KR970007024B1 - 숙주 균주로서의 클루이베로마이세스 - Google Patents

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제이. 제이. 반 오이이엔 알버트
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기스트 브로카데스 나암로제 베노오트하프
안스 월터 라벤
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Abstract

내용없음

Description

숙주 균주로서의 클루이베로마이세스
제1도는 플라스미드 pGBTe418의 도면이다.
제2도는 플라스미드 pGB901의 도면이다.
제3도는 아밀로글루코시다제 신호 서열로부터 채택된 신호서열에 대한 합성된 올리고뉴클레오티드의 설명도이다.
제4도는 합성 신호 서열의 설명도이다.
제5도는 클루이베로마이세스 락티스에 의한 프로키모신의 분비를 보여주는 면역 블롯도이다.
제6도는 맥주 효모균의 α-인자의 펩티드와 프로키모신과 전사 조절 영역의 융합펩티드를 포함하는 pDMl00PC로 부터의 완전한 BamHI삽입의 서열도이다.
제 7 도는 플라스미드 pKS 105의 제한지도이다.
제8도는 클루이베로마이세스 락티스 α-인자 DNA를 확인하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드프로브를 고안하기 위해 사용된 스트래티지를 도시한다.
제9도는 클루이베로마이세스 락티스 α-인자를 코드화하는 DNA단편의 완전한 서열도이다.
제10도는 α-인자 신호서열과 프로키모신 구조 유전자의 융합의 발현에 대해 사용된 플라스미드의 설명도이다.
제11도는 α-인자/프로키모신 융합에서 결합부분 주위의 서열을 도시한다.
제12도는 pAB309의 BamHI/SalI삽입의 서열도이다.
제13도는 클루이베로마이세스 락티스 α-인자 리더 DNA의 돌연변이 생성에 대한 프라이머의 서열을 도시한다.
제14도는 플라스미드 pUCG418의 도면이다.
제15도는 플라스미드 pGBtPA1의 도면이다.
제16도는 플라스미노겐/피브린-아가로스 겔로 도포된 SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 분석되는 바 클루이베로마이세스락티스에 의한 사람 t-PA의 분비를 도시한다.
제17도는 플라스미드 pGBtPA2의 도면이다.
제18도는 플라스미드 pGBHSA3의 도면이다.
제19도는 10%폴리아크릴 아미드 겔상에서 분석되는 바 클루이베로마이세스 락티스에 의한 HSA의 분비를 도시한다.
본 발명은 바람직하기는 성장배지속으로 분비되는 관심하의 폴리펩티드를 제조하기 위해 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)를 제조 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 클루이베로마이세스 중에서 키모신 및 그의 전구체, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA) 및 인간 혈청 알부민(HSA)를 제조하는 데 유용한 서열들에 의해 예시될 것이다.
미생물중에서 펩티드를 제조한다는 밝은 전망이 많은 인자에 의해 흐려져 왔다.
많은 경우 즉 펩티드가 만들어져 원형질내에 보유되는 경우, 봉입체가 생겨 단백질의 변성 및 재생(renaturation)을 필요로 했는데 가끔 단지 부분적으로 성공하거나 거의 성공하지 못했다.
다른 경우에는, 펩티드가 상당한 분해를 받아 수율이 낮을뿐 아니라 분리하기 어려운 복잡한 혼합물이 얻어졌다.
이런 곤란성들의 가능한 해결책으로서, 소망하는 펩티드가 영양배지내에 분비되게 하는 가능성이 연구되었다.
이 분비는 제한된 성공밖에 거두지 못했는데 그 이유는 모든 단백질이 사용된 숙주내에 분비할 수 있는 것은 아님이 발견되었기 때문이다.
분비되었을때도, 펩티드를 처리하면 얻어지는 물질은 소망하는 펩티드의 조성 및 또는 구조와 상이했다.
즉, 따라서 시험관내 및 생체내 여러 다양한 환경하에서 펩티드의 사용을 허용하는 조건하에서 효율적이고 경제적인 활성 펩티드를 제조하는 시스템을 개발할 수 있느냐 하는데에 큰 관심이 쏠리고 있다.
유럽 특허출원(EPA) 0096430은 외래 유전자의 클로닝과 발현을 위한 숙주로서의 클루이베로마이세스를 기재하고 있다. 그러나, 단백질을 성장배지중으로 분비하는 가능성에 대한 언급은 하고 있지 않다.
아스페르길루스(Aspergilus)에 대한 아밀로글루코시다제의 리더서열은 문헌에 기재되어 있다(Boyle et al., EMBO J.(1984) 3 : 1581-1585 및 Innis et al., Science (1985) 228 : 21-26).
락타제 프로모터는 브루니히(Bruenig et al., Nucleic Acids Res.(1984) 12 : 2327-2341)에 의해 기술되었다.
이종단백질의 분비를 사카로마이세스(Saccharomyces)쥐ㅇ에 유도하기 위한, 교배 형 α-인자와 관련된 신호펩티드의 사용과 전화효소와 산포스파타제를 사용하는 것에 대해서는 다른 문헌(EP-A-0123544 및 Smith et al., Science(1985) 229 : 1219)에 기재되어 있다.
사카로마이세스중에서 프리프로키모신, 프로키모신 및 키모신을 제조하는 것은 멜로등(Mellor et al., Gene(1983) 24 : 1-14)에 의해 연구되었다.
프로키모신이 사카로마이세스중에서 세포내적으로 만들어질때는 단지 얻어진 작은 퍼센트의 프로키모신이 활성 가능하다.
여기에 관해서는 문헌(Moir et al., in Developments in Industrial Biology(1985) 26 : 75-85; Mellor et al., Gene(1983) 24 : 1-14; Kingsman et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews Vol. 3(1985)386-418)을 참고하라.
사카로마이세스에 의해 만들어진 응집된 프로키모신은 프로키모신을 용해하기 위한 복잡한 변성 및 재생법을 필요로 했다(W083/04418 및 EP-A-0114506).
클루이베로마이세스 숙주균주, 클루이베로마이세스에 사용되기 위한 효율적인 전사 개시 및 종결영역을 포함하는 발현 카세트 및 조절영역의 전사 및 번역 조절하에 선택적으로 분비를 위한 신호서열을 포함하는 유전자로 되어있는 본 발명의 펩티드 제조시스템이 제공된다.
카세트는 얻어지는 형질전환체가 발현 카세트를 안정되게 유지시킬 수 있는 조건하에서 클루이베로 마이세스 숙주 균주내에 도입된다.
자연적으로 만들어지는 DNA 및 합성유전자가 관심의 펩티드를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 클루이베로마이세스 효모세포에 의하여 폴리펩티드의 효과적이며 경제적인 생산을 허용하는 발현 카세트가 제공된다.
발현 카세트는 클루이베로마이세스 숙주세포내에서 기능적인 전사 및 번역 조절서열 기능과 조절영역의 전사 및 번역제어하에 관심의 펩티드를 코드하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 지닌다.
오픈 리딩 프레임은 또한 폴리펩티드의 분비를 성장배지에 제공하는 클루이베로마이세스에 의하여 인지되는 리더서열을 포함할 수 있다.
사용되는 클루이베로마이세스 세포는 실험적 또는 산업적 균주의 어느 하나일 수 있다.
발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향에 전사 및 번역개시조절영역, 관심의 펩티드를 코드화하는 오픈리딩프레임을 포하할 것이며 클루이베로마이세스에 의하여 인지되는 분비를 위한 신호서열과 번역 종결 영역을 지닌 것이 바람직하다.
발현 카세트는 더 나아가 전사종결 조절영역을 포함할 것이다.
개시 및 종결 조절 영역은 클루이베로마이세스내에서 기능적이며 클루이베로마이세스 숙주의 생존력 및 번식에 바람직하지 않은 효과를 주지않고 관심의 펩티드의 효과적인 발현을 제공한다.
전사 및 번역개시 조절 영역은 클루이베로마이세스에 동종 또는 이종일 수 있다.
클루이베로마이세스 또는 사카로마이세스(예를들면 세레비시에(cerevisiad), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 캔디다(Candida) 등)과 같은 다른 효모종 또는 필라멘트형 진균(아스페르길루스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium) 등)과 같은 여타의 진균에 존재하는 유전자의 전사 개시 영역이 특히 흥미롭다.
전사개시조절영역은 알코올 데히드로게나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 포스포 글루코이소메라제, 포스포글리세레이트 키나제등의 해당계내의 유전자 또는 산 포스파타제, 락타제, 글루코아밀라제등과 같은 조절가능한 유전자로부터 수득 가능하다.
다수의 조절 서열중 어떤 것이라도 본질적인 또는 유도된 전사중 어느것이 바람직한가에 다른 특정상황, 관심의 오픈 리딩 프레임과 결합된 프로모터의 특정효과, 유도 가능한 전사를 허용하는 타 프로모터로부터의 조절 영역과 강력한 프로모터를 결합하는 능력, 제조의 용이성등에 따라 채택될 수 있다.
이러한 조절 영역은 문헌에 많은 선례가 있다.예를들어 본문에 참조로 써있는 EP-A-0164566이 있다.
유전적으로 변형된 미생물내의 이종 단백질의 분비는 일반적으로 두방법중 한가지에 의해 수행된다.
하나는 리더 서열이 단백질과 동종인 경우이고 다른 하나는 리더서열이 숙주 섕물과 동종인 경우이다.
클루이베로마이세스내의 이종 단백질 분비를 위한 본 발명에서 특히 흥미있는 것은 클루이베로마이세스 및 관심의 펩티드에 이종인 리더서열 또는 특별히 고안된 합성 리더서열의 사용이다.
전의 리더 서열을 코드화하는 DNA는 단리에 의하여 또는 합성으로 수득할 수 있다.
그러므로 오픈 리딩 프레임은 일반적으로 신호서열이 정상적으로 코드서열의 나머지와 연결된 야생형 또는 변이된 유전자, 신호서열이 정상적으로 오픈 리딩 프레임의 잔유부분과 연결되지 않은 하이브리드 또는 키메릭 오픈 리딩프레임, 또는 신호서열 및 오픈 리닝 프레임의 나머지가 바람직한 코돈, 편리한 제한부위, 신규 아미노산서열 등 또는 그의 조합을 제공하도록 합성된 합성서열을 포함할 것이다.
사용가능한 신호 서열은 α-인자, 전화효소, 아밀로글루코시다제 또는 구조유전자에 존재하는 천연 또는 야생형 신호 서열과 같은 유전자로부터 얻어지며 클루이베로마이세스, 사카로마이세스, 타진균(뉴로스포라, 아스페르길루스와 같은) 및 다른 진핵생물에 의하여 인지된다.
세포주변 공간보다는 오히려 영양배지내로 훙미있는 펩티드의 분비를 제공하는 신호서열을 사용하는 것이 특히 흥미있다.
일반적으로 신호서열은 오픈 리딩프레임의 5'-말단이다. 그러나, 어떤 경우에는 그것이 오픈 리딩 프레임에 내부신호 서열을 지니는 것이 바람직할 수 있다.
