JPH02222685A - ピキア，パストリスのグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 - Google Patents

ピキア，パストリスのグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子

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JPH02222685A
JPH02222685A JP1334693A JP33469389A JPH02222685A JP H02222685 A JPH02222685 A JP H02222685A JP 1334693 A JP1334693 A JP 1334693A JP 33469389 A JP33469389 A JP 33469389A JP H02222685 A JPH02222685 A JP H02222685A
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dna
gapdh
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gene
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
る。本発明の一つの態様においては、本発明はピキア・
パストリス（Ｐｉｃｂｉａ　Ｐｓｓｔｏｒｉｓ）のグリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の
全部もしくは一部を含んでいる新規ＤＮＡ断片に関する
。本発明の他の態様において本発明は上記のＤＮＡ断片
の使用に関している。更に、本発明の他の態様において
、本発明は新規ベクター及びこれらの上記ＤＮＡ断片で
形質転換された細胞に関する。
（従来の技術） 近年、組換えＤＮＡバイオテクノロジーが発達してきた
ので、多くの種々の有用なポリペプチドの細胞による制
御された生産が可能となってきた。
多くの真核細胞ポリペプチド、例えばヒト成長ホルモン
、白血球インターフェロン、ヒトインシュリン及びヒト
プロインシュリンが種々の組換え細胞で生産されている
。現在既に実用できる技術を連続的に適用することによ
り種々の他の有用なポリペプチド生成物の生産が将来可
能となることが予想されている。
組換え技術の分野において用いら・れる基礎的技術はこ
の分野の当業者には周知である。組換えＤＮＡバイオテ
クノロジーの実施のために存在すべき望ましい要素は、
下記のものに限定されないが：（１）宿主細胞中で発現
を制御する調節領域に機能可能なように連結した、ｌも
しくは１以上の所望のポリペプチドをコードする遺伝子
であって、機能可能なように連結したとはその成分がそ
れらの通常の機能を果たせるように配置されている並置
を言う。
（２）ベクター、通常ヌクレオチド配列を挿入可能なプ
ラスミド；ベクターは宿主を形質転換可能な構築物を含
むいかなるヌクレオチド配列であっても良い。
（３）所望のヌクレオチド配列を移入できる適当な宿主
であって、その宿主は移入されたヌクレオチド配列中に
コードされた情報を発現するための細胞器官をも有して
いる。
ＤＮＡからＲＮＡへの高いレベルの転写を提供でき且つ
外因性の環境刺激に対して応答する５′調節領域を有し
ていることは特に望ましい。現在のところ、高生産性発
酵酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉｘ　ｐｓｓｊｏ
ｒｉｓ）で使用でき、しかもグルコース、グリセロール
及びメタノールのような種々の炭素源の存在に対して応
答して転写を起こさせる５′調節領域は当分野では知ら
れていない。グルコース、グリセロール及びメタノール
は比較的高価ではなく、容易に利用できる炭素源である
ので、これらの炭素源の存在に応答して高速で転写を起
こす調節領域を単離することはこの分野に大きな寄与を
するであろう。
（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的は例えばグルコース、グリセロー
ル及びメタノールのような種々の炭素源に応答して効率
良く転写される５′調節領域を提供することである。
本発明の更に別の目的は少なくとも一つのポリペプチド
をコードしている異種ＤＮＡ配列に機能可能なように連
結した前記５′調節領域を含んでいるベクター及び前記
調節領域を少なくとも一つのポリペプチドをコードして
いる異種ＤＮＡ配列の発現を容易にするために誘導する
方法を提供することである。
本発明の別の目的は３′転写終結配列（ｌｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｏ　Ｌｅｒｍｉｎ＊ｔｉｏｎ　５ｓｑｕｅａ
ｃｅ）を提供することである。
更に、本発明の別の目的はピキア・パストリスのグリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡ
ＰＤＨと略す）構造遺伝子を提供することである。
本発明の他の態様、目的及び幾つかの効果は本明細書、
実施例及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明によれば、本質的にピキア・パストリスのＧＡＰ
ＤＨ５’調節領域からなる新規ＤＮＡ断片が提供される
。
本発明の他の実施態様は原核細胞及び真核細胞からなる
群から選択される細胞内において複製可能なＧＡＰＤＨ
５’調節領域を含む新規ベクターを提供する。
更に、本発明の他の実施態様は、少なくとも一つのポリ
ペプチドをコードしている異質ＤＮＡ配列の高レベル発
現を容易にするＧＡＰＤＨ５’調節領域を活性化するた
めの方法であって、即ち、異種ＤＮＡ配列に機能可能な
ように連結したＧＡＰＤＨ５’調節領域で形質転換され
た適当な宿主細胞をグルコース、グリセロール及び／又
はメタノールからなる群から選択されｔ；化合物もしく
はそれらの混合物と宿主細胞が宿主の増殖に適当な条件
下で前記化合物を容易に摂取できるような条件下で接触
させることを含んでいる方法である。
本発明の更に他の実施態様においては、本質的にピキア
・パストリスＧＡＰＤＨ３’転写終結配列を含んでいる
新規ＤＮＡ断片を単離することである。
本発明の別の実施態様においては、本質的にピキア・パ
ストリスＧＡＰＤＨ構造遺伝子を含んでいる新規な単離
されたＤＮＡ断片を提供することである。
（課題を解決するための手段） 本発明を具体的に説明する前にその理解を容易にするた
めに図面について簡単に説明する。
第１図はピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子の制限地
図の概略を提供している。制限地図ＡはＧＡＰＤＨ５’
調節領域、ＧＡＰＤＨ構造遺伝子（ＧＡＰＤＨポリペプ
チドをコードしている）、及び３　’　ＧＡＰＤＨ転写
終結配列の位置を示している。図面中のアステリスクは
複数の制限部位を示しており、それらについて全ての部
位は断片内に示されていない。制限地図Ｂ及・びＣはＧ
ＡＰＤＨ５’調節領域の２つのＤＮＡ断片を示しており
、それらはＤＮＡからＲＮＡへの転写を有効にすること
ができる。制限断片Ｂも配列決定されており、それは表
１に示されるおよそヌクレオチド−４９０付近で始まり
、そしておよそヌクレオチドｌ付近まで及んでいる。制
限地図りはＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ構造遺伝子中に存在する
制限部位の地図を提供している。制限地図ＥはＧＡＰＤ
Ｈ３’転写終結配列の制限地図を提供している。
第２図はプラスミドＰＲＡＩＩＯの構築の概略を提供し
ている。
第３図はプラスミドｐｓＬ１９の構築の概略を提供して
いる。略号ＧＡＰＤＨｐはＧＡＰＤＨ５’調節領域断片
を表している。
第４図はプラスミドｐｓＬ２０Ａの制限地図の概略を提
供している。略号ＧＡＰＤＩ−１ｐはＧＡＰＤＨ５’調
節領域断片を表している。
添付図面において、ヌクレオチド配列の操作に使用され
た制限部位は、連結のときに破壊されてしまうが、破壊
された部位について略号を括弧で囲むことによって示さ
れている。
本発明によれば、ピキア・パストリス由来のＧＡＰＤＨ
遺伝子を含む新規の単離されたＤＮＡ断片が提供される
。ピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子及び７ランキン
グ（ｆｌｓｎｋｉＢ）Ｄ　Ｎ　Ａの制限地図の一部は第
１図に提供されている。この遺伝子は表１に提供されて
いる部分的ヌクレオチド配列によって更に特徴ずけられ
る。
ピキア・パストリス由来のＧＡＰＤＨ５１１４節領域を
含んでいる新規ＤＮＡ断片も本発明により提供される。
表　　１ ピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子の部分的ヌクレオ
