DE4013536A1

DE4013536A1 - Monoclonaler antikoerper fuer mit hhv-6 infizierte zellen und deren proteinmaterial sowie seine anwendungen

Info

Publication number: DE4013536A1
Application number: DE19904013536
Authority: DE
Inventors: Balachandran Narayanaswamy
Original assignee: University of Kansas
Current assignee: University of Kansas
Priority date: 1989-05-04
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1990-11-08
Also published as: JPH0475583A

Description

Identifizierung, Isolierung sowie die biochemische und funktionale Charakterisierung von HHV-6-Proteinen sind die Grundlage für eine rationale Analyse der Biologie von HHV-6 und für diagnostische Zwecke.

Diese Schrift liefert den ersten Bericht über die Identi fizierung der für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifi schen Proteine und Glycoproteine. Da einige dieser Pro teine auch virusinduzierte Wirtsproteine sein könnten, wurden die identifizierten Proteine als "spezifisch für mit HHV-6 infizierte Zellen" bezeichnet. Die Reaktivi täten der Blutseren der Patienten deuten in hohem Maße auf die HHV-6-Spezifität der erkannten Proteine hin. Die Kartierung der die Proteine codierenden Gene auf dem viralen Genom wird den definitiven Beweis dafür liefern, daß sie in der Tat von dem Virus codiert werden. Mit einem Genom von über 170 kb sollte HHV-6 auch etwa 70 Proteine codieren, wobei die Anzahl der in den vorlie genden Untersuchungen identifizierten Proteine offen sichtlich eine Unterbewertung des Codierungspotentials von HHV-6 darstellt.

Versuche zur Ermittlung der Kinetik der HHV-6-Protein synthese waren bisher erfolglos, was

a) auf eine langsamere Wachstumsrate von HHV-6,
b) eine nicht synchronisierte Infektion,
c) die Anwesenheit sich vermehrender nicht infizierter Zellen und
d) das Fehlen einschichtiger Zellkulturen, welche zur Unterstützung einer produktiven HHV-6-Infektion imstande sind,

zurückzuführen ist.

Experimente unter Verwendung einer höheren Multiplizität der Infektion sind im Voranschreiten.

Wie sich HHV-6 einer Identifizierung so lange Zeit ent ziehen konnte, ist faszinierend und kann nur mit seinem Lymphotrophismus, seiner Latenz, der Reaktivierungsfre quenz und den verwendeten Erkennungssystemen in Zusammen hang stehen.

Ob die Isolierung aus an AIDS oder lymphoproliferativen Erkrankungen leidenden Patienten nur auf die Reaktivie rung latenter Viren oder eine spezifische Erkrankung zu rückzuführen ist, bleibt zu untersuchen. Entsprechend müssen die Stellen, an welchen HHV-6 in vivo in der Ver borgenheit bleibt sowie die Bedingungen für seine Reak tivierung erforscht werden. Diese Untersuchungen werden durch spezifische Proben wie z. B. monoclonale Antikör per ermöglicht, welche nach vorliegender Erfindung er zeugt wurden. Die vorgestellten Ergebnisse stellen den ersten Bericht über die Identifizierung der für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifischen Proteine und Glyco proteine dar. An einer weiter in die Tiefe gehenden Charakterisierung wird gearbeitet. Voruntersuchungen erbrachten in vitro unterschiedliche Tropismen sowie eine Heterogenität in der Begrenzungsstelle unter den verschiedenen Isolaten von HHV-6⁽¹¹⁾. Ob diese Isolate unterschiedliche Stämme von HHV-6 oder genau genommen noch mit verschiedenen Viren verwandt sind, wie z. B. HSV-1 und HSV-2, muß noch untersucht werden. Monoclonale Antikörper gegen den Stamm des Prototyps GS, die ent wickelt wurden, liefern ideale Reagenzien für die Unter suchung des Stammes und/oder der Typenunterschiede zwi schen den verfügbaren Isolaten und deren Beziehungen zu ihren biologischen Charakteristika. Diese monoclonalen Antikörper sind auch für die Identifizierung neuerer Isolate von Wert bei der Überwachung der in vitro-Infek tion und der Feststellung der Anwesenheit viraler Anti gene unter verschiedenen pathologischen Bedingungen und ihrer Latenz, was in seiner Gesamtheit für ein gründ liches Verständnis der Patho-Biologie von HHV-6 unent behrlich ist.

R. C. Gallo, D. V. Ablaski und S. Z. Sallahuddin liefer ten den Stamm des Prototyps GS von HHV-6 und das Blut serum des Patienten. Die monoclonalen Antikörper 2D6, 2D5, 2D4 und 6A5G3 sind als IgG2b bezeichnet. Die mono clonalen Antikörper 7A2 und 12B3G4 sind als IgG1 und der monoclonale Antikörper 9A5D12 ist als IgG2a bezeichnet.

Alle Hybridomzellinien sind bei der University of Kansas Medical Center, School of Medicine, Department of Micro biology, Molecular Genetics and Immunology, 39th and Rainbow Blvd., Kansas City, Kansas 66 103 hinterlegt.

Folgende Hybridomzellinien sind bei dem American Type Tissue Culture (ATTC) 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 seit dem 4. Mai 1989 hinterlegt und haben folgende Kennzeichnungen:

2D6
7A2
6A5G3
9A5D12
12B3G4.

