KR970002914B1 - Hsa의 제조 방법, 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 및 이로써 형질 전환된 메틸 요구 효모 - Google Patents

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Abstract

내용없음

Description

HSA의 제조 방법, 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 및 이로써 형질 전환된 메틸 요구 효모
제1도는 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터를 포함하는 플라스미드 pA0804를 나타낸 도면이다.
제2(a)도는 pA0804의 선형지도이다.
제2(b)도는 pA0804의 유도체인 pA0807의 선형지도이다.
제2(c)도는 pA0807N의 선형지도이다.
제2(d)도는 pHSA113의 선형지도이다.
제3도는 pA0807N의 원형 묘사도이다.
제4도는 NRRL B-18115의 자체적으로 복제되는 효모 플라스미드 DNA인 플라스미드 pTHFK△의 도면이다.
제5도는 pTHFK△의 유도체인 pHSA13의 도면이다.
본 발명은 재조합 DNA 바이오기술 분야에 관한 것이다. 한가지 양상에 있어서, 본 발명은 메틸요구 효모내에서 인간 혈청 알부민(HSA)의 발현을 위한 방법에 관한 것이다. 또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 새로운 DNA 분자 및 이로써 형질 전환된 새로운 효모 균주에 관한 것이다.
인간 혈청 알부민은 성인의 가장 풍부한 플라스마 단백질이다. 알부민의 농도는 70kg 성인 남자에 대해 인간 몸체 전반적으로 순환하는 알부민의 40mg/ml 또는 160g이다. 이 단백질은 구리, 니켈, 칼슘(약하게는, 2-3 결합 부위), 빌리루빈 및 프로토포르피린, 긴 사슬 지방산, 프로스타글란딘, 스테로이드 호르몬(막을 통한 이들의 전달을 촉진하는 이들의 호로몬과 약하게 결합), 티록신, 트리요오드 티로닌, 시스틴 및 글루타티오닌의 수송 및 결합의 기능 및 삼투압을 유지한다. 페터스 일동에 따라 정제된 알부민의 10,000kg 이상을, 미국에서는 순환 장애 또는 알부민 고갈을 갖는 환자에게 일년에 일회 튜여한다.
주로, HSA의 상업적 원료는 오직 분류화된 혈액으로부터이다. 혈액 방출 오염원 및 병원체의 가능한 위험을 고려할때, HSA 생성의 대안적 방법의 개발은 HSA의 상업적 생성에 상당히 공현할 것이다. 재조합 DNA 바이오 기술의 도래와 함께, 현재 대안적 방법에 의한 HSA의 생성이 가능하다.
HSA는
Figure kpo00002
세포 내에서 생성되기는 하지만, 불행하게도, 이 숙주 내에서 HSA를 생성하는데는 상당한 결점이 있다. 예를 들면,
Figure kpo00003
는, 값비싼 정제 단계에 의해 제거되어야만 하는 세포 내 독소틀 생성하기 때문이다.
따라서, HSA의 제조를 위한 방법의 개발은 본 분야에 상당한 공헌을 하게 될 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 HSA의 향상된 생성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HSA를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 새로운 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HSA의 향상된 생성을 가능하게 하는 벡터 또는 벡터들로 형질 전환된 새로운 메틸요구 효모(methylotropic yeast)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 HSA를 암호화하는 세로운 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라서, HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 양립 가능성(compatible) 발현 카세트(cassette)를 갖는 적어도 하나의 벡터로 메틸 요구 효모를 형질 전환시키고, HSA의 생성물을 얻기 위해 적당한 조건 하에서 결과 형성된 형질 전환체를 배양하는 것을 포함하는 HSA의 생성에 관한 방법 및 HSA를 암호화하는 새로운 뉴클레오티드 서열을 발견했다.
제1도는 시계 방향의
Figure kpo00004
-
Figure kpo00005
의 단편 내에 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터를 포함하는 플라스미드 pA0804를 나타낸다. 구조 유전자는 이 플라스미드의 유일한
Figure kpo00006
부위에 삽입될 수 있다. 본 플라스미드는, 제1도에 해당하는 선형 ∼7.44Kb
Figure kpo00007
단편을 회수하기 위한
Figure kpo00008
소화 및 겔 전기 영동에 의해, NRRL의 B-181l4의 플라스미드 DNA로부터 회수될 수 있다.
제2(a)도는 pA0804의 선형지도를 제공한다.
제2(b)도는 대략 458 염기쌍의 fl-ori를 함유하는 pA0804의 유도체인 pA0807의 선형지도를 제공한다.
제2(c)도는 pA0807의
Figure kpo00009
부위의 자리에 삽입된
Figure kpo00010
부위를 갖는 pA0807N의 선형지도를 제공한다.
제2(d)도는 유일한
Figure kpo00011
부위에 삽입된 HSA 유전자를 갖는 pA08070N의 선형지도인 pHSA113의 선형지도를 제공한다.
제3도는 원형으로 묘사된 pA0807N을 제공한다.
제4도는
Figure kpo00012
소화 겔 전기 영동 및 6.2Kb
Figure kpo00013
단편의 회수에 의하며, NRRL B-18115의 자체적으로 복제할 수 있는 효모 플라스미드 DNA인 플라스미드 pTHFK△를 나타낸 것이다.
제5도는 pTHFK△의 유일한
Figure kpo00014
부위에 삽입된 HSA 유전자를 함유하는 pTHFK△의 유도체인 pHSAl3을 나타낸다.
HSA의 구조 유전자는, 라운 일동, Nuc. Acids. Res. 9:6l05(1981), 듀가이크 지크 일동. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 71(1982)에 의해 서열화된다.
이 유전자는 실시예 I에 기술된 바에 의해, 또는 라운 일동., 듀가이크 지크의 기술에 의한 유전자의 재분리에 의해 얻을 수 있거나, 영국 바이오 테크놀로지 주식회사와 같은 주문 유전자 제조업체에 의해, 생체 외에서 합성될 수 있다. HSA 유전자를 얻을 수 있는 한가지 방법은 올리고 뉴클레오티드 프로우브(probe)및 임의로 HSA 구조 유전자에 대한 면역 스크리닝 양성 집락과 함께 간(liver)의 cDNA 라이브러리(library)를 스크리닝하는 것이다. 이 유형의 분리 계희을 수행하며 표 1에 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 HSA 유전자를 분리한다.
[표 1]
Figure kpo00015
표 1에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은, Ml3 유도체를 사용하는 서브클로닝(subcloning) 또는, 생거 일동.,
Figure kpo00016
74, 5463(1977)의 디데옥시 뉴클레오티드 사슬 종결법과 같은 임의의 적당한 기술에 의해 수행될 수 있는 분리된 HSA DNA의 서열화(서열화는, J. Mol. Biol. 142,1617(1980)에 기술한 바와 같다.)에 의해 얻어진다.
이 서열은 라운 일동 및 듀가이크 지크 일동에 의해 공개된 서열과 비교되는 새로운 뉴클레오티드 서열이다. 뉴클레오티드 서열의 비교는 하기 표 2에 제공된다.
[표 2]
Figure kpo00017
(원료 :1) 라운 일동., 2) 듀가이크 지크 일동., cDNA, 3) 듀가이크 지크 일동, 게놈 DNA, 4) 실시예 I
HSA에 대한 구조 유전자가 일단 회수되면, 유전자를 증식시키거나 또는 유전자 등을 조작하기 의하여 양립할 수 있는(compatible) 숙주세포주 및 벡터에 구조 유전자를 우선 삽입시키는 것이 필요할 수 있다.
숙주의 배양은 임의의 적당한 수단으로 달성될 수 있다. 숙주를 배양하기 위한 일반적 기술은 본 분야에 이미 공지되었으며, 여기서 사용된 균주의 특이한 요구에 대한 이들 방법의 임의의 선택은 본 분야의 당업자들이 잘 할 수 있다.
숙주로부터 플라스미드 DNA를 회수하는 것은, 이것의 작은 크기 및 닫힌 원형의 나선형에 기인한 여러가지 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수집한 숙주 세포를 원심 분리에 의해 펠릿화한 후, 재현탁하고 용해시킨다. 용해물을 원심분리하여 세포 부스러기를 제거해야 하며, DNA를 함유하는 상등액을 보유한다. DNA로부터 대부분의 다른 오염원을 제거하기 위해 페놀 추출을 수행할 수 있다. 이후에 페놀-추출된DNA를 밀도 구배 원심분리 또는 겔 여과 기술을 사용하여 더 처리하여 박테리아 DNA로부터 플라스미드 DNA를 분리할 수 있다. 상기 언급된 분리를 수행하기 위한 기술은 본 분야에 공지되었으며, 이들 기술을 수행하는 수많은 방법이 공지되었다.
HSA 구조 유전자의 회수를 용이하게 하기 위한 방법으로, 선택된 플라스미드를 절단할 적합한 엔도뉴클레아제를 선택함으로써, 플라스미드의 뉴클레아제 소화를 달성할 수 있다. 사용되는 엔도뉴클레아제는 HSA유전자가 절삭될 플라스미드에 의존할 것이다.
DNA의 겔 전기 염동은 수많은 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 피이. 지이. 시일리 및 이이. 엠. 서어딘의 핵산의 겔 전기 영동-실제의 접근(디이. 락우트 및 비이. 디이. 햄스 편집) p.39(l982)을 참조하라. 또한, 전기 용출, 분산, 겔 용해(아가로스 겔) 또는 물리적 압출(아가로스 겔)과 같은, 겔과 관련된 수많은 적절한 기술을 사용하여 용출을 달성할 수 있다. 또한, 고급이며, 낮은 용융 온도를 가지는 아가로스와 같은 몇몇 겔로써 용출이 행해질 필요는 없다는 것도 알게 되었다.
