JPH02104290A - メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現 - Google Patents
メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
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- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡ遺伝子工学の分野に関する。本発
明の１つの面はＣ１資化性酵母におけるヒト血清アルブ
ミン（ＩＳＡ）の発現のための方法に関する。本発明の
他の面は新規ＤＮＡ分子およびそれにより形質転換され
た新規酵母株に関する。
明の１つの面はＣ１資化性酵母におけるヒト血清アルブ
ミン（ＩＳＡ）の発現のための方法に関する。本発明の
他の面は新規ＤＮＡ分子およびそれにより形質転換され
た新規酵母株に関する。
（従来技術）
ヒト血清アルブミンは成人で最も量の多い血漿タンパク
質である。アルブミンの濃度は４Ｑｍｙ／ｉであり、７
０に９の成人男性では１６０ｇのアルブミンがヒトの体
を循環している。このタンパク質は浸透圧を維持し、銅
、ニッケル、カルシウム（弱＜、２−３の結合部位で）
、ビリルビンおよびプロト９ポルフイリン、長鎖脂肪酸
、グロスタグランジン、ステロイドホルモン（これらの
ホルモンと弱く結合し、膜を越えてのその移動を促進す
ル）、チロキシン、トリョードチロニン、シスチンおよ
びグルタチオンの結合および輸送に機能する。Ｐｅｔａ
ｒｓらによると、米国のみで毎年１０，０００キログラ
ム以上の精製アルブミンが循環障害またはアルブミン欠
乏の患者に投与されている。
質である。アルブミンの濃度は４Ｑｍｙ／ｉであり、７
０に９の成人男性では１６０ｇのアルブミンがヒトの体
を循環している。このタンパク質は浸透圧を維持し、銅
、ニッケル、カルシウム（弱＜、２−３の結合部位で）
、ビリルビンおよびプロト９ポルフイリン、長鎖脂肪酸
、グロスタグランジン、ステロイドホルモン（これらの
ホルモンと弱く結合し、膜を越えてのその移動を促進す
ル）、チロキシン、トリョードチロニン、シスチンおよ
びグルタチオンの結合および輸送に機能する。Ｐｅｔａ
ｒｓらによると、米国のみで毎年１０，０００キログラ
ム以上の精製アルブミンが循環障害またはアルブミン欠
乏の患者に投与されている。
現在ＨＳＡの唯一の市販源は分画された血液からのもの
である。血液が運ぶ夾雑物および病原体により起こりう
る危険性を考えると、ＩＳＡを製造する別の方法を発展
することは、ＩＳＡの商業生産に対して著しい貢献とな
るであろう。組換えＤＮＡ遺伝子工学の出現により、別
の方法でＩＳＡを製造する事が現在可能になった。
である。血液が運ぶ夾雑物および病原体により起こりう
る危険性を考えると、ＩＳＡを製造する別の方法を発展
することは、ＩＳＡの商業生産に対して著しい貢献とな
るであろう。組換えＤＮＡ遺伝子工学の出現により、別
の方法でＩＳＡを製造する事が現在可能になった。
ＩＳＡは大腸菌中で製造されてきたが、残念ながらこの
宿主中でＨＳＡ’に製造するにはかなりの欠点がある。
宿主中でＨＳＡ’に製造するにはかなりの欠点がある。
例えば、大腸菌は費用がかかる精製工程により除去しな
ければならない内毒素を産生ずる。
ければならない内毒素を産生ずる。
このように、ＩＳＡの産生のための方法を発展すること
はこの分野に著しい貢献となるであろう。
はこの分野に著しい貢献となるであろう。
それ故、本発明の目的はＩＳＡの増大された製造のため
の方法を提供することである。
の方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的はＨＳＡ′％：コードしている
ＤＮＡ配列を含む新規ベクターを提供することである。
ＤＮＡ配列を含む新規ベクターを提供することである。
本発明の更なる目的は、ＩＳＡの増大された製造が可能
なベクターまたはベクター類により形質転換された新規
Ｃ１資化性酵母を提供することである。
なベクターまたはベクター類により形質転換された新規
Ｃ１資化性酵母を提供することである。
本発明のなお更なる目的は、ＩＳＡをコードしている新
規ヌクレオチド配列である。
規ヌクレオチド配列である。
本発明に従うと、ＩＳＡのための構造遺伝子を含む適合
性発現カセットヲ持つ少くとも一つのベクターで０１資
化性酵母を形質転換し、得られる形質転換体をＨＳＡｋ
よび１（ＳＡをコードしている新規ヌクレオチド配列の
産生な得るのに適した条件下培養することから成るＨＳ
Ａ産生の方法が発見される。
性発現カセットヲ持つ少くとも一つのベクターで０１資
化性酵母を形質転換し、得られる形質転換体をＨＳＡｋ
よび１（ＳＡをコードしている新規ヌクレオチド配列の
産生な得るのに適した条件下培養することから成るＨＳ
Ａ産生の方法が発見される。
のフラグメント中に線状組込み部位−特異的ベクターを
含むプラスミドｐＡＯ８０４を示している。
含むプラスミドｐＡＯ８０４を示している。
構造遺伝子は本プラスミドの特異的なＥ ｏｏ ＲＩ部
位に挿入されるであろう。本プラスミドはＮＲＲＬ Ｂ
−１８１１４のプラスミドＤＮＡからＥｏｏＲＩ 消化
および第１図に対応する線状〜７．４に６ＥｏｏＲＩ
７ラグメント回収のためのゲル電気泳動により回収さ
れるであろう。
位に挿入されるであろう。本プラスミドはＮＲＲＬ Ｂ
−１８１１４のプラスミドＤＮＡからＥｏｏＲＩ 消化
および第１図に対応する線状〜７．４に６ＥｏｏＲＩ
７ラグメント回収のためのゲル電気泳動により回収さ
れるであろう。
第２図（α）はｐＡＯ８０４の直線地図を提供している
。
。
第２図（ｂ）は約４５８塩基対のｆ １− ｏｒｉを含
むｐＡＯ８０４の誘導体ｐＡＯ８０７の直線地図を提供
している。
むｐＡＯ８０４の誘導体ｐＡＯ８０７の直線地図を提供
している。
第２図（Ｃ）はｐＡ Ｏ８０７のＢＱＩ ＩＩ部位の代
わりにＮｏｔ Ｉ部位を持つｐＡＯ８０７Ｎの直線地図
を提示している。
わりにＮｏｔ Ｉ部位を持つｐＡＯ８０７Ｎの直線地図
を提示している。
第２図（ｄ＞は特異的ＥＯＯＲＩ部位にＨＳＡ遺伝子が
挿入されたｐＡ０８０７Ｎの直線地図であるｐＨ３Ａ１
１３の直線地図を提供している。
挿入されたｐＡ０８０７Ｎの直線地図であるｐＨ３Ａ１
１３の直線地図を提供している。
第３図はｐＡＯ８０７Ｎ’に円形型で示している。
第４図はＮＲＲＬ Ｂ−１８１１５の自律性酵母プラス
ミドＤＮＡのＥＯＯＲＩ消化、ゲル電気泳動および６．
２ＫｂＥｏｏ ＲＩ フラグメント回収によるプラス
ミドｐＴＨＦＫΔを示している。
ミドＤＮＡのＥＯＯＲＩ消化、ゲル電気泳動および６．
２ＫｂＥｏｏ ＲＩ フラグメント回収によるプラス
ミドｐＴＨＦＫΔを示している。
第５図はｐＴＨＦＫΔの特異的ＥｏｏＲＩ部位に挿入さ
れたＨＳＡ遺伝子を含むｐＴＨＦＫΔの誘導体であるｐ
ＨＳＡ１３ を示している。
れたＨＳＡ遺伝子を含むｐＴＨＦＫΔの誘導体であるｐ
ＨＳＡ１３ を示している。
ＩＳＡ構造遺伝子はＬａｗｎら、Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓ
。
。
Ｒｅｓ、、９：６１０５（１９８１）、およびＤｘｇａ
ｉｃｚｙｋら、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ、 Ａｅａｄ
、 Ｓｃｉ。
ｉｃｚｙｋら、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ、 Ａｅａｄ
、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７９ ： ７１ （１９８２）、Ｋより配列決
定されている。
定されている。
本遺伝子はＬ ａｗｓら、Ｄｘｇａｉｃｚｙｋ らま
たは実施例１に記載されな技術による遺伝子の再単離ま
たはブリティッシュ バイオテクノロジー社（Ｂｒ１ｔ
ｉｓｈ ＢｉｏｔａａｈｎｏＬｏｇ１１＋Ｌｔｄ ）
のごとき注文遺伝子製造某社によるインビトロでの合
成により得ることができるであろう。ＨＳＡ遺伝子を得
る一つの可能な方法はオリゴヌクレオチドプローブでお
よび随意にＨＳＡ構造遺伝子のための免疫スクリーニン
グ陽性プラークで肝臓−とＤＮＡライブラリーなスクリ
ーニングすることであろう。この型の単離スキームの実
行によすＨＳＡ遺伝子が単離され、ｆｉｌに示したヌク
レオチド配列を持っていた。
たは実施例１に記載されな技術による遺伝子の再単離ま
たはブリティッシュ バイオテクノロジー社（Ｂｒ１ｔ
ｉｓｈ ＢｉｏｔａａｈｎｏＬｏｇ１１＋Ｌｔｄ ）
のごとき注文遺伝子製造某社によるインビトロでの合
成により得ることができるであろう。ＨＳＡ遺伝子を得
る一つの可能な方法はオリゴヌクレオチドプローブでお
よび随意にＨＳＡ構造遺伝子のための免疫スクリーニン
グ陽性プラークで肝臓−とＤＮＡライブラリーなスクリ
ーニングすることであろう。この型の単離スキームの実
行によすＨＳＡ遺伝子が単離され、ｆｉｌに示したヌク
レオチド配列を持っていた。
表１に示されたヌクレオチド配列は単離されたＨＳＡ
ＤＮＡの配列決定により得られ、それは、Ｓａｎｇａ
ｒら、ＰＮＡＳ ７４．５４６３（１９７７）、のジ
デオキシヌクレオチド鎖終止法またはＳａｎｇｅｒら、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ、 １４２．１６１７（１９
８０）により記載されているようなＭ１３誘導体を用い
るサブクロニング配列決定法などのごとき任意の適した
技術により実行される。
ＤＮＡの配列決定により得られ、それは、Ｓａｎｇａ
ｒら、ＰＮＡＳ ７４．５４６３（１９７７）、のジ
デオキシヌクレオチド鎖終止法またはＳａｎｇｅｒら、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ、 １４２．１６１７（１９
８０）により記載されているようなＭ１３誘導体を用い
るサブクロニング配列決定法などのごとき任意の適した
技術により実行される。
ＬｃＬｗ％らシよびＤｘｇａｉｃｚｙｋらにより発表さ
れた配列と比較すると本配列は新規ヌクレオチド配列で
あることがわかる。ヌクレオチド配列の比較な弐２に示
した。
れた配列と比較すると本配列は新規ヌクレオチド配列で
あることがわかる。ヌクレオチド配列の比較な弐２に示
した。
ＨＳＡの構造遺伝子が回収されたら、遺伝子な増殖させ
る、または遺伝子および類似物を更に適合するように、
ｖＩ４整するため、最初に構造遺伝子をベクターおよび
適合宿主細胞株内へ挿入することが必要であろう。
る、または遺伝子および類似物を更に適合するように、
ｖＩ４整するため、最初に構造遺伝子をベクターおよび
適合宿主細胞株内へ挿入することが必要であろう。
宿主の培養は任意の適した手段により達成されるであろ
う。宿主培養の一般的技術はこの分野ではすでに知られ
ており、ここで使用された株の特定の要求に対するこれ
らの方法のどんな適応も当業者にとっては可能であろう
。
う。宿主培養の一般的技術はこの分野ではすでに知られ
ており、ここで使用された株の特定の要求に対するこれ
らの方法のどんな適応も当業者にとっては可能であろう
。
宿主からのプラスミドＤＮＡの回収はその密な小ささシ
よし閉じた環状超らせん形のためいくつかの技術により
達成できる。例えば、宿主細胞の採取に続いて遠心分離
によりペレット化し、その後再懸濁して溶菌する。溶菌
物は細胞砕片を除去するため遠心分離Ｋかけねばならず
、ＤＮＡを含む上置液を保持する。ＤＮＡからほとんど
の他の夾雑物を除去するためフェノール抽出が実施され
る。フェノール抽出ＤＮＡは次に密度勾配遠心分離また
はゲル濾過技術を用いて更に処理して細菌ＤＮＡからプ
ラスミドＤＮＡを分離する。酌にそれとなく示した分離
を達成する九めの技術はこの分野では良く知られており
、これらの技術を実施する多くの方法が知られている。
よし閉じた環状超らせん形のためいくつかの技術により
達成できる。例えば、宿主細胞の採取に続いて遠心分離
によりペレット化し、その後再懸濁して溶菌する。溶菌
物は細胞砕片を除去するため遠心分離Ｋかけねばならず
、ＤＮＡを含む上置液を保持する。ＤＮＡからほとんど
の他の夾雑物を除去するためフェノール抽出が実施され
る。フェノール抽出ＤＮＡは次に密度勾配遠心分離また
はゲル濾過技術を用いて更に処理して細菌ＤＮＡからプ
ラスミドＤＮＡを分離する。酌にそれとなく示した分離
を達成する九めの技術はこの分野では良く知られており
、これらの技術を実施する多くの方法が知られている。
このプラスミドのヌクレアーゼ消化は適当なエンドヌク
レアーゼを選択することにより達成され、それはＨＳＡ
構造遺伝子の回収を容易にするような様式で選択され几
プラスミドを切断するであろう。使用されるエンドヌク
レアーゼは切り出されるべきＨＳＡ遺伝子があるプラス
ミドに依存するであろう。
レアーゼを選択することにより達成され、それはＨＳＡ
構造遺伝子の回収を容易にするような様式で選択され几
プラスミドを切断するであろう。使用されるエンドヌク
レアーゼは切り出されるべきＨＳＡ遺伝子があるプラス
ミドに依存するであろう。
ＤＮＡのゲル電気泳動は多くの技術を用いて達成される
であろう。Ｐ、 Ｇ、 Ｓ＋αｔｙｈよびＥ、 Ｍ。
であろう。Ｐ、 Ｇ、 Ｓ＋αｔｙｈよびＥ、 Ｍ。
Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｂよびＢ−Ｄ、 Ｈａｍａｍ編集）
ｐ３９（１９８２）を参照されたい。電気的溶出、拡散
、ゲル溶解（アガロースゲル）または物理的押し出しく
アガロースゲル）のごとく使用したゲルについで適当な
多くの技術を用いて溶出が達成されるであろう。高品質
、低融点アガロースのごときいくつかのゲルについては
溶出が必要でないことがさらに認められる。
ｐ３９（１９８２）を参照されたい。電気的溶出、拡散
、ゲル溶解（アガロースゲル）または物理的押し出しく
アガロースゲル）のごとく使用したゲルについで適当な
多くの技術を用いて溶出が達成されるであろう。高品質
、低融点アガロースのごときいくつかのゲルについては
溶出が必要でないことがさらに認められる。
ＩＳＡ構造遺伝子またはそのフラグメントを含むフラグ
メントが単離されても、ベクターへ挿入される前に追加
の操作が必要とされるであろう。
メントが単離されても、ベクターへ挿入される前に追加
の操作が必要とされるであろう。
これらの操作にはリンカ−の添加またはフラグメントの
平滑端化が含まれるがそれに限定されるわけではない。
平滑端化が含まれるがそれに限定されるわけではない。
ＨＳＡ構造遺伝子の単離に続いて、遺伝子はプラスミド
または直線状部位特異的組込みベクターのごとき適した
Ｃ１資化性酵母ベクター内へ挿入される。本発明の実施
に好適なベクターはピキア（ｐｉｃｈｉα）属と一致す
るもので最も好適にはビプラスミドは長い間組換えＤＮ
Ａ遺伝子工学で用いられてきた基本的要素の一つである
。プラスミドは微生物中に観察される環状の染色体外二
重鎖ＤＮＡである。プラスミドは細用当り１−または多
数のコピーで存在することが観察されてきた。
または直線状部位特異的組込みベクターのごとき適した
Ｃ１資化性酵母ベクター内へ挿入される。本発明の実施
に好適なベクターはピキア（ｐｉｃｈｉα）属と一致す
るもので最も好適にはビプラスミドは長い間組換えＤＮ
Ａ遺伝子工学で用いられてきた基本的要素の一つである
。プラスミドは微生物中に観察される環状の染色体外二
重鎖ＤＮＡである。プラスミドは細用当り１−または多
数のコピーで存在することが観察されてきた。
プラスミドＤＮＡに含まれているものはプラスミド生殖
に必要な情報である（即ち１９８６年５月１４日に公開
されたヨーロッパ特許出願第０１８０８９９号にＣｒｅ
ｇｇＫよυ記載されているごとき自律性複製配列）。形
質転換体細胞中のプラスミドを表現型により選択する１
つまたはそれ以上の手段はマ念プラスミド中にコードさ
れている情報からも得られる。抗生物質抵抗性遺伝子ま
たは宿主の生化学的経路の欠陥を補う遺伝子のごとき表
現型または選択標識は形質転換した宿主細胞のクローン
の認識、選択シよび維持を可能にする。
に必要な情報である（即ち１９８６年５月１４日に公開
されたヨーロッパ特許出願第０１８０８９９号にＣｒｅ
ｇｇＫよυ記載されているごとき自律性複製配列）。形
質転換体細胞中のプラスミドを表現型により選択する１
つまたはそれ以上の手段はマ念プラスミド中にコードさ
れている情報からも得られる。抗生物質抵抗性遺伝子ま
たは宿主の生化学的経路の欠陥を補う遺伝子のごとき表
現型または選択標識は形質転換した宿主細胞のクローン
の認識、選択シよび維持を可能にする。
ＨＳＡ桐造遺伝子をＣＩ資化性酵母で表現するには、遺
伝子は５′制御領域および３′終止配列に作動可能なご
とく結合していなければならず、そうするこ′とにより
表現カセットを形成し、それはベクターを通じて宿主に
挿入されるであろう。
伝子は５′制御領域および３′終止配列に作動可能なご
とく結合していなければならず、そうするこ′とにより
表現カセットを形成し、それはベクターを通じて宿主に
挿入されるであろう。
以下の術語をはつきりさせる目的でここで定義する。
作動可能なごとく結合する・・・・・・それらの機能を
実行するように各成分が配置されている並置を意味する
。
実行するように各成分が配置されている並置を意味する
。
制御領域・・・・・・種々の刺激に応答し、ｍ ＲＮ
Ａ転写の速度に影響を及ぼすＤＮＡ配列。
Ａ転写の速度に影響を及ぼすＤＮＡ配列。
３′終止配列・・・・・・ポリアデニル化をきたす配列
のごときｍＲＮＡを安定化する機能を持つ終止コドンに
対し３′側の配列。
のごときｍＲＮＡを安定化する機能を持つ終止コドンに
対し３′側の配列。
御領域および３′終止配列のごときピキアにシいてその
正常な機能を実行するであろうＤＮＡ配列を意味する。
正常な機能を実行するであろうＤＮＡ配列を意味する。
組込み（インテグレイテイブ）ベクターとは、現在ヨー
ロッパ特許出ｌｌＡ２２６７５２号として公開されてい
るヨーロッパ特許出願第８６１１４７００゜７号に記載
されているＣｒｇｇｇ の直線状部位−特異的組込み
