PT88912B

PT88912B - Processo de engenharia genetica para a preparacao da proteina anticoagulante pp4

Info

Publication number: PT88912B
Application number: PT88912A
Authority: PT
Inventors: Hans Kupper; Ulrich Grundmann; Karl-Josef Abel
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-11-03
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1993-01-29
Also published as: JPH01165386A; DK610288D0; EP0318703A1; PT88912A; DE3737239A1; AU2458988A; DK610288A; FI885024A; KR890008317A; FI885024A0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A proteína PP4, anticoagulante, encontra-se descrita na DE-A 33 15 000 (US-A 4,507,229)» pelos parâmetros seguintes!

- uma mobilidade electroforêtica na zona situada entre as glo bulinas alfa., e alfa_»

X a — um ponto isielêctrico de 4,85ÍO,15i — um coeficiente de sedimentação s_or4 de 3,3^O,2Sj

2w ,W — um peso molecular de 35 000Í5 000 determinado num gel de po liacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS)j

- um coeficiente de extinção E^ (280 nm) de 5»9ÍO,6j icm

- um teor em hidratos de carbono de 2,4^0,94% (g/100 g) (mano se 0,3+0,2¾} galactose 0,4+0,2¾} xilose 0,1+0,2¾} ãcido neu raminico 0,4i0,2%) e

- 1 τ

-- a seguinte composição em aminoácidos:

Aminoácido

Grupo por 100 grupos (% molar)

Coeficiente de variaçao

Lisina	6,95	1,14
Histidina	0,97	17,4
Arginina	5 ,44	1,77
Acido asparaglnico	11,41	1,68
Treonina	6,78	2,40
Serina	6,21	2,26
Acido glutâmico	12,25	0,43
Prolina	1,96	6,20
Glicina	6,68	3,83
Alanina	7,92	1,67
1/2 cistina	0,77	19>5 .
Valina	5,34	3,80
Metionina	1,98	6,00
Isoleucina	5,21	2,23
Leucina	11,50	0,45
Tirosina	3»55	4,21
Fenilalanina	4,07	3,77
Triptofano	0,93	23,9

A PP4 inibe a coagulaÇao do sangue de forma reversível no passo da tromboplastina, como mencionado no registo de patente alemao P 36 43 182.6 e surge em concentrações elevadas durante e apôs os enfartes de miocèrdio bem como em vários tumores malignos.

Devido às propriedades inibitórias da coagula çao do sangue que esta proteína apresenta bem como ao seu interesse terapêutico e diagnóstico ê altamente desejável um processo de preparaçao por engenharia genetica. A invenção re fere-se sucessivamente a um processo para a preparaçao genêti ca da PP4, ao mRNA para tal necessário, ao cDNA dai obtido, às estruturas de DNA e dos vectores contendo parcial ou total mente este cDNA? às células transformadas com este DNA e ao polipêptido expresso a partir destas células. A invenção refe re-se ainda às sequências parciais dos aminoácidos da PP4*aos anticorpos específicos com elas obtidos? aos meios de diagnós tico preparados a partir desses anticorpos? às colunas de anticorpos a partir deles obtidos? bem como ao-polipêptido pre«tf parado utilizando essas colunas. Um outro aspecto da invenção refere-se a meios de diagnóstico que contêm total ou parcialmente o DNA ou o RNA ou os seus complementares que codificam a PP4, e a processos de diagnóstico com os quais se analisam líquidos corporais e tecidos utilizando os referidos meios de diagnóstico. Outros aspectos da invenção esclarecem-se mais em pormenor no que se segue ou definem-se nas reivindicações da patente.

Para a preparaçao de sequências de aminoácidos parciais e de sondas de oligonucleótido apropriadas delas derivadas? decompos-se a proteina PP4 em fragmentos bromociano? a partir dos quais se sequenciaram dois fragmentos (4l ou 44 aminoácidos). Determinaram-se as seguintes sequências»

PP4—oligopêptido A

MKGLGTDEES ILTLLTSRSN AQRQEISAAF KTLFGRDLLD D

PP4-oligopêptido B

MLWLLQANR DPDAGIDEAQ VEQDAQALFQ AGELKXGTDE EKFI

A partir do oligopêptido A escolheram-se dois oligonucleótidos de 35 ou 36 bases

ATGAAGGGCC T6GGCACAGA TGAGGAGAGC ATCCT (PP4-oligonucleÓtido 125) e

CAGGAGATCT CTGCTGCCTT CAAGACCCTG TTTGGC (PP4-oligonucleótido 197) e a partir do oligopêptido B uma sequência com 48 bases GACCCTGATG CTG6CATTGA TGAGGCCCAG GTGGAGCAGG ATGCCCAG (PP4—oligonucleótido 198) de acordo com os dados estatísticos de R. Lathe (J. Mói· Biol.

