ES2213841T3 - Particulas sinteticas semejantes al virus hpv16. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA SERIE DE PARTICULAS SINTETICAS DE NATURALEZA VIRAL UTILIZADAS PARA CARACTERIZAR UNA INFECCION CON PAPILOMAVIRUS HUMANO DE TIPO 16 (HPV 16) Y DE LAS DOSIFICACIONES QUE USAN DICHAS PARTICULAS SINTETICAS.

Description

Partículas sintéticas semejantes al virus HPV16.

Campo de la invención

Se proporcionan una serie de partículas sintéticas semejantes a virus útiles en la caracterización de la infección por el papilomavirus humano tipo 16 (HPV16) y los ensayos que emplean las partículas sintéticas.

Antecedentes de la invención

Las infecciones por papilomavirus ocurren en una diversidad de animales, incluyendo seres humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus infectan células epiteliales y, generalmente, inducen tumores fibroepiteliales o epiteliales benignos en el lugar de la infección. Los papilomavirus son agentes infectivos específicos de especie; un papilomavirus humano no puede infectar un animal no humano.

Los papilomavirus pueden clasificarse en distintos grupos en base al organismo hospedador que infectan. Los papilomavirus humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de 60 tipos en base a la homología de secuencia del ADN (para una revisión, véase Papilomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed), CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser inmunógenos específicos de tipo porque la inmunidad neutralizante a la infección de un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.

En los seres humanos, los diferentes tipos de HPV provocan distintas enfermedades. Los tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10 y 26-29 de HPV provocan verrugas benignas tanto en individuos normales como en inmunodeprimidos. Los tipos 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 de HPV provocan lesiones planas en individuos inmunodeprimidos. Los tipos 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55 de HPV provocan condilomas benignos de la mucosa respiratoria o genital. Los tipos 16 y 18 de HPV provocan displasia epitelial de la mucosa genital y están asociados con la mayoría de los carcinomas in situ o invasivos del cuello uterino, vagina, vulva y canal anal. Los HPV6 y HPV11 son los agentes causantes de más del 90% de todos los condilomas (verrugas genitales) y papilomas laríngeos. El subtipo más abundante de HPV de tipo 6 es el HPV6a.

Los estudios inmunológicos en animales han mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a los antígenos de papilomavirus previene la infección con virus homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces frente a los papilomavirus se ha ralentizado debido a las dificultades asociadas con el cultivo de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz frente al HPV se ha ralentizado particularmente debido a la ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización del papilomavirus por anticuerpos parece ser específica de tipo y dependiente de epítopos conformacionales de la superficie del virus.

Los papilomavirus son pequeños (50-60 nm), sin envoltura, son virus de ADN icosaédricos que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Las fases de lectura abiertas (ORF) del genoma del virus se designan E1 a E7 y L1 y L2, en donde "E" significa temprano y "L" significa tardío. L1 y L2 codifican para proteínas de la cápsida del virus. Los genes tempranos (E) están asociados con funciones tales como la replicación viral y la transformación celular.

La proteína L1 es la principal proteína de la cápsida y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína secundaria de la cápsida que tiene un peso molecular pronosticado de 55-60 kDa y un peso molecular aparente de 75-100 kDa según se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos sugieren que la mayoría de la proteína L2 es interna a la proteína L1. Las proteínas L2 están altamente conservadas entre los diferentes papilomavirus, especialmente los 10 aminoácidos básicos del extremo C-terminal. La ORF de L1 está altamente conservada entre diferentes papilomavirus.

Los genes L1 y L2 han sido usados para generar vacunas para la prevención y tratamiento de infecciones por papilomavirus en animales. Zhou y col., (1991; 1992) clonaron los genes L1 y L2 del HPV de tipo 16 en un vector de virus de la vacuna e infectaron células de mamífero CV-1 con el vector recombinante para producir partículas semejantes a virus (VLP).

