JP3425164B2 - ヒトヘルペスウィルス６型タンパク質ｐ１００、対応するＤＮＡ配列、それらの製造および使用 - Google Patents
ヒトヘルペスウィルス６型タンパク質ｐ１００、対応するＤＮＡ配列、それらの製造および使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトヘルペスウイルス
６型タンパク質ｐ１００およびその特異的免疫学的特性
を有するその部分に関する。本発明は更に、このタンパ
ク質またはその部分と特異的に反応する抗体、前記のタ
ンパク質またはその部分をコードするＤＮＡ配列、これ
らのＤＮＡ配列を含む組換えベクター、およびこれらの
ベクターで形質転換した宿主生物に関する。更に、本発
明は、これらのタンパク質およびＤＮＡ配列の製造、お
よび医薬または診断組成物におけるそれらの使用に関す
る。
６型タンパク質ｐ１００およびその特異的免疫学的特性
を有するその部分に関する。本発明は更に、このタンパ
ク質またはその部分と特異的に反応する抗体、前記のタ
ンパク質またはその部分をコードするＤＮＡ配列、これ
らのＤＮＡ配列を含む組換えベクター、およびこれらの
ベクターで形質転換した宿主生物に関する。更に、本発
明は、これらのタンパク質およびＤＮＡ配列の製造、お
よび医薬または診断組成物におけるそれらの使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−
６）は、アミノ酸配列の相同性（リトラー(Littler)
ら、１９９０年；ローレンス(Lowrence)ら、１９９０
年；チャング(Chang) とバラチャンドラン(Balachandra
n)、１９９１年；ナイペル(Neipel)ら、１９９１年）、
保存されたヘルペスウイルス遺伝子のゲノム位置および
配向（ナイペル(Neipel)ら、１９９１年）、および抗原
特性（ラーチャー(Larcher) ら、１９８８年；ヤマモト
(Yamamoto)ら、１９９０年；リトラー(Littler) ら、１
９９０年）に基づき、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣ
ＭＶ）に緊密に関連していることが近年になり示され
た。今日までのところ、ＨＨＶ−６の２種類のタンパク
質およびそれらの遺伝子、すなわち分子量が１３５ｋｄ
ａの主要キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）（リトラー(L
ittler) ら、１９９０年）およびＨＨＶ−６ｐ４１と呼
ばれる４１ｋｄａのリンタンパク質（チャング(Chang)
とバラチャンドラン(Balachandran)、１９９０年）だけ
が更に詳細に記載されている。後者のタンパク質は、Ｈ
ＣＭＶのＵＬ４４に相同性である。
６）は、アミノ酸配列の相同性（リトラー(Littler)
ら、１９９０年；ローレンス(Lowrence)ら、１９９０
年；チャング(Chang) とバラチャンドラン(Balachandra
n)、１９９１年；ナイペル(Neipel)ら、１９９１年）、
保存されたヘルペスウイルス遺伝子のゲノム位置および
配向（ナイペル(Neipel)ら、１９９１年）、および抗原
特性（ラーチャー(Larcher) ら、１９８８年；ヤマモト
(Yamamoto)ら、１９９０年；リトラー(Littler) ら、１
９９０年）に基づき、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣ
ＭＶ）に緊密に関連していることが近年になり示され
た。今日までのところ、ＨＨＶ−６の２種類のタンパク
質およびそれらの遺伝子、すなわち分子量が１３５ｋｄ
ａの主要キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）（リトラー(L
ittler) ら、１９９０年）およびＨＨＶ−６ｐ４１と呼
ばれる４１ｋｄａのリンタンパク質（チャング(Chang)
とバラチャンドラン(Balachandran)、１９９０年）だけ
が更に詳細に記載されている。後者のタンパク質は、Ｈ
ＣＭＶのＵＬ４４に相同性である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＨＶ６とＨＣＭＶと
によって引き起こされる感染症を識別することができる
ようにするには、ヒトヘルペスウイルス６型に特異的な
試薬を有することが望ましい。
によって引き起こされる感染症を識別することができる
ようにするには、ヒトヘルペスウイルス６型に特異的な
試薬を有することが望ましい。
【０００４】したがって、本発明の基礎となる技術的課
題は、免疫原性およびＨＣＭＶおよび他のヒトヘルペス
ウイルスと交差反応性を欠いた抗体の形成を引き起こす
能力を有するタンパク質を提供することである。更に、
対応するＤＮＡ配列を提供することが、技術的課題であ
る。
題は、免疫原性およびＨＣＭＶおよび他のヒトヘルペス
ウイルスと交差反応性を欠いた抗体の形成を引き起こす
能力を有するタンパク質を提供することである。更に、
対応するＤＮＡ配列を提供することが、技術的課題であ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この技術的課題は、特許
請求の範囲に記載されている態様を提供することによっ
て解決される。
請求の範囲に記載されている態様を提供することによっ
て解決される。
【０００６】それ故、本発明は、ヌクレオチド６３９に
対応する位置から開始してヌクレオチド３２４８に対応
する位置までの第３表（表１〜５）に示されるアミノ酸
