JPH04144686A - 構造蛋白質遺伝子、組換えベクター、それにより形質転換された大腸菌、ポリペプチドおよびポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＣ型肝炎の病因であるＣ型肝炎ウィルスの構造
蛋白質遺伝子、該遺伝子を大腸菌て遺伝子発現が可能な
ベクターに組み込んで得た組換えベクター、該組換えベ
クターにより形質転換された大腸菌、該大腸菌を用いて
生産されたポリペプチド、および該ポリペプチドの製造
方法に関する。

本発明による遺伝子およびポリペプチドは、Ｃ型肝炎の
診断上、極めて有用性の高いものである。

〔従来の技術〕

輸血後非Ａ非Ｂ肝炎を起こした患者の血清をもとに、Ｃ
型肝炎ウィルス（以下、ＨＣＶと略す場合かある）の遺
伝子の一部がクローニングされ、これか米国カイロン社
のホートンらによりサイエンスに報告された［５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　Ｖｏ１、　２４４．　ｐｐ、３５９３６２（
１９８９）、　）。更に、彼らはＣ型肝炎ウィルスの非
構造蛋白質領域をコードする遺伝子の一部を、酵母の発
現ベクターに挿入し、酵母てこの遺伝子を発現させるこ
とに成功した。この方法により生産される非構造蛋白質
の一部分は、Ｃ型肝炎患者血清中に存在する、抗ＨＣＶ
抗体に対して抗原性を有する　［Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ
、　Ｖｏ１、３３５．　ｐｐ、１−３．１９９０．］こ
の蛋白質は、現在市販されている唯一のＣ型肝炎診断用
抗原である。

〔発明か解決しようとする課題〕

酵母で生産された抗原性蛋白質は、Ｃ型肝炎患者血清中
に存在する抗ＨＣＶ抗体と反応するか、この抗ＨＣＶ抗
体はＣ型肝炎が発症してなお６力月程度を経て、はじめ
て陽性となるものであることか分かってきた。また、こ
の抗原を用いて正常人血清あるいはＣ型肝炎患者血清を
試験すると、偽陽性または偽陰性を示す場合があること
も分かってきた［Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｖｏ１、３
３５．　ｐｐ、７５４−７５７゜（１９９０）、および
臨床科学、２５巻、７号、８２７ページ、１９９０年］
。このため、より精度が高く、初期診断が可能となる、
新しい抗原性ポリペプチドの開発が求められている。　
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウィルスによって引き起こされる
肝炎であり、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎のほとんどは、この
肝炎であるといわれている。そして、その多くは更に肝
癌へと病状か進行する。Ｃ型肝炎ウィルスは遺伝子の長
さ約１０ｋｂ　（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡつイル
スと考えられ、ワラビウイルスの仲間であると推定され
ている。このことから考えると、５′末端側から約１．
５　ｋｂ　（約１５００ヌクレオチド）の部分が構造蛋
白質遺伝子部分に相当し、残りが非構造蛋白質遺伝子部
分に相当すると考えられる。また約１．５　ｋｂの構造
蛋白質遺伝子部分は、ワラビウイルスの遺伝子構造との
比較により、コア蛋白質遺伝子領域（Ｃ）、膜蛋白質遺
伝子領域（Ｍ）、外皮蛋白質遺伝子領域（Ｅ）に機能的
に分かれるものと考えられている。

Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子の非構造蛋白質遺伝子領域に
ついては、そのほとんどの領域かカイロン社によってヨ
ーロッパ特許ＥＰＯ３１８２１６に報告された。しかし
ながら構造蛋白質遺伝子領域については、これまでに殆
ど報告がなく、わずかに平成２年６月１５日、日本肝臓
学会総会シンポジウムにおいて、岡本による口頭発表が
あったに過ぎない。

従って、構造蛋白質遺伝子領域の総合的な知見は、これ
までに全く得られていないと言ってもよく、こういう状
況のもとでは、いかなる遺伝子領域を、いかなる宿主ベ
クター系にのせると、抗Ｃ型肝炎ウィルス抗体と反応し
得る、免疫的診断上有用となる抗原ポリペプチド（以下
、ｒＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチド］と表現する
場合かある）を効果的に得られるかは、全く不明である
。

ＨＣＶ抗原活性を存するポリヌクレオチドで、そのアミ
ノ酸配列が明らかにされているものは、現在までに、カ
イロン社によるｃｔｏｏ抗原（非構造蛋白質遺伝子領域
にコードされており、ヨーロッパ特許ＥＰ　０３１８２
１６に報告された）と、ＣＰ９抗原（構造蛋白質遺伝子
領域のアミノ酸配列３６個を有する合成ペプチドであり
、そのアミノ酸配列は平成２年６月１５日、日本肝臓学
会総会シンポジウムにおいて、岡本により口頭発表され
た）の２種類がある。

我々は、これまでにＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝
子領域について、独自に、その遺伝子発現を鋭意研究し
てきた。その結果、特定の構造蛋白質遺伝子領域を発現
させることにより、これまでに発表されているＨＣＶ抗
原活性をしのぐ性質を持つ、即ち抗原としての反応性か
強く、特異性が高く、かつ初期診断か可能である、ポリ
ペプチドを得ることに成功した。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
含むＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子にある。

Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ａｒｇ　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｎ Ｇｌｎ　　ｌｉｅ Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌ
ｙｓ　Ａｌａ　ＡｒｇＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ
　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕｒｇ ｔｙ Ｇｌｙ Ｓｐ ビｒｏ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　ＡｒｇＳｅｒ　Ａｒｇ
　ＡＳｎ しｅｕ　　Ｕｌｙ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　　［ｌｅ　Ａｓｐ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｈｉｓ Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　Ｖａｔ Ａｒｇ　Ａｌａ Ｇｌｕ　Ａｓｐ さらに、本発明は、下記の塩基配列を含むＣ型肝炎ウィ
ルスの構造蛋白質遺伝子にある。

ＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＣ
Ｔ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＸＸＡＣＣＡＡＡ　ＣＧＴ　Ａ
ＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡ　ＣＡＧＧＡＣＧ
ＴＴ　ＡＡＧ　ＴＴＣｃｃｃ　ＧＧＣＧＧＴ　ＧＧＴ　
ＣＡＧ　Ａ；５ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＡ
ＣＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣλδδＧＧＣＣＣＣ
ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＣＧＣＧＣＧ　ＡＣ
Ｔ　ＡＧＧＡＡＧ　ＡＣＴ　ＴＣＣＧＡＧ　ＣＧＧ　Ｔ
ＣＧ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＧＡＡＧＧ　ＣＧＡ
　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＡＴＣＣＣＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＧ
ＣＣＧＧＣＣＣＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＣＴＧＧ
　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣｃ　ＧＧＧＴＡＣＣＣＴ　ＴＧ
Ｇ　ＣＣＣＣＴＣＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＣＧＡＧ　ＧＧＴ
ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　Ｃ
ＴＣＣＴＧ　ＴＣＡ　ＣＣＣＣＧＴ　　ＧＧＣＴＣＴ　
　ＣＧＧ　　ＣＣＴ　　ＡＧＴ　　ＴＧＧ　　ＧＧＣＣ
ＣＣ５６スＧＡＣＣＣＣＣＧＧ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＴＣ
Ｇ　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　５＋ｃＦさらに、本発明
は、上記Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を、大腸
菌で遺伝子発現か可能なベクターに組み込んで得た組換
えベクターにある。

さらに、本発明は上記組換えベクターにより形質転換さ
れた大腸菌にある。

さらに、本発明は、上記大腸菌を培地に培養し、ＨＣＶ
抗原活性を有するポリペプチドを生産せしめ、培養物か
ら該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ＨＣＶ
抗原活性を有するポリペプチドの製造方法にある。

さらに、本発明は、下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗
原活性ポリペプチドにある。

Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ
　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
ＧｉｎＡｓｐ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ Ｇｉｎ　　ｌｉｅ Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｔｈｒ　Ａｒｇ Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ 本発明でいう構造蛋白質遺伝子領域とは、Ｃ型肝炎ウィ
ルスの構造蛋白質遺伝子のＣ領域と推定される、第１図
に示すＮ末端の領域を少なくとも含む遺伝子領域である
。第１図にはＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領域
のうち、優れた抗原活性に必須な領域である、ウィルス
遺伝子の開始コドンから始まる１６３個のアミノ酸の配
列と、対応する４８９塩基のＤＮＡの塩基配列を示す。

なお、第１図には、遺伝子の塩基配列かＤＮＡで表示し
である。もちろんＣ型肝炎ウィルスの遺伝子は本来ＲＮ
Ａであり、ウィルスのＲＮＡ遺伝子として第１図を解読
する場合は、Ｔ（チミン）をＵ（ウラシル）と置き換え
て読めば良い。

この遺伝子領域は、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者［血液中の
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値が１５
０以上を示した患者］の血清からウィルス遺伝子を分離
して作成したｃＤＮＡライブラリーから得ることか出来
る。例えば、まず患者血清から超遠心によりＣ型肝炎ウ
ィルスを分離し、次いでウィルスから遺伝子ＲＮＡを調
製し、該ＲＮＡに対して逆転写酵素を使用してｃＤＮＡ
を合成し、しかるのちに該ｃＤＮＡ断片をプラスミドベ
クターに挿入して、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。

次いで、本発明で示される構造蛋白質遺伝子の３′下流
に隣接する遺伝子領域を含む遺伝子断片を制限酵素で切
断して得た小ＤＮＡ断片をプローブとして用い、別途調
製済みのｃＤＮＡライブラリーに対してＤＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションを行うことにより、目的の遺伝
子領域を得ることか出来る。また、クローニングによる
方法以外に、該構造蛋白質遺伝子領域を、有機化学合成
的に合成したものも、好適に利用できる。

Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子の塩基配列については、これ
までに数例の報告しかないか、その中で加藤、大越、下
遠野らは、１９８９年に日本・のＣ型肝炎ウィルスとア
メリカのＣ型肝炎ウィルスとの塩基配列の相違を指摘し
、日本型とアメリカ型のＣ型肝炎ウィルスが存在するこ
とを報告している。

