JPH05506773A - 新規のｈｃｖ分離株 - Google Patents

新規のｈｃｖ分離株

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JPH05506773A JP90513188A JP51318890A JPH05506773A JP H05506773 A JPH05506773 A JP H05506773A JP 90513188 A JP90513188 A JP 90513188A JP 51318890 A JP51318890 A JP 51318890A JP H05506773 A JPH05506773 A JP H05506773A
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泉 斎藤
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ウェイナー，エイミー　ジェイ．
ハン，ヤン
コルバーグ，ジャニス　エイ．
チャ，タイ―アン
アービン，ブルース　ダンカン
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国立予防衛生研究所長
カイロン　コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 のＨＣＶ 筺ｊυ五肚 本発明は、新規のＣ型肝炎ウィルス分離株、それ由来のポリペプチド、ポリヌク レオチドおよび抗体、ならびに、ア。
セイ（例えば、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ）および ウィルスポリペプチドの製造における、このようなポリペプチド、ポリヌクレオ チドおよび抗体の使用に関する。
背！肛 非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）りは、感染性疾患、あるいはウィルスによって起 こると考えられている疾患のファミリーである。これは、公知の肝炎ウィルス、 すなわちＡ型肝炎ウィルス（）ＩＡ’／）　、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　、 およびデルタ肝炎ウィルスによって起こる他の型のウィルス関連の肝臓疾患、な らびにサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）あるいはエプスタインバーウィルス（Ｅ ＢＶ）によって起こる肝炎とは区別し得る。ＮＡＮＢＨは、最初は輸血された患 者に検出された。ヒトからチンパンジーへの感染およびチンパンジーでの連続継 代で、ＮＡＮＢＨが伝染性の（単数あるいは複数の）感染因子によることの確証 が提供された。疫学的証拠によってＮＡＮＢＨには３つの型が存在し得ることが 示唆されている。すなわち；水媒介性の流行型；血液あるいは針に関連する型； および散発的に発生する（コミユニティ−が罹患する）型である。しかし、最近 までＮＡＮＢＨの原因である感染因子は同定されていなかった。
ＮＡＮＢＨの臨床診断および同定は、主に他のウィルスマーカーを除くことによ ってなされてきた。推定されるＮＡＮＢＥＩの抗原および抗体を検出するのに用 いられる方法には、寒天ゲル拡散法、カウンターカレント免疫電気泳動法、免疫 蛍光顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、およびＥＬＩｓＡ法 がある。しかし、これらのアッセイはいずれも、ＮＡＮＢＩｌ［の診断テストと して用いられるには十分な感度、特異性、ならびに再現性を示さなかった。
最近まで、ＮＡＮＢＨ因子に関連する抗原抗体系の同定あるいは特異性は明瞭確 実にはされていなかった。ＮＡＮＢＩｌは１つよす多い感染因子によることは可 能であって、血清学的アッセイによってＮＡＮＢＨを有する患者の血清に何が検 出されているか明かではない。
かっては、ＮＡＮＢＨ因子であると考えられる多くのものが推測された。例えば 、Ｐｒ１ｎｃｅ　（１９８３）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｆｏｌ、　 ３７：２１７；　Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎａｇｌｅ　（１９８４） 　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、工１８５；　０ｖｅｒｂｙ　（１９８５） 　Ｃｕｒｒ、Ｈｅｐｔｏｌ、５：４９；　０ｖｅｒｂｙ　＜１９８６）　Ｃｕｒ ｒ、　Ｈｅｐｔｏｌ、　６：６５；　０ｖｅｒｂｙ　（１９８７）　Ｃｕｒｒ、 　Ｈｅｐｔｏｌ、　Ｚ・３５．および１ｗａｒｓｏｎ　（１９８７）　Ｂｒ１ｔ ｉｓｈ　Ｍｅｄ、　Ｊ、　２９５：９４６を参照のこと。しかし、これらのいず れにも、ＮＡＮＢＨの病因物質であることを示す証拠はない。
１９８７年に、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらは、確実にＮＡＮＢＩ（に関連するウィルス をクローン化した。例えば、欧州特許公開第３１８，２１６号；Ｈｏｕｇｈｔｏ ｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：３５９　（１９８９）を参照のこと。Ｈｏｕｇ ｈｔｏｎらは、そこで、新しいウィルスクラスであるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ ）の分離株のクローニングを開示しており、そのプロトタイプの分離株をｒ　Ｈ ＣＶＩＪと命名している。ＨＣＶは、ＲＮＡゲノムを有するフラビ様ウィルスで ある。Ｈｏｕｇｈｔｏｎらは、診断試薬として有用なｌ（Ｃ’／配列からの組換 えタンパク質の製造、ならびに、診断用のハイブリダイゼーションアノセイおよ び他のＨＣｖ分離株のクローニングに有用なポリヌクレオチドの製造について記 載している。
ＮＡＮＢＨ保持者およびＮＡＮＢＨに汚染した血液あるいは血液製剤のスクリー ニングおよび同定に感度のよい特異的な方法の必要性は重大である。輸血後肝炎 （ＰＴＨ）は輸血患者の約ｌＯ％に起こり、ＮＡＮＢＨが、これらの最高９０％ を占める。しばしば慢性の肝臓障害に進行する（　２５−５５％＞。
４患者の治療、ならびに血液および血液製剤による、あるいは個人間の密接な接 触によるＮＡＮＢＨ感染の予防には、ＮＡＮＢＨ関連の核酸、抗原および抗体を 検出する確実な診断手段および予後診断手段が必要とされる。さらに、この疾患 を予防および７．′あるいは処置するための効果的なワクチンおよび免疫治療学 的な治療剤の必要性がある。
前述の必要性をみたす有用な少なくとも１つのＨＣＶ分離株の同定がなされたが 、別の分離株、特にゲノムが相違を有する分離株は新規の応用性を有することを 証明し得る。
ｌ丑旦斐亘 ＮＡＮＢＨ保持者と考えられる日本人の血Ｍｍ供者からのｔｌｃＶの新規分離株 を特徴付けた。これらの分離株は、数種のウィルスドメインにおいて、プロトタ イプの分離株であるＨＣＶＩとはヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の異質性 （ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示す。これらの異なる配列が特に診断アッセ イおよびワクチンの開発に重要であると考えられている。
１つの実施態様において、本発明は、グループＪ１あるいはｊｌから選択される 分離株と実質的に相同であるＨＣＶ分離株の少なくとも１５ｂｐのヌクレオチド 配列を含有するＤＮＡ分子を提供する。このヌクレオチド配列は、ＨＣｖの分離 株ＨＣＶＩのヌクレオチド配列とは異なる。
他の実施態様では、本発明は、ＨＣＶ分離株Ｊ１あるいはＪｌのアミノ酸配列を コードする少なくとも１５ｂｐのヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ分子を提供 する。ここで、このＪｌあるいはＪｌのアミノ酸配列は、ＨＣＶの分離株ＨＣＶ Ｉのアミノ酸配列とは異なる。
ざらに本発ｑ、ｐ　７他の実施態様では、グループＪｌおよびＪｌから選択され る分離株と実質的に相同なＨＣＶ分離株のアミノ酸配列を含有する精製ポリペプ チドを提供する。ここで、このアミノ酸配列はｌ（Ｃ’／分離株のＨＣＶＩのポ リペプチドの配列とは異なる。
さらに本発明の他の実施態様では、ＨＣ’／の分離株のＪｌあるいはＪｌのアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。ここで、このｊｌあるいは」７の アミノ酸配列はＩＩｃＶＩｃ様のＨＣ’／１のアミノ酸配列とは異なり、このポ リペプチドは固体支持体に固定される。
さらに本発明の実施態様では、テスト試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出する、 下記の（ａ）および（ｂ）の工程を包含するイムノアッセイを提供する：（ａ） グループＪ１およびＪｌから選択される分離株と実質的に相同なＨＣ’／分離株 のアミノ酸配列であって、■Ｃｖ分離株ＨＣＶＩのアミノ酸配列とは異なるアミ ノ酸配列を含有する免疫原性ポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体を形成す る条件下で、テスト試料をインキュベートする工程；および（ｂ）この免疫原性 ポリペプチドを含有する抗原−抗体複合体を検出する工程。
本発明はさらに、ＨＣＶのエピトープに結合しない抗体を実質的には含有してい ない、ＨＣＶのエピトープに結合する抗ＨＣＶ抗体を含有する組成物を提供する ：ここで、（ａ）　ＨＣＶのエピトープは、グループＪｌおよびＪｌから選択さ れる分離株と実質的に相同であるＨＣＶ分離株のアミノ酸配列を含有し、このア ミノ酸配列は、ＨＣＶ分離株ＦＩＣＶＩのアミノ酸配列とは異なる；および（ｂ ）このＪｌあるいはＪｌのアミノ酸配列は、ＨＣ’／１とは免疫学的に交差反応 しない。
本発明のもう１つの実施態様では、下記の（ａ）および（ｂ）の工程を包含する 、テスト試料中のＨＣＶポリペプチドの存在を検出するイムノアッセイを提供す る：　（ａ）ＨＣＶのエピトープに結合する抗ＨＣＶ抗体とともに、抗原−抗体 複合体を形成する条件下でテスト試料をインキュベートする工程：ここで、（ｉ ）このＨＣＶのエピトープは、ＨＣＶ分離株ＪｌあるいはＪｌのアミノ酸配列を 含有する；　（ｉｉ）このｊｌあるいはＪｌのアミノ酸配列はＥｔｃ’／分離株 ＨＣＶＩのアミノ酸配列とは異なる；および（ｉｉｉ）このＪｌあるいはＪｌの アミノ酸配列は免疫学的にＨＣ’／ｌとは交差反応しない：および（ｂ）抗ＨＣ Ｖ抗体を含有する抗原−抗体複合体を検出する工程。
さらに本発明によって、哺乳動物に、ＨＣＶの分離株１１１ＣＶＩのアミノ酸配 列とは異なる、ＨＣｖの分離株Ｊ１あるいはＪｌのアミノ酸配列を含有するポリ ペプチドを投与し、そしてこの哺乳動物が抗ＨＣＶ抗体を産生ずることを包含す る、抗Ｅ［Ｃ１／抗体を生産する方法を提供する。
本発明のもう１つの実施態様では、下記の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）の工程を 包含する、テスト試料中のＨＣＶポリペプチドを検出する方法を提供する＝（ａ ）請求項１に記載のＤＮＡ分子を含有するプローブを提供する工程；（ｂ）テス ト試料中に存在するＨＣＶのポリヌクレオチドではない配列とプローブとのポリ ヌクレオチド２重鎖の実質的な形成がなされない、プローブとその相補体間での ポリヌクレオチドの２重鎖を形成させる条件下で、テスト試料とプローブとを接 触させる工程；および（Ｃ）このプローブを含有するポリヌクレオチドの２重鎖 を検出する工程。
さらに別の本発明の実施態様では、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を 包含する、ＨＣＶアミノ酸配列配列有する組換えポリペプチドを生産する方法を 提供する：　（ａ）ＨＣＶ分離株Ｊ１あるいはＪｌのアミノ酸配列をコードする コード配列に作動可能に結合された宿主細胞の制御配列を含有するＤＮＡ構築物 によって形質転換された宿主細胞を提供する工程。ここで、このＪｌあるいはＪ ｌのアミノ酸配列はＩ（Ｃ’／分離株ＨＣｖ１のアミノ酸配列とは異なる；（ｂ ）このコード配列が組換えポリペプチドに転写および翻訳される条件下で宿主細 胞を増殖させる工程；および（Ｃ）組換えポリペプチドを回収する工程。
本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、当分野の通常の技術を有する 当業者には下記の記載において容易に明白になる。
区画」１口１（疲咀 図１は、　Ｊｌ　Ｃ／Ｅドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異な る箇所とともに示す。
図２は、ＪＩ　Ｅドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所 とともに示す。
図３は、ＪＩ　Ｅ／ＮＳＩドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異 なる箇所とともに示す。
図４は、ＪＩ　ＮＳ３ドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる 箇所とともに示す。
図５は、ＪＩ　ＮＳ５ドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる 箇所とともに示す。
図６は、ＨＣＶＩの同じドメインのヌクレオチド配列とのＪｌ　Ｃ／Ｅのコンセ ンサス配列の相同性を示す。
図７は、ＪＩ　Ｅのコンセンサス配列の、ＨＣＶ　ｌの同じドメインのヌクレオ チド配列との相同性を示す。
図８は、ＪＩ　Ｅ／ＮＳＩのコンセンサス配列の、ＩＣ’／１の同じドメインの ヌクレオチド配列との相同性を示す。
図９は、ＪＩ　ＮＳ３のコンセンサス配列の、ＩＣ’／１の同じドメインのヌク レオチド配列との相同性を示す。
図１０は、ＪＩ　ＮＳ５のコンセンサス配列の、Ｅ［ＣＶｌの同じドメインのヌ クレオチド配列との相同性を示す。
図１１は、ＨＣＶＩゲノムの推定ゲノム構造を示す。
図１２　＋ｔ、ＨＣＶＩのＯＲＦヌクレオチド配列を示す。図では、ヌクレオチ ド番号１は、大きいＯＲＦの推定開始メチオニンの最初のＡである。このヌクレ オチドの上流のヌクレオチドはマイナスの番号が賦されている。
図１３は、ＨＣｖｌの同じドメインのヌクレオチド配列と比べた、ＪＩ　ＮＳＩ のドメイン（Ｊｌ　１５１９）の断片のコード鎖のコンセンサス配列を示す。さ らに、そこにコードされるアミノ酸も示す。
図１４は、ＨＣＶ　ｔの同じドメインのヌクレオチド配列と比べた、Ｊｌのコア からＮＳＩドメインのコンセンサス配列を示す。さらに、そこにフードされるア ミノ酸も示す。
図１５は、実施例■で決定されたＪｌのＮＳＩドメインのコード鎖のコンセンサ ス配列を示す。さらに、ＦＩＣ！／１の同じドメインのヌクレオチド配列および ｏｃｖｔおよびＪ１１重にコードされるアミノ酸を示す。
図１６は、ＪｌのＮ５３−Ｎ５４ドメインの０２００領域のコード鎖のコンセン サス配列を示す。さらに、ＨＣＶＩの同じドメインのヌクレオチド配列を示す。
さらに、配列中にコードされるアミノ酸も示す。
図１７は、実施例Ｖで決定されたＪｌのＮＳＩドメインのコード鎖のコンセンサ ス配列を示す。さらに、ＦＩＣＶＩの同じドメインのヌクレオチド配列を示す。
さらに、配列中にコードされるアミノ酸も示す。
図１８は、Ｊｌの非翻訳ドメインおよびコアドメインのコード鎖のコンセンサス 配列を示す。さらに、ＨＣＶＩの同じドメインのヌクレオチド配列、および配列 中にコードされるアミノ酸も示す。
（以下余白） 良ユ影と１昶ｌすＬ町 本発明の実施においては、特に断わりのない限り、当分野の技術範囲内である、 分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の通常技術を使用する 。このような技術は、文献に詳細に記載されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ 、　ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋの、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩ ＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（１９８２）　：　ＤＮＡ 　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　ＡＮＤ　ＩＩ　（Ｄ、Ｎ　Ｇｌｏｖ ｅｒ編集、１９８５）　；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳ ＩＳ　（Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ、Ｗ集、１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ 　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉ ｇｇｉｎｓ編集、１９８４）　；　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲ ＡＮＳＬＡＴｒＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、■１ｇｇ１ｎｓ 編集、１９８４）　：　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ，１，Ｆ ｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６）　；　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　 ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）；　Ｂ、　Ｐｅ ｒｂａｌの、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥＴｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）　；　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯ ＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）のンリーズ；　ＧＥＮＥ 　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　 （Ｊ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａｌｏｓ編集、１９８７、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。
１ｏｇｙ　Ｖｏｌ、１５４およびＶａｌ、　１５５　（それぞれＷｕおよびＧｒ ｏｓｓｍａｎ編集、Ｗｕ編集〉、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集（１９８７ ）の、ＩＭＭＵＮＯｃＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮ Ｄ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｌｏｎｄｏｎ）、５ｃｏｐｅｓ　（１９８７）の、　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＬＩＲ ＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、　５ ｅｃｏｎｃｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ 、）、および、ＩＩＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭ ＵＮＯＬＯＧＹ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　１−ＩＶ　（Ｄ、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌ１編集、１９８６）、を参照。前出および後出の、本明 細書に記載の全ての特許、特許出願およびその他の出版物を、参考文献として援 用する。
「Ｃ型肝炎ウィルス」は、以前は未知であった非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の病 因物質のために、当分野の研究者が用意しておいた用語である。従って本明細書 で用いる「Ｃ型肝炎ウィルス」（ＨＣＶ）とは、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらが記載した プロトタイプ分離株ＨＣＶＩクラスから、ＮＡ　ＮＢｖおよび／あるいはＢＢ− ＮＡＮＢＶと以前は呼ばれていたＮＡＮＢＨの原因物質を指す。例えば、本明細 書でその開示を参考文献として援用する、欧州特許公報第３１８．２１６号、お よび１９８９年５月１９日付の米国特許出願第３５５，００２号（同じ優先権を 有する米国以外の特許出願が入手できる）、を参照。ＨＣＶＩのヌクレオチド配 列および推定アミノ酸配列は、図６に示した。本明細書では、用語ＨＣＶＳＮＡ ＮＢ■、およびＢＢ−ＮＡＮＢＶは互換変換可能に用いられる。この用語法の延 長として、以前の非Ａ非Ｂ肝炎（、ＮＡＮＢＨ）と呼ばれていた、ＨＣＶによる 疾患をＣ型肝炎と呼ふ。
用語、ＮＡＮＢＨ（非Ａ非Ｂ肝炎）およびＣ型肝炎は、本明細書では互換可能に 使用し得る。本明細書で用いる用１ＮｒＨｃＶＪは、その病原株がＮＡＮＢＨを 引き起こす、ウィルス種、および弱毒化株あるいはそれらに由来する不完全な干 渉粒子、を指す。