Diese monoclonalen Antikörper gegen Struktur- oder Nicht-Struktur-Proteine des menschlichen Herpes-Virus-6 (HHV-6) sowie für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifi sche Proteine sind nützlich für die Identifizierung und immunchemische Charakterisierung der verschiedenen durch HHV-6 spezifizierten Proteine. Außerdem können unter Ver wendung verschiedener immunchemischer, der Fachwelt be kannter Techniken monoclonale Antikörper zur Identifi zierung neuerer HHV-6-Isolate aus klinischen Proben ver wendet werden. Unter Verwendung verschiedener, der Fach welt bekannter immunchemischer Techniken können monoclo nale Antikörper zur Feststellung und Erkennung der An wesenheit von HHV-6-Antigenen in menschlichen Geweben und Körperflüssigkeiten verwendet werden.

Virale, Proteine codierende Gene können bequem identifi ziert werden, indem monoclonale Antikörper in Lambda- gt11-Expressionssystemen oder anderen Expressionssystemen getestet werden, welche Bruchstücke der HHV-6-DNA (Gen-Bibliotheken) oder cDNA aus mit HHV-6 infizierten Zellen (cDNA-Bibliotheken) enthalten.

Einmal identifiziert, können die Gene sequenziert und exprimiert werden, wodurch große Mengen viraler Proteine erzeugt werden. Diese Proteine können für den Test menschlicher Seren auf ihren Gehalt an Antikörpern sowie bei der Entwicklung wirksamer Impfstoffe verwendet werden.

Die monoclonalen Antikörper können für die Gewinnung von Antikörperproben verwendet werden, um den Gehalt an Anti körpern in menschlichen Seren zu bestimmen sowie auf grund ihrer Affinität zur Reinigung von Proteinen, welche umgekehrt für die Bestimmung des Gehaltes an Anti körpern in menschlichen Seren verwendet werden können. Diese monoclonalen Antikörper können auch zur Überprü fung einer Infektion in vitro verwendet werden. Zum Beispiel ist bekannt, daß dieses Virus roseola verur sacht. Es steht möglicherweise mit dem Syndrom chroni scher Ermattung in Zusammenhang.

Diese und andere Anwendungen sind für die Fachwelt offen sichtlich. Die Beispiele dienen der Erläuterung der Er findung, ohne diese auf die spezifischen Beispiele zu beschränken. Andere Ausgestaltungen und Anwendungen werden für Fachleute offensichtlich sein.

Die Erfindung wurde teilweise mit den Subventionen AI-24 224 und BR5G-S07-RR0573 des öffentlichen Gesund heitsdienstes der Vereinigten Staaten unterstützt. Somit hat die Regierung der Vereinigten Staaten bestimmte Rechte an der Erfindung.

Die Figuren zeigen im einzelnen:

Fig. 1

SDS-PAGE-Analyse der für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifischen Proteine. Nicht infizierte HSB-2-Zellen und mit HHV-6 infizierte Zellen (6 Tage nach der Infektion) wurden mit ³⁵S-Methionin (Spalten 1, 2 und 5 bis 10) oder mit ³H-Blucosamin (Spalten 3 und 4) über 20 h mar kiert. Eine SDS-PAGE-Analyse sämtlicher Zellproteine sowie der immunologisch ausgefällten Proteine wurde auf 9%igem, mit N,N′-diallyl-Weinsäurediamid versetztem Acrylamid ausgeführt. Standardmarkierungen der Molekular gewichte sind in dazu parallenen Spalten aufgeführt.

Spalte 1 und 2: Mit ³⁵S-Methionin markierte vollständige Zellauszüge nichtinfizierter und infizierter Zellen; Spalte 3 und 4: Mit ³H-Glucosamin markierte vollständige Zellauszüge nichtinfizierter und mit HHV-6 infizierter Zellen. Spalten 5 und 6: Immunausfällung nichtinfizierter und mit HHV-6 infizierter Zellen aus vorimmunisiertem Blut serum. Spalte 7 und 8: Immunausfällung nichtinfizierter und mit HHV-6 infizierter Zellen durch nicht absorbierte Kaninchen- Antikörper gegen mit HHV-6 infizierte Zellen. Spalten 9 und 10: Immunausfällung von nichtinfizierten und mit HHV-6 infizierten Zellen durch absorbierte Kaninchen- Antikörper gegen HHV-6. Pfeile und Zahlen zeigen angenäherte Molekulargewichte von Proteinen und Glycoproteinen an, welche als für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifisch erkannt wurden.

Fig. 2 Identifzierung von für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifische Proteine durch menschliches Blutserum

Nicht infizierte HSB-2-Zellen und mit HHV-6 infizierte Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin oder mit ³H-Glycosamin markiert. Die Spalten 1 und 2 zeigen die Reaktivität des Blutserums eines Patienten (N620) mit ³⁵-Mehionin mar kierten nichtinfizierten und infizierten Zellen, die Spalten 3 und 4 zeigen die Reaktivität mit mit 3H-Glu cosamin markierten nichtinfizierten und infizierten Zel len. Spalte 5 zeigt die Reaktivität des Blutserums eines Patienten mit der Wester-Fleck-Reaktion unterworfenen vollständigen Zellauszügen von nicht infizierten Zellen und Spalte 6 von mit HHV-6 infizierten Zellen. Die Spalten 7 bis 10 zeigen die Reaktivität von Blutseren von Individuen mit einem hohen Gehalt an Antikörpern gegen andere menschliche Herpesviren mit mit HHV-6 infizierten, ³⁵S-Methionin markierten Zellen. Spalten 7 und 8: Blutserum NB mit nichtinfizierten und infizierten Zel len. Spalten 9-11: Blutseren IHFLR und JJ mit HHV-6- infizierten Zellen. Pfeile zeigen das angenäherte Mole kulargewicht der für mit HHV-6 infizierte Zellen spezi fischen Proteine.