(1985), 183, 1-12)

Com estas sondas de oligonucleôtido efectuou—se a selecção (Screening) de um banco de cDNA preparado a partir de placenta humana madura. Em primeiro lugar idolou-se o mRNA a partir da placenta e a partir daí preparou-se o cDNA. Introduziram-se neste extremos EcoRl e ligou-se na posição de corte EcoRl do fagovector )$tlO. Analizaram-se posteriormente 46 clonos identificados com as sondas anteriormente mencionadas. A sequenciaçao de acordo com métodos em si conhecidos re velou a sequência de DNA que codifica para a PP4.

A figura mostra a carta de restrição da sequência de cDNA que codifica a PPa. ”N” assibala o rerminal azotado, ”C” o terminal de carbono da zona de codificação, A(37)ⁿ a sequência de poli-(A) com 37 bases. A sequência de cDNA representa a sequência codificante total da PP4. A tabela 1 apresenta a sequência de DNA determinada (cadeia codificante) e a sequência de aminoácidos de um clono dela derivada. 0 cDNA total tem um comprimento de 1575 pares de bases e uma ordem de leitura aberta de 969 pares de bases. Na tabela 1 en ** Λ contram-se marcadas as posiçoes das tres sondas de oligonucle ôtido que hibridizam entre as posiçoes 188 a 222, 257 a 292 ou 590 a 627.

TABELA 1

30 50

GCCCCGCGTACCGTCGCCCGGCTCTCCGCCGCTCTCCCGGG6GTTCG6GGCACTTGGGTC

90 110

CCACAGTCTGGTCCTGCTTCACCTTCCCCTGACCTGAGTAGTCGCTATGGCACAGGTTCT

Μ A Q V L

I30 I50 170

CAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGAT6AGCGGGCTGATGCACAAACTCTTC6 RGTVTDFPGFDERADAQTLR

I9O 210 23O

GAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAG6AGAGCATCCTGACTCTGTTGACATCCCG KAMKGLGTDEESILTLLTSR

250 270 290

AAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGTTTGGCAGGGATCT

SNAQRQEISAAFKTLFGRDL

310 33O 35O

TCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTAATTGTGGCTCTGAT

LDDLKSELTGKFEKLIVAL&

370 390 4lO

GAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTGAAGGGA6CTGGAAC

KPSRLYDAYELKHALKGAG T

430 450 470

AAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAAGAACTGAGAGCCAT

NEKVLTEIIASRTPEELRAI

49O 510 53O

CAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGACGTGGTGGGGGACAC

KQ VYEEEYGSSLEDDVVGDT

55O 570 590

TTCAGGGTACTACCAGCG6ATGTTG6TGGTTCTCCTTCAGGCTAACAGAGACCCTGATGC

SGYYQRMLVVLLQANRDPDA

610 630 65O

TGGAATTGATGAAGCTCAAGTTGAACAAGATGCTCAGGCTTTATTTCAGGCTGGAGAACT

GIDEAQVEQDAQALFQAGEL

67O 69O 710

TAAATGGGGGACAGATGAAGAAAAGTTTATCACCATCTTTGGAACACGAAGTGTGTCACA

KWGTDEEKFITIFGTRSVSH

730 750 770

TTTGAGAAAGGTGTTTGACAAGTACAGTACTATATCAGGATTTCAAATT6AG6AAACCÁT

LRKVFDKYMTISGFQIEETI

790 810 83O

TGACCGCGAGACTTCTGGCAATTTAGAGCAACTACTCCTTGCTGTTGTGAAATCTATTCG

DRETS GNLEQLLLAVVKS IR

85O 870 890

AAGTATACCTGCCTACCTTGCAGAGACCCTCTATTATGCTATGAAGGGAGCTG6GACAGA

SIPAYLAETLYYAMKGAGTD

910 930 950

TGATCATACCCTCATCAGAGTCATGGTTTCCAGGA6TGA6ATTGATCTGTTTAACATCAG

DH TLIRVMVSRSEIDLFNIR

970 990 1010

GAAGGAGTTTAGGAAGAATTTTGCCACCTCTCTTTATTCCATGATTAAGGGAGATACATC

KEFRKNFATSLYSMIKGDTS

IO3O 1050 1070

TGGGGACTATAAGAAAGCTCTTCTGCTGCTCTGTGGAGAAGATGACTAACGTGTCACGGG

GDYKKALLLLCGEDD

1090 1110 1130

GAAGAGCTCCCTGCTGTGTGCCTGCACCACCCCACTGCCTTCCTTCAGCACCTTTAGCTG

II50 II70 II90

CATTTGTATGCCAGTGCTTAACACATTGCCTTATTCATACTA6CATGCTCATGACCAACA

1210 I23O I25O

CATACACGTCATAGAAGAAAATAGTGGTGCTTCTTTCTGATCTCTAGTGGAGATCTCTTT

I27O I29O I3IO

GACTGCTGTAGTACTAAAGTGTACTTAATGTTACTAAGTTTAATGCCTGGCCÀTTTTCCA

I33O I35O 1370

TTTAfATATATTTTTTAAGAGGCTAGAGTGCTTITAGCCTTTTTTAAAAACTCCATTTAT

I39O 1410 1430

ATTACATTTGTAACCATGATACTTTAATCAGAAGCTTAGCCTT6AAATTGTGAACTCTTG

1450 1470 1490

GAAATGGTATTAGTGAAGTTCGCAACTAAACTAAACCTGTAAAATTATGATGATTGTATT

1510 I53O 1550

CTTTAGATTAATGAAAAATAAACATTTCT6TCCCCCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