ＨＣＶは、Ｆｌａｖｉ様のウィルスである。フラビウイルス粒子の形態および形 成は公知で、Ｂｒ１ｎｔｏｎ（１９８６）の、ＴＨＥ　ＶＩＲＵＳＥＳ：ＴＨＥ 　ＴＯＧＡＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ　（Ｆｒａｅｎ ｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ　ンリーズ編集、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇ ｅｒおよびＳｈｅｌｅｓｉｎｇｅｒ＠編集、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、　ｐ Ｊ２７−３７４に記載されている。形態に関しては、一般にフラビウィルスは、 脂質二重層に包まれた中心ヌクレオカプシドを含んでいる。ピリオンは球状で、 そして約４０−５０　ｎｍの直径を宵している。これらのコアは、約２５−３０ 　ｎｍの直径である。ピリオンエンベロープの外部表面に沿って、直径約２　ｎ ｍのノブを末端に有する、約５−１０　ｎｍの長さの放射状突起物がある。
１（Ｃ’／ゲノムはＲＮＡからなる。ＲＮＡを含んだウィルスは、比較的高い自 然変異度を有することが知られている。即ち、取り込まれるヌクレオチド−個当 たり１０−３から１０−４の確率であると報告されている。従って、ＦＩＣＩ／ のクラスあるいは種の中に、病原性あるいは非病原性の多くの株が存在する。
ＨＣｖ分離株のゲノムは、ＨＣＶＩと大きさが似たポリタンパク質をコードし、 コードされたポリタンパク質がＨＣＶ　１と類似の疎水性および抗原性の特徴を 有腰そして、ＨＣＶＩで保存されているほぼ連続している（ｃｏ−１ｉｎｅａｒ ）ペプチド配列の存在する、約９．０００ヌクレオチドから約１２，０００ヌク レオチドの単一のＯＲＦからなると考えられている。加えて、このゲノムは、＋ （ポジティブ）鎖ＲＮＡであると考えられている。
ＨＣＶ単離株は、ＨＣＶＩゲノム中のエピトープと免疫学的に交差反応するエピ トープを包含する。他の既知のフラビウィルスと比較したときに、これらの内の 少なくともいくつかのエピトープはＨＣＶに特有なものである。エピトープの特 異性は、抗ＨＣＶ抗体との免疫学的反応性、および池のワラビウィルス種に対す る抗体に対する反応性の欠如により決定される。免疫学的反応性を調べる方法は 、例えば、ラジオイムノアッセイによる方法、ＥＬｒＳＡアッセイによる方法、 血球凝集反応による方法が当分野で公知であり、そしてアッセイ用の適切な技法 のいくつかの実施例が、本明細書で提供される。
さらに、ヌクレオチドレベルでのＦＩＣＶ単離株とＨＣＶＩゲノムとの総体的な 相同性は、恐らく約４０％あるいはそれ以上であり、恐らく約６０％あるいはそ れ以上、そして約８０％から約９０％あるいはそれ以上であることがより可能性 が高い、と考えられている。加えて、多くの対応する完全に相同な、少なくとも 約１３ヌクレオチドの連続する配列が存在する。新しい分離株からの配列とＨＣ ｖ１配列との間の対応は、当分野で公知の技術により調べ得る。例えば、新しい 分離株からのポリヌクレオチドの配列情報とＨＣＶＩ配列の直接比較により調べ 得る。あるいは、相同な領域で安定な二重鎖を形成するような条件下でポリヌク レオチドをハイブリダイゼーションしく例えば、Ｓ１消化に先立ち使用されるも の）、次いで一本鎖特異的なヌクレアーゼ（一つあるいは複数）で消化し、次い で消化した断片のサイズ決定により、相同性を調べ得る。
ＨＣＶ株間の、あるいはＨＣＶ単離株間の進化的関係から、ポリペプチドレベル での相同性により、ＨＣＶと推定される株あるいは分離株は同定可能である。従 って、新しいＨＣＶ分離株はポリヌクレオチドレベルで、約４０％より高い相同 性が予期され、恐らくは約７０％より高い相同性であり、約８０％より高い相同 性である可能性が高い。アミノ酸配列の相同性を調べる方法は当分野での公知で ある。例えば、アミノ酸配列を直接配列決定し、そして本明細書で提供される配 列と比較し得る。あるいは、ＨＣＶと予測されるゲノム物質のヌクレオチド配列 を決定し、それにコードされているアミノ酸配列を決定し、そして対応する領域 を比較し得る。
ＨＣＶＩのＯＲＦを図１２に示した。ＨＣＶ　１のポリタンパク質の非構造ドメ イン、コアドメイン、およびエンベロープドメインが予測されている（図５）。
ｒＣＪあるいはコアのポリペプチドは、ＨＣＶＩの５°末端から３４５ヌクレオ チドにコードされていると考えられている。［１ＣＶｌの推測されるｒｌＪある いはエンベロープドメインは、約３４６番目のヌクレオチドから約１０５０番目 のヌクレオチドにコードされていると考えられている。推測されるＮＳＩあるい は非構造ドメインは、約１（１５を番目のヌクレオチドから約９５％相同のヌク レオチドにコードされていると考えられている。残りのドメインに関しては、推 測されるＮＳ２は約９５％相同のヌクレオチドから約３０１８番目のヌクレオチ ドに、推測されるＮＳ３はヌクレオチド約３０１９番目のヌクレオチドから約９ ５％相同のヌクレオチドに、推測されるＮＳ４は約９５％相同のヌクレオチドか ら約６２９７番目のヌクレオチドに、そして推測されるＮＳ５はヌクレオチド６ ２９８から３°末端にコードされていると、各々考えられている。上記の境界は 、ＯＲＦの分析に基づく近似値である。本明細書の開示の観点から当業者は、正 確な境界を同定し得る。
ｒＨｃＶ／ＪＩＪあるいは「Ｊｌ」、および、ｒＨＣＶ／Ｊ７Ｊあルイハ「Ｊｌ 」は、本明細書に開示されたヌクレオチド配列により特徴付られる新しいＨＣＶ の分離株、およびそれと実質的に相同的な；即ち、ヌクレオチドレベルで少なく とも約９０％あるいは約９５％相同の、関連した分離株を指す。本明細書に開示 されている配列は、日本および他のアジアおよび／あるいは環太平洋諸国で大勢 を占めるＨＣＶのサブクラスを特徴付ると考えられている。
別のＪｌおよび３７分離株は、本明細書および欧州特許公報第３１８、２１６号 に開示された観点から得られ得る。特に、本明細書に開示した」１およびＪｌの ヌクレオチド配列、および図１２中の１（ＣＶＩ配列は、ＪｌおよびＪｌあるい は別の分離株の別のドメインをクローニングするためのプライマーあるいはプロ ーブとして使用し得る。
本明細書の指定した配列あるいは材料「からの」ヌクレオチド配列は、指定した 配列あるいは材料、あるいはそれらの一部分の配列に、相同（即ち、同じ）ある いは相補である、ヌクレオチド配列を指す。本明細書で提供されるＪｌの配列は 、最小で約６ヌクレオチド、好ましくは約８ヌクレオチド、さらに好ましくは約 １５ヌクレオチド、そして最も好ましくは２０ヌクレオチドあるいはそれ以上で ある。最大長は、完全なウィルスゲノムである。
本発明の幾つかの局面では、ポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、ＨＣｖ ゲノム、あるいはＪｌおよびＪｌに特有な配列に、相同であるか、あるいは相補 的であることが好ましい。
ある配列がゲノムに特有であるかどうかは、当業者に公知の技術で同定し得る。
例えば、その配列を、Ｇｅｎｅｂａｎｋのようなデータバンク中の配列と比較し 、未感染の宿主中あるいは他の微生物中に存在しているかどうかを確認し得る。
さらにこの配列を、例えばＨＡ’／５ＨＢＶ、およびＦｉＩ）Ｖのような肝炎を 引き起こすことが知られているもの、およびフラビウイルスの他の種を包含する 、他のウィルス物質の既知の配列とも比較し得る。派生した配列が、他の配列と 対応するか、あるいは対応しないかは、適切なストリンジエンシー条件下でハイ ブリダイゼーションすることで、同定し得る。核酸配列の相補性を調べるための ハイブリダイゼーション技術は当分野では公知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉ ｓら（１９８２）のＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲ Ｙ　ＭＡＮＵＡＬ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）をさらに参照。加えて、 ハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖ポリヌクレオチドのミスマツチ は、たとえば、二重鎖ポリヌクレオチドの中の一本鎖部分を特異的に消化するＳ Ｌのようなヌクレアーゼで消化することを含む、公知の技術で同定し得る。典型 的なりＮＡ配列が派生し得る領域には、これらに限定されないが、特異的エピト ープをコードする領域、および非転写領域および／あるいは非翻訳領域がある。
ＪｌあるいはＪｌのポリヌクレオチドは、示したヌクレオチド配列から直接取ら なくても良く、例えば、化学合成、あるい１；！ＤＮＡ複製、あるいは逆転写、 あるいは転写、を含む任意の方法で生成し得る。加えて、指定された配列の領域 に対応する領域の組み合わせは、意図した使用法と矛盾しないように、当分野で 公知の方法で改変し得る。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の標識物を一つあ るいはそれ以上含み得る。
指定したポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの材料「からの」アミノ酸配列 は、指定したポリペプチドの配列、あるいはその一部分の配列に、相同（即ち、 同じ）である、アミノ酸配列を意味する。指定された核酸配列「からの」アミノ 酸配列は、その配列にコードされたポリペプチド、あるいはその一部分と同じア ミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド中の、Ｊｌある いはＪｌのアミノ酸配列は、その長さが、少なくとも約５個のアミノ酸、好まし くは少なくとも約１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５個のアミ ノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸である。
本発明のポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はな い；ポリペプチドは、例えば、化学合成、あるいは組換え発現系による発現、あ るいはウィルスからの単離を含む任意の方法で生成し得る。ポリペプチドは、ア ミノ酸アナログ、あるいは非天然アミノ酸を、一つあるいはそれ以上含み得る。
配列にアミノ酸アナログを挿入する方法は、当分野で公知である。さらにポリペ プチドは、当業者に公知の標識物を一つあるいはそれ以上含み得る。
本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合 成、あるいは合成、の起源のポリヌクレオチドであって、その起源あるいは操作 のために；（１）それが天然で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレ オチドに結合されているもの；あるいは（２）天然には存在しないものを意図し ている。
本明細書で用いる用語「ポリスクレオチド」は、任意の長さのポリマー型のヌク レオチドで、リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを も指す。この用語は、分子の一次構造をのみ指す。従ってこの用語は二本鎖およ び一本鎖のＤＮＡ、およびＲＮＡを指す。さらに、以下に示す既知の種類の改変 されたポリヌクレオチドをも改変されない型のポリヌクレオチドと同様に含む。
改変には、例えば、当分野で公知の標識、メチル化、ｒｃａｐｓＪ、アナログに よる天然ヌクレオチド一つあるいはそれ以上の置換、およびヌクレオチド内の改 変が含まれる。ヌクレオチド内の改変には、例えば、非イオン性の結合による改 変（例えば、メチルリン酸、リン酸トリエステル、フォスフォアミデート、カル バメート、等）、およびイオン結合による改変（例えば、フォスフォロチオエー ト、フォスフォロジチオエート、等）、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレア ーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ−リジン、等を含む）のような ペンダント部分を含んだ改変、インターカレーシコン剤（例えば、アクリジン、 ソラレン、等）による改変、キレート剤（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素 、酸化性金属、等）を含んだ改変、アルキル化剤を含んだ改変、改変された結合 による改変（例えば、αアノメソツク核酸、等）、を含む。
「精製されたポリヌクレオチド」は、他の成分を実質的に含まない、特定のポリ ヌクレオチドを含む組成物を指し、そのような組成物は、典型的には少な（とも 約７０％の特定のポリヌクレオチドを含み、さらに典型的には少なくとも約８０ ％、９０％あるいはさらに９５％から９Ｈの特定のポリヌクレオチドを含む。
「精製されたポリペプチド」は、他の成分を実質的に含まない、特定のポリペプ チドを含む組成物を指し、この組成物は、典型的には少なくとも約７０％の特定 のポリヌクレオチドを含み、さらに典型的には少なくとも約８０％、９０％ある いはさらに９５％から９９％の特定のポリヌクレオチドからなる。
「組換え宿主細胞Ｊ、「宿主細胞Ｊ、「細胞Ｊ、「細胞株Ｊ、「細胞培養物」、 および他のこの様な用語は、単一細胞として培養された、組変えベクターあるい は他の転移ＤＮＡ用の受容細胞として用いられ得るか、あるいは用いられた微生 物あるいは高等真核細胞株を指し、そして形質転換された元の細胞の子孫を包含 する。−個の親細胞の子孫は、自然の変異、偶然の変異、あるいは意図的な変異 等の理由から、形態、あるいは、ゲノム相補性あるいは総ＤＮＡ相補性において 必ずしも完全に親細胞と同じである必要はないことは理解される。
「レプリコン」は、例えば、プラスミド、クロモソーム、ウィルス、フスミド、 等であり、細胞内でポリヌクレオチドの複製を行う自律的単位として働＜；即ち 、自身の制御下で複製する能力がある、任意の遺伝子エレメントである。
「クローニングベクター」は、選択された宿主細胞を形質転換し得るレプリコン であり、そして付加されたセグメントの複製、および／あるいは発現が引き起こ されるように、他のポリヌクレオチドセグメントが付加されている。典型的なり ローニングベクターには、プラスミド、ウィルス（ｆｉｌえば、バクテリオファ ージベクター）、およびコスミドが含まれる。
「組み込み用（ｉｎｔｅｇｒａｔ　ｔｎｇ）ベクター」は、選択された宿主細胞 中でレプリコンとしては働かないが、宿主を安定ニ形質転換するために、選択さ れた宿主中のレプリコン（典型的には、クロモソーム）に駐留物を組み込む（ｉ ｎｔｅｇｒａｔｅ）能力を有するベクターである。
「発現ベクター」は、選択された宿主細胞を形質転換し得る構築物で、選択され た宿主中で異種のコード配列を発現させる。発現ベクターは、クローニングベク ターあるいは組み込み用ベクターの何れでもよい。
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｍＲＩＩＪＡに転 写される、および／あるいはポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列 である。コード配列の境界は、５−末端の翻訳開始コドンおよび３−末端の翻訳 停止フドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、　ｃＤＮＡ、および 組み換えポリヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定はされない。
「制御配列」は、これらがライゲーションされているコード配列を発現させるの に必要なポリヌクレオチドの調節配列を指す。このような制御配列の特徴は、宿 主生物によって異なる。原核細胞では、制御配列は一般にプロモーター、リポソ ーム結合部位、および転写終結信号を含む。真核細胞では一般的に、制御配列は プロモーター、転写終結信号、および時としてエンハンサ−を含む。用語「制御 配列」は、発現のためにその存在が必要な全ての構成要素を少な（とも含んでい ることを意図し、そして、別の有用な構成要素も含み得る。
「作動可能に結合された」は、上述の構成要素が意図された様式で機能し得るよ うな関係の、近傍にあることを指す。
コード配列と「作動可能に結合された」制御配列は、制御配列と適合した条件下 でコード配列の発現がなされるような様式でつながれている。
「オープンリーディングフレーム」あるいはＯＲＦは、ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドの領域である；この領域は、コード配列の一部分、あるいは コード配列の全体であり得る。
［免疫学的に交差反応性である」は、同じ抗体が結合する、二つあるいはそれ以 上のエピトープ、あるはポリペプチドを指す。交差反応性は、競合アッセイのよ うな多くのイム７アノセイ法の何れかにより同定され得る。
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、ポリペプチド、あるいは、少な くとも一つのエピトープを含むポリペプチドの群を指す。「抗原結合部位」は、 （単数あるいは複数の）抗体分子の可変領域の折り畳みで形成されて、抗原のエ ピトープの特性に相補的な内部表面形および荷電分布を有する三次元的な結合部 位を形成し、これが特異的な結合を可能にして、抗原抗体複合体を形成する。抗 原結合部位は、ヘビーおよび／あるいはライトチェーンドメイン（各々、ＹＨお よびＭＬ）から形成され得、次いで抗原結合に寄与するハイパーバリアプルルー プを形成する。用語「抗体」は、キメラ抗体、改変抗体、−価抗体、Ｆａｂタン パク質、および単一ドメイン抗体を包含するが、これらに制限はされない。多く の場合、抗体の抗原に対する結合現象は、他のリガンド／抗リガンド結合と同等 である。
本明細書で使用されるように、用語「単一ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、ＦＩＬ ドメインを含む抗体で、指定された抗原と特異的に結合する。ｄＡｂは、’／Ｌ ドメインを含まないが、抗体に存在することが知られている他の抗原結合ドメイ ン、例えばにおよびλドメインを含み得る。ｄＡｂを調製する方法は当分野で公 知である。例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４（１９８９）を 参照。
抗体はまた、’／ＨおよびＭＬドメイン、および他の既知の抗原結合ドメインか らなり得る。これらのタイプの抗体の例、およびこれらの調製方法は当分野で公 知であり（例えば、本明細書では参考文献として援用する、米国特許第４．８１ ６．４６７号を参照）、そして以下のものが含まれる。例えば、「を推動物抗体 」は、テトラマーあるいはその凝集体である、抗体を指し、通常はｒＹＪ型の形 態に凝集している、チェーン間に共有結合を有しても有さなくともよい、ライト チェーンおよびヘビーチェーンを含む。を推動物抗体では、チェーンのアミノ酸 配列は、を推動物中で産生された抗体に見いだされる配列と、ｉｎ　５ｉｔｕあ るいはｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（例えば、ハイブリドーマ中で）に関わらず、相同で ある。を推動物抗体は、例えば、精製されたポリクローナル抗体およびモノクロ ーナル抗体を含み、これらの調製方法は以下に記載されている。
「ハイブリ、ド抗体ヨは、各チェーンが各々、哺乳動物抗体ノ別々のチェーンに 対して相同であり、このテトラマーあるいは凝集体により２つの異なる抗原が沈 降するように、これらを新たな集合物にしたものである。ハイブリ、ド抗体では 、一対のライトチェーンおよびヘビーチェーンが、第一の抗原に対して作成され た抗体に見いだされるそれと相同であり、一方、第二の対のチェーンが、第二の 抗原に対して作成された抗体に見いだされるそれと相同である。この結果、「二 価」の特性がもたらされる、即ち、二つの抗原に同時に結合することができる。
このようなハイブリッドは、以下に示すように、キメラチェーンを用いても形成 し得る。
「キメラ抗体」は、ヘビーチェーンおよび／あるいはライトチェーンが融合タン パク質である抗体を指す。典型的には、チェーンのアミノ酸配列の一部分は、特 定の種あるいは特定のクラスから由来する抗体の対応する配列に相同で、一方、 チェーンの残すのセグメントは、他の種および／クラスから由来する配列に相同 である。通常、ライトチェーンおよびヘビーチェーンの両方の可変領域は、一種 類のを推動物から由来する可変領域あるいは抗体によく似ており、一方、定常部 分は、他の種のを推動物から由来した抗体の配列に相同である。しかしながら、 この用語の定義は、この特定の例に限定されない。材料が異なるクラスあるいは 異なる種に出来するかどうかにかかわらず、また融点が可変／定常境界にあるか どうかにかかわらず、・＼ビーチェーンあるいはライトチェーンのいずれかある いは両方が、異なる抗体の配列に似た配列の組み合わせで構成される、任意の抗 体も含まれる。従って、定常あるいは可変領域のいずれも既知の抗体配列に似て いない抗体を産生ずることも可能である。従って例えば、可変領域が特定の抗原 に対して高い特異的親和性を有する抗体、あるいは、定常領域が増大した補体結 合作用を示す抗体を構築すること、あるいは、特定の定常領域が有する特性に別 の改善を加えることが可能である。
他の例は「改変抗体」である。これは、を推動物の抗体中の天然のアミノ酸配列 が変化した抗体を指す。組み換えＤＮＡ法を用いて、所望の特性が得られるよう に抗体を再設計し得る。
