CN113121656B - EBV包膜糖蛋白gp350抗原表位及其单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种EBV包膜糖蛋白gp350抗原表位及其单克隆抗体。其中所述抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO：12所示。所述的单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1‑3和轻链可变区的VLCDR1‑3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：5‑7所示，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：8‑10所示。本发明获得单克隆抗体的特异性良好，为后续的开发治疗性抗体或研制EBV相关疫苗奠定了基础。

Description

EBV包膜糖蛋白gp350抗原表位及其单克隆抗体
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及EBV预防和治疗，更具体涉及EBV的抗原表位及其制备的抗体。
背景技术
EBV是Epstein和Barr于1964年在研究非洲儿童恶性淋巴瘤时发现，是一种具有致癌性的双链DNA病毒，属于疱疹病毒γ家族（OGEMBO J G, MURASWKI M R, MCGINNES L W,et al. A chimeric EBV gp350/220-based VLP replicates the virion B-cellattachment mechanism and elicits long-lasting neutralizing antibodies in mice[J]. Journal of translational medicine, 2015, 13(1): 50.）。人是EB病毒感染的主要宿主，而呼吸道是EB病毒潜伏的最主要场所，其主要通过口腔唾液、输血传播。EBV原发性感染常发生在儿童早期，通常无症状或引起轻微症状，可在机体内建立终生潜伏感染状态从而导致EBV相关疾病的发生。据统计，有30%~40%青少年和成年人在初次感染后发展为传染性单核细胞增多症（infection mononucleosis，IM）的淋巴增生性综合征。根据美国健康组织的报告，每年至少发现125 000例IM新病例，每年有将近200 000例新的EBV相关恶性肿瘤病例和140 000例与EBV恶性肿瘤相关的死亡病例（COHEN J I, MOCARSKI E S, RAAB-TRAUB N, et al. The need and challenges for development of an Epstein-Barrvirus vaccine [J]. Vaccine, 2013, 31( S2): B194-B196.）。由此可知，EBV是一种对人类产生严重危害的人类疱疹病毒（SZAKONYI G, KLEIN M G, HANNAN J P, et al.Structure of the Epstein-Barr virus major envelope glycoprotein [J]. Naturestructural & molecular biology, 2006, 13(11): 996-1001）。
目前，EB病毒感染主要为对症治疗，但对临床症状的改善并无明显作用，因此防治和治疗EBV最具前景的途径之一是开发EBV相关疫苗（WEISS E R, ALTER G, OGEMBO J G,et al. High Epstein-Barr virus load and genomic diversity are associated withgeneration of gp350-Specific neutralizing antibodies following acuteinfectious mononucleosis [J]. Journal of virology, 2017, 91(1): JVI.01562-16.）。对于预防性疫苗，总体开展研究不多，重视程度不够，暂时没有商业化的疫苗可以预防EBV相关的疾病（RUISS R, JOCHUM S, WANNER G, et al. A virus-like particle-based Epstein-Barr virus vaccine [J]. Journal of virology, 2011, 85(24):13105-13113.；CORREIA S, PALSER A, ELGUETA KARSTEGL C, et al. Naturalvariation of Epstein-Barr virus genes, proteins, and primary microRNA [J].Journal of virology, 2017, 91(15): JVI.00375-17）。因此亟需一种安全有效的相关疫苗来预防EBV的感染及治疗EBV相关性疾病。