ベクターのごときものである。そのようなベクターは少
くとも連続的に配置された１）第１の挿入可能なりＮＡ
７ラグメント；２）選択されたマーカー遺伝子の配列を
含んでシリ；および本発明の実施のためには３）第２の
挿入可能なりＮＡフラグメントもまた使用されるであろ
う。
ロッパ特許出ｌｌＡ２２６７５２号として公開されてい
るヨーロッパ特許出願第８６１１４７００゜７号に記載
されているＣｒｇｇｇ の直線状部位−特異的組込み
ベクターのごときものである。そのようなベクターは少
くとも連続的に配置された１）第１の挿入可能なりＮＡ
７ラグメント；２）選択されたマーカー遺伝子の配列を
含んでシリ；および本発明の実施のためには３）第２の
挿入可能なりＮＡフラグメントもまた使用されるであろ
う。
第１および第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントは各々少
くとも２００ヌクレオチドの長さであり、形質転換され
るべき種のゲノムＤＮＡの一部と相同的なヌクレオチド
を持っている。発現カセットおよび選択マーカー遺伝子
が第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２
の挿入可能ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に位置す
るように組込みベクターの徨々の成分が連続的に配置さ
れＤＮＡの直線状フラグメントを形成している。第１お
よび第２の挿入可能ＤＮＡはそれらが親ゲノム中で配向
されているごとく連続的に配置された線状フラグメント
中でも互いに関して同じ様に配向されている。
くとも２００ヌクレオチドの長さであり、形質転換され
るべき種のゲノムＤＮＡの一部と相同的なヌクレオチド
を持っている。発現カセットおよび選択マーカー遺伝子
が第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２
の挿入可能ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に位置す
るように組込みベクターの徨々の成分が連続的に配置さ
れＤＮＡの直線状フラグメントを形成している。第１お
よび第２の挿入可能ＤＮＡはそれらが親ゲノム中で配向
されているごとく連続的に配置された線状フラグメント
中でも互いに関して同じ様に配向されている。
第１シよび第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントとして有
用なヌクレオチド配列はゲノムの一時変異が起こるはず
の未変性ゲノム部位の別々の部分と相同的なヌクレオチ
ド配列である。それゆえ例えばゲノム変異がアルコール
酸化酵素遺伝子の座位で起こるとすると、使用される第
１シよび第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントはアルコー
ル酸化酵素遺伝子座位の別々の部分と相同的なものであ
る。本発明に従うゲノム変異のためには２つの挿入可能
ＤＮＡフラグメントはそれらが親ゲノム中で存在するの
と同じ相対的配向で線状フラグメンにおいても互いにつ
いて配向されていなければならない。第１および第２の
挿入可能ＤＮＡフラグメントとして使用できるヌクレオ
チド配列の例としてはアルコール酸化酵素（ＡＯＸＩ）
遺伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＮＡ８）遺
伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子から成る群よ
り選択されるヌクレオチド配列が挙げられる。
用なヌクレオチド配列はゲノムの一時変異が起こるはず
の未変性ゲノム部位の別々の部分と相同的なヌクレオチ
ド配列である。それゆえ例えばゲノム変異がアルコール
酸化酵素遺伝子の座位で起こるとすると、使用される第
１シよび第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントはアルコー
ル酸化酵素遺伝子座位の別々の部分と相同的なものであ
る。本発明に従うゲノム変異のためには２つの挿入可能
ＤＮＡフラグメントはそれらが親ゲノム中で存在するの
と同じ相対的配向で線状フラグメンにおいても互いにつ
いて配向されていなければならない。第１および第２の
挿入可能ＤＮＡフラグメントとして使用できるヌクレオ
チド配列の例としてはアルコール酸化酵素（ＡＯＸＩ）
遺伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＮＡ８）遺
伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子から成る群よ
り選択されるヌクレオチド配列が挙げられる。
および）ＩＩＳ４遺伝子は同時係属中の出願番号筒７８
０．１０２号の出願シよびそれに対応するヨーロッパ特
許出願第０１８３０７０号に含まれている。
０．１０２号の出願シよびそれに対応するヨーロッパ特
許出願第０１８３０７０号に含まれている。
第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントは発現カセットで利
用される制御領域からなる作動可能な制御領域を含んで
いてもよい。発現カセットのための制御領域としての第
１の挿入可能ＤＮＡフラグメントの使用は本発明の良好
な実施態様である。
用される制御領域からなる作動可能な制御領域を含んで
いてもよい。発現カセットのための制御領域としての第
１の挿入可能ＤＮＡフラグメントの使用は本発明の良好
な実施態様である。
第１図はカセットのための制御領域として第１の挿入可
能ＤＮＡフラグメントを利用しているベクターの図を提
供している。
能ＤＮＡフラグメントを利用しているベクターの図を提
供している。
第１図に示したごとく、随意に挿入部位および３′終止
配列を第１の挿入可能ＤＮＡ７ラグメントの３／側にす
ぐ置いてもよい。この線状部位−特異的組込みベクター
のコンホメーションは適合性３′終止配列を添加する必
要もなく構造遺伝子の挿入部位が準備されているという
更なる利点を持つととくなる。
配列を第１の挿入可能ＤＮＡ７ラグメントの３／側にす
ぐ置いてもよい。この線状部位−特異的組込みベクター
のコンホメーションは適合性３′終止配列を添加する必
要もなく構造遺伝子の挿入部位が準備されているという
更なる利点を持つととくなる。
さらに、本発明の実施に使用される発現ベクターは第１
の挿入可能ＤＮＡ７ラグメントと第２の挿入可能フラグ
メントの間または第４図に示されているごとく制御領域
と終止配列の間に構造遺伝子またはカセットまたはその
類似物の挿入を容易にするためにポリリンカ一部位を含
むことができる。
の挿入可能ＤＮＡ７ラグメントと第２の挿入可能フラグ
メントの間または第４図に示されているごとく制御領域
と終止配列の間に構造遺伝子またはカセットまたはその
類似物の挿入を容易にするためにポリリンカ一部位を含
むことができる。
宿主株の形質転換に使用されるＤＮＡ中に少くとも１つ
の選択可能マーカー遺伝子が含まれていることも必要で
ある。この事により、形質転換ＤＮＡを取り込んだ微生
物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は宿
主が持っていなかった表現型特性を形質転換微生物に与
える。例えば非形質転換宿主株では特定のアミノ酸生合
成経路が欠損していたものが特定のアミノ酸を産生ずる
能力が回復した夛、または抗生物質シよび類似物に抵抗
性となる。
の選択可能マーカー遺伝子が含まれていることも必要で
ある。この事により、形質転換ＤＮＡを取り込んだ微生
物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は宿
主が持っていなかった表現型特性を形質転換微生物に与
える。例えば非形質転換宿主株では特定のアミノ酸生合
成経路が欠損していたものが特定のアミノ酸を産生ずる
能力が回復した夛、または抗生物質シよび類似物に抵抗
性となる。
典型的な選択可能マーカー遺伝子はピキア パまたは’
ｐｓ９０３からのＧ ４１８ ”／カナマイシン低抗性
遺伝子からなる群より選択されるであろう。
ｐｓ９０３からのＧ ４１８ ”／カナマイシン低抗性
遺伝子からなる群より選択されるであろう。
当業者は例えば細菌性プラスミドＤＮＡ、バクテリオフ
ァージＤＮＡおよび類似物のごとき付加的ＤＮＡ配列も
また本発明の実施に用いられるベクター中に取り込ませ
ることができることを認めるであろう。そのような配列
は細菌性宿主中のこれらのベクターの増殖および維持を
可能にする。
ァージＤＮＡおよび類似物のごとき付加的ＤＮＡ配列も
また本発明の実施に用いられるベクター中に取り込ませ
ることができることを認めるであろう。そのような配列
は細菌性宿主中のこれらのベクターの増殖および維持を
可能にする。
もし、第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントが制御領域を
含んでいないなら、作動可能発現カセットを提供するた
めにはｉした制御領域を構造遺伝子に作動可能な状態で
挿入する必要があろう。同様に、発現カセットを完成す
るための３／終終止列が挿入部位にない場合は３′終止
配列が挿入されるべき構造遺伝子に作動可能なごとく結
合されなければならないであろう。
含んでいないなら、作動可能発現カセットを提供するた
めにはｉした制御領域を構造遺伝子に作動可能な状態で
挿入する必要があろう。同様に、発現カセットを完成す
るための３／終終止列が挿入部位にない場合は３′終止
配列が挿入されるべき構造遺伝子に作動可能なごとく結
合されなければならないであろう。
尚業者はすでに特徴付けられ、Ｃｔ資化性酵母と連結し
て用いられろ多くの制御領域に気がつく単離される酸性
ホスファターゼ、ガラクロキナーゼ、アルコールデヒド
ロゲナーゼ、チトクロームＣ１アルフアー交配因子およ
びグリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ制
御領域；ピキア バストリス（Ｐｉａｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ ）から訪導される一部アルコール酸化酵素（
ＡＯＸＩ）、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨＡＳ
）、ｐ４０制御領域およびＨＩＳ４制御領域およびそれ
らの類似物から成る群より選択されるものが挙げられる
が酵母制御領域に限定されるものではない。現在、本発
明の実施に用いられる好適な制御領域はメタノール−含
有培地で反応する能力により％徴づけられるもので、そ
のような制御領域はＡＯＸＩ、ＤＨＡＳ、ｐ４０から成
る群より選択され、特許公開番号０１８３０７０として
１９８６年６月４日に公開されたヨーロッパ特許出願８
５１１３７３７゜２に記載されている。
て用いられろ多くの制御領域に気がつく単離される酸性
ホスファターゼ、ガラクロキナーゼ、アルコールデヒド
ロゲナーゼ、チトクロームＣ１アルフアー交配因子およ
びグリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ制
御領域；ピキア バストリス（Ｐｉａｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ ）から訪導される一部アルコール酸化酵素（
ＡＯＸＩ）、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨＡＳ
）、ｐ４０制御領域およびＨＩＳ４制御領域およびそれ
らの類似物から成る群より選択されるものが挙げられる
が酵母制御領域に限定されるものではない。現在、本発
明の実施に用いられる好適な制御領域はメタノール−含
有培地で反応する能力により％徴づけられるもので、そ
のような制御領域はＡＯＸＩ、ＤＨＡＳ、ｐ４０から成
る群より選択され、特許公開番号０１８３０７０として
１９８６年６月４日に公開されたヨーロッパ特許出願８
５１１３７３７゜２に記載されている。
本発明の実施に最も好適な制御領域はＡＯＸＩ制御頌域
である。
である。
３′終止配列は発現カセット中で利用され、前記のごと
くベクターの一部であろう。３′終止配列は遺伝子に作
動可能な状態で結合されている場合構造遺伝子によりコ
ードされているメツセンジャーＲＮＡを終結（ポリアデ
ニル化）および／゛ま虎は安定化する作用力１ある。本
発明の実施のための３′終止配列の実例となる源のいく
つかの例をア（Ｐｉａｈｉａ）３′終止配列に限定され
ろわけでは３′終止配列からなる群より選択されるもの
のごときものである。特に好適であるのはＡＯＸＩ遺伝
子の３′終止配列である。
くベクターの一部であろう。３′終止配列は遺伝子に作
動可能な状態で結合されている場合構造遺伝子によりコ
ードされているメツセンジャーＲＮＡを終結（ポリアデ
ニル化）および／゛ま虎は安定化する作用力１ある。本
発明の実施のための３′終止配列の実例となる源のいく
つかの例をア（Ｐｉａｈｉａ）３′終止配列に限定され
ろわけでは３′終止配列からなる群より選択されるもの
のごときものである。特に好適であるのはＡＯＸＩ遺伝
子の３′終止配列である。
本発明の実施には第１図および２に示した構成物のＢ（
７１ＩＩ フラグメントのごとき線状部位−特異性組込
みベクターかまたは第４図に示したごときプラスミドが
使用されろ。
７１ＩＩ フラグメントのごとき線状部位−特異性組込
みベクターかまたは第４図に示したごときプラスミドが
使用されろ。
適したベクターへのＨＳＡ構造遺伝子の挿入は選択され
たベクターを適当な部位または複数の部位で切断し、Ｈ
ＳＡ構造遺伝子を含む少くとも１つの作動可能発現カセ
ットがベクター中に存在する結果を生む任意の適した技
術により達成される。
たベクターを適当な部位または複数の部位で切断し、Ｈ
ＳＡ構造遺伝子を含む少くとも１つの作動可能発現カセ
ットがベクター中に存在する結果を生む任意の適した技
術により達成される。
Ｈ３Ａ構造遺伝子の結合は、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを利
用するごとき任意の適当な結合技術により達成されるで
あろう。
用するごとき任意の適当な結合技術により達成されるで
あろう。
ＩＳＡ構造遺伝子およびベクターの結合混合物の最初の
選択、繁殖および至適な増幅は、大腸菌のごとき細菌性
宿主内へ混合物を形質転換する事によＦ）（結合混合物
は酵母宿主内へ直接形質転換する事ができるけれど）好
適に実施される。大腸菌のための適した形質転換技術は
この分野ではよく知られている。さらに、選択マーカー
およびベクターの維持のために必要な細菌複製開始点が
細菌性宿主であることもこの分野ではよく知られている
。
選択、繁殖および至適な増幅は、大腸菌のごとき細菌性
宿主内へ混合物を形質転換する事によＦ）（結合混合物
は酵母宿主内へ直接形質転換する事ができるけれど）好
適に実施される。大腸菌のための適した形質転換技術は
この分野ではよく知られている。さらに、選択マーカー
およびベクターの維持のために必要な細菌複製開始点が
細菌性宿主であることもこの分野ではよく知られている
。
発現系に訃いてのＨＳＡ構造遺伝子を含む所望のプラス
ミドの単離および／または精製は宿主ＤＮＡからプラス
ミドＤＮＡを分離するための任意の適当な手段により達
成されろであろう。
ミドの単離および／または精製は宿主ＤＮＡからプラス
ミドＤＮＡを分離するための任意の適当な手段により達
成されろであろう。
同様に結合により形成されたベクターは、ＨＳＡ遺伝子
の存在および制御領域および３′終止配列へのその作動
可能な結合を実証するための繁殖後に好適に試験される
であろう。このことは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル
電気泳動またはエンドヌクレアーゼ消化−サザン ハイ
ブリダイゼーションなどを含む種々の技術により達成さ
れろであろうが、それに限定されるわけではない。
の存在および制御領域および３′終止配列へのその作動
可能な結合を実証するための繁殖後に好適に試験される
であろう。このことは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル
電気泳動またはエンドヌクレアーゼ消化−サザン ハイ
ブリダイゼーションなどを含む種々の技術により達成さ
れろであろうが、それに限定されるわけではない。
酵母宿主へのプラスミドまたは線状ベクターの１５３、
（１９８３）１６３ ；ＣｒｅｇｇらＭｏ１．Ｃａ１ｌ
Ｂｉｏ１．５ （１９８５）ｐｇ ３３７６ ；または
５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、ＧａｆＬｇ、 ５９ （１
９８７） ｐｇ１１５らにより示された技術を含む適当
な形質転換技術により達成されるがそれらに限定される
わけではない。本発明の実施に好適なものはＣｒａＱｆ
の形質転換技術である。と過剰の線状ベクターを利用し
−・ハサザンハイプリダイゼーションにより多挿入物を
選択するのが本発明の実施に望ましい。
（１９８３）１６３ ；ＣｒｅｇｇらＭｏ１．Ｃａ１ｌ
Ｂｉｏ１．５ （１９８５）ｐｇ ３３７６ ；または
５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、ＧａｆＬｇ、 ５９ （１
９８７） ｐｇ１１５らにより示された技術を含む適当
な形質転換技術により達成されるがそれらに限定される
わけではない。本発明の実施に好適なものはＣｒａＱｆ
の形質転換技術である。と過剰の線状ベクターを利用し
−・ハサザンハイプリダイゼーションにより多挿入物を
選択するのが本発明の実施に望ましい。
形質転換のための酵母宿主は任意の適当なＣｍ資化性酵
母である。Ｃ１＊化性酵母にはハンセヌラ（Ｈａｎｓａ
＊ｘｌａ ）、カンジダ（Ｃａｒｔ、ｄｓｄａ ） 、
クロ；ｔｏｒｕｌａ）から成る属がら選択されるメタノ
ール上で増殖できる酵母が挙げられるがそれに限定され
るわけではない。この種類の酵母の典＆的な特定の種の