Fig. 3 Erkennung von für mit HHV-6 infizierten Zellen spezifischen Proteine durch monoclonale Antikörper

Die Immunausfällung wurde unter Verwendung nicht infi zierter und mit HHV-6 infizierter HSB-2-Zellen, markiert mit ³⁵S-Methionin, ausgeführt. Spalten 1 und 2: normales Blutserum von Mäusen mit nicht infizierten und infizierten Zellen. Spalte 3 und 4: Immunisiertes Blutserum der Maus mit nicht infizierten und infizierten Zellen. Pfeile zeigen für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifi sche Proteine an. Die Spalten 5, 7, 9, 12 und 13 zeigen die Reaktivität der monoclonalen Antikörper mit nicht infizierten und die Spalten 6, 8, 10, 11 und 14 diejenigen mit mit HHV-6 infizierten Zellen.

MAk2D6: Spalten 5 und 6
MAk7A2: Spalten 7 und 8
MAk6A5H7: Spalten 9 und 10
MAk9A5D12: Spalten 11 und 12
MAk12B3G4: Spalten 13 und 14.

Fig. 4 Erkennung von für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifischen Glycoproteinen durch monoclonale Antikörper

Mit HHV-6 infizierte Zellen, markiert mit ³H-Glocosamin wurden durch folgende monoclonale Antikörper immunolo gisch ausgefällt:

Spalte 1: MAk2D6
Spalte 2: MAk6A5H7
Spalte 3: MAk13D6
Spalte 4: MAk2D4
Spalte 5: MAk6A5G3
Spalte 6: MAk14B4
Spalte 7: MAk7A2.

Pfeile zeigen die schwach markierten zusätzlichen Glyco proteine Gp116k, Gp38k, Gp36k und Gp31k, welche durch die monoclonalen Antikörper 2D6, 13D6 und 2D4 immuno logisch ausgefällt wurden. Bei nichtinfizierten Zellen wurden keine Reaktivitäten beobachtet.

Das menschliche Herpesvirus-6 (HHV-6) ist ein neues Herpes virus, welches vor kurzem aus den Leucozyten des äußeren Blutkreislaufes von sechs Patienten, welche an lym phoproliferativen Erkrankungen und AIDS erkrankt waren ⁽¹⁴⁾ isoliert wurde. Aufgrund der elektronenmikroskopi schen Morphologie, welche ein doppelsträngiges DNA-Genom sowie eine in eine Hülle eingeschlossene ikosaedrische Kapsel aufweist, wobei der Hüllkörper einen Durch messer von 200 nm zeigt, wurden alle sechs Isolate als zur Familie der Herpetoviridae gehörend identifi ziert ^{(10, 14)}. Immunologische und molekulare Analysen haben gezeigt, daß der neue Herpesvirus von anderen menschlichen Herpesviren verschieden ist ^{(10, 14)}. Die viralen Isolate reproduzierten sich in frisch angeregten einkernigen Leukozyten im Blut aus der menschlichen Nabel schnur oder im äußeren Blutkreislauf, der Milz und im Knochenmark Erwachsener. Weil die infizierten Zellen menschliche B-Zellen waren, wurde der neue Virus anfangs als menschlicher B-lymphotropher Virus (HBLV) ^{(8, 10, 14)} bezeichnet. Später wurde entdeckt, daß eines der Isolate (Strang des Prototyps GS) eine Anzahl von lymphoplasti schen T- und B-Zellinien, Zellen megakaryocytischen und neuronalen Ursprungs, infiziert und wird nun als mensch liches Herpesvirus-6 bezeichnet ⁽²⁾.

