) 단백질의 카복시 말단에 융합 산물을 생성시키는 GST일 수 있다. 형질전환된 이 콜라이 세포의 세포질에서 발현된 상응하는 재조합 단백질을 글루타치온-세파로스 수지를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 한편으로, 상기 결합/융합된 단백질은 상기 재조합 단백질의 카복시 말단 또는 아미노 말단 중 어느 하나에 융합 산물을 생성시키는 폴리히스티딘 표지(또한 His-표지로서 공지됨)일 수 있다. 형질전환된 이 콜라이 세포의 세포질에서 발현된 상응하는 재조합 단백질을 니켈-킬레이트 친화성-크로마토그래피(예를 들어 Qiagen, USA로부터의 Ni-NTA 수지)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 항원 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 작용적으로 결합된 전사 및 번역 조절 신호를 갖는 벡터(들)(상기 숙주 세포에서 목적하는 유전자 서열을 복제할 수 있다)에 삽입시킨다. 상기 도입된 DNA에 의해 안정하게 형질전환된 세포를, 또한 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입시킴으로써 선택할 수 있다. 상기 마커는 또한 영양요구성 숙주에 광영양성, 살생물제 내성, 예를 들어 항생제, 또는 중금속, 예를 들어 구리 등을 제공할 수 있다. 상기 선택성 마커 유전자는 발현시킬 DNA 유전자 서열에 직접 결합되거나 또는 동시 형질감염에 의해 동일 세포에 도입될 수 있다. 추가적인 요소들이 또한 본 발명 단백질의 최적 합성에 필요할 수도 있다.
특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 중요한 인자는 상기 벡터를 함유하는 수용 세포를 인식할 수 있고 상기 벡터를 함유하지 않는 수용 세포들로부터 선택할 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 목적하는 벡터의 사본 수; 및 상이한 종들의 숙주 세포들 사이를 상기 벡터가 "왕복"할 수 있는 것이 바람직한 가의 여부를 포함한다.
일단 상기 구조물(들)을 함유하는 벡터(들) 또는 DNA 서열을 발현을 위해 제조하였으면, 상기 DNA 구조물(들)을 다양한 적합한 수단들 중 어느 하나, 즉 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 칼슘 포스페이트-침전, 직접 미세주입 등에 의해 적합한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.
숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 진핵 숙주의 예는 포유동물 세포, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 상기 숙주 세포에서의 발현은 단백질 분자에 대한 번역 후 변경, 예를 들어 정확한 부위에서의 정확한 폴딩 또는 글리코실화를 제공한다. 또한 효모 세포는 글리코실화를 포함한 번역 후 펩타이드 변경을 수행할 수 있다. 강한 프로모터 서열, 및 효모에서 목적하는 단백질의 생산에 이용될 수 있는 높은 사본 수의 플라스미드를 사용하는 다수의 재조합 DNA 전략이 존재한다.
효모는 클로닝된 포유동물 유전자 산물 상에서 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 갖는 펩타이드(프리-펩타이드)를 분비한다. 원핵 숙주의 예는 세균, 예를 들어 에스케리키아 콜라이이다.
벡터(들)의 도입 후, 상기 숙제 세포를 선택성 배지(벡터 함유 세포의 성장을 위해 선택한다)에서 증식시킨다.
상기 클로닝된 유전자 서열(들)의 발현 결과 목적하는 단백질이 생산된다.
상기 재조합 항원의 정제를 상기 목적으로 공지된 방법들 중 어느 하나, 즉 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 등을 수반하는 임의의 통상적인 과정에 의해 수행한다. 본 발명 항원의 정제에 바람직하게 사용될 수 있는 추가의 정제 과정은 표적 단백질에 결합하고 컬럼 내에 함유된 젤 기질 상에 생성되고 고정화되는 단클론 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피이다. 상기 재조합 단백질을 함유하는 불순한 제제를 상기 컬럼에 통과시킨다. 항원들은 상기 특이 항체에 의해 상기 컬럼에 결합하게 되는 반면 불순물은 통과할 것이다. 세척 후, 상기 항원을 pH 또는 이온 강도의 변화에 의해 상기 젤로부터 용출시킨다.
본 발명의 또 다른 태양은 상술한 바와 같은 재조합 항원의 제조 방법이며, 상기 방법은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하고 목적하는 생성물을 단리함을 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열뿐만 아니라 상기와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자이다.
"실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열"은 유전자 암호의 변성 덕분에 주어진 아미노산 서열을 또한 암호화하는 모든 다른 핵산 서열들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 수득된 항원이 동일한 생물 활성, 즉 기생충에 대한 항체에 결합하는 능력을 유지하는 한, 매우 엄격한 또는 보통으로 엄격한 조건 하에서 본 발명의 항원 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 상보물에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "하이브리드화"란 용어는 2 개의 핵산 분자가 수소 결합에 의해 서로 회합함을 지칭한다. 전형적으로, 하나의 분자는 고체 지지체에 고정될 것이고 다른 것은 용액 중에서 자유로울 것이다.
이어서, 상기 두 분자는 수소 결합에 유리한 조건 하에서 서로 접촉하여 놓일 수 있다. 상기 결합에 영향을 미치는 인자로는 용매의 유형 및 부피; 반응 온도; 하이브리드화 시간; 교반; 고체 지지체에 대한 액체 상 분자의 비특이적 부착을 차단하는 작용제(덴하르트 시약 또는 BLOTTO); 분자의 농도; 분자의 해리 속도를 증가시키는 화합물의 사용(덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 하이브리드화에 이은 세척 조건의 엄격성이 있다.
엄격성 조건은 하이브리드화 실험에 사용되는 온도, 1가 양이온의 몰 농도 및 하이브리드화 용액 중의 폼아미드의 퍼센트의 함수이다. 임의의 주어진 조건 세트와 관련된 엄격성의 정도를 측정하기 위해서, 먼저 DNA-DNA 하이브리드의 용융 온도 Tm으로서 나타내는 100% 일치성의 하이브리드의 안정성을 측정하기 위해 메인코트 등(Meinkoth et al. 1984)의 식을 사용한다: Tm = 81.5 ℃ + 16.6(LogM) + 0.41(%GC) - 0.61(% 폼) - 500/L(여기에서 M은 1가 양이온의 몰 농도이고, %GC는 DNA 중의 G 및 C 뉴클레오타이드의 퍼센트이고, % 폼은 하이브리드화 용액 중의 폼아미드의 퍼센트이고; L은 염기쌍의 하이브리드 길이이다). 상기 Tm이 100% 일치성 하이브리드에 대해 계산된 경우로부터 감소되는 매 1 ℃에 대해서, 허용되는 불합치의 양은 약 1%씩 증가한다. 따라서, 소정의 염 및 폼아미드 농도에서 임의의 주어진 하이브리드화 실험에 사용된 Tm이 메인코트의 식에 따라 100% 하이브리드에 대해 계산된 Tm 보다 10 ℃ 아래인 경우, 약 10%까지 불합치가 존재한다 하더라도 하이브리드화가 일어날 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 매우 엄격한 조건은 약 15%까지의 서열 일탈을 묵인하는 조건인 반면, 보통으로 엄격한 조건은 약 20%까지의 서열 일탈을 묵인하는 조건이다. 비 제한적으로, 매우 엄격한(하이브리드의 계산된 Tm의 12 내지 15 ℃ 이하) 및 보통으로 엄격한(하이브리드의 계산된 Tm의 15 내지 20 ℃ 이하) 조건은 하이브리드의 계산된 Tm 이하의 적합한 온도에서 2 x SSC(표준 염수 시트레이트) 및 0.5% SDS의 세척 용액을 사용한다. 상기 조건의 최종적인 엄격성은 주로, 특히 사용된 하이브리드화 조건이 안정한 하이브리드와 함께 덜 안정한 하이브리드의 형성을 허용하는 조건인 경우 상기 세척 조건에 기인한다. 이어서 보다 높은 엄격성에서의 세척 조건은 상기 덜 안정한 하이브리드를 제거한다. 상술한 매우 엄격한 내지 보통으로 엄격한 세척 조건과 함께 사용될 수 있는 통상적인 하이브리드화 조건은 6 x SSC(또는 6 x SSPE), 5 x 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/㎖의 변성된, 단편화된 연어 정자 DNA의 용액 중에서 상기 Tm의 대략 20 내지 25 ℃ 이하 온도에서의 하이브리드화이다. 혼합된 탐침을 사용하는 경우, SSC 대신에 테트라메틸 암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, 1987-1998).
"핵산 분자"란 용어는 또한 DNA 및 RNA의 동족체, 예를 들어 변경된 주쇄를 함유하는 것들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양은 약제로서 상술한 키메릭 항원의 용도이다. 특히, 본 발명의 주목적들 중 하나는 HCMV 감염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 활성 성분으로서 키메릭 항원의 용도이다. 상기 약학 조성물은 바람직하게는 치료 유효량의 본 발명의 키메릭 항원 또는 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함해야 한다. 따라서 본 발명의 키메릭 항원은 HCMV 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 작용할 수 있다. 치료 용도를 위해서, 약제 또는 백신의 제조가 추가의 참조를 위한 일반적인 지식의 틀 내에 있는 경우, 독자는 본 설명에 인용된 특허 문헌을 다시 참조한다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양에 따라, 폴리펩타이드 백신을 제공한다. 2 가지 주요 유형의 폴리펩타이드 백신은 항원증강제 물질과 혼합된 폴리펩타이드 및 항원 제공 세포(APC)와 함께 도입되는 폴리펩타이드이다(Mayordomo et al. 1995, Nature Med. 1:1297).