［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｊａｐａｎ
　Ａｃａｄｅｍｙ、　Ｖｏ１、６５゜Ｓｅｒ、　Ｂ、　
Ｎｏ９．　ｐｐ、２１９〜２２３　（１９８９）、１゜
第１図は本発明にいう構造蛋白質遺伝子として、優れた
抗原活性に必須な領域を示すが、そのアミノ酸配列、塩
基配列は一例であり、本発明は何等このアミノ酸配列、
塩基配列に限定されない。すなわち、第１図に示された
領域は、遺伝子地図上で同一な位置づけをされる、他の
日本型あるいはアメリカ型のＣ型肝炎ウィルスの構造蛋
白質遺伝子の領域を代表しで示すものであり、その領域
とは、アミノ酸配列で示すとＣ型肝炎ウィルスの５′末
端の開始コドンのメチオニン（Ｍｅｔ　）から始まる１
６３個のアミノ酸の領域であり、ＤＮＡ塩基配列で示す
と開始コドンＡＴＧ　（ウィルス遺伝子ＲＮＡてはＡＵ
Ｇである）から始まる４８９個の塩基の領域である。

また第１図に示す構造蛋白質遺伝子領域の全部あるいは
一部について、その塩基配列の一部の領域か、置換ある
いは挿入、欠失したものであっても、その遺伝子発現に
より生産されるＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドの
性質が、本配列によって示されるものと実質的に同等で
ある場合は、本発明に含まれる。更に第１図の配列につ
いて、コドンのゆらぎの範囲内、即ち第１図のアミノ酸
配列を変えない範囲内で塩基が変化した配列にっいては
、第１図の塩基配列と実質的に同一と見なされ、本発明
に含まれる。

Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子は、通常知られて
いる遺伝子発現系、即ち大腸菌のホスト・ベクター系、
枯草菌のホスト・ベクター系、酵母のホスト・ベクター
系、昆虫細胞あるいは昆虫ノホスト・ベクター系、動物
細胞のホスト・ベクター系などを利用して、遺伝子発現
が可能である。

このうち、大腸菌は好適に利用できる例であり、大腸菌
で遺伝子発現か可能なベクターに組み込んで、構造蛋白
質遺伝子を発現させることか出来る。

大腸菌で構造蛋白質遺伝子を発現させる場合、ベクター
は特に限定されず、大腸菌のベクターとして通常使われ
るベクターなら、如何なるベクターも利用できるか、特
に遺伝子発現が高頻度でおこるベクターは好適に利用さ
れる。例えば、一連のｐＵＣベクター（宝酒造製品）、
一連のｐＴＶベクター（宝酒造製品）、一連のｐＴＺベ
クター（ＴＯＹＯＢＯ社製品）、一連のｐＥＴベクター
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖ
ｏ１、１８５に示される）などは好適である。大腸菌て
遺伝子発現が可能なベクターには、通常は大腸菌体内で
働く遺伝子発現のためのプロモーターや、それをコント
ロールするオペレーターか附属しているが、特に、遺伝
子発現を調節するオペレーターや、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼによる遺伝子発現調節機構が付加されたものなどは
、好適に利用できる。Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺
伝子は、ＣＤＮＡライブラリー作成時に付加されたリン
カ−由来の制限酵素部位、構造蛋白質遺伝子か挿入され
たプラスミド由来の制限酵素部位、または構造蛋白質遺
伝子内部の制限酵素部位などを利用して、ベクターのプ
ロモーターの下流に挿入することが出来る。こうして出
来た組換えベクターは、大腸菌体内で、Ｃ型肝炎ウィル
スの構造蛋白質遺伝子を発現させることができる。

組換えベクターで遺伝子発現を行う場合は、ポリペプチ
ドのＮ末端あるいはＣ末端にランダムな配列のアミノ酸
が複数個付加する場合かある。本発明でいうＣ型肝炎ウ
ィルスの構造蛋白質遺伝子には開始コドンＡＴＧ　（Ｒ
ＮＡ遺伝子ではＡＵＧである）かあり、この遺伝子か挿
入された組換えベクターでは、この開始コドンから翻訳
が開始されることになる。この場合は生産されたポリペ
プチドのＮ末端は、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質のＮ
末端とアミノ酸配列か一致する。しかし、組換えベクタ
ーを調製する際に、構造蛋白質遺伝子の開始コドンの上
流に同じフレームで別の開始コドンが存在する遺伝子構
造をとった場合には、ポリペプチドのＮ末端に更に余分
なアミノ酸が複数個付加されることもある。また構造蛋
白質遺伝子の３′側には終止コドンか存在しないために
、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領域をベクター
に挿入すると、その後に終止コドンが現れるまで、ラン
ダムなアミノ酸配列をコードする遺伝子の転写、翻訳が
続き、その結果、ポリペプチドのＣ末端に余分なアミノ
酸が複数個付加したポリペプチドが生産される。しかし
ながら、この様なＮ末端、あるいはＣ末端に付加された
複数個のアミノ酸はランダムなアミノ酸であるから、Ｈ
ＣＶ抗原活性には無関係であり、抗原活性測定に影響は
ない。　形質転換に用いる菌は、大腸菌てあれば特に制
限なく利用できる。例えば、ＪＭ８３．５Ｍ１０９、Ｈ
ＢＩＯＩ（宝酒造製品）、ＤＨＩ、Ｗ３１１０、Ｃ６０
０、ＢＬ２　Ｌ　ＢＬ２１　（ＤＥ３）などは好適に利
用できる。この様に、第１図に示す塩基配列を有する遺
伝子断片をベクターｐＥＴ−３ｄに挿入して得た組換え
ベクターｐＫＭＲ３を用いて、大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ
３）を形質転換した具体例は、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＨＣＶＫＭＲ３で
あり、この菌は茨城系つくば電束１丁目１番３号の通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２年６月
３０日付で微工研菌寄第１１５６９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−
１１５６９）として寄託されている。

