JPH02104292A - ヒト―インターロイキン―２のメチロトローフ酵母での発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
る。１つの態様において、本発明はヒト−インターロイ
キン−２（ｈＩＬ−２）蛋白質をメチロトローフ酵母で
発現させる方法に関する。他の態様において、本発明は
新規ＤＮＡ分子およびそれで形質転換された新規酵母株
に関する。

（従来技術） ヒト−インターロイキン−２（ｈＩＬ−２）はマイトジ
ェンまたは抗原によって活性化されたＴ−細胞によって
生産される蛋白質である。ｈＩＬ−２は数多くの免疫応
答を仲介し、抗原との相互作用に次いでＴ−細胞および
Ｂ−細胞の長期増殖を促進する。ｈＩＬ−２のこのよう
な特徴は、この蛋白質を免疫不全患者の治療に利用する
ことに興味を起こさせた。故に、ｈＩＬ−２はバイオテ
クノロジーの研究および生産上重要な蛋白質となった。

ｈＩＬ−２は大腸菌（Ｅ、ｃｏレエ）、哺乳類細胞、ヱ
ッカロマイセス拳セレピシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、およびストレプトミ
セス儂リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ　１
ｖｉｄａｎｓ）で生産されているが、不運なことに、こ
れらのシステムは各々重大な欠点を持っている。例えば
、大腸菌（Ｔ’Ｊ、Ｃ０１１）は精製によって除去しな
ければならないエンドトキシンを生産し：哺乳類細胞系
は酵母または細菌と比較して増殖に費用がか＼す；スト
レブトミセ玉・リビダンスおよびニエ互三ヱ王土ｘａセ
ｖピシアエでのｈＩＬ−２の現在の生産は容認しがたい
程低い。

従って、ｈＩＬ−２の生産を増加させる方法を開発する
ことはこの技術分野に大きく貢献するであろう。

（発明の構成） 本発明に従って、ｈＩＬ−２の構造遺伝子を含む適合発
現カセットを持つ少なくとも１つのベクターでメチロト
ローフ酵母を形質転換すること、およびその結果生じた
形質転換体をｈＩＬ−２の生産に適した条件下で培養す
ることからなるｈ−ＩＬ−２の改良された生産方法が提
供される。

ｈＩＬ−２の構造遺伝子はこの技術分野では周知であり
、タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）　、　５旦λ：３０５（１９８３）Ｋよっ
て最初に配列決定された。ｈｌＬ−２のヌクレオチド配
列を第１表に示す。この配列はｈＩＬ−２に天然に存在
するシグナル配列（最初の２０コのアミノ酸）を含んで
いない。第１表の配列は、発表されたタニグチらの配列
の２１番目のアミノ酸から始まる成熟型ｈＩＬ−２と共
にフレーム内に挿入されたメチオニンフドンな持つ。構
造遺伝子）１再単離によって得るか、またはプリティ、
シュ　バイオテクノロジー株式会社（Ｂｒ自ｉｓｈ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ、）のような注文遺
伝子製造業者によってインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
で合成するのが望ましい。注文合成された遺伝子は、制
限部位が合成遺伝子内に挿入または除去されているため
に使い易（・とい５理由で好んで用いられる。

以下の方法はｈＩＬ−２構造遺伝子を含むＤＮＡ配列を
修飾および単離するための数多くの方法のうちの１つを
例示するにすぎない。

本発明を実施するために用いたｈＩＬ−２構造遺伝子は
ｐＵＣ９：ｐＬ／ＩＬ−２内に含まれていた。

ｐＵＣ９：ｐＬ：ＩＬ−２プラスミドは大腸菌ＪＭ８３
株内に保持されていた。しかしながら、非相同遺伝子の
保持に適した大腸菌のベクターおよび株のシステムであ
ればどのようなシステムでもいったん単離したｈ　Ｉ　
Ｌ−２遺伝子の保持に利用しうる。

まず最初に、ｈＩＬ−２遺伝子を含むヌクレオチド配列
は、Ｉｓ　ｃ　ｏ　ＲＩ制限部位をＡＴＧ開始コドンの
５側に追加することによって本発明の実施に用いろ発現
ベクターへの挿入用に調製した。この第二〇ＥｃｏＲＩ
部位を挿入することで、ｈ　Ｉ　Ｌ−２遺伝子は本発明
の実施に用いる発現ベクターの唯一のＥｃ　ｏ　ＲＩ部
位へ挿入するために準備されたニフラグメントとして回
収できるようになった。

ＥｃｏＲＩ制限部位は、Ｅｃ　ｏ　ＲＩ制限部位を提供
するために設計した人造オリゴヌクレオチドを合成する
ことによって構築した。

このオリゴヌクレオチドは次のヌクレオチド配列 ５’　−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡ−３’３’−ＴＴ
ＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＣ−５’からなる。

このような合成配列は酵素的手段または化学的手段のど
ちらかによって製造される。適当な手段は、これに限る
わけではないが、リン酸トリエステル１亜リン酸塩、ま
たはホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｄｉｔ
ｅ）　　の化学作用に基づいた化学的方法を含む。本発
明の実施に用いるオリゴヌクレオチドは、製造業者が推
奨する操作法に従ってアプライド　バイオシステムズ　
モデル　３８０ＡＤＮＡ　　シンセサイザー（Ａｐｐｌ
　ｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ　３８０Ａ
　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した
。

二本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡとして合成し
、これをリン酸化しさらにアニールして上記の二本ｍｌ
　Ｄ　Ｎ　Ａの形にした。次に、プラスミドｐＵＣ９：
ｐＬ：ｐＩＬ−２は標準法で単離し、ＮｃｏＩで消化し
た。次いでＮｃｏＩフラグメントを牛の腸のアルカリホ
スファダーゼのような適切な試薬で脱リン酸化した。次
いでリンカ−をＮｃｏＩフラグメントと混合し、Ｔ４リ
ガーゼでＮｃｏＩ末端に結合させた。連結反応がうま（
い（とリンカ−の挿入されたプラスミドが再生された。

再構成プラスミドはＤＧ７５’　　のような適切なコン
ピテント宿主細胞に形質転換するための反応混合物を用
いて選択した。形質転換細胞はアンピシリン耐性で選択
した。形質転換細胞は、アンピシリン耐性コロニーから
プラスミドＤＮＡを回収しさらにＥｃｏＲＩで消化しゲ
ル電気泳動を行うことによって、ＥｃｏＲＩフラグメン
トの存在を試験した。Ｔｂ　ｃ　９　ＲＩフラグメント
内にｈＩＬ−２構造遺伝子を含むコロニーは本発明の実
施中に使用する発現ベクターに挿入するための遺伝子源
として保存した。

本発明の実施にあたって用いたヌクレオチド配列を第１
表に示す。

第１表 １　ＴＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＧＴＴＴＴＡＡＣ
ｒＧＡＡＡＣＡＡＡＣ＄ＡＧＡ　Ｉ　ＣＣＡＡπ鄭ロＡ
ＴＧＡＴＧ鑞割聾工面爾ＡＣＣＴＣＴ工τ４６　ＴＧＧ
ＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡ工ＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡ
ＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＱ：　ＧＴＧＧＡＴ
ＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴｒＴＣＴｍＧＴＧＴＣＧ
ＡＴＧＴｒＧ　ＡＣＣ９１ＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴ
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ＧＡＡＴｒＡＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡ国ＡＣＣＴＡ
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ＴＣｒＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡＴＣＴＡＣＣｒＡ
ＡＴＧＧＡ　ＡＡＡＣＡＧＴＩＴＣＧＴ’ＡＧＴＡＧＡ
ＧＴｒＧＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴＡ４５１　ＡＡＴＴＡＡ
ＧＴＧＣＴＴＣＣＣＡＣｒＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＡＧ
ＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴｒＡＡＴＴＣＡＣＧＡＡＧＧＧ″
ＴＧＡＡπＴＴＧＴＡＴＡＧｒＣＣＣＣＣｒＡＧＧＧ上
記の大腸菌株の培養は任意の適切な方法で行うことがで
きる。大腸菌培養の一般的技術はこの技術分野では既知
であり、このような方法をここで使用する株に特異的な
必要条件に適合させることは当業者に周知である。