상기 후자 유형의 백신에 사용되는 가장 통상적인 세포는 골수 및 말초 혈액 유래된 수지상 세포인데, 그 이유는 이들 세포가 CTL의 활성화를 돕는 동시 자극 분자를 발현하기 때문이다. 상기 폴리펩타이드의 제공은 상기 APC를, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 DNA, RNA)와 함께 부하하거나 또는 상기 APC를 폴리펩타이드 자체와 함께 부하함으로써 수행될 수 있다.
상기 첫 번째 유형의 폴리펩타이드 백신에 따라, 면역원성을 자극하는 항원증강제 물질을 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 개선하기 위해 상기 폴리펩타이드와 혼합한다. 면역학적 항원증강제는 일반적으로 2 개의 기본적인 유형, 즉 알루미늄 염과 오일 유화액으로 분류된다. 알루미늄 포스페이트 및 하이드록사이드(알룸) 항원증강제는 상응하는 수성 백신에 의해 수득되는 수준 이상으로 알룸-기재 백신에서 항원에 대한 상승된 수준의 항체를 유도한다. 다수의 알룸 기재 백신들이 그의 제조 방법을 포함하여, 예를 들어 미국 특허 제 5,747,653, 6,013,264, 6,306,404 및 6,372,223 호에 개시된 바와 같이 개발되었다. 그러나, 알루미늄 화합물이 항상 백신의 면역원성을 향상시킨 것은 아니다.
상기 오일 기재 항원증강제의 주성분은 오일, 유화제 및 면역자극제이다. 유화된 오일 기재 항원증강제의 가장 초기 유형은 대략 50:50 유중 수적형 유화액으로 이루어진 불완전 프로인트 항원증강제(IFA), 및 죽은 마이코박테리아를 포함하는 유사 제제인 완전 프로인트 항원증강제(CFA)이다. 상기 CFA의 강력한 항체-자극 효과는 어떤 다른 항원증강제도 능가하지 못했다.
그러나, 심각한 독성 반응으로 인해 CFA는 오직 실험 목적으로만 사용될 수 있으며 인간이나 가축 치료 백신에 사용될 수 없다. 인간에서 IFA의 사용은 수성 백신이 비교적 무력하고 알루미늄 화합물이 충분한 항원증감 활성을 제공하지 못한 임상적 상황들로 제한되었다. 항원의 면역원성 증강에 의한, 백신 항원증강제로서 개선된 유화액의 예로는 미국 특허 제 5,961,970 호에 개시된 바와 같은 서브마이크론 유화액 및 미국 특허 제 5,716,637 호에 개시된 바와 같은 고체 지방 나노유화액이 있다.
본 발명 폴리펩타이드의 흡수를 다수의 방법에 의해 촉진할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,554,378 호에 개시된 바와 같이 콜레라 독소 B 서브유닛, 또는 장독성 에스케리키아 콜라이의 열-불안정한 장독소의 구조적으로 관련된 서브유닛 B의 비-독성 유도체를 상기 조성물에 첨가할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 조성물을 개인의 면역을 위해 상기 개인에 직접 투여할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 실시태양에 따라, 상기 폴리펩타이드를 사용하여 공지된 단클론 항체의 특성 및 활성을 갖는 신규 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 폴리펩타이드에 의한 T-세포의 생체 외 활성화는 또한 목적하는 면역자극의 활성을 유도해낼 수 있다. 따라서, 상기 조성물을 생체 외 시스템에서 항체를 유도하는데 사용할 수 있으며 이어서 상기 유도된 항체를 감염의 치료를 위해 개인에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 또한 당해 분야에 개시된 바와 같이, 생체 외 시스템에 사용하여 채택된 면역요법의 과정에서 투여되는 T-세포를 자극할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "치료 유효량"이란 용어는 표적 질병 또는 증상을 치료, 개선 또는 예방하거나, 또는 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 화합물에 대해서, 치료 유효 용량을, 예를 들어 종양 세포의 세포 배양 분석에서, 또는 동물 모델, 대개는 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 초기에 추정할 수 있다.
상기 동물 모델을 또한 적합한 투여 농도 범위 및 경로를 결정하는데 사용할 수 있다. 이어서 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에 유용한 투여 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
인간 환자에 정확한 유효량은 질병 상태의 중증도, 환자의 일반적인 건강, 연령, 체중 및 환자의 성별, 식이요법, 투여 시간 및 회수, 약물 조합(들), 반응 감도, 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 변할 것이다. 상기 량을 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있으며 이는 의사의 판단 내에 있다. 조성물을 환자에게 개별적으로 투여하거나 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께 투여할 수 있다.
약학 조성물은 또한 치료제의 투여를 위한 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 상기와 같은 담체는, 상기 담체 자체가 상기 조성물을 수용하는 개인에게 유해한 항체의 생산을 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 한, 항체 및 다른 폴리펩타이드, 유전자 및 다른 치료제, 예를 들어 리포솜을 포함한다. 적합한 담체는 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
치료 조성물 중의 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 상기와 같은 조성물 중에 존재할 수 있다. 상기와 같은 담체는 상기 약학 조성물을 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다.
일단 제형화되었으면, 본 발명의 조성물을 환자에게 직접 투여할 수 있다. 치료되는 환자는 동물일 수 있으며; 특히 인간 환자를 치료할 수 있다.
본 발명에 사용되는 약학 조성물을 다수의 경로, 예를 들어 비 제한적으로 경구, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심실 내, 경피 또는 피부통과 적용(예를 들어 WO98/20734 참조), 피하, 복강 내, 비 내, 장, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 수단에 의해 투여할 수 있다. 유전자 건 또는 하이포스프레이를 또한 사용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다. 전형적으로, 상기 치료 조성물을 주사가능 물질로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조할 수 있으며; 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 투여 치료는 단일 용량 스케줄 또는 수회 용량 스케줄일 수 있다.
치료 유효량의 상술한 바와 같은 백신을 투여함을 포함하는, HCMV 감염을 앓고 있는 포유동물의 치료 방법은 본 발명의 태양들 중 하나를 나타낸다.
본 발명의 추가의 목적은 HCMV 감염의 진단, 특히 감염 시기의 진단을 위한 활성제로서 상술한 바와 같은 재조합 항원의 용도이다.
또한 본 발명에 따른 하나 이상의 항원 단편 또는 항원 단편들 또는 키메릭 항원들의 조합을 함유하는, HCMV 감염 진단용 키트는 본 발명의 일부이다. 상기와 같은 키트는 급성 및/또는 잠복성 HCMV 감염의 진단에 유용할 수 있다.
본 발명의 재조합 항원을 실질적으로 항체 검출을 위해 공지된 항원을 사용하는 임의의 분석 포맷으로 사용할 수 있다. 상기 분석 모두의 공통적인 특징은 상기 항원을, 상기 항원이 신체 성분 중에 존재하는 임의의 항체에 결합하도록 하는 조건 하에서 상기와 같은 항체를 함유하는 것으로 의심이 가는 상기 성분과 접촉시킨다는 것이다. 상기와 같은 조건은 전형적으로는 생리적 온도, pH 및 과잉의 항원을 사용하는 이온 강도일 것이다. 상기 항원과 시편과의 배양에 이어서 상기 항원을 포함하는 면역 복합체를 검출한다.
면역분석의 디자인은 상당히 다양해야 하며, 다수의 포맷들이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 프로토콜들은 고체 지지체, 또는 면역침전을 사용할 수 있다. 대부분의 분석은 표지된 항체 또는 폴리펩타이드의 사용을 포함하며; 상기 표지는 예를 들어 효소, 형광, 화학발광, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다. 상기 면역 복합체로부터의 신호를 증폭시키는 분석이 또한 공지되어 있으며; 이의 예는 비오틴 및 아비딘을 사용하는 분석, 및 효소 표지되고 매개된 면역분석, 예를 들어 ELISA 분석이다.
상기 면역분석은 비 제한적으로 이종 또는 동종 포맷일 수 있으며, 표준 또는 경쟁적인 유형의 것일 수 있다. 이종 포맷에서, 상기 폴리펩타이드를 전형적으로는 고체 기질 또는 지지체에 결합시켜 배양 후 상기 폴리펩타이드로부터 샘플의 분리를 촉진한다.