一覧はＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ ＩｃよるＣ１資化性菌の生
化学、２６９（１９８２）に見ることができるであろう
。現在好適なのは栄養素要求性ピキアパストリス（ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ） ＧＳ １１５（ＮＲ
ＲＬ Ｙ−１５８５１）のごときピキア（Ｐｉ−Ｃ屓ａ
）属のＣ１資化性酵母である。栄養素要求性Ｃ１資化性
酵母は本発明の実施の際その選択が容易であるという利
点もある。ピキア ノくストする株へ形質転換する５Ｌ
ＴＣ２の使用、または０４１８のごとき抗生物質抵抗性
マーカーを用いるといったように、もし適当な形質転換
マーカー遺伝子が選択されたら野生株Ｃｉ資化性酵母株
が同程度の成功度で使用できる事が認められる。
母である。Ｃ１＊化性酵母にはハンセヌラ（Ｈａｎｓａ
＊ｘｌａ ）、カンジダ（Ｃａｒｔ、ｄｓｄａ ） 、
クロ；ｔｏｒｕｌａ）から成る属がら選択されるメタノ
ール上で増殖できる酵母が挙げられるがそれに限定され
るわけではない。この種類の酵母の典＆的な特定の種の
一覧はＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ ＩｃよるＣ１資化性菌の生
化学、２６９（１９８２）に見ることができるであろう
。現在好適なのは栄養素要求性ピキアパストリス（ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ） ＧＳ １１５（ＮＲ
ＲＬ Ｙ−１５８５１）のごときピキア（Ｐｉ−Ｃ屓ａ
）属のＣ１資化性酵母である。栄養素要求性Ｃ１資化性
酵母は本発明の実施の際その選択が容易であるという利
点もある。ピキア ノくストする株へ形質転換する５Ｌ
ＴＣ２の使用、または０４１８のごとき抗生物質抵抗性
マーカーを用いるといったように、もし適当な形質転換
マーカー遺伝子が選択されたら野生株Ｃｉ資化性酵母株
が同程度の成功度で使用できる事が認められる。
元々は栄養素要求性細胞を形質転換後必要とする生化学
生成物（細胞の栄養素要求性のための）不在下で培養し
、新規表現型（”メタノールに鈍い”）を選択および検
出すること、または形質転換体に含まれている低抗性遺
伝子の不在下では酵母に対しては有毒な抗生物質存在下
で培養することなどの適当な技術を使用して（しかしそ
れらに限定されるわけではない）形質転換体Ｃ１資化性
酵母細胞を選択できる。
生成物（細胞の栄養素要求性のための）不在下で培養し
、新規表現型（”メタノールに鈍い”）を選択および検
出すること、または形質転換体に含まれている低抗性遺
伝子の不在下では酵母に対しては有毒な抗生物質存在下
で培養することなどの適当な技術を使用して（しかしそ
れらに限定されるわけではない）形質転換体Ｃ１資化性
酵母細胞を選択できる。
単離された形質転換Ｃｔ資化性酵母細胞はフラスコ振と
う発酵、高密度発酵またはＣｒｅｇｇらにより記載され
た技術、Ｃ１資化性酵母、ピキア パ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇ、、 ４７９ （１９８７） 、のどとき適当な発
酵技術により培養する。
う発酵、高密度発酵またはＣｒｅｇｇらにより記載され
た技術、Ｃ１資化性酵母、ピキア パ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇ、、 ４７９ （１９８７） 、のどとき適当な発
酵技術により培養する。
実施例
実施例に関する一般的情報：
株
ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａａｔｏｒｉｓ
）ＧＳ１１５（ｈｉａ ４）ＣＮＲＲＬ Ｙ−１５
８５１）７１ （んｉｓ ４ ａｏｚｌ ： Ａ
ＲＧ４ ）大腸菌ＹＭＣ９（Ｆ−λ−ｕｎｄｏ Ａ ｌ
ｈａｄｓ １７ＳＵＰＥ４４ ｔｈｉ １ ） すべてのプラスミド構成および調製に使用される。
）ＧＳ１１５（ｈｉａ ４）ＣＮＲＲＬ Ｙ−１５
８５１）７１ （んｉｓ ４ ａｏｚｌ ： Ａ
ＲＧ４ ）大腸菌ＹＭＣ９（Ｆ−λ−ｕｎｄｏ Ａ ｌ
ｈａｄｓ １７ＳＵＰＥ４４ ｔｈｉ １ ） すべてのプラスミド構成および調製に使用される。
大腸菌ＤＨ５ｏｃＦ’ Ｃ（Ｆ’、 ａｎｄＡ １
ｈｓｃＬ Ｒ１７（ｒ −１＋ ｔｎ−１） Ｓｕｐ
Ｅ ４４・ｔｈｓ ｉｓ λ″″ｒａｃＡ１゜ ＺＹＡａｒｇ Ｆ）Ｕ１６９） 大腸菌ＪＭ１０７ ｇｎｄＡｌ ｇｙｒＡ９６．
ｔｈｉ。
ｈｓｃＬ Ｒ１７（ｒ −１＋ ｔｎ−１） Ｓｕｐ
Ｅ ４４・ｔｈｓ ｉｓ λ″″ｒａｃＡ１゜ ＺＹＡａｒｇ Ｆ）Ｕ１６９） 大腸菌ＪＭ１０７ ｇｎｄＡｌ ｇｙｒＡ９６．
ｔｈｉ。
Ｂ、 ＬａｃＩｑＺΔＭ１５゜
大腸菌Ｙ１０８８（（ＡＴＣＣ第３７１９５号）；ｍａ
ｔ Ｂ ｔｒｐＲｔｏｎＡ２１ ｐｒｏｃ ： ：
Ｔｎ５ （ｐＭＣ９）。ｐＭｃ９＝ｐＢＲ３２２−１０
ＬｃｌＱ〕はＤＮＡ単離を目的とするライブラリーの増
加およびプラーク精製７アージ貯蔵物の調製のために使
用された。
ｔ Ｂ ｔｒｐＲｔｏｎＡ２１ ｐｒｏｃ ： ：
Ｔｎ５ （ｐＭＣ９）。ｐＭｃ９＝ｐＢＲ３２２−１０
ＬｃｌＱ〕はＤＮＡ単離を目的とするライブラリーの増
加およびプラーク精製７アージ貯蔵物の調製のために使
用された。
大腸菌Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ第３７１９７号）；５ｘｐ
Ｆ、ｔｒｐｃ２２ ：： Ｔｎ（ｐＭＣ９））は全ての
免疫学的プラークスクリーニングおよび続いての種々の
オリゴヌクレオチドプローブのスクリーニングのための
宿主として使用される。
Ｆ、ｔｒｐｃ２２ ：： Ｔｎ（ｐＭＣ９））は全ての
免疫学的プラークスクリーニングおよび続いての種々の
オリゴヌクレオチドプローブのスクリーニングのための
宿主として使用される。
以下の実施例で使用される緩衝液、溶液および培地は下
記の組成を持つ： ＬＢ＋ａｍｐ １０１ｉ１ ＃母抽出物２０ｇ ト
リプトン １１７ ＮａＣ１ ５Ｍ ＮａＯＨにてｐＨ７，５にｖ４整１００ツ アム
ピシリン ＬＢ １０ｉｌ 酵母抽出物２０ｇ トリプ
トン １０ｇ ＮａＣ１ ５Ｍ ＮａＨＣＯｐＨ７，５に調整 ＭＧＹ １３．４ｇ アミノ酸を含まないＹＮＢ
４００β９ ビオチン １０９ グルコース １０− グリセロール ＭＭ １３．４ｇ アミノ酸を含まないＹＮＢ
４００μＶ ビオチン ５− メタノール ＬＢ寒天プレート ＬＢ中１−２％寒天ＬＢ上層
寒天 ＬＢｅ１１３０．８％寒天上層アガロース
ＬＢ中 ０．８％アガロースＬＢＭ ＬＢ
＋１０ｍＭ ＭｇＳ０４ＬＢＭ／ＡＭＰ ＬＢＭ＋
５０μ９／−アムビシリンＨ−上層寒天 １６９バ
クト一トリプトン１０ｇバクトー酵母抽出物 １リツトルのＨ２０に５９のＮａＣＬ ＳＭ ５．８？ ＮａＣｌ２９ ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２７ Ｈ２Ｏ５０ＩＭトリスＨ（ｊ ｐＨ７，５５−２チ
ゼラチン ＳＤＲ，１リツトル １３．４９ ＹＮＢ４００
μｇ ビオチン １８２Ｉｉ ソルビトール ＩＣＨ７デキストロース １０ｙ寒天 ５０〜づつのグルタミン、 メチオニン、リジン、ロ イシンおよびイソロイシン ２ｙヒスチジン検検定台物 ５ＤＨＲ，１リツトル ＳＤＲ＋４０ｍｙヒスチジンＴ
Ｅ緩衝液： ｌｏｍＭ）リス−ＨＣｔ （ｐＨ８
，０）１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０） 高塩緩衝液： ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０１０ｍＭ ＭｒｉＣｌ ２ １００？？１Ｍ ＮａＣ１ Ｈ８緩衝液： ５０ｍＭ トリス・Ｈ（ｊ （ｐＨ７，５）、１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，１００？７１Ｍ ＮａＣｔ＞よび１ｍ
Ｍジチオスレイトール ＭＳ 緩衝液： １０ｍＭ）リス・Ｈ（ｊ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇ
ＣＬ ２ 、５０ｍＭ ＮａＣＬおよび１ｍＭジチオス
レイトール ＬＳ 緩衝液： １０ｍＭ トリス＠ＨＣＬ（ｐＨ７，５）、ｌＯ？Ｘ
ＭＭＱＣ１２および１ｍＭジチオスレイトール結合緩衝
液： ５０ｍＭ トリス−ＨＣＬ（ｐＨ７，４＞１０ ｍＭ
ＭｃｔＣＬ ２ １０ｍＭ ジチオスレイトール １惜Ｍ ＡＴＰ および １００μ９／ｆｌＬｔ ＢＳＡ ５０ｔｎＭ ）リス−Ｈ（ｊ （ｐＨ７，２）１０？
７ＬＭ ＭｇＳＯ４ ０，１ｍＭ ジチオスレイトール および１ｍＭ
ＥＤＴＡ ５０ｍＭ トリス・Ｈ（ｊ （ｐＨ９，０）１情Ｍ
ＭｇＣｌ２ １ ｍＭ ＺｎＣＬ ２および １ｍＭ スペルミジン ５０雷Ｍ トリス・Ｈ（ｊ（ｐＨ７，６）１０ ｍＭ
ＭｒｉＣｌ ２ ５惟Ｍ ジチオスレイトール ０．１愼Ｍ ＥＤＴＡ および ０．１ｍＭ スペルミジン ０．１５Ｍ Ｎａ２ ＣＯ３ ０，０３５Ｍ ＮａＨＣＯ３ ５０ｇ 無脂肪乾燥ミルク １９ チメロサール １００μｌ抗あわ剤Ａ（シグマ） ＩＸ Ｄ−ＰＢＳ（１／）（’ダルベツコ リン酸緩衝
塩溶液、ギプコ）に０．５− ライ−７２０ ＴＢＳ、ｌＸ １５０？７ＬＭ ＮａＣ１ １Ｏ□ｍＭ ）リス−ＨＣ１ｊｐＨ７，５ＢＳＴ ＩＸ ＴＢＳ ０．０５％ ツイーン２０ ＣαＳ １Ｍ ソルビトール １０？ＦＬＭ ＣｃＬＣｊ２ １０倶Ｍ トリス・ＨＣＬ、ｐＨ７，５無菌フイルター 実施例■ ヒト肝臓λｇｔＩＩ−ｃＤＮＡ 発現ライブラリー（
ロット番号２１０２）はクロンチク ラボラトリ−社（
ＣＬｏｎＬｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉ？
＆ｃ ）から購入された。このライブラリーは−当り９
Ｘ １０９フアージの力価を持っており、０．１５か
ら１．８キロ塩基対の範囲の推定挿入サイズの５．５Ｘ
１０’の独立な透明なプラークファージ分離物がら成っ
ている。
記の組成を持つ： ＬＢ＋ａｍｐ １０１ｉ１ ＃母抽出物２０ｇ ト
リプトン １１７ ＮａＣ１ ５Ｍ ＮａＯＨにてｐＨ７，５にｖ４整１００ツ アム
ピシリン ＬＢ １０ｉｌ 酵母抽出物２０ｇ トリプ
トン １０ｇ ＮａＣ１ ５Ｍ ＮａＨＣＯｐＨ７，５に調整 ＭＧＹ １３．４ｇ アミノ酸を含まないＹＮＢ
４００β９ ビオチン １０９ グルコース １０− グリセロール ＭＭ １３．４ｇ アミノ酸を含まないＹＮＢ
４００μＶ ビオチン ５− メタノール ＬＢ寒天プレート ＬＢ中１−２％寒天ＬＢ上層
寒天 ＬＢｅ１１３０．８％寒天上層アガロース
ＬＢ中 ０．８％アガロースＬＢＭ ＬＢ
＋１０ｍＭ ＭｇＳ０４ＬＢＭ／ＡＭＰ ＬＢＭ＋
５０μ９／−アムビシリンＨ−上層寒天 １６９バ
クト一トリプトン１０ｇバクトー酵母抽出物 １リツトルのＨ２０に５９のＮａＣＬ ＳＭ ５．８？ ＮａＣｌ２９ ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２７ Ｈ２Ｏ５０ＩＭトリスＨ（ｊ ｐＨ７，５５−２チ
ゼラチン ＳＤＲ，１リツトル １３．４９ ＹＮＢ４００
μｇ ビオチン １８２Ｉｉ ソルビトール ＩＣＨ７デキストロース １０ｙ寒天 ５０〜づつのグルタミン、 メチオニン、リジン、ロ イシンおよびイソロイシン ２ｙヒスチジン検検定台物 ５ＤＨＲ，１リツトル ＳＤＲ＋４０ｍｙヒスチジンＴ
Ｅ緩衝液： ｌｏｍＭ）リス−ＨＣｔ （ｐＨ８
，０）１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０） 高塩緩衝液： ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０１０ｍＭ ＭｒｉＣｌ ２ １００？？１Ｍ ＮａＣ１ Ｈ８緩衝液： ５０ｍＭ トリス・Ｈ（ｊ （ｐＨ７，５）、１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，１００？７１Ｍ ＮａＣｔ＞よび１ｍ
Ｍジチオスレイトール ＭＳ 緩衝液： １０ｍＭ）リス・Ｈ（ｊ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇ
ＣＬ ２ 、５０ｍＭ ＮａＣＬおよび１ｍＭジチオス
レイトール ＬＳ 緩衝液： １０ｍＭ トリス＠ＨＣＬ（ｐＨ７，５）、ｌＯ？Ｘ
ＭＭＱＣ１２および１ｍＭジチオスレイトール結合緩衝
液： ５０ｍＭ トリス−ＨＣＬ（ｐＨ７，４＞１０ ｍＭ
ＭｃｔＣＬ ２ １０ｍＭ ジチオスレイトール １惜Ｍ ＡＴＰ および １００μ９／ｆｌＬｔ ＢＳＡ ５０ｔｎＭ ）リス−Ｈ（ｊ （ｐＨ７，２）１０？
７ＬＭ ＭｇＳＯ４ ０，１ｍＭ ジチオスレイトール および１ｍＭ
ＥＤＴＡ ５０ｍＭ トリス・Ｈ（ｊ （ｐＨ９，０）１情Ｍ
ＭｇＣｌ２ １ ｍＭ ＺｎＣＬ ２および １ｍＭ スペルミジン ５０雷Ｍ トリス・Ｈ（ｊ（ｐＨ７，６）１０ ｍＭ
ＭｒｉＣｌ ２ ５惟Ｍ ジチオスレイトール ０．１愼Ｍ ＥＤＴＡ および ０．１ｍＭ スペルミジン ０．１５Ｍ Ｎａ２ ＣＯ３ ０，０３５Ｍ ＮａＨＣＯ３ ５０ｇ 無脂肪乾燥ミルク １９ チメロサール １００μｌ抗あわ剤Ａ（シグマ） ＩＸ Ｄ−ＰＢＳ（１／）（’ダルベツコ リン酸緩衝
塩溶液、ギプコ）に０．５− ライ−７２０ ＴＢＳ、ｌＸ １５０？７ＬＭ ＮａＣ１ １Ｏ□ｍＭ ）リス−ＨＣ１ｊｐＨ７，５ＢＳＴ ＩＸ ＴＢＳ ０．０５％ ツイーン２０ ＣαＳ １Ｍ ソルビトール １０？ＦＬＭ ＣｃＬＣｊ２ １０倶Ｍ トリス・ＨＣＬ、ｐＨ７，５無菌フイルター 実施例■ ヒト肝臓λｇｔＩＩ−ｃＤＮＡ 発現ライブラリー（
ロット番号２１０２）はクロンチク ラボラトリ−社（
ＣＬｏｎＬｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉ？
＆ｃ ）から購入された。このライブラリーは−当り９
Ｘ １０９フアージの力価を持っており、０．１５か
ら１．８キロ塩基対の範囲の推定挿入サイズの５．５Ｘ
１０’の独立な透明なプラークファージ分離物がら成っ
ている。
４×１０ の独立な７アージ単離物に相当する一部を取
り、ブローブナ１と相補的なヌクレオチド配列を含むも
のをスクリーニングする。ブローブナ１はｌ ９ ｂｐ
のオリゴヌクレオチド（下記工程５で示す）であり、ヒ
ト血清アルブミンの成熟分泌型の最初のアミノ酸のため
のコドンを含んでいる。スクリーニングは以下のごと〈
実施する。
り、ブローブナ１と相補的なヌクレオチド配列を含むも
のをスクリーニングする。ブローブナ１はｌ ９ ｂｐ
のオリゴヌクレオチド（下記工程５で示す）であり、ヒ
ト血清アルブミンの成熟分泌型の最初のアミノ酸のため
のコドンを含んでいる。スクリーニングは以下のごと〈
実施する。
工８１．大腸菌トランスフェクション
大腸菌Ｙ ｌ ０８８ （ＡＴＣＣ番号３７１９７）を
０．２％Ｄ−グルコースを補充したＬＢブロス（５，０
９，＃＃母抽出物（デイ７コ（Ｄｉｆｃ、ｏ＞）。
０．２％Ｄ−グルコースを補充したＬＢブロス（５，０
９，＃＃母抽出物（デイ７コ（Ｄｉｆｃ、ｏ＞）。
１０．０！ｉ’／ｌ！トリプトン（デイフコ）、５．０
９／／塩化ナトリウム〕からなるＬＢＤ液体培地に感温
する。この懸濁液の５０μｌを５０μｙ／−の７ムピシ
リンを含むＬＢ（ＬＢ＋Ａｍｐ）に１．２％寒天ノープ
ル（デイフコ）を加えた固型増殖培地上に拡げる。３７
℃にて一夜放置し細菌コロニーを増殖せしめろ。いくつ
かのコロニーヲｌＯｔｌｌ）ＬＢ−Ａｍｐ培地に移し、
ライブラリーのスクリーニングに使用される終夜培養物
を得るため２５０ｒμにセットした回転振とう機中３０
℃でインキエペートする。
９／／塩化ナトリウム〕からなるＬＢＤ液体培地に感温
する。この懸濁液の５０μｌを５０μｙ／−の７ムピシ
リンを含むＬＢ（ＬＢ＋Ａｍｐ）に１．２％寒天ノープ
ル（デイフコ）を加えた固型増殖培地上に拡げる。３７
℃にて一夜放置し細菌コロニーを増殖せしめろ。いくつ
かのコロニーヲｌＯｔｌｌ）ＬＢ−Ａｍｐ培地に移し、
ライブラリーのスクリーニングに使用される終夜培養物
を得るため２５０ｒμにセットした回転振とう機中３０
℃でインキエペートする。
λｇｅｌｌ−ＣＤＮＡ発現ライブラリーの一部を８Ｍ緩
衝液（（５０ｍＭ ）リス・ＨＣｊ、ｐＨ７，５゜０
．１ Ｍ ＮａＣＬ、 ８．１ ｍＭ ＭｇＳＯ３，
０，０１％（Ｗ／Ｖ） ゼラチン〕で１００倍に希釈
する。
衝液（（５０ｍＭ ）リス・ＨＣｊ、ｐＨ７，５゜０
．１ Ｍ ＮａＣＬ、 ８．１ ｍＭ ＭｇＳＯ３，
０，０１％（Ｗ／Ｖ） ゼラチン〕で１００倍に希釈
する。
４．４μｔを４．０−の大腸菌Ｙ１０８８の終夜培養物
と混合し、混合物を３０℃にて２０分間インキュベート
する。０．２−を５５℃に維持されている２、、５−の
軟寒天培地（（ＬＢに０．７％寒天ノープル（デイフコ
）を添加〕に添加し、それｔ’９０ｍの直径のベトリ皿
中の底寒天（１，２％寒天ノープルを含むＬＢ）上に均
等に拡げる。室温で１０分後、プレートを４３℃にセッ
トしたインキュベーターに置く。ファージプラークが放
置すると現れるがコンフルエントにはならない（通常４
から６時間）。
と混合し、混合物を３０℃にて２０分間インキュベート
する。０．２−を５５℃に維持されている２、、５−の
軟寒天培地（（ＬＢに０．７％寒天ノープル（デイフコ
）を添加〕に添加し、それｔ’９０ｍの直径のベトリ皿
中の底寒天（１，２％寒天ノープルを含むＬＢ）上に均
等に拡げる。室温で１０分後、プレートを４３℃にセッ
トしたインキュベーターに置く。ファージプラークが放
置すると現れるがコンフルエントにはならない（通常４
から６時間）。
工程２ フィルターリフト
プラークを含む上層寒天にＳ＆Ｓニトロセルロースフィ
ルター（０，４５μ孔径および８２１１直径）を重積す
る。最終段階でのフィルターの配向付けを助けるためイ
ンディアンインクを含む１８ゲージ針を付けた注射筒で
外大上のフィルターを５点刺し通す。１分径プラーク側
を上にしてフィルターを１．５Ｍ ＮａＣ１１０，５
Ｍ ＮａＯＨで飽和した３ＭＭワットマンＰ紙上に移
す。２分径フィルターは底側からプロットされるので中
和溶液（１，０Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１，５