大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収はプラスミドの構
成サイズおよび集合した閉環状球状スーパーへり、クス
構造によって、いろいろな技術で遂し成げられる。例え
ば、集菌に次いで、宿主細胞を遠心分離でペレット状に
し、その後再懸濁してさらに溶菌する。溶菌液を遠心分
離して細胞砕片を除去しＤＮＡを含む上澄液を残す。次
いでフェノール抽出を行うとＤＮＡからそれ以外の汚染
物質のほとんどを除去することができる。その後、フェ
ノール抽出したＤＮＡはさらに密度勾配遠心分離または
ゲルｒ過技術を用いて処理して細菌ＤＮＡからプラスミ
ドＤＮＡを分離する。上記の分離技術はこの技術分野で
周知であり、このような技術を実行するための方法は数
多く知られている。

プラスミドのヌクレアーゼ消化は選択されたプラスミド
を切断するのに適切なエンドヌクレアーゼを選択するこ
とによって、ｈＩＬ−２，構造遺伝子の回収を容易にす
るような方法で成し遂げられるであろう。使用されるエ
ンドヌクレアーゼはｈＩＬ−２が切り出されるはずのプ
ラスミドに依存する。例えば、プラスミドｐＵＣ９：ｐ
Ｌ：ｈＩＬ−２に含まれるｈＩＬ−２構造遺伝子はＮｃ
ｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして回収され得た。

ＤＮＡのゲル電気泳動は数多くの技術を用いて成し遂げ
られるであろう。セアリ（Ｐ、Ｇ、５ｅａｒｌｙ）およ
びサザｙ　（Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）、「核酸のゲ
ル電気泳動−実施研究法（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃ−ｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓｏｆ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ）
Ｊ　　リ　、クウ、ド（Ｄ　、　Ｒｉ　ｃｋｗｏｏｄ　
）およびホームズ（Ｂ、Ｄ、Ｈｏｍｅｓ）編、３９頁（
１９８２）を参照されたい。ゲルからの溶出もまた、通
電溶出、拡散、ゲル溶解（アガロースゲル）または物理
的抽出（アガロースゲル）のような、用いたゲルに適切
な数多くの方法を用いて成し遂げられる。

さらに、高品質の低温融解アガロースのようなある種の
ゲルでは溶出の必要性がないことが認められている。

ひとたび、それからｈＩＬ−２構造遺伝子またはフラグ
メントを含むフラグメントな単離しても、それをベクタ
ーに挿入するまでにはさらなる操作が必要とされるであ
ろう。このような操作には、これらに限定されるわけで
はないが、リンカ−の添加またはフラグメントを平滑末
端にすることなどが含まれる。

ｈＩＬ−２構造遺伝子の単離に次いで、遺伝子をプラス
ミドのような適切なメチロトローフ酵母のベクターに挿
入する。本発明の実施に好適なベクターとはくヱ７（Ｐ
ｉｃｈｉａ）属および最も好適にはピキア・パストリス
（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）にも適合するベク
ターである。

プラスミドは以前からずっと組換えＤＮＡの技術に使用
される基本因子の１つであった。プラスミドは微生物に
見い出される環状の染色体外の二本鎖ＤＮＡである。プ
ラスミドは細胞あたり１コまたは多数のコピーが存在す
ることが認められている。プラスミドＤＮＡに含まれる
情報はプラスミドの再生産に必要である、例えば、複製
開始点は細菌を複製するために含まれている。形質転換
された細胞内のプラスミドを表現型で選択する一つ以上
の手段もまたプラスミドにコードされた情報の中に包ま
れている。抗生物質耐性遺伝子または宿主の生化学的代
謝経路の欠損を補なう遺伝子のような表現型マーカーま
たは選択マーカーは形質転換された宿主細胞のクローン
を認識し、選択しさらに保持することを可能にする。

１１１Ｌ−２構造遺伝子をメチロトローフ酵母で発現さ
せるためには、遺伝子を５′調節領域および６′終止配
列と機能しうる状態で連結する必要があり、そうするこ
とによってベクターを通して宿主に挿入される発現カセ
ットが形成される。

ここで用いた次の用語を説明の目的で定義する。

［機能しうる状態で連結する」とは、成分がそれらの機
能を果たすように配列された並び方を指す。。

「調節領域」はいろいろな刺激と反応１〜てｍＲＮＡの
転写速度に影響を与えるＤＮＡ配列である。

［３′終止配夕１月はポリアデニル化を引き出す配列の
ようにｍＲＮＡを安定化する機能を果たす終止コドンま
での６′配列を指す。

［ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）適合」とは、４工１に起源を
有する調節領域および３′終止配列のように巨土工内で
正常な機能を果たすＤＮＡ配列を指す。

本発明を実施するためには、欧州員願第８６１１４７０
０．７号に記載され、第２２６７５２号として公表され
たフレラグ（Ｃｒｅｇｇ）　　の線状の部位特異的組込
み（インテグレティプ）ベクターのような組込みベクタ
ーが望ましい。そのようなベクターは少なくとも１）第
一の挿入可能ＤＮＡフラグメント；２）選択可能なマー
カー遺伝子；および３）第二の挿入可能ＤＮＡフラグメ
ント；が連続的に配置された配列からなる。

第一および第二の挿入可能ＤＮＡフラグメントはそれぞ
れ少なくとも約２００コのヌクレオチドの長さであり、
形質転換される種のゲノムＤＮＡの一部分と相同なヌク
レオチド配列を持つ。組込みベクターのいろいろな成分
は、発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子が第一
の挿入可能ＤＮＡフラグメントの６′末端と第２の挿入
可能ＤＮＡフラグメントリ５′末端との間に位置するよ
うな線状ＤＮＡフラグメントを形成するために連続的に
配置されている。第一および第二の挿入可能ＤＮＡフラ
グメントは、それらが族ゲノム内で方向を合わせて配置
されているのと同様に、連続的に配置された線状フラグ
メントでも互いの方向を合わせて配置されている。

第一および第二の挿入可能ＤＮＡフラグメントとして有
用なヌクレオチド配列とは、ゲノムの修飾が起こるはず
の本来のゲノムの部位で切断分離された一部分と相同な
ヌクレオチド配列である。

このように、例えば、ゲノムの修飾がアルコールオキシ
ダーゼ遺伝子座で起こるならば、用いる第一および第二
の挿入可能なＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子座より切断分離された一部分と相同な配列で
あるべきである。本発明に従って生ずるゲノムの修飾に
対して、２コの挿入可能なＤＮＡフラグメントは線状フ
ラグメントにおいてもそれらフラグメントが親ゲノム内
で存在するのと同じ方向関係になるように互いに方向を
合わせて配置されていなければならない。第一および第
二の挿入可能なＤＮＡフラグメントとして使用されうる
ヌクレオチド配列の例として、アルコールオキシダーゼ
（ＡＯＸｌ）遺伝子、ジヒドロキシアセトン　シンター
ゼ（ＤＨＡＳ）　遺伝子。

ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群より選択
されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＡＯＸ１遺伝子
、ＤＨＡＳ遺伝子、ｐ４０遺伝子および狸遺伝子は公開
済の欧州特許出願第０１８３０７１号〔フィリ、ブス　
ペトロレウム　カンパニー（Ｐｈｉ　ｆｌｉｐｓ　Ｐｅ
ｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ）］に含まれている。

第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントは発現カセット内
で利用される調節領域からなる機能し得る調節領域を包
含するであろう。発現カセットの調節領域として第一の
挿入可能なＤＮＡフラグメントを利用することは本発明
の好適な実施態様である。第１図はカセットの調節領域
として第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントを利用する
ベクターの図を提供する。

さらに第１図に示すように、挿入部位（群）および５′
終終止列は第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントの３′
末端に隣接するように配置されている。

このような線状部位特異的組込みベクターの配座は適合
する３′終終止列の追加を必要とせず、構造遺伝子の挿
入用に準備された部位を提供するというさらなる長所を
持つ。即ち、第１図のプラスミドでは、構造遺伝子はプ
ラスミド中に唯一存在するＩ！Ｉ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位に
挿入しうる。

さらに、本発明の実施にあたって使用する発現ベクター
は第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントと第二の挿入可
能なフラグメントとの間に構造遺伝子またはカセットな
どを挿入しやすくするためにポリリンカ一部位を含んで
いる。

また、宿主株を形質転換するために用いるＤＮＡには少
なくとも１コの選択可能マーカー遺伝子が含まれている
必要がある。このことは形質転換ＤＮＡの組み込まれた
微生物の選択および単離を容易にする。マーカー遺伝子
は宿主が保持していない表現型特性：例えば、形質転換
されてない宿主株の特定アミノ酸の生合成経路が欠損し
ている場合にその特定アミノ酸の生産能力を回復させる
こと、または抗生物質などの耐性；を形質転換された微
生物に付与する。