配列を有するＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６型）
タンパク質ｐ１００をコードするＤＮＡ配列に関する。
対応する位置から開始してヌクレオチド３２４８に対応
する位置までの第３表（表１〜５）に示されるアミノ酸
配列を有するＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６型）
タンパク質ｐ１００をコードするＤＮＡ配列に関する。
【０００７】タンパク質ｐ１００は、部分的にＨＣＭＶ
のｐｐ１５０に相同性の分子量が約１００ｋｄａである
ヒトヘルペスウイルス６型由来の構造タンパク質であ
る。これは、ＨＨＶ−６のＵ１１０２株のＥｃｏＲＩフ
ラグメント６／７（ＨＨＶ−６ゲノムの左端までの間隔
２１〜２５ｋｂ）の領域に位置している遺伝子の発現に
よって得ることができる。このタンパク質ｐ１００は免
疫原性を有し、ヒトサイトメガロウイルスおよび他のヒ
トヘルペスウイルスとの交差反応性を欠いている（ヤマ
モト(Yamamoto)ら、１９９０年）。それ故、これは、Ｈ
ＨＶ−６抗体を検出し、ＨＨＶ−６感染症対ＣＭＶ−感
染症の区別的診断を行うための試薬として用いることが
できる。
のｐｐ１５０に相同性の分子量が約１００ｋｄａである
ヒトヘルペスウイルス６型由来の構造タンパク質であ
る。これは、ＨＨＶ−６のＵ１１０２株のＥｃｏＲＩフ
ラグメント６／７（ＨＨＶ−６ゲノムの左端までの間隔
２１〜２５ｋｂ）の領域に位置している遺伝子の発現に
よって得ることができる。このタンパク質ｐ１００は免
疫原性を有し、ヒトサイトメガロウイルスおよび他のヒ
トヘルペスウイルスとの交差反応性を欠いている（ヤマ
モト(Yamamoto)ら、１９９０年）。それ故、これは、Ｈ
ＨＶ−６抗体を検出し、ＨＨＶ−６感染症対ＣＭＶ−感
染症の区別的診断を行うための試薬として用いることが
できる。
【０００８】本発明は、更に、位置６３９から位置３２
４８までの第３表に示されている対応ＤＮＡ配列に関す
る。
４８までの第３表に示されている対応ＤＮＡ配列に関す
る。
【０００９】ｐ１００をコードするＤＮＡ配列は、本明
細書に開示されているように、ＨＨＶ−６ゲノムから単
離することができる。得られるＤＮＡ配列が第３表に示
されているＤＮＡ配列と異なる場合には、前記のＤＮＡ
は通常のインビトロ突然変異誘発技法によってそこから
誘導することができる。更に、本明細書に開示されてい
る技術的教示を備えた当業者であれば、通常のＤＮＡ合
成技法によって本発明のＤＮＡ配列を得ることができる
であろう。
細書に開示されているように、ＨＨＶ−６ゲノムから単
離することができる。得られるＤＮＡ配列が第３表に示
されているＤＮＡ配列と異なる場合には、前記のＤＮＡ
は通常のインビトロ突然変異誘発技法によってそこから
誘導することができる。更に、本明細書に開示されてい
る技術的教示を備えた当業者であれば、通常のＤＮＡ合
成技法によって本発明のＤＮＡ配列を得ることができる
であろう。
【００１０】もう一つの態様では、本発明は、前記のＤ
ＮＡ配列とハイブリッド形成しＨＨＶ−６タンパク質ｐ
１００の特異的な免疫学的特性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列に関する。これに関連し、「ハイブ
リッド形成」という用語は、通常のハイブリッド形成条
件、好ましくはＴｍ値がＴｍ＝−２０からＴｍ＝−２７
℃の間であるハイブリッド形成条件に関する。更に好ま
しくは、「ハイブリッド形成」という用語は、ストリン
ジェントなハイブリッド形成条件に関する。「特異的免
疫学的特性」という用語は、第３表におけるアミノ酸配
列によって画定される全タンパク質並びにこのタンパク
質に特異的で且つヒトサイトメガロウイルスおよび他の
ヘルペスウイルスと実質的に交差反応しない抗体と反応
するこのタンパク質の部分を特徴付けるものである。こ
のタンパク質のかかる免疫原性部分またはエピトープの
例は、位置２９６０から位置３１４１までの第３表に示
されるヌクレオチド配列または位置２４０８から位置２
９５９までの第３表に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるアミノ酸配列である。これらのエピトー
プは、下記の診断組成物に用いることもできる。
ＮＡ配列とハイブリッド形成しＨＨＶ−６タンパク質ｐ
１００の特異的な免疫学的特性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列に関する。これに関連し、「ハイブ
リッド形成」という用語は、通常のハイブリッド形成条
件、好ましくはＴｍ値がＴｍ＝−２０からＴｍ＝−２７
℃の間であるハイブリッド形成条件に関する。更に好ま
しくは、「ハイブリッド形成」という用語は、ストリン
ジェントなハイブリッド形成条件に関する。「特異的免
疫学的特性」という用語は、第３表におけるアミノ酸配
列によって画定される全タンパク質並びにこのタンパク
質に特異的で且つヒトサイトメガロウイルスおよび他の
ヘルペスウイルスと実質的に交差反応しない抗体と反応
するこのタンパク質の部分を特徴付けるものである。こ
のタンパク質のかかる免疫原性部分またはエピトープの
例は、位置２９６０から位置３１４１までの第３表に示
されるヌクレオチド配列または位置２４０８から位置２
９５９までの第３表に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるアミノ酸配列である。これらのエピトー
プは、下記の診断組成物に用いることもできる。
【００１１】本発明は、更に、前記のＤＮＡ配列を含む
組換えベクターであって、それによってこのＤＮＡ配列
