JPH09278794A - キメラ抗原ペプチド - Google Patents
キメラ抗原ペプチドInfo
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- JPH09278794A JPH09278794A JP9027015A JP2701597A JPH09278794A JP H09278794 A JPH09278794 A JP H09278794A JP 9027015 A JP9027015 A JP 9027015A JP 2701597 A JP2701597 A JP 2701597A JP H09278794 A JPH09278794 A JP H09278794A
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- peptide
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 広範囲のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染を
検出することができる抗原の提供。 【解決手段】 ＨＣＶポリペプチドのコア領域、ＮＳ３
領域及びＮＳ４領域中のエピトープ領域を含むキメラ抗
原ペプチド。 【効果】 広範囲のＨＣＶ感染を高感度で検出すること
ができる。
検出することができる抗原の提供。 【解決手段】 ＨＣＶポリペプチドのコア領域、ＮＳ３
領域及びＮＳ４領域中のエピトープ領域を含むキメラ抗
原ペプチド。 【効果】 広範囲のＨＣＶ感染を高感度で検出すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、広範囲のＣ型肝炎
ウィルス（ＨＣＶ）の感染を検出することができる抗原
ペプチドに関する。
ウィルス（ＨＣＶ）の感染を検出することができる抗原
ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎は伝染性の肝炎でありウ
ィルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非
Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分
が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非
Ｂ型肝炎は、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点と
なっていた。１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウィ
ルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウィル
ス（ＨＣＶ）と命名された（1989年、Choo Q.-L.等、Sc
ience 、 244巻、p359-362）。ほぼ同時期に本出願人を
含む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単
離され、その構造上の特徴が明らかとなった。
ィルスを媒体として伝播すると考えられている。非Ａ非
Ｂ型肝炎の伝播経路はいまだ明らかになっていない部分
が多いが、輸血、血液製剤により引き起こされる非Ａ非
Ｂ型肝炎は、輸血後肝炎として医療上の大きな問題点と
なっていた。１９８９年非Ａ非Ｂ型肝炎に関連したウィ
ルス遺伝子の一部がクローニングされ、Ｃ型肝炎ウィル
ス（ＨＣＶ）と命名された（1989年、Choo Q.-L.等、Sc
ience 、 244巻、p359-362）。ほぼ同時期に本出願人を
含む多くの研究グループによりＨＣＶ遺伝子が数多く単
離され、その構造上の特徴が明らかとなった。
【０００３】推定されるＨＣＶ遺伝子は約９３００〜９
５００塩基からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、
約３，０００アミノ酸からなる一つながりのポリペプチ
ドをコードしている。予想されるアミノ酸配列はフラビ
ウィルスあるいはペスチウィルスと相同性を持ち、これ
らのウィルスに近縁のウィルスであろうと考えられてい
る。これらのウィルス構造との比較から、ＨＣＶゲノム
によってコードされるポリペプチドは、１本のポリペプ
チドとして細胞内において合成された後に、アミノ末端
から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ１）、Ｎ
Ｓ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋白質であ
るＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４，ＮＳ５に切断され、それぞ
れの機能を果たすと考えられている（1991年、Houghto
n, M.等、Hepatology、14巻、p381-391）。
５００塩基からなる＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持ち、
約３，０００アミノ酸からなる一つながりのポリペプチ
ドをコードしている。予想されるアミノ酸配列はフラビ
ウィルスあるいはペスチウィルスと相同性を持ち、これ
らのウィルスに近縁のウィルスであろうと考えられてい
る。これらのウィルス構造との比較から、ＨＣＶゲノム
によってコードされるポリペプチドは、１本のポリペプ
チドとして細胞内において合成された後に、アミノ末端
から構造蛋白質であるコア、エンベロープ（Ｅ１）、Ｎ
Ｓ１またはＥ２（ＮＳ１／Ｅ２）と、非構造蛋白質であ
るＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４，ＮＳ５に切断され、それぞ
れの機能を果たすと考えられている（1991年、Houghto
n, M.等、Hepatology、14巻、p381-391）。
【０００４】ＨＣＶの感染を調べるためには、ＨＣＶゲ
ノムによってコードされているこれらのポリペプチドに
よって、患者体内に誘発された抗体を検出する方法が一
般に用いられている。特にコア及びＮＳ３，ＮＳ４に対
する抗体は、ＨＣＶ患者の多数に検出されることから
（1991年、Houghton, M.等、Hepatology、14巻、p381-3
91）、これらのポリペプチドの一部を遺伝子工学的な手
法を用いて生産したものを抗原とした抗原抗体反応を検
出する試薬が作られ、ＨＣＶの感染の有無の判別に役立
って来た。しかしながら、広範囲のＣ型肝炎の感染をエ
ピトープペプチドのみを組合わせた単一のポリペプチド
で、高感度に検出できる抗原は知られていない。
ノムによってコードされているこれらのポリペプチドに
よって、患者体内に誘発された抗体を検出する方法が一
般に用いられている。特にコア及びＮＳ３，ＮＳ４に対
する抗体は、ＨＣＶ患者の多数に検出されることから
（1991年、Houghton, M.等、Hepatology、14巻、p381-3
91）、これらのポリペプチドの一部を遺伝子工学的な手
法を用いて生産したものを抗原とした抗原抗体反応を検
出する試薬が作られ、ＨＣＶの感染の有無の判別に役立
って来た。しかしながら、広範囲のＣ型肝炎の感染をエ
ピトープペプチドのみを組合わせた単一のポリペプチド
で、高感度に検出できる抗原は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、広
範囲のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の感染を高感度に検
出することができる抗原ペプチド、その製造方法、及び
この抗原ペプチドを用いたＨＣＶ感染の検出方法を提供
する。
範囲のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の感染を高感度に検
出することができる抗原ペプチド、その製造方法、及び
この抗原ペプチドを用いたＨＣＶ感染の検出方法を提供
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
め、本発明は、ＨＣＶポリペプチドのコア領域、ＮＳ３
領域及びＮＳ４領域のそれぞれからの２以上のペプチド
領域を連結したポリペプチドから成るＨＣＶ抗体に対す
るキメラ抗原ペプチドを提供する。従って本発明は、Ｈ
ＣＶポリペプチドのコア領域の少なくとも２個のエピト
ープ性ペプチド領域、ＮＳ３領域の２個のエピトープ性
ペプチド領域及びＮＳ４領域の少なくとも２個のエピト
ープ性ペプチド領域を含んで成るＨＣＶキメラ抗原ペプ
チドを提供する。なお、本発明のＨＣＶキメラ抗原ペプ
チドは、ＨＣＶに感染したヒトが産生する抗体と特異的
に結合するものである。
め、本発明は、ＨＣＶポリペプチドのコア領域、ＮＳ３
領域及びＮＳ４領域のそれぞれからの２以上のペプチド
領域を連結したポリペプチドから成るＨＣＶ抗体に対す
るキメラ抗原ペプチドを提供する。従って本発明は、Ｈ
ＣＶポリペプチドのコア領域の少なくとも２個のエピト
ープ性ペプチド領域、ＮＳ３領域の２個のエピトープ性
ペプチド領域及びＮＳ４領域の少なくとも２個のエピト
ープ性ペプチド領域を含んで成るＨＣＶキメラ抗原ペプ
チドを提供する。なお、本発明のＨＣＶキメラ抗原ペプ
チドは、ＨＣＶに感染したヒトが産生する抗体と特異的
に結合するものである。
【０００７】さらに具体的には、本発明は、ＨＣＶポリ
ペプチドのコア領域に含まれる３個のポリペプチド領域
（Ｃ−１，ＣＩ及びＣII）、ＮＳ３領域に含まれる２個
のアミノ酸領域（ＮＳ３−１及びＮＳ３−２）並びにＮ
Ｓ４領域に含まれる４個のアミノ酸領域（ＮＳ４−Ｉ
１，ＮＳ４−Ｉ２，ＮＳ４−II１及びＮＳ４−II２）を
含んで成る（但し、ＣＩ，ＮＳ４−Ｉ１及びＮＳ４−Ｉ
２はＩ型ＨＣＶに由来し、そしてＣII，ＮＳ４−II１及
びＮＳ４−II２はII型ＨＣＶに由来する）、キメラ抗原
ペプチドを提供する。本発明はさらに、このアミノ酸配
列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を
有するキメラ抗原ペプチドを提供する。
ペプチドのコア領域に含まれる３個のポリペプチド領域
（Ｃ−１，ＣＩ及びＣII）、ＮＳ３領域に含まれる２個
のアミノ酸領域（ＮＳ３−１及びＮＳ３−２）並びにＮ
Ｓ４領域に含まれる４個のアミノ酸領域（ＮＳ４−Ｉ
１，ＮＳ４−Ｉ２，ＮＳ４−II１及びＮＳ４−II２）を
含んで成る（但し、ＣＩ，ＮＳ４−Ｉ１及びＮＳ４−Ｉ
２はＩ型ＨＣＶに由来し、そしてＣII，ＮＳ４−II１及
びＮＳ４−II２はII型ＨＣＶに由来する）、キメラ抗原
ペプチドを提供する。本発明はさらに、このアミノ酸配
列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を
有するキメラ抗原ペプチドを提供する。
【０００８】本発明は、好ましくは、Ｃ−１がＨＣＶポ
リペプチドのアミノ酸配列１−４３（配列番号：３６）
から成り、ＣＩがＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配
列６６−８０（配列番号３７）から成り、ＣIIがII型Ｈ
ＣＶポリペプチドのアミノ酸配列６６−８０（配列番
号：３８）から成り、ＮＳ３−１がＨＣＶポリペプチド
のアミノ酸配列１２３８−１３１３（配列番号：３９）
から成り、ＮＳ３−２がＨＣＶポリペプチドのアミノ酸
配列１３６３−１４６０（配列番号：４０）から成り、
ＮＳ４−Ｉ１がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列
１７１２−１７５０（配列番号：４１）から成り、ＮＳ
４−Ｉ２がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６
７８−１７０５（配列番号：４２）から成り、ＮＳ４−
II１がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１７１６
−１７５０（配列番号：４３）から成り、そしてＮＳ４
−II２がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６９
０−１７１３（配列番号：４４）から成るキメラ抗原ペ
プチドを提供する。本発明はまた、このアミノ酸配列に
対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有す
るキメラ抗原ペプチドを提供する。
リペプチドのアミノ酸配列１−４３（配列番号：３６）
から成り、ＣＩがＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配
列６６−８０（配列番号３７）から成り、ＣIIがII型Ｈ
ＣＶポリペプチドのアミノ酸配列６６−８０（配列番
号：３８）から成り、ＮＳ３−１がＨＣＶポリペプチド
のアミノ酸配列１２３８−１３１３（配列番号：３９）
から成り、ＮＳ３−２がＨＣＶポリペプチドのアミノ酸
配列１３６３−１４６０（配列番号：４０）から成り、
ＮＳ４−Ｉ１がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列
１７１２−１７５０（配列番号：４１）から成り、ＮＳ
４−Ｉ２がＩ型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６
７８−１７０５（配列番号：４２）から成り、ＮＳ４−
II１がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１７１６
−１７５０（配列番号：４３）から成り、そしてＮＳ４
−II２がII型ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列１６９
０−１７１３（配列番号：４４）から成るキメラ抗原ペ
プチドを提供する。本発明はまた、このアミノ酸配列に
対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有す
るキメラ抗原ペプチドを提供する。
【０００９】本発明はさらに具体的には、遺伝子型グル
ープ１に属するＨＶＣポリペプチドの第１２３８位〜第
１３１１位または第１２３８位〜第１３１３位のペプチ
ド領域、第１３６３位〜第１４６０位のペプチド領域、
第１７１２位〜１７５１位のペプチド領域、第６６位〜
第８０位のペプチド領域および第１６８６位〜第１７０
４位のペプチド領域；遺伝子型グループ２に属するＨＣ
Ｖポリペプチドの第１７１６位〜第１７５１位のペプチ
ド領域、第６６位〜第８０位のペプチド領域及び第１６
９０位〜第１７１４位のペプチド領域；並びに遺伝子型
グループ１または２に属するＨＣＶポリペプチドの第１
位〜第４３位または第１位〜第４２位のペプチド領域を
含んで成り、これらがエピトープ活性を有しないリンカ
ーペプチドにより連結されていてもよい単一ポリペプチ
ド、あるいは上記アミノ酸配列に対して８０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列を有する単一ポリペプチドか
ら成るＨＣＶキメラ抗原ペプチドを提供する。
ープ１に属するＨＶＣポリペプチドの第１２３８位〜第
１３１１位または第１２３８位〜第１３１３位のペプチ
ド領域、第１３６３位〜第１４６０位のペプチド領域、
第１７１２位〜１７５１位のペプチド領域、第６６位〜
第８０位のペプチド領域および第１６８６位〜第１７０
４位のペプチド領域；遺伝子型グループ２に属するＨＣ
Ｖポリペプチドの第１７１６位〜第１７５１位のペプチ
ド領域、第６６位〜第８０位のペプチド領域及び第１６
９０位〜第１７１４位のペプチド領域；並びに遺伝子型
グループ１または２に属するＨＣＶポリペプチドの第１
位〜第４３位または第１位〜第４２位のペプチド領域を
含んで成り、これらがエピトープ活性を有しないリンカ
ーペプチドにより連結されていてもよい単一ポリペプチ
ド、あるいは上記アミノ酸配列に対して８０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列を有する単一ポリペプチドか
ら成るＨＣＶキメラ抗原ペプチドを提供する。
【００１０】本発明はまた、上記キメラ抗原ペプチドを
コードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、上記Ｄ
ＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクターを提供す
る。本発明はまた、上記発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主を提供する。本発明はさらに、上記宿主を培養
し、培養物からキメラ抗原ペプチドを採取することを特
徴とするキメラ抗原ペプチドの製造方法を提供する。本
発明はまた、ＨＣＶ感染の検出方法であって、被検体を
上記キメラ抗原ペプチドと接触せしめ、抗原−抗体反応
が生じたか否かを判定することを特徴とする方法を提供
する。
コードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、上記Ｄ
ＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクターを提供す
る。本発明はまた、上記発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主を提供する。本発明はさらに、上記宿主を培養
し、培養物からキメラ抗原ペプチドを採取することを特
徴とするキメラ抗原ペプチドの製造方法を提供する。本
発明はまた、ＨＣＶ感染の検出方法であって、被検体を
上記キメラ抗原ペプチドと接触せしめ、抗原−抗体反応
が生じたか否かを判定することを特徴とする方法を提供
する。
【００１１】本発明によって例示される手法に従えば、
抗原抗体反応を利用した方法に於て常に問題となる抗原
抗体間の非特異反応の軽減、抗原抗体間の特異反応の反
応性向上を達成することが出来、抗原抗体反応を利用し
た免疫学的診断方法に適用するためのペプチド抗原の機
能向上を達成出来る。また本発明によって例示されるポ
リペプチドを用いることにより、ＨＣＶ感染患者血清中
のＨＣＶに対する抗体を検出することが可能であり、Ｈ
ＣＶ感染の正しい判別に有用である。本発明によれば、
従来法では複数の抗原を生産しなければ達成できなかっ
た性能が１抗原で達成できる。その結果として従来法よ
りも、例えば生産回数の軽減、生産方法の簡便化、品質
管理など生産に関わる諸検査数の軽減と簡便化などの生
産面での効率化を図ることが可能となった。
抗原抗体反応を利用した方法に於て常に問題となる抗原
抗体間の非特異反応の軽減、抗原抗体間の特異反応の反
応性向上を達成することが出来、抗原抗体反応を利用し
た免疫学的診断方法に適用するためのペプチド抗原の機
能向上を達成出来る。また本発明によって例示されるポ
リペプチドを用いることにより、ＨＣＶ感染患者血清中
のＨＣＶに対する抗体を検出することが可能であり、Ｈ
ＣＶ感染の正しい判別に有用である。本発明によれば、
従来法では複数の抗原を生産しなければ達成できなかっ
た性能が１抗原で達成できる。その結果として従来法よ
りも、例えば生産回数の軽減、生産方法の簡便化、品質
管理など生産に関わる諸検査数の軽減と簡便化などの生
産面での効率化を図ることが可能となった。
【００１２】
【発明の実施の形態】ＨＣＶの感染診断は、ＨＣＶその
ものが発見される前に、ＨＣＶが増殖するために必要な
情報をコードする遺伝子断片の一部が単離されたため、
それを遺伝子組換え技術により酵母を宿主として発現さ
せたものを用いた診断方法が用いられることとなった。
このいわゆる第一世代試薬と呼ばれるＣ１００−３抗原
を用いた試薬（1989年、Kuo, G. 等、Science, 244, p3
62-364）により、ＨＣＶ感染患者の約７割が検出できる
ようになったことが報告されている。
ものが発見される前に、ＨＣＶが増殖するために必要な
情報をコードする遺伝子断片の一部が単離されたため、
それを遺伝子組換え技術により酵母を宿主として発現さ
せたものを用いた診断方法が用いられることとなった。
このいわゆる第一世代試薬と呼ばれるＣ１００−３抗原
を用いた試薬（1989年、Kuo, G. 等、Science, 244, p3
62-364）により、ＨＣＶ感染患者の約７割が検出できる
ようになったことが報告されている。
【００１３】しかし、その後の検討により、Ｃ１００−
３抗体は疑陽性が高く、現在ではＣ１００−３抗原を除
くことにより感染の判別がより確かなものになることが
報告されるに至った（1994年、Zaaijer, H.L. 等、Vox
Sang., 66, p150 ）。一般に特異／非特異反応比を向上
させる方法として、特異反応を生じさせるエピトープの
数を多くし、相対的に特異／非特異反応比を上昇させる
方法がとられている。この方法はＨＣＶ診断薬開発にお
いても用いられており、例えばいわゆる第一世代試薬か
ら第二世代試薬に移行した際には、Ｃ１００−３にコア
領域、ＮＳ３領域の組換え抗原を加えることにより、Ｃ
１００−３のみでは検出できなかった患者中の抗体を検
出できるようになった。
３抗体は疑陽性が高く、現在ではＣ１００−３抗原を除
くことにより感染の判別がより確かなものになることが
報告されるに至った（1994年、Zaaijer, H.L. 等、Vox
Sang., 66, p150 ）。一般に特異／非特異反応比を向上
させる方法として、特異反応を生じさせるエピトープの
数を多くし、相対的に特異／非特異反応比を上昇させる
方法がとられている。この方法はＨＣＶ診断薬開発にお
いても用いられており、例えばいわゆる第一世代試薬か
ら第二世代試薬に移行した際には、Ｃ１００−３にコア
領域、ＮＳ３領域の組換え抗原を加えることにより、Ｃ
１００−３のみでは検出できなかった患者中の抗体を検
出できるようになった。
【００１４】またその際にＣ１００−３の感度が減少
し、結果的に非特異的な反応が減少した（1992年、飯野
四郎と日野邦彦、代謝、29, p503-511；1993年、林紀夫
等、日本臨床、51巻、p329-333）。この際にはＣ１００
−３の疑陽性反応を生じさせる非特異反応が軽減したの
ではなく、特異反応を生じさせる領域（コア領域、ＮＳ
３領域）を加えることにより、相対的にＣ１００−３の
反応性が低下し、結果として特異／非特異反応比が上昇
し、判別結果をより信頼できるものとなった。しかしな
がらこのようにして改良が加えられた検出試薬を用いて
も数多くの問題点が報告されている。
し、結果的に非特異的な反応が減少した（1992年、飯野
四郎と日野邦彦、代謝、29, p503-511；1993年、林紀夫
等、日本臨床、51巻、p329-333）。この際にはＣ１００
−３の疑陽性反応を生じさせる非特異反応が軽減したの
ではなく、特異反応を生じさせる領域（コア領域、ＮＳ
３領域）を加えることにより、相対的にＣ１００−３の
反応性が低下し、結果として特異／非特異反応比が上昇
し、判別結果をより信頼できるものとなった。しかしな
がらこのようにして改良が加えられた検出試薬を用いて
も数多くの問題点が報告されている。
【００１５】例えばもっとも新しい第３世代と呼ばれる
試薬を用いてもＨＣＶが感染している患者の一部につい
て陽性判定をしない（1994年、B.C.Dow 等、Vox Sang.,
67巻、p236-237）、第３世代試薬の判定保留サンプル
にもＰＣＲによってＨＣＶの感染が裏づけられるものが
多く見いだされる（1994年、L.Dussaix 等、J.Clin.Mic
robiol., 32 巻、p2071-2075）などの報告があり更なる
改良が望まれている。本発明はこれらの一般的な手法と
は異なる手法により特異／非特異反応比を上昇させ、判
別結果の信頼性を向上させるものである。
試薬を用いてもＨＣＶが感染している患者の一部につい
て陽性判定をしない（1994年、B.C.Dow 等、Vox Sang.,
67巻、p236-237）、第３世代試薬の判定保留サンプル
にもＰＣＲによってＨＣＶの感染が裏づけられるものが
多く見いだされる（1994年、L.Dussaix 等、J.Clin.Mic
robiol., 32 巻、p2071-2075）などの報告があり更なる
改良が望まれている。本発明はこれらの一般的な手法と
は異なる手法により特異／非特異反応比を上昇させ、判
別結果の信頼性を向上させるものである。
【００１６】つまり、本発明は、ある抗原が患者血清と
反応した場合に、特異的な、診断に重要な抗体結合配列
（エピトープ）により反応しているのか、非特異反応に
より結合しているのかを調べ、診断に重要な特異的反応
を生じさせる配列のみを選択し、一方解析より明らかに
なった非特異反応を呼ぶ配列を除いた人工的な遺伝子配
列からなる抗原を構築することにより本発明は成立す
る。
反応した場合に、特異的な、診断に重要な抗体結合配列
（エピトープ）により反応しているのか、非特異反応に
より結合しているのかを調べ、診断に重要な特異的反応
を生じさせる配列のみを選択し、一方解析より明らかに
なった非特異反応を呼ぶ配列を除いた人工的な遺伝子配
列からなる抗原を構築することにより本発明は成立す
る。
【００１７】本発明を達成するにあたり、ＨＣＶポリペ
プチドのうち抗ＨＣＶ抗体を検出するに必要十分な配列
を検討した。検討するためにコア領域（Ｃ１１抗原：19
92年、M.Saito 等、Clin.Chem., 38巻、p2434-2439）、
ＮＳ３領域（Ｃ７抗原：1992年、M.Saito 等、Clin.Che
m., 38巻、p2434-2439）及びＮＳ４抗原（Ｃ１４−１，
Ｃ１４−２：1994年、T.Tanaka等、Hepatol., 19巻、p1
347-1353）を用いた。ＮＳ５領域については、「ＮＳ５
領域と反応する患者血清は少なく、ＮＳ５抗原とのみ反
応する血清はほとんどなく、またこれらはＨＣＶの存在
を示すＰＣＲでは陰性であることから疑陽性と考えられ
る」との報告が多数あり（1994年、Lancet、 343巻、p8
53-854；1994年、S.Uyttendaele 等、Vox Sang., 66
巻、p122-129）検討に値しないものと判断した。
プチドのうち抗ＨＣＶ抗体を検出するに必要十分な配列
を検討した。検討するためにコア領域（Ｃ１１抗原：19
92年、M.Saito 等、Clin.Chem., 38巻、p2434-2439）、
ＮＳ３領域（Ｃ７抗原：1992年、M.Saito 等、Clin.Che
m., 38巻、p2434-2439）及びＮＳ４抗原（Ｃ１４−１，
Ｃ１４−２：1994年、T.Tanaka等、Hepatol., 19巻、p1
347-1353）を用いた。ＮＳ５領域については、「ＮＳ５
領域と反応する患者血清は少なく、ＮＳ５抗原とのみ反
応する血清はほとんどなく、またこれらはＨＣＶの存在
を示すＰＣＲでは陰性であることから疑陽性と考えられ
る」との報告が多数あり（1994年、Lancet、 343巻、p8
53-854；1994年、S.Uyttendaele 等、Vox Sang., 66
巻、p122-129）検討に値しないものと判断した。
【００１８】本発明を達成するために、必要十分である
領域から、さらに必要な配列、非特異反応を引き起こす
不必要な配列を最初に分類した。ポリペプチドからなる
抗原に存在するエピトープは、比較的短い連続したアミ
ノ酸で構成されるものと、一次構造上離れた部位にある
アミノ酸が高次構造を組むことによって生じるものがあ
る（免疫学辞典：東京化学同人、１９９３年）。
領域から、さらに必要な配列、非特異反応を引き起こす
不必要な配列を最初に分類した。ポリペプチドからなる
抗原に存在するエピトープは、比較的短い連続したアミ
ノ酸で構成されるものと、一次構造上離れた部位にある
アミノ酸が高次構造を組むことによって生じるものがあ
る（免疫学辞典：東京化学同人、１９９３年）。
【００１９】エピトープを決定する代表的な方法とし
て、Geysen等の開発したＰＥＰＳＣＡＮ法（1987年、Ge
ysen等、J.Immunol.Meth., 102巻、p259-274）がある
が、この方法では、比較的短鎖のペプチドを固相上にて
合成させたものと抗体とを反応させることから、比較的
短い（６〜８アミノ酸長）連続したアミノ酸で構成され
るエピトープを決定するのに適している。しかし同方法
では、一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造
を組んだエピトープは検出されにくい。そこでエピトー
プ解析は化学的に合成した、または遺伝子工学的に合成
した比較的長鎖、アミノ酸長として２０〜６０のポリペ
プチドを用いて行う方が望ましい。
て、Geysen等の開発したＰＥＰＳＣＡＮ法（1987年、Ge
ysen等、J.Immunol.Meth., 102巻、p259-274）がある
が、この方法では、比較的短鎖のペプチドを固相上にて
合成させたものと抗体とを反応させることから、比較的
短い（６〜８アミノ酸長）連続したアミノ酸で構成され
るエピトープを決定するのに適している。しかし同方法
では、一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造
を組んだエピトープは検出されにくい。そこでエピトー
プ解析は化学的に合成した、または遺伝子工学的に合成
した比較的長鎖、アミノ酸長として２０〜６０のポリペ
プチドを用いて行う方が望ましい。
【００２０】コア領域のエピトープ解析 ＨＣＶポリペプチドの１から１６０番目のアミノ酸に対
して、１から２０、１１から３０、２１から４０のよう
に１０アミノ酸からなり、それぞれが２０アミノ酸長の
ペプチドを化学合成した。これらと患者血清との反応性
を検討したところ、患者血清と強く反応したペプチドは
１から４０に属するものがほとんどであり、これらは強
い抗原性を示すエピトープであることが分かった。一方
既に本出願人等によって明らかにされているように、Ｈ
ＣＶポリペプチドのコア領域にグループ１，２のＨＣＶ
感染により反応性の異なる領域が存在する（特願平６−
