JPH01165386A - 遺伝子操作による抗凝固性タンパク質ｐｐ４の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗凝固性タンパク質ＰＰ４は、ＤＥ−Ａ第３．３１５，
０００号（Ｕ　Ｓ　−Ａ第４　、５０７　、２２９号）
明細書に次のパラメーターとともに記載されている。

電気泳動移動度：α１とα２グロブリンとの間部電点：
４．８ｉ５±０．１５ 沈降係ｆｃｓ　　　＝３．３±０．２Ｓ２０、−讐 分子量［ソシウムドデシルサルフエイト＜ＳＯＳ＞を含
むポリアクリルアミドゲルで決定コニ３５．０００±５
，０００ 吸光係数（ｅｘｔ、１ｎｃｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉ
ｅｎｔ）　：Ｅ　ｒ　ｃｍ　（２８０ｎｍ　）＝５．９
±０．６炭水化物含有量：２．４±０．９４％（ｇ／１
００ｇ）（マン／−ス０．３：！＝０．２％、ガラ’）
Ｉ−−ス０．４±０．２％、キシロース０．１　＋０．
０４％、グルコース０．２±０．１％、グルコサミン１
．０±０．２％、／　イラミンｉ９０　、４　”−０、
２％　）アミノ酸組成ニ アミノ酸　　１００残基当りの残基数　　偏差係数（モ
ル％） リジン　　　　　　　　６．９５　　　　　　１．１４
ヒスチジン　　　　　　０．９７　　、　　　　１７．
４アルギニン　　　　　　５．４４　　　　　　１．７
７アスパラギン酸　　　１１．４１　　　　　　１．（
ｉ８トレオニン　　　　　ｔ３．７Ｂ　　　　　　　２
．４０セリン　　　　　　　６．２１　　　　　２．２
６グルタミン酸　　　　！２．２５　　　　　　０．４
３プロリン　　　　　　　１．９６　　　　　　６．２
０グリシン　　　　　　６．６８　　　　　　３．８３
アラニン　　　　　　７．９２　　　　　　１．Ｇ７シ
スチン　１／２　　　　０．７？　　　　　　１９．５
バリン　　　　　　　５．３４　　　　　３．８０メチ
オニン　　　　　　１．９８　　　　　　　（ｉ、ｏ。

イソロイシン　　　　５．２１　　　　　　２．２３０
イシン　　　　　　１１．５０　　　　　　０．４５チ
ロシン　　　　　　３．５５　　　　　　４．２１フエ
ニルアラニン　　４．０？　　　　　　　３．７７トリ
ブトフアン　　　０．９３　　　　　２３．９ＰＰ４は
、独国特許出願第ρ３６４３１８２．（３号明細書に提
示されているようにトロンボプラスチン段階において血
液凝固を可逆的に阻害し、心筋梗塞の間または後および
種々の悪性腫瘍の場合に高いｉ温度で現れる。

治療上および診断的な関心はもちろん、このタンパク質
の抗凝固的性質の故に、遺伝子操作による製造が強く望
まれる。したがって、本発明は、ＰＰ４の遺伝子操作に
よる製造法、これに必要なｍ　ＲＮ　Ａ、これによって
得られるｃＤＮＡ、　　このｃＤＮＡの全部または部分
を含むベクターおよびＤＮＡ構造物（５ｔｒｕｃｔｕ　
ｒｅｓ）、そのようなりＮＡによって形質転換された細
胞、およびこれらの細胞によって発現されたポリペプチ
ドに関する。本発明は、さらに、ＰＰ４のアミノ酸配列
の部分配列物、これらによって得られる特異抗体、これ
ら抗体から調製される診断補助物および抗体カラム、お
よびそのようなカラムを用いて得られるポリペプチドに
関する。本発明のさらなる様相は、ＰＰ４をコードする
ＲＮＡまたはＤＮＡ、　　またはこれらの相補物、の全
部または一部を含む診断補助物、およびそのような診断
補助物を用いて体液および組織を調べる診断的方法に関
する。本発明のさらなる様相は、以下に詳細に説明され
、特許請求の範囲に定義される通りである。

部分的アミノ酸配列物およびこれらから派生する適当な
オリゴヌクレオチドプローブを得るために、タンパク質
ＰＰ４を臭化シアン断片に切断した。これら断片の二つ
（それぞれ４１個および４４個のアミノ酸から成る）の
配列決定を行った。

