KR100252787B1 - 한세눌라 폴리모르파 유래의 다중병렬 도입형 자기복제 서열 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012) 유래의 다중병렬도입형(multiple tandem integrating) 자기복제서열(autonomously replicating sequence, ARS) 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
Description
본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1 유래의 다중병렬도입형(multiple tandem integrating) 자기복제서열(autonomously replicating sequence, ARS)에 관한 것이다.
의료용 재조합 단백질의 대량생산용 숙주로는 주로 사카로마이세스속 효모들이 사용되어 왔다. 그러나 사카로마이세스속 효모에서 재조합 단백질을 대량생산 하는 데 있어서는, 강력한 프로모터 시스템이 없고 플라스미드가 불안정하여 비선택적 배지에서 장기간 배양할 경우 플라스미드의 소실로 인하여 재조합 단백질의 생산성이 감소하는 문제점이 있다.
한세눌라 폴리모르파는 메탄올 자화 효모 균주로, 사카로마이세스속 효모에서와 같은 문제점이 없어 재조합 단백질의 대량생산을 위한 숙주로 매우 적합한 것으로 기대되고 있다. 즉, 한세눌라 폴리모르파는 위한 숙주로 매우 적합한 것으로 기대되고 있다. 즉, 한세눌라 폴리모르파는 메탄올 산화효소(methanol oxidase, MOX), 디히드록시아세톤 합성효소(dihydroxyacetone synthetase, DAS), 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)등과 같이 메탄올에 의하여 유도되는 강력한 프로모터 시스템을 가지고 있고 외래 유전자를 염색체에 용이하게 도입할 수 있어 안정성을 가지고 있다(유럽특허 제29108A호; Janowicz et al., Nucleic Acid Res., 13, 3042(1985); Ledeboer et al., Nucleic Acid Res., 13, 3063(1985)).
한세눌라 폴리모르파에서 외래 유전자의 안정성은 자기복제서열에 의한 발현벡터의 염색체내로의 도입에 기인한다. 자기복제서열은 단일 카피로 염색체에 삽입되는 특성이 있는 것도 있고, 복수 카피의 다중병렬형으로 염색체에 삽입되는 특성이 있는 것(이하 '다중병렬도입형 자기복제서열')도 있다.
한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열을 포함하는 플라스미드는 한세눌라 폴리모르파에 형질전환된 직후에는 일시적으로 플라스미드 상태로 존재하여 안정성이 매우 낮다. 그러나 형질전환체를 선택배지로부터 비선택배지로 옮겨 수차 계대배양하는 안정화 과정(stabilization procedure)을 거치면, 도입된 플라스미드는 염색체내로 삽입됨으로써 안정성이 높아진다. 이때 플라스미드의 다중병렬형 도입은 안정화 과정중에서 매우 드물게 일어나며, 이러한 플라스미드가 다중병렬형으로 도입된 균주의 선별에는 많은 시간과 노력이 요구된다는 단점이 있다.
일반적으로, 다중병렬형 유전자 도입의 빈도는 자기복제서열의 특성에 따라 다양하다. 도입된 플라스미드의 자기복제능이 클수록 형질전환 효율이 높아지고, 따라서 다중병렬형 유전자 도입의 빈도가 높다(유럽특허 제0374282호).
야노비츠 등은 한세눌라에서 B형 간염 항원 유전자를 100 카피까지 증가시켜 성공적으로 B형 간염 항원을 생산한 바 있다(Janowitcz et al., Yeast, 7, 431(1991)).
한세눌라 폴리모르파에는 두 가지 대표적인 균주들, 즉, CBS 4732(ATCC 34438, Hazeu et al., Arch. Microbiol., 87, 185(1972)) 및 DL-1(ATCC 26012, Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982(1973))이 있다. 균주 CBS4732는 재조합 단백질의 생산에 사용되어 왔고, 한세눌라 폴리모르파 CBS4732 유래의 몇몇 자기복제서열이 클로닝된 바 있으나(Roggenkamp et al., Mol. Gen, Genet., 202, 302(1986); 및 Bogdanova et al., Yeast, 11, 343(1995)), 자기복제서열들의 생화학적 특성에 대한 연구는 지금까지 수행된 바 없다.
한편, DL-1 균주는 CBS4732에 비해 다음과 같은 장점을 가지고 있음에도 불구하고 재조합 단백질의 생산에 사용된 바 없다. CBS4732와 달리, DL-1 균주는 생육 온도가 37 내지 50℃로서 내열성 균주이고, 메탄올 산화효소의 활성이 높아 고농도의 메탄올에서도 성장할 수 있으며, 상기 두 균주 각각의 메탄올 산화효소 프로모터를 포함하는 벡터들이 사용된 비교 연구에서 더 높은 단백질 수율을 나타낸다. 또한, 두 균주의 메탄올 산화효소 프로모터들은 메탄올-유도된 발현에 관련된 서열들이 서로 다르고(Godecke et al., Gene, 139, 35(1995)), DL-1의 상동성 재조합 효율이 CBS4732보다 높다. 따라서, 재조합 단백질의 생산에 숙주로서 균주 DL-1을 사용하는 것은 균주 CBS4732를 사용하는 것에 비해 다음과 같은 장점들을 제공할 것으로 기대된다.
첫째, 균주 DL-1은 고농도의 메탄올을 포함하는 배지에서 빠르게 성장하므로, 이종 유전자의 유도 발현을 위한 메탄올 농도의 정밀한 조절이 불필요하다. 이러한 특성은 이종 단백질의 생산이 성장에 의존적인 경우에 특히 적당하다. 둘째, DL-1 은 탄소원으로서 메탄올만을 함유하는 배지에서 잘 자라므로, 이종 유전자의 발현에서 DL-1 메탄올 산화효소 프로모터의 활성은 CBS4732 보다 높다고 추정된다. 셋째, DL-1은 이종 유전자의 삽입을 용이하게 하는 상동 재조합 효율이 높다.