분비를 위하여 내부 신호 서열을 이용한 것은 미국 특허 제4,338,397호 및 페라라 및 링가파의 문헌(J. Cell Biology(1985) 101: 2292-2301)에 나와있다.
관심의 오픈 리딩 프레임을 삽입할 수 있는 유전자는 해당계의 효소를 코드화하는 유전자등의 고도로 발현된 본질적인 유전자 또는 락타아제, 아밀로글루코시다제등과 같은 고도로 발현된 조절가능한 유전자를 포함한다.
최적의 유전자 발현을 위하여 번역개시 코돈 ATG를 둘러싸고 있는 뉴클레오티드 서열이 효모세포 및 동물세포에서 중요함은 기지의 사실이다.
예를들어 엠. 코작의 문헌(Microbiol. Revs.(1983) 47 : 1-45)은 COS세포내의 인슐린 발현에 대한 이들 영역의 효과를 광범위하게 연구하였다.
유사히 고도로 발현된 효모단백질 내에서 특정 뉴클레오티드가 이러한 유전자의 발현 수준에 대한 이러한 뉴클레오티드의 주요 효과를 나타내는 다른것들보다 빈번히 발견되었다.
외인성 유전자의 최적 유전자 발현을 위하여 개시코돈 ATG를 둘러싸는 뉴클레오티드 서열을 변경하는 것이 중요할 것이다.
이것은 특징부위 돌연변이 생성에 의하여 또는 프레임내의 외인성 유전자를 내인성 클루이베로마이세스 유전자와 융합시켜 실행되며 락타제 유전자와 같이 고도로 발현될 유전자가 바람직하다.
일반적으로 어느것으로도 사용가능하지만 분비과정후 보다는 분비과정중에 신호리더를 관심의 펩티드로부터 분리시키는 것이 보다 바람직하다.
통상 사용된 프로세싱신호는 신호서열에 천연으로 있는 프로세싱신호 또는 천연존재 신호로부터 수정된 프로세싱신호일 것이고, 이 신호는 신호펩티드의 가수분해적 절단과 관심하의 펩티드로부터 신호펩티드를 프로세스하는 결과를 유발하는 펩티드신호를 제공하기에 여전히 효과적이다.
α-인자(예컨대 본원에 참조로 삽입된 미국특허 제4,546,082호를 보라), 아밀로글루코시다제, α-아밀라제등과 같은 여러 프로세싱신호가 서열 결정되고 정의되었다.
어떤 경우에는 원하는 펩티드의 단리를 위해 후속절단을 필요로 하는 다른 펩티다제 인시 서열이 사용될 수 있을 것이다.이들 서열에는 2염기성 펩티드 즉 각각 KEX2, 소 엔테로키나제 및 효모막 펩티다제에 의해 절단되는 KR, (D)4K 및 EA가 포함된다.
관심하의 펩티드는 숙주에 원래있던 것이거나 또는 이종의 것이고 원핵 또는 진핵 공급원으로부터 유도되며 진행공급원에는 진균류, 원생생물, 척추동물, 무적추동물 등이 포함된다.
펩티드 생성물에는 락타제,α-아밀라제,β-아밀라제, 아밀로글루코시다제, 키모신 등과 같은 효소, 호르몬, 인터로이킨, 사이토킨, 카켁신, 성장인자, 예컨대 혈소판유도, 상피, 골격등의 성장인자, 성장호르몬, 난포자극 호르몬, 인터페론()(α-, β- 및 γ-), 인자 V, VI, VII, VIII(vW 또는 c), IX, X, XI 또는 XII와 같은 혈액인자, 플라스미노겐 액티베이터(조직 또는 뇨의), 혈청알부민, 예컨대 사람 혈청알부민, 콜로니 성장인자(예컨내 GM), 에리스로포이에틴, 타우마틴, 인슐린 등과 같은 포유동물 펩티드가 포함된다.
이들 구조 유전자는 여러방법으로 얻어질 수 있다.
아미노산 서열이 알려진 경우에는 특히 효모가 좋아하는 코돈을 얻고자 하는 경우에는, 구조 유전자는 전체로서 또는 부분으로서 합성될 수 있다.
그래서 클루이베로마이세스가 좋아하는 코돈을 사용하여 오픈 리딩 프레임의 전체 또는 일부가 합성될 수 있다.
바람직한 코돈은 클루이베로마이세스 숙주 예컨대 해당작용효소에 의해 최대량 생산되는 단백질에서 발견되는 코돈에 의해 구해질 수 있다.
서열을 합성하고 서열들을 모으는 방법은 문헌에 확립되어 있다.
오픈 리딩 프레임의 일부가 합성되고 일부가 천연 공급원으로부터 유도되는 경우에는, 합성된 부분이 두 천연존재 부분들 사이의 브릿지로서 작용하거나 또는 3'- 말단 또는 5'- 말단은 제공할 것이다.
특히 펩티드를 코드하는 신호서열과 오픈 리딩 프레임이 다른 유전자로부터 유도되는 경우에는 보통합성 어댑터가 사용될 것이다.
다른 경우에는 링커가 사용되어 여러 단편들이 상이한 제한부위에 삽입되거나 또는 링커내 서열에 대치될 수 있다.
대체로 오픈 리딩 프레임의 일부 또는 전부는 천연공급원으로부터 유래된다.
관심의 대상이 되는 서열을 확인하는 방법은 문헌에 충분히 예시되어 있으나, 개개의 경우에 있어 곤란성의 정도는 각각 다르다.
여러 기술에는 천연 존재 아미노산 서열의 적어도 일부가 알려져 있는 경우는 프로브의 사용이 포함되고, 그때에는 게놈 또는 cDNA라이브러리가 상보 서열에 대해 조사될 수 있다. 또는 관심대상의 유전자가 유도될 수 있을때 또는 세포가 같은 숙주로부터의 그러나 다른 분화의 것일 때에는 생산된 메신저 RNA를 비교함에 의해 상이한 전사가 검출될 수 있다.
다른 방법도 또한 예시되어 있다.
종결 영역은 개시영역이 얻어지는 유선자의 3'- 영역으로부터 또는 다른 유전자로부터 유도될 수 있다.
다수의 종결영역이 알려져 있으며 같은 그리고 다른 속 및 종의 각종 숙주에 있어 만족한 것으로 발견되었다.
종결영역은 어떤 특별한 성질때문이 아니다.
오히려 편리성때문에 선택된다. 바람직하기는 종결 영역은 효모 유전자 특히 사카로마이세스 또는 클루이베로마이세스로부터 유도될 것이다.
발현 카세트의 개발에 있어서, 조절영역과 오픈리딩 프레임을 포함하는 다양한 단편에 연결반응, 제한, 절제, 시험관내 돌연변이생성, 프라이머 수복, 링커 및 어댑터의 사용등과 같은 상이한 프로세싱 상태가 진행될 수 있다.
그로써 뉴클레오티드 전이, 변위, 삽입, 삭제등이 조절 영역 및 또는 오픈 리딩 프레임에 사용되는 DNA상에서 이루어질 수 있다.
발현 카세트의 제조도중에, DNA의 다양한 단편은 일반적으로, DNA의 확대, DNA의 변형 또는 서열, 링커등의 결합 또는 제거에 의한 조작을 허용하는 적합한 벡터에 클론될 것이다.
일반적으로 백터는 적어도 상대적으로 높은 복사수로 대장균내에서 복제될 수 있을 것이다.
pBR322, pACYC184, pUC7-19, M13, 캐이론 4A등과 같은 벡터를 포함하여 많은 벡터가 클로닝에 대해 쉽게 활용될 수 있다.
클로닝벡터는 대장균내에서 기능적인 효과적인 복제 시스템을 가짐으로써 특징지어진다.
또한, 클로닝 벡터는 적어도 하나의 제한부위, 일반적으로는 다수의 단일한 제한부위를 가질 것이며 또한 다중 제한부위 특히 치환에 대한 동일한 제한부위중 2개를 포함할 수 있다. 더불어, 클로닝 벡터는 형질전환에 대한 선택을 제공하는 하나 또는 그 이상의 마커를 가질 것이다.
마커는 일반적으로 항생물질, 중금속, 독소등과 같은 세포장해제에 대한 내성, 영양요구 숙주의 상보성, 또는 파지등에 대한 면역성을 제공할 것이다.
벡터 및 카세트의 적합한 제한 및 적절한 말단의 변형에 의해서, 블런트 말단을 제공하기 위한 돌출부의 되돌이 절단 또는 충전에 의해서, 링커의 첨가에 의해서, 테일링에 의해서 벡터와 발현 카세트 또는 그의 성분과의 연결 및 결합에 대해 상보적 말단이 제공될 수 있다.
카세트의 개발중 DNA의 각 조작후에 플라스미드가 클론되고 단리될 것이며, 필요에 다라 특정 카세트 성분이 적절한 서열이 얻어졌는지를 확실히 하기 위하여 그의 서열에 대해 분석될 것이다.
조작의 성질에 따라 소망하는 서열이 플라스미드로부터 절출되어 다른 벡터에 도입될수 있거나 또는 플라스미드는 제한될 수 있고 발현 카세트 성분은 적절히 조작될 수 있다.
벡터가 다른 복제 시스템을 요구하는 다른 숙주에서 복제될 수 있는 어떤 경우에는 셔틀 벡터가 사용될 수 있다. 이것은 두 숙주에서 기능하는 추가적인 마커를 요구할 수도, 요구하지 않을 수도 있다.
그러한 마커가 필요한 경우에 이들은 벡터에 포함될 수 있고 이때 카세트, 두 복제 시스템 및 마커(들)을 포함하는 플라스미드가 필요에 따라 숙주에서 다른 숙주로 이동될 수 있다.
이러한 상항에서 제2복제 시스템은 클루이베로마이세스에서 기능하는 복제시스템이 될 수 있다.
사용될 수 있는 복제시스템은 플라스미드, 예컨대 클루이베로마이세스 드로소필라룸(Kluyveromyces drosophilarum)으로부터의 pKDl, 바이러스, 또는 클루이베로마이세스 또는 다른 종, 특히 사카로마이세스와 같은 클루이베로마이세스와 관련된 종으로 부터의 염색체로부터 유도될 수 있다. 따라서 복제시스템에는 예컨대 동원체 서열등과 결합되어 사용될때 사카로마이세스에서 발견되는 2미크론 플라스미드와 자치 복제서열(ARS) 유전자의 복제 시스템이 포함된다.
소망에 따라 동종의 영역이 클루이베로마이세스 숙주의 게놈내로 발현 카세트의 통합을 촉진하기 위하여 제공될 수 있다.
본 발명의 구성에 있어서 특별한 관심은 KARS로 지칭되는 고빈도의 형질전환을 제공하는 클루이베로마이세스 DNA 염색체로부터 유도된 서열이다. KARS유전자는 증가된 형질전환 효율을 위한 클루이베로마이세스 DNA단편의 라이브러리를 스크린하여 얻어질 수 있다.
이 방법으로 KARS 서열을 포함하는 단편이 얻어질 수 있으며 이 단편은 제한, 절제 또는 프라이머 수복에 의해 더 수정될 수 있고 그에 따라 약 200bp내지 5000bp이하, 더 바람직하게는 약 200bp내지 200bp의 형질전환효율이 향상된 단편을 제공한다. KARS유전자의 존재로 DNA 마이크로그램당 약 103이상, 통상 DNA 마이크로그램당 104이상의 빈도에서 호변이성(prototophy)에 대해 클루이베로마이세스 락티스 영양요구주의 형질전환을 제공할 수 있다.