1570

AAAAAAAAAAAAAAA

De acordo com a invenção, pode utilizar-se o cDNA codificante para exprimir a PP4, através de sist-emas de expressão adequados. Por meio da escolha do hospedeiro pode ainda influenciar-se a forma da modificação da PP4. Deste modo, nao ocorre em bactérias mas sim em células de levedura uma glicosilaçao diferente da que ocorre em células eucariéticas superiores.

Conhecendo a sequência de aminoácidos da PP4 é possível, através de métodos convencionais ou de tecnologia genética, preparar sequências parciais de aminoácodos que podem servir como antigenes para a preparaçao de anticorpos po— liclonais ou monoclonais. Tais anticorpos podem servir nao sé para fins de diagnóstico, mas também para a preparaçao de co«V lunas de anticorpos, com as quais se pode efectuar a separaçao da PP4 a partir de soluçoes que a contêm para além de outras ptoteinas.

Utilizando o cDNA ou partes deste pode também,

- 6 •fc.

de um modo simples, isolar-se o clono genómico que codifica para a PP4, a partir de um banco genómico, com o qual nao só se facilita uma expressão em células eucarióticas, como também se podem encontrar outras vias de diagnóstico.

Alêm disso, a invenção encontra-se definida nas reivindicações da patente e mais esclarecida nos exemplos que se seguem.

Salvo indicaçao em contrário no texto, utilizam- se as seguintes abreviaturas:

EDTA s etilenodiaminotetraacetato de sódio

SDS = dodecilsulfato de sódio

DTT = ditiotreitol

BSA = albumina de soro de vitela

Exemplos:

i. Isolamento de RNA a partir de placenta humana

Obteve-se RNA a partir de placenta humana madura (segundo Chirgwin et al. , Biochemistry 18 (1979) 5292 - 5299)· Trituraram-se cerca de 10 g de tecido de placenta em azoto líquido, suspenderam-se em 80 ml de tiocianato de guani dinio 4M com mercaptoetanol 0,1 M e trataram—se durante 9θ se gundos a 20000 rpm num homogeneizador (Ultraturrax). Centrifu gou-se o lisado durante 15 minutos a 7000 rpm (centrífuga Sor vali — GSA) e precipitou—se a camada sobrenadante com 2 ml de ácido acético I M e 60 ml de etanol absoluto, a — 2E?C durante a noite. Após sedimentação a 6000 rpm e -10°C durante 10 minu tos, dissolveram-se completamente os ácidos nucleicos em 40 ml de cloridrato de guanidinio 7»5 M (pH 7»0) e precipitaram-se com uma mistura de 1 ml de ácido acético 1 M e 20 ml de eta— nol absoluto. Para a separaçao do DNA repetiu—se a precipitação mais uma vez com metade do volume. Dissolveu-se o RNA em 12 ml de H0, precipitpu-se com uma mistura de 1,2 ml de acetato de potássio 4 M e 24 ml de etanol absoluto, sedimentou—se

e finalmente tomou-se de novo em 10 ml de H^O (l ml por g de tecido).

2. Obtenção de mRNA de placenta contendo poli(A)

Para a obtenção de mRNA contendo poli (A), se parou-se o RNA de placenta por meio de cromatografia em oligo (dT)-celulose (Aviv e Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1973)5 l4O8—1412) em pipetas Pasteur de 2 ml com LiCl. Aplicaram-se à coluna cerca de 5 mg de RNA de placenta em tampao 1 (500 mM-LiCl, 20 mM Tris (pH 7,5)) 1 mM EDTA, 0,1% SDS). En quanto que o poli (A)⁺-RNA ficava ligado à oligo (d‘T)-celulose, continuava a eluir—se o poli (A) —RNA. Apés uma operaÇao de lavagem com tampao 2 (100 mM LiCl, 29 mM Tris (pH 7)5)) 1 mM EDTA, 0,1% SDS) eluiu—se da coluna o poli (A)⁺—RNA (mRNA de placenta) com tampao 3 (5 mM Tris (pH 7)5) ) 1 mM EDTA, 0,05% SDS).

A»

Para posterior purificação colocou—se o poli (A) -RNA em tampao 1 e cromatografou-se novamente sobre oligo ( dT)-celulose. Apés este segundo passo de purificação, oren dimento em poli(A)⁺—RNA de placenta foi de cerca de 4% do SNA aplicado.

