NO315206B1

NO315206B1 - New cells containing alcohol oxidase II regulatory region

Info

Publication number: NO315206B1
Application number: NO19954360A
Authority: NO
Inventors: James Michael Cregg
Original assignee: Res Corp Technologies Inc
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 2003-07-28
Also published as: NO954360L; NO954360D0

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår biologiske renkulturer av Pichia pastoris, transformert med vektorer som inneholder DNA-sekvenser som styrer transkripsjonen av DNA. The invention relates to the field of recombinant DNA biotechnology. One aspect of the invention relates to biological pure cultures of Pichia pastoris, transformed with vectors containing DNA sequences that direct the transcription of DNA.

Den foreliggende oppfinnelse angår generelt manipuleringen av genetisk materiale, særlig styringen av hyppigheten av transkripsjon av RNA fra DNA. Oppfinnelsen angår spesielt et regulatorisk område av Pichia pastoris alkoholoksidase II-genet. The present invention generally relates to the manipulation of genetic material, in particular the control of the frequency of transcription of RNA from DNA. The invention relates in particular to a regulatory region of the Pichia pastoris alcohol oxidase II gene.

Etter hvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg i de senere år, er den styrte produksjon ved celler av en mengde forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange er eukaryote polypeptider, for eksempel humant veksthormon, leukocytrinterferoner, humant insulin og humant proinsulin som er blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse av teknikker som man allerede beherskersventes i fremtiden å tillate rekombinant produksjon av en rekke forskjellige andre nyttige polypeptidprodukter. As recombinant DNA biotechnology has advanced in recent years, the controlled production by cells of a variety of useful polypeptides has become possible. Many are eukaryotic polypeptides, such as human growth hormone, leukocyte interferons, human insulin and human proinsulin, which have been produced by various microorganisms. The continued application of techniques already mastered is expected in the future to allow the recombinant production of a variety of other useful polypeptide products.

De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant-teknologi, er kjent av fagfolk. De elementer som fortrinnsvis foreligger for utførelse av rekombinant-DNA-bioteknologi, omfatter men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for ett eller flere ønskede polypeptider operabelt forbundet (operabelt forbundet betegner en sammenstilling hvorved komponentene er anordnet slik at de utfører sin vanlige funksjon) med adekvate styringssekvenser som er nødvendige for ekspresjon i vertscellen; (2) en vektor, vanligvis et plasmid, inn i hvilken en nukleotidsekvens kan innsettes, en vektor er et hvilket som helst nukleotidsekvensholdig konstruert stykke, som kan transformere en vert; (3) en egnet vert inn i hvilken den ønskede nukleotidsekvens kan overføres, hvor verten også har det celleapparat som tillater ekspresjon av den informasjon som det er kodet for, ved den overførte nukleotidsekvens. The basic techniques used in the field of recombinant technology are known to those skilled in the art. The elements that are preferably present for carrying out recombinant DNA biotechnology include, but are not limited to: (1) a gene encoding one or more desired polypeptides operably linked (operably linked means an assembly whereby the components are arranged so that they perform its normal function) with adequate control sequences necessary for expression in the host cell; (2) a vector, usually a plasmid, into which a nucleotide sequence can be inserted, a vector being any nucleotide sequence-containing construct, which can transform a host; (3) a suitable host into which the desired nucleotide sequence can be transferred, where the host also has the cellular apparatus that allows expression of the information encoded for by the transferred nucleotide sequence.

Et grunnleggende element som anvendes i rekombinant-teknologi er plasmidet, som er et sirkelformet ekstrakromosomalt dobbelttrådet DNA, som først ble funnet i mikroorganismer. Plasmider er blitt funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider, er en rekke forskjellige, av mennesker fremstilte plasmider blitt preparert. I plasmidet er det inkludert informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens og/eller et opprinnelsessted for replikasjon. En eller flere metoder til fenotypisk seleksjon av plasmidet i transformerte celler, kan også være innlemmet i den informasjon som er kodet inn i plasmidet. De fenotypiske egenskaper, eller markørseleksjons-egenskaper, såsom resistens for antibiotika, tillater at kloner av vertscellen som inneholder det plasmid som er av interesse, kan gjenkjennes og selekteres for ved preferentiell dyrking av cellene i selektive media. Vektorer, eller plasmider kan kløyves spesifikt av ett eller flere restriksjonsendonukleaser eller restriksjonsensymer, som hver gjenkjenner en spesiell nukloetidsekvens. Deretter kan et regulatorisk område, operabelt forbundet med et heterologt gen, dvs. et gen som ikke forekommer naturlig i kombinasjon med det regulatoriske område, eller andre nukleotidsekvenser, innsettes ved å forbinde operabelt det ønskede genetiske materiale ved kløyvingssetet, eller ved rekonstruerte ender som grenser opp til kløyvingssetet. A basic element used in recombinant technology is the plasmid, which is a circular extrachromosomal double-stranded DNA, which was first found in microorganisms. Plasmids have been found to occur in several copies per cell. Besides naturally occurring plasmids, a number of different man-made plasmids have been prepared. The plasmid includes information that is necessary for plasmid reproduction, i.e. an autonomous replication sequence and/or a place of origin for replication. One or more methods for phenotypic selection of the plasmid in transformed cells can also be incorporated into the information encoded in the plasmid. The phenotypic characteristics, or marker selection characteristics, such as resistance to antibiotics, allow clones of the host cell containing the plasmid of interest to be recognized and selected for by preferential cultivation of the cells in selective media. Vectors, or plasmids, can be cleaved specifically by one or more restriction endonucleases or restriction enzymes, each of which recognizes a particular nucleotide sequence. Then, a regulatory region, operably linked to a heterologous gene, i.e. a gene that does not naturally occur in combination with the regulatory region, or other nucleotide sequences, can be inserted by operably linking the desired genetic material at the cleavage site, or at reconstructed ends bordering up to the split wing seat.

Vektoren blir deretter innført i en vertscelle, hvor dens nukleotidsekvens kan beordre verten til å utføre forskjellige prosesser eller funksjoner. Noen eksempler omfatter ekspresjon av heterologe polypeptider, eller overekspresjon av homologe eller heterologe polypeptider. Prosessen hvor nukleotid innføres i vertcellen, blir generelt betegnet transformasjon. Store mengder av vektoren kan fås ved innføring av vektoren i en egnet vert for å øke dens kopitall. En vertscelle som det er vanlig å bruke for å øke kopitallet av vektoren, er E. coli. Vektorene blir deretter isolert fra den første vert, og innført i en annen vertscelle hvor de ønskede vektorbeordrede aktiviteter vil finne sted f.eks. produksjonen av et polypeptid. Produksjonen av et endeprodukt fra DNA på denne måte, blir betegnet som ekspresjon. Når genet er riktig innsatt i vektoren med hensyn til de partier av vektoren som styrer transkripsjon og translasjon av den kodede nukleotidsekvens, kan den resulterende vektor benyttes til å beordre produksjonen av polypeptidsekvensen for hvilken det innsatte gen koder. The vector is then introduced into a host cell, where its nucleotide sequence can command the host to perform various processes or functions. Some examples include expression of heterologous polypeptides, or overexpression of homologous or heterologous polypeptides. The process by which nucleotide is introduced into the host cell is generally termed transformation. Large amounts of the vector can be obtained by introducing the vector into a suitable host to increase its copy number. A host cell that is commonly used to increase the copy number of the vector is E. coli. The vectors are then isolated from the first host, and introduced into another host cell where the desired vector-ordered activities will take place, e.g. the production of a polypeptide. The production of an end product from DNA in this way is termed expression. When the gene is properly inserted into the vector with respect to the parts of the vector that direct transcription and translation of the encoded nucleotide sequence, the resulting vector can be used to direct the production of the polypeptide sequence for which the inserted gene codes.

Ekspresjon styres av et regulatorisk område. Regulatoriske områder er heterogene nukleotidsekvenser, som reagerer på forskjellige stimuli og virker inn på hyppigheten av RNA-transkripsjon. Ekspresjon kan skrus på eller av som reaksjon på stimuli. Ekspresjon som skrus på som reaksjon på en stimulus, blir vanligvis betegnet som derepresjon eller induksjon. Noen eksempler på induserbare ekspresjonssystemer er AOX1 -systemer i Pichia pastoris. estrogensystemene i Xenopus laevis og metalltioneinsystemene hos aper, mennesker, hamstere, mus og rotter. Induserbare ekspresjonssystemer er vanligvis under mer stringent styring enn konstitutive systemer. Disse systemer er vel egnede for gentekniske formål. Expression is controlled by a regulatory domain. Regulatory regions are heterogeneous nucleotide sequences, which respond to different stimuli and affect the frequency of RNA transcription. Expression can be turned on or off in response to stimuli. Expression that is turned on in response to a stimulus is usually termed derepression or induction. Some examples of inducible expression systems are AOX1 systems in Pichia pastoris. the estrogen systems in Xenopus laevis and the metallothionein systems in monkeys, humans, hamsters, mice and rats. Inducible expression systems are usually under more stringent control than constitutive systems. These systems are well suited for genetic engineering purposes.