２３２０７３）。その領域とは６１から８０にあたる領
域である。この領域についてグループＩとIIを比較した
例を下に示す。
して、１から２０、１１から３０、２１から４０のよう
に１０アミノ酸からなり、それぞれが２０アミノ酸長の
ペプチドを化学合成した。これらと患者血清との反応性
を検討したところ、患者血清と強く反応したペプチドは
１から４０に属するものがほとんどであり、これらは強
い抗原性を示すエピトープであることが分かった。一方
既に本出願人等によって明らかにされているように、Ｈ
ＣＶポリペプチドのコア領域にグループ１，２のＨＣＶ
感染により反応性の異なる領域が存在する（特願平６−
２３２０７３）。その領域とは６１から８０にあたる領
域である。この領域についてグループＩとIIを比較した
例を下に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】上記の領域に於てグループ間でアミノ酸配
列は保存されているのに対し、グループ間でアミノ酸配
列が異なっていることは明白である。この領域の配列が
抗原性を持ち、グループ判別の抗原として用いることが
可能か否かは、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチド
を作成し、それらが患者血清と反応するか否かを調べる
ことにより明らかとなる。
列は保存されているのに対し、グループ間でアミノ酸配
列が異なっていることは明白である。この領域の配列が
抗原性を持ち、グループ判別の抗原として用いることが
可能か否かは、それぞれのアミノ酸配列を持つペプチド
を作成し、それらが患者血清と反応するか否かを調べる
ことにより明らかとなる。
【００２３】実施例１に検討した結果を記載した。血清
との反応性はＮＳ４領域を用いた場合の反応性と比較す
ると反応する血清数は少ないことから、グループ判別の
ための主要なエピトープを提供しているとは考えられな
い。しかしながらＨＣＶグループ特異的に反応している
ことは、ＰＣＲ及びＮＳ４領域を用いた判別方法により
明らかとなった。さらに詳細に検討すると、ＮＳ４領域
には反応せず、この領域にのみグループ特異的に反応す
る患者血清が、グループＩの血清に於て少数ながら存在
することが明らかになった。
との反応性はＮＳ４領域を用いた場合の反応性と比較す
ると反応する血清数は少ないことから、グループ判別の
ための主要なエピトープを提供しているとは考えられな
い。しかしながらＨＣＶグループ特異的に反応している
ことは、ＰＣＲ及びＮＳ４領域を用いた判別方法により
明らかとなった。さらに詳細に検討すると、ＮＳ４領域
には反応せず、この領域にのみグループ特異的に反応す
る患者血清が、グループＩの血清に於て少数ながら存在
することが明らかになった。
【００２４】実施例１で示したものと同様の結果は、町
田等によって〔Machida et al., Hepatology, (1992) 1
6 : 886-891 〕、６５から８１の領域の配列を持つペプ
チドを用いて示されている。故にコア領域からはＨＣＶ
診断に必要なエピトープ配列は１から４０番目の配列
と、グループ１ ＨＣＶの６５から８０、グループ２
ＨＣＶの６５から８０番目の配列であることが判明し
た。
田等によって〔Machida et al., Hepatology, (1992) 1
6 : 886-891 〕、６５から８１の領域の配列を持つペプ
チドを用いて示されている。故にコア領域からはＨＣＶ
診断に必要なエピトープ配列は１から４０番目の配列
と、グループ１ ＨＣＶの６５から８０、グループ２
ＨＣＶの６５から８０番目の配列であることが判明し
た。
【００２５】ＮＳ３領域のエピトープ解析 ＮＳ３領域の一部、ＨＣＶポリペプチドの１２２１から
１４７３までからなるポリペプチドに結合する抗体は、
多くの患者血清中に認められ、強い抗原性が認められる
（特願平２−３３９５８９）。この領域のうち特異的反
応に重要な領域を限定するため、ＨＣＶポリペプチドの
１２２１から１２８１（Ｃ７−１）、１２６５から１３
３０（Ｃ７−２）、１３０８から１３７１（Ｃ７−
３）、１３４０から１４０９（Ｃ７−４）、１３８８か
ら１４４３（Ｃ７−５）、１４０９から１４７３（Ｃ７
−６）の配列を持つペプチドを遺伝子工学的に作成し、
患者血清中の抗体との反応性を検討した。
１４７３までからなるポリペプチドに結合する抗体は、
多くの患者血清中に認められ、強い抗原性が認められる
（特願平２−３３９５８９）。この領域のうち特異的反
応に重要な領域を限定するため、ＨＣＶポリペプチドの
１２２１から１２８１（Ｃ７−１）、１２６５から１３
３０（Ｃ７−２）、１３０８から１３７１（Ｃ７−
３）、１３４０から１４０９（Ｃ７−４）、１３８８か
ら１４４３（Ｃ７−５）、１４０９から１４７３（Ｃ７
−６）の配列を持つペプチドを遺伝子工学的に作成し、
患者血清中の抗体との反応性を検討した。
【００２６】その結果Ｃ７−２，Ｃ７−５及びＣ７−６
が患者血清の比較的多くと反応した。しかしながら、全
体（１２２１から１４７３）と反応する血清のうち、Ｃ
７−１からＣ７−６までの何れかに反応する血清の割合
は約６０％しかなく、用いた組換え抗原が比較的長鎖に
も関わらず、反応性が消失してしまうエピトープ、つま
り一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組
んだ強い構造エピトープが存在していることを示す。一
方Ｃ７−３は患者血清ともよく反応したが、健常人血清
の多くとも反応し、この領域には非特異反応を生じせし
める配列が存在することが分かった。
が患者血清の比較的多くと反応した。しかしながら、全
体（１２２１から１４７３）と反応する血清のうち、Ｃ
７−１からＣ７−６までの何れかに反応する血清の割合
は約６０％しかなく、用いた組換え抗原が比較的長鎖に
も関わらず、反応性が消失してしまうエピトープ、つま
り一次構造上離れた部位にあるアミノ酸が高次構造を組
んだ強い構造エピトープが存在していることを示す。一
方Ｃ７−３は患者血清ともよく反応したが、健常人血清
の多くとも反応し、この領域には非特異反応を生じせし
める配列が存在することが分かった。
【００２７】次にこのような高次構造依存的なエピトー
プを生じさせる領域が何れに存在するのかを調べた。Ｈ
ＣＶポリペプチドの１３４０から１４７３からなる比較
的長鎖のポリペプチド、Ｃ７−４６、を作成し患者血清
との反応性を検討した。この比較的長鎖のペプチドは患
者血清の多くと反応し、その反応する血清は、Ｃ７−
４，Ｃ７−５，Ｃ７−６の何れかに反応する血清と、こ
れらには反応しないが、長鎖のＣ７−４６には反応する
血清から成り立っていた。
プを生じさせる領域が何れに存在するのかを調べた。Ｈ
ＣＶポリペプチドの１３４０から１４７３からなる比較
的長鎖のポリペプチド、Ｃ７−４６、を作成し患者血清
との反応性を検討した。この比較的長鎖のペプチドは患
者血清の多くと反応し、その反応する血清は、Ｃ７−
４，Ｃ７−５，Ｃ７−６の何れかに反応する血清と、こ
れらには反応しないが、長鎖のＣ７−４６には反応する
血清から成り立っていた。
【００２８】このことから、Ｃ７−４６という長鎖にす
ることにより、高次構造依存的なエピトープが構成さ
れ、反応性が向上したことが示された。Ｃ７−４６の反
応性はさらに短くしたＣ７−Ｎａｔｉｖｅでも保持され
ていた。これらの結果から、ＮＳ３領域のエピトープ領
域としては、Ｃ７−２を含む１２３８から１３１１番目
の配列と、Ｃ７−４６の一部、つまり１３６６から１４
６０番目の配列が抗ＨＣＶ抗体検出に必要十分であるこ
とが判明した。
ることにより、高次構造依存的なエピトープが構成さ
れ、反応性が向上したことが示された。Ｃ７−４６の反
応性はさらに短くしたＣ７−Ｎａｔｉｖｅでも保持され
ていた。これらの結果から、ＮＳ３領域のエピトープ領
域としては、Ｃ７−２を含む１２３８から１３１１番目
の配列と、Ｃ７−４６の一部、つまり１３６６から１４
６０番目の配列が抗ＨＣＶ抗体検出に必要十分であるこ
とが判明した。
【００２９】ＮＳ４領域ペプチドのエピトープ解析 ＮＳ４領域の一部をコードするＣ１４−１−２抗原、Ｃ
１４−２−２抗原は、それぞれＨＣＶのグループ１、グ
ループ２に感染した患者の血清中の抗体と反応する（特
願平５−１９４１８５）。従来ＨＣＶ感染判別に用いて
いるＮＳ４領域からなるＣ１００−３抗原、およびＣ１
００−３抗原の一部からなる５−１−１抗原はＣ１４−
１−２抗原と似た反応性を呈する。すなわち従来用いら
れているＣ１００−３抗原、およびＣ１００−３抗原の
一部からなる５−１−１抗原はグループ１に感染した患
者の血清とはよく反応するものの、グループ２に感染し
た患者血清との反応性が低い。
１４−２−２抗原は、それぞれＨＣＶのグループ１、グ
ループ２に感染した患者の血清中の抗体と反応する（特
願平５−１９４１８５）。従来ＨＣＶ感染判別に用いて
いるＮＳ４領域からなるＣ１００−３抗原、およびＣ１
００−３抗原の一部からなる５−１−１抗原はＣ１４−
１−２抗原と似た反応性を呈する。すなわち従来用いら
れているＣ１００−３抗原、およびＣ１００−３抗原の
一部からなる５−１−１抗原はグループ１に感染した患
者の血清とはよく反応するものの、グループ２に感染し
た患者血清との反応性が低い。
【００３０】そのため、ＮＳ４領域を用いてＨＣＶ感染
の有無を検出するためにはグループ１，２の何れのＨＣ
Ｖに感染していても反応する抗原でなければならない。
そこで本発明者等はＣ１４−１−２，Ｃ１４−２−２抗
原のエピトープを組み合わせることにより、既に用いら
れている抗原の機能を増強させることに成功し、この組
み合わせた抗原ポリペプチドを最適なＨＣＶ抗体検出の
ための抗原の一部として用いることにした。
の有無を検出するためにはグループ１，２の何れのＨＣ
Ｖに感染していても反応する抗原でなければならない。
そこで本発明者等はＣ１４−１−２，Ｃ１４−２−２抗
原のエピトープを組み合わせることにより、既に用いら
れている抗原の機能を増強させることに成功し、この組
み合わせた抗原ポリペプチドを最適なＨＣＶ抗体検出の
ための抗原の一部として用いることにした。
【００３１】これらのポリペプチドに存在するエピトー
プは、ペプチドを用いた阻害実験により決定した。実施
例２に具体的な方法を記載したが、Ｃ１４−１−２抗原
と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１−Ｗ，１−
Ｘ，１−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに
１−Ｗで阻害が認められたものについては、１−Ｗの配
列を分断化した配列を持つ１−Ｗａを加えると反応の阻
害が認められた。一方Ｃ１４−２−２抗原と患者血清中
の抗体との反応は、ペプチド２−Ｗ，２−Ｘ，２−Ｙを
反応に加えることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害
が認められたものについては、２−Ｗの配列を分断化し
た配列を持つ２−Ｗａを加えると反応の阻害が認められ
た。
プは、ペプチドを用いた阻害実験により決定した。実施
例２に具体的な方法を記載したが、Ｃ１４−１−２抗原
と患者血清中の抗体との反応は、ペプチド１−Ｗ，１−
Ｘ，１−Ｙを反応に加えることにより阻害され、さらに
１−Ｗで阻害が認められたものについては、１−Ｗの配
列を分断化した配列を持つ１−Ｗａを加えると反応の阻
害が認められた。一方Ｃ１４−２−２抗原と患者血清中
の抗体との反応は、ペプチド２−Ｗ，２−Ｘ，２−Ｙを
反応に加えることにより阻害され、さらに２−Ｗで阻害
が認められたものについては、２−Ｗの配列を分断化し
た配列を持つ２−Ｗａを加えると反応の阻害が認められ
た。
【００３２】これらの結果からグループ１ ＨＣＶ感染
患者血清中に有る抗体のエピトープは、グループ１ Ｈ
ＣＶのポリペプチド配列の１７１２から１７５０番目と
１６７８から１７０５番目の配列にあり、グループ２
ＨＣＶ感染患者血清中に有る抗体のエピトープはグルー
プ２ ＨＣＶのポリペプチド配列の１７１６から１７５
０番目と１６９０から１７１３番目にあることが判明し
た。
患者血清中に有る抗体のエピトープは、グループ１ Ｈ
ＣＶのポリペプチド配列の１７１２から１７５０番目と
１６７８から１７０５番目の配列にあり、グループ２
ＨＣＶ感染患者血清中に有る抗体のエピトープはグルー
プ２ ＨＣＶのポリペプチド配列の１７１６から１７５
０番目と１６９０から１７１３番目にあることが判明し
た。
【００３３】エピトープキメラ抗原の設計 本発明によって可能となったエピトープキメラ抗原は、
明らかになったエピトープをただ単純に結合させること
では不十分である。単純にエピトープ配列を組み合わせ
た場合には、エピトープの結合によって生じる配列が、
新たなエピトープとなり、非特異反応を生じさせる可能
性が生じる。またペプチドが短鎖の場合には、ＮＳ３領
域のエピトープ解析で示したように、エピトープとして
機能しないことがある。そのため、ペプチドの鎖長を長
くすることにより、短鎖ペプチドでは見いだせなかった
このような配列がエピトープとして機能し、目的とする
機能以外の働きをする可能性がある。
明らかになったエピトープをただ単純に結合させること
では不十分である。単純にエピトープ配列を組み合わせ
た場合には、エピトープの結合によって生じる配列が、
新たなエピトープとなり、非特異反応を生じさせる可能
性が生じる。またペプチドが短鎖の場合には、ＮＳ３領
域のエピトープ解析で示したように、エピトープとして
機能しないことがある。そのため、ペプチドの鎖長を長
くすることにより、短鎖ペプチドでは見いだせなかった
このような配列がエピトープとして機能し、目的とする
機能以外の働きをする可能性がある。
【００３４】本発明は、このような問題点を解決する方
法をも示すものである。エピトープキメラ抗原は以下の
手順に従うことにより効率的に設計することが出来る。
始めにエピトープペプチドの性質を調べることが重要で
ある。即ちエピトープはそれに結合する抗体の結合部位
（パラトープ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワ
ールス力、疎水結合等により非共有的に結合する。結合
が成立するためにはエピトープ上のこれらの力が作用す
る部位と、パラトープ上の作用する部位とが一定の空間
配置を取ることが必要である。
法をも示すものである。エピトープキメラ抗原は以下の
手順に従うことにより効率的に設計することが出来る。
始めにエピトープペプチドの性質を調べることが重要で
ある。即ちエピトープはそれに結合する抗体の結合部位
（パラトープ）と水素結合、イオン結合、ファンデルワ
ールス力、疎水結合等により非共有的に結合する。結合
が成立するためにはエピトープ上のこれらの力が作用す
る部位と、パラトープ上の作用する部位とが一定の空間
配置を取ることが必要である。
【００３５】すなわちエピトープとして機能する配列か
らなるペプチドが、エピトープとして機能するために
は、パラトープに結合出来る立体構造を取ることが必要
である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長さが
変わる、ペプチドにアミノ酸が付加されることにより変
化することから、エピトープキメラ抗原において、エピ
トープペプチドを単に付加した場合には抗原性を失う可
能性が生じる。そのためエピトープキメラ抗原を設計す
る際にはエピトープキメラ抗原にエピトープペプチドを
導入することにより抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との
反応性を向上させるための工夫をする必要がある。その
ため組み合わせるエピトープペプチドの本来の構造につ
いての情報が必要である。
らなるペプチドが、エピトープとして機能するために
は、パラトープに結合出来る立体構造を取ることが必要
である。一方ペプチドの高次構造は、ペプチドの長さが
変わる、ペプチドにアミノ酸が付加されることにより変
化することから、エピトープキメラ抗原において、エピ
トープペプチドを単に付加した場合には抗原性を失う可
能性が生じる。そのためエピトープキメラ抗原を設計す
る際にはエピトープキメラ抗原にエピトープペプチドを
導入することにより抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との
反応性を向上させるための工夫をする必要がある。その
ため組み合わせるエピトープペプチドの本来の構造につ
いての情報が必要である。
【００３６】エピトープペプチドの構造を知るために
は、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）
分析により構造が分析出来ているものであれば、それを
用いれば良いが、一般にはこのような例は少ないことか
ら、アミノ酸配列からその２次構造予測を行う方法、例
えばChouとFasman等によって開発された計算式〔Chou
P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13：211-222
; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 1
3：222-245 ; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1978) Ann.Re
v.Biochem. 47：251-276 〕やRobson等によって開発さ
れた計算式〔Robson B. & Suzuki E. (1976) J.Mol.Bio
l. 107：327-356 ; Garnier, J., OsguthorpeD.J. & Ro
bson B. (1978) J.Mol.Biol. 120 : 97-120〕などを利
用し解析を行う。
は、結晶構造のエックス線回析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）
分析により構造が分析出来ているものであれば、それを
用いれば良いが、一般にはこのような例は少ないことか
ら、アミノ酸配列からその２次構造予測を行う方法、例
えばChouとFasman等によって開発された計算式〔Chou
P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 13：211-222
; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1974) Biochemistry 1
3：222-245 ; Chou P.Y. & Fasman G.D. (1978) Ann.Re
v.Biochem. 47：251-276 〕やRobson等によって開発さ
れた計算式〔Robson B. & Suzuki E. (1976) J.Mol.Bio
l. 107：327-356 ; Garnier, J., OsguthorpeD.J. & Ro
bson B. (1978) J.Mol.Biol. 120 : 97-120〕などを利
用し解析を行う。
【００３７】さらにHoppとWoods 〔Hopp T.P. & Woods
K.R. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：3824-3828
〕やKyteとDoolittle 〔Kyte J. & Doolittle R.F. (1
982)J.Mol.Biol. 157 : 105-132 〕等によって開発され
た計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを行いエ
ピトープペプチドが示す性質に関する情報を得ておくこ
とが好ましい。さらにJameson とWolf〔Jameson B.A. &
Wolf H. (1988) Comput.Applic. in Biosciences 4 :
181-186 〕によって提唱されている計算式に従い、目的
とするペプチドの抗原性に関しての予測した性質も知っ
ておくことは好ましいことである。
K.R. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：3824-3828
〕やKyteとDoolittle 〔Kyte J. & Doolittle R.F. (1
982)J.Mol.Biol. 157 : 105-132 〕等によって開発され
た計算式に従い、蛋白質の疎水−親水プロットを行いエ
ピトープペプチドが示す性質に関する情報を得ておくこ
とが好ましい。さらにJameson とWolf〔Jameson B.A. &
Wolf H. (1988) Comput.Applic. in Biosciences 4 :
181-186 〕によって提唱されている計算式に従い、目的
とするペプチドの抗原性に関しての予測した性質も知っ
ておくことは好ましいことである。
【００３８】さらにJanin 等やEmini 等によって提唱さ
れている表面部位の予測法〔JaminJ., Wodak S., Levit
t M. & Maigret B. (1978) J.Mol.Biol. 125 : 357-386
;Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., & Boger J.
(1965) J.Biol. 55 : 836-839〕、Karplus 等によって
提唱されている蛋白質の可塑性予測法〔Karplus P.A.&
Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 72 : 212-213 〕で得
られる情報も抗原性を予想する際に役立つ。
れている表面部位の予測法〔JaminJ., Wodak S., Levit
t M. & Maigret B. (1978) J.Mol.Biol. 125 : 357-386
;Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., & Boger J.
(1965) J.Biol. 55 : 836-839〕、Karplus 等によって
提唱されている蛋白質の可塑性予測法〔Karplus P.A.&
Schulz G.E. (1985) Naturwiss. 72 : 212-213 〕で得
られる情報も抗原性を予想する際に役立つ。
【００３９】エピトープキメラ抗原の設計においては、
上記の予測方法を参考に、組み合わせるエピトープペプ
チドの導入により抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との反
応性を向上させるように、さらに組み合わせることによ
り健常者血清と反応しないようなリンカーペプチドを結
合するように注意を払う必要がある。本発明のエピトー
プキメラ抗原を完成させるためには、上記のような予測
法に基づき遺伝子設計を行なうのみでは不十分であり、
さらにそれを発現させ、抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清
との反応性を確認し、さらに多数の健常者血清を用い、
非特異的な反応を生じていないことを確認することが必
要である。
上記の予測方法を参考に、組み合わせるエピトープペプ
チドの導入により抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清との反
応性を向上させるように、さらに組み合わせることによ
り健常者血清と反応しないようなリンカーペプチドを結
合するように注意を払う必要がある。本発明のエピトー
プキメラ抗原を完成させるためには、上記のような予測
法に基づき遺伝子設計を行なうのみでは不十分であり、
さらにそれを発現させ、抗体陽性のＨＣＶ感染患者血清
との反応性を確認し、さらに多数の健常者血清を用い、
非特異的な反応を生じていないことを確認することが必
要である。
【００４０】上記の設計方針に基づき設計を行ない、大
腸菌を用いて発現精製した異なる並びの抗原の機能を、
上記の機能確認方法により確かめることにより、配列番
号１に示したアミノ酸配列中、第１８位のアミノ酸Ｔｈ
ｒ以後のアミノ酸配列からなるエピトープキメラ抗原を
完成するに至った。この抗原においてエピトープ断片は
（１２３８−１３１３；グループ１）−（１３６３−１
４６０；グループ１）−（１７１２−１７５０；グルー
プ１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１
７０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グルー
プ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１
７１３；グループ２）−（１−４３）の並びで結合され
ている。この配列が好ましい抗原配列の様態の一つであ
るが、上記の設計方針と機能確認方法に従えば他の並び
も可能である。
腸菌を用いて発現精製した異なる並びの抗原の機能を、
上記の機能確認方法により確かめることにより、配列番
号１に示したアミノ酸配列中、第１８位のアミノ酸Ｔｈ
ｒ以後のアミノ酸配列からなるエピトープキメラ抗原を
完成するに至った。この抗原においてエピトープ断片は
（１２３８−１３１３；グループ１）−（１３６３−１
４６０；グループ１）−（１７１２−１７５０；グルー
プ１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１
７０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グルー
プ２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１
７１３；グループ２）−（１−４３）の並びで結合され
ている。この配列が好ましい抗原配列の様態の一つであ
るが、上記の設計方針と機能確認方法に従えば他の並び
も可能である。
【００４１】例えば、（１２３８−１３１３；グループ
１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−（１
７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８０；グ
ループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ１様）
−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６−８
０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ
２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片か
らなる抗原は、好ましい配列の様態の一つとして例示さ
れる。ここで、「グループ１様」とは、対応する領域の
グループ１のアミノ酸配列に対して相同性の高いアミノ
酸配列を意味する。
１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−（１
７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８０；グ
ループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ１様）
−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６−８
０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グループ
２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片か
らなる抗原は、好ましい配列の様態の一つとして例示さ
れる。ここで、「グループ１様」とは、対応する領域の
グループ１のアミノ酸配列に対して相同性の高いアミノ
酸配列を意味する。
【００４２】上記の方針に基づいて設計されたキメラ抗
原ペプチドの全アミノ酸配列の例を配列番号：４７に示
す。この配列中、３位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸
配列がキメラ抗原ペプチドのアミノ酸配列である。配列
番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド及び
配列番号：４７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドはいずれも、本願発明の抗原性を有することが確認さ
れており、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と配列番
号：４７に示すアミノ酸配列とは約８０％の相同性を有
する。従って、天然配列に基づく、配列番号：１に示す
アミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列の相同
性を有するアミノ酸配列を有し、且つＨＣＶに感染した
ヒトが産生する抗体と特異的に結合する抗原ペプチドも
本発明の範囲に含まれる。
原ペプチドの全アミノ酸配列の例を配列番号：４７に示
す。この配列中、３位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸
配列がキメラ抗原ペプチドのアミノ酸配列である。配列
番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド及び
配列番号：４７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドはいずれも、本願発明の抗原性を有することが確認さ
れており、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と配列番
号：４７に示すアミノ酸配列とは約８０％の相同性を有
する。従って、天然配列に基づく、配列番号：１に示す
アミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列の相同
性を有するアミノ酸配列を有し、且つＨＣＶに感染した
ヒトが産生する抗体と特異的に結合する抗原ペプチドも
本発明の範囲に含まれる。
【００４３】エピトープキメラ抗原の作成 前述の方法で設計したエピトープキメラ抗原は、種々の
原理に基づく化学合成法により作成することが可能であ
るが、遺伝子工学的な手法を用いて作成することも可能
である。遺伝子工学的な手法とは、配列番号：１に示さ
れるアミノ酸配列中、少なくとも１８位のアミノ酸Ｔｈ
ｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：４７に示すアミノ
酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列あるいはそ
の部分配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片
を、ＨＣＶゲノムＲＮＡやそれのｃＤＮＡから業界で一
般的に用いられている方法により単離する過程、もしく
は化学的に合成する過程、及びこれらの技術を組み合わ
せて得る工程を含む。
原理に基づく化学合成法により作成することが可能であ
るが、遺伝子工学的な手法を用いて作成することも可能
である。遺伝子工学的な手法とは、配列番号：１に示さ
れるアミノ酸配列中、少なくとも１８位のアミノ酸Ｔｈ
ｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：４７に示すアミノ
酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列あるいはそ
の部分配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片
を、ＨＣＶゲノムＲＮＡやそれのｃＤＮＡから業界で一
般的に用いられている方法により単離する過程、もしく
は化学的に合成する過程、及びこれらの技術を組み合わ
せて得る工程を含む。
【００４４】また上記ペプチドをコードするＤＮＡ断片
を含む複製可能な発現ベクターを構築する過程、前記発
現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形
質転換体を得る過程、さらに前記形質転換体を培養し発
現産物を発現させる工程、及び発現したペプチドを回収
する工程を含む。例えば配列番号１に示すアミノ酸配列
中第１８位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：
４７に示すアミノ酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ
酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ断片は実施
例４又は７に示すように作成することが可能である。さ
らに実施例５又は７に示す様に形質転換体を取得し、実
施例５及び８に示すようにして形質転換体を培養し、該
ペプチドを分離、回収することが可能である。
を含む複製可能な発現ベクターを構築する過程、前記発
現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形
質転換体を得る過程、さらに前記形質転換体を培養し発
現産物を発現させる工程、及び発現したペプチドを回収
する工程を含む。例えば配列番号１に示すアミノ酸配列
中第１８位のＴｈｒ以後のアミノ酸配列又は配列番号：
４７に示すアミノ酸配列中第３位のＴｈｒ以後のアミノ
酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ断片は実施
例４又は７に示すように作成することが可能である。さ
らに実施例５又は７に示す様に形質転換体を取得し、実
施例５及び８に示すようにして形質転換体を培養し、該
ペプチドを分離、回収することが可能である。
【００４５】遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発
現ベクターとしては、実施例に開示されている大腸菌を
宿主とし、大腸菌トリプトファンオペロンの制御下に発
現させるベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大
腸菌トリプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモータ
ー、Ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐｈｏ
Ａプロモーター、λプロモーター等を利用したベクター
を用いることが可能である。
現ベクターとしては、実施例に開示されている大腸菌を
宿主とし、大腸菌トリプトファンオペロンの制御下に発
現させるベクター以外にも、大腸菌を宿主としては、大
腸菌トリプトファンオペロン以外にもＴａｃプロモータ
ー、Ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐｈｏ
Ａプロモーター、λプロモーター等を利用したベクター
を用いることが可能である。
【００４６】また大腸菌以外にも酵母を宿主とし、解糖
系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒ
ドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ，II、ピ
ルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオ
ースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロ
モーターを利用した発現ベクターを用いて発現させるこ
とも可能である。さらに昆虫細胞を宿主としバキュロウ
ィルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞例えばＣＨ
Ｏ細胞や、ＣＯＳ細胞Ｈｅｌａ細胞等を宿主とし、慣用
に用いられる組み込み型発現ベクターやワクチニアウィ
ルスをベクターとした発現系、アデノウィルスや慣用に
用いられるウィルスをベクターとした発現系を利用して
も発現可能である。
系遺伝子、たとえばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒ
ドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼＩ，II、ピ
ルビン酸キナーゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオ
ースイソメラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロ
モーターを利用した発現ベクターを用いて発現させるこ
とも可能である。さらに昆虫細胞を宿主としバキュロウ
ィルスをベクターとした発現系、哺乳類細胞例えばＣＨ
Ｏ細胞や、ＣＯＳ細胞Ｈｅｌａ細胞等を宿主とし、慣用
に用いられる組み込み型発現ベクターやワクチニアウィ
ルスをベクターとした発現系、アデノウィルスや慣用に
用いられるウィルスをベクターとした発現系を利用して
も発現可能である。
【００４７】さらに遺伝子工学的手法を用いる場合に
は、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質
として発現させることも慣用に用いられる手段である。
かのごとく作成したキメラ抗原は実施例６及び９に示す
ようにＨＣＶ患者血清中の抗ＨＣＶ抗体を検出すること
が可能である。
は、キメラ抗原ペプチドを他のペプチドとの融合蛋白質
として発現させることも慣用に用いられる手段である。
かのごとく作成したキメラ抗原は実施例６及び９に示す
ようにＨＣＶ患者血清中の抗ＨＣＶ抗体を検出すること
が可能である。
【００４８】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものでは無いことは、
上述のごとく明らかである。実施例１ ．コア領域のエピトープの解析 配列番号２及び３の配列を持つペプチドをアプライドバ
イオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３０
Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより目
的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の配
列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により確
認した。
が、本発明は実施例に限定されるものでは無いことは、
上述のごとく明らかである。実施例１ ．コア領域のエピトープの解析 配列番号２及び３の配列を持つペプチドをアプライドバ
イオシステム社のペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ：４３０
Ａ）を用いて合成し、逆相クロマトグラフィーにより目
的のペプチドを精製した。精製したペプチドが目的の配
列であることはアミノ酸シークエンサーの分析により確
認した。
【００４９】このペプチドを２．５μｇ／mlの濃度とな
るように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．
５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジ
ュールプレートにウェルあたり１００μｌのせ、室温に
２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり
１００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸
緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置し抗原を
プレートに固定した。
るように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．
５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチモジ
ュールプレートにウェルあたり１００μｌのせ、室温に
２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり
１００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、０．１Ｍ燐酸
緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置し抗原を
プレートに固定した。
【００５０】各ウェルに検体希釈液〔０．５％カゼイ
ン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mMＥＤＴＡ、０．１Ｍ
燐酸緩衝液（pH７．０）〕によって１１倍に希釈した非
Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清１００μｌを加え４５分静置
した。ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で洗浄した後、１００μｌのホースラディッシュパーオ
キシダーゼによって標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を加
え、４５分静置した。ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで洗浄した後、常法に従い、発色法によ
り酵素活性を計測した。その結果を表２にまとめて示
す。
ン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mMＥＤＴＡ、０．１Ｍ
燐酸緩衝液（pH７．０）〕によって１１倍に希釈した非
Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清１００μｌを加え４５分静置
した。ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で洗浄した後、１００μｌのホースラディッシュパーオ
キシダーゼによって標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を加
え、４５分静置した。ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで洗浄した後、常法に従い、発色法によ
り酵素活性を計測した。その結果を表２にまとめて示
す。
【００５１】
【表２】
【００５２】この結果、配列番号：２及び３に示すアミ
ノ酸配列がそれぞれＩ型ＨＣＶポリペプチド及びII型Ｈ
ＣＶポリペプチドに対応していることが確認された。実施例２ ．ＮＳ３領域のエピトープ解析 ＮＳ３領域の部分配列を持つ断片を得るため、表３に示
す配列を持つ１２種類のプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成
機（ABI 社、Ｍｏｄｅｌ ３９４ＡまたはMilligen／Bi
osearch 社、Ｍｏｄｅｌ ８７００）を用いて合成し
た。
ノ酸配列がそれぞれＩ型ＨＣＶポリペプチド及びII型Ｈ
ＣＶポリペプチドに対応していることが確認された。実施例２ ．ＮＳ３領域のエピトープ解析 ＮＳ３領域の部分配列を持つ断片を得るため、表３に示
す配列を持つ１２種類のプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成
機（ABI 社、Ｍｏｄｅｌ ３９４ＡまたはMilligen／Bi
osearch 社、Ｍｏｄｅｌ ８７００）を用いて合成し
た。
【００５３】
【表３】
【００５４】ＮＳ３領域を含むDNA p3N2（特開平５−８
４，０８５）１ngを鋳型とし、１Ｆと１Ｒ、２Ｆと２
Ｒ、３Ｆと３Ｒ、４Ｆと４Ｒ、５Ｆと５Ｒ、または６Ｆ
と６Ｒの組み合わせでプライマーをそれぞれ１００pmol
用いＰＣＲ（polymerase chainreaction ）を行ない、
１Ｆと１ＲではＨＣＶポリペプチド１２２１から１２８
１に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−１断片）、
２Ｆと２Ｒでは１２６５から１３３０に相当する領域を
コードする断片（Ｃ７−２断片）、３Ｆと３Ｒでは１３
０８から１３７１に相当する領域をコードする断片（Ｃ
７−３断片）、４Ｆと４Ｒでは１３４０から１４０９に
相当する領域をコードする断片（Ｃ７−４断片）、５Ｆ
と５Ｒでは１３８８から１４４３に相当する領域をコー
ドする断片（Ｃ７−５断片）、または６Ｆと６Ｒでは１
４０９から１４７３に相当する領域をコードする断片
（Ｃ７−６断片）、さらに４Ｆと６Ｒにより１３４０か
ら１４７３に相当する断片Ｃ７−４６を得た。
４，０８５）１ngを鋳型とし、１Ｆと１Ｒ、２Ｆと２
Ｒ、３Ｆと３Ｒ、４Ｆと４Ｒ、５Ｆと５Ｒ、または６Ｆ
と６Ｒの組み合わせでプライマーをそれぞれ１００pmol
用いＰＣＲ（polymerase chainreaction ）を行ない、
１Ｆと１ＲではＨＣＶポリペプチド１２２１から１２８
１に相当する領域をコードする断片（Ｃ７−１断片）、
２Ｆと２Ｒでは１２６５から１３３０に相当する領域を
コードする断片（Ｃ７−２断片）、３Ｆと３Ｒでは１３
０８から１３７１に相当する領域をコードする断片（Ｃ
７−３断片）、４Ｆと４Ｒでは１３４０から１４０９に
相当する領域をコードする断片（Ｃ７−４断片）、５Ｆ
と５Ｒでは１３８８から１４４３に相当する領域をコー
ドする断片（Ｃ７−５断片）、または６Ｆと６Ｒでは１
４０９から１４７３に相当する領域をコードする断片
（Ｃ７−６断片）、さらに４Ｆと６Ｒにより１３４０か
ら１４７３に相当する断片Ｃ７−４６を得た。
【００５５】増幅されたＤＮＡ断片は２％アガロース電
気泳動により分離し、Mermaid Kit（Bio101社）を用い
アガロース断片から回収した。回収した断片はｐＧＥＭ
−Ｔ（Promega 社）を用いてクローニングし、Dye term
inator cyclesequencing kit(ABI)を用いDNA sequencer
(ABI：Model 373A）により分析することにより塩基配
列を決定し、目的の断片がクローニング出来ていること
を確認した。
気泳動により分離し、Mermaid Kit（Bio101社）を用い
アガロース断片から回収した。回収した断片はｐＧＥＭ
−Ｔ（Promega 社）を用いてクローニングし、Dye term
inator cyclesequencing kit(ABI)を用いDNA sequencer
(ABI：Model 373A）により分析することにより塩基配
列を決定し、目的の断片がクローニング出来ていること
を確認した。
【００５６】断片がクローニングされたプラスミドＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで切断し、２％アガロース
電気泳動により分離し、Mermaid Kit （Bio101社）を用
いＣ７−１からＣ７−６断片をそれぞれ回収した。回収
した断片をtrc promoterによりＴｒｐＥとの融合蛋白質
として発現させるためのベクターｐｔｒｃＴｒｐＥにク
ローニングすることによりｐＣ７−１，ｐＣ７−２，ｐ
Ｃ７−３，ｐＣ７−４，ｐＣ７−５，ｐＣ７−６を得
た。またＣ７−４６については、Mermaid Kit （Bio101
社）を用い回収した断片をｐＡＴ−ＴｒｐＥにクローニ
ングすることによりｐＣ７−４６を得た。これらのプラ
スミドによる大腸菌ＴＯＰ−１０株（Invitrogen社）の
形質転換体を用い、組換え抗原を発現させた。
ＡをＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで切断し、２％アガロース
電気泳動により分離し、Mermaid Kit （Bio101社）を用
いＣ７−１からＣ７−６断片をそれぞれ回収した。回収
した断片をtrc promoterによりＴｒｐＥとの融合蛋白質
として発現させるためのベクターｐｔｒｃＴｒｐＥにク
ローニングすることによりｐＣ７−１，ｐＣ７−２，ｐ
Ｃ７−３，ｐＣ７−４，ｐＣ７−５，ｐＣ７−６を得
た。またＣ７−４６については、Mermaid Kit （Bio101
社）を用い回収した断片をｐＡＴ−ＴｒｐＥにクローニ
ングすることによりｐＣ７−４６を得た。これらのプラ
スミドによる大腸菌ＴＯＰ−１０株（Invitrogen社）の
形質転換体を用い、組換え抗原を発現させた。
【００５７】組換え抗原の発現は、Ｃ７−１からＣ７−
６に関しては、形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培
地でＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で振蕩培養
し、ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranosid
e ）を終濃度０．４mMとなるよう加えた後さらに３７℃
で４時間振蕩培養することにより行なった。抗原は、誘
導発現させた菌体を集め、１ｇ菌体あたり５mlの細胞溶
解液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM
ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、２００μｇ／ml lysozym
e 〕に懸濁し、３７℃に保温することにより細胞壁を溶
解した後、超音波処理により破砕することによって得ら
れる不溶性分画から精製した。各抗原はＣ７−６を除き
４Ｍまたは６Ｍの尿素を加えた緩衝液〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕により抽出させることが出
来、Ｃ７−６については４Ｍ塩酸グアニジンを加えた緩
衝液により抽出した。
６に関しては、形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培
地でＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で振蕩培養
し、ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranosid
e ）を終濃度０．４mMとなるよう加えた後さらに３７℃
で４時間振蕩培養することにより行なった。抗原は、誘
導発現させた菌体を集め、１ｇ菌体あたり５mlの細胞溶
解液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM
ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、２００μｇ／ml lysozym
e 〕に懸濁し、３７℃に保温することにより細胞壁を溶
解した後、超音波処理により破砕することによって得ら
れる不溶性分画から精製した。各抗原はＣ７−６を除き
４Ｍまたは６Ｍの尿素を加えた緩衝液〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕により抽出させることが出
来、Ｃ７−６については４Ｍ塩酸グアニジンを加えた緩
衝液により抽出した。
【００５８】Ｃ７−１は抽出液から陽イオン交換カラム
クロマトグラフィーにより、Ｃ７−２の場合には陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー及び逆相カラムクロマ
トグラフィーにより、Ｃ７−３は陰イオン交換カラムク
ロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることによ
り、Ｃ７−４は逆相カラムクロマトグラフィーにより、
Ｃ７−５とＣ７−６は陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィーにより抽出液から精製した。
クロマトグラフィーにより、Ｃ７−２の場合には陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー及び逆相カラムクロマ
トグラフィーにより、Ｃ７−３は陰イオン交換カラムク
ロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることによ
り、Ｃ７−４は逆相カラムクロマトグラフィーにより、
Ｃ７−５とＣ７−６は陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィーにより抽出液から精製した。
【００５９】Ｃ７Ｎは以下のように構築した。オリゴヌ
クレオチドプライマーはフォスファアミダイト法により
Cyclone Plus DNA合成機(MILLIPORE社) を用いメーカー
の合成用プロトコールに従い合成した。合成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。 Ｃ７Ｓ２：５′−GGAATTCGAGGAGGTGGCCCTGTCTAACACT −
３′（配列番号：４５）、 Ｃ７ＡＳ２：５′−GGGATCCTTACTGGGTGACGCATGTGTTACAG
TC−３′（配列番号：４６）。
クレオチドプライマーはフォスファアミダイト法により
Cyclone Plus DNA合成機(MILLIPORE社) を用いメーカー
の合成用プロトコールに従い合成した。合成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。 Ｃ７Ｓ２：５′−GGAATTCGAGGAGGTGGCCCTGTCTAACACT −
３′（配列番号：４５）、 Ｃ７ＡＳ２：５′−GGGATCCTTACTGGGTGACGCATGTGTTACAG
TC−３′（配列番号：４６）。
【００６０】上記のプライマーを用いＣ７Ｎの発現用の
フラグメントをＰＣＲによって得、ベクターへクローニ
ング後、配列を確認した。まずプラスミドＣ１１−７
（特開平５−８４，０８５）１μｌ（１ng）、１０×反
応緩衝液＃１ １０μｌ、20mM ｄＮＴＰ’ｓ １０μ
ｌ、プライマーＣ７Ｓ２及びＣ７ＡＳ２をそれぞれ１μ
ｌ（各２０pmol）、並びにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１
μｌ（STRATAGENE社：２．５Ｕ）を加え、９５℃５分、
５０℃５分及び７２℃３分反応させた。その後、９４℃
１分、５０℃１分、７２℃１分のサイクルで３０回反応
させ、最後に７２℃で５分間加温した。このＰＣＲ反応
液を３％ NuSieve３：１アガロース(FMC Bioproducts
社）で電気泳動したところ、約３５０bpのＰＣＲ産物が
得られた。
フラグメントをＰＣＲによって得、ベクターへクローニ
ング後、配列を確認した。まずプラスミドＣ１１−７
（特開平５−８４，０８５）１μｌ（１ng）、１０×反
応緩衝液＃１ １０μｌ、20mM ｄＮＴＰ’ｓ １０μ
ｌ、プライマーＣ７Ｓ２及びＣ７ＡＳ２をそれぞれ１μ
ｌ（各２０pmol）、並びにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１
μｌ（STRATAGENE社：２．５Ｕ）を加え、９５℃５分、
５０℃５分及び７２℃３分反応させた。その後、９４℃
１分、５０℃１分、７２℃１分のサイクルで３０回反応
させ、最後に７２℃で５分間加温した。このＰＣＲ反応
液を３％ NuSieve３：１アガロース(FMC Bioproducts
社）で電気泳動したところ、約３５０bpのＰＣＲ産物が
得られた。
【００６１】ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、 Gene Cl
ean IIキット(Bio 101社）を用いて精製し、１０μｌの
ＴＥ溶液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１
mMＥＤＴＡ）に回収した。回収したＤＮＡ ５μｌにｐ
ＧＥＭ−Ｔベクター(Promega社）１μｌ（５０ng／μ
ｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ１μｌ(Promega社：１ Weissユニット
／μｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で３時間反応
させた。
ean IIキット(Bio 101社）を用いて精製し、１０μｌの
ＴＥ溶液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１
mMＥＤＴＡ）に回収した。回収したＤＮＡ ５μｌにｐ
ＧＥＭ−Ｔベクター(Promega社）１μｌ（５０ng／μ
ｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ１μｌ(Promega社：１ Weissユニット
／μｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で３時間反応
させた。
【００６２】この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１bl
ueを井上らの方法 (Inoue et al, Gene, 96 (1990) 23-
28) に従って形質転換させＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含む
Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する
事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損
のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色のコロニ
ーをアンピシリン５０mg／mlを添加したＬＢ培地３mlで
一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢ
Ｏ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｃＩで
切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミド
ＤＮＡを選択した。
ueを井上らの方法 (Inoue et al, Gene, 96 (1990) 23-
28) に従って形質転換させＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含む
Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する
事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損
のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色のコロニ
ーをアンピシリン５０mg／mlを添加したＬＢ培地３mlで
一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢ
Ｏ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｃＩで
切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミド
ＤＮＡを選択した。
【００６３】得られたプラスミドＤＮＡはWizerdTM Min
ipreps DNA Purification System(Promega社) を用い、
メーカーのプロトコールに従い精製した。精製したＤＮ
ＡをPRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminator c
ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社) を用い
Ｔ７プライマー（Applied Biosystems社) でメーカーの
推奨する方法に従って反応させた。この反応産物を３７
０ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems社) で解析
し、塩基配列を決定した。正しい配列のクローンをｐＧ
ＥＭ−Ｃ７Ｎと命名した。
ipreps DNA Purification System(Promega社) を用い、
メーカーのプロトコールに従い精製した。精製したＤＮ
ＡをPRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminator c
ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社) を用い
Ｔ７プライマー（Applied Biosystems社) でメーカーの
推奨する方法に従って反応させた。この反応産物を３７
０ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems社) で解析
し、塩基配列を決定した。正しい配列のクローンをｐＧ
ＥＭ−Ｃ７Ｎと命名した。
【００６４】次にｐＧＥＭ−Ｃ７ＮのＤＮＡフラグメン
トをＴｒｐＥプロモーターを持つ発現用ベクターｐＡＴ
−Ｔｒｐに組み込んだ。ｐＧＥＭ−Ｃ７Ｎ １μｇを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、３％ NuSie
ve３：１アガロース(FMC Bioproducts社) で電気泳動
し、約３５０bpのＤＮＡフラグメントが得られた。この
ＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、Gene Clean I
Iキットを用いて精製し、１０μｌのＴＥ溶液に回収し
た。このＤＮＡフラグメント５μｌに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｍＨＩで切断したＴｒｐプロモーターを持つ発
現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ（特開平５−８４，０８
５）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼバッファー１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１ W
eissユニット／μｌ）及び滅菌蒸留水２μｌを加え、１
６℃で３時間反応させた。
トをＴｒｐＥプロモーターを持つ発現用ベクターｐＡＴ
−Ｔｒｐに組み込んだ。ｐＧＥＭ−Ｃ７Ｎ １μｇを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、３％ NuSie
ve３：１アガロース(FMC Bioproducts社) で電気泳動
し、約３５０bpのＤＮＡフラグメントが得られた。この
ＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、Gene Clean I
Iキットを用いて精製し、１０μｌのＴＥ溶液に回収し
た。このＤＮＡフラグメント５μｌに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｍＨＩで切断したＴｒｐプロモーターを持つ発
現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ（特開平５−８４，０８
５）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼバッファー１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１ W
eissユニット／μｌ）及び滅菌蒸留水２μｌを加え、１
６℃で３時間反応させた。
【００６５】この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１bl
ueを井上らの方法に従って形質転換させた。このコロニ
ーをアンピシリン５０μｇ／mlを添加したＬＢ培地３ml
で一晩培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢ
Ｏ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉで切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラス
ミドを選択した。目的のプラスミドを含んだ大腸菌を１
００μｇ／mlのアンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地で一
晩培養し、大腸菌を回収し、菌体蛋白質を回収しＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行いアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色し、
目的とする１４Ｋの分子量の蛋白質を確認した。
ueを井上らの方法に従って形質転換させた。このコロニ
ーをアンピシリン５０μｇ／mlを添加したＬＢ培地３ml
で一晩培養し、プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢ
Ｏ：ＰＩ−１００）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉで切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラス
ミドを選択した。目的のプラスミドを含んだ大腸菌を１
００μｇ／mlのアンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地で一
晩培養し、大腸菌を回収し、菌体蛋白質を回収しＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行いアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色し、
目的とする１４Ｋの分子量の蛋白質を確認した。
【００６６】発現が確認された大腸菌を 100μｇ／mlの
アンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地３Ｌで一晩培養し、
大腸菌を遠心分離で回収した。大腸菌１ｇにつき５mlの
溶解緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０／３
０mM ＮａＣｌ／５mM ＥＤＴＡ）に懸濁し、リゾチー
ム１mgを加えて３７℃で１時間震盪した。これを１５０
Ｗ、９０秒の条件で２回ソニケーションし細胞を破砕し
た。これを１５Ｋ、３０分間４℃で遠心分離して得られ
た沈殿に緩衝液Ａ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８．
０）を加えて懸濁後、１５００rpm 、５ストロークの条
件でホモジェナイズした。
アンピシリンを含んだＭ９ＣＡ培地３Ｌで一晩培養し、
大腸菌を遠心分離で回収した。大腸菌１ｇにつき５mlの
溶解緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０／３
０mM ＮａＣｌ／５mM ＥＤＴＡ）に懸濁し、リゾチー
ム１mgを加えて３７℃で１時間震盪した。これを１５０
Ｗ、９０秒の条件で２回ソニケーションし細胞を破砕し
た。これを１５Ｋ、３０分間４℃で遠心分離して得られ
た沈殿に緩衝液Ａ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８．
０）を加えて懸濁後、１５００rpm 、５ストロークの条
件でホモジェナイズした。
【００６７】これを１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離し
て得られた沈殿を緩衝液Ａで洗浄、再び遠心分離を行っ
た。得られた沈殿に２Ｍ尿素を含んだ緩衝液Ａを加えて
懸濁し、１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離して上清と沈
殿を得た。沈殿に対して同様の操作を４Ｍ，６Ｍ尿素に
ついても行った。尿素抽出後、それぞれの操作で得られ
た抽出物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、Ｃ
ＢＢ染色を行うことによって目的の蛋白がどの画分に来
たかを確かめた。目的の蛋白質は夾雑物とともに４Ｍ尿
素抽出液中に存在した。
て得られた沈殿を緩衝液Ａで洗浄、再び遠心分離を行っ
た。得られた沈殿に２Ｍ尿素を含んだ緩衝液Ａを加えて
懸濁し、１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離して上清と沈
殿を得た。沈殿に対して同様の操作を４Ｍ，６Ｍ尿素に
ついても行った。尿素抽出後、それぞれの操作で得られ
た抽出物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、Ｃ
ＢＢ染色を行うことによって目的の蛋白がどの画分に来
たかを確かめた。目的の蛋白質は夾雑物とともに４Ｍ尿
素抽出液中に存在した。
【００６８】４Ｍ尿素抽出液をＱ sepharose（１６／１
０）にかけ、０．４ml／分の流速で１５分間、０−０．
３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。Ｏ．Ｄ．２８０nmの吸収ピ
ークを示した溶出画分をゲル濾過カラムHiload Superde
x ７５pg（２６／６０×２）にかけ、緩衝液Ｂ（５０mM
酢酸ナトリウムpH５．５／４Ｍ尿素／０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ／５mM ＤＴＴ）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋
白質を分離確認したところほぼ単一の蛋白質として分離
できた。目的蛋白質の存在する画分を５０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ pH８．０／０．４Ｍ尿素に透析し、ＤＴＴを
除いた。
０）にかけ、０．４ml／分の流速で１５分間、０−０．
３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。Ｏ．Ｄ．２８０nmの吸収ピ
ークを示した溶出画分をゲル濾過カラムHiload Superde
x ７５pg（２６／６０×２）にかけ、緩衝液Ｂ（５０mM
酢酸ナトリウムpH５．５／４Ｍ尿素／０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ／５mM ＤＴＴ）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋
白質を分離確認したところほぼ単一の蛋白質として分離
できた。目的蛋白質の存在する画分を５０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ pH８．０／０．４Ｍ尿素に透析し、ＤＴＴを
除いた。
【００６９】精製した抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純
度を検定した。精製した抗原を２．５μｇ／mlの濃度と
なるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH
７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチ
モジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室
温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあ
たり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置し
た。
度を検定した。精製した抗原を２．５μｇ／mlの濃度と
なるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH
７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマルチ
モジュールプレートにウェルあたり２００μｌのせ、室
温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあ
たり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼイン、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間静置し
た。
【００７０】このように抗原をプレートに固定した。検
体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を
固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた
後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応
させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加
え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えるこ
とにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測
定した。
体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を
固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた
後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応
させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加
え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えるこ
とにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測
定した。
【００７１】陽性陰性の判定は、第２世代ＨＣＶ検出試
薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国際試薬株式会社）
を用いて判定が陰性になった血清からなる群（５６例）
の分布からそれぞれの抗原を用いた場合の陽性判定値を
求めて判断した。陽性陰性の判定を行った血清は、第２
世代ＨＣＶ検出試薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国
際試薬株式会社）を用いて判定が陽性になった血清から
なる群（４２例）を用いた。これらの血清はいずれもＣ
７抗原に対する反応性は陽性を示す。各種抗原の陽性率
（カット中）は、Ｃ７−１（９．５％）、Ｃ７−２（２
８．６％）、Ｃ７−３（０％）、Ｃ７−４（０％）、Ｃ
７−５（３１．０％）、Ｃ７−６（１１．９％）、Ｃ７
−４６（１００％）、Ｃ７−Native（１００％）であっ
た。
薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国際試薬株式会社）
を用いて判定が陰性になった血清からなる群（５６例）
の分布からそれぞれの抗原を用いた場合の陽性判定値を
求めて判断した。陽性陰性の判定を行った血清は、第２
世代ＨＣＶ検出試薬（イムチェックＨＣＶコクサイ：国
際試薬株式会社）を用いて判定が陽性になった血清から
なる群（４２例）を用いた。これらの血清はいずれもＣ
７抗原に対する反応性は陽性を示す。各種抗原の陽性率
（カット中）は、Ｃ７−１（９．５％）、Ｃ７−２（２
８．６％）、Ｃ７−３（０％）、Ｃ７−４（０％）、Ｃ
７−５（３１．０％）、Ｃ７−６（１１．９％）、Ｃ７
−４６（１００％）、Ｃ７−Native（１００％）であっ
た。
【００７２】実施例３．Ｃ１４−１−２抗原のエピトー
プ解析 精製したＣ１４−１−２ペプチドを２．５μｇ／mlの濃
度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液
（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマ
ルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌの
せ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウ
ェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼ
イン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間
静置した。このように抗原をプレートに固定した。
プ解析 精製したＣ１４−１−２ペプチドを２．５μｇ／mlの濃
度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液
（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマ
ルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌの
せ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウ
ェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼ
イン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間
静置した。このように抗原をプレートに固定した。
【００７３】検体２０μｌと化学合成したペプチド
（０．１mg／ml）２０μｌを等量混和し、室温１時間静
置した。これに検体希釈液を２００μｌ加えた後にペプ
チドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応さ
せた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間
反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液
を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加え
ることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色
を測定した。結果を表４に示す。
（０．１mg／ml）２０μｌを等量混和し、室温１時間静
置した。これに検体希釈液を２００μｌ加えた後にペプ
チドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応さ
せた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間
反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液
を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加え
ることにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色
を測定した。結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
【００７５】表４に示した検体は全てＨＣＶグループＩ
に属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（特願平５−１
９４１８５号）との反応性より明らかであり、グループ
Ｉの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・
Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らか
である。これらの結果からＣ１４−１−２抗原に於て患
者血清中の抗体は阻害のかかったペプチドにエピトープ
が存在していることが明らかになった。
に属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（特願平５−１
９４１８５号）との反応性より明らかであり、グループ
Ｉの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・
Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らか
である。これらの結果からＣ１４−１−２抗原に於て患
者血清中の抗体は阻害のかかったペプチドにエピトープ
が存在していることが明らかになった。
【００７６】実施例４．エピトープキメラ抗原ペプチド
をコードする遺伝子の作成 表５に示すＤＮＡをＤＮＡ合成機（ABI : Model 394Aま
たはMillipore : Model 8700）を用いて合成した。
をコードする遺伝子の作成 表５に示すＤＮＡをＤＮＡ合成機（ABI : Model 394Aま
たはMillipore : Model 8700）を用いて合成した。
【００７７】
【表５】
【００７８】ＥＰ１及びＥＰ２Ｒはグループ１のＨＣＶ
ｃＤＮＡから１７１２−１７５０番目のペプチドをコ
ードする配列を取り出すためのプライマーである。ＥＰ
５とＥＰ６はグループ１のＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチ
ド１６７８−１７０５番目のペプチドをコードする配列
を取り出すためのプライマーである。またＣ７ＥＰ１Ｆ
とＣ７ＥＰ１Ｒは１２３８−１３１３番目のペプチドを
コードする配列を、Ｃ７ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒは１３
６３−１４６０番目のペプチドをコードする配列を、ｃ
ｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲは１−４３番目のペプチドを
コードする配列を取り出すためのプライマーである。
ｃＤＮＡから１７１２−１７５０番目のペプチドをコ
ードする配列を取り出すためのプライマーである。ＥＰ
５とＥＰ６はグループ１のＨＣＶ ｃＤＮＡからペプチ
ド１６７８−１７０５番目のペプチドをコードする配列
を取り出すためのプライマーである。またＣ７ＥＰ１Ｆ
とＣ７ＥＰ１Ｒは１２３８−１３１３番目のペプチドを
コードする配列を、Ｃ７ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒは１３
６３−１４６０番目のペプチドをコードする配列を、ｃ
ｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲは１−４３番目のペプチドを
コードする配列を取り出すためのプライマーである。
【００７９】またＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰＩＲはグ
ループ２ ＨＣＶの１７１６−１７５０番目のペプチド
をコードする配列を、ＣＯＲＥＧＲ２ＳとＣＯＲＥＧＲ
２ＡＳはグループ２ ＨＣＶの６６−８０番目をコード
する断片を、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒはグルー
プ２ ＨＣＶの１６９０−１７１３番目のペプチドをコ
ードする配列を作り出すためのプライマーである。
ループ２ ＨＣＶの１７１６−１７５０番目のペプチド
をコードする配列を、ＣＯＲＥＧＲ２ＳとＣＯＲＥＧＲ
２ＡＳはグループ２ ＨＣＶの６６−８０番目をコード
する断片を、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒはグルー
プ２ ＨＣＶの１６９０−１７１３番目のペプチドをコ
ードする配列を作り出すためのプライマーである。
【００８０】これらのプライマーを用いてＰＣＲにより
配列を取り出した。以下順次各断片の構築を記載する。
１ngのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ６−７９）（特開平６−２
２５，７７０）、１００pmolプライマー（ＥＰ１とＥＰ
２ＲまたはＥＰ５とＥＰ６）を加え、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．０
１％ゼラチン、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq DN
A Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整しミ
ネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５５℃、１分、
７２℃、２分の条件で２５サイクル反応を行わせた。
配列を取り出した。以下順次各断片の構築を記載する。
１ngのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ６−７９）（特開平６−２
２５，７７０）、１００pmolプライマー（ＥＰ１とＥＰ
２ＲまたはＥＰ５とＥＰ６）を加え、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．０
１％ゼラチン、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq DN
A Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整しミ
ネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５５℃、１分、
７２℃、２分の条件で２５サイクル反応を行わせた。
【００８１】またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒをそれぞ
れ２μｇ加え、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチン、
０．２mMｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq DNA Polymeraseとな
るよう１００μｌの反応液を調整しミネラルオイルを重
層し９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条
件で１５サイクル反応を行わせた。反応液の一部をアガ
ロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組合せでは約１
４０bpの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組合せでは約１５０bp
の、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せでは約５０bp
の断片、ＥＰ５とＥＰ６の組合せでは約１００bpの断片
を分離した。
れ２μｇ加え、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチン、
０．２mMｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq DNA Polymeraseとな
るよう１００μｌの反応液を調整しミネラルオイルを重
層し９４℃、３０秒、５０℃、１分、７２℃、２分の条
件で１５サイクル反応を行わせた。反応液の一部をアガ
ロース電気泳動し、ＥＰ１とＥＰ２Ｒの組合せでは約１
４０bpの、ＥＰ１とＶ４ＸＹＺの組合せでは約１５０bp
の、ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せでは約５０bp
の断片、ＥＰ５とＥＰ６の組合せでは約１００bpの断片
を分離した。
【００８２】分離したＤＮＡ断片をアガロース切片から
Mermaid kit （Bio101社）を用いメーカーの推奨する方
法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を
２５ngのｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターと共に２
０μｌの反応液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mM ＡＴＰ、１０mM Ｄ
ＴＴ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ〕中で１６℃１時間反応さ
せた。反応液の一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（St
ratagene社）をHanahan の方法〔DNA cloning :A pract
ical approach (ed. D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC
press, (1885)〕に従って形質転換した。アンピシリン
耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプ
レパレーション法により調製し、制限酵素で切断するこ
とにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質
転換体を選択した。
Mermaid kit （Bio101社）を用いメーカーの推奨する方