3· Síntese de cDNA a partir de placenta humana (cDNA de placenta) e de cDNA de cadeia dupla (dsDNA)

Antes da síntese do cDNA testou-se a composição Intacta do mRNA de placenta contendo Poli(A) num gel de agarose a 1,5%·

Em seguida dissolveram-se 4 p.g de mRNA de pia centa em 65,5 ^il de HgO' , desnaturaram-se durante 10 minutos a 70°C, e arrefeceram-se, em seguida, em gelo. A síntese do *** cDNA efectuou-se num volume de 100 pl, apés adiçao de 20 jil de tampão RT^ (250 mM Tris (pH 8,2) a 42°C, 25O mM KC1, 30 mM HgClg) , 2,5 p-l de dNTP 20 mM (isto ê, todos os quatro trifos- 8 fatos de desoxinucleÔsido), 1 /il de oligo(dT) de 1 /ig/ml, l/il de DTT 1 Mj 2 p.1 de RNAsina e 8 /il de transcriptase reversa (24 U//il) , durante 90 minutos a 42° C.

Sintetizou-se cDNA de cadeia dupla (ds DNA) de acordo com Gubler e Hoffmann (Gene 25 (19^3) 263-269). A síntese efectuau-se imediatamente a seguir à síntese do cDNA por adiçao de 3θ5>5 /il de HgO, 80 JíL de tampao RT^ (100 wM Tris (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 500 mM SCI, 50 mM DTT, 250 /ig/ml BSA), /il de RNAse H (2 U/^il) , 2j5 /til de DNA ligase de E. coli (5 U//il), 5 /il de /3-NAD 15 mM e 5 /il de DNA polimerase I (5 U/p.1) e incubaçao durante 5 h a 15°C. Terminou-se a reacçao por meio de inactivaçao térmica (70°Cj 30 minutos).

Apôs adição de 55 /il de dNTP 250 f&í, 55 jil de Tris 10 mM (pH 7j5)j 10 mM HgC^, 10 /ig/ml de BSA, 3 /il de DNA polimetase T4 1(1 U//il), de RNase H (2 U//il) e 2 /il de RNase A (2 /ig/ml) , incubou-se a mistura reaccional durante mais 30 minutos a 37°C, de modo a garantir que a síntese da segunda cadeia de DNA fosse completa (Repair Reaction”).

4. Ligaçao de lincantes EcoRI ao dsDNA e abertura dos lincan— tes

Para a construção de um banco de cDNA de placenta proveu-se o dsDNA com extremos EcoRI, para ser possível *** ligê-lo na posição de corte EcoRI do fagovector Agt 10 (T. Ma niatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, cold Spring Marbor). Com este objectivo

a) tratou-se o dsDNA com EcoRI-metilase, para proteger as posições de corte EcoRI internas,

b) proveu-se o dsDNA com lincantes EcoRI, que

c) se abriram em seguida com EcoRI.

a) A reacçao de metilase do dsDNA efectuou-se directamente a seguir à Repair Reaction, apôs adiçao de 25 /il de EDTA 500 mM (pH 8,0), 6,0 jul de tampao de metilase (100 mM r 9,

NaOAc (pH 5,2), 2 mg de S— adenosil-O-metionina) e 2 p.1 de EcoRI-metilase (20 U/jul), por meio de incubaçao a 37 C durante 3θ minutos.

Extraiu-se a mistura reaccional com fenol e precipitou-se o dsDNA com 60 ul de NaOAc 4 M e 1300 ul de etanol. Lavou-se o dsDNA duas vezes com etanol a 70% agitou-se uma vez com êter e secou-se.

b) Dissolveu-se o dsDNA metilado em E CoRI em 88 p± de H₂0 e ligou-se, apês adiçao de 10 pl de tampao de ligase (500 mM Tris (pH 7Λ), 100 níM MgCl , 100 mM DTT, 10 mM espermidina, 10 mM ATP, 1 mg/ml de BSA) e 1 jul de DNA ligase T4 (IOU/jiI) com 1 jtil de lincantes EcoRI (0,5 yig/ml) (pGGAATTCC ou pAGAATTCT), durante a noite a 15°C.

c) Ajustou-se o volume da mistura de ligase a 120 pl com 6 ^ul de H^O, 8® 10x tampao EcoRI e 2 jp.1 de EcoRI (120 U/ . ** o ul). Seguiu—se a digestão por EcoRI durante 2 horas a 37 C.

A*

5· Separaçao de lincantes nao ligados por meio de gradientes de acetato de potássio e selecçao de tamanhos do dsDNA

Para a separaçao de todos os lincantes EcoRI nao ligados a partir do dsDNA submeteu-se a mistura reaccional EcoRI total a um gradiente de acetato de potássio (5-20% KOAc, 1 mM EDTA, 1 jil/ml brometo de etídio) e centrifugou-se durante 3 horas a 5θ 000 rpm a 20° C (centrífuga Beckman SVí— —65)· 0 gradiente fraccionou-se de modo a que as primeiras cinco fracções fossem de 5θθ pl ® as restantes de 100 pl· As fracções precipitaram-se com 0,01 volumes de acrilamida (2 mg/ ml) e 2,5 volumes de etanol, lavaram-se uma vez com etanol a 70%, secaram-se e tomaram-se, cada uma, em 5 /il he H^O.