が同種または異種プロモーターによって制御され、所望
な宿主細胞中で発現することができるものに関する。
組換えベクターであって、それによってこのＤＮＡ配列
が同種または異種プロモーターによって制御され、所望
な宿主細胞中で発現することができるものに関する。
【００１２】本発明のもう一つの態様は、本発明の組換
えベクターの一つによって形質転換した宿主生物であっ
て、この宿主生物は、細菌、好ましくは大腸菌属の細
菌、酵母、好ましくはサッカロミセス属の酵母、植物細
胞または動物細胞、好ましくは哺乳類細胞である。
えベクターの一つによって形質転換した宿主生物であっ
て、この宿主生物は、細菌、好ましくは大腸菌属の細
菌、酵母、好ましくはサッカロミセス属の酵母、植物細
胞または動物細胞、好ましくは哺乳類細胞である。
【００１３】本発明は、ＨＨＶ−６タンパク質ｐ１００
の製造であって、形質転換した宿主生物を培養し、培養
物から前記のタンパク質を回収する工程を含む製造にも
関する。
の製造であって、形質転換した宿主生物を培養し、培養
物から前記のタンパク質を回収する工程を含む製造にも
関する。
【００１４】本発明のもう一つの目的は、ＨＨＶ−６タ
ンパク質ｐ１００または特異的免疫学的特性を有するそ
の部分と特異的に反応するがヒトサイトメガロウイルス
および他のヘルペスウイルスの成分とは反応しない抗体
を提供することである。本発明のタンパク質およびその
フラグメントを備えた当業者であれば、通常の方法によ
ってこれらの抗体を産生させることができる。本発明の
抗体の好ましい態様では、抗体は単クローン性抗体であ
る。
ンパク質ｐ１００または特異的免疫学的特性を有するそ
の部分と特異的に反応するがヒトサイトメガロウイルス
および他のヘルペスウイルスの成分とは反応しない抗体
を提供することである。本発明のタンパク質およびその
フラグメントを備えた当業者であれば、通常の方法によ
ってこれらの抗体を産生させることができる。本発明の
抗体の好ましい態様では、抗体は単クローン性抗体であ
る。
【００１５】本発明のもう一つの目的は、ＨＨＶ−６タ
ンパク質ｐ１００またはその特異的免疫学的特性を有す
るその部分および／またはそれらに対する抗体を含む医
薬組成物であって、ＨＨＶ−６感染症の予防または治療
に好適である医薬組成物を提供することである。
ンパク質ｐ１００またはその特異的免疫学的特性を有す
るその部分および／またはそれらに対する抗体を含む医
薬組成物であって、ＨＨＶ−６感染症の予防または治療
に好適である医薬組成物を提供することである。
【００１６】本発明のもう一つの目的は、ＨＨＶ−６タ
ンパク質ｐ１００またはその特異的免疫学的特性を有す
るその部分または本発明の対応ＤＮＡ配列または抗体を
含む組成物を提供することである。
ンパク質ｐ１００またはその特異的免疫学的特性を有す
るその部分または本発明の対応ＤＮＡ配列または抗体を
含む組成物を提供することである。
【００１７】これらの組成物は、更に、ＨＨＶ−６の主
要キャプシドタンパク質遺伝子、特に第１表（表６）に
示されるＤＮＡ配列および／またはこれらのＤＮＡ配列
または４１ｋｄａのホスホホリル化したＨＨＶ−６タン
パク質をコードする遺伝子の部分によってコードされる
ポリペプチド、特に第２表（表７）に示されるＤＮＡ配
列および／またはこれらのＤＮＡ配列によってコードさ
れるポリペプチドを含む。ＨＨＶ−６タンパク質ｐ１０
０は、ヒトサイトメガロウイルスまたはヒトヘルペスウ
イルスと交差反応性を欠く抗体の形成を誘発する能力を
有するので、ある感染症がＨＨＶ−６またはヒトサイト
メガロウイルス或いは他のヘルペスウイルスによって引
き起こされたものであるかどうかを識別するための区別
的診断に用いることができる。
要キャプシドタンパク質遺伝子、特に第１表（表６）に
示されるＤＮＡ配列および／またはこれらのＤＮＡ配列
または４１ｋｄａのホスホホリル化したＨＨＶ−６タン
パク質をコードする遺伝子の部分によってコードされる
ポリペプチド、特に第２表（表７）に示されるＤＮＡ配
列および／またはこれらのＤＮＡ配列によってコードさ
れるポリペプチドを含む。ＨＨＶ−６タンパク質ｐ１０
０は、ヒトサイトメガロウイルスまたはヒトヘルペスウ
イルスと交差反応性を欠く抗体の形成を誘発する能力を
有するので、ある感染症がＨＨＶ−６またはヒトサイト
メガロウイルス或いは他のヘルペスウイルスによって引
き起こされたものであるかどうかを識別するための区別
的診断に用いることができる。
【００１８】本発明を、下記の記載および表、図で更に
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００１９】第１表（表６）は、クローンｐＭＦ９４お
よびｐＭＦ２９５のウイルスインサートのＤＮＡ配列を
示す。両配列は、リトラー(Littler) ら、１９９０年に
公表されたのと同じＨＨＶ−６の主要キャプシドタンパ
ク質遺伝子の一部である。
よびｐＭＦ２９５のウイルスインサートのＤＮＡ配列を
示す。両配列は、リトラー(Littler) ら、１９９０年に
公表されたのと同じＨＨＶ−６の主要キャプシドタンパ
ク質遺伝子の一部である。
【００２０】第２表（表７）は、クローンｐＭＦ９０の
ウイルスインサートのＤＮＡ配列を示す。この配列は、
チャング(Chang) とバラチャンドラン(Balachandran)、
１９９１年に公表された配列のヌクレオチド１１７〜１
９４と同一である。
ウイルスインサートのＤＮＡ配列を示す。この配列は、
チャング(Chang) とバラチャンドラン(Balachandran)、
１９９１年に公表された配列のヌクレオチド１１７〜１
９４と同一である。
【００２１】第３表（表１〜５）は、（左端から開始し