사용될 수 있는 고체 지지체의 예는 나이트로셀룰로스(예를 들어 멤브레인 또는 미세적정 웰 형태로), 폴리비닐 클로라이드(예를 들어 시트 또는 미세적정 웰로), 폴리스타이렌 라텍스(예를 들어 비드 또는 미세적정 플레이트로), 폴리비닐리덴 플루오라이드(임뮬론(Immulon)TM으로서 공지됨), 다이아조화된 페이퍼, 나일론 멤브레인, 활성화된 비드 및 단백질 A 비드이다. 예를 들어, 다이나테크(Dynatech) 임뮬론TM1 또는 임뮬론TM2 미세적정 플레이트 또는 0.25 인치 폴리스타이렌 비드(Precision Plastic Ball)를 상기 이종 포맷에 사용할 수 있다. 상기 항원 폴리펩타이드를 함유하는 고체 지지체를 전형적으로는, 상기 지지체를 시험 샘플로부터 분리시킨 후, 및 결합된 항체의 검출 전에 세척한다. 표준 및 경쟁 포맷 모두 당해 분야에 공지되어 있다.
동종 포맷에서, 상기 시험 샘플을 용액 중의 항원들의 조합과 함께 배양한다. 예를 들어, 상기 샘플을 형성되는 임의의 항원-항체 복합체를 침전시키는 조건 하에 둘 수 있다. 상기 분석을 위한 표준 및 경쟁 포맷은 모두 당해 분야에 공지되어 있다.
표준 포맷에서, 상기 항체-항원 복합체를 형성하는 항체의 양을 직접 모니터한다. 이는 항-HCMV 항체 상의 에피토프를 인식하는 표지된 항-이종(예를 들어 항-인간) 항체가 복합체 형성으로 인해 결합할 것인지의 여부를 측정함으로써 성취될 수 있다. 경쟁 포맷에서, 상기 샘플 중의 항체의 양은 상기 복합체 중의 기지 량의 표지된 항체(또는 다른 경쟁 리간드)의 결합에 대한 경쟁 효과를 모니터함으로써 추론된다.
항-HCMV 항체를 포함하는 형성된 복합체(또는 경쟁 분석의 경우, 경쟁 항체의 양)를 상기 포맷에 따라 다수의 공지된 기법들 중 어느 하나에 의해 검출한다. 예를 들어, 상기 복합체 중의 표지되지 않은 항체를 표지(예를 들어 효소 표지)와 착화된 항-이종 IgG의 접합체를 사용하여 검출할 수 있다.
면역침전 또는 응집 분석 포맷에서 재조합 항원과 항체 간의 반응은 용액 또는 현탁액으로부터 침전하는 네트워크를 형성하고 침전물의 가시적인 층 또는 필름을 형성한다. 항-HCMV 항체가 상기 시험 시편 중에 존재하지 않는 경우, 가시적인 침전물은 형성되지 않는다.
본 발명의 재조합 항원을 전형적으로는 상기 면역분석에 사용하기 위한 키트의 형태로 패키징할 것이다. 상기 키트는 통상적으로 별도의 용기 중에 항원(고체 기질에 이미 결합되거나 또는 상기 항원을 상기 기질에 결합시키기 위한 시약과 별도로), 대조용 항체 제형(양성 및/또는 음성), 상기 분석 포맷이 동일한 신호 발생 시약(예를 들어 효소 기질)을 필요로 할 때 상기 표지가 신호를 직접 발생시키지 않는 경우 표지된 항체의 조합을 함유할 것이다. 상기 분석을 수행하기 위한 설명서(예를 들어 서면, 테이프, VCR, CD-ROM, 등)가 대개는 상기 키트 중에 포함될 것이다.
따라서 본 발명의 목적인 상기 진단 키트는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이제 본 발명을 실시예 및 도면에 의해 보다 상세히 예시할 것이다.
도 1은 세균 발현 벡터 pGEX-SN-Flag의 플라스미드 지도이다.
도 2는 선택된 파지 클론의 도식적인 표현이다. 상응하는 고유 단백질의 서열과 함께 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 재조합 HCMV 항원 단편들의 정렬을 나타낸다. 상기 도면은 각 클론의 상응하는 아미노산 및 HCMV 단백질 서열 상의 그들의 위치를 나타낸다.
도 3은 재조합 키메릭 항원의 도식적 표현이다. HCMV 유전자 산물의 단백질 단편을 암호화하는, 클론 CM-4.4, CM-2.7, CM-1.3, CM-2.10, CM-3.3 및 CM-8.3의 DNA 서열을 GST-EC7-Flag, GST-EC8-Flag 및 GST-EC14 융합 단백질의 제작에 사용하 였다.
도 4는 이 콜라이 세포에서 재조합 항원의 발현이다.
A - 정제된 재조합 GST(레인 2), GST-CM1.3(레인 3), GST-CM2.7(레인 4), GST-CM4.4(레인 5), GST-CM2.10(레인 6), GST-CM3.3(레인 7), GST-CM7.3(레인 8) 및 GST-CM8.3(레인 9) 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 상기 재조합 단백질에 12% 아크릴아미드 젤 상에서 전기영동(0.002 ㎎/레인)을 가하였다. KDa, 분자량 마커(레인 1).
B - 정제된 재조합 GST(레인 2) 및 키메릭 항원 GST-EC7-Flag(레인 3) 및 GST-EC8-Flag(레인 4)의 SDS-PAGE 분석(12% 아크릴아미드 젤)을 나타낸다. KDa, 분자량 마커(레인 1).
C - 항-Flag 홀스-래디쉬 퍼옥시다제-접합된 단클론 항체를 사용하는 정제된 재조합 GST(레인 1) 및 키메릭 항원 GST-EC7-Flag(레인 2) 및 GST-EC8-Flag(레인 3)의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다.
람다 -디스플레이 HCMV DNA 라이브러리의 제작
HCMV(AD169 균주)로부터의 게놈 DNA를 상업적으로 입수하였다(Advanced Biotechnology, MD, USA). 10 ㎍의 총 DNA를 0.5 ng의 엔도뉴클레아제 DNasel(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 랜덤하게 단편화하였다. DNA와 DNasel의 혼합물을 15 ℃에서 20 분간 배양하고 상기 DNA 단편을 제조사의 설명에 따라 "퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하였다. 상기 DNA 단편의 단부를, 상기 DNA를 효소 T4 DNA 폴리머라제(New England Biolabs, MA, USA)와 함께 60 분간 15 ℃에서 배양함으로써 "편평화"시켰다. 이어서 상기 단편을 페놀/클로로폼 중에서 추출에 의해 정제하고 후속적으로 에탄올 중에서 침전시켰다. 생성되는 DNA를 상기 단편의 단부에 제한 부위 Spel 및 Notl을 첨가할 목적으로 효소 T4 DNA 리가제를 사용하여 20 배 몰 과잉의 "합성 어댑터"와 연결시켰다. 6 개의 어댑터를 앞서 문헌[Beghetto et al., Int. J. Parasitol. 2003, 33:163-173]에 개시된 과정에 따라 사용하였다. 연결되지 않은 과잉의 어댑터를 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동에 의해 상기 연결 혼합물로부터 제거하였으며 200 bp 내지 1000 염기쌍(bp) 범위의 분자량을 갖는 DNA 단편을 상기 젤로부터 절제하고 제조사의 설명에 따라 "퀴아퀵 젤 추출 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하였다. 벡터 λKM4를 SpeI/Notl 로 절단하고 이어서 DNA 단편과 연결시켰다. 상기 라이브러리의 제작을 위해서 각각 0.4 ㎍의 벡터 및 대략 7 ng의 삽입물을 함유하는 6 개의 연결 혼합물을 사용하여 수행하였다. 4 ℃에서 효소 T4 DNA 리가제와 함께 밤새 배양 후, 상기 연결 혼합물을 시험관 내에서 "기가팩 골드(Gigapack gold)"(Stratagene, USA)와 함께 패키징하고 BB4 세포(이 콜로이 균주 BB4의 세균 세포; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)의 감염을 위해 도말하였다. 37 ℃에서 밤새 배양 후, 상기 파지를 SM 완충제(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)와 함께 상기 플레이트로부터 용출시키고, 정제하고 농축시키고 7% 다이메틸설폭사이드를 함유하는 SM 완충제 중에서 -80 ℃에서 보관하였다. 삽입물과 함께 전체 독립적인 클론의 수로서 계산된 라이브러리의 복잡성은 2 x 106 클론이었다.
인간 혈청에 의한 HCMV 디스플레이 라이브러리의 친화성 선택
단백질 G(Dynabeads Protein-G, Dynal, Norway)로 코팅된 자기 비드를 실온에서 30 분간 10 ㎕의 인간 혈청과 함께 배양하였다. 이어서 상기 비드를 PBS 중의 5% 탈지 분유, 0.05% 트윈 20, 및 10 mM MgSO4로 이루어진 차단 용액과 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 라이브러리의 대략 1010 파지 입자를 상기 비드에 가하고 약하게 교반하면서 실온에서 추가로 4 시간 배양하기 위해 차단 용액 1 ㎖에 희석하였다. 상기 비드를 1 ㎖의 세척 용액(PBS, 1% 트리톤x100, 10 mM MgSO4)으로 10 회 세척하였다. 결합된 박테리오파지를 상기 비드에 직접 첨가된 BB4 세포(1.2 ㎖/선택)의 감염을 위해서 증폭시키고 후속적으로 실온에서 30 분간 배양하였다. NZY-Top 아가(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)를 상기 비드의 혼합물에 가하고 세포를 NZY 플레이트 상에 바로 부었다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 배양하였다. 다음 날 상기 파지를 플레이트당 15 ㎖의 SM 완충제의 첨가에 의해 상기 플레이트로부터 모으고 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 상기 파지를 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌 글리콜, NaCl 1M)에 침전시켜 정제하고 최종적으로 SM 5 ㎖ 중에 현탁시키고 +4 ℃에서 보관하였다.