Para a determinação de tamanhos do dsDNA anaArf ft/ lisaram-se 1 jul de cada fracçao num gel de agarose a 1,5%· Alêm disso, determinou-se a quantidade de dsDNA com I pl de ft/ cada fracçao.

í\ hl

Reuniram-se as fracçoes com dsDNA superior a 1000 bp (pares de bases) e concentrou—se a amostra de modo a que a concentração final fosse de 27 ^ig/ml.

- *** . **

6. Introdução do dsDNA no fagovector Aftt 10 e reacçao in vi— tro packaging

A introdução do dsDNA na posição de corte EcoRI do fagovector )sgt 10 (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) efectuou-se numa mistura reaccional de ligase de 4/xl: 2 jui de deDNA, I jul de /gt 1θ^χ EcoRI (1 /ig/ml), 0,4 de tamAl pao de ligase, 0,5 yul de Η^Ο, θ’·*· /**· ligase T4. Incubou-se a mistura durante 4 horas a 15 C.

Para o estabelecimento do banco de cDNA de placenta no fagovector XgtlO, efectuou-se com os extractos ce lulares Λ—lisogênicos E. coli NS42Ô e NS433 uma reacçao in vitro packaging da mistura reaccional de ligase, à temperatu ra ambiente durante 2 horas (Vector Cloning Systems, San Diego, CAJ Enquist e Sternberg, Methods in Enzymology .68, (1979), 28ΐ-29θ)· Terminou-se a reacçao com 5θθ }il de meio de suspensão (SM: 0,1 M NaCi, 8 niM MgSO^, 50 mM Tris (pH 7,5), 0,01% gelatina) e 2 gotas de clorofórmio.

7· Determinação do título e análise do banco de cDNA de placenta número das Plaque Forming Units (PFU) do banco de cDNA de placenta determinou-se com células adequadas da estirpe E. coli K 12 CÔOO HFL: o seu valor foi de 1x10 ^PFU.

Al

Cerca de 80% de todos os fagos continham inserções de DNA superiores a 1000 pares de bases.

8. Sondas de oligonucleótido para o Screening do banco de cDNA de placenta

Sintetizaram—se três sondas de oligonucleóti— do para análise do banco de cDNA de placenta. As suas sequên- 11 r ·,

cias derivaram-se das sequências de aminoácidos de dois fragmentos bromociano da PP4.

tipo da construção e a utilização das sondas efectuou—se segundo as regras de R. Lathe, como acima referido.

As três sequências de oligonucleótido marcaram-se no extremo 5' com polinucleotidoquinase T4 na presença de (t-³²P)ATP (cerca de 1 jug de DNA (f-³²P)ATP: 30θθ Ci/mmol), 10 p.Ci/p.1} empregaram-se 6 jil/4(yil de mistura reaceional). As sondas tinham uma actividade específica de ΙχΙΟθ Bq/^il ou de l,5xiO⁶ Bq/pMol.

9· Screening¹¹ do cDNA de placenta com oligonucleótidos específicos da PP4

Tesyaram-se 1x10 PFU do banco de cDNA de pia centa com as sondas de oligonucleótido da PP4 125, 197 e 198.

,

Para isso colocaram-se 3x10 PFU com células da estirpe E. co li K 12 CóOO HFL em agar macio sobre caixas de Petri de 13,5 cm e incubaram-se durante 6 horas a 37°C. Nesta altura nao ti nha ainda ocorrido qualquer lisagem completa. Incubaram-se as placas durante a noite no frigorífico e colocaram-se os fagos sobre filtros de nitrocelulose (duplicatas) (fíchleicher 8c SchU.il, BA 85, Ref. NS 401124). Marcaram-se os filtros de ni— trocelulose e as caixas de Petri com uma canula de injecção de modo a permitir um ordenamento posterior. Armazenaram-se as caixas de Petri curn compartimento frio durante o processamento dos filtros de nitrocelulose. Desnaturou-se o DNA conti do sobre os filtros de nitrocelulose, colocando—se os filtros durante 5 minutos sobre papel de filtro (Whatman-M3) embebido em 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH. Em seguida, renaturaram-se os filtros do mesmo modo com 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris (pH 8,0) e lavaram- se com 2x SSPE (0,36 M NaCl, 16 niM NaOH, 20 mM NaH^PO^, mM EDTA). Secaram-se então os filtros durante 2 horas a 80 C em vácuo. Lavaram-se os filtros durante 4 horas a Ó5°C em