Herpesviren sind später aus dem Lymphozyten im äußeren Blutkreislauf von AIDS-Patienten aus Uganda ⁽⁹⁾, Gambia ⁽¹⁵⁾, Elfenbeinküste ⁽³⁾, Zaire ⁽¹²⁾ sowie aus an 3-Tage-Fieber erkrankten Säuglingen und Patienten mit dem Syndrom chronischer Ermattung isoliert wurden ⁽²⁾. All diese Isolate wurden durch ihre Hybridisierung mit einer DNA-Probe von 9 kb (pZVH14) von dem Stamm des Prototyps GS als zu HHV-6 gehörig erkannt. Menschliche T-Zellen, B-Zellen und Gliazellen unterstützten das Wachstum der Stämme aus Uganda und Gambia mit einem un terschiedlichen Grad an Effektivität ^{(9, 15)}. Der HHV-6- Stamm von der Elfenbeinküste wurde bei einem Patienten isoliert, welcher sowohl mit HTLV-1 als auch mit HIV-2 infiziert war und wuchs in CD4- und CD8-positiven T-Zellen im äußeren Blutkreislauf. Das Isolat aus Zaire (Z29) infizierte vorwiegend Lymphozyten aus dem inneren Blut kreislauf mit dem Ursprung bei T-Zellen, Wachstumsver suche in anderen Zelltypen waren jedoch nicht erfolg reich ⁽¹²⁾. Die Kenntnisse von der Biologie von HHV-6, insbesondere über seine Übertragung oder die Rolle, die es bei anderen menschlichen Erkrankungen als roseola spielt, sind dürftig und neuere seroepidemeologische Studien legen nahe, daß eine HHV-6-Infektion in frühen Lebensphasen eintritt ⁽²⁾. Die DNA von HHV-6 wird auf etwa 170 Kilobasen ⁽¹¹⁾ geschätzt, und diese sollten zumindest 70 Proteine codieren. Die Analyse der HHV-6- spezifischen Proteine ist die Voraussetzung für ein rationales Verständnis der Biologie von HHV-6, seiner Rolle bei menschlichen Erkrankungen und für diagnosti sche Zwecke. Als ersten Schritt zur Erreichung dieser Ziele wurden polyclonale Antikörper von Kaninchen sowie monoclonale Antikörper gegen infizierte Zellen ent wickelt. Diese Reagenzien sowie menschliches Blutserum sind für die anfängliche Charakterisierung der für mit HHV-6 infizierten Zellen spezifischen Proteine verwendet worden und die Ergebnisse werden hier vorgestellt.

Der für die Untersuchungen verwendete Stamm des Proto typs GS von HHV-6 (HBLV) war eine Gabe von Dr. R. C. Gallo, Dr. D. V. Ablashi und Dr. S. Z. Z. Salauhuddin, NCI, NIH, USA. Suspensionskulturen des menschlichen T-Zellstammes HSB-2 (ATCC CCL 120.1, CCRF-HSB-2), ge wachsen in RPMI-Medium (Sigma), ergänzt mit Antibiotica und 10%igem hitzeinaktiviertem Serumzusatz (CPSR-1, Sigma) wurden zur Vermehrung der Viren sowie zur Her stellung von Antigenen für verschiedene Untersuchungen verwendet. Zur Infektion wurden nicht infizierte HSB-2- Zellen zentrifugiert und die Pellets in einem Medium mit 5% CPSR-1 bei einer Konzentration von 10⁶/ml suspen diert. Diese wurden mit intakten, mit HHV-6 infizierten Zellen in einem Verhältnis von 10 : 1 (nicht infiziert : infiziert) oder mit eingefrorenen und anschließend auf getauten, mit HHV-6 infizierten Zellen gemischt. Die Infektion ergab eine charakteristische Anhäufung und Zunahme von infizierten Zellen innerhalb von 4-6 Tagen nach der Infektion (PI).

Die elektronenmikroskopische Untersuchung von Dünnschnit ten infizierter Zellen zeigten große Mengen sich ent wickelnder viraler Partikel im Kern der Wirtszellen sowie vollständig umhüllte Partikel in cytoplasmavakuolen und extrazellulären Kompatimenten (Werte nicht angegeben). Der Infektionsgrad wurde gemäß anderweitig bereits hin reichend beschriebener Verfahren gemessen ^{(1, 2, 14)}.

Im wesentlichen wurden frische HSB-2-Zellen (10⁶) mit verdünnten Lösungen sowohl von Lysaten infizierter Zellen als auch der überstehenden Flüssigkeiten infiziert. Nach fünf Tagen wurden die infizierten wie nicht infi zierten Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, auf einem Deckplättchen mit kaltem Aceton fixiert in einer indirekten Immunofluoreszenz untersuchung (IFA) auf die Anwesenheit viraler Antigene untersucht, wobei eingestellte verdünnte Lösungen des Blutserums eines Patienten (N620) ^{(1, 14)} verwendet wur den. 6 Tage PI enthielten die Zelllysate annähernd 10⁴ bis 10⁶ infizierende Viren pro ml (1 : 50% die Gewebe kultur infizierende Dosis), wobei die Ausbeuten bei den überstehenden Flüssigkeiten normalerweise etwa um das 10-100fache niedriger lagen als die bei den Zelllysaten.

Wenn in mehr als 90% der infizierten Zellen virale Antigene entdeckt wurden, wurden sie für die Immunisie rung von Mäusen und Kaninchen gesammelt.

Für die Markierungsexperimente wurden die nicht infi zierten und die mit HHV-6 infizierten Zellen (6 Tage PI) einmal mit PBS gewaschen und 10⁷ Zellen über eine Zeit dauer von 20 h mit einer ³⁵S-Methionin-Lösung mit einer Radioaktivität von 25 µCi (spezifische Radioaktivität 1072 Ci/mmul, NEN DuPont) oder mit einer Lösung von ³H-Glucosamin mit einer Strahlungsaktivität von 50 µCi/ml (spezifische Aktivität 25 Ci/mmul, American Radiolaabeld Chemicals Inc. St. Louis) in DMEM (Sigma) markiert. Die Immunausfällung wurde wie oben beschrieben durchgeführt durch Solubilisation der Zellen mit RIPA- Puffer ^{(4, 5, 6, 7)} und Mischen gleicher abscheidbarer Kontrollgrößen von Trifluoressigsäure mit virusinfizier ten Lysaten mit Antikörpern und Proteinen A-agarose- Tropfen (Genzym Corp. Boston, Mass.). Die Niederschläge wurden gewaschen, durch Kochen in einem Probenpuffer isoziiert un durch SDS-PAGE auf 9%igem, mit 0,28% N, N′-diallyl-Weinsäurediamid (DATD) vernetztem Acrylamid, gefolgt von einer Fluorographie, analysiert ^{(4, 5, 6, 7)}. Gleiche Mengen an Proteinen von nicht infizierten und mit HHV-6 infizierten Zellen wurden für Western-Fleck- Analysen verwendet ⁽⁶⁾.