可能なバリエーションは多く、一つあるいはそれ以上のアミノ酸の変化から、例 えば定常領域のような、領域の完全な再設計までを含む。定常領域の変化は一般 に、例えば、補体結合、細胞膜との相互作用、および他のエフェクター機能、の 変化のような所望の細胞性プロセスの特性を得るために行われる。可変領域の変 化は、抗原結合特性を変化させるために行い得る。抗体はまた、特定の細胞ある いは組織の部位への、分子あるいは物質の特異的送達を補助するように加工し得 る。
所望の改変は、例えば、組み換え技術、部位特異的変異誘発、等の分子生物学の 公知の技術により行い得る。
さらに別の例は、「−価抗体」である。これは、第二のヘビーチェーンのＦｃ（ 即ち、幹）領域に結合した、ヘビーチェーン／ライトチェーンダイマーからなる 、凝集体である。このタイプの抗体は、抗原変質を免れている。例えば、Ｇｌｅ ｎｎｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ　２９５ニア１２　（１９８２）、を参照。抗体の定 義に含まれるものにはさらに、抗体のｒＦａｂＪ断片がある。ｒＦａｂＪ領域は 、ヘビーチェーンおよびライトチェーンの分枝部分を含む配列と、概ね同じか、 あるいは類似のヘビーチェーンおよびライトチェーンの同部分を指し、そして、 特定の抗原に対し免疫学的結合性を示すが、エフェクターであるＦｃ部分を欠い ている。ｒＦａｂＪは、一つのヘビーチェーンおよび一つのライトチェーンの凝 集体（通常、Ｆａｂ’として知られている）、および２Ｈおよび２Ｌのチェーン を含んだテトラマー（Ｆ（ａｂ）２と呼ぶ）を含み、指定した抗原あるいは抗原 ファミリーと選択的に反応し得る。Ｆａｂ抗体は、上述の抗体と同じようにサブ セ、７トに、即ち、「を推動物ＦａｂＪ、［ハイブリッドＦａｂＪ、「キメラＦ ａｂ」、および「改変Ｆａｂｊ、に分類し得る。抗体のＦａｂ断片を製造する方 法は、当分野で公知であり、例えば、タンパク質分解、および組み換え技術によ る合成が含まれる。
「エピトープ」は、抗体結合部位を指し、通常はポリペプチドにより定義される が、非アミノ酸のハブテンでも有り得る。エピトープは、エピトープに特有な空 間配置の３個のアミノ酸からなり得、一般にはエピトープは少なくとも５個のこ のようなアミノ酸からなり、そしてさらに通常は、少なくとも８−１０個のこの ようなアミノ酸からなる。
「抗原抗体複合体」は、抗原上のニブトープに特異的に結合した抗体により形成 された複合体を指す。
「免疫原性ポリペプチド」は、単独で、あるいはキャリアーと結合して、アジュ バントと共に、あるいはアジュバントなしで、哺乳類動物中に細胞性および／あ るいは液性の免疫応答を引き起こすポリペプチドを指す。
「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、分子の長さを特定しない。従 って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に 含まれる。この用語はまた、例えば、グリコジル化、アセチル化、リン酸化、等 のポリペプチドの発現後の修飾を特定も除外もしない。定義に含まれるのは、例 えば、一つあるいはそれ以上のアミノ酸のアナログを含んだポリペプチド（例え ば、非天然のアミノ酸、等を含む）、結合の変化したポリペプチド、および、天 然および非天然の両方の、他の当分野で公知の改変である。
本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、宿主細胞に外来のポリヌク レオチドを挿入することを指し、挿入に用いた方法には無関係であり、例えば、 直接の取り込み、トランスタクンヨン、ｒ　−接合、あるいはエレクトロボーレ ー／ヨンである。外来のポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドのように、組 み込まれないベクターとして保持され得、あるいは宿主ゲノムに組み込まれ得る 。
「形質転換された」宿主細胞は、形質転換された当の細胞、および元々は外来で あったポリヌクレオチドを保持しているその子孫の両方を指す。
本明細書の用語「処置」は、予防および／あるいは治療を指す。
「個体」は、を推動物、特に哺乳類種のものを指し、そして、家畜、競技用動物 、およびヒトを含む霊長類を含むがこれらに限定されない。
「センス鎖」は、それからのｍＲＮＡ転写体に相同な二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を 指す。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的な配列を含む。
「抗体含有体成分」は、目的の抗体の原料である、個体の体の構成物を指す。抗 体含有体成分は当分野で公知であり、全血およびその構成成分、血漿、血清、を 髄液、リンパ液、呼吸器道、消化姦通、および尿生殖器道の外部切片、涙、唾液 、乳汁、白血球、およびミエローマ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
［精製されたＨＣＶｊ分離株は、ウィルスが通常付随している細胞構成物から、 および感染した組織中に存在し得る他のタイプのウィルスから、単離されたＨＣ Ｖ粒子の調製物を指す。ウィルスを単離する技術は当業者に公知であり、例えば 、遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
ＨＣＶ　ｒ粒子」は、全ピリオン、およびピリオン形成の中間体の粒子である。
ＨＣＶ粒子は、一般に、ＨＣＶ核酸に付随する一つあるいはそれ以上の１（ＣＶ タンパク質を有する。
「プローブ」は、プローブの少なくとも一つの領域と標的の領域との相補性によ り、標的ポリヌクレオチド中の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオ チドを指す。
「生物学的試料」は、個体から単離された組織あるいは液体の試料を指し、例え ば、全血およびその構成酸部、血漿、皿清、を髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器道 、消化姦通、および尿生殖器道の外部切片、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、 器官、およびｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中で生育 した細胞から得られる馴化培地、ウィルス感染細胞と推測される細胞、組み換え 細胞、および細胞構成物を含むが、これらに限定されない）もまた含まれるが、 これらに限定されない。
本発明は、ＨＣＶの新たに発見された分離株、ＪｌおよびＪｌ、これらのヌクレ オチド配列、タンパク配列、および得られるポリヌクレオチド、ポリペプチド、 およびこれらに由来する抗体の単離および特徴付に関する。分離株ｊ１およびＪ ｌは、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が新規であり、そしてこれらの配列 は、日本および他のアジア諸国からのＨＣｖ単離株に特徴的であると考えられて いる。
）ＩＣＶ／ＪｌおよびＨＣＶ／Ｊ　７に由来するヌクレオチド配列は、試料中の ウィルスの存在を診断するための、および、このウィルスの天然変異株を単離す るためのプローブとして有用である。
さらにこれらのヌクレオチド配列は、ＪｌおよびＪｌのゲノムの中にコードされ たＨＣｖ抗原のポリペプチド配列を得ることも可能とし、そして、標準物質とし て、あるいは、診断テストおよび／あるいはワクチンの成分として、有用なポリ ペプチドの製造を可能とする。さらにこれらのポリペプチド配列に含まれるＨＣ Ｖのエピトープに対するポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体は、 診断テスト用に、治療剤として、抗ウィルス剤のスクリーニング用に、およびＮ ＡＮＢＨウィルスの単離用に、有用である。加えて、本明細書に開示された配列 に由来するプローブを用いると、ＪｌおよびＪｌのゲノムの他の部分の単離およ び配列決定が可能となり、従って、ＮＡＮＢＨの、予防的および治療的の両方の 、診断および／あるいは処置に有用な、別のプローブおよびポリペプチドが得ら れる。
ＨＣＶ／Ｊ　１およびＨＣＶ／Ｊ７のヌクレオチド配列が得られると、ＨＣｖ感 染によるＮＡＮＢＨの診断に有用な、そして、供血者および供与された血液およ び白液製剤の感染をスクリーニングするのに有用な、ポリヌクレオチドプローブ およびポリペプチドの構築が可能となる。例えばこの配列から８−１０個のヌク レオチドあるいはもっと長いＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。こ れは例えば、ウィルスを有すると予測される患者の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡの存 在を検出するための、あるいは、ウィルスの存在に関して供与された血液をスク リーニングするためのハイブリダイゼーシコンブローブとして有用である。この ＨＣＩ／／ＪｌおよびＦＩＣＶ／Ｊ７配列はまた、ＮＡＮＢＨの期間に生成され た抗体の存在を診断する試薬として有用な、ＨＣＹ特異的ポリペプチドの設計お よび製造を可能とする。ＨＣＶ／ＪｌおよびＨＣＶ／Ｊ７の配列に由来する精製 されたポリペプチドに対する抗体はまた、感染した個体および血液中のウィルス 抗原を検出するために使用し得る。
これらＨＣＶ／ＪｌおよびＨＣＶ／Ｊ７の配列に関する知識はさらに、ＨＣＶに 対するワクチンとして使用し得、また抗体の産生にも使用し得るポリペプチドの 設計および製造を可能とする。そして、それは病気に対する防御としておよび／ あるいは■Ｃｖ感染した個体の治療に使用し得る。さらに、開示された［ＩＣ’ ／／Ｊ　１およびＨＣＶ／Ｊ７の配列は、ＨＣＶゲノムのさらなる特徴付けを可 能とする。これらの配列およびＨＣＶゲノムに由来するポリヌクレオチドプロー ブは、別のウィルスｃＤＮＡ配列をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングす るために使用し得、次いでこれを別の重複配列を得るために使用し得る。例えば 、欧州特許公開第３１８．２１６号を参照。
ＨＣＶ／Ｊ　ｌおよびＨＣＶ／Ｊ７のポリヌクレオチド配列、それらに由来する ポリペプチド、およびこれらのポリペプチドに対する抗体は、（単数あるいは複 数の）　ＢＢ−ＮＡＮＦ３Ｖ物質の単離および同定に有用である。例えば、ＨＣ Ｖ／Ｊｌ配列に由来するポリペプチドに含まれるＨＣ’／のエピトープに対する 抗体は、アフィニティークロマトグラフィーに基づくウィルスの単離法で使用し 得る。あるいは、この抗体を、他の方法によって単離されたウィルス粒子の同定 に使用し得る。次に、単離されたウィルス粒子内のウィルス抗原およびゲノム物 質は、さらに特徴付けられ得る。
）１ｃＶ／Ｊ　１およびＨＣＩ／／Ｊ７のゲノムのさらなる配列決定から、およ び、ＨＣＶ／ＪｌおよびＨＣｖ／Ｊ７の抗原のさらなる特徴付けおよびゲノムの 特徴付けから得られる情報により、別のプローブ、およびポリペプチド、および 抗体の設計および合成が可能となる。この抗体は、ＨＣＶにより引き起こされる ＮＡＮＢＨの予防および治療のための診断、および、感染血液および血液関連製 剤のスクリーニングのために使用し得る。
ＨＣＶ／Ｊ　１およびＨＣＶ／Ｊ　７のｃＤＮＡ配列が得られると、いずれかの 鎖にコードされたポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクター の構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域は、コートあるいはエンベロ ープ抗原、あるいはコア抗原、あるいは、例えばポリヌクレオチド結合タンパク 質、（単数あるいは複数の）ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およびウィルス粒 子の復製および／あるいは組立に必要とされる他のウィルスタンパク質を含む、 非構造タンパク質の抗原に由来し得る。所望のポリペプチドをコードする断片は 、通常の制限酵素消化あるいは合成的方法を用いてｃＤＮＡクローンから誘導し 、そして、例えばβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジムスター ゼ（ＳＯＤ）のような融合配列の部分を含み得る、ベクターにつなぎ入れる。Ｓ ＯＤの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、欧州 特許公開第１９５，０５６号に記載されている。ＳＯＤおよびＨＣＶポリペプチ ドの融合ポリペプチドをコードするベクターは、欧州特許公開第３１８．２１６ 才号に記載されている。いずれかのセンス鎖の、オーブンリーディングフレーム を含んだＨＣＶ　ｃＤＮＡのいかなる所望の部分でも、成熟タンパク質あるいは 融合タンパク質のような組み換えポリペプチドとして得ることができる。あるい は、ｃＤＮＡ中にコードされたポリペプチドは、化学合成により提供し得る。
融合あるいは成熟の形態を問わず、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、 任意の都合のよい宿主に適した発現ベクターにつなぎ入れ得る。組み換えポリペ プチドの形成には、現在、真核細胞および原核細胞宿主系の両方が使用されてお り、そしてより一般的な制御システムおよび宿主細胞のいくつかに関する要約を 以下に記した。このような宿主細胞中で産生されたポリペプチドは、次に溶解さ れた細胞から、あるいは培養液から単離され、そして目的の使用法が必要とする 状態まで精製される。精製は、例えば分別抽出、塩分面、イオン交換樹脂でのク ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離等の分野で公 知の方法で行い得る。タンパク質の精製のための種々の方法に関しては、例えば 、■ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　を参照。
このような組み換えあるいは合成のＨＣｖポリペプチドは、診断試薬として、あ るいはワクチン中に処方し得る中和抗体を生成させる物質として、使用し得る。
これらのポリペプチドに対する抗体はまた、診断試薬、あるいは受動免疫療法剤 として使用し得る。加えて、これらのポリペプチドに対する抗体は、ＨＣＶ粒子 の単離および同定に有用である。
ＨＣＶ抗原はまた、ＨＣＶのピリオンから単離し得る。ピリオンは、組織培養中 のＨＣ’／感染細胞中、あるいは感染した宿主中で生育し得る。
本発明のポリペプチドは、実質的に完全なウィルス領域を含むが、多くの適用で 必要とされるのはウィルスの抗原領域あるいは免疫原性領域を含むポリペプチド である。ポリペプチドの抗原的な領域は一般に相対的に小さく、典型的には、長 さが８−１０個のアミノ酸、あるいはそれ以下である。僅か５個のアミノ酸の断 片でも、抗原的領域を特徴付は得る。
コノヨウナ断片は、ＨＣＶ／ＪｌあるいはＨＣＩ／／Ｊ７（ＨＣＶ／Ｊ＆＞　（ Ｄ　ｘビトーブ領域に対応し得る。従ってＨＣＶ／Ｊｌおよび１（Ｃ１／／Ｊ７ のｃＤＮＡを元として使用して、ＨＣＶ／ＪｌおよびＨＣ’／／Ｊ７ボリベブチ ドの短い断片をコードするＤＮＡを、融合タンパク質、あるいは分離したポリペ プチドとして、組み換え技術で発現させ得る。加えて、短いアミノ酸配列は、化 学合成により簡便に得られ得る。
合成されたポリペプチドが、正しいエピトープを提供するへく正しく配置されて はいるが免疫原としては小さ過ぎる場合には、このポリペプチドを適切なキャリ アーと結合し得る。
このような結合を得るための多くの方法は当分野で公知であり、Ｐｉｅｒｃｅ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１ｌｌｉｎｏｉｓ、から市販されている、 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ビリジルーチオ）プロピオネート（５ＰＤＰ ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）／クロヘキサンー１ −カルボキシレート（ＳＭＣＣ＞を用いたジスルフィド結合の形成が含まれる（ ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システィン前記の付加によりスルフヒ ドリル基が提供される。）これらの試薬は、自身と一つのタンパク質上のペプチ ドシスティン残基との間にジスルフィド結合を生成し、そして、リジンのε−ア ミン基、あるいは他方のタンパク質の他のフリーのアミン基を介して、アミド結 合を生成する。種々のこのようなジスルフィド結合結合でなくチオエーテルを形 成する。これらのチオエーテル形成試薬の多くは市販されており、そして、６− マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミ ド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等の反応性エステルが含まれる。
カルボキシル基は、スクシンイミド、あるいは１−ヒドロキシルー２−ニトロ− ４−スルフオン酸ナトリウム塩と組み合わせることにより活性化し得る。抗原を 結合する他の方法は、欧州特許公開第２５９．１４９号（本明細書で参考文献と して援用する）に記載されたロタウィルス／「結合ペプチド」システムを採用し ている。以上のリストは完全なものではなく、名を挙げた化合物を改変したもの も使用し得るのは明白であそれ自身は宿主に有害な抗体の産生を誘起しな−１、 任意のキャリアーが使用し得る。典型的な適切なキャリアーは大きく、ゆっくり 代謝される巨大分子である。その例には、タンパク質；ラテックスに加工された セファロース、アガロースセルロース、セルロースビーズ等のような多糖類；ポ リグルタミン酸、ポリリジン等のような、ポリマー性のアミノ酸；アミノ酸コポ リマー；および不活性なウィルス粒子がある。
特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンビ、トヘモシア ニン、イムノグロブリン分子、サイログロブリン、オバアルブミン、破傷風トキ ソイド、および当業者に良く知られた他のタンパク質である。
完全長のウィルスタン、（り質に加えて、少なくとも一つのウィルスエピトープ をコードする、先端切断したＨＣＶアミノ酸配列配列むポリペプチドも、免疫学 的試薬として有用である。
例えば、このような先端切断した配列を含むポリペプチドＣよ、イムノアツセイ の試薬として使用し得る。これらのポリペプチドはまた、抗血清の製造あるいは ワクチン用の組成物中の、抗原サブユニ、トの候補でもある。これらの先端切断 した配列は、天然のウィルスタンノくり質に種々の公知の処理を行うことで製造 し得るが、一般に、）ＩＣ’／配列を含む、合成ある０）マ組み換えポリペプチ ドを作成するのが好ましい。これらの先端切断したＨＣＶ配列を含むポリペプチ ドは、ＨＣＶ配列力）らのみ（隣接したあるいは隣接しない、一つのある（Ｘは それ以上のエピトープ）作成し得、あるいはＨＣＶ配列および異種の配列を融合 タンパク質の形で作成し得る。有用な異種配列には、組み換え宿主からの分泌を 促す配列、（単数あるいは複数の）１（ＣＶエピトープの免疫学的反応性を増強 する配列、あるいはポリペプチドがイムノアッセイ支持体あるいはワクチンキャ リアーヘカップリングするのを促進する配列が含まれる。例えば、欧州特許公聞 策１１６．２０１号；米国特許第４．７２２．８４０号；欧州特許公開第２５９ ．１４９号：米国特許第４．６２９．７８３号（本明細書では開示内容を参考文 献として援用する）を参照。
（以下余白） 先端切断されたＨＣＶを含むポリペプチドの大きさは広＜変化し得、最小の大き さはＨＣＶエピトープを提供するのに充分な大きさの配列であるが最大の大きさ は特に重要ではない。幾つかの例では、最大の大きさは一般に、所望するＨＣＶ のエピトープ、および、もし存在するならば、異種の配列の（単数あるいは複数 の）機能を提供するために必要とされるよりも実質的に太き（はない。典型的に は、先端切断されたＨＣＶアミノ酸配列配列約５個から１００個のアミノ酸の範 囲の長さである。しかし、さらに典型的には、ＨＣＶ配列は最大約５０個のアミ ノ酸の長さで、好適には最大約３０個のアミノ酸である。一般に、少なくとも約 １０．１２あるいは１５個のアミノ酸、最大約２０個あるいは２５個のアミノ酸 までのＨＣＶ配列を選択するのが望ましい。
エピトープを含む先端切断したＨＣＶアミノ酸配列配列多くの方法で同定し得る 。例えば、全長のウィルスタンパク質配列は、全体で全長のタンパク質配列を包 含する一連の短いペプチドを調製することによりスクリーニングし得る。例えば 、１０Ｏ−ＩＩｌｅｒのポリペプチドから始めて、目的の反応性を示す（単数あ るいは複数の）エピトープの存在に関して各ポリペプチドをテストし、そして次 に、確認された１００−ｍａｒがらより小さい、重複する断片をテストして目的 のエピトープの位置を決めることはルーチンである。イムノアッセイでこのよう なペプチドをスクリーニングすることは、当分野の技術範囲内である。
タンパク質配列のコンピューター分析を行って、潜在的なエピトープを同定し、 そして次に同定された領域を含むオリゴヌクレオチドをスクリーニングのために 調製することも公知である。抗原性に関するこのようなコンピューター分析が実 際に存在するエピトープを常に同定するわけではなく、タンパク質のある領域を エピトープを含んだ領域として誤って同定することもあり得ることは、当業者も 認めている。
ＨＣＶの推定されるポリタンパク質とフラビウイルスとの関係の観察によって、 ｌ（ＣＭの「非構］　（ＮＳ）タンパク質の推定ドメインの予測が可能となった 。推定されるフラビウイルスの前駆体ポリタンパク質中のＮＳタンパク質の個々 の位置は、かなり良（知られている。さらに、これらはまた、ポリタンパク質の 観察された疎水性プロフィールの総体的変動とも一致する。フラビウイルスのＮ Ｓ５は、ピリオンのポリメラーゼをコードし、そしてＮＳＩは、動物に対して有 効なワクチンであることが示された補体結合抗原に相当することが確認された。