て）ＨＨＶ−６ ＥｃｏＲＩフラグメント番号６および
７の完全なＤＮＡ配列を示す。これらのフラグメント
は、ＨＨＶ−６の全ｐ１００遺伝子を含む。更に、ｐ１
００のアミノ酸配列も示されている。
て）ＨＨＶ−６ ＥｃｏＲＩフラグメント番号６および
７の完全なＤＮＡ配列を示す。これらのフラグメント
は、ＨＨＶ−６の全ｐ１００遺伝子を含む。更に、ｐ１
００のアミノ酸配列も示されている。
【００２２】免疫原性タンパク質およびその部分をコー
ドするＤＮＡ配列は、ゲノムＨＨＶ−６遺伝子バングに
おいてＨＨＶ−６タンパク質に対する単一および多特異
性ウサギ抗血清と同一であった。
ドするＤＮＡ配列は、ゲノムＨＨＶ−６遺伝子バングに
おいてＨＨＶ−６タンパク質に対する単一および多特異
性ウサギ抗血清と同一であった。
【００２３】ウサギを全ＨＨＶ−６感染ＨＳＢ−２細胞
で免疫した。得られた抗血清は少なくとも７種類のウイ
ルスタンパク質と反応した（図４）。ＨＨＶ−６の１０
０ｋｄａのタンパク質に対する抗体を、この血清から精
製した。この目的のために、全ウイルスタンパク質を、
調製用ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に付した。分
子量が１００ｋｄａのウイルスタンパク質をニトロセル
ロース膜に移し、希釈したウサギ血清と共にインキュベ
ーションした。ニトロセルロースシートに特異的に結合
した抗体を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７で溶出し
た。得られた抗体は、約１００ｋｄａのＨＨＶ−６ビリ
オンタンパク質と特異的に反応した（図４）。両血清調
製物を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングし
た。
で免疫した。得られた抗血清は少なくとも７種類のウイ
ルスタンパク質と反応した（図４）。ＨＨＶ−６の１０
０ｋｄａのタンパク質に対する抗体を、この血清から精
製した。この目的のために、全ウイルスタンパク質を、
調製用ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に付した。分
子量が１００ｋｄａのウイルスタンパク質をニトロセル
ロース膜に移し、希釈したウサギ血清と共にインキュベ
ーションした。ニトロセルロースシートに特異的に結合
した抗体を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７で溶出し
た。得られた抗体は、約１００ｋｄａのＨＨＶ−６ビリ
オンタンパク質と特異的に反応した（図４）。両血清調
製物を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングし
た。
【００２４】重複フラグメントでの全ＨＨＶ−６ゲノム
を含むコスミドからのゲノムライブラリーＤＮＡの構造
体を、超音波処理によって切断した。ＥｃｏＲＩリンカ
ーを添加し、ＥｃｏＲＩ消化およびサイズ分画した後、
これを市販のベクターであるラムダｚａｐＩＩ（ストラ
タジーン・インコーポレーテド(Stratagene Inc.) 、ラ
ジョラ、米国）に連結した。インビトロパッケージング
の後、３×１０５個の独立した組換体の遺伝子バンクを
得た。陽性のクローンを、前記の血清と市販の検出シス
テム（「ピコ・ブルー(Pico blue) 」、ストラタジーン
・インコーポレーテド(Stratagene Inc.) 、ラジョラ、
米国）を用いて、免疫学的スクリーニングによって同定
した。同定したラムダクローンを、次に製造業者の指示
（ストラタジーン・インコーポレーテド）にしたがって
「インビトロ切り出し」によってブルースクリプト(Blu
escript)ＳＫ−ベクターにサブクローニングした。ウェ
スターンブロットで特に反応性である４種類のクローン
（ｐＭＦ１０１、ｐＭＦ９０、ｐＭＦ９４、ｐＭＦ２９
５）を選択して、更に特性決定した。これらのクローン
のインサートをサンガーのチェーンターミネーション法
によって配列決定した。データーはゲネティックス・コ
ンピューター・グループ(Genetics ComputerGroup)
（ＧＣＧ、マジソン、ウィスコンシン、米国）の配列分
析パッケージによって分析した。予測されたアミノ酸配
列を用いて、公表されたヘルペスウイルス配列の総てを
含むライブラリーにおいてコンピュータープログラムＦ
ＡＳＴＡ（ピアソン(Pearson) とリップマン(Lipman)、
１９８８年）で相同性の検討を行った。クローンｐＭＦ
９４およびｐＭＦ２９５は、ＨＨＶ−６の公表された主
要キャプシドタンパク質遺伝子の部分（第１表）を含ん
でいたが、ｐＭＦ９０はＨＣＭＶのＵＬ４４に相同なオ
ープンリーディングフレームの部分（第２表）を含んで
いた。対応するＨＨＶ−６遺伝子は、４１ｋｄａのホス
ホリル化されたＨＨＶ−６タン白質に対する単クローン
性抗体を用いて最近になって同定された（チャング(Cha
ng) とバラチャンドラン(Balachandran)、１９９１
年）。しかしながら、チャングらによって同定されたエ
ピトープはそれらの配列のアミノ酸２２７の後に位置し
ており、ｐＭＦ９０はアミノ酸１１９〜１８７のみをカ
バーしている。クローンｐＭＦ１０１の予測されたアミ
ノ酸配列には相同遺伝子は見出すことができなかった。
ｐＭＦ１０１のインサートを用いて、ウイルスゲノム内
に遺伝子を配置した。全ＨＨＶ−６ゲノムを包含する７
種のコスミドクローンとのハイブリッド形成によって
（ナイペル（Neipel）ら、１９９１年）これを左端のリ
ピートに近い１．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント内に