EBV感染期表达的包膜糖蛋白gp350是EBV表面最丰富的包膜糖蛋白，约占EBVⅠ型和Ⅱ型中膜蛋白总量97%（MORGAN A J. Epstein-Barr virus vaccines [J]. Vaccine,1992, 10(9): 563-571.；TANNER J E, COINCON M, LEBLOND V, et al. Peptidesdesigned to spatially depict the Epstein-Barr virus major virion glycoproteingp350 neutralization epitope elicit antibodies that block virus-neutralizingantibody 72A1 interaction with the native gp350 molecule [J]. Journal ofvirology, 2015, 89(9): 4932-4941.）。其由907个氨基酸残基组成，其中属于胞外域的第147~165氨基酸残基是最有可能与CD21相互作用的表位（SITOMPUL L S, WIDODO N, DJATIM S, et al. Epitope mapping of gp350/220 conserved domain of epstein barrvirus to develop nasopharyngeal carcinoma (npc) vaccine [J]. Bioinformation,2012, 8(10): 479-482）。有研究表明，gp350蛋白通过附着在B细胞表面的CD21抗原受体上，介导EBV进入B细胞，是病毒吸附宿主细胞的重要蛋白（CUI X, CAO Z, SEN G, et al.A novel tetrameric gp350 1-470 as a potential Epstein-Barr virus vaccine [J].Vaccine, 2013, 31(30): 3039-3045.），是自然感染后免疫系统的靶标（LIN M C, LIN YC, CHEN S T, et al. Therapeutic vaccine targeting Epstein-Barr virus latentprotein, LMP1, suppresses LMP1-expressing tumor growth and metastasis in vivo[J]. BMC cancer, 2017, 17(1): 18.），是诱导宿主产生中和抗体的主要靶点（SZAKONYIG, KLEIN M G, HANNAN J P, et al. Structure of the Epstein-Barr virus majorenvelope glycoprotein [J]. Nature structural & molecular biology, 2006, 13(11): 996-1001.），是预防EBV感染的首要靶标（VAN ZYL D G, MAUTNER J, DELECLUSE HJ. Progress in EBV Vaccines [J]. Frontiers in oncology, 2019, 9: 104）。
亦有相关研究报道，gp350被确认为是细胞毒性和抗病毒免疫监测的主要靶抗原（OGEMBO J G, MURASWKI M R, MCGINNES L W, et al. A chimeric EBV gp350/220-based VLP replicates the virion B-cell attachment mechanism and elicits long-lasting neutralizing antibodies in mice [J]. Journal of translationalmedicine, 2015, 13(1): 50）。也有报道用gp350糖蛋白进行免疫可以在动物模型中对EBV诱导的淋巴瘤疾病提供保护作用。Gu等研究学者第一次临床试验的结果显示，gp350的疫苗接种可在接种受试者体内表现出免疫原性，并在体内产生中和抗体（GU S Y, HUANG T M,RUAN L, et al. First EBV vaccine trial in humans using recombinant vacciniavirus expressing the major membrane antigen [J]. Developments in biologicalstandardization, 1995, 84: 171-177.）。Moutschen等在CHO细胞中表达的可溶性gp350重组蛋白，在I/II期临床实验中接种疫苗的健康志愿者中可诱导中和抗体的产生；此外，在181例EBV血清阴性、健康的成年人中进行的II期临床试验结果显示，大多数受检者的血清能检测到EBV中和抗体，并且该疫苗对于预防EBV相关传染性单核细胞增多症的发展具有明显的效果（SOKAL E M, HOPPENBROUWERS K, VANDERMEULEN C, et al. Recombinantgp350 vaccine for infectious mononucleosis: a phase 2, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate the safety, immunogenicity, andefficacy of an Epstein-Barr virus vaccine in healthy young adults [J]. TheJournal of infectious diseases, 2007, 196(12): 1749-1753.