CN1103373C - 人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两种全新的编码人血清白蛋白的脱氧核糖核酸序列，即人血清白蛋白改构基因片段的设计和人工全合成，以及一种用甲醇酵母工程菌大规模生产基因重组人血清白蛋白的生产工艺，发现改构基因能大幅度增加人血清白蛋白的表达量；该生产工艺可使人血清白蛋白结构基因在甲醇诱导启动子的驱动下获得高水平表达，并将人血清白蛋白表达产物分泌到发酵液培养基内，为基因工程人血清白蛋白向更大规模的中试放大提供可靠的实验数据。

Description

人血清白蛋白的改构基因、表达载体及其宿主

本发明涉及到应用重组DNA技术在甲醇酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞中生产基因重组人血清白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin，HSA)。甲醇酵母工程菌在它们的基因组中至少稳定地整合有一个拷贝的由实验方法导入的编码HSA的改构HSA基因；这个改构DNA序列受甲醇酵母自身来源的高表达启动子的控制；在甲醇酵母适宜的液体培养基培养条件下能将HSA表达产物分泌到培养基内。本发明进一步相关的是适合甲醇酵母表达的人血清白蛋白改构基因的设计与化学合成；表达载体的构建；甲醇酵母转化子、工程菌；工程菌在实验室摇瓶上的基因表达；用发酵罐进行高密度高表达发酵生产rHSA。

人血清白蛋白的分子结构、基因结构及其理化性质

人血清白蛋白(HSA)是一种内含有585个氨基酸的单链无糖基化的蛋白质，分子量Mr为66000-69000道尔顿，等电点pI4.7-4.9。HSA的一级结构内含有35个半胱氨酸和一个色氨酸Trp214，其中34个半胱氨酸以共价键方式组合成17对二硫键；HSA的三级结构呈椭圆球状，内含有三个大的蛋白质结构域，每个大的结构域内含三个小结构域，以环—连接区—环(loop-link-loop)结构组合而成。1976年前后，美国德克萨斯大学的Brown教授及其学生发表系列论文(其中包括6篇博士论文)系统研究人、鸡、牛、猪、羊等种属的白蛋白的氨基酸组成及蛋白质结构域，发现白蛋白一级结构的氨基酸组成具有高度同源性和保守性，蛋白质都由三个结构域组成(Peters T(1985).Adv.Protein Chem.37：161-245；Brown JR(1976).Fed.Proc.35(10)：2141-2144；Meloun B，et al(1975).FEBS Lett.58：134-137)。近年来，用X-射线衍射晶体结构分析法显示，HSA三维构象由三个同源的蛋白质结构域组成一个心形分子；每个结构域内拥有共同的基序(motif)；在第二和第三结构域之间有一个疏水性口袋(hydrophobic cavity)，此结构参与许多外源性药物分子和内源性物质在血液循环中的运输。另外，HSA的拓扑结构显示，HSA主链骨架含有67％的α-螺旋区域与16％β-片层(He XM and Carter DC(1992).Nature 358：209-215)。

HSA是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含HSA约40克，一个正常成年男性(体重以70公斤计)，约有3.5-4升血液，即血浆中约有160克HSA。HSA除了在血浆中存在外，也存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中，构成血管外池；血液里和血管外池总的HSA达350克。由于全身能交换的总的HSA有350克，人体每天分解代谢消耗约14克，正常情况下，分解代谢消耗的HSA克数由肝细胞每天合成补充进入血流，使人体整个HSA代谢池达到动态平衡。HSA分子在人体内的半衰期为19天，平均寿命27天。在这27天里，HSA分子要在机体循环系统中进行15000次往返循环，其中15次通过血管外空间(Peters T(1985).Adv.ProteinChem.37：161-245)。

在人体生理条件下，HSA不仅具有维持血液中胶体渗透压(占80％左右)的作用，还参与众多内源性物质和外源性药物分子在血液中的运输，血液里的HSA起到高容量物质库的作用。大凡进入血液的高浓度的游离的配基通过迅速与HSA结合后，使其在血液中的游离分子(或离子)浓度下降，起稳定浓度的作用，如长链脂肪酸、金属离子、甲状腺激素、类固醇激素、睾酮、胆红素和阿司匹林、安定等分子作为配基与HSA结合形成复合体。这种复合体沿血流到达机体的肝、肾、肠道、脑和其他细胞的细胞膜界面附近，与膜上的HSA膜受体结合，使HSA发生构象变化，促使HSA与配基解离，便于这些配基被靶区细胞利用，进而发挥生物学作用。HSA在血液里参与运输的一些物质见表1。由于HSA作为血液最重要的运载工具和血浆蛋白成份，在机体内发挥重要作用，因而在临床医学实践中具有十分广泛的用途，被大量用来治疗各种休克，烧伤、战伤、外科手术后和工伤事故等各种病因引起的血容量减少病人以及慢性肾炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤病人以及营养不良水肿症、低白蛋白血症和无白蛋白血症病人等。由于HSA适应症多、用量大(每个病人每天用HSA量达几克范围)，因此HSA拥有巨大的市场需求量。据近年资料报道，目前HSA全球年销售量高达600吨左右，按目前50美元/10克计，每年销售额在30亿美元以上。中国市场近年销售量约70吨，年销售额在人民币30亿左右。目前，HSA在全球的需求量呈上升态

势(Goodey AR(1993).Trends Biotech.11(10)：430-433)。到目前为止，国内外HSA产品主要从捐血者血浆或人胎盘中提取。1946年前后，美国哈佛

             表1与人血清白蛋白相结合的一些内源性配基

                                           结合常数(KA)化合物                                      M^-1           n钙离子(二价)                               9×10²         1

                                       8.3×10         3铜离子(二价)                               1.6×10¹⁶      1油酸(盐)(1)                                26.0×10⁷      1

    (2)                                9.4×10⁷       1

    (3)                                2.9×10⁷       1

    (4)                                2.1×10⁷       1硬脂酸(盐)                                 15.0×10⁷      1亚油酸(盐)                                 7.9×10⁷       1软脂酸(盐)                                 6.2×10⁷       1溶血卵磷脂                                 4.3×10⁴       1二十碳四烯酸                                 3×10⁷         1前列腺素E1                                   7×10⁴         2石胆酸盐                                     9×10⁷         3鹅脱氢胆酸盐                                 2×10⁶         3胆酸                                         5.5×10⁴       3皮质醇                                       5×10³         2睾酮                                         4.2×10⁴       1胆红素                                       5×10⁷         1正铁血红素                                   1.1×10⁸       1L-色氨酸                                     6.3×10⁴       1L-甲状腺素                                   1.6×10⁶       1大学的Cohn教授发表了《血浆与蛋白质研究》的系列论文60余篇，论文中系统阐述了从血浆中用低温乙醇沉淀法制备HSA的工艺方法(Cohn EJ，et al(1946).J Am.Chem.Soc.68：459-475；Cohn EJ，et al(1947).J Am.Chem.Soc，69：1753-1761)。目前国内外HSAT业化制备方法还是沿用低温乙醇沉淀法及稍作的工艺改进(见中国专利公开号，CN1137528A，CN1120439A，CN1042716A，CN1087914A，CN1051913A，CN1123550A)。但近年来越来越多的人因输入血制品HSA而感染了艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎等传染性疾病。由于血源病毒污染等原因，再则国家对血制品严格控制进口，致使HSA供应十分紧张，人们迫切期望开发新的来源。用基因工程技术生产重组人血清白蛋白替代血源白蛋白是目前国际上最有发展前景的高科技途径。

HSA基因座位于人第四号染色体长臂(q11-22 of chromosome 4)，属单拷贝等显性基因，基因全长19002bp，内有15个外显子，被14个内含子和13个重复区序列所分隔，形成典型的真核断裂基因。基因的内含子遵守GT-AG法则。HSA基因组型基因的5’非翻译区内有Kozak序列(AXXATG)和帽子结构；作为RNA聚合酶II结合位点的Goldberg-Hogness序列TATA box(-32位)；作为真核生物启动子的增强子序列CCAAT box(-88位)；在3’非翻译区内有保守的AATAAA序列，为3’端polyA加尾的识别信号(Dugaiczyk A，et al(1986).J Biol.Chem.261(15)：6747-6757)。在人类肝细胞，基因组HSA基因转录出2080个碱基组成的mRNA分子，一个HSA mRNA分子与19个核糖体构成一个巨大的多聚体，在细胞质内进行HSA的生物合成，再经过高尔基复合体加工、修饰，将成熟的HSA分泌到肝细胞膜外，进入血流。在哺乳动物中，基因组白蛋白DNA与同家族的其他三个基因连锁在一起，构成一个白蛋白多基因家族，其家庭成员有：血清白蛋白、胎蛋白(α-fetoprotein)、阿尔法-白蛋白(α-Albumin)和维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein，DBP，也叫GC)。这个基因家族的四个成员都有15个外显子和14个内含子的基因结构特征，除了DBP基因缺损第12、13二个外显子外，编码的蛋白质不论在一级结构的氨基酸组成还是在空间结构都存在同源性和类似性，表明这四个家族成员起源一个共同的祖先基因(Dugaiczyk A，et al(1996).J Mol.Biol.259：113-119)。从生物体种系发生的角度考察，白蛋白己存在于两栖类和所有较高等的脊椎动物体内，开始白蛋白分子仅由一个190个氨基酸组成的小蛋白分子(相当于哺乳动物体内白蛋白分子三个大的结构域的一个大小)，由于动物越来越向高等生物进化，神经系统、循环系统、呼吸系统、消化系统和泌尿系统等机体系统的逐渐分化，作为血浆主要蛋白的白蛋白，如果分子小易从泌尿系统排泄损失等生理功能的需要，使白蛋白分子在自然选择的压力下逐步从一种小分子量的蛋白质(作为一个基序motif)一倍一倍地向大型化分子演化(Peters T(1985).Adv.Protein Chem.37：161-245；Putnam FW，TheProteins.2nd ed.Vol.4 Academic Press，London，1984；Dugaiczyk A，et al(1996).J Mol.Biol.259：113-119)。人血清白蛋白基因与人血液中另一种重要蛋白的基因—血红蛋白基因一样在全世界不同民族人群、种族中呈现多态性和易突变性，其蛋白质存在众多的变异体或称突变体，目前利用电泳分析鉴定至少已发现有100多种突变体，通过基因序列分析证实的点突变和缺损突变位点的突变体已超过50多种(见表2和图2)，其中检出的一半以上是意大利人群中发现的，HSA突变体可引起多种生理功能异常(Madison J，et al(1994).Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：6476-6480；Arai K，et al(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：497-501；Minchiotti L，et al(1987).Biochim.Biophys.Acta 916：411-418)。HSA突变体存在于血液中形成异白蛋白血症(alloalbuminemia)，最常见的异白蛋白血症是由部分正常的白蛋白与突变体(变异体)白蛋白同时存在于血流中构成所谓的双白蛋白血症(bisalbuminemia)，