Ｍ ＮａＣ１）で飽Ｈした第２の３ＭＭワットマンｐ
紙上に移す。８分間中和した後、フィルターを６ＸＳＳ
Ｃ（０，９ＭＮａＣ１，９０ｍＭクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７，０）にて洗浄する。プロットされたフィルター
を乾燥し、真空オープン中で８０’ＣＫで２時間焼く。
ルター（０，４５μ孔径および８２１１直径）を重積す
る。最終段階でのフィルターの配向付けを助けるためイ
ンディアンインクを含む１８ゲージ針を付けた注射筒で
外大上のフィルターを５点刺し通す。１分径プラーク側
を上にしてフィルターを１．５Ｍ ＮａＣ１１０，５
Ｍ ＮａＯＨで飽和した３ＭＭワットマンＰ紙上に移
す。２分径フィルターは底側からプロットされるので中
和溶液（１，０Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１，５
Ｍ ＮａＣ１）で飽Ｈした第２の３ＭＭワットマンｐ
紙上に移す。８分間中和した後、フィルターを６ＸＳＳ
Ｃ（０，９ＭＮａＣ１，９０ｍＭクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７，０）にて洗浄する。プロットされたフィルター
を乾燥し、真空オープン中で８０’ＣＫで２時間焼く。
工程３ プリハイブリダイゼーションおよびす１プロー
ブとのハイフ゛リダイゼーションおよびオートラジオグ
ラフイー ヒト血清アルブミンの、ＤＮＡを含むプラークはそのＤ
ＮＡを細菌ま念は形質転換ベクターＤＮＡと相補的では
なくしかしヒト血清アルブミン、ＤＮＡと相補的なヌク
レオチド配列として選択された放射活性標識オリゴヌク
レオチドとハイブリダイゼーションすることにより同定
される。
ブとのハイフ゛リダイゼーションおよびオートラジオグ
ラフイー ヒト血清アルブミンの、ＤＮＡを含むプラークはそのＤ
ＮＡを細菌ま念は形質転換ベクターＤＮＡと相補的では
なくしかしヒト血清アルブミン、ＤＮＡと相補的なヌク
レオチド配列として選択された放射活性標識オリゴヌク
レオチドとハイブリダイゼーションすることにより同定
される。
Ａ、標識オリゴヌクレオチドプローブの調製放射活性オ
リゴヌクレオチドプローブは７０ｍＭト リス 拳 Ｈ
Ｃｊ （ｐＨ７，６） 、 ｌ ＯηｚＭ
ＭｇＣＬ２１、 ＯｎｈＭ ＫＣｌ 、 ５．０ｍＭ
ジチオスレイトール。
リゴヌクレオチドプローブは７０ｍＭト リス 拳 Ｈ
Ｃｊ （ｐＨ７，６） 、 ｌ ＯηｚＭ
ＭｇＣＬ２１、 ＯｎｈＭ ＫＣｌ 、 ５．０ｍＭ
ジチオスレイトール。
１、０ ｍＭスペルミジンな含む１０μｌの緩衝液巾約
１００ｆｆｉＦの与えられたオリゴヌクレオチドを１０
０μＣｉの〔Ｐ″１ＡＴＰ と混合することによりＡＭ
される。１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添
加し、混合物は３７℃にて３０分間インキュベートする
。６５℃で５分間インキュベートして酵素を不活性化し
、反応混合物を精製することなくハイブリダイゼーショ
ン溶液に標識オリゴヌクレオチドを添加する。
１００ｆｆｉＦの与えられたオリゴヌクレオチドを１０
０μＣｉの〔Ｐ″１ＡＴＰ と混合することによりＡＭ
される。１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添
加し、混合物は３７℃にて３０分間インキュベートする
。６５℃で５分間インキュベートして酵素を不活性化し
、反応混合物を精製することなくハイブリダイゼーショ
ン溶液に標識オリゴヌクレオチドを添加する。
Ｂ、ブリハイブリダイゼーション
ファージＤＮＡ’＆含むフィルターリフトを０．９Ｍ
ＮａＣＬ、 ６．ＯｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、 １９．
８？７ＬＭトリス・ＨＣｌ （ｐＨ８，０） 、 ０．
１儂 フィコール。
ＮａＣＬ、 ６．ＯｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、 １９．
８？７ＬＭトリス・ＨＣｌ （ｐＨ８，０） 、 ０．
１儂 フィコール。
０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アル
ブミン、０．１％ＳＤＳおよび１０チ硫酸デキストラン
を含む溶液中で３−１６時間インキュベートする。
ブミン、０．１％ＳＤＳおよび１０チ硫酸デキストラン
を含む溶液中で３−１６時間インキュベートする。
Ｃ，ハイブリダイゼーション
ブリハイブリダイズしたフィルターをブリハイブリダイ
ゼーションと同一の、しかし放射活性−標識オリゴヌク
レオチド＋１を２ＩｖＺ−の濃度で含む溶液中でハイブ
リダイズする。フィルター当り２ｇＬｔの溶液を用い、
３７℃にて２０−４８時間インキュベートする。
ゼーションと同一の、しかし放射活性−標識オリゴヌク
レオチド＋１を２ＩｖＺ−の濃度で含む溶液中でハイブ
リダイズする。フィルター当り２ｇＬｔの溶液を用い、
３７℃にて２０−４８時間インキュベートする。
Ｄ、洗浄
フィルターは０．９ Ｍ ＮａＣ１，９０ｍＭ ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液中室温で４回（
１回の洗浄当り２０分）、０．１％ＳＤＳを含む同じ緩
衝液中４５℃にて１回（１時間）洗浄する。
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液中室温で４回（
１回の洗浄当り２０分）、０．１％ＳＤＳを含む同じ緩
衝液中４５℃にて１回（１時間）洗浄する。
各々のフィルター洗浄に１０４容量の溶液を使用する。
Ｅ、オートラジオグラフィー
フィルターを風乾し、Ｘ−線フイルム露光カセット中Ｘ
−線フイルム（コダックＸＡＲ−２ま九はＸＡＲ−５）
と合わせて置く。カセットを一８０℃にて２０−４８時
間インキュベートする。
−線フイルム（コダックＸＡＲ−２ま九はＸＡＲ−５）
と合わせて置く。カセットを一８０℃にて２０−４８時
間インキュベートする。
工程４ ＨＳＡタンパク質陽性プラークの免疫スクリ
ーニング λｇｔ１１ ベクター中のクローニング部位はβ−ガラ
クトシダーゼコード領域内にある。Ｉ ＰＴＧ（イソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）はλｇｔｌｌ ベ
クター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を誘導す
るので、それはまたβ−ガラクトシダーゼに関して読み
わく内にクローニングされ喪遺伝子の発現も誘導し、β
−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生ずる。それ故
、正しい配向をした読みわく内の全または部分ＨＳＡ遺
伝子からは免疫活性物質が得られねばならない。大腸菌
株Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ番号３７１９７）がＨＳＡ発現
陽性プラークの検出に用いられる。ファージの感染シよ
び塗布法は大腸菌Ｙｌ ０８８のために前に記載した方
法と同じである。プラークが約１ｆｌの直径になった後
、前もってｌＯｍＭ（Ｉ ＰＴＧ ）に浸漬し乾燥させ
であるニトロセルロースフィルターを上層寒天上に置く
。プレートを４３℃にて４−６時間インキュベートする
。その後フィルターをプレートから除き、１％ゼラチン
、０．０５％Ｂｒ５ｊ５８＆含むＴＢＳＴからなる阻害
溶液に浸す。フィルターは室温にてゆるやかに揺り動か
しながら０．５−１６時間インキュベートする。もしオ
リゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションと同一の
プレートからプラークリフトが必要とされる場合は、ニ
トロセルロースフィルターの重層に先立ちプレートを４
３℃インキュベーターに２時間戻す。
ーニング λｇｔ１１ ベクター中のクローニング部位はβ−ガラ
クトシダーゼコード領域内にある。Ｉ ＰＴＧ（イソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）はλｇｔｌｌ ベ
クター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を誘導す
るので、それはまたβ−ガラクトシダーゼに関して読み
わく内にクローニングされ喪遺伝子の発現も誘導し、β
−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生ずる。それ故
、正しい配向をした読みわく内の全または部分ＨＳＡ遺
伝子からは免疫活性物質が得られねばならない。大腸菌
株Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ番号３７１９７）がＨＳＡ発現
陽性プラークの検出に用いられる。ファージの感染シよ
び塗布法は大腸菌Ｙｌ ０８８のために前に記載した方
法と同じである。プラークが約１ｆｌの直径になった後
、前もってｌＯｍＭ（Ｉ ＰＴＧ ）に浸漬し乾燥させ
であるニトロセルロースフィルターを上層寒天上に置く
。プレートを４３℃にて４−６時間インキュベートする
。その後フィルターをプレートから除き、１％ゼラチン
、０．０５％Ｂｒ５ｊ５８＆含むＴＢＳＴからなる阻害
溶液に浸す。フィルターは室温にてゆるやかに揺り動か
しながら０．５−１６時間インキュベートする。もしオ
リゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションと同一の
プレートからプラークリフトが必要とされる場合は、ニ
トロセルロースフィルターの重層に先立ちプレートを４
３℃インキュベーターに２時間戻す。
ＩＰＴＧフィルターを阻害溶液から除き、阻害溶液で１
： １０００に希釈したヤギ抗−ＨＳＡ〔比濁計用等
級、アトランチツク アンチボデイズ（Ａｔムｎｔｉｃ
Ａｎ・ｔｉｂｏｄｉａｓ ）、カタロク番号００１−
１１、スカルポロフ、ＭＥ″ｌを使用してプラーク発現
免疫活性ＨＳＡが同定される。１時間室温でインキュベ
ートし、フィルターをＴＢＳＴ中５回洗浄する（１回の
洗浄当り１０分）。すべてのインキュベーションおよび
洗浄はゆるやかに揺り動かしながら実行する。抗−ＨＳ
Ａ抗体の結合は室温で１時間阻害溶液中１：１０００に
希釈したアルカリホスファターゼ−結合ウサギ抗ヤギＩ
ｇＧ（キルケガードアンドペリーラボラトリー（Ｋｉｒ
ｋａｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐａｒｒｙ ’Ｌａａ
ｂｏｒａｔｏｒｉａａ ）、ガイセルベルブ、ＭＤ）と
インキュベートすることにより検出される。前記のごと
く洗浄した後フィルターをニトロブルーテトラゾリウム
および５−プローｆ、−４−クロロー３−インドリルホ
スファ−ト（キルケガードアンドペリーラボラトリー）
を含むＯｌｌＭ）リス緩衝液からなるホスファターゼ基
質系中室温で１０−３０分間インキエベートする。安定
な紫色の沈澱が膜の反応部位に析出する。水中てフィル
ターを洗浄することにより反応が停止され、フィルター
は風乾する。
： １０００に希釈したヤギ抗−ＨＳＡ〔比濁計用等
級、アトランチツク アンチボデイズ（Ａｔムｎｔｉｃ
Ａｎ・ｔｉｂｏｄｉａｓ ）、カタロク番号００１−
１１、スカルポロフ、ＭＥ″ｌを使用してプラーク発現
免疫活性ＨＳＡが同定される。１時間室温でインキュベ
ートし、フィルターをＴＢＳＴ中５回洗浄する（１回の
洗浄当り１０分）。すべてのインキュベーションおよび
洗浄はゆるやかに揺り動かしながら実行する。抗−ＨＳ
Ａ抗体の結合は室温で１時間阻害溶液中１：１０００に
希釈したアルカリホスファターゼ−結合ウサギ抗ヤギＩ
ｇＧ（キルケガードアンドペリーラボラトリー（Ｋｉｒ
ｋａｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐａｒｒｙ ’Ｌａａ
ｂｏｒａｔｏｒｉａａ ）、ガイセルベルブ、ＭＤ）と
インキュベートすることにより検出される。前記のごと
く洗浄した後フィルターをニトロブルーテトラゾリウム
および５−プローｆ、−４−クロロー３−インドリルホ
スファ−ト（キルケガードアンドペリーラボラトリー）
を含むＯｌｌＭ）リス緩衝液からなるホスファターゼ基
質系中室温で１０−３０分間インキエベートする。安定
な紫色の沈澱が膜の反応部位に析出する。水中てフィル
ターを洗浄することにより反応が停止され、フィルター
は風乾する。
いくつかの実験においては陽性プラークの同定に１２５
ニータンパク質Ｇが使用された。この場合、フィルター
は前に記載したごとき抗−ＨＳＡ抗体とのインキュベー
ションおよび続いての洗浄後−当す０．３μＣｉの １
２５Ｉ−タンパク質Ｇを含むＴＢＳ （ライ−ｙ２０に
含まないＴＢＳＴ）溶液中で４時間インキュベートする
。フィルターはＢＴＢ８（０，０５％ Ｂｒ１ｊ ５
Ｂ’を含むＴＢＳ）で２回洗浄し、続いて更にＴＢＳ中
で２回洗浄する。
ニータンパク質Ｇが使用された。この場合、フィルター
は前に記載したごとき抗−ＨＳＡ抗体とのインキュベー
ションおよび続いての洗浄後−当す０．３μＣｉの １
２５Ｉ−タンパク質Ｇを含むＴＢＳ （ライ−ｙ２０に
含まないＴＢＳＴ）溶液中で４時間インキュベートする
。フィルターはＢＴＢ８（０，０５％ Ｂｒ１ｊ ５
Ｂ’を含むＴＢＳ）で２回洗浄し、続いて更にＴＢＳ中
で２回洗浄する。
すべての洗浄は室温でゆるやかに揺シ動かしながら１０
分間隔で実施する。オートラジオグラフィーは前記のご
と〈実施する。
分間隔で実施する。オートラジオグラフィーは前記のご
と〈実施する。
工程５ オリゴヌクレオチド÷２．◆３９Ｍ１および
Ｍ２とのプラークハイブリダイ ゼーション精製プラークは下記のオリ ゴヌクレオチドでスクリーニングされ 九。
Ｍ２とのプラークハイブリダイ ゼーション精製プラークは下記のオリ ゴヌクレオチドでスクリーニングされ 九。
ナ■： ｓ ’ −ｏｏ？ｏＡｏＴｏＴＴｏｒｏＴｏｏ
ＡＴｏ −３’÷２ ： ５ ’ −００ＡＯＴＴ
ＯＧＧＯＡＡＴ（ＸＩＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＯＯＡ
ＡＯＡＧＡＧＧ−３４３： ５ ’ −０００ＴＯＯＴ
ＯＧＧＯＡＡＡＧＯＡＧＧ −３Ｍｌ ： ５’−
ＧＡＡＡＴＡＡムＧＧＴ’ｒＡＯＯＯＡＯＴ？ＯＡ？−
３’Ｍ ２ ： ５ ’ −０００ＡＯＩ’ＴＯＡ？
ｒＧＴＧＯＯＡＡＡＧ−３’すｌプローブは成熟ＨＳＡ
タンパク質の最初の６つのアミノ酸に対応する１９のヌ
クレオチドにハイブリダイズする。÷２プローブは成熟
ＨＳＡタンパク質のす２８１からφ２９２のアミノ酸に
対応スるヌクレオチドと相補的でＨＳＡ−ｃＤＮＡ配列
内の単一Ｐ＄ｔＩ 制限エンドヌクレアーゼ部位から
上流にある。φ３のグローブは成熟ＨＳＡタンパク質の
す５６５から＋５７１のアｉ）酸のためのヌクレオチド
を含むクローンの検出に使用できる。上記３つのオリゴ
ヌクレオチドは公表されたＨＳＡ ｃＤＮＡ配列のこれ
らの領域内ではヌクレオチド変異がなかったため選択さ
れた。
ＡＴｏ −３’÷２ ： ５ ’ −００ＡＯＴＴ
ＯＧＧＯＡＡＴ（ＸＩＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＯＯＡ
ＡＯＡＧＡＧＧ−３４３： ５ ’ −０００ＴＯＯＴ
ＯＧＧＯＡＡＡＧＯＡＧＧ −３Ｍｌ ： ５’−
ＧＡＡＡＴＡＡムＧＧＴ’ｒＡＯＯＯＡＯＴ？ＯＡ？−
３’Ｍ ２ ： ５ ’ −０００ＡＯＩ’ＴＯＡ？
ｒＧＴＧＯＯＡＡＡＧ−３’すｌプローブは成熟ＨＳＡ
タンパク質の最初の６つのアミノ酸に対応する１９のヌ
クレオチドにハイブリダイズする。÷２プローブは成熟
ＨＳＡタンパク質のす２８１からφ２９２のアミノ酸に
対応スるヌクレオチドと相補的でＨＳＡ−ｃＤＮＡ配列
内の単一Ｐ＄ｔＩ 制限エンドヌクレアーゼ部位から
上流にある。φ３のグローブは成熟ＨＳＡタンパク質の
す５６５から＋５７１のアｉ）酸のためのヌクレオチド
を含むクローンの検出に使用できる。上記３つのオリゴ
ヌクレオチドは公表されたＨＳＡ ｃＤＮＡ配列のこれ
らの領域内ではヌクレオチド変異がなかったため選択さ
れた。
潜在的プローブはλＱｔ １１ ベクターおよび大腸
菌ＤＮＡに既知の配列に相同的な配列が無いことをみる
念めスクリーニングされた。このスクリーニングはハイ
ブリダイゼーションの非特異的部位を減少させるために
必要である。この分析に基づくと、プローブＭ２はベク
ター配列への低い水準の結合を示すことが期待できる。
菌ＤＮＡに既知の配列に相同的な配列が無いことをみる
念めスクリーニングされた。このスクリーニングはハイ
ブリダイゼーションの非特異的部位を減少させるために
必要である。この分析に基づくと、プローブＭ２はベク
ター配列への低い水準の結合を示すことが期待できる。
Ｍ２プローブはＡＴＧｙａ始コドンから上流の１０塩基
と相補的なヌクレオチドを含んでいるので、門密な条件
下ハイブリダイズするクローンは１ｏ塩基のすべてまた
はほとんどおよびそれゆえ完全なＨＳＡコード配列を含
んでいることが期待されるであろう。
と相補的なヌクレオチドを含んでいるので、門密な条件
下ハイブリダイズするクローンは１ｏ塩基のすべてまた
はほとんどおよびそれゆえ完全なＨＳＡコード配列を含
んでいることが期待されるであろう。
実施例Ｉ
フ゛ミン
工程Ｉ Ｍ１３ｍｐ１８クローニングベクターの調製
Ｍｌ ３ｍｐ １８ ［ニューイングランドバイオラボ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂａ ） ：）
複製型ＤＮＡ （４μ９）を５０μｊの高塩緩衝液中３
７℃にて１時間４０単位のＥ６０ＲＩで完全に消化する
。消化試料を７０℃にて５分間加熱し、酵素を不活性化
する。子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ。
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂａ ） ：）
複製型ＤＮＡ （４μ９）を５０μｊの高塩緩衝液中３