그렇지만, 한세눌라 폴리모르파 DL-1을 재조합 단백질 생산의 숙주로 사용하기 위해서는 자기 복제활성이 높은 다중병렬도입형 자기복제서열이 절실히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 한세눌라 폴리모르파 DL-1로부터 유래된 다중병렬 도입형 자기복제서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중병렬도입형 자기 복제서열을 함유하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 배양하여 이종단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
제1도는 플라스미드 pCLHX 및 pCE36의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
제2a도 및 제2b도는 안정화 과정 전과 후에 자기복제서열 HARS36을 포함하는 플라스미드 pCE36의 위치를 확인한 서던 블럿팅(Southern Blotting) 분석 결과를 나타낸 것이다.
제3a도 및 제3b도는 자기복제서열 HARS36을 포함하는 플라스미드 pCE36의 염색체내 삽입 형태 및 삽입 위치 결정을 위한 서던 블럿팅 분석의 결과를 나탸낸 것이다.
제4도는 자기복제서열 HARS36의 결실 분석(deletion analysis) 결과를 나타낸 것이다.
제5도는 자기복제서열 HARS36의 C 지역의 기능분석을 위한 서던 블럿팅 분석의 결과를 나타낸 것이다.
제6도는 자기복제서열 HARS36의 유전자 기원을 확인하기 위한 서던 블럿팅 분석의 결과이다.
제7도는 한세눌라 폴리모르파내에서 인체 표피 성장 인자(hEGF) 유전자를 발현시키기 위한 발현 벡터인 플라스미드pUREGF의 제조 과정을 나타낸 것이다.
제8a도 및 제8b도는 한세눌라 폴리모르파 UR2의 염색체내로 삽입된 hEGF 유전자의 형태 및 위치를 각각 확인한 서던 블럿팅 분석의 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 형질전환 DNA를 다중카피로 복제하고 이들을 한세눌라 폴리모르파의 염색체 내로 병렬형으로 도입하는, 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열이 제공된다.
본 발명의 다중병렬도입형 자기복제서열은 그의 3'-말단에 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 가지며, 이 단위의 반복횟수는 15회 이상이다.
본 발명의 다중병렬도입형 자기복제서열의 예로서는 하기 서열 1을 갖는 HARS36, 하기 서열 2를 갖는 TEL188, 하기 서열 3을 갖는 TEL135 및 하기 서열 4를 갖는 TEL61이 있다:
[서열 1]
T-1
T-2
[서열 2]
T-3
T-4
[서열 3]
T-5
[서열 4]
T-6
T-7
HARS36은 407번-522번 뉴클레오티드(이하 'A 지역'이라 함), 276번-406번 뉴클레오티드(이하 'B 지역'이하 함) 및 523번-700번 뉴클레오티드(이하 'C 지역'이라 함)에 자기복제 활성에 영향을 주는 세개의 기능성 인자를 가지고 있다. A지역이 제거된 HARS36을 포함하는 플라스미드로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시킨 경우, HARS36은 자기복제 활성을 완전히 상실하였다. 또한, B지역 또는 C지역이 제거된 HARS36을 포함하는 플라스미드로 동일한 균주를 형질전환시킨 경우, 형질전환 효율 및 형질전환체의 생장 속도가 감소하고, HARS36의 자기복제 활성이 전반적으로 감소하였다. 따라서, A지역은 HARS36의 자기복제 활성에 절대적으로 필요하고, B 및 C 지역은 HARS36의 완전한 자기복제 활성을 위해서 필요한 부분으로 판단된다. 또한, C지역이 제거된 HARS36을 포함하는 플라스미드로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시킨 경우, 숙주 염색체내로의 플라스미드의 도입이 느려진다. 따라서, C지역은 플라스미드를 숙주 세포의 염색체 내로 삽입시키는 기능을 한다.
한편, HARS36의 자기복제활성에는 영향을 주지 않는 700번-1227번 뉴클레오티드(이하 'D 지역'이라 함)로부터 유추된 아미노산 서열을 사카로마이세스 세레비지에의 DNA 중합효소 III(Morrison et al., Nucleic Acid Res., 20, 375(1992))의 396번-597번 아미노산 서열과 84%의 상동성을 나타낸다. 따라서, 자기복제서열 HARS36을 구성하는 A, B 및 C지역과 D지역은 서로 다른 염색체로부터 유래했다는 것이 밝혀졌다.
자기복제서열 TEL188은 HARS36의 A, B 및 C 지역과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 영역들을 가지며, TEL135는 영역 B의 일부가 결실되어 있다. TEL135 및 TEL61의 뉴클레오티드 서열들은 TEL188과 유사하며, TEL188, TEL135 및 TEL61 사이의 상동성은 90% 이상이다.
한편, 본 발명은 또한 본 발명의 다중병렬도입형 자기복제서열, 즉, 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열을 함유하는, 한세눌라 폴리모르파의 염색체내로 이종 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 다중병렬형으로 삽입하기 위한 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열, 예를 들어, HARS36, TEL188, TEL135 또는 TEL61; 프로모터; 상기 프로모터의 하류에 위치한, 이종 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 터미네이터를 함유한다. 상기 자기복제서열은 외래 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 숙주의 염색체내로 다중병렬형으로 도입되는데 있어서 결정적인 역할을 하여, 형질전환 효율을 증가시킨다. 목적하는 외래 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대한 자기복제서열의 상대적 위치는 중요하지 않다.
목적 단백질의 성질에 따라, 프로모터 및 터미네이터 등을 다양하게 선택하여 사용할 수 있으며, 특히, 목적 단백질의 구성적 발현을 위한 프로모터로서는 본 출원인에 의해 동일자로 출원된 대한민국 특허출원 제_______호에 개시된 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 GAPDH 프로모터 또는 그의 단편을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기와 같은 본 발명의 발현 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고, 이 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는, 한세눌라 폴리모르파에서 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 생산할 수 있는 목적 단백질의 예로서는, 히루딘, 인간 표피 성장인자(hEGF), 인간 혈청 알부민(HSA), 프로유로키나제, 유로키나제, 인간 α1-안티트립신, B형 간염 표면항원(HBsAg), 리포코틴, 인터페론, 이소자임, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 인슐린, 인자 VIII, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 칼시토닌, 인슐린-유사 성장인자, 성장 호르몬 등이 포함될 수 있다.