I praksis kan bruken av rekombinant-DNA-bioteknologi danne celler som kan uttrykke heterologe nukleotidsekvenser. Heterologe nukleotidssekvenser er nukleotidsekvenser som ikke opptrer naturlig i verten. Eksempler på slike vil være nye kombinasjoner av regulatoriske områder som opptrer naturlig inne i verten med strukturelle gener som ikke er naturlig knyttet til dette regulatoriske område. Et annet eksempel vil være kombinasjonen av et regulatorisk område med et gen som ikke forekommer naturlig i verten. Det heterologe polypeptid kan produseres som et fusjonspolypeptid, dvs. et heterologt polypeptid, sammenføyet med et parti av aminosyresekvensen av et homologt eller heterologt polypeptid. Det opprinnelig oppnådde fusjonspolypeptidprodukt blir iblant produsert i en inaktiv form, inntil det sammenføyde polypeptid kløyves i en ekstracellulær omgivelse. In practice, the use of recombinant DNA biotechnology can generate cells that can express heterologous nucleotide sequences. Heterologous nucleotide sequences are nucleotide sequences that do not occur naturally in the host. Examples of such would be new combinations of regulatory areas that occur naturally inside the host with structural genes that are not naturally linked to this regulatory area. Another example would be the combination of a regulatory region with a gene that does not occur naturally in the host. The heterologous polypeptide may be produced as a fusion polypeptide, i.e. a heterologous polypeptide joined with a portion of the amino acid sequence of a homologous or heterologous polypeptide. The initially obtained fusion polypeptide product is sometimes produced in an inactive form, until the joined polypeptide is cleaved in an extracellular environment.

Slik det tidligere er angitt i Europapatentsøknad nr. 86114700.7, koder Pichia pastoris-genomet for to funksjonelle alkoholoksidasegener AQX1 og AQX2. As previously stated in European Patent Application No. 86114700.7, the Pichia pastoris genome encodes two functional alcohol oxidase genes AQX1 and AQX2.

Det er nå funnet et 5' regulatorisk område som er knyttet til det AOX2 strukturelle gen. Dette regulatoriske område er induserbart ved metanol eller karbonkildehunger. Det maksimale ekspresjonsnivå fra det AQX2 regulatoriske område er imidlertid bare 5 - 11% i forhold til det fra det AOX1 regulatoriske område f AOXl-genet er angitt i Europapatentsøknad nr. 85201235.0). A 5' regulatory region has now been found which is linked to the AOX2 structural gene. This regulatory region is inducible by methanol or carbon source starvation. However, the maximum expression level from the AQX2 regulatory region is only 5 - 11% in relation to that from the AOX1 regulatory region (the AOX1 gene is indicated in European patent application no. 85201235.0).

Det AOX2 regulatoriske område kan anvendes til å uttrykke heterologe gener og er særlig nyttig i de situasjoner hvor høye ekspresjonsnivåer av et protein er ufordelaktige. The AOX2 regulatory region can be used to express heterologous genes and is particularly useful in situations where high expression levels of a protein are disadvantageous.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye celler som ikke har ulempene angitt ovenfor. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav. It is therefore an aim to provide new cells which do not have the disadvantages indicated above. This purpose has been achieved with the present invention characterized by what appears from the attached claims.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er det funnet, isolert ogkarakterisertbiologisk renkultur av Pichia pastoris med en DNA-sekvens som styrer hyppigheten av transkripsjonen av DNA til RNA. De nye DNA-sekvenser er nyttige for produksjonen av polypeptidprodukter ved metylotrofe gjærsorter såsom Pichia pastoris. According to the present invention, a biological pure culture of Pichia pastoris with a DNA sequence that controls the frequency of transcription of DNA to RNA has been found, isolated and characterized. The new DNA sequences are useful for the production of polypeptide products by methylotrophic yeasts such as Pichia pastoris.

Kort beskrivelse av tegningen: Short description of the drawing:

- Fig. 1 viser restriksjonskartet av AOX1 (a) og AQX2 (b) genene. - Fig. 1 shows the restriction map of the AOX1 (a) and AQX2 (b) genes.

- Fig. 2 viser et restriksjonskart av pBR322. - Fig. 2 shows a restriction map of pBR322.

- Fig. 3 viser et restriksjonskart av pYJ8. - Fig. 3 shows a restriction map of pYJ8.

- Fig. 4 viser et restriksjonskart av plasmid pYM5. - Fig. 4 shows a restriction map of plasmid pYM5.

- Fig. 5 viser et restriksjonskart av plasmid pMR4. - Fig. 5 shows a restriction map of plasmid pMR4.

- Fig. 6 viser et flytdiagram for konstruksjonen av pMR4. - Fig. 6 shows a flow diagram for the construction of pMR4.

- Fig. 7 viser et restriksjonskart av plasmid pBPfl. - Fig. 7 shows a restriction map of plasmid pBPfl.

- Fig. 8 viser et restriksjonskart av plasmid pYJ55. - Fig. 8 shows a restriction map of plasmid pYJ55.

- Fig. 9 viser et flytdiagram for konstruksjonen av plasmid pYJ55. - Fig. 9 shows a flow diagram for the construction of plasmid pYJ55.

- Fig. 10 viser et restriksjonskart av plasmid pSAOH5. - Fig. 10 shows a restriction map of plasmid pSAOH5.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er der skaffet celler med en ny DNA-sekvens inneholdende et regulatorisk, område som reagerer på minst en av de følgende betingelser: nærværet av metanol i vertsomgivelsen eller karbonkildehunger når vertscellen dyrkes på substrater andre enn metanol. Det regulatoriske område ifølge oppfinnelsen kan styre transkripsjonshyppigheten av RNA når det er operabelt forbundet ved 5'-enden av en DNA-sekvens, som.koder for produksjonen av mRNA. According to the present invention, cells have been obtained with a new DNA sequence containing a regulatory region which responds to at least one of the following conditions: the presence of methanol in the host environment or carbon source starvation when the host cell is grown on substrates other than methanol. The regulatory region according to the invention can control the transcription frequency of RNA when it is operably connected at the 5' end of a DNA sequence, which codes for the production of mRNA.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå av beskrivelsen og de tilhørende krav. These and other purposes of the invention will be apparent from the description and the associated claims.

I. Karakteriserin<g>av det alkoholoksidase regulatoriske område. I. Characterization<g>of the alcohol oxidase regulatory region.

Det fullstendige AOX2-gen inneholdes i det restriksjonskart som er vist på fig. l(b). Det AOX2 regulatoriske område inneholdes mellom det første EcoRI-sete fra 5'-enden, og startkodonet av det AQX2 strukturelle gen som vist ved restriksjonskartet på fig. 1 (b). Det parti av DNA-sekvensen som koder for alkoholoksidase II-proteinet, er vist ved det skraverte område under restriksjonskartet. Et restriksjonskart av alkoholoksidase I-genet, er vist for sammenligning av de to gener, fig. 1 (a). Ingen betydelig sekvenshomologi ble observert utenfor genenes proteinkodende parti. The complete AOX2 gene is contained in the restriction map shown in fig. l(b). The AOX2 regulatory region is contained between the first EcoRI site from the 5' end, and the start codon of the AQX2 structural gene as shown by the restriction map in fig. 1 (b). The part of the DNA sequence that codes for the alcohol oxidase II protein is shown by the shaded area below the restriction map. A restriction map of the alcohol oxidase I gene is shown for comparison of the two genes, fig. 1 (a). No significant sequence homology was observed outside the protein coding part of the genes.

Det AOX2 regulatoriske område er ved et lacZ-fusjonskonstruert stykke, blittkarakteriserttil å behøve ikke mer enn fra ca. basepar -1500 til ca. basepar -1, for regulatorisk aktivitet (som vist i tabell 1). Nukleotidsekvensen, for et DNA-fragment, inneholdende det AOX2 regulatoriske område, er vist i tabell 1. Det A0X2 regulatoriske område reagerer på minst en av de følgende betingelser: Nærværet av metanol som den eneste karbonkilde for metylotrofe gjærverter, såsom Pichiaastoris. eller karbonkildehunger i de nevnte vertsceller. Dessuten stimulerer det AOX2 regulatoriske område tilnærmet 5-11% av proteinproduksjonen av B-galaktosidase sammenlignet med det AOX1 regulatoriske område. The AOX2 regulatory region has, by a lacZ fusion-constructed piece, been characterized to need no more than from approx. base pair -1500 to approx. base pair -1, for regulatory activity (as shown in Table 1). The nucleotide sequence, for a DNA fragment containing the AOX2 regulatory region, is shown in Table 1. The AOX2 regulatory region responds to at least one of the following conditions: The presence of methanol as the sole carbon source for methylotrophic yeast hosts, such as Pichiaastoris . or carbon source starvation in the aforementioned host cells. Moreover, the AOX2 regulatory region stimulates approximately 5-11% of the protein production of B-galactosidase compared to the AOX1 regulatory region.

II. Isolasjon av alkoholoksidase II regulatorisk. område fra Pichia pastoris. II. Isolation of alcohol oxidase II regulatory. area from Pichia pastoris.