；MOUTSCHEN M,LEONARD P, SOKAL E M, et al. Phase I/II studies to evaluate safety andimmunogenicity of a recombinant gp350 Epstein-Barr virus vaccine in healthyadults [J]. Vaccine, 2007, 25(24): 4697-4705）。Sashihara等研究学者在恒河猴EBV动物模型中，发现EBV gp350可保护动物免受感染，并降低感染后的EB病毒载量（SASHIHARAJ, HOSHINO Y, BOWMAN J J, et al. Soluble rhesus lymphocryptovirus gp350protects against infection and reduces viral loads in animals that becomeinfected with virus after challenge [J]. PLoS pathogens, 2011, 7(10):e1002308）。所有进入了测试的疫苗都被证明具有中度免疫原性，且已经证实了一种来自gp350蛋白的EBV疫苗的二期试验可以降低IM的发生率，但并没有降低病毒感染率（MOUTSCHEN M, LEONARD P, SOKAL E M, et al. Phase I/II studies to evaluatesafety and immunogenicity of a recombinant gp350 Epstein-Barr virus vaccinein healthy adults [J]. Vaccine, 2007, 25(24): 4697-4705.）。尽管疫苗的有效性仍存在争议，但是其在EBV疫苗研究领域所起的推进作用毋庸置疑。EBV gp350疫苗的受试者中可检测到血清中抗gp350抗体，相关研究表明 gp350糖蛋白是一种有前景的抗EBV感染和EBV相关疾病的疫苗抗原。
发明内容
虽然现有技术对EBV gp350糖蛋白作为抗原有所认识，但尚没有解析所有的中和抗体表位和制备得到各表位相应的有效的中和单克隆抗体，限制了后续疫苗抗原的研发与疫苗效果的评估，因而对于EBV感染还没有较好的特效疗法。对此,本发明人进行了深入的研究，选取了其N端的306个氨基酸（15~320）作为研究对象，通过原核表达的方式制备了大量EBV gp350 15-320aa N端重组蛋白，经小鼠免疫并通过杂交瘤技术获得特异性好的鼠单克隆抗体，并筛选到一个新的中和单克隆抗体，尽管原来对N端的表位有所研究，但其并没有预测到发明具体的位置和其是中和表位。而要发明深入研究和结果而发现精确的中和表位而获得了对应的抗体，其效果显著，为后续的开发治疗性抗体或研制EBV相关疫苗奠定了基础。
第一方面，本发明首先提供一种EBV包膜糖蛋白gp350抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列为如SEQ ID NO：12 所示。进一步的，本发明提供一种EBV包膜糖蛋白gp350抗原多肽，其特征在于，其含有以如SEQ ID NO：12 所示氨基酸序列为抗原表位。更进一步的，本发明提供编码所述的抗原多肽的核苷酸序列。
本发明人通过制备了大量EBV gp350 15-320aa N端重组蛋白，经小鼠免疫并通过杂交瘤技术获得特异性好的鼠单克隆抗体，然后研究并鉴定出gp350蛋白的第62-81位氨基酸序列构成有效的抗原表位。
第二方面，本发明提供基于上述所述抗原表位，或含有该抗原表位的抗原多肽所获得的抗体。优选地，所述的抗体为单克隆抗体。
更具体地，所述单克隆抗体，其包含重链可变区的 VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，和轻链可变区的 VLCDR1、VLCDR2及 VLCDR3，其中所述 VHCDR1、VHCDR2 和 VHCDR3 的氨基酸序列分别如 SEQ ID NOs：5-7 所示，所述 VLCDR1、VLCDR2 和 VLCDR3 的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：8-10所示。更进一步地，所述单克隆抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
第三方面，本发明上述的抗体用于检测EBV的制剂中的应用。其可以用于检测待测样品是否含有EBV，或待测者是否携带或感染EBV。对于后者，其检测样品可以来自待测者的体液，血液等。
进一步地，本发明上述的抗体在制备预防或治疗EBV的制剂中的应用。其可制备成合适的剂型，含有任何合适的辅料。此外，也可与其他预防EBV的试剂联合使用。