典型的な選択可能マーカー遺伝子は臣ヱ１　乙からのイ
ンベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）、大腸菌の転置因子Ｔ
ｎ６０１またはＴｎ９Ｑ３からのＧ４１８Ｒカナマイシ
ン耐性遺伝子からなる群より選択され得る。

当業者は、例えば細菌性プラスミドＤＮＡおよびバクテ
リオファージＤＮＡなどのようなさらなるＤＮＡ配列も
また、本発明の実施にあたって使用するベクター内に組
み込まれ得ることを認識している。そのようなＤＮＡ配
列は細菌宿主内でのこれらのベクターの増幅および保持
を可能にする。

もし、第一の挿入可能ＤＮＡフラグメントが調節領域を
包含していなければ、機能し得る発現カセットな提供す
るために、適切な調節領域を構造遺伝子に機能しうる状
態で連結させて挿入する必要があるであろう。同様に、
もし６′終終止列が発現カセットを完全なものとするた
めに挿入部位に提供されていなければ、３′終終止列を
挿入される構造遺伝子に機能しうる状態で連結させる必
要があるであろう。

当業者は、特徴的であり且つメチロトローフ酵母との接
合に利用できる調節領域を数多（知っている。典型的な
調節領域はす、カロマイセス・竺しピシアエから単離さ
れた酸性ホスファターゼ。

ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ。

チトクロムＣ９α−接合因子およびグリセルアルデヒド
　３−リン酸デヒドロゲナーゼの調節領域；ピキア−・
／＜２土工二などに起源を有する第一アルコール　オキ
シダーゼ（ＡＯＸ−１）、ジヒドロキシアセトン　シン
ターゼ（ＤＨＡＳ）　、　ｐ　４０調節領域およびＨＩ
Ｓ４調節領域；からなる群より選択される酵母の調節領
域を含むが、これらに限定されるわけではない。現時点
で本発明の実施にあたって使用される好適な調節領域は
、ＡＯＸ１、ＤＨＡＳおよびｐ４０からなる群より選択
され且つ公開された欧州特許出願第０１８３０７１号に
開示された調節領域のように、メタノール含有培地と対
応する能力によって特徴付けられる調節領域である。

本発明の実施にあたって最も好適な調節領域はＡＯＸＩ
調節領域である。

６′終終止列は上述のよ５な発現カセットまたはベクタ
ーの一部に利用される。５′終終止列は、遺伝子に機能
しうる状態で連結した場合に、構造遺伝子によってコー
ドされるメツセンジャーＲＮＡを終結、ポリアデニル化
および／または安定化する機能を果たすであろう。本発
明の実施にあたって５′終終止列の起源となる実例は数
少ないが、これらにはニエユニエ土主玉・九と二乙二三
、二ｌセヌラ・ポリモルファ　（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　
ｐｏｌｙ−ｍｏｒｐｈａ）およびピキアの６′終終止列
が含まれ、またこれらに限定されるわけでもない。好適
な６′終終止列は、ＡＯＸ１遺伝子遺伝子１遺シ王遺伝
子’０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子の６′終終止列から
なる群より選択された６′終終止列のような、ピキア・
パストリスに起源を有する６′終終止列である。さらに
、特に好適な３′終終止列はＡＯＸＩ遺伝子の６′終終
止列である。

目下のところ、現行の本発明を実施するためには、第１
図および第２図に示す構造のＢｇｅＨフラグメントのよ
うな線状部位特異的組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）
ベクターの使用が望ましい。本発明を実施するためには
、プラスミドＨＩＬ３０１に含まれる線状ベクターが特
に望ましい。プラスミ）’ＨＩＬ３０１　は線状部位特
異的組込みベクターを含むフラグメント内に存在する、
ｐＡＯ８０４のＮａｅＩサイト１および６に挿入された
第二の選択マーカー（カナマイシン耐性）をもつプラス
ミドｐＡＯ８０４の修飾物である。この第二の選択マー
、カーは、ｐＵＣ９：ｐＬ：ｈＩＬ−２がらｈＩＬ−２
構造遺伝子を単離する場合のＤＮＡフラグメントリ調製
および精製を大規模に削除することを可能にする。ｐＵ
Ｃ９：ｐＬ：ｈＩＬ−２をＥｃｏＲＩで消化して、さら
にその後ｈＩＬ−２構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグ
メントを単離する代わりに、この反応混合物を直接ｐＨ
ＩＬ３０１の脱リン酸化したＥｃｏＲ１部位に結合させ
ることができる。次いで連結反応混合物を使って受容能
のある大腸菌に形質転換し；ｐＨＩＬ３０１を含むプラ
スミドをカナマイシン耐性によって直接選択することが
できる。

ｈＩＬ−２構造遺伝子の適切なベクターへの挿入は、選
択したベクターを特定部位（群）で切断し、その結果ベ
クター内に存在するｈＩＬ−２構造遺伝子を含む機能し
うる発現カセットを少なくとも１コ生ずる、任意の適切
な技術によって成し遂げられるであろう。

ｈ　Ｉ　Ｌ−２構造遺伝子の連結反応はＴ４ＤＮＡ　Ｉ
Ｊガーゼの使用といったような任意の適切な連結反応技
術によって成し遂げられるであろう。

ｈＩＬ−２構造遺伝子およびベクターの連結反応混合物
の最初の選択、伝播および任意の増巾は、（連結反応混
合物を酵母宿主に直接形質転換することもできるが）混
合物を大腸菌のような細菌宿主に形質転換することによ
って行われるのが望ましい。大腸菌に対する適切な形質
転換技術はこの技術分野では周知である。さらにベクタ
ーを細菌宿主内に保持するために必要な選択マーカーお
よび細菌の複製開始点もまたこの技術分野では周知であ
る。

発現システム内のｈＩＬ−２構造遺伝子を含む所望のプ
ラスミドの単離および／または精製はプラスミドＤＮＡ
を宿主ＤＮＡから分離する任意の適切な手段によって成
し遂げられるであろう。

同様に、連結反応によって形成されたベクターは、伝播
後、ｈＩＬ−２遺伝子の存在ならびにｈＩＬ−２遺伝子
の調節領域および６′終終止列への機能できろ状態での
連結反応を確かめるために試験するのが望ましい。これ
はこれらに限られるわけではないがエンドヌクレアーゼ
消化、ゲル電気泳動。

またはエンドヌクレアーゼ消化−サザン　ハイプリダイ
ゼーシ、　ン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉａｉｚａ
ｔｉｏｎ）を含むいろいろな技術によって成し遂げられ
るであろう。

プラスミドまたは線状ベクターの酵母宿主への形質転換
はこれらに限られるわけではないが、ヒパクテリ、７３
−０ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）＋　１５３
．１６３（１９８３）　；　　フレラグ（Ｃｒｅｇｇ）
ら、モ１／　キュ７エンド　セルラー　バイオロジー（
ｈｉｏｌ　、Ｃｅｌ　ｌ　。

Ｂｉｏ１、）、　５．５３７６Ｃ１９８５）　：　また
はスレエクリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）　、　５９＋１１５（１９８７）によ
って教授される技術を含む適切な形質転換技術によって
成し遂げられるであろう。本発明の実施にあたって好適
なのはフレラグの形質転換技術である。本発明を実施す
るためには、過剰の線状ベクターを用い且つサザンノ）
イブリダイゼーションによって多重挿入を選択するのが
望ましい。

形質転換用酵母宿主は任意°の適切なメチロトローフ酵
母であろう。メチロトローフ酵母はハンセ王乏（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、　Ｌ旦
五久９（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、＆＋７（Ｐｉｃｈｉａ
）、ｆ　　＃ｏｚイセスー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ
ｓ）　、　）ルロブシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）　　
およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる
属から選択されたメタノールで増殖可能な酵母を含むが
これらに限られるわけではない。

このクラスの酵母の典型である特定の種のリストはアン
トニ（Ｃ，Ａｎｔｈｏｎｙ）、　［メチロドローフッ生
化学（Ｔｈｅ　Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍ
ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）Ｊ　。

２６９（１９８２）の内に見い出し得る。現在のところ
好適なのは栄養素要求性のく土１　バストリス（Ｐｉｃ
ｈ　ｉａ　鷹巨堕揮至）　ＧＳ　１１５　（ＮＲＲＬ　
Ｙ−１５８５１）のようなピキア属のメチロトローフ酵
母である。