配置することができた（図２）。この領域において更に
配列決定を行うことによって、予測された分子量９７ｋ
ｄａを有する８７０アミノ酸のタンパク質をコードする
オープンリーディングフレームが明らかになった（以後
ｐ１００と呼ぶ）。
を含むコスミドからのゲノムライブラリーＤＮＡの構造
体を、超音波処理によって切断した。ＥｃｏＲＩリンカ
ーを添加し、ＥｃｏＲＩ消化およびサイズ分画した後、
これを市販のベクターであるラムダｚａｐＩＩ（ストラ
タジーン・インコーポレーテド(Stratagene Inc.) 、ラ
ジョラ、米国）に連結した。インビトロパッケージング
の後、３×１０５個の独立した組換体の遺伝子バンクを
得た。陽性のクローンを、前記の血清と市販の検出シス
テム（「ピコ・ブルー(Pico blue) 」、ストラタジーン
・インコーポレーテド(Stratagene Inc.) 、ラジョラ、
米国）を用いて、免疫学的スクリーニングによって同定
した。同定したラムダクローンを、次に製造業者の指示
（ストラタジーン・インコーポレーテド）にしたがって
「インビトロ切り出し」によってブルースクリプト(Blu
escript)ＳＫ−ベクターにサブクローニングした。ウェ
スターンブロットで特に反応性である４種類のクローン
（ｐＭＦ１０１、ｐＭＦ９０、ｐＭＦ９４、ｐＭＦ２９
５）を選択して、更に特性決定した。これらのクローン
のインサートをサンガーのチェーンターミネーション法
によって配列決定した。データーはゲネティックス・コ
ンピューター・グループ(Genetics ComputerGroup)
（ＧＣＧ、マジソン、ウィスコンシン、米国）の配列分
析パッケージによって分析した。予測されたアミノ酸配
列を用いて、公表されたヘルペスウイルス配列の総てを
含むライブラリーにおいてコンピュータープログラムＦ
ＡＳＴＡ（ピアソン(Pearson) とリップマン(Lipman)、
１９８８年）で相同性の検討を行った。クローンｐＭＦ
９４およびｐＭＦ２９５は、ＨＨＶ−６の公表された主
要キャプシドタンパク質遺伝子の部分（第１表）を含ん
でいたが、ｐＭＦ９０はＨＣＭＶのＵＬ４４に相同なオ
ープンリーディングフレームの部分（第２表）を含んで
いた。対応するＨＨＶ−６遺伝子は、４１ｋｄａのホス
ホリル化されたＨＨＶ−６タン白質に対する単クローン
性抗体を用いて最近になって同定された（チャング(Cha
ng) とバラチャンドラン(Balachandran)、１９９１
年）。しかしながら、チャングらによって同定されたエ
ピトープはそれらの配列のアミノ酸２２７の後に位置し
ており、ｐＭＦ９０はアミノ酸１１９〜１８７のみをカ
バーしている。クローンｐＭＦ１０１の予測されたアミ
ノ酸配列には相同遺伝子は見出すことができなかった。
ｐＭＦ１０１のインサートを用いて、ウイルスゲノム内
に遺伝子を配置した。全ＨＨＶ−６ゲノムを包含する７
種のコスミドクローンとのハイブリッド形成によって
（ナイペル（Neipel）ら、１９９１年）これを左端のリ
ピートに近い１．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント内に
配置することができた（図２）。この領域において更に
配列決定を行うことによって、予測された分子量９７ｋ
ｄａを有する８７０アミノ酸のタンパク質をコードする
オープンリーディングフレームが明らかになった（以後
ｐ１００と呼ぶ）。
【００２５】ほぼ完全なタンパク質を含んで成るｐ１０
０の５種類のフラグメント（ｐＤＦ４４６−４、ｐＤＦ
４４６−３、ｐＤ２Ｈａｅ、ｐＤ２Ｈｉｎｄ、ｐＭＦ１
０１Ｒ）を、ベクターｐＲＯＳ中でβ−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質として原核生物的に発現した（エリン
ジャー(Ellinger)ら）。ウェスターンブロットアッセイ
では、カルボキシ末端クローンのみが、両方のウサギヒ
トＨＨＶ−６陽性血清と反応した（図３、図４）。ｐＭ
Ｆ１０１Ｒから発現した融合タンパク質を用いて、前記
の様にしてウサギ血清から抗体を精製した。これらの抗
体を用いて、ＨＨＶ−６に感染したおよび感染していな
いＨＳＢ−２細胞でウェスターンブロット分析を行っ
た。１００ｋｄａのタンパク質は、感染した細胞のみに
検出された。これまで検討を行った総ての発現クローン
のうちで、ｐ１００のカルボキシ末端部分が、ウェスタ
ーンブロット分析において、ヒトＨＨＶ−６陽性の血清
によって最も信頼性高く認識された。診断の補助に必要
な量のビリオンタンパク質を単離するには、多大な技術
的推敲によってのみ可能となるので、本発明による遺伝
子操作による調製法は特に有利である。ＨＨＶ−６に感
染した細胞を用いるウェスターンブロット分析では、１
００ｋｄａのタンパク質がヒト血清により最も信頼性高
く認識される。ＨＣＭＶの相同遺伝子は遥かに大きなタ
ンパク質をコードするので、原核生物的に発現されたｐ
１００またはその部分が常にヒト血清によって認識され
ることを期待することはできず、またＨＨＶ−６の免疫
原部分はＨＣＭＶｐｐ１５０に対して何ら相同性を示さ
なかった。ＨＣＭＶ ＵＬ４４（ｐＭＦ９０）に相同な
ホスホリル化されたＨＨＶ−６タンパク質の原核生物的
に発現した部分が、ほとんどのＨＨＶ−６陽性のヒト血
清によって認識されることも驚くべきことである。
０の５種類のフラグメント（ｐＤＦ４４６−４、ｐＤＦ
４４６−３、ｐＤ２Ｈａｅ、ｐＤ２Ｈｉｎｄ、ｐＭＦ１
０１Ｒ）を、ベクターｐＲＯＳ中でβ−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質として原核生物的に発現した（エリン