最近、フラビウイルスのプロテアーゼ機能は、ＮＳ３中に在ることが示された。
ＨＣ’／とフラビウイルスとの観察された類似性のため、ＨＣＶ＝ｔ！リタンバ ク質中の対応するタンパク質ドメインおよび機能の概ねの位置に関する推論が可 能である。図１１は、ＨＣＶポリタンパク質の推定ドメインの概要を示している 。例えば、細菌、酵母、昆虫、およびを推動物細胞を含む種々の組換え宿主細胞 中でのこれらのドメインを含んだポリペプチドの発現は、診断、検出、およびワ クチンに使用し得る重要な免疫学的試薬を提供する。
本明細書に記載されたＨＣＶ分離株およびワラビウィルスの推定されたポリタン パク質の非構造タンパク質領域は、全般的に類似であるように見えるが、Ｎ−末 端に向かう推定構造領域の間では類似性が低い。この領域では、配列の相違が大 きく、そして加えて、二つの領域の疎水性プロフィールはさらに類似性が低い。
この「相違」は、ＩＩｃＶ中の推定ＮＳＩドメインのＮ−末端領域に始まり、推 定Ｎ−末端まで延びている。しかしながら、推定されるヌクレオカプシド（Ｎ− 末端塩基性ドメイン）およびＥ（一般的に疎水性）ドメインのｌ（Ｃ’／ポリタ ンパク質中でのおおまかな位置を予測することは、可能である。これらの予測か ら、有用な免疫学的試薬に対応し得るＨＣＶポリタンパク質の大まかな領域を同 定することは可能で有り得る。例えば、フラビウイルスのＥおよびＮＳＩタンパ ク質は、防御的ワクチンとして有効性を有する口とが知られている。このような 領域、および、例えば推定ＮＳ３、Ｃ１およびＮＳ５等の中のＨＣＶＩで抗原性 であることを示された幾つかの領域もまた、診断試薬を提供するに違いない。
）ＩＣ’／配列の免疫原性はまた、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原あるいはロタウィ ルスＶＰ６抗原のような粒子形成タンパク質と、融合あるいは組み合わされた配 列を調製することで増強され得る。１（ＣＶエピトープが粒子形成タンパク質を コードする配列に直接結合された構築物は、ＨＣＶエピトープに関して抗原性で あるハイブリッドを産生ずる。加えて、調製されたベクターの全ては）ＩＢＶに 特異的なエピトープを含み、例えば、プレー３ペプチドのような様々な程度の免 疫原性を有する。従って、ＨＣＶ配列を含む粒子形成タンパク質から構築された 粒子は、ＨＣＶおよび粒子形成タンパク質に関して、免疫原性である。例えば、 米国特許第４．７２２．８４０号；欧州特許公開第１７５．２６１号；欧州特許 公開第２５９．１４．９号；　Ｍｉｃｈｅ［Ｉｅら　（１９８４）　Ｉｎｔ、　 Ｓｙｍｐｏｓｉｕａ＋　ｏｎＶｉｒａｌ　ｔ（ｅｐａｔｉｔｆｓ；を参照。
ＨＣＶ／Ｊ　１あるいはＨＣＶ／Ｊ７に由来する一つあるいはそれ以上の免疫原 性ポリペプチドから、ワクチンが調製し得る。ＨＣＶとワラビウイルスとの間の 観察された相同性は、ワクチンとして最も効果的と思われるポリペプチド、およ び、これらがコードされているゲノムの領域に関する情報を提供する。ワラビウ イルスノゲノムノ一般的構造は、Ｔ）ＩＥ　ｖｌＲＵＳＥＳ：　ＴＨＥ　ＴＯＧ ＡＶ＋１？ＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＦＬＡｖＩＶ［ＲＩＩ）ＡＨ（シリーズｇ渠Ｆｒ ａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ、巻編集Ｓｃｈ　Ｉｅｓ　ｉｎ ｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）中でＲ４ ｃｅら　（１９８６）により、論議されている。フラビウイルスゲノムＩ？ＮＡ は、唯一のウィルス特異的ｍＲＮＡ種であると考えられており、これは３つの、 即ちＣＳＭおよびＥのウィルス構造タンパク質、および２つの大きな非構造タン パク質ＮＶ４およびＮＶ５、および、より小さい非構造タンパク質の複合セット に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープは、Ｅ（エンベロープ） タンパク質に存在することが知られている。ＴＨＥ　ＶＩＲＵＳＥＳ：　ＴＨＥ 　ＴＯＧＡＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ（シ！Ｊ　−ス 編果Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａＬおよびＷａｇｎｅｒｓ巻編集Ｓｃｈｌｅｓ ｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌｅｎｕｗ　Ｐｒｅｓｓ）中の Ｒｏｅｈｒｉｇ　（１９８６）。対応するＨＣＶのＥ遺伝子およびポリペプチド をコードする領域は、フラビウイルスに対する相同性に基づき予測し得る。従っ てワクチンは、１（ＣＶのＥのエピトープを含む組換えポリペプチドを含み得る 。これらのポリペプチドは、細菌、酵母、あるいは哺乳類細胞中で発現され得、 あるいは、ウィルス調製物から単離され得る。他の構造タンパク質もまた、防御 用の抗Ｆ［ＣＶ抗体を誘起するエピトープを含み得ることもまた予測される。従 って、単独で、あるいは組合せでＥＳＣ，およびＭのエピトープを含むポリペプ チドもまた、ｌ（Ｃ’／ワクチンに使用し得る。
上記に加えて、Ｎ５Ｉ（非構造タンパク質１）での免疫は、黄熱病に対する防御 をもたらすことが示された。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６）　Ｊ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　６０：１１５３゜この免疫は中和抗体の産生を引き起こさないが、 これは事実である。従って、特にこのタンパク質がワラビウイルス間で高度に保 持されていることから、ＨＣＶのＮＳＩもまたＨｃｖｇ染に対する防御となり得 ると考えられる。
さらにこのことは、非構造タンパク質が、中和抗体の産生は引き起こさないにも 拘らず、ウィルス病原性に対する防御を与え得ることも示す。
上記のし点から、ＨＣ’／に対する多価のワクチンは、一つあるいはそれ以上の 構造タンパク質からの一つあるいはそれ以上のエピトープ、および／あるいは一 つあるいはそれ以上の非構造タンパク質からの一つあるいはそれ以上のエピトー プヲ含み得る。これらのワクチンは、例えば、組換えＨＣＶポリペプチドおよび ／あるいはピリオンから単離されたポリペプチドを含み得る。特に、一つあるい はそれ以上の以下のＨＣ■タンパク質二Ｅ、　ＮＳＩ、Ｃ，ＮＳ２、ＮＳ３、Ｎ Ｓ４、およびＮＳ５、あるいは、それらに由来するサブユニット抗原を含むワク チンが期待されている。特に好適なのは、Ｅおよび／あるいはＮＳＩ、あるいは そのサブユニットを含むワクチンである。加えて、不活性化したＥＣＶをワクチ ンに使用することも可能であり得る；不活性化は、ウィルス溶解液の調製により 、あるいはフラビウイルスの不活性化を引き起こす、当分野で公知の手段、例え ば、有機溶媒あるいは界面活性剤による処理、あるいはホルマリン処理によって 行い得る。さらにまた、ワクチンは、弱毒化されたＥＣＶ株から、あるいは当分 野で公知の［Ｂｒｏｖｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：　５４９−５５０　＜１９ ８６）］、バクシニアベクターのようなハイブリッドウィルスから、調製し得る 。
有効成分として（単数あるいは複数の）免疫原性ポリペプチドを含んだワクチン の調製物は、当業者に公知である。このようなワクチンは典型的には、液体溶液 あるいは懸濁液のいずれかとして注射可能に調製される；また注射に先立ち溶液 中で、溶液として、あるいは懸濁液として調製するのに適した固体の形態でも調 製し得る。この調製物は乳化し得、あるいはリポソーム中にタンパク質をカプセ ル化し得る。免疫原性の有効成分はしばしば、薬学的に許容可能で有効成分と適 合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキス トロース、グリセリン、エタノール等、およびそれらの組合せである。加えて、 所望するならばワクチンは、湿潤剤あるいは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／ある いはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含み得 る。有効で有り得るアジュバントの例には、以下のものが含まれるが、これらに 制限はされない：水酸化アルミニウム、Ｎ〜ルアセチルムラミル−し−スレオニ ル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラニル −Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミ７（ＣＧＰ　１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと 呼ぶ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーし一ア ラニンー２−（１゛−２“−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロール−３−ヒドロ キシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ　１９８３５Ａ、　ＭＴＰ−Ｐ Ｅと呼ぶ）、および細菌から抽出したモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミ コレートおよび細胞壁骨格の３つの成分＜ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のス クアレン／Ｔｖｅｅｎ　８０乳化液中に含むＲＩＢｌ、アジュバントの有、幼性 は、このポリペプチドを含み、さらに種々のアジュバントを含むワクチンの投与 により得られる、ＨＣＶの抗原性配列を含んだ免疫原性ポリペプチドに対する抗 体の量を測定することで決定し得る。
このワクチンは、注射により、通常は皮下あるいは筋肉内のいづれかに非経口的 に従来のように投与される。別の様式の投与に適した別の処方には、廃剤および 、ときとして経口処方が含まれる。廃剤には、例えば、ポリアルキレングリコー ルあるいはトリグリセライドのような伝統的な結合剤およびキャリアーが含まれ 得る；このような廃剤は、有効成分を０．５％から１０％、好ましくは１％−２ ％の範囲で含んだ混合物から形成される。経口処方には、例えば薬剤等級の、マ ンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、す、カリンナトリ ウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等のような通常使用される賦形剤が含ま れる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方あ るいは粉末の形態を取り、そして１０％−９５％の、好ましくは２５％−７０％ の有効成分を含む。
タンパク質は、中性あるいは塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に許容 可能な塩には、酸付加塩（ペプチドのフリーのアミン基と形成した）、および例 えば、塩酸あるいはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、 マレイン酸等のような有機酸と形成した塩が含まれる。フリーのカルボキシル基 と形成した塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アン モニウム、水酸化カルシウム、あるいは水酸化第二鉄のような無機塩基、および イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチ ジン、プロカイン、等のような有機塩基から誘導し得る。
ワクチンは、投与処方が適合する様式で、そして、予防的におよび／あるいは治 療的に有効な量で、投与される。投与される量は一般に、投与当り抗原が５μｇ から２５０μｇの範囲であり、処置される対象、対象の抗体を合成する免疫系の 能力、および所望する防御の程度、に依存する。投与に必要とされる有効成分の 正確な量は、実施者の判断に依存し得、そして個体毎に固有となり得る。
ワクチンは、単回投与のスケジュールで、あるいは好ましくは複数投与スケジュ ールで、与え得る。複数投与スケジュールでは、予防接種の第一過程が１−１０ 回の別々の投与であり得、その後、免疫応答を維持あるいは補強するために、必 要−な投与をさらに引き続き、期間毎に行い、例えば、１−４ケ月に第二の投与 を行い、そして必要ならば、数カ月後に次の（単数あるいは複数の）投与を行う 。投薬法はまた、少なくとも部分的には、個体の必要に応じて決定され、実施者 の判断による。
加えて、（単数あるいは複数の）免疫原性のＨＣＶ抗原を含んだワクチンは、例 えば、免疫グロブリンのような他の免疫調節物質と共に投与し得る。
上述のようにして調製された免疫原性のポリペプチドは、ポリクローナルおよび モノクローナルの両方の抗体の製造に使用される。ポリクローナル抗体が所望な らば、選択した哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、その他）をＨＣ Ｖの（単数あるいは複数の）エピトープを有する免疫原性のポリペプチドで免疫 する。免疫した動物からの血清を、回収し、そして公知の方法に従って処理する 。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含んでいる血清が、他の抗原 に対する抗体を含んでいる場合、ポリクローナル抗体はイムノアフィニティーク リマドグラフィーにより精製され得る。ポリクローナルの抗血清の製造および処 理の技術は当分野で公知であり、例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集（ １９８７）　ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ 　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｌａｎｄｏｎ）を参照。
ＨＣＩ／エピトープに対するモノクローナル抗体もまた、当業者は容易に製造し 得る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作成の一般的方法は良く知られ ている。永久に継代可能な抗体産生細胞株は、細胞融合、および、ガン遺伝子Ｄ ＮＡで８９２８球を直接形質転換したり、あるいはエブスタインノイーウイルス によるトランスフェクションのような他の方法によッテも創製し得る。例えば、 Ｍ、　５ｃｈｒｅｉｅｒら　（１９８０）　ＩＴＹＢＲＩＤＯＭＡ　ＴＥＣＨＮ ＩＱＵＥＳ：　Ｈａｍｍｅｒｌｔｎｇら　（１９８１）、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ 　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ；　Ｋ ｅｎｎｅｔｔら　（１９８０）　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤ　［ＥＳ 　；を参照。また、米国特許第４．３４１．７６１号；第４゜３９９、１２１号 ：第４．４２７．７８３号：第４，４４４，８８７号；第４．４６６．９１７号 ；第４．４７２．５００号；第４．４９１．６３２号；および、第４．４９３． ８９０号も参照。ＨＣＶエピトープに対して製造された一連のモノクローナル抗 体は、種々の性質、即ち、アイソタイプ、エピトープ親和性、その他に関してス クリーニングし得る。
ＨＣＶエピトープに対する、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体 は、特に診断に有用であり、中和抗体は、受動的免疫療法に有用である。特にモ ノクローナル抗体は、抗イデイオタイプ抗体の作成に有用である。
抗イデイオタイプ抗体は、それに対する防御が望まれている感染物質の抗原の「 内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イデイオタイプ抗体を作成す る技術は当分野で公知である。例えば、Ｇｒｚｙｃｈ　（１９８５）、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３１６：７４；　ＭａｃＮａｍａｒａら　（１９８４）、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２６：１３２５、Ｕｙｔｄｅｈａａｇら　（１９８５）。
Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．上：１２２５、を参照。これらの抗イデイオタイプ抗体 はまた、ＮＡＮＢＨの治療および／あるいは診断に、およびＨＣＶ抗原の免疫原 性領域の解明に、有用で有り得る。
ＨＣ’／／Ｊ　１あるいはＨＣＶ／Ｊ７のポリヌクレオチド配列を基として用い て、切り出しあるいは合成的に、約８ヌクレオチドあるいはそれ以上のオリゴマ ーを調製し得る。このヌクレオチドは、ＨＣＶゲノムにハイブリダイズし、そし て、（単数あるいは複数の）ウィルス物質の同定に、（単数あるいは複数の）ウ ィルスゲノムのさらなる特徴付けに、および病気の個体中の（単数あるいは複数 の）ウィルスの検出に、有用である。ＨＣＶポリヌクレオチド（天然あるいは誘 導体）用のプローブは、ハイブリダイゼーションにより特有のウィルス配列の検 出が可能となる長さである。６−８個のヌクレオチドは、実際に使用し得る長さ であり得るが、約１０−１２個のヌクレオチドの配列が好ましく、そして約２０ 個のヌクレオチドが最適のようである。これらのプローブは、自動オリゴヌクレ オチド合成法を含む、日常的方法を用いて調製し得る。有用なプローブには、例 えば以下に記載する、本明細書に開示されたクローン、およびｃＤＮＡライブラ リーをプローブするのに有用な種々のオリゴマーがある。
ＨＣ’／ゲノムの任意の特有な部分に相補的であれば充分である。
プローブとして使用するためには、断片の長さが増せば不必要となるが、完全な 相補性が望ましい。
このようなプローブを診断試薬として使用する場合、所望するならば血液あるい は血清のような分析される生物学的試料を処理して、その中に含まれる核酸を抽 出し得る。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは他のサイズ選別技 術にかけ得る：あるいは、サイズ選別せずに核酸試料をドツトプロ７トし得る。
このプローブを次に標識する。適切な標識、およびプローブを標識する方法は当 分野で公知であり、例えば、ニックトランスレーションあるいはカイネーション による放射活性標識の組み込み、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プロ ーブ、が含まれる。試料から抽出された核酸を次に、適切なストリンジエンシー のハイブリダイゼーション条件下で標識プローブで処理する。偽陽性を妨げるた めに、通常は高いストリンジエンシーの条件が好ましい。ハイブリダイゼーショ ンのストリンジエンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミ ドの濃度を包含する、ハイブリダイゼーション中および洗浄工程中の多（の因子 によッテ、決められる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（１９８２）　ＭＯ ＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　 （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）に、これらの因子の概略が示されている。
一般的に、ＨＣＶゲ／ム配列は、感染した個体の血清中に相対的に低い濃度で、 即ち、約ｉｏ”−１ｏ３チンパンジー感染１１（ｃｈｆｍｐ　１ｎｆｅｃｔｉｏ ｕｓ　ｄｏｓｅｓ）（ＣＩＤ）／ｍｌの濃度で、存在していると考えられている 。このレベルは、ノーイブリダイゼーションア、２セイに増幅技術が用いられる ことを必要とし得る。このような技術は当分野で公知である。例えば、Ｅｎｚｏ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　ｉｏｎのｒ　Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄ ｇｅＪシステムは、修飾されていない３゜−ポリーｄＴ−テイルをＤＮＡプロー ブに付は加えるために、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを 使用スる。
このポリｄＴ−テイルを付けたプローブを、標的ヌクレオチド配列とハイブリダ イゼーションし、そして次に、ビオチン修飾したポリ−Ａとハイブリダイゼーシ ョンする。ＰＣＴ特許出願Ｎｏ。
８４１０３５２０、および欧州特許公開第１２４．２２１号、にはＤＮＡハイブ リダイゼーションアッセイが記載され、その中で：（１）被分析物を、酵素標識 したオリゴヌクレオチドに相捕的な一重鎖ＤＮＡプローブとアニールさせ、そし て、（２）得られたテイルの付いた二重鎖を酵素標識したオリゴヌクレオチドと ７〜イブリダイゼーシヨンしている。欧州特許公開第２０４，５１０号には、被 分析物ＤＮＡを、ポリーｄＴテイルのようなテイルを有するプローブ、および、 ポリーＡ配列のようなプローブのテイルとハイブリダイゼーシヨンする配列を有 し、そして複数の標識された鎖と結合し得る、アンブリファイア−鎖と接触させ る、ＤＮＡハイブリダイゼーションアノセイを記載している。
