ES2258778T3 - Particulas semejantes a virus sinteticas hpv11. - Google Patents
Particulas semejantes a virus sinteticas hpv11.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION ES UNA SERIE DE PARTICULAS SINTETICAS SIMILARES A UN VIRUS UTILES EN LA CARACTERIZACION DE LA INFECCION PRODUCIDA POR EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y LAS PRUEBAS QUE EMPLEAN LAS PARTICULAS SINTETICAS SIMILARES AL VIRUS.
Description
Partículas semejantes a virus sintéticas
HPV11.
La presente invención es una serie de partículas
semejantes a virus sintéticas (virus-like
particles, VLP) útiles en la caracterización de la infección por
papilomavirus humano y ensayos que emplean las partículas semejantes
a virus sintéticas.
Las infecciones por papilomavirus se producen en
varios animales, incluyendo los seres humanos, ovejas, perros,
gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan células epiteliales, generalmente induciendo tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en la zona de la infección.
Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de la especie;
un papilomavirus humano no puede infectar a un animal no humano.
Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos
distintos según el hospedador al que infectan. Los papilomavirus
humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de 60 tipos según
la homología en la secuencia de ADN (como reseña, véase
Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press,
Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser inmunógenos
específicos de tipo porque una inmunidad que neutraliza una
infección de un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a
otro tipo de papilomavirus.
En los seres humanos, diferentes tipos de HPV
provocan distintas enfermedades. Los tipos de HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10
y 26-29 provocan verrugas benignas tanto en
individuos normales como inmunodeprimidos. Los tipos de HPV 5, 8, 9,
12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50
causan lesiones planas en individuos inmunodeprimidos. Los tipos de
HPV 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55
provocan condilomas no malignos de la mucosa genital o respiratoria.
Los tipos de HPV 16 y 18 provocan displasia epitelial de la mucosa
genital y están relacionados con la mayoría de los carcinomas in
situ e invasivos de cuello de útero, de vagina, de vulva y del
conducto anal. Los HPV6 y HPV11 son los agentes causales de más del
90% de todos los condilomas (verrugas genitales) y papilomas
laríngeos. El subtipo más abundante del HPV de tipo 6 es HPV6a.
Estudios inmunológicos en animales han
demostrado que la producción de anticuerpos que neutralizan los
antígenos del papilomavirus previene la infección por el virus
homólogo. El desarrollo de vacunas eficaces contra el papilomavirus
se ha visto ralentizado por las dificultades relacionadas con el
cultivo de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una
vacuna eficaz contra el HPV ha estado particularmente ralentizado
por la ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización de
los papilomavirus por parte de los anticuerpos parece ser
específica del tipo y dependiente de los epítopos conformacionales
de la superficie del virus.
Los papilomavirus son virus de ADN icosaédricos
pequeños (50-60 nm), sin cubierta, que codifican
para hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los marcos
abiertos de lectura (ORF) de los genomas víricos se denominan de E1
a E7 y L1 y L2, en las que "E" significa temprano
(early) y "L" significa tardío (late). L1 y L2
codifican para proteínas de la cápside del virus. Los genes
tempranos (E) están relacionados con funciones tales como la
replicación vírica y la transformación celular.
La proteína L1 es la principal proteína de la
cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína menor de la cápside que tiene un peso
molecular predicho de 55-60 kDa y un peso molecular
aparente de 75-100 kDa según se determina mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos
sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna con
respecto a la proteína L1. Las proteínas L2 están altamente
conservadas entre los diferentes papilomavirus, especialmente los 10
aminoácidos básicos en el C terminal. El ORF de la L1 está
altamente conservado entre los diferentes papilomavirus.
Los genes de L1 y L2 se han usado para producir
vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones por
papilomavirus en animales. Zhou y col., (1991; 1992) clonaron los
genes L1 y L2 del HPV de tipo 16 en un vector del virus de la
variolovacuna e infectaron células de mamífero CV-1
con el vector recombinante para producir partículas semejantes a
virus (VLP).
Se han producido papilomavirus L1 y L2
recombinantes bovinos derivados de bacterias. Sueros neutralizados
con las proteínas bacterianas recombinantes presentaron reacciones
cruzadas con el virus natural a bajos niveles, probablemente debido
a diferencias en las conformaciones de las proteínas naturales y
derivadas de las bacterias.
Se han usado baculovirus recombinantes que
expresaban los ORFs de la L1 del HPV6, la L1 del HPV11, la L1 del
HPV16, la L1 del HPV18, la L1 del HPV31 o la L2 del HPV16 para
infectar células Sf9 de insectos y producir proteínas L1 y L2. Los
análisis por inmunotransferencia Western demostraron que las
proteínas L1 y L2 derivadas de baculovirus reaccionaban con
anticuerpos contra el HPV16. La L1 derivada de baculovirus forma
VLP.
Carter y col., (1991) demostraron la producción
de las proteínas L1 del HPV16 y L2 del HPV16 mediante cepas
recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Carter y col.
también demostraron la producción de las proteínas L1 y L2 del
HPV6b. La proteína L1 del HPV6b no era una proteína L1 de longitud
completa. Se produjeron proteínas recombinantes como productos
intracelulares, y también como productos secretados. Las proteínas
L1 y L2 recombinantes tenían unos pesos moleculares similares a los
de las proteínas naturales. Cuando las proteínas eran expresadas
intracelularmente, la mayor parte de la proteína resultaba ser
insoluble cuando las células eran lisadas en ausencia de reactivos
desnaturalizantes. Aunque esta insolubilidad puede facilitar la
purificación de la proteína, puede obstaculizar el análisis de los
epítopos naturales de la proteína.
Las proteínas recombinantes secretadas desde la
levadura resultaron contener carbohidratos derivados de la levadura.