法に従いＴＥ溶液中に回収した。回収したＤＮＡ断片を
２５ngのｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターと共に２
０μｌの反応液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mM ＡＴＰ、１０mM Ｄ
ＴＴ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ〕中で１６℃１時間反応さ
せた。反応液の一部を用い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（St
ratagene社）をHanahan の方法〔DNA cloning :A pract
ical approach (ed. D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC
press, (1885)〕に従って形質転換した。アンピシリン
耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプ
レパレーション法により調製し、制限酵素で切断するこ
とにより両断片が環状化しているプラスミドを持つ形質
転換体を選択した。
【００８３】ＥＰ１とＥＰ２Ｒとを用いて生じた断片の
クローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩと
ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行うことにより約１４
０bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用い
メーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。
またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せで生じた断片
のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩ
とＳｍａＩで切断し、電気泳動を行うことにより約６０
bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用いメ
ーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。
クローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩと
ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動を行うことにより約１４
０bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用い
メーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。
またＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒの組合せで生じた断片
のクローニングされているプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩ
とＳｍａＩで切断し、電気泳動を行うことにより約６０
bpの断片を分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用いメ
ーカーの推奨する方法に従いＴＥ溶液中に回収した。
【００８４】回収した断片とＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切
断したｐＴ７Ｔ３１９Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用
い、大腸菌ＳＵＲＥ（Stratagene社）を形質転換した。
アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤ
ＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素
で切断することにより両断片が結合環状化しているプラ
スミドを持つ形質転換体を選択した。
断したｐＴ７Ｔ３１９Ｕ（ファルマシア社）とＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応液の一部を用
い、大腸菌ＳＵＲＥ（Stratagene社）を形質転換した。
アンピシリン耐性のコロニーを選択し、形質転換体のＤ
ＮＡをミニプレパレーション法により調製し、制限酵素
で切断することにより両断片が結合環状化しているプラ
スミドを持つ形質転換体を選択した。
【００８５】得られたプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨ
Ｉで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片のクローニン
グされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩ
で切断し、電気泳動を行うことにより１００bpの断片を
分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した断片
と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反
応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratage
ne社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを
選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法
により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が
結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択
した。
Ｉで切断し、ＥＰ５とＥＰ６で生じた断片のクローニン
グされているプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩ
で切断し、電気泳動を行うことにより１００bpの断片を
分離し、Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した断片
と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。反
応液の一部を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratage
ne社）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを
選択し、形質転換体のＤＮＡをミニプレパレーション法
により調製し、制限酵素で切断することにより両断片が
結合環状化しているプラスミドを持つ形質転換体を選択
した。
【００８６】このようにしてＧｒ１ＥＰＶ５遺伝子断片
を持つプラスミドを構築した。このプラスミド１０ngを
用い各々３０pmolのＧｒ１ＥＰＶ５ＦとＧｒ１ＥＰＶ５
Ｒプライマーを用いＰＣＲを行い、（１７１２−１７５
０；グループ１）−（６６−８０；グループ１）−（１
６７８−１７０５；グループ１）番目のアミノ酸をコー
ドする配列を増幅させ、QIAquick PCR purification ki
t （QIAGEN社）を用い増幅断片を回収した。回収した断
片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニン
グした。このようにしてＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切り
出すことの出来る約２５０bpの断片を持つｐＧＲ１ＥＰ
Ｎを得た。
を持つプラスミドを構築した。このプラスミド１０ngを
用い各々３０pmolのＧｒ１ＥＰＶ５ＦとＧｒ１ＥＰＶ５
Ｒプライマーを用いＰＣＲを行い、（１７１２−１７５
０；グループ１）−（６６−８０；グループ１）−（１
６７８−１７０５；グループ１）番目のアミノ酸をコー
ドする配列を増幅させ、QIAquick PCR purification ki
t （QIAGEN社）を用い増幅断片を回収した。回収した断
片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega 社）ベクターにクローニン
グした。このようにしてＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切り
出すことの出来る約２５０bpの断片を持つｐＧＲ１ＥＰ
Ｎを得た。
【００８７】ＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒまたは、
ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１
ngのＳ１４株ＨＣＶ ｃＤＮＡ（本出願人等による特願
平４−２０７３９１）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ
１Ｒでは約１２０bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒ
では約８０bpの断片を増幅させ得た。またＣＯＲＥ−Ｆ
とＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．
０１％ゼラチン、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq
DNA Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整し
ミネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５０℃、１
分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行わせる
ことにより約５０bpの断片を得た。
ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１
ngのＳ１４株ＨＣＶ ｃＤＮＡ（本出願人等による特願
平４−２０７３９１）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ
１Ｒでは約１２０bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒ
では約８０bpの断片を増幅させ得た。またＣＯＲＥ−Ｆ
とＣＯＲＥ−Ｒをそれぞれ２μｇ加え、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、２．５mM ＭｇＣｌ2 、０．
０１％ゼラチン、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Taq
DNA Polymeraseとなるよう１００μｌの反応液を調整し
ミネラルオイルを重層し９４℃、３０秒、５０℃、１
分、７２℃、２分の条件で１５サイクル反応を行わせる
ことにより約５０bpの断片を得た。
【００８８】これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promega
社）ベクターにクローニングした。ＧＲ２ＥＰ１ＦとＧ
Ｒ２ＥＰ１Ｒから得た断片を持つプラスミドをＸｈｏＩ
とＣｌａＩで、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒから得
た断片を持つプラスミドをＳａｃＩとＣｌａＩで切断し
アガロース電気泳動により小断片を分離した。Mermaidk
it （Bio101社）を用い回収した小断片と、ＸｈｏＩと
ＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ
（＋）をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕ
ｅを形質転換することによりＸｈｏＩ，ＳａｃＩで切り
出される約１９０bpの断片を持つプラスミドを得た。
社）ベクターにクローニングした。ＧＲ２ＥＰ１ＦとＧ
Ｒ２ＥＰ１Ｒから得た断片を持つプラスミドをＸｈｏＩ
とＣｌａＩで、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒから得
た断片を持つプラスミドをＳａｃＩとＣｌａＩで切断し
アガロース電気泳動により小断片を分離した。Mermaidk
it （Bio101社）を用い回収した小断片と、ＸｈｏＩと
ＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ
（＋）をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕ
ｅを形質転換することによりＸｈｏＩ，ＳａｃＩで切り
出される約１９０bpの断片を持つプラスミドを得た。
【００８９】このプラスミドをＣｌａＩにより切断し、
ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒから得られた断片を持つプ
ラスミドをＡｃｃＩとＣｌａＩによって切断することに
より得られる断片を結合させることにより（１７１６−
１７５０；グループ２）−（６６−８０；グループ２）
−（１６９０−１７１３；グループ２）をコードする断
片を持つプラスミド、ｐＧＲ２ＥＰＮを得た。
ＣＯＲＥ−ＦとＣＯＲＥ−Ｒから得られた断片を持つプ
ラスミドをＡｃｃＩとＣｌａＩによって切断することに
より得られる断片を結合させることにより（１７１６−
１７５０；グループ２）−（６６−８０；グループ２）
−（１６９０−１７１３；グループ２）をコードする断
片を持つプラスミド、ｐＧＲ２ＥＰＮを得た。
【００９０】Ｃ７ＥＰ１ＦとＣ７ＥＰ１Ｒ、またはＣ７
ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１ngのＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡ（Ｃ１１−７）（特願平２−１８０８８
９）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒでは約２２０
bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒでは約３００bpの
断片を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Pr
omega 社）ベクターにクローニングした。Ｃ７ＥＰ１Ｆ
とＣ７ＥＰ１Ｒによって得られた断片をＥｃｏＲＩとＢ
ｓｐＥ１で、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒにより得
られた断片をＢｓｐＥ１とＨｉｎｄIII で切断しアガロ
ース電気泳動により小断片を分離した。
ＥＰ２ＦとＣ７ＥＰ２Ｒを用いＰＣＲにより１ngのＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡ（Ｃ１１−７）（特願平２−１８０８８
９）からＧＲ２ＥＰ１ＦとＧＲ２ＥＰ１Ｒでは約２２０
bpのＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒでは約３００bpの
断片を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Pr
omega 社）ベクターにクローニングした。Ｃ７ＥＰ１Ｆ
とＣ７ＥＰ１Ｒによって得られた断片をＥｃｏＲＩとＢ
ｓｐＥ１で、ＧＲ２ＥＰ２ＦとＧＲ２ＥＰ２Ｒにより得
られた断片をＢｓｐＥ１とＨｉｎｄIII で切断しアガロ
ース電気泳動により小断片を分離した。
【００９１】Mermaid kit （Bio101社）を用い回収した
小断片と、ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断したｐＵＣ１１９
をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形
質転換することによりＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切り
出される、（１２３８−１３１３）−（１３６３−１４
６０）をコードする約５００bpの断片を持つプラスミド
ｐＣ７ＥＰＮを得た。ｃｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲを用
いＰＣＲにより１ngのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ１１−２
１）（特願平２−４１３８４４）から約１２０bpの断片
を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promeg
a 社）ベクターにクローニングすることにより、１−４
３をコードするＳａｃＩ，ＢａｍＨＩで切り出される約
１２０bpの断片を持つプラスミド、ｐＣＯＲＥを得た。
小断片と、ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断したｐＵＣ１１９
をリガーゼにより結合させ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形
質転換することによりＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切り
出される、（１２３８−１３１３）−（１３６３−１４
６０）をコードする約５００bpの断片を持つプラスミド
ｐＣ７ＥＰＮを得た。ｃｏｒｅＮＦとｃｏｒｅＮＲを用
いＰＣＲにより１ngのＨＣＶ ｃＤＮＡ（Ｃ１１−２
１）（特願平２−４１３８４４）から約１２０bpの断片
を増幅させ得た。これらの断片はｐＧＥＭ−Ｔ（Promeg
a 社）ベクターにクローニングすることにより、１−４
３をコードするＳａｃＩ，ＢａｍＨＩで切り出される約
１２０bpの断片を持つプラスミド、ｐＣＯＲＥを得た。
【００９２】上記遺伝子断片を組み合わせ結合させ、ｐ
ＡＴ−ＴｒｐベクターのＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩサイト
に挿入することにより（１２３８−１３１３）−（１３
６３−１４６０）−（１７１２−１７５０；グループ
１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１７
０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グループ
２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７
１３；グループ２）−（１−４３）の並びからなるキメ
ラ抗原遺伝子を発現させるベクターｐＣ５０Ｎを得た。
なお、このプラスミドを含有する大腸菌ｐＣ５０Ｎ／Ｘ
Ｌ１−blueは工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５３８０として平成７年１２月２７日に寄
託された。
ＡＴ−ＴｒｐベクターのＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩサイト
に挿入することにより（１２３８−１３１３）−（１３
６３−１４６０）−（１７１２−１７５０；グループ
１）−（６６−８０；グループ１）−（１６７８−１７
０５；グループ１）−（１７１６−１７５０；グループ
２）−（６６−８０；グループ２）−（１６９０−１７
１３；グループ２）−（１−４３）の並びからなるキメ
ラ抗原遺伝子を発現させるベクターｐＣ５０Ｎを得た。
なお、このプラスミドを含有する大腸菌ｐＣ５０Ｎ／Ｘ
Ｌ１−blueは工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５３８０として平成７年１２月２７日に寄
託された。
【００９３】実施例５．エピトープキメラ抗原の発現と
精製 ｐＣ５０Ｎで形質転換された大腸菌を１００μｇ／mlア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これ
を１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含むＭ９−
ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心によ
り菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM ＮａＣｌ、５mM Ｅ
ＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（１０mg／ml
Lysozyme ）を加え、３７℃において１時間処理した。
この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ、９０秒で２回）に
かけることにより細胞を破壊した。
精製 ｐＣ５０Ｎで形質転換された大腸菌を１００μｇ／mlア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養した。これ
を１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含むＭ９−
ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後遠心によ
り菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、３０mM ＮａＣｌ、５mM Ｅ
ＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（１０mg／ml
Lysozyme ）を加え、３７℃において１時間処理した。
この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ、９０秒で２回）に
かけることにより細胞を破壊した。
【００９４】１５０００rpm で、４℃において３０分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlのＮ
Ｐ４０を１％含むＡ溶液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．５）〕に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm
で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４
℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶
性分画を５０mlの２Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモ
ジナイズ（１５００rpmで５ストローク）した。懸濁液
を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶
性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含
むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ス
トローク）した。懸濁液を１５０００rpmで、４℃にお
いて３０分間遠心し可溶性分画を回収した。６Ｍ尿素を
含む溶液で可溶化した抗原溶液から、Ｓセファーロース
ＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法と
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いた
ゲル濾過法によりエピトープキメラ抗原を精製した。
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlのＮ
Ｐ４０を１％含むＡ溶液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．５）〕に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm
で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm で、４
℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収した。不溶
性分画を５０mlの２Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモ
ジナイズ（１５００rpmで５ストローク）した。懸濁液
を１５０００rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶
性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含
むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ス
トローク）した。懸濁液を１５０００rpmで、４℃にお
いて３０分間遠心し可溶性分画を回収した。６Ｍ尿素を
含む溶液で可溶化した抗原溶液から、Ｓセファーロース
ＨＰカラム（ファルマシア社）を用いたイオン交換法と
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いた
ゲル濾過法によりエピトープキメラ抗原を精製した。
【００９５】実施例６．エピトープキメラ抗原と患者血
清との反応 エピトープキメラ抗原を精製した抗原を３μｇ／mlの濃
度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液
（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマ
ルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌの
せ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウ
ェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼ
イン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間
静置した。
清との反応 エピトープキメラ抗原を精製した抗原を３μｇ／mlの濃
度となるように８Ｍ尿素を含む０．１Ｍの燐酸緩衝液
（pH７．５）に希釈した。希釈した抗原をヌンク社のマ
ルチモジュールプレートにウェルあたり２００μｌの
せ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた後、ウ
ェルあたり２００μｌのブロッキング液〔０．５％カゼ
イン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．５mM ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を加え室温に２時間
静置した。
【００９６】このように抗原をプレートに固定した。検
体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を
固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた
後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応
させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加
え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えるこ
とにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測
定した。
体２０μｌに検体希釈液を２００μｌ加えた後に抗原を
固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた
後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応
させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加
え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えるこ
とにより反応を停止させ、比色計で４９２nmの発色を測
定した。
【００９７】複数抗原を用いている第２世代ＨＣＶ抗体
検出試薬としてはイムチェックＨＣＶコクサイ（国際試
薬株式会社）とＲＩＢＡ−２（オルソ社）を用い、判定
はそれぞれの試薬に添付されている基準に従った。結果
をまとめて示す。血清番号１０のように第２世代試薬間
で判定が一致しない疑陽性サンプルは、本発明のＣ５０
Ｎ抗原では陰性に、また第２世代確定診断試薬で判定保
留であった１４番の血清は、Ｃ５０Ｎ抗原では陽性に判
定された。このように本発明のＣ５０Ｎ抗原は複数抗原
を組み合わせたＨＣＶ抗体検出試薬の性能を１本の抗原
で発揮していることは明らかである。結果を表６及び表
７に示す。
検出試薬としてはイムチェックＨＣＶコクサイ（国際試
薬株式会社）とＲＩＢＡ−２（オルソ社）を用い、判定
はそれぞれの試薬に添付されている基準に従った。結果
をまとめて示す。血清番号１０のように第２世代試薬間
で判定が一致しない疑陽性サンプルは、本発明のＣ５０
Ｎ抗原では陰性に、また第２世代確定診断試薬で判定保