大腸菌を利用して構造蛋白質遺伝子を発現させる場合は
、その上流のプロモーターを働かせてやればよ（、オペ
レーターが存在しないか或はオペレーターが開いている
時は、通常用いられる栄養豊富な大腸菌用培地（Ｌ培地
、ＴＹ培地など）て培養しながら、構造蛋白質遺伝子を
発現させることか出来る。オペレーターを用いて遺伝子
発現を調節するか、或はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用い
る遺伝子発現調節系を利用する場合は、その調節機構に
適当である調節方法を行うことになる。例えばｌａｃプ
ロモーター、ｌａｃオペレーターが遺伝子発現を調節し
ているｐＵＣ，ｐＴｖｌｐＴＺなどノヘクター系では、
グルコースやラクトースを含まない栄養培地［各種無機
培地、半合成培地（Ｍ９培地など）、カゼイン分解物を
栄養源とする培地（バクトドリプトン培地など）コで培
養後、Ｉ　ＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を
添加して、遺伝子発現を開始させる方法がとられる。も
ちろんグルコースを含む栄養に富んだ培地で前培養後、
菌体を集菌、洗浄し、次いでグルコースを含まない栄養
培地に移して、Ｉ　ＰＴＧを添加して、遺伝子発現を行
う方法も有効である。Ｉ）ＥＴベクター系では遺伝子発
現は同様にＩＰＴＧで遺伝子発現が誘導されるが、その
機構はｐＵＣなどとは異なる。即ちホストＢＬ２１　（
ＤＥ３）の染色体上に、１ａｃＵＶ５プロモーターに続
いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼかコードされる遺伝子があ
り、まずＩＰＴＧにより染色体上のＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子か活性化され、次いて、生産されたＴ７ＲＮ
ＡポリメラーゼかベクターｐＥＴ上のφｌＯプロモータ
ーを選択的に認識し、その結果、φｌＯプロモーター下
流の遺伝子を多量に転写し、その結果、多量の該遺伝子
産物か生産される。１ａｃＵＶ５プロモーターはグルコ
ースによる異化代謝産物抑制はかからず、この宿主ベク
ター系では、ラクトースを含まない栄養培地［各種無機
培地、半合成培地（Ｍ９培地など）、カゼイン分解物を
栄養源とする培地（バクトドリブトン培地など）、また
はこれらの栄養源の組合せ培地］で培養後、ＩＰＴＧ（
イソプロピルチオガラクトシド）を添加して、遺伝子発
現を開始させる方法がとられる。もちろん、Ｌ培地（グ
ルコース添加）、ＴＹ培地（グルコース添加）などの栄
養源の豊富な培地で前培養後、菌体を集菌、洗浄し、別
の栄養培地に移して、Ｉ　ＰＴＧを添加して、遺伝子発
現を行う方法も有効である。

ポリペプチドは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分子量か決定され、またＮ末端のアミノ酸配列
の決定、およびアミノ酸分析によるアミノ酸組成の決定
により、その物質か特定される。本発明でいうポリペプ
チドとは、優れた抗原活性に必須な、第１図に示す領域
を含むポリペプチドであり、そのＮ末端あるいはＣ末端
に、余分なアミノ酸か複数個付加したものであってもよ
い。すなわち、Ｃ末端には更にＣ型肝炎ウィルスのアミ
ノ酸配列が続いて付加していても良く、またそのＮ末端
あるいはＣ末端にランダムなアミノ酸が複数個付加して
いても良い。付加された複数個のアミノ酸は、ＨＣＶ抗
原活性には何等悪影響はない。

ポリペプチドは、診断上有用なＥＩＡ用抗原、ＲＩＡ用
抗原あるいは凝集系試薬用抗原として利用できる。例え
ばＥＩＡやＲＩＡでは、ポリペプチドを各種固相に固定
化し、これに検体（血清）を添加すると、血清中に抗Ｈ
ＣＶ抗体（１次抗体）があればポリペプチドと結合する
。次いで抗ＨＣ■抗体（１次抗体）に対して反応する、
２次抗体（抗ヒトＩｇＧ）を反応させると、抗ＨＣＶ抗
体（１次抗体）の存在が免疫的に検出できる。検出方法
としては、２次抗体が酵素標識され、該酵素の反応を測
定する方法（ＥＩＡ）と、二次抗体が放射化合物標識さ
れ、該放射性化合物より放射される放射線を検出する方
法（ＲＩＡ）とがある。また凝集系試薬の場合には、ポ
リペプチドを担体に感作し、該担体と患者血清とを反応
させる。この時、血清中に抗ＨＣＶ抗体が存在する場合
は担体が凝集し、血清中の抗ＨＣＶ抗体の存在を免疫的
に検出できる。