파지- ELISA
다중 웰 플레이트(Maxisorb, Nunc, Denmark)를 4 ℃에서 항-람다 다클론 항체(NaHCO3 중의 0.7 ㎍/㎖, 50 mM, pH 9.6)로 밤새 코팅하였다. 상기 코팅 용액의 제거 후, 상기 플레이트를 차단 용액(PBS 중의 5% 탈지 분유, 0.05% 트윈-20)과 함께 1 시간 동안 배양하고 이어서 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20)로 2 회 세척하였다. 파지 용해물을 함유하는 차단 용액 100 ㎕의 혼합물을 각 웰에 가하고 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 1 ㎕의 인간 혈청을 100 ㎕의 차단 용액 중의 109 야생형 파지 입자, 1 ㎕의 토끼 혈청, 1 ㎕의 BB4 세포의 세균 추출물, 1 ㎕의 소 태아 혈청과 함께 실온에서 30 분간 배양하였다. 상기 플레이트를 파지 용해물과 배양 후 5 회 세척하고 이어서 37 ℃에서 60 분간 상기 혈청 용액과 함께 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 5 회 세척하고 이어서 항-인간 IgG 홀스-래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항체(Sigma-Aldrich, USA)를 함유하는 차단 용액과 함께 30 분간 배양하였다. 상기 플레이트를 5 회 세척하고 효소 활성을 100 ㎕의 TMB 액체 기질(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 측정하였다. 15 분의 전개 후에, 25 ㎕의 2M H2SO4를 가하여 반응을 정지시켰다. 마지막으로, 상기 플레이트를 자동 ELISA 판독기(Multiskan, Labsystem, Finland)를 사용하여 분석하고 결과를 OD=OD450 ㎚-OD620 ㎚로서 나타내었다. 상기 ELISA 데이터를 2 개의 독립적인 분석의 평균값으로서 평가하였다.
면역선별
파지 플라크를 실온에서 60 분간 배양에 의해 세균 배지로부터 나이트로셀룰 로스 필터(Schleicher & Schuell, Germany)로 옮겼다. 상기 필터를 차단 용액(PBS 중 5% 전지 분유, 0.05% 트윈-20) 중에서 실온에서 60 분간 차단시켰다. 40 ㎕의 인간 혈청을 차단 용액 4 ㎖ 중의 40 ㎕의 BB4 세포의 세균 추출물, 109 야생형 람다 파지 입자와 함께 예비 배양하였다. 상기 차단 용액의 제거 후에, 상기 필터를 실온에서 교반 하에 3 시간 동안 상기 혈청과 함께 배양하였다. 이어서 상기 필터를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20)로 5 회 세척하고 이어서 실온에서 60 분간 차단 용액 중의 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제-접합된 항체(Sigma-Aldrich, USA)와 함께 배양하였다.
상기 필터를 5 회 세척 후, 5 ㎖의 전개 용액(기질 BCIP 및 NBT, Sigma-Aldrich, USA)을 가하고 상기 필터를 물에 세척하여 상기 전개를 중단시켰다. 양성으로 입증된 파지 클론을 각각의 파지 플라크로부터 단리하고 이어서 후속의 특성화를 위해 증폭시켰다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloing: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
양성 클론의 특성화
상기 선택된 파지의 DNA 삽입물을 후속적으로 서열화하고 현재 입수 가능한 다양한 서열 데이터베이스(Non-Redundant Genbank CDS, Non-Redundant Database of Genbank Est Division, Non-Redundant Genbank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences)와 비교하였다.
상기 획득된 서열들을 3 개의 그룹으로 분류할 수 있다:
-공지된 HCMV 항원의 단편을 암호화하는 서열;
-공지되었지만, 인간 항체 반응에 관여하는 것으로 공지되지는 않은 HCMV 단백질의 단편을 암호화하는 서열;
-미지의 단백질(예를 들어 ORF)의 단편을 암호화하는 서열.
하기 표 1은 예로서 상기 선택된 클론들 중 일부의 서열을 제공한다:
[표 1]
Figure 112009054654535-PCT00001
Figure 112009054654535-PCT00002
서열 CM-2.10은 UL55로서 분류되고, 인간 항체 반응에 의해 인식되는 "항원 단편"으로서 결코 동정되지 않았던 외막 당단백질 gB(Pereira et al., Virol., 1984 139:73-86)의 단편을 암호화하는, HCMV 게놈의 DNA 단편을 구성한다. 상기 클론은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00003
Figure 112009054654535-PCT00004
(서열식별번호: 2)을 가지며 에피토프를 함유하는 단편으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
서열 CM-3.3은 UL71(Davison et al., J. Gen. Virol. 2003, 84:17-28)로서 분류되고, 인간 체액 반응에 의해 인식되는 "항원"으로서 결코 동정되지 않았던 폴리펩타이드를 암호화하는, HCMV 게놈의 DNA 단편을 구성한다. 상기 클론은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00005
Figure 112009054654535-PCT00006
(서열식별번호: 4)을 가지며 에피토프를 함유하는 단편으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
서열 CM-8.3은 UL25로서 분류되고, 인간 항체 반응에 의해 인식되는 "항원 단편"으로서 결코 동정되지 않았던 외피 항원(Lazzarotto et al., J. Gen. Virol. 2001, 82:335-338)의 단편을 암호화하는, HCMV 게놈의 DNA 단편을 구성한다. 상기 클론은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00007
Figure 112009054654535-PCT00008
(서열식별번호: 6)을 가지며 에피토프를 함유하는 단편으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
서열 CM-7.3은 UL56(Krosky et al., J. Virol. 1998, 72:4721-4728)로서 분류되고, 인간 체액 반응에 의해 인식되는 "항원 단편"으로서 결코 동정되지 않았던 폴리펩타이드를 암호화하는, HCMV 게놈의 DNA 단편을 구성한다. 상기 클론은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00009
(서열식별번호: 8)을 가지며 에피토프를 함유하는 단편으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
서열 CM-1.3, CM-2,7 및 CM-4.4는 UL32로서 분류되고, 인간 항체 반응에 의해 인식되는 "항원 단편"으로서 결코 동정되지 않았던 큰 구조의 외피 인단백질 pp150(Jahn et al., J. Virol., 1987, 61:1358-1367)의 단편을 암호화하는, HCMV 게놈의 DNA 단편을 구성한다. 상기 클론은 각각의 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00010
Figure 112009054654535-PCT00011
(서열식별번호: 10),
Figure 112009054654535-PCT00012
Figure 112009054654535-PCT00013
Figure 112009054654535-PCT00014
(서열식별번호: 12) 및
Figure 112009054654535-PCT00015
Figure 112009054654535-PCT00016
Figure 112009054654535-PCT00017
(서열식별번호: 14)를 가지며 에피토프를 함유하는 단편으로서 그들의 용도는 본 발명에 포함된다.
키메릭 항원의 제작
EC7 단백질 산물은 클론 CM-1.3, CM-2.7 및 CM-4.4의 DNA 서열을 함유하는 키메릭 분자이다.
서열식별번호: 14는 올리고뉴클레오타이드 K749(5'-GGACTAGTGGCAGTCAGAAACCGACCAG-3') 및 K751(5'-GGACTAGTGGCAGTCAGAAACCGACCAG-3')을 사용함으로써 클론 CM-4.4의 DNA 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다. 상기 올리고뉴클레오타이드 K751은 서열 CM-4.4와 CM-2.7을 연결하는 링커 SGGGS를 암호화하는 서열을 함유한다. PCR 조건은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
서열식별번호: 12는 올리고뉴클레오타이드 K750(5'-TCTGGTGGCGGTAGCCTGGTGGACATCACGG ATAC-3') 및 K753(5'-CGTGCTACCGCCACCAGAAAGGTCCCTTAAAGCCC AAAC-3')을 사용함으로써 클론 CM-2.7의 DNA 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다. 상기 올리고뉴클레오타이드 K753은 서열 CM-2.7과 CM-1.3을 연결하는 링커 SGGGS를 암호화하는 서열을 함유한다. PCR 조건은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
서열식별번호: 10은 올리고뉴클레오타이드 K752(5'-TCTGGTGGCGGTAGCACGAGCCAGAAACCGGTGCTG-3') 및 K754(5'-CCGCGGCCGCTGGACACGACATCATCCTCC-3')을 사용함으로써 클론 CM-1.3의 DNA 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다. PCR 조건은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
상기 PCT 산물들을 "퀴아겐 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하였 다. 서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 12의 DNA 증폭 산물 50 ng을 함께 혼합하고 올리고뉴클레오타이드 K749 및 K753을 사용함으로써 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. PCR 조건은 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 90"이었다. 50 ng의 상기 생성 DNA 증폭물을 "퀴아겐 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)로 정제하고 이어서 50 ng의 서열식별번호: 10의 DNA 증폭 산물과 혼합하였다. 최종적으로, 상기 DNA 혼합물을, 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 120"의 PCR 조건에 따라, K749 및 K754를 사용함으로써 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
EC8 단백질 산물은 CM-2.10, CM-3.3 및 CM-8.3 DNA 서열을 함유하는 키메릭 분자이다.