Beispiel 1

Eine erste Charakterisierung der für mit HHV-6 infizier te Zellen spezifischen Proteine wurde durch SDS-PAGE- Analyse vollständiger Auszüge von mit ³⁵S-Methionin und ³H-Glucosamin markierten nicht infizierten und infizierten HSB-2-Zellen (Fig. 1, Spalten 1-4) ausgeführt.

Verschiedene in infizierten Zellen vorkommende Proteine wurden auch in den nicht infizierten Zellen beobachtet, was auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, daß nur 40% der Zellen während der Dauer der Analysen viraler Antikörper exprimierten. Dies könnte außerdem darauf zurückzuführen sein, daß

a) die Abwesenheit von Wirtsproteinen durch den Virus gesperrt wird und/oder
b) die Induktion der Wirtsprotein-Synthese durch den Virus.

Wenn auch die radioaktiven Größen zwischen nicht infi zierten und mit HHV-6 infizierten Zellen (Fig. 1, Spalte 1 und 2) in diesem Experiment ungleich waren, so konnten doch über 20 mit Methionin markierte für virus infizierte Zellen spezifische Polypeptide identifiziert werden, wobei die scheinbaren Molekulargewichte der Poly peptide zwischen 180k und 31k (Tafel 1) lagen. Darunter waren die Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 180k, 135k, 110k, 105k, 90k, 82k und 41k relativ markant und das Protein mit einem Molekulargewicht von 135k wurde sogar in blaugesprenkelten Genen entdeckt (Daten nicht angeführt). Aus mit Glucosamin markierten Aus zügen wurden 8 Glucoproteine Gp135k, Gp120k, Gp116k, Gp105k, Gp95k, Gp90k, Gp82k und Gp54k identifiziert, welche spezifisch für virusinfizierte Zellen sind (Fig. 1, Spalte 3 und 4). Obwohl obige Werte nicht sehr ver schieden in bezug auf eine Störung durch Wirtsproteine sind, zeigen sie doch das Vorhandensein von Proteinen und Glycoproteinen an, welche für virusinfizierte Zellen spezifisch sind.

Beispiel 2

Hilfsweise wurden für die Erkennung der HHV-6-Proteine polyclonale Antikörper gegen infizierte Zellen aus Kaninchen dadurch vermehrt, daß Kaninchen mit Freund's Reagenz emulgierte Lysate von 10⁸ HHV-6-infizierten Zellen injiziert wurden. IgGs wurden dadurch gereinigt, daß sie über Protein-A-Agarose-Säulen Antikörper gegen HHV-6 passierten ⁽⁶⁾. Vorher immunisiertes Blutserum reagierte weder mit den Proteinen nicht infizierter noch mit denjenigen infizierter Zellen (Fig. 1, Spalte 5 und 6), im Gegenteil wurden verschiedene Polypeptide nichtinfi zierter sowie mit HHV-6 infizierter Zellen durch poly clonales HHV-6-Antiserum (Fig. 1, Spalte 7 und 8) in einer Immunreaktion ausgefällt. Solange die immunisie renden Antigene auch Wirtsproteine enthielten, war es nicht überraschend, eine Reaktivität mit nicht infizier ten Zellen festzustellen. Dennoch war es offensichtlich, daß verschiedene für virusinfizierte Zellen spezifische Proteine ebenfalls erkannt wurden (Fig. 1, Spalte 8). Zur Absorption von Antikörpern gegen Wirtszellenproteine wurden 500 µl aliquot gereinigtes IgG mit 10⁸ frischen, nicht infizierten HSB-2-Zellen gemischt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Diese Mischung wurde 30 min bei 12 000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit über 0,5- ml-Säulen von Sepharose 4B, gekoppelt mit Lysaten nicht infizierter HSB-2-Zellen, WI-38 (menschliche Fibrobla sten) RAJI (EBV-Genom positive menschlicher B-Zellen), Nierenzellen von Zwerghamstern (BHK-21) und Rinder- Albumin-Serum (BSA) gegeben. Absorbierte Antikörper gegen HHV-6 von Kaninchen zeigten nur eine sehr geringe Reaktion mit nicht infizierten Zellen (Fig. 1, Spalte 9) bei sehr geringen Reaktivitätsverlusten bei der Reaktion mit infizierten Zellen (Fig. 1, Spalte 10). In der Tat wurden verschiedene für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifische Polypeptide, wie z. B. Polypeptide mit einem annähernden Molekulargewicht von 180k besser aufgelöst, und annähernd 33 für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifische Proteine wurden identifiziert.

Die Polypeptide mit einem Molekulargewicht von ange nähert 180k, 135k, 125k, 120k, 116k, 105k, 82k, 77k, 72k, 68k, 64k, 50k, 41k sowie 33k wurden leichter er kannt, während andere Proteine erst nach längerer Be lichtungszeit des Autoradiogramms identifiziert wurden (Tafel 1). Die spezifische Reaktivität mit virusinfizier ten Zellen wurde durch die Adsorption infizierter Zellen vollständig aufgehoben.