７℃にて１時間４０単位のＥ６０ＲＩで完全に消化する
。消化試料を７０℃にて５分間加熱し、酵素を不活性化
する。子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ。
１単位）を添加し、混合物は５０’ＣＫて１時間インキ
ュベートする。１／１ｏ容量の５００ｍＭＥＧＡＴ（ｐ
Ｈ８）の添加により反応を終結させる。
ュベートする。１／１ｏ容量の５００ｍＭＥＧＡＴ（ｐ
Ｈ８）の添加により反応を終結させる。
６５℃にて４５分間加熱してＣＩＡＰを不活性化する。
反応混合物は等容量のＴＥ−飽和フェノールにて抽出し
、続いてクロロホルム抽出な行う。
、続いてクロロホルム抽出な行う。
水相中の線状化したＭ１３ｙａｐ１８を３容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムおよび無水エタノール混合物（１：３０．
Ｖ／Ｖ）の添加により沈澱せしめる。
酸ナトリウムおよび無水エタノール混合物（１：３０．
Ｖ／Ｖ）の添加により沈澱せしめる。
混合物は一２０℃にて一夜放置する。４℃にて１４．０
００ｘ！ｉ’″’ＣＩ５分遠心分離をしてＤＮＡを回収
する。ベレットを真空乾燥し、１００μｌのＴＥに再溶
解する。
００ｘ！ｉ’″’ＣＩ５分遠心分離をしてＤＮＡを回収
する。ベレットを真空乾燥し、１００μｌのＴＥに再溶
解する。
工程２ ＨＳＡ ｃＤＮＡ挿入物の調製およびＭ
１３ｍｐ１８ベクターとの結合 Ａ、高力価プレート溶菌物の調製 抗体に陽性の組換え体ファージおよび実施例Ｉで記載し
たオリゴヌクレオチドスクリーニング剤をファージＤＮ
Ａの調製のため増殖させる。塗布用細胞は大腸菌Ｙ１０
８８を４０−のＬＢＭ＋ＡＭＰ中−夜培養して調製する
。３，０００ｘ＠で１５分間室温にて遠心分離して細胞
を採取し、ベレットは１５−１６ｇＬｌの１０ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４に再懸濁する。寒天栓の形をしたＬＢプレート
からの個々のプラーク（実施例■に記載したごとくして
調製）を０．１１１１ｔの大腸菌を塗布細胞に懸濁する
。室温にて１０分間放置した後、２，５−のＬＢ？ｌよ
び２．５−のＬＢ上層寒天を５５℃にて添加する。
１３ｍｐ１８ベクターとの結合 Ａ、高力価プレート溶菌物の調製 抗体に陽性の組換え体ファージおよび実施例Ｉで記載し
たオリゴヌクレオチドスクリーニング剤をファージＤＮ
Ａの調製のため増殖させる。塗布用細胞は大腸菌Ｙ１０
８８を４０−のＬＢＭ＋ＡＭＰ中−夜培養して調製する
。３，０００ｘ＠で１５分間室温にて遠心分離して細胞
を採取し、ベレットは１５−１６ｇＬｌの１０ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４に再懸濁する。寒天栓の形をしたＬＢプレート
からの個々のプラーク（実施例■に記載したごとくして
調製）を０．１１１１ｔの大腸菌を塗布細胞に懸濁する
。室温にて１０分間放置した後、２，５−のＬＢ？ｌよ
び２．５−のＬＢ上層寒天を５５℃にて添加する。
混合物を前もって暖めておいた（４２℃）ＬＢ寒天プレ
ート上に注ぐ。室温にて約１０分後、プレートをさかさ
にし、４２℃にて一夜インキユペートする。次の日、３
−のＳＭＹプレートにどっと注いで７ア一ジ粒子を回収
する。１滴のクロロホルムを添加し、チューブを渦巻き
状にかきまぜる。
ート上に注ぐ。室温にて約１０分後、プレートをさかさ
にし、４２℃にて一夜インキユペートする。次の日、３
−のＳＭＹプレートにどっと注いで７ア一ジ粒子を回収
する。１滴のクロロホルムを添加し、チューブを渦巻き
状にかきまぜる。
内容物を４，０００ｘ５で１０分間遠心分離して細胞破
片を除去する。上澄み液（高力価溶菌物）を４℃にて貯
蔵する。
片を除去する。上澄み液（高力価溶菌物）を４℃にて貯
蔵する。
Ｂ、高力価溶菌物の力価検定
高力価溶菌物の１０−４希釈ＳＭ溶液から１μｌおよび
１０μｔな取り、０．３４の大腸菌Ｙ１０８８ブレーテ
ィング細胞と混合する。３７℃にて１０分間インキュベ
ート後５５℃に前もって暖めた３−のＬＢ上層寒天を加
える。混合物をＬＢプレート上に注ぎ４２℃にて一夜イ
ンキユペートする。
１０μｔな取り、０．３４の大腸菌Ｙ１０８８ブレーテ
ィング細胞と混合する。３７℃にて１０分間インキュベ
ート後５５℃に前もって暖めた３−のＬＢ上層寒天を加
える。混合物をＬＢプレート上に注ぎ４２℃にて一夜イ
ンキユペートする。
溶菌物−当りのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を記録
する。
する。
Ｃ０溶菌物塗布法によるファージＤＮＡの調製１５０ｎ
の直径のべ） １７皿中６−の上層アガロースを使用す
ることを除いて力価検定のため前に記載したごとく約１
０ｐｆｕ １μｍ布する。塗布細菌の融合性溶菌後フ
ァージを上層アガロースからＳＭ内へ抽出する。ファー
ジＤＮＡは次にラムダンーブ７アージアドンーパント（
ＬａｍｂｄａａｏｒｂＰｈａｇｅ Ａｄｓｏｒｂａｎｔ
） Ｃプロメガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉ
ｏｔｅｃ ）、マジソン、ＷＩ）を用い製造元の示唆に
従うと上澄み液から単離される。
の直径のべ） １７皿中６−の上層アガロースを使用す
ることを除いて力価検定のため前に記載したごとく約１
０ｐｆｕ １μｍ布する。塗布細菌の融合性溶菌後フ
ァージを上層アガロースからＳＭ内へ抽出する。ファー
ジＤＮＡは次にラムダンーブ７アージアドンーパント（
ＬａｍｂｄａａｏｒｂＰｈａｇｅ Ａｄｓｏｒｂａｎｔ
） Ｃプロメガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉ
ｏｔｅｃ ）、マジソン、ＷＩ）を用い製造元の示唆に
従うと上澄み液から単離される。
Ｄ、Ｍ１３ｍｐ１８との結合反応
ＨＳＡ−１ｇｔｌ１組換え体ＤＮＡ（４−５μｙ）を３
０μｊの高塩緩衝液中３７℃にて３時間２０単位のＥｃ
ｏＲＩ で消化する。消化後反応混合物をＥｃｏ Ｒ
Ｉ−ＣＩＡＰ処３１Ｍ１３ｍｐ１８とＴ４リガーゼを用
いて結合せしめる。典型的結合反応では（最終容量１０
μ／）４−５μｙの全ＤＮＡおよび０．８μｌ）のＭ１
３ｍｐ１８が１ｘ結合緩衝液ｒ５０ｍＭ）リスｌｌＨＣ
ｌ 、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣＩ２．１ｒｎＭ Ａ
ＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％（Ｗ／Ｖ） ポリエチレ
ングリコール−８０００）に含まれている。結合反応は
１−２単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用い１５℃で一夜
実施する。
０μｊの高塩緩衝液中３７℃にて３時間２０単位のＥｃ
ｏＲＩ で消化する。消化後反応混合物をＥｃｏ Ｒ
Ｉ−ＣＩＡＰ処３１Ｍ１３ｍｐ１８とＴ４リガーゼを用
いて結合せしめる。典型的結合反応では（最終容量１０
μ／）４−５μｙの全ＤＮＡおよび０．８μｌ）のＭ１
３ｍｐ１８が１ｘ結合緩衝液ｒ５０ｍＭ）リスｌｌＨＣ
ｌ 、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣＩ２．１ｒｎＭ Ａ
ＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％（Ｗ／Ｖ） ポリエチレ
ングリコール−８０００）に含まれている。結合反応は
１−２単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用い１５℃で一夜
実施する。
工程３ 受容性細胞の形質転換
結合混合物の一部（１−５μりを３００μｊの大ｗｋ醒
ＪＭ１０７受容性細廁（Ｍａｎｄｅ ｌら、Ｊ。
ＪＭ１０７受容性細廁（Ｍａｎｄｅ ｌら、Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５３，１５４（１９７０））または
１００μｔの大腸菌り、Ｈ５０ＣＦ’ 凍結受容性細
胞（ＢＲＬ）と混合し、氷上に４０分間保つ。ＤＮＡの
取り込みは４２℃、２分間の熱刺激により誘導する。形
質転換細胞を氷に戻す。２００μｌの新しく調製した対
数増殖期の大腸菌ＪＭ１０７．４０ ｔｔｌのＸ−ｇａ
ｌの２チジメチルホルムアミド溶液、１００ａｔの１０
ｍＭＩＰＴＧおよび３−のＨ−上層寒天（５５℃）から
なる塗布混合物を添加する。形質転換混合物をＬＢ寒天
プレート上に注ぐ。プレートはプラーク形成のため３７
℃にて終夜インキユベートする。
１００μｔの大腸菌り、Ｈ５０ＣＦ’ 凍結受容性細
胞（ＢＲＬ）と混合し、氷上に４０分間保つ。ＤＮＡの
取り込みは４２℃、２分間の熱刺激により誘導する。形
質転換細胞を氷に戻す。２００μｌの新しく調製した対
数増殖期の大腸菌ＪＭ１０７．４０ ｔｔｌのＸ−ｇａ
ｌの２チジメチルホルムアミド溶液、１００ａｔの１０
ｍＭＩＰＴＧおよび３−のＨ−上層寒天（５５℃）から
なる塗布混合物を添加する。形質転換混合物をＬＢ寒天
プレート上に注ぐ。プレートはプラーク形成のため３７
℃にて終夜インキユベートする。
工程４ Ｍ１３ｓｓＤＮＡ鋳型の調装とＤＮＡ配列分
析 組換え体Ｍ１３ファージを含む無色プラークな取り、１
．５−のＺＸＹＴ中３７℃にて５−６時間激しく振とう
しながら大腸菌ＪＭ１０７中で増殖せしめる。増殖後、
培養物を１４，０００ｇで１分間遠心分離して上澄み液
から細胞を分離する。細胞ペレットはＭ１３の複製型二
重鎖の調製に使用し、一方上澄み液は単鎖ＤＮＡ鋳型の
分離に使用する。Ｍ １３ ｄａＲＦはＢｉｒｎｂｏｉ
ｍおよびＤｏｉｌｙのアルカリ溶菌法（Ｎｕｃｌ、 Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ；１５１３（１９７
９））を使用して単離される。
析 組換え体Ｍ１３ファージを含む無色プラークな取り、１
．５−のＺＸＹＴ中３７℃にて５−６時間激しく振とう
しながら大腸菌ＪＭ１０７中で増殖せしめる。増殖後、
培養物を１４，０００ｇで１分間遠心分離して上澄み液
から細胞を分離する。細胞ペレットはＭ１３の複製型二
重鎖の調製に使用し、一方上澄み液は単鎖ＤＮＡ鋳型の
分離に使用する。Ｍ １３ ｄａＲＦはＢｉｒｎｂｏｉ
ｍおよびＤｏｉｌｙのアルカリ溶菌法（Ｎｕｃｌ、 Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ；１５１３（１９７
９））を使用して単離される。
Ｍ １３ ｓｓ ＤＮＡ鋳型は培養上澄み液からポリエ
チレングリコール沈澱およびフェノール抽出により分離
される。簡単に記すと、１ｇＬｔの培養上澄み液を２０
０μｅの２０％ポリエチレングリコール−６０００を加
えた２、５ＭＮａＣ１溶液に混合する。
チレングリコール沈澱およびフェノール抽出により分離
される。簡単に記すと、１ｇＬｔの培養上澄み液を２０
０μｅの２０％ポリエチレングリコール−６０００を加
えた２、５ＭＮａＣ１溶液に混合する。
混合物を室温にて１５分間放置後、１４，０００ｘｇで
５分間遠心分離するとＭ１３ファージ顆粒が回収される
。ファージペレットを１００μ１ｆ）ＴＢに再懸濁し、
緩衝液−飽和フェノールで抽出する。
５分間遠心分離するとＭ１３ファージ顆粒が回収される
。ファージペレットを１００μ１ｆ）ＴＢに再懸濁し、
緩衝液−飽和フェノールで抽出する。
Ｍ１３５ｓＤＮＡＹ含む水相に３容量の酢酸す） ＩＪ
ウムーエタノール混合物を混和する。−２０℃にて一夜
冷却後、１４，０００ｘ？で１０分間４℃にて遠心分離
することによりＤＮＡ沈澱物が回収される。乾燥ＤＮＡ
を５０μｌのＴＥに溶解し、その５μｌを配列決定反応
に使用する。ＤＮＡ配列決定はＳａｎｇｅｒらによるジ
デオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃｄ、 Ｓｅｔ、、 ７４ ： ５４６３（１９
７７））により実施された。）ＩＳＡｌ ３の全配列は
表ＩＫ示されている。
ウムーエタノール混合物を混和する。−２０℃にて一夜
冷却後、１４，０００ｘ？で１０分間４℃にて遠心分離
することによりＤＮＡ沈澱物が回収される。乾燥ＤＮＡ
を５０μｌのＴＥに溶解し、その５μｌを配列決定反応
に使用する。ＤＮＡ配列決定はＳａｎｇｅｒらによるジ
デオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃｄ、 Ｓｅｔ、、 ７４ ： ５４６３（１９
７７））により実施された。）ＩＳＡｌ ３の全配列は
表ＩＫ示されている。
実施例■
ｐＡ Ｏ８０４プラスミドは大腸菌宿主に含まれた形で
米国農務省の北部地域研究センター、ペオリア、イリノ
イ、から入手可能である（受付番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８
１１４）。ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ で消化し、その特異的Ｅ ｃｏ ＲＩ部位で切断さ
れた線状ｐＡＯ８０４である〜７．５ｋｂフラグメント
を回収するためのゲル電気泳動を行って回収的に単離さ
れる。プラスミドｐＡＯ８０７ＮはｐＡＯ８０４，ｐＢ
Ｒ３２２およびバクテリオファージｆｌ ＤＮＡから出
発して下記のごとく構成される。
米国農務省の北部地域研究センター、ペオリア、イリノ
イ、から入手可能である（受付番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８
１１４）。ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ で消化し、その特異的Ｅ ｃｏ ＲＩ部位で切断さ
れた線状ｐＡＯ８０４である〜７．５ｋｂフラグメント
を回収するためのゲル電気泳動を行って回収的に単離さ
れる。プラスミドｐＡＯ８０７ＮはｐＡＯ８０４，ｐＢ
Ｒ３２２およびバクテリオファージｆｌ ＤＮＡから出
発して下記のごとく構成される。
工程１ ｆＬ −ｏｒｉ ＤＮＡの調製ｆ Ｉ Ａ
／ｆ リ＃７７−ジＤＮＡ（５０１１）’に２００μｊ
のＭＳ緩衝液中３７℃にて４時間５０単位のＲｓａ Ｉ
シよびＤｒａＩで消化し、ｆ１複製開始点（ｏｒｉ）を
含む〜４５８ｂｐのＤＮＡ７ラグメントを放出せしめる
。消化混合物を等容量のフェノール：クロロホルム（Ｖ
／Ｖ ） 混合物で抽出し、続いて水相を等容量のク
ロロホルムで抽出する。最後ＫＮａＣ１の濃度を０．２
Ｍに調整し、２．５容量の無水エタノールを添加して
水相中のＤＮＡを沈澱せしめる。混合物は氷上（４℃）
で１０分間放置し、ＤＮＡ沈澱物はマイクロフユージ中
１０，０００ｘ９で４℃にて３００分間遠心離して集め
る。ＤＮＡペレットは２度７０チ水性エタノールで洗浄
する。洗浄されたペレットは真空下乾燥し、２５μｊの
ＴＥ緩衝液に溶解する。このＤＮＡは１．５％アガロー
スゲル上電気泳動を行い〜、ｔｓｓｂｐのｆｉ−ｏｒｉ
フラグメントを含むゲル部分を切り出し、ゲル中のＤＮ
Ａは５００μｌの５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８゜Ｏ）内へ電
気的溶出セｔ。
／ｆ リ＃７７−ジＤＮＡ（５０１１）’に２００μｊ
のＭＳ緩衝液中３７℃にて４時間５０単位のＲｓａ Ｉ
シよびＤｒａＩで消化し、ｆ１複製開始点（ｏｒｉ）を
含む〜４５８ｂｐのＤＮＡ７ラグメントを放出せしめる
。消化混合物を等容量のフェノール：クロロホルム（Ｖ
／Ｖ ） 混合物で抽出し、続いて水相を等容量のク
ロロホルムで抽出する。最後ＫＮａＣ１の濃度を０．２
Ｍに調整し、２．５容量の無水エタノールを添加して
水相中のＤＮＡを沈澱せしめる。混合物は氷上（４℃）
で１０分間放置し、ＤＮＡ沈澱物はマイクロフユージ中
１０，０００ｘ９で４℃にて３００分間遠心離して集め
る。ＤＮＡペレットは２度７０チ水性エタノールで洗浄
する。洗浄されたペレットは真空下乾燥し、２５μｊの
ＴＥ緩衝液に溶解する。このＤＮＡは１．５％アガロー
スゲル上電気泳動を行い〜、ｔｓｓｂｐのｆｉ−ｏｒｉ
フラグメントを含むゲル部分を切り出し、ゲル中のＤＮ
Ａは５００μｌの５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８゜Ｏ）内へ電
気的溶出セｔ。
める。ＤＮＡ溶液は前に記載したごときフェノール：ク
ロロホルム抽出を行い、ＤＮＡ沈澱は２５μｊのＴＥ緩
衝液に溶解する（ｆｌ−ｏｒｉフラグメント）。
ロロホルム抽出を行い、ＤＮＡ沈澱は２５μｊのＴＥ緩
衝液に溶解する（ｆｌ−ｏｒｉフラグメント）。
へのクローニング
ＰＢＲ３２２（２μ’ｉ＞を２０μｔのＭＳ緩衝液中３
７℃にて１０分間２単位のＤｒａＩ で部分消化する
。反応は繭記工程Ｉに記載したごとくフェノール：クロ
ロホルム抽出、続いてのＤＮＡ沈澱により終結せしめる
。ＤＮＡペレットを２０μｔのＴＥ緩衝液に溶解する。
７℃にて１０分間２単位のＤｒａＩ で部分消化する
。反応は繭記工程Ｉに記載したごとくフェノール：クロ
ロホルム抽出、続いてのＤＮＡ沈澱により終結せしめる
。ＤＮＡペレットを２０μｔのＴＥ緩衝液に溶解する。
２０μｔの結合緩衝液中１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
と１４℃にて一夜インキユペートすることにより、約１
００ ＱｆｌのこのＤＮＡと１００ ｎｙのｆｉ−ｏｒ
ｉフラグメント（工程１）を結合せしめる。７０℃にて
１０分間加熱して結合反応を終結せしめ、ｐＢＲ３２２
のＤｒａＩ部位（ヌクレオチド位置３２３２および３２
５１）へクローン化されたｆｌ−ｏｒｉを含むｐＢＲｆ
ｌ−ｏｒｉ を得るため大腸菌株ＹＭＣ９（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら）を形質転換するのに使用する。
と１４℃にて一夜インキユペートすることにより、約１
００ ＱｆｌのこのＤＮＡと１００ ｎｙのｆｉ−ｏｒ
ｉフラグメント（工程１）を結合せしめる。７０℃にて
１０分間加熱して結合反応を終結せしめ、ｐＢＲ３２２
のＤｒａＩ部位（ヌクレオチド位置３２３２および３２