Det AOX2 regulatoriske område ble isolert ved transformasjon av Pichia-stamme MC 100-3 (arg4, his4. aoxl=j=: : SARG4 aox2^: : Phis4). Denne stamme inneholder en mutantkopi av Pichia HIS4-genet insatt i AOX2-genet. MC 100-3 ble transformert med pYM5, et plasmid sammensatt av et 2,7 kb BglH-fragment inneholdende Pichia HIS4-genet insatt ved BamHI-setet av pBR322. DNA fra flere MC 100-3 (pYM5) His<+->transformanter, ble sortert ved Southern filter-hybridisering for transformanter som inneholdt pYM5 integrert med HIS4-fragmentet anordnet i AOX2-lokuset av MC 100-3. DNA fra en av disse stammer ble deretter digerert med Hindlll, som førte til frigjøring av et genomisk fragment på ca. 12 kb inneholdende 5,3 kb av sekvensen 5' av AOX2 Kpnl-setet, 2,7 kb av Pichia HIS4-genet og 4,0 kb av pBR322. Det Hindlll-kuttede DNA ble ligatisert og transformert inn i E. coli. Transformanter ble selektert ved resistens for ampicillin. Et plasmid, pMR4, ble utvunnet og et restriksjonskart av dette plasmid er vist på fig. 5. The AOX2 regulatory region was isolated by transformation of Pichia strain MC 100-3 (arg4, his4. aoxl=j=: : SARG4 aox2^: : Phis4). This strain contains a mutant copy of the Pichia HIS4 gene inserted into the AOX2 gene. MC 100-3 was transformed with pYM5, a plasmid composed of a 2.7 kb BglH fragment containing the Pichia HIS4 gene inserted at the BamHI site of pBR322. DNA from several MC 100-3 (pYM5) His<+-> transformants was sorted by Southern filter hybridization for transformants containing pYM5 integrated with the HIS4 fragment located in the AOX2 locus of MC 100-3. DNA from one of these strains was then digested with HindIII, which led to the release of a genomic fragment of approx. 12 kb containing 5.3 kb of the sequence 5' of the AOX2 KpnI site, 2.7 kb of the Pichia HIS4 gene and 4.0 kb of pBR322. The HindIII cut DNA was ligated and transformed into E. coli. Transformants were selected by resistance to ampicillin. A plasmid, pMR4, was recovered and a restriction map of this plasmid is shown in fig. 5.

II. Egenskaper av det AOX2 regulatoriske område. II. Properties of the AOX2 regulatory region.

For å sammenligne ekspresjon av det AOX2 regulatoriske område med det for AOX1. ble en AOX2- lacZ-ekspresjonsvektor konstruert som var så lik som mulig pSAOH5 (vist på fig. 10), en AQX1 - lacZ-fusjonsvektor. Flytdiagrammet for konstruksjon av AOX2- IacZ-vektoren, pYJ55, er vist på fig. 9. Preliminære DNA-sekvensdata fra 5'-enden av AOX2. viste at AOX2 inneholder to BamHI-seter i posisjoner i det strukturelle gen identiske med dem man finner i AOX1 strukturelt gen. Følgelig var det første trinn i konstruksjonen av pYJ55 å innsette et BgHI-BamHI-fragment på 1,8 kb, som inneholder det AOX2 regulatoriske område, og 45 basepar av den aminoterminale proteinkodende sekvens inn i BamHI-setet av pBPfl for å danne pYJ38. Det annet trinn var å kutte pYJ38 med BamHI, og innsette det samme adaptor-oligonukleotid som var innsatt for konstruksjonen av AOXl- lacZ-vektoren (5'-GATCACCCGGGT-3'). Innsettingen av denne adaptor ødela BamHI-setet av pYJ38 og dannet et nytt Smal-sete ved punktet for innsettingen. Dette plasmid, pYJ45, ble digerert med Smal, og det 1,8 kb Smal-fragment inneholdende den modifiserte AOX2-promotor ble innsatt i pBPfl for å danne plasmid pYJ46. Plasmid pYJ46 ble digerert med EcoRI for å fjerne et 0,3 kb fragment fra 5'-enden av AOX2-fragmentet i pYJ46. Plasmidet ble religatisert for å danne plasmid pYJ55. Et restriksjonskart av plasmid pYJ55 er vist på fig. 8. To compare expression of the AOX2 regulatory region with that of AOX1. an AOX2- lacZ expression vector was constructed that was as similar as possible to pSAOH5 (shown in Fig. 10), an AQX1 - lacZ fusion vector. The flow chart for construction of the AOX2-IacZ vector, pYJ55, is shown in Fig. 9. Preliminary DNA sequence data from the 5' end of AOX2. showed that AOX2 contains two BamHI sites in positions in the structural gene identical to those found in the AOX1 structural gene. Accordingly, the first step in the construction of pYJ55 was to insert a 1.8 kb BgHI-BamHI fragment containing the AOX2 regulatory region and 45 base pairs of the amino-terminal protein coding sequence into the BamHI site of pBPfl to form pYJ38. The second step was to cut pYJ38 with BamHI, and insert the same adapter oligonucleotide that was inserted for the construction of the AOX1-lacZ vector (5'-GATCACCCGGGT-3'). The insertion of this adapter destroyed the BamHI site of pYJ38 and created a new SmaI site at the point of insertion. This plasmid, pYJ45, was digested with SmaI, and the 1.8 kb SmaI fragment containing the modified AOX2 promoter was inserted into pBPfl to form plasmid pYJ46. Plasmid pYJ46 was digested with EcoRI to remove a 0.3 kb fragment from the 5' end of the AOX2 fragment in pYJ46. The plasmid was religated to form plasmid pYJ55. A restriction map of plasmid pYJ55 is shown in fig. 8.

Plasmid pYJ55 ble transformert inn i GS115 (his4), og His<+->transformanter ble sortert for en stabil His<+->fenotype som indikerte nærværet av et integrert plasmid. Genomisk DNA fra flere stabile His<+->stammer ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bekrefte nærværet og bestemme lokaliseringen av plasmidet. Plasmid pYJ55 was transformed into GS115 (his4), and His<+->transformants were sorted for a stable His<+->phenotype indicating the presence of an integrated plasmid. Genomic DNA from several stable His<+->strains was analyzed by Southern filter hybridization to confirm the presence and determine the location of the plasmid.

For å bedømme relative styrker av AOX1- og AOX2-promotorene ble produksjonen av IJ-galaktosidase ved pYJ55 og pSAOH5 sammenlignet ved transformasjon av disse plasmider inn i GS115. De transformerte GS115-stammer ble betegnet henholdsvis GS115 (pYJ55) og GS115(pSAOH5). Hver stamme inneholder plasmid intergrert ved HIS4-lokuset. Celler av hver stamme ble dyrket i glyserolmedium, byttet over til et medium uten karbonkilde i 24 timer og deretter byttet over til et medium med metanol i ytterligere 50 timer. Prøver av hver kultur ble fjernet ved slutten av hver vektsfase og ekstrakter ble preparet og analysert for B-galaktosidase. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2. To assess relative strengths of the AOX1 and AOX2 promoters, the production of IJ-galactosidase by pYJ55 and pSAOH5 was compared upon transformation of these plasmids into GS115. The transformed GS115 strains were designated GS115(pYJ55) and GS115(pSAOH5), respectively. Each strain contains plasmid integrated at the HIS4 locus. Cells of each strain were grown in glycerol medium, switched to a medium without a carbon source for 24 hours and then switched to a medium with methanol for another 50 hours. Samples of each culture were removed at the end of each weight phase and extracts were prepared and analyzed for β-galactosidase. The results of these analyzes are shown in table 2.

Betydelige mengder B-galaktosidase, ble ikke observert i glyseroldyrkede celler, av hverken AQXl- lacZ- eller AQX2- lacZ-stammer. I mediet uten karbonkilde, var aktivitetsnivået i AOX2- lacZ-stammen tilnærmet en tiendedel av den som ble obsevert for AOX1 - lacZ-stammen. Tilsetningen av metanol til de AOX2- lacZ-holdige celler, førte til nivåer av li-galaktosidase som nådde opp i ca. en niendedel av dem hos AOXl- lacZ-celler. Således er AOX1- og AOX2-<g>enene regulert på lignende måte. Det ene trekk som skiller er en betydelige lavere reaksjon på metanol og karbonkildehunger, av det AOX2 regulatoriske område. Significant amounts of B-galactosidase were not observed in glycerol-grown cells of either AQX1-lacZ or AQX2-lacZ strains. In the medium without a carbon source, the activity level in the AOX2 - lacZ strain was approximately one-tenth of that observed for the AOX1 - lacZ strain. The addition of methanol to the AOX2-lacZ-containing cells led to levels of β-galactosidase reaching approx. one ninth of them in AOXl-lacZ cells. Thus, the AOX1 and AOX2<g>enes are regulated in a similar way. The one distinguishing feature is a significantly lower reaction to methanol and carbon source starvation, of the AOX2 regulatory region.