特に望ましい技術は、先ず、血清中の標的１７Ｃ’／配列を約１０゜０００−倍 に、即ち、約１０６配列／ｍｌに増幅する工程を含む。例えば、５ａｉｋｉら　 ＜１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３、Ｍｕｌｌ　ｉｓらの米国特許第 ４、６８３．１９５号、およびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４．６８３．２０２ 号に記載されたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により行える。
増幅されたく単数あるいは複数の）配列は次に、係属出願の、欧州特許公開第３ １７−０７７号、およびヨ本特許出願番号第６３−２６０３４７号（これらは本 明細書の譲受人に譲渡され、本明細書ではこれらを参考文献として援用する）に 記載されたハイブリダイゼーションアッセイを用いて検８する。１０’／ｍｌの レベルの配列を検出する必要のあるこれらのハイブリダイゼーションアッセイは 、−重鎖の被分析物核酸に結合し、さらに複数の標識−重鎖オリゴヌクレオチド とも結合する、核酸マルチマーを利用している。標識ポリヌクレオチドプローブ に使用し得る適切な液相サンドイッチアッセイ、およびプローブを調製するため の方法は、欧州特許公開第２２５．８０７号（本明細書では参考文献として援用 する）に記載されている。
これらのプローブは、診断キット中に包括し得る。診断キットは、プローブＤＮ Ａを含み、プローブは標識されていても良く；あるいは、ＤＮＡプローブは非標 識で、標識用の成分を牛。
ト中の別の容器中に含んでいても良い。キットはまた、例えば、スタンダード用 物質、洗浄バッファー、およびテストを行うための指示書のような、特定のハイ ブリダイゼーションプロトコールに必要とされる、他の適切に包装された試薬お よび物を含み得る。
ＨＣＶ抗体を含む血清およびＩＣ’／／ＪｌおよびＨｅ’／／Ｊ７のポリペプチ ド中のＩＣ”／特異的エピトープに対する抗体と免疫学的に反応する、ＨＣＶ／ Ｊｌおよび）ＩＣＶ／Ｊ７のポリペプチドの両者は、生物学的試料中のＨＣＶ抗 体の存在を、あるいは、ウィルスおよび／あるいはウィルス抗原の存在を検出す るイムノア、セイに有用でぁる。イム／アッセイの設計は非常に多様で、これら の多様性は当分野で公知である。抗ＨＣＶ抗体用のイムノア、セイは、一つのウ ィルスエピトープ、あるいは数個のウィルスエピトープを利用し得る。複数のエ ピトープを用いる場合、このエピトープは、同じあるいは異なるウィルスポリペ プチドに由来し得、そして、エピトープは、別々の、組換えポリペプチドあるい は天然のポリペプチド中に、あるいは同じ組換えポリペプチド中に一緒に、存在 しても良い。
ウィルス抗原用のイムノアッセイは、例えば、ウィルスエピトープに対するモノ クローナル抗体、一つのウィルスポリペプチドのエピトープに対するモノクロー ナル抗体の組合せ、異なるウィルスポリペプチドの複数のエピトープに対するモ ノクローナル抗体の組合せ、同じウィルス抗原に対するポリクローナル抗体、異 なるウィルス抗原に対するポリクローナル抗体、あるいは、モノクローナルおよ びポリクローナルの抗体の組合せ、が使用し得る。
イムノアッセイのプロトコールは、例えば、競合法、あるいは直接反応、あるい はサンドイッチタイプのア・ソセイに基づき得る。プロトフールはまた、例えば 固相支持体を使用しても良く、あるいは免疫沈降法であっても良い。殆どのア、 ／セイは、標識した抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。
標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、あるいは色素分子であり得る。プ ローブからの信号を増幅するアツセイもまた公知である。その例は、ＥＬＩＳＡ アッセイのような、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、および、酵素 標識および酵素を介するイムノアッセイである。
典型的ニは、抗ＨＣＶ抗体用のイムノアッセイは、生物学的試料のようなテスト 試料を選択および調製し、そして次に、それを抗原性（即ち、エピトープを含有 する）ＨＣＶポリペプチドと共に、抗原抗体複合体が形成される条件下でインキ ュベートすることを含む。このような条件は当分野では公知である。
不均一系では、インキュベーション後にポリペプチドから試料を分離するために 、ポリペプチドは固相支持体に結合される。使用し得る固相支持体の例には、メ ンブレンあるいはマイクロタイターウェルの形態のニトロセルロース、シートす るいはマイクロタイターウェルの形態のポリ塩化ビニル、ビーズあるいはマイク ロタイターウェルの形態のポリスチレンラテックス、１ｍｍｏｂｕｌｏｎ”″と して知られているポリビニリジンフルオライド、ジアゾ化紙、ナイロンメンブレ ン、活性化ピース、オよびプロティンＡビーズ、である。最も好適なのは、Ｄｙ ｎａｔｅｃｈのＩｍｍｕｌｏｎ”　ｌ　フィクロタイタープレートあるいは０． ２５−インチのポリスチレンビーズであり、これはＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰ’１ａ ｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌでスペック（Ｓｐｅｃ）仕上げされ、不均一系で使用されて いる。固相支持体は、テスト試料から分離された後に一般に典型的に洗浄される 。均一系では、当分野で公知のように、テスト試料は抗原と共に、溶液中で、形 成された如何なる抗原抗体複合体をも沈降させる条件下でインキュベートする。
沈降した複合体を次に、例えば、遠心分離により、テスト試料から分離する。抗 ＨＣ’／抗体を含む形成された複合体は、次に多くの技術のいずれかにより検出 される。系によってはこの複合体は、標識した抗異Ｎ１ｇにより、あるいは、競 合系が用いられた場合には、結合した標識競合抗体量を測定することにより、検 出し得る。
１４Ｃ’／ポリペプチドが被分析物であるイムノアッセイでは、典型的には生物 学的試料であるテスト試料は、抗１１１Ｃ’／抗体と共に、抗原抗体複合体の形 成が可能な条件下で同様にインキュベートされる。抗体が固相支持体に結合され 、テスト試料と共にインキュベートされ；洗浄され：被分析物と第二の標識抗体 とを共にインキュベートされ；そして、支持体を再び洗浄する、「サンドイッチ 」アッセイのような種々の系を採用し得る。被分析物は第二抗体が支持体に結合 したかどうかを調べることで検出される。不均一系あるいは均一系のいづれでも 有り得る競合系では、テスト試料は通常、抗体および標識された競合する抗原と 共に、順番にあるいは同時に、インキュベートされる。これらおよび他の系は、 当分野で良く知られている。
ＨＣＶのブラビウイルスモデルは、ピリオンの構造タンパク質の診断用エピトー プの存在しそうな位置に関する予測を可能とする。Ｃ１ブレーＭ、　Ｍ、および Ｅドメインは全て、ウィルス抗原の検出、および特に診断に役立つ可能性の高い エピトープを含んでいると考えられる。同様に、非構造タンパク質のドメインは 、重要な診断用エピトープ（例えば、推定ポリメラーゼをフードするＮＳ５　； および、推定補体結合抗原をコードするＮ５Ｉ）を含むと考えられる。これらの 特異的なドメインのエピトープを含む、組換えポリペプチドあるいはウィルスポ リペプチドは、感染性血液の供与者および感染、患者中のウィルス抗体の検出に 有用であり得る。加えて、Ｅおよび／あるいはＭタンパク質に対する抗体は、Ｉ ’ｌＣＶにより引き起こされたＮＡＮＢ［ｌの患者、および感染性血液の供与者 の、ウィルス抗原検出用のイムノアッセイに使用し得る。さらに、これらの抗体 は、急性期の供血者および患者からの検出に、非常に有用であり得る。
推定ポリタンパク質の抗原性領域は、細菌でのポリタンパク質の部分をコードす るＨＣ’／のｃＤＮＡの発現産物の抗原性をスクリーニングすることにより、位 置付けおよび同定し得る。ＨＣＶの他の抗原性領域は、酵母系、および、昆虫お よびを推動物由来の細胞系を含む、他の発現系でＨＣｖのｃＤＮＡの部分を発現 させることにより検出し得る。加えて、抗原性指数および疎水性／親水性プロフ ィールに関する研究により、領域の抗原性の見込みに関する情報が得られる。有 効な検出系は、一連のエピトープの使用を含み得る。この一連のエピトープは、 −ツあるいは複数のポリペプチドに構築し得る。
免疫診断に適し、そして適切な標識試薬を含んだ適切なキットは、適切な容器中 のＨＣＶエピトープを含んだ本発明のポリペプチドあるいはＨＣＶエピトープに 対する抗体、そしてアッセイの実施に必要な他の試薬および物質（例えば、洗浄 バッファー、標識抗ヒトＩｇのような検出手段、標識抗１（Ｃ’／、あるいは標 ｍ　ＨＣＶ抗原）、および適当なアッセイ指示書のセットを含む、適切な物質を パッケージに入れることで構築される。
本明細書に記載したＨＣＶ／Ｊ　１および）ＩＣＶ／Ｊ７のヌクレオチド配列情 報は、ＨＣ■ゲノムの配列に関するさらなる情報を得るために、モしてＪｌある いはＪｌに関連した別のＨＣＶ分離株の同定および単離にも、使用し得る。そし てこの情報は、別のポリヌクレオチドプローブ、ＨＣ’／ゲノムから誘導したポ リペプチド、およびＦＩＣＶにより引き起こされたＮＡＮＢＦＩの診断およびあ るいは処置に有用であろうＨＣＶエピトープに対する抗体を導き出す。
本明細書に記載したＨＣＶ／ＪｌおよびＩ（ＣＶ／Ｊ７のヌクレオチド配列情報 は、それからＪｌおよびＪ７配列が由来する、ＥＩＣＶゲノムの未だ定義されて いない領域に由来する別の配列を単離するためのプローブの設計に有用である。
例えば、実施例に開示されたＨＣ’／のｃＤＮＡ配列の５−末端あるいは３−末 端に近い領域に由来する、約８個のあるいはそれ以上の、そして好ましくは２０ 個のあるいはそれ以上のヌクレオチドの配列を含んだ標識プローブは、ＨＣ’／ のｃＤＮＡライブラリーから重複するｃＤＮＡ配列を単離するために使用し得る 。上記のクローン中のｃＤＮＡと重複するが、上記のクローン中のｃＤＮＡが由 来しないゲノムの領域から由来する配列をも含む、これらの配列は次に、以下に 記載するｃＤＮＡと必ずしも重複しない他の重複断片を単離するためのプローブ の合成に使用し得る。ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は当分野で公知であ る。例えば、欧州特許公開第３１８．２１６号を参照。ｕｃｖｔ抗原に対する抗 体が証明されてＮＡＮＢＨを有すると診断された、日本および他のアジアの患者 の血清からライブラリーを調製するのが特に好ましい；これらの人々は、ＨＣＶ ／月、１（Ｃ１／／Ｊ７あるいは関連した分離株の保持者の最も有力な候補であ ると考えられている。
ＨＣｖ粒子は、ＮＡＮＢＨの個体の血清から、あるいは細胞培養物から、当分野 で公知の任意の方法で単離し得る。この方法には例えば、沈降あるいは排除法の ようなサイズ分別に基づ（技術、あるいは密度勾配中での超遠心のような密度に 基づ（技術、あるいはポリエチレングリフールのような物質と共に沈澱させる方 法、あるいはアニオン性あるいはカチオン性の交換物質、および疎水性により結 合する物質のような種々の物質によるクロマトグラフィーが含まれる。
１（ＣＶ粒子あるいは抗原を単離するための好ましい方法は、イムノアフィニテ ィーによる方法である。イムノアフィニティーの技術は当分野で公知であり、固 相支持体に抗体を固定し、それらの免疫選択性を保持しておく技術が含まれる。
これらの技術は、抗体が支持体に吸着されるものく例えば、ＫｕｒｓｔａｋのＥ ＮＺＹＭＥ　ＩＭＭＵＮＯＤＩＡＧＮＯＳＩＳ、　ｐａｇｅ　３１−３７を参照 ）、および抗体を支持体に共有結合するものであり得る。一般に、この技術は上 述の抗原を固相支持体に共有結合するために使用したものと類似である。しかし 、抗体の抗原結合部位が接近可能に保たれるようスペーサーグループが二価のカ ップリング試薬中に含まれ得る。抗体はモノクローナル、あるいはポリクロ−ナ ルで良く、イムノアッセイに使用する前に抗体を精製しておくことが望ましい。
ウィルスからのゲノムの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製およびブロービング 、クローンの配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、ラジオイムノア ッセイあるいはＥＬＩＳＡアッセイのような免疫学的アッセイの実施、培養によ る細胞の増殖、等に使用される一般的技術は当分野で公知であり、これらの技術 を記載したラボラトリーマニニアルは入手できるが、一般的指針として、これら の方法に関する現在得られる情報源、および実施する際に有用な物質を以下に記 載する。
指定の宿主と適合する適切な制御配列が使用できるなら、望みのコード配列を発 現させるために、原核および真核宿主細胞が使用し得る。原核細胞宿主の中では Ｅ、　ｃｏｌｉが最も頻繁に使用されている。原核細胞用の発現制御配列は、プ ロモーターを含み、オペレータ一部分、およびリポソーム結合部位を随意に含む 。原核細胞宿主に適合するトランスファーベクターは通常は、例えば、アンピノ リンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含んだプラスミドｐＢＲ ３２２、および、抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含んだ種々のｐＵＣベ クターから誘導される。これらのマーカーは、選択ニよりうまく形質転換体を得 るために使用し得る。通常使用される原核細胞の制御配列には、β−ラクタマー ゼ（ペニシリナーゼ）、およびラクトースブロモ−ターンステム（Ｃｈａｎｇら 　（１９７７）、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６＞、トリプトファン（ｔｒ ｐ）プロモーター７ステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら　（１９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　８．：４０５７）、および、λ−由来のＰＬプロモータ ーおよびＮ遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら　（１９８１）　 Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２ｇ）、およびｍおよび口１２８）が含まれる。以上 のシステムは特にＥ、　ｃｏｌｔに適合したものである；所望するならば、Ｂａ ｃｉｌｌｕｓあるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの株のような他の原核細胞宿主も 対応する制御配列と共に使用し得る。
真核細胞宿主には、培養システム中の酵母および哺乳類細胞が含まれる。Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　Ｓａｅｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｓｉｓ、　Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ　１ａｃｔｉｓおよびＰ ｉｃｈｉａ　註扛肛ｎは、最も一般的に使用される酵母宿主であり、便利な真菌 宿主である。酵母に適合したベクターは、栄養素要求性変異株に原栄養菌性を変 換、あるいは、野生株に重金属耐性を付与することによる、首尾良い形質転換体 の選択を可能とするマーカーを有している。酵母に適合したベクターは、２　ｍ ｆｅｒｏｎ複製開始点＜Ｂｒｏａｃｈら　（１９８３）　Ｍａｔｈ　Ｅｎｚ、　 １０１：３０７＞、ＣＥＮ３およびＡＲＳＩの組合せ、あるいは、宿主細胞ゲノ ムに適切な断片の組み込みをもたらす配列のような複製を保証する他の手段、を 使用し得る。酵母ベクター用の制御配列は、当分野で公知であり、解糖酵素合成 のプロモーター（Ｈｅｓｓら　（１９６８）　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　 Ｅｎｇ、７：１４９；　Ｈｏ１ｌａｎｄら　＜１９７８）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅ＋＊、２５６：１３８５）を含み、これには３フオスフオグリセレートキナー ゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　（１９８０）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５ ５：２０７３）が含まれる。さらにエノラーゼ遺伝子に由来するような転写停止 信号（ｌ（ａｌｌａｎｄ　（１９８１）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｍ、　 ２５６：１３８５）も含まれ得る。特に有用な制御システムは、グリセルアルデ ヒド−３フオスフエートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＩ（）プロモーター、ある いはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を調節し得るプロモーター、これも ＧＡＰＤＨに由来する転写停止信号、そして分泌が望ましいならば、酵母α因子 からのリーダー配列を含むものである。加えて、作動可能に結合された転写調節 領域および転写開始領域は、野生種生物では天然に結合しないような様式であり 得る。これらのシステムは、欧州特許公開第１２０．５５１号、欧州特許公開第 １．１６，２０１号、および欧州特許公開第１６４．５５６号（本明細書ではこ れら全てを参考文献として援用する）に詳細に記載されている。
発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞株は、当分野で公知であり、ＨｅＬａ 細胞、チ↓イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（Ｂ ｌ（Ｋ）細胞、および多くの他の細胞株を含む、アメリカンタイプカルチャーコ レクション（ＡＴＣＣ）から得られる多くの不死化細胞株が含まれる。哺乳類細 胞用の適切なプロモーターもまた、当分野で公知であり、５１ｍ１ａｎＶｉｒｕ ｓ　４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓ　（１９７８）、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３： １１３）、ラウスサルフーマウイルス（Ｒ３Ｖ）、アデノウィルス（ＡＤＶ）、 およびウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）、からのもののようなウィルスプロモ ーターが含まれる。哺乳類細胞はまた、転写停止信号およびポリＡ付加配列を必 要とし得る；発現を増大させるエンハンサ−配列もまた含まれ得、そして遺伝子 の増幅を引き起こす配列もまた望ましい。これらの配列は当分野で公知である。
哺乳類細胞中での複製に適したベクターは、ウィルスレプリコン、あるいは宿主 ゲノムへのＮＡＮＢＶエピトープをコードスル適切な配列の組込みを保証する配 列を含み得る。
ワクシニアウィルスシステムもまた、哺乳類細胞中で外来ＤＮＡを発現させるた めに使用し得る。異種遺伝子を発現させるために、通常、この外来ＤＮＡはワタ シニアウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入され、そして次に感染した細胞 を選択し得る。この方法は当分野で公知であり、さらなる情報は以下の文献中に 見いだされる［ＭａｃｋｅｔｔらＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　４９＋　８５７−８６４ 　（１９８４）およびＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ　、　Ｖｏｌ、　２．の第７章、Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ］。
加工て、ウィルス抗原は、バキニロウィルスシステムにより昆虫細胞中で発現し 得る。Ｓｕｎ＋＋＋ｅｒおよびＳｍ１ｔｈによるバキュロウィルスの発現に関す る概説ガイドブックは、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　。
ｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎ ｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　（Ｔｅ ｘａｓ　Ａｇｒｔｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎＢ ｕｌｌｅｔｆｎ　Ｎｏ、　１５５５）である。異種遺伝子をバキュロウィルスゲ ノムに組込むために、先ず遺伝子を、バキュロウィルス配列を幾つか含むトラン スファーベクターにクローニングする。
このトランスファーベクターを、昆虫細胞へ野生型ウィルスと共に同時にトラン スフェクトすると、野生型ウィルスとの組換えが起こる。通常トランスファーベ クターは、異種遺伝子が野生型バキュロウィルスの多面体遺伝子を崩壊させるよ うに作成されている。この組換えウィルスに感染した細胞は、野生型ウィルスに 感染した細胞とは表現形が異なっているので、この崩壊により組換えウィルスの 選択が容易となる。精製された組換えウィルスは、細胞を感染させ、異種遺伝子 を発現させるために使用し得る。もしシグナルペプチドを異種遺伝子のフレーム に結合してあれば、外来タンパク質は培地中に分泌され得る−そうでない場合に は、タンパク質は細胞の溶解物に結合している。さらなる情報は、Ｓｍ１ｔｈら のＭｏｌ。
＆　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２１５６−２１６５　（１９ｇ３＞あるいは ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓのＶｉｒｏｌｏｇｙ　１７：　３１−３９　 （１９８９）を参照。
形質転換は、例えば、ウィルス中にポリヌクレオチドをパンケージングしそして 宿主をウィルスで変換する、およびポリヌクレオチドの直接の取り込みを含む、 ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の方法によって行い得る。
使用される形質転換法は、形質転換される宿主に依存する。
直接の取り込みによる細菌の形質転換は一般に、塩化カルシウムあるいは塩化ル ビジウムでの処理を用いている（Ｃｏｈｅｎ　（１９７２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９：２１１０；　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９ ８２）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　Ｍ ＡＮＵＡＬ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、））。直接の取り込みによる酵母 の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら　（１９７８）　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５：　１９２９の方法により行 い得る。直接の取り込みによる哺乳類細胞の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７８）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：５４６のリン 酸カルシウム沈降法を、あるいはそれの公知の種々の変法を用いて行い得る。
ベクターの構築は当分野で公知の方法を用いて行う。部位特異的なりＮＡの開裂 を、適切な制限酵素で、これらの市販されている酵素の製造者により通常は特定 された条件下で、処理することにより行われる。開裂された断片は、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｏｏｌｏｇｙ　（１９８０）　６５：４９９−５６０に 見いだされる一般的方法に従って、ポリアクリルアミドあるいはアガロースのゲ ル電気泳動法を用いて分離し得る。非平滑末端の開裂断片は、Ｅ、　ｃｏＬＬ　 ＤＮＡポリメラーゼ１（フレナラ断片）を用い、混合物中の適切なデオキシヌク レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、平滑末端化し得る。Ｓｔヌクレアー ゼでの処理もまた使用し得、如何なる一本鎖ＤＮＡ部分も加水分解される。
ライゲーションは、標準的なバッファーおよび温度条件を用い、Ｔ４　ＤＮＡリ ガーゼおよびＡＴＰを用いて行われる；非平滑末端のライゲーションは、平滑末 端のライゲーションに比べ、ＡＴＰおよびリガーゼが少なくて済む。ベクター断 片がライゲーション混合物の一部分として用いられた場合、５−リン酸を除去し 、そしてその結果ベクターの再ライゲーションを妨害する目的でしばしば、ベク ター断片を細菌アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）あるいは仔つシ腸アルカリ フォスファターゼで処理する；あるいは、ライゲーションを妨害するために不要 な断片の制限酵素消化が使用され得る。ライゲーション混合物は、Ｅ、　ｃｏｌ ｉのような適切なりローニング宿主に形質転換され、成功した形質転換体は、例 えば抗生物質耐性により選択され、そして正しい構築に関してスクリーニングさ れる。
合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ　（１９８４）、　ＤＮＡ　ｉ：４０ １に記載されているように、自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製し得 る。所望するならば、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、反応の標準的条件を用いて、 ポリヌクレオチドキナーゼで処理することで、合成鎖を３２ｐで標識し得る。ｃ ＤＮＡライブラリーから単離されたものを含む、ＤＮＡ配列は、例えば、Ｚｏｌ ｌｅｒ　（１９８２）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０：６４ ８７に記載された部位特異的変異誘発を含む、既知の方法で改変し得る。
ＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　（１９７５ ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３二３９６ １の方法を用いてプローブし得る。簡単に説明すると、この方法では、プローブ されるＤＮＡハニトロセルロースフィルターに固定され、変性サレ、そしてバッ ファーでプレハイブリダイゼーションされる。バッファー中のホルムアミドの％ 、および、ブレ／％イブリダイゼーションおよび引き続くハイブリダイゼーショ ン工程の時間および温度条件は、必要とされるストリンジエンシーに依存する。
低いストリンジエンノー条件を要求するオリゴマープローブは一般に、低いフォ ルムアミド濃度、低い温度、および長いハイブリダイイー／−１フ時間で用いら れる。ｃＤＮＡあるいはゲノム配列から由来するもののように、３０個あるいは ４０個より多いヌクレオチド以上を含んだプローブには、一般に、より高い温度 、例えば約４０−４２℃、そして高い％の、例えば５０％のホルムアミドを用い る。プレハイブリダイゼーションの後、ｓ−５−３２ｐ−オリゴヌクレオチドプ ローブをバッファーに加え、そしてフィルターをハイブリダイゼーション条件下 でこの混合物とインキュベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオートラ ジオグラフィーにかけ、ハイブリダイゼーションしたプローブの位置を表示させ る；元のアガープレート上の対応する位置のＤＮＡを、所望のＤＮＡの材料とし て使用する。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、抗原あるいは抗体の濃度の測定に 使用し得る。この方法は、抗原あるいは抗体のいずれかに結合させた酵素に依存 し、そして、結合した酵素活性を定量的標識として用いる。抗体を測定するため に、既知の抗原を固相（例えば、マイクロプレートあるいはプラスチックカップ ）に固定し、試験する希釈血清とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識した抗 イムノグロブリンとインキュベートし、そして再び洗浄する。標識に適した酵素 は、当分野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。
固相に結合した酵素活性を特異的基質の添加、そして生成物形成あるいは基質の 利用を比色的に測定により測定する。結合した酵素活性は、結合した抗体量の直 接機能である。
抗原を測定するには、既知の特異的抗体を固相に固定し、抗原を含む試験材料を 添加し、インキュベージコンの後、固相を洗浄し、そして第二の酵素標識した抗 体を加える。洗浄後、基質を添加し、そして酵素活性を比色的に測定し、そして 抗原濃度に関連させる。
大Ｊ１舛 土 この実施例には、ＨＣＶ／ＪｌおよびＩＩＣＶ／Ｊ７のヌクレオチド配列のクロ ーニングが記載されている。
両方のＨＣＶピリオン源として用いられた血液試料は、抗ＨＣＩ／抗体アッセイ で陽性であった。これらの試料からのＨＣｖ分離株をＨＣ’／／ＪｌおよびＨＣ Ｖ／Ｊ７と命名した。Ｊ１分離株を含有する血液試料の感染力は、受血者の将来 的な軸直後の経過の研究によって確認された。Ｎａｔｔｏｎａｌ　Ｔｏｋｙｏ　 Ｃｈｅｓｔ　Ｈｏ５ｐｆｔａｌの外科のＴｏｈｒｕ　Ｋａｔａｙａｍａ博士は、 非Ａ型、非Ｂ型肝炎の患者から採血した。
さらに彼は、これらの患者への各々の血液供与者からの血液試料も集めた。次に 、これらの試料を、Ｃ１００−３ＨＣＶＩ抗原（欧州特許公開第３１８．２１５ 号）に対する抗体についてアッセイしたところ、供与者の１人からの血液が陽性 であった。
血液試料からのＲＮＡの単離は、超遠心分離による血液試料中のピリオンをベレ ット化することから始めた［Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｄ、Ｗ。
、　ＭｃＣａｕｓｔｌａｎｄ、に、Ａ、、　Ｃｏｏｋ　Ｅ、Ｈ，、５ｃｈａｂｌ ｅ、　Ｃ，Ａ、、　Ｅｂｅｒｔ。
ＪＷおよびＭａｙｎａｒｄ、　Ｊ、Ｅ、　（１９８５）　ＧａｓｔｒｏｅｎＬｅ ｒｏｌｏｇｙ　８８．７７３−７７９１゜次に、ＲＮＡを、塩化グアニジニウム ／塩化セシウム法によってベレットから抽出し［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、　Ｆ ｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、。
およびＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、（１９８２）　−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”’、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ］、そして、さらに尿素存在下に、フェノール／クロロホルム抽出に よって精製した［Ｂｅｒｋ、　Ａ、Ｊ、　Ｌｅｅ、Ｆ、、　Ｈａｒｒｉｓｏｎ、 　Ｔ、、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、および５ｈａｒｐ、　Ｐ、Ａ、　（１９７ ９）　Ｃｅ旦」Ｌ９３５−９４４１゜ ＨＣ’／１（７）　ヌクレｔｆ　Ｆ配列のＣ／ＥＳＥ、　Ｅ／ＮＳＩ、ＮＳ３お よびＮＳ５ドメインから、合成オリゴヌクレオチドブライマーの５組のペア　− ヲ設計して、ＪｌおよびＪ７のゲノムから断片を単離した。
プライマーの第１番目の組は、コアドメインおよびいくつかのエンベロープドメ イン中 ものであった。プライマーの第２番目の組は、エンベロープドメイン中の配列の 単離のためのものであった。プライマーの第３番目の組は、推定エンベロープド メインおよび非構造ドメイン１１すなわちＮＳＩの領域が重なったドメインの断 片を単離するためのものであった。プライマーの第４および第５番目の組は、非 構造ドメイン３および５、すなわちＮＳ３およびＮＳ５の断片を単離するために 用いた。種々のプライマーの配列を以下に示す： Ｃ／Ｅ領域のプライマーの配列は、 ２１Ｓ　５°ＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴ　３゜Ｊ８０Ａ　５’ 　ＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ３’　である。
Ｅ領域のプライマーの配列は、 ７１Ｓ５°ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ　３゜Ｊ１３２Ａ　５° ＡＡＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＣＴＡＡＧＧＣ３°　である。
Ｅ／ＮＳＩの領域のプライマーの配列は、１２７Ｓ　５°ＴＧＧＣＡＴＧＧＧＡ ＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧ　３゜１６６Ａ　５’　ＴＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＧＡ ＴＡＧＡＡ　３’　である。
ＮＳ３領域のプライマーの配列は、 ４６４Ｓ　５°ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ　３’５２６Ａ　５ ’　ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＴＡ　３’　である。
ＮＳ５領域のプライマーの配列は、 ８７０Ｓ　５“ＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡ　３”９１７Ａ　５ °ＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ　３“　である。
アンチセンスプライマー１６６Ａ、　５２６Ａあるいは９１７Ａの１８ｇを１０ ユニツトの逆転写酵素（Ｂｉｏｒａｄ）に加えて、単離されたＲＮＡを鋳型とし てからｃＤＮＡ断片を合成した。次に、適切なセンスプライマー２１Ｓ、　７１ Ｓ、　１２７Ｓ、　４６４Ｓあるいは８７０Ｓの１８ｇを加えた後、ｃＤＮＡ断 片を標準的なポリメラーゼチェーンリアクションによって増幅した［５ａｉｋｉ 、　Ｒ，に、、　５ｃｈａｒｆ、　Ｓ、、　Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｆ、、　Ｍｕｌ ｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、、　’Ａｏｒｎ　Ｇ、Ｔ、、　Ｅｒ１ｉｃｈ、　ｌ（、Ａ、 およびＡｒｎｈｅｉｍ、　Ｎ、（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３５ ０−１３５４１゜ＰＣＲ法によって増幅されたｃＤＮＡ断片をゲル単離し、ｐＵ ｃ１１９のＳｍａ１部位［Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、 　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５３．３− １１１、あるいはクローニングベクターＣｈａｒｏｍｉｄ　９−４２［５ａｉｔ ｏ、１．および５ｔａｒｋ、　Ｇ、　＜１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：　８６６４−８６６８］の誘導体である ｃｈａｒｏｔｎｉｄ　ＳＢの５ｎａＢＩ部位に平滑末端結合してクローン化した 。５個のウィルスドメインの断片を含有するクローンを首尾よ（構築した。
日本の分離株Ｊｌおよび」７のＰＣＲ反応から、Ｃ／Ｅ％Ｅ、　Ｅ／ＮＳＩ、Ｎ Ｓ３およびＮＳ５のそれぞれの領域の、３つの個々のクローンを、ジデオ牛／チ ェインターミネーシ１ン法によって配列決定した。
Ｃ／Ｅ以外の全領域の配列は、ｊ１分離株から単離した。Ｃ／Ｅ領域の配列のみ 、Ｊ７分離株から単離した。意外にも、両方の分離株から単離された断片は、Ｈ ＣＶＩゲノムから推測されるものよりも長くも短くもなかった。しかし、同じ領 域の配列を含有するクローン間には異質性が存在する。従って、コンセンサス配 列は、図１から図５にそれぞれ示されているように、Ｃ／Ｅ、　ＥＳＥ／ＮＳＩ 、ＮＳ３およびＮＳ５のそれぞれのドメインについて構築した。これらの相違は 、ＰＣＲでの増幅中に無作為に生じた人工なものとして説明され得る〔５ａｉｋ ｉ、　Ｒ，に、、　５ｃｈａｒｆ、　Ｓ、。
Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｆ、、　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、、　Ｂｏｒｎ、　Ｇ、Ｔ 、、　Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、およびＡｒｎｈｅｉｍ、　Ｎ、　（１９８５） 　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３５０−１３５４１゜他の説明は、１人の健康な 保持者の血漿に１つ以上のウィルスゲノムが存在していて、これらのゲノムがヌ クレオチドレベルでは異質であるというものである。
この点を明確にするために、何個のヌクレオチドの相違がアミノ酸の変化を導く のか、例としてＪ１分離株のＮＳ３ドメインの配列を用いて決定した。５個のヌ クレオチドの相違のうち、３個がアミノ酸コドンの３番目の位置であって、アミ ノ酸配列を変化させない。残りの２個のヌクレオチドの相違の両方とも、アミノ 酸コドンの１番目の位置であって、スレオニンからアラニンへの変化、およびプ ロリンからアラニンへのアミ／酸の変化を生じた。これら全ては、小さな中性ア ミノ酸残基である。同様に、他のドメインでのヌクレオチドの相違が分析される ときも、多くのサイレントな保持された変異が認められる。これらの結果は、１ 人の健康な供与者の血漿中のＨＣＶゲノムのヌクレオチド配列が、ヌクレオチド レベルで異質であることを示唆している。
さらに、各々の断片に対するコンセンサス配列がまとめられると、各々の配列を 、図６から１０に記載されているＨＣＶＩ分離株と比較した。図６では、Ｊ７分 離株のＣ／Ｅ領域の断片が、ＨＣＶＩ分離株に対して、５１２１５５２で９２． ８％のヌクレオチド相同性および１５０／１５４で９７．４％のアミノ酸相同性 を有することが示されている。図７では、ＪｌのＥドメインの断片は、ＨＣＶＩ に対して僅かに低いヌクレオチド相同性およびアミノ酸相同性を、それぞれ７６ ．２％および８２．９％有することが示されている。エンベロープドメインおよ び非構造ドメイン１個に重なっているＪ１分離株の断片は、図８に示されている ように、ＨＣＶＩに対して最も低い相同を有する。そこでは、Ｊ１分離株は、Ｈ ＣＶＩに対して７１．５％ヌクレオチド相同性および７３．５％アミノ酸相同性 を有する。図９では、ＪｌのＮＳ３ドメインの断片とＨＣ’／１との比較が示さ れている。ヌクレオチド配列間の相同性は７９．８％であって、一方、分離株間 のアミノ酸相同性は、アミノ酸で１７９７１９４、あるいは９２２％と大変高い 。図１０では、月のＮＳ５配列とＨＣＶＩと間の相同性が示されている。この配 列は、８４．３％のヌクレオチド相同性および８８．７％のアミノ酸相同性を有 する。
上記実施例に記載されているベクターは、Ｐａｔｅｎｔ　Ｍｊｃｒｏｏｒｇａｎ ｉｓｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｉｎ５ｔｔｔｕ ｔｅ、　Ａｇｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　５ｃｆｅｎｃｅ　ａｎｄ 　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｔ　１−３．　Ｈｉｇａｓｈｆ　１−ｃｈ。
ｍｅ　Ｔｓｕｋｕｂａ−ｃｈｉ、ｌｂａｒａｇｉ−ｋｅｎ　３０５．　Ｊａｐａ ｎに寄託されテいテ、ブダペスト条約のらとに維持されている。受託番号および 寄託臼は６８ページに示されている。
旦 ＦＩＣＶ／Ｊ　１クローンであるＪｌ−１５１９は、本質的には上記記載の方法 によって単離した。しかし、単離に用いたプライマーは、Ｊ１５９Ｓおよび１９ ９Ａであった。オリゴマーのプライマーＪ１５９Ｓおよび１９９Ａの配列は、以 下に示すものであって、これらはＪｌ−１２１６およびＭＣｌ７１中の配列に基 づいている。
Ｊ１５９Ｓ　５’　ＡＣＴ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＡＣＴＧＣＡＡＴ　ＧＡ　３゜１ ９９Ａ　５’　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＴＴＣＡＴＣＣＡ　３゜’） 　ａ　−ンＪ１１５１９１ｔ、３６７ヌクレオチド（７）ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列 を含有する。これはＮＳＩ領域の５゛側のほとんど半分に広がっていて、そして ＥＭ域のクローンＪｌ−１２１６と３１個のヌクレオチドが重なっている。この 領域に広がっている３つのそれぞれのクローンは配列決定され、３つのクローン から得たこの領域の配列は、同一であった。Ｊｌ−１２１６（図中ではＪｌとし て示されている）のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列およびここに（上記に示されている ヌクレオチド配列）コードされるアミノ酸配列が図１３に示されている。さらに 、図１３１．：　ハ、Ｊｌ−１２１６とプロトタイプＨｃｖ１ｃＤＮＡの比較し 得る領域との配列の相違（図中ではＰＴで示されている）、およびそれによって 得られるコードされたアミノ酸の変化が示されている。Ｊｌ−１２１６とＨＣ’ ／Ｌ　ｃＤＮＡとの間の相同性は、ヌクレオチドレベルで約７０％、そしてアミ ノ酸レベルで約７５％である。
Ｊ１分離株の推定されるコアからＮ５ｌｆｉ域にかけての配列組成は、図１４に 示されていて、さらに、図中にはＪ１配列にコードされたアミノ酸が示されてい る。ＨＣ’／１プロトタイプ配列からの変化は、Ｊｌのヌクレオチド配列の下の 行に示している。
そして破線は相同の配列を示している。ＨｃＶ　１プロトタイプ配列中にコード された相同でないアミノ酸は、ＨＣｖｌのヌクレオチド配列の下に示されている 。
Ｊｌ／１５１９　）１ｃＶ　ｃＤＮＡを含有するクローン化されたもの（ｐＳｌ −１５１９）は、ＤＨ５ｃｒに維持されていてＰａｔｅｎｔ　Ｍｆｃｒｏｏｒｇ ａｎｉｓｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙに寄託されている。