５１）へクローン化されたｆｌ−ｏｒｉを含むｐＢＲｆ
ｌ−ｏｒｉ を得るため大腸菌株ＹＭＣ９（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら）を形質転換するのに使用する。
工程３ ｐＡ Ｏ８０７の生成
ｐＢＲｆ １−ｏｒｉ （１０μ９）を３７℃にて各々
る。消化されたＤＮＡは舵起工程１で詳述したごとくフ
ェノール：クロロホルム抽出を行い、沈澱物は２５μｌ
のＴＥ緩衝液に溶解する。この物質は１．２％アガロー
スゲル上電気泳動を行い、ｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅ
Ｉ −Ｐｓｔ Ｉフラグメント（約０．８ｋｂ）を単離
して的起工程１で詳述したごとく２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解する。約１００１ｖ消化し、ホスファターゼ処理
をしである１００慢のｐＡＯ８０４と混合する。この混
合物は２０μｊの結合緩衝液中１単位のＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼと１４℃にて一夜インキュベートシて結合せしめ
る。
る。消化されたＤＮＡは舵起工程１で詳述したごとくフ
ェノール：クロロホルム抽出を行い、沈澱物は２５μｌ
のＴＥ緩衝液に溶解する。この物質は１．２％アガロー
スゲル上電気泳動を行い、ｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅ
Ｉ −Ｐｓｔ Ｉフラグメント（約０．８ｋｂ）を単離
して的起工程１で詳述したごとく２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解する。約１００１ｖ消化し、ホスファターゼ処理
をしである１００慢のｐＡＯ８０４と混合する。この混
合物は２０μｊの結合緩衝液中１単位のＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼと１４℃にて一夜インキュベートシて結合せしめ
る。
結合反応は７０”ＣＫで１０分間加熱することにより終
結せしめる。このＤＮＡはｐＡｏｓｏ７ｖｉるため、大
腸菌株ＹＭＣ９の形質転換に使用される。
結せしめる。このＤＮＡはｐＡｏｓｏ７ｖｉるため、大
腸菌株ＹＭＣ９の形質転換に使用される。
工程４ ｐＡＯ８０７Ｎ生成のためのｐＡＯ８０７
位への変換 ｐＡ０８０７（１０ムシ）を５０μＥのＨ８緩衝液中１
０単位のＢｇｌＩＩで３７℃にて４時間消化する。Ｂｇ
ｌ ＩＩ切断ＤＮＡ’（１０ａ９ ） Ｙ ５０ａｌの
ＮＴ緩衝液中５単位のＤＮＡポリメラーゼのクレノー断
片と室温にて３０分インキュベートすることによりＢｇ
ｌ ＩＩ付漕末端を満たす。この混合物から前記工程１
に記載したごとく、フェノール：クロロホルム抽出し、
ＤＮＡを回収する。ＤＮＡベレットは２５μｔのＴＥ緩
衝液に溶解する。このＤＮＡにニューイングランドバイ
オラボから得られた５０ｑ（１μｌ）のリン酸化された
ＮｏｔＩリンカ−（ｐＧＣＧＧＣＣＧＣ）、４０μｌの
５ｘ結合緩衝液、１２９μｅの水および５単位のＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼを混合する。この混合物は１４℃にて一
夜インキユペートする。７０℃にて１０分加熱して結合
度２を終結せしめる。続いて結合混合物はＨ８緩衝液条
件に調整した後１０単位のＮｏｔＩで消化する。前記工
程１で詳述したごとく、フェノール：クロロホルム抽出
後ＤＮＡＶ沈澱せしめる。沈澱物を５０μｌのＴＥ緩衝
液に溶解し、０．９チアガロースゲル上電気泳動する。
位への変換 ｐＡ０８０７（１０ムシ）を５０μＥのＨ８緩衝液中１
０単位のＢｇｌＩＩで３７℃にて４時間消化する。Ｂｇ
ｌ ＩＩ切断ＤＮＡ’（１０ａ９ ） Ｙ ５０ａｌの
ＮＴ緩衝液中５単位のＤＮＡポリメラーゼのクレノー断
片と室温にて３０分インキュベートすることによりＢｇ
ｌ ＩＩ付漕末端を満たす。この混合物から前記工程１
に記載したごとく、フェノール：クロロホルム抽出し、
ＤＮＡを回収する。ＤＮＡベレットは２５μｔのＴＥ緩
衝液に溶解する。このＤＮＡにニューイングランドバイ
オラボから得られた５０ｑ（１μｌ）のリン酸化された
ＮｏｔＩリンカ−（ｐＧＣＧＧＣＣＧＣ）、４０μｌの
５ｘ結合緩衝液、１２９μｅの水および５単位のＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼを混合する。この混合物は１４℃にて一
夜インキユペートする。７０℃にて１０分加熱して結合
度２を終結せしめる。続いて結合混合物はＨ８緩衝液条
件に調整した後１０単位のＮｏｔＩで消化する。前記工
程１で詳述したごとく、フェノール：クロロホルム抽出
後ＤＮＡＶ沈澱せしめる。沈澱物を５０μｌのＴＥ緩衝
液に溶解し、０．９チアガロースゲル上電気泳動する。
ＤＮＡフラグメント（より下のバンドはｐＢＲ３２２部
分およびｆｌ−ｏｒｉを含有するフラグメントの移動位
置に対応し、より上のバンドはｐＡＯ８０７の残った部
分に対応する、即ち５’ＡＯＸｌ。
分およびｆｌ−ｏｒｉを含有するフラグメントの移動位
置に対応し、より上のバンドはｐＡＯ８０７の残った部
分に対応する、即ち５’ＡＯＸｌ。
したグロトコールを用いてゲルから単離する。ゲル精製
ＤＮＡフラグメントを１０μｊのＴＥ緩衝液に溶解する
。線状部位特異的組込みベクターを表わすＤＮＡフラグ
メントは２００μｊのホスファターゼ緩衝液中３７℃に
て２単位のＣＨＡＰと３Ｃ１間インキュベートしてリン
酸エステルな加水分解する。加水分解されたＤＮＡは工
程１に記載したごとく、フェノール：クロロホルム抽出
し、沈澱せしめる。このＤＮＡをｐＡ Ｏ８０７プラス
ミドの残り（前記参照）を表わすより上のバンドのＤＮ
Ａと混合し、３０μｌの結合緩衝液中５単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼと４℃にて一夜結合反応を実施する。結合
混合物は７０℃にて１０分間加熱後氷上で冷却し、ｐＡ
Ｏ８０７Ｎを得るためその１０μｌ！を大腸菌ＹＭＣ９
の形質転換に使用する。ｐＡＯ８０７Ｎの構造は図３に
示しである。
ＤＮＡフラグメントを１０μｊのＴＥ緩衝液に溶解する
。線状部位特異的組込みベクターを表わすＤＮＡフラグ
メントは２００μｊのホスファターゼ緩衝液中３７℃に
て２単位のＣＨＡＰと３Ｃ１間インキュベートしてリン
酸エステルな加水分解する。加水分解されたＤＮＡは工
程１に記載したごとく、フェノール：クロロホルム抽出
し、沈澱せしめる。このＤＮＡをｐＡ Ｏ８０７プラス
ミドの残り（前記参照）を表わすより上のバンドのＤＮ
Ａと混合し、３０μｌの結合緩衝液中５単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼと４℃にて一夜結合反応を実施する。結合
混合物は７０℃にて１０分間加熱後氷上で冷却し、ｐＡ
Ｏ８０７Ｎを得るためその１０μｌ！を大腸菌ＹＭＣ９
の形質転換に使用する。ｐＡＯ８０７Ｎの構造は図３に
示しである。
実施例■
工、［Ｉ ＨＳＡフラグメントの回収約２．０ｋｂ
に対応するＨＳＡ遺伝子はｍｐ１８−ＨＳＡ１３複製型
ＤＮＡ （実施例Ｉを参照されたい）のＥｃｏＲＩ消化
により放出される。約１μｙのプラスミドｍｐ １８−
Ｈ３Ａ １３を２０ｔｔｌのＨ８緩衝液中３７℃にて２
時間５単位のＥｃｏＲＩで消化する。５０μｌのＨ２Ｏ
を希釈する事により反応を終結せしめ、実施例厘の工程
１に詳述したごとく、直ちにフェノール：クロロホルム
での抽出、シよび沈澱化を行う。ＤＮＡ沈澱物は１０μ
ｌの水に溶解し、後での使用のため一２０℃でｒｉｓ）
ＨＳＡ８ＡプラスミドｐＨＳＡ１３およびｐＨＳＡ１１
３を得るため、ベクターｐＴＨＦ’にΔシよびｐＡ０８
０７ＮのＥｃ ｏ ＲＩ部位へＨＳＡ遺伝子を挿入する
。
に対応するＨＳＡ遺伝子はｍｐ１８−ＨＳＡ１３複製型
ＤＮＡ （実施例Ｉを参照されたい）のＥｃｏＲＩ消化
により放出される。約１μｙのプラスミドｍｐ １８−
Ｈ３Ａ １３を２０ｔｔｌのＨ８緩衝液中３７℃にて２
時間５単位のＥｃｏＲＩで消化する。５０μｌのＨ２Ｏ
を希釈する事により反応を終結せしめ、実施例厘の工程
１に詳述したごとく、直ちにフェノール：クロロホルム
での抽出、シよび沈澱化を行う。ＤＮＡ沈澱物は１０μ
ｌの水に溶解し、後での使用のため一２０℃でｒｉｓ）
ＨＳＡ８ＡプラスミドｐＨＳＡ１３およびｐＨＳＡ１１
３を得るため、ベクターｐＴＨＦ’にΔシよびｐＡ０８
０７ＮのＥｃ ｏ ＲＩ部位へＨＳＡ遺伝子を挿入する
。
工程２ ＨＳＡ遺伝子の挿入のためのベクター操作
各々約１０μ９のｐＴＨＦＫΔ（図４）シよびｐＡ０８
０７Ｎを１００μｌのＨ８緩衝液中３７℃にて１６時間
１０単位のＥｃｏＲＩで消化する。反応混合物をアルカ
リホスファターゼ緩衝液条件に調整し、２００μｌの反
応液容量中３７℃にて３０分間１０単位のＣＩＡＰで処
理する。実施例■の工程１に詳述したごとくホスファタ
ーゼ処理をフェノール：クロロホルム抽出により終結せ
しめ、ＤＮＡを沈澱化させた後１００μｇ／−の最終濃
度でＴＥ緩衝液に溶解する。
０７Ｎを１００μｌのＨ８緩衝液中３７℃にて１６時間
１０単位のＥｃｏＲＩで消化する。反応混合物をアルカ
リホスファターゼ緩衝液条件に調整し、２００μｌの反
応液容量中３７℃にて３０分間１０単位のＣＩＡＰで処
理する。実施例■の工程１に詳述したごとくホスファタ
ーゼ処理をフェノール：クロロホルム抽出により終結せ
しめ、ＤＮＡを沈澱化させた後１００μｇ／−の最終濃
度でＴＥ緩衝液に溶解する。
工程３ ＩＳＡ遺伝予め発現ベクターへの挿入釜々１
００ｎＩｔのＥｅｏＲ４切断、ＣＩＡＰ処理ベクターＰ
ＴＨＦＫΔおよびｐＡＯ８０７Ｎ（実施例■、工程２）
を各々ｉ ｏ ｏｎｇのＥｃｏＲＩ消化ｍｐ １８−Ｈ
３Ａ １３ （実施例ＩＶ、工程１）と２０μｌの結合
緩衝液中で混合し、４℃にて１６時間２単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼで結合せしめろ。
００ｎＩｔのＥｅｏＲ４切断、ＣＩＡＰ処理ベクターＰ
ＴＨＦＫΔおよびｐＡＯ８０７Ｎ（実施例■、工程２）
を各々ｉ ｏ ｏｎｇのＥｃｏＲＩ消化ｍｐ １８−Ｈ
３Ａ １３ （実施例ＩＶ、工程１）と２０μｌの結合
緩衝液中で混合し、４℃にて１６時間２単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼで結合せしめろ。
７０℃にて１０分間加熱して結合反応を終結せしめ、プ
ラスミドｐＨＳＡ１３およびｐＨＳＡ １１３を得るた
めの大腸菌株ＤＧ７５’ の形質転換に使用する。
ラスミドｐＨＳＡ１３およびｐＨＳＡ １１３を得るた
めの大腸菌株ＤＧ７５’ の形質転換に使用する。
実施例Ｖ
工Ｉｓ Ｉ ＰＨＳＡ １１３ ヘ／ ｌ’ −ｆ
）８１４Ｍ２０μ９のｐＨＳＡ１１３を２００μｌのＨ
３緩衝液中３７℃にて１８時間５０単位のＮｏｔＩで消
化する。約２０μノのこの混合物をピキア パス（米国
農務省の北部地区研究センターに受付番号ＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１として供託されている）の形質転換に直接
使用する。残りの約１８０μｌのＮｏｔＩ 切断ｐＨＳ
Ａ １１３は実施例■の工程１に詳述したごとく、フェ
ノール：クロロホルム抽出および沈澱化を行う。１ＤＮ
Ａ沈澱物は２０μｌのＣａＳ溶液に溶解し、Ｇ５１１５
の形質転換にも使用される。Ｎｏｔｌ切断ｐＨＳＡ１１
３はピキア（Ｐｉｃｈｉａ ）座位に組込める。ｐＨＳ
Ａ１１３ｃｈｉａ ）のヒスチジノールデヒドロゲナー
ゼの遺伝子を運んでいるので得られる形質転換体は直ち
にＨｉｓ＋ 表現型に基づいて容易に選択できる。
）８１４Ｍ２０μ９のｐＨＳＡ１１３を２００μｌのＨ
３緩衝液中３７℃にて１８時間５０単位のＮｏｔＩで消
化する。約２０μノのこの混合物をピキア パス（米国
農務省の北部地区研究センターに受付番号ＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１として供託されている）の形質転換に直接
使用する。残りの約１８０μｌのＮｏｔＩ 切断ｐＨＳ
Ａ １１３は実施例■の工程１に詳述したごとく、フェ
ノール：クロロホルム抽出および沈澱化を行う。１ＤＮ
Ａ沈澱物は２０μｌのＣａＳ溶液に溶解し、Ｇ５１１５
の形質転換にも使用される。Ｎｏｔｌ切断ｐＨＳＡ１１
３はピキア（Ｐｉｃｈｉａ ）座位に組込める。ｐＨＳ
Ａ１１３ｃｈｉａ ）のヒスチジノールデヒドロゲナー
ゼの遺伝子を運んでいるので得られる形質転換体は直ち
にＨｉｓ＋ 表現型に基づいて容易に選択できる。
ａｏｘ １ ： ＡＲＧ４ ）を１０μりのｐＨ３Ａ
１３でＨｉｓ＋のため形質転換する。ｔｙｕｓ４に加え
てこのプラスミドは自律性顎間配列ＡＲ８１を運ん式で
複製できる。そのような形質転換体は“自律性形質転換
体”と称されている。この株を用いる理由は、ＫＭ７１
ではＡＲＧ４によりＡＯＸｌが破壊されて“メタノール
に鈍く”なるためおよびメタノールに対して正常株ＧＳ
１１５に比べＩａｃ２がＡＯＸＩプロモーターの制御
下に置かれている場合はβ−ガラクトシダーゼを高水準
で発現することが示されているためである。負の対照と
してＫＭ７１もま念ｐｙ、ｙ ３０で形質転換され（Ｎ
ＲＲＬＢ−１５８９０）、プラスミドはまたＨｉｓ４を
含んでいる。
１３でＨｉｓ＋のため形質転換する。ｔｙｕｓ４に加え
てこのプラスミドは自律性顎間配列ＡＲ８１を運ん式で
複製できる。そのような形質転換体は“自律性形質転換
体”と称されている。この株を用いる理由は、ＫＭ７１
ではＡＲＧ４によりＡＯＸｌが破壊されて“メタノール
に鈍く”なるためおよびメタノールに対して正常株ＧＳ
１１５に比べＩａｃ２がＡＯＸＩプロモーターの制御
下に置かれている場合はβ−ガラクトシダーゼを高水準
で発現することが示されているためである。負の対照と
してＫＭ７１もま念ｐｙ、ｙ ３０で形質転換され（Ｎ
ＲＲＬＢ−１５８９０）、プラスミドはまたＨｉｓ４を
含んでいる。
工程２ 細廁増殖
Ｇ３１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）を約１０−のＹ
ＰＤ培地に接種し、３０℃にて１２−２０時間振とう培
養する。１００−のＹＰＤに種培養物を接種するとＯＤ
６００は約０．００１を与える。培地を振とうフラス
コ中３０℃にて約１２−２０時間培養する。０Ｄ６００
が約０．２−０．３（約１６−２０時間後）に達した時
、ソー パル（５ｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｃを用い、１５
００９にで５分間遠心分離して培養物を採取する。
ＰＤ培地に接種し、３０℃にて１２−２０時間振とう培
養する。１００−のＹＰＤに種培養物を接種するとＯＤ
６００は約０．００１を与える。培地を振とうフラス
コ中３０℃にて約１２−２０時間培養する。０Ｄ６００
が約０．２−０．３（約１６−２０時間後）に達した時
、ソー パル（５ｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｃを用い、１５
００９にで５分間遠心分離して培養物を採取する。
工８３ スフェロプラストのｖ４服
細胞を１度１０−の無菌水で洗浄した後１５００９で５
分間遠心分離する（特にことわらない限り各細胞洗浄後
ソーパルＲＴ６０００Ｂ を用い１５０１で５分間遠心
分離を行う）。次に細胞を１度１０−の新しく調製した
ＳＥＤ、１度１〇−の無菌１Ｍソルビトール溶液で洗浄
し、最後に１０−のＳＣＥ緩衝液に再懸濁する。７．５
μｌの３ ｍｙ／−チモリアーゼｌ：１００，０００単
位／９、マイルズラボラトリー（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ ）から入手〕溶液を細胞溶液に添加
する。細胞を３０℃にて約１０分間インキュベートする
。
分間遠心分離する（特にことわらない限り各細胞洗浄後
ソーパルＲＴ６０００Ｂ を用い１５０１で５分間遠心
分離を行う）。次に細胞を１度１０−の新しく調製した
ＳＥＤ、１度１〇−の無菌１Ｍソルビトール溶液で洗浄
し、最後に１０−のＳＣＥ緩衝液に再懸濁する。７．５
μｌの３ ｍｙ／−チモリアーゼｌ：１００，０００単
位／９、マイルズラボラトリー（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ ）から入手〕溶液を細胞溶液に添加
する。細胞を３０℃にて約１０分間インキュベートする
。
（ＯＤａｏｏの６０％の減少が正確な時間シよび濃度の
マーカーとして利用できる）。スフェロプラストを１度
１０ｍの無菌１Ｍソルビトール溶液で洗浄し、７００９
で５−１０分遠心分離する。
マーカーとして利用できる）。スフェロプラストを１度
１０ｍの無菌１Ｍソルビトール溶液で洗浄し、７００９
で５−１０分遠心分離する。
（遠心分離の時閣および速度は変更してもよい；スフェ
ロプラストをペレット化するのに十分な程度遠心分離し
、やり過ぎるとその力で破壊される）。
ロプラストをペレット化するのに十分な程度遠心分離し
、やり過ぎるとその力で破壊される）。
最終的な細胞洗浄を１０−の無菌ＣａＳで行い、細胞を
再び７００１７で５−１Ｏ分遠心分離し０．６−のＣａ
５Ｋ再懸濁する。
再び７００１７で５−１Ｏ分遠心分離し０．６−のＣａ
５Ｋ再懸濁する。
工程４ 形質転換
５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａらのスフェロプラスト形質転換
技術、Ｇｅｎｅ ５９，１１５−１２５（１９８７）、
を用い１０μ９の線状ＨＳＡベクターでＧＳ １１ ｓ
細胞を形質転換する。１２Ｘ７５１ＩＩ無菌ポリプロピ
レンチユーブにＤＮＡ試料を添加する（２０μｌの容量
まで）。（ＤＮＡはＴＥ緩衝液のごとき適し九緩衝液に
溶解していなければならない）。各々のＤＮＡＥＵに１
００μｊのスフェロプラストを添加し、室温にて約２０
分インキュベートする。
技術、Ｇｅｎｅ ５９，１１５−１２５（１９８７）、
を用い１０μ９の線状ＨＳＡベクターでＧＳ １１ ｓ
細胞を形質転換する。１２Ｘ７５１ＩＩ無菌ポリプロピ