클로닝을 위한 여러가지 DNA 구조(플라스미드 및 바이러스)로 대장균을 형질전환시키는 방법이 본 발명에만 특정적인 것은 아니다. 접합, 형질도입, 형질전환, 예컨대 염화칼슘 또는 인사염 중개형질전환등이 사용될 수 있다.
대조적으로 효모 또는 종래기술의 대부분은 2000 내지 8000, 통상 4000 내지 7000달톤의 폴리에틸렌글리콜과 칼슘이온의 조합을 사용하는 원형질체의 형질전환에 의존해 왔다. 형질전환의 다른 방법은 클루이베로마이세스를 1 내지 25, 바람직하게는 4내지 10OD610의 밀도로 표준 효모영양배지에서 성장시키는 것을 포함한다.
그런후 클루이베로마이세스롤 수확하고 세척하여 유화촉진이온(chaotropic ion), 특히 리튬, 세슘 또는 루비듐의 알칼리 금속이온, 바람직하게는 염산염 또는 황산염으로서, 더 바람직하게는 약 0.lM엣 전처리한다.
유화촉진 이온으로 세포를 항온반응시킨후에 DNA를 가하고 적절한 온도, 보통은 20℃내지 35℃에서 약 5내지 60분간 더 항온 반응을 시킨다.
이어서 바람직하게는 25 내지 50%의 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 폴리에틸렌 글리콜의 동부피를 가하여 희석함으로써 전체 배지가 소망하는 최종농도로 되게 한다.
폴리에틸렌 글리콜은 약 2000 내지 8000 달톤이고 4000 내지 7000달톤이 바람직하다.
항온 반응은 비교적 짧은 시간, 보통은 5내지 60분간 진행한다.
항온반응 배지를 35℃내지 45℃, 바람직하게는 42℃에서 약 1내지 10분간 열처리하는 것이 바람직하다.
선택을 위해서 어떠한 유용한 마커도 사용될 수 있는데 클루이베로마이세스에 유용한 마커의 종류는 사카로마이세스용 마커보다 다양하지 못하다.
카나마이신과 아미노글리코시드 G418에 대한 내성과, 트립토판 대사경로에서, 특히 TRP1 또는 락토스 대사경로에서, 특히 LAC4에서 유전자의 상보성이 관심의 대상이다.
선택용 마커도 매우 편리하지만, 형질전환된 세포를 스크린하는 다른 방법도 있다(G. Reipen 등의 Current Genetics(1982) 5 : 189-193참조).
β-락타마제와 같은 지시효소의 사용 이외에 형질전환된 세포는 그들이 만드는 특정 생성물에 의해 스크린될 수 있다.
예컨대 키모신의 경우에 면역학적 방법 또는 효소적방법으로 생성물의 합성을 측정할 수 있다.
사용된 벡터는 클루이베로마이세스에서 엑스트라크로모좀을 유지하거나 또는 클루이베로마이세스 유전자내로 통합시킬 수 있다.
사카로마이세스로부터의 2미크론 플라스미드 복제 시스템이 클루이베로마이세스에서의 엑스트라크로모좀 유지를 제공한다는 것이 밝혀졌다.
또한 사카로마이세스 CEN3와 같은 동원체와, ARS또는 KARS와 같은 고빈도 형질전환 서열의 조합을 사용할 수도 있다. 클루이베로마이세스가 감수성을 갖는 항생물질에 대한 내성 또는 상보성과 같은 선택적 유지가 제공되는 경우에 ARS-유사서열이 엑스트라크로모좀 유지를 통상 충족시킬 것이다.
대규모 발효에 있어서, 플라스미드 안정성이 조금만 떨어져도 소망하는 단백질의 최종 수율에 크게 영향을 미칠 것이다. 클루이베로마이세스와 같은 숙주 세포에서 재조합형 분자의 안정성을 향상시키기 위해 숙주 염색체내로의 재조합형 분자의 통합이 사용될 수 있다.
통합이 소망스러운 경우에 숙주의 염색체 서열과 동종의 서열을 가져서 상동 재조합이 일어나는 것이 바람직하다. 랜덤 통합이 또한 발생하여 상동 서열이 선택적인 것으로 이해된다.
상동 서열이 사용되는 경우에 상동 서열은 적어도 약 200bp이고 1000bp이상일 수 있다.
또한 통합의 경우에 구조 유전자의 증폭을 기대할 수 있다. 증폭은 소망한 구조 유전자와 일렬로 있는 유전자를 제공함으로써 이루어지며, 선택적 배지에서 숙주에 대한 선택적 이점을 제공한다.
따라서, 이다이드로폴레이트 환원효소, 메탈로티오네인즈, 티미딘키나제등을 발현하는 유전자는 증폭을 제공할 각종 숙주에 유용하다고 판명되었으며, 유전자는 메토트렉세이트 등의 독소, 구리와 수은등의 중금속등으로부터의 보호를 제공한다.
안정한 복제를 제공하는 관심있는 벡터에는 클루이베로마이세스 락티스로부터 유래되는 KARS벡터, 예컨대 pKARS12와 pKARS가 있으며, 그 플랏,미드는 사카로마이세스 세레비시아에 플라스미드 YRp7중에 KARS12 또는 KARS2 서열을 포함하는 클루이베로마이세스 락티스 DNA 단편으로 되어 있다.
통합에 사용된 벡터는 예컨대, 플라스미드 YRp7을 운반하는 ARS1 그리고 LAC4유전자를 운반하는 클루이베로마이세스 락티스 Xho IDNA단편으로 된 하이브리드 플라스미드 pL4이다.
EP-A 0096430참조.
특히 관심이 있는 플라스미드에는 2미크론 플라스미드 복제시스템, LAC4 유전자, Tn 601및 Tn 5항카나마이신 유전자를 가지는 플라스미드가 있으며, 이는 클루이베로마이세스에서 항생 G418에 대한 내성을 부여한다(Jimenez and David, Nature (1980) 287 : 869-871).
이와 같은 플라스미드는 클루이베로마이세스에서의 자치 복제를 제공하고 글루코오스, 소르비톨 및 0.2μg/mlG418을 함유하고, G418에 대한 클루이베로마이세스의 민감도를 방해하는 KCl의 상승농도를 피하는 재생플레이트 위에서 G418에 대한 내성에 의하여 선택될 수 있다.
바람직한 플라스미드는 특히 사카로마이세스 세레비시아에로 부터의 TRP1유전자, 특히 클루이베로 마이세스 락키스로부터의 LAC4유전자, Tn5로부터 항생 G418에 대한 내성을 제공하는 KanR유전자등을 포함한다.
목적 벡터 및 구조는 소망한 구조유전자의 클로닝과 발현을 위한 적절한 숙주로 도입된다.
형질전환후, 콜로니는 일반적으로 약 내지 6일내에 재생배지상에 나타날 것이다. 항생물질이 선택하는데 사용되는 경우, 클로니는 자발적인 돌연변이가 내성균주에 없음을 확실히 하기 위하여 스크린 되어야 한다.
본 발명의 클라스미드와 방법을 사용하여, 약 5%의 내성콜로니가 플라스미드 DNA μg당 적어도 약4형질전환체를 부여하는 플라스미드 구조를 포함하는 것을 알게 되었다. 유일한 탄소원으로서 락토오스와 삼투 안정화제로서 0.6MKCl을 포함하는 플레이트를 사용하여 LAC4유전자 존재하에서 선택을 하는 경우, 모든 생존 콜로니는 자발적인 역돌연변이 세포가 아니라 형질전환체로 발견되었다.
약 20개의 형질전환체는 약 4내지 5일 배양후 적당한 온도, 예컨대 30℃에시 얻어졌다.
숙주 유기체로서, 클루이베르마이세스는 특히 이종의 단백질 제조, 예컨대 효소 키모신 및 그의 전구물질, 프리프로키모신, 슈우도키모신 및 프로키모신의 생성과 추출에, 사람의 혈청 알부민(HSA), 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 타우마틴 및 그의 전구 물질 형태에 대하여 적합하다.
사카로마이세스등의 다른 유기체가 프로키모신을 합당한 양으로 생성하더라도, 생성된 프로키모신은 활성 또는 활성가능한 형태로 추출될 수 없다.
본 발명자는 클루이베로마이세스에 의해 생성된 프로키모신의 총량중 90%이상이 매우 간단한 표준기법으로 활성형태로 추출될 수 있음을 발견하였다.
많은 클루이베로마이세스종중에서 어느것이라도 사용할 수 있다. 실험적 또는 산업적, 바람직하게는 산업균주를 사용할 수 있다. 산업적인 종에 의해 자연원으로부터 단리될 수 있거나 저장소 또는 다른원으로부터 허용가능한 유기체로부터 클루이베로마이세스 균주가 목적으로 되거나 또는 그와 같은 균주의 변이, 예컨대 둘연변이에 의해 얻어진다.
산업적인 균주는 유전자 교환에 내성이 있고, 원영양적인 주이거나 숙주 균주에 도입될 하나의 유전자에 의해 원영양주로 되는데 특징이 있으며, 통상 펩티드의 개량된 생성에 대해 선택된다.
용도를 찾을 수 있는 클루이베로마이세스 종 가운데 클루이베로마이세스 락티스(K.la-ctis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus), 클루이베로마이세스 써모토러란스(K. thermotolerans), 클루이베로마이세스 마르크시아누스(K.moxianus) 등이 있다.
클루이베로마이세스 유기체가 GRAS(통상 안전한 것으로 인정됨) 목록상에 있음을 유의해야 한다.
생체내에서 사용되거나 또는 정상적으로 소화될 생성물의 제조용도는 특별한 정부의 재조사 및 승인을 필요로 하지 않는다.
양생형과 돌연변이 클루이베로마이세스 특히 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 프라길리스를 숙주로서 사용할 수 있다.
특히 관심있는 숙주에는 클루이베로마이세스 락티스 SD11 lac4 trp1과 클루이베로마이세스 락티스 SD69 1ac4, 그리고 야생형 균주 CBS2360(EP-A-0096430 참조)이 있다.
플라스미드의 유지용 형질전환체에 선택적 압력을 유지하기 위해, 클루이베로마이세스 락티스 SD69 1ac4(PTY75-LAC4)와 클루이베로마이세스 락티스 SD 69 1ac 69 1ac4(pL4)를 위해서는 효모질소기제배지, 글루코스대신에 2%락토스, 그리고 클루이베로마이세스 락티스 SD11 lac4 tm1(pKARS12)를 위해서는 2% 글루코오스가 첨가된 효모질소기제 배지(Difco)등의 선택적 배지를 사용할 수 있다.
상기한 형질전환체를 EP-A-0096430에서 참조.
마찬가지로, 예컨대 G418에 대해 내항생물질을 부여하는 플라스미드를 함유하는 균주는 상기 항생물질을 함유하는 배지에서 배양될 수 있다.