■ ＨＳＶｌ　（欧州特許公開系３１８．２１５号を参照）の５−１−１ポリペプチ ドをフードする領域を取り囲む、推定のＮ５３−Ｎ５４領域、および推定ＮＳ　 １−Ｅ領域からのＣ２Ｏ０−Ｃ１００領域を含む、Ｊ１分離株の数個の領域をＰ ＣＲ法によって増幅した。このＣ２０Ｑ−ＣＩＱＯ領域は、プロトタイプＨＣＶ 　Ｉの３７９９から５３２１のヌクレオチドを含む。抽出を、プロテイナーゼに およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｍａｎｉａｔｉｓ　（１９８２）、 前述）の存在下でグアニジニウムチオンアネートで行った以外は、上記のように ＲＮＡを抽出した。各々のプライマー１μＭ、４０ユニ／トのＲＮアーゼインヒ ビター（ＲＮＡＳＩＮ）　、５ユニツトのＡＭＩ／逆転写酵素、および反応に必 要な塩および緩衝液を含む２５μ１反応液中でインキュベートしてＲＮＡをＨＣ Ｖ　ｃＤＮＡへ転写した。指定された領域からのＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメント の増幅は、合成オリゴマーの１６−ｍａｒプライマーのペアーを用いて行った。
ＰＣＲ増幅を３回（ＰＣＲＴ、　ＰＣＲＩＩ、およびＰＣＲＩＩＩ）行って完成 した。ＰＣＲ増幅の２回目および３回目（ＰＣＲＩＩ）には、異なったＰＣＲプ ライマーの組を用いた。１回目のＰＣＲ反応物を１０倍に希釈し、そして新しい プライマーを用いて複数回のＰＣＲ増幅を行ったので、最終的に最高で５ｏｚの １回目のＰＣＲ反応（ＰＣＲＩ）の生成物がさらに増幅された。領域の増幅に用 いたプライマーは、下記に示した。Ｊ１分離株の配列由来のＪＩＣ２００−３を 除いて、これらのプライマーは、プロトタイプＨｃｖｔ配列由来であった。
５°　ＡＡＣＡＧＧ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＧＧＴ　Ｃ３゜Ｊ（アンチセンス、）Ｉ ＣＶｌの５２５０で終わるヌクレオチド由来） ５°　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　Ｃ３’ＰＣＲＩ＋ ｕｈ１■（センス、ＨＳＶｌの５０５７番から始まるヌクレオチド由来のＨＣｖ 部分；制限酵素部位には下線が引いである）ｓ’　ｃ丁丁ＧＡＡＴ丁ＣＴＣＧ　 ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＧＣＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＣ３’旦且工路（ ７７ｆ　センス、ＨＳ’／１の５２３３番で終わるヌクレオチド由来の）ＩＣＶ 部分タンパク質；制限酵素部位には下線が引いである） ５°ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＧＡＣＧＧＧ　ＡＣＧ　ＣＧ Ｇ　ＴＣＴ　ＧＣ３゜ＣＲＩ１１ ■シュ状（前述参照） １／５Ｎｒｃ７　（アンチセンス、ＨＳＶ　１の５８０４番で終わるヌクレオチ ド由来である） ５°ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＣＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＴ　３゜”Ｎ５ＩＥ゛ ｐ域の　幅用のプライマーＣＲＩ ム套主胆（センス、ＨＳＶＩの９５３番から始まるヌクレオチド由来のＨＣＶ部 分；制限酵素部位には下線が引いである）５“ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧ　Ｃ ＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＴＧ　３’１（センス、ＨＳＶ　１の １０８７番から始まるヌクレオチド由来のＨＣＶ部分；制限酵素部位には下線が 引いである）５’　ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡ ＣＴＧＧ　ＧＣ３゜Ｊｌｒｃ１２　（アンチセンス、ＨＳＶＩの１９９５番で終 わるヌクレオチド由来であるＨＣＶ部分；制限酵素部位には下線が引いである） ５°ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡ　ＣＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＧＡ　３ ゜Ｊ１ｒｃ１３　（アンチセンス、ＨＳＶＩの１９４１番で終わるヌクレオチド 由来であるＨＣＶ部分；制限酵素部位には下線が引いである）５’　ＣＴＴＡＧ ＡＡＴＴＣＣＧＴ　ＣＣＡ　ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＧＧＣＡＧＣＴＴＣ３゜ＣＲＩＩ Ｊｌ、ｒｃ１３（前記参照） チド由来；制限酵素部位には下線が引いである）チド由来；制限酵素部位には下 線が引いである）５゛ＴＧＡ　ＧＡＣＧＧＡ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ 　３゜来である） ５°　ＴＣＣＴＡＣＴＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＴＣ３’ＪＩＣ２００−３（７ンｆ センス、Ｉ（ＣＶＩの４４０２番で終わルヌクレオチド由来である） ５’　ＧＧＡ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＴＣＧ　ＡＣ３’Ｊｌｒｃ５２ 　（アンチセンス、ＨＣＶ　ｌの５８５３番で終わるヌクレオチド由来のＨＣＶ 部分：制限酵素部位には下線が引いである）５°　ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧ 　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＡ　ＧＧＣＡＧＴ　３’釘遣工坊（前記参照） ＣＲＩＩ ＪＩＣ２００−２（セフ　ス、ＨＣ’／１の３５５７番から始まるヌクレオチド 由来のｌ（ＣＭ部分；制限酵素部位には下線が引いである）ド由来のＨＣＶ部分 ；制限酵素部位には下線が引いである）５’　ＣＴＴＧＡＡＴＴＣ丁ＣＧ　ＡＡ Ｇ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＴＡＧ　ＣＣＧ　ＧＴＣＡＴＧ　３’■エユ昆（ 前記参照） Ｊ１ｒｃ５１　（アンチセンス、ＨＣＶ１の５８２６番で終わるヌクレオチド由 来のＨＣＶ部分；制限酵素部位には下線が引いである）５°ＣＴＴＡＧＡＡＴＴ ＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＧ　ＣＡＣ３’増幅されたＨＣＶ　ｃＤ ＮＡは、クローニングしないで直接に、および／またはクローニングして、配列 決定した。配列決定は、本質的には５ｈｙａＩＴｌａ１ａおよびＡｔｎｅｓ、　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７ユ：１６０２（１９８９）に記載されて いるように、アシンメトリツクＰＣＲ法ニよって行った。　この方法では、ｃＤ ＮＡの増幅は、１つの鎖の増幅が優先して行われるように、プライマーの１つの 濃度を制限（通常、約１＝５０の割合）して行う。次に、優先的に増幅された鎖 は、ジデオキシチェインターミネーション法によって配列決定される。
ＰＣＲ法によるアシンメトリツク配列決定に用いるプライマーを下記に示す。Ｎ Ｓ１領域用：　ＪＩＩＺ−１およびＪ１ｒｃ１３　（両方とも配列決定されてい る）　；　ＪＩＩＺ−２、Ｊ１ｒｃ１３　（両方の鎖で確認されている）。Ｃ２ Ｏ０−Ｃ１００のＮ末端領域、Ｃ２Ｏ０−Ｃ１００のＣ末端領域、および５−１ −１領域を含有するＮ５３−Ｎ５４領域用：　ＪＩＣ２００−２およびＪＩＣ２ ００−７（Ｃ２００−Ｃ１００のＮ末端領域に対する）およびＪＩＣ２００−４ およびＪＩＣ２００−５（Ｃ２００−Ｃ１００のＣ末端領域に対する）；および ５１１／３５Ａおよびｈｅｐ　４　（５−１−１領域に対する）。ＪＩＣ２００ −２、ＪＩＣ２００−４、および５１１／３５Ａの配列は、前記に示されている ；　ｈｅｐ４、ＪＩＣ２００−６、およびＪＩＣ２００−７の配列は、以下に示 す。
回ｚ１（ＨＣＶ　１の５４１５番から始まるヌクレオチド由来である）５’　Ｔ Ｔ　ＧＧＣＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＧＣＴＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　 ３゜ＪＩＣ２００−６（ＨＣＶＩの３８７５番から始まるヌクレオチド由来のＨ ＣＶ部分；制限酵素部位には下線が引いである）５’　ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧ Ｔ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＣＴＴ　３’ＪＩ Ｃ２００−７（ＨＣＶｌ）３９４６番から始まるヌクレオチド由来ノＨＣＶ部分 ；制限酵素部位には下線が引いである）５°ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＧ　ＧＣＡ 　ＴＣＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＣＡＣＴＣＧ　ＴＣ３’−ＮＳＩ”領域、Ｃ ２Ｏ０−Ｃ１００領域および５−１−１領域のアシンメトリツク配列決定によっ て得られた配列は、それぞれ図１５および図１６に示されている。図中、ｊ１配 列にコードされるアミノ酸は、Ｊｌのヌクレオチド配列の上に示されている。Ｊ １配列とＨＣＶＩのプロトタイプヌクレオチド配列との差は、Ｊｌ配列の下に示 されている（棒線は、両方の配列の相同なヌクレオチドを示している）。Ｉ（Ｃ ＶＩのプロトタイプ配列の異なるコードされるアミノ酸配列は、ＨＣＶ　ｔのヌ クレオチド配列の下に示されている。
ＮＳＩ領域、Ｃ２００−Ｃ１，ＯＯ領領域および５−１−１−領域のＩＣ’／　 ｃＤＮＡをクローン化した。推定ＮＳＩ領域の３００ｂｐおよび２３０ｂｐの断 片を、宿主ＨＢＩＯＩ中で、商業的に入手可能なベクターの誘導体ｐＧＥＭ−３ ７にクローン化して、そしてＡＷ−３００ｂｐとしてＡＴＣＣに寄託した。
誘導体ベクターは、元来のｐＯＥＭ−３７ポリリンカー、完全なＡｍｐｒ遺伝子 、およびＥ、　ｃｏｌｉでの複製に必要な遺伝子を維持している。ＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ断片は、Ｓａｃ　＋およびＸｂａ　Ｉで取り出し得る。Ｃ２００のＮ末端断 片？７Ｑｂｐを含有するＨＣＶ　ｃＤＮＡを、ＨＢＩＯ１テｐＭＩＥ１ｍクロー ン化して１２クローンをプールし、ＡＮ−７７０ｂｐ−ＮとしてＡＴＣＣニ寄託 した。ＨＣＶ　ｃＤＮＡは、ＨａｅｌＩによってベクターから取り出し得る。得 られたＨａｅｌｌ断片は、５°末端および３゛末端にそれぞれ３００ｂｐおよび ２５０ｂｐのベクターＤＮＡを含有する。また７ｏｏｂｐのＣ２００１７）　Ｃ 末端断片（ＡＮ−７００ｂｐ−Ｃ）を含有する［ｆＣＶ　ｃＤＮＡを、Ｍ１３ｍ ｐｌｏにクローン化して宿主ＤＨ５α−Ｆ°に維持した；クローニングはベクタ ーのポリリンカ一部位に行った。得られたファージをプールして、ＡＷ−７００ ｂｐ−ＮあるいはＡｗ−’ｙｏｏｂｐ−ｃとして１９９０年９月１１日にＡＴＣ Ｃに寄託した。［ｌ’Ｃ’／Ｌの５−１−１領域に等しいＪｌからのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡを、ｍｐ１９　Ｒ１部位にクローン化し、そしてＤＨ５α−Ｆ’中に維持 した。このクローニングからのいくつかのｍ１３フアージ上清をプールして、Ｊ ｌ　５−１−１としてＡＴＣＣに１９９０年９月１１日に寄託した。ＨＣＶ　ｃ ＤＮＡはファージをＥｃｏＲＩ処理して得られ得る。ＪＬ　５−１−１およびＡ Ｗ−７００ｂｐ−ＮあるいはＡＮ−７００ｂｐ−Ｃの受託番号は、ＡＴＣＣの（ ３０１）　８８１−２６００に電話で問い合わせれば得られる。
上記のクローン化されたものは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ ＴＣＣ）に寄託されている。
ヱ Ｊ１分離株の予想される”ＮＳＩ”領域の配列を含有するＨＣＶ　ｃＤＮＡライ ブラリーは、λ−ｇｔ２２に直接クローニングすることによって得られた。”Ｎ ＳＩ”領域は、ＨＣ’／ｌのプロトタイプ核酸配列の番号系の、ヌクレオチド約 １４６０番からヌクレオチドの約２７３０番にひろがっている。ここで、ヌクレ オチドの１番は、推定されるポリタンパク質の開始メチオニンコドンの最初のヌ クレオチドである。［ｌＣＶ　ｃＤＮＡの１番目および２番目の鎖の合成用のプ ライマーは、それぞれＪＨＣ６７およびＪＨＣ６８であって、ＲＮＡ源はＪ１血 漿であったこと以外は、クローニングは、本質的には、ＨａｎおよびＲｕｔｔｅ ｒのＧＥＮＥＴＩＣＥＮＧＴＮＥＥＲＩＮＧ、　Ｖａｔ　１０　（Ｊ、Ｋ。
５ｅｔｌｏｖ編、　Ｐｌｅｎｕｍ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　１９８８ ）に記載されている方法によってなされた。この方法では、ＲＮＡは低温におい てグアニジウムチオシアネートで抽出する。次に、全長のｃＤＮＡに変換し、こ れをλファージに、ｎ■プロモーターの特定の方向にクローン化する。この方法 によって、ＪＩ　ＲＮＡに対するＥＣＶ　ｃＤＮＡを、λ−ｇｔ２２のＮｏｔ１ 部位に挿入した。ライブラリー中に”ＮＳＩ”配列が存在することは、ＡｌＸ５ ４プローブを用いて検出した。
図１４に示されている領域と約２０ヌクレオチドが重なっている、この領域から 下流のｒＮｓｌＪ領域の配列は、ＰＣＲ増幅用のプライマーとしてＡｌＸ６１お よびＡｌｘ６２に変えて、上記のアシンメトリツク配列決定法によって決定した 。得られた配列は、図１７に示されている。（ＰＣＲ増幅は、ヌクレオチドの約 １９３０番からヌクレオチドの約２３４０番の領域であって、この領域は、図１ ５に示されている配列にも含まれることに注意。）λ−ｇｔ２２のＨＣＶ　ｃＤ ＮＡライブラリーを得るため、およびｒＮｓｌＪ領域の部分の配列を決定するた めに用いたプライマーおよびプローブの配列は、以下に示した。
ＪＨＣ６７ ５’　ＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧ　ＣＧＴ　３゜ ＪＨＣ６８ ５°　ＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＡＡＧＡ　ＣＴＧＣＴ　ＡＧＣＣＧ　ＡＧＧＴ 　３゜ＡＬＸ　６１ ５°　ＡＣＣＴＧ　ＣＣＡＣＴ　ＧＴＧＴＡ　ＧＴＧＧＴ　ＣＡＧＣＡ　ＧＴＡ ＡＣ３゜ＡＬＸ　６２ ５°　ＡＣＧＧＡ　ＣＧＴＣＴ　ＴＣＧＴＣＣＴＴＡＡＣＡＡＴＡ　ＣＣＡＧＧ 　３゜ＡＬＸ　５４ ５“　ＧＡＡＣＴ　ＴＴＧＣＧ　ＡＴＣＴＧ　ＧＡＡＧＡＣＡＧＧＧ　ＡＣＡＧ Ｇ　３’配列決定された領域由来のＪＩ　ＨＣＶ　ｃＤＮＡの４００ｂｐの断片 を、ｐＧＥＭ３　ｚにクローン化してＨＢＩＯＩに維持した。ＨＣＩ／　ｃＤＮ Ａｌま、５ａｃＩおよびＸｂａｌによってベクターから取り出し得る。ベクター （ＪＨ−４００ｂｐ）で形質転換された宿主細胞は、ＡＴＣＣＩこ寄託されてい る。
プールされたｃＤＮＡライブラリーは、Ｊ１血清力）らつくった。
プールされたライブラリーはＪ１ゲノムを全般にわたって含み、ＨＣＶ−Ｊｌ　 λ　ｇｔ２２として同定される。プールされたｃＤＮＡライブラリーは、１１個 の別々のｃＤＮＡライブラＩＪ−の一部をプールしてつくった。このライブラリ ーは、そのゲノムを全般（こわたって含んだＨＣ’／　ｃＤＮＡを得るため１こ 設計されたプライマーカ）らライブラリーをつくること以外番よ、上言己の直接 （ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｔ）クローニング法によって調製した。このプライマー （よ、ＨＣＶＩの配列由来であって、ＪＨＣ６７およびＪＨＣ６８を含んでいた 。ＨＣＶ　ｃＤＮＡを、λ−ｇｔ２２のＮｏｔ１部位に挿入した。プールされた ｃＤＮＡライブラリーＨＣＶ−Ｊ　ｌ　λ　ｇｔ２２は、ＡＴＣＣＩ；ｌ：寄託 されテイル。
亘 図１４に示されている配列の上流のポリヌクレオチドの領域の配列を決定した。
この領域は、■ＣＶ−１（図１２参照）のヌクレオチドの一２６７位から始まり 、５６０個のヌクレオチドに広がる。Ｊ１血清から抽出したＲＮＡからＨＣｖｃ ＤＮＡを調製し、そしてＰＣＲ法によってｔ（ＣＭ　ｃＤＮＡを増幅して配列決 定がなされた。
ＲＮＡは、プライマーカにおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理した 後、血清１００μｌから抽出した。試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、 ＲＮＡをエタノールで沈澱させた。
Ｊ１分離株由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡを、沈澱させたＲＮＡを０．ＯＩＭのＭｅＨ ｇｏｌ（で変性させて調製した１１０分間室温で放置した後、２−メルカプトエ タノールを水銀イオンを離すために５ｅｑｕｅｓｔｅｒに加えた。直ちに、ｃＤ ＮＡ合成の第一番目の鎖側の混合物を加えて、３７℃で１時間インキュベートを 続けた。アンチセンス鎖の合成の条件を、以下に示した：　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　ＨＣＩ、ｐＨ１！、３．７５ｎ＋ＭＫＣＩ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジ チオスレイトール、５００μＭの各々のデオキシヌクレオチド３リン酸、　２５ ０ｐｍｏｌの特定のアンチセンスｃＤＮＡプライマー　ｒ２５．２５０ユニツト のＭＭＬＶ逆転写酵素。第２の鎖（センス）を合成するために、合成反応成分を 加えて１４°Ｃで１時間インキュベートした。第２の鎖の反応成分を以下に示し た：　１４ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ５ｐＨ８，３，６８ｍＭ　ＫＣＩ、　７．５ ｍＭ硫酸アンモニウム、３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２．８ｍＭジチオスレイトー ル、２５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩおよびｌユニットのＲＮアーゼＨ０反 応は、試料を９５°Ｃで１０分間加熱して停止した。その後、氷上で冷却した。
ＨＣＶ　ｃＤＮＡをＰＣＲを２回行って増幅した。１回目は、２０μｌのｃＤＮ Ａ混合物を用いて行った。ＰＣＲ反応条件を以下に示した＝１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　ＨＣＩ、ｐＦＩ８．３．５０ｍＭ　）ＦＣＩ、　１．５１１１Ｍ　ＭｇＣｌ２ ．０．００２％ゼラチン、各々のデオキシヌクレオチド３リン酸２００ｍＭ　、 および２．５ユニツトのＡｍｐｌｉｔａｑｏＰＣＲの温度サイクルは、以下に示 すとおりであった：９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分間、４０回繰り返 した後、７２℃７分間。ＰＣＨの第２回目は、ＰＣＲ産物の特異性を増すために 、組み合わされたプライマー（すなわち、ＰＣＲ増幅の第１回目の産物の内部領 域に結合されたプライマー）を用いて行われた。第１回目のＰＣＲ反応物の１パ ーセントを、プライマーを取り替え、そしてＰＣＲ反応の第２工程を、５０℃を ６０℃に変えて行った以外は、本質的には第１回目のように増幅した。ＰＣＨの 第１回目に用いたプライマーは、ＡＬＸ９０およびｒ１４であった。ＰＣＲの第 ２回目に用いたプライマーは、ｒ１４およびｐ１４であった。
ＨＣＶ　ｃＤＮＡの合成用およびＰＣＲ法用のプライマーの配列を以下に示した ： ５°　ＡＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＴＧ　ＣＧＣＧＡＣＣＴＡ　３′ＬＸ９ ０ ５’　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧ　ＴＧＡＧＧＡ　ＡＣＴＡ　 ３’５°　ＧＧＧ　ＣＣＣＣＣＡＧ　ＣＴＡ　ＧＧＣＣＧＡ　ＧＡ　３’５°　 ＡＡＣ丁ＡＣＴＧＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＧＣ３’ＰＣＲ産物を ゲル精製し、約６１５ｂｐの位置に移動したものを単離し、そして標識に３２Ｐ −ＡＴＰを用いて、　Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法の 変法によって配列決定した。この変法では、配列の複製はプライマーとしてＰ３ ２およびＲ３１を用いて開始した；２本鎖のＤＮＡを複製の前に、３分間９５° Ｃで分離し、標識されたジデオキシによって停止するポリヌクレオチドの合成は 、業者の指針に従って、Ｂｓｔポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐより入手 した）で触媒した。配列決定は、シーケンシング反応当りＰＣＲ産物５００ｎｇ から１μｇを用いて行った。
プライマーＰ３２　（センス）およびＲ３１（アンチセンス）は、それぞれに、 ＨＣＶ　１配列のヌクレオチド−１３７から−１１５およびヌクレオチド１９２ から１７３由来であった。プライマーの配列を以５’　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＴＣＡ ＡＴ　ＧＣＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＴＴ　３’Ｒ３１プライマー ５’　ＧＧＣＣＧＸ　ＣＧＡ　ＧＣＣＴＴＧ　ＧＧＧ　ＡＴ　３’ここでＸ＝Ａ あるいはＧ ５゛非畦訳領域および推定「コア」領域の一部を含むＪ１分離株中の領域の配列 は、図１８に示す。図中、Ｊ１配列中にコードされるアミノ酸はヌクレオチド配 列の上に示している。プロトタイプＨＣＶＩの配列は、Ｊ１配列の下に示してい る。棒線は、Ｊｌと相同な配列を示す。ＨＣＶ　Ｌ配列中にコードされる異なる アミノ酸は、ＨＣＶＩ配列の下に示されている。