Beispiel 3

Um die HHV-6-Spezifität der Proteine in infizierten Zellen definitiver zu identifizieren, wurde als nächstes das Blutserum eines Patienten (N620) verwendet, welches keine Reaktivität mit nicht infizierten Zellen bezüglich der Immunausfällung und Western-Fleck-Untersuchungen aufwies (Fig. 2, Spalten 1, 3 und 5). Mehr als 30 mit ³⁵S-Methionin markierte, für virusinfizierte Zellen spezifische Polypeptide wurden durch das Blutserum des Patienten immunologisch ausgefällt (Fig. 2, Spalte 2), wobei Polypeptide mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 180k, 135k, 120k, 116k, 105k, 102k, 95k, 82k, 74k, 64k, 54k, 41k, 38k und 33k sehr leicht entdeckt wurden. Aus mit ³H-Glucosamin markierten, mit HHV-6 infizierten Zellen wurden 7 Glycoproteine, Gp135k, Gp116k, Gp105k, Gp95k, Gp82k, Gp64k und Gp54k in einer Immunreaktion ausgefällt (Fig. 2, Spalte 4). Nach verlängerter Be lichtungszeit wurden außerdem ein zusätzliches Glyco protein (Gp38k) identifiziert. Diese Experimente iden tifizierten weiterhin für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifische Proteine und zeigten, daß HHV-6 genau wie andere Herpesviren ⁽¹³⁾ verschiedene Glycoproteine codiert. Das Blutserum des Patienten erkannte in Western-Fleck-Untersuchungen mehr als 20 Proteine aus HHV-6 infizierten Zellen (Fig. 2, Spalte 6). Die höhere Reaktivität mit Proteinen in einem Bereich von 120k bis 105k zeigte die Anwesenheit größerer immunogener Deter minanten in diesen Proteinen an. Verschiedene andere Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 105k, 102k, 95k, 90k, 82k, 77k, 74k, 64k, 60k, 58k, 54k, 50k, 48k und 38k wurden ebenfalls erkannt, wobei das 135k- Protein, welches in Immunfällungsreaktionen eindeutig identifiziert wurde, kaum nachzuweisen war. Die gerin gere Reaktivität bei den Western-Fleck-Reaktionen könnte auf die Verwendung einer höheren Verdünnung des Blut serums des Patienten (1 : 500) zurückzuführen sein, wobei gerade diese geringere Reaktivität zeigt, daß die erkannten Proteine für HHV-6 infizierte Zellen spezi fisch sind.

Das Serum des Patienten enthielt außerdem Antikörper gegen andere menschliche Herpesviren ⁽¹⁴⁾ und erkannte verschiedene Proteine von mit HSV-1, HSV-2, CMV oder EBV infizierten Zellen in Western-Fleck-Reaktionen (Daten nicht angegeben). Seit sich überkreuzende reaktive Anti gen-Determinanten zwischen dieser vier Viren ⁽⁶⁾ nachge wiesen worden waren, bestand die Möglichkeit, daß die Reaktivität mit mit HHV-6 infizierten Zellen auf sich überkreuzend reaktive Antikörper zurückzuführen war. Wegen der begrenzten Menge an Serum von dem Patienten wurde die Adsorption von mit anderen menschlichen Herpes viren infizierten Zellen nicht durchgeführt. Als alternativer Zugang dazu wurden Seren normaler Indi viduen mit vergleichbarem oder höherem Gehalt an Anti körpern gegen andere Herpes-Viren getestet. Die Seren NB und IHF wiesen einen hohen Gehalt an Antikörpern gegen CMV (1 : 10 240) auf, die Seren LR und JJ einen hohen Gehalt an Antikörpern gegen HSV-1 und HSV-2 (1 : 10 240), während der Gehalt des Serums an EBV-Antikörpern bei über 1 : 160 lag. Bei der IF-Untersuchung an mit HHV-6 infizierten Zellen zeigten alle vier Seren selbst bei einer Verdünnung 1 : 10 eine relativ geringe Fluores zenz. Keines dieser Seren reagierte mit nicht infizier ten Zellen. Die Reaktivität eines dieser Seren wird in Fig. 1, Spalte 7, dargestellt. Im Gegensatz zu dem Serum eines Patienten fällt in allen normalen Seren in einer Immunreaktion ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 135k aus mit HHV-6 infizierten Zellen aus (Fig. 3, Spalten 8-11) und bei längerer Belichtungsdauer zeigten sich schwach markierte Polypep tide mit einem Molekulargewicht von 95k bzw. 82k.

In den Western-Fleck-Reaktionen erkannten diese Seren unter den dabei herrschenden Versuchsbedingungen selbst bei einer Verdünnung von 1 : 50 keines der HHV-6-spezifi schen Proteine und das 135k-Proteine war kaum nachweis bar (Daten nicht angegeben). Eine höhere Reaktivität mit dem 135k-Protein könnten die Folge einer HHV-6-Infektion in der Vergangenheit sein oder sie könnte auf die sich überkreuzende Reaktivität mit Antigen-Determinanten anderer Herpesviren zurückzuführen sein. Da normale Blutseren in ihrer Reaktivität mit HHV-6-Proteinen be grenzt waren, kann daraus abgeleitet werden, daß die in dem Blutserum des Patienten entdeckte spezifische Reak tivität gegen HHV-6 auf spezifische Antikörper zurückzu führen ist. Die Daten legen außerdem eine sich minimal überkreuzende Reaktivität der Antigene zwischen HHV-6 und anderen menschlichen Herpesviren nahe.