3xSSC, 0,1% SDS (20xSSC=3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio) e pró-hibridizaram-se durante 4 horas a 65^oC (solução de prê—hibridaÇaoí 0,6 M NaCl, 0,06 M Tris (pH 8,3)» 6 mM EDTA, 0,í% de polimero de sacarose sintético nao iÓnico (^Ficoll), 0,2% polivinilpirrolidona 40, 0,2% BSA, 0,1% SDS, 5θ ug/ml de DNA de esperma de arenque desnaturado). Incubaram—se os filtros durante a noite com adiçao de 100 000-200 000 Bq do oligonucleôtido marcado por ml de solução de hibridaÇao (como a solu Çao de pré—hibridaÇao, contudo sem DNA de esperma de arenque) em copos de vidro ou em películas de polietileno humedecidos, sob agitaçao ligeira. A temperatura de hibridaÇao foi de 44 C ou 52°C. Lavaram-se os filtros de nitrocelulose com 6xSSC, 0,05 M piro fosfato de sódio, durante 1 hora a. temperatura ambiente e durante mais uma hora à temperatura·da hibridaÇao em causa. Secaram-se os filtros e autoradiografaram-se durante a noite. Os sinais na película de raios X que apareciam em ambas as duplicatas, reuniram-se na caixa de Petri e removeu-se a região (cerca de 5θ áreas) com o extremo largo de uma pipeta de Pasteur e ressuspenderam-se os fagos em 1 ml de tampao SM. Reuniram—se os fagos positivos durante três operaçoes sucessivas atê se obter um único clono.

Testou-se um total de ΙχΙΟθ PFU do banco de cDN3 de placenta. Identificaram—se 54 sinais sobre os filtros duplicados. Por meio de uma nova selecçao (screening) com as sondas individuais mostrou—se que 18 clonos reagiam com to das as sondas. Todos os 18 clonos continham uma sequência codxficante para a PP4 com um comprimento máximo de 1575 pares de bases para o clono PP4/4.

A comparaçao das sequências de oligonucleóti— dos 125, 197 θ 198 com a sequência de PP4 determinada encontra—se resumida na Tabela 2.

Tabela 2

Sequência da PP4 vs. oligonucleotido 125 da PP4

151 TGATGAGCGGGCTGATGCACAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGG 200

.....................................ATGAAGGGCCTGG 13

201

GCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACTCTGTTGAO*TCCCGAAGTAATGCT I II11II II11111IIII1 111

GCACAGATGAGGAGAGCATCCT............................

25O

Sequência da PP4 vs. oligonucleÔtido 197 da PP4

251 CAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGTTTGGCAGGGATCT 300 )HI í-l I IJII | ι-ιι-ιι-ι nu II

...... CAGGAGATCTCTGCTGCCTTCAAGACCCTGTTT6GC........ 36

Sequência da PP4 vs. oligonucleÔtido 193 da PP4 • · · · ·

551 TACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGGCTAACAGAGACCCTGATGC 600 II I 111 I N I I

1.......................................GACCCTGAT6C 11 • · · · *

601 TGGAATTGATGAAGCTCAA&TTGAACAAGATGCTCAGGCTTTATTTCAGG 650 l|| II |l 11II II || II ll II UIU III

TGGCATTGATGAGGCCCAGGTGGAGCAGGATGCCCAG............. 48

10· Análise sequencial do DNA

Multiplicaram-se os fagoclonos PP4/2O, PP4/14 e PP4/4 e extraiu-se o DNA de cada um deles. Isolou—se o res— pectivo fragmento EcoRX e ligou-se na posição EcoRI do vector Bluescript MI3 (Stratagene, San Diego, CA, USA) para análises de restrição e analises de sequenciaÇao por meio do método di desoxi enzimático de acordo com Sanger. A sequência apresenta uma ordem de leitura aberta e codifica para uma proteina com

- 14 um máximo de 320 aminoácidos.

11. Expressão da proteína PP4 anticoagulante

Linearizou-se o pTrc98-l (registo de patente europeu EL 0 236 978) com BglII e encheram—se os extremos co— alescentes com polimerase de Klenow. Tratou-se em seguida o DNA com fosfatase. Digeriu—se o plasmideo placl^q (Wang et al. (1983), Cold Spring Harbor, Symp. Quan. Biol. 47,85—91) com EcoRI, encheram—se também os extremos coalescentes com polimerase de Klenow e ligou—se e transformou—se o fragmento com cer ca de 1100 pares de bases, que contêm a variante completa do lacl^q (calos (1987), Nature 274, 762-765), com o DNA do pTrc 98—1 linearizado. 0 plasmideo resultante (com a orientação de transcrição do gene de lacl idêntica a orientação de transcriçao do promotor trc) foi o pTrc 90-3· A sequencia do pTrc— 90-3 compreende 4134 pares de bases. Digeriu-se o pTrc9O-3 com Ncol e HindIII e ligou—se o fragmento mais longo com os oligo nucleátidos sintéticos A, B ou C, em três misturas reaccionais separadas e transformou-se em seguida em células adequadas da estirpe E. coli K12 W3H01acI^qí