                表2人血清白蛋白基因点突变所致突变体的类型突变体类型         突变体名称           可能的密码子改变    证实或推断的改变Arg^-2→His     Lille，Varese，etc.         T/CGT→CAT                  G→AArg^-2→Cys     Malmo I，Tradate，etc       T/CGT→TGT                  C→TArg^-1→Gln     Christchurch.etc.           T/CGA→CAA                  G→AArg^-1→Pro     Takefu.Honolulu-I           T/CGA→CCA                  G→CArg^-1→Leu     Jaffna                      T/CGA→CTA                  G→TAsp¹→Val      Iowa City-2，Blenheim       A/GAT→GTT                  A→THis³→Gln      Nagasaki-3                  CAC/A→CAR                  C→RHis³→Tyr      Larino                      CAC/A→TAC                  C→TGlu⁵⁰→Lys     Torino                      T/GAA→AAA                  G→AASp⁶³→Asn     Malmo(no.95)                T/GAC→AAC                  G→AGlu⁸²→Lys     Vibo Valentia               T/GAA→AAA                  G→AArg¹¹⁴→Gly    Yanomama-2                  C/CGA→GGA                  C→GGlu¹¹⁹→Lys    Nagova                      A/GAG→AAG                  G→AHis¹²⁸→Arg    Komagome-2                  T/CAT→CGT                  A→GCys¹⁷⁷→Phe    Hawkes Bay                  C/TGC→TTC                  G→TArg²¹⁸→His       Honolulu              T/CGC→CAC          G→ALys²²⁵→Gln       Tradate-2             C/AAA→CAA          A→CLys²⁴⁰→Glu       Herborn               C/AAA→GAA          A→GGln²⁶⁸→Arg       Malmo(no.10)          T/CAA→CGA          A→GAsp²⁶⁹→Gly       Nagasaki-1            A/GAT→GGT          A→GLys²⁷⁶→Asn       Caserta               G/AAG→AAY          G→CLys³¹³→Asn       Tagliacozzo，etc.     T/AAG→AAY          G→TAsn³¹⁸→Lys       Malmo(no.47)          AAC/T→AAR          C→RAla³²⁰→Thr       Redhill               T/GCT→ACT          G→AGlu³²¹→Lys       Roma                  T/GAG→AAG          G→AGlu³³³→Lys       Sondrio               T/GAA→AAA          G→AGlu³⁵⁴→Lys       Hiroshima-1           T/GAA→AAA          G→AGlu³⁵⁸→Lys       Porto Alegre-1，etc.  T/GAG→AAG          G→AAsp³⁶⁵→His       Parklands             A/GAT→CAT          G→CAsp³⁶⁵→Val       Iowa City-1           A/GAT→GTT          A→TLys³⁷²→Glu       Naskapi，Mersin，etc. C/AAA→GAA          A→GAsp³⁷⁵→Asn       Nagasaki-2            C/GAT→AAT          G→AGlu³⁷⁶→Lys       Tochigi               T/GAA→AAA          G→AGlu³⁷⁶→Gln       Malmo(no.5)           T/GAA→CAA          G→CGl³⁸²→Lys        Hiroshima-2           G/GAA→AAA          G→AGlu⁴⁷⁹→Lys       Dublin                A/GAA→AAA          G→AAsp⁴⁹⁴→Asn       Casebrook             C/GAT→AAT          G→AGlu⁵⁰¹→Lys       Vancouver，etc.       A/GAG→AAG          G→AGlu⁵⁰⁵→Lys       Ortonovo              T/GAA→AAA          G→ALys⁵³⁶→Glu       Castel di Sangro      C/AAG→GAG          A→GLys⁵⁴¹→Glu       Maku                  A/AAA→GAA          A→GAsp⁵⁵⁰→Gly       Mexico                T/GAT→GGT          A→GAsp⁵⁵⁰→Ala       Malmo(no.61)          T/GAT→GCT          A→CAsp⁵⁶³→Asn       Fukuoka-l，Paris-2    C/GAT→AAT          G→AGlu⁵⁶⁵→Lys       Osaka-1               G/GAG→AAG          G→AGlu⁵⁷⁰→Lys       B-type(Verona)        C/GAG→AAG          G→ALys⁵⁷³→Glu       Milano Fast           T/AAA→GAA          A→GLys⁵⁷⁴→Asn       Vanves                A/AAA→AAY          A→YR＝A或G；Y＝C或T；可引起许多人体生理功能异常，如HSA Arg²¹⁸→His(CGC→CAC)，可引起高甲状腺素血症(hyperthyroxinemia)；最严重的异白蛋白血症类型是一种无白蛋白血症(analbuminmia)，患者常伴有水肿和高脂血症hyperlipidemia)，其寿命比同种族人群平均寿命要短(Petersen CE，et al(1997).Biochemistry 36(23)：7012-7017；Petersen CE，et al(1996).J Biol.Chem.271(32)：19110-19117；Dammacco F，etal(1980).Vox Sang.39：153-161)。人血清白蛋白基因工程研究现状

1981年Genentech公司的Lawn等人率先报道从人肝脏中克隆了全长HSA cDNA，用双脱氧末端中止法测定了基因序列，进而基因密码子推断出HSA成熟蛋白质有585个氨基酸，成熟基因前面还有一个编码prepro HSA的包含24个氨基酸的基因序列，其中preHSA有18个氨基酸组成，呈疏水性；pro-HSA由6个氨基酸组成，呈碱性；其末端有哺乳动物内肽酶所识别加工的Arg-Arg双碱性氨基酸加工位点。Genentech公司的研究人员将编码成熟HSA基因片段在大肠杆菌trp启动子的控制下，在大肠杆菌中获得了胞内表达(Lawn RM，et al(1981).Nucleic Acids Res9(22)：6103-6114)。1982年，美国哈佛大学诺贝尔奖获得者Gilbert教授等报道用小鼠白蛋白cDNA作探针，从人胎肝cDNA中通过核酸杂交技术克隆了HSA cDNA，并在大肠杆菌表达系统中获得了表达，表达产物分泌到细胞周质(Philipp BW andGilbert W(1982).J Cell Biochem.Suppl.6：337-346)。Lawn等克隆的成熟HSA基因推断的氨基酸序列与Meloun先前报道的HSA比较有11个氨基酸的差异(Meloun B，et al(1975).FEBS Lett.58：134-137)；与Dayhoff报道的HSA序列比较有28个氨基酸的差异(Dayhoff M(1978).Atlas of Protein Sequence and Structure，Vol5(Suppl.3)，p266，National Biomedical Research Foundation，Washington)；与目前公认的HSA氨基酸序列比较有一个氨基酸不同，即Glu396→→Lys(Dugaiczyk A，et al(1986).J Biol.Chem.261(15)：6747-6757)，因而认为Lawn等人表达的HSA为一种HSA突变体。1982年，Dugaiczyk等人报道了用PCR法从人肝脏中克隆HSA cDNA全长基因，编码HSA成熟蛋白基因与Lawn等人的也有差别，与目前公认的HSA序列比较也有一个氨基酸差异，Glu97→Gly(Dugaiczyk A，et al(1982).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：71-75)。用哺乳动物不同种属的动物如大鼠、牛和人类的HSA分子的氨基酸序列作比较，其中97位和396位氨基酸残基均为Glu(Peters T(1985).Adv.Protein Chem.37：161-245)。从八十年代初到目前九十年代，HSA基因工程一般都是以上二个HSA序列作为基因表达的目的基因(见表3)。

应用大肠杆菌表达系统表达HSA，由于表达产物存在于细胞质形成包涵体形式，其基因工程产品需要破菌、分离包涵体、纯化和复性；再则HSA分子内部二硫键多、三维结构复杂和多肽链主链骨架内部原子空间排布所占体积大，用大肠杆菌表达容易形成折叠错误以及构象有别天然分子的重组HSA分子，表达量也较低，一般在每升几十毫克水平，因而难于产业化(Lawn RM，et al(1981).Nucl.Acids Res.9(22)：6103-6114)；Latta M，et al(1987).Bio/Technology 5：1309-1314)。用低等真核生物酵母表达系统表达外源基因，由于能将基因工程产物直接分泌到培养基内，而培养基内是氧化环境有利于二硫键形成，有利于表达出天然构象的蛋白质分子。如1982年用酿酒酵母表达大分子量蛋白乙型肝炎表面抗原(作为基因工程疫苗)获得成功(Valenzuela P，et al(1982).Nature 298：347-350)，因而用酵母系统表达HSA较大肠杆菌表达系统有很大的优越性。酵母表达系统的载体-宿主系统分附加体型与整合型两种表达方式。附加体型的重组质粒存在于酵母的细胞质内，重组质粒内有自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)。可在酵母细胞内自主复制，并在启动子元件调控下表达外源基因，但这种重组质粒在酵母宿主细胞芽殖分裂、世系传代中容易丢失，因而往往难以用工业化大型发酵罐来放大生产。整合型表达质粒是以线形化质粒或环形质粒形式整合到酵母的基因组内(单拷贝或多拷贝整合)，然后随着酵母宿主菌染色体的复制而复制，外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失，另外目的基因在酵母启动子的调控下进行表达的过程同酵母菌自身基因表达的过程一样，是在细胞核内转录出hnRNA，经过修饰和加工成为mRNA，并穿越核膜到达细胞质与核糖体结合，再表达目的基因的。整合型表达方式适合用工业化大型发酵罐来进行发酵生产(Romanos MA，et al(1992).Foreign geneexpression in yeast：a review.Yeast 8：423-488)。因而表3用酵母表达系统表达HSA一般都采用分泌性整合型表达方式。另一方面，酵母作为工业微生物的重要宿主菌，在工业发酵方面已积累了大量的经验，尤其是表3内几种酵母菌作为生产单细胞蛋白工程菌种，在大型发酵罐高细胞密度发酵培养方面已有相当成熟的生产工艺。以上三个方面的优势合在一起，使酵母表达系统成为目前国际上开发基因工程HSA最有价值的表达系统。英国Delta生物技术公司的Sleep、匈牙利科学院遗传学研究所的Kalman以及日本绿十字公司的Okabayashi等研究小组

               表3基因工程人血清白蛋白表达系统       科研单位                         参考文献大肠杆菌       Genentech Co USA              Nucl.Acids.Res.1981，9(22)：6103-6114表达系统                                     EP0073646(1983)

           Harvard Univ.                 J Cell Biochem.(1982)

           Upjohn，USA                   EP0079739(1983)

           Genetica/Rhone-Poulenc        FR2579224(1983)

           France                        Biotechnology(1987)5(12)：1309-1314枯草杆菌       Genex，USA                    EP0206733(1986)表达系统                                     EP0229712(1987)

                                         J Bacteriol(1987)169(7)：2917-2925酿酒酵母       Genentech Co USA              Bio/Technology(1986)4(8)：726-730表达系统       Delta，UK                     EP0322094(1989)

                                         EP0317254(1989)

                                         WO9002808(1990)

                                         Bio/Technology(1991)9：184-187

           Rhone-Poulenc，France         EP0361991(1990)

           Green Cross Co，Japan         EP0319641(1989)

                                         EP0399455(1990)

           Tonen，Japan                  EP0366400(1990)

                                       EP0509841(1992)

        Tou-Fuel，Japan                EP0330451(1989)

                                       JP06090742(1994)

        Skandigen/Vepex                Nucl.Acids Res.(1990)18(20)：6075-6081

        Biotechnika，Hungary           EP0308381(1989)

                                       Yeast(1988)4，S141粟酒裂殖酵母Delta，UK                      WO9001063(1990)表达系统巴斯德毕赤酵母Phillips Petroleum           Pharm.Eng.(1992)12：48-51表达系统      CO，USA                      P0510693(1992)

                                       EP0344459(1989)

                                       EP0510678(1992)

          Salk Inst.                   WO9213951(1992)

          Biotechnol，USA

          Green Cross Co，Japan        EP683233(1995)

                                       EP639643(1995)

          Res.Corp.Technol，USA        EP771871(1997)汉逊多形酵母Rhein Biotech，Germany Trends Biotechnol.(1992)10(12)：413-417表达系统      Delta，UK                    Yeast(1990)，S449转基因动物    Rhone-Poulenc，France        WO9303164(1993)(小鼠、大鼠、兔                            Transgenic.Res.(1994)3(6)：365-375绵羊、山羊、猪、牛)           Genpharm Internayinal，USA   WO9108216(1991)

          Inst.Animal Sci，Transgenic Res.(1992)1(15)：195-208

          Volcani Center，Israel Transgenic Res.(1994)3(3)：141-151

          J Histochem.Cytochem.(1995)43(5)：461-470表达系统      科研单位               参考文献克鲁维酵母    Rhone-Poulenc，France  Yeast(1994)10：1297-1303表达系统                             Bio/technol.(1991)9：968-975

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                                 EP0361991(1990)

          Gist-Brocades，        US4990447(1991)

          Netherlands            EP0301670(1989)转基因植物    Mogen International NV，Biotechnol.NY(1990)8(3)：217-221(马铃薯和烟草)Leiden，NetherlandsEP：欧洲专利；WO：世界专利；US：美国专利；JP：日本专利用酿酒酵母表达系统(Saccharomyces Cerevisiae)分泌表达HSA，每升表达量均在几个毫克至一百毫克之间(Sleep D，et al(1990).Bio/Technology 8：42-46；KalmanM，et a1(1990).Nucleic Acids Res.18(20)：6075-6081；Okabayashi K，etal(1991).J Biochem 110：103-110)。法国的Fleer和Blondeau等人用乳酸克鲁维酵母表达系统(Kluyveromyces Lactis)分泌表达HSA，实验室摇瓶表达水平在每升几百毫克水平；用高密度发酵技术已使表达上升至每升1-2克的高水平(Fleer R，etal(1991).Bio/Technology 9：968-975)。英国谢菲尔德大学的Hodgkins和Delta公司的goodey等人用多形汉逊酵母表达系统(Hansenula Polymorpha)分泌表达HSA，用高密度发酵技术诱导表达每升表达量在1-2克水平。美国菲利浦石油公司生物技术部和莎克生物技术研究所的Sreekrishna和Barr等人用巴斯德毕赤酵母的整合型表达系统分泌表达HSA(应用高细胞密度发酵技术进行二相发酵和诱导表达)，每升表达已达2-4克的高水平(Barr KA，et al(1992).Protocol for efficient secretionof HSA developed from pichia pastoris.Pharm Eng.12：48-51)。九十年代以来，利用转基因植物和动物生产多肽药物、基因工程抗体和基因工程疫苗是一个重要的研究方向。荷兰Mogen公司的Hoekemu等人将HSA基因克隆到改进的花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子的下游，再将重组质粒转化马铃薯(Solanum tuberosum)和烟草(Nicotiana tabacum)植株，构成转基因植物。为了外源蛋白质的分泌，一方面可利用外源基因自身的prepro序列(本例用preproHSA)；另一方面也可利用烟草外泌的PR-S蛋白的信号肽序列。结果表明，PR-S信号肽序列与HSA成熟蛋白构成的嵌合基因片段能在转基因植物的叶组织中表达出加工正确的HSA；克隆pre-pro-HSA全长基因的转基因植株，引导肽不能被植物完全加工(Hoekema A，et al(1990).J Cell Biochem.Suppl.14E，333；Sijmons PC，etal(1990).Biotechnology NY 8(3)：217-221)。以色列动物科学研究所的Shani等人利用绵羊β-乳球蛋白(Beta-lactoglobulin，BLG)启动子，在下游克隆preproHSA全长基因cDNA或基因组HSA全长基因和多种带部分内含子序列的全长HSA基因片段，重组质粒转化生殖细胞后形成含有外源基因的转基因动物(转基因小鼠等)，在转基因动物泌乳期的乳汁中表达重组HSA，其中有的转基因动物表达量达0.3mg/ml(ShaniM，et al(1992).Transgenic Res.1(5)：195-208；Barash I，et al(1994).Transgenic Res.3(3)：141-151；Barash I，et al(1996).Nucleic Acids Res.24(4)：602-610；Hurwitz DR，et al(1994).Transgenic Res 3(6)：365-375)。

发明概述：

本发明涉及二种全新的编码HSA的脱氧核糖核酸序列(即HSA改构基因)的设计和人工合成：根据Dugaiczyk报道的HSA氨基酸序列和Koutz报道的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX1)基因的偏爱密码子，再结合其他一些基因设计原则综合设计了编码HSA的全新基因；进而采取双链人工全合成的策略化学合成HSA全长基因(长度为1849bp)和成熟基因(长度为1779bp)，是迄今为止国际上化学合成的最长的功能基因之一。将该化学合成的HSA基因转化巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(NRRY-15815)，转化子经筛选，发酵试验，发现一种增加HSA表达量的巴斯德毕赤酵母工程菌。

本发明涉及一种改进的表达盒用于在巴斯德毕赤酵母中重组HSA的生产，表达盒的结构如下：

1)一种巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区(内含启动子元件)，这种5’调控区可选择毕赤酵母的醇氧化酶(AOX1)基因或二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因等，调控区的3’末端与下述2)的序列相连接；

2)上述编码HSA的新基因的全长基因(即利用HSA自身的引导肽序列来引导目的基因进行分泌性表达)；用酿酒酵母菌来源AMF pre-pro序列(包含酵母菌KEX-2蛋白酶加工位点Lys-Arg二个密码子)与上述编码HSA的新基因的成熟基因片段构成嵌合基因(用酵母内源性引导肽序列来引导目的基因进行分泌性表达)；这二种HSA结构基因的3’末端与下述3)的序列相连接；

3)一种甲醇酵母来源的3’终止序列。

本发明中的甲醇酵母表达载体内至少构建有一个上述的含有改构的HSA结构基因的表达盒和一种可供筛选的标记基因。这种重组表达载体转化甲醇酵母宿主菌可用环状质粒形式或线性化位点特异性整合载体二种形式。本发明优先选择线形化位点特异性整合载体，用原生质体转化法将重组表达载体定点整合到甲醇酵母(如巴斯德毕赤酵母等)基因组上特异性位点的基因座内(如整合到AOX1基因或his4基因位点)，本发明所涉及的生产HSA的工程菌内至少稳定地整合有一个拷贝的含上述表达盒的重组载体。

另外，本发明还涉及一种用甲醇酵母工程菌大规模生产重组HSA的生产过程：一种至少被整合有一个拷贝的含有改构的HSA结构基因的重组载体的工程菌，在摇瓶或发酵罐高密度发酵条件下，HSA结构基因在一种甲醇诱导启动子的驱动下，将HSA表达产物分泌到培养基内。

本发明优先选择的巴斯德毕赤酵母表达系统应该作为一种用甲醇酵母宿主菌生产HSA的模式系统，其它有用的甲醇酵母，如来自假丝酵母、毕赤酵母、汉逊酵母和球拟酵母四个属的许多独立菌株都可作为类似的等价的酵母菌株(见表5)，被用于作为生产重组HSA的宿主菌。

1981年，HSA cDNA被克隆，根据基因序列所确定的HSA氨基酸序列也一同发表(Lawn RM，et al(1981).Nucleic Acids Res 9：6103-6114；Dugaiczyk A，et al(1982).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：71-75)。1986年，Dugaiczyk等人从人类基因组文库中克隆了HSA基因组全长序列(19002bp)，有15个外显子和14个内含子构成，并报道了由基因序列所确定的HSA氨基酸序列，后者不论在HSA基因序列和氨基酸序列都纠正了以往的一些纷纭报道，是到目前为止最具权威性的结果，本发明所依据的HSA氨基酸序列就是根据此文献的报道结果(Dugaiczyk A，et al(1986).Moleeular structure of the human albumin gene is revealed by nucleiotidesequence with q 11-22 of chromosome 4.J Biol.Chem.261(15)：6747-6757)。

本发明涉及一种全新的编码HSA的脱氧核苷酸序列的设计和人工全合成：根据1986年Dugaiczyk报道的HSA氨基酸序列和Kouts等人1989年报道巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)醇氧化酶(alcobol oxidase，AOX1)基因的偏爱密码子(表4)，再结合其它一些基因设计原理综合分析设计了二个编码HSA的全新基因(Kouts P，et al(1989).Structure comparison of the pichia pastoris alcohol oxidase gene.Yeast 5：167-177；Cregg JM，et al(1989).Functional characterization of thetwo

表4  巴斯德毕赤酵母高表达基因AOX1和AOX2的密码子使用频率、

              相对同义密码子用法值和相对适合指数

氨基酸	密码子	密码子使用频率	相对同义密子用法值(RSCU)	相对适合指数(W)	氨基酸	密码子	密码子使用频率	相对同义密码子用法值(RSCU)	相对适合指数(W)
										PheLeuIleMetValTyr	UUUUUCUUAUUGCUUCUCCUACUGAUUAUCAUAAUGGUUGUCGUAGUGUAUUAC	10465601722113333032422532259	0.3571.6430.3093.7111.0510.1250.1250.6881.5001.5000.0001.0002.3331.3890.1670.1110.0661.934	0.2171.0000.0831.0000.2830.0340.0340.1851.0001.0000.0001.0001.0000.5950.0720.0480.0341.000	SerProThrAlaCys	UCUUCCUCAUCGCCUCCCCCACCGACUACCACAACGGCUGCCGCAGCGUGUUGC	383922292560393343502780166	2.6122.6900.1380.1381.3330.0922.5750.0001.9751.6710.2030.1522.3531.2710.3760.0001.4550.545	0.9741.0000.0510.0510.5180.0361.0000.0001.0000.8460.1030.0771.0000.5400.1600.0001.0000.375

TerHisGlnAsnLvsAspGlu

UAAUAGCAUCACCAACAGAAUAACAAAAAGGAUGACGAAGAG

11838218855146221643744

1.5001.5000.3481.6521.4480.5220.2541.7460.3681.6320.4941.5060.9141.086

1.0001.0000.2111.0001.0000.3810.1451.0000.225L 0000.3281.0000.8421.000

terTrpArgSerArgGly

UGAUGGCGUCGCCGACGGAGUAGCAGAAGGGGUGGCGGAGGG

0181000051541896240

0.0001.0000.9230.0000.0000.0000.3450.0694.9860.0922.9920.2020.0870.000

0.0001.0000.1850.0000.0000.0000.1280.0261.0000.0181.0000.0680.2700.000

alcohol oxidase genes from yeast，pichia pastoris.Mol.Cell Biol，9，1316-1323)。本发明所涉及巴斯德毕赤酵母表达系统宿主菌野生型菌种(NRRLY-11430，NRRLY-11431，US patent 4，414，329，1983)是一种极端特异性的嗜甲醇酵母菌株，在自然生长状态下，其中醇氧化酶基因(AOX1)表达的醇氧化酶蛋白质含量占这种酵母宿主菌总蛋白质(即巴斯德毕赤酵母细胞基因组内1200万碱基对上的6000多个基因的全部基因产物谱—总蛋白质谱)30％以上(Couderc R and Barratt J(1980).Oxidation of methanol by the yeast pichia pastoris，purification andproperties of alcobol oxidase.Agricul.Biol.Chem.44：2279-2289)。这说明本发明所涉及的微生物表达系统—巴斯德毕赤酵母表达系统宿主菌菌株内的AOX1基因的5’调控区域内包含有非常强大和严格受甲醇底物调控的启动子元件(即AOX1启动子)。醇氧化酶基因编码的相应氨基酸的密码子通过结构分析显示呈高度密码子偏爱用法(high codon bias usage)。这种高表达基因仅使用61个编码氨基酸密码子中的25个有效密码子(effective number of codons，Nc)；罕用密码子使用的频率低于10％；密码子偏爱指数(codor bias index，CBI)和密码子适合指数(codonadaption index，CAI)均高达95％以上，醇氧化酶密码子使用频率见表4。本发明涉及用醇氧化酶(AOX1)结构基因偏爱密码子来替换人血清白蛋白(HSA)结构基因的密码子，然而用AOX1强启动子来控制下游的该新人工合成的编码HSA的基因，使HSA基因在甲醇酵母巴斯德毕赤酵母宿主菌中达到最佳表达的目的(HSA基因全新设计的战略、原理和设计的序列以及全合成方法及结果见实施例1，2)。然而将这种高表达HSA工程菌在大型发酵罐中进行高密度培养，大量生产基因工程重组HSA产品(详细的生产过程见实施例6)。

本发明涉及用醇氧化酶(AOX1)基因偏爱密码子替换HSA全长基因(信号肽用HSA基因自身天然的信号肽序列；也可用酵母宿主菌来源信号肽序列；也可用人工合成的嵌合信号肽序列)，在HSA基因ATG前面插入5聚脱氧寡聚核苷酸(AAACGATG)，其中内含有真核基因保守的kozak序列AXXATG(Kozak M(1987).Nucleic Acids Res.15：8125-8148；Kozak M(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8301-8305)；AOX1基因偏爱密码子替换编码成熟蛋白的HSA基因片段，在基因5’端插入酿酒酵母KEX-2蛋白酶加工位点(Leu-Glu-Lys-Arg)的基因序列，再与酿酒酵母来源的α-交配因子(alpha-mating factor，AMF)Prepro序列(编码85个氨基酸的基因序列)构成嵌合基因。这两种基因片段再与上游巴斯德毕赤酵母的AOX1基因5’调控区(pichiapastoris AOX1 5’regulation region)相连接，在AOX1调控区内含有启动子元件和增强子元件。

利用本发明，HSA基因在其自身信号肽序列或酵母内源性信号肽序列的引导下在巴斯德毕赤酵母中获得分泌性表达，表达产物直接分泌到培养基内，发酵液内分泌表达的水平高达每升5-6克，通过发酵生产工艺的优化工程菌还有进一步提高表达量的潜力。本发明HSA分泌表达的水平显著高于以往甲醇酵母(包括汉逊多形酵母和巴斯德毕赤酵母表达系统)生产HSA的水平(每升发酵液1-3.4克的水平)。

本发明将适合于毕赤酵母宿主菌表达的人工合成的HSA结构基因克隆至pPIC9表达载体的AOX1 5’调控区和AOX1 3’终止序列的中间，校正阅读框架，在表达载体上构成一个表达盒(expression cassette)，再将这种基因重组的表达载体(可以是环状的或线性化的)通过原生质体转化法，转化毕赤酵母菌原生质体，进而将表达盒稳定地整合到宿主菌的基因组内(即染色体上)。该表达盒AOX1 5’调控区或启动子用于增强HSA mRNA转录的速率；AOX1 3’终止序列具有终止HSA结构基因翻译和稳定mRNA转录产物的功能和作用(如促使hnRNA加polyA尾等)。

在本发明科研中发现，目的基因的ATG之前插入酵母来源的基因5’非编码区的脱氧核苷酸(5-11聚脱氧寡核苷酸序列)能提高目的基因的表达量。插入的脱氧寡聚核苷酸优先选择A和T碱基。在本发明中与HSA结构基因ATG相连接的寡聚核苷酸序列优先来自巴斯德毕赤酵母的AOX1或二羟基丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase，DAS1)基因5’端调控区序列。

已有几种调控序列被鉴定和证实，能用来在巴斯德毕赤酵母中表达HSA。从巴斯德毕赤酵母基因组中克隆的醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因和p40基因的5’调控区(启动子元件)能用来驱动下游的HSA结构基因表达。本发明优先选择的5’调控区，例如选择AOX1，AOX2和DAS1等(Stroman DW，et al.US Patent 4,855,231)。本发明最优先选择的5’调控区是选择AOX1启动子序列。

在上述讨论的表达盒内还包含3’终止序列。3’终止序列的功能是对编码的结构基因起终止、多聚腺苷化和稳定mRNA的作用。但在本发明中3’终止序列不被认为是极为关键和不可替代的。在本发明的科研过成中发现，来源于汉逊多形酵母和巴斯德毕赤酵母的3’终止序列均可被用来构建表达盒。本发明声明优先采用那些从巴斯德毕赤酵母菌来源的3’终止序列，例如AOX1基因、AOX2基因、DAS1基因、p40基因和His4基因的3’终止序列，特别优先选择AOX1 3’终止序列。

巴斯德毕赤酵母菌种能被转化多种类型的HSA结构基因(如HSA全长基因和成熟基因)。HSA结构基因可从人肝细胞cDNA文库、人肝细胞cDNA表达文库或人类基因组文库筛选重新获得(Lawn RM，et al(1981).Nucleic Acids Res 9：6103-6114；Dugaiczyk A，et al(1982).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：71-75；Dugaiczyk A，et al(1986).J Biol.Chem.261(15)：6747-6757)；也可由目前DNA化学合成的主流方法亚硫酰胺法人工合成的HSA基因。本发明涉及用巴斯德毕赤酵母AOX1基因偏爱密码子来替换HSA结构基因：由AOX1基因5’非翻译区5聚脱氧寡核苷酸加HSA全长基因；酿酒酵母来源引导肽pre-pro-AMF序列加HSA成熟基因二种结构基因，见图。上述多种途径来源的HSA结构基因克隆到一种合适的巴斯德毕赤酵母分泌性表达载体上如pPIC9、pPIC9K、pAO804、pAO815、pHIL-S1、pYAM7SP6等。本发明优先选择用巴斯德毕赤酵母AOX1基因偏爱密码子来编码的HSA结构基因和pPIC9分泌性表达载体。

质粒型载体长期以来作为重组DNA技术的关键要素和支撑技术被应用。质粒是一种存在于染色体外的双链环状DNA物质，它存在于许多微生物物种中。已发现质粒在细胞内有单个拷贝或多个拷贝的方式存在。质粒载体作为巴斯德毕赤酵母表达系统表达外源基因的运载工具，在酵母细胞中有二种存在方式：一种是作为环状质粒存在于细胞质中，这种质粒要求有自复制序列(autonomous replication sequence，ARS)存在，便于重组质粒在宿主菌细胞质自行复制、扩增(Cregg JM，1989，US patent4,837,148)，外源基因在质粒表达盒内的启动子元件驱动下进行基因表达，这就是重组质粒存在酵母菌基因组外的附加体型表达方式。另一种质粒载体被称之为线性化位点特异性整合载体(linear site-specific integrative vector)，质粒内部没有ARS，重组载体被构建完成后，用一种适当的限制性内切酶酶切线性化，转化酵母宿主菌后，被定点地稳定地整合至巴斯德毕赤酵母的染色体基因组的特异位点上。重组质粒随着酵母染色体的复制而复制，在酵母菌分裂传代中不易丢失；外源基因在表达盒内的启动子的控制下进行表达，这种表达方式被称之为整合型表达方式。本发明优先选择后一种方式，即将本发明改构的HSA结构基因稳定地整合至巴斯德毕赤酵母宿主菌基因组内，以达到超稳定表达的目的。

本发明应用了上述的线性化位点特异性整合型载体(Cregg JM，1989，US patent4,882,279；Romannos MA，et al(1995).Cur.Opin.Biotecnol.6：527-533)。这些载体一般至少有以下几个部分构成：1)一种第一次可插入DNA片段的序列；2)一种可供选择的标记基因；3)一种第二次可插入DNA片段的序列。一种包含有外源结构基因的表达盒可插入在这种载体的第一与第二可插入DNA片段之间，在标记基因的前或后面都可以。一种可供选择的方法是，如果表达盒的5’调控区或启动子元件被结合在这种可插入DNA片段之一的内部，外源结构基因被连接在启动子的下游，这样与另一个可插入DNA片段连在一起即可构建成一个表达盒。

这种第一和第二可插入DNA片段的每一个片段长度至少不能少于200bp，并且核苷酸序列与巴斯德毕赤酵母宿主菌基因组内被整合位点的基因序列有对应的同源关系，如第一可插入DNA片段的核苷酸序列与被整合位点基因的5’侧翼序列同源，则第二可插入DNA片段的核苷酸序列应与被整合位点基因的3’侧翼序列同源，这样便于线性化重组载体进行位点特异性同源重组。另外，重组整合载体的几个构成部分应该被有序定向地配置在一起，如表达盒和标记基因被配置在第一可插入DNA片段的3’端和第二可插入DNA片段的5’端，这样此种线性化重组载体与宿主菌基因组被整合位点基因通过同源重组后插入的方向也是确定的。用于作为第一和第二可插入DNA片段的核苷酸序列，与宿主菌天然基因组中修改(或置换)位点的基因序列是同源的。例如，基因组修改(或置换)位点发生AOX1基因位点，那么第一和第二可插入DNA片段可采用AOX1基因位点，两端侧翼部分(包括AOX1 5’调控区和3’终止序列)的DNA序列。在本发明中可作为第一和第二可插入DNA片段的序列，能从如下基因组内分离到的基因中选择：来源于巴斯德毕赤酵母菌株NRRL Y-11430和NRRLY-11431的AOX1基因，DAS1基因，p40基因和His4基因(US patent 4,855,231；US patent 4,885,242)。

第一可插入DNA片段内部可包含能操纵的调控区(启动子元件)，它可以构成表达盒内的调控区。第一可插入DNA片段作为表达盒的调控区的用法是优先包含在本发明内的。图1为一种表达载体示意图，在该载体中第一可插入DNA片段作为表达盒中的调控区5’AOX1，一个多克隆位(multicloning sites，MCS)与一个3’终止序列3’AOX1被配置在第一可插入DNA片段的3’端。这种线性化位点特异性整合载体的构造还有一个优点在于提供了一个结构基因插入位点，而无需再加一个相容的独立的3’终止序列。如果第一可插入DNA片段内不含一种5’调控区序列，那么一种适当的5’调控区将需要插入到结构基因的5’端，这是为提供一种可操纵的表达盒所必需的，类似地，如果第二可插入DNA片段内没有提供一种3’终止序列，那么一种适合的3’终止序列必需被连接到结构基因的3’端。这也是构成一个完整的表达盒所必需的。

人们非常期望在上述线性化整合型表达载体上至少包含有一个可供选择的标记基因。这样上述线性化位点特异性整合载体转化毕赤酵母宿主菌后，标记基因可用于对整合有外源基因片段的宿主菌从整个转化菌群体中筛选和分离出来。标记基因可授予被转化有外源基因片段的宿主菌一种新的表型特征，而野生型宿主菌则没有，譬如宿主菌产生一种特殊氨基酸能力的恢复，而没有转化外源基因的宿主菌则存在这种特殊氨基酸生物合成通路上的缺陷，或者提供对某种抗生素的抗性等。典型的可供选择的标记基因有从巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母来源的His 4基因(US patent4,885,242)和Arg 4基因(US patent 4,818,700)；从酿酒酵母来源的转化酶基因(SUC2)(US patent 4,857,467)；或者从大肠杆菌Tn601或Tn903转座子来源的G418/kanamycin抗性基因。此外，一些来自细菌质粒DNA和噬菌体DNA的序列(如Amp、fl ori和ColEl ori等序列)也被组装到表达载体上，使重组载体能在细菌宿主细胞中复制、扩增，以利于表达载体的构建和鉴定。

HSA结构基因和上述表达载体经合适的限制性内切酶酶切后，利用T4DNA连接酶连接起来构建成表达载体，其中表达载体上至少包含一个拷贝的包含HSA结构基因的表达盒。将连接液取适量后优先转化大肠杆菌宿主菌(如直接转化毕赤酵母宿主菌则转化率很低)，利用大肠杆菌的标记基因(如Amp^r、G418^r、和kanamycin等)，选择含适当抗生素的LB培养板和液体培养基对转化菌群体进行初步的筛选，繁殖和选择性扩增，抽提细菌质粒DNA进行酶切鉴定，筛选出含有HSA结构基因的宿主菌。这种宿主菌可按大规模质粒抽提方法制备大量的重组质粒，以便后续的进一步鉴定和原生质体转化。至于在重组载体上进一步鉴定由5’调控区-HSA结构基因-3’终止序列组成的表达盒的结构与方向正确与否，也可用多种技术予以鉴定：如限制性内切酶鉴定、凝胶电泳或Southern杂交技术等。

将上述构建完成的重组质粒直接或经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母宿主菌细胞，其中较成熟的转化技术有，如用氯化锂的化学转化方法(Ito，et al(1983).JBacteriol.153：163-168)；电穿孔转化方法(Bio-Rad laboratories 1991，Genepulser transfection apparatus operating instruction and applicationsguide.)；原生质体转化方法(Cregg JM，et al(1985).Mol.Cell Biol.5：3376-3385)。在本发明科研中优先选择Cregg等人提供的原生质体转化方法，重组质粒线性化和鉴定重组载体整合用Southern杂交技术。

本发明用于作为基因工程宿主菌是甲醇酵母。甲醇酵母包括假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)四个属，其表5中所有甲醇酵母菌株均可用来作为本发明改构的HSA结构基因的表达的宿主菌。在本发明的科研实践中优先选择巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母，尤其是优先选择营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)，GS190(NRRLY-18014)，PPFI(NRRLY-18017)，这些菌株的微生物学特性已被详细地描述(US patent 4,818,700和US patent 4,812,405)。在本发明科研中还发现，营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株还有便于筛选、重组和转化的作用。

            表5甲醇酵母菌株Candida boidinii                Hansenula nonfermentansCandida lipolytica              Hansenula philodenraCandida mycoderma               Hansenula holstiiCandida utilis                  Pichia farinosaCandida stellatoides            Pichia polymorphaCandida robusta                 Pichia membranaefaciensCandida claussenii              Pichia pinusCandida rugosa                  Pichia pastorisCandida tropicalis              Pichia trehalophilaHansenula minuta                Torulopsis sonorensisHansenula saturnus              Torulopsis candidaHansenula californica           Torulopsis bolmiiHansenula mrakii                Torulopsis versatilisHansenula silvicola             Torulopsis glabrataHansenula polymorpha            Torulopsis molishianaHansenula wickerhamii           Torulopsis nemodendraHansenula capsulata             Torulopsis nitratophilaHansenula glucozyma             Torulopsis pinusHansenula henricii              Torulopsis bombicol

野生型巴斯德毕赤酵母菌株如NRRLY-11430和NRRLY-11431也能直接作为本发明改构的HSA结构基因的宿主菌，只要在表达载体上克隆一个可供筛选的标记基因(如SUC2基因和neo基因等)，这样重组载体转化野生型毕赤酵母菌株后，其中转化子便能在含蔗糖的培养基或含有G418抗生素的培养基上生长，而非转化子则不能在此类培养基上生长，这样就能方便地筛选出重组转化子。

本发明将线性化位点特异性重组载体用原生质体方法转化上述甲醇宿主菌后，能用适当的技术将转化整合有HSA结构基因表达盒的转化子从宿主菌群体中筛选出来，如转化混合液涂布在RDHB(含L-组氨酸)培养板上，由于宿主菌基因组内缺失组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，his4)，因而不能利用L-组氨酸，因此不能在RDHB培养板上生长形成菌落；而线性化位点特异性重组载体上有his 4标记基因，随同HSA结构基因表达盒一起整合至甲醇酵母宿主菌的基因组内，能表达出组氨酸脱氢酶，因而能在含有L-组氨酸的RDHB培养板上生长形成菌落，这就是利用微生物营养缺陷型特性进行筛选转化子，另一方面由于定点整合，导致宿主菌基因组内整合位点基因的破坏，微生物也可能出现新的表型，如甲醇利用缓慢还是正常等。另一种常用的筛选方法是利用neo基因和zeocin基因作标记基因，在选择性培养基内加入相应的抗生物(如G418和kanamycin等)，重组转化子由于能在含抗生素的培养基中生长而得到筛选。

将上述筛选得到的重组转化子随机挑取若干克隆后，接菌入试管或摇瓶进行表达试验，进一步分离出表达HSA的达最高水平的细胞克隆，该克隆再经扩增后作为工程菌长期保存，或直接用在使用摇瓶发酵技术或罐高密度高表达发酵技术进行生产基因重组HSA产品中作为种子菌之用，这种发酵技术见Cregg等人报道(Cregg JM，et al(1987).High-level expression and efficient assembly of hepatitis Bsurface antigen in the methylotrophic yeast，pichia pastoris.Bio/Technology5：479-485；Clare JJ，et al(1991).High-level expression of tetanus toxinfragment C in pichia pastoris strains containing multiple tandem integrationof the gene.Bio/Technology 9：455-460)。

在本发明中，为了大规模工业化生产基因重组HSA产品，根据甲醇酵母，尤其是巴斯德毕赤酵母—整合型表达系统的微生物特性，在发酵罐上制定了三阶段、高密度和分批补料的发酵工程的操作程序(fermentation protocol)：1.第一阶段，也称为生长期，将上述筛选分离得到的最高水平表达HSA的工程菌作为种子菌接菌在一种酵母基础培养基(10 X Basal Salts+250 X PTM₁+8％甘油)内，这种培养基内的碳源为一种非诱导型碳源(如甘油)。当生长于含这种碳源的培养基时，这种甲醇酵母工程菌表达外源基因被完全抑制，即只允许细胞分裂、增殖，细胞密度增加，而外源基因不被表达，在生长相培养基的pH维持在5左右。2.第二阶段，这是短暂的时期，非诱导型碳源逐渐消耗贻尽诱导型碳源(甲醇)缓慢地开始补入发酵罐，发酵罐内的细胞密度在进一步增加，甲醇反应启动子(methanol responsivepromoter)的抑制状态在逐步解除。在这个阶段培养基的pH被逐步调整到生产阶段的pH值，即一般在pH5-6，优先选择pH为5.8。3.第三阶段，也称生产阶段，在这个阶段诱导型碳源甲醇开始加快补入发酵罐内，发酵罐内的细胞密度有的就不再增加(如mut^-菌株)，有的还稍有增加(如mut⁺菌株)，HSA结构基因在甲醇反应启动子(如AOX1启动子)的调控下将基因表达产物开始源源不断地分泌发酵培养基内，这种发酵方式称为限制甲醇分批补料方式(limited methanol fed-batch mode)，在整个生产阶段发酵罐内的甲醇浓度被限制0.2-0.9％的浓度范围内。本发明发酵生产HSA，在第三阶段，即生产阶段，也可采用混合补料方式(mixed feed fed-batchmode)，即非诱导型碳源甘油加诱导型碳源甲醇按一定比例(2∶1)混合后逐渐补入发酵罐内，这种发酵方式的特点是，发酵罐内的细胞密度在生产阶段还在进一步增加，含HSA结构基因的表达盒在诱导型碳源甲醇诱导下将HSA分泌到发酵培养基内。混合补料方式尤其适合用巴斯德毕赤酵母宿主菌作连续发酵，持续生产目的基因产物HSA。

本发明的具体细节将在下面的实施例中加以进一步详细描述。

下面所有实施例通用的一些材料和方法一.菌种：

1.巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(his4)NRRLY-15851；

2.大肠杆菌宿主菌：

E.coli Top10F’{proAB，lacI^q，lacZΔM15，Tn10(Tet^R)}mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，Ф 80lacZΔM15，ΔLacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara-leu)7697，galU，galK，epsL(str^R)，endA1，nupGλ^-；

E.coli JM109 F’[(recA1，supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F’[traD36 proAB⁺lacI^qlacZΔM15])；

E.coliHB101(supE44 hsd S20(rB-mB-)recA₁₃ara-14 proA₂ lac Y₁ galK₂ rpsL₂₀xyl-5mtl-1)。

以上大肠杆菌宿主菌用质粒的构建和制备。二.主要试剂

1.DNA限制性内切酶、T₄DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、Pharmacia、

  Bio-Labs及华美生物工程有限公司

2.酪蛋白水解物      (德国MERK公司产品)

3.Bacto-酵母抽提物  (美国Difco公司产品)

4.PCR扩增试剂盒     (瑞典Pharmacia公司产品)

5.DNA序列分析试剂盒 (美国USB公司产品)

6.同位素α-P³²-dATP与γ-P³²-dATP(英国Amersham公司产品)

7.丙烯酰胺(Acr)

  N，N-二甲基双丙烯酰胺(Bis)

  十二烷基硫酸钠(SDS)

  盐酸胍、尿素、TEMED          (英国Sigma公司产品)

8.IPTG、X-gal、DTT、Agarose    (英国Sigma公司产品)

9.YNB、Biotin、Agar            (美国Difco公司产品)

10.山梨醇、葡萄糖、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异

 亮氨酸、L-谷氨酸              (美国Sigma公司产品)

11.甘油、甲醇                  (上海化学试剂厂)

12.酶反应液

   限制性内切酶高盐缓冲液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，

   100mM NaCl，10mM MgCl₂

   限制性内切酶中盐缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.5)

   50mM NaCl，10mM MgCl₂

   限制性内切酶低盐缓冲液：10mM Tris-HCl(pH8.0)

   10mM MgCl₂

   T₄DNA连接酶缓冲液：50mM Tris-HCl(pH8.0)

   10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP

13.SDS-PAGE蛋白电泳试剂：

   电泳缓冲液：192mM甘氨酸，25mM Tri-HCl，0.1％SDS，pH8.3

   浓缩胶缓冲液：125mM Tris-HCl，0.1％SDS，pH6.8

   分离胶缓冲液：375mM Tris-HCl，0.1％SDS，pH8.8

   样品缓冲液(1X)：50mM Tris-HCl(pH6.8)，1％SDS，10％甘油，2.5％

   巯基乙醇，0.05％溴酚蓝

   30％丙烯酸酰胺：29％丙烯酸酰胺，1％N，N二甲基双丙烯酰胺

   考马斯亮蓝染色液：0.25％(W/V)考马斯亮蓝G-250，5％Hac，45％乙醇

   脱色液：7.5％HAc，10％乙醇

14.常用缓冲液：

   TE缓冲液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA

   STE缓冲液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，20mM NaCl

   PBS缓冲液：10mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₃(pH7.0)，150mM NaCl

   10X TBS缓冲液：每升含108克Tris碱，55克硼酸，40ml EDTA(0.5M)，

   pH8.0

   50X TAE缓冲液：每升含242克Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml EDTA

   (0.5M)，pH8.0

   饱和酚：重蒸后用TE缓冲液饱和，分装量-20℃保存

   酚∶氯仿∶异戊醇(V/V)∶1∶1∶0.8

   氯仿∶异戊醇(V/V)：24∶1

15.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制

   1.SED：1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0

   2.SCE：9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168gEDTA，pH5.8

   3.CaS：1M山梨醇，10mM CaCl₂

   4.SOS：1M山梨醇，0.3 X YPD，10mM CaCl₂

   5.CaT：20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl₂

   6.PEG：20％PEG-3350，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl(pH7.4)

   7. 1M PBS buffer：132ml 1M K₂HPO₄，868ml 1M KH₂PO₄，pH6.0。三.主要仪器设备

1.ABI381A型DNA自动合成仪，美国Applied Biosystems(ABI)公司产品；

2. 2.6升发酵罐，日本MARUBISHI公司产品；

3. 5升RIBE-5全自动发酵罐，华东理工大学国家生化工程技术研究中心产品；

4. 50升RIBE-50全自动发酵罐，华东理工大学国家生化工程技术研究中心产品；

5. 15升Biocenter 15F全自动发酵罐，华东理工大学国家生化工程技术研究中

   心产品；

6. 50升Biocenter 50F全自动发酵罐，华东理工大学国家生化工程技术研究中

   心产品。三、实验方法(一)培养基与培养条件

大肠杆菌培养基LB(1％bacto-typtone，0.5％bacto-yeast extract，1％NaCl)，固体培养基加Agar粉15g/L，大肠杆菌在37℃条件下培养；毕赤酵母丰富培养基YPD(1％Yeast extract，2％peptone，2％dextrose)；毕赤酵母原生质体再生培养基RBD[1M sorbital，1％dextrose，1.34％YNB，4X10^-5 Biotin，0.005％氨基酸混合液(包括L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸)]，如果是固体培养基则在液体培养基内加2％Agar粉；毕赤酵母菌摇瓶培养基BMGY和BMMY(1％yeast extract，2％peptone，100mM PBS buffer，pH 6.0，1.34％YNB，4X10^-5％Biotin，1％glycerol或0.5％methanol)。毕赤酵母菌在30℃条件下培养。(二)毕赤酵母菌发酵罐高密度发酵培养基与培养条件：

A.10 X Basal Salts：

  1.H₃PO₄，85％                    42ml

  2.CaSO₄·2H₂O                    1.8g/L

  3.K₂SO₄                          28.6g/L

  4.MgSO₄·7H₂O                    23.4g/L

  5.KOH                               6.5g/L

B.250 X PTMl salts：

  1.CuSo₄·5H₂O                    6g/L

  2.KI                                0.08g/L

  3.MnSO₄·H₂O                     3g/L

  4.Na₂MoO₄·2H₂O                 0.2g/L

  5.H₃BO₃                          0.02g/L

  6.CoCl₂                           0.5g/L

  7.ZnCl₂                           20g/L

  8.FeSO₄·7H₂O                    65g/L

  9.Biotin                           0.2g/L

  10.H₂SO₄                         5ml

C.glycerol                           8％(V/V)

D.Feed medium 50％glycerol(1L)+12ml/L PTM1

E.Induced medium 100％methanol+12ml/L PTM1

F.Dissolved O₂(DO)     ＞20％

G.pH                    5.0-5.8

H.Temperature           30℃(三)质粒的抽提

1.小规模质粒抽提

挑单克隆菌接种于2ml含相应抗菌素的LB培养基中，37℃振荡过夜。次日取1.5m菌液于Eppendorf管中，离心沉淀菌体，去上清。将细菌沉淀置于冰浴，依次加入100μl溶液I(50mM Glucose，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，振荡混匀，室温孵育5min；加200μl溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)，翻转混匀，冰浴5min；加150μl溶液III(3M NaAc，pH4.8)，轻微振荡混匀，冰浴5min；加入450μl重蒸酚/氯仿(1∶1)，混匀后12,000rpm离心10min，小心吸取上层水相于2倍体积的预冷无水乙醇中，-20℃冰箱内放置2小时，离心12,000rpm 15min，吸去乙醇，再小心加500μl 70％乙醇清洗除去盐份，离心抽干后加18μl TE和2μl RNAase酶液，37℃保温1小时，供酶切鉴定和进一步克隆用。

2.大规模质粒抽提

取500ml培养过夜的菌液，4℃下5000rpm离心10min，加100ml STE，悬洗后再离心收集菌体，依次加入溶液I(50mM Glucose，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)18ml，溶菌酶(10mg/ml，1％SDS)2ml，置室温孵育10min；加溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)40ml，轻轻混匀(至菌液透明为止)，冰浴5min；再加溶液III(3M NaAc，pH4.8)20ml，混匀后冰浴10min；加等体积的酚∶氯仿(1∶1)溶液抽提2次，加入2倍体积的预冷的无水乙醇-20℃放置过夜，12,000rpm离心15min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗1-2次，抽干后用3ml TE溶解，加RNA酶液(10mg/ml)10μl，37℃保温30min，上Sepharose 2B层析柱(1×10cm，用TE平衡)，用TE(pH7.6)为洗脱液收集第一峰(大分子量DNA)。将收集的样品量体积后，加入2倍体积的预冷的无水乙醇和1/10体积3M NaAc(pH5.2)，混匀放置-20℃冰箱过夜，12,000rpm离心15min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗1-2次，抽干后1ml TE溶解，取适量溶液用紫外光分光光度计260nm测定DNA含量。大规模抽提的重组质粒DNA可用于本发明的原生质体法转化毕赤酵母宿主菌和长期低温保存之用。

(四)大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化

将大肠杆菌宿主菌接种于2ml LB培养液中，37℃振荡过夜。次日取500ml过夜菌接种于50ml LB培养液中，37℃ 300rpm振荡培养1小时，至菌体密度达0.5个OD600。4℃下离心5000rpm离心5min，倾去上清，菌体加25ml含100mM CaCl₂，10mM Tris-HCl(pH7.4)的冷溶液悬浮，冰浴放置30-60min，然后再4℃ 5000rpm离心5min，小心倾去上清，菌体用氯化钙冷溶液2ml悬浮，放置冰浴40min后，即可用于转化。

取200μl上述新鲜制备的感受态大肠杆菌细胞悬于Eppendorf管内，加适量重组质粒DNA连接液10μl，冰浴30min，42℃热休克2min；加入500μl LB培养液在37℃摇床上缓摇1小时用10,000rpm离心10sec，倾去大部分LB，保留约200μl LB，用枪头轻轻将细菌悬液混匀后，分成50μl和150μl，各涂一块含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖平板，37℃培养箱内培养8-16小时。

               实施例1.适合巴斯德毕赤酵母宿主菌表达的

               人血清白蛋白全长基因和成熟基因的设计

本发明涉及化学合成HSA全长基因和成熟基因两个基因片段，其长度分别为1849bp(编码609个氨基酸)和1779bp(编码585个氨基酸)，是迄今为止国际上化学全合成的最长的功能基因之一。

本发明的设计思想为：利用目前国际上最为理想的微生物表达系统—巴斯德毕赤酵母—整合型表达系统作为本发明目的基因的表达系统；进而利用巴斯德毕赤酵母宿主菌强大的启动子醇氧化酶基因(AOX1)启动子作为驱动本发明目的基因的启动子元件；进而将HSA结构基因的密码子用醇氧化酶基因(AOX1)的高表达极端偏爱性用法的偏爱密码子来替换。

本发明涉及对HSA基因进行具体全新地设计，设计时采用了分子生物学三大核心数据库：1.国际核酸序列数据库(Gen Bank/EMBL/DDBJ)；2.瑞士蛋白质序列及注解数据库(Swiss-PROT)；3.美国Brookhaven国家实验室提供的蛋白质及生物分子三维结构数据库(Protein Data Bank，PDB)。再采用多种计算机软件包(包括美国威斯康星大学Genetic Computer Group编制的GENESIS和PROSIS软件包、美国加州理工学院编制的Caltec软件包、瑞典Pharmacia公司提供的DNASIS和PROSIS软件包以及其它程序)进行多方面的辅助分析，在计算机图形工作站(SGI R4400)上进行HSA基因全新地设计，并考虑如下原则：1.HSA合成基因尽可能选用巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(AOX1)基因偏爱的偏爱密码子，降低该基因罕用的密码子的比例，其中该基因偏爱密码子占编码的HSA合成基因密码子总数98％：2.消除HSA合成基因内部出现的复杂的二级结构(包括重复结构、互补结构、发夹结构及大片段的反向回文结构)等；3.消除了HSA合成基因内部不适宜基因操作的部分限制性内切酶位点；同时在HSA基因内部从5’至3’方向依次插入了Sal I、Hind III、Not I、Xba I四个限制性内切酶位点，使HSA基因相对均衡地被分割成五大片段，便于合成基因的拼接、克隆和组装；3.在HSA合成基因内部尽量减少连续的G-C配对，增加较多毕赤酵母偏爱的A-T配对；4.根据巴斯德毕赤酵母表达系统，重新设计了HSA基因的阅读框架，其中全长HSA基因将5’端的限制性内切酶BamH I位点插入到AOX1基因5’调控区域(启动子区域)，后接AAACG 5个脱氧寡聚核苷酸(内含真核基因的Kozak序列)，再与后面的HSA基因的起始密码子ATG相连，成熟HSA基因在5’端插入BamH I、Xho I酶切位点，在这二个酶切位点之后插入赖氨酸和精氨酸两个双碱性氨基酸密码子，用于酵母内源性的KEX-2蛋白酶加工剪切；在HSA合成基因的3’端采用了双重终止密码子TAATAG，加强翻译的终止信号，防止基因表达时发生通读，末端再加上一个EcoRI酶切位点；6.HSA全长基因在构成表达盒时直接采用HSA自身引导肽(包括18个氨基酸的信号肽和6个氨基酸的前导肽)序列融合在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子下游，来引导HSA结构基因进行分泌性表达；HSA成熟基因5’端插入XhoI酶切位点和酵母菌KEX-2蛋白酶双碱性氨基酸(-Lys-Arg-)的编码序列，将它与上游的酵母α-交配子引导肽(85个氨基酸组成)序列相融合，将此嵌合基因克隆在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子下游，在AOX1启动子的驱动下来进行HSA基因的分泌性表达。

综上所述，本发明设计的HSA全长基因和成熟基因见图3-4。

应用如下公式来计算改构HSA基因密码子偏爱指数(Codon bias index，CBI)： $\mathrm{CBI}=\frac{\mathrm{Nopt}-\mathrm{Nran}}{\mathrm{Ntot}-\mathrm{Nran}}$ 其中：Nopt为偏爱密码子(Optional Codons)在该基因密码子中出现的总数；

  Nran为所有同义密码子(Synonymous Codons)被等价地使用的数目；

  Ntot为该基因密码子的总数(应将该基因内的编码甲硫氨酸(Met)、

  色氨酸(Trp)和终止密码子等三类密码子除外)。

据统计，全长HSA基因，Ntot＝600，Nran＝9，Nopt＝591， $\mathrm{CBI}=\frac{591-9}{600-9}=98.5\%$ 成熟HSA基因，Ntot＝578，Nran＝8，Nopt＝570 $\mathrm{CBI}=\frac{570-8}{578-8}=98.6\%$

以上结果显示，本发明所设计全长HSA基因和成熟HSA基因的密码子偏爱指数分别达到98.5％和98.6％。

应用如下公式来计算改构基因密码子适合指数(codon adaption index，CAI)

         CBI＝CAIobs/CAImax                            (1) $\mathrm{CBIobs}={\left(\underset{k=1}{\overset{L}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}\right)}^{1/L}---\left(2\right)$ $\mathrm{CAI}\max ={\left(\underset{K=1}{\overset{L}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}\max \right)}^{1/L}---\left(3\right)$ 等价地计算方法还有： $\mathrm{CAI}={\left(\underset{k=1}{\overset{L}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{wk}\right)}^{1/L}---\left(4\right)$ (4)式进一步化简成为下式： $\mathrm{CAI}=\exp \frac{1}{L}\underset{k=1}{\overset{L}{\mathrm{\Σ}}}\ln \mathrm{Wk}---\left(5\right)$ 其中：CAIobs为观察的密码子适合指数；

  CAImax为最大的密码子适合指数；

  RSCU(relative synonymous codon usage，RSCU)为相对同义密码子

  用法值；

  W为每一个密码子的相对适合值，W的最大值为1；

  L为基因的长度(应将该基因内的Met、Trp和终止密码子等三类密码

  子除外)。据统计，全长HSA基因利用下式来计算CAI，相关数值见表4 $\mathrm{CAI}={\left(\frac{\underset{k=1}{\overset{600}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}}{\underset{k=1}{\overset{600}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}\max }\right)}^{1/600}$ $={\left(\frac{1.632\×2.333\×...\×1.389\×...\×2.992\×3.711}{1.632\×2.333\×...\×2.333\×...\×2.992\×3.711}\right)}^{1/600}$ $={\left(\frac{1.389\×0.368\×0.350\×1.271\×0.357\×0.357\×0.357\×0.357}{2.333\×1.632\×2.353\×2.353\×1.643\×1.643\×1.643\×1.643}\right)}^{1/600}$ $={\left(\frac{3.649\×{10}^{-3}}{153.613}\right)}^{1/600}$

  ＝(2.404×10^-5)^1/600

  ＝98.2％成熟HSA基因利用下式来计算CAI， $\mathrm{CAI}={\left(\frac{\underset{k=1}{\overset{578}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}}{\underset{k=1}{\overset{578}{\mathrm{\Π}}}\mathrm{RSCUk}\max }\right)}^{1/578}$ $={\left(\frac{1.506\×2.353\×...\×0.368\×...\×2.992\×3.711}{1.506\×2.353\×...\×1.632\×...\×2.992\×3.711}\right)}^{1/578}$ $={\left(\frac{0.368\×0.350\×1.271\×0.357\×0.357\×0.357\×0.357}{1.632\×2.353\×2.353\×1.643\×1.643\×1.643\×1.643}\right)}^{1/578}$ $={\left(\frac{2.659\×{10}^{-3}}{65.844}\right)}^{1/578}$

   ＝(4.059×10^-5)^1/578

   ＝98.3％

根据上述理论计算结果，本发明所设计全长HSA基因和成熟HSA基因的密码子适合指数分别达到98.2％和98.3％。

               实施例2适合巴斯德毕赤酵母宿主菌表达的

               人血清白蛋白全长基因和成熟基因的化学合成

本发明涉及将实施例1设计的HSA全长基因(以下称X基因)和成熟基因(以下称Y基因)采用双链全合成的战略：先合成互补的寡聚核苷酸片段，根据其粘性末端依次拼接成5个大片段；将这5个大片段分别克隆至pBluescriptSK载体相当的位点上，进行DNA序列测定；将测序正确的这5个大片段进一步组装成设计的全长基因和成熟基因。再进行DNA序列测定，验证化学合成的基因与设计方案是否完全一致。具体的化学合成流程图如下(以X基因为例).

                          X基因的化学合成

                     Step1.克隆Xa、Xb、Xc、Xd和Xe

                      寡聚核苷酸片段的化学合成

                                 ↓

                       用多聚核苷酸激酶磷酸化

                                 ↓

                     磷酸化寡聚核苷酸片段的退火

                                 ↓

                         用T4DNA ligase连接

                                 ↓

                    连接的DNA大片段用适当的限制性

                       内切酶酶切产生粘性末端

                                 ↓

                         基因大片段用琼脂糖凝胶

                             电泳分离与纯化

                                   ↓

                      基因大片段与pBluescript载体

                        连接、转化大肠杆菌宿主菌

                                   ↓

                        小规模质粒制备与酶切鉴定

                                   ↓

                               DNA序列测定

                          (Xa、Xb、Xc、Xd和Xe)

                                   ↓

              Step2.             组装X基因

                        (连接Xa、Xb、Xc、Xd和Xe)

                                   ↓

                           转化大肠杆菌宿主菌

                                   ↓

                        小规模质粒制备与酶切鉴定

                                   ↓

                               DNA序列测定

                        组装Y基因(连接Ya大片段

                           与Xb-Xc-Xd-Xe片段)

                                   ↓

                           转化大肠杆菌宿主菌

                                   ↓

                        小规模质粒置备与酶切鉴定

                                   ↓

                               DNA序列测定

X基因和Y基因具体地分成寡聚核苷酸片段、大片段以及插入适当的酶切位点。其中X基因被分成Xa、Xb、Xc、Xd和Xe 5个大片段。Xa进一步分成20个寡聚核苷酸片段，依次为X₁、X₂、X₁₇、X₁₈、A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇、A₈、A₉、A₁₀、A₁₁、A₁₂、A₁₃、A₁₄、A₁₅和A₁₆。Xb进一步分成12个寡聚核苷酸片段，依次为B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇、B₈、B₉、B₁₀、B₁₁和B₁₂。Xc进一步分成20个寡聚核苷酸片段，依次为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₂₁、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉和C₂₀。Xd分成8个寡聚核苷酸片段，依次为D₁、D₂、D₃、D₄、D₅、D₆、D₇和D₈。Xe分成18个寡聚核苷酸片段，依次为：E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、E₁₇和E₁₈。Y基因X基因比较，仅第一个大片段Xa有差异，其余四个大片段与X基因Xb、Xc、Xd和Xe不论顺序还是DNA序列都完全相同。Ya进一步分成18个寡聚核苷酸片段，依次为Y₁、Y₂、A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇、A₈、A₉、A₁₀、A₁₁、A₁₂、A₁₃、A₁₄、A₁₅和A₁₆，其中A₁至A₁₆ 16个寡聚核苷酸片段与X基因完全相同，见图15。

寡聚核苷酸片段的化学合成与纯化

本发明涉及的所有上述寡聚DNA核苷酸片段分别在ABI DNA合成仪进行合成。去保护基后，每一个DNA片段分别用16％变性胶聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)进行电泳，电泳完毕后，在紫外灯下切下相当的条带，用0.5M NaCl溶液浸泡，保持在室温过夜。然后用C₁₈柱脱盐。洗脱液用60％甲醇，收集液用真空抽干。每一个DNA寡聚核苷酸片段的纯度被进一步鉴定，由γ-P³² dATP同位素末端标记每一个DNA片段反应由多聚核苷酸激酶(polynucleotide kinase)催化，然后用16％PAGE电泳，电泳结束后用X-光片压片及放射自显影检查其纯度。供合成基因用的每个DNA寡核苷酸片段的纯度应达到或超过99％，如果纯度不够，必须被重新纯化。

pBluescript SK载体DNA制备

X基因和Y基因都分成5个片段，酶切位点也相同(以X基因为例)：

对于BamHI-Sal I大片段的Xa与Ya，Sal I-Hind III大片段的Xb，Hind III-Not I大片段的Xc，Not I-XbaI的大片段Xd，Xba I-EcoRI大片段Xe，这些大片段分别被克隆到pBluescript SK载体的相应的酶切位点上。下面的方案(protocol)是一个典型方法(以Xa为例)：0.05μg pBluescript载体DNA用BamHI-Sal I双酶切，被酶切过的载体DNA用Qiagen柱纯化。收集液用2倍体积预冷的无水乙醇沉淀，离心12,000rpm 15min，沉淀用70％乙醇洗1-2次，离心后弃乙醇溶液，沉淀真空抽干冷冻保存备用。

寡聚核苷酸片段的磷酸化与连接

同样以Xa大片段拼接为例，其余大片段的拼接以此类推。每一个寡聚DNA片段(含0.1OD)10μl(Xa大片段有20个寡聚DNA片段)加到1.5ml Eppendorf管内，再加100μl溶液(含1μmole ATP，20μl 10 X kinase buffer，40 U的多聚核苷酸激酶)，轻轻混匀，在37℃孵育60min。然后75℃ 15min灭活kinase，加入700μl预冷的无水乙醇，混匀，在-20℃放置2小时，离心12,000rpm 15min，弃乙醇，沉淀用70％乙醇洗1-2次，离心，抽干，冷冻保存备用。

将上面磷酸化的DNA片段溶于100μl TE内，浓度为1ng/1μl。加寡聚DNA片段混合液20μl，加入2.2μl 1M NaCl，混匀后加热至75℃变性2min，然后在2小时内逐渐退火，冷却至室温，在这种退火液中加50μl溶液(10 X ligase buffer 7μl，1μmole ATP，20 U的T₄DNA ligase)，在12℃孵育过夜。

上述连接液取适量用相应的限制性内切酶酶解，产生相应的两个粘性末端，便于将大片段克隆至pBluescript SK载体相应的多克隆位点(MCS)上。如Xa大片段可用BamH I-Sal I双酶切，再用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀法回收DNA大片段。取这样品1μl与2μl DNA Marker(100bp梯子)用16％PAGE电泳鉴定，溴乙  染色，检查相当的DNA片段的大小。这种酶切鉴定后的DNA大片段可用于进一步克隆。将上述酶切后的DNA大片段克隆至pBluescript SK载体上，加pBluescript SK载体(BamH I-Sal I酶切，50ng)10μl，10 X ligase buffer 4μl，Xa DNA大片段(50ng)10μl，T4DNA ligase 20 U，用灭菌双蒸水补足40μl体系，混匀，12℃连接过夜。取上述连接液1μl来转化大肠杆菌HB101感受态宿主菌。随机挑取12-18个克隆，用碱变性法快速抽提双链质粒DNA，用BamH I-Sal I双酶切鉴定，结果有3个克隆含有相应大小的DNA片段。用类似方法，获得了4个克隆的Xb，7个克隆的Xc，5个克隆的Xd，6个克隆的Xe和9个克隆的Ya。

将上述各个阳性克隆在大肠杆菌中扩增后，用小规模质粒抽提法进行双链质粒DNA的抽提，再分别用Qiagen kit进一步纯化。用这些纯化后的双链DNA作模板，在DNA全自动测序仪上进行序列分析。结果测出2个克隆的Xa，2个克隆的Xb，1个克隆的Xc，1个克隆的Xd，2个克隆的Xe和2个克隆Ya，与设计的基因片段的序列完全一致。

X基因与Y基因的组装

将上述测序正确的含Xa、Xb、Xc、Xd、Xe和Ya大片段DNA的pBluescript SK重组载体分别用BamH I-SalI、Sal I-Hind III、HindIII-Not I、Not I-Xba I、XbaI-EcoRI进行酶解。酶切产物分别3％琼脂糖凝胶电泳，用刀片切下含相应大小的DNA片段的胶条，再用Qiagen kit回收DNA片段。每个大片段DNA分别用10-50μl TE溶解，使其浓度为10ng/10μl。

取上述每个大片段DNA各2μl(X基因Xa-Xb-Xc-Xd-Xe)，0.2N NaCl 10μl，加热至75℃变性2min，然后在3小时逐渐退火到室温。加40μl溶液(含10 Xligasebuffer 6μl，ATP 1μmol，T₄DNA ligase 10 U，用灭菌双蒸水补足60μl体系)，混匀后在12℃连接过夜。取上述连接液1μl来转化大肠杆菌HB101感受态宿主菌。随机挑取36个克隆，用碱变性法快速抽提双链质粒DNA，用BamH-EcoRI双酶切鉴定，结果10个克隆的X基因被筛选出来。用纯化后的双链DNA作模板，在DNA全自动测序仪上进行序列分析。结果测出2个克隆的X基因与设计的基因序列完全一致，见图20-28。

Y基因的组装是将测序正确的X基因，用BamHI-Sal I酶解，经纯化后，将含有Xbcde片段与Ya大片段连接组装而成。再在DNA全自动测序仪上进行序列分析。结果测出3个克隆的Y基因与设计的基因完全一致，见图29-32。

X、Y基因限制性内切酶的图谱见图17-19。

              实施例3表达载体pHSA201和pHSA301的构建

将实施例2内化学合成的人血清白蛋白的全长基因(1849bp)用BamHI-EcoRI双酶切从pBluescript SK克隆载体上切下；编码成熟蛋白的HSA基因(1779bp)用XhoI-EcoRI双酶切从pBluescript SK克隆载体上切下，片段经1％Agarose琼脂糖凝胶电泳，切下相应大小的胶条，分别用DNA回收kit回收目的基因的片段。将Hsa BamHI-EcoRI片段与HSA XhoI-EcoRI片段分别克隆到用相应酶切的巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建成pHSA201(含HSA BamHI-EcoRI片段)和pHSA301(含HSA XhoI-EcoRI片段)重组载体的流程图见图33-34，连接反应体系为：

HSA DNA片段  (60ng)4μl    T₄ DNAligase(2U)1μl

pPIC9载体      (240ng)5μl    ddH₂O        6μl

5 X ligase buffer  4μl在20μl反应体系内，16℃连接过夜。

将上述含重组质粒pHSA201或pHSA301的连接液分别加4μl和8μl二个浓度转化感受态大肠杆菌JM109宿主菌，涂布于LB(含氨苄青霉素20μg/ml)平板上，37℃培养箱培养过夜。然后，将含有重组质粒pHSA201或pHSA301的转化菌落随机挑取其中18个菌落，分别接菌于2ml LB(含氨苄青霉素20μg/ml)，在摇床上振荡6-8小时，用碱变性法快速抽提质粒双链DNA，再分别用BamHI-EcoRI或XhoI-EcoRI酶切，1％agarose琼脂糖凝胶电泳，鉴定出符合相应大小的含HSA基因的重组子，其中鉴定出含HSA BamHI-EcoRI片段的4个克隆，含HSA XhoI-EcoRI片段的5个克隆。再从上述鉴定出来的含pHSA201或pHSA301重组质粒的大肠杆菌宿主菌内接菌，按大规模质粒抽提法抽提大量的含pHSA201或pHSA301重组质粒，用于转化巴斯德毕赤酵母宿主菌或长期保存。供转化巴斯德毕赤酵母菌的重组质粒应用限制性内切酶Bgl II线性化，方法为取重组质粒pHSA201或pHSA301各20μg，用10 X低盐浓度缓冲液，再加入Bgl II限制性内切酶2 U，37℃保温2小时，使之完全线性化，再将酶裂解反应液75℃保温10min，使Bgl II内切酶灭活，供用原生质体转化方法转化巴斯德毕赤酵母宿主菌之用。

             实施例4.用酵母原生质体转化方法转化

           重组质粒pHSA201或pHSA301至巴斯德毕赤酵母宿主菌

巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(NRRLY-15851)生长在YPD培养板上，挑取单克隆GS115菌落至5ml YPD液体培养基内，30℃振荡过夜。取20μl菌液至100ml YPD液体培养基内，30℃振荡过夜。将100ml菌液在室温用1500g离心10min，弃上清；用20ml灭菌水悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心10min，弃上清；用10ml SED悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心5min，弃上清；用10ml山梨醇悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心5min，弃上清；用10ml SCE悬浮酵母细胞，加入3μlZymolgase(蜗牛酶，Sigma公司产品，3mg/ml)，在30℃孵育30-45min，使酵母宿主菌约70％左右形成原生质体为佳；在室温将酵母菌原生质体用750g离心10min，弃上清；加入5ml 1M山梨醇悬浮酵母原生质体，在室温用750g离心10min，弃上清；加入5ml CaS悬浮酵母菌原生质体，在室温用750g离心10min，弃上清，再加0.6-1ml CaS悬浮酵母菌原生质体(在30min内供转化使用)。

取上述巴斯德毕赤酵母菌原生质体液100μl分别加入实施例3中用BgI II限制性内切酶线性化的重组质粒pHSA201、pHSA301或pPIC9空载载体(作为目的基因表达的对照之用)，各10μl(含5μg线性化DNA片段)，在室温孵育10min；每管加入1ml新鲜配制PEG/CaT(1∶1)溶液，混匀后室温孵育10min；在室温用750g离心10min，弃上清，用吸水纸吸干Eppendorf管内所有的液体；再在每管内加入150μl SOS溶液，室温孵育20min，再在每管内加入850μl山梨醇溶液，充分混匀后，再从每管内各取100-300μl转化液加至10ml溶化后保温在45℃的RD内，快速混匀后，铺于RDB板上，在30℃培养箱内倒置培养4-6天。在RDB培养板上可长出许多单克隆的含有重组质粒阳性菌落。

        实施例5.人血清白蛋白的改构基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将实施例4中用原生质体转化法转化的含有线性化位点特异性整合载体的重组载体pHSA201、pHSA301或pPIC9空载载体表达盒的阳性转化子从RDB培养板上分别随机挑取24个克隆，接种于4ml GMMY培养液中，在30℃摇床振摇36-48小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品被分别进行6％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表达克隆，其中含pHSA201重组质粒的筛选出4个克隆，含pHSA301重组质粒的筛选出3个克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用表型等鉴定之用。

挑取上述工程化的高表达克隆(含pHSA201或pHSA301重组质粒)的菌落接种于4ml GMGY液体培养基中，30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml GMGY培养基内，在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清，然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD₆₀₀，基因表达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心20min，弃菌体，含大量HSA表达产物的上清液，可用低温乙醇(乙醇浓度6％)沉淀，Sephadex G-25和Sephadex G-75凝胶排阻层析法纯化，再进一步在FPLC上MONO Q HR 5/5和Superdexp30层析柱进一步纯化，柱层析收集的蛋白峰流出液用冷冻干燥机抽成干粉，样品可用于SDS-PAGE电泳鉴定，Western-blot分析、N-端氨基酸序列分析和作肽图、做HSA溶液构象鉴定等重组HSA的分析工作。

    实施例6.巴斯德毕赤酵母工程菌在50L发酵罐上的高密度发酵试验

                  —重组人血清白蛋白的大规模生产

在本实施例中将巴斯德毕赤酵母工程菌分别在2.6L、5L、15L和50L发酵罐上用补料-分批发酵方式(Fed-bach-fermentation)进行高细胞密度培养发酵试验，目的在于探索大规模生产基因重组人血清白蛋白的途径。

巴斯德毕赤酵母工程菌菌株GS115：pHSA201或GS115：pHSA301生长在YPD平板上，挑取单克隆菌落接种于BMGY液体培养基中，在摇床上振荡24小时。将种子菌转接于250ml BMGY液体培养基中，在摇床上继续振荡24小时。再将种子菌转接于5L发酵罐内的基础培养基内。基础培养基由10 X Basal salt+250 X PTM1+5％(w/v)甘油+0.05％泡敌组成。种子菌在5L发酵罐内培养20-24h，菌体密度达到130-150 OD₆₀₀，将其接菌至50L发酵罐内。50L发酵罐盛放基础培养基25L，基础培养基由10 X Basal salt+250 X PTM₁+8％(w/v)甘油+0.05％泡敌组成。分批生长条件包括：pH＝5.5-5.8(由25％氢氧化铵溶液控制)；发酵温度T为30℃；发酵罐内的溶氧量(DO)大于20％空气饱和度。

发酵罐内的甲醇酵母工程菌生长24小时左右，基础培养基内作为碳源的甘油基本上完全耗竭。然后一种限制的甘油补料通过蠕动泵开始输入发酵罐内，补料液内含50％(w/v)甘油+12ml/L PTM1，补料时间为17-28小时，补料速度为200-260ml/小时。限制性的甘油补料结束后，一种缓慢的甲醇补料开始进行，补料液内含100％甲醇+12ml/L PTM1，开始时补料速度仅为10-15ml/小时，经过几个小时的缓慢补料，直到罐内工程菌对甲醇限制的培养物反应出现。这种培养物反应表现为突然地溶氧量增加与甲醇补料的短暂停顿。之后，甲醇补料速度开始加快，罐内的甲醇浓度在此后的整个诱导表达时期被在线检测，补料速度由计算机编程过程控制自动地调整，维持罐内培养基内的甲醇浓度在0.2-0.9％之间。在整个发酵过程的不同时间点，对发酵液内的总蛋白进行在线跟踪检测：用血制品人血清白蛋白所作的标准曲线求得的经验方程，计算发酵液内的总蛋白含量。

对发酵罐内每批发酵液中分泌表达HSA的表达量进行定量分析。取每批发酵液若干，进行离心5000g X 20min，弃菌体，上清液经浓缩、G-25脱盐后，样品进行SDS-PAGE电泳，然后用考马斯亮蓝进行染色，再将电泳条带用光密度法进行定量分析，并用天然血制品HSA纯净样品的不同浓度的SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝电泳条带的面积作标准，进行对发酵罐内生产的重组HSA的表达量作定量分析，一些发酵指标见表6。

          表6用高密度发酵技术生产基因重组人血清白蛋白批次    菌株             pH       甲醇诱导时间    细胞干重    HSA表达量

                                 (小时)        (g/L)        (g/L)1   GS115：pHSA201S₁    5.78         101            79          2.652   GS115：pHSA201S₂    5,85         168            185         5.683   GS115：pHSA201S₃    5.80         192            163         5.964   GS115：pHSA201S₄    5.90         258            169         4.675   GS115：pHSA301S₁    5.76         102            80          2.456   GS115：pHSA301S₂    5.85         168            178         5.537   GS115：pHSA301S₃    5.80         256            152         4.58

Claims (15)

1、一种编码人血清白蛋白的改构基因，包含图3a-3c所示的第84-1838位的核苷酸序列。

2、一种改构的编码人血清白蛋白的全长基因，包含1)图3a-3c所示的第12-1838位的核苷酸序列，或2)图4a-4c所示的第12-2021位的核苷酸序列。

3、根据权利要求2所述的改构的编码人血清白蛋白的全长基因，其特征在于：在人血清白蛋白引导肽序列ATG之前插入5聚脱氧寡聚核苷酸AAACGATG，其中内含有真核基因保守的Kozak序列AXXXATG。

4、一种表达载体，包含：

1)一种巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区，内含启动子元件，这种5’调控区选自毕赤酵母来源的醇氧化酶AOX1基因、二羟基丙酮合成酶DAS1基因或组氨醇脱氢酶HIS4基因，调控区的3’末端与下述2)的序列相连接；

2)权利要求2所述改构的编码人血清白蛋白的全长基因之一；

3)一种甲醇酵母来源的3’终止序列，这种3’终止序列选自巴斯德毕赤酵母来源的AOX1基因、AOX2基因、p40基因或His4基因的3’终止序列。

5、根据权利要求4所述的表达载体，还包含至少一个可供筛选的标记基因和一个在大肠杆菌宿主菌内能复制的复制起点的DNA片段。

6、根据权得要求4所述的表达载体，它是环状质粒。

7、根据权利要求4所述的表达载体，其中至少含有一个拷贝的改构的编码人血清白蛋白的全长基因。

8、根据权利要求4所述的表达载体，其中启动子元件与3’终止序列都是从巴斯德毕赤酵母AOX1基因分离得到的DNA片段。

9、根据权得要求4所述的表达载体，其中含有多拷贝的1)-3)的序列。

10、根据权利要求9所述的表达载体，其中多拷贝的1)-3)的序列之间以头-尾相连接的方式串联在一起。

11、根据权利要求4所述的表达载体，它是图25所示的pHSA201。

12、根据权利要求4所述的表达载体，它是图26所示的pHSA301。

13、根据权利要求4所述的表达载体，它是限制性内切酶Bg1II酶后的线性化载体。

14、权利要求4-13任一项的表达载体转化的甲醇酵母宿主菌。

15、根据权利要求14的甲醇酵母宿主菌，它选自巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115NRLLY-15851或假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母三个属的甲醇酵母。

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