JPH0759578A - 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造 - Google Patents

組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造

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JPH0759578A
JPH0759578A JP6126496A JP12649694A JPH0759578A JP H0759578 A JPH0759578 A JP H0759578A JP 6126496 A JP6126496 A JP 6126496A JP 12649694 A JP12649694 A JP 12649694A JP H0759578 A JPH0759578 A JP H0759578A
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dna
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JP6126496A
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James Mon Lee
ジェイムス・モン・リー
Axel Ullrich
アクセル・ウールリッヒ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトＩＧＦの成熟タンパク質を組換え生産す
る手段を提供する。 【構成】 形質転換組換え細菌宿主中でヒトＩＧＦを暗
号化しているＤＮＡ配列を発現することができる発現ベ
クターと同発現ベクターで形質転換された細菌宿主。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の目的】本発明は組換えＤＮＡ技術による、種々
の形のヒトＩＧＦ(インシュリン様成長因子)の製造法に
関する。特に本発明は、組換えＤＮＡ変換宿主生物中で
の発現、プロセシング(加工、または加工処理)および分
泌による、成熟蛋白質生成物としてのヒトＩＧＦの製造
法を提供するものである。即ち本発明は、種々の形のヒ
トＩＧＦの生産、分離および用途、およびそれを製造す
るための、関連する組換えＤＮＡ技術を提供するもので
ある。更に、本発明は関連する蛋白質、ヒトＥＧＦ(外
皮成長因子)の類似の製造法に関するものでもある。
【０００２】本発明は、一部には、組換え宿主生物によ
って、個別に、成熟蛋白質の形で、ヒトＩＧＦを製造す
ることができる新規な系を発見したことに基づいてい
る。これは、少なくとも一部の酵母α因子信号(シグナ
ル)配列と融合したヒトＩＧＦのアミノ酸配列を発現
し、その信号配列をプロセシングし、成熟ヒトＩＧＦ蛋
白質を、宿主生物を扶養している培地中に分泌すること
ができる発現系(これは本発明の１態様である)によって
達成された。即ち、この本発明の新規な態様は、初め
て、ヒトＩＧＦを個別の、成熟蛋白質として製造、分離
および利用を可能ならしめるものと考えられる。しかし
本発明は、その広い範囲の意味に於いて、細菌と細胞培
養を含む他の組換え系でヒトＩＧＦのアミノ酸配列を調
製することを含み、従って、成熟ヒトＩＧＦのみなら
ず、必須成分としてＩＧＦのアミノ酸配列を含有してい
る融合生産物誘導体を提供するヒトＩＧＦ ＤＮＡ配列
の発現を含んでいる。この様な生産物は、生物学的に活
性であることがわかり、従って、所期の目的に有用であ
る。
【０００３】本発明の背景を説明し、またある場合に
は、より詳細な内容を紹介するために各種の文献を引用
したが、それらは、それぞれアルファベットまたは数字
で表わし、それらの記号を添えて本明細書の末尾にまと
めた。
【０００４】
【本発明の背景】
Ａ．ヒトＩＧＦ(インシュリン様成長因子)過去の研究者
達にとって、ヒトＩＧＦは熱心な研究対象であった。こ
の蛋白質または一連の蛋白質を種々の面から研究した多
数の文献が発表されている(文献Ａ〜Ｌ参照)。
【０００５】インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩはヒ
ト血清から単離された(文献Ａ)。「インシュリン様成長
因子」という用語またはＩＧＦは、インシュリン様作用
および多くの細胞に対して有糸分裂促進剤として作用す
るこれらのポリペプチド類のインシュリン様構造を表わ
すのに選ばれた。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの完全
なアミノ酸配列は決定されている(文献Ｄ、Ｅ)。これら
は共に１本鎖ポリペプチドで、３つのジスルフィド橋を
持っており、それぞれヒトインシュリンＡ鎖およびＢ鎖
に４９および４７％の配列同一性を有している。連結ペ
プチドまたはＣ領域は、プロインシュリンのそれよりも
極めて短かく、それと有意な相同性を持っていない(Ｉ
ＧＦの生物学的作用に関する初期の研究についての総論
は文献Ｆ参照のこと)。
【０００６】ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ヒト血
清およびヒト脳脊髄液に存在する成長促進ポリペプチド
である。その構造はプロインシュリンとホモローガス
(相同)である。ＩＧＦ−Ｉは、特異なＩＧＦ結合蛋白質
とともに肝臓で生産される様であり、この両者は、成長
ホルモンの支配下にある。即ち、ヒトＩＧＦは、ヒト成
長ホルモンの作用を媒介する活性な成長促進分子である
と考えられている。
【０００７】成長因子として人類に適用される高品質の
ヒトＩＧＦを、必要なだけ多量に提供するには、組換え
ＤＮＡおよび関連技術を応用するのが最も効果的である
ことがわかった。目標とする所は、宿主生物から、組換
えＤＮＡ技術の産物として、生物学的に活性な融合蛋白
質として、あるいは、より重要なことであるが成熟蛋白
質として、ヒトＩＧＦを生産することであった。この様
な物質は、生物活性を示し、各種の成長に影響のある症
状の治療に臨床応用が可能であろう。
【０００８】Ｂ．組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術は、一応成熟期に達したと言える。分
子生物学者は、各種のＤＮＡ配列をある程度容易に組換
え、形質転換された微生物および細胞培養株中で多量の
外来性蛋白質産物を生産し得る新しいＤＮＡ体をつくる
ことができる。一般的な手技手法は、各種のＤＮＡの平
滑末端あるいは粘着末端フラグメントをインビトロで結
合させ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な発
現媒体(ビヒクル)を調製し、所望の外来性産物を効率的
に合成させることである。しかし、産物によっては、そ
れを生産する方法は依然として回りくどいものであり、
常に成功を予見し得る程には、この科学は進歩していな
い。事実、基礎的な実験に基づくことなく、成功すると
予想する者は、著しい実施不能の危険をおかしてそうす
るのである。
【０００９】主要な要素、即ち複製起源、１種またはそ
れ以上の表現型選択特性、発現プロモーター、外来性遺
伝子の挿入および残留ベクターのＤＮＡ組換えは、通常
宿主細胞の外で行なう。得られた組換え複製可能発現ビ
ヒクルまたはプラスミドを形質転換によって細胞に導入
し、その形質転換体を増殖させることによって多量の組
換えビヒクルを得る。暗号化されているＤＮＡ情報の転
写および翻訳を支配している部分に関して適切な位置に
この遺伝子が挿入された場合は、この得られた発現ビヒ
クルは、挿入された遺伝子が暗号化しているポリペプチ
ド配列を生産するのに有用である。この過程は発現と呼
ばれる。要すれば宿主細胞を溶解させ、他の蛋白質から
分離精製して生産物を回収することができる。
【００１０】実際には、組換えＤＮＡ技術を使って全て
外来性のペプチドを発現させることができ(いわゆる直
接発現)、あるいはまた、ホモローガス(同種の)ポリペ
プチドのアミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス
(異種の)ポリペプチドを発現させることもできる。後者
の場合、目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂
されるまで、融合したホモローガス／ヘテロローガスポ
リペプチド内で不活性化されていることがある(文献Ｍ
およびＮ参照)。
【００１１】同様に、遺伝および細胞生理を研究するた
めの細胞培養または組織培養の技術も非常に進歩してい
る。単離した正常細胞から、続々と継代(移植)して調製
した耐久セルラインを保持する手技手法を使用すること
ができる。研究に使用するには、この様なセルラインは
液体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるだ
けである。その他の背景については文献ＯおよびＰ参
照。
【００１２】同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化