栄養素要求性のメチロトローフ酵母もまたその選択が容
易なため、本発明の実施に好都合である。野生型メチロ
トローフ酵母種は、ピキア　／＜２上ユ玉をスクロース
上で増殖できる株に形質転換するためのＳＵＣ２の使用
といったように適切な形質転換マーカー遺伝子を選択す
るか、または０４１８のような抗生物質耐性マーカーを
使用するならば、同じように首尾よく使用しうることが
確認されている。

形質転換したメチロトローフ酵母は、これラニ限られる
わけではないが、栄養素要求性細胞を形質転換後（細胞
の栄養素要求性に従って）必要とされる生化学製品不在
下であらかじめ培養するこト、新規の表現型〔［メタノ
ールスロー］（ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｓｌｏｗ）　）の検
出による選択、または形質転換体に含まれる耐性遺伝子
が存在しない酵母に対しては有毒である抗生物質の存在
下で培養すること、を含む適切な技術を使用することに
よって選択できる。

単離された形質転換体メチロトローフ酵母細胞は振とう
フラスコ発酵、またはフレラグ（Ｃｒｅｇｇ）　。

「メチロトローフ酵母、ピキア　ＵでのＢ型肝炎表面抗
原の高濃度発現および効果的組立て（Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖ
ｅｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔεｆｆｉｃｉ
ｅｎｔＡｓｓｅｍｂｌｙ　　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
　　Ｂ　ＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎｉｎ　　ｔｈｅ
　〜１ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｙｅａｓｔ、Ｐｉ
ｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）　Ｊ　、バイオ／テクノロ
ジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　５．４７９
（１９８７）によって開示されているような高密度発酵
技術のような適切な発酵技術によって培養される。

発現は使用した調節領域に適した方法で成し遂げられる
であろう。好適には、もしメタノール応答性調節領域が
用いられるならば、発現の誘発は栄養培地中の形質転換
細胞を使用した調節領域に対して適切なアルコールにさ
らすことによって成し遂げられるであろう。

ｈＩＬ−２は、十分期間誘導した形質転換細胞を溶菌し
、ビーズ摩砕のような標準技術を用い、次いで細胞砕片
を取去するのに十分な遠心分離を行うことによって粗精
製状態で回収されるであろう。

当業者は上述のような一般的抽出技術またはさらなる精
製の代わりになりうる、一つの異質蛋白質を単細胞宿主
微生物から抽出するための有効な方法を数多く知ってい
る。

次の実施例は本発明の実施を制限するものではなく本発
明の実施をさらに例証するために提供される。

（実施例） 実施例に関する一般情報： 見 ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
）　ＧＳ１１５（Ｉ（ＩＳ４）（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８
５１１はこの実施例で用いた宿主酵母株である。

大腸菌（旦托旦鳳）　ＤＧ７５’　（ｈｓｄ　１　、υ
巳ヒ五。

ＬａｃＹ、ｔｈｒ−１，５ｕｐＥ４４．ｔｏｎＡ２１　
ｌａｍｂｄａ〔−〕）またはＪＭＩ　０７　（ｅｎｄＡ
　１　、　ｇｙｒＡ９６　、肋ユ旦ｈｓｄ旦１７　、　
Ｓｕ　ｐＬ’４４　、　ｒｅ上Ａ、　ｌａｍｂｄａ（−
Ｌ△ｃ　１ａｃ−ＰｒｏＡＢ）　、　（ＦＯ，ｔｒａＤ
３６．　ＰｒｏＡＢ　。

Ｉ　ａｃ　ＩＱＺ△Ｍ１５１　］　　はププラスミド構
築の伝播と同様にプラスミド構築のために使用した。

緩衝液、および溶液、および培地 以下の実施例で用いた緩衝液および溶液は下に示した組
成をもつ。

ｄＨ２０ミリ−Ｑ（ｍｉ　ｌ　Ｉ　１−Ｑ）Ｃミリポア
Ｃｍ目１ｉｐｏｒｅ）］試薬φ水システムで処理された
脱イオンＨ２０ １Ｍ−トリス緩衝液１２１．１ｇ）リス塩基／ｓｏｏｍ
ｒのＨ２０；濃（６５％）Ｈ（Ｊ水溶液を加えることに
よってｐＨを所望の値に調整する；最終的にｒ＋Ｈを調
整する前に溶液を室温に冷却させる；最終容量１ｅに希
釈する。

ＴＥ緩衝液　　　１．０ｍＭ−ＥＤＴＡｌｏ、０１Ｍ（
ｐＨ７，４）トリス緩衝液 ＳＥＤ　　　　　　ＩＭ−ソルビトール２．５　ｍＭ　
−Ｅ　Ｄ　ＴＡ ５０ｍＭ−ＤＴＴ −−ｐＨ８に調整 ＳＣＥ　　　　　　ＩＭ−ソルビトール１３ｍＮｉ−ク
エン酸ナトリウム １ｍＭ−ＥＤＴＡ −−Ｈ（Ｊ’　−ｃ−ｐＨを５．８に調整ＣａＳ　　　
　　　１Ｍ−ソルビトールｉＱｍＭ−ＣａＣｅ２ ｉＱｍＭ−トリス塩酸（ｐＨ７，５） −一フイルター滅菌 ＰＥＣＪ液　　　２０％ポリエチレングリコール−５６
５０１０ｍＭ−ＣａＣｅ２ １０ｒｎＭ−Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，４）
−一フイルター滅菌 ＳＯ３ＩＭ−ソルビトール １０ｍＭ−ＣａＣｅ２ ６６．５％Ｙ　Ｅ　Ｐ　Ｄ 破壊緩衝液５０ｍＭ−Ｎａ３ＰＯ４、ｐＨ７，５５％グ
リセロール １ｍＭ−ＥＤＴＡ １ｍＭ−ＰＭＳ−ＦＣシグマ（ｓｉｇｍａ）”］ＹＰＤ
（Ｉｇ）　　　１０ｇ酵母エキス２０ｇペプトン １０ｇデキストロース ５ＤＲ（１ｇ）　　　、６．７ｇＹＮＢ４００μｇビオ
チン １８２ｇソルビトール １０ｇデキストロース １０ｇ寒天 各々５０ｍｇのグルタミン、メチオニン。

リジン、ロイシンおよびイソロイシン ２ｇヒスチジン　アッセイ　混合物 ＳＤＨＲ（１ｇ）　　ＳＤＲ＋２０ｍ９ヒスチジン（実
施例１．ＤＮＡの微量調製（ミニプレプ））溶液Ｉ ０．５１ｄ２０％滅菌グルコース（〜５０ｍＭ最終濃度
）１　　ｍｌ　　　１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，００，
２５ｍｌ　　Ｉ　Ｍ　−）リス・塩酸、ｐＨ８，０３，
２５ｍＪ　　ｄＨ２０ ’ｌ０ｍ１　　総容量（１０ｍ、！９リゾチーム〔シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）］を２，５蛯溶液Ｉに加える） 溶液■（毎週調製する） ０．２Ｎ−ＮａＯＨ １％ＳＤＳ 溶液１■ ３　Ｍ−Ｎａ０Ａｃ　、　ｐ　Ｈ４，８−晩培養した１
、５ｍ／！の大腸菌〔Ｌｃｏ　ｌ　ｉ　）　ＤＧ’７５
’細胞を４℃で３０秒間べ、クマン　ミクロフユージ（
Ｂｅｃｋｍａｎ　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）を用（・て遠心
分離した。

その結果得られた上澄液を捨て、ペレットを４ｍ９／　
ｒｎｌ　’Ｊゾチームを含む１００μｅの溶液Ｉに再懸
濁し、サンプルを氷上で３０分間インキュベーションし
た。２００μｅの溶液■を加え、穏やかにうず′巻き攪
拌して蛋白質凝集塊を砕いてばらばらにした。サンプル
を再び氷上で３０分間インキ、ぺ−ションした。１５０
μｅの溶液■をサンプルに加えた。これを攪拌し、氷上
で６０分間インキュベーションした。サンプルを上述の
ように５分間遠心分離し、上澄液を新しいチューブにデ
カントした。

１ｍｌの無水アルコールを上澄液に加え、−２０℃で一
部インキユベーションした。インキュベーション後、サ
ンプルを１５分間上述のように遠心分離し、上澄液を捨
て、さらにペレットを１ＴｒＬｌの７０％冷エタノール
で２回洗滌した。次いでペレットを真空下で乾燥させ、
５０μｅの１０ｍＭ−ト、ＩＪス・Ｃｅ、０．１ｍＭ−
ＥＤＴＡに再懸濁した。その後、サンプルは一２０℃で
凍結保存した。