Skjønt innføringen av det AOX2 regulatoriske område/B-galaktosidase gen-fusjon i en vertsgjærcelle er blitt beskrevet her, vil fagfolk innse at det ikke er nødvendig for utførelse av oppfinnelsen å benytte sirkelformede plasmider eller det li-galaktosidase strukturelle gen. Således kan andre vektorer som kan opprettholdes i gjær benyttes i anvendelsen av dette regulatoriske område sammen med andre heterologe gener. Alternativt kan dette regulatoriske område operabelt forbundet med andre heterologe gener integreres inn i kromosomet av vertsgjærcellen ved anvendelse av integrative vektorer. Dessuten kan funksjonelle mutanter av det AOX2 regulatoriske område som her er beskrevet, bestående av kortere DNA-sekvens fra 5'-enden, også anvendes til å regulere heterolog genekspresjon. Although the introduction of the AOX2 regulatory region/B-galactosidase gene fusion into a host yeast cell has been described herein, those skilled in the art will recognize that it is not necessary for the practice of the invention to use circular plasmids or the β-galactosidase structural gene. Thus, other vectors that can be maintained in yeast can be used in the application of this regulatory region together with other heterologous genes. Alternatively, this regulatory region operably linked to other heterologous genes can be integrated into the chromosome of the host yeast cell using integrative vectors. Moreover, functional mutants of the AOX2 regulatory region described here, consisting of shorter DNA sequence from the 5' end, can also be used to regulate heterologous gene expression.

Eksempler Generell informasjon som angår eksemplene. Examples General information concerning the examples.

Stammer Tribes

Medier, buffere og oppløsninger Media, buffers and solutions

1 M Tris-buffer 121,1 g Tris-base i 800 ml H2O; juster pH på den ønskede verdi ved tilsetning av konsentrert (35%) vandig HC1; tillat oppløsningen å kjølne til værelsestemperatur før endelig pH-justering, fortynn til et endelig volum på 1 1. 1 M Tris buffer 121.1 g Tris base in 800 mL H2O; adjust the pH to the desired value by adding concentrated (35%) aqueous HC1; allow the solution to cool to room temperature before final pH adjustment, dilute to a final volume of 1 L.

TE-buffer 1,0 mM EDTA TE buffer 1.0 mM EDTA

i 0,01 M (pH 7,4) Tris-buffer SSC 0,15MNaCl in 0.01 M (pH 7.4) Tris buffer SSC 0.15MNaCl

15 mM natriumcitrat justert til pH 7,0 med NaOH 15 mM sodium citrate adjusted to pH 7.0 with NaOH

TAE 40 mM eddiksyre TAE 40 mM acetic acid

5 mM EDTA 5 mM EDTA

i 0,02 M (pH 8,3) Tris-buffer Denhardfs oppløsning 5 g Ficoll in 0.02 M (pH 8.3) Tris buffer Denhardf's solution 5 g Ficoll

(50x) 5 g polyvinylpyrrolidon (50x) 5 g polyvinylpyrrolidone

5 g bovinserumalbumin (BSA; Pentax Fraction V) brakt på et samlet volum på 500 ml med vann 20X SSPE 20 mM EDTA 5 g bovine serum albumin (BSA; Pentax Fraction V) brought to a total volume of 500 ml with water 20X SSPE 20 mM EDTA

0,16 M NaOH 0.16 M NaOH

0,2 M NaH2P04 H20 3,6MNaCl justert til pH 7,0 med NaOH 0.2 M NaH2PO4 H20 3.6MNaCl adjusted to pH 7.0 with NaOH

LB (Luria-Bertani) 5 g Bacto-trypton LB (Luria-Bertani) 5 g Bacto-tryptone

-medium 5 g Bacto-gjærekstrakt -medium 5 g Bacto yeast extract

2,5 g NaCl i 1 1 vann, justert til pH 7,5 med NaOH 2.5 g NaCl in 1 1 water, adjusted to pH 7.5 with NaOH

YPD-medium 1% Bacto-gjærekstrakt 2% Bacto-pepton 2% Dekstrose YNB-medium 6,75 g gjaer-nitrogenbase uten aminosyrer YPD medium 1% Bacto yeast extract 2% Bacto peptone 2% Dextrose YNB medium 6.75 g yeast nitrogen base without amino acids

(DIFCO) i 1 1 vann (DIFCO) in 1 1 water

SED IM sorbitol SED IM sorbitol

25 mM EDTA 25 mM EDTA

50 mM DTT 50 mM DTT

SCE-buffer 9,1 g sorbitol SCE buffer 9.1 g sorbitol

1,47 g natriumcitrat 0,168 g EDTA 1.47 g sodium citrate 0.168 g EDTA

50 ml H20 50 ml of H20

-pH til 5,8 med HC1 -pH to 5.8 with HCl

CaS 1 M sorbitol lOmMCaCb CaS 1 M sorbitol lOmMCaCb

—filtersteriliser PEG-oppløsning 20% polyetylenglykol-3350 10 mM CaCl2 10 mMTris HCI (pH 7,4) —filter sterilize PEG solution 20% polyethylene glycol-3350 10 mM CaCl2 10 mM Tris HCI (pH 7.4)

--filtersteriliser --filter sterilize

SOS 1 M sorbitol SOS 1 M sorbitol

0,3x YPD-medium 10 mM CaCl2 0.3x YPD medium 10 mM CaCl2

Formamide fargeblanding 0,1% xylencylenol FF Formamide color mixture 0.1% xylencylenol FF

0,2% bromfenolblått 10 mM EDTA 0.2% bromophenol blue 10 mM EDTA

95% avionisert formamid Toppgel 76,8 g urea 24 ml akrylamide-utgangsmateriale 95% deionized formamide Top gel 76.8 g urea 24 ml acrylamide starting material

8 ml 10x TBE 8 ml 10x TBE

bring på et endelig volum på 160 ml bring to a final volume of 160 ml

Akrylamidutgangs- 38 g akrylamid Acrylamide output - 38 g of acrylamide

materiale 2 g bis(N,N-metylenbisakrylamid) material 2 g bis(N,N-methylenebisacrylamide)

tilsett vann til et endelig volum på 100 ml add water to a final volume of 100 ml

Bunngel 14,4 g urea Bottom gel 14.4 g urea

3,0 g sakkarose 3.0 g of sucrose

7,5 ml 10x TBE 7.5 ml 10x TBE

4,5 ml akrylamidutgangsmateriale 0,3 ml bromfenolblått-oppløsning 4.5 ml acrylamide starting material 0.3 ml bromophenol blue solution

(0,01 g/ml) (0.01 g/ml)

tilsett vann til å gi et endelig volum på 30 ml Dideoksy: add water to give a final volume of 30 ml Dideoxy:

dd ATP 0,125 med mer dd ATP 0.125 and more

ddCTP 0,10 med mer ddCTP 0.10 and more

ddGTP 0,10 med mer ddGTP 0.10 and more

dd TTP 0,80 mM dd TTP 0.80 mM

DNTP-utgangsmaterialer 0,5 mM dGTP DNTP starting materials 0.5 mM dGTP

0,5 mM dCTP 0.5 mM dCTP

0,5 mM TTP 0.5 mM TTP

0,5 mM dATP 0.5 mM dATP

10X Klenow fort<y>nnin<g>s- 70mM TrisHCl, pH 7,5 10X Klenow fort<y>nnin<g>s- 70mM TrisHCl, pH 7.5

buffer 200mM NaCl buffer 200mM NaCl

70mM MgCl270 mM MgCl 2

ImM EDTA 1 mM EDTA

10X TMD. pH 7. 5 0,1M Tris HC1, pH 7,5 10X TMD. pH 7. 5 0.1 M Tris HCl, pH 7.5

0,05M MgCl20.05M MgCl2

0,075M DTT 0.075M DTT

Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor angitte oppløsninger den grunnleggende konsentrasjon (lx) som ble anvendt. Gjennom alle eksemplene der hvor forskjellige konsentrasjoner anvendes er dette faktum angitt ved at oppløsningene er betegnet som et multippel av den grunnleggende (lx) konsentrasjon. Unless otherwise stated, the solutions given above represent the basic concentration (lx) used. Throughout all the examples where different concentrations are used, this fact is indicated by the solutions being designated as a multiple of the basic (lx) concentration.

Re<g>enererin<g>sagar Re<g>enerin<g>sagar

1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g kaliumklorid, 240 ml H20, autoklavering. 1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13.4 g potassium chloride, 240 ml H20, autoclaving.

2) 10x glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklavering. 2) 10x glucose: 20 g dextrose, 100 ml H20, autoclaving.

3) lOx YNB: 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H2O, autoklavering. (Tilsett eventuell aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 ug/ml før eller etter autoklavering). 4) Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YNB til 240 ml av den smeltede Agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin, og eventuelt en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon av 20 pg/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C. 3) lOx YNB: 6.75 g yeast nitrogen base without amino acids, 100 ml H2O, autoclaving. (Add any amino acid or nucleic acid up to a concentration of 200 ug/ml before or after autoclaving). 4) Add 30 ml of 10x glucose and 30 ml of 10x YNB to 240 ml of the molten Agar/KCl solution. Add 0.6 ml of 0.2 mg/ml biotin, and optionally any other desired amino acid or nucleic acid to a concentration of 20 pg/ml. Keep molten regeneration agar at 55-60°C.