Beispiel 4

Es wurden monoclonale Antikörper für die Identifizierung individueller, für virusinfizierte Zellen spezifische Proteine erzeugt. 4-6 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden durch wöchentlich drei intraperitoniale Injektion von 3 × 10⁷ infizierten Zellen immunifiziert. Das vorimmuni fizierte Blutserum reagierte mit keinem der Proteine (Fig. 3, Spalte 1 und 2), im Gegenteil fällte das Blut serum von einer immunisierten Maus in einer Immunreak tion verschiedene Proteine nichtinfizierter und mit HHV-6 infizierter Zellen aus (Fig. 3, Spalten 3 und 4).

Die Proteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 180k, 135k, 116k, 110k, 105k, 102k, 95k, 90k, 82k und 41k waren für mit HHV-6 infizierte Zellen spezifisch, und diese Reaktivität verringerte sich auch nach Adsorption des Blutserums mit nicht infizierten Zellen nicht (Werte nicht angegeben). Die Zellen aus der Milz dieser Maus wurden nach anderweitig hinreichend be schriebenen Verfahren ^{(4, 7)} mit Sp2/0Ag.14-Myelomzellen verschmolzen. Verschiedene HHV-6-spezifische Antikörper absondernde Hybridomzellen wurden zu Beginn aufgrund ihrer spezifischen Reaktivität mit HHV-6-infizierten Zel len in den Blutseren ELISA und IFA ausgesondert. Kultur überschüsse dieser Klone wurden als nächstes für Immun fällungsreaktionen mit mit ³⁵S-Methionin-markierten nichtinfizierten und infizierten Zellen verwendet und diejenigen Hybridomclone, welche für HHV-6-spezifische Peptide in einer Immunreaktion ausfällten, wurden zwei mal geclont und erneut separiert.

Keiner der monoclonalen Antikörper fällte nachweisbar Polypeptide nichtinfizierter Zellen aus (Fig. 3, Spalten 5, 7, 9, 12 und 13). Jedoch fällte jeder Antikörper ein oder mehrere mit ³⁵S-Methionin markierte Polypeptide mit HHV-6-infizierter Zellen (Fig. 3, Spalten 6, 8, 10, 11 und 14). Im einzelnen unterschiedliche Immunfällungs muster wurden durch diese monoclonalen Antikörper erhalten, was anzeigte, daß die Antikörper unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Zwei Polypeptide, ein breit wan derndes Polypeptid mit einem scheinbaren Molekularge wicht von 82k sowie ein verstreutes 105k-Polypeptid wurden in einer Immunreaktion durch einen monoclonalen Anti körper 2D6 (Fig. 3, Spalte 6) ausgefällt. Eine längere Belichtungszeit des Autoradiogramms zeigte außerdem ver schiedene schwach markierte Polypeptide mit einem ange näherten Molekulargewicht von 116k, 72k, 38k, 36k und 31k.

Der monoclonale Antikörper 7A2 reagierte mit einem mar kanten Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 102k und einem schwach markierten Polypeptid mit einem Mole kulargewicht von 74k (Fig. 3, Spalte 8).

Drei stark markierte Polypeptide mit angenäherten Moleku largewichten von 116k, 64k und 54k sowie verschiedene schwach markierte Polypeptide mit Molekulargewichten von 105k, 60k und 45k wurden in einer Immunreaktion durch den monoclonalen Antikörper 6A5H7 ausgefällt (Fig. 3, Spalte 10).

Der monoclonale Antikörper 9A5D12 fällte in einer Immun reaktion Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 110k bzw. 41k aus (Fig. 3, Spalte 11), während ein einzelnes Polypeptid mit einem angenäherten Molekulargewicht von 135k durch den Antikörper 12B3G4 erkannt wurde (Fig. 3, Spalte 14). Überkreuz geführte Absorptionsexperimente zeigten, daß die erkannten Proteine einzelne Antigene darstellten und daß all diese monoclonalen Antikörper in ihrer Reaktion mit virusinfizierten Zellen sehr spezi fisch waren.

Da die HHV-6-spezifischen Antikörper absondernden Hybridomzellen zweimal geclont wurden, ist es unwahr scheinlich, daß die Ausfällung mehrerer Peptide auf eine polyclonale Natur der Antikörper zurückzuführen ist, sondern dies ist höchstwahrscheinlich auf die Zwischen stufe-Produkt-Beziehungen oder die geteilten Determinanten sowie/oder die Ausfällung von Proteinen als Komplexe zurückzuführen.

Bei der Untersuchung von mit ³H-Glucosamin markierten Auszügen fällten die monoclonalen Antikörper in einer Immunreaktion verschiedene Glycoproteine aus (Fig. 4, Spalten 1 bis 7), jedoch reagierte keiner von ihnen mit Kontrollzellen (Daten nicht angegeben). Die Antikörper 2D6, 13D6 und 2D4 reagierten mit zwei breit wandernden Glycoproteinen Gp105k und Gp82k (Fig. 4, Spalten 1, 3 und 4). Zusätzlich fällten diese Antikörper noch die schwach markierten Glycoproteine Gp116k, Gp38k, Gp36k und Gp31k (Fig. 4, Pfeile) in einer Immunreaktion aus, welche Zwischenprodukte und/oder Spaltprodukte darstellen könnten.

Die Antikörper 6A5H7, 6A5G3 und 14B3 fällten in einer Immunreaktion 3 Glycoproteine Gp116k, Gp64k und Gp54k aus (Fig. 4, Spalte 2, 5 und 6).

Der monoclonale Antikörper 7A2 fällte in einer Immun reaktion das Glycoprotein Gp102k sowie schwach markierte Glycoproteine mit angenäherten Molekulargewichten in der Größenordnung zwischen 72k bis 105k aus (Fig. 4, Spalte 7).

Die Antikörper 9A5D12 und 12B3G4 reagierten mit keinem der Glycoproteine mit HHV-6-infizierter Zellen.

Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein dreier Glyco proteine verschiedener Spezifitäten in mit HHV-6-infi zierten Zellen und weitere Studien über Wirkungsweise und Synthese dieser Proteine, Festlegung der viralen Organisation und die Neutralisationsmöglichkeiten dieser Antikörper schreiten laufend voran.

Tafel 1

Proteine spezifisch für HHV-6 infizierten Zellen

Claims

1. Eine Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für mit HHV-6 infizierte Zellen, HHV-6-Proteine oder -Polypeptide oder HHV-6-Glyco proteine spezifische monoclonale Antikörper zu erzeugen.

2. Eine Hybridonzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für glycosilierte Polypeptide aus der Gruppe Glycoproteine HHV-6 infizierter Zellen mit einem Molekulargewicht von annähernd 82 000; 105 000; 116 000; 72 000; 38 000; 36 000 und 31 000 Dalton spezifischer Antikörper zu erzeugen.

3. Eine Hybridomzellinie nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die monoclonalen Antikörper 2D6; 13D6 und 2D4 erzeugt.

4. Eine Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für Polypeptide von mit HHV-6 infi zierten Zellen mit einem Molekulargewicht von 102 000 und 74 000 Dalton sowie für HHV-6-Glyco proteine mit einem Molekulargewicht von 72 000 und 105 000 Dalton spezifische Antikörper zu erzeugen.

5. Eine Hybridomzellinie nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie den monoclonalen Antikörper 7A2 erzeugt.

6. Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für Polypeptide von mit HHV-6 infizierten Zellen, welche ein Molekulargewicht von 116 000; 64 000; 54 000; 105 000; 60 000 und 45 000 Dalton aufweisen, sowie für HHV-6-Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von 116 000; 64 000 und 54 000 Dalton spezifische Antikörper zu erzeugen.

7. Hybridomzellinie nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß sie die monoclonalen Antikörper 6A5H7 und 6A5G3 erzeugt.

8. Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für Polypeptide von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht von 110 000 und 41 000 Dalton spezifische Antikörper zu erzeugen.

9. Hybridomzellinie nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß sie den monoclonalen Antikörper 9A5D12 erzeugt.

10. Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, für Polypeptide von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht von 135 000 Dalton spezifische monoclonale Antikörper zu erzeugen.

11. Hybridomzellinie nach Anspruch 10, dadurch gekenn zeichnet, daß sie den monoclonalen Antikörper 12B3G4 erzeugt.

12. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er in der Lage ist, mit HHV-6-infizierten Zellen, HHV-6-Proteinen bzw. -Polypeptiden oder HHV-6-Glyco proteinen zu reagieren.

13. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er aus der die monoclonalen Antikörper 2D6, 7A2, 6A5G3, 6A5H7, 9A5D12, 12B3E4, 13D6 und 2D4 enthaltenden Gruppe von monoclonalen Antikörpern ausgewählt ist.

14. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ist für HHV-6-infizierte Zellen oder proteinhaltiges Material davon und daß er aus der die monoclonalen Antikörper 2E6, 7A2, 6A5G3, 6A5H7, 9A5D12, 12B3G4, 13D6 und 2D4 umfassenden Gruppe monoclonaler Antikörper ausgewählt ist.

15. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er für Proteine von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung zwischen 31 000 bis 135 000 Dalton spezifisch ist.

16. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er für Proteine von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht von 116 000; 110 000; 105 000; 102 000; 82 000; 74 000; 72 000; 64 000; 60 000; 54 000; 45 000; 41 000; 38 000; 36 000 und 31 000 Dalton spezifisch ist.

17. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er für Glycoproteine von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung zwischen 31 000 bis 116 000 Dalton spezifisch ist.

18. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er für Glycoproteine von mit HHV-6 infizierten Zellen mit einem Molekulargewicht von 31 000; 36 000; 38 000; 54 000; 64 000; 82 000; 105 000 und 116 000 Dalton spezifisch ist.

19. Verfahren zur Feststellung spezifischer mit HHV-6 in fizierter Zellen oder deren Polypeptiden oder Glyco proteinen in einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe menschlichen Gewebes oder mensch licher Körperflüssigkeit von jenem Patienten mit einem oder mehreren monoclonalen Antikörpern, welche aus der die monoclonalen Antikörper 2D6, 7A2, 6A5H7, 6A5G3, 9A5D12, 12B3G4, 13D6, 2D4 ausgewählt sind, in Kontakt gebracht wird und eine positive Immunreaktion entdeckt wird.