（実施例２　、ｐＨＩＬ５０１の作製）プラスミドｐＡ
Ｏ８０４はノーザン　レジオナルリサーチ　センター（
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
　Ｃｅｎｔｅｒ）、　：ｘ−−、ニス、デパートメント
　オプ　アグリカルチ＋　−（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒ　ｔ
ｍｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、　　ペオリ
ア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、
に寄託された寄託番号ＮＲＲＬＢ−１８１１４の大腸菌
（ＬＣＯレエ）宿主より入手可能であり、プラスミドＤ
ＮＡを収集し、Ｅｃ　ｏ　ＲＩで消化し、さらに７．１
ｋｂのフラグメントを分離用アガロースゲルより回収す
ることによって得られる。プラスミドｐＨＩＬ３０１は
ｐＡＯ８０４より以下のようにして作製した：０．２１
μｇｐＡＯ８０４を最終濃度１００μｇ／ｍｌ　の牛血
清アルブミンを含む２０ｔｉｅｃ総容量）の中程度塩緩
衝Ｗ　（５０ｍＭ−ＮａＣｅ　。

１０ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−（Ｊ？　ｐＨ７，５、１０ｍＭ
−Ｍｇ（Ｊ２．１　ｍＭジチオスレイトール）中、１０
単位の制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩで消化した。消
化は７０分間６７”Ｃで行った。次いでサンプルを７０
℃に５分間加熱し、さらに６０μｅのｄ　Ｈ２０を加え
た。フェノール：クロロホルム抽出をマニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）らの方法に従って行ない、さらに几容量
（２５μｅ）の７．５Ｍ−酢酸アンモニウムを添加し、
次いで１５０μｅの無水エタノールを加え、−７０℃で
４５分間インキーベーションすることによってＤＮＡを
沈澱させた。ＤＮＡはヘルムレ（Ｈｅｒｍｌ　ｅ）　ｆ
）　卓上遠心機を用いて高速で１５分間遠心分離するこ
とによって収集した。ＤＮＡＮレベレは１ｄの７０％エ
タノールを添加しうることによって、さらにそれに次い
で上述の方法で遠心分離を行うことによって２回洗滌し
た。その後ペレットな真空下で乾燥し、さらに１０μｅ
のｄＨｚｏに再懸濁した。この溶液は「切断ベクター」
と呼ばれるものを含んでいる。

これとは別に、カナマイシン耐性遺伝子ＫｍＲを含むＫ
ａｎＲゲンプロ、り（Ｇｅｎｂｌｏｃｋ）　、　７　、
　／ｌ／マシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製、を最終濃
度で１００．Ｊ！／ｆｆ１７！となる牛血清アルブミン
を含む２０μｅ（総容量）の中程度塩緩衝液中、１０単
位の制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。消化は７０分間
５７℃で行い、さらにサンプルを５分間７０℃に加熱し
た。

５０ＡｅのｄＨｚｏを加え°、フェノール：クロロホル
ム抽出を上述の方法に従って行った。その後ＤＮＡを上
述の方法に従って沈澱させ、真空下で乾燥した。サンプ
ルを乾燥状態とし、これを「切断挿入」と呼ぶ。

乾燥した切断挿入を次のもの：５μｅ（約０．１μｇ）
の切断ベクター（上記）：　２μｅの５×リガーゼ緩衝
液〔ベセスダ　リサーチ　ラボス（ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ））、１単位のＴ４リガーゼ
（ＢＲＬ）。

および最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなる牛血清アルブ
ミン：を含む総容量１０μｇ溶液に再懸濁した。２種類
の対照反応を行った。これらの対照反応は：１）切断挿
入ＤＮＡ抜きの上記連結反応混合物、ならびに２）切断
挿入ＤＮＡおよびリガーゼ抜きの上記連結反応混合物を
含んでいる。反応は室温で６５時間インキュベーション
して行った。

その後、各々のサンプルを用いて、ダガルト（Ｄａｇａ
ｒｔ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　６　、２３−２８（
１９７９）に記載されている方法に従って大腸菌ＤＧ７
５’株に形質転換した。形質転換された細胞をアンピシ
リン（１００μｇ／ｒｕｔ　）およびカナマイシン硫酸
塩（５０μｇ／ｍｌｌ　）を含むＬＢ培地に塗布し、３
７℃で一部インキユベーションした。現われたコロニー
は切断ベクターおよび切断挿入が結合した連結反応混合
物で形質転換された細胞に由来するものである。

形質転換体のプラスミド含量は実施例１に記載した微量
調製法、それに続（ＰｓｔＩ切断およびアガロースゲル
電気泳動によって分析した。ＤＧ７５’（ｐＨＩＬ３０
１）およびＤＧ７５’（ｐＨＩＬ３０２　）　　と呼ば
れる２種類の株がｐＡＯ８０４内に挿入されたＫｍＲ遺
伝子を持つものとして選択された。

（実施例３．大腸菌プラスミド中間体の構築）次のリン
カ−を設計し、アプライド　ノくイオシステム（Ａｐｐ
ｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル６８０Ａの
ＤＮＡシンセサイザーによってβ−シアノエチルホスホ
ロアミダイト法を用いて合成１−た：５’−ＣＡＴＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＡＡ−３’３’−ＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧＴ
ＡＣ−５’このリンカ−はＮｃｏＩ切断ＤＮＡに挿入さ
れて、ＮｃｏＩサイトを壊わしさらにＤＮＡＫＥｃｏＲ
Ｉサイトを付加するであろう。二本鎖リンカ−はリン酸
化し、アニールし、ＮｃｏＩ切断ＤＮＡに連結し、ｐＵ
Ｃ９：ｐＬ：ＩＬ２ＤＮＡを脱リン酸化した。連結反応
についで、ＤＮＡをＮｃｏＩで切断してリンカ−を含ま
ない任意の分子を不活性化した。次いでサンプルを用い
て実施例Ｈに記載した方法に従ってＤＧ７５’　　を形
質転換し、アンピシリン耐性で選択した。２１種類の形
質転換体を用（・て実施例Ｉに記載の方法に従ってプラ
スミドＤＮＡの微量調製（ミニプレプ）を行い、次いで
ＥｃｏＲＩで切断し、さらにアガロース電気泳動を行っ
た。これらのうち１４種類がｈＩＬ−２構造遺伝子の５
′側の始めに所望の新規Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩサイトラ含ん
でいた。ｈＩＬ−２遺伝子の６′末端にＥｃｏＲＩサイ
トが予め存在しているために、この新規構築物はｈＩＬ
−２遺伝子をＥｃｏＲＩフラグメントの１つとして除去
できる。

（実施例■、旦土ドパストリス〔上、ｇ国〕発現ベクタ
ー内でのＩＬ−２遺伝子の 構築） 実施例ｒＩ■によって確立された新規Ｊ！Ｉ　ｃ　ｏ　
ＲＩ−サイトを持つサンプルをプールし、：Ｉ！ｌ　ｃ
　ｏ　ＲＩで切断し、実施例■で調製したｐＨＩＬ３０
１をＩシｃｏＲＩで切断しさらに脱リン酸化したものに
連結した。ＤＧ７５’は実施例■記載の方法に従ってこ
のＤＮＡで形質転換し、カナマイシン耐性（ＫｍＲ）で
選択した。

２４コの【−形質転換体を用い、実施例Ｉ記載の方法に
従ってプラスミドＤＮＡの微量調整を行い、次いでＨｉ
ｎｄＩＩ’ｌおよびＢａｍＨＩで切断し、さらにアガロ
ース電気泳動を行った。単離した形質転換体のうち６コ
がｐＨＩＬ３０１内に適切な方向に配置されたｈｌＬ−
２遺伝子を含んでいた。これらの内の１つをｐＨＩＬ３
ろ６と呼ぶ。

（実施例ｖ、ｇ−ｒ７・バスｌＪ２の形質転換）Ａ１．
ベクターの調製 大腸菌（Ｅ、　ｃｏ　ｌ上）　ＤＧ７５’より得られた
１０μｓのプラスミドｐＨＩＬ３３３をＢｇｅ■で完全
消化した。