チド配列 ｒＣＴ 翫ｎＨＩ ＧＧＡＴαゴｍ ＾α：ＣＡＴＣＴＣｒＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＣｒＣＣ
ＧＴＴＧＣＡＡＣＴＡＡＡＡＣｒＴＡＡＡＴＧＴ圓Ａ（
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ＡにＧＡＡＡＴｒＴＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣ
ＴＴＴＴｃＴ ＾ＣＧＴＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＡα；ＧＡＡ（ＴＣＧＴ
ＧＴＡＣＣＣＡＣＣＴ ＴＡＡＴ＾αηχα石＾α℃＾ＴＧＴＣＡＴＧａ ＣＡＡＡＧＡＣｒｒｒＡＡＡＴ１ゴＡＡｍＡｍＧＴＣＣ
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ＡＡＡＣＡＣＡ＾ＴＧＧＣＴ＾丁ＣＡＣＴＧＴＣＧＧＴ
ＡＴＴ＾＾ＣＧＧＴＴＴＣＧＧＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＣ
ＧＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＣＴ　ＣＴ
Ｔ　ＴＣＣＡＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＴ
Ｔ　ＧＴｒ　ＧＣｒ　ＡＴＣＡＡＣＧＡＣ＋１０　　　
　　１２０　　　　　１３０　　　　　　！４０　　　
　　１５０ＣＣＡ　ＴｒＣＡｎ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡ
Ａ　ＴＡＣＧ（ゴαゴＴＡＣＡＴＧ　ＴＴＣＡＡＧ　Ｔ
ＡＣＧＡＣＴＣＴ　ＡＣＣ＋６０　　　　　１７０　　
　　　１８０　　　　　１９０　　　　　２００ＣＡＣ
ＡＡに　ＧＣＴ　ＴＡＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＧＴ
Ｔ　ＴＣＴα：ＣＡにＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＴＣＡ
ＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＴ　ＡＡＡ　にＡＡ　ＡＴＣＡＣ
ＣＧＴＴ　ＴｒＣＣＡＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣＣＣ
ｒ　ＧＴＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＳａｉ＋ ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＣＧＡ
ＣＴＡＣＧＴＣＡＴｒ　ＧＡＧ　ＴＣＣ＾ｃｃ　ｃａ　
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ＧＴ　ＧＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＴＣＡ
ＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＣＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＣＴ
　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣＧＴＴ　ＧＴＣＧＧＴ　ＧＴ
ＣＡＡＣＧＡに　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＴ　ＴＣ
Ｔ　ＧＡＣＴｒＧ　ＡＡＣＡＴＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＡＴ
　ＣＯＴＣＴ　ＴＧＴ　ＡＣｒＡＣＣＡＡＣＴＧＴ　ｍ
　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＧＣＣＡＡＧ　ＧＴＴ　Ｇ
ＴＣＡＡＣＧＡＣＡＣｒ買ＣＧＧＡ　ＡＴＴ５１０　　
　　．５２０　　　　　５３０　　　　５３０　　　　
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ＣＧＴＣＣＡＣＴＣＣＡ丁にＡＣＣＧＣＧＡＣＴＣＡＡ
ＡＡＧ５６０　　　　　５７０　　　　　５８０　　　
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Ａ　ＧＧＩα汀ＡＧＡ　ＡＣＧαゴＴＣｒ６１０　　　
　　６２０　　　　　６３０　　　　　　［￥１０　　
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ＣＴ　ＴＣＣＡＣＴαｒ　ｃｃｒ　Ｇ（ゴＡＡＧ　ＧＣ
ＣＧＴＣＧＧＴ　ＡＡＧ　ＧＴＴ６６０　　　　　６７
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ＧＡＧ　ＧＡＧ　　ＡＴＣＡＡＧ　丁ＣＴ　ＧＴＴ　　
ＡＴＣＡＡＧ　ＧＣｒ　ＧＣＴ　ＴＣＣＧＡＧ　ＧＧＴ
　　ＡＡＧ　ＣＴＣＡＡＧ　にＧＴ　（Ｔｒ　ＴｒＧ　
ＧＧＴ　ＴＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴα℃ａ了ＧＴＣ
ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＣ没損　　　　　８７θ　
　　　　　　羽０８９０　　　　　　更ＴＴＧ　ＧＧＴ
　ＧＡＣＧＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧ
ＡＣＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＣＧＧＴ　ＡＴｒ　ＣＡＡ　
ＴＴＧＡＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＧＴＣＡＡＧ　
ＣＴＧ　ＡＴＣＴＣＴ　ＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＣＡＡＣＧ
ＡＧ　ＴＡＣαゴＳｅｌ＋ ＴＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡ　ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＧ
　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＡＣＧＴＴ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　Ｇ
ＣＴ　ＴＡＡ＋０１０　　　１０２０　　　１０３０　
　　１０４０　　　１０５０　　　１０６０　　　１０
７０ｌａｌ ＡＴＣＧＡｍＧＴ　ＡＴ（ＴＧＡ　Ａ　ＡＴ　ＡＧＣＴ
Ｇ　ＡＡ　ＡＴＴＣにＡ　ＡＡＡｍＣＡＴｒＡＴＧＧＣ
ＴｆｆＡＴＣＴＡＣＴＴｒＡＧＣＧＴＡＴｒ　Ａ１０８
０　　　１０９０　　　１１００　　　１１１０　　　
１１２０　　　１１３０　　　１１４ＯＡ（ＴＧＴＧＴ
ＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴｒＣαｍα刀ＡＴＣ＋
１５０　　　１１６０　　　１１７０ＡＴＴＴｒＡＴＴ
ｒＴＣＡＧＡＴＡＡＣＡαゴにＡＡにＭ丁汀πη汀＋２
２０　　　１２３０　　　１２４０　　　１２５０　　
　１２６０　　　　！２７０　　　１２８０ＣＧＧＡＧ
ＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧ
ＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＴＣＣＴσＡＡＴＡＡＡＧ
ＧＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＴ＋２９０　　　１３００
　　　１３１０ＣｍＧＴＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣσロ
ゴ＾Ｔｒｃｃｒ＋３２０ ■３３０ ■３４０ ＴｅｌηπＣ １３６０！３７０　　１３７９ 丁ＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＧ’ｒＣＣＴＴＡＴ
ＣＴＡＡＡ更に本発明によれば、ピキア・パストリス由
来のＧＡＰＤＨ遺伝子の転写終結配列を含んでいる新規
ＤＮＡ断片が提供される。
更に本発明の別の実施態様において、ピキア・パストリ
スＧＡＰＤＨポリペプチドをコードするＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ
　）Ｉ構造遺伝子が提供される。
ピキア・パストリスのＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤ
Ｈ５’調節領域及びＧＡＰＤ）（３’転写終結配列は例
えばＮＲＲＬ＃１１４３０のようなピキア・パストリス
株から下記の実施例に記載されているのと同様の方法で
回収することができる。
ピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子を回収するための
一般的方法は、例えば類縁の酵母からのＧＡＰＤＨ遺伝
子断片のようなＧＡＰＤＨグローブをサザンプロットに
おいてピキア・パストリスＤＮＡのライブラリーをスク
リーニングするために使用することからなっている。ム
スチ（Ｍａｓｔｉ）らのＧｅｎｅ　２５．１３３−１４
３（１９８３）に開示されているプラスミドｐｐ６ｙ由
来の２．２ｋｂＨｉｎｄｌＩＩ断片は使用することので
きる適当なグローブであろう。
他のプローブは表１に開示された配列に基づいて選択も
しくは合成されるであろう。サザンプロツトは当業者に
知られている如何なる方法によっても実施できる。ピキ
ア・パストリスライブラリーは、フレラグ（Ｃｒｅｔｔ
）らによるＭ６１．　ＣＣ１１Ｂｉｏ、　Ｓ。
３３７６−３３８５（１９Ｎ）に述べられている方法、
これに限定する意図ではないが、そのような方法を含む
当分野で知られている技術によって調製できる。
ピキア・パストリスからこの遺伝子を単離するための他
の方法も利用することができる。
ＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領域断片（
第１図（Ｂ））及びＧＡＰＤＨ３’転写終結配列は表１
に提供されているヌクレオチド配列を使用すること及び
その配列を既知の酵素的もしくは化学的手段を用いて合
成することによって得ることができる。限定するつもり
はないが、適当な手段にはホスホトリエステル、ホスフ
ァイト、もしくはシアノエチルホスホルアミダイト化学
法に基づく化学的方法がある。
当業者は、本発明の単離されたピキア・パストリスＧＡ
ＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領域もしくはＧ
ＡＰＤＨ３’転写終結配列と後に単離されるピキア・パ
ストリスＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領
域もしくはＧＡＰＤＨ３’転写終結配列とを比較すると
遺伝的浮動もしくは起こる可能性のある配列エラーのた
めに最小ＩＩ（ｄｅ　ｍ１ｎｉｓ＋ｉｓ）の数の差異を
含んでいることを認識するであろう。
ＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領域及びＧ
ＡＰＤＨ３’転写終結配列に対する修飾も、例えば新た
な制限部位を提供したり、存在している５′もしくは３
′制限部位を除去したり又はｌｌｉ片をプラントエンド
にするためにＤＮＡリンカ−を付加することもしくはＭ
１３１３変異誘行うことによって行うことができる。
−旦、ＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領域
及びＧＡＰＤＨ３’転写終結配列が回収されると、それ
は真核細胞のもしくは原核細胞のプラスミド−宿主系、
例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中に保持されているｐ
ＢＲ３２２もしくは当分野で知られている他のどのよう
な適当な系でも維持でき複製される。
当業者は数多くの追加のＤＮＡ配列を使用されるベクタ
ー、僅かの代表的例のみを言うならば例えば細菌プラス
ミドＤＮＡ、マーカー遺伝子、バクテリオファージＤＮ
Ａ、自己複製配列に取り込ませることができることは理
解できるであろう。
ＧＡＰＤＨ５’調節領域はおよそヌクレオチド−１２０
０付近のＢｇｌ■部位からおよそヌクレオチド１６付近
にある構造遺伝子の開始点の近くのおよそＡａｔ［１部
位付近までのＤＮＡ断片内に含まれている（第１図（Ａ
）を参照）。しかし、この断片の３′末端はヌクレオチ
ドｌで効果に影響を与えることなく終わることができる
。ＧＡＰＤＨ５’調節領域はヌクレオチド−４９０付近
のＢａｍＨ１部位で始まりヌクレオチド１付近までのお
よそ４９０塩基対ＤＮＡ断片中に回収することもできる
。使い易くするために、制限部位をヌクレオチドｌ付近
に挿入しても良く、例えばＥｃｏＲ１部位が表１中の下
の箱の文字中に示されＩ；。
実施例７はある一つの方法を示しており、それによって
ＥｃｏＲＩ部位がｍ１３変異誘発を用いてヌクレオチド
ｌ付近（表１中の下方の箱の文字で示されている）に挿
入され、従ってＧＡＰＤＨ５′調節領域として機能する
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ■断片を提供する（第１図（Ｂ）
参照）。Ｂｇｌｌｌ−Ａａｔｌｌ断片及びＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ断片の両方とも、少なくとも一つのポリペプ
チドをコードしている異種ＤＮＡの５′末端に位置して
おり且つａｔ＃！可能なように連結している場合にＤＮ
ＡからＲＮＡへの転写を有効に行わせることができる。
ここで開示されたＧＡＰＤＩ５　’調節領域を利用する
ために、第１図ＢもしくはＣに述べられた断片を少なく
とも一つのポリペプチドをコードしている異種ＤＮＡ配
列に機能可能なように連結させることができる。本明細
書の目的においては、異種ＤＮＡ配列は前記調節領域と
結合しては天然には存在しないＤＮＡ配列の組み合わせ
である。
ＧＡＰＤＩ５　’調節領域に機能可能なように連結でき
る少なくとも一つのポリペプチドをコードしている適当
な異種ＤＮＡ配列には、これらに限定する意図はないが
、ストレプトキナーゼ、ティシュブラスミノーゲンアク
チベーター、肝炎表面抗原及びウシリゾチームがある。
本発明と共に使用できる異種ＤＮＡは５　’　ＡＴＧ開
始コドン、３′終止コドンを含んでいなければならず、
及びｍＲＮＡを安定化する又はポリアデニル化を導く機
能を有している追加のヌクレオチド配列を含んでいても
良い。
異種ＤＮＡ配列に機能可能なように連結したＧＡＰＤＩ
５　’調節領域の組み合わせは適当なベクター内に挿入
されても良い。数多くの酵母−宿主細胞組み合わせが可
能であり、当業者には周知である。マーカー遺伝子又は
ベクターを細菌や酵母内での迅速な増殖や増殖に伴う増
幅が可能なようにする追加の配列が存在しても良い。
ＧＡＰＤＩ５　’調節領域の使用のための適当な宿主細
胞には例えばサツカロマイセス（Ｓａｃｃｈｘｒｏｍ凹
）、ピキア（Ｐｉｃｂｉｎ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅ
ａｕｌａ）のような酵母があり、特にピキア・パストリ
ス（Ｐｉｃｂｉｓ　ｐａｓｊｏｒｉｓ）が好ましい。
ＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ５’調節領域又はＧ
ＡＰＤＩ３　’転写終結配列を宿主細胞株への適合性ベ
クターによる形質転換は当業者Ｉこは周知の適当な形質
転換法によって行うことができる。
適当な宿主に形質転換された異種ＤＮＡ配列に機能可能
なように連結したＧＡＰＤＩ５　’調節領域はＤＮＡか
らＲＮＡへの転写を可能にするであろう。適当な宿主に
形質転換された調節領域に機能可能なように連結した異
種ＤＮＡ配列の発現は、形質転換された宿主を例えばグ
ルコース、グリセロール及び／又はメタノールからなる
群から選択されるような種々の炭素源と宿主細胞の増殖
にとって適当な条件下で上記に挙げた化合物の一つを宿
主が摂取できるような状態で接触させることを含む方法
を用いて高いレベルの発現に誘導することが可能である
。グルコース及びグリセロールが宿主細胞に形質転換さ
れＩ：ＧＡＰＤＨ５’調節領域に機能可能なように連結
した異種ＤＮＡ配列の高い転写レベルを誘導するために
現在のところ好ましい。
全ての酵母が全ての炭素源を利用できないことは理解さ
れるであろう。それゆえに、高いレベルの転写を得るた
めにはグルコース、グリセロール又はメタノールを利用
することのできる酵母を選択することが有利である。し
かし、これらの炭素源を利用できない酵母においてさえ
も、低いレベルの転写が観察される。
当業者は高い効率の転写を得るだめのグルコース、グリ
セロール及び／又はメタノールの最適量が種々の因子に
依存してまた酵母によっても変化することは理解できる
であろう。ピキア・パストリスについて、高いレベルの
転写は少なくとも一つのポリペプチドをコードしている
異種ＤＮＡ配列に機能可能なように連結したＧＡＰＤＩ
（５’調節領域で形質転換された細胞から次の条件下で
得られると現在のところ考えられる＝　（ａ）メタノー
ル濃度は約０．２％〜約１．５％（％は培地の体積に対
する重量）、好ましくは約０．５％（％は培地の体積に
対する重量）であり；　（ｂ）グルコ−ス濃度は約１％
〜約５％（％は培地の体積に対する重量）、好ましくは