次のような配列が見出された。

ＰＰ４オリゴペプチドＡ 門にＧＬＧＴＤＥＥＳ　ＩＬＴＬＬＴｓＲｓＮ　ＡＱＲ
ＱＥＩＳＡＡＦＫＴＬＦＧＲＤＬＬＤ　Ｄ ＰＰ４オリゴペプチドＢ ＭＬＶＶＬＬＱＡＮＲＤＰＤＡＧＩＤＥＡＱ　ＶＥＱＤ
ＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＸＧＴＤＥ　ＥＫＦ＋ Ｒ，Ｌａｔｈｅ　　［，１，Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　困
（１９８５）　１−１２］の統計的データに基づいて、
オリゴペプチドＡから３５個および３６個の塩基をそれ
ぞれ有する二つのオリゴヌクレオチド ＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡ　ＴＧＡＧ
ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴ（ＰＰ４オリゴヌクレオチド１
２５） および ＣＡＧＧＡＧＡＴＣＴ　ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴ　ＣＡＡ
ＧＡＣＣＣＴＧ　ＴＴＴＧＧＣ（ＰＰ４オリゴヌクレオ
チド１９７） を、また、オリゴペプチドＢから４８個の塩基を有する
配列物 ＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧ　ＣＴにＧＣＡＴＴＧＡ　ＴＧＡ
ＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧ　ＡＴＧｃＣＣＡ
Ｇ（ＰＰ４オリゴヌクレオチド１９８） を選択した。

これらオリゴヌクレオチドプローブを成熟ヒト胎盤から
のｍ　ＲＮ　Ａから調製しておいたｃＤＮＡバンクのス
クリーニングに用いた。ｍ　ＲＮ　Ａをまず胎盤から分
難して、そこからｃＤＮＡを調製した。後者にＥｃｏＲ
Ｉ末端を付して、ファージベクター人ｇｔｌｏのＥｃｏ
ＲＩ切断部位に連結した。上記のプローブを用いて同定
しておいた４６個のクローンをさらに分析した。既知の
方法にて配列決定して、ＰＰ４をコードするＤＮＡ配列
を明らかにした。

第１図はＰＰ４をコードするＣＤＮＡ配列の制限酵素地
図を示す。　「Ｎ」はＮ末端を表し、　ｒＣＪはコード
領域におけるＣ末端を表し、　［Ａ（３７）Ｊは３７個
の塩基のポリ−（Ａ）配列を表す。ＣＤＮＡ配列は、Ｐ
Ｐ４の完全なコード配列を表す。表１は、一つのクロー
ンについて、見出されたＤＮＡ配列（コード鎖）および
それに対応するアミノ酸配列を示すものである。完全な
ｃＤＮＡは、１５７５塩基対（ｂｐ）の長さで、かつ９
６９ｂｐの転写解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆ
ｒａｍｅ）を有する。塩基番号１８８と２２２との間、
２５７と２９２との間および５９０と６３７との間にそ
れぞれハイブリダイズする３個のオリゴヌクレオチドプ
ローブの位置が、表１に下線で示されている。

本発明によれば、適当な発現システムを利用してコード
ｃＤＮＡを用いてＰＰ４を発現させることが可能である
。さらに、宿主の選択によってＰＰ４の修飾のタイプに
影響を及ぼすことができる。これまでのところでは、細
菌中では糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きな
いが、一方、酵母細胞で起きる糖化は高等真核細胞にお
けるものとは異なる。

ＰＰ４のアミノ酸配列が解ると、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体の製造のための抗原として用い得る
アミノ酸部分配列物を従来法または遺伝子操作法によっ
て調製することができる。

そのような抗体は、診断的用途だけでなく、抗体カラム
の調製にも用いられる。そのようなカラムによって、Ｐ
Ｐ４を他のタンパク質とともに含む溶液からＰＰ４を分
離することか可能である。

また、ＰＰ４をコードし、真核細胞中での発現を促進し
、さらには診断的結論をも導くことができるようなゲノ
ムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用いてゲノム
バンクから簡単な方法て単離することも可能である。