このＤＮＡフラグメントを用いてノーザン　レジオナル
　リサーチ　センター　オブ　ニー、ニス。

デパートメント　オプ　アグリカルチャー（Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ　ｆ（ｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ　　ｏｆｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）　Ｋ寄託された
寄託番号ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１のピギアバストリス
（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐａ５ｔｏｒｉｓ）ＧＳＩ　１５株（
トｌｌ５４）　を形質転換Ｉ−た。ヒスチジン経路　デ
ヒドロゲナーゼを含むベクターで形質転換するとヒスチ
ジン経路の欠損が補足され、ＧＳ１１５形質転換細胞を
Ｈｉ　ｓ十に変えるであろう。故に、形質転換体のスク
リーニングは細胞を形質転換後ヒスジン欠乏の増殖環境
下で培養しさらにこの条件下で増殖可能な細胞を回収す
ることによって容易になし遂げられるであろう。

Ｂ、細胞増殖 ピキア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８
５１）を約ｉｏｏｍｚのＹＰＤ培地に接種し、３０’Ｃ
で１２〜２０時間培養した。１００蛯のＹＰＤ培地に種
培養を接種し０．Ｄ６００を約０．００１とした。培地
を振と５フラスコ中、３０℃で約１２〜２０時間培養し
た。０Ｄ６００が約０．２〜０．３になった時点（約１
６〜２０時間後）で、培養物を１ｓｏｏ９で５分間、ソ
ーパル（Ｓｏ　ｒｙａｌ　Ｉ）　ＲＣ５Ｃを用いて遠心
分離することによって収集した。

Ｃ，スフェロプラストの調製 細胞を１３ｍ／の滅菌水で一回洗滌し、次いで１５００
ｇ、５分間遠心分離した。（遠心分離は、別の方法が示
されていない場合には、細胞洗滌のたびごとに１５００
．！ｉ’で５分間ソーパルＲＴ６０００Ｂを用いて行う
。）次いで細胞を調製したばかりのＳ　Ｅ　Ｄで一回、
ｉＱｍ／の滅菌Ｉ　Ｍ　−ソ／ｌ／　ヒ）　−ルで一回
洗滌し、最後に１０ｍｔのＳ　ＣＥ緩衝液に再懸濁した
。ｚ５μｅの５ｍｇ／ｍｅジモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙ
ａｓｅ）Ｃ１００，０００単位／ｇのものをマイルス　
ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）より得た〕を細胞溶液に加えた。次いで細胞をろ０
℃に約６分間インキュベーションした。（０，Ｄ６００
の８０％減少を収集時間および濃度マーカーとして利用
した。）スフェロプラストを１Ｑｒｎｌの滅菌１Ｍ−ソ
ルビトールで一回洗滌し、ｉ、ｏ　ｏ　ｏ　ｓで５〜１
０分間遠心分離した。（遠心分離にかける時間および速
度はさまざまであり；スフェロプラストをペレット状に
するには十分であるがスフェロプラストを遠心力で破壊
するほどではない時間と速度で遠心分離する。）１ｏｍ
ｌの滅菌ＣａＳを最終的に細胞を洗滌するために用い、
細胞を１，０００ｇで５〜１０分間再度遠心分離してさ
らに０．６ｍｌのＣａＳに再懸濁した。

Ｄ、形質転換 スリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒ　１ｓｈｎａ）らのス
フェロプラスト形質転換技術、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、
　５９　。

１１５−１２５（１９８７）を用い、ＧＳ１１５細胞を
１０μＩの線状ｐＨＩＬ３３３ベクターで形質転換した
。

ＤＮＡサンプルを１２Ｘ７５ｍｍ滅菌ポリプロピレンチ
ー−プに（最高で２０μｅ容量）加えた。（ＤＮＡはＴ
Ｅ緩衝液のような適切な緩衝液に含まれている。）１０
０μｅのスフェロプラストをＤＮＡサンプルのそれぞれ
に加え、室温で約１０分間インキュベーションした。１
ｒｎｔのＰＥＧ溶液をそれぞれのサンプルに加え、室温
で約１０分間インキュベーションし、１．０００　ｇで
５〜１０分間遠心分離した。

５Ｏ８（１５０μｅ）をペレットに加え、２０分間室温
でインキュベーションした。最後に８５０μｅの１Ｍ−
ソルビトールを加えた。

Ｅ、スフェロプラストの再生 形質転換サンプルが準備できる少なくとも６０分前に、
２０ｒｎＩ！の再生寒天ＳＤＲを底部寒天層としてプレ
ートに注いだ。さらに、形質転換サンプルがＳＯ８に保
たれている間に、３ｍＪ分割量の再生寒天を１５ｍ／の
逆円錐形コーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）チーープに分割
し、４５℃浴に保った。形質転換したサンプルの５０．
２５０　または５００μｅアリコートを４５℃に保たれ
た融解状態の再生寒天８ｍｌアリコートに加え、さらに
２０ｆｆｉ／の底部寒天固体層が入ったプレート上に注
いだ。プレートを３０℃で３〜５日間インキュベーショ
ンした。

Ｆ、形質転換体の選択 形質転換体はヒスチジン欠乏のＳＤＲ培地に培養するこ
とによって選択したヒスチジン欠損下で増殖する培養物
を（部位選択的組込みを指す）「メタノールスロー」表
現型でさらに選択した。

次いで、両方の表現型の存在を示す形質転換されたＧＳ
１１５細胞を培養し、ｈＨ，−２の生産についてアッセ
イした。ピキア・パストリスＧＳ１１５／ｐＨＩＬ３３
３−１４　はこのような方法で選択した。

（実施例Ｖ１．ＩＬ−２の存在の検出および確認）エレ
クトロイミュノプロット（Ｅｌｅｃｔ　ｒｏｉｒｒｍｕ
ｎｏｂｌｏｔｓ）−ポリアクリルアミドゲルで分離した
、標準ＩＬ−２［コラボラティブ　リサーチ（Ｃｏ　Ｉ
　ｌ　ａｂｏｒａｔ　１ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）］を含
む蛋白質を、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）７６．４３５０
（１９７９）に記載された方法に従って３００ｍＡで２
〜４時間電気泳動的にニトロセルロースに転移させた。

イミュノプロ、トをポンセアウＳ　（Ｐｏｎｃｅａｕ　
Ｓ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　　社、を用いて使用書に
従って蛋白質染色し、写真撮影した。

ニトロセルロースをＴＢＳＴ（０，１５Ｍ−Ｎａ（Ｊｌ
ｏ、０５％ツウイー　ン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０を含む
１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−Ｃｅ。

ｐＨ７，４）でリンスした。さらに、ニトロセルロース
の蛋白質結合部位を０．０５％ツウィーンを含むＴＢＳ
Ｔ（パラティゲル（Ｂａｔｔｅｉｇｅｒ）ら、ジャー解
したプロ、キング　バッファー〔５％無脂肪ドライミル
ク、　０．１　ｍ９／ｍｌ　チメロサール、ジョンソン
（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　　ら、ジーン　アナリシス　テク
ニックス（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ　、Ｔｅｃｈ、　）、　
１　、３（１９８４）　Ｅ中で１〜１８時間６７°Ｃに
インキュベーションすることによってブロックした。次
いで、ニトロセルロースをＩＬ−２に対するマウスのモ
ノクローナル抗体〔ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ））の
’ＩＯｔｔｇ／ｍｌブｏ　＋７キング　バッファー中、
１．５時間、２２°Ｃで穏やかに振動させながらインキ
ュベーションした。

ＴＢＳＴ中で５分間、６回洗滌の後、ニトロセルロース
をヤギの抗マウスＩｇＧＩ：キルゲガールド　アンド　
ベリー　ラボ（Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒ
ｒｙＬａｂｓ））の１μｇ／　ｔｒｔｌブロッキングバ
ッファー中、４５分間２２℃で穏やかに振動させながら
インキュベーションした。上述のようにＴＢＳＴ中で洗
滌後、ニトロセルロースをアルカリホスファターゼ結合
−ウサギの抗ヤギＩｇＧ（キルゲガールド　アンド　ベ
リー　ラボ）の０．２５μｇ／ｎｌプロ、キングバッフ
ァー中、４５分間２２°Ｃで穏やかに撮動させながらイ
ンキュベーションした。上述のようＫＴＢＳＴで洗滌後
、ニトロセルロースをＢＣＩＰ／ＮＢＴ　アルカリホス
ファターゼ基質（キルケガールト　アンド　ベリー　ラ
ボ）に浸し、さらに１０〜６０分間発色するまで穏やか
に振動させた。強い濃藍色の反応生成物がゲル内のｈＩ
Ｌ−２存在箇所にできる。このような条件下では５μｇ
　以上のｈＩＬ−２が検出可能である。