約２％（％培地の体積に対する重量）であり；及び（Ｃ
）グリセロール濃度は約１％〜約５％（％は培地の体積
に対する重量）、好ましくは約２％（％は培地の体積に
対する重量）であり、他の全ての栄養物及び増殖に必要
なものは適切に供給されている。グルコース、グリセロ
ールもしくはメタノールを利用できる他の酵母では高い
レベルの転写を得るのに異なった範囲の濃度となること
が予想されるが、その範囲は当業者によって決定するこ
とができるであろう。
ＧＡＰＤＨ遺伝子のＧＡＰＤＨ３’転写終結配列は、ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列の３′に結合すると
ｍ　ＲＮ　Ａ転写を終わらせ又はｍ　ＲＮＡを安定化す
ると考えれている。この３′終結配列は表１に示される
およそヌクレオチド１００５付近からおよそヌクレオチ
ド１３８０付近に及ぶ部分的ヌクレオチド配列によって
更に特徴付けられた。そのＧＡＰＤＨ３’転写終結配列
はおよそヌクレオチド９７０付近のＣｌａｌ部位付近か
らおよそヌクレオチド２０００付近のＢｇｌＨ部位付近
に及ぶＤＮＡ断片内に含まれている（第１図（Ｆ）に示
されている）。しかし、ＧＡＰＤＨ３’終結配列はＧＡ
ＰＤＨ終止コドンの約３００塩基対３′のみを必要とし
ており、それはｍＲＮＡ転写を終了させるためにおよそ
ヌクレオチド１０００付近に位置している（表１参照）
。従って、ＧＡＰＤＨ３’転写終結配列はＧＡＰＤＨ構
造遺伝子に対するＤＮＡ３’のおよそ３００からおよそ
１０００ヌクレオチドからなることができる。しかし、
メツセンジャーＲＮＡ転写終結を強化するためｌ：１０
〜３０個の５′ヌクレオチドから終止コドンまでを含む
こともピキア・パストリスにおいて有用であることを発
見した。ＧＡＰＤＨ３’転写終結配列はおよそｉ　ｏｏ
ｏヌクレオチドからなるＣ１ａｌ−Ｂｇｌ■断片として
利用することが現在のところ好ましい。ＧＡＰＤＨ３’
転写終結配列はポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配
列に機能可能なように連結することができ、そして例え
ばサツカロマイセス、ピキア及び／）ンゼヌラのような
酵母内でのｍＲＮＡの安定化又は転写の終結に利用され
るが、特にピキア・パストリス内での使用に適している
。
ＧＡＰＤＨ構造遺伝子はおよそヌクレオチド１付近から
およそヌクレオチド９９９付近に及んでいる（表１又は
第１図（Ｄ）参照）。Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ構造遺伝子は
種々の目的、限定する意図はないが例えば（ａ）追加の
相同性組換えを実施するためのＤＮＡ構築（異種ＤＮＡ
配列をピキア・パストリスゲノムのＧＡＰＤＨの位置に
ＧＡＰＤＨ遺伝子活性を破壊することなく挿入するため
の方法）及び（ｂ）アッセイのためのピキア・パストリ
スのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
蛋白質の生産のために組換えバイオテクノロジーにおい
で利用できる。
以下に示す非制限的実施例は本発明の詳細な説明するた
めに提供されている。
実施例の一般的情報 株 ピキア・パストリスス（Ｐｉｃｈｉｘ　ｐｉｓｔｏｒｉ
すＮＨＬ　Ｙ−ピキア・パストリスＧ５ｌｌ５（ｈｉｓ
４）ＮＲＲＬ　ＹｉＳ８５！。
アメリカ合衆国農務省ノーザンレギオナノしリサーチラ
ボラトリ−（Ｔｈｅ　Ｎｏｒｌｈｅｒ＋＋　１ｅｔｉｏ
ａｓｌ　Ｒｅ５ａｒｅｂ　ＬｘｂｏｒｉＬａｒｉｅｓ）
に１９８４年８月３１日に寄託されている。
大腸菌（Ｅ、　ｅ・ｌｉ）　ＭＣ１０６１［Ｆ−ｓｒａ
Ｄ１３９Δ（ｉｒｓＡＢＤＩＣ−１ｅｕ）　　フロア９
Δ１ＩＣＸ７４　　Ｈｌｌｌ　　ｇａｌＫ　　ｒｐｓＬ
　　ｂｓｄＲ］大腸菌ＪＭ１０３Δ（Ｉｉｃｐｒｏ）　
ｔｈｉ　ｒｐｓｌ　（ｓｊｒＡ）　５ｕｐＥ　ｅｎｄＡ
　５ｂｅＢ　ｂｓｄＲ １２１，１［トリス塩基／８００ｍａ水；濃塩厳（３５
％）を添加することによ？ｐＨを所望の値に調整する；
溶液を最終的なりＨ調整の前に室温まで冷却し、最終容
１１１１１まで希釈する。
ＴＥ緩衝液 ０．１ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡｌｏ、ＯＩＭ　トリス緩衝液（
ｐｉ−（１，０）ＳＣ Ｏ，ｌＳＭ　ＮΔＣ１ ０、ＨＭクエン酸ナトリウム Ｎａ０Ｂ″ｃｐＨを７　、　Ｄ　ｌ：調整するデンハル
ト溶液（ＤｅａｋＪｒｄｌ’ｓ　ｓｏｌ＋＋ｌｊａｍ）
５ｇフィコール ５！ポリビニルビａリドン ロウシ血清アルグミン（ＢＳＡ；ペンタックス画分マ） 水で全容量を５００ｍ　ｌにした ２０ＸＳＳＰＥ ２０ｍＭ　　ＥＤＴＡ ０．２１　Ｎａ［Ｉ、ＰＯ４・［Ｉ、０３．６Ｍ　ＮＩ
Ｃ＋ ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した Ｌ　Ｂ　（Ｌｕｒｉｓ−Ｂｅｒｔｓｓｉ）培地ｌｏｔバ
クトートリブトン ５ｇバクトー酵母エキス １０ｇ　ＮａＣ１ １水中でｐＨを８１０［１で７．５に調整したＹＰＤ培
地 １％バクトー酵母エキス ２％バクト〜ペプトン ２ｘデキストロース ＹＰＤアガー ＹＰＤ培地＋２％アガー ＹＮＢ培地 ６．７５ｇアミノ酸を含まない酵母窒素塩基（ＤＩＦＣ
Ｏ）／１０水 ＥＤ １Ｍソルビトール ＨｍＭ　ＥＤＴＡ ５０ｓ＋Ｖ　　ＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液 ９．１８ソルビトール １．４７ｇクエン酸ナトリウム ０．１６８！　ＥＤＴＡ ＳＯｓ＋１　１１．Ｏ ｐＨを１ｌｃｌｒｓ、Ｈ：：調整シタ ａＳ １Ｍソルビトール ＋０鵬Ｍ　　ＣｅＣｌ３ 濾過滅菌 ＰＥＧ溶液 ２０％ポリエチレングリコール−３３５０１０膳Ｍ　　
ＣｌＣｌ２ １０ｍＭ　トリス−［ＩＣ１（ｐ［ｌ？、４）濾過滅菌 ホルムアミド染料混合物 ０．１％キシレンシレノール（ｃｙｌｅｎｏｌ）ＦＦＯ
，２％ブロモフェノールブルー １０ｍＭ　ＥＤＴＡ ９５％脱イオンホルムアミド アクリルアミド原液 ３８ｇアクリルアミド ２ｇビス（Ｎ、トメチレンビスアクリルアミド）水を添
加して全容量を１００ｍ　１にしたボトムゲル 目、４！尿素 ３．０客スクロース ？、Ｓｍｌ　ｌａｘ　ＴＢＥ ４、Ｓ１アクリルアミド厚液 ０．３１ブロモフエノールブルー溶液（０，０１１／ｍ
ｌ）水を添加して全容量を３０ｍ１にした ジデオキシ： ｄｄＡＴＰ　　　　　Ｏ，１２５膳Ｍ ｄ１ｃＴＰ　　　Ｏ，ｌＯｍＭ ｄｄＧＴＦ’　　　０．ｌｈ＋Ｍ ｄｄＴＴＰ　　　Ｏ，８０ｍＭ ＤＮＴＰＩｊｉ’（液 ０、ＳｍＭ　ｄＧＴＰ Ｏ，ＳｍＭ　ｄＣＴＰ Ｏ，５＋ｓＭ　ＴＴ？ Ｏ，ＳｓＭ　ｄＡＴＰ １０ｒａＭ　）リス・ｆｌｃＩ、ｐ　Ｈ７，５２Ｎｔｍ
Ｍ　　ＮａＣ１ ７０厘Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ ＩｔｓＭ　　ＥＤＴＡ ＴＢＥ緩衝液 ０．０８９Ｍ　ｌ−リス−ポレート ０．０！９Ｍホウ酸 ＳＥＴ（２０ｘ） ３Ｍ　　Ｎ５ＣＩ ０．４Ｍ　ｌ−リス・ｌｌＣｌ、ｐＨ７，８２０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ １０ｘＴＭＤ、　　ｐＨ７，５ ０，１Ｍ　トリス−ｔｌｃｌ、ｐＨ７，５０、，０５Ｍ
　　ＭｔＣｈ ０．０７５Ｍ　　ＤＴＴ Ｏ，ＯＩＭ　　ＡＴＰ 特に断らない限り、上記の溶液は用いる基本（ｌ×）濃
度を示している。実施例を通して、異なった濃度で使用
されており、その場合には基本濃度（ＩＸ）に対す倍率
を付した溶液で表している。
再生アガー ｌ）アガー−ＫＣＩ：９（バクトーアガー、１３．４ｇ
塩化カリウムｊ４０ｍｌＨ２Ｏ、オートクレーブ殺菌。
２）ＩＯＸグルコース：２０露デキストロース、１００
鳳１１１２０、オートクレーブ殺菌 ３　）　ｌａｘ　ＹＮＢｓ６．７５ｇアミノ酸を含まな
い酵母窒素塩基、　１００ｍ１Ｂｔｏ、オートクレーブ
殺菌４）２４０ｍｌｌの溶解したアガー−ＫＣｌ溶液に
ＩＯＸグルコース３０ｍａ及び１０ＸＹＮＢ３０ｍ１！
を添加する。０　、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｉのビオチン
０　、６　ｍ　ａ及び他の必要なアミノ酸もしくは核酸
を２０μｇ　／　ｍ　Ｑの濃度まで添加する。溶解した
再生アガーを５５〜６０°Ｃに保持する。
ザイモリアーゼ（２７ｍｏｌｙｓｓｅ）６０．０００供
給源：マイパスラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌｉｂｅ
ｒａｌｏｒｉｅｓ） 配列決定 ＤＮＡ配列決定はサンガー（ＳｓＢｅｒ）らのＰＮＡＳ
　７４、５４６３（＋９７７）に開示されたジデオキシ
ヌクレオチド鎖−終止法により行った。
次の略号を使用した： ＥＤＴＡ　　エチレンジアミン四酢酸 ＴＭＥＤ　　Ｎ、Ｎ、Ｆｌ’、Ｎ’、−テトラメチレン