本発明は、さらに、特許請求の範囲に定義され、以下の
請訓に詳細に説明される通りである。

上記で説明したものの池に、次の略語を用いる。

ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム５ＤＳ＝
ソジウムドデシルサルフエ−１・ＤＴＴ＝ジチオスレイ
トール ＢＳＡ＝ウシ血ｉ青アルフ゛ミン 桝上 １、ヒト胎盤からのＲＮＡの単λＷ ＲＮ　Ａを成熟ヒト胎盤から得た（　Ｃｔｌｉ　ｒｙ、
ｕ　ｉ　ｒｒらの方法：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
比（１９７９）　５２９Ｌ５２９９）。杓ｌｏｇの胎盤
組織を乳鉢で消体窒素中で破砕し・て、０．１Ｍメルカ
プトエタノールを含む８０ｍ１の４さ／Ｉグアニジンチ
オシアネー１・中にＱｉさせて、次いでホモジナイザー
（ｔＪＩ　ｔｒａｔｕｒｒａｘ）て２０，０００１・ｐ
ｍで９０秒間処理した。破砕物を７．０００　ｒｌ＋ｍ
て１５分間遠心分ｉｆｆ　（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡロ
ーター）して、上清を２ｍｌの１Ｍ酢酸および６０ｍ１
の純エタノールで一２０°Ｃて一晩で沈澱させた。核酸
を６．０００ｒｐｍで一１０℃にて１０分間で沈澱させ
て、次いて４０ｍ１の７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７
，０）に完全に溶Ｍｌ−ｃ、ｌ　ｍｌ＋７）　Ｉ　ＭＷ
ｖ酸と２０ｍ１の純エタノールとの混合液で沈澱させた
。

ＤＮＡを除去するために、各容量を半分にして沈澱処理
をもう一度繰り返した。ＲＮＡを１２１のＨ２Ｏに溶解
して、１．２ｍｌの４Ｍ酢酸カリウムと２４ｍ１の純エ
タノールとの混合液で沈澱させて、最後にこの沈澱を再
び１０ｍ１のＨ２Ｏに入れた（組織１ｇ重量当り１　ｍ
ｌ）。

２、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ　ＲＮ　Ａの調製ポリ（Ａ
）を含むｍ　ＲＮ　Ａを得るために、胎盤ＲＮＡを２ｍ
ｌのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロー
スクロマトグラフィー［ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ：　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　ｕ（１９７３）　１４０８−１４１２１でＬｉＣ１
にて分画した。緩衝液１　　［６００ｍＭ　Ｌ　ｉｃ　
ｌ、２０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、
０．１％ＳＤＳ］に溶解した約５ｍｇの胎盤ＲＮＡをカ
ラムにかけた。ポリ（Ａ）”　ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）
−セルロースと結合したが、ポリ（Ａ）　−ＲＮＡを再
び溶出することができた。緩衝液２　［１００ｍＭ　Ｌ
：　ｉｃ　１．２９ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ。

０．１％ＳＤＳ］で洗浄処理した後に、ポリ（Ａ）”　
ＲＮＡ　（胎盤ｍＲＮＡ）を緩衝液３［５ｍＭ）リス（
１）Ｈ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳコ
にてカラムから溶出させた。

ざらに精製するために、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを緩衝液
１に調整して、再びオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマ
トグラフに供した。この第二精製工程の後の胎盤ポリ（
Ａ）”　ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４％だった
。

３、ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）および二
本鎖ｃ　Ｄ　ＮＡ　（ｄｓＤ　ＮＡ）の合成ｃＤＮＡ合
成の前に、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ　’ＲＮ　Ａの全体
を１．５％アガロースゲルで調べた。

次いて、４μ８の胎盤ｍ　ＲＮ　Ａを６５．５μｌの）
Ｔ２Ｏに溶解して、７０°Ｃにて１０分間変性させて、
再び水中で冷却した。

これに、２０　／ｌＩのＲＴｉ緩衝液［２５０ｍＭ）リ
ス（ｐ）ｉ８．２．４２℃）、２５０ｍＭＫＣｌ、３０
ｍＭ　ＭｇＣＩ　２　］、２．５μｌの２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ（全４種類のデオキシヌクレオシド三燐酸）、１μｍ
の１１１ｇ／ｍｌのオリゴ（ｄ　Ｔ）、１μｍのＩＭ　
ＤＴＴ、２　／２１のＲＮＡ５ｉｎおよび８　／ｌｌの
逆転写酵素（２４Ｕ／μｍ）を加えて１００７１１の混
合液にして、その後、４２℃で９０分間てｃＤＮＡを合
成した。