La presencia de estos oligosacáridos conectados por N puede
enmascarar los epítopos naturales. Además, las proteínas
recombinantes secretadas pueden contener otras modificaciones, tales
como la retención de la secuencia líder secretora.
La presente invención está dirigida a la
producción de una serie de partículas semejantes a virus sintéticas
útiles en la caracterización de la infección por papilomavirus
humano y ensayos que emplean las partículas semejantes a virus
sintéticas.
La invención implica la caracterización de los
residuos específicos de la L1 del HPV11 que son necesarios para la
unión de los anticuerpos neutralizantes.
La L1 del HPV11 sólo contiene 38 aminoácidos
diferentes de la L1 del HPV6, más una inserción de residuo. A pesar
de la fuerte identidad entre estas dos proteínas, se produjo un
conjunto de anticuerpos monoclonales neutralizantes que son
específicos para las VLP del HPV11. Determinamos cuáles de estas
posiciones de aminoácidos eran importantes para la unión de los
anticuerpos monoclonales neutralizantes. Esto se realizó evaluando
la unión de los anticuerpos monoclonales a una familia de clones del
HPV11 que contienen sustituciones de residuos de aminoácidos del
HPV6 por residuos de aminoácidos del HPV11 en estas posiciones.
El conjunto de anticuerpos monoclonales
neutralizantes para HPV11 se obtuvo de Neil Christiansen
(Pennsylvania State University, Hershey, PA). Los anticuerpos
monoclonales del conjunto son específicos para el HPV11 y
dependientes de las VLP. Los anticuerpos pueden distinguirse entre
sí según qué residuos de aminoácidos afectan a la unión de los
anticuerpos individuales, aunque hay posiciones solapantes para
todos los anticuerpos monoclonales.
Estos residuos definen colectivamente el epítopo
para los anticuerpos conocidos por neutralizar el HPV11. En
principio, la mutación de la L1 del HPV6 sólo en estas posiciones
elegidas da como resultado la unión de estos anticuerpos
monoclonales neutralizantes específicos del HPV11. Las VLP derivadas
del HPV6 pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales contra
el epítopo neutralizante del HPV11. Esta es la base de un ensayo de
liberación para verificar que las VLP creadas del HPV11 contienen el
epítopo neutralizante.
Este problema no ha sido resuelto en el pasado
y, hasta nuestro conocimiento, es la primera demostración de la
transferencia de un epítopo conformacionalmente dependiente.
Había dos dificultades que superar. En primer
lugar, el epítopo es conformacional, y los medios convencionales de
cartografiado de epítopos, de unión a fragmentos de péptidos, no
pudieron ser utilizados. Fue necesario expresar cualquier proteína
L1 de prueba de una forma que facilitara la formación de partículas
semejantes a virus que mimeticen la estructura del virus. En segundo
lugar, el gran número de clones de L1 requerido para el
cartografiado requirió la producción de un medio fácil para expresar
las proteínas víricas de cubierta de prueba.
Sin el conocimiento del epítopo neutralizante
sería difícil validar la elaboración de VLP para uso comercial.
Un uso de las VLP derivadas es como reactivos en
un ensayo de liberación frente al HPV11. La L1 del HPV6 está mutada
para que se corresponda con el HPV11 en las posiciones definidas por
estos estudios. La unión de los anticuerpos monoclonales
neutralizantes del HPV11 a estas VLP derivadas del HPV6 será
demostrada.
Estas VLP derivadas del HPV6 pueden usarse en un
ensayo de unión de competición con VLP elaboradas del HPV11 para su
unión a los anticuerpos monoclonales neutralizantes del HPV11. Sólo
las derivadas del HPV6 que demostraron unirse a los anticuerpos
monoclonales competirán con el material auténtico.
Alternativamente, pueden producirse anticuerpos
monoclonales contra el epítopo neutralizante sobre el HPV6 derivado;
después, se demostrará que la vacuna elaborada del HPV11 se une a
estos anticuerpos.
La presente invención es una serie de partículas
semejantes a virus sintéticas útiles en la caracterización de la
infección por papilomavirus humano y ensayos que emplean las
partículas sintéticas.
La Figura 1 muestra que las VLP con propiedades
específicas de tipo son producidas en una transfección transitoria.
Se cotransfectaron células Sf9 con ADN Baculogold^{TM} y bien
pVL1393:CRPV o bien pVL1393:HPV11. Las células se recogieron después
de seis días, se prepararon los extractos y se realizaron ELISA
según se describe en el texto. Columna 1, VLP de CRPV; columna 2,
VLP de HPV11; columna 3, extracto de SF9; columna 4, ADN de
baculovirus; columna 5, pVL1393 : CRPV; columna 6, pVL1393 :
HPV11.
A. El anticuerpo primario es una dilución de
10^{-5} de CRPV.5A de fluido de ascitis.
B. El anticuerpo primario es una dilución de
10^{-5} de H11.F1 de fluido de ascitis.
La Figura 2 muestra que el material inmunogénico
producido mediante transfección transitoria es sensible a la
desnaturalización. Se cotransfectaron células Sf9 con pVL1393:HPV11
y ADN de BaculoGold^{TM}, las células se recogieron después de
seis días y los extractos se prepararon según se describe en el
texto. Una porción de los extractos se desnaturalizó mediante
dilución en carbonato sódico 0,1 M, pH 10,5, y se incubó a
temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces estos extractos se
extendieron en una placa de microtitulación y se dejaron secar. Los
extractos no tratados se extendieron sobre placas de microtitulación
y se incubaron hasta el día siguiente a 4°C. Se realizaron ELISA
según se describe en Procedimientos usando una dilución de 10^{-5}
de H11.F1 o de H6.C6 de ascitis. Columna 1, extracto de Sf9; columna
2, extracto de pVL1393. A, el extracto no está desnaturalizado. B,
el extracto se trató con tampón de carbonato.