하이브리드 플라스미드가 소망한 단백질의 대규모 생산에 사용되는 경우, 적어도 실질적으로 모든 박테리아 DNA서열을 하이브리드 플라스미드로부터 제거하는 것이 통상 유용하다. 관심있는 구조 유전자의 성질에 따라 발현 생성물은 숙주세포의 세포질에 잔존하거나 분비될 수 있다.
세포내에 잔존하는 단백질뿐만 아니라 분비되는 단백질이 가용성임이 발견되었다.
발현생성물이 숙주 세포에 잔존하는 경우, 유도가능한 전사개시 영역을 갖는 것이 통상 바람직하므로, 형질전환체가 고밀도에 도달할 때까지 소망한 생성물이 거의 없거나 나타나지 않는다. 발현 생성물이 형성되는데 충분한 시간이 지난후, 세포는 종래의 방법, 예컨대 원심분리로 단리되고 용해될 수 있으며 관심있는 생성물이 단리된다.
생성물의 성질과 용도에 따라, 용해물은 크로마토그라피, 전기 영동, 용매 추출, 결정화등의 각종 정제방법이 수행될 수 있다. 순도는 약 50% 내지 90% 또는 그 이상, 완전히 순수해질 때까지 변화될 수 있다.
생성물이 분비될 때 본질적 및 비본질적 전사개시영역은 관심의 단백질 또는 폴리펩티드의 생성용으로 사용된 발효과정에 따라 적용될 수 있다.
발현 생성물은 배양배시로 분비되어서 배지가 일부분 철수되는 연속 기재상에서 생성되며, 소정 생성물은 예컨대 친화성 크로마토그라피등에 의해 추출되고 소비된 배지는 폐기되거나 또는 필수성분을 회복시킴으로써 재순환된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허출원들은 본 발명이 속하는 기술에 숙련된 자의 기술의 수준을 표시한다.
모든 공보 및 특허출원은 각 개개공보 또는 특허출원이 참고로 혼입되어 명확하게 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 참고적으로 여기에 기재된다.
다음 실시예들은 예시적으로 적용된 것으로 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.
(실험)
(실시예 1)
긴 락타제 프로모터 서열을 함유하는 키모신 발현플라스미드의 제조
A. pUCla56의 제조
염색체 DNA를 클루이베로마이세스 락티스 균주 CBS 2360(Das와 Hollenberg의 Current Genetics(1982) : 123-128)로부터 단리하여 XhoI로 절단하고 수크로스 구배상에서 크기에 따라 분리하였다.
락타제 유전자를 함유하는 부분을 니트로셀룰로스 필터(EP-A-0096430, 실시예 16C2참조)상에 DNA를 스포팅한 후 플라스미드 pK16으로부터의 LAC4프로브로 검출하였다.
LAC4 유선자를 함유하는 DNA를 플라스미드 pPA153-215(Andreoli, Mol. Gen. Genet.(1985)199 : 372-380)의 Sal I부위로 클론하여서 플라스미드 pPA31을 발생시켰다.
락타제유전자를 함유하는 pPA31의 Xba I단편을 플라스미드 pUCla56을 산출하는 pUC 19(야니쉬-페론 등, Gene(1985) 33-119)의 Xba I부위에서 아클론하였다.
B. 락타제유전자의 터미데이터로의 G418 내성유전자의 도입
G418 내성 마커를 함유하는 터미데이터 플라스미드 pGBTeG418로부터 얻었다.
pGBTeG418을 함유하는 대장균을 1987년 2월 26일 번호 CBS 184.87로 센트라알 뷰로우 부어 쉼멜컬춰에 기탁하였다.
플라스미드 pGB%eG418(제1도 참조)은 상술된 바와 같이 플라스미드 pPA 153-215와, 3.7Kb BamHI 클루이베로마이세스 락티스 락타제 터미네이터 단편(Breuning et al., Nucl. Acid Res.(1984) 12 : 2327-2341) 및 배넷천과 할에 의하여 J. Biol. Chem(1982) 257 : 3018-3018-3025에 기재된 바와 유사한 효모로부터의 프로모터 알코올 데히드로게나제 I(ADH)의 지시하에서 G418에 대한 내성을 부여하는 Tn5유전자(Reiss et al., EMBO J.(1984) 3 : 3317)로 이루어지는 5.6Kb 단편으로 이루어진다.
C. G418 내성유선자와 프로키모신을 코드화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pGB900의 제조
G418내성유전자를 함유하는 플라스미드 pGBTeG 418(실시예 1B를 참조) 로부터의 3.6Kb Hind III XbaI 단편과 pGB123(EP-A-0096430 참조)으로부터의 프로키모신 유전자를 함유하는 SalI-Hind III단편을 SalI과 XbaI으로 절단된 pUC19에 연결하였다. 이것은 플라스미드 pGB900을 산출하였다.
D. 플라스미드 pGB901의 제조(제2도 참조)
플라스미드 pGB901을 다음 4단편을 연결시켜 제조하였다.
(1) pUCa56으로부터 단리된 락타제 ATG출발코돈으로부터 약 -90위치까지의 락타제 프로모터를 함유하는 3.6Kb Xba I-Hae II 단편,
(2) 상기 Hae II부위에서 Sal I부위까시 연장하는 Hae II-Sal I단편, 이것을 EP-A-009430의 실시예 16.C2예 기술된 바 유사한 Bal 31 실형에서 위치 -26에 연결하였다. 그러나 이 실험에서는 단지 Sal I링커가 사용된다. 이 단편은 다음 서열을 갖는다:
Figure kpo00002
(3) pGB901으로 부터의 G418과 프로키모신을 함유하는 5.lKb Sal I-Xbal단편(실시예 1C참조).
(4) Xba I으로 절단된 pUC19.
플라스미드의 제조동안에 Hae II부위로부터 CG서열을 부주의로 제거하여서 이 위치에 Hind III위를 생성하게 되었다.
프로키모신을 코드화하는 DNA는 플라스미드 pGB901에 내재하며, 이것은 pGB131, 132 또는 l24로부터 Sal I-Bg1 II단편(EP-A-0096430)을 사용함으로써 각각 프리프로키모신, 슈우도키모신 또는 키모신 DNA를 가지는 플라스미드로 용이하게 변환될 수 있다.
(실시예 2)
클루이베로마이세스 락티스 형질전환체로부터 프로키모신의 분비
클루이베로마이세스에서 프로키모신의 합성을 지시하기 위해서 플라스미드 pGB901을 유사한 결과를 갖는 클루이베로마이세스 락티스 C균주 SD11과 CBS 2360을 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환을 제한 엔도뉴클레아제로 절단된 플라스미드 DNA 또는 무상의 플라스미드 DNA를 사용함으로써 EP-A-0096430의 실시예 4 및 14에 기술된 바와같이 필수적으로 실행하였다.
후자의 경우에 프로모터영역, 예를 들면 Sac II, Nde I, Sna BI또는 Spe I에서, 또는 터미네이터 영역, 예를 들면 Eco RV에서, 또는 프로모터 및 터미네이터 영역 둘 다에서 절단하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하였다.
클루이베로마이세스 락티스균주 CBS 2360을 2.5ml의 6.7% 효모질소원(Difco)을 함유하는 YEPD-배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스) 용액 100ml에서 약 7의 OD610으로 성장시켰다. 세포들을 10ml배양액으로부터 원심분리하여 수집하고 TE-완충액(10mM 트리스-HClpH 7.5, 0.1mM EDTA)로 세척한 다음 1mlTE-완충액에서 재현탁시켰다.
동일부피의 0.2M 아세트산 리튬을 가하고 진동수욕(Waterbath) 중에서 1시간동안 30℃에서 배양하였다.
플라스미드 pGB901(15μg)을 락타제 프로모터 중의 단일한 Sac II부위에서 절단하고, 에탄올로 침전시킨 다음 15mlTE-완충액중에 재현탁시켰다. 이 DNA샘플을 100㎕의 예비-배양된 세포에 가하고, 배양을 30분간 연장하였다.
다음에 동일부피의 70% PEG 4000을 가하고 이 혼합물을 1시간 동안 동일한 온도에서 배양한 다음 5분간 42℃에서 열충격을 가하였다. 다음에 1ml의 YEPD-배지를 가하고 이 세포롤 1.5시간동안 30℃의 수욕중에서 진동배양하였다.
최종적으로 세포를 원심분리로 수집하고 300㎕ YEPD에 재현탁시켜, G418이 없는 15ml의 YEPD 한천으로 도포된(사용 1시간전에), 300μg/ml의 G418과 함께 15ml의 YEPD 한천을 함유하는 한천 플레이트상에 분무하였다.
콜로니를 30℃에서 3일간 성장시켰다.
클루이베로마이세스 락티스 군주 SDl1을 유사한 방법으로 형질전환시키되, 단 선택 플레이트중의 최초 G418 농도만은 150μg/ml로 강하시켰다.
실험중 어느 한 실험에서는 CBS 2360 형질전환체를 2% 갈락토스를 함유하는 YEP-배지중에서 30℃에서 성장시켰다.
60시간 후에 세포와 배지를 원심분리로 분리하였다. 세포를 유리구로 처리함으로써 분쇄하였다.
배양배지와 세포추출물을 키모신 활성에 대하여 분석하기전에 pH2에서 처리하였다.(폴트만, Methods in Enzymology (1970) 19 : 421-426 참조).
세포를 원심분리로 배양액으로부터 제거하고, 생성된 상징액을 1M H2SO4를 가하여 pH2까지 산성화 시킨 다음 실온에서 2시간 동안 방치하였다.
다음에 용액 2M트리스 염기를 가하여 pH6까지 중화시켰다. 50㎕부피의 적당한 희석액을 10mM CaCl2중의 12%탈지분유 현탁액에 가하고 클롯 하나가 형성될 때까지 37℃에서 배양하였다. 키모신 활성 1단위는 이와 같은 조건하에서 10분후 한 클롯을 형성하는데 요구되는 활성 키모신의 양으로서 정의된다. 단백질분비에 대한 신호서열이 없어도 클루이베로마이세스 락티스 형질전환체에 의한 프로키모신의 생성 및 분비에 의한 우유-응고 활성을 갖는 상징액을 프로키모신에 가하였다.
상기한 우유-응고 분석으로 측정했을 때 배지내에서는 생성된 충 프로키모신의 약 30∼60%를 발견하였다.
클루이베로마이세스 락티스 균주 SD11을 사용했을 때 유사한 결과를 얻었다.
(실시예 3)
키모신 생성을 증진시키는 락타제-키모신 융합단백질
다양한 Sna BI-Sal I 단편(EP-A-0096430의 실시예 16.C2에 기술된 것이 유사하나, 단 단일 Sal I 링커만을 사용하는 Bal 31 실험으로부터)을 취함으로써 락타제와 키모신 단백질 사이의 융합물을 함유하는 pGB901의 변이체를 얻었다(표 1).
락타제 DNA와 링커 서열에 의하여 제공된 여분의 아미노산은 산으로 처리함으로써 프로키모신의 프로서열과 함께 제거할 수 있다. 락타제를 코드하는 서열(pGB901)로 부터의 4아미노산을 함유하는 융합이 키모신 생성의 증진을 초래한다는 것을 관찰하였다.