レンチユーブにＤＮＡ試料を添加する（２０μｌの容量
まで）。（ＤＮＡはＴＥ緩衝液のごとき適し九緩衝液に
溶解していなければならない）。各々のＤＮＡＥＵに１
００μｊのスフェロプラストを添加し、室温にて約２０
分インキュベートする。
各々の試料に１−のＰＥＧ溶液を加え、室温にて約１５
分インキュベートした後７００９で５−１０分間遠心分
離する。ベレットに５Ｏ８（１５０μｌ）を加え室温で
３０分インキュベートする。最後に８５０μＥの１Ｍソ
ルビトールを添加する。
分インキュベートした後７００９で５−１０分間遠心分
離する。ベレットに５Ｏ８（１５０μｌ）を加え室温で
３０分インキュベートする。最後に８５０μＥの１Ｍソ
ルビトールを添加する。
工程５ スフェロプラストの再生
２０−の再生寒天ＳＤＲの底寒天層を形質転換試料が準
備できる少くとも３０分前にプレートに注ぐ。さらにＳ
Ｏ８中に形質転換試料がある期間に４５℃浴中の１５−
の円錐形の底を持つコーニングチューブに再生寒天を８
−づつ移す。４５℃に保たれ念溶融再生寒天８−に５０
，２５０または８００μｌの形質転換試料を添加し、固
体２゜−底寒天層を含むプレート上に注ぐ。プレートを
３０℃にて３−５日間インキュベートする。
備できる少くとも３０分前にプレートに注ぐ。さらにＳ
Ｏ８中に形質転換試料がある期間に４５℃浴中の１５−
の円錐形の底を持つコーニングチューブに再生寒天を８
−づつ移す。４５℃に保たれ念溶融再生寒天８−に５０
，２５０または８００μｌの形質転換試料を添加し、固
体２゜−底寒天層を含むプレート上に注ぐ。プレートを
３０℃にて３−５日間インキュベートする。
工程６ 形質転換体の選択
形質転換体はヒスチジンを欠く培地、ＳＤＲ上で培養し
て選択する。ヒスチジン無しでも増殖する培養物は更に
”メタノールに鈍い”表現をでスクリーニングする（部
位選択的組込みを示す）。
て選択する。ヒスチジン無しでも増殖する培養物は更に
”メタノールに鈍い”表現をでスクリーニングする（部
位選択的組込みを示す）。
両方の表現屋の証拠を示す形質転換体Ｇｓ１１５細胸を
培養し、ＨＳＡの産生な検定する。
培養し、ＨＳＡの産生な検定する。
実施例■
プラスミドＰＨＳＡ１３で形質転換したＫＭ７１株およ
び負の対照のｐＹＪ３０形質転換体ＫＭ７１を１０−の
ＭＧＹ培地で６００ｈＭでの光学密度が８．００になる
まで増殖せしめ、その後ＭＭ培地に移す。ＭＭ上で３日
間インキュベーションした後遠心分離により細胞を採取
し、培地上澄み液？：１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フル、！ｌ−ＩＪ ）’ （ＰＭｓＦ）に調整し、ＨＳ
Ａ分析のために凍結保存する（上澄み液Ｍ）。細胞は１
ｍＭＰＭｓＦ を含む５００μＩの切断緩衝液に懸濁し
、氷上で断続的に総計で４分間ガラスピーズと伴に激し
く渦巻状に攪拌する。続いて試料はマイクロラージ中１
０，０００ｘｇで１０分間４℃にて遠心分離するとベレ
ットから透明な上澄み液が分離され、上澄み液工と称す
る。ベレットを６Ｍ尿素を含む５００μｌの切断緩衝液
で抽出し、この抽出液を上澄み液Ｉと称する。定量的Ｈ
ＳＡ−ＥＬＩＳＡだけでなくＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ； １５２巻、（１９８７）”モ
レキュラークローニング技術への手引き”に記載されて
いるごときＰＡＧＥイムノプロット法により種々の上澄
み液のＨＳＡ″？：分析する。この目的のために開発し
たＨＳＡ−ＥＬＩＳＡ法を実施例■に示した。ＨＳＡ−
ＥＬＩＳＡにより決定されたごとく上澄み液工が他の分
画に比べて最も高い水準でＨ８ｊｌ含んでいた１表３
）（ＰＡＧＥ−エレクトロイムノプロッティングによる
算定でもＩＳＡは王として溶解分画に存在していた）。
び負の対照のｐＹＪ３０形質転換体ＫＭ７１を１０−の
ＭＧＹ培地で６００ｈＭでの光学密度が８．００になる
まで増殖せしめ、その後ＭＭ培地に移す。ＭＭ上で３日
間インキュベーションした後遠心分離により細胞を採取
し、培地上澄み液？：１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フル、！ｌ−ＩＪ ）’ （ＰＭｓＦ）に調整し、ＨＳ
Ａ分析のために凍結保存する（上澄み液Ｍ）。細胞は１
ｍＭＰＭｓＦ を含む５００μＩの切断緩衝液に懸濁し
、氷上で断続的に総計で４分間ガラスピーズと伴に激し
く渦巻状に攪拌する。続いて試料はマイクロラージ中１
０，０００ｘｇで１０分間４℃にて遠心分離するとベレ
ットから透明な上澄み液が分離され、上澄み液工と称す
る。ベレットを６Ｍ尿素を含む５００μｌの切断緩衝液
で抽出し、この抽出液を上澄み液Ｉと称する。定量的Ｈ
ＳＡ−ＥＬＩＳＡだけでなくＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ； １５２巻、（１９８７）”モ
レキュラークローニング技術への手引き”に記載されて
いるごときＰＡＧＥイムノプロット法により種々の上澄
み液のＨＳＡ″？：分析する。この目的のために開発し
たＨＳＡ−ＥＬＩＳＡ法を実施例■に示した。ＨＳＡ−
ＥＬＩＳＡにより決定されたごとく上澄み液工が他の分
画に比べて最も高い水準でＨ８ｊｌ含んでいた１表３
）（ＰＡＧＥ−エレクトロイムノプロッティングによる
算定でもＩＳＡは王として溶解分画に存在していた）。
表 ３
ＫＭ７１／ｐＹＪ３０−１ ＜１ （０，
０００１％ＫＭ７１／ｐＨＳＡ１３−１８９１４ ０．
８９チＫＭ７１／ｐＨＳＡ１３−２１５７７７１．６チ
ＫＭ７１／ＰＨＳＡ１３−４５６４８ ０．５６％ＫＭ
７１／ＰＨＳＡ１３−６８８８８５８．９％実施例■ Ｎ０ｔＩ切断ｐＨＳＡ１１３を用いて得られた数千のＧ
５１１５Ｈｉｓ 形質転換体をプールしておき、そ
の一部を１０４のＭＧＹに接種し、飽和するまで増殖せ
しめる。この時点で細胞ＹＭＭに移し、振どう機上３０
℃にてインキュベートする。
０００１％ＫＭ７１／ｐＨＳＡ１３−１８９１４ ０．
８９チＫＭ７１／ｐＨＳＡ１３−２１５７７７１．６チ
ＫＭ７１／ＰＨＳＡ１３−４５６４８ ０．５６％ＫＭ
７１／ＰＨＳＡ１３−６８８８８５８．９％実施例■ Ｎ０ｔＩ切断ｐＨＳＡ１１３を用いて得られた数千のＧ
５１１５Ｈｉｓ 形質転換体をプールしておき、そ
の一部を１０４のＭＧＹに接種し、飽和するまで増殖せ
しめる。この時点で細胞ＹＭＭに移し、振どう機上３０
℃にてインキュベートする。
ＭＭ上にして２８稜細胞を採取し実施例■で記載したご
とく上澄み液Ｉを調製しＨＳＡ発現を分析する。ＨＳＡ
発現率は可溶性タンパク質の〜０．１チであった。
とく上澄み液Ｉを調製しＨＳＡ発現を分析する。ＨＳＡ
発現率は可溶性タンパク質の〜０．１チであった。
ＭＤプレート上のレプリカ平板コロニーをＭＭプレート
上へ複表することによｊ）Ｈｉｓ＋形質転換体プールを
またスクリーニングする。いくつかのＨｉ ｓ”−メタ
ノールに対して鈍い形質転換体がＭＧＹ上で増殖し、Ｍ
Ｍへ移された。実施例■に記載したごとく細胞抽出物を
調製しＨＳＡ発現率を分析した。ＩＳＡの水準は２０ｍ
１／ｌまたは全可溶性細胞タンパク質の２俤まで上昇し
ている事が検出された。、 実施例■ Ｎａ ｚｃＯｓ／Ｎａ ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９，５）
に溶解した５０μｌの１ ： ５００ヤギ−抗−Ｈ
ＳＡ抗体を９０穴ＥＬＩＳＡ プレート（コーニング
）の穴に置き３７℃にて１時間インキュベートする。
上へ複表することによｊ）Ｈｉｓ＋形質転換体プールを
またスクリーニングする。いくつかのＨｉ ｓ”−メタ
ノールに対して鈍い形質転換体がＭＧＹ上で増殖し、Ｍ
Ｍへ移された。実施例■に記載したごとく細胞抽出物を
調製しＨＳＡ発現率を分析した。ＩＳＡの水準は２０ｍ
１／ｌまたは全可溶性細胞タンパク質の２俤まで上昇し
ている事が検出された。、 実施例■ Ｎａ ｚｃＯｓ／Ｎａ ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９，５）
に溶解した５０μｌの１ ： ５００ヤギ−抗−Ｈ
ＳＡ抗体を９０穴ＥＬＩＳＡ プレート（コーニング
）の穴に置き３７℃にて１時間インキュベートする。
２度ＴＢＳＴ、２度ｄＨ２０で洗浄し、各々に２００μ
ｌのプロット緩衝液を添加し、その後３７℃にて一夜イ
ンキユペートする。インキュベーション後、再びＴＢＳ
Ｔで３度、ｄＨ２０で２度洗浄し、各々に５０μｌの試
料を加える（保存ＨＳＡ溶液＝＝ ５ Ｘ １０７ｎｇ
／’ ；標準溶液＝２〜１４ｎｇ／−ル試料は室温にて
２時間回転し、その後ＴＢＳＴで５度、ｄＨ２０で２度
洗浄し、５０μｌの１ ： ２０００希釈の西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ−結合ヤギに−ＨＳＡ抗体〔クーパー
バイオメゾカル社（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ、 Ｉｎｃ、 ） ）のブａｙト緩衝液溶液（５μｌ
！／ｌｏｇＬｔ）を添加する。プレートを再び室温で１
時間振とうした後ＴＢＳＴで３度、ｄＨ２０て３度洗浄
し、１００μｌのＡＢＴＳ（ＡＢＴＳ ペルオキシダー
ゼ基質溶液、キルケガードアンドペリーラボラトリー社
）を室温に暖めて添加する。最後に、室温で試料を２０
分間振とうし、反応を停止するために各々に１００μｌ
の２チシユウ酸を添加し、４０５ｎｍの吸光度な記録す
る。
ｌのプロット緩衝液を添加し、その後３７℃にて一夜イ
ンキユペートする。インキュベーション後、再びＴＢＳ
Ｔで３度、ｄＨ２０で２度洗浄し、各々に５０μｌの試
料を加える（保存ＨＳＡ溶液＝＝ ５ Ｘ １０７ｎｇ
／’ ；標準溶液＝２〜１４ｎｇ／−ル試料は室温にて
２時間回転し、その後ＴＢＳＴで５度、ｄＨ２０で２度
洗浄し、５０μｌの１ ： ２０００希釈の西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ−結合ヤギに−ＨＳＡ抗体〔クーパー
バイオメゾカル社（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ
ｌ、 Ｉｎｃ、 ） ）のブａｙト緩衝液溶液（５μｌ
！／ｌｏｇＬｔ）を添加する。プレートを再び室温で１
時間振とうした後ＴＢＳＴで３度、ｄＨ２０て３度洗浄
し、１００μｌのＡＢＴＳ（ＡＢＴＳ ペルオキシダー
ゼ基質溶液、キルケガードアンドペリーラボラトリー社
）を室温に暖めて添加する。最後に、室温で試料を２０
分間振とうし、反応を停止するために各々に１００μｌ
の２チシユウ酸を添加し、４０５ｎｍの吸光度な記録す
る。
第１図は、プラスミドｐＡＯ８０４の図解であム第２図
（＆）はｐＡＯ８０４の直線地図を提供している。 第２図（ｂ）は約４５８塩基対のｆｌ−ｏｒｉを含、
むｐＡＯ８０４の誘導体ｐＡＯ８０７の直線地図を提供
している。 第２図（ｃ）はｐＡＯ８０７のＢｇｌＩＩ部位の代わり
にＮｏｔＩ 部位を持つｐＡ０８０７Ｎの直線地図を
提示している。 第２図（ｄ）は特異的ＥｃｏＲＩ 部位にＨＳＡ遺伝
子が挿入されたｐＡＯ８０７Ｎ の直線地図であるｐＨ
ＳＡ１１３の直線地図を提供している。 第３図はｐＡ０８０７Ｎを円形城で示している。 第４図はＮＲＲＬＢ−１８１１５の自律性酵母プラスミ
ドＤＮＡのＥｃｏＲＩ 消化、ゲル電気泳動および６．
２ｋｂ ＥｃｏＲＩ フラグメント固状によるプラ
スミドｐＴＨＦＫΔを示している。 第５図はｐＴＨＦＫΔの特異的ＥｃｏＲＩ 部位に挿入
されたＨＳＡ遺伝子を含むｐＴＨＦＫΔの誘導体である
ｐＨ３Ａ１３を示している。 代理人 弁Ｂ± 湯 浅 恭 三１ 。 １−−−−−＋ （外４名） 図面の浄書（内容に変更なし］ ｒｔ Ｉ 手続補正書ω゛肉 １．事件の表示 平成１年特許願第１０５７３０号 ２、発明の名称 メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現
３、補正をする者 事件との関係 特許用１領人 住所 名 称 フィリップス・ベトロリウム◆カンパニー４
、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６区 ５、 ｌ’ｉｔｉ正命令の日付 ｑｉ成 １年 ７月
２５日 （発送臼）６、補正の対象 出１帳人の代表者基を記載した願書
（＆）はｐＡＯ８０４の直線地図を提供している。 第２図（ｂ）は約４５８塩基対のｆｌ−ｏｒｉを含、
むｐＡＯ８０４の誘導体ｐＡＯ８０７の直線地図を提供
している。 第２図（ｃ）はｐＡＯ８０７のＢｇｌＩＩ部位の代わり
にＮｏｔＩ 部位を持つｐＡ０８０７Ｎの直線地図を
提示している。 第２図（ｄ）は特異的ＥｃｏＲＩ 部位にＨＳＡ遺伝
子が挿入されたｐＡＯ８０７Ｎ の直線地図であるｐＨ
ＳＡ１１３の直線地図を提供している。 第３図はｐＡ０８０７Ｎを円形城で示している。 第４図はＮＲＲＬＢ−１８１１５の自律性酵母プラスミ
ドＤＮＡのＥｃｏＲＩ 消化、ゲル電気泳動および６．
２ｋｂ ＥｃｏＲＩ フラグメント固状によるプラ
スミドｐＴＨＦＫΔを示している。 第５図はｐＴＨＦＫΔの特異的ＥｃｏＲＩ 部位に挿入
されたＨＳＡ遺伝子を含むｐＴＨＦＫΔの誘導体である
ｐＨ３Ａ１３を示している。 代理人 弁Ｂ± 湯 浅 恭 三１ 。 １−−−−−＋ （外４名） 図面の浄書（内容に変更なし］ ｒｔ Ｉ 手続補正書ω゛肉 １．事件の表示 平成１年特許願第１０５７３０号 ２、発明の名称 メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現
３、補正をする者 事件との関係 特許用１領人 住所 名 称 フィリップス・ベトロリウム◆カンパニー４
、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６区 ５、 ｌ’ｉｔｉ正命令の日付 ｑｉ成 １年 ７月
２５日 （発送臼）６、補正の対象 出１帳人の代表者基を記載した願書
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）作動可能なごとく制御領域および３′終止配列
に結合されているヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の構造
遺伝子を含む少くとも１つの発現カセットを持つ少くと
も１つのベクターでＣ＿１資化性酵母を形質転換し；お
よびその後 ｂ）適切な条件下で得られた形質転換体酵母株を培養し
て前記ＨＳＡタンパク質の産生を得ることからなるＨＳ
Ａの生産方法。 ２、前記ベクターがプラスミドまたは線状組込み部位−
特異的ベクターからなる群より選択される特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、ベクターが線状組込み部位−特異的ベクターである
特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記線状組込み部位−特異的ベクターが下記の連続
的配置： ａ）第１の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 ｂ）少くとも１つのマーカー遺伝子および制御領域およ
び３′終止配列と作動可能なごとく結合したＨＳＡの構
造遺伝子を含む少くとも１つの発現カセット、および ｃ）第２の挿入可能ＤＮＡフラグメント を含み、その際成分（ｂ）のマーカー遺伝子およびカセ
ットの順序は交換してもよい、特許請求の範囲第３項記
載の方法。 ５、第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントおよび第２の挿
入可能ＤＮＡフラグメントが￥ピキア￥・￥パストリス
￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離
される遺伝子のＤＮＡ配列から誘導され、かつ￥ＡＯＸ
１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥から成
る群より選択される特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記発現カセットが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥
ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離される￥ＡＯＸ１￥、ｐ
４０、￥ＤＨＡＳ￥、￥サッカロミセス￥・￥セレビシ
エ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ￥）から単離される酸性ホスファターゼ、ガラ
クトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロ
ムＣ、アルファー交配因子およびグリセルアルデヒド３
−リン 酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される、下記成
分（ｂ）に作動可能なごとく結合されている制御領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構造遺伝子、および ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
遺伝子および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離される３′終
止配列からなる群より選択される￥ピキア￥・￥パスト
リス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）由来
の３′終止配列からなる、特許請求の範囲第４または５
項記載の方法。 ７、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス￥
（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離さ
れる￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥、￥サツカロミセ