〔発明の効果〕

本発明によりＣ型肝炎ウィルスの抗体に特異的に反応す
る有用な抗原性を有するポリペプチドを効率よく生産す
ることが出来る。こうして得られたポリペプチドは、Ｃ
型肝炎の診断薬として利用できるが、Ｃ型肝炎の診断薬
として完全なものがない現在、本発明はきわめて大きい
意義を持つ。

本発明により得られた有用な抗原性を有するポリペプチ
ドは、Ｃ型肝炎の患者血清中に存在する抗Ｃ型肝炎ウィ
ルス抗体を特異的に認識するため、凝集法による診断用
抗原や、酸素抗体法（ＥＬＩＳＡ）による診断用抗原と
して応用できる。

〔実施例〕

以下に本発明を具体的に例示するために実施例を示すが
、本発明の範囲はこの実施例に限定されるものではない
。

実施例！ （ＲＮＡの調製） 輸血後非Ａ非Ｂ患者血清３０００−を１９．００Ｏｒｐ
ｍで１６時間超遠心し、沈澱を得た。該沈澱物をＧＩＴ
Ｃ溶液１００ｒＩｄ！に溶解し、該溶解物１ｏｏ−に対
して、１００−のフェノール−クロロホルム（１：ｌ）
を加え、１５分間室温で振盪後、３０００ｒｐｍ、１５
分間遠心した。該反応液の水層を取り出し、イソプロピ
ル　アルコール１００ｒＩＬｌを加え、−２０℃に３時
間放置した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈澱
物を得た。

該沈澱物に対し、ＧＩＴＣ溶液１０−を加えて溶解液と
した。該溶解液に対して、１０ｒＩＬｌのフェノール−
クロロホルム（１：１）を加え、１０分間室温で振盪後
、３０００ｒｐｍ、　１５分間遠心した。該反応液の水
層を取り出し、クロロホルム２０−を加え、５分間振盪
した。振盪後、３０００ｒｐｍ　、　５分間遠心し、水
層１０−を回収した。この水層１０−に対して、５ＭＮ
ａＣ１溶液０．４−を加えた。

その後、３０−の水冷エタノールを添加し、−２０°Ｃ
で１２時間放置した。放置後、３０００ｒｐｍで１５分
間遠心し、沈澱物を得た。該沈澱物を７５％エタノール
で洗浄し、乾燥後、蒸留水２００μｌに溶解し、ＲＮＡ
溶解液を得た。

なお、上記ＧＩＴＣ溶液の組成は、４Ｍグアニジウムイ
ソチオシ了ネート（フル力株製）　、　２５ｍＭクエン
酸ソーダ、０．５％　サルコシル、　　０．１Ｍメルカ
プトエタノールである。

（ＰＣＲ法による遺伝子増幅） 得られたＲＮＡ溶液４μｌに、逆転写酵素反応液［２５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｔ（８，３）、　３７
５ｍＭ　ＫＣＩ、　５０ｍＭＤＴ７．１５ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２］　２　ｕ　ｌ　、塩基配列が（５’）　ＡＧＴＴ
ＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡ（３’　
）で示される２５塩基のブライマー溶液１ｕｌ　　（１
００ｎｇ／μｌ　）　、４種類のデオキシヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、各
１５ｍＭ］を各０．５μｌずつ加えて、９μｌの溶液を
作った。

これにミネラルオイルを加えて、７０℃、２分間加熱し
、ついで３７°Ｃに冷却し、逆転写酵素ｌμ１（ＢＲＬ
社製品）を加え、３７℃で６０分反応させた。

この反応液（１０μｌ）に、更にＰＣＲ反応液［４００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，８）、　１１００ｎ
硫酸アンモニウム、　４０ｍＭ　　塩化マグネシウム、
　６０ｍＭ　　メルカプトエタノール、０．１％Ｂ５Ａ
ｌ　８．３μｍ、４種類のデオキシヌクレオチド［ｄＡ
ＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ。

各１５ｍＭ］を各５μｌずつ、塩基配列（５’　”）　
ＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＴＡ
ＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣ
ＴＡＴＣＡＧＴＴＡ（３’　”）で示される６０塩基の
ブライマー溶液５　ｕ　ｌ　（１００ｎｇ／μｌ　）、
塩基配列（５°）　ＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡ
ＡＣＣＧＡＡＣＣＡ（３”）で示される２５塩基のブラ
イマー溶液５　μｌ　（１００ｎｇ／μｌ　’）、水０
．７μｌを加え、全量４９μｌの溶液とした。

この溶液を９２°Ｃで５分間処理し、室温に冷却してＴ
ａｑポリメラーゼ１μｍ（２単位、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製品）を加えた。以下１．社製−
ル（５５℃、４５秒）、ポリメラゼーシヨン（７２℃、
２分）、変性（９０℃、１分）を、３５回繰り返して、
ＤＮＡの増幅を行った。なお、本方法で使用したブライ
マーを、カイロン社がＥＰＯ３１８２１６に発表したＨ
ＣＶの遺伝子の塩基配列番号で示せば、以下の通りであ
る。まず６０塩基のものは、１４〜７３番目のセンス鎖
に相当し、２５塩基のものは２９７〜３２１番目のアン
チセンス鎖に相当する。