Se han generado papilomavirus bovinos recombinantes L1 y L2 derivados de bacterias. El suero neutralizante frente a las proteínas bacterianas recombinantes presenta reactividad cruzada frente a virus naturales a bajos niveles, presumiblemente debido a las diferencias en las conformaciones de las proteínas derivadas de bacterias y las naturales.

Se han usado baculovirus recombinantes que expresan las ORF de L1 de HPV6, L1 de HPV11, L1 de HPV16, L1 de HPV18, L1 de HPV31 o L2 de HPV16 para infectar células Sf9 de insecto y producir proteínas L1 y L2. Los análisis de inmunotransferencia muestran que las proteínas L1 y L2 derivadas de baculovirus reaccionan con el anticuerpo frente al HPV16. La L1 derivada de baculovirus forma VLPs.

Carter y col., (1991) mostraron la producción de proteínas L1 y L2 de HPV16 mediante cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Carter y col. también mostraron la producción de proteínas L1 y L2 de HPV6b. La proteína L1 de HPV6b no tuvo la longitud completa de la proteína L1. Las proteínas recombinantes se produjeron tanto como productos intracelulares como productos secretados. Las proteínas recombinantes L1 y L2 tuvieron pesos moleculares similares a los de las proteínas naturales. Cuando las proteínas se expresaron intracelularmente, se encontró que la mayoría de la proteína era insoluble cuando las células se lisaron en ausencia de agentes desnaturalizantes. Aunque esta insolubilidad podría facilitar la purificación de la proteína, esto podría impedir el análisis de los epítopos naturales de la proteína.

Se mostró que las proteínas recombinantes secretadas a partir de la levadura contenían carbohidratos derivados de la levadura. La presencia de estos oligosacáridos unidos en N podría enmascarar los epítopos naturales. Además, las proteínas recombinantes secretadas podían contener otras modificaciones, tales como la retención de la secuencia líder secretora.

Kirnbauer y col., J. Virol., 1993, 67(12), 6929-6936, describen que el autoensamblaje a muy bajo nivel y/o erróneo del "prototipo" de VLP HPV16 L1 se debe a la presencia de una histidina en el aminoácido 202 de L1.

Zhou y col., Virology, 1992, 189, 592-599 y Henio y col., J. Gen. Virol., 1995, 76, 1141-1153, describen la proteína L1 de HPV16 tiene una treonina en el aminoácido 202.

La presente invención se dirige a la producción de proteínas recombinantes de papilomavirus que tienen las propiedades de conferir inmunidad de las proteínas naturales de los papilomavirus así como a los métodos para su producción y uso. La presente invención es una serie de partículas sintéticas semejantes a virus útiles en la caracterización de la infección por papilomavirus humano y los ensayos que emplean las partículas sintéticas semejantes a virus.

La invención es un gen L1 de HPV16 con E que sustituye al D que existe de forma natural en el residuo 202 de L1. Este gen produce VLP en células Sf9 transfectadas con baculovirus que se unen al anticuerpo monoclonal H16.U4, pero no al anticuerpo monoclonal H16.V5. Estos dos anticuerpos monoclonales son tanto específicos de HPV16 como dependientes de VLP. Se ha demostrado tanto mediante competición como mediante estudios de unión de mutantes que representan dos clases distintas de anticuerpos monoclonales específicos de HPV16 y dependientes de VLP. Hasta la fecha, se ha observado que todos los demás anticuerpos monoclonales específicos de HPV16 y dependientes de VLP son de una de las mismas dos clases de anticuerpos.

El panel de anticuerpos monoclonales neutralizantes para HPV16 se obtuvo de Neil Christensen (Pennsylvania State University, Hershey, PA). Los anticuerpos monoclonales del panel son todos específicos de tipo y dependientes de VLP. Los anticuerpos pueden distinguirse unos de otros en cuanto a los residuos de aminoácidos que afectan a la unión de los anticuerpos individuales, aunque hay posiciones solapantes para todos los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos adicionales usados en estos estudios también se obtuvieron del Dr. Neil Christensen.