学は有用な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白質
を生産する細胞は、何百という他の蛋白質、細胞代謝の
内性産物をも生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の
蛋白質から分離しておかないと、他の化合物と同様、所
望の蛋白質による治療過程でヒトや動物に投与されると
毒性を現わすことがある。従って、当面の特定の系に適
した分離法を計画し、所望の用途に使用できる均質な安
全な生産物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となっ
てくる。蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、
そしてそれを特性化して、細胞が確実に、変化したり変
異することなく、忠実にそれを生産したことを確めるの
にも必要である。この科学分野は更に、バイオアッセイ
や安定性試験を計画したり、臨床試験やマーケティング
を行なう前にやらなければならないその他の手続きにも
関係している。
【００１３】
【本発明の要約】本発明は、組換えＤＮＡ技術により、
市場に出すまでに必要な動物実験および臨床実験を行な
うのに十分な量のヒトＩＧＦ、関連する蛋白質、ヒトＥ
ＧＦを、好ましくは直接の形で生産することができるこ
とを発見したことに基づいている。この生産物、ヒトＩ
ＧＦおよびＥＧＦは、本発明によって生産されるあらゆ
る形に於いて、ヒトの成長に関連する種々の症状または
疾患の予防または治療に使用することができる。従っ
て、本発明の目的の１つは、本発明の方法および手段に
よって製造されるヒトＩＧＦまたはヒトＥＧＦ、または
それらの適当な医薬組成物を使って、ヒトの患者の成長
状態を処置する方法を提供するものである。
【００１４】更に本発明の目的は、組換え宿主生物内に
於ける発現、加工、および分泌の生産物としての実質的
に純粋な、成熟ヒトＩＧＦを提供することである。この
ヒトＩＧＦは、この物質を製造するのに使用され得る発
現系由来のＮ−末端アミノ酸配列を伴なっていない。即
ち、本発明はＩＧＦのアミノ酸配列を含むポリペプチド
の製造に関するものであるが、その特徴とする所は、成
熟ヒトＩＧＦを直接、使用した組換え宿主生物の培地内
に生産させることである。本発明はまた、ヒトＩＧＦお
よびヒトＥＧＦを暗号化している遺伝子配列を発現可能
な形で担持している複製可能なＤＮＡ発現ビヒクル、こ
の様なビヒクルで形質転換された微生物株または細胞培
養、およびヒトＩＧＦおよびヒトＥＧＦのアミノ酸配列
を生産し得るその様な形質転換体の微生物あるいは細胞
培養を提供するものである。更に本発明は、この様な遺
伝子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物および細胞培
養、並びにそれらの特定の態様を調製するのに有用な各
種の方法を提供するものである。更に本発明は、その様
な微生物および細胞培養の醗酵培養の製造法を提供する
ものである。
【００１５】以下に図面について説明する。図１はヒト
ＩＧＦ−１のための発現ベクターの組み立てに使用され
る化学的に合成されたＤＮＡ鎖を表わしている。１Ｌ、
２Ｌ、３Ｌおよび４Ｌはそれぞれ４３、４６、４３およ
び４６量体、１Ｒ、２Ｒ、３Ｒおよび４Ｒはそれぞれ４
６、５４、４６および４６量体である。
【００１６】図２は図１のＤＮＡから完成された２本鎖
ＤＮＡを表わしている(ＤＮＡポリメラーゼＩ合成２本
鎖ＤＮＡ)。
【００１７】図３は、ＥcoＲＩおよびＰstＩおよびＢam
ＨＩで制限酵素切断(restriction)した後の図２のＤＮ
Ａのフラグメントを示している。
【００１８】図４は、左半分のＩＧＦ−Ｉ組み立てにお
ける、図３のパーツ１およびパーツ２のpＢＲ３２２へ
のライゲーションを示している(ＥcoＲＩ−ＢamＨＩpＢ
Ｒ３２２＋パーツ１＋パーツ２のスリー・パーツ・ライ
ゲーション)。
【００１９】図５は、ＩＧＦ−Ｉの右半分のパーツ３お
よび４を示している。
【００２０】図６は、ＩＧＦ−Ｉ組み立てに於ける、図
５のパーツ３および４の、図４のベクターへのライゲー
ションを表わしている(ＩＧＦ−Ｉ ＬＨ３２２＋パー
ツ３＋パーツ４のスリー・パーツ・ライゲーション)。
【００２１】図７は、ＤＮＡ配列およびＩＧＦ−Ｉを含
有している推定の融合蛋白質の配列を示している。翻訳
分子量＝２８６７１.５１、下線部分＝成熟ヒトＩＧＦ
−Ｉ、箱で囲った部分＝コラゲナーゼ認識部位。
【００２２】図８は、ＤＮＡ配列およびＩＧＦ−Ｉを含
有している推定の短い融合蛋白質の配列を示している
(ＳＬＥ−ＩＧＦ−Ｉ融合蛋白質)。下線部分＝成熟ヒト
ＩＧＦ−１、箱で囲った部分＝コラゲナーゼ認識部位。
【００２３】図９は本発明の組み立てに使用されるプラ
スミドである。
【００２４】図１０は、α因子プレ−プロ配列と融合し
たＩＧＦ−Ｉの、ＤＮＡおよび蛋白質配列を示している
(酵母プレプロα因子−ＩＧＦ−Ｉ)。下線部分＝成熟ヒ
トＩＧＦ−１、箱で囲った部分＝コラゲナーゼ認識部
位。
【００２５】図１１は、ＩＧＦ−Ｉと融合した、α因子
プロモーターおよびプレ−プロ配列を有しているベクタ
ーである。
【００２６】図１２は、ＩＧＦ−Ｉと融合した酵母イン
ベルターゼ信号(シグナル)を示している(酵母インベル
ターゼ信号−ＩＧＦ−１蛋白質)。下線部分＝成熟ヒト
ＩＧＦ−１。
【００２７】図１３は酵母ＰＧＫプロモーターを含有し
ている親プラスミドである(ＹＥp１ＰＴ Ｓmall)。
【００２８】図１４は、ＰＧＫプロモーター、インベル
ターゼ信号およびヒトＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含んでいる酵
母発現ベクターである(ＹＥp１ＰＴ Ｓmall Ｐ．Ｉ．
ＰＧＫプロモーター)。
【００２９】図１５は成熟ヒトＥＧＦの暗号配列を組み
立てるのに使用される合成ＤＮＡである。
【００３０】図１６は、ヒトＥＧＦ暗号配列と融合した
酵母α因子「プレ−プロ」配列を示している。
【００３１】図１７は、ヒトＥＧＦ暗号配列と融合した
酵母インベルターゼ信号配列を示している。
【００３２】図１８はヒトＩＧＦ−ＩＩの暗号配列であ
る。
【００３３】
【詳細な説明】
Ａ．定義「 ヒトＩＧＦ」および「ヒトＥＧＦ」は、微生物または細胞
培養系によって生産されるヒトのインシュリン様成長因
子およびヒトの表皮性成長因子であり、生物活性形は、
ヒトの組織由来のヒトのＩＧＦおよびヒトのＥＧＦに相
当するアミノ酸配列を含んでいる。本発明に於いて生産
されたヒトＩＧＦおよびＥＧＦ蛋白質は、ＤＮＡ、遺伝
子および推論的なアミノ酸配列決定によって明らかにさ
れた。全配列におけるアミノ酸の違い、あるいはその様
な配列の１若しくはそれ以上のアミノ酸の欠落、置換、
挿入、逆位、または付加によって例示される様に、天然
に対立遺伝子変異が存在し、かつ個体から個体へと起る
ので、本発明はこれらの２つの分子の対立遺伝子変異体
の全てを含むものと解釈されるべきである。更に、グリ
コシル化の位置およびその程度は、用いた組換え宿主生
物の種類によって異なるので、その様にして起こり得る
変異体も本発明の範囲に含まれる。最後に、ＤＮＡ技術
を使って、この様な分子の基本的な遺伝子配列を簡単に
修飾することによってヒトＩＧＦおよびヒトＥＧＦの各
種の誘導体を製造する可能性もある。この様な修飾は、
実施例の様に、基本的ＤＮＡの部位指向性突然変異誘発
によって達成することができた。ヒトＩＧＦおよびヒト
ＥＧＦの誘導体を生成させるこの様な修飾は全て、必須
の特徴的なヒトＩＧＦおよびヒトＥＧＦ活性が影響を受
けずに残っている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】本発明によって生産されるヒトＩＧＦまた
はヒトＥＧＦの状態を表わすのに使用される「実質的に
純粋な形」という用語は、非組換え細胞によって、即
ち、その天然の環境で生産されるヒトＩＧＦまたはヒト
ＥＧＦに通常随伴している蛋白質またはその他の物質を
含んでいないことをいう。
【００３５】「発現ベクター」とは、ＤＮＡ配列が、その
発現に影響を与え得るベクター内の他の配列、即ちプロ
モーター／オペレーター配列に作働可能な様に結合され
た場合、そのベクターに含まれるそのＤＮＡ配列を発現
することができるベクターを意味する。結局、「発現ベ
クター」とは、機能的な定義である: 特定のＤＮＡ暗号
を発現することができるＤＮＡ配列は全てここに配置さ
れる。通常、組み換えＤＮＡ技術に使用される発現ベク
ターはプラスミドの形であることが多い。このプラスミ
ドは、ベクターの形に於いては染色体に結合していない
環状の２本鎖ＤＮＡループのことをいう。プラスミド
は、ベクターの最も普通に用いられる形であるので、本
明細書に於いては、プラスミドとベクターを交換可能な
用語として用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能
を有する、当技術分野で知られている、あるいは今後知
られ得る他の形の発現ベクターも含まれると解釈すべき
である。