以下、ＰＣＲ法により増幅した遺伝子産物のクローニン
グについて述べるが、このクローニングの方法はマニア
ティスらの方法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）、　］
に従って行った。まず増幅した遺伝子産物（３０７塩基
対）をアガロースゲル（２％）で電気泳動し、これから
目的の長さのＤＮＡを回収した。ついでこれをＫｌｅｎ
ｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ酵素処理し、ＤＮＡの末端を平
滑に揃え、更にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、
５°末端をリン酸化した。

これをプラスミドベクターｐ　Ｔ　Ｚ　１９ＲのＨｉｎ
ｃＩＩ部位に挿入し、遺伝子のクローン化を行った。つ
いで、得られたクローンの３０７塩基の配列を決定した
。

決定した塩基配列をもとに、２０塩基のオリゴヌクレオ
チド（５°’）　ＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡ
ＡＴＡ（３°）［カイロン社の発表した配列の１７１〜
１９０番目の連鎖に相当する１と、２４塩基のオリゴヌ
クレオチド（５′）ＧＣＧＴＣＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧ
ＧＴＣＣＡＧＴＧ　（３°）［カイロン社の発表した配
列の１４７〜１７０番目のセンス鎖に相当する］の２種
類を合成した（アブライドバイオシステムズ社製品、３
４０Ａ型機を使用した）。

（ｃＤＮＡライブラリーの構築） ｃＤＮＡ合或はＢＲＬ社の合成キットを使用した。その
方法はｃＤＮＡ合成マニュアル［ＢＲＬ／コスモバイオ
社Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａ１、　Ｃａｔ、
　Ｎ。

８２６７ＳＡ］に従って行った。本実施例の（ＲＮＡの
調製）の項で、非Ａ非Ｂ患者血清より調製した１本鎖Ｒ
ＮＡ溶液５μｌに、２０塩基のオリゴヌクレオチドを５
μｌ　　（１００μＭ）を加え、逆転写酵素反応を行い
、ＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖とした。次いで大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■と、大腸菌ＲＮＡ分解酵素Ｈとを加え、
ＤＮＡ／ＤＮＡ２本鎖とした。

次に、こうして得られた２本鎖ＤＮＡの両末端にＥｃｏ
ＲＩ　リンカ−を結合させた。この処理には宝酒造の酵
素を用い、宝酒造の酵素に添付されている反応条件で反
応を行った。まず２本鎖ＤＮＡ約１μｇを用いて、Ｅｃ
ｏＲＥメチラーゼ処理を行い、その後Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼ反応によりＥｃｏＲＩ　リンカ−ｄ　（ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ）を結合させた。最後に得られた反応液をＥｃｏ
Ｒｒで切断し、ＥｃｏＲＩ断片を回収した。

最後にこのＥｃｏＲＩ断片をλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部
位に挿入し、組換えλｇｔｌｌファージを作成したが、
これにはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキットＧＩＧＡＰＡ
ＣＫＩＩ　ＧＯＬＤを用い、方法はキットに添付されて
いるマニュアル［Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／Ｉｎ５ｔｒｕｃｔ
ｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃａｔ、　＃２００２１４゜２
００２１５、２００２１６．　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　６．
１９８９］に従った。

まずλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲＩ断片を挿
入し、これをＴ４リガーゼにより結合させた。得られた
組換エフｙ　−’）　Ｄ　ＮＡ溶液ヲＧＩＧＡＰＡＣＫ
　ＩＩ　ＧＯＬＤのＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇ　Ｋｉｔを用いて、ファージに戻した。この時のタ
イターを滴定した所１．２×１０６であった。このタイ
ター値は、 独立したクローンの数を示す。

（プラークハイブリダイゼーション） プラークハイブリダイゼーションの方法はマニアティス
らの方法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）、　］に従っ
て行った。まず大腸菌Ｙ１０９０をホ、ストとし、直径
１５ｃｍのプレート１０枚に、得られた組換えλｇｔ１
１ファージ５Ｘ１０’相当を出現させた。得られたプラ
ークを、ニトロセルロースに写し取り、２４塩基のオリ
ゴヌクレオチドをプローブとしてノ１イブリダイゼーシ
ョンを行った。こうして、１狐１・以上の挿入断片をも
つクローン８株を選択し、この中で最も長い断片を持つ
クローンを１株選び出した。

そして、このクローンのＤＮＡをとり、ＥｃｏＲＩで切
断して、約１．２ｋｂのＳＦ３と名付けられた断片を回
収した。この遺伝子断片の塩基配列を第３図に示す。こ
の遺伝子断片は１２５１塩基からなる。

（構造蛋白質遺伝子を含む断片の調製）ＳＰ４断片をＤ
ｄｅ　Ｉ制限酵素で切断し、２５８塩基（第３図の第１
塩基から第２５８塩基に相当する）のＤＮＡ断片を、ア
ガロース電気泳動ゲルより回収した。

回収したＤＮＡ断片を［γ−”Ｐ］　ＡＴＰで放射標識
し、これをプローブとして、前出のｃＤＮＡライブラリ
ーに対してプラークハイブリダイゼーションを行った。

この方法は前出のマニアティスらの方法［Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｔ＋ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ　（１９８２）、　］と同じ方法である。こうして
、プラークハイブリダイゼーションに対して陽性な、第
１図に示す４８９塩基のＤＮＡ断片を含む、新たなりロ
ーンを選択した。