ジアミンＤＴＴ　　ジチオスレイトール ＢＳＡ　　ウシ血清アルブミン ＥＬＢｒ　　エチジウムプロミド Ｃｉ　　　キュリー ｄＡＴＰ　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＧＴＰ　　
デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　デオキシチミ
ジン三リン酸ｄＣＴＰ　　デオキシシチジン三リン酸ｄ
ＸＴＰ　　“全部の″゛デオキシ三リン酸ヌクレオチド
制限及びＤＮＡ−修飾酵素はベセスダリサーチラボラト
リーズ（Ｂｅｔｂｅｓｄｉ　Ｒｅ５ｅｓｃｂ　Ｌａｂｏ
ｒｓｔｅｒｉｅｓ）、ニューイングランドバイオラボ（
Ｎｅｖ　Ｅａ（Ｉｓｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）又はベーリ
ンガーマンノ１イム（ＢｏｅｈｒｉａＨｅｒＭ為＋＋＋
＋ｈｅｉ鴎）から購入した。
実施例１ ピキア・パストリスからのＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ遺伝子の
単２０ｐｇのｐｐ６ｙプラスミド（Ｍａｓｔｉら、Ｇｅ
ｎｅ２５、　Ｈ３（＋９１３））をＨｉｎｄｌ［［で消
化した。２゜２ＫｂのＨｉｎｄＩ［！断片を０．８％ア
ガロースゲルから単離し、モしてニックトランスレーシ
ョンで標識した（Ｍｘｎｉｘｔｉｓら、１９８３年）。
この断片は３つのサカロマイセス・セルビツシエーのグ
リセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の
一つのコード配列の殆ど及び５′配列を含んでい　Ｉこ
　。
ピキア・パストリスＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３０からの
ゲノムＤＮＡ６μｇ（実施例３に従って調製）をＥｃｏ
ＲＩもしくはＨｉｎｄｎｌで消化した。
このゲノムＤＮＡをｂｕｇの切断ゲノムＤＮＡ／レーン
及び上記の標識された２、２ｋｂＨｉｎｄ■断片を用い
てサザンフイルターハイブリダイゼーションによってス
クリーニングした。両方の消化によってハイブリダイゼ
ーションの単一バンドが現れｔ二。
このプローブをピキア・パストリスゲノムＤＮＡのライ
ブラリーをスクリーニングするのにも使用した。このラ
イブラリーは以府に開示されており　　（Ｍｏ１．　　
　ｓａｄ　　Ｃｅ１ｌ　　　Ｂｉｏ、　　　５．　　３
３７６（１９Ｎ））　　、　　ＹＥｐ１３　（ＡＴＣＣ
３７１１５）のＢａｍＨ１部位に挿入されたピキアゲノ
ムＤＮＡの５ａｕ３Ａの部分消化物である。そのライブ
ラリーを、受容能ＭＣ１０６１細菌細胞を形質転換しく
ＭｓａｉｉＬｊｓら、１９３２年）、これらの細胞をＬ
Ｂ及び５０μｇ／　ｍ　１１アンピシリンプレートに撒
き、そしてグルンステイン（Ｇｒａｎｓｔｅｉｍ）及び
ホグネス（Ｈｏｇｍｅｓｓ）のＰＮＡＳ　７２：３９６
１（１９７５）に記載されたようにフィルターリフトを
行うことによりスクリーニングした。
個々の陽性コロニーを標準的ミニプレプ（鳳１ｉｉｐｒ
ｅｐ）法で調製されたＤＮＡのＢａｍＨＩ、Ｓａ　Ｉ　
１゜及びＰｖｕｎ消化を用いて調べた（Ｍｓａｉｘｔｉ
ｓら、１９８２年）。これらのミニプレプ消化から、３
つの明瞭な、しかし重複しているクローンを同定し、そ
してそれぞれｐＰＧＡＰ−６、ｐＰＧＡＰ７、及びｐＰ
ＧＡＰ−９と命名した。これらの構成物の部分的制限地
図は第１図に示されている。
ＧＡＰＤＨ構造遺伝子を含んでいるゲノムクローンの制
限断片をクローンのサザンプロットにおいてサツカロマ
イセスプローブとのハイブリダイゼーションによって同
定した。これらのプロットに基づいて、およそ７００ｂ
ｐの５ａｌＩ断片が強くハイブリダイゼーションし、そ
して隣接のおよそ７６０ｂｐＢａｍＨＩ−５ａ　Ｉ　Ｉ
断片もハイブリダイゼーションした。これらの断片を４
０μｇのｐＰＧＡＰ−６を５ａｌＩ及びＢａｍＨＩで消
化して後０，８％アガロースゲルから単離した。
その７００ｂｐの５ａｌＩ断片を５ａｌＩ−消化及びア
ルカリホスファターゼ処理Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡにサブ
クローンし、Ｇｌと命名されたＭ１３サブクローンを得
た。同様に、７６０ｂｐＳａ！Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を５
ａｌＩ−及びＢａｍＨＩ−１３断及びアルカリホスファ
ターゼ−処理Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡにサブクローンし、
Ｇ１５と命名されたＭ１３サブクローンを得た。他のＤ
ＮＡはＤＮＡ配列決定に使用した。カルボキシル末端コ
ード及び３′非コ一ド配列を他のＭ１３サブクローンか
らの鋳型ＤＮＡの配列決定によって決定した。ピキア・
パストリスＧＡＰＤＨ構造遺伝子及び周囲の５′及び３
′ゲノムＤＮＡの配列は表１に示されている。フィルタ
ー結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーシヨンについて
は、精製ＤＮＡをＩ　ＸＴＢＥ緩衝０．７％アガロース
ゲルによる電気泳動（Ｍｓａｉｉｔｉｓら、１９８２年
）に付し、そして標準的方法（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
＋＋）、Ｊ、　Ｍｏｌ。
！ｌｉｅ、　９１．５０３（１９７５））に従ってニト
ロセルロースフィルターに移した。細菌コロニーからの
ＤＮＡを標準的方法（グルンステイン及びホグネス、ｆ
’Ｎ＾Ｓ　７Ｌ　３９６１（１９７５））を用いたクロ
ランフェニコール増幅の後ニトロセルロースに移した。
ニックトランスレーションによるＤＮＡの標識は標準的
方法（Ｍｓ＋＋ｉｉ口Ｓら、１９８２年）を用いて行っ
た。
ゲノムサザンプロットもしくは細菌コロニートランスフ
ァーに対する交差一種ハイブリダイゼーションは４０％
ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハルト、０．１
％ＳＤＳ、　及び０．１％ピロリン酸ナトリウム中で行
い、そして５０°Ｃで３ＸＳＳＣ，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、０．１％ＳＤＳ及び０．１％ビロリン酸ナトリウムで
洗浄した。
実施例２ ピキア・パストリスの形質転換 酵母細胞を約１０ｍ１ｔのＹＰＤ培地に植菌し、３０°
Ｃで１２〜２０時間振とう培養した。その細胞をＡ、。
。が約０．Ｏｌから約０．１になるように希釈して、そ
してＹＰＤ培地で３０°Ｃで約６〜８時間対数増殖させ
た。Ａ　、、、が約０．１の種培養液０．５ｍ１ｌを１
００ｍＭのＹＰＤ培地に接種して、そして３０℃で約１
２〜２０時間振とう培養した。
Ａ、。。が約０．２〜０．３に達したならば、その培養
液を１５００ｇで５分間の遠心分離（ＤＡＩＪＯＮ　Ｉ
ＣＥ　ＤＰＲ−６０００）により集菌した。
スフェロプラストを調製するために、その細胞を一度１
０ｍ１ｌの無菌水で洗浄しく各洗浄後、上記に述べたよ
うな遠心分離を行った）、調製直後のＳＥＤｌｏｍＱで
１回、無菌の１Ｍソルビトール１０　ｍ　Ｑで１回洗浄
し、ＳＣＥ緩衝液５ｍ１ｌに再懸濁した。４　ｍ　ｇ　
／　ｍ　ｌのザイモリアーゼ６０゜０００（マイルスラ
ボラトリーズ）５μａを添加して、そして細胞を３０’
Ｏで約３０分間インキュベーションした。
スフェロプラスト形成を次のようにして監視した。細胞
の１００μｌアリコートをザイモリアーゼ添加の直前及
び直後、及びインキュベージジン中の種々の時間に５％
５ＤＳ９００μ悲及び１Ｍソルビトール９００μ症に添
加した。インキュベ−ジョンを細胞がＳＤＳ中では溶解
するがソルビトール中では溶解しない時点で停止した。
−旦形成されたスフェロプラストを一度無菌ＬＭソルビ
トール１０ｍ１中で１００ＯＧ、５−１０分間の遠心分
離により洗浄し、そして遠心分離により無菌Ｃａ５１０
ｍｇで１回洗浄し、モしてＣａ５０゜６ｍ１ｌに再懸濁
した。
実際の形質転換については、水中もしくはＴＥ緩衝液中
のＤＮＡサンプル（典型的には全容量２ａｐｔ中にｌ〜
ｔｏμｇ）を１．５ｍｅ工ｙペンドル７マイクロフージ
チユーブに添加しｔ；。（少量のＤＮＡについて、最大
の形質転換が各サンプル中に超音波分散された大腸菌Ｄ
　Ｎ　Ａ　５　ｍ　ｇ　／　ｍ（の約１μ之を用いると
起こる。）スフェロプラスト１００μｌを各ＤＮＡサン
プルに添加し、そして室温で約２０分間インキュベーシ
ョンした。
ＰＥＧ溶液１ｍ１ｌを各サンプルに添加し、そして室温
で約１５分間インキユベーンヨンし、そしてサンプルを
下記に述べるようにプレートに撒いた。
再生アガー１０ｍｆｆ１を形質転換サンプルの準備がで
きる前史なくとも３０分前に各プレートに入れた。再生
アガーの１０ｍ１アリコートを形質転換サンプルがＳＯ
５中にある間に４５〜５０℃の湯浴中のチューブにも分
配した。そしてサンプルをチューブに添加し、固体のボ