El gen sustituido HPV16:D202E produce VLP a juzgar por la unión no deficiente del anticuerpo monoclonal H16.U4. Este anticuerpo monoclonal es específico de HPV16 y dependiente de VLP. La VLP de HPV16:D202E tienen realmente una unión deficiente al H16:V5, que es también un anticuerpo monoclonal específico de HPV16 y dependiente de VLP, que como muestran tanto los autores de la invención como el Dr. Neil Christensen, se une a VLP de manera claramente diferente al H16:U4. Estas VLPs pueden ser útiles para distinguir y caracterizar las respuestas inmunológicas a una infección por HPV16 o a la vacunación.

Este problema no se ha solucionado en el pasado y, en la medida de nuestro conocimiento, es la primera demostración de que un epítopo dependiente de la conformación es continuo.

Había una dificultad principal que superar. Cómo el epítopo es conformacional fue necesario expresar cualquier proteína L1 del análisis de manera que facilitara la formación de partículas semejantes a virus que imitarán la estructura del virus.

Sin el aislamiento de un epítopo específico de tipo sería difícil discriminar las respuestas al HPV16.

Un uso de la VLP derivada de HPV16 es como reactivo en un ensayo serológico. El suero del ensayo puede analizarse mediante la unión de las VLP de HPV16:D202E. La unión demuestra la presencia de una respuesta al tipo U4. Esto también puede usarse para valorar los niveles relativos de las respuestas al tipo V5 en diferentes muestras de suero.

Sumario de la invención

Se proporcionan partículas sintéticas semejantes a virus útiles en la caracterización de la infección por el papilomavirus humano tipo 16 (HPV16) y los ensayos que emplean las partículas sintéticas.

Las secuencias de aminoácidos de la proteína L1 de HPV16 y las sustituciones específicas hechas en este estudio están disponibles en el EMBL Gene Bank.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan partículas sintéticas semejantes a virus, de acuerdo con la reivindicación 1, útiles en la
caracterización de la infección por el papilomavirus humano tipo 16 (HPV16) y los ensayos, de acuerdo con la reivindicación 2, que emplean las partículas sintéticas. Las VLP sintéticas pueden usarse para controlar las respuestas serológicas a la infección por HPV16 y a la inmunización.

Las infecciones por papilomavirus se presentan en una diversidad de animales, incluyendo los seres humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus infectan células epiteliales y, generalmente, inducen tumores fibroepiteliales o epiteliales benignos en el lugar de la infección.

Los papilomavirus pueden clasificarse en distintos grupos en base al organismo hospedador que infectan. Los papilomavirus humanos (HPV) clasifican adicionalmente en más de 60 tipos en base a la homología de secuencia del ADN (para una revisión, véase Papilomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed), CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser inmunógenos específicos de tipo porque la inmunidad neutralizante a la infección de un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.

En los seres humanos, los diferentes tipos de HPV provocan distintas enfermedades. Los tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10 y 26-29 de HPV provocan verrugas benignas tanto en individuos normales como en inmunodeprimidos. Los tipos 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 de HPV provocan lesiones planas en individuos inmunodeprimidos. Los tipos 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55 de HPV provocan condilomas benignos de la mucosa respiratoria o genital. Los tipos 16 y 18 de HPV provocan displasia epitelial del tracto genital y están asociados con la mayoría de los carcinomas in situ e invasivos del cuello uterino, vagina, vulva y canal anal. Los HPV6 y HPV11 provocan la mayoría de las verrugas genitales y papilomas laríngeos.

Los estudios inmunológicos en animales han mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a las proteínas de la cápsida de los papilomavirus previene la infección con virus homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces frente a los papilomavirus se ha ralentizado debido a las dificultades asociadas con el cultivo de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz frente al HPV se ha ralentizado particularmente debido a la ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización del papilomavirus por anticuerpos parece ser específica de tipo y dependiente de epítopos conformacionales de la superficie del virus.