La Figura 3 muestra las secuencias de
aminoácidos de la proteína L1 del HPV11 y del HPV6. Estas secuencias
también están disponibles en el EMBL Gene Bank.
La presente invención es una serie de partículas
semejantes a virus sintéticas (VLP) útiles en la caracterización de
la infección por papilomavirus humano y ensayos que emplean las
partículas semejantes a virus sintéticas, que pueden usase para
monitorizar y confirmar las VLP elaboradas mediante tecnologías de
ADN recombinante.
Las infecciones por papilomavirus se producen en
varios animales, incluyendo los seres humanos, ovejas, perros,
gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan células epiteliales, generalmente induciendo tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en la zona de la
infección.
Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos
distintos según el hospedador al que infectan. Los papilomavirus
humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de 60 tipos según
la homología en la secuencia de ADN (como reseña, véase
Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press,
Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser inmunógenos
específicos de tipo porque una inmunidad que neutraliza una
infección de un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a
otro tipo de papilomavirus.
En los seres humanos, diferentes tipos de HPV
provocan distintas enfermedades. Los tipos de HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10
y 26-29 provocan verrugas benignas tanto en
individuos normales como inmunodeprimidos. Los tipos de HPV 5, 8, 9,
12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50
causan lesiones planas en individuos inmunodeprimidos. Los tipos de
HPV 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55
provocan condilomas no malignos de la mucosa genital y respiratoria.
Los tipos de HPV 16 y 18 provocan displasia epitelial del tracto
genital y están relacionados con la mayoría de los carcinomas in
situ e invasivos de cuello de útero, de vagina, de vulva y del
conducto anal. Los HPV6 y HPV11 provocan la mayoría de las verrugas
genitales y papilomas laríngeos.
Estudios inmunológicos en animales han
demostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes
con-
tra las proteínas de la cápside del papilomavirus previene la infección por el virus homólogo. El desarrollo de va-
cunas eficaces contra el papilomavirus se ha visto ralentizado por las dificultades relacionadas con el cultivo
de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz contra el HPV ha estado particularmente ra-
lentizado por la ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización de los papilomavirus por parte de
los anticuerpos parece ser específica del tipo y dependiente de los epítopos conformacionales de la superficie del
virus.
tra las proteínas de la cápside del papilomavirus previene la infección por el virus homólogo. El desarrollo de va-
cunas eficaces contra el papilomavirus se ha visto ralentizado por las dificultades relacionadas con el cultivo
de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz contra el HPV ha estado particularmente ra-
lentizado por la ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización de los papilomavirus por parte de
los anticuerpos parece ser específica del tipo y dependiente de los epítopos conformacionales de la superficie del
virus.
Los papilomavirus son virus de ADN icosaédricos
pequeños (50-60 nm), sin cubierta, que codifican
para hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los marcos
abiertos de lectura (ORF) de los genomas víricos se denominan de E1
a E7 y L1 y L2, en las que "E" significa temprano
(early) y "L" significa tardío (late). L1 y L2
codifican para proteínas de la cápside del virus. Los genes
tempranos (E) están relacionados con funciones tales como la
replicación y la transformación víricas.
La proteína L1 es la principal proteína de la
cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína menor de la cápside que tiene un peso
molecular predicho de 55-60 kDa y un peso molecular
aparente de 75-100 kDa según se determina mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida.
Se ha informado de la producción de las
proteínas L1 del HPV16, L2 del HPV16 y L1 del HPV de tipo 6 por
parte de cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae.
Sería útil desarrollar procedimientos para producir grandes
cantidades de proteínas de papilomavirus de cualquier especie y tipo
mediante el cultivo de levaduras recombinantes. También sería útil
producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus que
tuvieran las propiedades de conferir inmunidad de las proteínas
naturales, tales como la conformación de la proteína natural. Para
conseguir este último objetivo sería necesario analizar el efecto de
las numerosas mutaciones en el gen de la L1 sobre la unión de
anticuerpos de propiedades conocidas (dependientes de VLP, reactivos
cruzados, etc.)
El cribado empírico de secuencias de péptidos
naturales o modificados genéticamente para buscar residuos
funcionales es inherentemente dependiente de la expresión de un gran
número de variantes de las secuencias, para ensayar su potencia
funcional relativa. El nivel de expresión de la proteína obtenido
puede ser particularmente crítico en el caso de proteínas
estructurales víricas autoensamblantes, porque la eficacia del
autoensamblaje depende frecuentemente de la concentración. Se ha
usado ampliamente el sistema vector de expresión de baculovirus de
insectos para estudiar el autoensamblaje vírico, pero generalmente
requiere un aislamiento y expansión previos de una estirpe vírica
recombinante purificada en placa para producir cantidades útiles de
partículas autoensambladas. Al examinar varias posibilidades para
la expresión de niveles analíticos de la proteína de cubierta L1 de
los papilomavirus del conejo de rabo blanco y humano de tipo 11,
averiguamos que incluso una breve cotransfección transitoria de
células de insecto con vectores de transferencia de baculovirus y
ADN vírico dieron lugar a partículas ensambladas que eran
inmunológicamente indistinguibles de las partículas obtenidas
previamente a partir de las estirpes purificadas en placa. A los
seis días de la cotransfección de las células Sf9 con ADN de
plásmido/vírico, pudieron demostrarse al menos 1-2
\mug de las partículas L1 ensambladas/100 mm de placa. Este nivel
de expresión es más que suficiente para ensayar la funcionalidad, y
tiene numerosas ventajas sobre los sistemas de expresión temporal de
células de mamíferos comparables.