本发明通过深入研究，首次鉴定和发现gp350蛋白的第62-81位氨基酸序列构成有效的抗原表位。并通过翔实的实验表明，本发明获得的抗gp350单克隆抗体在Westernblot、细胞免疫荧光检测中证实，具有良好的免疫反应性以及特异性。用抗体捕获病毒实验和中和实验等方法对抗体进行鉴定，发现其具有较好的病毒结合能力和中和能力。同时，对抗gp35015-320aa单克隆抗体的抗原表位以及VH和VL基因序列进行了分析。所有这些结果的获得，为嵌合抗体的构建、表达奠定了基础，也为后续以gp350蛋白为基础的疫苗研发奠定了实验基础。
附图说明
图1∶PCR扩增gp350基因截短片段与重组质粒酶切鉴定。
其中，A：PCR扩增gp350基因截短片段，lane M：DNA的相对分子质量；lame 1：gp35015-320aa PCR产物；lame 2：阴性对照。B：重组质粒酶切鉴定，lane M：DNA的相对分子质量；lane1：重组质粒pET-32a-gp35015-320aa经Bgl II/Not I双酶切后的产物；lane 2：重组质粒pET-32a-gp35015-320aa。
图2 重组gp35015-320aa 蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化。
其中，（a）SDS-PAGE鉴定重组gp35015-320aa的表达。lane M：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1：未加IPTG诱导菌株所表达的gp35015-320aa蛋白；lane 2：加入IPTG诱导的重组菌株表达的gp35015-320aa蛋白；lane 3：菌体超声离心后悬液；lane 4：菌体超声离心后上清；lane 5：菌体超声离心后沉淀；lane 6：4 M尿素溶解蛋白后上清；lane 7：4 M尿素溶解蛋白后沉淀；（b）、（c）分别为SDS-PAGE与Western blot鉴定重组蛋白。lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：RosettagamiB（DE3）表达菌株里gp35015-320aa诱导前；lane 2：RosettagamiB（DE3）表达菌株里gp35015-320aa诱导后；（d）、（e）分别为SDS-PAGE与Westernblot鉴定纯化后重组蛋白纯度。lane M：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1：阴性对照；lane 2：纯化后gp35015-320aa蛋白。
图3 免疫小鼠血清抗体滴度的检测。
图4 单克隆抗体的纯化和鉴定。
其中，（a）SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体。lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：未煮沸的腹水；lane 2：煮沸的腹水；lane 3：未煮沸纯化后的抗体；lane 4：煮沸纯化后的抗体；（b）SDS-PAGE图；（c）Western blot鉴定4E1；（d）Western blot阴性对照。
图5 抗体4E1的细胞反应性的鉴定。
其中，（a）EBV感染细胞荧光下观察到的结果，免疫反应一抗为4E1；（b）EBV感染细胞荧光下观察到的结果，阴性对照（不加一抗）；（c）EBV感染细胞白光下观察的结果，免疫反应一抗为4E1；（d）EBV感染细胞白光下观察的结果，阴性对照（不加一抗）。
图6 抗体对病毒捕获能力的评估。其中lane M：DNA marker；lane 1：没有包被抗体对照组；lane 2：没有加EBV感染细胞对照组样品；lane 3：阴性对照；lane 4：阳性对照；lane 5：4E1实验组样品；lane 6：4E1实验组样品；
图7 4E1抗体阻断病毒能力的评估。其中A：4E1 抗体1∶10稀释；B：4E1 抗体1∶100稀释；C：4E1 抗体1∶1 000稀释；D：未加 4E1 抗体组（ *，与未加抗体处理D组比较，P<0.05）；
图8 4E1抗体病毒中和能力的评估。其中A：4E1抗体1∶10稀释；B：4E1抗体1∶100稀释；C：4E1抗体1∶1 000稀释；D：未加4E1抗体组（ *，与未加抗体处理D组比较，P<0.05）；
图9. 合成肽表位作图鉴定4E1单抗表位，图中，表格为ELISA结果，下图为Bio-DotSF上slot dot 的实验结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
1、EBV gp350原核表达质粒的构建与鉴定
使用DNAStar软件分析EBV gp350亲水性和抗原性特征，选取gp350基因第15~320个氨基酸所在的优势表位区段作为免疫靶向片段。
设计目的片段的特异性引物，从B95-8细胞提取EBV基因组DNA为模板，PCR获取gp350截短基因片段，截短的gp350基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，在1000 bp处有一条特异性的条带（图1A lane 1），条带大小与预期结果一致，而阴性对照中无此条带（图1A lane 2），初步确定PCR产物是目的片段。将酶切胶回收后的目的片段与质粒pET-32连接，构建重组质粒，双酶切（Not I和Bgl II）鉴定重组表达质粒pET-32a-gp35015 -320aa，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶上分别可见1 000bp处的条带及5 900bp的载体片段（图1B lane 1），分子量大小与预期结果相符，重组质粒测序结果显示PCR扩增的基因序列与EBV gp350 15-320aa基因序列一致。