トムアガー層を存しているプレート上に注ぎ込み、そし
て３０℃で３〜５日間インキュベーションしｔこ。
スフェロプラストの質は次のようにして測定した。ｔｏ
／７１１のサンプルを取り出し、９９０μＱの１Ｍソル
ビトールに添加することによって１００倍に希釈した。
ｌＯμρの希釈物を取り出し、更に９９０μｌの１Ｍソ
ルビトールを添加した。
両方の希釈物１００μｔをＹＰＤアガープレート上に撒
き調製中に非スフェロプラスト化完全細胞として残った
濃度を測定した。再生可能な全スフェロプラストを測定
するだめの、各希釈物１００μｌを宿主が要求する全て
のアミノ酸４０μｇ　／　ｍ〜を補充された再生アガー
１０ｍ１に添加した。
形質転換実験の良い値は１〜３Ｘ１０’全再生可能スフ
五ロブラスト／　ｍ　１及び約Ｉ　Ｘ　１０’完全細胞
／　ｍ　ｌであった。
実施例３ 酵母ＤＮＡ調製 酵母細胞を２％デキストロースを付加したＹＮＢ培地１
００ｍ１ｌＩ中でＡ、。。がｌ〜２になるまで３０℃で
培養し、そしてダモンＩＥＣＤＰＲ−６０００遠心分離
Ｉｆ！１５で２，０ＯＯＧで５分間遠心してペレット状
にしｔ；。そのベレットをｄＨ２０で１回、ＳＥＤ中で
１回、１Ｍソルビトール中で１回洗浄し、そして０．１
Ｍ１−リス・ＨＣＩ。
ｐＨ７，０，１Ｍソルビトール及び１０ｍＭＥＤＴＡの
溶液Ｓｍｆｆ１中に再懸濁した。その細胞を４ｍ　ｇ　
／　ｍ　ｌのザイモリアーゼ６０，０００（マイルスラ
ボラトリーズ）５０〜１００ｐｆｆｉ　と混合し、３０
°Ｃで１時間インキユベーンヨンした。得られたスフェ
ロプラストを１００ＯＧで５〜ｌＯ分間遠心分離し、そ
して５ｍ１の溶解緩衝液（０，１％ＳＤＳ、１０ｍＭト
リスーＣＩ　　（ｐＨ７，４）、５ｍＭＥＤＴＡ及び５
０ｍＭＮａＣ１）に懸濁しｌ；。プロテイナニゼＫ（ベ
ーリンガーマンハイム）及びＲＮアーゼＡ（シグマ）を
それぞれ１００μｇ　、／　ｍ　ｎとなるように添加し
て、その溶液を３７℃で３０分間インキュベーションし
た。ＤＮＡと同体積のイソアミルアルコールを含むクロ
ロホルム（２４：ｌ、ｖ　／　ｖ　）との１１１ＪＩＩ
物を穏やかに撹拌することによって脱蛋白し、そしてそ
の相を１２０００ｇ、２０分間の遠心分離によって分離
しＩ；。上層（水層）を新しいチューブに抜き取り、同
体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ルの混合物（５０／４８／２）で抽出した。その層を前
記のように分離して、そしてその最上層を２〜３倍体積
の１００％冷エタノールを含んでいるプユーブに入れた
。そのサンプルを穏やかに撹拌して、ＤＮＡをグラスチ
ンク棒上に巻き取ることによって集める。そのＤＮＡを
１ｍｅＴＥ緩衝液に直ぐに溶解して、１００倍体積のＴ
Ｅ緩衝液に対して４℃で一晩透析した。
実施例４ ｐＲＡｌｌｏの構築 １０、ｌｊｇのＩ）ＢＲ３２２をＥｃｏＲＶ及びＰｖｕ
ｌｌで製造元の指示に従って消化した。そのプラスミド
を６６ｍＭトリス−ＣＩ、ｐ　Ｈ７，４，６゜６ｍＭＭ
ｇＣ１２，１０ｍＭＤＴＴ、及び０．４ｍＭＡＴＰ中で
０．５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて４℃で２
４時間結合させた。これはｐＢＲ３２２Δｌと命名され
た。２０μｇのｐＧＡＰ−７（実施例１）をＡａｔｌｌ
及びＥｃｏＲＩで消化した。ピキア・パストリスＧＡＰ
遺伝子の５′非−コード配列及びアミノ末端コード配列
を含んでいる２、８５ｋｂ断片を０．８％アガロースゲ
ルから単離した。１０μｇのｐＢＲ３２２Δ１をＡａｔ
ｌｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、製造元の指示に従って１
００μ区の反応容量中でアルカリホスアフターゼを用い
て脱リン酸化した。３．３μｇのＡａｔｎ−ＥｃｏＲＩ
断片及び１１００ｎのプラスミドを上記のように結合さ
せた。得られたプラスミドをｐＰＧＡＰｌｏｌと命名し
た。１０μｇのｐＰＧＡＰＩＯＩをＡａｔｌｌ出消化し
出土化のように脱リン酸化した。新しいＢｇｌｌ［部位
を次のようにしてＩ）　ＰＧＡＰ　１０１中に作つｔ；
。アダプターオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホ
ルアミダイト化学を用いるアブライドバイオシステムダ
ＤＮＡシンセサイザー、モデル３８０Ａを使用して合成
した： ５　’　−ＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴ−３’５００
ｎＨのオリゴヌクレオチドを８０℃に加熱することによ
ってアンニールし、ゆっくりと冷却し、そしてキナーゼ
処理（Ｌａｉｓ目Ｓら、１９８３年参照）されたアンニ
ールアダプター３０ｎｇ及びｌｏｎｇのＡａｔｌ＋消化
されたｐＰＧＡＰｌｏｌを上記のようにＴ４リガーゼを
用いて結合させＩ；。得られたプラスミドをｐｐＧＡＰ
３４５と命名した。２０ｐｇのｐＰＧＡＰ３４５をＢｇ
ｌｆｆで消化した。Ｉ）　ＰＧＡＰ　３４５から１．２
　ｋ　ｂのＢｇｌ■断片を０．８％アガロースゲルを用
いて単離した。ｉ　ｏｐｇのｐＢＰ　ｆ　ｌ　（ＮＲＲ
ＬｓＢ１５８９２）をＢａｍＨＴで消化し、上記のよう
に脱リン酸化した。１００ｎｇの１．２ｋｂＢｇｌｆｆ
断片及び５ＱｎｇのＢａｍＨｌ−消化且つホスファター
ゼ処理されたｐＢＰｆｌを上記のように結合させた。得
られたプラスミドをｐＲＡｌｌｏと命名し、そしてそれ
はｐＢＰｆｌ由来の大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子
と同じ読み枠で融合したピキア・パストリスＧＡＰＤＨ
３１１伝子の上記の部分を含んでいた。ｐＲＡｌｌｏの
構築は第２図に詳細が示されている。
実施例５ ＧＳ　ｌ　１５　（ｐＲＡｌ　１０）の調製ピキア・パ
ストリスＧ５１１５、ヒスチジン栄養要求株、（ＮＲＲ
Ｌ　　Ｙ−１５８５１；ｈｊｓ４）を実施例２で述べた
ようにプラスミドｐＲＡ１１０（実施例４由来）で形質
転換した。形質転換の前に、ＰＲＡＩＩＯをＢａｍＨＩ
で消化して、宿主ゲノムへのプラスミドの組み込みを容
易にする。個々の安定なＨｉｓ＋形質転換体からのゲノ
ムＤＮＡをサザンフイルターハイプリダイゼーションに
よって分析して、プラスミドのゲノム位置を決定した。
１．５μｇのゲノムＤＮＡを実施例３に従って調製した
。このＤＮＡをＢｇｌｍで消化し、０．７％アガロース
ゲルを使用する電気泳動ヲ行い、そしてニトロセルロー
スフィルターに移しｌ二（サザン、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏ、　９３５０３（＋９７５））。
ピキア・パストリスのＨＩＳ４位置（ｐＹＭ４）に相補
的プローブ及びピキア・パストリスＧＡＰＤＨ位置（ｐ
ＲＡ１０６）に相補的プローブは二ンクトランスレーシ
ョンによって標識され、ｐＲＡ１１０プラスミドの組み
込み部位の決定に使用された。（ｐＲＡ１０６プラスミ
ドは１１００ｎの５ａｌＩ−消化且つアルカリホスファ
ターゼ処理されたｐＵｃ１９ＤＮＡと０．８％アガロー
スゲル電気泳動の後のｐＰＧＡＰ−６ＤＮＡの５ａｌｌ
切断物２０μｇから単離された２００ｎｇの７００ｂｐ
Ｓａ　Ｉ　Ｉ断片とを結合させることによって形成され
ｌ：、、）（プラスミドｐＹＭ４はｐＹＭ３０　（ＮＲ
ＲＬ＃Ｂ−１５８９０）をＣ１ａＩで消化しそしてその
末端を再結合させることによって得られた）ＧＡＰＤＨ
位置に組み込まれたｐＲＡＩＩＯを含んでいる一つの形
質転換体をＧ５１１５　（ｐＲＡｔｔｏ）と命名した。
実施例ｉ ピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター及びＧＡＰ
ＤＨプロモーターの制御及び発現をＧＳｌ　１５　（ｐ
ＲＡＩ　１０）中でのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定
することによって特徴付けｔ；。２％グルコースもしく
は０．５％メタノールのどちらかを含むＹＮＢ培地中で
２５０ｍＭの培養株を３０℃で培養した。培養液を一定
の間隔で希釈して細胞の対数増殖を維持した。２５０Ｄ
ユニツトの細胞（〜１．５Ｘ１０’細胞）のサンプルを
対数増殖期の種々の時間に取り出し、そして−２０’０
で凍結した。
ＧＡＰＤＨプロモーターの強さをＡＯＸ　１プロモータ
ー（これもピキア・パストリスから得られる）と比較し
た。使用したアルコールオキシダーゼ−β−ガラクトシ
ダーゼ融合構築物はｐＳＡＯＨ５、ＮＲＲＬ＃Ｂ−１５
８６２であった。βガラクトシダーゼ活性を次のように
測定した。
１）必要な溶液： Ｚ−緩衝液、ｌリッター　　　　最終濃度ＮＪ、ＢＰＯ
，・７［１２０１６，１（０，０６ＭＮａＨ２ＰＯ４５
，ＳＨＯ，０４Ｍ ＫＣｌ　　　　　　　　　Ｏ，７５ｇ　　　　１１．０
１ＭむＳＯ２・７■２０　　　　　Ｌ２４６（０，ＯＯ
ＩＭ２−メルカｙ＋ｘタノール　　　　　　　２．７ｍ
　ｌ　　　　　　　Ｏ，Ｏ５Ｍ１０にして；ｐＨを７に