5’ CATGGAATTCCGA llllllll

CTTAAGGCTTCGA 5’

5' CATGGGAATTCGA (Hllllll

CCTTAAGCTTCGA 5'

5’ CATGGGGAATTCGA

ΙΙΠΙ1ΙΙΙΙ

CCCTTAAGCTTCGA 5’ esultantes pTrc98A (oligo A), ligo C) digeriram—se com EcoRI

Oligo A

Oligo B

Oligo C

Os plasmideos r pTrc98B (oligo B) e pTrc98C (o e HindIII, isolou-se em cada caso o fragmento mais longo e li gou—se com o fragmento de polilincagem EcoRl—HindII de 55 pares de bases do vector pUClô comercialmente disponível (Yamisch—Perron et al· (1985), Gene 33, 103—119)· Os plasmideos resultantes sao o pTrc99A (4176 pares de bases), o pTrc99B (4177 pares de bases) e o pTrc99C (4178 pares de bases). Em consequência dos oligonucleotidos sintéticos ligados Á, B e C, distinguem-se os vários vectores por uma base entre as posiçoes de reconhecimento Ncol e EcoRl, o que mais uma vez con— duz a um desvio da estrutura de translaçao. Â presença do gene lacl^ no vector de expressão (serie pTrc99) ê interessante quando se utilizam para expressão estirpes E. coli que nao possuem qualquer repressor lac endogênico ou, nos casos em que a proteína expressa tem um efeito tSxico sobre a célula de E. coli hospedeira, sendo por esta razao necessária uma re

IV pressão completa na fase de clonagem ou de crescimento.

A*

No presente exemplo de execução utilizou-se o vector pTrc99A para a expressão da proteína PP4 madura, nao fundida, em S. coli. A sequência de DNA do cDNA da PP4 na zona do codao de iniciaçao ê a seguinte:

Met Ala Gin Vai

5'...GTAGTCGCT ATG GCA CAG GTT ... 3' /V AJ

Uma vez que nao existe nenhuma posição Ncol

Al no ATG nao pode clonar—se este DNA directamente no vector de

A# ΛΖ expressão pTrc99A.· Pode contudo obter—se uma posição Ncol por uma énica troca de bases (de ”T” para ”C”) na sequência de cDNA da PP4: 5’ CTATGG 3’ para 5’ CCATGG 3’· θ segundo aminoácido (Ala) nao ê atingido por esta manipulaçao porque o segundo codao da sequência estrutural da PP4 começa com uma G”. Para a mutagênese isolou-se um fragmento EcoRI-HindIII com 1462 pares de bases do clono PP4—4 da PP4 e ligou—se ao vector de mutagênese pMa5-8 também cortado com EcoRl e HindIII.

vector de mutagênese pMa5~8 possui, para além de uma origem de repiicaÇao bacteriana e de um marcador de resistência aos antibióticos» uma região de polilincagem de clonagem e a oriA» .

gem de replicaçao do bacteriofago SI de cadeia simples. Esta última faz com que se possa isolar uma cadeia simples do cDNA clonado da PP4 de acordo com métodos conhecidos e se possa su jeitá—lo ao protocolo de mutagénese grapped-Duplex” publicado (Kramer et al. (1984)? Nucl. Acids Res. 12, 9441-9456), tendo-se utilizado o oligodesoxinucleótido seguinteί

5' GAA CCTGTGCCATGGCGACTACTCTAGG 3»

Identificou-se um dono que apresentava a mur* taçao Ncol desejada, por meio da respectiva análise de restri çao e designou-se por pKc5-8-PP4-NcoI. A partir deste plasmideo isolou-se o fragmento NcoI-HindIII com I305 pares de bases e ligou—se ao vector pTrc99A adequadamente cortado. 0 pias mideo resultante pTrc99A compreende 5423 pares de bases e exprime, apôs incubaçao do promotor trc, a proteina PP4 com cer ca de 35 KD nao fundida. A proteina constitui cerca de 5% do total das proteinas celulares e é solúvel. Reage especificamente com anti—soros anti PP4 mas nao com anti—soro anti PP4.

Claims

REIVINDICAÇÕES

Processo para a preparaçao da proteina PP4 an ticoagulante, caracterizado por se introduzir a sequência de DNA codificante, de acordo com a Tabela 1.