ジャー(Ellinger)ら）。ウェスターンブロットアッセイ
では、カルボキシ末端クローンのみが、両方のウサギヒ
トＨＨＶ−６陽性血清と反応した（図３、図４）。ｐＭ
Ｆ１０１Ｒから発現した融合タンパク質を用いて、前記
の様にしてウサギ血清から抗体を精製した。これらの抗
体を用いて、ＨＨＶ−６に感染したおよび感染していな
いＨＳＢ−２細胞でウェスターンブロット分析を行っ
た。１００ｋｄａのタンパク質は、感染した細胞のみに
検出された。これまで検討を行った総ての発現クローン
のうちで、ｐ１００のカルボキシ末端部分が、ウェスタ
ーンブロット分析において、ヒトＨＨＶ−６陽性の血清
によって最も信頼性高く認識された。診断の補助に必要
な量のビリオンタンパク質を単離するには、多大な技術
的推敲によってのみ可能となるので、本発明による遺伝
子操作による調製法は特に有利である。ＨＨＶ−６に感
染した細胞を用いるウェスターンブロット分析では、１
００ｋｄａのタンパク質がヒト血清により最も信頼性高
く認識される。ＨＣＭＶの相同遺伝子は遥かに大きなタ
ンパク質をコードするので、原核生物的に発現されたｐ
１００またはその部分が常にヒト血清によって認識され
ることを期待することはできず、またＨＨＶ−６の免疫
原部分はＨＣＭＶｐｐ１５０に対して何ら相同性を示さ
なかった。ＨＣＭＶ ＵＬ４４（ｐＭＦ９０）に相同な
ホスホリル化されたＨＨＶ−６タンパク質の原核生物的
に発現した部分が、ほとんどのＨＨＶ−６陽性のヒト血
清によって認識されることも驚くべきことである。
【００２６】本発明によれば、ｐ１００および／または
ＨＨＶ−６のＵＬ４４相同物のフラグメント（ｐＭＦ９
０）および／または４１ｋＤのホスホリル化したＨＨＶ
−６タンパク質またはその免疫原部分であって原核また
は真核細胞、例えば酵母細胞、ヒトまたは動物の細胞中
で製造されたものを、例えばＥＬＩＳＡアッセイにおい
てＨＨＶ−６抗体を検出するための試薬として用いるこ
とが可能である。
ＨＨＶ−６のＵＬ４４相同物のフラグメント（ｐＭＦ９
０）および／または４１ｋＤのホスホリル化したＨＨＶ
−６タンパク質またはその免疫原部分であって原核また
は真核細胞、例えば酵母細胞、ヒトまたは動物の細胞中
で製造されたものを、例えばＥＬＩＳＡアッセイにおい
てＨＨＶ−６抗体を検出するための試薬として用いるこ
とが可能である。
【００２７】
例
ＨＨＶ−６ｐ１００のカルボキシ末端部分から１８２ｂ
ｐのフラグメント（第３表（表１〜５）中のヌクレオチ
ド２９６０〜３１４１）を、発現ベクターｐＲＯＳに連
結した（エリンジャー・エス(Ellinger, S.)ら、１９８
９年）。このクローンをｐＭＦ１０１Ｒと呼ぶ。プラス
ミドｐＭＦ９０、ｐＭＦ９４およびｐＭＦ２９５からの
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントも、ｐＲＯＳ
に連結した。これらをそれぞれｐＤ２ＭＦ９０、ｐＤ２
ＭＦ９４およびｐＤ２ＭＦ２９５と呼ぶ。生成するハイ
ブリッドプラスミドの大腸菌ＪＫ５０への形質転換の
後、プラスミドＤＮＡが予想された制限パターンを有す
るクローンを単離した。ｌａｃプロモーターをイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で
誘発した後、これらのクローンはウイルス画分を有する
多量の融合タンパク質を発現した。この融合タンパク質
を細菌細胞から単離し、ウェスターンブロット実験に用
いた。ＨＨＶ−６に感染したＨＳＢ−２細胞を用いる標
準的なイムノフルオレッセンスアッセイでＨＨＶ−６陽
性である総てのヒト血清はこれらの融合タンパク質の少
なくとも一つを認識した（図３）。イムノフルオレッセ
ンスを用いてＨＨＶ−６陰性であったヒト血清は、僅か
に反応するかまたはまったく反応しなかった。
ｐのフラグメント（第３表（表１〜５）中のヌクレオチ
ド２９６０〜３１４１）を、発現ベクターｐＲＯＳに連
結した（エリンジャー・エス(Ellinger, S.)ら、１９８
９年）。このクローンをｐＭＦ１０１Ｒと呼ぶ。プラス
ミドｐＭＦ９０、ｐＭＦ９４およびｐＭＦ２９５からの
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントも、ｐＲＯＳ
に連結した。これらをそれぞれｐＤ２ＭＦ９０、ｐＤ２
ＭＦ９４およびｐＤ２ＭＦ２９５と呼ぶ。生成するハイ
ブリッドプラスミドの大腸菌ＪＫ５０への形質転換の
後、プラスミドＤＮＡが予想された制限パターンを有す
るクローンを単離した。ｌａｃプロモーターをイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で
誘発した後、これらのクローンはウイルス画分を有する
多量の融合タンパク質を発現した。この融合タンパク質
を細菌細胞から単離し、ウェスターンブロット実験に用
いた。ＨＨＶ−６に感染したＨＳＢ−２細胞を用いる標
準的なイムノフルオレッセンスアッセイでＨＨＶ−６陽
性である総てのヒト血清はこれらの融合タンパク質の少
なくとも一つを認識した（図３）。イムノフルオレッセ
ンスを用いてＨＨＶ−６陰性であったヒト血清は、僅か
に反応するかまたはまったく反応しなかった。
【００２８】したがって、ｐ１００またはＨＨＶ−６の
ＵＬ４４相同物の原核生物的に発現した部分を用いて、
これまで用いられてきたイムノフルオレッセンスよりも
感度が高く且つ特異的な診断分析に用いることができ
る。
ＵＬ４４相同物の原核生物的に発現した部分を用いて、
これまで用いられてきたイムノフルオレッセンスよりも
感度が高く且つ特異的な診断分析に用いることができ
る。
【００２９】文献：チャング・シーケイ(Chang, C.K.)
およびバラチャンドラン、エヌ(Balachandran, N.)、
（１９９１）、ヒトヘルペスウイルス６のリンタン白質
をコードするｃＮＡの同定、特性決定および配列分析、
J. Virol., 65: 2884-2894。ラーチャー、シー(Larche
r, C.) 、ヒューマー、エイチ・ピー(Huemer, H.P.)、
マルグライター、アール(Margreiter, R.)およびディー
リッチ、エム・ピー(Dierich, M.P.) 、（１９８８）、
ヒトヘルペスウイルス−６とサイトメガロウイルスとの
血清学的交差反応、[letter), Lancet, 2: 963-964。ロ
ーレンス、ジー・エル(Lawrence, G.L.)、チー、エム(C
hee, M.)、クラクストン、エム・エイ(Craxton, M.A.)
、ゴンペルス、ユー・エイ(Gompels, U.A.) ホーネ
ス、アール、ダブリュ(Honess, R.W.)およびバレル、ビ
ー・ジー(Barrell,B.G.) 、（１９９０）、ヒトヘルペ
スウイルス６はヒトサイトメガロと緊密な関係がある、
J. Virol., 64: 287-299。リトラー、イー(Littler,
E.) 、ローレンス・ジー(Lawrence, G.)リウ・エム・ワ
イ(Liu, M.Y.) バレル、ビー・ジー(Barrell, B.G.) お
よびアランド、ジェイ・アール(Arrand, J.R.)、（１９
９０）、ヒトヘルペスウイルス６の主要キャプシドタン
パク質遺伝子の同定、クローニングおよび発現、J. Vir
ol., 64: 714-722。ナイペル、エフ(Neipel, F.)、エリ
ンジャー、ケイ(Ellinger, K,)およびフレッケンシュタ
イン、ビー(Fleckenstein, B.)、（１９９１）、ヒトヘ
ルペスウイルス６型の特異領域はヒトサイトメガロウイ
ルスのＵＬセグメントに対して本質的に共直線性（coli
near）である、J. Gen. Virol.。ヤマモト、エム(Yamam
oto, M.)、ブラック、ジェイ・ビー(Black, J.B.) 、ス
チュアート、ジェイ・エイ(Stewart, J.A.) ロペツ、シ
ー(Lopez, C.) およびペレット、ピー・イー(Pellet,
P.E.)、（１９９０）、ヒトヘルペスウイルス６感染症
の特異的血清学的マーカーとしてのヌクレオキャプシド
タンパク質の同定、J.Clin. Microbiol., 28: 1957-196
2。
およびバラチャンドラン、エヌ(Balachandran, N.)、
（１９９１）、ヒトヘルペスウイルス６のリンタン白質
をコードするｃＮＡの同定、特性決定および配列分析、
J. Virol., 65: 2884-2894。ラーチャー、シー(Larche
r, C.) 、ヒューマー、エイチ・ピー(Huemer, H.P.)、
マルグライター、アール(Margreiter, R.)およびディー
リッチ、エム・ピー(Dierich, M.P.) 、（１９８８）、
ヒトヘルペスウイルス−６とサイトメガロウイルスとの
血清学的交差反応、[letter), Lancet, 2: 963-964。ロ
ーレンス、ジー・エル(Lawrence, G.L.)、チー、エム(C
hee, M.)、クラクストン、エム・エイ(Craxton, M.A.)
、ゴンペルス、ユー・エイ(Gompels, U.A.) ホーネ
ス、アール、ダブリュ(Honess, R.W.)およびバレル、ビ
ー・ジー(Barrell,B.G.) 、（１９９０）、ヒトヘルペ
スウイルス６はヒトサイトメガロと緊密な関係がある、
J. Virol., 64: 287-299。リトラー、イー(Littler,
E.) 、ローレンス・ジー(Lawrence, G.)リウ・エム・ワ
イ(Liu, M.Y.) バレル、ビー・ジー(Barrell, B.G.) お
よびアランド、ジェイ・アール(Arrand, J.R.)、（１９
９０）、ヒトヘルペスウイルス６の主要キャプシドタン
パク質遺伝子の同定、クローニングおよび発現、J. Vir
ol., 64: 714-722。ナイペル、エフ(Neipel, F.)、エリ
ンジャー、ケイ(Ellinger, K,)およびフレッケンシュタ
イン、ビー(Fleckenstein, B.)、（１９９１）、ヒトヘ
ルペスウイルス６型の特異領域はヒトサイトメガロウイ
ルスのＵＬセグメントに対して本質的に共直線性（coli
near）である、J. Gen. Virol.。ヤマモト、エム(Yamam
oto, M.)、ブラック、ジェイ・ビー(Black, J.B.) 、ス
チュアート、ジェイ・エイ(Stewart, J.A.) ロペツ、シ
ー(Lopez, C.) およびペレット、ピー・イー(Pellet,
P.E.)、（１９９０）、ヒトヘルペスウイルス６感染症
の特異的血清学的マーカーとしてのヌクレオキャプシド
タンパク質の同定、J.Clin. Microbiol., 28: 1957-196
2。
【００３０】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００３１】
【表６】
【００３２】
【表７】
【図１】ＨＨＶ−６感染ＨＳＢ−２細胞で免疫したウサ
ギの抗血清およびこの抗血清から精製したＨＨＶ−６タ
ンパク質ｐ１００に対する抗体をウイルスタンパク質と
反応させるウェスターンブロット分析を示す説明図。
ギの抗血清およびこの抗血清から精製したＨＨＶ−６タ
ンパク質ｐ１００に対する抗体をウイルスタンパク質と
反応させるウェスターンブロット分析を示す説明図。
【図２】ＨＨＶ−６ゲノムの制限地図を示す説明図。
【図３】ウサギ血清とＰＡＧＥクマシー染色を用いるウ
ェスターンブロットにおける発現ベクターｐＲＯＳ中の
ＨＨＶ−６タンパク質の発現の結果を示す説明図。
ェスターンブロットにおける発現ベクターｐＲＯＳ中の
ＨＨＶ−６タンパク質の発現の結果を示す説明図。
【図４】４名の患者の血清とＨＨＶ−６エピトープとの
反応性を示す説明図。
反応性を示す説明図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:85
// Ｃ１２Ｐ 21/08 1:19
(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C07K 14/045
C07K 16/08
C12N 1/19
C12N 1/21
C12N 5/10
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (19)
- 【請求項１】ヌクレオチド６３９に対応する位置から開
始してヌクレオチド３２４８に対応する位置までの次式
に示されるアミノ酸配列からなるＨＨＶ−６（ヒトヘル
ペスウイルス６型）タンパク質ｐ１００をコードする単