留であった１４番の血清は、Ｃ５０Ｎ抗原では陽性に判
定された。このように本発明のＣ５０Ｎ抗原は複数抗原
を組み合わせたＨＣＶ抗体検出試薬の性能を１本の抗原
で発揮していることは明らかである。結果を表６及び表
７に示す。
【００９８】実施例７．人工配列を持つ抗原遺伝子の構
築と発現 下記の配列を持つＤＮＡ断片をＤＮＡ合成機（アプライ
ドバイオシステム394A）を用い、メーカーの推奨する方
法に従い合成した。合成したＤＮＡ断片はＯＰＣカラム
（アプライドバイオシステム）を用いメーカーの推奨す
る方法に従い精製した。
築と発現 下記の配列を持つＤＮＡ断片をＤＮＡ合成機（アプライ
ドバイオシステム394A）を用い、メーカーの推奨する方
法に従い合成した。合成したＤＮＡ断片はＯＰＣカラム
（アプライドバイオシステム）を用いメーカーの推奨す
る方法に従い精製した。
【００９９】 ＥＰ−１０：AGCCGTGACC CAGAATTCAC CAAAGTGCCG GTTGC
TTATG CGGCCAAAGG TTATAAGGTC CTGGTTCTGG ACCCGAGC
（配列番号：４８） ＥＰ−１１：ACCATGGGCC TTGCTCAGAT ACGCGCCGAA ACCCA
GGGTG CTGGCAACGC TCGGGTCCAG AACCAG（配列番号：４
９） ＥＰ−１２：GCCCATGGTG TGAACCCGAA CATCCGCACG GGCAT
CCGTA CCGTTACCAC CGGTGCTCCG GTGACCTAT （配列番号：
５０） ＥＰ−１３：ATCGTACGCA CCGCCGGCGC AACCGCCGTC CGCCA
GGTAT TTACCGTAGG TGGAATAGGT CACCGGAGCA CC （配列番
号：５１） ＥＰ−１４：GGTGCGTACG ATGTGATCTA TGGCCGCGCG ATCC
CGATCG AAGCGATCAA AGGCGGTCGC CATCTGGTT（配列番号：
５２） ＥＰ−１５：CAATCCGGAC AGCGCGCTCG CCAGTTCATC GCATT
TCTCC TTGCTATGGC AGAAAACCAG ATGGCGACCG CC （配列番
号：５３）
TTATG CGGCCAAAGG TTATAAGGTC CTGGTTCTGG ACCCGAGC
（配列番号：４８） ＥＰ−１１：ACCATGGGCC TTGCTCAGAT ACGCGCCGAA ACCCA
GGGTG CTGGCAACGC TCGGGTCCAG AACCAG（配列番号：４
９） ＥＰ−１２：GCCCATGGTG TGAACCCGAA CATCCGCACG GGCAT
CCGTA CCGTTACCAC CGGTGCTCCG GTGACCTAT （配列番号：
５０） ＥＰ−１３：ATCGTACGCA CCGCCGGCGC AACCGCCGTC CGCCA
GGTAT TTACCGTAGG TGGAATAGGT CACCGGAGCA CC （配列番
号：５１） ＥＰ−１４：GGTGCGTACG ATGTGATCTA TGGCCGCGCG ATCC
CGATCG AAGCGATCAA AGGCGGTCGC CATCTGGTT（配列番号：
５２） ＥＰ−１５：CAATCCGGAC AGCGCGCTCG CCAGTTCATC GCATT
TCTCC TTGCTATGGC AGAAAACCAG ATGGCGACCG CC （配列番
号：５３）
【０１００】 ＥＰ−１６：CTGTCCGGAT TGGGTCTGAA CGCTGTGGCA TTCTA
TCGCG GTCTGGACGT GAGCATTATC CCGACCCAGG GC （配列番
号：５４） ＥＰ−１７：CGCGAAGCTT ACCAGACCGG TCATCAGCGC ATCGG
TGCTA ACGATAACCA CATCGCCCTG GGTCGGGATA AT （配列番
号：５５） ＥＰ−１８：GTAAGCTTCG CGAGCCATGT GCCGTACATC GAGCA
GGGTA TGCAACTGAG CGAACAATTT AAGCAGAAG （配列番号：
５６） ＥＰ−１９：CGGGGCGGCC GCCTCCGCCT GTTTGGTCGC GGTCT
GCAGC AGACCCAGGC TCTTCTGCTT AAATTGTTCG CT （配列番
号：５７） ＥＰ−２０：GAGGCGGCCG CCCCGGTGGT TGGCACCCCG AAAAG
CCGCC GTCCG （配列番号：５８） ＥＰ−２１：GATGGTACCC GGTTGCGCCC AGGCACGACC TTCCG
GACGG CGGCTTTTC （配列番号：５９） ＣＥＰ（１３）：CAGGGTACCA TCATCCTGAG CGGTCGTCCG G
CGGTTGTAC CGGAT （配列番号：６０）
TCGCG GTCTGGACGT GAGCATTATC CCGACCCAGG GC （配列番
号：５４） ＥＰ−１７：CGCGAAGCTT ACCAGACCGG TCATCAGCGC ATCGG
TGCTA ACGATAACCA CATCGCCCTG GGTCGGGATA AT （配列番
号：５５） ＥＰ−１８：GTAAGCTTCG CGAGCCATGT GCCGTACATC GAGCA
GGGTA TGCAACTGAG CGAACAATTT AAGCAGAAG （配列番号：
５６） ＥＰ−１９：CGGGGCGGCC GCCTCCGCCT GTTTGGTCGC GGTCT
GCAGC AGACCCAGGC TCTTCTGCTT AAATTGTTCG CT （配列番
号：５７） ＥＰ−２０：GAGGCGGCCG CCCCGGTGGT TGGCACCCCG AAAAG
CCGCC GTCCG （配列番号：５８） ＥＰ−２１：GATGGTACCC GGTTGCGCCC AGGCACGACC TTCCG
GACGG CGGCTTTTC （配列番号：５９） ＣＥＰ（１３）：CAGGGTACCA TCATCCTGAG CGGTCGTCCG G
CGGTTGTAC CGGAT （配列番号：６０）
【０１０１】 ＣＥＰ（１４）：CTCGAGAAAT TCTTGATACA GCACTTCACG A
TCCGGTACA ACCGC （配列番号：６１） ＥＰ１０１：GAGCTCGCCA TGGGCACCAA CCCGAAACCG GAGCG
TAAAA GCAAGCGTAA CACCAACCGT AAACCGCAGG ATATTAAA
（配列番号：６２） ＥＰ１０２：GCGGATCCTT ACGGACCACG ACGCGGCACC AGGTA
CACAC CACCCACCAC CTGACCACTA CCCGGGAATT TAATATCCT G
CGGTTTACG （配列番号：６３） ４２−１：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGC
CGC GCGATCCCGA T（配列番号：６４） ４２−２：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGC
CGC GCGATCCCGA T（配列番号：６５） ４２−３：GTTACAGTCG ACCACTGAGT CAAAATCGCC GGTAAAA
CCG GTCATCAGCG CATCGG（配列番号：６６） ４２−４：CGAAGCTTAC CAGTCCAGAT CCCTGGGTGA TGCATGT
GTT ACAGTCGACC ACTGAGT（配列番号：６７）
TCCGGTACA ACCGC （配列番号：６１） ＥＰ１０１：GAGCTCGCCA TGGGCACCAA CCCGAAACCG GAGCG
TAAAA GCAAGCGTAA CACCAACCGT AAACCGCAGG ATATTAAA
（配列番号：６２） ＥＰ１０２：GCGGATCCTT ACGGACCACG ACGCGGCACC AGGTA
CACAC CACCCACCAC CTGACCACTA CCCGGGAATT TAATATCCT G
CGGTTTACG （配列番号：６３） ４２−１：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGC
CGC GCGATCCCGA T（配列番号：６４） ４２−２：GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGC
CGC GCGATCCCGA T（配列番号：６５） ４２−３：GTTACAGTCG ACCACTGAGT CAAAATCGCC GGTAAAA
CCG GTCATCAGCG CATCGG（配列番号：６６） ４２−４：CGAAGCTTAC CAGTCCAGAT CCCTGGGTGA TGCATGT
GTT ACAGTCGACC ACTGAGT（配列番号：６７）
【０１０２】Ｃ７領域エピトープ遺伝子断片は、ＥＰ−
１０とＥＰ−１１，ＥＰ−１２とＥＰ−１３，ＥＰ−１
４とＥＰ−１５，ＥＰ−１６とＥＰ−１７の組み合わせ
で、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含むよう反応
液を１００μｌ調整し、TaqDNA polymerase（パーキン
エルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７
２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％
アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid
DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの
推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回
収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−
Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を
行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することに
より各断片をクローニングした。
１０とＥＰ−１１，ＥＰ−１２とＥＰ−１３，ＥＰ−１
４とＥＰ−１５，ＥＰ−１６とＥＰ−１７の組み合わせ
で、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含むよう反応
液を１００μｌ調整し、TaqDNA polymerase（パーキン
エルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７
２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％
アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid
DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの
推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回
収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥＭ−
Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反応を
行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換することに
より各断片をクローニングした。
【０１０３】Automated DNA sequencer （アプライドバ
イオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確
認した後、ＥＰ−１０とＥＰ−１１の組み合わせから得
られる断片をクローニングしたプラスミドからはＥｃｏ
ＲＩ−ＮｃｏＩで切断することにより得られる断片、Ｅ
Ｐ−１２とＥＰ−１３の組み合わせから得られる断片を
クローニングしたプラスミドからはＮｃｏＩ−Ｂｓｉｗ
Ｉで切断することにより得られる断片、ＥＰ−１４とＥ
Ｐ−１５の組み合わせから得られる断片をクローニング
したプラスミドからはＢｓｉｗＩ−ＢｓｐＥＩで切断す
ることにより得られる断片、ＥＰ−１６とＥＰ−１７の
組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラス
ミドからはＢｓｐＥＩ−ＨｉｎｄIII で切断することに
より得られる断片を調製し、これらを組み合わせてＮＳ
３領域エピトープをコードするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
I 断片を構築した。
イオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確
認した後、ＥＰ−１０とＥＰ−１１の組み合わせから得
られる断片をクローニングしたプラスミドからはＥｃｏ
ＲＩ−ＮｃｏＩで切断することにより得られる断片、Ｅ
Ｐ−１２とＥＰ−１３の組み合わせから得られる断片を
クローニングしたプラスミドからはＮｃｏＩ−Ｂｓｉｗ
Ｉで切断することにより得られる断片、ＥＰ−１４とＥ
Ｐ−１５の組み合わせから得られる断片をクローニング
したプラスミドからはＢｓｉｗＩ−ＢｓｐＥＩで切断す
ることにより得られる断片、ＥＰ−１６とＥＰ−１７の
組み合わせから得られる断片をクローニングしたプラス
ミドからはＢｓｐＥＩ−ＨｉｎｄIII で切断することに
より得られる断片を調製し、これらを組み合わせてＮＳ
３領域エピトープをコードするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
I 断片を構築した。
【０１０４】ＨＣＶグループ１のＮＳ４領域エピトープ
とＨＣＶグループ１コア領域エピトープをコードする断
片はＥＰ−１８とＥＰ−１９，ＥＰ−２０とＥＰ−２１
を組み合わせ、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含
むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase
（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０
℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応
させた。３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離
し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用
い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバ
ッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用
い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に
従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質
転換することにより各断片をクローニングした。
とＨＣＶグループ１コア領域エピトープをコードする断
片はＥＰ−１８とＥＰ−１９，ＥＰ−２０とＥＰ−２１
を組み合わせ、精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ含
むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymerase
（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０
℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応
させた。３％アガロースゲル電気泳動により断片を分離
し、Mermaid DNA purification kit（Bio101社）を用
い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバ
ッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を用
い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に
従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質
転換することにより各断片をクローニングした。
【０１０５】Automated DNA sequencer （アプライドバ
イオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確
認した後、ＥＰ−１８とＥＰ−１９の組み合わせから得
られる断片をクローニングしたプラスミドからはＨｉｎ
ｄIII −ＮｏｔＩで切断することにより得られる断片、
ＥＰ−２０とＥＰ−２１の組み合わせから得られる断片
をクローニングしたプラスミドからはＮｏｔＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片を調製し、これらを結合することによりＨｉｎｄ
III −ＫｐｎＩ断片を調製した。一方ＣＥＰ（１３）と
ＣＥＰ（１４）の精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ
含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymera
se（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０
℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応
させた。
イオシステム373A）により、塩基配列が正しいことを確
認した後、ＥＰ−１８とＥＰ−１９の組み合わせから得
られる断片をクローニングしたプラスミドからはＨｉｎ
ｄIII −ＮｏｔＩで切断することにより得られる断片、
ＥＰ−２０とＥＰ−２１の組み合わせから得られる断片
をクローニングしたプラスミドからはＮｏｔＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片を調製し、これらを結合することによりＨｉｎｄ
III −ＫｐｎＩ断片を調製した。一方ＣＥＰ（１３）と
ＣＥＰ（１４）の精製したＤＮＡ断片それぞれを１μｇ
含むよう反応液を１００μｌ調整し、Taq DNA polymera
se（パーキンエルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０
℃、１分、７２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応
させた。
【０１０６】３％アガロースゲル電気泳動により断片を
分離し、Mermaid DNA purificationkit（Bio101社）を
用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥ
バッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を
用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法
に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形
質転換することにより各断片をクローニングした。Auto
mated DNA sequencer（アプライドバイオシステム373
A）により、塩基配列が正しいことを確認した後、ＣＥ
Ｐ（１３）とＣＥＰ（１４）の組み合わせから得られる
断片をクローニングしたプラスミドから得たＫｐｎＩ−
ＸｈｏＩ断片と、上記のＨｉｎｄIII −ＫｐｎＩ断片を
結合させ、グループ１エピトープキメラペプチドをコー
ドするＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片を得た。
分離し、Mermaid DNA purificationkit（Bio101社）を
用い、メーカーの推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥ
バッファー中に回収した。回収したＤＮＡ断片の一部を
用い、ｐＧＥＭ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法
に従い連結反応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形
質転換することにより各断片をクローニングした。Auto
mated DNA sequencer（アプライドバイオシステム373
A）により、塩基配列が正しいことを確認した後、ＣＥ
Ｐ（１３）とＣＥＰ（１４）の組み合わせから得られる
断片をクローニングしたプラスミドから得たＫｐｎＩ−
ＸｈｏＩ断片と、上記のＨｉｎｄIII −ＫｐｎＩ断片を
結合させ、グループ１エピトープキメラペプチドをコー
ドするＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片を得た。
【０１０７】グループ２エピトープキメラペプチドをコ
ードする断片はｐＣ５０ＮをＸｈｏＩ−ＳａｃＩで切断
することによって得られる断片を用いた。これらのコア
エピトープペプチドをコードする断片は、精製したＥＰ
１０１，ＥＰ１０２断片それぞれを１μｇ含むよう反応
液を１００μｌ調整し、Taq DNApolymerase（パーキン
エルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７
２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％
アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid
DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの
推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回
収した。
ードする断片はｐＣ５０ＮをＸｈｏＩ−ＳａｃＩで切断
することによって得られる断片を用いた。これらのコア
エピトープペプチドをコードする断片は、精製したＥＰ
１０１，ＥＰ１０２断片それぞれを１μｇ含むよう反応
液を１００μｌ調整し、Taq DNApolymerase（パーキン
エルマー社）を用い９４℃、３０秒、５０℃、１分、７
２℃、１分のサイクルで１５サイクル反応させた。３％
アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、Mermaid
DNA purification kit（Bio101社）を用い、メーカーの
推奨する方法に従いＤＮＡ断片をＴＥバッファー中に回
収した。
【０１０８】回収したＤＮＡ断片の一部を用い、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反
応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換するこ
とにより各断片をクローニングした。Automated DNA se
quencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩
基配列が正しいことを確認することによりコアエピトー
プペプチドをコードする断片ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片
を得た。上記の各エピトープ断片を順次連結結合させて
いくことにより、エピトープキメラペプチドＣＥＰ−Ａ
をコードするＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩを得た。この断片
をｐＡＴ−ＴｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
部位に挿入することによりＣＥＰ−Ａ抗原発現ベクタ
ー、ｐＣＥＰ−Ａを構築した。
Ｍ−Ｔベクターとメーカーの推奨する方法に従い連結反
応を行ない、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換するこ
とにより各断片をクローニングした。Automated DNA se
quencer （アプライドバイオシステム373A）により、塩
基配列が正しいことを確認することによりコアエピトー
プペプチドをコードする断片ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片
を得た。上記の各エピトープ断片を順次連結結合させて
いくことにより、エピトープキメラペプチドＣＥＰ−Ａ
をコードするＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩを得た。この断片
をｐＡＴ−ＴｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
部位に挿入することによりＣＥＰ−Ａ抗原発現ベクタ
ー、ｐＣＥＰ−Ａを構築した。
【０１０９】ＣＥＰ−Ａ抗原の発現プラスミドのＮＳ３
領域の変更を以下のように行った。ｐＣＥＰ−Ａ １ng
（１０μｌ）に１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５
μｌ，２mM ｄＮＴＰ ５μｌ、プライマー４２−２及
び４２−３，１００pmol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKa
Ra LA Taq （宝酒造、５単位／μｌ）０．５μｌを加
え、滅菌蒸留水で５０μｌにした。ミネラルオイル（シ
グマ社）を１滴重層し、攪拌後軽く遠心した。これをパ
ーキンエルマーシータス社のDNA Thermal cycler PJ200
0 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイ
ルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリング５０
℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を３０サイ
クル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持し、４℃に
冷却した。
領域の変更を以下のように行った。ｐＣＥＰ−Ａ １ng
（１０μｌ）に１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５
μｌ，２mM ｄＮＴＰ ５μｌ、プライマー４２−２及
び４２−３，１００pmol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKa
Ra LA Taq （宝酒造、５単位／μｌ）０．５μｌを加
え、滅菌蒸留水で５０μｌにした。ミネラルオイル（シ
グマ社）を１滴重層し、攪拌後軽く遠心した。これをパ
ーキンエルマーシータス社のDNA Thermal cycler PJ200
0 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイ
ルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリング５０
℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を３０サイ
クル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持し、４℃に
冷却した。
【０１１０】得られたＰＣＲ反応液２．５μｌに１０ｘ
ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２mM ｄＮＴＰ
５μｌ、プライマー４２−１及び４２−４，１００pm
ol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKaRa LA Taq （宝酒造、
５単位／μｌ）０．５μｌを加え、滅菌蒸留水で５０μ
ｌにする。これをパーキンエルマー社のDNA Thermalcyc
ler PJ2000 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応の
プロファイルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリ
ング５０℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を
３０サイクル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持
し、４℃に冷却した。このＰＣＲ反応液を3% NuSieve a
garose (FMC Bioproducts 社) で電気泳動したところ、
約３５０bpのＰＣＲ産物が得られた。
ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２mM ｄＮＴＰ
５μｌ、プライマー４２−１及び４２−４，１００pm
ol／μｌ）を各０．２μｌ，TaKaRa LA Taq （宝酒造、
５単位／μｌ）０．５μｌを加え、滅菌蒸留水で５０μ
ｌにする。これをパーキンエルマー社のDNA Thermalcyc
ler PJ2000 にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応の
プロファイルはＤＮＡ変性９４℃，０．５分、アニーリ
ング５０℃，１分、伸張反応７２℃，１分でこの反応を
３０サイクル繰り返した。終了後７２℃で７分間保持
し、４℃に冷却した。このＰＣＲ反応液を3% NuSieve a