[표 1] pGB901과 pGB902중의 락타제 프로모터와 프로키모신 사이의 결합부분에서의 뉴클레오티드 서열
Figure kpo00003
Figure kpo00004
단백질합성은 박스로 표시된 ATG코돈에서 출발한다.
(실시예 4)
클루이베로마이세스 형질전환체에 의한 프리프로키모신의 발현 편의상 pGB902(실시예 3참조)의 폴리링커로 부터 Sal I부위를 제거하였다. pGB902를 Sal I으로 부분소화시킨 다음 Bal 31(Boehringer)과 함께 잠시 항온반응하였다.
선형 단편을 아가로스 겔로부터 단리, 연결시키고 대장균내로 형질전환하였다. 정확한 플라스미드, pGB903을 얻었다. 제한분석한 결과 이 플라스미드도 역시 폴리링커로부터 제거된 Xba I과 Hind III부위를 갖고 있었다.
프리프로키모신을 함유 및 발현하는 플라스미드를 제조하기 위하여, 플라스미드 pGB903을 제한 엔도뉴클레아제 Sal I과 Bgl II로 소화시켰다.
전기용출에 의하여 1lKb DNA단편을 단리시켰다.
이와 유사하게 프리프로키모신 유전자를 함유하는 플라스미드 pGB124(EP-A-0096430 실시예 16참조)를 소화시켜서, 프리프로키모신 유전자의 N-말단부를 함유하는 0.3Kb Sal I-Bgl II단편을 분리하였다.
11Kb와 0.3Kb DNA단편을 혼합하고, DNA 리가제로 연결시켜서 대장균내로 형질전환하였다.
락타제 유전자의 소부분에 융합된 프리프로키모신 유전자를 함유한 플라스미드 pGB904를 단리하였다(표 2).
[표 2] pGB904중의 락타제 프로모터와 프리프로키모신 사이 결합부분에서의 뉴클레오티드 서열pGB904
Figure kpo00005
단백질 합성은 박스로 표시된 ATG코돈에서 출발한다.
Sac II로 선형화 하였던 pGB904로 클루이베로마이세스 락티스 CBS 2360세포들을 형질전환하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 형질전환체들을 선택하고 배양하여 키모신 활성에 대하여 시험하였다.
다음의 [표 3]에 있어서, pGB902 (실시예 3참조)로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 CBS2360으로부터의 프로키모신의 분비와 pGB904로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 CBS 236으로부터의 프로키모신의 분비를 비교한다.
(프로) 키모신 생성은 OD610에서 세포 ml당 200의 임의의 유니트로 발현된다.
[표3] pGB902와 pGB904로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포들에 의한 프로키모신의 분비
Figure kpo00006
(실시예 5)
이종 리더 서열을 사용하는 클루이베로마이세스에 의한 프로키모신의 분비
A. 아밀로글루코시다제 리더 서열의 화학적 합성과 상기 리더서열을 함유하는 플라스미드의 제조
아스페르길루스 아와모리(Aspergilus awamori)의 아밀로글루코시다제(AG)의 리더서열은 이니스(Innis) 등에 의해서 사이언스(1985) 228 : 21-26에 발표되었다.
단백질 서열을 기초로 하여, 프로키모신 유전인자 앞에 리더 서열의 삽입을 허용하도록 올리고 뉴클레오티드를 유도하였다(제 3도 참조).
올리고뉴클레오티드를 응용 바이오시스템 DNA 합성기로 합성하였다.
올리고뉴클레오티드를 변성용 폴리아크릴아미드 겔 상에시 전기영동에 의하여 정제한 다음에 그 겔로부터 전기 용출하였다.
유일한 Sal I 부위에서 플라스미드 pGB903(실시예 4참조)을 절단하였다.
올리고뉴클레오티드를 65℃, 50℃및 37℃에서 2xSSC에서 각각 한시간동안 하이브리드를 형성시켰다.
올리고뉴클레오티드는 다중결합체의 형성을 방지하기 위해 5'끝에서 인산염을 전혀 가지고 있지 않았다. T4폴리뉴클레오티드 리가제를 사용하여 DNA를 Sal I 부위에 연결하였다.
연결 혼합물을 대장균 HB101으로 형질 전환하였다.
24개의 군체들을 배양하였고 플라스미드 DNA를 단리하였다. 제한 효소 분석에 의해 하나의 플라스미드 pGB905가 올리고 뉴클레오티드의 정확한 배향을 가지는 것을 알았다.
플라스미드 pGB905를 클루이베로마이세스 락티스 CBS2360으로 형질전환하였다.
실시예 2에 기술된 절차에 따라 (프로)키모신 생성을 분석하였다.
그 결과 OD610에서 세포 ml당 200의 임의의 유니트로 (프로)키모신이 생성되었으며 다음의 [표 4]에 도시되어 있다.
[표4] pGB902와 pGB905로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 세포들에 의한 프로키모신의 분비
Figure kpo00007
B. 신규한 합성 리더 서열을 함유하는 플라스미드의 구조안으로의 신규한 합성 리더 서열의 화학적합성
어떤 종래의 리더 서열과도 다른 서열을 갖는 합성 리더시열을 제조하였다.
이러한 리더 시열을 사용하여, 함성된 모든 프로키모신은 아래에 도시한 바와 같이 클루이베로마이세스에 의하여 분비되었다.
신호 서열 절단부위의 -6에서 +2위치까지 빈번히 나타나는 아미노산을 이용하여 이러한 합성 리더서열을 고안하였다(Von Heyne, Eur. J. Blochem (1983) 133 : 17-21).
빈번히 나타나는 효모 코돈들을 또한 사용하였으며 pGB902에서 26 뉴클레오티드의 삭제에 대해 ATG 서열의 앞에 엑스트라 뉴클레오티드를 함입하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드와 그 결과로 생긴 리더 서열을 제5도에 도시한다.
합성 리더 서열 DNA를 응용 바이오시스템 DNA합성기를 사용하여 합성하였다.
그 결과로 생긴 올리고뉴클레오티드를 TBE 완충액(50mM 트리스, 50mM 붕산염, 1mM EDTA, pH8.3)과 7M요소를 함유하는 40cm길이,1mm두께의 폴리아크릴아미드 겔상에서 브로모페놀 블루우마커가 겔길이 3분의 2를 이동했을 때까지 이동시켰다.
DNA를 눈에 보이게 하였고, 겔로부터 용출하여 에탄올로 침전시켰다.
또한, pGB901로부터의 유도체를 pUC19의 폴리링커로부터 유발된 Sal I부위의 둘레를 삭제하여 만들었다.
이것은 pGB90.3으로부터의 0.5kb SnaBI-Bgl II단편을 그에 대응하는 pGB901으로부터의 단편으로 대체함으로써 이루어졌다. 그 결과로 생긴 플라스미드를 유일한 Sal I 부위에서 절단하였다.
올리고 뉴클레오티드를 65℃, 50℃ 및 37℃에서 2xSSC에서 각각 한시간동안 하이브리드를 형성시켰다.
DNA를 T4폴리뉴클레오티드 리가제를 이용하여 Sal I부위에 연결하였다.
그 다음에 플라스미드를 대장균 HB101내로 형질전환하였다.얻어진 군체중에서 24개의 군체들을 배양하였고 플라스미드 DNA를 단리하였다.
하나의 플라스미드 pGB906이 제한효소의 소화에 의하여 정확한 배향의 올리고뉴클레오티드를 가지는 것을 알았다.
pGB906으로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 CBS2360은 생성된 프로키모신의 95%이상을 분비하였다는 것을 알았다.
C. pGB905로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스에 의해 생성된 키모신 단백질의 분석
클루이베로마이세스 락티스 CBS2360(pGB905) 형질전환체를 30℃에서 3일간 배양하였고 샘플들을 배양상징액으로 부터 수집하였다.
단백질 샘플들을 라엠리의 문헌(Laemmli)(Nature(1970) 227 : 680-685)에 따라 폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동하였다.
단백질을 타우빈(Towbin)등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76 : 4350-4354)에 따라 니트로셀룰로오스 필터상에 블로팅하였다.
키모신 단백질을 필터를 키모신에 대한 폴리클로날 항형철(Chr. Hansen)과 함께, 그리고 이어서 과산화효소(Amersham)에 커플된 당나귀 항-토끼 항체와 그리고 최종적으로 0.6mg/ml의 4-클로나프톨 및 0.015%과산화 수소와 함께 40%메탄올을 함유하는 완충용액(50mM Tris-HC1 pH7.5, 0.9% NaC1)중에서 항온반응함으로써 검출하였다.
AG신호서열에 의해 분비된 프로키모신을 이 측정에 의하여 증명된 바와같이 (제5도) pH2처리후에 정확하게 절단하였다. 유사한 결과를 클루이베로마이세스 락티스 CBS2360(pGB906)형질전환체로 얻었다.
(실시예 6)
효과적인 분비를 위한 맥주효모균 α-인자 서열을 함유하는 플라스미드의 제조.
A . 사카로마이세스 α-인자 발현 플라스미드
1. 플라스미드의 제조
pDMl00-PC : 출발물질은 플라스미드 pGB163(EP-A-0096430 실시예 16.C1참조)이었다.
플라스미드 pGB163을 BamHI으로 소화하였고 Xba I -BamHI,α-인자리더-프로키모신 어댑터에 연결하였다.
그 결과의 혼합물을 PstI으로 처리하여 프로 α-인자 프로세싱 부위와 프로키모신의 N-터미날 영역을 코드화하는 96bp단편을 단리하였다.
소의 프로키모신을 코드화하는 1900bp 단편을 플라스미드 pJS111로부더 단리하고 이어서 PstI 및SalI으로 소화하였다.
플라스미드 pJS111은 ADH-2 프로모터 및 글리세르알데히드 3-포스페이트(GAPDH) 터미네이터의 조절 제어하의 pGB163으로부터의 프로키모신 유전자를 함유하는 pBR322 유도체이다. 제거된 1900bp PstI부터 SalI까지 단편은 프로키모신 유전자와 GAPDH 터미네이터를 함유한다.
효모 GAPDH49 유전자 프로모터 및 전사 터미네이터는 본질적으로 Travis, J. Bilo. Chem. (1985) 260 : 4384-4389에 기술된 바와 같다.
GAPDH프로모터, 맥주효모균 α-인자 리더 및 XbaI 및 SalI부위들의 측면에 위치된 사람-인터페론에 대한 합성유전자와 α-인자 터미네이터의 융합을 함유하는 플라스미드 pDMl00을 XbaI과 SalI으로 소화하였고 알칼리 포스파타제로 처리하였으며, 그리고 나서 상기 설명된 96bp 및 1900bp단편들에 연결하였다.
α-인자 리더 및 터미네이터는 본질적으로 Brake, Proc. Natl Acad. Sci. USA(1984)81 : 4642-4646에 기술된 바와 같다.
최종 플라스미드 pDM100-PC를 단리하였고 그것은 GAPDH 프로모터,α-인자 리더 및 프로키모신유전자의 융합물을 함유하였다.
BamHI삽입의 완전한 서열이 제6도에 예시되어 있다.