エンザイムーリンクド　イミュノソルベントア、セイ（
ＥＬＩＳＡ）−使用したアッセイは、９６穴のＥＬＩＳ
Ａミクロタイタープレートの穴をｈＩＬ−２に対するマ
ウスのモノクローナル抗体（ゲンザイム）の１０μｇ／
ｍｅ　Ｑ、０５Ｍ　Ｎａ２Ｃ○３−ＮａＨＣＯ３，ｐＨ
９，５溶液で被覆し、乙７°Ｃに２時間置くことによる
サンドイッチＥＬＩＳＡ法である。

ＴＢＳＴでリンス後、さらなる蛋白質結合部位を上述の
プロッキングバ、ファーでブロックした。プレートをＴ
ＢＳＴ中で５回洗滌し、次いで５０μｅ／穴の対照標準
ｈＩＬ−２（コラボラティブリサーチ）または試験溶液
を加え、さらにプレートを２２℃、振とう器〔ディナテ
ック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　Ｅ上で１．５時間インキュ
ベーションした。プレートを上述の方法で洗滌し、さら
に５０μｅ／穴のｈＩＬ−２に対するウサギの抗体（コ
ラボラティプリサーチ）の１０μｇ／ｒｎｔプロ、キン
グ溶液を加えた。４５分間振とう器上でインキュベーシ
ョンの後、プレートを上述の方法で５回洗滌し、５０μ
ｅ／穴のビオチン標識のヤギの抗ウサギＩｇＧ（キルケ
ガールトアンド　ベリー　ラボ）の０．５μｇ／ｍｌプ
ロ、キング溶液を加え、さらにプレートを振とう器上で
４５分間インキュベーションした。上述の方法で５回洗
滌の後、５０μｅ／穴の西洋わさびペルオキシダーゼ結
合のストレプタビジ７　（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）
（キルケガールド　アンド　ベリー　ラボ）の０．５μ
ｇ　／　ａｔプロ、キングバッファーを加え、フレート
を４５分間振とう器上でインキュベーションし、さらに
上述の方法に従ってＴＢＳＴ中で５回再洗滌した。最後
に１００μｅ／穴のＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質ｆｊ
ＪｏＬ（キルケガールド　アンド　ベリーラボ）を加え
、プレートを振とう器上で２０分間インキュベーション
し、次いで１１００Ａ、／穴の２％シュウ酸を加えろこ
とによって反応を終了させた。緑色の反応生成物が穴の
中に形成され、キネティック　ミクロプレートリーダー
（ＫｉｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ
）　　（モレキュラー　デバイ、Ｘ　（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）　〕を用いてＡ４０５を測定し
た。このような条件下では２μｇ／ｍ１以上のＩＬ−２
が検出可能である。第２表に示すＩＬ−２発現データを
参照されたい。〔細胞抽出物内の蛋白質濃度を１ｍｇ／
ｍ１、ＩＬ−２の溶解度を１０％、ＩＬ−２の測定量は
全可溶性細胞蛋白質の０．０４〜０．０８％に相当する
、または振とうフラスコ中のＩＬ−２を４〜８　μｇ　
／ｒｎｌ　（４〜８　ｍ９／　ｅ　）、と仮定する。〕 第２表 ＥＬＩＳＡによるピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞抽出物中
の概算のＩＬ−２濃度 １１　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
　　　　　　４４０１２　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　　　　４４７１３　　　　　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　４５７
１４　　　　　　　＋　　　　　　　　　　５６０１５
　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　
　　　　７８０１６　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　　　　　　７６２１７　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　６３０１８　　　　　　　　　　
　＋　　　　　　　　　　　　　　　　６３３１９　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　８０８２０　　　　
　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　
５１５２１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＜３．５２２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＜３．５２３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＜３．５メタノール誘導（０，５％ｖ／ｖ）を異なる時
間行った場合に細胞内に存在するＩＬ−２量もまたＥＬ
ＩＳＡで測定した（第６表）。

第６表 メタノール誘導の時間経過に供なう、ピキア（Ｐｉｃｈ
ｉａ）細胞抽出物中のｎ、−：存在量のＥＬＩＳＡ法に
よる概算 ４８　　　　　　＜２．５ ＩＬ−２＋１２　　　　　２８０ 生物活性一対照標準プラスミドまたはｈＩＬ−２遺伝子
含有プラスミドで形質転換した細胞から得られた可溶性
細胞質内袖出物の生物活性をｈＩＬ−２を発現させるた
めのメタノール誘導の時間経過に供なって評価した（第
４表）。検出された免疫反応性ＩＬ−２の蛋白質量当り
の生物活性は４〜２０Ｘ　１０６ＢＲＭＰ　　単位７ｍ
ｇ蛋白質に相当する。この値は、これらの実験に用いた
ＩＬ−２標準（コラボラティプリサーチ製品番号８８−
１１［）５）の値、５．８〜１０６単位／ｍｇ　蛋白質
に十分匹敵する。