Los papilomavirus son pequeños (50-60 nm), sin envoltura, son un virus de ADN icosaédricos que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Las fases de lectura abiertas (ORF) del genoma del virus se designan E1 a E7 y L1 y L2, en donde "E" significa temprano y "L" significa tardío. L1 y L2 codifican las proteínas de la cápsida del virus. Los genes tempranos (E) están asociados con funciones tales como la replicación viral y la transformación celular.

La proteína L1 es la principal proteína de la cápsida y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína secundaria de la cápsida para la que se pronostica un peso molecular de 55-60 kDa y un peso molecular aparente de 75-100 kDa según se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Se ha informado de la producción de proteínas L1 de HPV16, L2 de HPV16 y L1 de HPV6 mediante cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Esto podría ser útil para desarrollar métodos de producción de grandes cantidades de proteínas de papilomavirus de cualquier especie y tipo mediante el cultivo de levaduras recombinantes. Podría también ser útil para producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus que tienen las propiedades de conferir inmunidad de las proteínas naturales, tal como la conformación de la proteína natural. Para conseguir este último fin sería necesario analizar el efecto de numerosas mutaciones en el gen L1 sobre la unión de anticuerpos de propiedades conocidas (dependientes de VLP, con reactividad cruzada, etc.).

El exploración empírica de secuencias de péptidos naturales o modificados en busca de restos funcionales es inherentemente dependiente de la expresión de muy diversas variantes de la secuencia para ensayar su potencia funcional relativa. El nivel de expresión de proteína obtenido puede ser particularmente crítico en el caso de proteínas virales estructurales que se autoensamblan, ya que frecuentemente la eficacia del autoensamblaje es dependiente de la concentración. El sistema del vector de expresión de baculovirus en insectos ha sido ampliamente usado para estudiar el autoensamblaje viral pero generalmente, requiere el aislamiento previo y la expansión de una estirpe viral recombinante purificada de una calva para generar cantidades útiles de partículas autoensambladas. Examinando diversas posibilidades para la expresión de niveles analíticos de la proteína L1 de la cubierta de los papilomavirus del conejo de Florida humano tipo 11, los autores de la invención encontraron que incluso una breve cotransfección transitoria de células de insecto con vectores de transferencia de baculovirus y ADN viral rinde partículas ensambladas que fueron inmunológicamente indistinguibles de las partículas obtenidas previamente a partir de estirpes purificadas de clavas (Benincasa y col. 1996. Rapid, high-level transient expression of papillomavirus-like particles in insect cells. Biotechniques 20,890-895). Dentro de los seis días desde la cotransfección ADN viral/plásmido de células Sf9, se pudieron mostrar al menos 1-2 mg de partículas L1 ensambladas/100 mm de placa. Este nivel de expresión es más que suficiente para ensayos de funcionalidad, y tiene varias ventajas sobre otros sistemas comparables de expresión transitoria en células de mamífero.

Para definir epítopos neutralizantes en infecciones por HPV, fue necesario identificar los restos de aminoácidos que confieren especifidad específica de tipo antigénico en los subtipos de papilomavirus humanos (Christensen, N. D., y col. 1990, Monoclonal antibody-mediated neutralization of infectious human papillomavirus type 11). Muchos de los epítopos específicos de tipo son conformacionalmente dependientes y son detectables únicamente tras el ensamblaje de la VLP. Se ha demostrado que la proteína estructural L1 de la cubierta de varios papilomavirus animales y humanos se autoensambla eficazmente cuando se expresa en células de insecto por medio de cepas de baculovirus recombinantes (Christensen, N. D. y col. 1994, Assembled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high titers of neutralizing antibodies. J. Gen. Virol. 75, 2271-2276). El tiempo y el trabajo implicados en la generación de fagos recombinantes excluyen el uso de este método para seleccionar muy diversas variantes de VLP producidas a través de mutagénesis dirigida. Sin embargo, los autores de la invención observaron previamente que cuando se expresa en el sistema de baculovirus, una proteína recombinante es detectable como producto secretado en cantidades de mg/ml dentro de los 5-7 días desde la transfección inicial de las células del insecto con ADN de plásmido y viral. En base a esta observación, los autores de la invención examinaron si se podrían acumular cantidades suficientes de proteína L1 de papilomavirus que permitieran el autoensamblaje de VLP después de una expresión transitoria, particularmente si se utiliza un sistema de transfección con baculovirus más eficaz tal como el Baculogold ^{TM}(Pharmingen, San Diego, CA). Empleando un protocolo rápido de transfección transitoria de 6 días, se produce la proteína L1 de la cubierta de numerosos tipos de papilomavirus, ensamblada apropiadamente en VLP. Los extractos preparados a partir de células transfectadas transitoriamente con construcciones del gen L1 de HPV11 o CRPV que contenían material inmunógeno reconocido por anticuerpos monoclonales específicos de tipo y dependientes de VLP generados contra VLP de HPV11 o CRPV. El material expresado transitoriamente no tenía reactividad cruzada con otros anticuerpos específicos de tipo, y el reconocimiento fue sensible a la desnaturalización alcalina, lo que demuestra adicionalmente la fidelidad de la formación de VLP.