2、重组蛋白EBV gp350蛋白的诱导表达与纯化
将测序鉴定正确的pET-32a-gp35015-320aa重组质粒转化至RosettagamiB（DE3）表达菌株中，挑取阳性菌株克隆于LB液体培养基中活化过夜，并按照1∶100接种至500 mL/瓶的LB液体培养基中大量表达，37℃，250 r/min培养至OD600为0.6~0.8时，加入终浓度为200ng/mL IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷）于25℃，180 r/min进行诱导培养（摸索最佳浓度IPTG、最佳诱导时间和温度的诱导条件，诱导后高速离心收集菌体并超声破碎），25℃诱导蛋白表达6 h后高速离心收集菌体并超声破碎，收集沉淀。用2%的TritonX-100（buffer I）、buffer I、2 M Urea/buffer I洗涤包涵体，然后用4 M尿素重悬沉淀，离心收集上清。在变性条件下经Ni-TED亲和层析柱纯化重组蛋白，低温条件下梯度透析复性蛋白，收集gp35015-320aa重组蛋白。经SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfonatepolyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Westernblot分析和鉴定。
结果显示，与诱导前相比诱导后 RosettagamiB（DE3）菌株中表达相对分子质量约为50 kDa蛋白，其分子量的大小与预期相符（图2a~2c lane 2）。超声破碎菌体，SDS-PAGE结果显示目的蛋白主要表达在包涵体（图2a lane 5）。经包涵体洗涤、Ni-TED亲和层析纯化，并用SDS-PAGE（图2d）及Western blot（图2e）鉴定，结果显示：纯化后的蛋白达到了电泳程度，可用于免疫小鼠制备单克隆抗体。
3、Balb/c小鼠的免疫及检测
将纯化的重组蛋白与佐剂等体积混合乳化，对6~8周龄Balb/c雄性小鼠采用皮下多点注射方法进行免疫，每只小鼠免疫的蛋白量约100 μg。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫改用弗氏不完全佐剂，每隔14 d免疫1次，共免疫４次。将蛋白直接进行腹腔追加免疫。终免3 d后进行细胞融合。每次免疫前1 d对小鼠进行眼眶静脉取血，分离血清后采用间接ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）法检测血清中抗体效价及重组抗原的特异性。
以纯化后的gp35015-320aa蛋白作为抗原免疫小鼠，使用间接ELISA法检测血清中抗体滴度，结果显示：小鼠在四次免疫中血清抗体滴度成梯度增长，效价可达1∶400 000（图3），说明重组gp35015-320aa蛋白具有良好的免疫性，第四次免疫后血清效价达到制备单克隆抗体的要求。
取免疫完成后小鼠脾细胞与对数生长期的SP2/6细胞按5∶1~10∶1的比例混合，并逐滴缓慢加入37℃事先预热的PEG-1 500（聚乙二醇）进行融合，1 min内加完。37℃水浴静置90 s，然后在3 min内逐滴加入无血清DMEM培养基终止PEG融合。计数后，用含HAT和20%胎牛血清的DMEM培养基接种到96孔细胞培养板中，放置于37℃，5%CO2细胞恒温培养箱中培养。
培养箱中培养7~8 d，再经PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤后换成HT培养基继续培养，培养3 d后取细胞上清使用间接ELISA筛选阳性克隆孔，对阳性克隆孔进行亚克隆。对克隆后检测为阳性的单克隆细胞株通过有限稀释法进行3~4次亚克隆纯化，并且每一轮亚克隆都需要检测抗体分泌情况，最终将获得稳定分泌抗体单克隆细胞株逐步扩大培养并及时冻存。
取8~10周龄的雄性Balb/c小鼠，给小鼠腹腔按500 μL/只的剂量注射灭菌液体石蜡油使其致敏。7 d后给每只鼠的腹腔接种500 μL细胞数为1×106~2×106个/mL的杂交瘤细胞株。小鼠出现腹部肿胀、消瘦、呼吸急促、活动减少等体征时，开始收集腹水。腹水经4℃ 2000 g 30 min离心留取上清。并通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein G进行纯化，经SDS-PAGE电泳鉴定纯度及BCA法测定浓度。
将纯化的重组蛋白gp35015-320aa免疫BALB/c小鼠，随后通过细胞融合、ELISA检测和4轮亚克隆化，最终筛选获得多株稳定分泌抗gp35015-320aa单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中一株4E1活性较好。注射4E1杂交瘤细胞收集小鼠腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein G进行纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度，结果显示（图4a）抗体到达电泳纯可用于后续实验。将纯化的重组蛋白gp35015-320aa包被板条，使用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价，结果显示抗体效价达到1∶256 000。同时，对抗体亚型进行鉴定，结果发现其属于IgG1亚型。Western blot（DAB显影）结果显示：抗体能与重组蛋白发生免疫反应，而且具有良好的活性（图4b）。
4、抗gp350单克隆抗体的鉴定
1) 单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）亚型鉴定按照试剂盒说明书进行检测，BCA法检测单克隆抗体浓度，SDS-PAGE电泳鉴定纯度。
2) Western blot鉴定：通过12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；TBST洗涤3次，加入纯化的单克隆抗体为一抗（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；PBST洗涤3次，加入酶标二抗（1∶10 000稀释），室温孵育1 h；PBST洗涤3次，加入DAB显色液染色或ECL化学发光显影，使用Tannon分析仪进行分析。
3) 细胞免疫荧光：将细胞均匀滴加到爬片上，自然风干后，使用4%的多聚甲醛避光固定，再均匀滴加0.5% Triton X-100后室温通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS。在爬片上均匀滴加80 µL 5% BSA（牛血清白蛋白）后在湿盒中室温封闭1h，PBS洗涤一次，滴加足量的一抗，并放入湿盒中，4℃过夜。经PBS洗涤后加入荧光二抗，室温孵育1 h后，PBS洗涤后封片，在荧光显微镜下观察结果。
4) 病毒捕获实验：将单抗包被到抗原管中，用封闭液封闭后，实验组中每孔加入病毒细胞裂解液100 μL，37℃孵育1 h后使用PBS洗6~8次。每孔加入30 L ddH2O，置于96℃热处理15 min，收集热处理后上清作为模板，特异性引物进行PCR实验鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析结果。
5) 病毒中和实验：将培养好的Hone-1细胞计数后，将其铺至48孔板，再将病毒与梯度稀释的抗体混合物（对照组不加抗体混合）置于37℃孵育1 h，将病毒混合液分装到48孔板，每一稀释度接种3孔，每孔加入2% 1640新鲜培养基补齐至500 μL，置于培养箱中与细胞共培养12 h，吸去细胞上清液，经1×PBS洗涤，加入2% 1640新鲜培养基换液，48~72 h后收样，提取DNA，荧光定量PCR进行检测。
相应的实验结果如下：
1）验证了纯化抗体与病毒的特应性反应，以4E1抗体为一抗，使用免疫荧光对EBV感染的B95-8细胞进行检测，结果显示抗体与带有EB病毒的B95-8细胞具有较好的反应性，即与细胞中的病毒具有特异性的免疫反应。
2）检测了制备的单克隆抗体是否具有捕获病毒的能力，直接将纯化的单克隆抗体包被96孔酶标板，然后按照实验方法中的步骤进行实验。捕获PCR电泳后的结果如图6，说明4E1单抗株具有较好的病毒结合能力。本实验设置四组对照，一组对照不包被抗体后加入病毒细胞裂解液（图6 lane 1），一组对照与实验组包被同浓度抗体后加入没有病毒细胞的裂解液（lane 2），一组对照为PCR反应体系的阴性对照（lane 3），一组对照PCR反应体系的阳性对照（lane 4），实验组为（lanes 5 and 6）。
3）检测了抗体的病毒阻断能力，以EBV感染的细胞和抗体（1∶10、1∶100、1∶1 000三个稀释梯度）混合物与EBV阴性的Hone-1细胞以共培养的方式培养2~3 d，收集样品，提取DNA，然后通过QPCR（荧光定量PCR）检测病毒基因gp350相对表达量，gp350含量越高，病毒滴度越高（*P<0.05认为差异有统计学意义）。本实验中，A、B、C、D分别为4E1抗体稀释梯度1∶10、4E1抗体稀释梯度1∶100、4E1抗体稀释梯度1∶1 000以及未加4E1抗体，根据图7可知，A、B、C加抗体组处理中病毒基因gp350相对表达量要低于未加抗体处理D组（*P<0.05），说明抗体具有病毒阻断能力。
4）检测了制备的单克隆抗体的病毒中和能力，以病毒液和抗体（1∶10、1∶100、1∶1000 三个稀释梯度）混合物与EBV阴性的Hone-1细胞以共培养的方式培养 2~3 d，收集样品，提取DNA，然后通过QPCR检测病毒基因gp350相对表达量，病毒基因gp350含量越高，病毒滴度越高（*P<0.05认为差异有统计学意义）。本实验中，A、B、C、D分别为4E1抗体稀释梯度1∶10、4E1抗体稀释梯度1∶100、4E1抗体稀释梯度1∶1 000以及未加4E1抗体，根据图8可知A、B、C加抗体组处理中病毒基因gp350相对表达量要低于未加抗体处理D组（*P <0.05），说明抗体对病毒具有中和能力。
6、抗体结合表位的确定和抗体可变区分析
1）抗体结合表位的确定：为了确定单克隆抗体4E1的抗原结合表位，结合现有EBVgp350蛋白强抗原表位，由上海强耀生物科技有限公司合成6条多肽，分别命名为gp-1到gp-6，多肽经过高压液相色谱纯化和质谱鉴定，确保合成的氨基酸序列正确，然后采用免疫印迹技术(Western blotting)和酶联免疫吸附测定技术确定单克隆抗体4E1的抗原结合表位。多肽序列如表1。
表1. 根据gp350氨基酸序列合成的gp350多肽序列
多肽序号 Gp350蛋白上氨基酸位置 多肽序列 序列编号
gp-1 18-32 LTGEDPGFFNVEIPE SEQ ID NO：11
gp-2 62-81 DLDFGQLTPHTKAVYQPRGA SEQ ID NO：12
gp-3 101-130 ELALTMRSKKLPINVTTGEEQQVSLESVDV SEQ ID NO：13
gp-4 147-165 QNPVYLIPETVPYIKWDNC SEQ ID NO：14
gp-5 197-214 SVKTEMLGNEIDIECIME SEQ ID NO：15
gp-6 280-301 YVFYSGNGPKASGGDYCIQS SEQ ID NO：16
2) 抗体可变区分析：①RNA的提取：在EP管中加Trziol振荡混匀，以确保所有细胞破碎，在室温静置5 min。根据Trziol五分之一的量加入氯仿，混合，静置5 min，12 000 g下，4℃离心15 min。离心后分为三层，将最上层上清液转移到另一干净的EP管中，重复抽提一次，加入相同体积异丙醇沉淀，﹣20℃放置30 min冰浴后，12 000 g下，4℃离心10 min，弃上清。加入75%乙醇1 mL，颠倒混合静置一会，7 500 g，4℃离心5 min，弃上清。自然风干后加入适量DEPC水溶解。②RT-PCR及PCR：参照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA SynthesisKit (TAKARA)的产品说明书，合成cDNA第一条链，以抗体可变区通用引物分别扩增出VH基因及VL基因，PCR产物胶回收后送去测序。
本发明采用合成肽表位作图，将合成的多肽包被在96孔ELISA板或固定于Bio-DotSF微滤装置的硝酸纤维素膜上，然后分别按照ELISA和Bio-Dot SF 的方法进行操作，然后染色，在酶标仪或者化学发光仪上检测试验结果，结果如图9。从图上可以看出，无论是ELISA还是Bio-Dot SF 方法获得的记过完全一致，即所获得的单克隆抗体只与gp350蛋白和gp-1多肽反应，而阴性对照没有任何反应，说明4E1单抗结合的抗原表位位于gp-2多肽上。
单克隆抗体的重链可变区基因序列的全长为447bp（如SEQ ID NO：1所示），编码149个氨基酸残基（如SEQ ID NO：2所示）。隶属小鼠Ig重链可变区Ⅲ亚组；轻链的可变区的长度为390个碱基（如SEQ ID NO：3所示），编码130个氨基酸残基（如SEQ ID NO：4所示），隶属小鼠 IgK链可变区4/5亚组。其进一步分析可知，重链的CDR1序列为：GYSITSDYA（SEQ IDNO：5）、CDR2的序列为：ISYIGST（SEQ ID NO：6）、CDR3序列为ATFGNYPFFDF（SEQ ID NO：7）；而重链的CDR1序列为：SSVSY（SEQ ID NO：8）、CDR2的序列为：VTS（SEQ ID NO：9）、CDR3的序列为：QQWSSDPPT（SEQ ID NO：10）。
<110>湖南师范大学
<120> EBV包膜糖蛋白gp350抗原表位及其单克隆抗体
<160>16
<210>1
<211>447
<212>DNA
<213>抗体重链DNA
<400> 1
atgagagtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60
cagcttcagg agtcgggacc tggcctggtg aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc 120
actgtcactg gctactcaat caccagtgat tatgcctgga actggatccg gcagtttcca 180
ggaaaaactc tggagtggat gggcttcatc agctacattg gtagcactag ctaccaccca 240
tctctcaaaa gtcgactctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag 300
ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcaacctt tggtaactat 360
cccttctttg acttctgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacgaca 420
cccccatccg tttatccctt ggtccct 447
<210>2
<211>149
<212>PRT
<213>抗体重链
<400>2
MRVLILLWLF TAFPGILSDV QLQESGPGLV KPSQSLSLTC TVTGYSITSD YAWNWIRQFP 60
GKTLEWMGFI SYIGSTSYHP SLKSRLSITR DTSKNQFFLQ LNSVTTEDTA TYYCATFGNY 120
PFFDFWGQGT TLTVSSAKTT PPSVYPLVP 149
<210>3
<211>390
<212>DNA
<213>抗体轻链DNA
<400> 3
atgagtgcct cagtcataat gtccagggga caaattgttc tcacccagtc tccagcactc 60
atgtctgcag ctccagggga gaaggtcacc atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt 120
tacatgtact ggtaccaaca gaggccagga tcctccccca caccctggat ttatgtcaca 180
tcccacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagcggca gtgggtctgg gacttcttac 240
tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg 300
agtagtgacc caccgacgtt cggtggaggc accaaggtgg aaatcacacg ggctgatgct 360
gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 390
<210>4
<211>130
<212>PRT
<213>抗体轻链
<400>4
MSASVIMSRG QIVLTQSPAL MSAAPGEKVT MTCSASSSVS YMYWYQQRPG SSPTPWIYVT 60
SHLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SSDPPTFGGG TKVEITRADA 120
APTVSIFPPS 130
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>抗体重链CDR1
<400>5
GYSITSDYA 9
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>抗体重链CDR2
<400>6
ISYIGST 7
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>抗体重链CDR3
<400>7
ATFGNYPFFD F 11
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>抗体轻链CDR1
<400>8
SSVSY 5
<210>9
<211>3
<212>PRT
<213>抗体轻链CDR2
<400>9
VTS 3
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>抗体轻链CDR3
<400>10
QQWSSDPPT 9
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>11
LTGEDPGFFN VEIPE 15
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>12
DLDFGQLTPH TKAVYQPRGA 20
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>13
ELALTMRSKK LPINVTTGEE QQVSLESVDV 30
<210>14
<211>19
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>14
QNPVYLIPET VPYIKWDNC 19
<210>15
<211>18
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>15
SVKTEMLGNE IDIECIME 18
<210>16
<211>20
<212>PRT
<213> Epstein-Barr virus
<400>16
YVFYSGNGPK ASGGDYCIQS 20

Claims (5)

1.一种EBV包膜糖蛋白gp350的抗体，其包含重链可变区的 VHCDR1-3 和轻链可变区的VLCDR1-3，其中所述 VHCDR1、VHCDR2 和 VHCDR3 的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO：5-7 所示，所述 VLCDR1、VLCDR2 和 VLCDR3 的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-10所示。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求1至3任一项所述的抗体在制备用于检测EBV的制剂中的应用。
5.如权利要求1至3任一项所述的抗体在制备预防或治疗EBV的制剂中的应用。
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人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备;何赛等;《生命科学研究》;20170228;第21卷(第1期);第16-22页 *

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