효모 형질전환체의 선택을 위하여, 2개의 플라스미드 pKS100과 pAB300을 제조하였다.
pKS100 : 맥주효모균 URA3 유선자를 함유하는 YEp24로부터의 170bp Hind III 단편을 pDMl00-PC안으로 삽입하여 플라스미드 pKS100을 제조하였다.
pAB300 : 클루이베로마이세스 락티스 LAC4 유전자의 3'영역과 G418 내성마커를 함유하는 pGB901로부터의 3500bp Hind III-SalI 단편의 pDM100-PC안으로의 삽입에 의하여 플라스미드 pAB300을 제조하였다.
pDMl00-PC에 있어 GAPDH/α-인자/프로키모신 BamHI 삽입은 제 6 도에 도시되었다.
2. 클루이베로마이세스 락티스 및 맥주효모균의 형질전환
플라스미드 pKS100을 프로키모신을 코드하는 영역내의 Bgl II부위에서 소화시켰으며 클루이베로마이세스 락티스 균주 KRN201-6을 형질전환하는 데 사용하였다.
이 균주는 1ac4 유전자가 pGB901로부터의 LAC4 프로모터-프로키모신 유전자 융합에 의해 대체된 균주 2UV21(a lac4 54pl ura3[kil°])의 유도체이다.
그러므로, pKS100의 통합이 통합된 프로키모신을 코드하는 영역에 표적이 되었다.
또한, 맥주효모균 균주 AB110(α ura3 1eu2 his4 pep4-3[cir°])을 형질전환하기 위하여 플라스미드 pKS100이 사용되었는데, 이 경우에 있어서 GAPDH유전자의 3'영역내의 Sac II부위에 표적을 두었다.
최종 형질전환체를 액체 YEPD배지내에서 포화상태까지 성장시켰으며, 배양상징액 및 세포용해물을 pH2에서 활성화한 후 키모신 활성에 대하여 측정하였다.
하기 [표 5]에 요약된 결과로써 나타낸 바와같이, 클루이베로마이세스 락티스 형질전환체는 프로키모신을 배지로 효과적으로 분비하였으며, 한편 맥주효모균 형질전환체는 단지 제조된 프로키모신의 작은유분만을 분비하였다.
[표 5] 클루이베로마이세스 락티스 및 맥주효모균 형질전환체에 있어서의 프로키모신 생성
Figure kpo00008
클루이베로마이세스 락티스 균주 2UV21을 G418내성으로 형질전환하기 위하여 플라스미드 pAB300이 사용되었으며, LAC4 유전자의 3'영역내의 EcoRV부위에의 통합을 표적으로 하였다. 이 형질전환체는 또한 하기 [표 6]에 나타난 바와같이 프로키모신을 배양 배지안으로 효율적으로 분비하는 것으로 판명되었다.
[표 6] α-인자/프로키모신 융합물로부터의 프로키모신 분비
Figure kpo00009
B. LAC4프로모터/α-인자리더/프로키모신 융합의 제조
이 융합물을 제조하기 위하여 2개의 중간채 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pDM l00-PC를 부분적으로 Pst I으로 소화하였고, LAC4의 5' 영역의 26bp및 α-인자리더의 부위를 코드화하는 Sal I-Pst I어댑터에 연결하였고, 그 다음에 Hind III로 소화하였다.
1500bp 단편을 이 혼합물로부터 단리한 후, Hind III 및 Sal I으로 소화한 pUC18안에 클론하여 pKS102를 제조하였다.
합성 대장균 lac오퍼레이터를 플라스미드 pKS103을 제조하기 위하여 pKS102의 α-인자리더를 코드하는 서열의 5'바로 옆의 Sal I 부위에 연결하였다.
이것은 LAC4의 프로모터/α-인자 리더/프로키모신 융합이 대장균에 독성이 될 수 있기 때문에 행하였다.
pKS103에서 490bp의 Sal I-Bgl II 단편을 단리하였고, Sal I-Bgl II-소화된 pJD15R에 연결하였다.
플라스미드 pJD15R는 pJD15를 제조하기 위하여 충전에 의하여 pUC19폴리링커의 Sal I부위를 제거한 후 반대방향으로 8800bp Xba I 단편을 재클롬함으로써 pGB901부터 유도한다. 이러한 반응으로부터 플라스미드 pKS105를 단리하였다. 이들 플라스미드는 제7도에 도시되어 있다.
다음에 플라스미드 pKS105를 통합형질전환에 대한 표적부위로서 LAC4 5'영역의 Sac II부위를 사용하여 클루이베로마이세스 락티스 균주 CBS 2360을 G418 내성으로 형질전환하기 위하여 사용하였다. 키모신 제조는 하기의 [표 7]에서 보는 바와 같이 OD610에서 세포의 ml당 200의 유니트로 발현된다.
[표7] pKS105로 형질전환된 클루이베로마이세스락티스세포에 의한 프로키모신의 분비*
Figure kpo00010
* 상대유니트/ml배양액의 키모신활성
(실시예 7)
효과적인 분비에 대한 클루이베로마이세스 락티스 α-인자서열을 함유하는 플라스미드의 제조
A. 클루이베로마이세스 락키스 α-인자신호서열의 단리 및 사용
배양상징액의 생물학적 측정을 시험균주로서 맥주효모균 Mat a sst2-3균주 RC687을 사용하여 줄리어스 등의 Cell(1983) 32; 839에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다.
클루이베로마이세스 락티스 균주 CBS141(α)를 0.5%글루코스, 황산암모늄이 없는 0.17%효모질소원(Difco) 및 0.002% 황산암모늄으로 구성되는 배지에서 배양하였다.
원심분리에 의하여 세포를 제거한 후, 아세트산을 농도 0.lM로 배양상징액에 가하고, 이 상징액을 바이오-렉스 70(Biorad)의 컬림위를 통과시켰다.
컬럼을 0.lM 아세트산으로 세척한 후 α-인자를 80%에탄올/10mM HCl로 용출하였다. 이 용출물을 증발시켜 건조한 후 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)/20%아세토니트릴에 용해하고 역상-HPLC가아드 컬럼에 적용하였다.
컬럼을 0.1% TFA와, 20%, 40%, 60% 및 80% 아세토니트릴을 함유하는 용액으로 단계적으로 세척하였다.
α-인자 활성을 함유하는 60% 유분을 분석용 C-18HPLC 컬럼에 가한 후 0.1% TFA중의 20% 내지 80% 아세토니트릴의 구배로 용출하였다. 유분을 수집하고 α-인자 확성에 대하여 측정하였다. α-인자활성을 함유한 유본을 건조하여 아미노산 서열분석을 행하였다.
B. 플라스미드 라이브러리의 하이브리드 형성 스크리닝.
올리고 뉴클레오티드의 푸울을 ｒ-[32P]-APT 및 T4폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 표지하였다.
이들 올리고 뉴클레오티드 프로브를 다음의 하이브리드 형성용액 : 4×SSC, 50mM KH2PO4pH7, 1%사르코실, 10%황산덱스트란, 200㎍/ml의 음파처리된, 변성된 연어정자 DNA중에서 42℃에서 서던블로트 또는 박테리아 콜로니를 프로브하기 위하여 사용하였다.
필터를 42℃에서 2×SSC, 0.1% SDS로 세척하였다.
클루이베로마이세스 락티스 균주 SD11(a trpl lac4)로부터 게놈 DNA의 제한된 Sau 3AI소화에서 유발되고, 5000bp 이상의 단편을 정제하기 위하여 크기가 분별된 삽입을 포함하고있는 벡터 pJS109중의 플라스미드 라이브러리를 100μg/ml암피실린을 포함하고 있는 L-아가의 80mm플레이트당 500-2000 콜로니의 밀도로 대장균 균주 HB101의 형질전환체를 플레이팅 함으로써 이들 프로브로 스크린하였다.
DNA를 콜르니로부터 니트로셀를로스 필터로 이동하여 상기와 같이 이들 필터를 하이브리드 형성시켰다.
하이브리드 형성시열을 포함하고 있는 플라스미드를 가진 단일의 콜로니를 단리하기 위하여 필터위에 있는 하이브리드 형성신호의 영역에 대응하는 원래의 플레이트위의 구역을 선택한 후 다시 플레이트하고 하이브리드 형성에 의하여 재시험하였다.
양성 클로니를 적은 배양으로부터 정제된 DNA의 서던 블로트분석에 의하여 추가로 시험하였다.
하이브리드 형성-양성 콜로니로부터 정제된 플라스미드를 다양한 제한효소로 소화하여 생성된 단편을 DNA서열분석에 대하여 적절한 크기의 제한단편을 확인하기 위하여 동일한 하이브리드 형성 프로브를 사용하는 서던 블록트 분석에 의하여 분석하였다.
이에 따라 확인된 단편들을 아가로스 겔 전기영동에 의하여 정제하였고 적절한 MP18 및 MP19 벡터내로 클론하였다. 다음에 DNA 서열분석을 행하였다.
C. 클루이베로마이세스 α-인자의 단리
클루이베로마이세스 락티스 α-인자의 처음의 10아미노산은 맥주효모균으로부터의 그것과 명확한 상동성을 나타냈고 그중 6개는 동일한 잔기였다. 이 서열을 아래에 표시한다.
Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln
이 단백질 서열을 제8도에 도시된 바와 같은 대응 구조유전자에 대한 구조 유전자에 상보되도록 유추된 한 세트의 올리고 뉴클레오티드를 만드는 데 사용하였다.
α-인자 펩티드의 단편에 대하여 가능한 모든 코돈을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 96및 8의 상이한 분자의 2개의 푸울(pool)로서 합성하였다.
이들 두개의 푸울을 γ-[32P]-ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드키나제를 사용하여 방사성 표지하였고, 클루이베로마이세스 락티스 DNA의 제한 소화의 서던블로트롤 프로브하기 위하여 각각 사용하였다.
푸울 #2는 단일 단편에 강력한 하이브리드를 형성하였고 몇개의 다른 소화에 있어서 제2단편에 매우 약한 하이브리드를 형성하였다. 따라서 푸울 2를 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA의 플라스미드 라이브러리를 스크린하기 위하여 선택하였다.
플라스미드 라이브러리를 스크린 하기 위해 이들 프로브를 사용하여 많은 하이브리드를 형성하는 클론의 단리를 유발하였다. 이들 클론중 하나, afk 18b의 DNA서열분석은 그것이 맥주효모균 α-인자 관련 펩티드를 코드호하는 것을 보여주었다.
하이브리드 형성 세그먼트는 약 1000bp의 PstI-EcoRI단편상에 위치하고 있다.
이 단편의 서열은 제9도에 표시되어 있다.
클루이베로마이세스 락티스 전구체는 단지 N-연결된 탄수화물 사슬의 첨가용 2부위를 포함한다.
더불어 클루이베로마이세스 락티스 반복의 스페이서는 맥주효모균 반복의 스페이서보다 더 길며 맥주묘호균에서 발견된 Glu/Ala-Pro 서열보다는 패턴 X-Ala/Pro을 가진 보다 더 다양한 서열을 나타낸다.
DNA서열의 비교는 코닝영역전체에 강한 상동도를 나타냈다.