する。
０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシＦ（ＯＮＰＧ
）： ０ＮＰＧ　（シダ７Ｎ−１１２７）４００ｍｇを１００
ｍ１！の蒸留水に溶かして４ｍｇ／ｍｅ　０ＮＰＧ溶液
を作った。
２）無細胞蛋白抽出調製 各サンプルをｄＨ２０中で１回、溶解緩衝液（６２、５
ｍ　Ｍ　トリス−ＣＩ、ｐＨ８，７，５ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ
Ｔ　Ａ　、　２　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　）中で１回
洗浄して、４００μ９の溶解緩衝液に再懸濁する。０．
４５ｍｍの大きさのガラスピーズ０．５ｇをサンプルの
４００μｌアリコートに添加し、その混合物を氷上で１
分間隔で６０秒ずつ４回ポルッテクス撹拌した。細胞ス
ラリーをガラスピーズから分離して、懸濁物をマイクロ
フージで５分間遠心分離した。
その上澄液をアッセイのためにポリプロピレンマイクロ
７−ジチユーブに移しｔ；。各抽出物中の全蛋白質量を
ローリ（Ｌｏマｒｙ）アッセイ法で測定した。
ＢＳＡを蛋白質の標準として用いた。
３）アッセイ法 Ｉｐｌの無細胞蛋白質抽出物を１ｍＭのＺ緩衝液に添加
した。その混合物をポルテックス撹拌し、３０°Ｃで５
分間インキュベーションした。反応は０．２ｍＭの０Ｎ
ＰＧ　（４ｍｇ／ｍＱ　）の添加によって開始した。０
　、５　ｍ　Ｍの１ｍＮａ２ｃＯ３溶液を添加して適当
な時に反応を止めた、（Ａ４ｚａ〈ｌ）通常２から５分
間の間である。そして、４２０ｎｍの吸光度を測定する
。
４）β−ガラクトシダーゼ活性ユニットの計算ＩＵはｐ
Ｈ７，３０℃で１分間当たり生成されるオルトニトロフ
ェノール（ＯＮＰ）ｌ　ｎｍｏ　１ｅである。ＯＮＰｌ
ｎｍｏｌｅは１ｃｍ光路長で４２０　ｎ　ｍ　（Ａ４２
６）での吸光度０．００４５を有している。従って、４
２０ｎｍで吸光度ｌは２２２　ｎｍｏ　！　ｅＯＮＰ／
ｍＱ　％又は３７８ｎｍｏｌｅＯＮＰ／１．７ｍＭ　　
（分析された上澄液の全容量は１．７　ｍＱであった）
を表している。表２に示されるユニットは次のように計
算された：アッセイ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性
を０．１ｍリン酸カリウム（１）Ｈ７，４）、１．０ｍ
Ｍ　　ＮＡＤ”、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、及び４．０ｍ
Ｍグリセルアルデヒド−３−リン酸を含んでいる１、０
ｍ１１反応溶液中でアッセイした。
ＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍの吸光をスペクトロホトメ
ーターで測定することによってをモニターした。グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性ユニッ
トは２５℃での生成するＮＡＤＨのｐｍｏ　Ｉ数／　ｍ
　ｇ　’？Ｉｉ白質／分で表される（マツクアリスター
（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ）及びホルランド（［ｌｏ　１
ｆｌｄ）の、ＪＲＣ２６０，１５０１９（１９Ｂ５））
。
表　　２ の酵素活性 Ｇ５ｌｌ５（ｐＲＡＩｌＯ）　　２％グＡ、：ｌ−ス２
１５　　　　　１４０．５％メタノール　　　１４．５
　　　　　１．６１）酵素活性はμモル生成物／ｍｇ蛋
白質／分として表し、対数増殖期の細胞の３つのサンプ
から得られた測定値の平均を示した。
実施例７ ｐＲＡ１０４の構築 ピキアのＧＡＰＤＨ遺伝子の開始メチオニンと重なる新
しいＥｃｏＲ１部位を下記のように作製した。下記の配
列を有するオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホル
アミダイト化学（ｃｙｓａｏｅｔｈｙＩｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｓ思１ｄｉｌｅ　ｃｈｅｍｉｓｌｒｙ）を用いるアブ
ライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｓｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｃｍｓ）社製ＤＮＡシンセサイザー、モデル３８０
Ａを用いて合成しｊ二： ５　’−ＴＡＣＣ（ｉＡＣＡＧＴＧ＾↑ＡＧＧＡＡＴＴ
ＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＧＴ−３’。
Ｍ１３クローン、Ｇ１５（実施例１参照）を突然変異誘
発の鋳型として用いた。このりａ−ンは４９４から＋２
７１に位置するピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子の
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩから５ａｌｌ断片を含んでいた。アン
ニーリング、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド伸長、
及びアルカリスクロース勾配遠心分離をシラー（２ｏ１
１ｅｒ）及びスミス（Ｓｌ【ｂ）のＭｅｊｈ、　Ｅｆｉ
２Ｆｍ６１．１００．４６１（１９１３）に従って行っ
た。陽性のスクリーニングはホノブデン（Ｂｏｂｄｅｎ
）らのＡｏｔｌｙｌｉｃｓｌ　　ＢｉｏｃｈＣｍ、　　
１４１．　７５（１９８５）に述べられているように溶
液７〜イブリダイゼーシヨン及びアガロースゲル電気泳
動を用いて行った。
新しいＥｃｏＲ１部位を保持しているＤＮＡクローンを
ｍ　ｐ　１８　Ｇ　ｌ　５　＊と呼ぶ。ＤＮＡ中のその
部位の正しい位置及び配列をサンガーらの方法（ＰＮＡ
Ｓ　７４．５４６３（！９７７））に従ったＤＮＡ配列
決定によって確認した。この新しい制限部位を含んでい
るＤＮＡをｍ　ｐ　１８　Ｇ　１５　＊及びプラスミド
ｐＲＡ１０３　（下記参照）からの複製型ＤＮＡをＢａ
ｍＨＩ及び５ａｌｌで切断すること、及びｐＲＡ１０３
の大きなりａｍＨＩ−５ａｌｌ断片をｍｐ１８Ｇ１５＊
からの小さいＢａｍＨＩ−Ｓａ　ｌ　Ｉ断片と結合させ
ることによってｐＢＲ３２２を基礎とするプラスミドに
移しＩ；。ｐＲＡ１０３において、ピキアゲノムクロー
ンｐＰＧＡＰ−７由来の−３，２５ｋｂから＋、２７　
ｋ　ｂに及ぶおよそ３゜６ｋｂのゲノムＨｉ　ｎｄｌｕ
−５ａ　Ｉ　１断片がｐＢＲ３２２のＨｉｎｃｌｌｌ［
と５ａ１１部位にサブクローン化されている。この突然
変異誘発されたＢａｍＨＩ−５ａｌｌ断片を保持してい
る類似クローンをｐＲＡ１０４と命名した。
実施例８ ｐｓＬ１７の構築 １／’ｇのｐＢＲ３２２を５ａ１１で消化し、タレノー
ポリメラーゼで満たして、そして結合させた。得られた
プラスミドをｐｓＬ１４と命名した。
１４μｇのプラスミドｐＴＨＢＳ　１をＰｓｔｒ及びＥ
ｃｏＲＩで消化し、ｐＢＲ３２２ＤＮＡのおよそ８００
ｂｐ及びピキア・パストリスＡＯＸ　１遺伝子由来の〜
３００ｂｐターミネーター断片を含んでいる約１．１ｋ
ｂ断片を０．８％調製用アガロースゲルから単離した。
同じ３００ｂｐターミネータ−断片はプラスミドＩ）Ｂ
ＳＡＧＩ５１（これはＮＲＲＬ＃Ｂ−１８０２１として
寄託されている）から５ｔｕｌ−ＨｉｎｄＩＩ［断片と
して単離することができ、そしてＥｃｏＲ１リンカ−を
５ｔｕｌ部位に付加することができる ９μｇのｐｓＬ１４をＰｓｔｌ及びＥｃ　ｏＲ１で消化
し、」−記に述べたように子ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼを用いて脱リン酸化した。８０ｎｇの１．１ｋｂＰ
ｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を１２゜５ｎｇのＰｓｔｌ−
ＥｃｏＲＩ消化ｐｓＬ１４と結合させ、そして得られた
プラスミドをｐ　Ｓ　Ｌ　１５と命名した。
１８μｇのｐＲＡ１０４（実施例７）をＥｃ。
ＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ピキア・パストリスＧＡ
ＰＤＨプロモーターを含んでいる５１５ｂｐの断片を５
％ポリアクリルアミドゲルから単離した。１０／ｊｇの
Ｐｓｔｌ５をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、上記
のように子ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化した。５０ｎｇのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を
１５ｎｇのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐｓＬ１５と結