二本鎖ｃ　Ｄ　ＮＡ　（ｄｓＤ　ＮＡ）をＧｕｈｌｅｒ
およびＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｅｎｅ　２５　（１
９８３）　２６３−２６９）にて合成した。合成は、ｃ
ＤＮＡ合成の直後に、３０５．５７１１のＨ２Ｏ，８０
μｍのＲＴ２緩ｊｌ液［１００ｍＭ）リス（ｐＨ７，５
）、２５ｍＭＭｇＣＩ２　　、　　５００ｍＭ［＜ＣＩ
　　、　　　５０ｍＭＤＴＴ。

２５０　μｇ／ｍｌＢ　ＳＡコ、　２１１１のＲＮａ５
ｅＨ（２Ｕ／　ｔｌｌ　）、２．５μｍの大腸菌ＤＮＡ
リガーゼ（５Ｕ／　Ｉｔ　Ｉ　）、５μｍの１５ｍＭβ
−ＮＡＤ、および５７１１のＤＮＡポリメラーゼＩ　（
！５Ｕ／μｍ）を添加して、１５℃で５時間インキュベ
ートして行った。反応を加熱不活化（７０°Ｃ１３０分
間）によって終結させた。

５５μｍ０２５０ノＩＭｄＮＴＰ、５’５７１１の１０
ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．
１０７１３／＋ｎｌＢ　Ｓ　Ａ、３μｍのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（１０／１１１）、２μｍのＲＮａｓｅＨ
（２Ｕ／１１１）および２μｍのＲＮａ５ｅＡ　（２７
１ｇ／ｍｌ）を反応混合液に添加した後、３７゛Ｃでさ
らに３０分間インキュベートして二本口のＤＮＡＮ玉鎖
上ける合成が完全であるようにした（「修復反応」）。

４、　　ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結、お
よびリンカ−の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、ｄｓＤＮＡにＥ
ｃｏＲＩ末端を付して、ファージｌ＼クター人ｇｔｌｏ
のＥｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［
Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：（１９８２）　、　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒコ。この目的のために、ｄｓＤＮＡを、 ａ）ｄｓＤ　Ｎ　Ａの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ｂ）ＥｃｏＲ
Ｉリンカ−を付して、 Ｃ）次いで、これらリンカ−をＥｃｏＲＩで開裂した。

ａ）に関して： ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応を、修復反応に続いて直ち
に、２５μｍの５００ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８゜０）
、６０　μ＋（７）メチラーゼ緩衝ｉ１　（１００ｍＭ
Ｎａ０Ａｃ　（ｐＨ５，２）、２ｍｇのＳ−アデノシル
−し−メチオニン）および２１１１のＥｃｏＲＩメチラ
ーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた後、３７℃で３０分間イ
ンキュベートして行った。

反応混合物をフェノールで抽出して、ｄｓＤＮＡを６０
μｍの４ＭＮａ０Ａｃおよび１３００　／ｌＩのエタノ
ールで沈澱させた。ｄｓＤＮＡを７０％エタノールで２
回洗浄して、エーテルと１回振盪して抽出して、乾燥さ
せた。

ｂ）に関して： ＥｃｏＲＩメチル化ｄｓＤＮＡを、８８μｍのＨ２Ｏに
溶解して、１０μｍのリガーゼ緩衝液［５００ｍＭ）リ
ス（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＭｇＣ１２，１０８ｍＭ
ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＭＡＴＰ、１　
ｍｇ／　ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ’］および１７１１（７）Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（ＩＯＵ／μｍ）を加えた後に、１μ
ｍのＥｃｏＲＩリンカ−（０，５ｕｇ／μ１）（Ｉ）Ｇ
ＧＡＡＴＴＣＣおよびｐＧＣ；ＡＡＴＴＣＴ）と１５℃
にて一晩で連結させた。

Ｃ）に関して： リガーゼ混合物の容量を、６μｍのＨ２Ｏ，１２μｍの
１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液および２μｍのＥｃｏＲＩ　　
（１２０Ｕ／μｌ）で１２０　μＩにした。