ス￥・￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）から単離されるＳＵＣ２
および￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のＧ４１８
＾Ｒ遺伝子からなる群より選択される、特許請求の範囲
第４、５または６項記載の方法。 ８、前記ベクターが ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離された５′￥ＡＯＸ１￥制
御領域の約１キロベースである下記成分（ｂ）に作動可
能なごとく結合された第１の挿入可能ＤＮＡフラグメン
ト、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構成遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）と結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）下記成分（ｅ）に結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＨＩＳ４￥である少くとも１つのマー
カー遺伝子、および ｅ）３′￥ＡＯＸ１￥終止配列の約０．６５キロ塩基で
ある第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントを含んでいる特
許請求の範囲第５、６または７項記載の方法。 ９、プラスミドが自律性複製ＤＮＡ配列およびマーカー
遺伝子を含む、特許請求の範囲第２項記載の方法。 １０、前記発現カセットが ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐ
ａｓｔｏ−ｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥、ｐ
４０、￥ＤＨＡＳ￥、￥サツカロミセス￥・￥セレビシ
エ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ￥）から単離された酸性ホスファターゼ、ガラ
クトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロ
ームＣ、アルファー交配因子およびグリセルアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択され、
下記成分（ｂ）に作動可能なごとく結合されている制御
領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構造遺伝子、および ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、 ￥ＤＨＡＳ￥遺伝子および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離
される３′終止配列からなる群より選択される￥ピキア
￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ￥）からの３′終止配列を含む特許請求の範囲第９
項記載の方法。 １１、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス
￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離
された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥、￥サツカロミ
セス￥￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）から単離されたＳＵＣ２
および￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のＧ４１８
＾Ｒ遺伝子から成る群より選択される特許請求の範囲第
９または１０項記載の方法。 １２、前記プラスミドが ａ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合された￥ピ
キア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔ
ｏ−ｒｉｓ￥）から単離された５′￥ＡＯＸ１￥制御領
域、ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されて
いるＨＳＡの構造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）と結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）少くとも１つのマーカー遺伝子、および ｅ）０．１９キロベースである第２のＤＮＡフラグメン
トが自律性複製ＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第９、
１０または１１項記載の方法。 １３、前記マーカー遺伝子が￥ＨＩＳ４￥である特許請
求の範囲第９項記載の方法。 １４、下記の連続的配置： ａ）第１の挿入可能ＤＮＡフラグメント ｂ）少くとも１つのマーカー遺伝子および作動可能なご
とく制御領域および３′終止配列に結合された少くとも
１つの発現カセット、および ｃ）第２の挿入可能ＤＮＡフラグメント； を含み、 ただしマーカー遺伝子および成分（ｂ）のカセットの順
序は交換してもよい、線状組込み部位−特異的ベクター
。 １５、前記第１の挿入可能ＤＮＡフラグメントおよび前
記第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントが￥ピキア￥・￥
パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥
）から単離された遺伝子のＤＮＡ配列から誘導され、お
よび￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩ
Ｓ４￥から成る群より選択される特許請求の範囲第１４
項記載のベクター。 １６、前記発現カセットが、 ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥、ｐ４
０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥、￥サツカロミセ
ス￥￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥
￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）から単離された酸性ホスフ
ァターゼ、ガラクトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、チトクロムＣ、アルファー交配因子およびグルセ
ルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼから成る群よ
り選択される、下記成分（ｂ）に作動可能なごとく結合
されている制御領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構造遺伝子、および ｃ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥遺伝子
、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子および￥ＨＩＳ４
￥遺伝子から単離される３′終止配列から成る群より選
択された３′終止配列を含む特許請求の範囲第１４また
は１５項記載のベクター。 １７、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥￥パストリス￥
（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離さ
れた￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥；￥サツカロミセ
ス￥￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥
￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）から単離された￥ＳＵＣ２
￥および細菌￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のＧ
４１８＾Ｒから成る群より選択される特許請求の範囲第
１４、１５または１６項記載のベクター。 １８、前記ベクターが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥
ｐａｓ−ｔｏｒｉｓ￥）から単離された約１キロベース
の長さの５′￥ＡＯＸ１￥遺伝子の作動可能な制御領域
であり、下記成分（ｂ）に作動可能なごとく結合されて
いる第１の挿入可能ＤＮＡフラグメント、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）に結合されている￥ピキア￥￥パス
トリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）か
ら単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）下記成分（ｅ）に結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＨＩＳ４￥である少くとも１つのマー
カー遺伝子、および ｅ）３′￥ＡＯＸ１￥終止配列の約０．６５キロベース
である第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントを含む特許請
求の範囲第１４項記載のベクター。 １９、ａ）Ｃ＿１資化性酵母中で複製可能な自律性複製
配列 ｂ）少くとも１つのマーカー遺伝子 ｃ）作動可能なごとく制御領域および３′終止配列に結
合されたＨＳＡの構造遺伝子を含む少くとも１つの発現
カセットを含むプラスミド。 ２０、前記発現カセットが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥
ｐａｓｔ−ｏｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥、
ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥、￥サツカロ
ミセス￥・￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓ￥）から単離された酸性
ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、アルコールデヒド
ロゲナーゼ、チトクロムＣ、アルファー交配因子、およ
びグルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼから
成る群より選択され、下記成分（ｂ）に作動可能なごと
く結合されている制御領域、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡの構造遺伝子、および ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥
ｐａｓｔｏ−ｒｉｓ￥）から単離された￥ＡＯＸ１￥遺
伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、￥ＨＩＳ４
￥遺伝子から単離される３′終止配列から成る群より選
択された３′終止配列を含む特許請求の範囲第１９項記
載のベクター。 ２１、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス
￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離
された￥ＨＩＳ４￥、および￥ＡＲＧ４￥；￥サツカロ
ミセス￥￥セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓ￥）から単離された￥ＳＵ
Ｃ２￥および細菌性￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１
￥のＧ４１８＾Ｒから成る群より選択される特許請求の
範囲第１９または２０項記載のベクター。 ２２、ベクターｐＨＳＡ１３。 ２３、作動可能なごとく３′終止配列に結合したＨＳＡ
構造遺伝子に作動可能に結合した制御領域からなる少く
とも１つの発現カセットを含む少くとも１つのベクター
で形質転換されたＣ＿１資化性酵母。 ２４、酵母が￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈ
ｉａ￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）である特許請求の範囲第２
３項記載のＣ＿１資化性酵母。 ２５、酵母が￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈ
ｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）株ＧＳ１１５である特許
請求の範囲第２３項記載のＣ＿１資化性酵母。 ２６、ａ）第１の挿入可能ＤＮＡフラグメント、ｂ）下
記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合された、少くとも
１つのマーカー遺伝子およびＨＳＡの構造遺伝子を含む
少くとも１つの￥ピキア￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥）適合性
発現カセット、ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐ
ｉｃｈｉａ￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から単離された￥Ａ
ＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子お
よび￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離される３′終止配列か
らなる群より選択される３′終止配列、および ｄ）第２の挿入可能ＤＮＡフラグメント を含み、但し、成分（ｂ）のマーカー遺伝子およびカセ
ットの順序は交換してもよい、連続的配置を持つ少くと
も１つの線状組込み部位−特異的ベクターで前記ＧＳ１
１５を形質転換する特許請求の範囲第２５項記載の￥ピ
キア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５。 ２７、前記ベクターが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥
ｐａｓｔｏ−ｒｉｓ￥）から単離された５′￥ＡＯＸ１
￥制御領域の約１キロベースであり、下記成分（ｂ）に
作動可能なごとく結合されている第１の挿入可能ＤＮＡ
フラグメント、 ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されている
ＨＳＡ構造遺伝子、 ｃ）下記成分（ｄ）に結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）下記成分（ｅ）に結合されている￥ピキア￥・￥パ
ストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）
から単離された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子、ｅ
）３′￥ＡＯＸ１￥終止配列の約０．６５キロベースで
ある第２の挿入可能ＤＮＡフラグメントからなつている
特許請求の範囲第１７項記載の線状部位特異的組込みベ
クター。 ２８、￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥
￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５／ｐＨＳＡ１１３。 ２９、前記ＧＳ１１５が前記線状組込み部位特異的ベク
ターの１つ以上のコピーで形質転換されることを特徴と
し、特許請求の範囲第１７項のごとく形質転換される￥
ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５。 ３０、ａ）￥ピキア￥￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ
￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）中で複製可能な自律性複製配
列、ｂ）少くとも１つのマーカー遺伝子、 ｃ）作動可能な状態で制御領域および３′ 終止配列に結合されているＨＳＡの構造遺伝子を含む少
くとも１つの発現カセットから成る少くとも１つのプラ
スミドで前記ＧＳ１１５が形質転換される特許請求の範
囲第２５項記載の￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉ
ｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５。 ３１、￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥
￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５／ｐＨＳＡ１１３。 ３２、表１に記載された配列であるＨＳＡをコードする
ヌクレオチド配列。
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| US186420 | 1988-04-25 |
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