D .플라스미드의 제조
일련의 플라스미드(제10도에 표시된)를 강한 프로모터의 전사제어하에 발현되는 프로키모신에 클루이베로마이세스 락티스 α-인자리더와의 융합을 제공하도록 제조하였다.
pAB307 : afk18b(제 9도)로부터의 673bp SspI-EcoRI 단편을 클레노우효소에 의해 EcoRI돌출부를 채우고 블런트 말단에 Bgl II 링커를 첨가하여 변형하였다.
이 단편을 그후 맥저효모균 클리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 유전자(GAPDH)의 프로모터와 터미데이터 영역을 결합하는 Bgl II부위로 삽입하였다. 이 카세트를 pUCl8에 BamHI단편으로서 클론하여 pAB307을 제조하였다.
pAB309 :α-리더와 소의 프로키모신을 코드화하는 서열의 융합을 그후 수행하였다. 우선 pAB307을 NcoI로 소화하져 돌출말단을 녹두 뉴클레아제로 처리하여 블런트 말단으로 만들었다.
이 결과물을 그후 Sal I으로 소화하였다.
이것에 프로키모신과 맥주효모균 전사종결영역을 코드화하는 서열을 포함하는 2000bp EcoRV-Sal I단편을 연결하였다. 이 단편은 맥주호모균 GAPDH전사종결영역에 융합된 프로키모신 cDNA를 함유하는 단편의 5'말단에 XbaI-BamHI 어댑터가 첨가된 플라스미드 pJS111로부터 유도하였다.
이 연결 혼합물을 대장균균주 HB101을 형질전환하는데 사용하였고 플라스미드 pAB309를 운반하는 형질전환체를 단리하였다.
이 융합의 결합부분 주위의 서열이 제11도에 표시되어 있으며 pAB309중의 전체 BamHI-SalI삽입서열이 제12도에 표시되어 있다.
pAB312 : 클루이베로마이세스 락티스 균주의 형질전환을 얻기 위하여 pGB901로부터 유도된 3560bp Hind III 단편을 플라스미드 pAB312를 생성하는 pAB309에 삽입하였다.
Hind III단편은 클루이베로마이세스 락티스 LACA유전자의 3'영역과 박테리아 항 G418구조 유전자의 맥주효모균 ADHI프로모터와의 융합을 포함한다.
pAB313 및 pAB314 : 1900bp SacI-Hind III를 pAB309로부터 단리하여 MP19(야니쉬-페론등, Gene(1985)33; 103)에 클론하였다.
단일 스트란드의 파지 DNA를 제조하여 제13도에 도시된 2올리고뉴클레오티드 프라이머중 하나와 같이 시험관 돌연변이 형성용 주형으로서 사용하였다.
M13 파지 MP19/αk11.5와 MP19/αk12.2를 각각 프라이머 #1과 프라이머 #2를 사용하여 제조하였다.
이중 스트란드 RF DNA를 이들 파지로부터 제조하였고 1100bp SacI-StuI 단편을 양자로부터 단리하였다. 이들 단편을 pAB312로부터의 7100bp SacI-StuI단편에 연결하였다.
제13도에 표시된 서열 변경을 갖는 최종 플라스미드 pAB313과 pAB314를 단리하였다.
E. 클루이베로마이세스 형질전환
플라스미드 pAB312를 EcoRV로 소화하고(클루이베로마이세스 락티스 게놈의 LAC4 영역에 대한 통합을 표적으로 하기 위하여) 그후 클루이베로마이세스 락티스 균주 2UV21(a ura trp lac4[kll°])을 G418 내성으로 형질전환시키는 데 사용하였다.
플라스미드 pAB313과 pAB314를 균주 2UV21을 G418 내성으로 형질전환하는 데 사용하였다.
형질전환체 2UV21 : : pAB312, 2UV21 : : pAB313 및 2UV21 : : pAB314의 배양액을 성장시켜 배양상정액을 상기와 같이 키모신 활성에 대하여 분석하였다. 많은 이들 형질전환체와 비형질전환 대조균주를 1% 효모 추출물,2% 펩톤, 2%글루코스, 0.17% 효모질소원, 50μg/ml 및 50μg/ml 우라실로 이루어진 1ml배지에서 36시간동안 성장시켰다.
배양상징액을 그후 산활성화 후 키모신활성에 대해 분석하였다. 모든 형질전환체는 활성 가능한 키모신을 분비하는 것을 발견하였다.
이 결과를 다음 [표 8]에 표시한다.
[표8] 클루이베로마이세스에서의 프로키오신의 분비
Figure kpo00011
각 형질전환체는 트리클로로아세트산-침전된 배양 상징액의 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단일 프로키모신-관련종을 분비하는 것으로 발전되었다.
pAB312질전환체에 의해 분비된 프로키모신-관련 단백질은 전기영동 이동에 의해 측정되는 바pAB313과 pAB314형질전환체에 의해 분비된 것보다 약간 더 높은 분자량을 갖는 것으로 나타났다.
KRNJ303-1과 KRN304-4에 의해 분비된 주종을 분리용 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하고 기체상 아미노산 서열분석을 받았다.
이들 증의 N-말단 서열은 다음과 같이 주어진다.
KRN-303-1
1 5 10 15
Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro
KRN 304-4
1 5
Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile
이 결과는 KRN303-1에 의하여 분비된 프로키모신 관련종은 아미노말단 스페이서(spacer) 서열의 프로세싱이 진행되지 않았고 KRN304-4에서 분비된 종은 확실히 성숙한 프로키모신 아미노말단을 갖는다는 것을 나타낸다.
(실시예 8)
아밀로글루코시다제 신호 서열을 사용한 클루이베로마이세스 락티스에 의한 t-PA의 분비
A. 조직형 플라스미노겐 엑티베이터 cDNA의 클로닝
조직형 플라스미노겐 엑티베이터(t-PA)를 코드하는 cDNA를 페니카등에 의하여 기제된 것과 유사한 방법(Nature(1983) 301 : 214)으로 얻있다.
DNA서열분석 및 제한 지도는 t-PA cDNA의 확실성을 증명하였다.
대부분의 성숙한 단백질에 대한 완전한 코딩 영역과 3'비코딩 영역을 포함하는 2.0kb Bgl II단편(페니카등 참조)을 발현연구에 대해 사용하였다.
B. pUC19로의 항 G418마커의 도입
배넷첸과 할에 의하여 기재된 바와 유사한(J. Biol. Chem. (1982) 257 : 3018), 맥주효모균의 알코올 데히드로게나제(ADHI) 프로모터 지하에서 G418에 대한 내성을 부여하는 Tn5유전자(Reiss et al., EMBO J.(1984) 3 : 3317)을 포함하는 DNA단편을 pUC19(Yanisch- Perron et al., Gene(1985) 33 : 103)의 Sma I에 삽입하였다.
얻어진 플라스미드 pUCG418은 제14도에 도시되었으며, pUCG418을 함유한 대장균을 번호 CBS 872.87하에 1987.12.4일에 센트라알 뷰로우 부어 쉼멜컬춰(CBS)에 기탁하였다.
C. pGBtPA1의 제조
몇개의 클로닝단계로 pGBtPA1을 다음 성분을 함유하여 제조하였다(제15도와 [표 9]참조):
(1) XbaI과 Hind II로 절단된 pUCG418(상기참조);
(2) 락타제 프로모터를 함유한 pGB901로부터의 XbaI-SalI단편;
(3) 아스페르길루스 아와모리(Innis et al., Science(1985) 223 : 21)로 부터의 아밀로글루코시다제의 신호서열을 코드하는 합성 DNA. 출발 코돈앞의 서열은 락타제 프로모터 단편끝에서 Sal I부위를 제거하도록 선택되며 추가로 락타제 유전자의 5'비코딩 영역의 부분을 포함한다;
(4) t-PA cDNA로부터의 2.0kb Bgl II단편(상기 참조);
(5) 락타제 유전자의 3'비코딩 영역의 부분을 포함하는 합성 DNA;
[표 9] 플라스미드 pGBtPA1의 개략적 표시
Figure kpo00012
단백질 합성은 밑줄친 ATG코돈에서 시작한다.
D. 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환과 형질전환체의 분석
pGBtPA1을 사용한 클루이베로마이세스 락티스 균주 CBS2360의 형질전환을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 실행하였다.
형질전환제와 대조균주 CBS2360을 YEPD-배지에서 약 64시간동안 30℃에서 배양하였다. 세포를 배양배지로부터 원심분리에 의하여 분리하였다. 세포를 생리식염용액중에 300의 OD6l0에서 재현탁하고 볼텍스 쉐이커상에서 3분동안 최대속도로 유리비드와 쉐이킹함으로써 분쇄하였다. 세포파편을 원심분리에 의하여 제거하였다.
왈렌 등에 따른 클롯용해측정(Bio-chem. Biophys. Acta(1982) 719 : 318)을 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였다.
15mM 인산염 관충액(pH7.3), 0.2CU/ml플라스미노겐, 1.5mg/ml 피브리노겐과 0.04% 젤라틴을 함유한 용액을 만들었다.
마이크로타이터플레이트의 각 웰에 10㎕ 트롬빈(13.9NIH 유니트/ml, 25㎕샘플과 65ml의 플라스미노겐/피브리노겐용액을 넣고 혼합하였다.
반응시키면서 30분마다 OD450을 측정하였다.
흑색종 세포로부터의 t-PA(Kabi Vitrum)를 마이크로리더 플레이트마다 측정곡선을 제공하도록 사용하였다.
[표 10]은 형질전환체의 일반적 분석결과를 나타낸다. 그것은 t-PA가 pGBtPA1로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스의 배양배지에서 발견됨을 증명한다.
[표10] CBS2360으로부터 및 pGBtPA1으로 형질전환된 CGS2360으로부터의 배양액의 클롯용해측정
Figure kpo00013
세포추출물의 일부에서 약한 t-PA활성(≤3μg/1)이 발견되었다.
또한 Granelli-Piperno 및 Reich(J. Exp. Med.(1978) 148 : 223)예 따라 플라스미노겐/피브린-아가로스겔로 덮여진 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석을 행하였다.
CBS 2360 또는 pGBtPA1로 형질전환된 CBS2360의 배양상징액의 200μ1를 에탄올로써 침전하였고 20μ1 샘플 완충액(62.5mM Tris-HC1 pH6.8, 2% 도데실황산나트륨, 10%글리세롤, 브로모페놀블루)에 재현탁하였다.
샘플을 사전 비등없이 겔상에 놓았다. 그 결과 (제16도에 도시됨)는 클루이베로마이세스 락티스에 의한 사람 t-PA의 분비를 증명한다. 더우기, 분비물질의 대부분은 글리코실화되는 것이 명백하다.
t-PA의 분비를 또한 사람 t-PA에 대한 모노클로날 항체(Biopool로 부터 구한 ESP5)로 ELISA를 이용함에 의하여 및 크로모제닉 활성 측정(Kabi Vitrum으로부터의 상업용 시험)에 의해 확인하였다.