上記の６００ｂｐ　（ＴＣ６００ｂｐ）のＪ１配列を代表するＨＣＶ　ｃＤＮＡ 断片を、ｐＧＥＭ３Ｚにクローン化して、宿主ＨＢＩＯＩに維持した。ＨＣＶ　 ｃＤＮＡ断片はＳａｃ　＋およびＸｂａｌで取り出し得る。これは、ＡＴＣＣに 寄託されている。
ブダペスト条約に基づいてＰａｔｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｄｅｐ ｏｓｉｔｏｒｙに寄託されているもの。
も丘惣　受ＥＪＬ！＝　寄ｒｔ旦 Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５／ｐｓ１．−８７９１ａ　ＢＰ−２５９３９／１５／１ ９８９（このクローンは、ＪｌのＨＳ５ドメインの４２７ｂｐを含有する）Ｅ、 　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＵ１−１２１６ｃ　ＢＰ−２５９４９／１５／１９ ８９（このクローンは、ＪｌのＥ／ＮＳＩドメインの３５１ｂｐを含有する）Ｅ 、　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＵ１−４６５２ｄ　ＢＰ−２５９５９／１５／１ ９８９（このクローンは、ＪｌのＮＳ３ドメインの５８３ｂｐを含有する）Ｅ、 　ｃｏｄｉ　ＤＨ５α／ｐｓｉ−７１３ｃ　ＢＰ−２６３７１１／１／１９８９ （このクローンは、ＪｌのＥドメインの５ａｏｂｐを含有する）Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ＤＨ５α／ｐＳ？−２８ｃ　ＢＰ−２６３８１１／ｌ／１９８９（このクロー ンは、ｊ７のＣ／Ｅドメインの５ｓ２ｂｐを含有する）Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＨ５ α／ｐｓｌ−１５１９ＢＰ３０８１　８／３０／９０実施例に記載されている以 下のベクターはアメリカンタイプカルチャーコレクン−ｚン（ＡＴＣＣ）　、１ ２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａ ｎｄ　２０８５２に寄託されていて、以下の受託番号が付けられた。寄託物はブ ダペスト条約に基づいている。
ＡＷ−３００ｂｐ （Ｅ、　ｃｏｌｉ　）ＩＢＬＯＩ／ｐＧＥＭ３Ｚ）　６８３９２　９／１１／９ ０ＡＷ−７７０ｂｐ−Ｎ （Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ／ｐＭＩＥ）　６８３９５　９／１１／９０ＡＷ −７００ｂｐ−ＣあるいはＡＶ−７００ｂｐ−Ｎ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α− Ｆ■Ｍ１３ｍｐｌＯ）これらの寄託物は当業者の利用に提供される。これらの寄 託物は、これらの寄託物が本発明を実施するために必要であることを認めるもの でもなければ、本発明の開示に関する同等の実施態様が当業者の範囲内に属さな いことを認めるものでもない。これらの寄託物の公衆への入手可能性は、本特許 および他の特許のもとに、寄託物の製造、使用、あるいは販売のライセンスを与 えるものではない。寄託物の塩基配列は、本発明の開示に引例として引用され、 本発明に記載された全ての配列に関して争いを生じた場合にこれを規制する。
本発明が、当該分野の当業者のために特定の実施例によって記述したが、本発明 の範囲はこれに制限されない。なぜならば、本発明°の開示からさらに別の実施 態様が、当業者には明らかだからである。
Ｊ７　３７　ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣ ＧＧＧＡＧＧＭａｔ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ 、ｒ７　７３　ＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡ　 入ＡＴＧ 一一一　人ｒｇ Ｌｅｕ　−一− ＦＩＧ、　１−１ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕｌ ｌｏ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＴ’ＥＣＣＴＣＴＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧＳ ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ ５６９　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＧＣＡＦＩＧ、　２−３ 相違 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ、 ７１　：Ｌ６　ＧＣＡ　ＧＣＣＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＣＡに　ＴＴ Ａ　ＣＴＣ入 ＦＩＧ、　３−１ Ｓｅｒ　Ｌｅｕ ｑ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ Ｊｌ　３４０　ＣＴＴ　ＧＣＣＧＣＧ　ＣＴＧＦＩＧ、　３−２ Ｓｅｒ 、７１　５９　ＡｃＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＡＣＣＧＴ ＧＡｌａ １ａ Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＨｉｓＪ ｌ　５４５　ＧＴＣＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡ　ＣＡ ＣＰｒｏ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ Ｊｌ　５７２　ＣＣＴ　ＡＴＡ、ＡＣＣＡＡＡＦＩＧ、　４−３ Ｌａｕ　Ｔｈｒ Ｔ 、ｆ７　１　ＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＭＡＧＧＣＣＴＴ ＧＴＧＧＴＣＶＩ Ｊ７　３７　ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣ ＧＧＧＡＧＧＣＶＩ Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ Ｊ７　７３　ＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡ　Ａ ＡＴＨＣＶＩ　ＣＧ １（ＣＶＩ　Ｔ　Ａ　Ａ ＨＣＶＩ　Ｔ　ＣＴ ＨＣＶＩ ＨＣＶＩ　Ｔ　Ａ　ＣＧ ＨＣＶＩ　Ａ ＦＩＧ、　６−１ ＨＣＶＩ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ ＨＣＶＩ　Ｔ ＨＣＶＩ　ＧＣＧ ＨＣＶＩ　Ｔ　Ｔ ＦＩＧ、　６−２ ＨＣＶＩ　Ａ　Ｃ ＨＣＶＩ　ＴＣＴ　Ａ ＨＣＶＩ　Ｇ　Ｃ ＲＧ、　６−３ Ａ　ＴＣＴ　Ａ ＣＣＴ　Ｔ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＪ ｌ　１１０　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴ ＧＴ　ＣＴＧＧ　ＣＧ　Ｃ ａｌ ＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＴ Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ ☆☆☆　☆☆☆ ＣＣＴＴＣＴ Ｐｒ。
ＦｊＧ、　７−１ Ｇ　Ｔ　ＣＣＴ ＣＣＣＣＡＴＧ　Ｃ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｔ　Ｔ　ＧＧ　ＣＧ　Ｇ ＡＧＴ　ＧＡＧＣＴ ｅｔ ＧＧＣＡ　ＧＧＡＡＣ ＧＧ　ＣＡＧＣＴ　Ｔ　Ａ　Ｔ Ａｌａ　Ｇｌｎ　工１ｅ ＣＴＣＧＣＣＡＣＣＴ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ ＦＩＧ、　７−２ Ｇ　ＣＣＣＣＡ ｅｕ Ｇ　ＣＴＴＧＧＧＡ Ｔ　ＣＡＧ　ＣＣＴＧ ＧＡＣＧＡＧＴ　Ｔ　Ｔ ＴＡ　ＡＧ　Ｔ　Ｃ 工ｌｅ　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ Ｊｌ　５ｇ９　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＧＣＡＴＡＧ ｈｒ ＨＣＶＩ　ＣＴ、　ＡＧ Ｔｈｒ Ｍｅｔ　Ａｌａ ＨＣＶ：Ｌ　ＣＡ　Ｔ　ＡＣ 工ｌｅ　Ｌｅｕ　工１ｅ ＨＣＶＩ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｇ ＨＣＶＩ　ＡＡ　Ｇ　Ｔ　ＴＣ 工１ｅ　Ｐｈｅ ＨＣＶＩ　Ｇ　ＣＣＧＡＣ Ｖａｌ　Ｌｅｕ ＨＣＶＩ　ＧＡ　ＣＣＧＡ Ａｌａ　Ｇｌｕ ）ＩＣＶＩ　Ａ　ＣＣＡＡにＴＧＣＣ Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＨ ＣＶＩ　Ｇ　Ａ　ＣＣ 工１ｅ ＨＣＶＩ　ＣＣＴＣＧ Ｌｅｕ　５ｅｒ Ａｓｎ　Ｔｒｐ Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ Ｊｌ　３４３　ＧＣＣＧＣＧ　ＣＴＧ ＨＣＶＩ　ＡＧＴ １ｙ ＦＩＧ、　８−２ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　工１ｅ ＦＩＧ、　９−１ ＨＣＶＩＬ　ＣＣＡ ｅｔ ＦＩＧ、　９−２ ＨＣＶＩ　ｔａｃａｔｃａｔｇａｃａｔｇｃａｔｇｔｃＦＩＧ、　９−３ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ Ｊｌ　Ｉ　ＣＣＴＣＡＣＣ ＣＶＩ ＨＣＶＩ　Ｔ　ＡＡＣＣＡＡ ｈｒ ＨＣＶＩ　Ａ ＨＣＶＩ　Ｔ　Ａ ＨＣＶＩ　Ｔ　ＣＡＣＧ ｈｅ ＨＣＶＩ　Ａ　ＣＴ　Ｔ ｓｅｒ　工ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ、 ７１　１４：３　ＴＣＣＡＴＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＡ 　ＣＴＴＨＣＶＩ　ＡＧＧ　Ａ　ＡＧＣＧ ＨＣＶＩ　ＣＧ　ＣＣＧ　Ｇ Ｇｌｎ　Ｇｌｕ ＨＣＶＩ　ＣＡ　Ａ ＨＣＶＩ　Ｔ　ＣＡ　ＣＡ Ｐｒｏ　Ｇｉｎ ）（ＣＶＩ　ＣＣＣ ＨＣＶＩ　Ａ　Ｔ ）（ＣＶＩ　ＣＧ　Ａ　Ａ １ａ ＨＣＶ：Ｌ　Ｇ　ＣＴ　Ｃ １ａ ＨＣＶＩ　ＣＧＣＣＴ Ａｒｇ ＨＣＶＩ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＴＡ ＦＩＧ、　１０−２ ＨＣＶ−１ ＴＧＧ ＴＡＣＴＣＧ　ＴＧＣＴＴＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴ 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Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. １．グループＪ１およびＪ７から選択される分離株に実質的に相同であるＨＣＶ 分離株の少なくとも１５ｂｐのヌクレオチド配列を含有し、該ヌクレオチド配列 がＨＣＶ分離株ＨＣＶ１のヌクレオチド配列とは異なる、ＤＮＡ分子。
  2. ２．ＨＣＶ分離株Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列をコードする少なくとも１５ ｂｐのヌクレオチド配列を含有し、該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列がＨＣＶ 分離株ＢＣＶ１のアミノ酸配列とは異なる、ＤＮＡ分子。
  3. ３．前記Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列が実質的に完全なウイルスポリペプチ ドである、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  4. ４．前記Ｊ７のアミノ酸配列が、アミノ酸１位からアミノ酸１１５位である、請 求項２に記載のＤＮＡ分子。
  5. ５．前記Ｊ１ｋのアミノ酸配列が、アミノ酸１１６位からアミノ酸３５０位であ る、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  6. ６．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸３５１位からアミノ酸６５１位である 、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  7. ７．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸１００７位からアミノ酸１６５０位で ある、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  8. ８．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸２１００位からコード配列の最後まで である、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  9. ９．Ｊ１およびＪ７からなるグループから選択される分離株に実質的に相同であ るＨＣＶ分離株のアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が、ＨＣＶ分離株ＨＣ Ｖ１によってコードされるポリペプチドの配列とは異なる、精製ポリペプチド。
  10. １０．前記Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列が、どのようなＨＣＶ１のエビトー プとも免疫学的に交差反応をしないエビトープを含有する、請求項９に記載の精 製ポリペプチド。
  11. １１．前記Ｊ７のアミノ酸配列が、アミノ酸１位からアミノ酸１１５位である、 請求項９に記載の精製ポリペプチド。
  12. １２．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸１１６位からアミノ酸３５０位であ る、請求項９に記載の精製ポリペプチド。
  13. １３．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸３５１位からアミノ酸６５１位であ る、請求項９に記載の精製ポリペプチド。
  14. １４．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸１００７位からアミノ酸１５５０位 である、請求項９に記載の精製ポリペプチド。
  15. １５．前記１１のアミノ酸配列が、アミノ酸２１００位からコード配列の最後ま でである、請求項９に記載の精製ポリペプチド。
  16. １６．Ｊ１およびＪ７からなる群から選択されるＨＣＶ分離株のアミノ酸配列を 含有するポリペプチドであって、該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列がＨＣＶ分 離株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なり、そして該ポリペプチドが固体支持体に 固定されている、ポリペプチド。
  17. １７．テスト試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するための、イムノアッセイで あって； （ａ）Ｊ１およびＪ７からなる群から選択されるＨＣＶ分離株のアミ／酸配列を 含有する抗原ポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体を形成させる条件下で、 該テスト試料をインキュべートする工程であって、該アミノ酸配列がＨＣＶ分離 株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なり、および（ｂ）該Ｊ１あるいはＪ７のアミ ノ酸配列はＨＣＶ１とは免疫学的に交差反応しない、工程；そして、（ｂ）該抗 原ポリペプチドを含有する抗原−抗体複合体を検出する工程；を包含する、イム ノアッセイ。
  18. １８．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸１１６位からアミノ酸３５０位、ア ミノ酸１３５１位からアミノ酸５５１位、アミノ酸１００７位からアミノ酸１６ ５０位、およびアミノ酸２１００位からコード配列（の最後）までのアミノ酸配 列からなる群から選択されるウイルスドメイン由来である、請求項１７に記載の イムノアッセイ。
  19. １９．前記Ｊ１のアミノ酸配列がアミノ酸１位からアミノ酸１１５位である、請 求項１７に記載のイムノアッセイ。
  20. ２０．前記テスト試料がヒトの血液あるいはその画分である、請求項１７に記載 のイムノアッセイ。
  21. ２１．ＨＣＶのエビトープに結合する抗ＨＣＶ抗体を含有し、実質的にＨＣＶの エビトープに結合しない抗体を含まない組成物であって；ここで、 （ａ）該ＨＣＶのエビトープがＪ１およびＪ７からなる群から選択されるＨＣＶ 分離株のアミノ酸配列を含有し；（ｂ）該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列が、 ＨＣＶ分離株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なり；そして （ｃ）該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列が、ＨＣＶ１と免疫学的に交差反応し ない、組成物。
  22. ２２．前記抗ＨＣＶ抗体がポリクローナルである、請求項２１に記載の組成物。
  23. ２３．前記抗ＨＣＶ抗体がモノクローナルである、請求項２１に記載の組成物。
  24. ２４．テスト試料中のＨＣＶポリペプチドの存在を検出するためのイムノアッセ イであって； （ａ）ＨＣＶのエビトープに結合する抗ＨＣＶ抗体とともに、抗原−抗体複合体 を形成する条件下で、該テスト試料をインキュべートする工程であって；ここで 、 （ｉ）該ＨＣＶエビトープがＪ１およびＪ７からなる群より選択されるＨＣＶ分 離株のアミノ酸配列を含有し；（ｎ）該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列がＨＣ Ｖ分離株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なり；そして （ｉｉｉ）該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配列が免疫学的にＨＣＶ１と交差反応 しない、工程；および（ｂ）該抗ＨＣＶ抗体を含有する抗原−抗体複合体を検出 する工程；を包含する、イムノアッセイ。
  25. ２５．前記Ｊ１のアミノ酸配列が、アミノ酸１１６位からアミノ酸３５０位、ア ミノ酸３５１位からアミノ酸６５１位、アミノ酸１００７位からアミノ酸１６５ ０位、およびアミノ酸２１００位からコード配列の最後までのアミノ酸配列から なる群から選択されるウイルスドメイン由来である、請求項２４に記載のイムノ アッセイ。
  26. ２６．前記Ｊ７のアミノ酸配列がアミノ酸１位からアミノ酸１１５位である、請 求項２４に記載のイムノアッセイ。
  27. ２７．Ｊ１およびＪ７からなる群から選択されるＨＣＶ分離株のアミノ酸配列を 含有するポリペプチドを哺乳動物に投与することを包含し、ここで該Ｊ１あるい はＪ７のアミノ酸配列はＨＣＶ分離株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なり、そし てこのことにより該哺乳動物が抗ＨＣＶ抗体を産生することを包含する、抗ＨＣ Ｖ抗体を生産する方法。
  28. ２８．テスト試料中のＨＣＶポリヌクレオチドを検出する方法であって； （ａ）請求項１に記載のＤＮＡ分子を含有するプローブを提供する工程； （ｂ）該プローブとその相補体間のポリヌクレオチド２重鎖を形成させ、該テス ト試料に存在する非ＨＣＶポリヌクレオチド配列と該プローブとの実質的なポリ ヌクレオチドの２重鎖の形成がない条件下で、該テスト試料と該プローブとを接 触させる工程；および （ｃ）該プローブを含有するいかなるポリヌクレオチド２重領をも検出する工程 ；を包含する、方法。
  29. ２９．ＨＣＶのアミノ酸配列を含有する組換えポリペプチドを生産する方法であ って； （ａ）Ｊ１およびＪ７を含有する群から選択されるＨＣＶ分離株のアミノ酸配列 をコードするコード配列に作動可能に結合された宿主細胞のコード配列に作動可 能に結合された宿主細胞の制御配列を含有するＤＮＡ構築物によって、形質転換 された宿主を提供する工程であって、ここで、該Ｊ１あるいはＪ７のアミノ酸配 列はＨＣＶ分離株ＨＣＶ１のアミノ酸配列とは異なる、工程；（ｂ）核コード配 列が組換えポリペプチドに転写および翻訳される条件下で該宿主細胞を増殖させ る工程；および（ｃ）該組換えポリペプチドを回収する工程；を包含する、方法 。
  30. ３０．受託番号ＢＰ−２５９３、ＢＰ−２５９４、ＢＰ−２５９５、ＢＰ−２６ ３７、ＢＰ−２６３８、ＢＰ−３０８１、ＡＴＣＣ　ＮＯ．６８３９２、ＡＴＣ Ｃ　ＮＯ．６８３９３、ＡＴＣＣ　ＮＯ．６８３９４、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．６８３ ９５およびＡＴＣＣ　ＮＯ．４０８８８４で寄託されている材料からなる群由来 の生物学的材料。
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