garose (FMC Bioproducts 社) で電気泳動したところ、
約３５０bpのＰＣＲ産物が得られた。
【０１１１】この約３５０bpのＰＣＲ産物をアガロース
から切り出し、ＴＥ（１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ (pH
７．５），１mM ＥＤＴＡ）を２００μｌ加え、６８℃
に加温する。ＴＥ飽和フェノールでフェノール抽出を２
回、ＴＥ飽和クロロフォルムでクロロフォルム抽出を１
回行い、水層を分離する。エタノール沈殿を行い、７５
％エタノールで１回リンスし、乾燥させ、ＴＥ１０μｌ
に溶解した。回収したＤＮＡ ５μｌにｐＧＥＭ−Ｔベ
クター（Promega 社）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０ｘ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ，Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ１μｌ（Promega 社：1 Weiss units ／μ
ｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で１時間反応させ
た。
から切り出し、ＴＥ（１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ (pH
７．５），１mM ＥＤＴＡ）を２００μｌ加え、６８℃
に加温する。ＴＥ飽和フェノールでフェノール抽出を２
回、ＴＥ飽和クロロフォルムでクロロフォルム抽出を１
回行い、水層を分離する。エタノール沈殿を行い、７５
％エタノールで１回リンスし、乾燥させ、ＴＥ１０μｌ
に溶解した。回収したＤＮＡ ５μｌにｐＧＥＭ−Ｔベ
クター（Promega 社）１μｌ（５０ng／μｌ）、１０ｘ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー１μｌ，Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ１μｌ（Promega 社：1 Weiss units ／μ
ｌ）、滅菌蒸留水２μｌを加え１６℃で１時間反応させ
た。
【０１１２】この反応液５μｌを用い大腸菌ＸＬ−１
ｂｕｌｅを井上らの方法〔Inoue etal, Gene, 96 (199
0) 23-28〕に従って形質転換させＸ−ｇａｌ，ＩＰＴＧ
を含むＬＢ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを
選択する事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダ
ーゼ欠損のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色
のコロニーをアンピシリン１００μｇ／mlを添加したＬ
Ｂ培地３mlで一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置
（KURABO：PI-100）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｌＩ及びＨｉｎｄII
I で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラス
ミドＤＮＡを選択した。
ｂｕｌｅを井上らの方法〔Inoue etal, Gene, 96 (199
0) 23-28〕に従って形質転換させＸ−ｇａｌ，ＩＰＴＧ
を含むＬＢ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを
選択する事によりアンピシリン耐性で、βガラクトシダ
ーゼ欠損のプラスミドを持つコロニーを得た。この白色
のコロニーをアンピシリン１００μｇ／mlを添加したＬ
Ｂ培地３mlで一昼夜培養し、プラスミド自動分離装置
（KURABO：PI-100）でプラスミドＤＮＡを回収した。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｌＩ及びＨｉｎｄII
I で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラス
ミドＤＮＡを選択した。
【０１１３】得られたプラスミドＤＡＮはWizerdTM Min
ipreps DNA Purification System（Promega 社）を用
い、メーカーのプロトコールに従い精製した。精製した
ＤＮＡをPRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminat
or cycle Sequencing Kit (Applied Biosysytems社）を
用いＴ７プライマー及びＳＰ６プライマー（Applied Bi
osysytems 社）でメーカーの推奨する方法に従って反応
させた。この反応産物を370 DNA sequencer (Applied B
iosysytems社）で解析し、核酸配列を決定した。正しい
配列のクローンをｐＧＥＭ−Ｃ７Ｍと命名した。
ipreps DNA Purification System（Promega 社）を用
い、メーカーのプロトコールに従い精製した。精製した
ＤＮＡをPRISMTM Ready Reaction dyeDeoxyTM terminat
or cycle Sequencing Kit (Applied Biosysytems社）を
用いＴ７プライマー及びＳＰ６プライマー（Applied Bi
osysytems 社）でメーカーの推奨する方法に従って反応
させた。この反応産物を370 DNA sequencer (Applied B
iosysytems社）で解析し、核酸配列を決定した。正しい
配列のクローンをｐＧＥＭ−Ｃ７Ｍと命名した。
【０１１４】ｐＧＥＭ−Ｃ７ＭをＳｐ１ＩとＨｉｎｄII
I によって切断し、アガロース電気泳動により３４０bp
の断片を分離した。分離した断片はMermaid DNA purifi
cation kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方
法に従い、ＴＥバッファー中に回収した。一方ｐＣＥＰ
−ＡをＳｐ１ＩとＨｉｎｄIII によって切断し、アガロ
ース電気泳動により約４kbp の断片を分離した。分離し
た断片はGene Clean II キット（Bio101社）を用い、メ
ーカーの推奨する方法に従い、ＴＥバッファー中に回収
した。上記の回収した両断片をＴ４ ＤＮＡ リガーゼ
により連結結合させ、反応液を用い大腸菌ＨＢ１０１を
形質転換し、目的の断片が挿入されているクローンを選
択した。
I によって切断し、アガロース電気泳動により３４０bp
の断片を分離した。分離した断片はMermaid DNA purifi
cation kit（Bio101社）を用い、メーカーの推奨する方
法に従い、ＴＥバッファー中に回収した。一方ｐＣＥＰ
−ＡをＳｐ１ＩとＨｉｎｄIII によって切断し、アガロ
ース電気泳動により約４kbp の断片を分離した。分離し
た断片はGene Clean II キット（Bio101社）を用い、メ
ーカーの推奨する方法に従い、ＴＥバッファー中に回収
した。上記の回収した両断片をＴ４ ＤＮＡ リガーゼ
により連結結合させ、反応液を用い大腸菌ＨＢ１０１を
形質転換し、目的の断片が挿入されているクローンを選
択した。
【０１１５】この結果、（１２３８−１３１３；グルー
プ１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−
（１７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８
０；グループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ
１様）−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６
−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グルー
プ２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片
からなる抗原、ＣＥＰＭを発現する発現ベクターｐＣＥ
ＰＭによって形質転換された大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ
／ＨＢ１０１株を得た。
プ１様）−（１３６３−１４６０；グループ１様）−
（１７１２−１７５１；グループ１様）−（６６−８
０；グループ１様）−（１６８６−１７０４；グループ
１様）−（１７１６−１７５１；グループ２）−（６６
−８０；グループ２）−（１６９０−１７１３；グルー
プ２）−（１−４２；グループ１様）のエピトープ断片
からなる抗原、ＣＥＰＭを発現する発現ベクターｐＣＥ
ＰＭによって形質転換された大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ
／ＨＢ１０１株を得た。
【０１１６】実施例８．エピトープキメラ抗原の発現と
精製 大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ／ＨＢ１０１株を１００μｇ
／mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養し
た。これを１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含
むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後
遠心により菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５），３０mMＮａＣｌ，５
mM ＥＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（10mg
／ml Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を加え、37℃において１時間
処理した。この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ, ９０秒
で２回）にかけることにより細胞を破壊した。１５００
０rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回
収した。
精製 大腸菌形質転換体ＣＥＰＭ／ＨＢ１０１株を１００μｇ
／mlアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃一夜培養し
た。これを１％濃度で１００μｇ／mlアンピシリンを含
むＭ９−ＣＡに接種し３７℃一夜培養した。培養終了後
遠心により菌体を集め、５０mlのＬｙｓｉｓ液〔５０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５），３０mMＮａＣｌ，５
mM ＥＤＴＡ〕に再懸濁し、１mlのリゾチーム液（10mg
／ml Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を加え、37℃において１時間
処理した。この懸濁液を超音波処理（１５０Ｗ, ９０秒
で２回）にかけることにより細胞を破壊した。１５００
０rpm で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回
収した。
【０１１７】不溶性分画を５０mlのＮＰ４０を１％含む
Ａ溶液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）〕に再
懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）し
た。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの２
Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００
rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm
で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収し
た。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸
濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）し
た。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間
遠心し可溶性分画を回収した。６Ｍ尿素を含む溶液で可
溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム
（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒ
ｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法
により本発明のエピトープキメラ抗原を精製した。
Ａ溶液〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）〕に再
懸濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）し
た。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間
遠心し不溶性分画を回収した。不溶性分画を５０mlの２
Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸濁しホモジナイズ（１５００
rpm で５ストローク）した。懸濁液を１５０００rpm
で、４℃において３０分間遠心し不溶性分画を回収し
た。不溶性分画を５０mlの６Ｍ尿素を含むＡ溶液に再懸
濁しホモジナイズ（１５００rpm で５ストローク）し
た。懸濁液を１５０００rpm で、４℃において３０分間
遠心し可溶性分画を回収した。６Ｍ尿素を含む溶液で可
溶化した抗原溶液から、ＳセファーロースＨＰカラム
（ファルマシア社）を用いたイオン交換法とＳｕｐｅｒ
ｄｅｘ７５ｐｇ（ファルマシア社）を用いたゲル濾過法
により本発明のエピトープキメラ抗原を精製した。
【０１１８】実施例９．エピトープキメラ抗原と患者血
清との反応 上記のようにして得た本発明のエピトープキメラ抗原Ｃ
ＥＰＭを５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む
０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈し
た抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェル
あたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希
釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキン
グ液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２．
５mM ＥＤＴＡ，０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を
加え室温に２時間静置した。このように抗原をプレート
に固定した。検体２０μｌに検体希釈液２００μｌ加え
た後に抗原を固定したプレートに加えた。
清との反応 上記のようにして得た本発明のエピトープキメラ抗原Ｃ
ＥＰＭを５μｇ／mlの濃度となるように８Ｍ尿素を含む
０．１Ｍの燐酸緩衝液（pH７．５）に希釈した。希釈し
た抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェル
あたり２００μｌのせ、室温に２時間静置した。抗原希
釈液を除いた後、ウェルあたり２００μｌのブロッキン
グ液〔０．５％カゼイン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２．
５mM ＥＤＴＡ，０．１Ｍ燐酸緩衝液（pH７．０）〕を
加え室温に２時間静置した。このように抗原をプレート
に固定した。検体２０μｌに検体希釈液２００μｌ加え
た後に抗原を固定したプレートに加えた。
【０１１９】３０℃１時間反応させた後、洗浄を行な
い、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノク
ローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄し
た後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時
間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を
停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。結果を
表６及び表７に示す。
い、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノク
ローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄し
た後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時
間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を
停止させ、比色計で４９２nmの発色を測定した。結果を
表６及び表７に示す。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
【表７】
【０１２２】
配列番号：１ 配列の長さ：１２７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 ATCGAT ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp 1 5 10 CCA GAA TTC ACT AAA GTG CCG GCT GCA TAT GCA GCC CAA GGG TAC AAG 96 Pro Glu Phe Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys 15 20 25 30 GTG CTC GTC CTC AAC CCG TCC GTT GCC GCC ACC TTA GGT TTT GGA GCG 144 Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala 35 40 45 TAT ATG TCT AAG GCA CAT GGC ACC GAC CCC AAC ATC AGA ACT GGG GTA 192 Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val 50 55 60 AGG ACT ATC ACC ACA GGC GCC CCC ATC ACG TAC TCC ACC TAC GGC AAG 240 Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys 65 70 75 TTC CTT GCC GAC GGT GGT TGT TCT GGG GGC GCT TAT GAC ATC ATA GGG 288 Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Gly 80 85 90 TCC GGA GAG GAG GTG GCC CTG TCT AAC ACT GGA GAG ATC CCC TTC TAT 336 Ser Gly Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr 95 100 105 110 GGC AAA GGC ATC CCC ATT GAA GTC ATC AAG GGG GGA AGG CAT CTC ATT 384 Gly Lys Gly Ile Pro Ile Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile 115 120 125 TTC TGC CAT TCC AAG AAG AAG TGC GAC GAG CTC GCC GCG AAG TTG TCA 432 Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser 130 135 140 GGC CTC GGG ATT AAT GCT GTG GCA TAC TAC CGG GGT CTT GAT GTG TCC 480 Gly Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser 145 150 155 GTC ATA CCG ACC AGC GGA GAC GTC GTT GTC GTG GCA ACA GAC GCT CTA 528 Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu 160 165 170 ATG ACG GGC TAT ACC GGC GAT TTT GAC TCA GTG ATC GAC TGT AAC ACA 576 Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr 175 180 185 190 TGC GTC ACC CAG GGA TCT GGA CTG GTA AGC TTC GCC TCA CAC CTC CCT 624 Cys Val Thr Gln Gly Ser Gly Leu Val Ser Phe Ala Ser His Leu Pro 195 200 205 TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAG CTT GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG 672 Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala 210 215 220 CTC GGA TTG CTG CAA ACA GCC ACC AAG CAC GCG GAG GCT GCT GCT CCC 720 Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys His Ala Glu Ala Ala Ala Pro 225 230 235 GTG GTA GGT ACC CCT AAA GCT CGT CGT CCG GAA GGT CGT GCT TGG GCT 768 Val Val Gly Thr Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala 240 245 250 CAA CCC GGG AGT GTG GTC ATT GTG GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG 816 Gln Pro Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg 255 260 265 270 CCG GCT GTT ATT CCC GAC AGG GAA GTC CTC TAC CGG GAG TTC TTT CTC 864 Pro Ala Val Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Phe Leu 275 280 285 GAG GCC TCT AGA GCG GCT CTC ATT GAA GAG GGG CAA CGG ATA GCC GAG 912 Glu Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu 290 295 300 ATG CTG AAG TCC AAG ATC CAG GGC TTA CTG CAG CAA GCC TCC AAG CAG 960 Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln 305 310 315 GCC CAA GAC ATA AAA ATC GAC GGT ACC CTG ATT ATT CCG AAA GAT CGT 1008 Ala Gln Asp Ile Lys Ile Asp Gly Thr Leu Ile Ile Pro Lys Asp Arg 320 325 330 CGC AGC ACC GGT AAA AGC TGG GGT AAA CCG GGC TTC CTC ATC GAT AGC 1056 Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Phe Leu Ile Asp Ser 335 340 345 350 TTG CAT ATC AAC CAG CGA GCC GTC GTT GCA CCG GAC AAG GAG GTC CTT 1104 Leu His Ile Asn Gln Arg Ala Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu 355 360 365 TAT GAG GCT TTT GAT GAG ATG GAG CTC GCC ATG GGC ATG GGC ACG AAT 1152 Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu Leu Ala Met Gly Met Gly Thr Asn 370 375 380 CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA AGA AAC ACT AAC CGT CGC CCA CAA 1200 Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln 385 390 395 GAC GTT AAG TTT CCG GGC GGC GGC CAG ATC GTT GGC GGA GTA TAC TTG 1248 Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu 400 405 410 TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGA TAAGGATCC 1278 Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg 415 420
【０１２３】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ 配列 Phe Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp 1 5 10 15 Ala Gln Pro Gly 20
【０１２４】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ 配列 Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp 1 5 10 15 Gly Lys Pro Gly 20
【０１２５】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCCA GTCATTCCAA GTGGCCCAT 29
【０１２６】配列番号：５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT ACCCAGTTCT GATGTTGGG 29
【０１２７】配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGG AGCGTATATG TCTAAG 26
【０１２８】配列番号：７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT AGCCGATGCC CAAGATGGA 29
【０１２９】配列番号：８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGG CGCTTATGAC ATCATA 26
【０１３０】配列番号：９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT ATCCAGTGTT AGACAGGGC 29
【０１３１】配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGG AGCACGGCTC GTCGTG 26
【０１３２】配列番号：１１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT ATGACAACTT CGCGGCGAG 29
【０１３３】配列番号：１２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGG AAGGCATCTC ATTTTC 26
【０１３４】配列番号：１３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT AGCCCGTCAT ATGAGCGTC 29
【０１３５】配列番号：１４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGG CCTCGGGATT AATGCT 26
【０１３６】配列番号：１５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGATCCTT ACTCAATGGT GAAGGTGGG 29
【０１３７】配列番号：１６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGAATTCGC CTCACACCTC CCTTACATC 29
【０１３８】配列番号：１７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGGTACCTAC CACGGGAGCA GCAGCTC 27
【０１３９】配列番号：１８ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 AGGTACCCCT AAAGCTCGTC GTCCGGAAGG TCGTGCT 37
【０１４０】配列番号：１９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 TCCCGGGTTG AGCCCAAGCA CGACCTTCCG GACG 34
【０１４１】配列番号：２０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 ACCCGGGAGT GTGGTCATTG TGGGTAGG 28
【０１４２】配列番号：２１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GAGGATCCTT ATCAATCGAA CTCCCGGTAG AGGACTTC 38
【０１４３】配列番号：２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GTAAGCTTCG CCTCACACCT CCCTTACATC 30
【０１４４】配列番号：２３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCCTCGAGAA AGAACTCCCG GTAGAGGAC 29
【０１４５】配列番号：２４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 ATGGAGCTCG CCATGGGCAT GGGCACGAAT 30
【０１４６】配列番号：２５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 TATGGATCCT TATCTGGGGC CCCTGCGCGG CAA 33
【０１４７】配列番号：２６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CCAGCCTTCA CTAAAGTGCC GGCTGCA 27
【０１４８】配列番号：２７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CTCTCCGGAC CCTATGATGT CATAAGCGCC 30
【０１４９】配列番号：２８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGGTCCGGAG AGGAGGTGGC CCTGTCT 27
【０１５０】配列番号：２９ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GAAGCTTACC AGTCCAGATC CCTGGGTGAC GCATCTGTTA CA 42
【０１５１】配列番号：３０ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GACTCGAGGC CTCTAGAGCG GCTCTCATT 29
【０１５２】配列番号：３１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCTATCGATT TTTATGTCTT GGGCCTG 27
【０１５３】配列番号：３２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 AAAATCGATA GCTTGCATAT CAACCAG 27
【０１５４】配列番号：３３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GACGAGCTCC ATCTCATCAA AAGCCTC 27
【０１５５】配列番号：３４ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CGGTCGACGG TACCCTGATT ATTCCGAAAG ATCGTCGCAG CACCGGTA 48
【０１５６】配列番号：３５ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCTATCGATG AGGAAGCCCG GTTTACCCCA GCTTTTACCG GTGCTGCG 48
【０１５７】配列番号：３６ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg 35 40
【０１５８】配列番号：３７ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 1 5 10 15
【０１５９】配列番号：３８ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 1 5 10 15
【０１６０】配列番号：３９ 配列の長さ：７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val 1 5 10 15 Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser 20 25 30 Lys Ala His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile 35 40 45 Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala 50 55 60 Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 65 70 75
【０１６１】配列番号：４０ 配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ile Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys 20 25 30 His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu 35 40 45 Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 50 55 60 Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val 85 90 95 Thr Gln
【０１６２】配列番号：４１ 配列の長さ：３９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys His Ala 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Pro Val Val 35
【０１６３】配列番号：４２ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala 1 5 10 15 Val Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe 20 25
【０１６４】配列番号：４３ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met 1 5 10 15 Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala 20 25 30 Gln Asp Ile Lys 35
【０１６５】配列番号：４４ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu His Ile Asn Gln Arg Ala Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu 1 5 10 15 Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu 20
【０１６６】配列番号：４５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGAATTCGAG GAGGTGGCCC TGTCTAACAC T 31
【０１６７】配列番号：４６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGGATCCTTA CTGGGTGACG CATGTGTTAC AGTC 34
【０１６８】配列番号：４７ 配列の長さ：１１９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GAA TTC ACC AAA GTG CCG GTT GCT TAT GCG GCC AAA GGT TAT AAG GTC 48 Glu Phe Thr Lys Val Pro Val Ala Tyr Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val 5 10 15 CTG GTT CTG GAC CCG AGC GTT GCC AGC ACC CTG GGT TTC GGC GCG TAT 96 Leu Val Leu Asp Pro Ser Val Ala Ser Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr 20 25 30 CTG AGC AAG GCC CAT GGT GTG AAC CCG AAC ATC CGC ACG GGC ATC CGT 144 Leu Ser Lys Ala His Gly Val Asn Pro Asn Ile Arg Thr Gly Ile Arg 35 40 45 ACC GTT ACC ACC GGT GCT CCG GTG ACC TAT TCC ACC TAC GGT AAA TAC 192 Thr Val Thr Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Tyr 50 55 60 CTG GCG GAC GGC GGT TGC GCC GGC GGT GCG TAC GAT GTG ATC GGA TCT 240 Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Tyr Asp Val Ile Gly Ser 65 70 75 80 GGA GAG GAG GTG GCC CTG TCT AAC ACT GGA GAG GTC CCC TTC TAT GGC 288 Gly Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Val Pro Phe Tyr Gly 85 90 95 CGC GCG ATC CCG ATC GAA GCG ATC AAA GGC GGT CGC CAT CTG GTT TTC 336 Arg Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Val Phe 100 105 110 TGC CAT AGC AAG GAG AAA TGC GAT GAA CTG GCG AGC GCG CTG TCC GGA 384 Cys His Ser Lys Glu Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ser Ala Leu Ser Gly 115 120 125 TTG GGT CTG AAC GCT GTG GCA TTC TAT CGC GGT CTG GAC GTG AGC ATT 432 Leu Gly Leu Asn Ala Val Ala Phe Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Ile 130 135 140 ATC CCG ACC CAG GGC GAT GTG GTT ATC GTT AGC ACC GAT GCG CTG ATG 480 Ile Pro Thr Gln Gly Asp Val Val Ile Val Ser Thr Asp Ala Leu Met 145 150 155 160 ACC GGT TTT ACC GGC GAT TTT GAC TCA GTG GTC GAC TGT AAC ACA TGC 528 Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Val Asp Cys Asn Thr Cys 165 170 175 ATC ACC CAG GGA TCT GGA CTG GTA AGC TTC GCG AGC CAT GTG CCG TAC 576 Ile Thr Gln Gly Ser Gly Leu Val Ser Phe Ala Ser His Val Pro Tyr 180 185 190 ATC GAG CAG GGT ATG CAA CTG AGC GAA CAA TTT AAG CAG AAG AGC CTG 624 Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ser Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ser Leu 195 200 205 GGT CTG CTG CAG ACC GCG ACC AAA CAG GCG GAG GCG GCC GCC CCG GTG 672 Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 210 215 220 GTT GGC ACC CCG AAA AGC CGC CGT CCG GAA GGT CGT GCC TGG GCG CAA 720 Val Gly Thr Pro Lys Ser Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 225 230 235 240 CCG GGT ACC ATC ATC CTG AGC GGT CGT CCG GCG GTT GTA CCG GAT CGT 768 Pro Gly Thr Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val Pro Asp Arg 245 250 255 GAA GTG CTG TAT CAA GAA TTT CTC GAG GCC TCT AGA GCG GCT CTC ATT 816 Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Leu Glu Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile 260 265 270 GAA GAG GGG CAA CGG ATA GCC GAG ATG CTG AAG TCC AAG ATC CAG GGC 864 Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly 275 280 285 TTA CTG CAG CAA GCC TCC AAG CAG GCC CAA GAC ATA AAA ATC GAC GGT 912 Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala Gln Asp Ile Lys Ile Asp Gly 290 295 300 ACC CTG ATT ATT CCG AAA GAT CGT CGC AGC ACC GGT AAA AGC TGG GGT 960 Thr Leu Ile Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly 305 310 315 320 AAA CCG GGC TTC CTC ATC GAT AGC TTG CAT ATC AAC CAG CGA GCC GTC 1008 Lys Pro Gly Phe Leu Ile Asp Ser Leu His Ile Asn Gln Arg Ala Val 325 330 335 GTT GCA CCG GAC AAG GAG GTC CTT TAT GAG GCT TTT GAT GAG ATG GAG 1056 Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu 340 345 350 CTC GCC ATG GGC ACC AAC CCG AAA CCG GAG CGT AAA AGC AAG CGT AAC 1104 Leu Ala Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Glu Arg Lys Ser Lys Arg Asn 355 360 365 ACC AAC CGT AAA CCG CAG GAT ATT AAA TTC CCG GGT AGT GGT CAG GTG 1152 Thr Asn Arg Lys Pro Gln Asp Ile Lys Phe Pro Gly Ser Gly Gln Val 370 375 380 GTG GGT GGT GTG TAC CTG GTG CCG CGT CGT GGT CCG TAAGGATCC 1197 385 390 395
【０１６９】配列番号：４８ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 AGCCGTGACC CAGAATTCAC CAAAGTGCCG GTTGCTTATG CGGCCAAAGG TTATAAGGTC 60 CTGGTTCTGG ACCCGAGC 78
【０１７０】配列番号：４９ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 ACCATGGGCC TTGCTCAGAT ACGCGCCGAA ACCCAGGGTG CTGGCAACGC TCGGGTCCAG 60 AACCAG 66
【０１７１】配列番号：５０ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCCCATGGTG TGAACCCGAA CATCCGCACG GGCATCCGTA CCGTTACCAC CGGTGCTCCG 60 GTGACCTAT 69
【０１７２】配列番号：５１ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 ATCGTACGCA CCGCCGGCGC AACCGCCGTC CGCCAGGTAT TTACCGTAGG TGGAATAGGT 60 CACCGGAGCA CC 72
【０１７３】配列番号：５２ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGTGCGTACG ATGTGATCTA TGGCCGCGCG ATCCCGATCG AAGCGATCAA AGGCGGTCGC 60 CATCTGGTT 69
【０１７４】配列番号：５３ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAATCCGGAC AGCGCGCTCG CCAGTTCATC GCATTTCTCC TTGCTATGGC AGAAAACCAG 60 ATGGCGACCG CC 72
【０１７５】配列番号：５４ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CTGTCCGGAT TGGGTCTGAA CGCTGTGGCA TTCTATCGCG GTCTGGACGT GAGCATTATC 60 CCGACCCAGG GC 72
【０１７６】配列番号：５５ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CGCGAAGCTT ACCAGACCGG TCATCAGCGC ATCGGTGCTA ACGATAACCA CATCGCCCTG 60 GGTCGGGATA AT 72
【０１７７】配列番号：５６ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GTAAGCTTCG CGAGCCATGT GCCGTACATC GAGCAGGGTA TGCAACTGAG CGAACAATTT 60 AAGCAGAAG 69
【０１７８】配列番号：５７ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CGGGGCGGCC GCCTCCGCCT GTTTGGTCGC GGTCTGCAGC AGACCCAGGC TCTTCTGCTT 60 AAATTGTTCG CT 72
【０１７９】配列番号：５８ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GAGGCGGCCG CCCCGGTGGT TGGCACCCCG AAAAGCCGCC GTCCG 45
【０１８０】配列番号：５９ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GATGGTACCC GGTTGCGCCC AGGCACGACC TTCCGGACGG CGGCTTTTC 49
【０１８１】配列番号：６０ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CAGGGTACCA TCATCCTGAG CGGTCGTCCG GCGGTTGTAC CGGAT 45
【０１８２】配列番号：６１ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CTCGAGAAAT TCTTGATACA GCACTTCACG ATCCGGTACA ACCGC 45
【０１８３】配列番号：６２ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GAGCTCGCCA TGGGCACCAA CCCGAAACCG GAGCGTAAAA GCAAGCGTAA CACCAACCGT 60 AAACCGCAGG ATATTAAA 78
【０１８４】配列番号：６３ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GCGGATCCTT ACGGACCACG ACGCGGCACC AGGTACACAC CACCCACCAC CTGACCACTA 60 CCCGGGAATT TAATATCCT GCGGTTTACG 90
【０１８５】配列番号：６４ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGCCGC GCGATCCCGA T 51
【０１８６】配列番号：６５ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GGCCCTGTCT AACACTGGAG AGGTCCCCTT CTATGGCCGC GCGATCCCGA T 51
【０１８７】配列番号：６６ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 GTTACAGTCG ACCACTGAGT CAAAATCGCC GGTAAAACCG GTCATCAGCG CATCGG 56
【０１８８】配列番号：６７ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Synthetic DNA 配列 CGAAGCTTAC CAGTCCAGAT CCCTGGGTGA TGCATGTGTT ACAGTCGACC ACTGAGT 57
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 33/576 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 千葉 幸江 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ポリペプチ
ドのコア領域の少なくとも２個のエピトープ性ペプチド
領域、ＮＳ３領域の２個のエピトープ性ペプチド領域、
及びＮＳ４領域の少なくとも２個のエピトープ性ペプチ
ド領域を含んで成る、ＨＣＶに感染したヒトが産生する
抗体と特異的に結合するＨＣＶキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項２】 遺伝子型グループ１に属するＨＣＶポリ
ペプチドの第１２３８位〜第１３１１位または第１２３
８位〜第１３１３位のペプチド領域、第１３６３位〜第
１４６０位のペプチド領域、第１７１２位〜第１７５１
位のペプチド領域、第６６位〜第８０位のペプチド領域
および第１６８６位〜第１７０４位のペプチド領域；遺
伝子型グループ２に属するＨＣＶポリペプチドの第１７
１６位〜第１７５１位のペプチド領域、第６６位〜第８
０位のペプチド領域及び第１６９０位〜第１７１４位の
ペプチド領域；並びに遺伝子型グループ１または２に属
するＨＣＶポリペプチドの第１位〜第４３位または第１
位〜第４２位のペプチド領域を含んで成り、これらの領
域がエピトープ活性を有しないリンカーペプチドにより
連結されていてもよい単一ポリペプチド、あるいは上記
アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列を有する単一ポリペプチド、から成る請求項１
に記載のＨＣＶキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項３】 配列番号：１に示すアミノ酸配列中、１
８位のアミノ酸Ｔｈｒ以後のアミノ酸配列、又は配列番
号：４７に示すアミノ酸配列中３位のアミノ酸Ｔｈｒ以
外のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のＨ
ＣＶキメラ抗原ペプチド。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のキ
メラ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡを含んで成る発
現ベクターにより形質転換させる宿主を培養し、該培養
物からキメラ抗原ペプチドを採取することを特徴とす
る、キメラ抗原ペプチドの製造方法。 - 【請求項６】 ＨＣＶ感染の検出方法であって、被検体
を請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ抗原ペプ
チドと接触せしめ、抗原−抗体反応が生じたか否かを判
定することを特徴とする方法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP02701597A JP3891629B2 (ja) | 1996-02-09 | 1997-02-10 | キメラ抗原ペプチド |
| EP98102215A EP0870830A3 (en) | 1997-02-10 | 1998-02-09 | Chimera hepatitis C virus antigen |
| US09/020,846 US6322965B1 (en) | 1997-02-10 | 1998-02-09 | Chimera antigen peptide |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-24045 | 1996-02-09 | ||
| JP2404596 | 1996-02-09 | ||
| JP02701597A JP3891629B2 (ja) | 1996-02-09 | 1997-02-10 | キメラ抗原ペプチド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09278794A true JPH09278794A (ja) | 1997-10-28 |
| JP3891629B2 JP3891629B2 (ja) | 2007-03-14 |
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ID=26361524
Family Applications (1)
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| Country | Link |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1997
- 1997-02-10 JP JP02701597A patent/JP3891629B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6428792B1 (en) | 1996-05-24 | 2002-08-06 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| US7056658B2 (en) | 1996-05-24 | 2006-06-06 | Chiron Corporation | Multiple epitope fusion protein |
Also Published As
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|---|---|
| JP3891629B2 (ja) | 2007-03-14 |
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