서열식별번호: 4를 올리고뉴클레오타이드 K761(5'-GGACTAGTGCTCACATTAACACCGTCTC-3') 및 K762(5'-GTGAGCTACCGCCACCAGAAAGTTCACGCGCGGAAC-3')를 사용함으로써 클론 CM-3.3의 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드 K762는 서열 CM-3.3과 CM-8.3을 연결하는 링커 SGGGS를 암호화하는 서열을 함유한다. PCR 프로토콜은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
서열식별번호: 6을 올리고뉴클레오타이드 K763(5'-CTTTCTGGTGGCGGTAGCTCACGTCGCTCTGGCG-3') 및 K764(5'-GGTGCTACCGCCACCAGAAAACGATCGTTTCTTTTCGC-3')를 사용함으로써 클론 CM-8.3의 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드 K764는 서열 CM-8.3과 CM-2.10을 연결하는 링커 SGGGS를 암호화하는 서열을 함유한다. PCR 프로토콜은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
서열식별번호: 2를 올리고뉴클레오타이드 K765(5'-TTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTAC-3') 및 K766(5'-CCGCGGCCGCTACCGCCACCAGAATGCG-3')를 사용함으로써 클론 CM-2.10의 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다. PCR 프로토콜은 25 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 30"이었다.
상기 PCR 산물들을 "퀴아겐 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하였다. 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 8의 DNA 증폭 산물 50 ng을 함께 혼합하고 올리고뉴클레오타이드 K761 및 K764를 사용함으로써 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. PCR 프로토콜은 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 90"이었다. 50 ng의 상기 생성 DNA 증폭물을 정제하고 이어서 50 ng의 서열식별번호: 2의 DNA 증폭 산물과 혼합하였다. 최종적으로, 상기 DNA 혼합물을, 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 52 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 120"의 PCR 조건에 따라, 올리고뉴클레오타이드 K761 및 K766을 사용함으로써 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
EC14 단백질 산물은 클론 CM-2.7, CM-2.10 및 CM-1.3의 DNA 서열을 함유하는 키메릭 분자이다.
서열식별번호: 12를 올리고뉴클레오타이드 K825(5'- GGGGATCCCACTAGTCGTGCTGGCCAGCCG CTG-3') 및 K826(5'-GGTGCTACCGCCACCAGAAAGGTCCCTTAAAGC CCAAAC-3')를 사용함으로써 클론 CM-2.7의 DNA에 대한 주형으로서 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드 K826은 서열 CM-2.7과 CM-2.10을 연결하는 링커 SGGGS를 암호화하는 서열을 함유한다.
서열식별번호: 2를 올리고뉴클레오타이드 K827(5'-CCTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTACAG-3') 및 K828(5'-GAGACTACCACCCCCGGAATGCGTGCCAGTCTGTCCG-3')를 사용함으로써 클론 CM-2.10의 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
서열식별번호: 10을 올리고뉴클레오타이드 K829(5'-CATTCCGGGGGTGGTAGTCTCACGAGCCAGAAACCGG-3') 및 K830(5'-CCAGACTCGAGTCACCCGCGGCCGCTACCGCCACCAGAGCTGCC-3')를 사용함으로써 클론 CM-1.3의 DNA 증폭용 주형으로서 사용하였다.
상기 PCR 산물들을 "퀴아겐 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하였다. 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 2의 DNA 증폭 산물 50 ng을 함께 혼합하고 올리고뉴클레오타이드 K825 및 K828을 사용함으로써 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. PCR 조건은 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 50 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 90"이었다. 50 ng의 상기 생성 DNA 증폭물을 "퀴아겐 정제 키트"(Qiagen, CA, USA)에 의해 정제하고 이어서 50 ng의 서열식별번호: 10의 DNA 증폭 산물과 혼합하였다. 최종적으로, 상기 DNA 혼합물을, 30 주기 동안 94 ℃에서 30", 50 ℃에서 30" 및 72 ℃에서 120"의 PCR 조건에 따라, K825 및 K830을 사용함으로써 DNA 증폭 용 주형으로서 사용하였다.
하기 표 2는 예로서 EC7 및 EC8 키메릭 항원의 DNA 서열들을 제공한다:
[표 2]
Figure 112009054654535-PCT00018
Figure 112009054654535-PCT00019
상기 키메릭 단백질 EC7은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00020
Figure 112009054654535-PCT00021
(서열식별번호: 16)을 가지며, 다수의 HCMV 단백질 단 편을 함유하는 재조합 항원으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
상기 키메릭 단백질 EC8은 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00022
Figure 112009054654535-PCT00023
Figure 112009054654535-PCT00024
(서열식별번호: 18)을 가지며, 다수의 HCMV 단백질 단편을 함유하는 재조합 항원으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
상기 키메릭 단백질 EC14는 아미노산 서열
Figure 112009054654535-PCT00025
Figure 112009054654535-PCT00026
(서열식별번호: 36)을 가지며, 다수의 HCMV 단백질 단편을 함유하는 재조합 항원으로서 그의 용도는 본 발명에 포함된다.
이 콜라이 세포의 세포질에서 GST 와의 융합 산물로서 재조합 항원의 발현을 조정하 는 DNA 벡터의 제작
선택된 HCMV 파지 클론을 암호화하는 DNA 단편을 단백질 글루타치온 설포 트랜스퍼라제(GST)와의 융합 산물로서 클로닝하고 그의 특이성 및 선택성을 측정하기 위해 세균 세포의 세포질에서 용해성 단백질로서 발현시켰다. 클론 CM-2,10, C-3.3, CM-8.3, CM-7.3, CM-1.2, CM-1.3, CM-1.5, CM-2.7, CM-2.11 및 CM-4.4의 DNA 서열들을 제한 효소 Spel 및 Notl로 절단하였다. 절단된 DNA를, 앞서 Spel 및 Notl 엔도뉴클레아제로 절단한 벡터 pGEX-SN(Minenkova et al., International Journal of Cancer, 2003, 106:534-44)에 클로닝하여 GST 단백질의 카복시 말단에 융합 산물을 생성시켰다. 또한, 키메릭 항원 EC7, EC8 및 EC14를 암호화하는 DNA를 벡터 pGEX-SN 및 pGEX-SN-Flag에 클로닝하여 GST-융합 산물을 생성시켰다. 올리고뉴클레오타이드 K718(5'-GGCCGCGGAGACTACAAAGACGACGATGACAAATGAG-3') 및 K719(5'-AATTCTCATTTGTCATCGTCGTCTTTGTAGTC TCCGC-3')를 어닐링하여 수득한 짧은 dsDNA 서열을 Spel-Notl 절단된 pGEX-SN 벡터에 삽입하여 플라스미드 pGEX-SN-Flag를 제작하였다(도 1 참조). 생성 플라스미드를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 수용능력 이 콜라이 세포를 형질전환시켰다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
재조합 항원의 생화학적 특성화
재조합 GST 융합 단백질을 형질전환된 이 콜라이 세포의 세포질에서 발현시키고 제조사의 설명에 따라 글루타치온-세파로스 수지(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질 순도 및 농도를 각각 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트-폴리-아크릴아미드 젤 전기영동) 분석 및 브래드포드 분석에 의해 평가하였다.
재조합 키메릭 항원 GST-EC7-Flag 및 GST-EC8-Flag에 또한, 1차 항체로서 항-FLAG-M2 단클론 항체(1 ㎍/㎖; Sigma-Aldrich, USA), 2차 항체로서 알칼리 포스파타제-접합된 염소 항-마우스-IgG 항체(1:10000 희석; Sigma-Aldrich, USA), 및 기질로서 나이트로블루 테트라졸륨(NBT) + 5-브로모-4-클로로-3-인도실 포스페이트(BCIP)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 가하였다.
상기 친화성-정제된 재조합 산물을 PBS에 대해 투석하고, PBS로 1 ㎎/㎖의 농도로 희석하고 사용 시까지 -20 ℃에서 보관하였다. 정제된 산물의 수율은 세균 배양물 리터 당 4 내지 15 ㎎의 범위였다.