【００３６】本明細書に於いて「組換え宿主細胞」とは、
この様なベクターで形質転換された細胞を意味する。従
って、この様な細胞によって生産されるヒトＩＧＦおよ
びヒトＥＧＦ分子は、「組換えヒトＩＧＦ」および「組換
えヒトＥＧＦ」と呼ぶことができる。
【００３７】Ｂ．宿主細胞培養およびベクター 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の真
核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することがで
きる。勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み
立てるに際し、ＤＮＡ配列をクローニングするのに原核
生物が好ましい。特にＥ．coli Ｋ１２株２９４(ＡＴ
ＣＣ Ｎo．３１４４６)が特に好ましい。使用し得るそ
の他の微生物株として、Ｅ．coli Ｂ、Ｅ．coli Ｘ１
７７６(ＡＴＣＣ Ｎo．３１５３７)などのＥ．coli株が
含まれる。上記の株、Ｅ．coli Ｗ３１１０(Ｆ-,λ-,
原栄養体、ＡＴＣＣ Ｎo．２７３２５)、Ｂacillus s
ubtilisの様な桿菌、Ｓalmonella typhimuriumまたは
Ｓerratia marcesanの様なその他の腸内細菌、および
各種のシュードモナスも使用することができる。これら
は限定する意味で挙げたのではなく、単なる例示に過ぎ
ないことは言うまでもない。
【００３８】一般に、これらの宿主に関しては、その宿
主細胞と適合し得る種由来のレプリコンおよび調節配列
を含んでいるプラスミドベクターが使用される。このベ
クターはもともと、形質転換細胞に表現形質(表現型)の
選択性を付与することのできる標識化配列と共に複製部
位を持っている。例えば、Ｅ．coliは、Ｅ．coli種由来
のpＢＲ３２２を使って形質転換される(Ｂolivarら、Ｇ
ene２:９５(１９７７))。pＢＲ３２２はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでお
り、従って、これは形質転換細胞を同定するための簡単
な手段となる。このpＢＲ３２２プラスミドやその他の
微生物プラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を
発現するのに使用することのできるプロモーターを含ん
でいなければならず、あるいは含む様に改良されなくて
はならない。組換えＤＮＡの組み立てに通常用いられる
プロモーターにはβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)お
よびラクトースプロモーター系(Ｃhangら、Ｎature２７
５:６１５(１９７８); Ｉtakuraら、Ｓcience１９８:１
０５６(１９７７); Ｇoeddelら、Ｎature２８１:５４４
(１９７９)およびトリプトファン(trp)プロモーター系
(Ｇoeddelら、ＮucleicＡcids Ｒes．８:４０５７(１
９８０); ＥＰＯ Ａpplpubl Ｎo．００３６７７６)が
ある。これらが最も普通に用いられているが、その他の
微生物プロモーターも発見され、使用されており、それ
らのヌクレオチド配列は詳細に発表されているので、当
業者であれば、それらをプラスミドベクターに機能的に
結合させることができる(Ｓiebenlistら、Ｃell ２０:
２６９(１９８０))。
【００３９】原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微
生物も使用することができる。Ｓaccharomyces cerevi
siae、普通のパン酵母は、真核微生物中最もよく使用さ
れるものであるが、その他の多くの株も使用される。Ｓ
accharomyces中で発現させるには、例えばプラスミドＹ
Ｒp７(Ｓtinchcombら、Ｎature ２８２:３９(１９７
９); Ｋingsmanら、Ｇene ７:１４１(１９７９); Ｔsc
hemperら、Ｇene１０:１５７(１９８０)がよく用いられ
る。このプラスミドは、トリプトファンを生産する能力
を欠いている酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮo．
４４０７６またはＰＥＰ４−１(Ｊones,Ｇenetics８５:
１２(１９７７))にとって選択マーカーとなるtrp１遺伝
子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴と
してのtrp１損傷が存在することは、トリプトファンの
非存在下に発育させることによって形質転換体を検出す
る有効な環境を提供することになる。
【００４０】酵母ベクター中の適切な促進(promoting)
配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Ｈitzeman
ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５５:２０７３(１９８０))ま
たは他の解糖酵素(Ｈessら、Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒe
g．７:１４９(１９６８);Ｈollandら、Ｂiochemistry
１７:４９００(１９７８))、例えばエノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど
のプロモーターが含まれる。好適な発現プラスミドを組
み立てるに際し、これらの遺伝子の終了(termination)
配列もまた、発現ベクターに、発現しようとする配列の
３に結合させてmＲＮＡのポリアデニル化および終了を
提供する。発育条件によってコントロールされる、もう
１つの転写における有利性を持った他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関与する分解酵
素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利
用に関与する酵素(Ｈolland、前記)などのプロモーター
領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起源お
よび終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクターが
適している。
【００４１】微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も
宿主として使用することができる。原則として、脊椎動
物および無脊椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。
しかし、脊椎動物細胞が最も興味があり、脊椎動物細胞
の培養増殖(組織培養)が最近では、常套手段となって来
た(Ｔissue Ｃulture Ａcademic Ｐress,Ｋruseおよ
びＰatterson, editors(１９７３))。この様な有用な
宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイ
ニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系、Ｗ１３８、Ｂ
ＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系などである。こ
の様な細胞の発現ベクターは、通常、(要すれば)複製起
源、発現しようとする遺伝子の前に位置するプロモータ
ー、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡ組み継ぎ(スプ
ライス)部位、ポリアデニル化部位、転写終了配列など
を含んでいる。
【００４２】哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクタ
ー上の調節機能はウイルスから提供されることが多い。
例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウイルス２から誘導され、シミアンウイルス４０
(ＳＶ４０)から導かれることが最も多い。古い、そして
新しいＳＶ４０ウイルスのプロモーターは、共にこのウ
イルスから、ＳＶ４０ウイルスの複製起源を含んでいる
フラグメントとして簡単に得られるという理由で特に有
用である(Ｆiersら、Ｎature ２７３:１１３(１９７
８))。Ｈind ＩＩＩサイト(部位)からウイルスの複製起
源内に存在しているＢgl Ｉサイトに至る約２５０bp配
列を含んでいるならば、それより小さいあるいは大きい
ＳＶ４０フラグメントも使用することができる。更に、
所望の遺伝子配列と正常通り結合しているプロモーター
または調節配列を、この様な調節配列が宿主細胞に適合
する限り、使用することができ、またそれが好ましいこ
とが多い。
【００４３】複製起源は、ＳＶ４０または他のウイルス
(例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)が誘