Para definir los epítopos neutralizantes en las
infecciones por HPV, necesitamos identificar los residuos de
aminoácidos que confieren una especificidad de tipo antigénica sobre
los subtipos de papilomavirus humanos (Christensen, N. D., y col.,
1990, Monoclonal antibody-mediated neutralization of
infectious human papillomavirus type 11, J. Virol. 64,
1936-1944). Muchos de los epítopos específicos de
tipo son conformacionalmente dependientes, y sólo son detectables
tras el ensamblaje de las VLP. Se ha demostrado que la proteína
estructural de cubierta L1 de muchos papilomavirus animales y
humanos se autoensambla eficazmente cuando se expresa en células de
insectos a través de cepas de baculovirus recombinantes
(Christensen, N. D., y col., 1994, Assembled
baculovirus-expressed human papillomavirus type 11
L1 capsid protein virus-like particles are
recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high
titres of neutralizing antibodies. J. Gen. Virol. 75, 2271 - 2276).
El tiempo y el trabajo implicados en la producción de fagos
recombinantes imposibilitan el uso de este procedimiento para cribar
un gran número de variantes de VLP producidas mediante mutagénesis
dirigida. Sin embargo, previamente observamos que cuando se
expresaba en el sistema de baculovirus, una proteína recombinante es
detectable como un producto secretado en cantidades de \mug/ml en
los 5-7 días desde la transfección inicial de
células de insectos con ADN de plásmidos y víricos. Basándonos en
esta observación, examinamos si se acumularían cantidades
suficientes de proteína L1 de papilomavirus como para permitir el
autoensamblaje en VLP tras la expresión transitoria, particularmente
si se utilizaban sistemas de transfección de baculovirus más
eficaces, tales como el Baculogold^{TM} (Pharmingen, San Diego,
CA). Empleando un protocolo rápido de transfección transitoria de 6
días, se produjo la proteína recubierta L1 de numerosos tipos de
papilomavirus, adecuadamente ensamblada en VLP. Los extractos
preparados a partir de células transfectadas transitoriamente con
constructos del gen de la L1 del CRPV o del HPV11 contenían material
inmunogénico reconocido por anticuerpos monoclonales dependientes de
VLP y específicos de tipos producidos contra las VLP de CRPV o de
HPV11. El material expresado transitoriamente no era reactivo
cruzado con otros anticuerpos específicos de tipo, y el
reconocimiento era sensible a una desnaturalización alcalina, lo que
demostraba adicionalmente la fidelidad en la formación de las
VLP.
Para cartografiar el epítopo neutralizante de
HPV11, mutamos individualmente el HPV11 en los residuos en los que
la secuencia diverge de la secuencia de HPV6b. Las posiciones fueron
mutadas para que se correspondieran con la secuencia de HPV6b (se
eliminó la tirosina de la posición 132 para analizar el efecto de
esta inserción). Usando el sistema de expresión transitoria Sf9
descrito anteriormente, estos genes mutantes de la L1 del HPV11
fueron expresados y analizados para comprobar su unión mediante
anticuerpos monoclonales específicos de HPV11.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
definir adicionalmente la invención sin limitar, sin embargo, la
invención a los detalles de estos ejemplos.
El gen estructural de la L1 del HPV11 se clonó a
partir de cepas clínicas usando una PCR con cebadores diseñados a
partir de la secuencia publicada para la L1. El gen de la L1 se
subclonó posteriormente tanto en BlueScript (Pharmacia) para
mutagénesis como en pVL1393 (Stratagene) para su expresión en
células Sf9.
Se introdujeron mutaciones en el gen de la L1
usando el kit de mutagénesis in vitro Amersharn Scultor. El
aspecto de la mutación deseada fue confirmado mediante una
secuenciación, y el gen mutado se subclonó en pVL1393 para su
expresión en células Sf9.
El gen estructural de la L1 del HPV6 se subclonó
tanto en pAlt-1 (Promega) para mutagénesis como en
pVL1393 (Stratagene) para su expresión en células Sf9. Se produjeron
mutaciones usando los sistemas de mutagénesis in vitro
Altered Sites II (Promega), se verificaron mediante una
secuenciación y se subclonaron en pVL1393 para su expresión en
células Sf9.
Se transfectaron células SF9 usando el kit
BaculoGold Transfection (Pharmingen). Las transfecciones se
realizaron esencialmente según las instrucciones del fabricante con
las siguientes modificaciones. Se transfectaron 8\cdot10^{8}
células Sf9 en un plato 100 mM con 4 \mug de ADN BaculoGold y 6
\mug de ADN de prueba. Las células se recogieron después de 6 días
y se ensayaron para comprobar la producción de VLP.
Las células se recogieron seis días después de
la transfección, mediante un raspado seguido de un centrifugado a
baja velocidad. Las células se resuspendieron en 300 \mul de
tampón de ruptura (NaCl 1 M, Tris 0,2 M, pH 7,6) y se
homogeneizaron durante 30'' en hielo usando un Polytron PT 1200 B
con una sonda PT-DA 1205/2-A
(Brinkman) en un tubo de Falcon 1259. Las muestras se rotaron a 2500
rpm durante 3 minutos para sedimentar los desechos. Los tubos se
lavaron con 150 \mul adicionales de tampón de ruptura, los
sobrenadantes se recogieron en un tubo de micrófuga de 1,5 ml, y se
volvieron a rotar durante 5 minutos en una micrófuga Eppendorf
(Brinkman). Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a 4ºC
hasta su uso. Los ensayos ELISA se realizaron típicamente el mismo
día.
Se diluyeron 5 \mul de extracto en 50 \mul
de BSA al 1% en PBS (disolución salina tamponada con fosfato;
NaPO_{4} 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM) y se colocaron en una placa
de poliestireno. La placa se incubó hasta el día siguiente a 4ºC. Se
retiraron los extractos y la placa se bloqueó con leche en polvo al
5% en PBS. Todas las etapas posteriores de lavado se realizaron con
BSA al 1% en PBS. La placa se incubó a temperatura ambiente con
anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios,
anticuerpos monoclonales producidos contra las VLP del HPV11, se
obtuvieron como estirpes de ascitis del Dr. Neil Christensen
(Pennsylvania State University). Se diluyeron a 10^{5} en BSA al
1% en PBS antes de su uso. Después del lavado, las placas se
incubaron durante 1 hora con anticuerpo secundario. El anticuerpo
secundario, IgG (\gamma) de cabra anti-ratón
marcada con peroxidasa, se adquirió en Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., y se usaron a una dilución de 10^{3} en BSA
al 1% en PBS. Después de un lavado final, se realizó un ensayo de
fosfatasa alcalina y se leyó la absorbancia a 405 nm.
Para cartografiar los residuos críticos de un
epítopo neutralizante especifico de HPV11, nos aprovechamos de dos
condiciones. En primer lugar, usamos un conjunto de anticuerpos
monoclonales que son específicos para la L1 del HPV11 y reconocen la
L1 sólo cuando está en una VLP. Las condiciones de ensayo descritas
en el Ejemplo 3 son tales que estos anticuerpos no son reactivos
cruzados con la estrechamente relacionada L1 de la VLP del HPV6b. De
entre estos cinco anticuerpos, se ha demostrado que 4 neutralizan al
HPV11 en el sistema Kreider Xenograft (Kreider y col., 1987, J.
Virol. 61: 590-593).
Las L1 del HPV6 y del HPV11 son las proteínas L1
más estrechamente relacionadas dentro de la familia de virus de
papiloma. La L1 del HPV6 tiene 500 residuos de aminoácidos de
longitud. La L1 del HPV11 tiene 501 residuos. Pueden alinearse de
forma que el aminoácido de más del HPV11 esté en la posición 132.
Con esta alineación, son idénticas en la secuencia de aminoácidos en
todas las posiciones excepto en 39 (92,4%), incluyendo la
inserción.
Concluimos que la especificidad de tipo 11 de
los anticuerpos monoclonales debe residir en estos 39 residuos de
diferencia. Cambiando sistemáticamente un residuo de tipo 11 por uno
de tipo 6, aquellos residuos críticos de la respuesta de tipo 11
serían revelados por una pérdida en la afinidad de unión por parte
de los anticuerpos monoclonales específicos del tipo 11. Dado que
los residuos estarían mutados en residuos que aparecen de forma
natural en el tipo 6, la probabilidad de que dichas sustituciones
afecten a la formación de las VLP sería pequeña.
Para determinar la repercusión sobre la unión de
cualquier residuo en particular, se expresaron tanto el HPV11 como
el correspondiente derivado de HPV11 en el sistema de expresión
transitoria. Se realizó un ELISA usando el conjunto de anticuerpos
monoclonales específicos de HPV11, y se compararon los resultados de
ambos. La producción de L1 se normalizó con el anticuerpo monoclonal
H6.C6. El anticuerpo H6.C6 es reactivo cruzado con HPV11, el epítopo
es lineal e independiente de la formación de VLP. Por lo tanto, mide
la producción de L1.
Los resultados son sometidos a una doble
normalización. En primer lugar se calcula la proporción de
absorbancia entre el anticuerpo de prueba y H6.C6 para la posición
de prueba. Se determina la misma proporción para HPV11 y se divide
entre la proporción para la posición de prueba. Así, una doble
proporción próxima a 1 significa que no hay una diferencia
detectable en la unión del anticuerpo al clon de prueba con respecto
a HPV11. Una doble proporción menor de uno significa que el
anticuerpo de prueba se une peor al clon de prueba que al tipo
natural. En teoría, una proporción mayor de 1 significa que el
anticuerpo se une mejor al clon de prueba que al HPV11. Esto no se
observó en la práctica. Una proporción en el intervalo de 0,1 a 0,2
es esencialmente fondo, lo que significa que no podemos detectar la
unión del anticuerpo a la VLP mutante.
Las posiciones en la L1 del HPV11 que difieren
del HPV6 fueron mutadas individualmente para que se correspondieran
con el correspondiente residuo de HPV6. Los clones se expresaron en
células SF9 mediante un Baculovirus recombinante expresor, y se
vieron afectados por la unión del conjunto de anticuerpos
monoclonales específicos de HPV11 determinado (Tabla 1). Los
residuos que aparecen en la columna 2, marcados como "menor
unión", son posiciones consideradas críticas para la unión de
uno o más de los anticuerpos monoclonales. Los residuos enumerados
en la columna 1, marcados como "conserva la unión", son
juzgados no críticos para la unión de cualquiera de los anticuerpos
monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Conserva la unión \+ \hskip4,5cm \+ Pierde la
unión \cr HPV11 : K28T \+ \hskip4,5cm \+ HPV11 :
GI31S\cr HPV11 : Y49F \+ \hskip4,5cm \+ HPV11 :
Y132 \Delta \cr HPV11 : K53R \+ \hskip4,5cm \+ HPV11 :
Y246F\cr HPV11 : V54A \+ \hskip4,5cm \+ HPV11 : N278G\cr
HPV11 : L119F \+ \hskip4,5cm \+ HPV11 : S346T\cr HPV11
: T170K\+\+\cr HPV11 : S173T\+\+\cr HPV11 : S166P\+\+\cr HPV11 :
N179A\+\+\cr HPV11 : L219I\+\+\cr HPV11 : V225T\+\+\cr HPV11 :
T263E\+\+\cr HPV11 : D271T\+\+\cr HPV11 : L273I\+\+\cr HPV11 :
V274I\+\+\cr HPV11 : G277S\+\+\cr HPV11 : S281T\+\+\cr HPV11 :
A294G\+\+\cr HPV11 : H300N\+\+\cr HPV11 : H325Q\+\+\cr HPV11 :
K347T\+\+\cr HPV11 : A349S\+\+\cr HPV11 : F366V\+\+\cr HPV11 :
Q434P\+\+\cr HPV11 : D439N\+\+\cr HPV11 : M440L\+\+\cr HPV11 :
F458Y\+\+\cr HPV11 : T474S\+\+\cr HPV11 : A467I\+\+\cr HPV11 :
P488A\+\+\cr HPV11 :
T497A\+\+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones que codifican para las L1 mutantes
descritos en la Tabla 1 en la columna "pierde la unión" se
denominan HPV11 : G13S, HPV11 : YI32\Delta, HPV11 : Y246F, HPV11 :
N278G y HPV11 : S346T. Alternativamente puede omitirse el prefijo
"HPV".