Se demostró previamente que los epítopos conformacionales de HPV pueden ser mapeados. Específicamente, se mostró que los restos Gly131-Tyr132 de L1 de HPV11 eran responsables de la unión específica de tipo de varios anticuerpos monoclonales neutralizantes de HPV11 (Ludmerer y col., 1996. Two amino acid residues confer type specificity to a neutralizing, conformationally dependent epitope on human papillomavirus type 11. J. Virol. 70, 4791-4794). Para valorar los efectos de las sustituciones del residuo 202 de HPV16, se mutó el gen L1 de HPV16 en esta posición, y se empleó el sistema de expresión transitoria de Sf9 descrito anteriormente para expresar VLP.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para definir adicionalmente la invención, sin embargo, sin limitar la invención a estos ejemplos en particular.

Ejemplo 1 Generación de construcciones de expresión de ensayo

El gen estructural L1 de HPV16 se subclonó tanto en BluScript (Pharmacia) para la mutagénesis, como en pVL1393 (Stratagene) para la expresión en células Sf9. Las mutaciones se generaron usando el kit de mutagénesis in vitro Sculptor de Amersham, se verificaron por secuenciación y se subclonaron en pVL1393 para la expresión en células Sf9.

Ejemplo 2 Expresión transitoria de VLP de L1 en células Sf9

Se transfectaron células Sf9 usando el kit de transfección BaculoGold (Pharmingen). Las transfecciones se hicieron esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Se transfectaron 8\cdot10^{8} células Sf9 en una placa de 100 mm con 4 mg de ADN BaculoGold y 6 \mug de ADN de ensayo. Las células se recogieron después de seis días y se analizaron respecto a la producción de VLP.

Ejemplo 3 Preparación de extractos de Sf9 y ensayos de ELISA

Las células se recogieron a los seis días después de la transfección mediante raspado seguido de una centrifugación a baja velocidad. Las células se resuspendieron en 300 ml de tampón de lisis (NaCl 1M, Tris 0.2 M pH 7,6) y se homogeneizaron durante 30 segundos en hielo usando un Polytron PT 1200 B con una sonda PT-DA 1205/2-A (Brinkman) en un tubo Falcon 1259. Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 3 minutos para sedimentar los restos. Los tubos se lavaron con 150 ml adicionales de tampón de lisis, los sobrenadantes se recogieron en un tubo de microcentrifugadora de 1,5 ml y se centrifugaron de nuevo durante cinco minutos en una microcentrifugadora Eppendorf (Brinkman). Los sobrenadantes se recogieron y se guardaron a 4ºC hasta su uso. Típicamente los ensayos de ELISA se llevaron a cabo el mismo día.