HCMV 감염된 개인의 혈청으로부터 IgG 항체와 단일 재조합 항원 단편과의 면역반응성: IgG Rec - ELISA
상기 GST 융합 산물의 ELISA 수행을, 맥시소브(Maxisorb)-다중 웰 플레이트(Nunc)를 단일 항원 단편으로 코팅 완충제(50 mM NaHCO3, pH 9.6) 중의 1 ㎍/㎖의 농도로 코팅함으로써 수행하였다. 4 ℃에서 밤새 배양 후 플레이트를 차단 완충제(5% 비-지방 분유, PBS 중의 0.05% 트윈-20)와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고 후속적으로 37 ℃에서 1 시간 동안 차단 용액 중에서 1:100으로 희석한, HCMV-혈청 양성 및 혈청음성 개인의 혈청과 함께 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈-20으로 광범위하게 세척하고 이어서 차단 용액 중에서 1:7500 희석한 항-인간-IgG 알칼리 포스파타제-접합된 항체(Sigma-Aldrich, USA)를 각 웰에 가하였다. 37 ℃에서 30 분 후에 상기 플레이트를 세척하고 전개 용액(10% 다이에탄올아민 pH 9.8, 0.5 mM MgCl2, 0.05% NaN3) 중의 색원성 기질 p-나이트로페닐 포스페이트(pNPP; Sigma-Aldrich, USA)와 함께 배양하였다. 결과를 자동화된 ELISA 판독기(Multiskan Labsystems, Finland)를 사용하여 405 및 620 ㎚에서의 광학 밀도(OD) 간의 차이로서 기록하였다. 각각의 혈청 샘플에 대해서 상기 분석을 중복 수행하고 평균값을 계산하였다.
하기 표 3은 36 HCMV-혈청 양성 및 33 HCMV-혈청 음성 개인의 혈청 샘플을 사용하는, GST 융합 단백질로서 발현된 단일 항원 단편을 기본으로 한 ELISA 분석의 결과를 요약한다.
혈청 샘플 중의 HCMV-특이 IgG의 측정을 제조사의 설명에 따라 완전-세포, HCMV 항원 분석 ETI-CYTOK-G PLUS(Diasorin, Saluggia, Italy)에 의해 수행하였다. 모든 재조합 항원에 대해서 컷오프 값을 상기 HCMV IgG 음성 혈청으로부터 획득한 흡광도 판독치의 3 회 표준편차 플러스 평균으로서 측정하였다. 대조군으로서, 야생형 GST 단백질에 대한 IgG 반응성을 각 혈청에 대해 평가하였다. 단일 재조합 항원에 대한 양성 IgG 반응성을 할당하는데 사용되는 진단 기준은 상기 컷오프보다 더 큰 ODGST -항원 및 상기 ODGST보다 더 큰 ODGST -항원이었다. 표 3의 각 컬럼에 반응성 혈청의 수 및 상응하는 퍼센트를 기록한다.
[표 3]
Figure 112009054654535-PCT00027
Figure 112009054654535-PCT00028
하기 표 4는 최근 임신 중 HCMV 재활성화 또는 2차 HCMV 감염이 된 25 명의 여성으로부터의 혈청 샘플(CA1-CA25)을 사용한 IgG Rec-ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 혈청 샘플 중 HCMV-특이적 IgG의 측정을 완전-세포, HCMV 항원 분석 ETI-CYTOK-G PLUS(Diasorin, Saluggia, Italy)에 의해 또는 단일 재조합 항원 면역분석을 사용함으로써 수행하였다. 각각의 GST-융합 산물의 경우, 컷오프를 HCMV 혈청 음성 환자들(n=20)의 혈청으로부터 획득한 흡광도 판독치의 평균 + 3SD로서 측정하였다. ETI-CYTO-K PLUS, GST-CM2.10, GST-CM3.3, GST-CM8.3, GST-CM7.3, GST- CM1.3, GST-CM2.7, 및 GST-CM4.4에 대한 컷오프 값은 각각 0.2, 0.073, 0.078, 0.101, 0.089, 0.145, 0.147 및 0.138이었다. 굵게 쓴 값은 양성 반응을 가리킨다. 표준 분석에 의해 획득한 광학 밀도의 수치들은 다른 것들과 비교할 수 없는데, 그 이유는 상기 분석들이 모두 국제 표준에 대한 기준 없이 수행되었기 때문임을 알아야 한다.
[표 4]
Figure 112009054654535-PCT00029
하기 표 5는 단일 재조합 항원(IgG Rec-ELISA)에 의해 획득된 결과와 비교된, 상업적인 분석(ETI-CYTOK-G PLUS)의 성능 특징을 나타낸다. 표 5로부터, CMV-3.3 항원 단편을 기본으로 한 Rec-ELISA를 제외하고, 상기 분석의 특이성 및 양의 예견 값들(거짓 양성의 존재를 보고하는 세 번째 및 다섯 번째 컬럼 참조)은 모두 본 발명의 재조합 항원 단편을 사용하는 경우 최대(100%)에 도달한 것이 분명하다.
[표 5]
Figure 112009054654535-PCT00030
* PPV, 양의 예견 치; NPV, 음의 예견 치.
HCMV 감염된 개인 혈청의 IgG 항체와 재조합 키메릭 항원과의 면역반응성
재조합 키메릭 항원의 ELISA 성능수행을, 맥시소브 플레이트(Nunc)를 각각 코팅 완충액 중의 0.5 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖ 및 3 ㎍/㎖ 농도의 GST-EC7-Flag, GST-EC8-Flag 및 GST-EC14로 코팅하여 실행하였다. 4 ℃에서 밤새 배양 후 플레이트를 차단 완충제(5% 비-지방 분유, PBS 중의 0.05% 트윈-20)와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고 이어서 37 ℃에서 1 시간 동안 차단 용액 중에서 1:100으로 희석한, 혈청 샘플과 함께 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈-20으로 광범위하게 세척하고 이어서 차단 용액 중에서 1:20000 희석한 항-인간-IgG 홀스-래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항체(1 ㎎/㎖; Sigma-Aldrich, USA)를 각 웰에 가하였다. 최종적으로, 플레이트를 색원성 기질 테트라메틸벤지딘(TMB; Sigma-Aldrich, USA)과 함께 배양하여 효소 활성을 밝혔다. 결과를 자동화된 ELISA 판독기(Multiskan Labsystem, Finland)에 의해 검출된, 450 및 620 ㎚에서의 흡광도(광학 밀도, OD) 간의 차이로서 기록하였다. 각각의 혈청 샘플에 대해서 상기 분석을 중복 수행하고 평균값을 계산하였다.
하기 표 6은 36 HCMV-혈청 양성(C1-C36) 및 33 HCMV-혈청 음성(N1-N33) 개인의 혈청 샘플을 사용하는, 키메릭 항원 EC7-Flag, EC8-Flag 및 GST-EC14 또는 완전 세포, HCMV 항원 분석 ETI-CYTOK-G PLUS(Diasorin, Saluggia, Italy)을 사용하는 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 각각의 키메릭 항원의 경우, 컷오프를 HCMV 혈청 음성 환자들의 혈청으로부터 획득한 흡광도 판독치의 평균 + 3SD로서 측정하였다. ETI-CYTO-K PLUS, GST-EC7-Flag, GST-EC8-Flag 및 GST-EC14에 대한 컷오프 값은 각각 0.296, 0.296, 0.273 및 0.203이었다. 굵게 쓴 값은 양성 반응을 가리킨다. 표준 분석에 의해 획득한 광학 밀도의 수치들은 다른 것들과 비교할 수 없는데, 그 이유는 상기 분석들이 모두 국제 표준에 대한 기준 없이 수행되었기 때문임을 알아야 한다.
[표 6]
Figure 112009054654535-PCT00031
Figure 112009054654535-PCT00032
[표 6]
Figure 112009054654535-PCT00033
하기 표 7은 EC7 및 EC8 키메릭 항원(IgG Rec-ELISA)에 의해 획득된 결과와 비교된, 상업적인 분석(ETI-CYTOK-G PLUS)의 성능 특징을 나타낸다. 표 7로부터, 상기 분석의 감도(거짓 음성의 존재를 보고하는 두 번째 컬럼 참조)는 본 발명의 키메릭 항원을 사용하는 경우 최대값에 도달하는 것이 분명하다. 또한, 용해된, 완전-세포 CMV 항원을 사용하는 상업적인 시험 ETI-CYTOK-G 및 키메릭 항원 EC7 또 는 EC14를 사용하는 IgG rec-ELISA는 모두, 재조합 항원을 사용하여 수행한 분석과 전형적으로 관련되는 재현성 수준을 유지하면서, 동일한 성능 특징들을 나타냄을 알아야 한다.
[표 7]
Figure 112009054654535-PCT00034
* PPV, 양의 예견 치; NPV, 음의 예견 치.