ＩＬ−２ミクロア、セイはギリス（Ｇｉ　Ｉ　Ｉ　ｉｓ
）も、ジャーナル　オプ　イミュノロジ−（Ｊ、Ｉｒｒ
ｍｕｎ、）１２０、、２０２７（１９７８）に従って行
った。簡単に言えば、ＩＬ−２依存性であり、かつ１０
％の熱不活性化した胎児ウシ血清〔ジプコ（Ｇｉｂｃｏ
）］、１０ｒｒＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ジプコ）、２
ｍＭ　グルタミン（ジブコ）および１％抗生物質−抗マ
イコチ、り溶液〔シグマ（ｓｉｇｍａ）］を含むＲＰＭ
１１６４０（ジブコ）中で５％ネズミＴ−細胞ポリクロ
ーンＩＬ−２（コラボラティプリサーチ）と共に慣例的
に培養したＣＴＩＬ−２細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＴｌＢ
２１４）を３ｏｏｘ、ｙ、ソーパルＲＴ６０００遠心分
離機で遠心分離して収集し、ＩＬ−２を含まない培養液
で６回洗滌し、ｈＩＬ−２を含まない培地に２×１０５
細胞／　ｒｎｌとなるように再懸濁した。１００μｅ／
穴のアリコートを９６−穴の平底セルウェル（Ｃｅｌｌ
Ｗｅｌｌｓ）　（：Ｉ−＝ング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）］に
分配した０１００μｅのＩＬ−２（コラボラテイプ　リ
サーチ）を含む培地０．２〜５００単位／威、または０
．００５〜２０％容量の細胞抽出濃度の試験溶液を穴の
中に加え、プレートを加湿したＣＯ２・インキュベータ
ー〔キ、　　ｘ　（Ｑｕｅｕｅ））内、３７℃で２４時
間インキュベーションした。最後４時間の間は１μＣｉ
／穴の３Ｈ−チミジン（アメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）　）を加えた。細胞をガラスファイバーフィールタ
ー〔スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ））上に集め、さらに
高分子物質に結合したチミジン量は、フィルターディス
クなぺ、り−ｒ　ｙ　（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ＬＳ　５８
０１シンチレーシヨン　カウンターで計数することによ
って定量した。このような条件下では、ＩＬ−２無添加
下でのバックグラウンド結合は１０００　ｃｒＸｎ以下
であり、標準ＩＬ−２との結合最高値は６０，０００〜
１．００，０００　ＣＰ　　の範囲である。　　　　　
゛第４表 臣犬ヱ（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞抽出物中のＩＬ−２の生
物活性無添加　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３８８実施例は単に本発明の実施を例証するために
提供されているにすぎず、本発明の態様または特許請求
の範囲を任意の方法に制限するものとして読むべきでは
ない。本発明の本質および精神から逸脱しない、道理に
かなった変化および修飾は所望かつ要求する特許保護の
態様の範囲内にあると期待する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、線状組込み部位特異的ベクターをＢｇｅＵか
ら右回りにＢｇｅＵまでのフラグメントに包含するプラ
スミドｐＡＯ８０４の図を提供する。 第２図は、ｈＩＬ−２遺伝子を含むｐＨＩＬ３３３の構
築の図解を提供する。 ｒ−−’−” 代理人　弁理士　湯　浅　恭　三・′に−、−７１ ＦＩＧ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、改良されたヒト−インターロイキン−２（ｈＩＬ−
   ２）の生産方法であって； ａ）調節領域および３′終止配列に機能しうる状態で連
   結したｈＩＬ−２構造遺伝子を含む少なくとも１コの発
   現カセットを保持している少なくとも１コのベクターで
   、メチロトローフ酵母を形質転換すること；およびその
   後、 ｂ）その結果得られた形質転換された酵母株を適当な条
   件下で培養して該ｈＩＬ−２蛋白質生成物を得ること； からなる上記方法。 ２、該ベクターがプラスミドまたは線状の組込み（イン
   テグレイティブ）部位特異的ベクターからなる群より選
   択される、請求項１記載の方法。 ３、ベクターが線状の組込み部位特異的ベクターである
   、請求項２記載の方法。 ４、該線状組込み部位特異的ベクターが以下のような連
   続的配列： ａ）第一の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 ｂ）少なくとも１コのマーカー遺伝子、ならびに調節領
   域および３′終止配列に機能しうる状態で連結されたｈ
   ＩＬ−２の構造遺伝子を包含する少なくとも１コの発現
   カセット、および ｃ）第二の挿入可能フラグメント； を含み、その際成分（ｂ）のマーカー遺伝子およびカセ
   ットの順序を入れかえることができる、請求項３記載の
   方法。 ５、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第二の
   挿入可能フラグメントが￥ピキア￥・￥パストリス￥（
   ￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離され
   た遺伝子のＤＮＡ配列に起源を有し、かつ￥ＡＯＸ１￥
   、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥からなる群
   より選択される、請求項４記載の方法。 ６、該発現カセットが、 ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐ
   ａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥、ｐ４
   ０、￥ＤＨＡＳ￥、￥サッカロマイセス￥・￥セレビシ
   アエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ￥）から単離された酸性ホスファターゼ、ガ
   ラクトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトク
   ロムＣ、α−接合因子およびグルタルアルデヒド３−リ
   ン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される、下記
   成分（ｂ）に機能しうる状態で連結された調節領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結されたｈＩ
   Ｌ−２の構造遺伝子、 ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
   遺伝子および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離された３′終
   止配列よりなる群より選択される￥ピキア￥・￥パスト
   リス￥の３′終止配列、 からなる、請求項４記載の方法。 ７、該マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス￥か
   ら単離された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥、￥サッ
   カロマイセス￥・￥セレビシアエ￥から単離された￥Ｓ
   ＵＣ２￥、並びに細菌のトランスポゾンＴｎ６０１また
   はＴｎ９０３遺伝子からのＧ４１８＾Ｒ／カナマイシン
   耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項４記載の
   方法。 ８、該ベクターが ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥から単離された約１キロ
   ベースの５′￥ＡＯＸ１￥調節領域である、下記成分（
   ｂ）に機能しうる状態で連結された第一の挿入可能ＤＮ
   Ａフラグメント、 ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結されたｈＩ
   Ｌ−２の構造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）に連結された￥ピキア￥・￥パスト
   リア￥から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ
   ）下記成分（ｅ）に連結された￥ピキア￥・￥パストリ
   ア￥から単離された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子
   、ｅ）トランスポゾンＴｎ９０３またはＴｎ６０１から
   のカナマイシン耐性であるマーカー遺伝子、ｆ）約０．
   ６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列である第二
   の挿入可能なＤＮＡフラグメント、 からなる、請求項４記載の方法。 ９、次の連続的配置 ａ）第一の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 ｂ）少なくとも１コのマーカー遺伝子ならびに調節領域
   および３′終止配列に機能しうる状態で連結したｈＩＬ
   −２構造遺伝子を含む少なくとも１コの発現カセット、
   および ｃ）第二の挿入可能ＤＮＡフラグメント； からなり、成分（ｂ）のマーカー遺伝子およびカセット
   の順序を変えることができる、線状組込み部位特異的ベ
   クター。 １０、該第一挿入可能ＤＮＡフラグメントおよび第二の
   挿入可能ＤＮＡフラグメントが￥ピキア￥・￥パストリ
   ス￥から単離された遺伝子のＤＮＡ配列に起源を有し、
   かつ￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩ
   Ｓ４￥からなる群より選択される、請求項９記載のベク
   ター。 １１、該発現カセットが ａ）￥ピキア￥・￥パストリア￥より単離された、￥Ａ
   ＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥、および￥ＨＩＳ４￥
   ；￥サッカロマイセス・セレビシアエよ￥り単離された
   酸性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、アルコールデ
   ヒドロゲナーゼ、チトクロムＣ、α−接合因子、および
   グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼからな
   る群より選択される、下記成分（ｂ）に機能しうる状態
   で連結された調節領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結されたｈＩ
   Ｌ−２の構造遺伝子、 ｃ）￥ピキア￥・￥パストリア￥より単離された￥ＡＯ
   Ｘ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子およ
   び￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離された３′終止配列から
   なる群より選択された３′終止配列、 からなる、請求項９記載のベクター。 １２、該マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス￥
   より単離された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥；￥サ
   ッカロミケスセレビシアエ￥より単離された￥ＳＵＣ２
   ￥、ならびに細菌トランスポゾンＴｎ９０３もしくはＴ
   ｎ６０１からのＧ４１８＾Ｒ／カナマイシン耐性遺伝子
   からなる群より選択される、請求項９記載のベクター。 １３、該ベクターが ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥から単離された約１キロ
   ベースの長さの５′￥ＡＯＸ１￥遺伝子の機能しうる調
   節領域である、下記成分（ｂ）と機能しうる状態で連結
   された第一の挿入可能ＤＮＡフラグメント、ｂ）下記成
   分（ｃ）に機能しうる状態で連結されたｈＩＬ−２の構
   造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）と連結された￥ピキア￥・￥パスト
   リス￥から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ
   ）下記成分（ｅ）と連結された￥ピキア￥・￥パストリ
   ス￥から単離された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子
   、ｅ）細菌トランスポゾンＴｎ６０１またはＴｎ９０３
   からのカナマイシン耐性であるマーカー遺伝子、ｆ）約
   ０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列である
   第二の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 からなる、請求項９記載のベクター。 １４、３′終止配列に機能しうる状態で連結された、ｈ
   ＩＬ−２構造遺伝子に機能しうる状態で連結された調節
   領域からなる少なくとも１コの発現カセットを包含する
   少なくとも１コのベクターで形質転換されたメチロトロ
   ーフ酵母。 １５、酵母が￥ピキア￥・￥パストリス￥である、請求
   項１４記載のメチロトローフ酵母。 １６、酵母が￥ピキア￥￥パストリス￥ＧＳ１１５株で
   ある、請求項１４記載のメチロトローフ酵母。 １７、該ＧＳ１１５は ａ）第一の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結された、少
   なくとも１コのマーカー遺伝子およびｈＩＬ−２の構造
   遺伝子を含む少なくとも１コの￥ピキア￥適合性発現カ
   セット、 ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離された￥ＡＯ
   Ｘ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、お
   よび￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離された３′終止配列か
   らなる群より選択された３′終止配列、 ｄ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント、の連続配列
   であり、成分（ｂ）のマーカー遺伝子およびカセットの
   順序を入れ代えることのできる、少なくとも１コの線状
   組込み部位特異的ベクターで形質転換されている、請求
   項１６記載の￥ピキア￥・￥パストリス￥Ｇ１１５。 １８、該線状組込み部位特異的ベクターが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離された約１キ
   ロベースの５′￥ＡＯＸ１￥調節領域である、下記成分
   （ｂ）と機能しうる状態で連結された第一の挿入可能Ｄ
   ＮＡフラグメント、 ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうる状態で連結されたｈＩ
   Ｌ−２の構造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）に連結された￥ピキア￥・￥パスト
   リス￥から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止領域、ｄ
   ）下記成分（ｅ）に連結された￥ピキア￥・￥パストリ
   ス￥から単離された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子
   、ｅ）細菌のトランスポゾンＴｎ６０１またはＴｎ９０
   ３からのカナマイシン耐性であるマーカー遺伝子、ｆ）
   約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列であ
   る第二の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 からなるベクターである、請求項１７記載のピキア・パ
   ストリス。 １９、￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥
   ￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）、ＧＳ１１５／ｐＨＩＬ３３３
   。 ２０、Ｇ１１５が該線状組込み部位特異的ベクターの１
   コ以上のコピーで形質転換されている、請求項１７記載
   のように形質転換された￥ピキア￥・￥パストリス￥Ｇ
   Ｓ１１５。