Dyrking av Pichia pastoris Cultivation of Pichia pastoris

P. pastoris ble dyrket i YPD (rikt) eller YNB (minimalt) medium. Etter behov ble YNB-medium supplert med karbonkilde (2% dekstrose, 1% glycerol, eller 0,5% metanol) og med 50 ug/ml aminosyre. P. pastoris was grown in YPD (rich) or YNB (minimal) medium. As needed, YNB medium was supplemented with carbon source (2% dextrose, 1% glycerol, or 0.5% methanol) and with 50 µg/ml amino acid.

Sekvensering Sequencing

DNA-sekvensering var ved dideoksynuklotid-kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977). DNA sequencing was by the dideoxynucleotide chain termination method according to Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977).

De følgende forkortelser er benyttet i eksemplene: The following abbreviations are used in the examples:

EDTA etylendiamintetraeddiksyre EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

TEMED N,N,N',N'-tetrametylendiamin TEMED N,N,N',N'-tetramethylenediamine

DTT ditiotreitol DTT dithiothreitol

BSA bovineserumalbumin BSA bovine serum albumin

EtBr etidiumbromid EtBr ethidium bromide

Ci Curie Ci Curie

dATP deoksyadenosintrifosfat dATP deoxyadenosine triphosphate

dGTP deoksyguanosintrifosfat dGTP deoxyguanosine triphosphate

TTP thymidintrifosfat TTP thymidine triphosphate

dCTP deoksycytidintrifosfat dCTP deoxycytidine triphosphate

dXTP "generisk" deoksytrifosfatnukleotid dXTP "generic" deoxytriphosphate nucleotide

oligo(dT)i2is kilde: Collaborative Research, Inc. oligo(dT)i2is Source: Collaborative Research, Inc.

Zymolyase 60.000 kilde: Miles Laboratories Zymolyase 60,000 Source: Miles Laboratories

Isolering av alkoholoksidase II regulatorisk område Isolation of the alcohol oxidase II regulatory region

Eksempel I Example I

Paring av PPF1 X KM7121 og utvikling av MC100- 3 Mating of PPF1 X KM7121 and development of MC100-3

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) og KM7121 ( arg4 his4 aoxl=j=: : SARG4 aox24/: :PHIS4) (NRRL Y-l 8019) ble hver kodet fra en ny YPD-plate inn i et rør med sterilt vann. Ca. 5 x 10<7>celler av hver stamme ble blandet, behandlet med lyd (sonicated) i en kort periode for å bryte opp celleklumper, og spredt på en GNAP-agarplate (5% dekstrose, 2% pepton, 1% gjæreksrakt, 0,5% agar, 2,3% næringsagar). En ublandet sammenligningsprøve av hver stamme (ca. 1x10 celler) ble behandlet på samme måte. GNAP-platene ble inkubert ved 30°C i ca. 24 timer, og deretter replikaplatet på spordannelsemedium-agarplater (0,5% Na-acetat, 1% KC1, 2% agar). Disse plater ble inkubert i ca. 20 timer ved 30°C, og deretter replikaplatet på minimalmedium-agarplater uten noen karbonkilde. Metanol ble matet til cellene på minimalplatene i dampfasen. Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) and KM7121 ( arg4 his4 aoxl=j=: : SARG4 aox24/: :PHIS4) (NRRL Y-l 8019) were each plated from a new YPD plate into a tube of sterile water. About. 5 x 10<7> cells of each strain were mixed, sonicated for a short period to break up cell clumps, and spread on a GNAP agar plate (5% dextrose, 2% peptone, 1% yeast extract, 0 .5% agar, 2.3% nutrient agar). An unmixed control sample of each strain (approximately 1x10 cells) was treated in the same manner. The GNAP plates were incubated at 30°C for approx. 24 hours, and then replica plated onto sporulation medium agar plates (0.5% Na acetate, 1% KCl, 2% agar). These plates were incubated for approx. 20 hours at 30°C, and then replica plated on minimal medium agar plates without any carbon source. Methanol was fed to the cells on the minimal plates in the vapor phase.

Etter 5 dager kom ca. 200 kolonier til syne på minimalplaten, som mottok de blandede celler. Ingen kolonier ble noen gang utviklet på de ublandede sammenligningsplater, et resultat som antyder at Arg<+>His<+>Mut<+->koloniene på den blandede plate var diploide, som et resultat av paringer mellom PPF1- og KM7121-celler (Mut<+>= metanol utnyttelse). Den diploide karakter av disse Arg<+>His<+>Mut<+->stammer ble bekreftet ved undersøkelse av AOX-loci hos fire av disse stammer ved Southern filter-hybridisering. Spesifikke prober som ble benyttet var: pPG3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4 spesifikk probe og pPG4.0 (NRRL B-15868), en AQX1 spesifikk probe. After 5 days approx. 200 colonies visible on the minimal plate, which received the mixed cells. No colonies ever developed on the unmixed comparison plates, a result suggesting that the Arg<+>His<+>Mut<+->colonies on the mixed plate were diploid, as a result of matings between PPF1 and KM7121 cells ( Mut<+>= methanol utilization). The diploid nature of these Arg<+>His<+>Mut<+->strains was confirmed by examination of AOX loci in four of these strains by Southern filter hybridization. Specific probes used were: pPG3.0 (NRRL B-18022), an AOX2 specific probe; pYJ30 (NRRL B-15890), a HIS4 specific probe and pPG4.0 (NRRL B-15868), an AQX1 specific probe.

For å sporulere PPF1 x KM7121 diploidene, ble en koloni (MC 100) først utvunnet fra metanolmediets diploide seleksjonsplate. Ca. 1 x IO<6>av disse celler ble spredt på GNAP-plater, og behandlet som beskrevet for paringsfremgangsmåten, bortsett fra at spordannelseplaten ble inkubert i fire dager ved 30°C for å tillate cellene og fullføre sporedannelsen. Sporer ble utvunnet fra platene ved rensing av hver plate med 5 ml sterilt vann. Suspensjonen ble vasket 2 ganger med 3 ml fosfatbuffer (0,1M Na304, pH 7,5). En blanding av de gjær-lytiske ensymer Glusulase (Endo Laboratories, NY) og Zymolyase (60.000 enheter/g; Miles Laboratories) og 13- . merkaptoetanol, ble satt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis på 2% (v/v), 0,5 mg/ml og 0,1% for å ødelegge vegetative celler. Blandingen ble inkubert i 5 timer ved 30°C. To sporulate the PPF1 x KM7121 diploids, a colony (MC 100) was first recovered from the methanol medium diploid selection plate. About. 1 x 10<6> of these cells were spread on GNAP plates and treated as described for the mating procedure, except that the sporulation plate was incubated for four days at 30°C to allow the cells to complete sporulation. Spores were recovered from the plates by rinsing each plate with 5 ml of sterile water. The suspension was washed 2 times with 3 ml of phosphate buffer (0.1 M Na 3O 4 , pH 7.5). A mixture of the yeast lytic enzymes Glusulase (Endo Laboratories, NY) and Zymolyase (60,000 units/g; Miles Laboratories) and 13- . mercaptoethanol, were added to final concentrations of 2% (v/v), 0.5 mg/ml and 0.1%, respectively, to destroy vegetative cells. The mixture was incubated for 5 hours at 30°C.

Sporepreparatet ble deretter vasket 2 ganger i sterilt vann inneholdene 0,2% Tween 80 (v/v) og resuspendert i fosfatbuffer. Preparatet ble deretter behandlet med tre 20-sekunders sykluser av lydbehandling, for å bryte opp klumper av sporer. En prøve av sporpreparatet ble deretter fortynnet og spredt på ikke-selektive masterplater av minimalt medium, med 2% glukose og 50 ug/ml hver av arginin og histidin. Disse ble inkubert i 48 timer ved 30°C. Hver masterplate ble deretter replikaplatet på den følgendes serie av minimale plater: 1) glukose, -arg, -his 2) glukose, -arg, +his 3) glukose, +arg, -his og 4) glukose, +arg, +his. The spore preparation was then washed twice in sterile water containing 0.2% Tween 80 (v/v) and resuspended in phosphate buffer. The preparation was then treated with three 20-second cycles of sonication to break up clumps of spores. A sample of the tracer preparation was then diluted and spread on non-selective master plates of minimal medium, with 2% glucose and 50 µg/ml each of arginine and histidine. These were incubated for 48 hours at 30°C. Each master plate was then replicate plated onto the following series of minimal plates: 1) glucose, -arg, -his 2) glucose, -arg, +his 3) glucose, +arg, -his and 4) glucose, +arg, +his .

Etter inkubering i 24 timer ved 30°C, ble koloniene undersøkt for Arg- og His-fenotyper. Kolonier som var Arg<+>His-, ble deretter testet for vekst på metanol ved utstrykning på YNB-metanolagarplater. Etter ca. 1 uke ved værelsestemperatur ble platene undersøkt for Mut-fenotype. En Arg<+>His- Mut—stamme ble betegnet MC100-3. After incubation for 24 hours at 30°C, the colonies were examined for Arg and His phenotypes. Colonies that were Arg<+>His- were then tested for growth on methanol by streaking onto YNB methanol agar plates. After approx. After 1 week at room temperature, the plates were examined for Mut phenotype. An Arg<+>His-Mut strain was designated MC100-3.