SEQUENCE LISTING <110> Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. <120> RECOMBINANT ANTIGENS OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS (HCMV) <130> 547 <160> 42 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 222 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(222) <400> 1 acc aaa gac acg tcg tta cag gct ccg cct tcc tac gag gaa agt gtt 48 Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val 1 5 10 15 tat aat tct ggt cgc aaa gga ccg gga cca ccg tcg tct gat gca tcc 96 Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala Ser 20 25 30 acg gcg gct ccg cct tac acc aac gag cag gct tac cag atg ctt ctg 144 Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu Leu 35 40 45 gcc ctg gcc cgt ctg gac gca gag cag cga gcg cag caa aac ggt aca 192 Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly Thr 50 55 60 gat tct ttg gac gga cag act ggc acg cat 222 Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr Gly Thr His 65 70 <210> 2 <211> 74 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 2 Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu Leu 35 40 45 Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly Thr 50 55 60 Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr Gly Thr His 65 70 <210> 3 <211> 345 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 3 gct cac att aac acc gtc tcc tgt cct acc gtt atg agg ttc gac cag 48 Ala His Ile Asn Thr Val Ser Cys Pro Thr Val Met Arg Phe Asp Gln 1 5 10 15 cgg ctg ctg gaa gag ggc gac gag gag gat gaa gtg acc gtg atg tcg 96 Arg Leu Leu Glu Glu Gly Asp Glu Glu Asp Glu Val Thr Val Met Ser 20 25 30 ccg tca ccc gag ccc gtg caa cag cag ccg ccg gtc gag ccc gtg cag 144 Pro Ser Pro Glu Pro Val Gln Gln Gln Pro Pro Val Glu Pro Val Gln 35 40 45 cag cag ccc cag gga cgc ggg tct cac cgt cgg cgc tac aag gag tcg 192 Gln Gln Pro Gln Gly Arg Gly Ser His Arg Arg Arg Tyr Lys Glu Ser 50 55 60 gcg ccg caa gag acg ctg cct acg aat cac gaa cgc gag att ttg gat 240 Ala Pro Gln Glu Thr Leu Pro Thr Asn His Glu Arg Glu Ile Leu Asp 65 70 75 80 ctc atg cga cac agc ccc gac gtg cct cgg gag gcg gtg atg tca ccg 288 Leu Met Arg His Ser Pro Asp Val Pro Arg Glu Ala Val Met Ser Pro 85 90 95 acc atg gtc acc ata cct cct ccc cag ata ccc ttt gtg ggt tcc gcg 336 Thr Met Val Thr Ile Pro Pro Pro Gln Ile Pro Phe Val Gly Ser Ala 100 105 110 cgt gaa ctt 345 Arg Glu Leu 115 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 4 Ala His Ile Asn Thr Val Ser Cys Pro Thr Val Met Arg Phe Asp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Glu Glu Gly Asp Glu Glu Asp Glu Val Thr Val Met Ser 20 25 30 Pro Ser Pro Glu Pro Val Gln Gln Gln Pro Pro Val Glu Pro Val Gln 35 40 45 Gln Gln Pro Gln Gly Arg Gly Ser His Arg Arg Arg Tyr Lys Glu Ser 50 55 60 Ala Pro Gln Glu Thr Leu Pro Thr Asn His Glu Arg Glu Ile Leu Asp 65 70 75 80 Leu Met Arg His Ser Pro Asp Val Pro Arg Glu Ala Val Met Ser Pro 85 90 95 Thr Met Val Thr Ile Pro Pro Pro Gln Ile Pro Phe Val Gly Ser Ala 100 105 110 Arg Glu Leu 115 <210> 5 <211> 255 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(255) <400> 5 tca cgt cgc tct ggc gaa ccc tcg acg gtg att tat atc ccc tcg agc 48 Ser Arg Arg Ser Gly Glu Pro Ser Thr Val Ile Tyr Ile Pro Ser Ser 1 5 10 15 aac gag gac acg ccg gcg gat gag gag gcg gag gac agc gtt ttc acg 96 Asn Glu Asp Thr Pro Ala Asp Glu Glu Ala Glu Asp Ser Val Phe Thr 20 25 30 agc acg cgg gcg cgc agc gcc acg gaa gat ctg gat cgc atg gag gcc 144 Ser Thr Arg Ala Arg Ser Ala Thr Glu Asp Leu Asp Arg Met Glu Ala 35 40 45 ggt ttg tcg ccc tac agc gtc tcc tcg gac gct ccg tcg tcc ttc gag 192 Gly Leu Ser Pro Tyr Ser Val Ser Ser Asp Ala Pro Ser Ser Phe Glu 50 55 60 ctc gtg cgc gag acc ggc ggc acc ggc gcc gcc aag aaa ccg agc gaa 240 Leu Val Arg Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Lys Lys Pro Ser Glu 65 70 75 80 aag aaa cga tcg ttt 255 Lys Lys Arg Ser Phe 85 <210> 6 <211> 85 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 6 Ser Arg Arg Ser Gly Glu Pro Ser Thr Val Ile Tyr Ile Pro Ser Ser 1 5 10 15 Asn Glu Asp Thr Pro Ala Asp Glu Glu Ala Glu Asp Ser Val Phe Thr 20 25 30 Ser Thr Arg Ala Arg Ser Ala Thr Glu Asp Leu Asp Arg Met Glu Ala 35 40 45 Gly Leu Ser Pro Tyr Ser Val Ser Ser Asp Ala Pro Ser Ser Phe Glu 50 55 60 Leu Val Arg Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Lys Lys Pro Ser Glu 65 70 75 80 Lys Lys Arg Ser Phe 85 <210> 7 <211> 96 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <400> 7 ctt att ctc gag gag att cga cgt ccg ctg cca gat ggc acg ggg ggc 48 Leu Ile Leu Glu Glu Ile Arg Arg Pro Leu Pro Asp Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 gac ggc ccc gag ggc gag gct att cac ctg cgt gga cgg gag gcg cat 96 Asp Gly Pro Glu Gly Glu Ala Ile His Leu Arg Gly Arg Glu Ala His 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 8 Leu Ile Leu Glu Glu Ile Arg Arg Pro Leu Pro Asp Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Asp Gly Pro Glu Gly Glu Ala Ile His Leu Arg Gly Arg Glu Ala His 20 25 30 <210> 9 <211> 480 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(480) <400> 9 acg agc cag aaa ccg gtg ctg ggc aag cga gtc gcg acg ccg cac gcg 48 Thr Ser Gln Lys Pro Val Leu Gly Lys Arg Val Ala Thr Pro His Ala 1 5 10 15 tcc gcc cga gcg cag acg gtg acg tcg acg ccg gtt cag gga agg cta 96 Ser Ala Arg Ala Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Val Gln Gly Arg Leu 20 25 30 gag aaa cag gtg tcg ggc acg ccg tcg acg gta ccc gcc acg ctg ttg 144 Glu Lys Gln Val Ser Gly Thr Pro Ser Thr Val Pro Ala Thr Leu Leu 35 40 45 caa cct caa ccg gct tcg tct aaa acg acg tca tca agg aac gtg act 192 Gln Pro Gln Pro Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Ser Arg Asn Val Thr 50 55 60 tct ggc gcg gga acc tct tcc gct tct tcg gct cga cag ccg tca gcc 240 Ser Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Arg Gln Pro Ser Ala 65 70 75 80 tcg gcg tcc gtt ttg tcg ccc acg gag gat gat gtc gtg tcc ccc gcc 288 Ser Ala Ser Val Leu Ser Pro Thr Glu Asp Asp Val Val Ser Pro Ala 85 90 95 aca tcg ccg ctg tcc atg ctt tcg tca gcc tct ccg tcc ccg gcc aag 336 Thr Ser Pro Leu Ser Met Leu Ser Ser Ala Ser Pro Ser Pro Ala Lys 100 105 110 agt gcc ccc ccg tct ccg gtg aaa ggc cgg ggc agc cgc gtc ggt gtt 384 Ser Ala Pro Pro Ser Pro Val Lys Gly Arg Gly Ser Arg Val Gly Val 115 120 125 cct tcc ttg aaa cct act ttg ggc ggc aag gcg gtg gta ggt cga ccg 432 Pro Ser Leu Lys Pro Thr Leu Gly Gly Lys Ala Val Val Gly Arg Pro 130 135 140 ccc tcg gtc ccc gtg agc ggt agc gcg ccg ggt cgc ctg tcc ggc agc 480 Pro Ser Val Pro Val Ser Gly Ser Ala Pro Gly Arg Leu Ser Gly Ser 145 150 155 160 <210> 10 <211> 160 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 10 Thr Ser Gln Lys Pro Val Leu Gly Lys Arg Val Ala Thr Pro His Ala 1 5 10 15 Ser Ala Arg Ala Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Val Gln Gly Arg Leu 20 25 30 Glu Lys Gln Val Ser Gly Thr Pro Ser Thr Val Pro Ala Thr Leu Leu 35 40 45 Gln Pro Gln Pro Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Ser Arg Asn Val Thr 50 55 60 Ser Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Arg Gln Pro Ser Ala 65 70 75 80 Ser Ala Ser Val Leu Ser Pro Thr Glu Asp Asp Val Val Ser Pro Ala 85 90 95 Thr Ser Pro Leu Ser Met Leu Ser Ser Ala Ser Pro Ser Pro Ala Lys 100 105 110 Ser Ala Pro Pro Ser Pro Val Lys Gly Arg Gly Ser Arg Val Gly Val 115 120 125 Pro Ser Leu Lys Pro Thr Leu Gly Gly Lys Ala Val Val Gly Arg Pro 130 135 140 Pro Ser Val Pro Val Ser Gly Ser Ala Pro Gly Arg Leu Ser Gly Ser 145 150 155 160 <210> 11 <211> 462 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(462) <400> 11 ccg ctg gtg gac atc acg gat acc gag acg agc gcc aaa ccg ccc gtc 48 Pro Leu Val Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val 1 5 10 15 acc acc gcg tac aag ttc gag caa ccg acg ttg acg ttc ggc gcc gga 96 Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly 20 25 30 gtt aac gtt cct gct ggc gcc ggc gct gcc atc ctc acg ccg acg cct 144 Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu Thr Pro Thr Pro 35 40 45 gtc aat cct tcc acg gcc ccc gct ccg gcc ccg aca cct acc ttc gcg 192 Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala 50 55 60 ggt acc caa acc ccg gtc aac ggt aac 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Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu Thr Pro Thr Pro 35 40 45 Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala 50 55 60 Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala 65 70 75 80 Pro Leu Pro Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala 85 90 95 Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro 100 105 110 Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser Thr Thr Pro Arg Arg 115 120 125 Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Arg Asp Ala 130 135 140 Ala Asp Glu Val Trp Ala Leu Arg Asp Leu 145 150 <210> 13 <211> 270 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(270) <400> 13 ccg ggc agt cag aaa ccg acc agc ggt ccc ttg aac atc ccg caa caa 48 Pro Gly Ser Gln Lys Pro Thr Ser Gly Pro Leu Asn Ile Pro Gln Gln 1 5 10 15 caa cag cgt cac gcg gct ttc agt ctc gtc tcc ccg cag gtg acc aag 96 Gln Gln Arg His Ala Ala Phe Ser Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys 20 25 30 gcc agc ccg gga agg gtc cgt cgg gac agc gcg tgg gac gtg agg 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gtc acc ata cct cct ccc cag ata ccc ttt gtg ggt 336 Ser Pro Thr Met Val Thr Ile Pro Pro Pro Gln Ile Pro Phe Val Gly 100 105 110 tcc gcg cgt gaa ctt tct ggt ggc ggt agc tca cgt cgc tct ggc gaa 384 Ser Ala Arg Glu Leu Ser Gly Gly Gly Ser Ser Arg Arg Ser Gly Glu 115 120 125 ccc tcg acg gtg att tat atc ccc tcg agc aac gag gac acg ccg gcg 432 Pro Ser Thr Val Ile Tyr Ile Pro Ser Ser Asn Glu Asp Thr Pro Ala 130 135 140 gat gag gag gcg gag gac agc gtt ttc acg agc acg cgg gcg cgc agc 480 Asp Glu Glu Ala Glu Asp Ser Val Phe Thr Ser Thr Arg Ala Arg Ser 145 150 155 160 gcc acg gaa gat ctg gat cgc atg gag gcc ggt ttg tcg ccc tac agc 528 Ala Thr Glu Asp Leu Asp Arg Met Glu Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ser 165 170 175 gtc tcc tcg gac gct ccg tcg tcc ttc gag ctc gtg cgc gag acc ggc 576 Val Ser Ser Asp Ala Pro Ser Ser Phe Glu Leu Val Arg Glu Thr Gly 180 185 190 ggc acc ggc gcc gcc aag aaa ccg agc gaa aag aaa cga tcg ttt tct 624 Gly Thr Gly Ala Ala Lys Lys Pro Ser Glu Lys Lys Arg Ser Phe Ser 195 200 205 ggt 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Leu Leu Gln Pro Gln Pro Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser 290 295 300 tca agg aac gtg act tct ggc gcg gga acc tct tcc gct tct tcg gct 960 Ser Arg Asn Val Thr Ser Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala 305 310 315 320 cga cag ccg tca gcc tcg gcg tcc gtt ttg tcg ccc acg gag gat gat 1008 Arg Gln Pro Ser Ala Ser Ala Ser Val Leu Ser Pro Thr Glu Asp Asp 325 330 335 gtc gtg tcc ccc gcc aca tcg ccg ctg tcc atg ctt tcg tca gcc tct 1056 Val Val Ser Pro Ala Thr Ser Pro Leu Ser Met Leu Ser Ser Ala Ser 340 345 350 ccg tcc ccg gcc aag agt gcc ccc ccg tct ccg gtg aaa ggc cgg ggc 1104 Pro Ser Pro Ala Lys Ser Ala Pro Pro Ser Pro Val Lys Gly Arg Gly 355 360 365 agc cgc gtc ggt gtt cct tcc ttg aaa cct act ttg ggc ggc aag gcg 1152 Ser Arg Val Gly Val Pro Ser Leu Lys Pro Thr Leu Gly Gly Lys Ala 370 375 380 gtg gta ggt cga ccg ccc tcg gtc ccc gtg agc ggt agc gcg ccg ggt 1200 Val Val Gly Arg Pro Pro Ser Val Pro Val Ser Gly Ser Ala Pro Gly 385 390 395 400 cgc ctg tcc ggc agc tct ggt ggc ggt agc ggc cgc 1236 Arg Leu Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Arg 405 410 <210> 36 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Thr Ser Arg Ala Gly Gln Pro Leu Val Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr 1 5 10 15 Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln Pro Thr 20 25 30 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala 35 40 45 Ile Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala 50 55 60 Pro Thr Pro Thr Phe Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser 65 70 75 80 Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn 85 90 95 Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu Ala Tyr 100 105 110 Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val 115 120 125 Ser Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln 130 135 140 Thr Ala Ser Arg Asp Ala Ala Asp Glu Val Trp Ala Leu Arg Asp Leu 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser 165 170 175 Tyr Glu Glu Ser Val Tyr Asn Ser Gly 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Ser Gly Ser Ala Pro Gly 385 390 395 400 Arg Leu Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Arg 405 410 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 37 ggggatccca ctagtcgtgc tggccagccg ctg 33 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 ggtgctaccg ccaccagaaa ggtcccttaa agcccaaac 39 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 cctttctggt ggcggtagca ccaaagacac gtcgttacag 40 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 gagactacca cccccggaat gcgtgccagt ctgtccg 37 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 41 cattccgggg gtggtagtct cacgagccag aaaccgg 37 <210> 42 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 42 ccagactcga gtcacccgcg gccgctaccg ccaccagagc tgcc 44

Claims (36)

  1. HCMV 단백질의 3 개 이상의 상이한 항원 부위들의 융합을 함유하는 키메릭 재조합 항원으로서, 상기 항원 부위가 HCMV-특이적 항체에 결합하는 B-세포 에피토프이고, 상기 3 개의 상이한 항원 부위들 중 하나가 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열로 이루어진 키메릭 재조합 항원.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 HCMV-특이적 항체가 HCMV에 의해 감염된 환자의 혈청으로부터 추출되는 키메릭 항원.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 3 개의 상이한 항원 부위가 공유 결합 또는 펩타이드 링커에 의해 결합되는 키메릭 항원.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 모두 함유하는 키메릭 항원.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 또한 함유하는 키메릭 항원.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 또한 함유하는 키메릭 항원.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 또한 함유하는 키메릭 항원.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 항원.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 항원.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 항원.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
  12. 제 11 항에 있어서,
    서열식별번호: 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
  13. 제 11 항에 있어서,
    서열식별번호: 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
  14. 제 11 항에 있어서,
    서열식별번호: 35의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
  15. 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 임의의 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열.
  16. 제 15 항의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 키메릭 재조합 항원.
  17. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 서열인 뉴클레오타이드 서열.
  18. 제 17 항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제 18 항의 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포.
  20. 제 19 항의 숙주 세포를 배양하고 목적하는 생성물을 단리함을 포함하는, 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 항원의 제조 방법.
  21. HCMV 감염의 진단을 위한 활성제로서 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 항원의 용도.
  22. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항원을 포함하는 HCMV 감염 검출용 진단제.
  23. 제 22 항에 따른 하나 이상의 진단제를 함유하는, HCMV 감염 진단용 분석 키트.
  24. 시험 샘플을 제 22 항에 따른 진단제와 접촉시킴을 포함하는, HCMV 감염의 진단 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 시험 샘플을 HCMV 항체의 존재에 대해 검사하고, (i) 상기 시험 샘플을 제 22 항의 진단제와 배양하고, (ii) 항체-진단제 복합체가 형성되게 하고, (iii) 상기 복합체의 존재를 검출하는 단계들을 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 시험 샘플이, HCMV 감염이 의심되는 환자의 혈청 또는 혈장인 방법.
  27. 약제로서 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 항원의 용도.
  28. HCMV 감염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 활성 성분으로서 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 항원의 용도.
  29. 약제로서 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열의 용도.
  30. HCMV 감염의 치료 또는 예방에 유용한 약제의 제조를 위한 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 뉴클레오타이드 서열의 용도.
  31. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항원을 항원증강제와 함께 포함하는 면역조절 백신.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 항원증강제가 알루미늄 염 및 수 중 유적형 유화액으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
  33. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항원을 함유하는, 특히 백신 형태의 약학 조성물.
  34. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 특히 백신 형태의 약학 조성물.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
    인간 및/또는 수의학적 용도에 적합한 조성물.
  36. 치료 유효량의 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 백신을 투여함을 포함하는, HCMV 감염을 앓고 있는 포유동물의 치료 방법.
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