(실시예 9)
사람 혈청 알부민으로부터의 신호 서열을 이용한 클루이베로마이세스 락티스에 의한 t-PA의 분비
A. pGBtPA2의 제조
몇 클로닝 단계로, pGBtPA2를 이하의 성분을 포함하여 제조하였다(제17도 및 [표 11]참조):
(1) Xba I 및 Hind III로 절단된 pUCG418 ;
(2) 락타제 프로모터를 함유하는 pGB901로부터의 Xba I-Sal I단편;
(3) 사람 혈청 알부민의 프리프로영역을 코드하는 합성 DNA;
(4) t-PA cDNA로부터의 2.0kb Bgl II단편(실시예 8참조);
(5) 락타제 유전자의 3'비코팅 영역부의 연부를 포함하는 합성 DNA.
[표 11] 플라스미드 pGBtPA2의 대략적 표시
Figure kpo00014
단백질 합성은 밑줄친 코돈에서 시작한다.
B. 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환 및 형질전환체의 분석
pGBtPA2를 사용한 CBS 2360의 형질전환을 실시예 8에 설명된 바와 같이 수행하였다.
형질전환체 및 대조균주를 성장시켜 이전예에 기술된 바와 같이 처리하였다.
클롯용해측정의 결과를 [표 12]에 요약한다.
[표12] CBS 2360 및 pGBtPA2로 형질존환된 CBS2360의 배양액의 클롯용해 측정
Figure kpo00015
Figure kpo00016
세포 추출물의 일부에서 약간의 t-PA활성(<3μg/l)이 발견되었다.
(실시예 10)
클루이베로마이세스 락티스에 의한 사람 혈청 알부민의 분비
A. HSA cDNA의 합성 및 클로닝
사람 혈청 알부민을 코드화하는 cDNA를 사람의 간으로 붙 공급되는 mRNA를 이용하여 Okayama 및 Berg의 방법(Mol. Cell. Biol.(1982) 2 : 161)에 따라서 제조하였다.
cDNA를 pBR322로 부터 유도된 벡터에 클론하여 대장균에 형질전환하였다.
형질 전환체의 스크리닝을 Nucleic Acids Res.(1981) 9 : 6103에서 기재된 로운등의 HSA cDNA클론서열에 기초한 올리고데옥시리보뉴 클레오티드를 사용하여 수행하였다.
선택된 cDNA클론을 부분적으로 서열화하고 로운등의 서열과 비교하였다. 이것은 프리프로 HSA를 로드하는 영역의 처음 5뉴클레오티드는 없지만 코딩영역의 뉴클레오티드 9-15에서 BstE II부위는 여전히 관찰되는 것을 나타냈다.
3'비코딩영역의 이런 BstE II부위와 Hind III부위(상기 언급된 Lawn등을 참고)를 발현벡터로의 서브클론용으로 사용하였다.
B. pGBtPA1의 제조
몇개의 클로닝단계로 다음의 성분:
(1) XbaI과 Hind III로 절단된 pUCG 418(실시예 8 참조);
(2) pGB901로부터의 XbaI-SalI 단편(실시예 1 참조);
(3) 락타제 유전자의 3'비코딩영역의 일부를 포함하는 합성 DNA(SalI-Hind III단편)를 포함하는 pGBtPA1을 제조하였다.
이 단편의 서열을 [표 13]에 나타냈다
[표13] pGBHSA1의 Sall-Hind III 단편의 서열
Figure kpo00017
C. pGBHSA2의 제조
pGBHSA1을 Sall과 EcoRV로 절단하고 합성 DNA를 삽입하였다 :
Figure kpo00018
밑줄 친 ATG코돈은 궁극적인 발현구조(pGBHSA3, 아래 참조)에서 개시 코돈을 가리킨다. 생성된 플라스미드를 pGBHSA2로 명명하였다.
D. pGBHSA3의 제조
HSA cDNA-클론을 Hind III로 절단하고 스티키말단을 클레노우 DNA폴리머라제 I을 사용하여 충전하였다. 연속적으로 DNA를 BstE II로 절단하고 완전한 HSA코딩영역의 거의 모두를 포함하는 BstEn-Hind III(채워진) 단편을 정제하였다.
pGBHSA2롤 XhoI으로 소화하여 스티키말단을 클레노우 DNA폴리머라제 I을 사용하여 충전하고 BstE II로 소화하였다.
최종벡터에 HSA를 코드화하는 단편 (BstE II-Hind III(채워진))을 삽입하였다. 얻어진 플라스미드 pGBHSA3를 제18도에 도시된다.
E. 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환과 형질전환체의 분석
pGBHSA3를 사용한 클루이베로마이세스 락티스 균주 2360의 형질전환을 실시예 2에서 설명한 것처럼 수행하였다.
형질전환체와 대조균주 CBS 2360을 30℃에서 약 64시간동안 YEPD배지에서 성장시켰다.
세포를 원심분리에 의해 배양배지로부터 분리하였다.
30μ1의 샘플을 상징액으로부터 취하여 라엠리의 방법(Nature 227, 680(1970))에 따라 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다.
제19도에 나타난 결과는 pGBHSA3으로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스세포에 의해 HSA가 배양배지로 분비되는 것을 나타낸다. 또한, 다른 단백질의 분비가 HSA생성세포에서 감소된다는 표식도 있다.
상기 결과는 클루이베로마이세스 균주에서 효과적이고 편리한 외인성 유전자의 발현을 얻을 수 있다는 것을 증명한다.
더우기, 클루이베로마이세스 균주는 프로키모신을 사용한 결과에 의해 예시되는 바, 광범위의 단백질의 고도로 효과적인 분비 및 프로세싱을 제공하고 특히 유용한 것으로 여겨진다.
클루이베로마이세스 내의 효과적인 프로모터의 조절 제어하에서 외인성 유전자의 도입 및 바람직하게는 외인성 유전자의 전위, 특히 분비에 대한 신호서열과의 결합을 허용하는 구조 및 벡터가 제공된다. 그로써, 발효시스템이 활성 또는 활성가능한 형태로 광범위한 외인성 단백질의 상업적 제조용으로 제공된다.
다음 유기체들을 1987. 6. 30에 아메리칸타입 컬춰 클렉션에 기탁하였다 : 2UV21, ATCC 수탁번호제20855호; KRN 201-6, ATCC 수탁번호 제20854호; HB1P1 pAB307, ATCC 수탁번호 제67454호; HBl01 pAB312, ATCC 수탁번호 제67455호.
비록 전술한 발명이 이해를 명료하게 하기 위해 예시와 실시예로서 상세하게 설명되었다 할지라도, 어떤 변화 및 수정은 첨부된 특허청구 범위내에서 실제화될 수 있다는 것이 명백해 질 것이다.

Claims (30)

  1. 클루이베로마이세스 숙주 세포중에서 관심의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은; 관심의 상기 폴리펩티드를 코드화하는 DNA서열을 상기 숙주 세포안으로 도입하고, 상기 DNA서열을 포함하는 상기 숙주 세포를 배양배지중에시 성장시켜 관심의 상기 폴리펩티드, 또는 그의 일부가 배양배지중에 분비되도록 하고, 상기 폴리펩티드, 또는 그의 일부가 배양배지로부터 단리되는 것으로 이루어시는 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA서열이 상기 숙주 세포안으로 도입되고 전사의 방향으로 상기 숙주세포에서 기능적인 전사 개시 조절 영역; 관심의 상기 폴리펩티드를 코드화하는 상기 DNA서열; 및 상기 숙주 세포에서 기능적인 전사 종결 조절영역을 포함하는 DNA구조의 일부를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심의 상기 숙주 세포에 또는 상기 폴리펩티드에, 또는 관심의 상기 숙주 및 상기 폴리펩티드에 이질적인 신호 서열이 상기 DNA서열의 5'말단에 리딩프레임이 맞도록 결합되고, 그로써 관심의 상기 폴리펩티드가 상기 숙주 세포에 의하여 분비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 관심의 상기 폴리펩티드가 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효소는 키모신 또는 그의 전구체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 효소는 조직 플라스미노센 액티배이터(t-PA), 또는 그의 돌연변이 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 관심의 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 클루이베로마이세스의 산업용 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 클루이베로마이세스 락티스 또는 클루이베로마이세스 프라길리스인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 DNA구조는 적어도 하나의 선택 마커, 상기 DNA서열의 자치복제를 위한 복제시스템, 또는 형질전환 효율을 증가시키는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 복제 시스탬은 자치적 복제 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자치적 복제 서열은 클루이베로마이세스 자치적 복제 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 선택 마커는 G418에 대해 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 형질전환된 클루이베로마이세스 숙주 세포에 있어서, 전사의 방향으로, 상기 숙주세포에서 기능적인 전사개시 조절영역, 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA서열과 리딩프레임이 맞도록 결합된 상기 숙주 세포에서 기능적인 신호서열로서 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 상기의 DNA서열에 이질적인 신호서열 및 상기 숙주세포에서 기능적인 전사 종결 조절 영역을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 신호 서열이 맥주 효모균으로부터의 α-인자 신호 서열인 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제14항에 있어서, 상기 신호 서열이 아스페르길루스 아와모리로부터의 아밀로글루코시다제 신호 서열인 것을 특징으로 하는 세포.
  17. 제14항에 있어서, 상기 관심의 폴리펩티드가 키모신, 또는 그의 전구체, t-PA 또는 HSA인 것을 특징으로 하는 세포.
  18. 제14항에 있어서, 선택 마커, 상기 DNA서열의 자치 복제에 대한 복 시스템, 또는 형질전환 효율을 증가시키는 서열중 적어도 하나가 상기 발현 카세트에 결합되는 것을 특징으로 하는 세포.
  19. 제14항에 있어서, 상기 복제 시스템이 자치 복제 서열(ARS)인 것을 특징으로 하는 세포.
  20. 제14항에 있어서, 상기 자치 복제 서열은 클루이베로마이세스 자치 복제 서열인 것을 특징으로 하는 세포.
  21. 제14항에 있어서, 상기 선택 마커는 G418에 대한 내성인 것을 특징으로 하는 세포.
  22. 클루이베로마이세스 숙주 세포에서의 사용을 위한 DNA구조에 있어서, 전사의 방향으로, 상기 숙주 세포에서 기능적인 전사개시 조절영역; 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA서열과 리딩프레임이 맞도록 결합된 상기 숙주에서 기능적인 신호서열; 및 상기 숙주세포에서 기능적인 전사 종결 조절 영역으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 신호서열이 관심의 상기 숙주세포에 또는 상기 폴리펩티드에, 또는 관심의 상기 숙주세포 및 상기 폴리펩티드에 이질적인 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 선택 마커, 상기 DNA구조체의 자치 복제에 대한 복제 시스템, 또는 형질전환 효율을 증가시키는 서열중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 관심의 폴리펩티드와 신호서열을 코드화하는 DNA서열이 클루이베로마이세스에서 발현되는 유전자에 리닝프레임이 맞도록 융하되는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 DNA서열이 락타제 유전자의 N-말단의 적어도 4개의 아미노사을 코드화 하는 제2DNA서열에 융합되는 것을 특징으로 하는 DNA구조제.
  27. 플라스미드 pKS105.
  28. 플라스미드 pGB901.
  29. 플라스미드 pGBTPA1.
  30. 플라스미드 pGBHSA3.
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