Se diluyeron 5 ml de extracto en 50 ml de BSA 1% en PBS (solución salina tamponada con fosfato; NaPO_{4}20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM) y se sembraron sobre una placa de poliestireno. La placa se incubó toda la noche a 4ºC. Los extractos se eliminaron y la placa se bloqueó con leche en polvo 5% en PBS. Todas las etapas de lavado siguientes se realizaron con BSA 1% en PBS. La placa se incubó a temperatura ambiente con el anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios, anticuerpos monoclonales generados contra VLP de HPV11, se obtuvieron como estirpes de ascitis del Dr. Neil Christensen (Pennsylvania State University). Se diluyeron hasta 10^{5} en BSA 1% en PBS antes del uso. Después de lavar, las placas se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario, anti-ratón IgG (g) de cabra marcado con peroxidasa, se compró en Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. y se usó a una dilución 10^{3} en BSA 1% en PBS. Después del lavado final, se realizó un ensayo de fosfatasa alcalina y se leyó la absorvancia a 405 nm.

Ejemplo 4 Sustituciones en HPV16

Para valorar los efectos sobre la unión de los anticuerpos monoclonales de las sustituciones en L1 de HPV16, se expresaron transitoriamente clones mutados en células Sf9 y se analizó la unión, en un formato ELISA, a los extractos preparados a partir de las células transfectadas. La expresión de L1 fue normalizada usando el anticuerpo monoclonal H16.D9, un anticuerpo monoclonal generado frente a VLP de HPV16 que se une únicamente a material desnaturalizado. Para establecer una línea de base de la unión del anticuerpo monoclonal, también se expresó el clon HPV16:D202H, un clon de L1 que previamente había mostrado que no produce VLP. Como control adicional, también se expresaron VLP de HPV11. Los anticuerpos monoclonales H16.U4 y H16.V5 no se unen a VLPs de
HPV11.

Para determinar la afección en la unión de cualquier resto particular, se expresaron tanto HPV16 como su correspondiente derivado HPV16 en el sistema de expresión transitorio. Se realizó un ELISA usando el panel de anticuerpos monoclonales específicos de HPV16 y se compararon los resultados de ambos. La producción de L1 se normalizó con el anticuerpo monoclonal H16.D9. El anticuerpo H16.D9 tiene reactividad cruzada con HPV11 y su epítopo es lineal y se reconoce independientemente de la formación de VLP. De este modo se mide la producción de L1. Un valor normalizado en el intervalo de 0,1 a 0,2 es esencialmente fondo, lo que significa que no podemos detectar la unión del anticuerpo al VLP mutante.

TABLA 1

VLP	H16.U4	H16.V5
HPV16	0,79	1,08
HPV16:D202E	0,59	0,15
HPV16:D202H	0,21	0,19
HPV11	0,06	0,06

Ejemplo 5 Control de las respuestas serológicas a la infección por HPV11 o a la inmunización

Los VLP de HPV16:D202E se usaron para controlar las respuestas inmunitarias frente a HPV16 después de la infección viral o de la inmunización con VLP de HPV16. Se revestirán los pocillos de una placa de microvaloración con HPV16 y HPV16:D202E en forma natural. Después de bloquear, los sueros de ensayo serán incubados y analizados en un formato ELISA. La unión a los VLP de HPV16:D202E demostrará un componente semejante a U4 en la respuesta inmunitaria. Para determinar una respuesta del tipo V5, los sueros de ensayo se equilibrarán primero con una cantidad saturante predeterminada de VLP de HPV16:D202E. Esto puede llevarse a cabo en el pocillo de una placa de microvaloración. El sobrenadante se eliminará y se añadirá como un anticuerpo primario en el pocillo de la placa de microvaloración revestido previamente con prototipos de VLP de HPV16. Ya que las respuestas semejantes a U4 habrán sido selectivamente eliminadas, la unión demostrará la presencia de respuestas semejantes a V5.

Ejemplo 6 Expresión transitoria de VLP en células Sf9

El gen estructural L1 de HPV11 se clonó a partir de cepas clínicas usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores diseñados a partir de la secuencia publicada de L1 (8,17). El gen estructural L1 de CRPV se clonó mediante PCR a partir del ADN genómico viral. Los genes de L1 se subclonaron en pVL1393 (Stratagene) para la expresión en células Sf9.