次いで、このクローンのファージＤＮＡをＥｃｏＲＩ断
片で切断し、５６２塩基の挿入断片を回収し、次いでこ
の断片をプラスミドベクターｐ’ｒｚ　１９ＲのＥｃｏ
Ｒ１部位に挿入した。更に該プラスミドをＢｓｐＨＩと
ＢａｍＨＩで切断し、５１３塩基の遺伝子断片を回収し
、これをプラスミドベクターｐＥＴ−３ｄのＮｃｏＩ〜
Ｂａｍ旧部位に挿入して、組換えベクターｐＫＭＲ３を
得た。ｐＫＭＲ３上には第１図で示される４８９塩基の
ＤＮＡ断片が含まれる。また同様に、ＢｓｐＨＩ〜Ｂａ
ｍＨＩ断片を、別のプラスミドベクター（ｐＴＶ１１９
Ｎ）のＮｅｏ　Ｉ〜ＢａｍＨ１部位に挿入して、組換え
ベクターｐＮｓＫ１を得た。ｐＮｓＫｌ上には、第１図
で示される４８９塩基のＤＮＡ断片が含まれる。以上の
プラスミド構築の過程を、第４図に示す。

なお、組換えベクターｐＫＭＲ３上の、Ｃ型肝炎ウィル
ス構造蛋白質遺伝子を含むオーブンリーディングフレー
ムの塩基配列と、対応するアミノ酸配列を第２図に、ま
た組換えベクターｐＮｓＫｌ上の、Ｃ型肝炎ウィルス構
造蛋白質遺伝子を含むオーブンリーディングフレームの
塩基配列と、対応するアミノ酸配列を第５図に示す。

以後、組換えベクターｐＫＭＲ３のオーブンリーディン
グフレーム（第２図）から遺伝子発現して生産されるポ
リペプチドをＣ０ＲＰ、組換えベクターｐＮＳＫｌのオ
ーブンリーディングフレーム（第５図）から遺伝子発現
して生産されるポリペプチドをＣ０ＲＥＮｌ　と呼ぶ。

実施例２ （ポリペプチドの製造） 形質転換直後の大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３［プラスミドｐＫ
ＭＲ３により形質転換された大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３
）］を３リットルのＭ９２Ｂ培地（ＮＨ２Ｃｌ　０．３
％、ＫＨ２ＰＯ。

０．３％、Ｎａ２ＨＰＯ，０，６％、ＮａＣＬｏ、５％
、Ｍｇ３０．１ｍＭ、バクトドリブトン１％、グルコー
ス０．１％、アンピシリン５０．ｃｚｇ／ｍｌ）で培養
し、ＯＤ　６００が０．４となった時点で、ＩＰＴＧ　
（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度か０．４
ｍＭになるように添加し、引続き３７度で２時間培養し
た。

菌体を集菌後、破砕し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行うと、分子量約２万
３千に相当する位置に濃いメインバンドが見られた。ま
たそれ以外にも、分子量２万３千以下にスメアなから、
かなり薄い一連のバンドの影が現れ、その中でも特に約
２万の位置には太い帯状の影が見られた。目的のものは
分子量約２万３千に位置するものであり、それ以下の分
子量のものは、何等かの理由でこれが分解したものであ
ろう。

次に、分取電気泳動を行い、泳動後のゲルを２Ｍ　ＫＣ
Ｉ溶液に浸漬し、分子量２３ｋｄの位置に出現した白色
バンドを切り出し、０．１Ｍ　）リス、０．１Ｍ　　）
リシン、０．１％ＳＤＳの溶出液を使用して電気的に溶
出した。これを繰り返し行い、６ｍｇの粗精製ポリペプ
チドを含む溶液が得られた。この粗精製ポリペプチドを
イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグ
ラフィーを行うことにより精製し、最終的にポリペプチ
ド１．５ｏ＋ｇを得た。

精製したポリペプチド０．２ｍｇを用い、Ｎ末端領域の
アミノ酸配列を、ＡＢＩ　ｍｏｄｅ１４７７Ａ／１２０
Ａアミノ酸配列決定システム（ＡＢＩ社製）を使用して
決定した。キャリヤーにはバイオブレンプラス（ＡＢｒ
社製）を用いた。こうして決定されたポリペプチドのＮ
東端から１９残基までのアミノ酸配列はＭｅｔ、Ｓｅｒ
、　ＴｈｒｌＡｓｎ、　Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、　Ｐｒｏ、Ｇ
ｌｎ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ。

Ｔｈｒ、　ＬｙｓＳＡｒｇＳＡｓｎ、　Ｔｈｒ、　Ａｓ
ｎＳＡｒｇＳＡｒｇ、　Ｐｒｏてあり、これは遺伝子か
ら予想される配列と同一である。

更に精製ポリペプチド１．０ｍｇを凍結乾燥し、該凍結
乾燥物に対して６Ｎ−ＨＣｌを加えて溶解し、１０５℃
、２２時間加水分解した。この加水分解物に対して日立
８３５型アミノ酸分析システム（日立製作所株製）を使
用して、アミノ酸組成を分析した。