ＥｃｏＲＩ消化を３７℃にて２時間で行った。

５、酢酸カリウム勾配による非結合リンカ−の除去、お
よびｄｓＤＮＡの大きさによる選択ＥｃｏＲＩ反応混合
物を酢酸カリウム勾配（５〜２０％Ｋ　ＯＡ　ｃ、Ｉｎ
＋ＭＥＤＴＡ、１１１１／ｍ１臭化エチジウム）に供し
て、５０，０００ｒｐｍで２０℃にて３時閉遠心分離（
ベックマンＳＷ６５０−ター）することによって、すべ
ての非結合ＥｃｏＲｆリンカ−をｄｓＤＮＡがら除去し
た。

勾配流出物を、最初の５画分を５００μｍずつ、後はす
へて１００７７１ずつを計量して下から分画した。画分
を０．Ｏ１容量のアクリルアミド（２ｍｇ／ｍｌ）およ
び２．５容量のエタノールで沈澱さすで、７０％強度の
エタノールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５　Ｉｔ
　ｌの８２０に入れた。

ｄｓＤＮＡの大きさを決めるために、各両分の１７１１
を１．５％のアガロースゲル中で分析した。

さらに、ｄｓＤＮＡの量を各両分のｌ１１１を用いて決
定した。

１０００１）ｌ）以上のｄｓＤＮＡを含む両分を合わせ
て、その試料を最終濃度２７μ８７ｍ１になるまで濃縮
した。

６、ファージベクターλｇ　ｔ　１０　ヘのｄｓＤＮＡ
の挿入、およびインビトロ組み入れ（ｐａｃｋａｇ　ｉ
　ｎｇ）反応 ｄｓＤＮＡを４μＩのリガーゼ混合物中でファージベク
ター人ｇ　ｔ　１０　（＼’ｅｃｔｏｒ　ＣＩｏｎｉｎ
３　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）
のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。

リガーゼ混合物は２７１１のｄｓＤ　ＮＡ、　　１７ｚ
　Ｉの入ｇｔｌＯＸＥｃｏＲＩ　（１μｇ／ｍｌ）、０
．４７１１（７）リガーゼ緩衝液、０．５７ｚｌ（７）
　Ｈ２０゜０．１μｍのＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼか
らなる。混合物を１５℃で４時間インキュベートした。

ファージベクター人ｇｔｌＯ中に胎盤ｃＤＮＡバンクを
確立するために、次いでリガーゼ混合物をλ清涼性細胞
抽出物（大腸菌Ｎ５４２８およびＮ５４３３）とのイン
ビトロ組み入れ反応に室温で２時間供した（Ｖｅｃｔｏ
ｒ　ＣＩｏｎｉｎ３５ｙｓｔ、ｅｍｓ、　ＳａｎＤｉｅ
ｇｏ、ＣＡ％Ｅｎｑｕｉｓｔおよびｓｔｅｒｎｂｅｒｇ
：　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｆｉ
ｆｌ（１９７９）　２８１−２９８）。反応を５００μ
１（７）懸濁培地［ＳＭ：　０．１ＭＮａＣｌ、８　ｍ
ＭＭ　ｇ　ＳＯ２，５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、０
、Ｏ１％ゼラチンコおよび２滴のクロロホルムで終結さ
せた。

７、胎盤ｃＤＮＡバンクの力価決定および分析大腸菌１
（１２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントにした細胞を用
いて決定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成ユニッ
）　（ＰＦＵ）の数は、Ｉ　Ｘ　１０６ＰＦＩＪであっ
た。全ファージの約８０％が１０００ｂｐより大きいＤ
ＮＡ挿入物を含んでいた。

８、胎盤ｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのオリ
ゴヌクレオチドプローブ 胎盤ｃＤＮＡバンクの分析のために三つのオリゴヌクレ
オチドプローブを合成した。それらの配列は、ＰＰ４の
二つの臭化シアン断片から得た。

構築の方法および二つのプローブの使用は主にＲ，Ｌａ
ｔｈｅ　（前出）の方法に従った。

三つのオリゴヌクレオチド配列物の５゛末端をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ　
［約１）１ｇのＤＮＡ（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ：３　θ　
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　、　１０７１Ｃｉ／　μ　ｌ　、
　６　μ　１／４０μｍの反応混合物とともに用いるコ
の存在下でラベルした。プローブの比活性は、Ｉ　Ｘ　
１０８Ｂｑ／７ｚ１７ｒなわちＩ　、　５　Ｘ　１０８
Ｂｑ／　ｐｍｏｌであワた。