Las células Sf9 se cotransfectaron usando el kit de transfección BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA). Las transfecciones se hicieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación: Se transfectaron 8\cdot10^{6} células Sf9 en una placa de 100 mm con 4 mg de ADN viral Baculogold y 6 \mug de ADN plasmídico de ensayo. Las células se recogieron después de seis días, excepto cuando se especifica de otro modo, y se analizan respecto a la producción de VLP mediante inmunotransferencia o ensayo de ELISA (véase más adelan-
te).

Ejemplo 7 Preparación de extractos de Sf9 y ensayos de ELISA

Las células se recogieron seis días después de la transfección. Las placas se rasparon para resuspender las células y las células se recogieron mediante centrifugación a baja velocidad. Las células se resuspendieron en 300 ml de tampón de lisis (NaCl 1 M, Tris 0.2 M pH 7,6) y se homogeneizaron durante 30 segundos en hielo usando un Polytron PT 1200 B con una sonda PT-DA 1205/2-A (Brinkman) en un tubo Falcon 2059. Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm en una centrifugadora GPR (Beckman Instruments, Inc. Palo Alto, CA) durante 3 minutos para sedimentar los restos. Los tubos se lavaron con 150 ml adicionales de tampón de lisis, los sobrenadantes se recogieron en un tubo de microcentrifugadora de 1,5 ml y se centrifugaron de nuevo durante 5 minutos en una microcentrifugadora Eppendorf (Brinkman). Los ensayos de ELISA se comenzaron el mismo día.

Se diluyeron 5 ml de extracto en 50 ml de BSA 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se realizaron partes alicuotas en placas de microvaloración de 96 pocillos Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Inc.) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Los extractos se eliminaron y la placa se bloqueó con leche en polvo 5%/PBS. Todos las etapas de lavado siguientes se realizaron con BSA 1%/PBS. La placa se incubó a temperatura ambiente con el anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios, anticuerpos monoclonales CRPV.5A y H11.F1, se obtuvieron como estirpes de ascitis del Dr. Neil Christensen. Son anticuerpos dependientes de VLP y específicos de tipos que reconocen VLP de CRPV y de HPV11, respectivamente (Neil Christiansen, comunicación personal). Se diluyeron 10^{5} veces en BSA 1%/PBS antes de usarlo. Después de lavar en BSA 1%/PBS, las placas se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario, anti-ratón IgG (g) de cabra marcado con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) y se usó a una dilución 10^{3} en BSA 1% en PBS. Después del lavado final, se realizó un ensayo de fosfatasa alcalina y se leyó la absorvancia a 405 nm.

Claims (2)

1. Partículas sintéticas semejantes al virus HPV16 (VLP), designadas HPV16:D202E, que contienen una sustitución de glutamato por el aspartato que se presenta de forma natural en el resto 202 de L1.

2. Un método de ELISA para serotipar las respuestas inmunitarias al HPV16 y a los VLP sintéticos de HPV16 que contienen una sustitución de glutamato por el aspartato que se presenta de forma natural en el resto 202 de L1 (HPV16:D202E) que puede distinguir las diferencias en las respuestas inmunitarias del tipo 16 y que comprende las siguientes etapas:

a)

sembrar las muestras de VLP HPV16:D202E en una placa de ELISA;

b)

incubar las muestras;

c)

bloquear las muestras;

d)

lavar las muestras;

e)

incubar un grupo de muestras de suero de ensayo;

f)

eliminar el suero no unido e incubar de nuevo con VLP de HPV16 en formato ELISA como se describe en b-e;

g)

incubar la mezcla;

h)

lavar la mezcla;

i)

añadir IgG (g) de cabra anti-ratón;

j)

incubar las muestras;

k)

lavar las muestras;

l)

revelar con un ensayo de fosfatasa alcalina y leer a 405 nm.