アミノ酸組成の分析結果を以下に示すが、この結果は遺
伝子構造から予想されるものと同じであった。以下、ア
ミノ酸の種類、１分子あたりのアミノ酸組成の実測値（
かっこ内は配列から予想される計算値）を順に示すと、
Ｇｌｙ　２５（２４）、Ａｌａ１９（１９）、Ｖａｌ　
９（８）、Ｌｅｕ　１４（１５）、Ｉｌｅ　４（４）、
Ｍｅｔ３（３）、Ｐｈｅ　２（２）、Ｐｒｏ　２１（２
０）、Ｓｅｒ　１０（１１）、Ｔｈｒｌｏ（１０）、Ａ
ｓｐ　６（６）、Ｇｌｕ　７（７）、Ｌｙｓ　９（９）
、Ｈｉｓ　２（２）、Ａｒｇ　２５（２６）、Ｔｙｒ　
４（４）であった。

以上の結果から、得られたポリペプチドは第２図に示す
アミノ酸配列をもつポリペプチドであることか確認され
た。

実施例３ 実施例２と同じ方法により、組換えベクターｐＮｓＫ１
により形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩを培養し、ポリ
ペプチドＣ０ＲＥ−Ｎｌを生産させた。そして、この培
養液１００μｌと、実施例２でポリペプチドＣ０ＲＥを
生産させた大腸菌培養液１００μｌとを、それぞれ５Ｄ
Ｓｔ気泳動して、ウェスタンブロッティングによる解析
を行った。ウェスタンブロッティングによる解析は以下
の手順で行った。まず蛋白質のブロッティングは、アト
−社製製品　ホライズプロット装置を用いて電気的に行
い、膜はイモピロンＰｖＤＦトランスファーメンブレン
（ミリポア社製品）を用い、その方法はアンダーセンら
の方法［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｖｏｌ。

１０、　ｐ２０３（１９８４）、１に従って行った。次
に蛋白質が移しとられたイモピロンＰＶＤＦ　）ランス
ファーメンブレンに対して、−次抗体として正常人血清
または輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者血清を反応させ、次に二
次抗体として第１表に示す抗体を反応させた。こうして
、アビジン／ビオチン化酵素複合体反応により、血清中
の抗ＨＣＶ抗体（−次抗体）の検出を行った。またこの
実験はトービンらの方法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　Ｖｏ１、７６、　ｐ
４３５０（１９７９）、　］に従って行った。

第１表 この結果、輸血後非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清を使用し
た場合には、Ｃ０ＲＥでは約２３ｋｄ、　Ｃ０ＲＥ−Ｎ
ｌでは約２９ｋｄに相当する位置に、特異的な陽性バン
ドが検出された。また正常人血清を使用した場合には、
これらのバンドは検出されなかった。このことより、本
発明により生産されたポリペプチドは、Ｃ型肝炎患者を
特異的に判定できることか判明した。

実施例４ 実施例３と同じ方法により、種々のヒトの血液について
、ウェスタンブロッティングによる分析を行った。第２
表にその結果を示す。なお、表中の「Ｎｏ」は調べた検
体数であり、（Ａ）はＣ１００抗原を用いた市販のオー
ツＨＣＶＡｂＥＬ　ＩＳＡキットにより、陽性と判定さ
れた検体数であり、（Ｂ）は、本発明によるＣ０ＲＰ抗
原によりウェスタンブロッティング分析で陽性と判定さ
れた検体数であり、ｒＡ＋／Ｂ−Ｊは（Ａ）で陽性、（
Ｂ）で陰性と判定された検体数であり、ｒＡ−／Ｂ＋Ｊ
は（Ａ）で陰性、（Ｂ）で陽性と判定された検体数であ
る。この結果、大腸菌で遺伝子発現されたＣ０ＲＥ蛋白
質が、ＨＣＶ感染を検出するのに有効であることが確認
された。

（本頁以下余白） 第 表

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドのアミノ
酸配列と、それをコードするＤＮＡ塩基配列を示す図で
あり、第２図は組換えベクターｐＫＭＲ３上のドブ７１
Ｊ−ディングフレームの塩基配列と、対応するアミノ酸
配列を示す図であり、第３図はＨＣＶのＳＰ４遺伝子断
片の塩基配列を示す図であり、第４図は組換えベクター
の構築図であり、第５図は組換えベクターｐＮｓＫｌ上
のオープンリーディングフレームの塩基配列と、対応す
るアミノ酸配列を示す図である。 Ｅｃ　：　ＥｃｏＲＩ、　Ｂｍ：　ＢａｍＨＩ、　Ｂｓ
　：　ＢｓｐＨＩ　。 Ｓｃ　：　５ａｃｌ　、　Ｎｃ　：　ＮｃｏＩ：ベクタ
一部位 ＝＝＝コニクローニング遺伝子部位 −一一■：マルチブルクローニング部位（ベクター由来
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＣ
   型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 ２、下記の塩基配列を含むＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白
   質遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 ３、請求項１または請求項２で示されるＣ型肝炎ウィル
   スの構造蛋白質遺伝子を、大腸菌で遺伝子発現が可能な
   ベクターに組み込んで得た組換えベクター。 ４、請求項３記載の組換えベクターにより形質転換され
   た大腸菌。 ５、請求項４記載の大腸菌を培地に培養し、ＨＣＶ抗原
   活性を有するポリペプチドを生産せしめ、培養物から該
   ポリペプチドを採取することを特徴とする、ＨＣＶ抗原
   活性を有するポリペプチドの製造方法。 ６、下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプ
   チド。 【遺伝子配列があります。】