導される様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み
立てることにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機
構により提供することができる。このベクターが宿主細
胞染色体に組み込まれたら、後者は十分であることが多
い。
【００４４】Ｃ．方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞として使用
する場合は、Ｇrahamらの燐酸カルシウム沈澱法(Ｇraha
mおよびＶan der Ｅb．Ｖirology ５２:５４６(１９
７８))によってトランスフェクションを行なう。しか
し、核注入またはプロトプラスト融合などの、ＤＮＡを
細胞に導入する他の方法も使用することができる。
【００４５】原核細胞または実質的な細胞壁構造を持っ
た細胞を使用する場合、好ましいトランスフェクション
の方法は、Ｃohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウ
ム処理である(Ｃohen,Ｆ．Ｎ．らＰroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．(ＵＳＡ),６９:２１１０(１９７２))。
【００４６】所望の暗号配列および調節配列(control
sequence)を含んでいる好適なベクターを組み立てるに
は標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを開裂し、修復(テイラー)し、所
望のプラスミドを形成する様に、希望の形に再結合す
る。
【００４７】開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理
することにより行なう。通常、約１μgのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメント、約２０μlの緩衝液、約１単
位の酵素を使用する(特定の制限酵素に対する適切な緩
衝液および基質の量は製造業者が指定している)。３７
℃で約１時間インキュベートする。インキュベートした
後、フェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を
除き、水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収
する。
【００４８】平滑末端が必要な場合は、ポリメラーゼＩ
(Ｋlenow)１０単位で、１５℃で１５分間処理し、フェ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱に付す。
【００４９】開裂したフラグメントの大きさによる分離
は、Ｇoeddelらの方法(Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａci
ds Ｒes．８:４０５７(１９８０))に従い、６％ポリア
クリルアミドゲルを使って行なう。
【００５０】結合(ライゲーション)には、正しく符号す
る様に末端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の成分
を、ＤＮＡ０.５μg当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて処理する(開裂したベクターを成分として
用いる場合は、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予め
処理して開裂したベクターの再結合を防ぐのがよい）。
【００５１】組み立てたプラスミド中の正しい配列を確
認するための分析には、ライゲーション混合物を使って
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を
形質転換し、適切な場合はアンピシリン耐性によって、
成功した形質転換体を選択する。形質転換体からプラス
ミドを調製し、Ｍessingらの方法(Ｎucleic Ａcids
Ｒes．,９:３０９(１９８１))またはＭaxamらの方法(Ｍ
ethods in Ｅnzymology,６５:４９９(１９８０))によ
って制限および／または配列化によって分析する。
【００５２】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、これは本発
明を例示するためのものであって、これによって本発明
を限定するものと解釈してはならない。
【００５３】ヒトＩＧＦ−１の合成および発現 酵素は以下の供給源から入手した。 Ｎew Ｅngland Ｂiolabs: 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ。 Ｂethesda Ｒesearch Ｌabs: 制限酵素、細菌性アル
カリホスファターゼ。 Ｂoehringer−Ｍannheim: Ｅ．coli ＤＮＡポリメラー
ゼＩ(Ｋlenow)。 Ｐ＋Ｌ Ｂiochemicals: ポリヌクレオチドキナーゼ、
ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 Ｎew Ｅngland Ｎuclear: pＢＲ３２２[オリゴ(dＧ)
−尾部化]ＤＮＡ 試薬 ＢioＲad: ビス・アクリルアミド、アクリルアミド、Ｔ
ＭＥＤ。 Ｓigma: アンモニウムパーサルフェート。 Ａmersham: １０２１８ γ32Ｐ ＡＴＰ＞５０００Ｃi
／ミリモル; １０１６５γ32Ｐ dＣＴＰ＞４００Ｃi／
ミリモル。 Ｓolution and Ｍedia: １×ＴＢＥ: ．５４Ｍトリス
塩基、０.５４Ｍホウ酸、．０１７Ｍ Ｎa2ＥＤＴＡ。 Ｄifco: 酵母含窒素塩基(ＹＮＢ); トリプトン、酵母抽
出物; Ｂacto−Ａgar;カザミノ酸。 オートラジオグラフィー: Ｋodak Ｘ−Ｏ mat ＡＲ
ＸＡＲ−２フィルム。 ガラスビーズ: ０.４５−０.５０mＭ Ｂ．Ｂraun Ｍel
sungen ＡＧ。 ＬＢ培地(１ l当たり): ＮaＣl １０g、酵母エキス５
g、トリプトン１０g、ＮaＯＨ(５０％).１７ml。 ＬＢ寒天(１ l当たり): トリプトン１０g、酵母エキス
５g、ＮaＣl .５g、Ｂacto−Ａgar１５g、ＮaＯＨでpＨ
７.５に調節。 抗生物質: 全ての培地にテトラサイクリン(５μg／ml);
全ての培地にアンピシリン(２０μg／ml)(平板または
液体)。 Ｍ９培地(１ l当たり): Ｎa2ＨＰＯ4(無水)６g; ＮＨ4
Ｃl １g; ＫＨ2ＰＯ4３g; ＮaＣl .５g; ＭgＳＯ4 １m
Ｍ; ０.５％(w／v)グルコース; ０.５％(w／v)カザミノ
酸; .０００１％チアミン−ＨＣl。 ＹＮＢ−ＣＡＡ(１ l当たり): 酵母含窒素塩基(アミノ
酸なし)６.７g; アデニン１０mg; ウラシル１０mg; カ
ザミノ酸５g; グルコース２０g。 ＹＮＢ−ＣＡＡ寒天平板(１ l当たり): ＹＮＢ−ＣＡＡ
＋寒天３０g。 標準的ライゲーション条件: ベクターに対し１０倍モル
過剰の挿入体(またはリンカー)。１×Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液および４００−８００Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ; １４°−１２−１６時間。 標準的キネーション(Ｋination)条件: １×ポリヌクレ
オチドキナーゼ緩衝液;１５Ｕ ポリヌクレオチドキナ
ーゼ; ３７°、６０分; 次いで６５°で１０分間加熱し
て反応終結。 １×キナーゼ緩衝液: ７０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７.
６); １０mＭ ＭgＣl2;５mＭ ＤＴＴ。 １×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液: ５０mＭトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ７.８); １０mＭ ＭgＣl2; ２０mＭ ＤＴＴ; １
mＭ rＡＴＰ。
【００５４】ＤＮＡ配列の組み立て、方法(Ｓtrategy)および選択 ヒトＩＧＦ−１分子の１°蛋白質構造は決定されている
(１)。この蛋白質の配列および遺伝暗号に基いて、成熟
ヒトＩＧＦ−１蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列(全
ての塩基位置に於ける全ての可能な塩基置換体を含む)
をコンピューター分析(Ｇenentech Ｕntrans Ｐrogra
m)によって決定した。制限部位分析プログラム(Ｇenent
ech Ａsearch Ｐrogram)を使用して、同じ蛋白質を一
貫して暗号化してる全ての可能なＤＮＡ配列内に存在し
ている、可能性のある全ゆる制限部位が見つけられた。
この暗号配列内の３つの部位、即ちＰst Ｉ、ＢamＨＩ
およびＡvaIIを選んだ。更に２つの部位が、両末端、成
熟蛋白質の暗号配列の丁度外側に置かれた: １つは開始
コドン、ＡＵＧの前のＥcoＲ Ｉ部位、もう１つは暗号
配列の終止コドン、ＴＡＧに続くＳal Ｉ部位である。
これらの部位の選択により、暗号配列を別々のパーツ
(一部分)にしてクローニングすることができ、次いでそ
れらをそれぞれ切り取って集め、完全なＩＧＦ−１遺伝
子を作成することができた。この組み立ては、左半分を
形成している２つのパーツ、右半分を形成している２つ
のパーツ、の４つのパーツを集めて組み立てることであ
った。各パーツは、化学的に合成したＤＮＡの２本鎖で
構成されている(図１)。提案された合成フラグメントは
また、内部相補性について分析された。
【００５５】これらの４つのパーツを生成させるのに使
用した組み立てには、その３'末端に９−１０bpの長さ
の相補配列を持った合成オリゴヌクレオチド基質のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ修復合成を用いた。ＤＮＡポリメラー
ゼＩ(Ｋlenow)および４つのデオキシヌクレオシド・ト
リホスフェートの存在下で、これらのプライマー−鋳型
は伸長されて全長２本鎖ＤＮＡとなった。所望の部分以
外の場所でのプライミング、および自己−ハイブリダイ
ゼーションを避けるために、各セットの１本鎖ＤＮＡ群
をコンピュータープログラム(Ｇenentech Ｈomology
Ｐrogram)によって分析し、可能な限り、ヘアピンルー
プ、自己−プライミングまたはミス−プライミングを起
す可能性のある配列を除去して別のコドンで置き換え
た。これらの４つの２本鎖ＤＮＡのそれぞれは、ＩＧＦ
−１を暗号化していないＤＮＡの９−１２bpを、さら
に、各末端に含んでいる(図２参照)。この追加のＤＮＡ
は、制限酵素消化によって粘着末端を生成できるように
する為に含ませた。この様にして生成した粘着末端によ
り、その２本鎖片を、合成遺伝子の隣接する暗号断片あ
るいはクローニングビヒクルにライゲーションすること
ができる。
【００５６】各部分の末端の制限部位の先にある２本鎖
ＤＮＡの追加の９−１２bp(図２)により、ＴdＴ媒介に
よって、各２本鎖ＤＮＡ断片の３'末端に１本鎖のオリ
ゴデオキシシチジン鎖を形成させることができた。これ
らのオリゴデオキシシチジンを尾部とする２本鎖ＤＮＡ
を相補的なオリゴデオキシグアノシンを尾部とする、ク
ローニングビヒクルのＰst Ｉ部位にアニーリングする
ことができた。クローンし、配列を決定して正しい塩基
配列を確認したら、その部分を、その４つのパーツのそ
れぞれの末端で選択された制限部位を制限酵素で開裂し
た後、容易に単離し、結合させることができ、完全な合
成ＩＧＦ−１遺伝子を形成させることができた。
【００５７】本発明に於いて使用し、成功した方法は、
Ｒossiらの方法(文献２８)に類似している。しかし、制
限酵素認識部位の先の僅か２つの過剰ＤＮＡの塩基対を
使用するＲossiらの方法でＩＧＦ−１暗号配列を組み立
て、クローニングする試みは、繰り返し失敗に終った。
本発明に於いて採用した方法は、また、次の点でＲossi
らの方法と異なっている: 即ち、２本鎖ＤＮＡの両末端
に置いた制限部位により、スリー・パート・ライゲーシ
ョンより２本鎖ＤＮＡの要求量が少ない方法、(dc)−尾
部化および(dＧ)−尾部化ベクターへのアニーリングに
より、各２本鎖ＤＮＡフラグメントをそれぞれクローニ
ングするのに便利である。
【００５８】化学合成 ＣreaおよびＨornの方法(文献２)により、長さが４３、
４３、４６、４６、４６、４６、５４および４６塩基の
８つのフラグメントを化学合成した。ただし、縮合剤と
して、２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル
クロリド・テトラゾールの代りにメシチレンニトロトリ
アゾールを使用した。
【００５９】フラグメントの合成は、適当な固形担体
(セルロース)に、適当な完全に保護されたダイマーまた
はトリマーブロックを順次添加していくことにより行な
った。サイクルは、オリゴチミジン酸の合成について記
載されたもの(Ｃreaら、上記）と同じ条件で行なった。
最終的なポリマーを塩基（濃アンモニア水)および酸(８
０％ＨＯＡc)で処理し、ポリマーをペレット化し、上清
を蒸発乾固した。残渣を４％アンモニア水に溶かし、エ
チルエステルで３回洗い、完全に脱保護されたフラグメ
ントの分類に使用した。
【００６０】２０％ポリアクリルアミドゲルを使って電
気泳動法により精製した。純化したオリゴヌクレオチド
はゲル溶出の後エタノール沈澱にかけた。dＣＴＰは例
外であるが、最終濃度２００μＭのデオキシリボヌクレ
オシドトリホスフェートの存在下、２２５−２８５ピコ
モルの各化学合成フラグメントを当量の相補性１本鎖Ｄ
ＮＡフラグメントと混合した(即ち、１Ｌ＋３Ｌ;２Ｌ＋
４Ｌ;１Ｒ＋３Ｒ;２Ｒ＋４Ｒ)。dＣＴＰは、比活性１０
００−２０００Ｃi／ミリモルのα32Ｐ−標識アイソト
ープとして５μＭの濃度で加え、修復合成反応生成物の
モニターが容易に行なえる様にした。この反応は、最終
濃度５０mＭのトリスＨＣl(pＨ７.５)、２０mＭのＭgＣ
l2、２０mＭのＤＴＴおよび１５４ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ(Ｋlenow)を含む緩衝液中、反応容量２００μlで行な
った。反応は４℃で１２−１８時間行なった。
【００６１】反応終了後、ＥＤＴＡを２５mＭの濃度で
加えた。混合物を含む試料緩衝液をフェノール抽出、ク
ロロホルムで２回抽出し、生成物をエタノール沈澱に付
した。ペレットを.３Ｍ ＮaＯＡcにとり、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させた。このペレットを水に溶解した後、
１Ｌ＋３Ｌおよび２Ｌ＋４Ｌ生成物を別々に、１×Ｐst
Ｉ緩衝液(５０mＭ(ＮＨ4)2ＳＯ4、２０mＭトリスＨＣl
(pＨ７.５)、１０mＭＭgＣl2)および７０Ｕ Ｐst Ｉを
含んでいる反応ミックス１００μl中、Ｐst Ｉで消化し
た。４時間後、ＥＤＴＡを１０mＭの濃度になる様に加
え、エタノール沈澱にかけた。ペレットを.３Ｍ ＮaＯ
Ａcにとって再沈澱させ、次いで水に入れた。Ｐst Ｉ−
消化した１Ｌ＋３Ｌ生成物を１００μlの反応ミックス
１×ＥcoＲＩ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、６mＭトリスＨ
Ｃl(pＨ７.５)、６mＭ ＭgＣl2)および７０Ｕ ＥcoＲＩ
中、３７℃でＥcoＲＩ消化した。Ｐst Ｉ消化２Ｌ＋４
Ｌ生成物は、１×ＢamＨＩ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、
６mＭトリスＨＣl(pＨ７.９)、6mＭ ＭgＣl2)および７０
Ｕ ＢamＨＩの反応ミックス１００μl中、３７℃でＢam
ＨＩ消化した。４時間後、ＥＤＴＡを両混合物に加え、
試料緩衝液を加えた。それらを６％ポリアクリルアミド
平板ゲル電気泳動にかけた。６％平板ゲルは６％(w／v)
アクリルアミド(アクリルアミド対ビスアクリルアミド
が２０対１)１×ＴＢＥ、１％ＡＰＳおよび０.１％ＴＥ
ＭＥＤを含む混合物に流し込んで調製した。反応生成物
をオートラジオグラフィーにより、ゲル上で位置づけ、
４５bpＥcoＲＩ−Ｐst Ｉ消化１Ｌ＋３Ｌ生成物(パーツ
１)(図３参照)に相当する帯(バンド)および５０bp Ｐst
Ｉ−ＢamＨＩ消化２Ｌ＋４Ｌ生成物(パーツ２)(図３参
照)をゲルから切り取り、物質を０.２×ＴＢＥに電気溶
出し、フェノール抽出し、クロロホルム抽出した後エタ
ノール沈澱にかけた。次いでパーツ１および２を水に溶
解した。
【００６２】クローニングベクターの調製 クローニングベクターは、１×ＲＩ緩衝液中、pＢＲ３
２２(文献１５)２０μgを５０Ｕ ＥcoＲＩおよび５０Ｕ
ＢamＨＩで、３７℃で６時間消化することにより調製
した。ＥＤＴＡを１０mＭの濃度になる様添加した後、
試料緩衝液を加え、この混合物を５％ポリアクリルアミ
ドゲル上で泳動させた。５μg／mlのＥt．ブロミドを含
有する水中で１０'染色して着色し、水で２回洗浄し、
ＵＶ徹照装置(３０２nＭ)の上に置いた。約３７１２bp
のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化pＢＲ３２２分子に相当する
帯をゲルから切り取った。このゲル片からＤＮＡを電気
溶出し、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈澱にかけた。ペレットを水に溶かし、
ライゲーションに備えた。
【００６３】ライゲーション ライゲーション反応において挿入体とベクターのモル比
がほぼ１０対１であるスリー・パート・ライゲーション
(図４参照)において、パーツ１および２を、１×Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液(５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.
８)、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ rＡＴ
Ｐ)および〜８００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(ＮＥＢ)
中、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化３２２ベクターに結合させ
た。この反応は１４°で１２−１６時間行なった。
【００６４】形質転換 形質転換宿主としてＥ.coli株２９４を使用し、Ｍ.Ｄag
ertおよびＳ.Ｄ.Ｅhrlich(文献３)の方法を用いて行な
った。形質転換細胞をアンピシリン(２０μg／ml)含有
ＬＢ−寒天プレート(ＬＢ−Ａmp−プレート)に置き、形
質転換体をスクリーニングし、２０μg／mlのアンピシ
リンを含むＬＢ培地で増殖させた。ＢirnboimおよびＤo
ly(文献４)の迅速ミニスクリーニング法の改良法を用い
て形質転換体をスクリーニングした。この様にして調製
した少量の(miniprep)ＤＮＡをＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
で消化し、ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動させ
た。約２１８bp ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ挿入体を示した数
個の形質転換体を多量に増殖させ、それぞれからプラス
ミドを分離し、ＭaxamおよびＧilbertの方法(文献５)に
よって配列を決め、正しい化学合成および組み立てを確
認した。ＩＧＦ−１の完全な正しい左半分の配列を含有
しているpＢＲ３２２ベクターは、ＩＧＦ−１ ＬＨ３２
２と命名された(図５参照)。
【００６５】ＩＧＦ−１の右半分のフラグメントのクローニング ＤＮＡポリメラーゼＩ−媒介修復合成の同じ条件で、合
成ＩＧＦ−１の右半分を含む２個のフラグメント対を２
本鎖ＤＮＡに変換した。ＤＮＡポリメラーゼＩ反応の
後、酵素消化を行なうことなく、１Ｒ＋３Ｒ(パーツＩ
ＩＩ)および２Ｒ＋４Ｒ(パーツＩＶ)反応物を６％ポリ
アクリルアミド平板ゲル上で泳動させた。オートラジオ
グラフィーにより８３bp (パーツＩＩＩ)および９１bp
(パーツＩＶ)帯を位置づけ、ゲルから切り取った。電気
溶出の後、エタノール沈澱させた２本鎖ＤＮＡを、Ｖil
la−Ｋomaroffら(文献６)およびＲowenＫampおよびＦir
tel(文献７)の方法を使ってdＣ−尾部形成した(図６参
照)。この反応は、５０μl容量の１×テイリングミック
ス(.２Ｍカコジル酸カリウム、２５mＭトリスＨＣl(pＨ
６.９)、２mＭ ＤＴＴ、.５mＭ ＣＯＣl2)および２２μ
m dＣＴＰを用いて行なった。３７°で１０分間予備加
温した後、１０−２０単位のターミナルヌクレオチジル
トランスフェラーゼを加えて１５０秒反応を行ない、Ｅ
ＤＴＡを加えて反応を終結し、フェノール抽出、クロロ
ホルム抽出し(２回)、エタノール沈澱にかけた。
【００６６】これらのオリゴ(dＣ)尾部化パーツＩＩＩ
およびＩＶを、別々に、５０μlの１×アニーリング緩
衝液(.１Ｍ ＮaＣl、１０mＭトリスＨＣl(pＨ７.８)、
１mＭＥＤＴＡ)中、最終ＤＮＡ濃度１−２μg／mlで、
当モル量のオリゴ(dＧ)−尾部化Ｐst Ｉ切断pＢＲ３２
２ベクターと混合した。７５℃に加熱した後、混合物を
１６時間で徐々に４℃まで冷却し、この混合物を、Ｄag
ertおよびＥhrlichの方法(文献３)に従って、コンピテ
ントＥ.coli２９４細胞に導入した。形質転換細胞をＬ
Ｂ−テトラサイクリン−寒天平板に置き、５μg／mlの
テトラサイクリン濃度のＬＢ−テトラサイクリン培地で
増殖させた。テトラサイクリン耐性の形質転換体をひろ
い上げ、ＬＢ−アンピシリン−寒天平板にうえつけ、Ｐ
st Ｉ部位で挿入されたかどうかを調べた。パーツ３お
よび４のそれぞれについて数個のテトラサイクリン耐
性、アンピシリン感受性のコロニーをミニスクリーニン
グし、Ｐst Ｉ部位に於ける挿入を示すものを大規模に
増殖させ、ＭaxamおよびＧilbertの技術(文献５)によっ
て配列を決定し、パーツ３および４の正しい配列を確認
した。
【００６７】完全な合成ＨuＩＧＦ−１暗号配列の組み立て 調製: パーツ３および４ １×Ａva ＩＩ緩衝液(６０mＭ ＮaＣl、６mＭトリス−
ＨＣl(pＨ８.０)、１０mＭ ＭgＣl2、６mＭ２−メルカ
プトエタノール)中、３０ＵのＡva ＩＩを用いて各ベク
ター２０μgを消化し、パーツ３および４をそれぞれそ
のベクターから分離した。３７℃で６時間後、１５０μ
lの反応物にＥＤＴＡを１５mＭの濃度になる様に添加
し、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、エ
タノール沈澱させた。次いでパーツ３のペレットを１×
ＢamＨＩ緩衝液にとり、１５０μlの容量中、３０Ｕの
ＢamＨＩを用いて３７℃で４時間消化した。パーツ４を
含んでいるペレットは、１５０μlの１×Ｓal Ｉ緩衝液
中、３０Ｕ Ｓal Ｉにより３７℃で４時間消化した。
【００６８】両消化物を６％ポリアクリルアミド平板
(スラブ)ゲル上で泳動させて染色した。パーツ３に相当
する５１bp 帯およびパーツ４に相当する６２bp 帯をゲ
ルから取り出し、ＤＮＡを電気溶出し、フェノール抽出
し、クロロホルム抽出を２回行ない、エタノール沈澱さ
せた。次いでペレットを水に取り、ライゲーション(結
合)に備えた。
【００６９】ベクター調製 ２０μgのＩＧＦ−１ＬＨ３２２ベクターを、１×Ｂam
ＨＩ緩衝液を含む２００μlの反応系中、５０ＵのＢam
ＨＩと５０ＵのＳal Ｉにより３７℃で６時間消化し
た。ＥＤＴＡを１５mＭの濃度に添加した後、消化混合
物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動し、エチ
ジウムブロミド染色し、３８１４bp 帯をゲルから切り
取った。
【００７０】電気溶出、フェノール抽出、クロロホルム
抽出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡペレットを水に
取り、スリー・パート・ライゲーションでパーツ３およ
び４と結合させた。この結合は、既述したスリー・パー
ト・ライゲーションの場合と同じ条件で行なった(図７
参照)。パーツ３および４は、ライゲーションミックス
中、ベクターに対して１０倍モル過剰量の挿入体の形で
存在していた。この混合物を、ＤagertおよびＥhrlich
の方法(文献３)によって調製したコンピテントＥ.coli
２９４細胞に導入し、ＬＢ−アンピシリン平板上に植え
つけた。数個の形質転換体をミニスクリーニングし、約
１１５bp ＢamＨＩ−Ｓal Ｉフラグメントを示す２つの
クローンを大量に増殖させ、それらのプラスミドを調製
した。完全な合成遺伝子の両方の鎖の配列をＭaxam−Ｇ
ilbertの方法(５)で決定し、その正しい配列を確認し
た。ヒトＩＧＦ−１を暗号化している完全な正しい配列
を含んでいるこのpＢＲ３２２プラスミドをpＢＲ３２２
Ｈu ＩＧＦ−１と命名した。
【００７１】ヒトＩＧＦ−１の発現 細菌内でのＩＧＦ−１融合発現 初期の試みは融合蛋白質としてＩＧＦ−１を発現するこ
とであった。これを達成する為、pＮＣＶ(文献９)およ
びpＮＣＶsＬＥ(文献１０)発現ベクターを使用した。p
ＮＣＶsＬＥ発現ベクターはpＮＣＶベクターの誘導体で
あり、以下の如くして調製した: 即ち、pＮＣＶを、Ｌ
Ｅ融合の１３コドンを開裂するＢgl Ｉで処理した。こ
の部位を合成ＤＮＡを使ってＥcoＲＩ開裂部位に変換
し、発現ベクターpＮＣＶsＬＥを得た。このプラスミド
に導入した合成ＤＮＡは次の配列を持っており、 ５'−ＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣ ５'−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧ この配列をプラスミド: ＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧ に導入した。
【００７２】trp融合蛋白質からヒトＩＧＦ−１蛋白質
を遊離させる方法として、Ｗunschらの酵素的蛋白質分
解法(文献８)をこの発現系に適用し得る様に、リンカー
を設計した。これを達成する為、以下のＤＮＡリンカ
ー: を標準的方法(文献２)により化学合成した。これは、tr
p融合蛋白質およびＩＧＦ−１遺伝子に結合されると、
ＩＧＦ−１の最初の２つのアミノ酸残基であり、プロリ
ンおよびアラニンが前につくことによって、一緒になっ
てＣlostridiumhistolyticum(文献１１および１２)から
分離されたコラゲナーゼの認識部位を形成するグリシン
およびプロリンの前に、アミノ酸残基プロリンおよびア
ラニンを暗号化する。この酵素は、この様な部位に作用
してアラニン−グリシンペプチド結合を開裂するといわ
れている。
【００７３】コラゲナーゼ開裂部位を持った融合蛋白質
を暗号化しているＤＮＡ配列を組み立てる為に、３０μ
gのpＢＲ３２２Ｈu ＩＧＦ−１プラスミドを、２００μ
lの１×ＢamＨＩ緩衝液中、５０Ｕ ＢamＨＩおよび５０
Ｕ Ｐvu Ｉ酵素によって、３７℃で６時間開裂させた。
ＥＤＴＡを１５mＭの濃度に加えた後、反応混合物を６
％ポリアクリルアミド平板ゲル上でクロマトグラフィー
した。小さい方のＰvu Ｉ−ＢamＨＩフラグメント(〜７
２５bp)を分離し、１５０μlの１×Ｓau ９６Ｉ緩衝液
(６０mＭ ＮaＣl、６mＭトリス−ＨＣl(pＨ７.４)、１
５mＭ ＭgＣl2、６mＭ２−メルカプトエタノール)中、
４０ＵのＡva ＩＩで消化した。ＥＤＴＡを１５mＭの濃
度で添加した後、得られた混合物を６％ポリアクリルア
ミド平板ゲル上でクロマトグラフィーした。小さい方の
Ｓau ９６Ｉ−ＢamＨＩフラグメント(〜８６bp)をゲル
から抽出し、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽
出し、エタノール沈澱させた。このフラグメントをライ
ゲーションに用いた。
【００７４】リンカーフラグメント２００ピコモルを、
２０μlの１×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液(７０m
Ｍトリス−ＨＣl(pＨ７.６)、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭ
ＤＴＴ、１mＭ rＡＴＰ)中、３７℃で１時間、１００Ｕ
のポリヌクレオチドキナーゼで処理した。６５℃で５分
間加熱して反応を終結させた。キナーゼ処理したリンカ
ーフラグメント１００ピコモルを、３０μlの１×Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、１４°で１２−１６時間、８
６bp Ｓau ９６Ｉ−ＢamＨＩフラグメントに結合させ
た。このライゲーション反応を、ＥＤＴＡを１５mＭの
濃度になる様に加えて終了させ、フェノール抽出し、ク
ロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。ペレ
ットを１×ＢamＨＩ緩衝液にとり、５０ＵのＥcoＲＩお
よび５０ＵのＢamＨＩを含む反応液１００μl中、３７
℃で６時間消化した。ＥＤＴＡを加えて消化を終結さ
せ、この混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上で
クロマトグラフィーし、新たに生成した(〜９７bp)Ｅco
ＲＩ−ＢamＨＩフラグメントをゲルから抽出し、ライゲ
ーションに備えた。この新しいフラグメントを受け入れ
るベクターは、２００μlの１×ＢamＨＩ緩衝液中、３
０μgのpＢＲ３２２ＨuＩＧＦ−１を、それぞれ１００
ＵのＥcoＲＩおよびＢamＨＩによって、３７℃で８時間
消化することによって調製した。反応を終了させ、６％
ポリアクリルアミド平板ゲル上でクロマトグラフィー
し、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化プラスミドに相当する大き
い方の帯(〜３８３０bp)を分離し、このプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、ライゲーションに備えた。ベクターに対し
て挿入フラグメント１０倍モル過剰量を含む３０μlの
ライゲーション反応物中、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメ
ントを、上記の標準的なライゲーション条件下で、Ｅco
ＲＩ−ＢamＨＩ消化プラスミドpＢＲ３２２Ｈu ＩＧＦ
−１に結合させた。既述した様にして(文献３)調製した
コンピテントＥ.coli２９４を形質転換用宿主として使
用し、形質転換した細胞をＬＢ−アンピシリン寒天平板
上に植えた。数個の形質転換体を拾い上げ、既述した如
く(文献４)ミニスクリーニングし、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ
挿入を示す２個を多量に増殖させ、それらのプラスミド
を精製した。Ｍaxam−Ｇilbert法(文献５)を使って構成
物の配列を決定し、ＥcoＲＩ−Ｓau ９６Ｉコラーゲナ
ーゼリンカーの合成および挿入を証明した。このプラス
ミドはpＢＲ３２２Ｈu Ｓyn ＩＧＦ−１−Ｍと命名し
た。
【００７５】pＮＣＶおよびpＮＣＶsＬＥに挿入するた
めのこのＥcoＲＩ−Ｓal Ｉ ＩＧＦ−１暗号配列を調製
するために、３０μgのpＢＲ３２２Ｈu Ｓyn ＩＧＦ−
１−Ｍを２００μlの１×Ｓal Ｉ緩衝液(１５０mＭ Ｎa
Ｃl、６mＭトリス−ＨＣl(pＨ７.９)、６mＭ ＭgＣl2、
６mＭ２−メルカプトエタノール)中、７０ＵのＳalＩを
用いて、３７℃で６時間消化した。ＥＤＴＡを１５mＭ
になる様に添加した後、この混合物をフェノール抽出
し、クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させ
た。
【００７６】標準的な化学合成法(文献２)により、Ｓal
Ｉ−ＥcoＲＩリンカー: ５' ＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＴＧ ３' ３' ＧＣＡＴＧＴＡＣＴＴＡＡ ５' を合成し、４００ピコモルを既述した様にキナーゼ処理
した。２００ピコモルのキナーゼ処理リンカーを、３０
μlの１×ライゲーション緩衝液中、８００ＵのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、Ｓal Ｉ消化pＢＲ３２２Ｈu Ｓ
yn ＩＧＦ−１−Ｍ(既述した様に調製)に、１４℃で１
２−１６時間反応させて結合した。
【００７７】ＥＤＴＡで反応を終結した後、混合物をフ
ェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、エタノー
ル沈澱させた。ペレットを１×ＥcoＲＩ緩衝液にとり、
容量２００μl中の１００Ｕ ＥcoＲＩで、３７℃で８時
間消化した。ＥＤＴＡを１５mＭの濃度で加えた後、こ
の混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上でクロマ
トグラフィーした。このゲルを染色し、ＥcoＲＩ−Ｅco
ＲＩ Ｈu ＩＧＦ−１フラグメントに相当する〜２３０b
p帯をゲルから抽出し、フェノール抽出し、クロロホル
ムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメ
ントはpＮＣＶおよびpＮＣＶsＬＥにライゲーションし
得るものであった。pＮＣＶおよびpＮＣＶsＬＥは、２
００μlの１×ＥcoＲＩ緩衝液中、それぞれ２０μgを、
１００ＵのＥcoＲＩを用いて、３７℃で８時間消化して
ライゲーションに備えた。消化後、細菌性アルカリホス
ファターゼ２００Ｕを各反応物に加え、その混合物を６
５℃で２時間加温した。ＥＤＴＡを１５mＭの濃度とな
る様に添加し、混合物を３回フェノール抽出し、クロロ
ホルムで２回抽出し、次いでエタノール沈澱させた。こ
れらの発現ベクターをライゲーション用に調製した。
【００７８】ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩヒトＩＧＦ−１フラグ
メントのこの２つの発現ベクターへの結合(ライゲーシ
ョン)は、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液と８００Ｕの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの３０μl反応液中、１４℃で１２
〜１６時間行なった。ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメント
は、ベクターに対して１０倍モル過剰量存在せしめた。
【００７９】コンピテントＥ.coli２９４を調製し(文献
３)(ＡＴＣＣ３１４４６)、ライゲーションのための形
質転換宿主として用いた。形質転換細胞をテトラサイク
リン含有ＬＢ−寒天平板(５μg／ml、ＬＢ−Ｔet−平
板)上に植え、形質転換体をミニスクリーニングした(文
献４)。pＮＣＶ−ＩＧＦ−１構成物の形質転換体からの
ミニスクリーンプラスミドＤＮＡを、Ｐst ＩおよびＢg
l ＩＩの両者で消化し、ＥcoＲＩフラグメント挿入の配
向性を調べた。そのプラスミドが〜５７０bpＢgl ＩＩ
−Ｐst Ｉフラグメント(〜６９０bpフラグメントと対照
的に)を含んでいる２つのクローンを多量に増殖させ、
それらのプラスミドを調製した。この構成物の配列をＭ
axam−Ｇilbert法(文献５)により測定し、trp融合とＩ
ＧＦ−１蛋白質暗号配列の接合部での正しい挿入および
所望の読み取り枠の保持を確認した。正しく挿入された
ＩＧＦ−１フラグメントを持ったプラスミドはpＮＣＶ
ＬＥ−ＩＧＦ−１と命名された。pＮＣＶ−sＬＥ−ＩＧ
Ｆ−１構成物の形質転換体も同じ方法(文献５)でミニス
クリーニングし、このプラスミドＤＮＡをＨincＩＩお
よびＰst Ｉで消化した。〜１５０bp ＨincＩＩ−Ｐst
Ｉフラグメント(〜１０５bp ＨincＩＩ−ＨincＩＩフラ
グメントと対照的に)を示す２つのクローンを多量に増
殖させ、それらのプラスミドを調製した。Ｍaxam−Ｇil
bert技術(文献５)を使って、trp融合およびＩＧＦ−１
蛋白質暗号配列の機能を配列化し、適切な配向性および
適当な読み取り枠の保持を確認した。この正しい挿入お
よび適切な読み取り枠を持ったプラスミドは、pＮＣＶ
−sＬＥ−ＩＧＦ−１と命名した。
【００８０】これらの構成物のそれぞれを発現させるた
めに、２つのクローン、即ち、一方はpＮＣＶ−ＩＧＦ
−１、他方はpＮＣＶ−sＬＥ−ＩＧＦ−１を持つもの、
を０.５mg／mlのトリプトファンを補充した１０mlのＭ
９−テトラサイクリン培養培地に接種した。ＩＧＦ−１
遺伝子挿入物を持たないpＮＣＶ−ＬＥ含有クローン
も、アッセイに於けるネガティブ対照とするために、培
養培地に接種した。かきまぜながら３７℃で１２−１６
時間増殖させた後、これらの培地０.５mlを使ってＭ９
−テトラサイクリン培養培地２５０mlに接種した。かき
まぜ下に３７℃で１２〜１６時間増殖させた後、Ｓorva
ll ＧＳＡローターを用い、５０００rpmで１０分間遠
心分離して細胞を収穫した。屈折体(refractile bodie
s)を、a) 宿主蛋白質のほとんどを溶解するのに適した
イオン強度の緩衝溶液に宿主細胞を懸濁させ、b) この
懸濁液を細胞壁／膜分裂にかけ、c) この分裂懸濁液を
低速で遠心分離してペレットを形成させ、所望により、
先の工程を繰り返し、そしてd) ペレットに屈折体とし
てヘテロローガス(異種)蛋白質を回収する(文献１３)。
３つの標品のそれぞれの屈折性粒子少量を、ＳＤＳおよ
び２−メルカプトエタノール含有試料緩衝液中で煮沸
し、Ｌaemmliの方法(文献１４)に従ってＳＤＳ−ポリア
クリルアミド平板ゲル上で泳動させた。pＮＣＶ−ＩＧ
Ｆ−１(ＬＥ−ＩＧＦ−１)によって発現された蛋白質の
サイズは〜２８,６７０ダルトン(図７）であり、ｐＮＣ
Ｖ−sＬＥ−ＩＧＦ−１蛋白質(sＬＥ−ＩＧＦ−１)につ
いては〜９７７０ダルトンであった(図８)。これらの２
つの発現された蛋白質を６Ｍグアニジン−ＨＣlに溶解
させ、希釈緩衝液で５０倍に希釈した。希釈後のpＮＣ
Ｖ−ＩＧＦ−１のための最終緩衝液は０.１２Ｍグアニ
ジン−ＨＣl、.０５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ８)、２０％グ
リセリン、０.１mg／mlＢＳＡ、.１５Ｍ ＮaＣl、０.１
mＭ ＥＤＴＡであり、pＮＣＶ−sＬＥ−ＩＧＦ−１屈折
体の希釈後の最終緩衝液は０.１４Ｍグアニジン−ＨＣ
l、２５mＭトリスーＨＣl(pＨ７.６)、１０mＭＣaＣl2
であった。個々の粒子物質を引き延ばした後、溶解した
trp−ＩＧＦ−１融合蛋白質を含む２つの溶液を、Ｈint
zらにより改良された(文献２４)Ｆurlanettoらの放射免
疫アッセイ法(文献２３)により分析した。融合蛋白質は
両者共、この分析で活性を示した。ネガティブ対照標品
もこの分析にかけたが、測定可能な活性は示さなかっ
た。
【００８１】酵母で発現および分泌 細菌細胞溶解物(lysates)から、屈折体の精製および溶
解の必要性を避けるために、その代りとして酵母の発現
−分泌系を研究した。細胞溶解物からの蛋白質純化が避
けられる利点の他に、カップリングした発現−分泌系
は、融合蛋白質を除去するための、その後のインビトロ
に於ける加工工程を避けることができる。３種の酵母発
現−分泌系を利用することができる: 即ち１) 酵母α因
子(文献２２)、これは酵母のα−因子プロモーターおよ
びプレプロ配列を使う、２) インベルターゼプロモータ
ーおよび信号配列からなる酵母インベルターゼ(文献１
６)、および３) ＰＧＫプロモーター(文献２５)および
インベルターゼ信号(文献１６)からなるハイブリッド。
【００８２】酵母α−因子プロモータープレ−α因子Ｉ
ＧＦ−１プラスミドの組み立て α因子プロモーターおよびプレプロ配列を使ってＩＧＦ
−１を発現させる為に、Ｓingh(文献２２)によって組み
立てられたプラスミドを使用した。プラスミドＰ６５
(図９参照)は、α−因子プロモーターの配列、α−因子
プレプロ配列、酵母２ミクロンターミネーター、酵母Ｔ
rp１遺伝子およびpＢＲ３２２プラスミドの部分を持っ
ている。α−因子プレプロ配列中の、ＩＧＦ−１暗号配
列を挿入するのに好都合な制限部位が死んでいるので、
pＮＣＶおよびpＮＣＶsＬＥに結合させた(細菌での組み
たてについて既述した様に)同一の〜２３０bp ＥcoＲＩ
−ＥcoＲＩ Ｈu Ｓyn ＩＧＦ−１−Ｍフラグメントを
使用した。このＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメントは、コ
ラゲナーゼ認識部位プロリン−アラニン−グリシン−プ
ロリンを含んでおり、もしＩＧＦ−１が融合蛋白質とし
て分泌されたら、コラゲナーゼで消化することができ
る。この組み立て(図１０参照)で発現される蛋白質は、
ＩＧＦ−１に融合したプレプロα−因子蛋白質からな
る。
【００８３】〜２３０bp ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメ
ントを挿入するために、プラスミドＰ６５を、１×Ｅco
ＲＩ緩衝液中ＥcoＲＩで部分消化し、０.７％水平アガ
ロースゲル上でサイズ化した。直線状の単独の制限プラ
スミドに相当する帯を切り取り、ゲルから溶出させ、フ
ェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、エタノー
ル沈澱させた。このＤＮＡペレットを５０mＭのトリス
−ＨＣl(pＨ８)にとり、５'突出末端の１００％脱燐酸
化を確実にするための条件下で、細菌性アルカリホスフ
ァターゼで処理した。この処理の後、ホスファターゼ活
性を、先づＥＤＴＡを１５mＭの濃度になる様に加えて
除去し、次いでＤＮＡをフェノールで３回抽出し、クロ
ロホルムで２回抽出し、ベクターをエタノール沈澱させ
た。この物質は線状化Ｐ６５ベクターを含んでおり、２
つの部位のいずれかで、ＥcoＲＩにより消化した: 即
ち、１つは、α−因子プロモーターおよびプレプロ配列
の上流のＥcoＲＩ部位、もう１つは、α−因子プロモー
ターおよびプレプロ配列のすぐ下流のