JPS61257188A - Ｅｂｖゲノムのｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子、ならびにｅｂｖ関連抗原および該抗原を含有する診断用組成物および製剤組成物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発凱坐技■久団 本発明は、以下に述べる方法ならびに診断用および製剤
組成物に用いられるべきＥＢＶ関連抗原の少なくとも部
分のためにコードするＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列ならび
にそれぞれのＤＮＡ配列の少な（とも部分の位置決定お
よび単離方法に関する。

さらに、本発明は、細菌、酵母、哺乳動物細胞のような
適当な宿主中へ導入された後、該ＥＢＶ関連抗原の抗原
決定基の産生のために有用である組換えＤＮＡ分子すな
わちクローニングおよび発現ベクターに関する。

さらに、本発明は、ＥＢＶ関連抗原に対する抗体の迅速
、簡単、高感度、高度特異的な決定のためのそれぞれの
方法および組成物またはキットにも関する。これらの試
験に於て、ＥＢＶの異なる抗原を用いて、これらの抗原
に対する患者の血清中の特異抗体群を検出する。この検
出は、前感染、新感染、慢性感染、回復および腫瘍（ｎ
ｅｏｐｌａｓ　ｔｉｃ）状態のような血清供与者の感染
の状態に関するかなり信頼できる結論を可能にする。さ
らに、本発明は、ＥＢＶ関連疾患の予防および治療に有
用な該抗原を含有する製剤組成物例えばワクチンに関す
る。

１」ｕ１看 ヘルペスウィルス〔ヘルペトビリジアエ（ＨｅｒｐｅＬ
ｏｖｉｒｉｄｉａｅ）　）は、全直径１５０ｎｎ＋の包
囲２０面体カプシドである。ウィルスゲノムは、分子量
約１０”Ｄの２本鎖ＤＮＡからなっている。

ヒトのヘルペスウィルスは、ヘルペスシンプレックス■
　（“単純庖疹”）、ヘルペスシンプレックス■（陰部
庖疹）、バリセラーシスター（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚ
ｏｓｔｅｒ）　　（水痘、帯状庖疹）、チトメガロウイ
ルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）　（先天性奇
形、例えば小頭症）、およびエプスタイン−パル（Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）（伝染性単
核症（ＩＭ）、パーキットの（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リ
ンパ腫（ＢＬ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ））である。

ヘルペスウィルスは、宿主の一生の間持続する可能性の
ある潜在的感染をつくり上げる顕著な性質を示す。１次
感染後、ヘルペスウィルスは、照射や免疫抑圧のような
、幾つかの公知の型の刺激の１つによって活性化される
までは、休止しているか、あるいは散在的にだけ見られ
るかあるいは全く見られない。かかる内因性疾患の再発
は、ヘルペスシンプレックスまたはシスター（ｚｏｓｔ
ｅｒ）の場合には皮膚上の小庖疹の集まりの形をとり、
あるいはチトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓ）またはＥＢＶの場合にはより一般化された結
果を示す可能性がある。潜在的感染として無期限に存続
するこの能力のために、これらのウィルスは事実上長期
間生存することができる。ここ数年間、ヒトの癌とＥＢ
Ｖとの相関に注意が向けられている。

ＥＢＶは第１次疾患として伝染性単核症を生ずる。主と
して子供または若年成人に起こる。平均成人人口の９０
％以上が、抹稍Ｂ−リンパ球内に−生存続するＥＢＶで
感染されている。このウィルスは耳下腺中で産生され、
経口ルートによって広がる。

血清学は、２種のヒトの腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓ　ｔｉ
ｃ）疾患、アフリカン　バーキット　リンパ腫（八ｆｒ
ｉｃａｎ　Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ）　
　（Ｂ　Ｌ）および鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の惹起にＥＢＶ
が関与する可能性があることを示唆している。伝染性単
核症はＥＢＶによる１次感染の１つの結果である。伝染
性単核症は、付加的な危険因子が無ければ生命を脅かす
疾患ではない。

しかし、しばしば長期間（数週間程度）の自覚的病気感
情と肺臓破裂の危険が劇的に増すための物理的ストレス
を避ける必要性とが、確かにこの疾患の抑制を示唆する
であろう。

伝染性単核症の臨床的診断は、通常、下記のパラメータ
ーの組み合わせから誘導される。

］、　　１．０．０００〜２０，０００、そして５０，
０００にまで達する高い白血球数。

２０）１０％の異型細胞 ３、　リンパ節炎 ４、熱があること 伝染性単核症の患者は唾液中にＥＢＶを放散する。この
ウィルス放散では、流行および近接者の感染は稀である
ので、この病気の漫延に対して特別な予防を必要としな
い（Ａ、Ｓ、エバンス（Ａ、Ｓ。

Ｅｖａｎｓ）、“ＥＢウィルシス染の伝達、経口薬物に
於けるウィルス感染（Ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏ
ｎ　ｏｆ　ＥＢｖｉｒａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　
Ｖｉｒａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｊｏｎｓ　ｉｎ　ＯｒａｌＭ
ｅｄｉｃｉｎｅ＞　　″、Ｊ、フックス、Ｇ、ジョーダ
ン（Ｊ、ＩＩｏｏｋｓ、　Ｇ、Ｊｏｒｄａｎ）編者、エ
ルスビアノースホランドアムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ　Ｎｏｒｔｈ１１０ｌｌａｎｄ　Ａｍｓｔｅｒｄａ
ｍ）、　ｐ、２１Ｈ１９８２）　）　、ウィルス放散は
病気の回復によっては止まらず、成人人口の少な（とも
６０％（おそらくは１００％まで）が、耳下腺の唾液腺
管の上皮細胞中で生涯産出される少なくとも低いレベル
のＥＢＶを放散する〔１１．ウォルフ、Ｍ、ハウス、Ｅ
、ウィルメス（Ｈ，Ｗｏｌｆ。

Ｍ、１Ｉａｕｓ、　Ｅ、Ｗｉｌｍｅｓ）　、”耳下腺中
に於けるエプスタイン・パルウィルスの存続（Ｐｅｒｓ
ｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉ
ｒｕｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　ｐａｒｏｔｉｄ　ｇｌａｎ
ｄ）”。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５Ｈ１９８４））　　。

伝染性単核症例の約１％は、該疾患の初期に於て既に、
あるいはその後の帰結として合併症を示す。はとんどの
合併症は自己免疫機構によるものであり、ある症例では
身体がＥＢＶ転化、増殖性Ｂ細胞の過剰を除去すること
ができる機構による対宿主移植片症と区別することがで
きない。

例えばコルチコステロイドとの併用に於ける高い投与量
のシクロボリンＡによる治療のような還境あるいはプル
ティ口（ｐｕｒｔＨｏ）記載のようなＡＩＤＳまたはあ
る種の遺伝的疾病素質〔ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ）
症候群、Ｘ染色体連鎖リンパ増殖症（ＸＬＰ）；Ｄ、Ｔ
、プルティ口、Ｋ、サカモト、■、バルナベイ、Ｊ、シ
ーソー、Ｔ、ベクトルグ、Ｇ、　ロジャーズ、Ｊ、イエ
ッッ、Ｓ、ハラダ（Ｄ、Ｔ、Ｐｕｒｔｉｌｏ、　Ｋ、Ｓ
ａｋａｍｏｔｏ、　Ｖ、Ｂａｒｎａｂｅｉ。

Ｊ、５ｅｅｌｅｙ、　Ｔ、Ｂｅｃｈｔｏ１ｇ＋　Ｇ、Ｒ
ｏｇｅｒｓ、　Ｊ、Ｙｅｔｓ。

Ｓ、ｌ１ａｒａｄａ）およびＸＬＰ共同研究者：“Ｘ連
鎖リンパ増殖症候群（Ｘ−１ｉｎｋｅｄ　ｌｙｍｐｈｏ
−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）　　
（Ｘ　Ｌ　Ｐ　）をもつ少年に於けるエプスクインーバ
ルウイルス誘発疾患、最近までの登録研究（ＥｐｓＬｅ
ｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ　１ｎｂｏｙｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｘ−１ｉ
ｎｋｅｄ　Ｉｙｍｐｈｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ
ｓｙｎｄｒｏｎｅ　（Ｘ　Ｌ　Ｐ　）　、Ｕｐｄａｔｅ
　ｏｎ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｒｅｇｉｓｔｒ
ｙ）”、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　７３．　ｐ４９
（１９８２））のためにＴ細胞応答が不十分な場合には
、感染したＢ細胞は、宿主の制御から逃がれて、試験管
内で培養されるときになすであろうように制限無く増殖
する機会をもつ可能性がある。この結果は、ＡＩＤＳ患
者の場合にはＢＬ様疾患として（Ｊ、　　Ｌ、ジ−グラ
−１Ｒ，Ｃ，マイナー、Ｅ、ローゼンバウム、Ｅ、Ｔ、
　　レンネソテ、Ｅ、シリトエ、Ｃ，カサバント、Ｗ、
Ｌ、　　ドリュー、Ｌ、ミンク、Ｊ、ゲルショア、Ｊ、
グリーンスパン、Ｊ、ペックステア・ド、Ｋ、ヤマモト
（Ｊ、Ｌ、Ｚｉｅｇｌｅｒ、　Ｒ，Ｃ，Ｍｉｎｅｒ。

ＩＥ、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、　Ｅ、Ｔ、Ｌｅｎｎｅｔｔ
ｅ、　Ｅ、５ｈｉｌｌｉｔｏｅ。

Ｃ，Ｃａ５ａｖａｎｔ、　Ｗ、Ｌ、Ｄｒｅｗ、　Ｌ、Ｍ
ｉｎｔｚ、　Ｊ、Ｇｅｒｓｈｏｒ、　Ｊ。

Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ、　Ｊ、Ｂｅｃｋｓｔｅａｄ、　Ｋ
、ＹａｍａｍｏＬｏ）　、’同性愛男子に於けるパーキ
ット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）様リンバ腫の発現（Ｏｕｔ
ｂｒｅａｋ　ｏｆ　Ｂｕｒ、ｋｉｔｔ’５−１ｉｋｅ　
ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｉｎｈｏｍｏｓｅｘｕａｌ　ｍｅｎ
）　　”　、、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２０）ρ、
６３１　（１９８２））　、あるいはＸ　Ｌ　ｊ患者Ｃ
Ｄ。

Ｔ、プロティ口（Ｄ、Ｔ、Ｐｕｒｔｉｌｏ）ら、上掲〕
または腎臓移植受納者（Ｄ、Ｗ、ハント、Ｇ、フリッツ
ェラ、Ｄ、Ｔ、プロティ口、Ｋ、サカモト、Ｊ。

Ｌ、サリバン、Ａ、　Ｋ、サエムンドセン、Ｇ、クライ
ン、Ｒ，Ｌ、　　シモンズ、Ｊ、Ｓ、ナシヤリアン（Ｄ
、Ｗ、Ｈａｎｔｏ、　Ｇ、Ｆｒ１ｚｚｅｒａ、　Ｇ、Ｔ
、Ｐｕｒｔｉｌｏ、　Ｋ。

Ｓａｋａｍｏｔｏ、　Ｊ、Ｌ、５ｕｌｌｉｖａｎ、　Ａ
、に、Ｓａｅｍｕｎｄｓｅｎ＋　Ｇ。

に１ｅｉｎ、　　Ｒ，Ｌ、Ｓｉｍｏｎｓ、　Ｊ、Ｓ、Ｎ
ａｊａｒｉａｎ）　、”腎臓移植受納者に於けるリンパ
増殖性障害の臨床スペクトルおよびエプスタイン・パル
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルスの役割の証拠（
Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆｌｙｍｐｈ
ｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｃｅｉｓｏｒｄｅｒ
ｓ　ｉｎ　ｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔｒｅｃｉｐ
ｉｅｎＬｓ　ａｎｄ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈ
ｅｒｏｔ　ｏｆ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕ
ｓ　）　　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４１、　　ｐ、４２５３　（１９８１）　］では多クロ
ーン性リすパ増殖性疾患として記載された。

伝染性単核症または急性ＥＢＶ感染の確実かつ迅速な同
定は、白血病に対する鑑別診断、あるいは移植受納者の
場合に於ける移植拒絶発症に対する鑑別診断が必要な場
合には特に重要である。これらの場合に、誤った診断は
正しくない治療に導き、重大な、生命を脅かす結果をも
たらす可能性がある。

ＥＢＶで己こされる１次疾患の子方 伝染性単核症は、−生の極めて早い時期にＩＥＢＶによ
る感染が起こるフイリソピンやマレ−シアのような地域
で゛は知られていないように思われる（Ｄ、Ｓ、に、タ
ン（Ｄ、Ｓ、に、Ｔａｎ）、“マラヤに於けるアジア人
の間には伝染性単核症は無い（Ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ　ａ
ｍｏｎｇ　Ａｓ１ａｎｓ　ｉｎＭａｌａｙｇ）”、　Ｍ
ｅｄ、　Ｊ、Ｍａｌａｙａ　２１　ｐ、３５Ｂ　（１９
６７）　）。

はとんど全人口が遅くとも２〜１０才には抗体を持って
いる。臨床的徴候は若年感染または成年感染の結果であ
るように思われる。ワクチンで感作された生体は、顕著
な臨床的症状なしに感染され、上に挙げた危険群に於け
るしばしばの致死の結果がワクチンによって除かれると
仮定することができる。

パーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）　’ンパ　とＥＢＶ
パーキット（ＢｕｒｋｉＬｔ’ｓ）リンパ腫の発生は、
染色体再配列と連関している。すべての症例がリンパ腫
細胞中にＥＢＶゲノムを含有しているわけではないが、
少なくとも高い出現率をもつ地域では、これらの腫瘍の
９７％がＥＢＶ関連であり、ＥＢ■感染の抑制がパーキ
ット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫の危険を少なくす
るらしい。

ＥＢＶ関゛の可叱な２゛　＾”としての１咽Ｕ隻 ＥＢＶが１００％の関連を示す他の疾患は鼻咽頭癌（Ｎ
　Ｐ　Ｃ）である（Ｍ、Ｊ、　シモンズとＫ。

シャンムガラトナム（Ｍ、Ｊ、Ｓｉｍｏｎｓ　ａｎｄＫ
、Ｓｈａｎｍｕｇａｒａｔｎａａ＋）　ｌｉ著、“鼻咽
頭癌の生物学（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｎａｓ
’ｏｐｈａｒｙｎｇａｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）　　”
ＵＩＣＣテクニカルレポートシリーズ（ＵＩＣＣｔｅｃ
ｈｎｉｃａｌ　ｒｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ）、インタ
ーナショナルユニオンアゲインストカンサー（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｃａ
ｎｃｅｒ）　％ジュネーブＮｐ、１゜（１９８２））。

ＮＰＣは、はとんどしばしば、後鼻腔のローゼンミュレ
ル窩（咽頭窩）から始まる。しばしば、患者は、頚部リ
ンパ節に最初の典型的な転移が生じた後にしか入院させ
られない。

中国南部のある地域で、またシンガポールやマレ−シア
の中国人の中では、ＮＰＣは、１年につき１００，００
０人あたり４０人までの出現率をもち、最も頻度の高い
腫瘍である。ポルネオやチュニジア（Ｔｕｎｅｓｉａ）
のような世界の他の地域でも出現率が高い。はとんどの
その他の地域では、出現率は、１年につきｔｏｏ、ｏｏ
ｏ人当たり約０．２人であり、耳、鼻、咽頭（ＥＮＴ）
の腫瘍の約４％を示す。はとんどのすべての高危険地域
に於て、年令分布は、約４０〜５０才の明らかな単一ピ
ークを示す。しかし、ポルネオに於て、およびチュニジ
ア（Ｔｕｎｅｓｉａ）ではある程度、５〜１５才の若手
層に顕著な第２ピークが見られる（Ｍ、Ｊ、シモンズ（
Ｍ、Ｊ、Ｓｉｍｏｎｓ）ら、上掲〕。

伝統的な中国医療を含む環境因子が、南アジアのある人
口、主として中国人人口中の鼻咽頭癌の危険を増した原
因である可能性がある〔′免疫欠失と癌：エプスタイン
−パルウィルスとリンパ増殖性悪性度（Ｉｍｍｕｎｅ　
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　：Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｌｙｍｐ
ｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｍａｌｉｇｎａｎｃｉ
ｅｓ）　　”、Ｄ、フルティ口（［］Ｎｐｕｒ　ＨＩｏ
）編集、プレナムプレス（Ｐｌ、ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ
）　ｐ、２３３（１９８４）中のＨウルツ（Ｈ，Ｗｏｌ
ｆ）著“エプスタイン−パルウィルスの生物学（Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕ
ｓ）　　”〕。

ＥＢＶ関゛−腫　形成の抑制 腫瘍形成の抑制には、３つの可能な基本的戦略がある。

１、早期発見とそれに続く治療 ２０）理想的には寿命を越えて発病を遅らせること３、
　予防 これらの目的は、多くの腫瘍形成のような多回性疾患に
於ても達成され得る。それ自体では罹病させるのに必ず
しも十分でない本質的な１つ以上の因子を除くことによ
って、あるいは腫瘍症状の発現を促進する因子を減らす
ことによって、疾患出現率を減少させることができる。

本発明の特異的ウィルス関連抗原、あるいは抗体または
遺伝物質を、ウィルス関連腫瘍の早期診断の道具として
使用することにより、木質的な因子の除去を容易にする
ことができる。

Ａ、ＥＢＶによる１゛感染：ＶＡＣ（ウィルスカプシド
抗原）、ＥＡ（初期抗原（ｅａｒｌｙ　−ａｎｔｉｇｅ
ｎ））　、ＥＢＮＡ　Ｃエプスタイン−パル核抗原（Ｉ
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉ
ｇｅｎ）　）に対する抗体の発生 ＥＢＶは、急性または１次感染中にＢリンパ球を感染す
る（単核症）。免疫応答が無いため、多数の細胞が溶解
サイクル（ｌｙｔｉｃ　ｃｙｃｌｅ）中に入り、完全な
１組のウィルス抗原を産生じ、抗原は、細胞溶解中に血
流中へ放出される。これらの抗原に対して、宿主の免疫
系によって特異抗体が合成される（表Ａ）。

恐らく、ＥＢＶの発現を抑制する細胞因子のために、す
べてのＢリンパ球が十分に溶解性の感染を支持する能力
があるわけではない。これらの細胞は、宿主の一生の残
りの期間ＥＢＶゲノムを潜在的に担持している。

大人 ”ＸＬＰ免疫学的に奪取された宿主の１例として’　Ｇ
Ｐ２４０／２００の免疫沈降によって測定（ＭＡ　：膜
抗原）１２皿１ｉ土ＥＡに対する抗体の消失ならびにＶ
ＣＡおよびＥＢＮＡに対する抗体の保持身体の免疫防禦
機構が、溶解的に感染させられた細胞を循環から取り除
くので、抗体レベルは回復期中に低下し始める。しかし
、上述したように、ＥＢＶは耳下腺中で産生される。ウ
ィルス粒子とＥＡを含む細胞内ウィルス関連抗原とは唾
液中へ放出され、中咽頭に達する。ここでウィルス粒子
はＢリンパ球に結合し、抗原として身体へ提示され、か
くしてＶＣＡに対する抗体力価が保たれる。

ＥＡは、リンパ球に結合できないので、プロテアーゼに
よって分解され、従って免疫系に対して抗体産生性抗原
として有効ではない。

ＥＢＶによって潜在的に感染された循環リンパ球はＥＢ
ＮＡを含有する。その生活環の終わりに、これらの細胞
は破壊して、ＥＢＮＡを血流中へ放出する。従って、こ
の抗原に対する抗体は存続する。

かくして、耳下腺中に於けるＦ、ＢＶ産生と潜在的感染
Ｂ細胞からのＥＢＮＡの放出とのために、回復患者の血
清は、抗ＶＣＡおよび抗ＥＢＮＡＩｇＧ抗体レベルが低
い（上記表Ａ参照）。加えて、溶解サイクル（Ｉｙｔｉ
ｃ　ｃｙｃｌｅ）に入り得る稀なりリンパ球から放出さ
れるＥＡは、低劣な抗原である可能性があり、使用する
試験系で検出できる抗体レベルを生じないかもしれない
。

抗体群の出現の公知の順序、特にＩｇＭ抗体の初期の存
在およびそれに続＜ＩｇＧ抗体の存在の順序と組合わせ
て、ＥＢＶで惹起される１次疾患の種々の抗原群を、改
良診断法に利用することができる。しかし、主として細
胞抗原または細胞誘導抗原に基づく使用可能な試験系に
は、重大な制限がある。これは、感度、特にＩｇＭ抗体
の検出に対する感度に関し、非特異的反応にも関する。

ｃ、　Ｎｐｃに・Ｐ、した固　中（７）Ｅｆ３Ｖ’　　
　　：エプスタイン−パル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
）ウィルスが鼻咽頭癌およびアフリカバーキットリンパ
腫（Ａｆｒｉｃａｎ　Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ　Ｌｙｍｐｈ
ｏｍａ）に原因として関連する可能性があるという第１
の示唆的な証拠が血清学的データから誘導された〔総説
として、Ｍ、Ａ、エプスタイン、Ｂ、Ｇ、アコング（Ｍ
、Ａ。

Ｅｐｓｔｅｉｎ、　Ｂ、Ｇ、八ｃｈｏｎｇ）、　　”ザ
エブスタインーバルウイルス（Ｔｈｅ　Ｅｐｓｔｅｊｎ
−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）　　”、シュプリンゲルフェ
ルラークベルリン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　ＶｅｒｌａｇＢ
ｅｒｌｉｎ）　、ハイデルベルク、ニューヨーク（１９
７９）参照）。

ウィルスまたは少なくとも初期ウィルス抗原を産出する
細胞について主として間接的な免疫螢光法を用いて、患
者の血清中に、これらの抗原に対する明らかに°より高
い抗体力価が見いだされた。

初期抗原（Ｅａｒｌｙ　Ａｎｔｉｇｅｎ）　（ＥＡ）と
名付けられる１群の蛋白質とウィルスカプシド抗原と呼
ばれる他の群の蛋白質とに対する非特異免疫グロブリン
を検出したこれらの第１の試験は、ＥＢＶとこれらの疾
患との間の関係の確立に役立った。しかし、これらの試
験は、単一の血清から悪性疾患を明確に診断するために
は価値が制限され、かつ治療の監視に用いることができ
ない。

抗原および抗体群特異性試験の導入、特に２種の抗原族
ＥＡとＶＣＡに対する抹梢ＩｇＡ抗体の決定は、また少
なくともＥＡ族を細分しようとする最初の意図（ＥＡ、
ＤまたはＲ，Ｇ、ヘンル、Ｗ、ヘンル、Ｇ、クライン（
Ｇ、１（ｅｎｌｅ、　Ｗ、Ｈｅｎ１ｅａｎｄ　Ｇ、Ｋｌ
ｅｉｎ）、“エプスタイン−パルウィルス感染細胞の初
期抗原複合体（ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏａ＋
ｐｌｅｘ）中の２種の明瞭な成分の立証（Ｄｅｍｏｎｓ
ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ２　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇ
ｅｎｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
　Ｖｉｒｕｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ）Ｔｎｔ
、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　８．　ｐ、２７２　（１９７１
）　）も、試験の診断および予後の価値を著しく改良し
た。

ＮＰＣに対する危険度の高い地域では、成人人口の１％
がＥＢＶカプシド抗原（ＶＣＡ）に対するＩｇＡ抗体を
もっている。

この群の３％が、臨床検査でＮＰＣを有しており、但し
末端症例は例外で、抗ＶＣＡＩｇＡ陰性症例は発見され
なかっ殆。３年間の追跡調査で、ＩｇＡ抗ＶＣＡ陽性症
例から、毎年約１％がＮＰＣを発生した。この性能の試
験は、高度特異的自動読取り可能ＥＬＩＳＡ試験（ｈｉ
ｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｕｔｏｍａｔｏ−ｒｅａ
ｄａｂｌｅ　ＥＬＩＳＡ　ｔｅｓｔ）として有効なら（
ど、極度に危険な人口のための優れた“第１段階”スク
リーニングを与えるであろう。

ＥＢウィルシスｇＡ／ＶＣＡ抗体の検出は、ＮＰＣの診
断にとって有用であり（３６頁の表参照）、初期段階の
検出のために特に価値がある。

例えば、ウズホウ市（Ｗｕｚｈｏｗ　Ｃ１ｔｙ）　（中
国、ＮＰＣの高度危険地域）では、血清学的大規模調査
によって発見されたＮＰＣの頻度は、夏期（４２％）と
■期（４８％）の患者の％が、そうでない場合の外来患
者診療所で発見される頻度（１期１．７％、■朋３０％
）よりも蟲かに高かった。生き残りの機会は、明らかに
治療を始めた時期に関係する。

１期の生存率は〔上溝腫瘍病院（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｔ
ｕｍｏｒ）Ｉｏｓｐｉｔａｌ）によれば〕９３％、■期
では７５％であり、より進んだ期では非常に低い。従っ
て、早期発見および早期治療によってＮＰＣの死亡率を
減少させることが可能である。

ＥＢＶの早期抗原複合体（ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇｅｎ
ｃｏｍｐｌｅｘ）に対するＩｇＡ抗体は、用いられる方
法によるが、ＮＰＣ患者の４０〜７０％で検出される。

これらの抗体は、腫瘍をもっていない人口にはほとんど
存在していない。腫瘍をもっている個体のかかる試験は
、治療開始の決定に非常に重要であり、腫瘍患者の１０
０％近くに於て疾患の発見が可能になるように感度が増
強されるならば、その価値はさらに高くなるであろう。

ＩｇＡ／ＶＣＡ抗体陽性個体間のＮＰＣの検出率は１．
９％であり、ＩｇＡ／ＥＡ抗体陽性個体の検出率は３０
〜４０％である。これらのデータは、’ｇＡ／ＥＡ抗体
試験の方がＮＰＣの検出にはより特異的であるが、Ｔｇ
Ａ／ＶＣＡ抗体はど敏感でないことを示している。

数多くの研究所がＥＡおよびＶＣＡに対するＩｇＡ抗体
の連続的測定を用いて治療の成功を監視しておりかつ極
めて良好な成功さをもって再発の早期発見を行っている
。

２５０／３５０の膜蛋白　およびそのイいわゆる膜抗原
複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎｃｏｍｐｌ
ｅｘ）　（ＭＡ）を構成するウィルスエンベロープの４
種の蛋白質は記載されている（Ｌ、Ｆ、　クアルティー
レ、Ｇ、Ｒ，ピアソン（Ｌ、、Ｆ、Ｑｕａｌｔｉｅｒｅ
。

Ｇ、　Ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ）、ら、上掲；Ｊ、ノース、
Ａ、Ｊ。

モーガン、Ｍ、Ａ、　エプスタイン（Ｊ、Ｎｏｒｔｈ、
Ａ、Ｊ。

Ｍｏｒｇａｎ、　Ｍ、Ａ、ＩＥｐｓｔｅｉｎ）、　　“
ＥＢウィルシスンベロープおよびウィルス決定膜抗原（
Ｍ−Ａ、）ポリペプチドに関する観察（Ｏｂｓｅｒｖａ
ｔｉｏｎｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ＥＢｖｉｒｕｓ　ｅｎｖｅ
ｌｏｐｅ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
　ｍｅｍｂｒａｎｅａｎＬｉ８ｅｎ　　（ＭＡ）　　ｐ
ｏｌｙ　　ｐｅｐｔｉｄｅ）、　　　”　　Ｉｎｔｊ、
Ｃａｎｃｅｒ２６、　ｐ、２３１（１９８０）　）。こ
れらの蛋白質の２種、すなわちｇｐ２５０とｇｐｚｓｏ
とは、抗原的に密接に関連しているＣＤ、Ａ、　ソーリ
ー・ローソンとに、ゲイリンガ−（Ｄ、Ａ、Ｔｈｏｒｌ
ｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ　ａｎｄＫ、Ｇｅｉｌｉｎｇｅｒ）
、′エプスタインーパルウィルスの主要糖蛋白質（ｇｐ
２５０／　３５０）に対する単クローン性抗体は感染性
を中和する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｊｅ
ｓ　　ａｇａｉｎｓｔ　　ｔｈｅ　　ｍａｊｏｒ　　ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｇｐ２５０／３５０）　ｏｆ
　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ｎｅｗｔｒ
ａｌｉｚｅｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）　　″　、　　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　　ＵＳ
Ａ　　７７＋ｐ５３０７（１９８０）　）。１つの成分
の分子量は、ウィルスが誘専される細胞系によるが、２
００　、０００〜２５０．０００　Ｄの範囲であり、第
２の抗原的に関連する糖蛋白質は、３００，０００〜３
５０，０ＯＯＤの分子量を有するが、ある細胞系では存
在しない。

これらの糖蛋白質は、すべて、抗原性、蛋白質、コード
するＤＮＡ配列が関連しているので、それらは、通常、
ｇｐ２２０／３５０またはｇｐ２５０／３５０あるいは
単にｇｐ２５０またはｇｐｚｓｏと呼ばれるが、関連糖
蛋白の全群を意味する。

糖蛋白質２５０／３５０は、ヒトおよびある種の霊長類
のＢ−リンパ球のＥＢＶリセプターに結合することがで
き、かくしてこれらの細胞の感染を開始することができ
る（Ａ、ウェルズ、Ｎ、コイデ、Ｇ、クライン（Ａ、Ｗ
ｅｌｌｓ、　Ｎ、Ｋｏｉｄｅ、　Ｇ、Ｋｌｅｉｎ）　。

“２種の大ウィルスエンベロープ糖蛋白質はレセプター
陽性細胞に結合するエプスタイン・パルウィルスを媒介
する（Ｔｗｏ　ｌａｒｇｅ　ｖｆｒｏｎ　ｅｎｖｅｌｏ
ｐｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｍｅｄｉａｔｅ　Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓｂｉｎｄｉｎｇ　
ｔｏ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ
ｓ）”、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

４１、　ｐ、２８６（１９８２）　）。これらの蛋白質
に対する抗体はウィルスの感染性を中和する。このこと
は、ヒトならびにウサギ抗血清およびマウス単クローン
性抗体で示されたＣＤ、Ａ、ソーリーーローソン（Ｄ、
Ａ、Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌｏｗｓｏｎ）ら、上掲〕。単ク
ローン性抗体の使用により、ｇｐ３５０およびｇｐ２５
０の両方に存在する唯一の抗原決定基の封鎖は、ウィル
ス中和のために十分であることを示した。固定化された
ｇｐ３５０およびｇｐｚｓｏへのヒト血清の吸着は中和
用抗体を除去したＣＤ、Ａ、ソーリーーローソン（Ｄ、
Ａ、Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌｏｗｓｏｎ）ら、上掲〕。

かくして、 ａ）ｇｐ３５０およびｇｐｚｓｏは中和用抗体の産生を
誘発し、かつ ｂ）　　ｇρ３５０およびｇｐｚｓｏに対する抗体は中
和能を有する という有力な証拠がある。

従って、この蛋白質ならびにその関連ウィルス遺伝子産
物ｇｐ３５０　（３５０，０００の分子量を有する）は
、可能なＥＢＶワクチンの候補である（Ａ、Ｊ、　モー
ガン、Ｍ、Ａ、エプスタイン、Ｔ、Ｒ，ノース（Ａ、Ｊ
、Ｍｏｒｇａｎ＋　Ｍ、Ａ、Ｅｐｓｔｅｉｎ、　Ｊ、Ｒ
。

Ｎｏｒ　Ｌｈ）、“マウス、ウサギ、コツトン・トップ
タマリン（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ　ｔａｍａｒｉｎｓ）
に於ける新規アジユバントを伴うエプスタイン−パルウ
ィルス膜抗原（ＭＡ）ｇｐ３４０に関する比較免疫原性
の研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｉｃｉｔｙ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅ
ｎ（ＭＡ）ｇｐ３４０ｗｉｔｈ　ｎｏｖｅｌ　ａｄｊｕ
ｖａｎｔｓ　ｉｎ　ｍ１ｃｅ、　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｎ
ｄｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ　ｔａｍａｒｉｎｓ）”、　Ｊ
、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、　１３＋ｐ、２８１（１９８４
）　）。これらの糖蛋白質は、誘導されたＨＢＶ産生性
細胞系で示されるか細胞表面蛋白質の放射性ヨウ素化後
に容易に示すことができるＣＬ、Ｆ。

クアルティーレ、Ｇ、Ｒ，ピアソン（Ｌ、Ｆ、ＱｕａＪ
　Ｌｉｅｒｅ。

Ｇ、Ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ）、　　”エプスタイン−パル
ウィルス誘発膜抗原：ＥＢＶ重感染ラジう胞がらのトラ
イトンＸ−１００可溶化ウイルス膜抗原の免疫化学的キ
ャラクタリゼーション（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａ丁ｒ　ｖ
ｉｒｕｓ−ｔｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔ
ｉｇｅｎｓ　：　ｉｍｍｕｎｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｏｎ　
Ｘ−１００５ｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄｖｉｒａｌ　ｍｅｍ
ｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｆｒｏｍ　ＥＢＶｓｕ
ｐｅｒｉｎｆｅｃｔｅｄ　Ｒａｊｉ　ｃｅｌｌｓ）”、
　ＩｎＬ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２３＋ρ、８０８（１９
７９））　　。

ＩｇＧ抗体は、１次ＥＢＶ感染の急性期中には存在しな
いが、回復期後の一生の間存在する。

ＩｇＭ抗体は、この疾患の早期に存在するが、回復期中
には存在しない。

ＥＢＶ抗原に対するＩｇＡ抗体は、はとんどもっばらＮ
ＰＣ患者に存在し、あまり感度の高くない試験でもこれ
らの患者の少なくとも５８％の血清中に検出される〔ゼ
ングイとハンスウルフ（Ｚｅｎｇ　Ｙｉ　ａｎｄ　Ｈａ
ｎｓ　Ｗｏｌｆ）、作製中の原稿および下記実施例１６
〕。

ＮＰＣ患者と正常個体とからのＶＣＡおよびＭＡに対す
るＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の陽性率の比較 ＭＡ／【ｇＧ　　　ＭＡ／ｒｇＡ　　　　　ＶＣＡ／Ｉ
ｇＡ　　　　［！Ａ／ＩｇＡ症例（＋）　（＋）　　（
＋）　（＋）　　（＋）　（＋）　　（＋）　（＋）数
　率％　数　率％　数　率％　数　率％ＰＣ 患者４８４８　１００　２８５８．３　４８　１００　
３１　６４．６正常 個体４８４７９７．９　　０　０　　０　０　　０　０
＊％ｆＡ／ＩｇＧおよびＭＡ／ＩｇＡは免疫螢光法で検
出。

ＶＣＡ／ＩｇＡおよびＥＡ／ＩｇＡは免疫酵素試験で検
出。

全ｇｐ２５０分子またはそのバンクポーンポリペプチド
鎖の部分は、受身血球凝集反応、交差ゲル電気泳動法、
ラジオイムノアッセイ法あるいは酵素免疫測定法のよう
な優先的クラス特異性抗体検出試験の試薬として利用す
ることができる。

高度に特異的な試験抗原は、より良い信号を与えかつそ
うでなければわからない臨床的に重要な低い抗体レベル
を検出する。ある場合には、全遺伝子産物ではなくてｇ
ｐ２５０の特異な抗原部位を用いることによって、疾患
のより正確な診断が可能になる。

Ａ、生涯の早期に於けるＥＢＶによる感染は無症状の血
清変換を起こすだけであるので、母性抗体またはワクチ
ンによって誘発された抗体の存在は、１次ＥＢＶ感染の
臨床的発現に影響するであろうことが予想される。好ま
しくはＥＢＶ感染を受ける危険のピーク前の、子供また
は若年成人の予防接種は、人口中の伝染性単核症の臨床
的発現を有効に減少させることが期待される。

Ｂ、ＮＰＣまたはＢＬＯ高出現率をもつすべての地域に
於て、人口は、−生の最初の１〜２年以内にＥＢＶへの
ほとんど１００％の血清変換を示す。予防接種は、誕生
後間もなく行われねばならないであろう。この予防接種
を規則正しく繰り返せば、多分、ＥＢＶ感染を予防し、
あるいはそれを遅らせ、あるいは初期１次惑染の生物学
的影響を減少させるであろう。これらの結果のおのおの
は、その後の腫瘍の発生を予防し、あるいはその開始を
相当に遅らせ、あるいはその相対的危険を減少させるこ
とが期待される。

Ｃ，ＮＰＣに於て、腫瘍部位に於けるウィルス抗原の時
々の産生は、主としてＩｇＡ分泌性Ｂリンパ球を刺激す
るであろう。ＩｇＡ抗体は、抗体媒介細胞障害を阻害す
る能力がある。ｇｐ２５０のようなウィルス膜抗原に対
するＩｇＡ抗体は、ＮＰＣおよびＢＬ患者中に存在し、
疾患の指示剤であるだけでなく、そのマスキングボテン
シャルによって免疫系の不全に貢献して腫瘍細胞を除去
することすらあり得る。腫瘍患者に投与された多量の精
製抗原は、［ｇＡと結合し、同抗原に対する過剰のＩｇ
Ｇ抗体の産生を開始する可能性がある。これらの特異的
１ｇＧ抗体は、次に残留１ｇＡ抗体と競争して、抗体依
存性機構による腫瘍細胞の除去を可能にする。

Ｄ、ｇｐ２５０または関連産物の適当な投与は、細胞免
疫機構をも増強し、かくして腫瘍の増殖を制限すること
ができる。

本発明のＥＢＶ＠ｉ”原の生産 ■、すべての発見の結果として、本発明の目的は、抗体
クラスおよび抗原特異性抗体の検出のための試験の感度
を改良することおよび大量試験と、より良い標準化とを
可能にする方式とを開発することである。

２０）ＥＢＶは、有効に感染できる細胞が現在知られて
おらずかつＥＢＶまたは関連抗原の調製のための源とし
て用いられるすべての細胞が固定細胞かまたは腫瘍誘導
細胞でさえあるので、溶解細胞サイクル中で有効に産生
され得ない。

はとんどの細胞系に於てレトロウィルスが示されている
。従って、かかる培養から単離される産物は、非常に高
価であるばかりでなく、その使用も潜在的に危険である
。

３、　　ｍ換えＤＮＡ技術の適用は、組換えＤＮＡ分子
により形質転換されかつ適当な培養系で増殖された適当
な宿主細胞による有用なポリペプチドの生産を可能にし
た。

４、本発明によれば、細菌〔例えばエシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属〕、酵母〔
例えばカンシタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、またはサツカロ
ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属〕、哺乳類細
胞〔例えば、ベロ（Ｖｅｒｏ　）−細胞、ＣＨＯ−細胞
またはリンパ芽球皮疹細胞系〕のような適当な宿主に於
けるＥＢＶ蛋白質ｐ１３８Ｎｐ１５０、ｇｐ２５０／３
５０をコードする遺伝子または遺伝子の少なくとも部分
の遺伝情報を発現させるために組換えＤＮＡ法を用いる
。

５、　さらに、Ｅ１３Ｖ蛋白質ｐ１５０Ｎｐ１４３．１
）１３８Ｎｐ１１０Ｎｐ１０５Ｎｐ９０、ｐ８０Ｎｐ５
４をコードするゲノム領域を同定し、かつその診断目的
のための関連を確認した。

従って、蛋白質ｐ１３８Ｎｐ１５０．ｇｐ２５０／３５
０のために示した方法によるこれらの蛋白質またはその
抗原決定基の生産のための主要情報をも本発明では記載
する。

排換人旦凡人に街 Ａ、光里屓工糸 原核生物は、最もしばしば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の
種々の株によって代表される。しかし、細菌、例えばバ
チルス・ズブチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬｉｌｉ
ｓ）　、種々のプセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）種または他の細胞株のような他の微生物株も用いら
れる。かかる原核生物系では、宿主と相容性の種から誘
導される複製部位および制御配列を含むプラスミドベク
ターが用いられる。例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は
、典型的には、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、ジーン
（Ｇｅｎｅ）２０）ｐ、９５　（１９７７）によって大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）種から誘導されるプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢｌ？３
２２は、アンゼシリンおよびテトラサイクリン耐性のた
めの遺伝子を含み、これらのマーカーは、所望のベクタ
ーの構築に於て保持される場合も破壊される場合もあり
得る。本明細書で、随意にオペレーターと共に、リポソ
ーム結合部位配列と共に、形質転換開始のためのプロモ
ーターを含むと定義される、通常用いられる原核生物制
御配列は、かかる通常用いられるプロモーターを、ベー
タラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳＜Ｍ　（ｌ
ａｃ）プロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、ネー
チ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、１９８Ｎｐ１０５６（１
９７７））としておよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター系〔ゴエデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８．　ｐ、４０５７（
１９８０））として含む。携帯用制御カセットとして有
用となったラムダ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝
子リポソーム結合部位〔シマタケ（Ｓｈ　ｉｍａ　ｔａ
ｋｅ）ら、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　２９２　Ｎ
ｐ：１２Ｂ　（１９８２））も例である。しかし、原核
生物と相客性のどんな人手可能なプロモーターも使用す
ることができる。

細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として使
用することができる。サツカロミセス拳セレビシアエ（
Ｓｕｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
の実験室株、パン酵母が最も多く用いられるが、多数の
他の株が市販されている。２μの複製起源を用いるベク
ターが示されている（Ｊ、Ｒ。

ブローチ（Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ）、Ｍｅｌｔｈ、　Ｅ
ｎｚ、　１０１．ｐ３０７（１９８３）　）が、酵母の
発現のために適した他のプラスミドが知られている〔例
えばステインチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ネー
チャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２０）ｐ、３９　（１
９７９）：チェンバ（Ｔｓｃｈｅｍｐｅ）ら、ジーン（
Ｇｅｎｅ）　　１０Ｎｐ、１５７（１９８０）；Ｌ、ク
ラーケ（Ｌ、Ｃ１ａｒｋｅ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　
Ｌｏｔ、　ｐ、３００（１９８３）参照〕。酵母ヘクタ
ー用の制御配列には、解糖酵素の合成のためのプロモー
ターが含まれる〔ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅ
ｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７．　ｐ、１４９（１９６８）
　；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１７Ｎｐ、４９００
　（１９７８）　）　、技術上既知のその他のプロモー
ターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプ
ロモーター〔ヒツツエマン（Ｉｌｉｔｚｅｍａｎ）ら、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ。

２５５、　ｐ、２０７３　（１９８０））　、およびグ
リセリンアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキ
ソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グリコース−６−燐酸イソメラーゼ、
３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ
、三炭Ｉｌ！ｅ酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ、グルコキナーゼのような他の解糖酵素のため
のプロモーターが含まれる。増殖条件によって制御され
る転写の付加的利益を有する他のプロモーターは、アル
コールデヒドロゲナーゼ２０）イソテトラロームＣ，Ｍ
ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解（ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｖｅ）酵素、マルトースおよびガラクトース利
用の原因となる酵素〔ホランド（１１０ｌ　１ａｎｄ）
、上掲〕のた−めのプロモーター領域である。

種々の証拠は、コード配列の３゛末端に於てターミネー
タ−配列が望ましいことを示唆している。かかるターミ
ネータ−は、酵母誘導遺伝子中のコード配列に続く３゛
未翻訳ｖ４域内に見いだされる。示される多くのベクタ
ーは、プラスミドｐｅｎｏ４６　　（Ｍ、　　Ｊ、ホラ
ンド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
）　　２５６Ｎｐ、１３８５　　（１９８１））を含む
エノラーゼ■遺伝子またはＹＥｐ　１３（Ｊ、ブローチ
（Ｊ、Ｂｒｏａｃｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８Ｎｐ、
１２１　　（１９７９））から得られるＬＥ［２遺伝子
から誘導される制御配列を含むが、酵母と相容性のプロ
モーター、複製源および他の制御配列を含む任意のベク
ターが適当である。

勿論、多細胞生物から誘導される真核生物宿主細胞培養
中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現することも
可能である。例えば、グルーズとパターソン（Ｃｒｕｚ
　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編著″組成培養（Ｔｉ
ｓｓｕｅ’　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　　″、アカデミツクプ
レス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　　（１９７３
）を参照されたい。有用な宿主細胞系には、ベロ（ＶＥ
ＲＯ）およびヘラ（Ｈｅ　Ｌ　ａ　）細胞、ならびにチ
ャイニーズハムスターオバリー（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍ
ｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ）　（ＣＩ（Ｏ）細胞が含まれる
。かかる細胞のための発現ベクターは、通常、例えばシ
ミアン（Ｓｉｍｊａｎ）ウィルス４０（ＳＶ４０）〔フ
ィアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）２７３Ｎｐ、１１３　　（１９７８））からの通常
用いられる初期および後期プロモーター、あるいはポリ
オーマアデノウィルス、牛乳頭腫ウィルスまたはニワト
リ肉腫ウィルスから誘導されるプロモーターのような他
のウィルスプロモーターのような、哺乳類細胞と相容性
のプロモーターおよび制御配列を含む。

哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な面は、１９８３年
８月１６日発行の米国特許第４．３９９，２１６号中で
、アクセル（Ａｘｅｌ）が記載している。今や、最適発
現には“エンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）　　”領域
が重要であるようにも思われる。これらの領域は、一般
に、プロモーター領域の上流にしばしば見られる配列で
ある。

複製源は、必要ならばウィルス源から得ることができる
。しかし、染色体中への遺伝子組込みは、真核生物に於
けるＤＮＡ複製の通常の機構であり、それ故、独立に複
製するヘラターは所要でない。植物細胞も、現在、宿主
として有効であり、ツバリンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉ
ｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）プロモーターおよびポリアデニ
ル化シグナル配列（Ａ、デピノカー（Ａ、Ｄｅｐｉｃｋ
ｅｒ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　Ｌ
　ｐ、５６１　（１９８１））のような、植物細胞と相
容性の制御配列も有効である。

Ｂ、適当な宿主のン質転（ 使用される宿主細胞によって、かかる細胞にとって適当
な標準的方法を用いて形質転換を行う、Ｓ、Ｎ、コーエ
ン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ）　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　６９
．　ｐ、２１１０　（１９７２）によって記載されたよ
うな、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、原核
生物または実質的な細胞壁バリヤーを含む他の細胞に用
いられる。

ある種の植物細胞に対しては、アグロバタテリウムパン
ノファシエンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）による感染（Ｃ，Ｈ，シャウ（に、１
１．Ｓｈｏｗ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２３　Ｎｐ、
３１５（１９８３））が用いられる。かかる細胞壁のな
い哺乳類細胞に対しては、グラハムとファンデルニブ（
Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）の燐酸
カルシウム沈殿法〔バイオロジー（νｉｒｏｔｏｇｙ）
　５２＋ｐ、５４６　（１９７８））が好ましい。酵母
中に於ける形質転換は、Ｐ、パンゾリンゲン（Ｐ、Ｖａ
ｎＳｏｌｉｎｇｅｎ）ら（Ｊ、Ｂａｃｔ、　１３０．　
ｐ、９４６　（１９７７）　）とＣ，Ｌ、フシャオ（Ｃ
，Ｌ、Ｈｓｉａｏ）ら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ｔｌｓＡ）　７
６、　ｐ、３８２９　（１９７９））の方法に従って行
われる。別法では、クレイ（Ｋｌｅｂｅ）らの方法〔ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）　２５．　ｐ、３３３（１９８３）　
）を用いることができる。

Ｃ１，＾えクローニングおよび−視さ久久二傅構築 所望のコード（ｃｏｄｉｎｇ）および制御配列を含む適
当なベクターの構築は、技術上よく理解されている標準
連結および制限方法を用いる。単離したプラスミド、Ｄ
ＮＡ配列または合成されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを開裂し、テーラ−１，（ｔａｉｌｏｒｅｄ）かつ
所望の形に再連結する。

部位特異性ＤＮＡ開裂は、技術上一般に理解されている
条件下で適当な１種または２種以上の制限酵素による処
理によって行われ、その特別なものは、これら市販の制
限酵素のメーカーによって明示されている。例えば、ニ
ューイングランドバイオラブズ、プロダクト　カタログ
（Ｎｅｗ　ｌＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇ）を参照されたい。

所望ならば、標準方法を用い、ポリアクリルアミドゲル
またはアガロースゲル電気泳動によって、開裂断片のサ
イズ分離を行うことができる。サイズ分離の一般的な記
載は、“酵素学に於ける方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”６５゜ｐ、４９９−５６０　
（１９８０）に見られる。

制限開裂断片は、４種のデオキシヌクレオチド三燐酸（
ｄＮＴＰｓ）の存在下に於て、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
　　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ！　〔フレナラ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）　）の大断片による処理によって平滑末端にする
ことができる。フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片は５゛付
着末端に於て満たすが、突き出している３゛一本積を、
板金４種のｄＮＴＰｓが存在してもチューバック（ｃｈ
ｅ％４　ｂａｃｋ）する。所望ならば、付着末端の性質
によって指令される制限内で、選ばれた１種または２種
以上のｄＮＴＰｓだけを供給することによって、選択的
に修復を行うことができる。適当な条件下に於けるＳ１
ヌクレアーゼによる処理は、−末鎖蛋白質の加水分解を
もたらす。

合成オリゴヌクレオチドは、マツチウム（Ｍａｔｌｅｕ
ｃｃｉ）らのトリエステル法（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　１０３．　ｐ、３１８５　（１９８１）　）
または１９８３年１１月１５日発行の米国特許第４．４
１５，７３２号記載のカルーザーズ（Ｃａｒｕ　ｔｈｅ
ｒｓ）のジエチルホスホルアミダイト（ｄｉｅｔｈｙｌ
　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によって製造す
ることができる。

連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
い、標準の条件および温度の下で行われる。

“ベクター断片”を用いるベクター構築に於ては、５゛
燐酸を除去しかつベクターの再連結を防ぐために、通常
、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）でベクター断
片を処理する。ＢＡＰの消化は、標準条件下（下記説明
のように）で行われる。

Ｄ、朋厘１ｚ：　ｔＡ　４）ｒ−（グ改沢構築に於て、
プラスミド構築のための正しい連結は、大腸菌（ＩＥ、
ｃｏｌｉ）または他の適当な宿主を連結混合物で形質転
換させることによって確認される。上首尾の形質転換体
は、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物
質耐性によって、あるいは技術上知られているような、
プラスミド構築方式に依存する他のマーカーを用いて選
ばれる。

又尻生血工奏厘Ｗ 本発明は、組換えＤＮＡ技術によるＥＢＶ特異的抗原の
製造ならびにＥＢＶ関連疾患の診断、予防、治療に於け
るその使用に関する。従って、本発明の目的は、鼻咽頭
癌（ＮＰＣ）、伝染性単核症、バーキット（Ｂｕｒｋｉ
ｔｔ’ｓ）リンパ腫（図１および図２８の凡例参照）の
ようなエプスタイン−パルウィルス関連疾患と免疫学的
方法によって相関されるｐ１５０Ｎｐ１４３Ｎｐ　１．
３８ＮｐＨｏ、ｐ１０５Ｎｐ９０．　ｐ８０．Ｎｐ５４
　（Ｇ、　Ｊ、ベイリス、Ｈ，ウルツ（Ｇ、Ｊ、Ｂａｙ
ｌｉｓｓ、　Ｉｌ、Ｗｏｌｆ）、下掲〕のような新規エ
プスタイン・パルウィルス抗原を同定することである。

本発明のもう１つの目的は、例えばＥＢＶが診断上重要
でかつ医療目的のために適切な該抗原をコードするＢ９
５−８細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）　、ロックビル、メリーランド、ＵＳ
＾（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ１６１２）　（Ｊ　、スケア、Ｊ
、Ｌ、ストロミンガー（Ｊ、５ｋａｒｅ、　Ｊ、Ｌ、Ｓ
ｔｒｏｍｉｎｇｅｒ）、“エプスタイン−パルウィルス
の形質転換Ｂ９５−８株からのＤＮＡのＢａｍ１ｌｌ工
ンドヌクレアーゼ断片のクロ、−ニングおよびマツピン
グ（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄＭａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｂ
ａｍ１ｌｌ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔｓ　ｏｆｔｈｅ　　ＤＮＡ　　ｆｒｏｍ　　ｔｈｅ
　　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　　Ｂ９５−８　５ｔｒ
ａｉｎｏｆ　［７ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ
）’、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、　ｐ３８６０（１９８０））
からクローニングされているように、ＥＢＶのゲノム領
域の位置決定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および同定
である。

本発明のもう１つの目的はＮｐ１３８およびｐ１５０の
ような医療用に有用な抗原の少なくとも一部分をコード
するＢ９５−８細胞からクローニングされる、ＥＢＶ、
例えば現存のＥＢＶライブラリーからのＥＢＶのゲノム
領域のサブクローニングである。このことは、ＥＢＶ　
　Ｂ９５−８サブクロ一ンｐＢＲ３２２Ｂａｍ＾　（Ｊ
、スケア（Ｊ、５ｋａｒｅ）ら、下掲〕から誘導される
サブゲノム断片、例えＸｈｏｌ断片をプラスミドｐＵＣ
８（Ｊ、メッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）下掲）（ｐ
［Ｊｃ６３５、図４参照）に接合させることによって達
成さる。

本発明のもう１つの目的は、細菌（例えばエシェリヒア
（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ）属、サルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
の細菌）、酵母〔例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属
またはサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属の酵母〕、動物細胞およびヒト細胞（例えばベロ（Ｖ
ｅｒｏ）−細胞；　ＣＨＯ−細胞；適当な選択系と随意
に官能性ｇｈｆｒ遺伝子担持プラスミドならびに適当な
調節配列の制御下のＥＢＶ遺伝子の遺伝情報と組合わせ
たＣｌｌ０ｄｈｆｒ細胞；あるいはリンパ芽球皮疹細胞
系〕のような適当な宿主細胞中に於けるそれぞれの遺伝
情報の発現による蛋白質の製造である。これらの宿主細
胞によって生産される蛋白質は、例えばｐ１３８、ｐ１
５０またはｇｐ２５０／３５０関連抗原決定基を含み、
発現方式によって、融合蛋白質として、あるいは非融合
蛋白質として合成される。

細胞による融合蛋白質の生産のために、ゲノムサブ断片
例えばＥＢＶ　　Ｂ９５−８のｐ１３８の一部分をコー
ドしかつ既知のプラスミドｐｔｌｃ　Ｂ中へ導入される
ゲノムサブ断片の発現を、例えばイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＪＰＴＧ）によって誘発さ
せた。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で固定され
た。

もう１つの融合蛋白質は、サブクローンｐ［Ｉｃ６３５
をＥｃｏＲＩおよびＢｇＩ［によって開裂しかっこの断
片をベクタープラスミドｐＵＣ９　（Ｕ、　リュータ−
（ＩＪ、Ｒｕｔｈｅｒ）　、下拙〕中へ導入することに
よって得られる。得゛られた組換えプラスミドはｐＵＣ
９２４（図６）である。発現産物は約９６ｋｄのサイズ
であった。

もう１つの融合蛋白質はＮｐＢＲ３２２ＭａｍＡの該Ｘ
ｈｏｌ−ｐ１３８コードフラグメントの遺伝情報をプラ
スミドルＥへ３０５（Ｅ、アマン、Ｊ、）゛ロシウス、
Ｐ、ブタシュネ（Ｅ、Ａｍａｎｎ、　Ｊ、Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、　Ｍ、Ｐｔａｓｈｎｅ）　＋大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）中に於けるクローン化遺伝子の調節された発現のため
に有用なハイ−ブリッドＬｒｐ−１ａｃ−プロモーター
担持ヘラター（Ｖｅｃ　ｔａｒｓｂｅａｒｉｎｇ　ａ　
ｈｙｂｒｉｄ　ｔｒｐ−１ａｃ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｕ
ｓｅｆｕｌ　ｆｏｒｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｏｎｅｄ　ｇｅｎｅ　　ｉｎ　Ｅ
。

ｃｏｌｉ）　　”、　　ジーン（Ｇｅｎｅ）　　２５　
Ｎｐ、１６７　（１９８３））中に於て発現させること
によって産生される。

ＰＥＡ３０５に関する適正な読取り枠中へｐ１３８関連
情報を入れた後、クローンｐＭＦ９２４がλ−リプレッ
サー蛋白ｔｃｔ　　ｃ図７）の一部分を含む融合蛋白質
を合成する。

さらにもう１つの融合蛋白質はＮｐ１３８関連遺伝情報
３′を含む３．ＯｋｂゲノムＸｈｏＩ断片をｔｒｐ〜ｌ
ａｃプロモーターへクローニングする〔下拙のＦ。

アマン（Ｆ、Ａｌｌ１ａｎｎ）ら記載のように〕ことに
よって得られる。この目的には、既知のプラスミドｐＫ
Ｋ２４０−１１を用いた。得られたｐＫＫ３７８は、ｐ
１３８関連ＤＮＡＤＮＡ上の後に続くアミノ末端メチオ
ニン残基からなる融合蛋白質を合成する（図８）。

本発明のさらにもう１つの目的はＮｐ１３８のようなウ
ィルス蛋白質の抗原決定基蛋白質サブ領域のみを含有す
る融合蛋白質または非融合蛋白質またはオリゴペプチド
を提供することである。この目的のため、テ゛イジタル
エキッブメントＶＡＸ１　１　　／　　７　５　０　　
　（Ｄｉｇｉｔａｌ　　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　　ＶＡＸ
　　１１／７５０）コンピューターのために本発明者ら
が開発したコンピュータープログラムを用い、コンピュ
ーター指示分析によって、蛋白質の決定基の位置を決定
する。他の問題およびＧ、Ｈ，コーエン、Ｂ、ディーツ
ショルド、Ｍ、ボンフドレオン、Ｄ、ロング、Ｅ、ゴル
ブ、Ａ、バリチオ、Ｌ、ペレイラ、Ｒ，Ｊ、アイゼンベ
ルブ（Ｇ、１１．Ｃｏｈｅｎ。

Ｂ、Ｄｉｅｔｚｓｅｈｏｌｄ、　Ｍ、Ｐｏｎｃｅ　ｄｅ
　Ｌｅｏｎ、　Ｄ、Ｌｏｎｇ＋Ｅ、Ｇｏｌｕｂ、　Ａ、
Ｖａｒｒｉｃｈｉｏ、　ｉ、、Ｐｅｒｅｉｒａ＋Ｒ，Ｊ
、［Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、“中和用抗原の生産を刺激
するヘルペスシンプレックスウィルス糖蛋白ｔＤの抗原
決定基の位置決定および合成（Ｌｏｃａ　１　ｉｚａ　
ｔ　１ｏｎａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｏｎ　
　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｏｆ
Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｇｌｙｃ
ｏｐｒｏ’ｔｅｉｎ　Ｄ　ｔｈｅｔｓｔｉｍｕｌａｔｅ
ｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｗｔｒ
ａｌｉｚｔｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ）　、　Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、　４９．　ｐ、１０２　（１９８４）によるもう１
つのコンピューターのために同様なプログラムを用いた
。それぞれの断片をｐｕｃ　８またはｐＵＲ２８８（Ｕ
、　　リュータ−（Ｕ、Ｒｉｔｈｅｒ）ら、下拙〕のよ
うなベクター中へクローニングすることにより、戚匹並
および剋竪並のようなプラスミドが得られた。産生され
た大および小融合蛋白質は、ゲル電気泳動およびイムノ
ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験
で研究される。ｐＵＣ２８Ｂにおけるクローニング実験
が、小９１３８関連ポリペプチドを安定化させるために
行われた。

本発明のもう１つの目的は、数種の異なるＥＢＶ血清型
の抗原決定基を含む多抗原（ｐｏｌｙａｎｔｉｎｇｅｎ
ｓ）の発現である。この目的のため、対応する　ＤＮＡ
断片を連鎖し、適当なベクター中へ導入する。発現産物
は融合および非融合ＥＢＶ−特異的多抗原である。

ｐ１５０関連抗原決定基を含む別の融合蛋白質がＮｐＨ
Ｒプラスミドおよびｐｔｌｃプラスミド中の対応するＤ
ＮＡ配列のクローニングおよび発現によって得られた。

得られた構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）は、組換エフ
ラスミドＮｐＵＲ２９０ｃＸＨ５８０ＮｐＵＲ２９０Ｄ
ＢＸ３２０、ρＵＲ２９２ＤＢ８１１３０ＮｐＵＲ２９
０ＤＴＴ７００ＮｐＵＲＤＴＴ７４０　。

ｐＵＲ２９０ＤＴＰ６８０ＮｐＵＲ２８８ＤＰＰ３２０
であった。

本発明のもう１つの目的は、ウィルス蛋白質ｐ１３８の
コート　（ｃｏｄｉｎｇ）　ｖ４域の一部分を含む匹匹
別およびｐＵＣ６０１のような新規の発現ベクトルの構
築である。ＤＮＡ配列を、この配列に対して３゛で、ベ
クター中へ導入すると、発現蛋白質は、ｐ１３８特異的
アミノ酸配列定配って安定化されかつプロテアーゼ分解
に対して保護される。

本発明のさらにもう１つの目的は、３〜１４個のアルギ
ニン残基のためのＤＮＡ配列コードと誘発現ベクターの
クローニング部位の少な（とも１個の停止コドンとを導
入しかつさらに適当な読取り枠内に置くことによる該発
現ベクターの修飾である。得られたベクターはｐＵＣＡ
１２　Ｇ６０１である。

もし蛋白質物質のためのＤＮＡ配列コードをこの発現ベ
クター中へ挿入すると、発現産物は、プラスミド西超匹
旦す（図１２ａ参照）およびｐＵＣＡＲＧ６８０によっ
てコードされた融合蛋白質のようなカルボキシ末端に該
アルギニン残基を担持する融合蛋白質である。

かくして、本発明の゛もう１つの目的は、Ｈ，Ｍ。

サツセンフェルド、Ｓ、Ｊ、ブリューワー（１１，Ｍ。

５ａｓｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｓ、Ｊ、Ｂｒｅｗｅｒ）　　
（“組換え蛋白質の精製のために設計されたポリペプチ
ド融合（Ａ’ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｕｓｉｏｎ　
ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ）’、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２．　ｐ
、７６　（１９８４）　）に従って宿主細胞溶解産物か
らＥＢＶｐ　１３８または関連するポリペプチドまたは
オリゴペプチドのような診断、予防、治療に有用な蛋白
質を単離するための簡単な方法を提供することである。

　“ 該アルギニン残基の埋入により、発現された蛋白質の正
味の電荷はより正となり、宿主細胞の溶解後、オリゴ−
アルギニン連鎖蛋白質は、ＳＰセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）　Ｃ−２５カラムクロマトグラフイーによ
って単離される。オリゴアルギニン基のため、このＥＢ
Ｖ特異的蛋白質は、高ＮａＣｌ！濃度に於て溶出される
。この溶出液を、次に、カルボキシ末端リジンおよびア
ルギニン残基を分解するカルボキシペプチダーゼＢで処
理する。最後にもう１つのＳＰセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）　Ｃ−２５クロマトグラフイーを行い、Ｅ
ＢＶ関連蛋白質を低食塩濃度で溶出する（図１６、参照
）。しかし、この方法が媒質中へ分泌される蛋白質の精
製にも使用できることは明らかである。

イオン交換カラムまたは発現された蛋白質に対する特異
抗体で負荷されたカラム上でのモレキュラーシープ処理
または親和性クロマトグラフィーのような他の確立され
た蛋白質精製法が付加的なまたは別個の精製法として使
用できるものも明らかである。本質的に天然産蛋白質ま
たはその部分のアミノ酸配列を含む非融合蛋白質の生産
のためには、本発明の組換えプラスミドを修飾すること
ができる。発現ベクターの細菌蛋白質をコードする領域
とＥＢＶ関連蛋白質をコードする領域との間にオリゴヌ
クレオチドリンカーを挿入する場合、オリゴヌクレオチ
ドに対応するアミノ酸配列が発現された融合蛋白質の一
部分となる。この融合蛋白質は、それを発現する形質転
換体から単離した後、導入されたアミノ酸リンカ−中の
アミノ酸゛配副時異的プロテアーゼにより、あるいはア
ミノ酸リンカ−が酸開裂に対して敏感なペプチド結合を
含む場合には、酸例えば蟻酸による処理によって開裂さ
れる。

本発明のもう１つの目的は、特異的ウィルス抗原ｇｐ２
５０およびｇｐ３５０の少なくとも一部分をコードする
ＥＢＶのゲノム領域のクローニングである。これはＮｐ
ＢＲ３２２ＢａｍＬ　（Ｊ、スケア（Ｊ、５ｋａｒｅ）
ら、下拙〕中に含まれる細胞株Ｂ　９５−８　（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ　１６１２）　　（Ｒ，ハエル（Ｒ，Ｂａｅｒ
）ら、下掲〕からのＥＢＶゲノムをプラスミドｐＵＣ８
　（Ｊ、メッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、下掲〕
へ接合することによって達成される。得られた組換えプ
ラスミドをｐ［ＩｃＬＰｌ、９　（図１９参照）と称す
。

細菌による融合蛋白質の生産のために、ＥＢＶＢ９５−
８のｇｐ２５０およびｇｐ３５０の一部分をコードする
ゲノムザブ断片を、酵素β−ガラクトシダーゼをコード
する！ａｃＺ遺伝子の領域を担持するベクターｐＵＲ２
９０（Ｕ、　　リュター（Ｕ、　Ｒｊｉ　ｔｈｅｒ　）
ら、下拙〕中へクローニングした（潤」、図２０参照）
。それぞれの発現産物は、免疫学的方法で精製されかつ
同定された。

本発明のさらにもう１つの目的は、ｇｐ２５０およびｇ
ｐ３ｓｏの抗原決定基蛋白質ザブ領域のみを含有する融
合蛋白質または非融合蛋白質を提供することである。こ
の目的のため、蛋白質の抗原決定基を、ディジクルエキ
ノブメントＶＡＸ　　１１／　７５０　（Ｄｉｇｉｔａ
ｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔν八Ｘ　１１／７５０へコンピ
ューター用に本発明者らが開発したコンピユークープロ
グラムを用いるコンピューター指示分析によって位置決
定した。

それぞれのＤＮＡ断片を、次にＮｐＵＲ（ｐ−ガラクト
シダーゼ）のような通常の発現ベクター中にクローニン
グする（Ｕ、　　リュター（Ｕ、Ｒｕｔｈｅｒ）ら、下
掲〕。得られたプラスミドは、例えばｐＵＲＬＥＰ６０
０およびｐＨＲＬＸＰ３９０である（図２７参照）。

さらに、ｇｐ２５０／３５０のＮ末端抗原決定基を、ｐ
ＵＣヘクヘラ（ｐＬＩＲＬＥＰ６００　、図２７参照）
中に融合蛋白質として発現させた。ｇｐ２５０およびｇ
ｐ３５０のＮ末端抗原決定基をコードするＤＮＡ断片を
上記発現ベクターｐＵＣＡＲＧ６０１中へクローニング
することによって、もう１つの融合蛋白質が提供される
。

本発明のもう１つの目的は、該コンピューター分析で位
置決定されたｇｐ’ｚｓｏおよびｇｐ３５０の数個の抗
原決定基を含む多抗原の発現である。この目的のため、
対応するＤＮＡ断片を連鎖させかつ適当なベクター中に
導入する。発現産物は、融合または非融合ＥＢＶ特異性
多抗原である。

本発明の最終の目的は、臨床診断または科学的研究に有
用な診断用組成物（キット）の製造のための、該ＥＢＶ
関連蛋白質またはそのサブ領域または適当ならばＥＢＶ
関連ＤＮＡ断片またはクローンの利用である。これらの
試験は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ〔酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍ
ｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓ
ａｙ）　）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ（Ｒａ
ｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）　）または間接的
赤血球凝集試験のような原理に基づいている。さらに、
ＥＢＶ関連蛋白質は、例えばワクチン接種プログラムの
監視、疫学的問題の分析、患者の治療、ならびに噴核症
、ハーキソト（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫、鼻咽頭
癌のようなＥＢＶ関連疾患の予防および治療のためのワ
クチンの製造のために用いることができる。ワクチンは
、通常の方法に従って製造される。随意に水酸化アルミ
ニウムのような通常のアジュバントと共に、単位供与量
をバイアルに入れる。別法では、産物をリボゾームとの
凝集体の形で投与することができる。患者は、抗体産生
を刺激するのに十分な用量でワクチンを接種されかつ１
か月後および６か月後に再接種される。

最後に、本発明の蛋白質は、ＮＰＣまたは慢性伝染性工
ｉｔ核症またはＥＢＶ関連ハーキソト（Ｂｕｒｋｉｔｔ
’ｓ）リンパ腫のような疾患にかかっている患者の免疫
応答を変調することができるので、ＥＢＶ関連疾患の予
防および治療に有用である。

発明を＼施するための最良の方式 ＮＰＣの診断に適した抗原の同定 診断上重要なＥＢＶ関連抗原のための所望なりＮΔ配号
コード（ｃｏｄｉｎｇ）を得るため、下記の戦略を開発
した。

正常な成人、新しい伝染性単核症または鼻咽頭癌患者の
種々の血清によるエプスタイン−パル（［１ｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス蛋白質の免疫沈降を用いて、特
別な疾患の免疫状態および特徴の診断に適切な抗原を同
定した（図１）。これらの抗原は。

ハイブリッド選択翻訳によりエプスタイン−パル（Ｅｐ
ｓ　ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルスゲノム上に位置決定
された。配列データを用いて、これらの遺伝子をＥＢＶ
−ＤＮＡからサブクローニングし、真核生物および原核
生物細胞中で発現させた。

免疫沈降により、ＥＡおよびＶＣＡが単一の抗原ではな
く、数種のポリペプチドからなる抗原の群であることが
わかったＣＧ、Ｊ、ベイリス、Ｈ，ウルツ（Ｇ、Ｊ、Ｂ
ａｙｌｉｓｓ、　Ｈ，Ｗｏｌｆ）、′エプスタインーパ
ルウィルスの調節された発現。■、溶解サすクル中ＥＢ
Ｖによって特定される蛋白質（Ｔｈｅ　ｒｅｇｎｌａｔ
ｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ、　ｍ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　５ｐ
ｅｃｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＥＢＶ　ｄｕｒｉｎｇｔｈｅ　
１ｙｔｉｃ　ｃｙｃｌｅ）”、　Ｊ、Ｇｅｎ、ν１ｒｏ
１．５６．　ｐ、１０５（２９８１））　　。

免疫沈降のために、ＥＢＶ産住性、ＭＡ陽性細胞系Ｐ３
ＨＲ１，ＥＢＶ陽性、非産生性ラジ（Ｒａｊｉ）細胞系
、ＥＢＶ陰性細胞系ＢＪＡＢを用いた。細胞が、約１０
’／ｍｊ！の密度に達したとき、等容量の新鮮な媒質で
希釈した。ＥＢＶ抗原の誘発のため、Ｐ３ＨＲ１培養細
胞を、継代培養後直ちに、４０ｎｇ／ｍｆのポルポル−
１２−ミストレート−１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏ
ｌ−１２−ｍｙ−ｓＬｒａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ
）　（ツルハウゼン（ｚｕｒ　Ｈａｕｚｅｎ）ら（Ｈ，
ツルハウゼン、Ｆ、　　Ｊ、オネイル、Ｕ。

Ｋ、フリーズ、Ｅヘフカ−（Ｈ，Ｚｕｒ　１ｌａｕｚｅ
ｎ、　Ｆ、Ｊ。

０’Ｎｅ１１１．　Ｕ、に、Ｆｒｅｅｓｅ＋　Ｅ、Ｈｅ
ｃｋｅｒ）　”腫瘍プロモーターＴＰＡによって誘発さ
れる永続性腫瘍原性ヘルペスウィルス（Ｐｅｒｓｉｓｔ
ｉｎｇ　ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ
　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏ
ｍｏＬｏｒ　ＴＰＡ）　”ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ
）　２７２．　ｐ３７３　（１９７８月〕と３ｍＭの酪
酸とで処理した。蛋白質を標識するため、細胞を、低速
遠心分離機で集め、５０〜１００μＣｉ／ｍｆの３ＳＳ
−メチニオンを含む無メチニオンＭＥＭ培地中に２×１
０ｂ細胞／　ｍ　１の密度に再懸濁した。この細胞を、
３７℃１５％ＣＯｔで４時間インキエベートし、次に、
冷ハンクス燐酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗い、冷
ＩＰ緩衝液（１％トライトン−Ｘ−１００，０，１％Ｓ
ＤＳ　。

０．１３７Ｍ　　ＮａＣｊ２；１ｍＭ　　ＣａＣｆｚ　
　；１ｍＭ　　ＭｇＣｌ１ｔ　；　１０％グリセリン；
２０ｍＭトリフ１．−Ｈ（１！　　ｐｉ（９，０；０．
０１％”　ａＮ３　　；　１μｇ／ｍｌ弗化フェニルメ
チルスルホニル）中に、５Ｘｂ に、細胞を、ソニケーションで破壊し、氷上で６０分間
インキュベートした。抽出物を、１００．０００　ｘｇ
で、４℃に於て３０分間遠心分離して清澄にした。

３ＳＳ−メチオニン標識抽出物は、記１１（Ｇ、Ｊ。

ベイリス（Ｇ、Ｊ、［１ａｙｌｉｓｓ）ら、上掲〕のよ
うに正確に免疫沈降した。結果は図１に示しである。

ｐ１３８Ｎｐ１０５Ｎｐ９０．ｐ８０に対する抗体は、
ＮＰＣ血清のおのおのの中に、また他のＥＢＶ惑染特異
的血清の一部の中にのみ存在する。

同様にしてＮｐ５４　〔上掲のＧ、Ｊ、ベイリス（Ｇ、
Ｊ、Ｂａｙｌｉｓｓ）らの１）５８と同じ〕に対する抗
体は、新しいＥＢＶ感染（伝染性単核症）に対して、回
復期状態に比べて有意である。ｐ１５０、ｐ１４３Ｎｐ
１１０に対する抗体は、健康な個体の回復期血清中にも
存在し、免疫のための、または新しいＥＢＶ感染に対す
る１ｇＭ特異性試験に関連して、あるいはＥＢＶ関連腫
瘍（ＮＰＣ’とＢＬ）に対するＩｇＡ特異性試験と関連
して、マーカーとして役立つことができる。

次の工程は、ＥＢＶゲノム上に抗原を位・置決定するこ
とであった。従って、上記ＥＢＶ産生性細胞を、誘発の
２日後、４Ｍイソチオシアン酸グアニジンと０．５　Ｍ
　２−メルカプトエタノールとで溶解することによって
ＲＮＡを調製した（Ｊ、Ｍ。

チャーゲイン、Ａ、Ｅ、プルジビラ、Ｒ，Ｊ、マクドナ
ルド、Ｗ、Ｊ、ラック−（Ｊ、Ｍ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ＋
八、Ｅ、Ｐｒｚｙｂｙｌａ、　Ｒ，Ｊ、ＭａｃＤｏｎａ
ｌｄ、　Ｗｊ、Ｒｕｔｔｅｒ　）　。

“リボヌクレアーゼに富む源からの生物学的活性リボ核
酸の単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌａｃｔｉｖｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉ
ｄ　ｆｒｏｍ　ｓｏｕｒｃｅｓｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ
　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）　　”　、　バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８．　ｐ、
５２９４　（１９７９）　）　、溶解産物を、２０．　
ＯＯＯｒｐｍで１時間遠心分離しく５Ｗ４１、ベックマ
ン）、２ｍｌのＣｓ　Ｃｌ　％密度１．８ｇ／ｃＩ１１
の上に上澄液を重層した。

１５０．０００ｇで１７時間遠心分離後、ＲＮＡペレッ
トをクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。

１００μｇの全細胞ＲＮＡを、６５％のホルムアルデヒ
ドと０．４Ｍ　　Ｎａ（１！との中で、５２℃に於て２
．５時間、１６μｇのクローン化ＥＢＶ−ＤＮＡにハイ
ブリッドさせ、ソニケーションシ、変性し、小さいニト
ロセルロースフィルター上にスポットした。結合したｍ
ＲＮＡを、フィルターを９０秒間水中で沸騰させること
によって溶出した。このＲＮＡを、試験管内で、ｍＲＮ
Ａ依存性ウサギ網状赤血球溶解産物で翻訳した。翻訳産
物を、前述したようにＣＧ、Ｊ、ベイリス、Ｇ、デビー
、Ｈ，ウルツ（Ｇ、Ｊ、Ｂａｙｌｉｓｓ、　Ｇ、Ｄｅｂ
ｙ。

Ｈ，Ｗｏｌｆ）　、　　“ＥＢＶ誘発抗原の分析のため
の免疫沈降阻止検定（Ａｎ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐ
ｉｔａｔｉｏｎ　ｂｌｏｃｋｉｎｇａｓｓａｙ　　ｆｏ
ｒ　　ｔｈｅ　　ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｅ［ｌ
Ｖ　　ｉｎｄｕｃｅｄａｎｔｉｇｅｎｓ）’、Ｊ、Ｖｉ
ｒｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　７．ｐ、２２２（１９８３）
）未標識ＥＢＶ−陰性ＢＪＡ−Ｂ細胞からの蛋白質抽出
物でプレイシキュベーションした後、１検定につきヒ１
−ＮＰＣ血清プール５μ２を用いて免疫沈降させた。免
疫複合体を、蛋白質Ａ−セファロース上に結合させ、洗
浄し、ビードを電気泳動試料緩衝液中で沸騰させること
によって溶出し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に
負荷した。

この方法で、Ｅ’ＢＶ　　Ｂ９５−８ゲノムに対して、
多数のウィルス蛋白質をマツピングすることができた（
図２）。ｐ１３８の位置決定は、図２に示しである。配
列データ（Ｒ，バレル、Ａ、Ｔ、バンキアー、Ｍ、Ｄ、
ビギン、Ｐ、Ｌ、デイニンガー、Ｐ、Ｊ、ファウエル、
Ｔ、Ｊ、ギブマン、Ｇ、ハトフル、Ｇ、Ｓ、ハドソン、
Ｓ、Ｃ，サソチウエル、Ｃ，セギン、Ｐ、Ｓ、Ｉ−ラフ
エル、Ｂ、バレル（Ｒ，Ｂａｅｒ、八、Ｔ、Ｂａｎｋｉ
ｅｒ、　Ｍ、Ｄ、Ｂｉｇｇｉｎ＋Ｐ、ｌ７．Ｄｅｉｎｉ
ｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、Ｆａｗｅｌｌ、　Ｔ、Ｊ、Ｇｉｂ
ｓｏｎ。

Ｇ、１ｌａｔｆｕｌｌ、　Ｇ、Ｓ、ｌ１ｕｄｓｏｎ＋　
Ｓ、Ｃ，Ｓａｔｃｈｗｅｌｌ。

Ｃ，Ｓｅｇｕｉｎ、　　Ｐ、Ｓ、Ｔｕｆｆｕｅｌ、　　
Ｂ、Ｂａｒｒｅｌｌ、　　”　Ｂ　９５−８エプスタイ
ン−パルウィルスゲノムのＤＮＡ配列および発現（ＤＮ
Ａ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　ｏｆＩＪｅ　８９５−８　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ）″、ネーチ＋　−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　３１０．Ｎｐ、２０７　（１９８４）　）
を用いて、ｐ１３８およびｐ５４のための適当なオープ
ン読取取り枠を確認した（図２）。これらのオープン読
取り枠は、ウィルスゲノムの右端のＢａｍＡ断片の右部
に完全に含まれる。

Ｒ，バレル（Ｒ，Ｂａｅｒ）ら（上掲）の配列データに
よるとＮｐ１３８をコードするために適した大きいオー
プン読取り枠がＥＢＶ　　Ｂ９５−８のＢａｍＡフラグ
メントに含まれている。ｐ１３８の遺伝子のヌクレオチ
ド配列、対応するアミノ酸配列とそれぞれの調節素子は
、図３に示しである。

プラスミドｐＢＲ３２２−ＢａｍＡ　ＣＪ、スケア（Ｊ
、５ｋａｒｅ）ら、上掲〕のＤＮＡ５０μｇを、１５０
ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ　％　６ｍＭメルカプトエタノール
、６ｍＭ）リス−Ｈｅｌｐ１１７．９を含む全容１５０
μ！中で、３７℃に於て２時間、５０ＵＸｈｏｌ（ベー
リンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）で消化した。停
止緩衝液（１０ｍＭｌ−リス−ＨＣ１，５０ｍＭＥＤＴ
Ａ、６０％蔗糖、１％ブロムフェノールブルーＮｐｌ＋
７．５　）　　３０μｌを添加し、混合物を、酢酸塩緩
衝液（０，０４Ｍ１−リス−酢酸塩、２ｍＭＥＤＴＡＸ
ｐＨ７，６）中の分取用１％アガロースゲル上に置き、
４℃に於て、４０Ｖで１６時間電気泳動を行った。サイ
ズマーカーとして、ＨｉｎｄｌＩＩ消化λ−ファージＤ
ＮＡ　（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）を
用いた。ｌ・リス−酢酸緩衝液中のゲルをエチジウムプ
ロミド（０，５μｇ／ｍｌ＞で、室温（ＲＴ）に於て１
時間染色後、ＵＶ照明によってＤＮＡを可視化し、３．
０ｋｂおよび３．３ｋｂに対応するバンドを切り取った
（３．ＯｋｂのＸｈｏｌで生成された断片は所望の断片
であり、３．３ｋｂのＸｈｏｌで生成された断片は部分
消化産物である（１つのＸｈｏｌ制限部位が切断されて
いない）〕。

アガロース片を透析袋内に入れ、３容のトリス−酢酸緩
衝液を添加して各バンドのＤＮＡを溶出し、４時間（１
００Ｖ、４℃）電気泳動を行った。

エルティップＤ　（Ｅｌｕｔｉｐ　Ｄ）カラム〔シュラ
イヒエルアンドシェル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５
ｃｈｕｅｌｌ）　）で、メーカーが推奨する方法に従っ
てクロマトグラフィーを行い、含まれているエチジウム
プロミドをイソアミルアルコールで抽出し、２．５容の
エタノールを加え、１晩中−２０℃でインキュベートし
て沈殿させることによってさらに精製した。このＤＮＡ
を、ソーパルＳ　Ｓ　３４　（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＳＳ　
３４）ローター中で遠心分離（１７，００Ｏｒｐｍ　、
２０分）することによって集め、７０％エタノールで洗
浄し、凍結乾燥後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡＮｐＨ７，５）１５μ
ｌに溶解した。

単離された２つの断片のＤ　Ｎ　Ａ　ｔｆ４度を、おの
おの１，１７１を１１００ｎおよび１ｇｇのｐＵＣ８Ｄ
ＮＡと並列で電気泳動することによって概算した。

ベクターｐ［Ｉｃ８　　（ドイツチェサムルングフヱー
ルミクロオルガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍａ
＋ｌｕｎｇｆａｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）
（ＤＳＭ）、ゲソチンゲン、西独に寄託、受入れ番号Ｄ
ＳＭ、３４２０）　　（Ｊ、メッシング、Ｊ、ビエイラ
、“２重消化制限断片の（ｏｆ　ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｇ
ｅｓｔ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
）　　″ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９．　Ｉ）、２６９　
（１９８２））の５ａｌＩ［で消化したＤＮＡを前述の
ようにして調製した。但し、次のりガーゼ反応中、ベク
ターの再連結を抑制するため、ＤＮＡをアルカリホフフ
ァターゼ（０，５単位（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　、３
７℃で３０分〕で処理した。

以下に於て、２種の精製断片のおのおのを開裂ベクター
中へ挿入した（ＳａｉｌおよびＸｈｏｌは同じ付着末端
すなわち−ＴＧＣＡ−を生ずる）。この目的のため、各
断片に対して、ＩＵ　　Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ〔ベーリ
ンガー（ＢｏｅｈｒｉｎＨｅｒ）　）を含むリガーゼ緩
衝液（１０ｍＭ）リス、１０ｍＭＭｇ　Ｃｍ！ｚ　、６
ｍＭメルカプトエタノール、０．６ｍＭ　　ＡＴ　Ｐ、
　ｐＨ７，５）全容２０μｊ２中、３００ｎｇのＤＮＡ
断片と１１００ｎのｐＵＣ８ＤＮＡとで連結反応を行っ
た。１４℃に於て２０時間後、８０μ１ＯＴＥｉ街液と
２００μｌのコンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　
Ｊ　Ｍ　８３細胞（ＡＴＣＣ３５６０７）（Ｊ、ビエイ
ラ、Ｊ、メッシング（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ。

Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　”合成万能プライマーによる挿
入突然変異および配列化のためのｐＵＣプラスミド、Ｍ
１３ｍｐ７誘導系（Ｔｈｅ　ｐＵＣ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ
、　ａｎ　Ｍ　１３ｍｐ　？−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｙｓ
ｔｅｍ　ｆｏｒ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　５
ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ
ｓ）”。

ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９．　ｐ、２５９　（１９８２
））とを添加した。

塩化カルシウム法（Ｍ、マンデル、Ａ、ヒガ（Ｍ。

Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ、Ｈｉｇａ）　、”カルシウム依存
性バタテリオファージＤＮＡ感染（Ｃａｌｃｉｕｍ　ｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔｂａｃｔｅｒｏｐｈａｇｅ　ＤＮＡ　
１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）　　”、　Ｊ、Ｍｏ１．５３゜ｐ
１５４　（１９７０）　）に従って形質転換を行った。

次に、この細胞を、１．５　ｍｌのし一プロス（５ｇ酵
母エキス、Ｌｏｇ）リブトン、５ｇ　　ＮａＣＪＩ）と
混合し、３７℃に於て１．５時間インキュベートし、最
後に、５０μｇ　／　ｍ　Ｉ！のアンピシリン（シグマ
（Ｓｉｇｍａ））と４０μｇ／ｍｆのＸ　−ｇａｌ　　
（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）とを補足
したし一プロス寒天平板上で平板培養した。この培養中
、再連結ｐＵＣ　ｓ分子を担持する細菌は青色コロニー
を生じ、組換えプラスミドを担持する細菌は白色コロニ
ーを生じた。

所望の組換えプラスミドを担持するコロニーの同定のた
め、１２個の白色コロニーを取り、Ｌ−ブロス中で３７
℃に於て１晩中増殖させた。ＨｏＣ，バーンポイムとＪ
、ドーリ−（１１，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ　Ｊ、
Ｄｏｌｙ）　　（”組換えプラスミドＤＮＡのスクリー
ニングのための迅速なアルカリ抽出法（Ａ　ｒａｐｉｄ
　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅ　ｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ）、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．　ｐ、１５１３（１９７９
））によるＤＮＡ製剤の試料をＢａｍＨＩおよび旧ｎｄ
Ｉ［［で消化し、前述のようにアガロースゲル上で電気
泳動を行った。さらに組入れられた断片の配向を示すた
め、Ｂａｍ１ｌｌおよびＢｇｌＩＩで消化を行い、最後
に、３．３ｋｂをＸｈｏｌ消化によって試験した。

プラスミドｐＵＣ６３５は、Ｂａｏ＋Ａ断片（ｐＢＲ３
２２ＢａｍＡ）の３．０　ｋｂＸｈｏ　Ｉサブ断片を、
適正な配向および１ａｃＵＶ５プロモーターに対する適
正な読取り枠内で担持しかつほとんど全ｐ１３８　（図
４）の発現のために用いられる。ｐ［ＪＣ６，ｊ５でコ
ードされた融合蛋白質は、β−ガラクトシダーゼアミノ
末端の１２個のアミノ酸とｐ１３８の約１０２０個のア
ミノ酸とβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端部分の
６０個のアミノ酸とｐＢＲ３２２でコードされた領域の
もう２９個のアミノ酸とからなる。

プラスミドρＵＣ６１３０は、反対の配向の３．３　ｋ
ｂの断片を担持する（図４）。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
Ｋ１２ＪＭ８３株は、β−ガラクトシダーゼリプレッサ
ー過剰生産株でないので、融合蛋白質は構成的に発現さ
れる。従って、プラスミドｐＵＣ６３５を、β−ガラク
トシダーゼリプレッサー過剰生産株大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）　Ｋ　１２　ＢＭＨ７１−１８（ＤＳＭ３４１３）
　　（Ｕ、　　リュター、Ｂ、ミュラー・ヒル（Ｕ、Ｒ
ｕｔｈｅｒ、　Ｂ、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ）、　　”
　ｃＤＮＡクローンの容易な同定（Ｅａｓｙ　１ｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｃＤＮＡ　　ｃｌｏｎｅｓ
）”、　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　　１０．ｐ、１７
９１（１９８３）　　）中へ導入した。大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｍ　Ｂ　Ｈ７１＝１８株の代わり
に、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　ｌ　２ＪＭ１０９　
　（ＤＳＭ３４２３）も使用することができる（実験方
法の木質的変化なしに）。

ｐＵＣ６３５以外に、他の３種のプラスミド、ｐＵＣ９
ｇ　４ＮｐＭＦ９２４ＮｐＫＫ３７８（図６−図８）が
構築された。

ｐＫＫ３７８の挿入物は同じＸｈｏ１部位から始まり、
停止コドンの第３Ｘｈｏ１部位がある２５０ｂｐ　３’
まで続く。この３．３ｋｂの断片は、不完全な消化によ
って生成され、ｔａｃ−プロモーターとｐＫＫ２４０−
１１ＣＦ、アマン（Ｆ、Ａｎ＋ａｎｎ）ら、上掲〕の開
始コドンとの背後に挿入された。発現産物は僅か２種の
細菌アミノ酸を含み、そのサイズは、細菌ｊ！ａｃＺ部
分が無くなっているのでｐＵＣ６３５の発現産物のサイ
ズより小さい。

ｐＵＣ９２４は、ＢｇｌｌＩ部位から第３Ｘｈｏ１部位
までの断片を含む。ｐＵＣ９　（ＤＳＭ３４２１）はベ
クターとして用いられた。この挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）
のサイズはｐＬｌｃ６３５中のものよりも小さいので、
またｐ１３８からの停止コドンを用いるので、発現産物
の分子量はｐＵＣ６３５およびｐＫＫ３７８に於けるよ
りも小さいと期待される。

プラスミドｐＭＦ９２４はＮｐＥＡ３０５　（Ｅ、アマ
ン（Ｅ、Ａ＋ｙ＋ａｎｎ）ら、上掲〕とＮｐＵＣ９２４
と同じＢｇｌ　Ｕ　−Ｘｈｏ　Ｔ断片とから構築された
。ｐＮＦｌは、後に０１リプレツサーのＮ末端部分が続
＜　ｔａｃ−プロモーターを有し、得られる融合蛋白質
はｐＵＣ９２４に於けるよりも１７ｋｄ大きいと期待さ
れる。

これらの構築物は、ｔａｃ−および１ａｃ−プロモータ
ーをＩＰＴＧで誘導しかつ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で蛋白質
を分離することによって、ＥＢＶ関連抗原の産生につい
て試験された。領域内のクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓ
　ｉｅ）ブルー染色ゲル上に、新しいバンドは全く見ら
れないか、または弱いバンドしか見られなかった。しか
し蛋白質をニトロセルロース上へ移行し、高力価ＮＰＣ
−ブール血清とペルオキシダーゼ接合第２抗ＩｇＧ抗体
とで免疫染色した後、すべての構築物に於て新しいＥＢ
Ｖ特異的バンドが明らかに検出された（図４）。

発現された蛋白は、すべて、はとんど所期のサイズを示
すが、収量は広範囲にわたっていた。

ｐＵＣ６３５およびｐＭＦ９２４でコードされる蛋白質
はＮｐＵｃ９２４およびｐＫＫ３７８からの非融合蛋白
質よりも安定に発現できるように思われる。

しかしＮｐＵＣ６３５からの最高の発現蛋白質でも、そ
の収量は、真核生物蛋白質の大きいサイズのためのもの
であるかも知れないがクーマツシー染色ゲル（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ−５ｔａｉｎｅｄ　ｇｅｔ）に於て極めて弱
いバンドしか見られなかったので大規模生産にとっては
低過ぎる。

実施例３ プラスミドｐＵＣ６３５ＮｐＵｃ９２４ＮｐＭＦ９２４
、ｐＵＫ３７８で形質転換された宿主細胞を、５０μｇ
／　ｍ　ｌのアンピシリンで補足されたし一ブロス中で
、細胞密度ＯＤ＆。。＝０．８に培養した。次に、β−
ガラクトシダーゼの誘導のため、乳糖アナロゴン（ａｎ
ａｌｏｇｏｎ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド〔ｒｐ’ｒｃ：シグマ（Ｓｉｇｍａ）’）を添
加した（最終濃度：１ｍＭ）。３７℃に於て１．５時間
、さらにインキュベーション後、培養細胞を遠心分離し
た。この細胞を、２００μｌの沸騰混合物（２％ＳＤＳ
、５％メルカプトエタノール、３％蔗糖、５０ｍＭ）リ
ス−ＨＣ１ｐ１７．０）中に再懸濁し、１００℃で１０
分間加熱した。得られた蛋白質抽出物２０μｌを１２．
５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、最後に、クー
マツシーブルー染色で可視化したが、発現産物の収量が
非常に低いので、免疫染色が必要であった。そこで、電
気泳動で分離した蛋白質をニトロセルロースフィルター
へ移行した。すなわち“ウェスタン・プロット（Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）　　”を調製した（Ｊ。

レナート、Ｊ、ライザー、Ｇ、Ｒ，シャーク（Ｊ、Ｒｅ
ｎａｒｔ、　Ｊ、Ｒｅ１ｓｅｒ、　Ｇ−Ｒ，５ｈａｒｋ
、　”ゲルからジアゾベンジル−メチル−ペーパーへの
蛋白質の移行および抗血清による検出（Ｔｒａｎｓｔｅ
ｒ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｇｅｌｓ　ｔｏ
　ｄｉａｚｏｂｅｎｚｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐａｐｅｒ
　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｓ
ｅｒａ）”、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６、　ｐ
、３１１６　（１９７９）；獣医学に於ける潜在的ヘル
ペス感染（Ｌａｔｅｎｔ　ｌ１ｅｒｐｅｓＩｎｆｅｃｔ
ｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）、マーチヌスニジノフ（Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１
ｊｎｏｆｆ）　Ｐｕｂｌ、、　ｐ１０５（１９８４）中
のＳ、モトロー、Ｈ，ウルツ（Ｓ、Ｍｏｄｒｏｗ。

１１、Ｗｏｌｆ）　、“ヘルペスウィルスサイミリおよ
びヘルペスウイルスアテレスで誘発された蛋白質のキャ
ラクタリゼーション（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｔｏ
ｎ　ｏｆｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ　ａ
ｎｄ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ａｔｅｌｅｓｉｎｄｕ
ｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　　〕。

ウェスタン−プロット緩衝液（７２ｇグリシン、１５ｇ
トリス、１１メタノール、蒸留水で５１にする）中、電
流強度０．８Ａで３時間、ウェスタン・プロットを調製
した。次に、ニトロセルロースを、クーエン（Ｃｏｈｅ
ｎ）緩衝液〔０，１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）　　
４００．１％ポリビニルピロリドン、１．６％ＢＳＡ、
０．１％ＮＰ４０，０．０５％ゼラチン、０．１７Ｍ　
　Ｈ，ＢＯ：＋　、２８ｍＭ　　ＮａＯＨ。

１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，６ｍＭ　　ＮａＮ：＋、ｐＨ
８，２）で３時間飽和し、ＮＰＣ患者からの１：５０希
釈高力価ＥＢＶ特異的血清と共に１晩中インキニベート
した。血清は、細菌蛋白質から生ずるバックグラウンド
を少なくするため、細菌蛋白質抽出液（１ｍｌ／１０９
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞〕に予め吸収させておいた
。次に、ニトロセルロースフィルターをゼラチン緩衝液
（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１５
０ｍＭ　　ＮａＣ１゜０．２５％ゼラチン、０．５％ト
ライトン、０．２％ＳＤＳＮｐＨ７，５）中で５時間洗
浄することによって未結合ＩｇＧを除去した。吸収され
たＥＢＶ−特異性蛋白質を可視化するため、ベルオキダ
ーゼにカップリングさせかつＴＮ緩衝液（１５４ｍＭＮ
ａＣ１，１０ｍＭトリスＮｐｆ１７．４）で１：２００
に希釈したウサギ抗ヒＩ−ｒｇＧ抗体を添加した。

室温で２時間後、未結合のウサギ抗体を、前述のように
ゼラチン緩衝液で洗浄することによって除去した。最後
に、１００ｍ１ｔの５ｍＭ）リス−ＨＣβＮｐＨ７，５
中で、５０ｍｇのジアミノベンジジン〔シグマＳｉｇｍ
ａ）と４０μｊ２のＨｏｏｔとを加え、室温で１０分間
インキュベートすることによって、ペンオキシダーゼ反
応を行った。この実験の結果は図５に示しである。

クローン大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｊ　Ｍ　
１０９ｐｕｃ６３５を、上述のアンピシリンで補足した
し一ブロス５００ｍ＃中で、３７℃に於て、０Ｄｓｂ。

が０．８になるまで増殖させた。融合蛋白質合成を、Ｉ
ＰＴＧ　（１ｍＭ）で誘導し、さらに２時間インキュベ
ーションを続行した後、ＧＳＡローター〔ソーパル（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）　）中で、５０００ｒｐｒａで１０分間
遠心分離して細胞を集め、この細胞を、５０ｍ７！の２
０ｍＭトリス−ＨＣ１ｐＨ７，５に再懸・濁した。細胞
を溶解するため、ＥＤＴＡ　（最終濃度５０ｍＭ）とリ
ゾチーム（最終濃度２ｍｇ／ｍｊりとを添加し、この混
合物を、３７℃に於て３０分間インキュベートした。次
に、細胞を、８分間、２回ソニケーション〔ラブソニッ
ク１５０（Ｌａｂｓｏｎｉｃ　１５０　）　、ブラウン
（Ｂｒａｕｎ））　シ、トライトンＸ−１００を最終濃
度３％になるように添加し、３７℃に於てさらに３０分
間インキユベートシた後、１０．　ＯＯＯｒｐｍで２０
分間遠心分離（ＳＳ３４０−ター（ソーパル（Ｓｏｒｖ
ａｌｌ））　）することによって、懸濁液中の不溶粒子
をベレット化した。得られたペレットを、８Ｍ尿素、１
０ｍＭトリス−ＨＣＮ、０．５％β−メルカプトエタノ
ールＮｐＨ７，５の溶液２０ｍ７！に溶解し、前のよう
に再度遠心分離した。

最後に、８０ｍｇの蛋白質を、緩衝液（８Ｍ尿素、１０
ｍＭトリス、０．１％β−メルカプトエタノールＮｐＨ
７，５）でカラムクロマトグラフィー〔セファＣ）−ス
２β−Ｃ１（ファーマシア（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ）　
）、長さ８０ｃｎａ、直径３ｃｍ）にかけた。捕集した
４ｍ！！ずつの試料のおのおのの３０μｌを、１５％Ｐ
ＡＧＥで分析し、融合蛋白質含有分画をプールした。

原理的に、診断用試験に於ては、抗原蛋白質の抗原決定
基サブ領域だけが必要である。従って、ｐ１３８アミノ
酸配列をコンピュータープログラムで解析し、同定され
たこの遺伝子のサブ領域を適当なベクター中に導入した
。かかる小蛋白質の産生は、これら小蛋白質が産物の長
さが減少するにつれて抗原性の急速な変化を受けにくく
なるという利点がある。さらに特別には、クラス特異的
抗体の検定に関して、診断上の価値がある。

Ｐ、チョウとＧ、ファスマン（Ｐ、Ｃｈｏｕ　ａｎｄＧ
、Ｆａｓｍａｎ）の方法〔“蛋白質から計算されるα−
へリカルーβ−シートおよびランダムコイル領域に於け
るアミノ酸の配座パラメーター （Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｐａｒｍｅｔｅｒｓ
　ｆｏｒ　ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ　１ｎ（Ｘ　　ｔｌｅ
ｌｉｃａｌ　　β−５ｈｅｅｔ　ａｎｄ　ｒａｎｄｏｍ
　ｃｏｉｌ　ｒｅｇｉｏｎｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆ
ｒｏｍ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　　”、バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１３．　ｐ、２１１
　（１９７４））によれば、そのアミノ酸配列（１次構
造）によっひき起こされる蛋白質のおよその２次構造の
計算が可能である。示唆された構造に重ねて、プログラ
ムが相対的親水性、疎水性を決定する。両方のデータセ
ントを組合わせて、２次構造のα−ヘリカル、β−シー
ト、β−ターニングおよびランダムコイル領域を示すコ
ンピューターグラフインクが描かれる。それによって親
水性領域および疎水性領域が、それぞれ白丸および黒丸
で示される。

かかるコンピューターグラフィックの１例は、図９にｐ
１３８アミノ酸配列について示しである。

抗原性部位が、蛋白質の表面にある親水性β−ターンに
主として位置するとの仮定に基づくと、ｐ１３８のほぼ
アミノ酸５２０とカルボキシ末端との間の領域が抗原性
であるべきである。対応するＤＮＡ配列はｐＵＣ６３５
のＰｓｔｌ断片によって示される。

かくしてＮｐＵｃ６３５をＰｓｔＩで開裂し、すべての
ＰｓｔＩ断片を単離し、Ｐｓｔｌ開裂ｐｕｃ　８中へ導
入し、付加的な４ｏｏｂｐを有する残りのベクター断片
（ｐ　１３８をコードする配列の第１Ｐｓｔ１部位まで
）を再連結させた（方法はすべて実施例２記載の通り）
。

得られた組換えプラスミドを、それぞれｐＵＣＰ４００
　ＮｐＵｃＰ３８０　ＮｐＵｃＰ６００ＮｐＵｃＰ２１
０　　、ｐＨｃＰ７５０ＮｐＨｃＰ５４０と称した。

ｐ１３８をコードする配列のアミノ末端領域は、プラス
ミドｐＢＲ３２２ＢａｍＡをＰｓｔｌおよびＨｇ１ＡＩ
で消化しかつ該断片をＰｓｔ［開裂ｐＵＣ９中へ挿入す
ることによってクローニングされたＣＪ、メッシング（
Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、下拙〕　（実施例２記載の方
法）。得られた組換えプラスミドｐＵＣｌＩＰと称す。

翻訳が挿入の３゛末端で停止するｐＵＣ）ＩＰは例外で
あるがＮｐＵｃ　８に対するすべてのサブクローン配向
および読取り枠は正しい。

＠後に、この組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）　Ｋ　１２　Ｊ　Ｍ　１０９細胞中へ導入した。

実施例６ 咀 ｐＵＣサブクローン（実施例５）は、短いために適当か
３次構造を構築できず、従って完全な蛋白質よりもプロ
テアーゼによって大きな程度に分解される可能性がある
ため細菌中で安定に発現できないので、本発明者らは、
Ｒｆｊ　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断片サブクローンをＢａｍＨＩ
および旧ｎｄｌｌＩで開裂しかつそれぞれの断片を単離
してそれらをＢａｍＨＩおよび）１ｉｎｄＩ［Ｉで開裂
したｐＵＲ２８８中へ連結させること（方法はすべて実
施例２記載の通り）によって、ｐｌＪＲ２８Ｂ　（ＤＳ
Ｍ３４１５）　　（Ｕ、　リュター（Ｒｕｔｈｅｒ）ら
、下拙〕によってコードされるβ−ガラクトシダーゼの
少なくとも一部分を用いて大融合蛋白質をコードする組
換えプラスミドを構築した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｊ　Ｍ　１０９中
で発現を行った。産物は、実施例３記載のようにして分
析した。ゲルのクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブ
ルー染色後、サイズの異なる数種の大融合蛋白質を検出
したが、ウェスタン・プロットの調製後ＮｐＵＲ６００
およびｐ［ｌＲ５４０によって発現される産物だけが上
記１ｇＧ抗体と特異的反応を示した（図１０）。

これらの結果は、コンピューター解析とよく一致してい
る。

また、実施例５によって得られるクローンの発現を実施
例３記載に従って行った。産物も、実施例３記載のよう
にして分析した。クーマンシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ
）染色ゲルから、プラスミドｐＵＣＰ６００とｐＵＣＰ
３８０だけが安定な融合蛋白質をコードすると考えるこ
とができる。ウェスタン・プロットはＮｐＵｃＰ６００
誘導融合蛋白質だけが抗原性であることを示す（図１１
）、この融合蛋白質は、アミノ末端クローニング部位で
コードされる１１種のアミノ酸とｐ１３８の約６００ｂ
ｐによってコードされる領域とＩａｃＺ遺伝子のカルボ
キシ末端アミノ酸とを含む。かくして、組換え発現プラ
スミドｐＵＲ６００およびｐＵＲ５４０ならびニｐｌＪ
ｃＰ６００は、それぞれがＥＢＶ蛋白質ｐ１３８の抗原
決定基を含む、大融合蛋白質および小融合蛋白質の生産
に使用することができる。

スｌ貧九り 実施例６の実験によってＮｐ１３８で誘導される蛋白質
部分が、プラスミドｐ［ＩｃＰ６００でコードされる蛋
白質以外は不安定であることがわかった。

ｐ１３８のＣ末端からの第２抗原領域（ｐ５４０、図９
参照）は、組換えｐＵＣベクターｐｕｃｐ　５４０を用
いて安定に発現することができない。かかるそれ自体不
安定な発現産物を安定化させるｐ１３８のＰ　６００　
ＳＪｉ域の能力を本実施例で示す。

このためには、該プラスミドを５ｓｔｒおよびＨｉｎｄ
ｌｌｌで消化（Ｓｓｔ１部位は第１ＰｓｔＩ部位から約
ｚｏｂｐ３°のところにある）することによって、ｐＵ
ＣＰ６００の５’　−Ｐｓｔ１部位を除去しなければな
らなかった。このｐ１３８関連Ｓｓｔ　Ｉ　−１１ｉｎ
ｄＩ［断片を５ｓｔＩ／旧ｎｄＩ［Ｉ開裂ｐＵＣ１２　
（ＤＭＳ３４２２）中へ挿入したＲ、クー、Ｌ、グロス
マン、Ｋ１モルトアブ（Ｒ，Ｗｕ、　Ｌ、Ｇｒｏ　Ｂｍ
ａｎｎ　ａｎｄ　Ｋ、Ｍｏ１ｄｏａｖｅ）編著１酵素学
の方法（Ｍｅｉｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）Ｖｏｌ　１０１．　Ｐａｒｔ　Ｃ中のＪ、メッシング
（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）、′クローニング用の新Ｍ１３
ベクター（Ｎｅｗ　Ｍ　１３　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　Ａｃａｄ。

Ｐｒｅｓ、　Ｎｅｗ　’１ａｒｋ、　１９８３．２０−
７８　）。

次に、得られた組換えプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔｌで消化した。得られた６００ｂｐ断片をプラスミ
ドｐｕｃ　Ｂ中へ挿入した。今や、５”−Ｐｓｔ１部位
はＳｓ目部位で置換されており、がくしで、読取り枠は
、挿入物の３゛　−および５゛　−末端の所で再構成さ
れる（図１２ａ）。得られた組換えプラスミドｐｌＪｃ
６０１は、依然として安定な産物を発現する（図１３）
。

ＥＢＶをコードする配列の３゛末端に於けるＰｓｔＩお
よび旧ｎｄＩ［［部の間に、５アルギニンと２個の停止
コドンを枠内にコードする公知の方法で得られた合成オ
リゴペプチドを図１２ｂ）のように挿入した。得られた
プラスミドｐｔｌｃＡＲｃ６０１は、そのＣ末端で５個
のアルギニン残基に融合するｐ１３８のＰ６００領域を
コードする。

最終工程に於てＮｐ１３８のＰ５４０領域をコードする
Ｐｓｔｌ断片を、Ｐｓｔｌによる消化後のｐ１３８のＰ
６００領域をコードするＰｓｔｌ断片へ連結した。得ら
れた組換えプラスミドｐＬＩｃＡＲＧ　１１４．　Ｏは
、枠内に融合されたｐ１３８の２個の抗原部位を含む約
４３ｋｄの安定な蛋白質をコードする。この融合蛋白質
に於て、蛋白質領域Ｐ６００は蛋白質領域Ｐ５４０を安
定化する（図１３）。発現産物のカルボキシ末端に於け
るアルギニン残基は、サツセンフエルドとブリューワー
（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ　ａｎｄ　Ｂｒｅｗｅｒ）　（
下拙）が記載しているように、得られた融合蛋白質の精
製のために用いることができる（図１６）。

実施例８ 組換えプラスミドｐＵＣＡＲＧ　６８０の構築プラスミ
ドｐＵＣＡＲＧ　１１４０か“らＮｐ１３８をコードす
る領域の４３５ｂｐとｐ６００断片のＣ末端部分とｐ５
４０断片のＮ末端部分とが欠けている修飾プラスミド（
ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ）を構築した。

コンピュータープログラムで予想された主な抗原性部位
は依然として存在する。このプラスミドをｐｌＪｃＡＩ
？Ｇ　６８０と称した。このプラスミドの構築は、ｐＵ
ＣＡＲＧ　］、　ｌ　４０をＮｃｏｌで消化することに
よって達成された（開裂部位は図３中のｂｐ１８４１お
よびｂｐ３２４３に相当する）ｌ）６０ＯＮｃｏ！部位
中およびｐ５４ＯＮｃｏ１部位中の読取り枠は合わない
ので、付着末端を８１ヌクレアーゼで除去した。

３０　ｔｔ　ｇのｐＵＣＡＲＧ　１１４０をＮｃｏＴで
消化し、３．３ｋｂベクター−ｐ１３８断片をゲル電気
泳動で分離し、精製した。このＤＮＡ断片５μｇを、３
３ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ　　ＮａＣ１，０，０
３ｍＭ　　Ｚｎ５Ｏａ　ＮｐＨ４，５の１０１Ｌｃｚ６
で、室温に於て１５分間、１００単位Ｓ１ヌクレアーゼ
で消化した。フェノール抽出により消化を停止させ、エ
タノールで沈殿させた後、このＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼで再連結させ、コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）　Ｋ　１２　Ｊ　Ｍ　１０９細胞の形質転換に用い
た。得られたクローンを、サイズ３０ｋｂの新しい蛋白
質（ｐＵＣＡＲＧ　６８０　）の出現のためにスクリー
ニングした。ｐｌｊｃＡＲＧ６８０でコードされる短縮
されたｐ　６００／ｐ　５４０融蛋白質は、依然として
抗原として反応する。新たに構築された組換えプラスミ
ドｐＵＣＡＲＧ　６８０　　（Ｄ　Ｓ　Ｍ３４０８）は
、ＤＳＭ３４０８の寄託番号でＤＳＭに寄託された。

個々のＮＰＣ血清を用いる、組換えプラスミドｐＵＣＡ
ＲＧ　１１４０ＮｐｕｃｓｔｏＮｐｔｌＲ６００（実施
例６および７）でコードされる融合蛋白質とのイムノプ
ロット（ｉｎ＋ｍｕｎｏｂｌｏｔｓ）は、種々の患者で
免疫反応が異なることを示す（図１４）。これに関して
、該プラスミドはｐ　１３８　領域Ｐ５４０＋Ｐ６００
、Ｐｂ２Ｏ、Ｐ２Ｏ３をそれぞれ含む融合蛋白質をコー
ドすることを理解せねばならない。

ＮＰＣ血清隘３５２に於てＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の主
分画はＰ　５４０　ＳＲ域に向けられるが、ＮＰＣ血清
１１ｈ３５４中の主分画はｐ　１３８　（７）Ｐ６００
領域に向けられる。ＮＰＣ患者からの多くの血清から調
製された代表的プールは付加的な抗原性部位を検出しな
かった。この発見からの結論は、本発明の組換えプラス
ミドによってコードされる抗原決定基Ｐ５４０、Ｐ２Ｏ
３が、診断目的に有用なＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験のために所
望な特異性を得るのに必要かつ十分であるということで
ある。

実施例１０ ｐＵＣＡＲＧ　１１４０でコードされる精製融合蛋白質
をミクロ力価平板に塗抹した。個々のＮＰＣ血清を、そ
のＴｇＣについて、また特にそのＩｇＡ反応性について
試験した。これらの血清のＩｇＡ−抗ＥＡ力価は、通常
の免疫螢光性試験で前もって測定した。最高力価は１：
８０であった。図１５に示すＥＬＩＳＡ試験では、２種
のＥＢＶ陰性血清、１種のＮＰＣ血清プール、１０種の
個個のＮＰＣ血清を、１：１０６’４０希釈まで試験し
た。

試験は、通常のＥＬＩＳＡ試験法に従って行った。

結合した抗体は、ペルオキシダーゼで接合したマウス抗
ヒトＩｇＧすなわちＩｇＡとペルオキシダーゼとの反応
で検出した。すべてのＮＰＣ血清が塗抹抗原との反応（
ＩｇＡで１　：　２５６０まで）を示し、陰性対照では
バックグラウンド反応は見られなかった。この結果はＮ
ｐＵｃＡＲＧ　１１４０でコードされる発現産物がＮＰ
Ｃの診断および早期発見に適していることを示している
。

ｇｐ２５０およびｇ９３５０をコードする領域をＥＢＶ
　　Ｂ９５−８ゲノムのＢａｍＬ断片（Ｊ、スケア（Ｊ
、５ｋｅｒｅ）ら、上掲〕にマツピングした。両方のポ
リペプチドが同一領域を共有するので、雨量白質は読取
り枠を重ねることによってコードされると想像されたＣ
Ｍ、ハンメル、Ｄ、ソー９−・ローソン、Ｅ、キーフ（
Ｍ、Ｈｕｍｍｅｌ、　Ｄ、Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏ
ｎ、　Ｅ、Ｋｉｅｆｆ）、′エプスタイン・パルウィル
スＤＮＡ断片は２種の主なエンベロープ糖蛋白質（ｇｐ
３５０／３００とｇｐ２２０／２００）のためのメツセ
ージをコードする（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒ
ｕｓＤＮＡ　　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　　ｅｎｃｏｄｅｓ
　　ｍｅｓｓａｇｅｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｔｗ。

ｍａｊｏｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ　＜ｇｐ３５０／３００　ａｎｄｇｐ２２０／２
００）　）”、　　Ｊ、　　ｏｆ　Ｖｔｒｏｌ、　　４
９．　　ｐ、４１３（１９８４））　。

バエル（Ｂａｅｒ）ら（上掲）の配列データは、ウィル
スゲノムの該ＢａｍＬ断片中のドナースプライス部位と
アクセプタースプライス部位とを含む大きいオーブン読
取り枠を示した（図１７および図１８）。

ｇｐ３５０はこの領域から転写されたスプライシングさ
れないｍＲＮＡの翻訳産物でありかつｇρ２５０は対応
するスプライシングされたｍＲＮＡの産物であると仮定
される（図１７）。両産物共にウィルスカプシド中に見
いだされるので、免疫グロブリンＨ鎖遺伝子と匹敵でき
る方法（Ｔ、ホンジジウ（Ｔ、１Ｉｏｎｊｏ、“免疫グ
ロブリン遺伝子（１＋＊ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｇ
ｅｎｅｓ）”、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｏｆＩｍｍｕｎｏ
ｌ、　１．　ｐ、４９９　（１９８３））で該ｍＲＮＡ
の示差スプライシングが起こると仮定される。このスプ
ライシグ中で、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡの６３
０ｂｐが除去されて、ｇｐ２５０をコードするｍＲＮＡ
が得られる（図１７および図２７（点線）〕（Ｒ，バエ
ル（Ｒ，Ｂａｅｒ）ら、上掲〕。

従って、ｇｐ３５０の読取り枠の全部または一部分をク
ローニングして、最終的にｇｐ３５０関連産物を単離し
かつ産生させる。ｇｐ２５０だけでなくｇｐ３ｓｏも高
度にグリコジル化された蛋白質であることに留意せねば
ならない。対照的に、本発明による組換えＤＮＡ分子の
発現によって産生される蛋白質は、天然に通常存在する
それぞれのウィルス蛋白質と異なる。原核生物中で発現
が行われる場合には、未修飾蛋白質が得られるが、真核
生物中で発現が行われる場合には、異なるグリコジル化
パターンあるいは天然産物に比べて別の修飾を有する蛋
白質が得られる。

ＢａｒｎＬ断片をｐＢＲ３２２に導入し、得られた組換
えプラスミドで大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）　Ｋ　１２　Ｈ
Ｂ１０１を形質転換させた〔Ｊ−スケア（Ｊ、５ｋａｒ
ｅ）、上掲〕。宿主大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）　Ｋ　１２
　ＨＢ　１０１の代わりに、本発明に用いた宿主細菌を
用いてもよい。

Ｍ、ハンメル（Ｍ、ｌｌｕｎｒｍｅｌ）ら（上掲）、Ｊ
、Ｉ？、ノース（Ｊ、Ｒ，Ｎｏｒｔｈ）ら（Ｊ、Ｒ，ノ
ース、八、Ｊ、モーガン、Ｊ、Ｌ、　ｌ−ンブソン、Ｍ
、Ａ、エプスタイン（Ｊ、Ｒ，Ｎｏｒｔｈ　。

Ａ、Ｊ、ｎｏｒＢａｎ、　Ｊ、Ｌ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、
　Ｍ、＾、Ｅ１ｓｔｅｉｎ）、“精製エプスタイン−パ
ルウィルスＭｒ３４０．　ＯＯＯ糖蛋白質は、リボゾー
ム中に取込まれるとき、強力なウィルス中和性抗体を誘
導する（１’ｕｒｉｆｉｅｄＥｐｓＬｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ｖｉｒｕｓ　Ｍｒ　３４０，０００　ｇｌｙｃｏｐｒｏ
ｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ−
ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓＷｈ
ｅｎ　１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　ｉｎ　ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅｓ）　　″、Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．　
ｐ、７５０４（１９Ｂ２）　）およびり、Ａ、ソー９−
・ローソンとＣ１＾、ブードリー（Ｄ、Ａ、　Ｔｈｏｒ
ｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　Ｐｏｏｄｒ
ｙ）〔“試験管内で中和用抗体の生成の原因となるエプ
スタイン−パルウィルスの主成分（ｇｐ３５０−ｇｐ２
２０）の同定と単離（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　
ａｎｄ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　　Ｍａｉｎ
　　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　　（ｇｌ）３５０−ｇｐ２２
０）ｏｆ　　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　
Ｒｅ５ｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎ
ｇ　Ｎｅｕｔｒａ−１ｉｚｉｎｇ　　Ａｎｔｒｂｏｄｉ
ｅｓ　　Ｉｎ　　Ｖｉｖｏ）”、　　ＪＪｉｒｏｌ、４
３．Ｐ、７３０（１９８４）　）の刊行物の内容は、ｇ
ｐ２５０／３５０をコードする配列の領域が十分に抗原
性でかつ（あるいは）免疫原性の蛋白質をコートするこ
とおよびこれらのサブ領域の導入後のこれらの産物が原
核生物細胞中および真核生物細胞中で安定に発現され得
ることを予想することはできない。従って、本発明の完
全に未修飾のまたは異なる方法で修飾されたｇｐ２５０
／３５０関連蛋白質が十分に活性な抗原および（または
）免疫原であることは驚くべきことである。特に、先行
刊行物中では、蛋白質の小さい炭水化物残基がこの蛋白
質の抗原または免疫原ポテンシャルに明らかに寄与する
ことは除外されなかった。

図１７に示すように、ＢａｍＬ断片〔ハンメル（Ｈｕｍ
ｍｅｌ）ら、下拙］の１．９　Ｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔ
ｌ断片は、アミノ酸位置２３２から始まりアミノ酸位置
８２５で終わるｇｐ３５０をコードする領域の部分を含
んでいる。

＋Ｉ　、　Ｃ、バーンボイムとＪ、ドーリイ（Ｈ，Ｃ，
Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ　Ｊ、Ｄｏｌｙ）　　Ｃ″組換
えプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための迅速ア
ルカリ抽出法（Ａ　　ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　　「ｏ
ｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐ
ｌａｓｍｉｄ　　ＤＮＡ）”、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．　ｐ、１５１３（１９７９
））が発表した方法に従ってＮｐＢＲ３２２−ＢａｍＬ
プラスミドＤＮＡの大規模調製を行った。このＤＮＡ５
０μｇを、５０ｒｎＭＮａＣ７！、１０ｍＭ　　ＭｇＣ
７！ｚ　、１　ｍＭ　　ｏ’ｒＴ。

１０ｍＭトリス−Ｈ（１Ｎｐｌ＋７．５中で、３７°Ｃ
に於て２時間、１００単位のＰｓｌＩ　（ヘーリンガー
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）で消化した。１１５容の
、５０ｍＭｒ’、　Ｄ　Ｔ　Ａ、６０％蔗糖、２％ブロ
ムフェノールブルーを添加して消化を停止した。得られ
た溶液を、トリス−酢酸緩衝液（０，０４Ｍ）リス−酢
酸、２ｍＭ　　ＥＤＴＡＮｐＨ７，６）中の１％アガロ
ースゲル（シーケム（Ｓｅａｋｅｍ）　、　　Ｆ’　Ｍ
　Ｃ）上で電気泳動によって分離した。サイズマーカー
として、旧ｎｄ■消化λ−ファージＤＮＡ〔ヘーリンガ
ー（Ｂｏｅｈ−ｒｉＢｏｒ）　）を用いた。室温（Ｒ’
ｒ）に於て１４時間、４０Ｖで電気泳動した後、ゲルを
、０．５μｇ／ｍｊ！エヂジウムブロミド含有トリス−
酢酸緩衝液で染色した。

ＵＶ照射によってゲル中のＤＮＡバンドを可視化し、実
施例２記載のようにして１．９　Ｋｂ　ＰｓｔＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片を単離した。

ベクターｐＵＣ８のＰｓｔｌ消化ＤＮＡを前述のように
して調製した。但し、次のりガーゼ反応中、ベクターの
再連結を抑制するためＤＮＡをアルカリホスファターゼ
〔０，５単位（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　、３７℃、３
０分〕で処理した。

精製した断片のおのおの１μβを、１１００ｎおよび５
００ｎｇのｐＵＣ８−ＤＮＡと共に並列で電気泳動（上
述の条件下で）することによって、精製断片のン農度を
概算した。

１、９　Ｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片４００ｎｇとＰ
ｓｔＩ消化ベクターＤＤＮＡ１００ｎとを連結させ、連
結したプラスミドＤＮＡで大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１
２　ＪＭ１０９を形質転換させ、実施例２記載のように
して陽性クローンを同定した。

得られたクローンを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　
ＪＭ１０９ｐｕｃｔＮｐ　１．９と呼び、得られた組換
えプラスミドを組換えプラスミドｐｔｌｃＬＰ　１．９
と呼んだ。

ス五ｍ ｇｐ３ｓｏサブ領域の安定産物の発現のため、該１、９
　ｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片をベクターｐＵＲ２９
０（Ｄ　Ｓ　Ｍ３４１７）　　（図２０）（Ｕ、リスタ
ー（Ｕ、ｌ１ｉｉｔｈｅｒ）ら、下拙〕中にリクローニ
ング（ｒｅｃｌｏｎ）　　Ｌ／た。

得られた組換えプラスミドは、ｇｐ３５０のアミノ酸２
３２〜８２５とｐＵＲ２９０およびｐＢＲ３２２ヌクレ
オチド残基のクローニング部位によってコードされるア
ミノ酸とがその後に続く、β−ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端領域の融合蛋白質をコードする。

それぞれのアミノ酸配列を図２１に示す。

プラスミドｐＵＣＬＰ　１．９のＤＮＡ５０μｇを１０
０単位のＢａｍ旧および旧ｎｄｌ［で消化し、上述のよ
うにして１％アガロースゲル上で分離した。初めにｐＵ
ＣＢ中に導入したＰｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片より僅かに数
個多くのヌクレオチドを含む、ここに得られた１、　９
ｋｂ　Ｂａｍ　ＩＩＩ　／　１ｌｉｎｄｌｌｌ断片を、
その他の得られた断片から１％アガロースゲル上で（上
述のようにして）分離し、最後に、上述のようにしてゲ
ルから単離し、ベクターｐｌＪＲ２９０のＢａｎ　ＩＩ
Ｉ／　ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡＣＵ、リュター、Ｂ・
、ミュラー・ヒル（υ、Ｒｔｉｔ−ｈｅｒ、　Ｂ、Ｍｊ
ｉｌｌｅｒ−！ｆｉｌｌ）、”　　ｃ　ＤＮＡクローン
の容易な同定（Ｅａｓｙ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ）’ＥＭＢＯＪｏｕ
ｒｎａｌ　１０．　ｐ、１７９１（１９８３）　）中へ
、上述の方法に従って連結させた。

次の工程は、これらの組換えＤＮＡ分子によるβ−ガラ
クトシダーゼリプレッサー・蛋白質過剰産生株の形質転
換であった。形質転換体を平板培養し、上述のように分
析した。但し、ＤＮＡ調製物の試料をＢａｍ１ｌｌ／旧
ｎｄｎｌおよびＥｃｏＲＩで消化した得られたクローン
、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）Ｋ１２　ＪＭ１０９ｐ（ＩＲＬ
Ｐ　１．９は、プラスミドｐＵＣＬＰ　１．９およびベ
クターｐＵＲ２９０の該ＢａｍＨＩ−旧ｎｄＩＩ１１．
９Ｋｂ断片の組換え体である。プラスミドｐｔｌＲＬＰ
　１．９を担持している（図２０参照）。

合成されるｇｐ３５０関゛」ポリペプチド５０μｇ　／
　ｍ　１のアンピシリンで補足した５ｍ（ｌのし一ブロ
ス中で、３７℃に於て、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２
ＪＭ１０９　ｐｌＪＩＩＬＰ　１．９を１晩中培養して
増殖させた。この培養細胞を、次に、５６０ｎｍに於け
る光学密度（ＯＤＳ＆。）０．４に希釈し、この細菌懸
濁液４ｍｌを、０Ｄｓｂｏが０．８になるまで３７℃に
於てインキュベートした。

次に、プラスミドｐｕＲｔＮｐ　１．９が担持している
遺伝情報の発現を、実施例３のようにして誘導し、最後
に、実施°例３記載のようにクーマツシー（Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅ）ブルー染色することによって正ｒ′″質、　
　を可視化した。

対照実験と比較して、プラスミドｐ［ＩＲｌ、Ｐ　１．
９でコードされかつサイズが１１６ｋＤ〜１００ｋＤの
範囲の幾つかの新規蛋白質が検出された（図２２）。

異なるサイズの発現産物は、不完全なｍＲＮＡ合成また
は翻訳によるものかも知れない。新規産物がＥＢＶ関連
蛋白質であることを立証するため、電気泳動で分離され
たすべての蛋白質をニトロセルロースフィルターに移行
した。すなわち実施例３記載の方法によっで“ウェスタ
ン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）”を調製し
た。この実験の結果は図２２に示しである。

β〜ガラクトシダーゼの天然のカルボキシ末端アミノ酸
配列のｇｐ３５０関連アミノ酸配列による置換はβ−ガ
ラクトシダーゼ四量体の生成を阻害する。さらに、この
新たに発現された融合蛋白質は、細菌の細胞中に高濃度
で存在し、従って宿主細胞の細胞質内に沈殿する。

実施例４記載の方法に従って、クローン大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ１２ＪＭ１０９　　ｐＵＲＬＰ　１．９を
用いて対応する融合蛋白質を産生させた。

この精製法の数段階の結果を図２３に示す。

図２４は、親水性（黒丸）および疎水性（灰色丸）領域
の相対的価値と共に、ｇｐ３５０のコンピューターで予
測された２次構造を示す。β−ターンまたはループ構造
は、１８０°のラインターンとして示される（α−らせ
ん、α−シート、コイル構造は、用いた尺度ではやっと
識別できる。）抗原部位は、蛋白質の表面に暴露する可
能性がある親水性環境内のβ−ターン中にあるという仮
定に基づ（と、約アミノ酸５０およびアミノ酸７０なら
びに８００−８３０の領域がそれぞれ抗原エピトープを
示すと期待される。

鉦邪仮逼０（７）さ」ＩＶどじｅ漏Ｌ１と乙若扛走グ光
則 ｐＢＲ３２２（Ｊ、スケア（Ｊ、５ｋｅｒｅ）ら、下拙
）中にクローニングされたＥＢＶ　Ｂａｍ１ｌｌ−Ｌ断
片をＥｃｏＲＩ　　（図１７に示した配列中の位置６５
０および１２８４に於ける制限部位）で消化し、得られ
た６３４ｂｐ断片を、電気泳動後アガロースゲルから溶
出し、ＥｃｏＲＩ線状化ｐＵＣ１９（０３ｍ３４２５）
　　（ヤニッシューペロン（ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏ
ｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）３３．１０３−１１９　（
１９８５））に連結させた。次に、この連結産物で大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２ｊ旧０９を形質転換させた（
すべての工程は、実施例２記載のように行った）。実施
例２．に従って、得られた組換えプラスミドを、適当な
制限酵素を用いて、その挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）の配向
について試験した。ｐＵＣ１９プラスミドの１　ａｃＺ
遺伝子の読取り枠に対して読取り枠の反対の配向で挿入
物を担持する組換えプラスミドをｐＨｃ１９ＬＥＰ６０
０と称し、さらにクローニングのために使用した。

ｐＬＩｃ１９ＬＥ！’６００をＢａｍ１ｌｌおよびＰｓ
ｔｌ　（ＢａｍＨＴ部位はｐＵＣ１９から誘導され、Ｐ
ｓｔ１部位は図１７の位置１２４８に相当する）で消化
し、得られた６００゛ｂｐ断片を、前辺てＢａｍ１ｌｌ
およびＰｓｔｌで消化しであるｐｔｌＲ２９１（１）３
Ｍ３４１８）　　Ｃリュター（Ｒ２’ｔｈｅｒ）　、下
拙〕中へ挿入した。得られた組換えプラスミドｐＨＲＬ
ＥＰ６００は、β−ガラクトシダーゼのＣ末端に於ける
リンカ−領域中に於て下記の配列を示した。

ＰＵＲ２９１／　　　ｐＵＣ１９ β−ｇａｌ−ＴＧＴ　ＣＧＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣＣＣＧ　
ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣ／　　　　　　ｇｐ２
５０／３５０ ＧＡＡ　　ＴＴＣＣＣＡ　　ＴＴＴ　　・・・・・・・
・ＡＣＣ／ｐＨＲ２９１ ＴＧＣＡＧＣＣ４八　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＣＧＡ　　
ＴＧＡＩ　ＰＴＧ−誘導後のこの組換えプラスミドから
、実施例３記載のように融合蛋白質の発現を行った。

この実験の結果は、図２５に示す。図２５　（下部）か
ら、得られた発現産物は、ＮＰＣ血清のプールによって
中程度に抗原性の蛋白質として認識されると見なすこと
ができる。

ｇｐ２５０／３５０のＣ末端のサブクローニングおよび
。

匹 プラスミドｐＵＣＬＰ　１．９　（実施例１１参照）を
ＸｍｎＩ（図１７の位置２７６０に於ける制限部位）お
よび旧ｎｄ　ｍ　（ｐＵＣ−プラスミドから誘導される
領域内の制限部位）で消化することによって、コンピュ
ーター指示分析によっても抗原性であると期待されるＣ
末端付近の抗原エピトープを含む領域を単離した。この
精製３８６ｂｐ断片を、予めＨｉｎｃＩ［およびＨｉｎ
ｄＩ［［で消化しである９［ＩＣ１Ｑ中へ挿入した。大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ１２ＪＭ１０９中へ導入され
た、ここに得たプラスミドはρＵＣ１９ＬＸＰ３９０？
Ｉ！１ である。

ｐＵＣ１９ＬＸＰ３９０の挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）をＢ
ａｍ１ｌｌおよび旧ｎｄＩ［［で切り出し、同じ酵素で
消化したｐＵＲ２８８中へ結合させた。得られた組換え
プラスミドを大腸菌１．ｃｏｌｉ）　Ｋ１２ＪＭ１０９
中へ導入しＮｐｔｌＲＬＸＰ３９０と称した。そのリン
カ−領域の配列は下記の通りである。

ｐＵＲ２８８／　　　　ｐＬＩｃ１９　　　　　／β−
ｇａｌ−ＴＧＴ　　ＣＧＧ　　ＧＧＡ　　ＴＣＣＴＣＴ
　　ＡＧＡ　　ＧＴＣＡＧＴ　　ＴＣＣｇｐ３５０　　
　　　　　　／　　ｐＬＩｃ８　　／　ｐＬＩＲ２８Ｂ
ＣＡＣ・・・、・・、、ＧＴＡ　　ＣＴＧ　　ＣＡＧ　
　ＣＣＡ　　ＡＧＣＴＴＡ　　ＴＣＧＩ　ＰＴＧ誘導後
、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が、該形質転換宿主
によって合成された。ウェスタン・プロットに於て、発
現産物は、ＮＰＣ血清プールと高い反応性を示す（図２
５下部参照）。

ジルグ（Ｊｉｌｇ）　ら〔讐、ジルグと１１．ウルツ（
Ｗ、Ｊｉ１ｇ＋Ｉｎｄ　Ｉｌ、Ｗｏｌｆ）”、エプスタ
イン・パルウィルス特異姓膜抗原８ｐ２５０に対する抗
体の診断的意義、（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　５１ｇｎ１
ｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　
ｔｈｅＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ−Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｇｐ２
５０）　”　、ザジャーナル　オブ　インフェクシアス
ディジージズ（ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆ
ｅｃ、ｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）　＋旦、　２２
２−２２５　（１９８５）　）は、ｇｐ２５０およびｇ
ｐ３５０の、ＢＢＶに対する免疫状態の決定および特に
慢性ＥＢＶ感染の診断のための抗原としての正当性を示
した。ＥＢＶ感染後正常な免疫応答を示すヒトはｇ９２
５０およびｇｐ３ｓｏに対する抗体をもっているが、慢
性ＥＢＶ惑染にかかっている患者は未だ付加的な介在配
列（図２７参照）を含むｇｐ３５０にのみ免疫応答を示
す。これらのヒトの血清学的状態は、実施例４記載の方
法によって精製された３種の融合蛋白質を用いるＥＬＩ
ＳＡ試験で検査することができる。３種の融合蛋白質全
部に対する抗体反応は正常な免疫状態を示す。もしｐｔ
ｌＲＬＥＰ６００およびｐｔＪＩ？ＬＸＰ３９０でコー
ドされる蛋白質と反応しないかまたは弱く反応するがＮ
ｐＵＲＬＰｌ、９（介在配列を含む、図２７参＠）に対
して反応性であるならば、慢性ＥＢＶ惑染の可能性が極
めて大きい。

膜蛋白質ｇｐ２５０／３５０およびそのサブ断片に対す
るＩｇＡ抗体は、正常な人口中には存在しないが、−比
較的敏感でない免疫蛍光法で測定するとき鼻咽頭癌患者
の５８％に存在する。これらの結果は、同等の試験系に
於けるＥＢＶ特異的初期抗原（ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇ
ｅｎ）に対するＩｇＡ抗体の検出率にイ以ている。同様
に、より高感度のＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験は１００％に近い
検出率をもち、偽陽性結果のほんの僅かの増加がある。

従って、新たに構築された組換えプラスミドｐＵＲＬＥ
Ｐ６００　、　ｐＨＲＬＸＰ３９０　。

ｐＵＲＬＰ　１．９でそれぞれコードされる抗原は、鼻
咽頭点の初期診断および治療の管理に有用な物質である
。

ｇｐ２５０／３５０のＮ末端領域を含む組換えプラスミ
ｒ″ｐｔｌｃ１９ＬＥＰ６００　　（実施例１５参照）
を１１ａｍｌｌＩおよびＰｓｔｌで消化した。このＩＦ
、ＢＶ誘導断片を、予め同じ酵素で消化しであるｐｔｌ
ｃＢ中へ連結させた。得られたクローンｐｔｌｃＬＥｌ
’６００のリンカ−領域の配列は下記の通りである。

／　　　ｐＵＣ８　　　　　／　　ｐＵＣ１９ＡＴＴ　
ＡＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＣＧＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣＣＣＧ
　ＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＧ／　ｇｐ３５０　　　　　　　
　　　　　　ｐＵＣ８ＣＴＣＧＡＡ　ＴＴＣＣＣＡ　Ｔ
ＴＴ・・・・・・ＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＧＣＴＡ
Ｔ Ｉ　ＰＴＧによる誘導後ＮｐＵｃＬＥＰ６００でコード
された融合蛋白質は、細菌細胞内で全く安定でありかつ
ＮＰＣ血清プールによって抗原として認識される（図２
６参照）。細菌融合部分は、Ｎ−末端に於ける１４個の
アミノ酸とＣ末端に於ける９個のアミノ酸とからなる。

この蛋白質の価値は、ワクチンに応用できることであり
、特にそれがβ−ｇａｌ融合蛋白質で決定されたように
（図１５参照）Ｃ末端からのそれ自体不安定な第２抗原
領域と融合されるときワクチンに応用できることである
。

実施例１１．１５〜１７によって構築された組換え発現
プラスミドおよびクローニングプラスミドの挿入物（ｉ
ｎｓｅｒｔ）は図２７に示しである。

天１」（Ｌ影 プラスミドｐＵＣ１９ＬＩｉＰ６００　　（図１５参照
）をＰｓＬｌで消化し、得られた５ｏｏｂｐ断片を、Ｐ
ｓｔＩで線状化されたプラスミドｐＵＣＡＲＧ６０１　
　（実施例７参照）に連結させた。ｇｐ３５０挿入物が
ρ１ＪｃＡＲＧ６０１−読取り枠と同じ配向であること
がチェックされ、得られた組１負えプラスミドをｐｔｌ
ｃＡＲＧ１２３０と称した。得られたプラスミドのリン
カ−領域中および接合（ＪｕｎｃＬｉｏｎ）部位に於け
る配列は下記の通りであｐＨｃ８　　　　　／　ｐＵＣ
１２　／＾ＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＡＡ
Ｔ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＡＣＣｐ１３８　
　　　　／　　　　　ｐｌＪｃ１９・・・・・・・・Ａ
ＴＣＣＴＧ　　ＣＡＧ　　ＧＴＣＧＡＣＴＣＴ　　ＡＧ
Ａ／　　　　ｅｐ３５０ ＧＧＡ　ＴＣＣＣＣＧ　にＧＴ　ＡＣＣＧＡＧ　ＣＴＣ
ＧＡＡ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＴＴ／　９ＵＣＡＲＧ６０１ ・・・・・・・・ＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴ
ＣＧＴＣＧＴＴ　　ＧＡＴ八ＡＣＧＴＴ Ｉ　ＰＴＧによる誘導後ＮｐＵｃＡＩ？Ｇ１２３０を担
持する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に１２ＪＭ１０９は、２
種の異なる蛋白質すなわちｐ１３８とｇｐ２５０／３５
０からの抗原性領域からなる安定でかつ抗原性の蛋白質
を発現する。

さらに、この発現産物は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験に於ける
抗原として、またワクチン接種用の抗原としても使用す
ることができる。

Ｂ９５−８からの上清を用いてヒト腰帯血球〔フィコー
ル／ハイバーク（Ｆｉｃｏｌ／　Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配
からのリンパ球分画）を不死化した。０．５Ｘ１０’リ
ンパ球を、０．５　ｍ　Ｉｔのミクロ力価平板につき十
分に接種し、５０μｌの８９５−８の無細胞上清を添加
し、３７℃に於て２時間、吸着させた。インキュベーシ
ョン後、ウィルスを含んでいる培地をとり出し、１０％
の子牛胎児血清を含むＲＰＭＴ１６４０培地で洗浄し、
同培地２００１μβ中で、３７℃に於て５％Ｃ○２雰囲
気中でインキュへ−１・した。発育しつつあるリンパ芽
球皮疹細胞を、実験開始から３週間以後に評価し、陽性
形質転換として計数した。

血清の中和性は、Ｂ９５−８細胞上清を含むエプスタイ
ン−パルウィルスの一定量を、複試験に於ける対照とし
てのそれぞれの予備免疫化血清を含む試験血清２０μ２
と共に僅かに攪拌しながら１時間インキュベートした後
、上清を腰帯血液リンパ球に吸着させることによって試
験した。２時間後にセルから接種物を除去した後、保持
培地（１０％ＦＣ３で補足したＲＰＭ１１６４０）を、
中和活性試験下にあるそれぞれの血清５％で補足した。

下記の結果が得られた。

」−例」」− 診断に適した蛋白質ｐ１５０　　（ウィルスカプシド抗
原ＶＣＡ　（実施例１、図２８Ｄ参照）〕を抗原部位に
ついて試験し、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として
発現させるためにサブクローニングした。抗原部位をコ
ードすると期待されるＮ末端領域は、キャロン４　Ａ　
（Ｃｈａｒｏｎ　４八）ファージＥＢ６９−７９　（Ｇ
、Ｎ、ブＪル、Ｄ、ライスマン、Ｃ，キントナー、Ｇ、
クラウス、Ｂ、サグアン（Ｇ、Ｎ、Ｂｕｅｌｌ。

Ｄ、Ｒｅｉｓｍａｎ、　Ｃ，Ｋｉｎｔｎｅｒ、　Ｇ、Ｃ
ｒｏｕｓｅ、ａｎｄ　Ｂ、Ｓｕｇｄｅｎ）＋”エプスタ
イン−パルウィルスの８９５−８株（ＡＴＣＣＣＲＬ　
１６１２）からの重複ＤＮＡ断片のクローニングは内部
反復に対する相同の部位を示す（ＣＩｏｎｉｎｇ　ｏｖ
ｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｒ
ｏｍ　ｔｈｅ　Ｂ９５−８５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｔｒｕｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１
２）　ｒｅｖｅａｉｓ　ａ　５ｉｔｅ　ｏｆ　ｈｏｍｏ
ｌｏｇｙｔｏ　ｔｈｅ　１ｎｔｅｒｎａｉ　ｒｅｐｅｔ
ｉｔｉｏｎ）、”ジャーナル　オブ　ピロロジー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏ、ｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４０，９７７
−９８２　（１９８１））をＢａａ＋Ｈｔで消化するこ
とによッテ得られ、得られた１１７６ｂｐ断片をｐｔｌ
ｃ１２のＲａｍ旧部位中へクローニングした。適当な配
、向での挿入を有する得られたプラスミドから、Ｘｈｏ
ｌ／５ａｉｌで５ｓｏｂｐ断片を切除した。５ａｌＩ部
位はｐＵＣ１２リンカ−から由来し、ＸｈｏＩ部位はｐ
１５０の開始から上流へ３３ｂｐの所にある。この断片
を、５ａｌＩで消化されたｐＵＣ８　（ＳａｌｌとＸｈ
ｏＩとは同じ付着末端配列を共有する）中へ挿入した。

得られたクローンをＢａｍ１１部位の次にｐ１５０開始
コドンをもつようにスクリーニングした。適当なりロー
ンからＮｐ１５１コード領域をＢａｍＨＩおよび！ｌ１
ｎｄＩ［［で切り出し、ＢａｍＨＩおよび旧ｎｄｌｌ［
で消化されたｐＵＲ２９０（ｐＵＲ２９０ＣＸｌ１５８
０）中にクローニングした。このクローンからのβ−Ｇ
ａｌ：：ｐ１５（ｌ融合蛋白質の発現は、図２９に示し
である。それがＮＰＣ血清プールと極めてよく反応する
能力は図３０かられかる。

さらに、従ってＮｐ１５０：β−ｇａｌ融合構築体が得
られた。例えば図３１に示されているサブクｏ　−７ｐ
ＵＲ２９０口ＢＸ３２０．　ｐＵＲ２９２ＤＢＢ１８０
．　ｐｔｌＲ２９０ＤＴＴＴｏｏ、　ｐＵＲＤＴＴ７４
０．　ｐＵＲ２９０ＤＴＰ６８０．　ｐυＲ２８８ＤＰ
Ｐ３２０が得られた。このサブクローンの名称から用い
られたペターがわかり、例えばサブクローンρｌｌＲ２
９０ＤＢＸ３２０の構築のためには、ベクターＱを用い
た。

図３０から、サブクローニングのために用いた制限酵素
部位もわかる。　ｐＵＲＤＢ８１８０を除いてすべての
クローンは、所望の断片をｐＵＣ８またはｐＵＣ１２（
下拙参照）中ヘサブクローニングしてＮｐＵＲべ、　　
フタ−（下拙参照）へクローニングするために適したＢ
ａｎ旧および旧ｎｄｎ１部位を得ることによって）　　
構築された。ｐＵＲ２９２ＤＢＢ１８０は、Ｂａ５ａｌ
目で線状化されたρＵＩ？２９２中への１８０ｂｐのＢ
ｇｌ　　Ｉｆ−Ｂｇｌ　　ＩＩ断片の挿入によって誘導
された。図２９および図３０はそれらの発現および抗原
性を示す。

ｐＵＲ２９０ｃＸＩＩ５８０テ：２−ドされかつ実施例
４によって精製されたβ−Ｇａｌ：　ｐ　ｌ　５０融合
蛋白質は、ＩＥＬＩＳＡ試験でＥＢＶ特異性抗原として
反応し、診断に応用できることを示す。５ｓｏｂｐ断片
（ｐＵＲ２９０ｃｓＨ５８０の構築のために用いられる
）を、Ｂａ＋１１１１および旧ｎｄＩ［［を用いてｐＵ
Ｃ１８　（０５Ｍ３４２４）中へ挿入することによって
ｐ１５０のＮ末端断片をもつ安定な発現も得られた。得
られたクローンｐＵＣ１８ｃＸＨ５８０は、サイズが約
２５ｋＤの安定な抗原性蛋白質を発現する。

本発明の目的のために、下記の寄託プラスミド、宿主細
菌、細胞系を用いた。寄託は、ブタベスト条約に従って
行われた。

以上、本発明の多数の実施態様を示したが、ＥＢＶ関連
抗原をコードしかつ組換えＯＮＡ分子の産生をコードす
るＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列を利用する他の実施態様を
与えるために本明細書の構成を変え得ることは明らかで
ある。該ＤＮＡ配列に関連しかつ他のＥＢＶ血清型から
ｍ！され得る他のＤＮＡ配列も用い得ることは当業者に
は明らかである。ＥＢＶは、公知の天然ＤＢＶ源、例え
ば感染した患者の唾液から容易に得ることができる。

生物学的に同等な結果を得るため、他の適当なベクター
／宿主系を用い得ることは明らかである。

本発明は、現在入手できる宿主／ベクター系に限定され
るものではない。

【図面の簡単な説明】

免疫沈降した″ＳＳ−標識−蛋白質を５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルにＸ線フィルム
を露出した。 免疫沈降に用いた種々の血清源は、オートラジオグラフ
ィーのそれぞれの領域の下に示しである。 “プール”と称する対照は、免疫沈降性のＥＢＶ特異的
蛋白質のすべてを含んでいる。 このオートラジオグラフィーから、ＮＰＣ血清のおのお
のに、かつＥＢＶ惑染特異的血清のあるものにのみ、少
なくともｐ１３８Ｎｐ１０５、ｐ８０に対する抗体が存
在することがわかる。同様に、回復期状態に比べて、新
しいＥＢＶ惑染（伝染性単核症）にはＮｐ５４に対する
抗体が重要である。ｐ１５０．ｐ１４３Ｎｐ１１０Ｎｐ
９０に対する抗体は、健康な個体の回復期血清中にも存
在し、免疫のため、あるいは新しいＥＢＶ感染について
１ｇＭ特異性試験に関連して、あるいはＥＢＶ関連腫瘍
（ｍｅｏｐｌａｓｉａ）　（Ｎ　Ｐ　ＣおよびＢＬ）に
ついてはＩｇＡに関連してマーカーとして作用すること
ができる。 図２は、ＥＢＶ　　Ｂ９５−８ゲノムに火するｍＲＮＡ
’ｓ　　のマツピングを示す。 Ｆ、ＢＶ　　Ｂ９５−８ゲノムのＢａｍＨＩ制限部位は
、図の下に示してあり、それぞれの制限断片は、大文字
および小文字で示しである。個々のＢａｍＨＩ制限断片
に対するハイブリッド選択によって位置決定される蛋白
質のｍＲＮＡ’ｓ　　は数および線で示しである。この
図からＮｐ１３８の遺伝子がＢａｍへ断片に相関してい
ることがわかる。 ここに示した配列は、それぞれの陰性鎖である。 ｐ１３８コード領域は、ヌクレオチド位置１８２から始
まり、ヌクレオチド位置３５６３で終わる。 このコード領域の断片のクローニングに用いられる制限
部位が示しである。 皿土珪ユニｉ丞ｌ上奸堕競豊主ｌ牡且四旦Ｉ里地図を示
す。 ベクターｐＵＣ８のサイズは２．７ｋｂである。１　ａ
ｃＵＶ５β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびオペ
レーター（ＰＯ）のクローニング部位３゛　は、Ｅｃｏ
ＲＩ（Ｅ）、　Ｂａｍ１ｌ［（Ｂ）、　Ｓａｌ［（Ｓ）
、　Ｐｓｔｌ（Ｐ）、　ｌ１ｉｎｄｌＩ（（ＩＩ）部位
を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子は八ＭＰで示される。 ｐ１３８コード領域の３．０　ｋｂおよび３、３　ｋｂ
ＸｈｏＩ断片をｐ１１０８の５ａｉｌ部位中へ挿入する
。 挿入は中抜きバーで示しである。ｐＨｃ６３５は、３．
０ｋｂＸｈｏｌ断片を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に
対して正しい読取り枠内に含んでいるがＮｐＵｃ６１３
０は、３．３　ｋｂＸｈｏｌ断片を反対の配向で含んで
いる。 第１列は免疫染色したウェスタン・プロットで、ｐ［Ｉ
ｃ８で形質転換され、Ｉ　ＰＴＧで誘導された細菌から
単離された蛋白質を示し、 第２列はｐＵＣ９２４で形質転換された細菌の蛋白質で
あり、 第３列はｐＫＫ３７Ｂで形質転換された細菌の蛋白質で
あり、 第４列はｐＭＰ９２４で形質転換された細菌の蛋白質で
あり、 第５列はｐＵＣ６３５で形質転換された細菌の蛋白質で
ある。 融合蛋白質のサイズは、７５ｋＤ（第２列）、１１０ｋ
Ｄ（第３列）、９０ＫＤ（第４列）、１３５ｋＤ（第５
列）と概算された。 図６は、プラスミド１Ｉｃ９２４の制限１１図である。 ベクターｐＵＣ９のサイズは２．７ｋｂである。ｌ　ａ
ｃＵＶ５β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびオペ
レーター（ＰＯ）のクローニング部位３′は、ＥｃｏＲ
Ｉ（Ｅ）、　Ｂａｍ１ｌｌ（Ｂ）、　５ａｉｌ（Ｓ）、
　ＰｓｔＩ（１’）、　１ｌｉｎｄ　Ｉ［［（Ｉｆ）を
含む。β−ラクタマーゼ遺伝子はＡＭＰで示される。 ｐＵＣ６３５の２．６　ｋｂ　Ｂｇｌ　Ｉ［／　ＩＥｃ
ｏＲＩ　−断片を、ＢａｍｌｌＴ部位とＥｃｏＲ１部位
との間に挿入する。Ｂｇｌ　　ＩＩの略号は’Ｂｇ”で
ある。 図７は、プラスミドＭＦ９２４の制限地ヌである。 ｐＵＣ９２４の２．６　ｋｂ　Ｂａｍ１ｌｌ　１ｌｉｎ
ｄ　ｍ断片がハイブリッドｔｒｐ−１ａｃプロモーター
（Ｌａｃ）とＣ，（入りブレソサー）のアミノ末端コー
ド領域との３°に位置するＮｐＥＡ３０５のＢ　ａ　０
＋　ＩＩおよび旧ｎｄｌｌ［制限部位中へ挿入された。 図８は、プラスミドρＫＫ３７８の制限地図である。 リンカ−としてｐＢＲ３２２の３４５　ｂｐ　Ｂａｍ１
ｌｒ／Ｈｉｎｄｌ［Ｉ’断片（黒い太線で示す）を用い
、ベクターｐＫＫ２４０−１１の１１ｉｎｄ［１部位中
へｐＵＣ６１３０の３．．３ｋｂ　Ｂａｍ１ｌｌ／旧ｎ
ｄ［［断片を挿入した。かくしてＮｐ１３Ｂコード断片
は、ハイブリッドｔｒｐ−Ｌａｃプロモーター（ｔａｃ
）およびＡＴＣ開始コドンの３゛に位置する。 図９は、　１３８の２′構造である。 ｐ１３８の２次構造のチョウーファスマン（Ｃｈｏｕ−
Ｆａｓｍａｎ）計算のコンピュータープロットを示す。 また、疎水性領域（黒丸）および親水性領域（白丸）も
示す。 抗原部位は、β−ターンをもつ親水性領域にあると期待
される。この環境はＮｐ６００領域中および蛋白質のカ
ルボキシ末端に与えられる。 ベクターｐＵＣ８およびｐＵＲ２８８中へサブクローニ
ングされた領域が示されている。 図１０はＮｐ１３８のＰｓｔｌ断片を担持するプラスミ
ドｐＵＲで形質転換された細菌の発現産物を示す。 Ａ９種々のプラスミドを担持するＩＰＴＧ誘導細菌の溶
解産物のクーマツジ−ブリリアントブルー染色ＳＤＳポ
リアクリルアミドスラブゲル分析を示す。分子量１２０
〜１５０ｋｄの融合蛋白質を黒丸で示す。トラックＭ　
（ＴｒａｃｋＭ）分子量マーカーが図３に示すようなｐ
１３８の領域を含むプラスミドを担持する細菌のｐＵＩ
１４００−　ｐＵＲ５４０の溶解産物を標識する。 Ｂ、ゲル（パネルＡで示したものと同様な）からニトロ
セルロースペーパー（ウェスタンプロット）上へ移行さ
せた蛋白質の酵素免疫測定を示す。この測定では、高力
価血清のプールを用い、洗浄後、結合した免疫グロブリ
ンを、ヒ目ｇＧに対する抗体にカップリングさせたペル
オキシダーゼとジアミノベンジジンとによる逐次反応に
よって可視化した。ｐＵＲ６００およびｐＵＲ５４０を
含む細菌からの融合蛋白質だけが特異的反応を示す。プ
ラスミドｐＵＣ６３５　（陽性対照としての）はｐ１３
８コード領域のほとんど全部を含むが、蛋白質は不安定
で、急速に分解する。ｐＵＣ８は、ＥＢＶ誘導配列を含
まないベクタープラスミドを含む陰性対照である。 工。 ゲルからニトロセルロースペーパー（ウェスタン・プロ
ット）へ電気泳動によって移行させた蛋白質の酵素免疫
測定を行った。この測定では、高力価抗血清のプールを
用い、洗浄後、結合した免疫グロブリンを、ヒトＩｇＧ
に対する抗体にカップリングさせたペルオキシダーゼと
ジアミノベンジジンとによる逐次反応によって可視化し
た。ｐｌＪｃＰ６００を含む菌からの融合蛋白質は安定
に産生され、特異的抗原反応を示す。 ａ　）　ｐＵＣ６００の５’　　−Ｐｓｔ１部位を、５
ｓｔＴ（２０ｂｐ上流）および旧ｎｄＤＩで消化するこ
とによって除去し、次いでｐＵＣ１２−５ｓｔｌ　／　
ｌ１ｉｎｄ　ｍと連結させた。 このプラスミドから、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで挿入
物（ｉｎｓｅｒｔ）を除去しＮｐＬＩｃ８−　ＥｃｏＲ
Ｉ中へ連結させた。得られたプラスミドｐＵＣ６０１中
へ、５個のアルギニンと２個の停止コドンとをコードす
るオリゴヌクレオチドを、３’　　−Ｐｓｔ１部位とＨ
ｉｎｄ　ｍ　（ｐＵＣＡＲＧ６０１）との間の１本鎖Ｄ
ＮＡとして挿入した。最後の工程に於てＮｐ１３８のＣ
末端からの第２抗原決定基をコードする５４０ｂｐ　Ｐ
ｓｔｌ断片を、Ｐｓｔｌによる消化および連結によって
挿入した。得られたプラスミドは、５個のアルギニン残
基がその後に続く両方の抗原決定基を枠内に含んでいた
。このプラスミドをｐＵＣＡＲ１１４０と称した。 ｂ）オリゴアルギニンリンカ−のヌクレオチド配列。下
方１￥（ｌｏｗｅｒ　５ｔｒａｎｄ）を合成し、ｆ’ｓ
ｔＩおよび旧ｎｄＨ［の付着末端間の架橋形成によって
１本鎖ＤＮＡとして挿入した。 上部は、クーマツシー（Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ）染色ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。新たに検出された蛋白質は、黒色
点で標識した。下部は、ＮＰＣ患者からの血清による免
疫染色液に得られた対応するウェスタンプｏ　７ト（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）を示す。ｐＨＲ６００と比べ
てＮｐＨＲ６００によってコードされるＥＢＶ関連蛋白
質は、１４個のアミノ酸が欠けている（ｐｌＪＣ−ポリ
リンカーによってコードされる６個のアミノ酸とＰｓｔ
ｌ　−５ｓｔｌ断片からの８個のアミノ酸）ので、約１
．５　ｋ　Ｄ小さい。ｐＵＣＡＲＧ６０１によってコー
ドされる蛋白質のサイズは、挿入されたオリゴヌクレオ
チド中に存在する停止コドンによってｐＵＣの１ａｃＺ
領域中を通しての読取りが阻害されるので、さらに約１
１ｋＤ減少される。ｐＵＣＬＡＲＧ１１４０では、５４
０ｂｐ断片の挿入によって約４２ｋＤにサイズが増加す
る。この蛋白質は細菌細胞中で安定である。 図に示したプラスミドを担持するＩＰＴＧ誘導大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌ、）細胞の溶解産物を、１２％５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で、４回、独立に分離し、ウェスタン・プロッテ
ィングによってニトロセルロースへ移行させた。第１列
：陰性参照としてのｐＵＲ２８８；第２列：陽性対照と
してのｐＵＣＡＲＧ１１４０　；第３列：ｐＵＲ５４０
；第４列：　ｐＨＲ６００゜２種の個々のＮＰＣ血清（
Ｎ１３５２とＮｔｔ３５４）をフィルターと共にインキ
ュベートし、結合したＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を、ペル
オキシダーゼ接合抗ヒ目ｇＧおよび抗ヒトＩｇＡウナギ
抗体を用′いて可視化した。ウェスタン・プロット中の
蛋白質の異なる位置、特にｐＵＣＡＲＧ１１４０の異な
る位置は５ＤＳ−ＰＡＧＥの異なる電気泳動時間から得
られる。 ＮＰＣ血清ＩＶｈ３５２に於ては、ｔｇｃおよびＴｇＡ
抗体の主な反応はｐ１３８のＣ末端からのｐ５４０エピ
トープ（図９参照）に対して向けられるが、血清隘３５
４では抗−ｐ１３８抗体の主要部分はｐ６００エピトー
プ（図９参照）。このことは、血清中の抗ｐ１３８抗体
の検出には両方の抗原部位が必要であることを示す。 ヌ１５は、プラスミドＵＣＡＲＧ１１４０によってコー
第１列および第３列：　ＥＢＶ陰性血清、第２列：　Ｎ
ＰＣプール血清、第４−１３列：個々のＮＰＣ血清。希
釈試験は下部に示す。左側：　ＩｇＧ　、右側：ＩｇＡ
。 Ａ、５個のアルギニン残基と２個の停止コドンとをコー
ドするオリゴヌクレオチドの配列。５゛末端に於ける旧
ｎｄ１１１部位と３゛末端に於けるＰｓｔＩ部位とは、
このオリゴヌクレオチドをｐＵＣ８中へ挿入することに
よって生成された。 Ｂ、カルボキシ末端に該Ａｒｇ　−リンカ−を担持する
不溶性の発現真核生物蛋白質の精製スキーム。 この糖蛋白質のためのコード領域は、ゲノム位置９２１
５３から始まり、位置８９４３３で終わる。図に示した
配列は、代表的な陰性鎖であり、位置９２７０３のＢａ
ｍ１１１部位から始まる。この図の配列番号によれば、
ｇｐ３ｓｏコード領域は、位置５５６と３２７６の間に
ある。塩基対５２０の領域内のＴＡＴＡＡ−ボックスは
・・・で標識され、位Ｗ　３２９０の多分ポリアデニル
化位置は＋＋＋で標識される。スプライスドナーおよび
スプライスアクセプタ一部位は、ドナ一部位は）　　Ｃ
−・−・で、アクセプタ一部位は−・−・−）（で示さ
れる。コード領域のカルボキシ末端付近の疎水性領域は
＊＊＊で標識される。恐らく、このアミノ酸配列は、こ
の蛋白質を膜に固着させるためのアンカー配列として働
く。 Ａ、制限地図： 制限酵素Ｂａｍ１ｌｌ　、、　ＥｃｏＲＩ　％旧ｎｄＩ
［［、Ｐｓｔｌの位置が、ＢａｍＬ−断片のヌクレオチ
ド位置に対して示される。 Ｂ、オーブン読取り枠： Ｂａｍ１ｌｌ　Ｌ−断片のオープン読取り枠が箱として
示され、それぞれのＤＮＡ配列の両方の極性で与えられ
る。 図１９は、プラスミドｐＵＣＬＰ１．９の制限地図を水
工。 ｐｕｃｓのサイズは２．７ｋｂである。ＬａｃＵＶ５β
−ガラクトシダーゼプロモーターおよびオペレーター（
ＰＯ）のクローニング領域３°は、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、
Ｂａｍ旧（Ｂ）　、　５ａｌｌ（Ｓ）　、　Ｐｓｔｌ（
Ｐ）　、　１ｌｉｎｄ　ＩＩ［（Ｈ）部位を含む。中抜
きバーで示されるＢａｍＬ−断片の１．９ｋｂサブ断片
をＰｓｔ１部中へ挿入した。この読取り枠はＮｐｔｌｃ
８のＬａｃＺコード部分と同じ配向を有する（太い黒線
で示す）。 図２０は、プラスミドＵＲＬＰ１．９の制限ｌｂ図を示
す。 ベクターｐＵＲ２９０は、５．２ｋｂの長さを有し、β
−ラクタマーゼ遺伝子（ＡＭＰ”）からなりＮｐＢＲ３
２２の複製源である。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は太
い黒線で示され、それぞれのプロモーター・オペレータ
ー領域はＰＯで示される。制限酵素の略号は下記の通り
である。ＢａｍＨＩ　（Ｂ）　、　Ｃ１ａｌ（ｃ）、［
ｃｏＲＩ（Ｅ）　、　１ｌｉｎｄ　ｌ［Ｉ（ＩＩ）　、
　Ｐｓｔｌ（Ｐ）　、　５ａｌｌ（Ｓ）。 ｐＵＣＬｒ’１．９の１．９ｋｂ挿入物はＢａｍ１１１
部位と１ｌｉｎｄｌ１１部位との間に導入された。 剋工藁１１ ｂｐ４−３０６９：β−ガラクトシダーゼｂｐ３０７０
−３０７２　：　ｐＵＲ２９０リンカ−（小文字で示す
） ｂｐ３０７３−３０８８：多重クローニング部位（Ｂａ
ｍｌｌｌ　〜Ｐｓｔｌ　；小文 字で示す） ｂｐ３０８９〜４９８５　：ｇｐ３５０のｒ’ｓｔｌ断
片ｂｐ４９８６〜４９９４　：　ｐｔｌｃ８多重クロー
ニング部位 （ＰｓｔＩ〜１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　；小文字で示す） ｂｐ４９９５〜末端：　ｐＢＲ３２２配列。 されるβ−ａｌ：３５０　　白　の　　をスす。 第１列および第２列は、未誘導の（第１列）およびＩ　
ＰＴＧ誘導の（第２列）　ｐＵＲＬＰｌ、９含有クロー
ンのクーマツシーブルー染色ＰＡＧＥを示す。 分子量の異なる数多くのバンドがあるので、蛋白質の主
部分は不完全に合成されたように思われる。 第３列は、ＮＰＣ血清によるペルオキシダーゼＤＡＢ染
色ウェスタンプロットを示す。β−ガラクトシダーゼに
相当するサイズ１１６ｋＤのバンド以外は、新たに発現
されたすべての蛋白質は抗原性である。 細菌のバックグラウンドバンドは、使用した血清中の高
含量の抗菌性抗体によるものである。 Ａ、クーマツシー染色ゲル；Ｂ、ＮＰＤ血清で処理した
ウェスタンプロット。 第１列：未誘導培養 第２列：　Ｉ　ＰＴＧ誘導培養 第３列＝８Ｍ尿素中に溶解した溶解菌の不溶性蛋白質 第４列：セファロース２Ｂ−Ｃｌクロマトグラフィー後
後−ルされたβ−ｇａｌ　：ｇｐ３５０蛋白質含有分画 図に示した尺度では、ループ構造だけが１８０゜のライ
ンターン（ｌｉｎｅ　ｔｕｒｎｓ）　として明瞭に見ら
れる。 プラスミドｐＵＲＬＥＰ６００およびｐＵＲＬＸＰ３９
０　ニよってコードされるクーマツシーブルー染色発現
産物を上部に示す（ｐＵＲ２８８は対照）。下部には、
ＥＢＶ陽性血清との反応性を示すための免疫染色後の同
じプローグを示す。 図２６は、１ＩｃＬＥＰ６００およびＵＣＡＲＧ１２３
０によってコードされる　白　の　　とそれらのＥＢＶ
″性血清に対する「応性とを、ＵＣ８を１．として示ｔ
ユ 上部：クーマソシー染色５ＤＳ−ｊＡＧＥ下部：免疫染
色ウェスタンプロット。 黒いバーはｇｐ２５０／３５０をコードする領域を示す
。 さらに、サブクローニングのために用いられた制限酵素
、スプライス部位、実施例１３および１５−１７で構築
された組変え発現プラスミドの挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）
が示しである。 Ａ、蛋白質　１）５４ 試験管内翻訳でｐ４７と同定されたがモノクローン性抗
体による免疫沈降と相関がある蛋白質５４のヌクレオチ
ド配列および誘導されるアミノ酸配列。 Ｂ、蛋白質ｐ９０ Ｃ３蛋白質ｐ１４３ Ｄ、蛋白質ｐ１５０゜ 図２９は、β−ａｌｅ：１５０融合ド白′−の光基乏示
す。 頂部に示したＴＰＴＧ誘４クローンを、溶解後、１０％
５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、蛋白質をクーマツシーブ
ルーで染色した。対照としてｐＵＲ２８８をβ−ガラク
トシダーゼのサイズを示すために用いた。すべてのクロ
ーンが対照クローンよりも大きくかつ挿入物（ｉｎｓｅ
ｒｔ）サイズに相当する新しい蛋白質を産′生ずる。 図２９に示したクローンからの同じ溶解産物をニトロセ
ルロースへ移行し、免疫染色（上部）によってＥＢＶ関
連抗原を可視化した。Ｎ末端部分をコードするクローン
は強く反応する。 図３１はＮｐ１５０コード帛域の地図である。 ｐ１５０コード領域を黒いバー７示す。サブクローニン
グのために用いられた制限部位および得られたｐＵＲ−
クローンも示しである。 晶 十１品 五疋・＝−） ＝　１−、、−、、い２１１２．、　い≧　１、イ１１
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Ｑ　　　　　　Ｍ　　　　　　ｒｑ　　　　　　ｌ’Ｑ
　　　　　　Ｍ　　　　　　ｌ’Ｑ第５図 第７図 第１０図 Ａ 第１２図 Ｐｓｔｌ／ＨｉｎｄＴＩＩ ＡＣＧＴ［Ｇ（Ａ　ＧＣＡ　［ｉ（：Ａ　ＧＣＡ　ＧＣ
Ａ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　［ｆｉＡＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　５ｔｏｐ　ｓｒ叩第１１図 第１３図 第１４図 第１６図 ”ａ　ｃａｒ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＧ
Ａ　ＴＡＡ”ＡＣＧＴＣＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣ
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−一＋−１− ｊｌｒＩＱ図 第２０図 ｏ　　　　　　　ｏ　　　　　　　ｏ　　　　　　　ｏ
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？　　　　　　−第２２図 マーカー　イνリ　　を１　　　イ多１１第ｎ図 第２５図 ■　■二　冨 ■　　　　会　０　　００ ・ｐＵＲＬＥＥＰ６００ ＝　ｐＴＪＦ？、’、ＵＸＰ３９ｑ 、ρＬＩＲ２８８ げ υ　　　　　　　　υ　　　　　　　　Ｕ　　　　　　
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　で’ａ　　　　　’ａ　　　　　’ａ　　　　　’ａ
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＋Ｃｊ’ａ　　　　　　　　’ａ　　　　　　　　’ａ
’ａ　　　　　　　　ｐＣｊ、　　　　℃　　　　　　
　で　　　　　　　て　　　　　　　で第２９図 第３０図 手続補正書（方式）６１．６．−６ 昭和　　年　　月　　日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 １、事件の表示　　　昭和６０年特許穎第１８５６６１
号３、補正をする者 事件との関係　　出願人 氏名　　　　ハンス　ヨツト　ヴオルフ４、代理人 ５、補正命令の日付　　ＭｊＪｏｇｏ′ｊ！Ｆｔｌ１２
〆Ｂ１、　明細書の図面の簡単な説明の欄の記載を次の
とおり訂正する。 ２０）　明細書の図面の簡単な説明の欄中、下記箇所の
“を示す。”を［を示す電気泳動パターンの写真である
。」とそれぞれ訂正する。 上　　申 本願について、適正な図面を提出するよう御指令を受け
ましたが、第１．５．９．１０．１１．１３．１４．１
５．２２．２３．２４．２５．２６．２９．３０図はそ
れぞれ図面では濃淡等を鮮明に描くことができませんの
で、図面に代え写真をもって提出いたします。 更に、写真を提出することによって明細書の図面の簡単
な説明の欄を訂正いたしましたので、よろしく御審査の
上受理願いたく上申に及ぶ次第です。 昭和　　年　　月　　日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 １、事件の表示　　　　昭和６０年特許願第１８５６６
１号３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 氏名　　　ハンス　ヨツト　ヴオルフ ４、代理人 明細書中下記の通り補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）図３、図１７、図２８に示すようなアミノ酸配列
   を有するＥＢＶ関連抗原蛋白質の少なくとも一部分に対
   応することを特徴とする、ＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列。 （２）蛋白質ｐ１５０、ｐ１４３、ｐ１３８、ｐ１１０
   、ｐ１０５、ｐ９０、ｐ８０Ｎｐ５４またはｇｐ２５０
   ／３５０の少なくとも一部分に対応することを特徴とす
   る、特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列。 （３）５′フランクおよび３′フランク中のそれぞれの
   調節配列を付加的に含有することを特徴とする、特許請
   求の範囲第（１）項または第（２）項記載のＤＮＡ配列
   。 （４）特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列に対
   してヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレ
   オチドの挿入、ヌクレオチド配列（ｓｔｒｅｔ−ｃｈ）
   の逆位を含む突然変異によって関連ずけられかつ特許請
   求の範囲第（１）項記載の蛋白質の少なくとも一部分を
   コードする、天然源または合成源または半合成源を含む
   いずれからの源からの、特許請求の範囲第（１）項〜第
   （３）項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列にハイブリ
   ッドするＤＮＡ配列。 （５）組換えプラスミドｐＵＣ６１３０、ｐＵＣ６３５
   、ｐＵＣＰ４００、ｐＵＣＰ３８０、ｐＵＣＰ６００、
   ｐＵＣＰ２１０、ｐＵＣＰ７５０、ｐＵＣＰ５４０、ｐ
   ＵＣＨＰ、ｐＵＣ９２４、ｐＭＦ９２４、ｐＫＫ３７８
   、ｐＵＲ６００、ｐＵＲ５４０、ｐＵＣＡＲＧ６８０ま
   たはｐＵＣＡＲＧ１１４０中に挿入されていることを特
   徴とする、特許請求の範囲第（２）項記載のＤＮＡ配列
   。 （６）組換えプラスミドｐＵＣＬＰ１．９、ｐＵＲＬＰ
   １．９、ｐＵＣ１９ＬＥＰ６００、ｐＵＣ１９ＬＸＰ３
   ９ｕ、ｐＵＲＬＸＰ３９０、ｐＵＣＡＲＧ１２３０、ｐ
   ＵＣＬＥＰ６００、ｐＵＣＬＸＰ３９０またはｐＵＲＬ
   ＥＰ６００中へ挿入されていることを特徴とする、特許
   請求の範囲第（２）項記載のＤＮＡ配列。 （７）組換えプラスミドｐＵＲ２９０ＣＸＨ５８０、ｐ
   ＵＲ２９０ＤＢＸ３２０、ｐＵＲ２９２ＤＢＢ１８０、
   ｐＵＲ２９０ＤＴＴ７００、ｐＵＲＤＴＴ７４０、ｐＵ
   Ｒ２９０ＤＴＰ６８０またはｐＵＲ２８８ＤＰＰ３２０
   中へ挿入されていることを特徴とする、特許請求の範囲
   第（２）項記載のＤＮＡ配列。 （８）単一のＥＢＶゲノムから誘導される特許請求の範
   囲第（１）項〜第（４）項のいずれか１項のＤＮＡの少
   なくとも２つの領域を読取り枠中に含有することを特徴
   とするＤＮＡ配列。 （９）異なるＥＢＶゲノムから誘導される特許請求の範
   囲第（１）項〜第（４）項のいずれか１項のＤＮＡ配列
   の少なくとも２つの領域を読取り枠中に含有することを
   特徴とする、特許請求の範囲第（８）項記載のＤＮＡ配
   列。 （１０）正しい読取り枠中に位置し、少なくとも１個の
   停止コドンがその後に続く３〜１５個のアルギニンコド
   ンをその３′末端に於て含有することを特徴とする、特
   許請求の範囲第（１）項〜第（９）項のいずれか１項に
   記載のＤＮＡ配列。 （１１）得られたポリペプチド中で配列特異性プロテア
   ーゼのための開裂部位として働くかあるいは蟻酸のよう
   な酸による酸処理によって開裂可能であるオリゴペプチ
   ドをコードするオリゴヌクレオチドをその５′末端に於
   て含有することを特徴とする、特許請求の範囲第（１）
   項〜第（６）項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。 （１２）特許請求の範囲第（１）項〜第（１１）項のい
   ずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含有することを特徴と
   する、クローニングのための組換えＤＮＡ分子。 （１３）表現調節配列に作動的に連結合された特許請求
   の範囲第（１）項〜第（１１）項のいずれか１項に記載
   のＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、表現のため
   の組換えＤＮＡ分子。 （１４）表現調節配列が大腸菌λプロモーター系、大腸
   菌ラック系（ｌａｃ−ｓｙｓｔｅｍ）、大腸菌β−ラク
   タマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ系、大腸菌リポ蛋白質プロモ
   ーター、酵母および他の真核性表現調節配列の群から選
   ばれることを特徴とする、特許請求の範囲第（１３）項
   記載の組換えＤＮＡ分子。 （１５）そのコードされた蛋白質が融合蛋白質中にその
   ３′末端へ連結されたＤＮＡ配列によってコードされた
   蛋白質を安定化するｐ１３８コードＤＮＡ配列の一部分
   を担持し、かつ第２ＤＮＡ配列の挿入後正しい読取り枠
   中のこの第２配列の３′末端に位置される少なくとも１
   個の停止コドンが後に続く３〜１５個のアルギニン残基
   をコードするＤＮＡ配列を担持するベクター、（１６）
   ｐＵＣＡＲＧ６０１である特許請求の範囲第（１５）項
   記載のベクター。 （１７）特許請求の範囲第（１２）項〜第（１４）項の
   いずれか１項に記載の少なくとも１個の組換えＤＮＡ分
   子によって形質転換されていることを特徴とする宿主。 （１８）大腸菌、他の細菌、酵母、他の真菌、動物細胞
   、ヒト細胞の株からなる群から選ばれる特許請求の範囲
   第（１７）項記載の宿主。 （１９）特許請求の範囲第（１）〜第（１１）項のいず
   れか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされること
   を特徴とする、ＥＢＶ関連疾患の診断および治療に適し
   たＥＢＶ関連抗原決定基を有する蛋白質。 （２０）特許請求の範囲第（８）項および第（９）項の
   いずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされる
   ことを特徴とする、ＥＢＶ関連疾患の診断および治療に
   適した少なくとも２個のＥＢＶ関連抗原決定基を有する
   多抗原。 （２１）特許請求の範囲第（１９）項または第（２０）
   項記載の蛋白質を含有することを特徴とする融合蛋白質
   。 （２２）特許請求の範囲第（１９）項〜第（２１）項の
   いずれか１項に記載の少なくとも１つの蛋白質を試料中
   の抗ＥＢＶ抗体と結合するのに十分な量で含有する、抗
   ＥＢＶ抗体の検出のための診断用組成物。 （２３）特許請求の範囲第（１）項〜第（１１）項のい
   ずれか１項記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列を試料中
   のＥＢＶ関連ＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの
   ために十分な量で含有する、ＥＢＶ関連疾患の検出のた
   めの診断用組成物。 （２４）ヒトに於てＥＢＶに対する抗体の産出を刺激す
   るために十分な量の、特許請求の範囲第（１９）〜第（
   ２１）項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの蛋白
   質と製剤上受容できる担体または希釈剤とを含有する製
   剤組成物。 （２５）特許請求の範囲第（２４）項記載の製剤組成物
   を免疫応答を誘導または変調するのに十分な量でヒトに
   投与することからなる、ＥＢＶ感染の予防またはＥＢＶ
   関連疾患の治療方法。