HSA 구조 유전자 또는 단편을 함유하는 단편을 분리했을때, 벡터 내에 삽입시키기 전에 부가적인 조작이 요구될 수 있다. 이들 조작은 단편의 블런트 말단화 또는 링커의 첨가를 포함할 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다.
HSA 구조 유전자의 분리에 이어서, 유전자를 플라스미드 또는 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터와 같은 적당한 메틸요구 효모 벡터에 삽입한다. 바람직하게 본 발명의 실시를 위한 벡터는 피치아
Figure kpo00018
속(屬),보다 바람직하게는 피치아 파스토리스
Figure kpo00019
와 양립할 수 있는 것이다.
플라스미드는 오랫동안 재조합 DNA 기술에서 사용되는 기본 요소가 되어 왔다. 플라스미트는 미생물에서 발견되는 원형 염색체의 이중 가닥 DNA이다. 플라스미드는 세포당 단일 또는 다중 복사로 발생되는 것으로 발견되었다. 플라스미드 DNA에 포함되는 것은, 크레그에 의해 1986년 5월 4일 공개된 유렵 출원 제0180899호에서 기술되는 바와 같은 자발적인 복제 서열인 플라스미드의 재생성을 위해 요구되는 정보이다. 형질 전환 세포에서 플라스미드를 표현형으로 선택하는 하나 이상의 수단 또한, 플라스미드 내에서 암호화되는 정보 내에 포함될 수 있다. 숙주 생화학 경로에서 결점을 보완하는 유전자 또는 항생 물질 내성 유전자와 같은 선택 마아커, 또는 표현형 마아커는, 형질 전환된 숙주 세포의 클론이 인지되고 선택되며 유지될수 있도록 한다.
메틸 요구 효모 내에서 HSA 구조 유전자를 발현시키기 위해, 유전자가 5' 조절 영역 및 3' 종결 서열에 실시가능하게 연결되어야만 하며, 이는 벡터를 통해 숙주로 삽입될 발현 카세트(cassette)를 형성한다.
하기 용어들은 명백히 하기 위해 여기에 정의된다.
실시 가능하게 연결된…성분들이 기능을 수행하기 위해 배치된 병렬을 말한다.
조절 영역…다양한 자극에 반응하고 mRNA 전사의 속도에 영향을 미치는 DNA 서열
3' 종결서열…폴리아데닐화를 유도하는 서열과 같은, mRNA를 안정화하도록 작용하는 멈출 코오돈에 대한 3' 서열
피치아 양립성…피치아로부터 유도된 3' 종결 서열 및 조절 영역과 같은, 피치아 내에서 그들의 정상적 기능을 수행할 DNA 서열을 말한다.
유럽 출원 연속 번호 86114700.7에서 기술된 바와 같은, 크레그의 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터와 같은 삽입성 벡터는 현재 공개 유럽 특허 출원 226752호로서 공개되어 있다. 이러한 벡터는 적어도 l) 첫번째 삽입성 DNA 단편; 2) 선택성 마아커 유전자; 및 3) 본 발명의 실시를 위해서 사용될 수 있는 두번째 삽입성 DNA 단편의 연속적으로 배열된 서열을 포함한다.
첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편들은 길이가 각각 적어도 약 200 뉴클레오티드이며, 형질 전환될 속(屬)의 게놈 DNA의 부분에 동형인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 삽입성 벡터의 다양한 성분은 발현 카세트 및 선택성 마아커 유전자가 첫번째 삽입성 DNA 단편의 3' 말단 및 두번째 삽입성 DNA 단편의 5' 말단사이에 배치되는 것과 같이 DNA의 선형 단편을 형성하도록 연속적으로 배열된다. 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 모(母) 게놈에서 배향된 것과 같이 연속으로 배열된 선형 단편에서 서로서로에 대하여 배향된다.
첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로서 유용한 뉴클레오티드 서열은, 게놈 변경이 발생할 원래 게놈부위의 부분과 동형인 뉴클레오티드 서열이다. 그래서, 예를 들어, 게놈 변경이 알코을 산화효소 유전자의 지점에서 발생할 수 있을때, 사용된 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 알코올 산화효소 유전자 지점의 분리 부분에 동형이다. 본 발명에 따른 게놈 변경을 위해, 두가지 삽입성 DNA 단편은 모 게놈 내에 존재하는 것과 같은 상대적인 배향으로 선형 단편 내에 서로서로에 대하여 배향되어야 한다. 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로서 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 예로는, 알코올 산화호소(
Figure kpo00020
) 유전자, 디히드록시 아세톤 합성효소
Figure kpo00021
유전자, p40 유전자 및
Figure kpo00022
유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열이 있다.
Figure kpo00023
유전자,
Figure kpo00024
유전자, p40 유전자 및
Figure kpo00025
유전자는 동시 계류중인 출원연속 번호 780,102 및 이에 해당하는 유럽 특허 공개 0183070에 포함된다.
첫번째 삽입성 DNA는, 발현 카세트에서 사용되는 조절 영역을 포함할 수 있는, 실시 가능한 조절 영역을 포함할 수 있다. 발현 카세트에 대한 조절 영역으로서 첫번째 삽입성 DNA 단편의 이용이 본 발명의 바람직한 구체예이다. 제1도는 카세트에 대한 조절 영역으로서 첫번째 삽입성 DNA 단편을 사용하는 벡터의 도면을 제공한다.
임의로 제1도에 나타내는 바와 같이, 삽입 부위 또는 부위들 및 3' 종결 서열은 첫번째 삽입성 DNA 단편에 대한 3'에 즉시 위치할 수 있다. 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터의 이 구조는 양립 가능한 3' 종결 서열의 첨가를 필요로 하지 않고, 구조 유전자의 삽입을 위해 미리 준비된 부위를 제공하는 부가적인 잇점을 갖는다
이외에 본 발명의 실시예서 사용된 발현 벡터는, 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편사이에, 또는 제4도에 나타내는 바와 같은 종결서열 및 조절 영역 사이에, 구조 유전자 또는 카세트 또는 이와 유사물의 삽입을 용이하게 하기 위해 폴리링커 부위를 함유할 수 있다.
또한 숙주 균주를 형질 전환시키기 위해 사용된 DNA 내에 적어도 하나의 선택성 마아커 유전자를 포함해야 한다. 이것은 형질 전환 DNA를 통합한 유기체들의 선택 및 분리를 용이하게 한다. 마아커 유전자는, 형질 전환되지 않은 숙주 균주가, 특히 아미노산 생합성 경로 또는 항생물질 내성 및 이와 유사한 것에서 결점을 가질때, 특히 아미노산을 생성할 능력을 회복시키는 것과 같은, 숙주가 갖지 않은 형질 전환된 유기체의 표현형 특성을 부여한다.
모범적인 선택성 마아커 유전자는 피치아 파스토리스에서 유래된
Figure kpo00026
유전자 및
Figure kpo00027
유전자, 사카로마이시스 세레비지에에서 유래한 전환효소 유전자(
Figure kpo00028
) 또는 E. 콜리 운반성 요소
Figure kpo00029
또는
Figure kpo00030
에서 유래한 G418R/카나마이신 내성 유전자로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
당업자들은, 부가적인 DNA 서열 또한 본 발명의 실시예서 사용되는 벡터, 예를 들어, 박테리아성 플라스미드 DNA, 벡테리오파지 DNA 등에 포함될 수 있다는 것을 알고 있다. 이러한 서열은 박테리아 숙주 내 이들 벡터의 증폭 및 유지를 가능하게 한다.
첫번째 삽입성 DNA 단편이 조절 영역을 함유하지 않을 경우, 적당한 조절 영역이, 실시 가능한 발현 카세트를 제공하기 위하여, 구조적 유전자에 실시가능하게 연결되어 삽입되는 것이 요구될 것이다. 마찬가지로, 3' 종결 서열이, 발현 카세트를 완결시키기 위해 삽입 부위에 제공되지 않는 경우, 3' 종결 서열은 삽입될 구조 유전자에 실시 가능하게 연결되어야 할 것이다.
당업자들은, 메틸 요구 효모와 연합하여 사용될 수 있고 특징이 되는 수 많은 조절 영역을 알고 있다. 모범적인 조절 영역은 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토키나제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파-교배인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 조절 영역; 피치아 파스토리스 및 이와 유사물로부터 분리된 일차 알코올을 산화호소(
Figure kpo00031
), 디히드록시아세톤 합성 효소
Figure kpo00032
, p40 조절 영역 및
Figure kpo00033
조절 영역으로 구성되는 군으로부터 선택된 효모 조절 영역을 포함하나 이로써 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용된 주로 바람직한 조절 영역은 공개 제0183070호로서 1986년 6월 4일 공개된 유럽 특허 출원 85113737.2에서 기술된
Figure kpo00034
, p40으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 영역과 같은 메탄올-함유 배지에 반응하는 이들의 능력을 특징으로 하는 것들이다.
본 발명의 실시를 위해 가장 바람직한 조절 영역은
Figure kpo00035
조절 영역이다.
3' 종결 서열은 발현 카세트 내에서 사용되거나 상기 언급한 바와 같은 벡터의 부분일 수 있다. 3' 종결서열은, 유전자에 실시가능하게 연결될때, 구조 유전자를 암호화하는 전령 RNA를 안정시키거나, 또한 폴리아데닐화 및/또는 종결화를 할 수 있다. 본 발명의 실시를 위한 3' 종결 서열에 대한 구체적인 원료의 몇몇 예들은 사카로마이시스 세레비지에, 한세눌라 폴리모르파(
Figure kpo00036
) 및 피치아 3' 종결 서열을 포함하나 이로써 제한되지는 않는다. 바람직한 것은
Figure kpo00037
유전자,
Figure kpo00038
유전자, p40유전자 및
Figure kpo00039
유전자의 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것과 같은 피치아 파스트리스로부터 유도되는 것들이다. 특히 바람직한 것은
Figure kpo00040
유전자의 3' 종결 서열이다.
본 발명의 실시를 위해, 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터, 에를 들어, 제1도 및 제2도에서 나타나는 구조의 BalII 단편 또는 제4도에서 제공되는 바와 같은 플라스미드가 사용될 수 있다.
HSA 구조 유전자를 적당한 벡터 내로 삽입하는 것은, 선택된 벡터를 적당한 부위 또는 부위들에서 절단하여 그 벡터 내에 존재하는 HSA 구조 유전자를 포함하는 적어도 하나의 실시 가능한 발현 카세트를 형성하는, 임의의 적당한 기술에 의하여 달성될 수 있다.
HSA 구조 유전자의 연결을 T4 DNA 리가제(ligase)를 사용하는 것과 같은 임의의 적합한 연결 기술에 의해 달성할 수 있다.
벡터 및 HSA 구조 유전자의 연결 혼합물의 초기 선택, 증식, 및 임의의 증폭은, 바람직하게, 혼합물을
Figure kpo00041
(연결 혼합물이 직접 효모 숙주에 형질 전환될 수 있지만)와 같은 박테리아성 숙주에 형질 전환시켜 수행할 수 있다.
Figure kpo00042
에 대한 적당한 형질 전환 기술은 본 분야에 공지되어 있다. 또한, 벡터의 유지를 위해 필요한 박테리아의 복제 오리진(origin) 및 선택 마아커 역시 본 분야에 공지된 박테리아성 숙주이다.
발현 시스템에서 HSA 구조 유전자를 함유하는 원하는 플라스미드의 분리 또는/및 정제는 숙주 DNA로부터 플라스미드 DNA를 분리하기에 적당한 임의 수단에 의해 완성될 수 있다.
마찬가지로, 연결에 의해 형성된 벡터도 HSA 유전자의 존재 및 조절 영역 및 3' 종결 서열에 실시 가능하게 연결된 것을 증명하기 위하여, 바람직하게는 증식 후에 시험될 수 있다. 이것은 엔도뉴클레아제 소화, 겔 전기 영동, 또는 엔도뉴클레아제 소화-서어던 혼성화(Southern hybridization)를 포함하나 이로써 제한되지는 않는 다양한 기술에 의하여 달성될 수 있다.
플라스미드 또는 선형 벡터를 효모 숙주로 형질 전환시키는 것은, 힌넨 일동.,
Figure kpo00043
75' (1978) 1929, 아이토 일등., J. 박테리올 153, (1983) 163 ; 크레그 일동
Figure kpo00044
5(1985) pg 3376 ; 또는 스리이크리슈나 일동.,
Figure kpo00045
59(1987) pg 115에 의해 지침이 되는 것들을 포함하나 이로써 제한되지 않는 적당한 형질 전환 기술에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 실시를 위해 바람직한 것은 크레그의 형질전환 기술이다. 본 발명의 실시를 위해 과량의 선형 벡터를 사용하고, 서어던 혼성화에 의해 다중 삽입물을 선택하는 것이 바람직하다.
형질 전환을 위한 효모 숙주는 적당한 메틸 요구 효모일 수 있다. 메틸 요구 효모는 한세눌라, 캔디다.(
Figure kpo00046
), 클로액케라(
Figure kpo00047
), 피치아, 사카로마이시스, 트룰로프시스(
Figure kpo00048
) 및 로두토룰라(
Figure kpo00049
)로 구성되는 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이로써 제한되지 않는다. 모범적인 이 부류의 효모인 특이 속의 리스트는, 씨이. 안토니, 메틸 요구주의 생화학, 269(1982)에서 발견될 수 있다. 주로 바람직한 것은 피치아 속의 메틸 요구 효모, 예를 들어, 영양 요구 피치아파스토리스 GS115(NRRLY-15851)이다. 영양요구 메틸요구 효모는, 본 발명의 실시에 있어 용이한 선택성으로 인하여 유리하다. G418과 같은 항생물질 내성 마이커를 사용하거나, 수크로즈(Sucrose) 상에서 성장할 수 있는 균주에 피치아 파스토리스를 형질 전환시키기 위한 SUC2의 이용과 같은 적당한 형질 전환 마이커 유전자가 선택될 경우, 야생형(wild tupe)메틸 요구 효모 균주도 동일한 성공율로서 사용될 수 있음을 발견하였다.
요구되는(세포의 영양요구성에 기인하여) 생화학 생성물의 부재하에 형질 전환시키고, 새로운 표현형("메탄올 슬로우'')을 감지 및 선택한 후 영양 요구 세포를 배양하거나, 또는 형질 전환체에 포함된 내성 유전자의 부재 하에서 효모에 대해 독성인 항생물질 존재하에 배양하는 것을 포함하나 이로써 제한되지는 않는 적합한 기술을 사용하기 위하여, 형질 전환된 메틸요구 효모 세포를 선택할 수 있다.
분리되고 형질 전환된 메틸요구 효모 세포는, 적절한 발호 기술, 예를 들어, 진탕 플라스크 발효, 고 밀도발효, 또는 크레그 일동이 메틸요구 효모, 피치아 파스토리스 내 B형 간염 표면 항원의 효율적인 조립 및 고 수준 발현에 대하여 5 Bio/Technology 479(1987)에 개시한 기술들에 의하여 배양된다.
(실시예들)
실시예들에 적당한 일반적인 정보;
모든 플라스미드 구성 및 제조를 위하여 사용되는 균주들
피치아 파스토리스 GS115(his4)[NRRL Y-15851]
피치아 파스토리스 KM71(
Figure kpo00050
)
Figure kpo00051
은 집락(plaque)정제 파아지 스톡(stock)의 제조 및 DNA 분리를 위한 라이브러리의 증폭을 위해 사용된다.
Figure kpo00052
Y10 90[ATCC no. 37197) ;
Figure kpo00053
Figure kpo00054
: : Tn10(pMC9)]은 모든 면역학적 집락 스크리닝, 및 다양한 올리고뉴클레오티드 프로브로의 연속 스크리닝을 위한 숙주로서 사용된다.
E. 콜리 균구 ATCC 37195 및 37197은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 구입 가능하다(박테리아, 파아지 γDNA 벡터 16판(1985) P245의 목록을 보라).
완충용액, 용액 및 배지
하기 실시예에서 사용되는 완충용액, 용액 및 배지는 하기와 같은 조성을 갖는다 :
Figure kpo00055
Figure kpo00056
Figure kpo00057
Figure kpo00058
Figure kpo00059
(실시예 Ⅰ)
Figure kpo00060
의 분리
인간의 간(肝) λgt-cDNA 발현 라이브러리(lot#2102)를 클론레크 레보로토리스사로부터 구입한다. 이 라이브러리는 9×109파아지/ml의 역가를 가지며, 0.15 내지 1.8kb 쌍의 평가된 삽입 크기를 갖는 5.5×105개의 독립적 투명 집락 파아지 분리물로 구성된다.
4×105독립, 파아지 분리물을, 프로브 #1에 대해 상보적인 뉴클레오티트 서열을 함유하는 것들을 위해 스크리닝한다. 프로브 #1은 인간 혈청 알부민의 숙성 분비 형태의 첫번째 6개 아미노산에 대한 코오돈을 포함하는 19bp 올리고뉴클레오티드(하기 단계 5에서 나타남)이다. 스크리닝을 하기와 같이 수행한다.
단계 1 E. 콜리 트랜스펙션(Transfection)
Figure kpo00061
Y1088(ATCC 제37195호)을 LB 육즙[5.0g/l효모 추출물(디프코), 10.0g/l트립톤(디프코), 50g/l염화나트륨을 포함하고, 0.2% D-글루코스가 보충된 액체 배지 LBD에 현탁시킨다. 이 현탁액의 50㎕의 표본을, 50㎍/ml의 암피실린(LB+Amp)을 함유하는 LB 내에서, 1.2% 한천 노블(디프코)을 포함하는 고체 성장 배지 상에 퍼뜨린다. 박테리아 콜로니(colony)를 37℃에서 밤새도록 성장시킨다. 몇개의 콜로니를 10ml의 LB-Amp 배지로 운반하고 라이브러리의 스크리닝을 위해 사용될 밤새의 배양물(overnight culture)을 얻기 위해 250rpm에서 작동하는 회전 진탕기에서 30℃로 항온 배양한다.
λgtll-cDNA 발현 라이브러리의 부분 표본을 SM 완충용액[(50mM 트리스 HC1, pH 7.5, 0.lM NaC1, 8.1mM MgSO4, 0.01%(w/v) 젤라틴]내에서 100배 희석한다. 4.4μl를
Figure kpo00062
Y1088의 밤새의 배양물 4.0ml와 혼합하고, 혼합물을 30℃에서 20분간 배양한다. 0.2ml 부분 표본을 55℃에서 유지되는 2.5ml 소프트 한천배지[LB 내 0.7% 한천 노블(디프코)]에 첨가하고 직경 90mm의 페트리 접시 내에서 바닥 한천(1.2% 한천노블을 함유하는 LB)상에 고르게 퍼뜨린다. 실온에서 10분 후에, 평판 배지를 43℃에서 작동하는 항온기 내에 둔다. 파아지 집락이 나타나도록 하나, 합류되지 않도록 한다(일반적으로 약 4-6시간).
단계 2 필터 리프트(Filter Lifts)
집락을 함유하는 상층 한천을 S & S 니트로 셀룰로오스 필터(0.45μ의 기공 크기 및 82mm 직경)로 오버레이(overlay)한다. 다음 단계에서의 필터의 배향을 돕기 위해서, 한천 상 필터를 인디아 잉크를 함유하는 주사기의 18게이지 바늘로 5개 지점에서 구멍을 낸다. 1분 후에, 필터를 집락을 윗면으로 하여 1.5M NaCl/0.5M NaOH로 포화된 3MM 와트만(whatmann) 필터지 상에 옮긴다. 2분 후, 필터를 바닥면으로부터 블롯팅하여 중화 용액(1.0M 트리스-HC1, pH 8.0, 1.5M NaC1)으로 포화된 두번째 3MM 와트만 필터지로 옮긴다. 중화 8분 후, 필터를 6×SSC(0.9M NaC1, 90mM 나트륨 시트레이트, pH 7.0)내에서 세척한다. 필터를 블롯팅 건조시키고 진공 오븐에서 80℃에서 2시간 동안 열처리한다.
단계 3 자동 방사선 사진법(Autoradiography) 및 #1 프로우브로 혼성화 및 예비 혼성화
인간 혈청 알부민에 대한 cDNA를 함유하는 집락을, 그들 DNA와 인간 혈청 알부민 cDNA에는 상보적이나, 박테리아 또는 형질 전환 벡터 DNA에는 상보적이지 않은, 이들의 뉴클레오티드 서열에 대해 선택된 방사능-표지 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키므로써 규명하였다.
A. 표지된 올리고뉴클레오티드 프로우브의 제조
방사성 올리고뉴클레오티드 프로우를, 대략 100ng의 주어진 올리고뉴클레오티드와 70mM 트리스-HCl (pH 7.6), 10mM MgCl2, 1.0mM KCl, 50mM 디티오트레이톨, 1.0mM 스페로미딘을 함유하는 완충용액 10μl내의 10μCi의 [-32P]ATP를 혼합하여 제조한다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제 10유니트를 첨가하고, 혼합을 37℃에서 30분 동안 항온 배양한다. 효소를 65℃에서 5분간 항온 배양하여 실활(失活)시키고, 표지된
올리고뉴클레오티드를 반응 환합물로부터 임의의 정제없이 용액에 첨가한다.
B. 예비 혼성화
파아지 DNA를 함유하는 필더 리프트를, 0.9M NaC1, 6.0mM Na2EDTA, 19.8mM 트리스ㆍ HC1(pH 8.0), 0.l% 피콜(Ficoll), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소혈청 알부민, 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 함유하는 용액에서 3-16시간 동안 배양하였다. 필터 당 10ml의 용액이 사용된다.
C. 혼성화
예비 혼성화 필터를, 2ng/ml 농도의 방사성으로 표지된 올리고뉴클레오티드 #1을 함유하는 것을 제외하고, 예비 혼성화에서와 같은 용액 내에서 혼성화시킨다. 필터당 2ml의 용액을 사용하여 37℃에서 20-48시간 동안 배양한다.
D. 세척.
필터를 실온에서, 0.9M NaC1, 90mM 나트륨 시트레이트(pH7.0)로써 4회(세척 당 20분), 그리고 0.1% SDS를 함유하는 동일한 완충용액으로써 45℃(1시간)에서 1회 세척한다. 각 필터를 세척하기 위해 10ml 부피의 용액을 사용한다.
E. 자동 방사선 사진법(Autoradiography)
필터를 공기 건조하고, X-선 필름(코닥 XAR-2 도는 XAR-5) 근처의 X-선 필름 노출 카세트 내에 둔다. 카세트를 -80℃에서 20-48시간 동안 배양한다.
단계 4 HSA 단백질 양성 집락에 대한 면역 스크리닝.
λgtll 벡터 내 클로닝 부위는 β-갈락토시다제 암호 영역내에 있다. IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토시드)가 λgtll 벡터내의 β-갈락토시다제 유전자의 발현을 유도하므로, 그것은 또한 β-갈락토시다제에 대한 골격 내에서 클로닝되는 유전자의 발현을 유도하고 β-갈락토시다제 융합-단백질을 생성하기 위해 사용될 수도 있다. 그러므로, 정확한 방향 및 골격 내 전체 또는 부분 HSA 유전자는 면역 반응 물질을 생산해야만 한다.
Figure kpo00063
균주 Y1090(ATCC 제37197호)은 HSA 발현-양성 집락의 검출을 위해 사용된다. 파아지로의 감염 및 평판화 절차는
Figure kpo00064
균주 Y1088에 대해 상기 기술된 바와 같다. 집락이 대략 1mm 직경이 된 후, 상기 10mM(IPTG)에 침지되고 건조된 니트로셀률로오스 필터를 상층 한천 상에 둔다. 평판배지를 43℃에서 4-6시간 동안 배양한다. 이후에 필터를 평판 배지로부터 제거하여 TBST 내 1% 젤라턴, 0.05% 브리즈 58을 포함하는 차단 용액 내에 침지시킨다. 필터를 0.5-16시간 동안 부드럽게 흔들면서 실온에서 배양한다. 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 위한 동일한 평판 배지로부터 집락 리프트를 원할때, 평판배지를 니트로셀룰로오스 필터를 오버레이하기 전에 2시간 동안 43℃ 항온기로 반송시킨다.
IPTG 필터를 차단 용액으로부터 꺼내고, 면역반응 HSA를 발현하는 집락을 차단 용액 내에서 염소(goat)의 항-HSA(미들 이스트주, 스카보로우시, 목록번호 001-11, 아틀란틱 항체, 네펠로메트릭용) 의 1/1000 희석액을 사용하여 규명한다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후에, 필터를 TBST 내에서 세척 당 10분씩 5회 세척한다. 모든 항온배양 및 세척을 부드럽게 흔들면서 수행한다. 항-HSA 항체의 결합은 실온에서 1시간 동안, 차단 용액내에서 알카리성 포스파타제가 접합된 토끼의 앤티고우트(antigoat) IgG(메릴랜드주, 가이터스부르그시, 키르케가아드 및 페리 레보로토리스)의 1/1000 희석액(0.5㎍/ml)과 함께 배양하므로써 감지된다. 상기와 같이 세척한 후, 실온에서 10-30분 동안, 0.lM 트리스 완충 용액 내의 니트로 블루데트라졸리움 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(키트케가이드 및 페리 레보로토리스)를 포함하는 포스파타제 기질 시스템 내에서 필터를 배양한다. 안정된 자주빛 침전물이 막의 반응 부위에 침착되었다. 물내에서 필터를 세척하므로써 반응을 정지시키고, 필터를 공기 중에서 건조시킨다.
몇몇 실험에서는, 양성 집락을 규명하기 위해125I-단백질 G를 사용하였다. 이 경우에, ml당 0.3μC1의125I-단백질 G을 함유하는 TBS(트윈-20이 없는 TBST) 용액 내에서, 필터를 4시간 동인 배양하고, 이어서 항-HSA 항체와 함께 배양하고, 이후에 상기 기술한 바와 같이 세척하였다. 필터를 BTBS(0.05% 브리즈58을 함유하는 TBS)에서 2회 세척한 후, TBS 내에서 2회 더 세척하였다. 모든 세척은 실온에서 부드럽게 흔들면서 10분 간격으로 실시한다. 자동 방사선 사진법을 상기와 같이 실시한다.
단계 5 올리고뉴클레오티드 #2, #3, ml 및 M2와의 집락 혼성화
정제된 집락을 하기 올리고뉴클레오티드로써 스크리닝한다.
#1 : 5'-CCTCACTCTTGTGTGCATC-3'
#2 : 5'-CCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTTTTCCAACAGAGG-3'
#3 : 5' -CCCTCCTCGGCAAAGCAGG-3'
ml : 5'-GAAATAAAGGTTACCCACTTCAT-3'
M2 : 5' -CCCACTTCATTGTGCCAAAG-3'
#1 프로우브는 숙성한 HSA 단백질의 첫번째 6개 아미노산에 해당하는 19 뉴클레오티드에 혼화된다. #2 프로우브는 숙성한 HSA 단백질의 아미노산 #281-#292에 해당하는 뉴클레오티드에 상보적이며, HSA-cDNA 서열내 단일 Pst I 제한 앤도뉴클레아제 부위로부터 업스트림(upstream)이다. #3 프로우브는 숙성한 HSA 단백질의 아미노산 #565-#571에 대한 뉴클레오티드를 포함하는 클론의 감지를 위해 사용될 수 있다. 상기 세개의 올리고뉴클레오티드는 공개된 HSA cDNA 서열내에서 이들 영역 내에 뉴클레오티드 변형이 없기 때문에 선택된다.
잠재적 프로우브들은,
Figure kpo00065
DNA 및 λgtll 벡터 내의 공지 서열과 동형인 서열이 별로 없음으로 인하여 스크리닝된다. 이 스크리닝은 혼성화의 비특이 부위를 감소시키기 위해 필요하다. 이 분석을 기본으로 해서, 프로우브 M2는 낮은 수준으로 벡터 서열에 결합될 것으로 예측할 수 있다. M2 프로우브가 ATG 출발 코오돈으로부터 10염기 업스트림에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하기 때문에, 매우 엄격한 조건하에서 혼화되는 임의의 클론은 모든 또는 대부분의 10염기를 포함하는 것으로, 그리하여 전체 HSA의 암호화 서열을 함유할 것으로 예측된다.
(실시예 II)
서열 분석을 의한 ml3mp18로의 인간 혈청 알부민 cDNA의 클로닝
단계 1 M3mp18 클로닝 벡터의 제조
ml3mp18(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 복제형 DNA(4㎍)를, 고염 완충용액 50μl 내의
Figure kpo00066
40 유니트로써, 37℃에서 1시간 동안 완전히 소화시켰다. 소화된 샘플을 70℃에서 5분 동안 가열하여 효소를 실활시켰다. 송아지 창자의 알칼리성 포스파타제(CIAP, 1 유니트)를 첨가하고 혼합물을 50℃에서 l시간 동안 배양하였다. 1/10 부피의 500mM EGTA(pH 8)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. CIAP를 65℃에서 45분 동안 가열하여 실활시켰다. 반응 혼합물을 TE-포화 페몰 및 연이어 같은 부피의 클로로포름 추출물로 추출하였다. 수성 상 내의 선형화된 ml3mp18을 3부피의 3M 아세트산 나트륨 및 무수 에탄올 혼합물(1 : 30V/V)을 첨가하며 침전시켰다. 혼합물을 -20℃에서 밤새 놓아 두었다. 4℃에서 14,000×g로 15분 동안 원심 분리하여 DNA를 회수하였다. 펠릿을 진공 건조하고 TE l00μl내에 재용해시켰다.
단계 2 HSA cDNA 삽입체의 제조 및 ml3mp18 벡터와의 연결(ligation)
A. 고역가 평판 배지 용해물(Lysate)의 제조
실시예 I에서 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 스크닝체 및 항체에 대해 양성인 재조합체 파아지를 파아지 DNA를 제조하기 위해 증폭시켰다. LBM+AMP 40ml내에
Figure kpo00067
Y1088을 밤새도록 배양하여 평판화 세포를 제조하였다. 세포를 실온에서 15분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 수집하고, 펠릿을 10mM MgSO415-16ml내에서 재현탁시켰다. 한천 플러그(plug) 형태의 LB 평판배지(실시예 I에서 기술된 바와같이 제조된)로부터의 개별적인 집락을
Figure kpo00068
Y1088 평판화 세포 0.lml내에 현탁시켰다. 실온에서, 10분동안 정지시킨 후, 55℃, 25ml의 LBM 및 25ml의 LB 상층한천을 첨가하였다. 혼합물을 미리 데워진(42℃) LB 한천 평판배지에 쏟아 붓는다. 실온에서 10분 후, 평판 배지를 뒤집어서 42℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 파아지 입자를 SM 3ml로 평판 배지를 넘치게 하여 회수하였다. 클로로포름 한 방을을 첨가하여 튜브를 볼텍싱(vortexing)하였다. 내용물을 4,000×g에서 10분 동안 원심 분리시켜 세포 부스러기를 제거하였다. 상등액(고-역가 용해물)을 4℃에 저장하였다.
B. 고-역가 용해물의 적정(Titering)
SM 내의 고-역가 용해물 10-4희석액으로부터의 1μl 및 10μl 부분 표본을
Figure kpo00069
Y1088 평판화 세포 0.3ml화 함께 혼합하였다. 37℃에서 10분 동안 배양한 후에, 55℃에서 미리 데워진 LB 상층 한천 3ml를 첨가하였다. 혼합물을 LB 평판 배지 상에 쏟아 붓고 42℃에서 밤새 배양한다. 용해물 ml당 집락 형성 유니트(pfu : plaque forming units)의 수를 기록하였다.
C. 평판 배지 용해물법에 의한 파아지 DNA의 제조
상층 아가로스 6ml를 150mm 직경 페트리 접시에서 사용한 것을 제외하고는, 적정하기 위해 상기 기술한 바와 같이 약 106puf를 평판화하였다. 평판화 박테리아를 합류 용해한 후에, 파아지를 상층 아가로스로부터 SM으로 추출하였다. 이후에, 제조자의 제안된 프로토콜에 따라 람다 조브 파아지 흡착제(Lambdasorb Phage Adsorbant; 웨스트 인디스주, 매디슨시, 프로메가 바이오텍)를 사용하여 상등액으로부터 파아지DNA를 분리하였다.
D. ml3mp18과의 연결 반응(Ligation Reaction)
HSA-λgtll 재조합 DNA(4-5㎍)를, 고염 완충용액 30μl 내에서
Figure kpo00070
20 유니트로 3시간 동안 37℃에서 소화시켰다. 소화 후에, 반응 혼합물을 단계 1에서 기술한 바와 같이 더 처리하였다. 전체 혼합물을 T4 리가제를 사용하여
Figure kpo00071
-CIAP 처리된 ml3mp18과 연결시켰다. 전형적인 연결반응(최종 부피 10μl)은 1X 연결 완충용액(50mM 트리스-HC1, pH 7.6, 10mM MgC12, 1mM ATP, 1mM DTT, 5%(W/V) 폴리에틸렌 글리콜-800)내 0.8㎍의 ml3mp18 및 4-5㎍의 전체 DNA를 포함한다. T4 리가제 1-2 유니트를 사용하여 15℃에서 밤새 연결시켰다.
단계 3 컴피턴트(competent) 세포의 형질 전환
연결 혼합물의 부분 표본(1-5μl)을 300μl의
Figure kpo00072
JM l07컴피턴트 세포[맨델 일동.,
Figure kpo00073
53, 154(1970)] 또는 100μl의
Figure kpo00074
DH5α F' 동결 성분 세포(BRL)와 혼합하고 얼음에서 40분 동안 유지시켰다. 42℃에서 2분 동안의 열 쇼크에 의해 DNA의 흡수를 유도하였다. 이후에, 형질 전환된 세포를 얼음으로 반송시켰다. 증식기(exponential phase)에서 신선하게 제조된
Figure kpo00075
JM 107 200μl와, 2% 디메틸포름아미드 내 X-갈(gal) 40μl, 10mM IPTG l00μl 및 H-상층 한천 3ml를 함유하는 평판화 혼합물을 55℃에서 첨가하였다. 형질 전환 혼합물을 LB 한천 평판 배지 상에 쏟아 부었다. 평판 배지를, 집락 형성을 위해 37℃에서 밤새 배양하였다.
단계 4 ml3ssDNA 주형의 제조 및 DNA 서열의 분석
재조합 ml3 파아지를 함유하는 무색의 집락을 취하여 2XYT 1.5ml 내
Figure kpo00076
JM 107에서 37℃에서 5-6시간 동안 활발하게 진탕시키면서 증폭시켰다. 증폭시킨 후에, 배양물을 14,000g에서 1분 동안 회전시켜서, 세포를 상등액으로부터 분리하였다. 세포 펠릿은 ml3의 이중 가닥 복제형의 제조를 위해 사용하는 한편, 상등액을 단일-가닥 DNA 주형의 분리를 위해 사용하였다. ml3dS RF를 번보임 및 도일리(Birnboim and Doily)의 알카리성 용해법(Nucl. Acids Research 7 : 1513(1979))을 사용하여 분리하였다. ml3ssDNA주형을 폴리에틸렌 글리콜 침전 및 페놀 추출에 의해 배양 상등액으로부터 분리하였다. 간단하게, 배양 상등액 1ml를 2.5M NaC1내 20% 폴리에틸렌 글리콜-6000의 200μl와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 놓아둔 후, 14,000×g에서 5분 동안 원심분리시켜서 MB 파아지 입자를 회수하였다. 파아지 펠릿을 100μ1의 TE에 재현탁시키고 이어서 완충용액-포화 페놀로 추출하였다. ml3ssDNA를 함유하는 수성 상을 3부피의 나트륨 아세테이트 및 에탄올 혼합물과 혼합하였다. -200℃에서 밤새 식힌 후에, 4℃ 14,000×g에서 10분 동안 원심 분리하여 DNA 침전물을 회수하였다. 전조 DNA를 50μl의 TE에 용해시키고 5μl를 서열화를 위하여 사용하였다. DNA 서열화를 생거 일동의 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법(Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463(1977))에 의해 수행하였다. HSA 13의 완전한 서열을 표 1에 나타낸다.
(실시예 Ⅲ)
pA0807N의 제조
pA0804 플라스미드는 일리노이주 페오리아시, 미농무성의 북부 지역 연구소(1986년 9월 16일에 기탁된 수탁번호 NRRL B-18114)로부터의
Figure kpo00077
숙주로부터 얻을 수 있다. 유일한
Figure kpo00078
부위에서 절단된 선형 pA0804인∼7.5kb 단편을 회수하기 위하여, 플라스미드 DNA를 분리하고,
Figure kpo00079
으로 소화시키고, 겔전기영동하므로써, pA0804는 분리된다. 플라스미드 pA0807N은 하기와 같이, pA0804, pBR322 및 박테리오파아지 fl DNA로부터 출발하여 구성되었다.
단계 1 fl-ori DNA의 제조
fl 박테리오파아지 DNA(50㎍)를 MS 완충용액 200μl내에서 37℃에서 4시간 동안
Figure kpo00080
및
Figure kpo00081
50유니트로 소화하여 복제의 f1 오리진(origin)을 함유하는 ∼458bp DNA 단편을 방출시켰다. 소화 혼합물을 동일한 부피의 페놀 : 클로로포름(V/V)으로 추출하고 이어서, 수성층은 동일한 부피의 클로로포름으로 추출하였다. 최종적으로, NaC1 농도를 0.2M로 조정하고, 무수에탄올 2.5부피를 첨가하여 수성 상의 DNA를 침
전시켰다. 혼합물을 얼음(4℃)에서 10분 동안 정치시켜 DNA 침전물을 마이크로퓨즈 내 4℃에서 10,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 수집하였다. DNA 펠릿을 70% 수성 에탄올로 2회 세척한다. 세척된 펠릿을 진공건조하고 TE 완충용액의 25μl 내에 용해시켰다. 이 DNA를 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기 영동하고, ∼458bp의 fl-ori 단편을 함유하는 겔 부분을 절삭하여 겔 내의 DNA를 5mM EDTA(pH 8.0) 500μl로 전기 용출시켰다. DNA 용액을 상기 기술한 바와 같이 페놀 : 클로로포름 추출하여 DNA 침전물을 TE 완충용액(f1-ori 단편) 25μl내에 용해시켰다.
단계 2 pBR322의
Figure kpo00082
부위로 f1-ori을 클로닝
pBR322(2㎍)를 37℃, MS 완충용액 20μl 내에서 10분 동안
Figure kpo00083
2 유니트로 부분 소화시킨다. 페놀 : 클로로포름 추출에 이어 상기 단계 1에서 기술한 바와 같이 DNA 침전에 의해 반응을 종결시겼다. DNA 펠릿을 TE 완충용액 20μl 내에 용해시킨다. 이 DNA 약 100ng을, 1 유니트의 T4 DNA 리가제와 함께 20μ1의 연결 완충용액에서 14℃에서 밤새 배양시키므로써, 100ng의 f1-ori 단편(단계 1)과 연결시켰다. 70℃에서 10분 동안 가열하므로써 연결을 종결시킨 후, 그것을
Figure kpo00084
균주 YMC9(매니아티스 일동)을 형질 전환시키기 위하여 사용하여 pBR322의
Figure kpo00085
부위(뉴클레오티드 위치 3232 및 3251)에 클로닝된 f1-ori를 함유하는 pBRf1-ori를 얻었다.
단계 3 pA0807의 제조
pBRf1-orl(10㎍)를 각 10 유니트의
Figure kpo00086
및
Figure kpo00087
으로 37℃에서 4시간 동안 소화시켰다. 소화된 DNA를 상기 단계 1에서 기술된 바와 같이 페놀 : 클로로포름으로 추출하여 침전시키고, 25μl의 TE 완충용액에 용해시켰다. 이 물질을 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기 영동시켜 f1-ori를 함유하는
Figure kpo00088
단편(대략 0.8kb)을 분리하고, 이를 TE 완충용액 20μl에 용해(상기 1단계에서 기술한 바와 같이)시켰다. 이 DNA 약 100ng을,
Figure kpo00089
및
Figure kpo00090
으로 소화된 pA0804 100ng과 혼합하며 포스파라제 처리하였다. 이 혼합물을, 연결 완충용액 20μl 내에서 l 유니트의 T4 DNA 리가제와 함께 14℃에서 밤새 배양시킴으로써, 서로 연결시켰다. 70℃에서 10분 동안 가열하므로써, 연결 반응을 종결시켰다. 이 DNA를 사용하여
Figure kpo00091
균주YMC9을 형질 전환하여 pA0807을 얻었다.
단계 4 pA0807N을 제조하기 위해 pA0807 내 두개의
Figure kpo00092
부위를
Figure kpo00093
부위로 전환
pA0807(10㎍)을 HS 완충용액 50μl 내에서 37℃에서 4시간 동안
Figure kpo00094
10 유니트로 소화시켰다. 50μl의 NT 완충용액 내의
Figure kpo00095
절단된 DNA(10㎍)를, DNA 폴리머라제의 클리나우 단편 5 유니트와 함께 상온에서 30분간 배양시키므로써,
Figure kpo00096
의 점착성 말단(cohesive end)을 채워넣었다. 이 혼합물을 상기 1단계에서 기술한 바와 같이 페놀: 클로로포름 추출시키고 DNA를 회수하였다. DNA 펠릿을 TE 완충용액 25μl내에 용해시켰다. 이 DNA를 뉴 잉글랜드 바이오랩으로부터 얻어진 포스포릴화
Figure kpo00097
링커(pGCGGCCGC)50ng(1μl), 5×연결 완충용액 40μl, 물 129μl 및 T4 DNA 리가제 5 유니트와 혼합하였다. 이 혼합물을 14℃에서 밤새 배양하였다. 70℃에서 10분 동안 가열하여 연결 반응을 종결시켰다. 이어서, 용액을 HS 완충용액 조건으로 조정한 후,
Figure kpo00098
10 유니트로 연결 혼합물을 소화시켰다. DNA를 상기 단계 1에서 기술한바와 같이 페놀: 클로로포름 추출 후 침전시켰다. 침전물을 TE 완충용액 50μl내에 용해시켜 0.9% 아가로스겔 상에서 전기 영동하였다. f1-ori 및 pBR322 부분을 함유하는 단편의 이동 위치에 해당하는 DNA 단편의 하부 밴드 및 pA0807의 나머지 부분(즉, 5'
Figure kpo00099
)에 해당하는 상부 밴드를, 상기 1단계에서 기술한 바와 같은 프로토콜을 사용하여 겔로부터 분리하였다. 겔 정제된 DNA 단편을 TE 완충용액 10μl에 용해시켰다. 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터를 나타내는 DNA 단편을, 포스파타제 완충용액 200μl내에서 CIAP 2 유니트로써 30분간 상온에서 배양시킴으로써, 포스파타제 처리하였다. 포스파타제 처리된 DNA를 단계 1에서 기술한 바와 같이 페놀: 클로로포름 추출하고, 예비침전시켰다. 이 DNA를 pA0807 플라스미드의 나머지(상기 부분 참조)를 나타내는 상부 밴드 DNA와 혼합하고, 4℃에서, T4 DNA 리가제 5 유니트로써, 30μl의 연결 완충용액 내에서 밤새 연결시켰다. 연결 혼합물을 70℃에서 10분 동안 가열하 얼음에서 냉각시키며, 10μl의 부분 표본을 사용하여
Figure kpo00100
YMC9을 형질 전환시켜 pA0807N을 얻었다. pA0807N의 구조를 제3도에 나타내었다.
(실시예 Ⅳ)
피치아 파스토리스 HSA 발현 벡터의 구조
단계 1 HSA 단편의 회수
약 2.0kb에 해당하는 HSA 유전자를
Figure kpo00101
소화에 의해 mp18-HSA 13 복제형 DNA(실시예 II를 보라)로부터 방출시켰다. 폴라스미드 mp18-HSA 13 약 1㎍을 HS 완충용액 20μl내에서
Figure kpo00102
5 유니트로 37℃에서 2시간 동안 소화시켰다. dH2O 50μl로 희석하고, 페놀 : 클로로포름으로 즉시 추출하며, 침전(실시예 Ⅲ의 단계 I에서 기술한 바와 같이)시킨다. DNA 침전물을 물 10μl에 용해시키고, 이후 이용을 위해 -20℃에 저장한다. HSA 유전자를 벡터 pTHFK△ 및 pA0807N의
Figure kpo00103
부위에 삽입시켜서 피치아 피스토리스 HSA 발현 플라스미드 pHSA 13 및 pHSA 113을 연었다.
단계 2 HSA 유전자의 삽입을 위한 벡터 조작
각각 약 10㎍씨의 pTHFK△(제4도) 및 pA0807N을 HS 완충용액 100μl 내에서
Figure kpo00104
10 유니트로써 37℃에서 16시간 동안 소화시켰다. 반응 혼합물을 알카리성 포스파타제 완충용액 조건으로 조정하고, 37℃에서, 30분 동안 반응 부피 200μ1 내에서 CIAP 10 유니트로 처리하였다. 포스파타제 처리를 페놀 : 클로로포름 추출 처리하여 종결시키고, 실시예 Ⅲ의 단계 1에서 기술한 바와 같이 DNAs을 침전시키고 최종 농도 100㎍/ml로 TE 완충용액 내에 용해시켰다.
단계 3 HSA 유전자를 발현 벡터 내로 삽입
Figure kpo00105
으로 절단되고 ClAP 처리된 각각 약 100ng씩의 벡터 pTHFK△ 및 pA0807N(실시예 Ⅲ의 단계 2)을, 대략 각각 100ng씩의
Figure kpo00106
으로 소화된 mp18-HSA13(실시예 Ⅳ의 단계 1)과 연결 완충용액 20μ1내에서 혼합하여 T4 DNA 리가제 2 유니트로써 4℃에서 16시간 동안 연결시켰다 70℃에서 10분 동안 가열하여 연결 반응을 종결시키고
Figure kpo00107
균주 DG75를 형질 전환시키기 위해 사용하여 플라스미드 pHSA13및 pHSA113을 얻었다.
(실시예 V)
pHSA 113 및 pHSA13으로써 피치아 파스토리스를 형질 전환시킴
단계 1 pHSA113 벡터의 제조
약 20㎍의 pHSA113을 37℃에서 18시간 동안 HS 완충용액 200μ1 내에서
Figure kpo00108
50 유니트로써 소화시켰다. 1984년 8월 31일에 수탁번호 NRRL Y-l5851로 미농무성 북부 지역 연구소에 기탁된 피치아 파스토리스 GS115(his4)를 형질 전환시키기 위해, 이 혼합물 약 20μ1를 직접 사용하였다. 나머지 대략 180μ1의
Figure kpo00109
절단 pHSA113은 실시예 Ⅲ의 단계 Ⅰ에서 설명한 바와 같이 페놀 : 클로로포름 추출시키고 침전시킨다. DNA 침전물을 CaS 용액 20μl에 용해시키고, 또한 GS115의 형질 전환을 위해 사용하였다.
Figure kpo00110
절단 pHSA113은 피치아 좌위(座位)에 삽입될 수 있다. 또한
Figure kpo00111
단편형 pHSA113은 피치아의 히스티디놀 탈수소효소 유전자를 운반할 수 있기 때문에, 결과형성된 형질 전환체는 His
Figure kpo00112
표현형을 기준으로 쉽게 선택할수 있다
피치아 균주 KM71(
Figure kpo00113
)을 His
Figure kpo00114
에 대해 10㎍의 pHSA13으로써 형질 전환시켰다.
Figure kpo00115
이외에, 이 플라스미드는 자체적으로 복제하는 서열
Figure kpo00116
을 운반한다. 그것은 피치아 내에서 자체적으로 복제될 수 있다. 이러한 형질 전환체를 "자발적인 형질 전환체''로서 언급할 것이다. 이 균주를 사용하는 이유는 KM71이
Figure kpo00117
에 의한
Figure kpo00118
의 파괴에 따른 ''메탄올-슬로우''이며, lacZ가
Figure kpo00119
프로모터의 조절하에 있을때 메탄올-정장 균주인 GS115에서 보다 높온 수준의 β-갈락토시다제의 발현을 보여왔기 때문이다. 음성 조절에 있어서, KM71 또한
Figure kpo00120
를 함유하는 플라스미드인 pYJ30(NRRL B-15890)으로써 형질 전환시켰다.
단계 2 세포 성장
피치아 파스트리스 GS115(NRRL Y-15851)를 약 10ml의 YPD 배지에 접종시키고 30℃에서 12-20시간 동안 진탕 배양하였다. 100ml의 YPD 배지를 종균으로써 접종하여 약 0.001의 OD600을 얻었다. 배지를 30℃에서 약 12-20시간 동안 진탕 플라스크 내에서 배양하였다. OD600이 약 0.2-0.3(약 16-20시간 후)일때, 소발(Sorvall) RC5C를 사용하여 5분 동안 1500g에서 원심분리시키므로써, 배양물을 수집하였다.
단계 3 스페로플라스트의 제조
세포를 10ml의 살균수로 한번 씻은 후,1500g에서 5분간 원심분리 하였다(다른 언급이 없는 한, 원심분리는 각 세포를 한 번 세척한 후 소발
Figure kpo00121
를 사용하여 1500g에서 5분간 수행한다). 그리고 나서, 세포를 10ml의 신선하게 제조된 SED로 한 번, 10ml의 살균된 1M 솔비톨로 1번 씻고, 마지막으로 10ml의 SCE 판충용액 내에 재현탁시켰다 7.5μ1의 3mg/ml 지몰리아제(Zymolyase)(마일즈 레보로토리스로부터 얻은 100,000단위/g)를 세포 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 30℃에서 약 10분 등만 배양하였다.(OD600에서의 60%의 감소가 보정시간 및 농도 표시로서 사용될 수 있다). 스페로플라스트를 700g에서 5-10분간 원심분리시킴으로써, 10ml의 살균된 1M 솔비톨로 한 번 세척하였다(원심분리를 위한 시간과 속도는 다양할 수 있다 : 스페로플라스트를 펠릿팅시키기에 충분하게 원심분리시키지만 너무 심해 이들이 힘에 의해 파괴되어서는 안된다). 10ml의 살균된 CaS를 최종 세포 세척물로서 사용하고, 세포를 700g에서 5-10분간 다시 원심분리하여 CaS 0.6ml 내에서 재현탁시켰다.
단계 4 형질 전환
스리크리슈나 일동(유전자 59, 115-125(1987))의 스페로플라스트 형질 전환 기술을 사용하여 10㎍의 선형 HSA 벡터로써 GS115 세포를 형질 전환시켰다. DNA 샘플을 12×75mm의 살균 폴리프로필렌 튜브에 담았다(20μl 부피까지). (DNA는 TE 완충용액과 같은 적당한 완충용액 내에 있어야 한다). 100μl의 스페로플라스트를 각 DNA 샘플에 첨가하고 약 20분 동안 실온에서 배양하였다. 1ml의 PEG 용액을 각 샘플에 첨가하고 실온에서 약 15분 동안 배양한 후, 700g에서 5-10분 동안 원심분리시켰다. SOS(150μl)를 펠릿에 첨가하여 30분 동안 실본에서 배양하였다. 마지막으로, 850μl의 1M 솔비톨을 첨가하였다.
단계 5 스페로플라스트의 재생
평판 배지 당, 20ml의 재생 한천 SDR의 바닥 한천층을 형질 전환 샘플을 준비하기 적어도 30분 전에 따라 붓는다. 또한, 형질 전환 샘플이 SOS 내에 있는 기간 동안, 재생 한천 8ml 부분 표본을 45℃ 조 내 15ml 원추형 바닥 코닝(corning) 튜브 내에 분산시킨다. 이 형질 전환된 샘플 50, 250 또는 800μl의 부분 표본을 45℃에서 유지된 용융 재생 한천의 8ml 부분 표본에 첨가하여 이를 20ml의 고체 바닥 한천 층을 함유하는 평판 배지 상에 따라 부었다. 평판 배지를 30℃에서 3-5일간 배양하였다.
단계 6 형질 전환체의 선택
형질 전환체는 SDR, 즉 히스티딘 부족 배지 상에서 배양시킴으로써 선택된다. 히스티딘 부재 하에 성장한 배양물을 "메탄올 슬로우(methanol slow)'' 표현형(부위 선택적 삽입을 지시함)에 대해 또다시 스크리닝 한다. 그리하여 양쪽 표현형의 증거를 보여주는 형질 전환된 GS115 세포를 배양하고 HSA의 생성에 대해 분석하였다.
(실시예 VI)
GS115/pHSA13 자발적인 형질 전환체 내의 HSA의 메탄올 유도 발현
플라스미드 pHSA13으로 형질 전환된 KM71 균주 및 pYJ30으로 형질 전환된 음성 조절 KM71을, MGY상 10ml 배양물 내에서 600㎚에서의 광학 밀도가 8.00이 될 때까지 성장시킨 후, MM 배지로 이동시켰다. MM 상에서 3일 동안 배양시킨 후, 세포는 원심분리에 의해 수집하고, 배지 상등액은 1mM 페닐메틸설포닐 불화물(PMSF)로 조정하여 HSA 분석(상등액 M)을 위하여 냉동 저장하였다. 세포를, lmM PMSF를 함유하는 500μl의 응리(凝籬)(breaking) 완충용액에 현탁시켜, 얼음상에서 간헐적인 주기로 총 4분 동안 유리비이드로써 활발하게 볼텍싱 시켰다. 이어서, 이 샘플을 마이크로퓨즈 내에서, 10,000×g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 맑은 상등 용액을 펠릿으로부터 분리하여, 상등액 I로서 표시하였다. 6M 요소를 함유하는 500μl 응리 완충용액으로 펠릿을 추출하여, 이 추출물을 상등액 II로 표시하였다. 여러가지 상등액을, 양적인 HSA-엘리사(ELISA) 뿐만 아니라, Methods ln Enzymology, Vol 152(198
7), ''분자 클로닝 기술에 대한 안내''에서 기술한 바와 같은 PAGE 면역 블롯트에 의해 HSA에 대하여 분석하였다. 이 목적을 위해 개발된 HSA-엘리사 절차를 실시예 Ⅷ에 제공한다. 상등액 I은 HSA-엘리사(표 3)에 의해 결정된 바와 같이 다른 분류물에 비해 가장 높은 수준의 HSA를 함유하였다(표 3). (HSA는 PAGE-전기 면역 블롯팅에 의해 평가된 바와 같이 용성 분류물 내에 주로 존재한다.).
[표 3]
KM71 형질 전환체로부터 제조된 상등액 I내의 HSA 농도
Figure kpo00122
(실시예 Ⅶ)
GS115/pHSA113 삽입 형질 전환체의 메탄올 조절 발현
Figure kpo00123
절단 PHSA113을 사용하여 얻어진 GS115의 수천개의 His
Figure kpo00124
형질 전환체를 한데 모으고, 부분 표본을 MGY l0ml에 접종하여 포화되도록 성장시켰다. 이때, 세포를 MM에 옮기고 30℃의 진탕기에서 배양하였다. MM 상에서 2일 후에, 세포를 수집하고 실시예 Ⅵ에서와 같이, 상등액 I을 제조하여 HSA 발현에 대해 분석하였다. HSA 발현수준은 용성 단백질의 ∼0.1%였다.
MD 평판 배지상의 콜로니들을 MM 평판 배지상으로 복제 플레이팅(replica plating) 시키므로써, His
Figure kpo00125
형질 전환체 푸울(pool)을 "메탄올 슬로우" 형질 전환체에 대해서도 스크리닝하였다. 여러 His
Figure kpo00126
-메탄올 슬로우 형질 전환체를 MGY 상에서 성장시켜 MM으로 이동시킨다. 세포 추출물을 제조하고 실시예Ⅵl에서 기술한 바와 같이 HSA 발현 수준에 대해 분석하였다. HSA 수준을 20mg/l, 또는 전체 용성 세포성 단백질의 2% 수준 이하까지 검출하였다.
(실시예 Ⅷ)
HSA 엘리사(ELISA)
Na2CO3/NaHCO3완충용액(pH 9.5)내 염소의 항-HSA 항체
Figure kpo00127
희석액 50μl를 96웰 엘리사 평판 배지(코닝)의 웰에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이들을 TBST로 2회, dH2O로 2회 세척하고, 블로토 완충용액 200μl를 각각에 첨가한 후, 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후에, 이들을 다시 TBST로 3회, dH2O로 2회 세척하여 샘플 50μl를 각각(저장 HSA 용액=5×107ng/ml; 표준 용액=2-14ng/ml)에 첨가하였다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 회전시킨 후, TBST로 5회, 그리고 dH2O로 2회 세척하고, 블로토 완충용액(5μl/10ml)내 양 고추 냉이 과산화효소가 접합된 염소의 항-HSA 항체(코오퍼 바이오메디칼사)의 1 : 2000 희석액 50μl를 첨가하였다. 다시, 평판 배지를 실온에서 1시간 동안 진탕시킨 후, TBST로 3회, dH2O로 3회 세척하고, 실온으로 데워진 ABTS(ABTS 과산화효소 기질 용액, 키르케가아드 및 페리 랩사) 100μl를 첨가하였다. 최종적으로, 샘플을 실온에서 20분 동안 진탕시키고, 2% 옥살산 100μl를 각각에 첨가하여 반응을 멈추게 하고, 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

Claims (31)

  1. a) 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시 가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 가지는 적어도 하나의 벡터로 메틸 요구 효모(methylotropic yeast)를 형질 전환시킨 후, b) 상기 HSA 단백질을 생성시키기 위해, 적당한 조건하에서 결과 형성된 형질 전환된 효모 균주를 배양하는 것을 포함하여 구성되는, HSA의 제조 방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 또는 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 벡터가 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터가 하기 a-c)의 연속 배열을 함유하는 방법 : a) 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) 적어도 하나의 마아커(merker) 유전자 및 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트(casette)(이때, 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바꿜 수 있다) 및 c) 두번째 삽입성 DNA 단편.
  5. 제4항에 있어서, 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 피치아 파스토리스(
    Figure kpo00128
    )로부터 분리된 유전자의 DNA 서열로부터 유도되고,
    Figure kpo00129
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 발현 카세트가, a) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00130
    , p40,
    Figure kpo00131
    와 사카로마이시스 세레비지에
    Figure kpo00132
    로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되며, 하기 b)에 실시가능하게 연결된 조절 영역과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자 및 c)
    Figure kpo00133
    유전자,
    Figure kpo00134
    유전자,
    Figure kpo00135
    유전자 및
    Figure kpo00136
    유전자로부터 분리된 3' 종결 서열들로 구성되는 군으로부터 선택된 피치아 파스토리스로부터의 3' 종결 서열을 포함하여 구성되는 방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 마아커 유전자가 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00137
    및
    Figure kpo00138
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된
    Figure kpo00139
    및
    Figure kpo00140
    및
    Figure kpo00141
    의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 벡터가, a) 하기 b)에 실시가능하게 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된 5'
    Figure kpo00142
    조절 영역 약 1kb인 첫번째 삽입성 DNA 단편과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자와, c) 하기 d)에 연결된 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00143
    의 3' 종결 서열과, d) 하기 e)에 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00144
    인 적어도 하나의 마아커 유전자 및 e) 3'
    Figure kpo00145
    종결 서열의 약 0.65kb인 두번째 삽입성 DNA를 포함하여 구성되는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 플라스미드가 자체적으로 복제되는 DNA 서열 및 마아커 유전자를 포함하여 구성되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 발현 카세트가, a) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00146
    , p40,
    Figure kpo00147
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파교배 인자 및 클리세로알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성된 군으로부터 선택되며, 하기 b)에 실시 가능하게 연결된 조절 영역과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자 및 c)
    Figure kpo00148
    유전자, p40 유전자,
    Figure kpo00149
    유전자 및
    Figure kpo00150
    유전자로부터 분리된 3' 종결 서열들로 구성되는 군으로부터 선택된 피치아 파스토리스로부터의 3' 종결 서열을 포함하여 구성되는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 마아커 유전자가 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00151
    및
    Figure kpo00152
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된
    Figure kpo00153
    및
    Figure kpo00154
    및
    Figure kpo00155
    의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 플라스미드가, a) b)에 실시가능하게 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된 5'
    Figure kpo00156
    조절 영역과, b) c)에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자와, c) d)에 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00157
    의 3' 종결 서열과, d) 적어도 하나의 마아커 유전자 및 e)자체적으로 복제되는 DNA 서열인, 약 0.19kb 서열의 두번째 DNA 단편을 포함하여 구성되는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 마아커 유전자가
    Figure kpo00158
    인 방법.
  14. (a) 첫번째 삽입성 DNA 단편과, (b) 적어도 하나의 마아커 유전자 및 3' 종결 서열과 조절 영역에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자를 포함하는 걱어도 하나의 발현 카세트(이때, 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바뀔수 있다) 및 c) 두번째 삽입성 DNA 단편의 연속 배열을 포함하여 구성되는, 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 피치아 파스토리스로부터 분리된 유전자의 DNA 서열로부터 유도되고,
    Figure kpo00159
    , p40,
    Figure kpo00160
    및
    Figure kpo00161
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트가, a) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00162
    , p40,
    Figure kpo00163
    및
    Figure kpo00164
    와, 시카로마이시스 세레미지에로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되며, 하기 b)에 실시가능하게 연결된 조절 영역과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자 및 c) 피치아 파스트리스로부터 분리된
    Figure kpo00165
    유전자, p40 유전자,
    Figure kpo00166
    유전자 및
    Figure kpo00167
    유전자로부터 분리된 3' 종결 서열들로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열을 포함하여 구성되는 벡터.
  17. 제l4항 또는 제l5항에 있어서, 상기 마아커 유전자가 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00168
    및
    Figure kpo00169
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된
    Figure kpo00170
    및 박테리아성
    Figure kpo00171
    및
    Figure kpo00172
    의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
  18. 제14항에 있어서, a) b)에 실시가능하게 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된 길이 약 1kb인 5'
    Figure kpo00173
    의 실시가능한 조절 영역인 첫번째 삽입성 DNA 단편과, b) c)에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자와, c) d)에 연걸된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00174
    의 3' 종결 서열과, d) e)에 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00175
    인 적어도 하나의 마아커 유전자 및 e) 3'
    Figure kpo00176
    종결 서열의 약 0.65kb인 두번째 삽입성 DNA 단편을 포함하는 벡터.
  19. a) 메틸 요구 효모 내에서 복제할 수 있는, 자체적으로 복제되는 서열과, b) 적어도 하나의 마아커 유전자 및 c) 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하여 구성되는 플라스미드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 발현 카세트가, a) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00177
    , p40,
    Figure kpo00178
    및
    Figure kpo00179
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되며, 하기 b)에 실시가능하게 연결된 조절 영역과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자 및 c) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00180
    유전자, p40 유전자,
    Figure kpo00181
    유전자 및
    Figure kpo00182
    유전자로부터 분리된 3' 종결 서열들로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열을 포함하여 구성되는 플라스미드.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 마아커 유전자가 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00183
    및
    Figure kpo00184
    와, 사카로마이시스 세레비지에로부터 분리된
    Figure kpo00185
    및 박테리아성
    Figure kpo00186
    및
    Figure kpo00187
    의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 플라스미드.
  22. 벡터 pHSA13.
  23. 3' 종결 서열에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자에 실시가능하게 연결된 조절 영역을 포함하는 적어도 하나의 발현 카제트를 포함하는 적어도 하나의 벡터로써 형질 전환된 메틸 요구 효모.
  24. 제23항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스인 메틸 요구 효모.
  25. 제23항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스 균주 GS115인 메틸 요구 효모.
  26. 제25항에 있어서, 상기 GS115가, a) 첫번째 삽입성 DNA 단편과, b) 하기 c)에 실시가능하게 연결된, 적어도 하나의 마아커 유전자 및 HSA에 대한 구조 유전자를 포함하는 적어도 하나의 피치아 양립성 발현카세트(이때, 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바꿜 수 있다). c) 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00188
    유전자, p40 유전자,
    Figure kpo00189
    유전자 및
    Figure kpo00190
    유전자로부터 분리된 3' 종결 서열들로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열 및 d) 두번째 삽입성 DNA 단편의 연속 배열로 된, 적어도 하나의 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터로써 형질 전환되는 피치아 파스토리스 GS115.
  27. 제17항에 있어서, 상기 벡터가, a) b)에 실시가능하게 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된 5'
    Figure kpo00191
    조절 영역 약 1kb인 첫번째 삽입성 DNA 단편과, b) c)에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자와, c) d)에 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00192
    의 3' 종결 서열과, d) e)에 연결된, 피치아 파스토리스로부터 분리된
    Figure kpo00193
    인 마아커 유전자 및 e) 3'
    Figure kpo00194
    종결 서열의 약 0.65kb인 두번째 삽입성 DNA 단편을 포함하여 구성되는, 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터.
  28. 피치아 파스토리스 GS115/pHSA113.
  29. GS115가 제17항에서와 같은 선형의 부위 특이적 삽입성 벡터의 하나 이상의 복제물에 의하여 형질 전환되는, 형질 전환된 피치아 파스토리스 GS115.
  30. 제25항에 있어서, 상기 GSl15가, a) 피치아 파스토리스 내에서 복제할 수 있는, 자체적으로 복제되는 서열과, b) 적어도 하나의 마아커 유전자 및 c) 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연결된 HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드로써 형질 전환되는, 피치아 파스토리스 GS115.
  31. 서열이 하기와 같은, HSA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
    Figure kpo00195
KR1019890005444A 1988-04-25 1989-04-25 Hsa의 제조 방법, 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 및 이로써 형질 전환된 메틸 요구 효모 KR970002914B1 (ko)

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