Eksempel II Example II

Transformasjon av Pichia pastoris Transformation of Pichia pastoris

Gjærceller ble podet inn i ca. 10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C, i 12-20 timer. Cellene ble deretter fortynnet til en A600på 0,01 - 0,1, og opprettholdt i logaritmisk fase i YPD-medium ved 30°C i 6 - 8 timer. 100 ml YPD-medium ble podet med 0,5 ml av podekulturen ved en Acoopå ca. 0,1, og ristedyrket ved 30°C i 12-20 timer. Kulturen ble deretter høstet når A600var 0,2 - 0,3 (etter tilnærmet 16 - 20 timer) ved sentrifugering ved anvendelse av en DAMON IEC DPR-6000 sentrifuge ved 1500 g i 5 minutter. Yeast cells were inoculated into approx. 10 ml of YPD medium and cultured on a shaker at 30°C, for 12-20 hours. The cells were then diluted to an A600 of 0.01 - 0.1, and maintained in logarithmic phase in YPD medium at 30°C for 6 - 8 hours. 100 ml of YPD medium was inoculated with 0.5 ml of the inoculation culture at an Acoop at approx. 0.1, and shake cultured at 30°C for 12-20 hours. The culture was then harvested when A600 was 0.2 - 0.3 (after approximately 16 - 20 hours) by centrifugation using a DAMON IEC DPR-6000 centrifuge at 1500 g for 5 minutes.

For å fremstille sfæroplaster, ble cellene vasket en gang i 10 ml sterilt vann To prepare spheroplasts, the cells were washed once in 10 ml of sterile water

(sentrufugering ble utført etter vasking som det beskrevet ovenfor), en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol, og resuspendert i 5 ml SCE-buffer. 5 yl av 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories), ble tilsatt og cellen inkubert ved 30°C i ca. 30 minutter. (centrifugation was performed after washing as described above), once in 10 ml of freshly prepared SED, once in 10 ml of sterile IM sorbitol, and resuspended in 5 ml of SCE buffer. 5 µl of 4 mg/ml Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories) was added and the cell incubated at 30°C for approx. 30 minutes.

Sfæroplastdannelse ble overvåket som følger. 100 ul porsjoner av celler, ble satt til 900 yl av 5% SDS og 900 yl av IM sorbitol før eller like etter tilsetningen av Zymolayse, og på forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonsperioden. Inkubasjonen ble stoppet ved det punkt hvor cellene lyserte i SDS, men ikke sorbitol. Straks de var dannet, ble sfæroplaster vasket en gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrufugering ved 1.000 g i 5-10 minutter, og vasket en gang i 10 ml sterilt CaS ved sentrufugering, og resuspendert i 0,6 ml CaS. Spheroplast formation was monitored as follows. 100 µl aliquots of cells were added to 900 µl of 5% SDS and 900 µl of IM sorbitol before or just after the addition of Zymolyse, and at various times during the incubation period. The incubation was stopped at the point where the cells lysed in SDS but not sorbitol. Once formed, spheroplasts were washed once in 10 ml sterile IM sorbitol by centrifugation at 1,000 g for 5-10 min, and washed once in 10 ml sterile CaS by centrifugation, and resuspended in 0.6 ml CaS.

For den egentlige transformasjon, ble DNA-prøver i vann eller TE-buffer tilsatt (inntil 20 yl samlet volum), til 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (For små mengder DNA, finner maksimal transformasjon sted ved anvendelse av ca. 1 yl 5 mg/ml lydbehandlet E. coli-DNA i hver prøve). 100 yl sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 20 minutter. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve, og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 1.000 g i 5-10 minutter, og supernantanten ble kassert. Pelletene ble resuspendert i 150 yl SOS og inkubert ved værelsestemperatur i 30 minutter. 850 yl steril IM sorbitol, ble satt til hver, og prøvene ble platet som beskrevet nedenfor. For the actual transformation, DNA samples in water or TE buffer were added (up to 20 µl total volume), to 12 x 75 mm sterile polypropylene tubes. (For small amounts of DNA, maximal transformation occurs using approximately 1 µl of 5 mg/ml sonicated E. coli DNA in each sample). 100 µl spheroplasts were added to each DNA sample and incubated at room temperature for approx. 20 minutes. 1 ml of PEG solution was added to each sample, and incubated at room temperature for approx. 15 minutes. The samples were centrifuged at 1,000 g for 5-10 minutes, and the supernatant was discarded. The pellets were resuspended in 150 µl SOS and incubated at room temperature for 30 minutes. 850 µl of sterile IM sorbitol was added to each, and the samples were plated as described below.

10 ml regeneringsagar ble helt på hver plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene var ferdige. Porsjoner på 10 ml regeneringsagar ble også fordelt på rørene i et bad på 45-50°C, i løpet av den periode som transformasjonsprøvene var i SOS. Prøver ble deretter satt til rørene, helt på plater inneholdene det faste bunnagarlag, og inkubert ved 30°C i 3-5 dager. 10 ml of regeneration agar was poured onto each plate at least 30 min before the transformation samples were finished. Portions of 10 ml regeneration agar were also distributed to the tubes in a bath at 45-50°C, during the period that the transformation samples were in SOS. Samples were then added to the tubes, poured onto plates containing the solid bottom agar layer, and incubated at 30°C for 3-5 days.

Sfæroplastkvalitet på forskjellige punkter ble bestemt som følger. 10 pl prøve ble fjernet og fortynnet 100 x ved tilsetning til 990 yl IM sorbitol. 10 yl av fortynningen ble fjernet, og en ytterligere 990 yl porsjon av IM sorbitol ble tilsatt. 100 yl av begge fortynninger ble utstrykningsplatet på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæreoplastdannende hele celler som var tilbake i preparatet. 100 yl av hver fortynning ble satt til 10 ml regeneringsagar som var blitt supplert med 40 yg/ml av alle de aminosyrer som var nødvendige for verten for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for transformasjonseksperimentet var 1 - 3 x 10<7>, samlede regenererbare sfæroplaster pr. ml og ca. 1 x IO<3>hele celler pr. ml. Spheroplast quality at different points was determined as follows. 10 µl sample was removed and diluted 100x by addition to 990 µl IM sorbitol. 10 µl of the dilution was removed and an additional 990 µl portion of 1M sorbitol was added. 100 µl of both dilutions were streak plated on YPD agar medium to determine the concentration of non-spheroplast forming whole cells remaining in the preparation. 100 µl of each dilution was added to 10 ml regeneration agar which had been supplemented with 40 µg/ml of all the amino acids necessary for the host to determine the total regenerable spheroplasts. Good values for the transformation experiment were 1 - 3 x 10<7>, total regenerable spheroplasts per ml and approx. 1 x IO<3> whole cells per ml.

Eksempel III Example III

Konstruksjon av MC 100- 3 ( pYM5) Construction of MC 100-3 (pYM5)

Ca. 10 yg pBR322 ble digerert med BamHI og defosforylert. Ca. 50 yg pYJ8 (NRRL B-15889), som inneholder Pichia HJS4-genet, ble digerert med Bglll. Et 2,7 kb Bglll-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 300 ng av fragmentet og 300 ng av BamHI-digerert pBR322, ble ligatisert ved anvendelse av 0,5 enheter T4 DNA-ligase i 10 yl samlet volum, av 66 mM Tris HCl, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,4 mM ATP, i 24 timer ved 4°C. About. 10 µg of pBR322 was digested with BamHI and dephosphorylated. About. 50 µg of pYJ8 (NRRL B-15889), which contains the Pichia HJS4 gene, was digested with Bglll. A 2.7 kb BglII fragment was isolated from a 0.8% preparative agarose gel. 300 ng of the fragment and 300 ng of BamHI-digested pBR322 were ligated using 0.5 units of T4 DNA ligase in 10 µl total volume of 66 mM Tris HCl, pH 7.4, 6.6 mM MgCl2, 10 mM DTT and 0.4 mM ATP, for 24 h at 4°C.

Ligasjonsreaksjonen ble anvendt til å transformere E. coli MC 1061 ti ampicillinresistens som beskrevet i eksempel V. Tranformanter blekarakterisert vedrestriksjonsdigereringer, og den riktige størrelse og orientering av det innskutte stykke ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Dette plasmid ble kalt pYM5, og ble utvunnet fra E. coli ved anvendelse av den alkaliske lyse-plasmidpreparerings-teknikk beskrevet hos Maniatis et al (1982). (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambroox, J. (1982). Molecular Clonine: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.) The ligation reaction was used to transform E. coli MC 1061 into ampicillin resistance as described in Example V. Transformants were characterized by restriction digests, and the correct size and orientation of the insert was confirmed by agarose gel electrophoresis. This plasmid was named pYM5, and was recovered from E. coli using the alkaline lysis plasmid preparation technique described by Maniatis et al (1982). (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambroox, J. (1982). Molecular Clonine: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)

Ca. 10 yg pYM5 ble digerert med Stul før transformasjon av MC 100-3. Dette trinn beordret plasmidet til å integrere ved en av de HIS4-gensekvenser som forelå i MC 100-3, enten det native HIS4-lokus eller det modifiserte AOX2-lokus. Transformasjon ble utført i henhold til fremgangsmåter vist i eksempel II. About. 10 µg of pYM5 was digested with Stul prior to transformation of MC 100-3. This step directed the plasmid to integrate at one of the HIS4 gene sequences present in MC 100-3, either the native HIS4 locus or the modified AOX2 locus. Transformation was performed according to procedures shown in Example II.

DNA fra en rekke MC100-3(pYM5) His<+->transformanter ble isolert i henhold til eksempel IV og sortert ved Southern filter-hybridisering, for transformanter som inneholdt pYM5 integrert ved HIS4-fragmentet anordnet ved AOX2. Spesifikke prober som ble anvendt var: pPG 3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4 spesifikk probe. DNA from a series of MC100-3(pYM5) His<+-> transformants was isolated according to Example IV and sorted by Southern filter hybridization, for transformants containing pYM5 integrated at the HIS4 fragment located at AOX2. Specific probes used were: pPG 3.0 (NRRL B-18022), an AOX2 specific probe; pYJ30 (NRRL B-15890), a HIS4 specific probe.

Egenskaper av det alkoholoksidase II regulatoriske område Properties of the alcohol oxidase II regulatory region

Eksempel IV Example IV

Giær- DNA- fremstilling Yeast DNA production

Gjærceller ble dyrket i 100 ml YNB-medium + 2% dekstrose ved 30°C, inntil A^o var lik 1 - 2 og deretter pelletert ved anvendelse av en Damon IEC DPR-6000, sentrifuge ved 2000 g i 5 minutter. Pelletten ble vasket en gang i dH20, en gang i SED, en gang i IM sorbitol og deretter resuspendert i 5 ml av en oppløsning av 0,1M TrisHCl, pH 7,0 og IM sorbitol. Cellene ble deretter blandet med 50 - 100 ul av en 4 mg/ml oppløsning av Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) og inkubert ved 30°C i 1 time. De resulterende sfæroplaster ble deretter sentrifugert ved 1 000 g i 5 - 10 minutter og suspendert i 5 ml lysebuffer [0,1% SDS, lOmM Tris HCl (pH 7,4), 5mM EDTA og SOmMNaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 pg/ml og oppløsningen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble avproteinisert ved forsiktig omrøring av preparatet med et like stort volum kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v), og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12 000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble overført til et nytt rør, og ekstrahert med et like stort volum fenol/kloroform/ isoamylalkohol. Fasene ble separert som tidligere, og toppfasen anbragt i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig omrørt og DNA ble oppsamlet ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer, og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer. Yeast cells were grown in 100 ml YNB medium + 2% dextrose at 30°C, until A 20 equaled 1 - 2 and then pelleted using a Damon IEC DPR-6000, centrifuge at 2000 g for 5 minutes. The pellet was washed once in dH 2 O, once in SED, once in 1M sorbitol and then resuspended in 5 ml of a solution of 0.1M TrisHCl, pH 7.0 and 1M sorbitol. The cells were then mixed with 50-100 µl of a 4 mg/ml solution of Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories) and incubated at 30°C for 1 hour. The resulting spheroplasts were then centrifuged at 1000 g for 5-10 minutes and suspended in 5 ml of lysis buffer [0.1% SDS, 10 mM Tris HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA and SOmMNaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) and RNase A (Sigma) were each added to 100 pg/ml and the solution incubated at 37°C for 30 minutes. DNA was deproteinized by gently stirring the preparation with an equal volume of chloroform containing isoamyl alcohol (24:1, v/v), and the phases were separated by centrifugation at 12,000 g for 20 minutes. The upper (aqueous) phase was transferred to a new tube, and extracted with an equal volume of phenol/chloroform/isoamyl alcohol. The phases were separated as before, and the top phase placed in a tube containing 2-3 volumes of cold 100% ethanol. The sample was gently stirred and the DNA was collected by winding on a plastic rod. DNA was immediately dissolved in 1 ml of TE buffer, and dialyzed overnight at 4°C against 100 volumes of TE buffer.

Eksempel V Example V

Konstruksjon av pMR4 Construction of pMR4

DNA ble isolert i henhold til fremgangsmåten i eksempel IV fra en MCI 00-3(pYM5) His<+->transformant generert som angitt i eksempel III. 10 yg av dette genomiske DNA ble digerert med Hindlll og ligatisert. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 4°C i 24 timer i 66 mM Tris HC1, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP, og 0,5 enheter T4 DNA-ligase. DNA was isolated according to the procedure of Example IV from an MCI 00-3(pYM5) His<+> transformant generated as indicated in Example III. 10 µg of this genomic DNA was digested with HindIII and ligated. The ligation reaction was performed at 4°C for 24 hours in 66 mM Tris HCl, pH 7.4, 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.4 mM ATP, and 0.5 units of T4 DNA ligase.

Ligasjonsblandingen ble transformert direkte inn i E. coli MC 1061-celler, som var blitt gjort kompetente for transformasjon og transformert som beskrevet av Maniatis et al. (1982). Seleksjon for ampicillinresistens ble utført ved dyrking av cellene i enten LB-medium eller 2B-medium (0,2% NH4P04, 1,2% Na2HP04, 0,013% MgS04 7H20, 0,074% CaCl2'2H20, 1 ug/ml tiamin, 0,4% dekstrose) supplert med 50 yg/ml ampicillin. The ligation mixture was transformed directly into E. coli MC 1061 cells, which had been rendered competent for transformation and transformed as described by Maniatis et al. (1982). Selection for ampicillin resistance was performed by growing the cells in either LB medium or 2B medium (0.2% NH4PO4, 1.2% Na2HP04, 0.013% MgSO4 7H2O, 0.074% CaCl2'2H2O, 1 ug/ml thiamine, 0, 4% dextrose) supplemented with 50 µg/ml ampicillin.

Et 12,0 kb plasmid betegnet pMR4 ble utvunnet i henhold til Maniatis et al. (1982). Dette plasmid inneholdt 5,3 kb DNA 5', i forhold til AOX2 Kpnl-setet. 2,7 kb av Pichia HIS4-genet, og 4,0 kb av pBR322. A 12.0 kb plasmid designated pMR4 was recovered according to Maniatis et al. (1982). This plasmid contained 5.3 kb of DNA 5' to the AOX2 KpnI site. 2.7 kb of the Pichia HIS4 gene, and 4.0 kb of pBR322.

Eksempel VI Example VI

Konstruksjon av pYJ55 Construction of pYJ55

For å bestemme reguleringen og ekspresjonen av AOX2-promotoren. ble en vektor inneholdende AOX2 5-sekvensen føyet til E. coli lacZ-<g>enet konstruert. 50 yg av pMR4 (Eksempel V) ble digerert med Bglll og BamHI i henhold til produsentens retningslinjer. Et Bglll - BamHI-fragment på en 1,8 kb inneholdende AOX2-promotoren, ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 10 ug pBPfl (NRRL B-15892) ble digerert med BamHI og defosforylert ved anvendelse av alkalisk fosfatase i et reaksjonsvolum på 50 ul (1 U enzym ved 37°C i 1 time i 50mM Tris HCl, pH 9,0, ImM MgCl2, 100 yMZnCl2, ImM spermidin). To determine the regulation and expression of the AOX2 promoter. a vector containing the AOX2 5 sequence added to the E. coli lacZ gene was constructed. 50 µg of pMR4 (Example V) was digested with BglII and BamHI according to the manufacturer's guidelines. A 1.8 kb BglII - BamHI fragment containing the AOX2 promoter was isolated from a 0.8% preparative agarose gel. 10 µg of pBPfl (NRRL B-15892) was digested with BamHI and dephosphorylated using alkaline phosphatase in a reaction volume of 50 µl (1 U enzyme at 37°C for 1 h in 50 mM Tris HCl, pH 9.0, 1 mM MgCl2, 100 yMZnCl2, ImM spermidine).

300 ng av 1,8 kb-fragmentet og 300 ng av pBPfl ble ligatisert med T4-ligase som følger. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 23°C i 1 time i et 10 ul reaksjonsvolum inneholdende 66mM_ TrisHCl, pH 7,6, 5mM_ MgCl2, 5mM_ ditiotreitol, ImM ATP og 1 Weiss-enhet T4-ligase. Den resulterende vektor ble betegnet pYJ38. 300 ng of the 1.8 kb fragment and 300 ng of pBPfl were ligated with T4 ligase as follows. The ligation reaction was performed at 23°C for 1 hour in a 10 µl reaction volume containing 66 mM TrisHCl, pH 7.6, 5 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol, 1 mM ATP and 1 Weiss unit T4 ligase. The resulting vector was designated pYJ38.

Et nytt Smal-restriksjonssete ble dannet i pYJ38 som følger. Et adaptoroligonukleotid ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems DNA Synthesizer, Model 380 A, ved anvendelse av cyanoetylfosforamiditt-kjemi: 10 ug pYJ38 ble digerert med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase som angitt ovenfor. 1 ug av den ovenfor angitte adaptor og 0,1 ug av BamHI-di<g>erert pYJ38 ble ligatisert ved anvendelse av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Den modifiserte vektor ble betegnet pYJ45. Et 1,8 kb Smal-fragment inneholdende den modifiserte AOX2-promotor ble oppnådd ved digerering av 50 ug pYJ45 med Smal. Fragmentet ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 0,3 ug av fragmentet og 0,3 ug av Smal-digerert pBPfl, ble ligatisert som angitt ovenfor for å danne vektoren pYJ46. Et 0,3 kb EcoRI-fragment ble slettet fra 5'-enden av AQX2-segmentet i pYJ46 som følger. 10 ug pYJ46 ble digerert med EcoRI og behandlet med alkalisk fosfatase som beskrevet ovenfor. En separat 50 yg porsjon av pYJ46 ble også digerert med EcoRI og et 1,5 kb-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Ca. 0,3 yg hver av fosfatasert pYJ46 og det isolerte fragment ble ligatisert og transformert inn i E. coli som beskrevet ovenfor. Et plasmid som hadde den riktige struktur ble isolert og betegnet pYJ55. A new Smal restriction site was generated in pYJ38 as follows. An adapter oligonucleotide was synthesized using an Applied Biosystems DNA Synthesizer, Model 380 A, using cyanoethyl phosphoramidite chemistry: 10 µg of pYJ38 was digested with BamHI and treated with alkaline phosphatase as indicated above. 1 µg of the above adapter and 0.1 µg of BamHI-dilated pYJ38 were ligated using T4 ligase as described above. The modified vector was designated pYJ45. A 1.8 kb SmaI fragment containing the modified AOX2 promoter was obtained by digesting 50 µg of pYJ45 with SmaI. The fragment was isolated from a 0.8% preparative agarose gel. 0.3 µg of the fragment and 0.3 µg of SmaI-digested pBPf1 were ligated as above to form the vector pYJ46. A 0.3 kb EcoRI fragment was deleted from the 5' end of the AQX2 segment in pYJ46 as follows. 10 µg of pYJ46 was digested with EcoRI and treated with alkaline phosphatase as described above. A separate 50 µg portion of pYJ46 was also digested with EcoRI and a 1.5 kb fragment was isolated from a 0.8% preparative agarose gel. About. 0.3 µg each of phosphatized pYJ46 and the isolated fragment were ligated and transformed into E. coli as described above. A plasmid having the correct structure was isolated and designated pYJ55.

Eksempel VII Example VII

Utvikling av stamme GS115 fYJ55) Development of strain GS115 fYJ55)

Pichia pastoris GS115, en histidin-auxotrof (NRRL Y-15851; his4) ble tranformertmed plasmid pYJ55 (Eksempel VI) som beskrevet i eksempel II. Genomisk DNA fra stabile His<+->stammer, ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bestemme plasseringen av plasmidet. En transformant inneholdende pYJ55 integrert ved HIS4-lokuset. ble betegnet GS115 (pYJ55). Pichia pastoris GS115, a histidine auxotroph (NRRL Y-15851; his4) was transformed with plasmid pYJ55 (Example VI) as described in Example II. Genomic DNA from stable His<+->strains was analyzed by Southern filter hybridization to determine the location of the plasmid. A transformant containing pYJ55 integrated at the HIS4 locus. was designated GS115 (pYJ55).

Eksempel VIII Example VIII

Sammenligning mellom AOX1- og AOX2- promotorene Comparison between the AOX1 and AOX2 promoters

Regulering og ekspresjon av AOX1- og AQX2- promotorene, er blitt sammenlignet ved bestemmelse av B-galaktosidaseaktiviten av stammer GS115(pSAOH5) og GS115(pYJ55). 100 ml kulturer av hver stamme ble dyrket i YNB pluss 1% glycerolmedium i 24 timer ved 30°C, byttet om til YNB-medium uten en karbonkilde i 24 timer ved 30°C, deretter byttet om til YNB-medium med 0,5% metanol i 50 timer ved 30°C. Prøver av hver kultur ble fjernet på de følgende tidspunkter: Regulation and expression of the AOX1 and AQX2 promoters have been compared by determining the β-galactosidase activity of strains GS115(pSAOH5) and GS115(pYJ55). 100 ml cultures of each strain were grown in YNB plus 1% glycerol medium for 24 h at 30°C, switched to YNB medium without a carbon source for 24 h at 30°C, then switched to YNB medium with 0.5 % methanol for 50 hours at 30°C. Samples of each culture were removed at the following times:

1) etter 24 timer i glycerolmedium 1) after 24 hours in glycerol medium

2) etter 24 timer i ikke noe karbonmedium 2) after 24 hours in no carbon medium

3) etter 24 og 50 timer i metanolmedium. 3) after 24 and 50 hours in methanol medium.

Ekstrakter ble fremstilt og analysert for B-galaktosidaseaktivitet som beskrevet nedenfor. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2. Extracts were prepared and assayed for β-galactosidase activity as described below. The results of these analyzes are shown in table 2.

fi- galaktosidaseanalvse fi- galactosidase analvse

1) Nødvendig oppløsning: 1) Required resolution:

fyll opp til 1 1; pH bør være 7 fill up to 1 1; pH should be 7

O- Nitrofenvl- B- D- galaktosid ( ONPG): O-Nitrophenyl-B-D-galactoside (ONPG):

Oppløs 400 mg ONPG (Sigma N-l 127) i 100 ml destillert vann for å danne en 4 mg/ml ONPG-oppløsning. Dissolve 400 mg ONPG (Sigma N-1 127) in 100 ml distilled water to form a 4 mg/ml ONPG solution.

2) Preparering av cellefritt proteinekstrakt: 2) Preparation of cell-free protein extract:

Hver prøve ble vasket en gang i CIH2O, en gang i lysebuffer og resuspendert i lysebuffer ved en konsentrasjon på 150 Agoo/ml. 0,5 g glassperler ble satt til en 350 ul porsjon av prøve og blandingen ble svirret fire ganger i 60 sekunder hver med ett minutts mellomrom på is. Celleoppslemmingen ble fjernet fra glassperlene og suspensjonen ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrosentrifuge. Supernantanten ble overført til et mikrosentrifugerør av polypropelen for analyse. Mengden av samlet protein i hvert ekstrakt ble bestemt ved Bradfords analysemetode (Bio-Rad). BSA tjente som proteinstandarden. Each sample was washed once in CIH 2 O, once in lysis buffer and resuspended in lysis buffer at a concentration of 150 Agoo/ml. 0.5 g of glass beads was added to a 350 µl portion of sample and the mixture was vortexed four times for 60 seconds each one minute apart on ice. The cell suspension was removed from the glass beads and the suspension was centrifuged for 5 minutes in a microcentrifuge. The supernatant was transferred to a polypropylene microcentrifuge tube for analysis. The amount of total protein in each extract was determined by Bradford's assay method (Bio-Rad). BSA served as the protein standard.

3) Analysemetode: 3) Analysis method:

1 - 50 yl cellefritt proteinekstrakt ble satt til 1 ml Z-buffer. Blandingen ble svirret og inkubert i 5 minutter ved 30°C. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml). 0,5 ml av IM Na2C03-oppløsning ble tilsatt for å stanse reaksjonen på et passende tidspunkt (A42o<l)- Absorbansen ved 420 nm ble deretter avlest. 1-50 µl of cell-free protein extract was added to 1 ml of Z-buffer. The mixture was vortexed and incubated for 5 minutes at 30°C. The reaction was started by adding 0.2 ml of ONPG (4 mg/ml). 0.5 ml of IM Na 2 CO 3 solution was added to stop the reaction at an appropriate time (A 4 2 o<l)- The absorbance at 420 nm was then read.

4) Beregning av 13-galaktosidase-aktivitetsenheter 4) Calculation of 13-galactosidase activity units

1 U = 1 nmole ortonitrofenol (ONP) ble dannet hvert minutt ved 30°C og pH=7. 1 nmole ONP har en absorbans ved 420 nm (A420) på 0,0045 med en banelengde på 1 cm. Følgelig representerer en absorbans på 1 ved 420 nm, 222 nmole ONP/ml eller 378 nmole ONP/1,7 ml (det samlede volum av supernantant som ble analysert var 1,7 ml). Enheter uttrykt i tabell 2 ble beregnet som følger: 1 U = 1 nmole orthonitrophenol (ONP) was formed every minute at 30°C and pH=7. 1 nmole of ONP has an absorbance at 420 nm (A420) of 0.0045 with a path length of 1 cm. Accordingly, an absorbance of 1 at 420 nm represents 222 nmole ONP/ml or 378 nmole ONP/1.7 ml (the total volume of supernatant analyzed was 1.7 ml). Units expressed in Table 2 were calculated as follows:

Claims

1. Biological pure cultures of Pichia pastoris. characterized in that they are prototrophic for arginine, auxotrophic for histidine and unable to use methanol as a carbon source.

2. Pure culture as stated in claim 1, characterized in that the strain is MC 100-3.