９、ＰＰ４−特異性オリゴヌクレオチドによる胎盤ｃＤ
ＮＡのスクリーニング Ｉ　Ｘ　１０６ＰＦｔＪの胎盤ｃＤＮＡを、ＰＰ４オリ
ゴヌクレオチドプローブ１２５．１９７および１９日を
合わせて調べた。この目的のために、３ＸＩＯ’ＰＦＵ
を、軟寒天中の大腸菌■（１２Ｃ６００ＨＦ　Ｌ株の細
胞とともに１３．！５ｃｎ＋のベトリ皿上にプレートし
て、３７℃で６時間インキュベートシた。この時、溶菌
はまだ不完全だった。

プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートして、ファー
ジをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ、ＢＡ　８５、Ｒｅｆ、　Ｎｏ、
４０１１２４）に移した（デユープリケード）。ニトロ
セルロースフィルターおよびベトリ皿には、注射針を用
いて後ｇ′）照合のために印を付した。ニトロセルロー
スフィルターの処理の間、べ１・り皿を冷蔵庫に保存し
た。ニトロセルロースフィルター上のＤ　Ｎ　Ａを１．
５ＭＮａＣ１および０．５ＭＮａ○［−ｆに浸した濾紙
（〕７ツトマンＭ　３　）上にフィルターを５分間置く
ことによって変性させた。次いてフィルターを同様にし
Ｔ１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍトリス（ｐＨ８，０）を
用いてもとに戻して、２×５ＳＰＥ　（０，３６Ｍ　Ｎ
ａＣＬ　　１６ｍＭ　ＮａＯＨ１２０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｈ
２ＰＯ４，２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。次いてフィル
ターを８０℃にて２時間真空中で乾燥した。フィルター
を３ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ　（２０ＸＳＳＣ＝３Ｍ
　ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）中で６５”
Ｃにて４時間洗浄して、６５°Ｃにて４時間プレハイブ
リダイセージョンさせた［プレハイブリダイゼーション
溶液二〇、（３ＭＮａＣ１，０，０６Ｍトリス（ｐＨ８
，３）、６ｍＭＥＤＴＡ、０，２％非イオン性合成シュ
ークロースポリマー（ＲＦｉｃｏｌｌ）、０．２％ポリ
ビニルピロリドン４０．０．２％ＢＳ八、０．１％ＳＤ
Ｓ、；ｙ　０７１ｙ、ｌ　ｍＩｆ性ニシン精子ＤＮＡ］
。

フィルターに、！、ｎｌのハイブリダイゼーション溶ｌ
夜にシン端子Ｄ　Ｎ　Ａを含まないブレハイブリｙイセ
ーシｊン、盲薔ｌ）当；）ｉ０３．０００〜２００．０
００ＢＱのラベルし・た万すゴスクレオチドを加えて、
これをビーカーまたは封をしたポリエチレンフィルム中
で静かに振盪しながら一晩インキユヘートした。ハイブ
リダイゼーションの温度は４４′Ｃまたζよ５２℃であ
った。二ｌ・ロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ：、
０．０５Ｍピロ燐酸ナトリウムで室温で１時間、それぞ
れのハイブリダイゼーション温度でさらに１時間洗浄し
た。フィルターを乾燥させて、−晩オーＩ・ラジオグラ
フに洪した。Ｘ線フィルムの両デユープリケードに現れ
たシグナルをベトリ皿に照合して、対応領域（約５０プ
ラーク）をパスツールピペットの広い先端で切り出して
、ファージをＬｌのＳＭ緩衝イαに再懸濁させた。陽性
の７７−ジを３回のサイクルで単離して、単一のクロー
ンを得た。

全部で、Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ’１）ＦｔＪの胎盤ｃＤＮＡバ
ンクを調べた。５４個のシグナルをデユープリケードフ
ィルター上で同定した。さらに個々のプローブでスクリ
ーニングを行うことによって、１８個のクローンがすべ
てのプローブと反応することが判明した。　　これら１
８個のクローンはすべてＰＰ４コ一ド配列を有しており
、クローンＰ　Ｐ　４／４は最長の１５７５ｈｐを有す
る。