合させた。得られたプラスミドをＰｓｔｌ６と命名した
。ｌＯｐｇのＰｓｔｌ６をＢａｍ）ＩＩで消化し、上記
のようにアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。
ピキア・パストリスＨＩＳ４遺伝子を選択マーカーとし
て用いるためにＰｓｔｌ６に付加した。
約２．７ｋｂのＢｇｌｎ断片を１０μｇのｐＹＭ１１２
ａをＢｇｌｌｍで切断すること及び０．８％アガロース
ゲルから２．７ＫｂＢｇ　Ｉ　ｎ断片を単離することに
よってｐＹＭ１１２ａより単離した。
同じＢｇｌｎ断片はＮＲＲＬ＃Ｂ−１５８８９として寄
託されているｐＹＪ８プラスミドから単離することがで
きる。しかし、プラスミド９ＹＭ［１２ａ中にＨＩＳ４
遺伝子を含んでいるＢｇｌｌＩ断片はｐＹＪＢをＢａｍ
ＨＩで消化しζ粘着末端をタレノーポリメラーゼを用い
て満たし、そしてプラントエンド結合を行うことによっ
て取り出された遺伝子内に存在するＢａｍＨＩ部位を持
っていた。ＨＩ３４遺伝子を含んでいるＢｇｌｌｌ断片
からのＢａｍＨＩ部位の除去は断片のＨＩＳ４遺伝子活
性に影響を与えなかった。７５ｎｇのＢｇ！■断片及び
２５ｎｇのＢａｍＨＩ−消化、脱リン酸化ｐｓＬ１６を
上記のようにＴ４リガーゼを用いて結合させた。得られ
たプラスミドをｐＳＬ１１７と命名し、第３図Ｂに示し
た。
実施例９ ９ＳＬ１９の構築 ｌＯｐｇの＋）ＹＪ３０　（ＮＲＲＬ＃Ｂ−１５８９０
）をＥｃｏＲＩで消化し、タレノーポリメラーゼで満ｆ
：、　Ｌ　ｆ−０このＤＮＡ２０ｎｇを以前に述べたよ
うにＴ４リガーゼで結合させた。これをｐＳＬ１８と命
名しＩ；。２０μｇのｐｓＬｉｓをＰｓｔｌ及びＨｉｎ
ｃｉｌｌｌで消化した。−９００ｂｐ断片を０．８％ア
ガロースゲルから単離した。ｌｏｐｇのＰｓｔｌ７をＰ
ｓｔｌ及びＨｉｎｄｌｌで消化し、子ウシ腸アルカリホ
スファターゼを用いて脱リン酸化した。４０ｎｇの断片
及びｌ　Ｏｎ、　ｇのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄｌＩ［消化、
アルカリホスファターゼ処理プラスミドをＴ４リガーゼ
を用いて上記のように結合させた。得られたプラスミド
をｐＳＬ１９と命名した。Ｐｓｔｌ９の構築を第３図Ｂ
に示した。
Ｘ３例１Ｏ ｐｓＬ２０Ａの構築 実施例９からのＰｓｔｌ９を、表３中に置かれるウシリ
ゾチームＣ２をコードするＥｃｏＲＩリンカ−の付いた
ＤＮＡ配列を用いてウシリゾチームｃ２についての発現
プラスミド構築のために使用した。この蛋白質をコード
しているＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵＣ１９ベクター中のこ
の断片のサブクローンであるプラスミドｐＳＬ１３から
精製した。１０ｎｇのｐＳＬ１９ＤＮＡをＥｃｏＲＩで
消化し、アルカリホスファターゼで処理した。４Ｏｎｇ
のウシリゾチーム遺伝子を含んでいる０゜４６ＫｂＥｃ
ｏＲＩ断片をＩ）ＳＬ１９ＤＮＡと結合させた。得られ
たグラスミドをｐＳＬ２０Ａと命名した（第４図）。
このプラスミドからのＤＮＡを５ａｌｌで切断し、実施
例２に従ってピキア・パストリスＧ５ｌ１５に形質転換
するのに使用した。これらの細胞を最少グルコース培地
で発酵槽中で培養し、ウシリゾチームの化生産性に対す
る希釈率（ｄｉｌｗｌｉｏａｒｉｔｅ）の影響を測定し
た。希釈率が０．１及び０゜２ｈｒ−’である場合、比
生産は約１μｇ／ｇ細胞／時間であり、一方同じ株で希
釈率を最大比増殖速度０．３ｈｒ”以上に上げると、比
生産は１０倍に増加し、約１０ｐｇ／ｇ細胞／時間であ
った。
表　　３ 成熟蛋白質開始 ＧＡＧＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣ丁Ｃ
ＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＡ
ＴＡＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣ
ＧＡＡＴＴＡＦＩＧ。
３１Ｇ　　　　　　　　３２０　　　　　　　　Ｉ３０
＾ＴＧＧＡＡ＾＾ＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧ
丁ＡＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧ
ＴＧＡＧ３７０　　　　　　　３１１Ｇ ＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴ
ＧＧ３９０　　　　　　４０Ｇ　　　　　　　＋１０Ａ
ＡＡＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴ
Ｃ＾ＧＣＡＧＴＴＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＣＡＣＣ
ＣＴＧＥｅｏＲＩ７ダプター
【図面の簡単な説明】
第１図は、ピキア・パストリスのＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ遺
伝子の制限地図を表す模式図である。 第２図は、グラスミドＩ）ＲＡＩＩＯ構築の工程図であ
る。 第３図は、プラスミドｐｓＬ１９構築の工程図である。 第４図は、プラスミドｐｓＬ２０Ａの制限地図を表す模
式図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、本質的にピキア・パストリス（￥Ｐｉｃｈｉａ￥　
    ￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）のＧＡＰＤＨ５′調節領域から
    なる単離されたＤＮＡ断片。 ２、第１図（Ｂ）の制限地図を有している請求項１記載
    のＤＮＡ断片。 ３、表１に示されたヌクレオチド−４９０付近からヌク
    レオチド１付近までのヌクレオチド配列を有している請
    求項２記載のＤＮＡ断片。 ４、ポリペプチドをコードしている異種ＤＮＡ配列に機
    能可能なように連結した請求項２記載のＤＮＡ断片。 ５、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化
    因子、肝炎表面抗原及びウシリゾチームをコードするＤ
    ＮＡからなる群から選択される異種ＤＮＡ配列に機能可
    能なように連結した請求項２記載のＤＮＡ断片。 ６、原核及び真核細胞からなる群から選択される細胞内
    で複製可能なＤＮＡ配列に連結している請求項４記載の
    ＤＮＡ断片。 ７、第１図（Ｃ）の制限地図を有している請求項１記載
    のＤＮＡ断片。 ８、ポリペプチドをコードしている異種ＤＮＡ配列に機
    能可能なように連結した請求項７記載のＤＮＡ断片。 ９、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化
    因子、肝炎表面抗原及びウシリゾチームをコードするＤ
    ＮＡからなる群から選択される異種ＤＮＡ配列に機能可
    能なように連結した請求項７記載のＤＮＡ断片。 １０、原核及び真核細胞からなる群から選択される細胞
    内で複製可能なＤＮＡ配列に連結している請求項８記載
    のＤＮＡ断片。 １１、少なくとも一つのポリペプチドをコードする異種
    ＤＮＡ配列の高いレベルの発現を容易にするためにＧＡ
    ＰＤＨ５′調節領域を活性化するための方法であって、
    異種ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されたＧＡＰＤ
    Ｈ５′調節領域で形質転換された適当な宿主細胞をグル
    コース、グリセロール及びメタノールからなる群から選
    択される化合物又はそれらの混合物とその宿主細胞の増
    殖について適当な条件下で宿主細胞による前記化合物の
    摂取が容易となるようにして接触させることを含んでい
    る前記方法。 １２、本質的にピキア・パストリスＧＡＰＤＨ３′転写
    終結配列からなる単離されたＤＮＡ断片。 １３、第１図（Ｅ）の制限地図を有している請求項１２
    記載のＤＮＡ断片。 １４、表１に示されたヌクレオチド１００５付近からヌ
    クレオチド１３８０付近までのヌクレオチド配列を有し
    ている請求項１２記載のＤＮＡ断片。 １５、少なくとも一つのポリペプチドをコードしている
    異種ＤＮＡ配列に機能可能なように連結した請求項１３
    記載のＤＮＡ断片。 １６、本質的にピキア・パストリスＧＡＰＤＨ構造遺伝
    子からなる単離されたＤＮＡ断片。 １７、第１図（Ｄ）の制限地図を有している請求項１６
    記載のＤＮＡ断片。 １８、本質的にピキア・パストリスＧＡＰＤＨ遺伝子か
    らなる単離されたＤＮＡ断片。
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