이하, 참조예 및 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하나 본 발명의 내용에 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예:
(1) 미생물의 형질전환
한세눌라 폴리모르파 세포의 형질전환은 초산 리튬-DMSO 법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991))에 따라 실시하였다. 대장균 세포의 형질전환은 SEM 방법(Inoue et al., Gene, 96, 23(1990))에 따라 실시하였다.
(2) 서던 블럿팅 분석(Southern blotting analysis)
서던 블럿팅 분석은 42℃ 하이브리디제이션 오븐(hybridization oven, Hybaid, 영국)에서 하이브리디제이션 용액(5×SSC, 0.1% N-라우로일 사코신(lauroyl sarcosine), 0.02% SDS, 5% 블록킹 시약, 50% 포름아미드)을 이용하여 서던 방법(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975))에 따라 실시하였다. 프로브는 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트(Non-radioactive DNA Labeling and Detection Kit, Boehringer Mannheim, 독일)을 사용하여 제조하였다.
(3) 뉴클레오티드 서열 결정
유전자의 뉴클레오티드 서열은 ABI 서열분석 키트(ABI Prism Dye Terminatior Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Perkin-Elmer Cetus, 미국)와 DNA 서열분석기(DNA Sequencer, Model 373A, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 결정하였다.
실시예 1 : 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열 HARS36
한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열중에서 다중병렬도입형으로 도입가능한 자기복제서열을 스크린하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(단계 1) 재조합 플라스미드 pCLHX의 제조
우선 한세눌라 폴리모르파의 류이신2 유전자(LEU2)를 포함하는 플라스미드 p18B1(Agaphonov et al., Yeast, 10, 509 (1994)]를 제한효소 XhoII로 절단하여 1.2kb 크기의 DNA 절편을 분리한 후, 이 DNA 절편을 pBC KS+(Stratagen사)에 삽입하여, 한세눌라 폴리모르파의 류이신2 유전자를 포함하는 플라스미드 pCLHX를 제조하였다(도 1).
(단계 2) 한세눌라 폴리모르파의 게놈 DNA의 라이브러리 제조
한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 게놈 DNA를 크라이어(Cryer)의 방법(Campbell & Duffus, Yeast, 107, IRL Press(1988))에 따라 분리한 후, 제한효소 Sau3AI으로 절단하여 DNA 절편을 얻었다. 이 DNA 절편에 클레나우 DNA 중합효소 (Klewow DNA polymerase)로 G와 A의 2개의 뉴클레오티드를 첨가한 후 전기 영동하여 500-1,500 bp 크기의 DNA 절편들을 분리하였다.
한편, 상기 (단계 1)에서 제조한 플라스미드 pCLHX를 제한효소 SalI로 절단한 후, 클레나우 DNA 중합효소로 C와 T의 2개의 뉴클레오티드를 첨가하였다.
상기 분리한 한세눌라 폴리모르파 DNA 절편을 절단된 pCLHX에 삽입하여, 한세눌라 폴리모르파 게놈의 플라스미드 라이브러리(library)를 제조하였다.
플라스미드 라이브러리를 SEM 방법(Inoue et al., Gene, 96, 23(1990))에 따라 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이 형질전환체를 클로람페니콜 30㎍이 함유된 LB 배지(ℓ당 트립톤 10g, 효모 추출액 5g, 소디움 클로라이드 10g 및 박토아가 20g)에 도말하고 37℃에서 하룻밤 배양하여, 약 5×104의 콜로니를 얻었다. 이들 콜로니로부터 DNA를 추출하여, 증폭된 플라스미드 라이브러리의 DNA를 얻었다.
(단계 3) 한세눌라 폴리모르파의 형질전환 및 도입된 플라스미드의 안정화
한세눌라 폴리모르파 게놈의 라이브러리 DNA를 리튬 초산법(Bogdanova et al., Yeast, 11, 343(1995))에 따라 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 영양요구성 변이균주인 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(NPO Biotechnologia, Moscow, Russia)에 형질전환시킨 후, 이를 최소 배지(0.67% 아미노산이 제외된 효모 질소염기, 2% 글루코오스 및 2% 박토아가)에 도말하고 37℃에서 3일간 배양하여 형질전환체를 얻었다. 레플리카법에 따라 이 형질전환체 콜로니를 모두 복합 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 글루코오스, 2% 박토아가)에서 48시간동안 및 최소 배지에서 24 시간동안 배양하여, 플라스미드가 염색체내로 도입되어 안정화되도록 유도하였다.
플라스미드가 염색체내로 도입되었는지를 1차적으로 확인하기 위하여, 안정화 과정을 거친 한세눌라 폴리모르파 형질전환체를 복합 배지에서 약 20세대 동안 배양한 후, 복합 배지와 최소 배지에 각각 레프리카 플레이팅하고, 37℃에서 3일간 배양하여 양쪽 배지에서 성장한 콜로니의 수를 비교하였다. 그 결과, 류이신 선택표지의 안정성이 100%로 유지되는 것으로 확인되었다.
또한 플라스미드가 염색체내로 도입되었는지를 2차적으로 확인하기 위하여, 상기 안정화 과정을 거친 한세눌라 폴리모르파 형질전환체로부터 추출한 전체 DNA로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 30㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에서 대장균 형질전환체를 선별한 결과, 형질전환체가 나타나지 않음을 확인하였다.
염색체에 플라스미드가 도입된 한세눌라 폴리모르파로부터 추출된 DNA는 대장균을 형질전환시킬 수 없으며, 상기 결과는 상기 플라스미드가 한세눌라 폴리모르파의 염색체내로 도입되었음을 나타낸다.
(단계 4) 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열(HARS)의 선별
상기 (단계 3)에서 얻은 안정화된 형질전환체로부터 크라이어(Cryer)의 방법(Campbell & Duffus, 상기 문헌 참조)에 따라 DNA를 분리하고, 이를 제한효소 ScaI으로 절단한 후 다시 자가 연결 (self ligation)시켰다. 수득된 플라스미드를 사용하여 참조예의 방법에 따라 대장균 DH5α를 형질전환시킨 후, 이 형질전환체를 30㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다.
플라스미드 pCLHX는 클로람페니콜 내성(Cmr) 유전자에 제한효소 ScaI의 절단부위가 있으므로, 자기복제서열이 염색체에 단일 카피로 도입되는 경우에는 형질전환된 대장균이 클로람페니콜에 대하여 내성이 없으나, 자기복제서열이 대장균 염색체에 다중 병렬형의 복수 카피로 도입되는 경우에는 형질전환된 대장균이 클로로암페니콜에 대하여 내성을 가지게 된다.
실험 결과, 클로람페니콜에 대하여 내성을 가지는 7개의 형질전환된 대장균을 선별하였다. 선별한 7개의 형질전환된 대장균의 플라스미드에는 pCLHX와 다른 약 700-1,500 bp 크기의 DNA 절편이 포함되어 있었으며, 이 플라스미드를 각각 pCE 11, pCE 24, pCE 35, pCE 36, pCE 37, pCE 48 및 pCE 410으로 명명하였다.
상기 플라스미드들의 제한효소 분석 결과, 플라스미드 pCE24, pCE35 및 pCE36의 DNA 절편은 동일하였으나, 이들과 플라스미드 pCE11, pCE37, pCE48 및 pCE410은 DNA 절편 각각은 서로 상이하였다. 즉, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열로서 서로 다른 DNA 절편 5종류를 얻었다.
(단계 5) HARS의 자기복제 활성
상기 (단계 4)에서 얻은 5종류의 DNA 절편의 자기복제 활성을 확인하기 위하여, 형질전환 및 서던 블럿을 실시하였다.
① 형질 전환 효율 조사
(단계 4)에서 얻은 7개의 플라스미드를 리튬초산 방법에 따라 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 각각 형질전환한 후 형질전환체의 수를 조사하여, 플라스미드 ㎍당 형질전환체의 수를 결정하였다. 이때 각 플라스미드의 농도는 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 또한, 대조군으로서 자기 복제서열을 함유하지 않는 pCLHX를 사용하였고, 비교군으로서 한세눌라 폴리모르파에서 자기복제 활성을 보이는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 류이신-2 유전자를 함유하는 플라스미드 YEp13(Berardi and Thomas, Curr. Genet., 18, 169 (1990)), 한세눌라 폴리모르파 CBS 4732 유래의 자기복제서열 HARS2 및 HARS3를 각각 함유한 플라스미드 pA2 및 pA3(Bogdanova et al., Yeast, 11, 343(1995))을 사용하였다.
그 결과는 하기의 표 1과 같다.
[표 1]
t-8
표 1에서 보는 바와 같이, 자기복제서열을 포함하는 모든 플라스미드는 자기복제서열을 포함하지 않는 대조군 플라스미드 pCLHX보다 월등히 높은 형질 전환효율을 나타내었고, 특히 본실시예에서 얻은 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 자기복제서열을 포함한 플라스미드는 다른 보고된 자기복제서열을 포함한 플라스미드 보다 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 또한 동일한 자기복제서열을 포함한 플라스미드 pCE24, pCE35 및 pCE36는 다른 플라스미드에 비하여 월등히 높은 형질전환 활성을 보였다.
플라스미드 pCE36으로 형질전환된 대장균 DH5α(대장균 DH5α/pCE36)를 1997년 7월 24일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0352BP 호로서 기탁하였다.
② 서던 블럿
안정화 과정의 전과 후에 형질전환체내 플라스미드 DNA의 위치를 서로 비교하기 위하여, 다음과 같이 서던 블럿을 실시하였다.
즉, 형질전환 직후의 형질전환체 및 (단계 3)과 동일한 방법의 안정화 과정을 거친 후의 형질전환체의 DNA를 각각 분리하고 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 막에 전이하였으며, 프로브로는 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 플라스미드 pBC KS+ (Stratagene사 제품)을 사용하여, 서던 블럿팅 분석을 실시하였다.
실험 결과는 제2a도 및 제2b도에 나타낸 바와 같다. 형질전환 직후의 형질전환체(제2a도)에서는 도입된 플라스미드가 환상 형태(circular form) 및 수퍼코일된 형태(supercoiled form)의 플라스미드 형태로 관찰되었다. 그러나 형질전환되지 않은 대조군에서는 도입된 플라스미드가 복제되지 못하여 관찰되지 않았다. 따라서 자기복제서열을 포함하는 모든 플라스미드는 한세눌라 폴리모르파내에서 자기 복제하고 있음을 알 수 있었다.
또한 안정화 과정후의 형질전환체(제2b도)에서는 도입된 플라스미드가 플라스미드 형태가 아닌 염색체에 삽입된 형태로 관찰되었다.
플라스미드 pCE 24, 35 및 36은 안정화 과정전에도 이미 염색체로 도입된 경우가 관찰되었는데, 이는 상대적으로 다른 자기복제서열에 비하여 염색체로 전이되려는 성질이 강하기 때문인 것으로 판단된다.
이상의 결과로부터, 형질전환 효율이 높고 염색체로 전이되려는 성질이 강한 것으로 판단되는 플라스미드 pCE36의 1.2kb 크기의 자기복제서열을 HARS36으로 명명하였다.
실시예 2 : 자기복제서열 HARS36의 특성 확인
(1) 유전자 도입 특성
자기복제서열 HARS36를 포함하는 플라스미드 pCE36이 형질전환시 염색체내로 삽입되는 형태를 조사하기 위하여, 참조예의 방법에 따라 플라스미드 pCE36으로 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)을 형질전환시킨 후, 이 형질전환체를 최소배지에서 배양하고, 성장한 콜로니중 10개의 형질전환체를 무작위로 선택하였다. 선택된 형질전환체들을 실시예 1의 (단계 3)에서와 같이 안정화 과정을 거치게 한 후, 플라스미드가 염색체내로 도입되었는지를 확인하였다. 안정화된 형질전환체를 선택배지(0.67% 아미노산 결핍 효모 질소 기질, 2% 글루코즈)에서 배양한 후, 전체 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 제한효소 ScaI으로 절단하고, 디곡시게닌으로 표지된 플라스미드 pBC KS+를 프로브로 사용하여 실시예 1의 (단계 5)에서와 같이 서던 블럿팅 분석을 하였다.
이때 플라스미드가 염색체내로 다중병렬 형태로 도입된 경우에는 5.9kb 크기의 플라스미드 pCE36 절편이 강한 밴드로 관찰되고 2개의 말단 절편이 약한 밴드로 나타나게 된다.
실험 결과는 제3a도에 나타낸 바와 같으며, 제3a도에서, M열은 상단으로부터 23.0, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.2 및 0.56kb를 나타내는 DNA 크기 표지이다. 제3a도에서, 10개의 pCE36 형질전환체중 6개의 형질전환체에서 5.9kb 크기의 밴드와 2개의 약한 밴드가 관찰되었는데, 이는 6개의 형질전환체에서 플라스미드 pCE36이 다중병렬형으로 삽입되었음을 나타낸다.
또한 10개의 형질전환체 모두에서 3.8kb 크기의 밴드가 관찰되었는데, 이로부터 10개의 형질전환체 모두에서 플라스미드 pCE36이 염색체의 유사한 위치에 삽입되었음을 알 수 있었다.
플라스미드 pCE36가 삽입되는 염색체의 위치를 결정하기 위하여, 제8열의 형질전환체의 DNA를 엑소뉴클레아제(exonuclease) Bal31로 시간을 달리하여 처리하여 절단하고, 다시 제한효소 ScaI로 절단한 후, 상기한 프로브를 사용하여 실시예 1의 (단계 5)에서와 같이 서던 블럿팅 분석을 실시하였다.
그 결과는 제3b도에 나타낸 바와 같으며, 제3b도에서, M열은 상기 제3a도에서와 같은 DNA 크기 표지이다. 엑소뉴클레아제 Bal31의 처리 시간이 경과함에 따라 5.9 kb 밴드의 강도는 변화가 없는 반면, 3.8kb 크기의 밴드는 점점 분해되어 크기가 줄어드는 것으로 나타났으므로 상대적으로 엑소뉴클레아제 Bal31에 민감함을 알 수 있다. 염색체 말단의 DNA는 염색체 내부에 위치하는 DNA보다 엑소뉴클레아제 Bal31에 민감함을 고려할 때, 모든 형질전환체에서 관찰되는 3.8kb의 밴드는 염색체의 말단임을 알 수 있었다. 즉, 한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열 HARS36에 의한 유전자의 도입은 대부분 염색체의 말단 위치에서 60%의 효율로 다중병렬형으로 이루어짐을 알 수 있다.
(2) 자기복제서열 HARS36의 기능성 인자의 확인
한세눌라 폴리모르파 자기복제서열 HARS36의 기능성 인자(functional element)를 확인하기 위하여, 결실된 HARS36의 DNA 절편의 형질전환 활성 및 루이신 선택표지의 안정성을 다음과 같이 측정하였다.
즉, 1.2kbp의 HARS36 DNA를 ExoIII/멍빈 뉴클레아제 결실 키트(Mung Bean Nuclease Deletion Kit, Stratagene 사)를 사용하여 제4도에서와 같이 양쪽 방향에서 점차적으로 결실시켜, 5'-말단으로부터 197번(Del 1), 275번(Del 88), 371번(Del 81), 406번(Del 22), 453번(Del 16) 뉴클레오티드까지가 각각 결실된 DNA 절편들 (결실 그룹 I) 및 3'-말단으로부터 452번(Del 138), 524번(Del 133), 701번(Del 120) 및 799번(Del 117) 뉴클레오티드까지가 각각 결실된 DNA 절편들(결실 그룹 II)을 얻었다(제4도).
상기 결실된 HARS36 DNA 절편 각각을 플라스미드 pCLHX에 삽입하여 결실된 DNA 절편을 함유하는 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드의 형질전환 활성을 실시예 1의 (단계 5)에서와 같이 측정하였다. 또한, 결실된 HARS36의 류이신 선택 표지의 안정성은 결실된 DNA 절편을 함유하는 플라스미드를 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 형질전환한 후 형질전환체를 최소 배지에서 배양하여 조사하였다. 이때 대조군으로는 결실되지 않은 HARS36을 사용하였다.
각각의 형질전환체를 복합배지에 접종하고, 분광 광도계를 이용하여 600nm에서 초기 흡광도를 측정한 후, 37℃에서 24시간 배양한 다음 흡광도를 측정하여 성장세대수를 결정하였다. 한편 동일한 세포수를 복합 배지와 최소 배지에 각각 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 나타난 집락의 수를 비교하여 세대당 선택표지의 안정성을 결정하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같다.
[표 2]
t-9
+++ : 1㎍의 DNA당 형질전환체가 2,400 개를 초과함
+ : 1㎍의 DNA당 형질전환체가 800개를 초과함
+S : 1㎍의 DNA당 형질전환체가 800개를 초과하지만 세포의 성장속도가 느림
- : 형질전환체가 없음
MARS286 : HARS36 DNA의 5'-말단에서 237번째까지의 염기서열이 결실되고, 3'-말단에서 524번째까지의 염기서열이 결실된 결실 클론
표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 결실 I에서 결실 클론 Del 1 및 88은 형질전환 활성에 거의 변화가 없었으며, 결실 클론 Del 81 및 22에서는 대조군 HARS36보다 형질전환 효율이 다소 감소하였고, 고체배지상에서의 형질전환체가 콜로니를 형성하는 속도가 느렸다. 또한, 결실 클론 Del 16은 완전히 형질전환 활성을 상실하였는데 이는 HARS36의 절편이 자기복제 활성을 상실하였음을 의미한다.
결실 II에서는 결실 클론 Del 120 및 117이 형질전환 활성에 거의 변화가 없었으며, 결실 클론 Del 133은 형질전환 활성이 다소 감소하였고, Del 138은 형질전환 활성을 완전히 상실하였다.
즉, 407번-523번의 뉴클레오티드 서열(A 지역)이 제거되면 자기복제 활성을 완전히 상실하였으며, 276번-407번의 염기서열(B 지역) 및 523번-700번의 염기서열(C 지역)이 제거되면 형질전환 효율 및 형질전환체의 생장속도가 저해되어 전체적으로 HARS36의 활성이 감소하였다. 따라서, A 지역의 서열은 HARS36 활성에 절대적으로 요구되는 서열이고, B 지역과 C 지역의 서열은 완전한 HARS36 활성을 위하여 필요한 서열로 판단된다.
또한, C 지역의 서열의 역할을 확인하기 위하여, C 지역의 서열이 제거된 MARS286을 포함하는 플라스미드로 상기와 같이 한세눌라 폴리모르파 DL-1L을 형질 전환시켰다. 이 형질전환체를 최소배지에 접종하여 배양한 후, 서로 다른 세대의 세포로부터 전체 DNA를 얻었다. 이 전체 DNA 및 프로브로서 디곡시게닌으로 표지된 플라스미드 pBC KS+(Stratagen 사)를 사용하여 실시예 1의 (단계 5)에서와같이 서던 블럿팅 분석을 실시하여, 플라스미드가 에피솜 상태로 어느 정도 지속되는지를 확인하였다. 이때 대조군으로는 완전한 HARS36을 포함하는 플라스미드 pCE36을 사용하여 동일한 실험을 실시하였다.
그 결과, 제5도에 나타낸 바와 같이, C 부분의 서열이 제거된 MARS286은 대조군 HARS36에 비하여 비슷한 세대에서 염색체로의 삽입이 상당히 저해되었다. 따라서, C 부분은 플라스미드가 염색체로 용이하게 삽입되도록 유도하는 역할을 함을 알 수 있었다.
(3) 자기복제서열 HARS36의 염기 서열
HARS36의 염기 서열은 DNA 서열분석기(model 373A, Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다.
HARS36의 뉴클레오티드 서열은 상기 서열 1과 같으며, 각각의 기능성 인자에 해당하는 부분에서 특징적인 염기 서열이 관찰되었는데, A 지역(407번-523번 뉴클레오티드)에서는 다른 진핵 세포의 자기복제서열 코아(ARS core)에서 발견되는 AT-rich 서열이 관찰되었고, B 지역(276번-407번 뉴클레오티드 서열)에서는 하기 서열 5번의 반복 서열 I(RS-1) 및 하기 서열 6의 반복 서열 II(RS-II)이 관찰되었으며, C 지역(523번-700번 뉴클레오티드 서열)에서는 G가 풍분한 8bp 서열(5'-GGGTGGCG-3')이 18번 반복되는 것이 관찰되었다.
[서열 5]
5'-GAATTAGAGA GG-3'
[서열 6]
5'-GAATTAGAGC AAGTAG-3'
(4) 자기복제서열 HARS36의 기원
한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)의 게놈 DNA에 대하여 HARS36 서열 전체 또는 일부를 프로브로 사용하여 서던 블럿을 실시하였다.
이때, 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)의 게놈 DNA는 제한효소 EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, BamHI, PstI로 각각 절단하여 사용하였으며, 프로브로서는 프로브 1로 상기 서열 1의 HARS36 서열 전체, 프로브 2로 HARS36의 238번-523번 뉴클레오티드 서열(A 지역 및 B 지역을 포함), 그리고 프로브 3으로 HARS36의 992번-1227번 뉴클레오티드 서열(D 지역을 포함)을 각각 사용하였다.
실험 결과는 제6도에 나타내었으며, 제6도에서 M열은 DNA 크기 표지로서 위로 부터 23.0, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0 및 0.56kb를 각각 나타내고, 1열 내지 6열은 EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, BamHI 및 PstI으로 각각 절단된 한세눌라 폴리모르파 DL-IL(Leu 2)의 게놈 DNA를 나타낸다.
제6도에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로브 2를 사용한 서던 블럿 결과와 프로브 3을 사용한 서던 블럿 결과는 서로 매우 다른 패턴을 보였다. 이는 D 지역이 A지역, B지역 및 C지역을 포함한 지역과는 서로 다른 유전자 기원을 가짐을 나타낸다. 즉, HARS36은 클로닝 과정에서 두개의 복합적인 유전자 형태로 얻어졌음을 알 수 있다.
실시예 3 : 한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열 TEL188, TEL135 및 TEL61
한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)의 전체 게놈 DNA를 DNA T4 중합 효소로 처리한 후, PstI으로 절단하여 400-600 bp의 DNA 절편을 얻었다. 이 DNA 절편들을 플라스미드 pBluescript KS+(Stratagen사)의 PstI-EcoRV 위치에 삽입하여 제조된 플라스미드 라이브러리로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 약 500개를 선발하고, 이 형질전환 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 프로브로서 상기 실시예 2(4)의 프로브 2를 사용하여 서던 블럿팅 분석을 실시하였다.
서던 블럿 결과, pBKS-TEL188, pBKS-TEL135 및 pBKS-TEL61로 명명된 3개의 플라스미드가 프로브 2와 상동성을 나타내었다.
이들 플라스미드에 포함된 신규 서열을 각각 TEL188, TEL135 및 TEL61로명명하였으며, 이들의 DNA 염기 서열을 결정하여 GeneBank에 각각 U82170, U82171 및 U82172로 등록하였다. 상기 TEL188, TEL135 및 TEL61 유전자의 염기 서열은 각각 상기의 서열 2, 서열 3 및 서열 4와 같으며, 이로부터 유추되는 서열의 크기는 각각 453, 405 및 460 bp인 것으로 확인되었다.
TEL188의 서열은 HARS36의 A지역, B지역 및 C지역과 완전히 동일하여, 상기 두 서열은 동일한 염색체 기원을 가지고 있음이 확인되었다. TEL135 및 TEL61의 서열도 HARS36 서열과 매우 유사하였으나, TEL135의 서열은 B 지역 일부분이 결실되어 있었다.
서열 TEL188, TEL135 및 TEL61의 말단은 모두 HARS36의 C 지역과 동일한 반복 서열 5'-GGGTGGCG-3'으로 구성되어 있었고, 반복 횟수는 각각 18회, 23회 및 18회이었다.
플라스미드 pBKS-TEL61, pBKS-TEL135 및 pBKS-TEL188로 각각 형질전환된 대장균 DH5α(대장균 DH5α/pBKS-TEL61, 대장균 DH5α/pBKS-TEL135 및 대장균 DH5α/pBKS-TEL188)를 1997년 7월 24일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0353BP 호, 제 KCTC 0354BP 호 및 제 KCTC 0355BP 호로서 각각 기탁하였다.
실시예 4 : 자기복제서열 TEL188, TEL135 및 TEL61의 자기복제 활성
실시예 3에서 얻은 3개의 자기복제 서열, TEL188, TEL135 및 TEL61의 자기복제 활성을 다음과 같이 조사하였다.
즉, 상기 자기복제 서열들을 각각 pCLHX의 PstI-HindIII 위치에 삽입하여 각각 pCTEL188, pCTEL135 및 pCTEL61을 제조하고, 이들 재조합 플라스미드를 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 형질전환시켜 실시예 1의 (단계 5)에서와 같이 형질 전환 효율을 조사하였다. 이때 대조구로서 자기복제 서열을 함유하지 않는 플라스미드 pCLHX 및 HARS36 서열을 함유한 플라스미드 pCE36을 사용하여 동일하게 형질전환을 실시하였다.
실험 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
T-10
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 서열 TLE188, TEL135 및 TEL61은 HARS36과 유사한 자기 복제 활성을 가지며, 상기 서열들은 기능적으로 HARS36 서열과 동일하거나 유사하였다.
즉, 서열 HARS36, TEL188, TEL135 및 TEL61에 공통적으로 존재하는 자기복제서열 및 말단 반복 서열 5'-GGGTGGCG-3'은 다중병렬도입형 자기복제 능력을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 5 : 한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열을 이용한 인체 표피 성장인자(hEGF)의 생산
(단계 1) 발현벡터의 제조
한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열 HARS36을 이용하여 인체 표피 성장 인자(human epidermal growth factor; hEGF)를 생산하기 위하여, 먼저 hEGF 유전자를 포함하는 플라스미드 pUREGF를 제7도의 제조과정에 따라 다음과 같이 제조하였다.
즉, 플라스미드 pAA3(Tajima et al., Mol. Cell. Biol., 6, 246-256(1986))를 HindIII로 절단하여 사카로마이세스 세레비지에 유래의 URA3유전자를 포함하는 1.2kb의 DNA 절편을 얻었다. 실시예 1의 (단계 4)에서 제조된, 한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열 HARS36을 포함하는 플라스미드 pCE36을 HindIII로 절단하고, 절단된 플라스미드 pCE36에 URA3 유전자를 포함하는 1.2kb DNA 절편을 삽입하여 플라스미드 pCEU36을 제조하였다. 플라스미드 pCEU36 및 플라스미드 pA-EGF3(오용익 등, 산업미생물학회지, 22, 477-484(1994))를 각각 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 서로 여결하여 플라스미드 pCEU-EGF를 제조하였다. 이를 다시 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단하여 한세눌라의 류이신 유전자(HLEU2)를 제거함으로써 URA3 유전자, 자기복제서열 HARS36 및 인체 표피 성장인자를 포함하는 플라스미드 pUREGF를 제조하였다.
이 플라스미드 pUREGF로 형질전환된 대장균 DH5α(대장균 DH5α/pUREGF)를 1997년 1월 14일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8771P 호로서 기탁하였다.
(단계 2) 우라실 요구성 한세눌라 폴리모르파 균주의 제조
다음으로, EGF 생산을 위한 숙주세포로 사용하기 위하여 우라실 요구성 한세눌라 폴리모르파 균주를 다음과 같이 제조하였다.
즉, 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 자외선을 조사하여 돌연변이를 유발한 후, 생존한 5×104세포를 20㎍/㎖의 우라실 및 70㎍/㎖의 5-플루오로오로트산 (5-FOA)를 함유하는 최소 배지에 도말하고 배양하여 약 1,000개의 저항성이 있는 콜로니를 1차 선별하였고, 1차 선별한 콜로니를 우라실이 없는 최소 배지에 레프리카 플레이팅하여 약 22개의 우라실 요구성 균주를 2차 선별하였다. 이들중 세포 성장 속도가 비교적 빠른 균주 DLU10을 선별하여 인체 표피 성장 인자의 생산을 위한 숙주 세포로 사용하였다.
(단계 3) hEGF의 생산량 측정
상기한 플라스미드 pUREGF를 한세눌라 폴리모르파 DLU 10에 형질전환한 후, 최소배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 질소 기질, 2% 글루코즈, 2% 아가)에서 37℃로 72시간동안 배양하여 선별하였다. 플라스미드 pUREGF를 함유하는 한세눌라 폴리모르파 DLU10(H. polymorpha DLU10/pUREGF)을 1997년 7월 24일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0356BP 호로서 기탁하였다.
형질전환체를 YPD 고체배지에서 37℃에서 24시간 배양하여 자란 콜로니를 니트로셀룰로오스 막에 전이한 후, 니트로셀룰로오스 막을 유도 배지(증류수 1ℓ당 효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 메탄올 20㎖, 박토아가 20g)에 옮겨 37℃에서 24시간 배양하였다. 니트로셀룰로오스 막을 세척액(500mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 세척하고, 0.4% 글루타르알데하이드로 실온에서 45분간 처리하여 분비된 hEGF를 고정시킨 후, TBST(TBS: 10mM Tris, 0.15mM NaCl, pH 7.4, 0.05% Tween 20)로 5분씩 2회 세척하고, 다시 5% 탈지분유(w/v in TBS)로 37℃에서 1시간 반응시킨 후, TBST로 5분씩 2회 세척하였다.
상기 막을 hEGF의 단일 클론 항체(monoclonal antibody: UBI #05-109)를 TBS 용액에 1:10,000의 비율로 희석한 용액으로 37℃에서 1시간 처리한 후 TBST로 5분씩 2회 세척하였다. 이 막을 알칼라인 포스파테이즈가 결합된 이차 항체 (alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG, Bio-Rad사)를 TBS에 1:3,000의 비율로 희석한 용액으로 1시간 동안 상온에서 처리한 후, TBST 및 TBS로 각각 5분씩 3회 세척하였다.
알칼라인 포스파테이즈의 기질인 5% NBT(nitro blue tetrazolium)와 5% BCIP(bromochloroindolyl phosphate)를 알칼라인 포스파테이즈 반응 완충액(100mM Tris pH 9.5, 100mM NaCl, 15mM MgCl2)에 0.33% NBT와 0.165% BCIP가 되도록 희석한 후 상기 막에 가하여 발색시켰다. hEGF가 발현된 균주의 위치에서 보라빛의 시그널을 확인할 수 있는데, 분비되는 hEGF의 양이 많을 수록 강한 시그널을 보이므로 발색 정도가 강한 부위에 대응하는 형질전환체들을 1차 선별하였다.
1차적으로 선별된 균주들을 YP-글리세롤 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글리세롤)에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하였다. 이를 2% 메탄올이 첨가된 YP 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤)에 1%로 접종하여 37℃에서 진탕배양하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 ELISA(enzyme-liked immunosorbent assay) 방법으로 hEGF의 분비 정도를 측정하였다.
채취한 시료는 원심분리하여 상등액을 분리한 후 항원 코팅 완충액(0.1M sodium carbonate buffer pH 9.6)에 적절히 희석하여 희석액 100㎕씩을 마이크로타이터 웰(Nunc-immunomodule)에 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 웰을 PBST(PBS: phosphate buffered saline+0.1% 트윈 20)로 세척한 후 PBS에 0.05%로 녹인 젤라틴을 웰당 100㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 웰을 PBST로 세척하고 hEGF의 단일 클론 항체(monoclonal antibody: UBI #05-109)을 0.05% 젤라틴이 들어있는 PBS 용액에 1:10000의 비율로 희석하여 웰당 100㎕씩 넣었다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 다시 PBST로 씻어내로 여기에 서양 고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 이차 항체(Horse radish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG : Bio-Rad)를 0.05% 젤라틴이 들어 있는 PBS 용액에 1;3,000의 비율로 희석하여 웰당 100㎕ 씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST로 씻어내고 발색시켰다. 발색은 Pierce사의 퍼옥시다제 반응 기질인 TMB 기질 키트(Substrate Kit)를 사용하였는데, 0.04% TMB(3, 3'. 5, 5' tetramethylbenzidine)와 시트르산 완충액에 0.02%로 희석한 과산화수소를 1:1로 섞어 웰당 100㎕씩 넣은 다음 약 15분 후 2M 황산을 100㎕씩 넣어 반응을 정지시켰다. 발색 시킨후의 정량은 96-웰 플레이트 오토리더(96-well plate autoreader: THERMOmax, Moleculr Devices, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 정량을 위한 표준 hEGF 시료(UBI사, #01-107)는 0.25ng/웰에서 5ng/웰까지 각각 희석하여 반응시켰다. 이 과정을 통하여 선별한 hEGF 고생산 균주 UR2는 약 474.96㎎/L의 생산성을 보여 기존의 HARS3를 이용한 대조균주 2-21(24.0 ㎎/L)(오용익 등, 산업미생물학회지, 22, 477-484(1994))에 비해 20배 이상 생산성이 향상되었다.
(단계 4) hEGF 유전자의 도입 형태 조사
한세눌라 폴리모르파로 도입된 hEGF 유전자의 도입형태를 조사하기 위하여 hEGF 고생산균주 UR2의 전체 염색체를 분리하여 전기영동하고 메탄올 산화효소(MOX) 프로모터 유전자를 프로브로 사용하여 서던블롯팅하였다. 제8a도 및 제8b도는 재조합 hEGF 생산균주 UR2의 유전자도입 카피(copy) 수 및 삽입형태 결정을 위한 서던블롯팅 분석 결과를 나타낸 것으로, 제8a도에서 보는 바와 같이, 염색체에 단일카피 존재하는 MOX 프로모터에 의해 나타난 시그날(0.8kb)과 hEGF발현을 위해 도입된 MOX 프로모터의 시그날(1.8kb)을 비교하였을 때 상대적으로 형질전환에 의해 나타난 시그날이 매우 강하기 때문에 외래유전자가 다중으로 도입되었음을 알 수 있었다.
또한 병렬형의 삽입형태를 확인하기 위하여 형질전환 플라스미드 pUREGF를 단일 부위만을 절단하는 제한효소 BamHI으로 처리하고 사카로마이세스 세레비지에의 URA3를 프로브로 사용하여 서던블럿팅하였다. 제8b도에서 보는 바와 같이 형질 전환 플라스미드 pUREGF와 동일한 크기의 강한 시그날과 약한 시그날을 보이는 하나의 말단절편에 해당하는 시그날이 보였고 또 하나의 말단 시그날을 사용한 프로브와 상동성이 없기 때문에 관찰되지 않았다. 따라서 hEGF 유전자가 한세눌라 폴리모르파의 염색체내로 다중병렬형으로 도입되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다중병렬도입형 자기복제서열들은 한세눌라 폴리모르파의 염색체에 다중병렬형으로 도입되는 특성이 있으므로, 본 발명의 다중병렬형 자기복제서열을 함유하는 발현 벡터는 한세눌라 폴리모르파에서 외래단백질의 생산을 위해 사용될 경우 형질전환의 효율 및 안정성이 높아 매우 유용하다.
Claims (11)
- 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열.
- 제1항에 있어서,하기 서열 1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 다중병렬도입형 자기복제 서열.[서열 1]
[서열 2]
[서열 3]
[서열 4]
- 외래 유전자를 숙주의 염색체내로 다중병렬도입시킬 수 있고, 서열 1의 523번 내지 700번 뉴클레오티드로 이루어진, 하기 서열 7을 갖는 한세눌라 폴리모르파 DL-1으로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열의 DNA 단편:[서열 7]
- 3'-말단에 서열 5-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열; 프로모터; 상기 프로모터의 하류에 위치한, 이종 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 터미네이터를 함유하는, 한세눌라 폴리모르파의 염색체내로 이종 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 다중병렬형으로 삽입하기 위한 발현벡터.
- 제4항에 있어서,상기 다중병렬도입형 자기복제서열이 서열 1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현벡터.
- 제4항에 있어서,발현벡터 pUREGF인 발현벡터.
- 제6항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제7항에 있어서, 대장균 DH5α/pUREGF(KCTC 8771P)인 미생물.
- 제7항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파 DLU10/pUREGF(KCTC 0356BP)인 미생물.
- 3'-말단에 서열 5-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열의 조절하에 발현가능하게 연결된 이종 단백질 유전자를 함유하는 발현벡터를 제작하고, 이 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고, 이 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는, 한세눌라 폴리모르파에서 이종 단백질을 생산하는 방법.
- 제10항에 있어서,상기 이종 단백질이 인체 표피성장인자(hEGF)인 방법.
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