表２に、オリゴヌクレオチド配列１２５．１９７および
１９８と見出されたＰＰ４配列とを比較して示す。

１０、ＤＮＡ配列分析 ファージクローンＰ　Ｐ　４／２０、ＰＰ４／１４およ
びＰＰ４／４を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した
。各場合に、ＥｃｏＲＩ断片を単離して、ＢＩｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＭ　１３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ
部位に連結して、Ｓａｎｇｅｒの酵素的ジデオキシ法を
用いて制限酵素分析および配列分析を行った。配列は、
転写解読枠および最大３２０個のアミノ酸を有するタン
パク質のコードを示す。

１１、　　抗凝固性タンパク質ＰＰ４の発現ｐＴｒｃ９
Ｂ−１（欧州特許出願第ＥＰ０２３６９７８号明細書）
をＢｇｌＩＩによって直線状にして、突出末端をクレノ
ウボリメラーゼで埋填して、次いでホスファターゼで消
化した。プラスミドＰ１ａｃＩ’（［讐ａｎｇら：　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ、　Ｑｕ
ａｎｔ−Ｂｉｏｌ、　１２　（１９８３）　８５−９１
）をＥｃｏＲＩで消化して、突出末端を同様にクレノウ
ボリメラーゼで埋填して、完全な１ａｃＩ’を対立形質
（ａｌｌｅｌｅ）　　［Ｃａ１ｏｓ：　Ｎａｔｕｒｅ　
２Ｌ１（１９７８）７６２−７６５］を有する約１１ｋ
ｂの断片を上記の直線状ｐＴｒｃ９Ｂ−ＩＤＮＡに連結
させた。得られたプラスミド（ｔｒｃプロモーターの一
つと同一の１ａｃＩ’遺伝子転写方向を有する）は、ｐ
Ｔｒｃ９０−３であった。ｐＴｒｃ９０−３の配列は４
１３４ｂｐを含む。ｐＴｒｃ９０−３をＮｃｏｌおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、大きい断片を合成オリゴヌ
クレオチドＡ、　　ＢまたはＣの一つと三つの別々の反
応で連結させた。

オリゴＡ　　　５’ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴ
ＡＡＧＧＣＴＴＣＧＡ　５’ オリゴＢ　　　５’ＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＴ
ＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡ　５’ オリゴＣ５’ＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴ
ＡＡＧＣＴＴＣＧＡ　５’ 次いで、大腸菌に１２株Ｗ３１１０１ａｃＩ４のコンピ
テントにした細胞を形質転換した。得られたプラスミド
、ｐＴｒｃ９８Ａ（オリゴＡ）、ｐＴｒｃ９８Ｂ（オリ
ゴＢ）およびｐＴｒｃ９８Ｃ（オリゴＣ）、をＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、大きい断片をそれ
ぞれ単離して、これを市販のベクターｐＵｃ１Ｂからの
５５ｂρのポリリンカー断片と連結させた［Ｙａｎｉｓ
ｔｒＰｅｒｒｏｎら：　Ｇｅｎｅ　３，３（１９８５）
　１０３−１１９１゜得られたプラスミドは、ｐＴｒ　
ｃ９９Ａ　（４１７６ｂｐ）、ｐＴｒｃ９９Ｂ　（４１
７７ｂｐ）およびｐＴｒ　ｃ９・９Ｃ（４１７８ｂｐ）
である。オリゴヌクレオチドＡ、　　ＢおよびＣを連結
によって加えたために、これらベクターはＮｃｏＩとＥ
ｃｏＲＩ部位との間で１塩基ずつ異なっており、したが
って翻訳解読枠にシフトがある。内生性１ａｃリプレツ
サーを持たない大腸菌株を発現に用いる場合には、発現
ベクター（ｐＴｒｃ９９シリーズ）上の１ａｃｌｃｉの
存在は有利である。また、その存在は、発現されたタン
パク質が大腸菌宿主細胞に毒性であって、そのためにク
ローニングにおいて早期増殖相で完全な抑制が要求され
るような場合にも常に有利である。

本例では、非融合成熟ＰＰ４タンパク質の大腸菌におけ
る発現に、ベクターｐＴｒｃ９９Ａを用いた。ＰＰ４ｃ
ＤＮＡの開始コードンにおけるＤＮＡ配列は、次のよう
に解読される。

Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ ５’、、、ＧＴＡＧＴＣＧＣＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡ
Ｇ　ＧＴＴ　、、、　３’ＡＴＧの位置にＮｃｏＩ部位
が無いことから、このＤＮＡを直接にｐＴｒｃ９９Ａ発
現ベクターにクローニングすることは不可能である。　
しかし、ＰＰ４ｃＤＮＡ配列中の１個の塩基を交換する
（「Ｔ」から「Ｃ」へ）ことによってＮｃｏ１部位を作
出することができる（５′Ｃ工ＡＴＣ；Ｇ３’→５’Ｃ
ΩＡＴＣ；Ｇ３’）。

ＰＰ４構造配列の二番目のコードンがｒＧＪで始まるた
めに、二番目のアミノ酸（Ａ　ｌ　ａ）はこの操作によ
って影響されない。実際に突然変異を行うために、ＰＰ
４クローンＰＰ４−４から１４　Ｇ　２　ｂ’ｐのＥｃ
ｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄｍ断片を単離して、同様にＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［Ｉで切断しておいた突然変
異用（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ベクターｐＭａ５−８
に連結させた。突然変異用ベクター１）　Ｍ　ａ　５−
８は、細菌の複製開始点および抗生物質耐性マーカーの
１也にクローニングに適したポリリンカー領域および一
木鎖バクテリオファージＦｌの復製ｉ…始点を有してい
る。最後に記した性質によって、−本領のクローン化Ｐ
Ｐ４ｃＤＮＡの単離および次のようなオリゴデオキシヌ
クレオチドを用いるｒｅａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌ　ｏｆｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＪ　　［
Ｋｒａｍｅｒら：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　１２（１９８４）　９４４１−９４５６］の適用が可
能になる。

５’　ＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＴＡＣ
ＴＣＴＡＧＧ　３’目的のＮｃｏｌ突然変異を有するク
ローンを制限酵素分析で同定して、ｐＭａ５−８−ＰＰ
４−Ｎｃｏ　Ｉと命名した。このプラスミドから１３０
５ｂｐのＮｃｏｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離して、対
応するように切断しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａに
連結させた。得られたプラスミドｐＴｒ’ｃ９９Ａ−Ｐ
Ｐ４は５４２５　ｂｐからなり、ｔｒｃプロモーターの
誘導の後、約３５ｋＤの非融合ＰＰ４タンパク質を発現
する。全細胞タンパク質の約５％が可溶性ＰＰ４タンパ
ク質からなる。

それは、抗ＰＰ４抗血清と特異的に反応するが、抗ＰＰ
４−Ｘ抗血清とは反応しない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係るＰＰ４をコードするｃＤＮＡ配
列の制限酵素地図を示す、説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗凝固性タンパク質ＰＰ４をコードし、表１に示さ
   れたコード鎖を含む、ＤＮＡ配列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅ
   ）。 ２、請求項１に記載のＤＮＡと緊縮条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｏｎｓ）下でハイ
   ブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ。 ３、表１に示されたアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ
   配列物。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む、遺伝子構造物（ｇｅｎｅ　ｓｔｒｕｃｔ
   ｕｒｅ）。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む、ベクター。 ６、請求項１〜４のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む、形質転換細胞。 ７、遺伝子操作によって得られ、かつ表１に示されたア
   ミノ酸配列を有する、ＰＰ４。 ８、請求項１、３または４（ただし請求項４は請求項１
   および３のみに係る）のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ
   の発現系への挿入、およびそこでの発現、から成る、Ｐ
   Ｐ４の製造法。 ９、ＰＰ４に特異的であって、かつ遺伝子操作によって
   製造されたＰＰ４、または抗原活性を有するその部分、
   から得た、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １０、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡの全
   部または部分を含む、診断補助物。 １１、請求項１に記載のＤＮＡと相補的な、ＤＮＡまた
   はＲＮＡの、全部または部分を含む、診断補助物。 １２、請求項９に記載の抗体を含む、診断補助物。 １３、体液、組織またはそれらから分離した核酸を請求
   項１０〜１２のいずれか１項に記載の診断補助物と接触
   させることからなる、診断法。 １４、請求項８に記載の方法で製造したＰＰ４を含む、
   医薬物。