離ＤＮＡ配列物。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 - 【請求項２】位置６３９から位置３２４８に対応する位
置までのヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のＤ
ＮＡ配列物。 - 【請求項３】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列とス
トリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッ
ド形成し、かつ上記のアミノ酸配列で定義される全タン
パク質もしくは該タンパク質の部分であって該タンパク
質に特異的な抗体と反応するがヒトサイトメガロウイル
スおよび他のヘルペスウイルスの構成成分との交差反応
性を実質的に有さないタンパク質をコードするＤＮＡ配
列物。 - 【請求項４】位置２９６０から位置３１４１までの請求
項１に示される配列を有するＨＨＶ−６タンパク質ｐ１
００の免疫原性部分をコードするＤＮＡ配列物。 - 【請求項５】位置２４０８から位置２９５９までの請求
項１に示される配列を有するＨＨＶ−６タンパク質ｐ１
００の免疫原性部分をコードするＤＮＡ配列物。 - 【請求項６】請求項１〜２、４〜５のいずれか１項に記
載のＤＮＡ配列によってコードされる、ＨＨＶ−６タン
パク質ｐ１００またはそのアミノ酸配列において１もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつＨＨＶ−６タンパク質ｐ１０
０の免疫原性を有し、ヒトサイトメガロウイルスおよび
他のヒトヘルペスウイルスとの交差反応性を実質的に欠
く特性を有するタンパク質。 - 【請求項７】請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮ
Ａ配列を含む組換えベクター。 - 【請求項８】前記ＤＮＡ配列が、所望な宿主中でのその
発現を可能にする同種または異種プロモーターによって
制御される、請求項７に記載の組換えベクター。 - 【請求項９】請求項７または８に記載のベクターを含む
形質転換宿主生物。 - 【請求項１０】細菌、好ましくは大腸菌属の細菌、酵
母、好ましくはサッカロミセス属の酵母、植物細胞また
は動物細胞、好ましくは哺乳類の細胞である、請求項９
に記載の形質転換宿主生物。 - 【請求項１１】請求項６に記載のＨＨＶ−６タンパク質
ｐ１００またはその免疫原性を有し、ヒトサイトメガロ
ウイルスおよび他のヒトヘルペスウイルスとの交差反応
性を実質的に欠く特性を有するその部分の製造法であっ
て、請求項９または１０に記載の形質転換宿主生物を培
養し、前記のタンパク質をこの培養物から回収する工程
を含む方法。 - 【請求項１２】請求項６に記載のタンパク質と特異的に
反応するが、ヒトサイトメガロウイルスおよび他のヘル
ペスウイルスの成分とは反応しない抗体。 - 【請求項１３】単クローン性抗体である、請求項１２に
記載の抗体。 - 【請求項１４】請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡ配列および／または請求項６に記載のタンパク質お
よび／または請求項１２または１３に記載の抗体を含
む、ＥＬＩＳＡアッセイを行うための組成物。 - 【請求項１５】請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡ配列および／または請求項６に記載のタンパク質お
よび／または請求項１２または１３に記載の抗体を含
む、ＨＨＶ−６の区別的診断のための組成物。 - 【請求項１６】更に、ＨＨＶ−６の主要キャプシドタン
パク質遺伝子の部分、特に次式に示される二種のＤＮＡ
配列および／またはこれらのＤＮＡ配列によってコード
されるポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成
物。 【化５】 - 【請求項１７】更に、ＨＨＶ−６の主要キャプシドタン
パク質遺伝子の部分、特に請求項１６中の式に示される
二種のＤＮＡ配列および／またはこれらのＤＮＡ配列に
よってコードされるポリペプチドを含む、請求項１５に
記載の組成物。 - 【請求項１８】更に、４１ｋＤのホスホリル化ＨＨＶ−
６タンパク質をコードする遺伝子の部分、特に次式に示
されるＤＮＡ配列および／またはこれらのＤＮＡ配列に
よってコードされるポリペプチドを含む、請求項１４に
記載の組成物。 【化６】 - 【請求項１９】更に、４１ｋＤのホスホリル化ＨＨＶ−
６タンパク質をコードする遺伝子の部分、特に請求項１
８中の式に示されるＤＮＡ配列および／またはこれらの
ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドを含む、
請求項１５に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91111338 | 1991-07-08 | ||
| DE91111338.9 | 1991-07-08 |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20441492A Expired - Fee Related JP3425164B2 (ja) | 1991-07-08 | 1992-07-08 | ヒトヘルペスウィルス６型タンパク質ｐ１００、対応するＤＮＡ配列、それらの製造および使用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0524421B1 (ja) |
| JP (1) | JP3425164B2 (ja) |
| AT (1) | ATE235553T1 (ja) |
| AU (1) | AU666482B2 (ja) |
| CA (1) | CA2073282C (ja) |
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| ES (1) | ES2194008T3 (ja) |
| PT (1) | PT524421E (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ATE240398T1 (de) | 1997-07-11 | 2003-05-15 | Fleckenstein Bernard Prof Dr | Von kaposi-sarkom assoziiertem herpes-virus (kshv,hhv-8) kodiertes polypeptid und dessen verwendung in diagnostik und therapie |
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