17 TABELA 1

10 30 50

GCCCCGCGTACCGTCGCCCGGCTCTCCGCCGCTCTCCCG6GGGTTCGGGGCACTTGGGTC

70 90 110

CCACAGTCTGGTCCTGCTTCACCTTCCCCTGACCTGAGTAGTCGCTATGGCACAGGTTCT

Μ A Q V L

I3O I50 170

CAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGATGCACAAACTCTTCG

R G T V T D F P G F D E R A D A Q T L R

190 210 23O

GAAGGCrATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACTCTGTTGACATCCCG

KAMKGLGTDEESIL TLLTSR

25O 270 290

A AGTAAfGCTCA-GCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGTTTGGCAGGGATCT

SNAQRQEISAAFKTLFGRDL

310 33O 35O

TCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTAATTGTGGCTCTGAT

LDDLKSEL TGKFEELIVALM

370 390 410

GAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTGAAGGGAGCTGGAAC

K.PSRLYDAYELKHALKGAGT

430 450 470

AAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAAGAACTGAGAGCCAT

Ν Ε K V L ϊ Ε I I A S R T P Ε E L R A I

490 510 530

CAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGACGTGGTGGG6GACAC

KQVYEEEYGSSLEDDVVGDT

550 570 590

TTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGGCTAACAGAGACCCTGATGC

SGYYQRMLVVLLQANRDPDA

610 63O 65O

TGGAATTGATGAAGCTCAAGTTGAACAAGATGCTCAGGCTTTATTTCAGGCTGGAGAACT

GIDEAQVEQDAQALFQAGEL

67O 690 710

TAAATGGGGGACAGATGAAGAAAAGTTTATCACCATCTTTGGAACACGAAGTGTGTCTCA

KWGTDEEKFI TIFGTRSVSH

730 750 770

TTTGAGAAAGGTGTTTGACAAGTACATGACTATATCAGGATTTCAAATTGAGGAAACCAT

L Ε K V F D K Y Μ T I S 6 F Q I Ε Ε T I

18 790 810 830 TGACCGCGAGACTTCTGGC^ATTTAGAGCAACTACTCCTTGCTGTTGTGAAATCTATTCG

D fítí TSÔNLEQLLLAVVKSxR

850 870 890

AAGTATACCTGCCTACCTTGCAGAGACCCTCTATTATGCTATGAAGGGAGCTGGGACAGA

SIPAYLAETLYYAMkGAGTD

910 930 950

TGATCATACCCTCATCAGAGTCATGGTTTCCAGGAGTGAGATTGATCTGTTTAACATCAG

DHTLIRVMVSRSEIDLFNIR

970 990 1010

GAAGGAGTTTAGGAAGAATTTTGCCACCTCTCTTTATTCCATGATTAAGGGAGATACATC

KEFRKNFATSLYSMIKGDTS

IO3O 1050 1070

TGGGGACTATAAGAAAGCTCTTCTGCTGCTCT6TGGAGAAGATGACTAACGTGTCACGGG

GDYKKALLLLCGEDD

1090 1110 II30

GAAGAGCTCCCTGCTGTGTGCCTGCACCACCCCACTGCCTTCCTTCAGCACCTTTAGCTG

II50 II70 1190

CATTTGTATGCCAGTGCTTAACÀCATTGCCTTATTCATACTAGCATGCTCATGACCAACA

1210 1230 I25O

CATACACGTCATAGAAGAAAATAGTGGTGCTTCTTTCTGATCTCTAGTGGAGATCTCTTT

1270 1290 I3IO gactgctgtagtactaaagtgtacttaatgttactaagtttaatgcctggccattttcca

1330 1350 1370

TTTATATATATTTTTTAAGAGGCTAGAGTGCTTTTAGCCTTTTTTAAAAACTCCATTTAT

1390 l4l0 1430

ATTACATTTGTAACCATGATACTTTAATCAGAAGCTTAGCCTTGAAATTGTGAACTCTTG

1450 1470 1490

GAAATGGTATTAGTGAAGTTCGCAACTAAACTAAACCTGTAAAATTATGATGATTGTATT

1510 I53O I55O

CTTTAGATTAATGÂAAAATAAACATTTCTGTCCCCCTGAAAAAAAAAÁAAAAAAAAAAAA

1570

AAAAAAAAAAAAAAA em vectores de expressão adequados como o fagovector Q^gtlO se guido por reacçao in vitro packaging e se proceder à expres

A* sao em sistemas de expressão adequadas como o vector pTrc99A.
- 2&

Processo para a preparaçao de anticorpos poli clonais ou monoclonais, caracterizado por se utilizarem para a imunizaÇao a PP 4 quando preparada de acordo com a reivindi** caÇao I ou partes dela com actividade antigenica.
- 3* Processo para a preparaçao de meios de diagnóstico, caracterizado por se utilizarem uma sequência de áci dos nucleicos como a da Tabela 1, partes desta ou sequências a eia complementares.
— 4& —

Processo para a preparaçao de um meio de dia w

gnóstico, caracterizado por se empregarem anticorpos quando preparados de acordo com a reivindicação 2.

Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo a proteina PP4 quando preparada de acordo com a rei vindicaçao 1, com veículos e/ou aditivos farmacêuticos adequa dos.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alema em 3 de Novembro de 1987» sob o nS P 37 37 239*4.