Los cuatro residuos que afectan a la unión están
espaciados a una considerable distancia entre sí, englobando la
envergadura total más de 200 residuos a lo largo de la secuencia
lineal.
Las posiciones afectan a la unión de los
anticuerpos de forma diferente. No más de tres posiciones afectan a
la unión de cualquier anticuerpo individual. Sólo la posición 246
afecta a la unión de los cinco anticuerpos. En todos los casos se
observa una cierta medida de unión detectable. Esto indica que la
formación de las VLP no se ve afectada. La repercusión sobre la
unión por el cambio en la posición 278 parece insignificante y es
cuestionable, pero en este momento se incluye porque la ligera
reducción es reproducible.
La repercusión sobre la unión, medida según la
proporción de afinidad normalizada de las VLP, se proporciona en la
Tabla 2. La Tabla 3 proporciona las configuraciones de unión para
los anticuerpos monoclonales de HPV11, según se deducen a partir de
estos estudios.
| Posición | H11.A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 |
| G131S | 0,93 | 0,20 | 0,11 | 0,12 | 0,96 |
| \Delta132 | 1,0 | 0,36 | 0,08 | 0,11 | 0,64 |
| Y246F | 0,48 | 0,33 | 0,52 | 0,45 | 0,32 |
| N278G | 1,4 | 0,79 | 0,69 | 0,81 | 0,92 |
| S173T | 0,82 | 1,14 | 0,85 | 0,85 | 0,94 |
| S346T | 0,98 | 1,6 | 0,74 | 0,79 | 0,32 |
| * (Proporción de afinidad normalizada = Posición X (A_{405}H11.Y/A_{405} H6.C6)/HPV11(A_{405}H11.Y/A_{405}H6.C6). |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Posición | H11.A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 |
| G131S | + | - | - | - | + |
| Y132\Delta | + | -/+ | - | -/+ | + |
| Y246F | -/+ | -/+ | -/+ | -/+ | -/+ |
| N278G | + | +/- | +/- | +/- | +/- |
| S346T | + | + | + | + | - |
Para monitorizar la producción de VLP de HPV11
para asegurar que contienen el epítopo neutralizante importante, se
emplea el siguiente ELISA de competición. Las VLP derivadas de HPV6,
pero no las VLP de HPV6, compiten por la unión con las VLP de HPV11
con anticuerpos monoclonales H11, B2, H11.F1 y H11.G5. Esto muestra
la presencia del epítopo neutralizante en las VLP demostrando una
unión específica y competente al epítopo neutralizante. El ensayo se
realiza de la siguiente forma.
1. Colocar en placa 10-100 ng
del lote de prueba de VLP de HPV11 por pocillo en una placa ELISA de
96 pocillos. Diluir la muestra en BSA al 1,0% en PBS (tampón ELISA).
Colocar en placa 50 \mul de muestra. Incubar hasta el día
siguiente a 4ºC.
2. Retirar los sobrenadantes de los pocillos.
Bloquear durante una hora con leche en polvo al 5% en PBS a
temperatura ambiente.
3. Aclarar con tampón ELISA.
4. Preparar diluciones del anticuerpo monoclonal
H11.F1.
- A.
- Preparar un grupo de diluciones con cantidades crecientes de VLP derivadas de HPV6.
- B.
- Preparar un grupo duplicado de diluciones con cantidades crecientes de VLP de HPV6.
- C.
- Preparar una dilución sin VLP añadidas.
5. Añadir 50 \mul de las muestras de
anticuerpos a los pocillos de la placa ELISA. Incubar durante una
hora a temperatura ambiente.
6. Retirar los anticuerpos y lavar tres veces
con tampón ELISA.
7. Añadir 50 \mul de IgG (\gamma) de cabra
anti-ratón a una dilución apropiada. Incubar durante
una hora a temperatura ambiente.
8. Lavar tres veces con tampón ELISA. Revelar
con un ensayo de fosfatasa alcalina y leer a 405 nm.
9. Una fuerte señal a 405 nm es fuertemente
competente con las VLP derivadas de HPV6, pero no con las VLP de
HPV6, confirmará la presencia del epítopo neutralizante en el lote
de prueba de las VLP de HPV11.
Las VLP derivadas de HPV6 se usan para
caracterizar lotes de prueba de sueros policlonales para comprobar
la actividad neutralizante. Se produce un lote de sueros
policlonales, por ejemplo, mediante un lote de pruebas de VLP de
HPV11. Alternativamente, es una muestra humana para la cual se desea
una caracterización de su capacidad neutralizante.
Se preclarifican sueros policlonales con VLP de
HPV6. Esto elimina los anticuerpos reactivos cruzados, tanto los
dependientes de VLP como los no dependientes. El epítopo
neutralizante de HPV11 es específico de tipo 11, y los anticuerpos
producidos contra él no son eliminados mediante una preincubación
con las VLP de HPV6. Sin embargo, las partículas derivadas de HPV6
se unen a esos anticuerpos, y la observación de dicha unión, por
ejemplo, en un ELISA estándar, demuestra la presencia de anticuerpos
neutralizantes en las muestras de sueros de prueba.
Se clarifica una muestra de prueba de sueros
policlonales según el siguiente procedimiento.
1. Se realiza una estimación del total de
anticuerpos de unión a las VLP. Las VLP se inmovilizarán sobre una
placa ELISA en un formato de sándwich usando un monoclonal
anti-HPV11 (hay muchos disponibles). La cantidad de
anticuerpo policlonal que se une se estima usando un segundo
anticuerpo anti-HPV11 de concentración conocida como
estándar. Alternativamente, se determina la concentración de IgG del
policlonal, y se asume que son todos anti-HPV11.
2. Las VLP de HPV6 se añaden a una alícuota de
los sueros en un exceso de 10 veces la cantidad en \mug de
anticuerpos de HPV11 en los sueros policlonales, según se determinó
en la etapa uno.
3. La mezcla se incuba hasta el día siguiente a
temperatura ambiente, seguida de un centrifugado alta velocidad
(300.000 g) durante 5 horas para sedimentar los complejos
VLP-anticuerpo.
4. El procedimiento se repite otras dos
veces.
5. Los sueros lavados se prueban para comprobar
la unión en un ELISA en sándwich. Las VLP de HPV6 y las derivadas de
HPV6 (que se unen a los monoclonales neutralizantes) serán
inmovilizadas mediante un anticuerpo monoclonal HPV6. Los sueros
policlonales lavados deberían mostrar sólo una unión mínima a las
VLP de HPV6. Una fuerte señal contra las VLP derivadas de HPV6
demuestra la unión al dominio neutralizante principal de HPV11, y
que los sueros policlonales contienen anticuerpo neutralizante.
Puede establecerse un segundo ensayo para
demostrar la capacidad neutralizante en la muestra de sueros de
prueba usando el ensayo de neutralización Xenograph (Christensen y
col., 1990. J. Virol. 64: 1936-1944; Christensen y
col., 1994, J. Gen. Virol. 75: 2271-2276).
1. Se producen sueros lavados contra las VLP
derivadas de HPV6 según el protocolo proporcionado anteriormente,
sustituyendo las VLP derivadas de HPV6 por VLP de HPV6. Se elaboran
sueros policlonales lavados con VLP de HPV6 como control.
2. Se elabora una serie de diluciones de los
sueros policlonales y se analizan en el ensayo de neutralización
Xenograph para establecer el título de neutralización de los
sueros.
3. Se elaboran grupos paralelos de diluciones de
sueros lavados derivados de HPV6 y sueros lavados de HPV6 y se
valoran en el Xenograph.
4. La presencia de actividad neutralizante en el
ensayo del Xenograph, que es ampliamente eliminada por lavado con
las VLP derivadas de HPV6, pero no con las VLP de HPV6, demuestra
mediante un ensayo biológico la presencia de anticuerpos en los
sueros contra el epítopo neutralizante del HPV11.
El gen estructural de la L1 del HPV11 se clonó a
partir de cepas clínicas usando la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) con cebadores diseñados a partir de la secuencia
publicada de la L1 (8,17). El gen estructural de la L1 del CRPV se
clonó mediante PCR a partir de ADN genomico vírico. Los genes de la
L1 se subclonaron en pVL1393 (Stratagene) para su expresión en
células Sf9.
Las células Sf9 fueron cotransfectadas usando el
kit BaculoGold Transfection (Pharmingen, San Diego, CA). Las
transfecciones se realizaron según las instrucciones del fabricante
con la siguiente modificación: se transfectaron 8\cdot10^{6}
células Sf9 en un plato de 100 mm con 4 \mug de ADN vírico de
BaculoGold y 6 \mug de ADN de plásmido de prueba. Las células se
recogieron después de 6 días, excepto cuando se indique de otro
modo, y se ensayaron para comprobar la producción de VLP mediante
inmunotransferencia Western un ensayo ELISA (a continua-
ción).
ción).
Las células se recogieron seis días después de
la transfección. Las placas se rasparon para resuspender las
células, y las células se recogieron mediante un centrifugado a baja
velocidad. Las células se resuspendieron en 300 \mul de tampón de
ruptura (NaCl 1 M, Tris 0,2 M, pH 7,6) y se homogeneizaron durante
30 segundos en hielo usando un Polytron PT 1200 B con una sonda
PT-DA 1205/2-A (Brinkman) en un tubo
de Falcon 2059. Las muestras se rotaron a 2500 rpm en una centrífuga
GPR (Beckman Instruments, Inc. Palo Alto, CA) durante 3 minutos
para sedimentar los desechos. Los tubos se lavaron con 150 \mul
adicionales de tampón de ruptura, los sobrenadantes se recogieron en
un tubo de micrófuga de 1,5 ml, y se volvieron a rotar durante 5
minutos en una micrófuga Eppendorf (Brinkman). Los ensayos ELISA se
iniciaron el mismo día.
Se diluyeron 5 \mul de extracto en 50 \mul
de BSA al 1% en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), se
alicuotaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos Immulon 2
(Dynatech Laboratories, Inc) y se incubaron hasta el día siguiente a
4ºC. Se retiraron los extractos y la placa se bloqueó con leche en
polvo al 5%/PBS. Todas las etapas posteriores de lavado se
realizaron con BSA al 1%/PBS. La placa se incubó a temperatura
ambiente con anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos
primarios, anticuerpos monoclonales CRPV.5A y H11.F1, se obtuvieron
como estirpes de ascitis del Dr. Neil Christensen. Son anticuerpos
específicos de tipo y dependientes de VLP que reconocen las VLP de
CRPV y de HPV11, respectivamente (Neil Christiansen, comunicación
personal). Se diluyeron 10^{5} veces en BSA al 1%/PBS antes de su
uso. Después del lavado con BSA al 1%/PBS, las placas se incubaron
durante 1 hora con anticuerpo secundario, IgG (g) de cabra
anti-ratón marcada con peroxidasa (Kirkegaard &
Perry Laboratories, Inc.) y se usaron a una dilución de 10^{3} en
BSA al 1% en PBS. Después de un lavado final, se realizó un ensayo
de fosfatasa alcalina y se leyó la absorbancia a 405 nm.
Basándonos en los estudios del Ejemplo 4,
mutamos el gen de la L1 del HPV6 en los residuos de aminoácidos 131,
245 y 277 para que se correspondieran con la secuencia de la L1 del
HPV11. Además, insertamos una tirosina después del residuo 131,
extendiendo la longitud del gen de la L1 mutado del HPV6 en un
residuo hasta 501 aminoácidos. Denominamos a este clon
6:131,132,245,277. Pronosticamos que estos cuatro cambios, todos los
cuales se corresponden con la secuencia de la L1 del HPV11,
facilitarían la unión de los anticuerpos neutralizantes específicos
de HPV11 H11.B2, H11.F1 y H11.G5. Esto es, de hecho, verdad, según
se muestra en la tabla, a
continuación.
continuación.
Valores de afinidad relativa con respecto a HPV6
y un derivado
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Anticuerpo \+ \hskip2,5cm \+ HPV6 \+
\hskip2,5cm \+ 6:131,132,245,277 \cr H11.A3 \+
\hskip2,5cm \+ 0,15 \+ \hskip2,5cm \+ 0,23\cr
H11.B2 \+ \hskip2,5cm \+ 0,18 \+ \hskip2,5cm
\+ 0,82\cr H11.F1 \+ \hskip2,5cm \+ 0,20 \+
\hskip2,5cm \+ 0,89\cr H11.G5 \+ \hskip2,5cm
\+ 0,14 \+ \hskip2,5cm \+ 0,84\cr H11.H3 \+
\hskip2,5cm \+ 0,11 \+ \hskip2,5cm \+
0,17\cr}
Esto confirma que los cuatro residuos de
aminoácidos 131,132, 245 y 277 definen la especificidad del sitio de
unión con respecto a los anticuerpos neutralizantes H11.B2, H11.F1 y
H11.G5.
El anticuerpo H11.H3 puede distinguirse de los
otros tres anticuerpos neutralizantes por su sensibilidad para
unirse en la posición 346, en la ausencia de sensibilidad para
unirse en la posición 131. Esto indica que la unión de este
anticuerpo ha cambiado hacia el C terminal, pero todavía se
superpone al sitio de unión de los otros tres anticuerpos
monoclonales neutralizantes.
Adicionalmente derivamos el clon derivado de
HPV6 definida anteriormente añadiendo un cambio adicional en la
posición 345, para que se correspondiera con la secuencia de HPV11
en su posición 346. Denominamos a este clon 6:131,132,245,277,345.
La predicción es que se unirá a los cuatro anticuerpos
neutralizantes, incluyendo H11.H3. Los datos se muestran en la
tabla, a continuación.
Valores de afinidad relativa con respecto a HPV6
y un derivado
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Anticuerpo \+ \hskip2,5cm HPV6 \+
\hskip2,5cm 6:131,132,245,277,345 \+\+\cr H11.A3
\+ \hskip2,5cm 0,15 \+ \hskip2,5cm 0,23\+\+\cr
H11.B2 \+ \hskip2,5cm 0,18 \+ \hskip2,5cm
0,82\+\+\cr H11.F1 \+ \hskip2,5cm 0,20 \+
\hskip2,5cm 0,89\+\+\cr H11.G5 \+ \hskip2,5cm
0,14 \+ \hskip2,5cm 0,84\+\+\cr H11.H3 \+
\hskip2,5cm 0,11 \+ \hskip2,5cm
0,17\+\+\cr}
Como se esperaba, este clon produjo VLP que
podían unirse a los anticuerpos neutralizantes H11.B2, H11.F1 y
H11.G5, y confirma esta observación. Inesperadamente, no se unió al
anticuerpo H11.H3, lo que indica que también se requiere un cambio
adicional al de la posición 345 para la unión al H11.H3.
Para estudiar adicionalmente la unión del
anticuerpo H11.H3, se añade un cambio en el residuo 438 del gen de
la L1 del HPV6, para que se corresponda con el residuo de la L1 del
HPV11 en 439. El cambio se añade tanto al clon 6:132,245,277,345
como al clon 6:131,132,245,277,345. esto produce los clones
6:132,245,277,345,438 y 6:131,132,245,277,345,438. El clon
6:132,245,277,345,438 se une al anticuerpo H11.H3, y el clon
6:131,132,245,277,
345,438 se une a los anticuerpos H11.B2, H11.F1, H11.G5, y H11.H3. Estos clones amplían la sensibilidad obtenible en los ensayos descritos a continuación en las reivindicaciones 2 y 3, y anteriormente en los Ejemplos 7 y 8.
345,438 se une a los anticuerpos H11.B2, H11.F1, H11.G5, y H11.H3. Estos clones amplían la sensibilidad obtenible en los ensayos descritos a continuación en las reivindicaciones 2 y 3, y anteriormente en los Ejemplos 7 y 8.
<110> Ludmerer, Steven
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PARTÍCULAS SEMEJANTES A VIRUS
SINTÉTICAS DE HPV 11
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 19504
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 96924522.4-2105
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1996-07-15
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/001.504
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-07-17
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 9603758.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-02-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US96/11739
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-07-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PAPILOMAVIRUS HUMANO 11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PAPILOMAVIRUS HUMANO 6b
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SECUENCIA CONSENSO DE LAS
LIPOPROTEÍNAS DE HPV 11 Y HPV 6b
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (1)
1. Partículas semejantes a virus
sintéticas, que comprenden una proteína L1 del HPV6 o L1 del HPV11
que está mutada en las posiciones elegidas entre:
- a)
- HPV6 : S131G, 132T, F245Y, G277N.;
- b)
- HPV6 : S131G, 132T, F245Y, G277N, T345S;
- c)
- HPV11 : G131S;
- d)
- HPV11 : \Delta132;
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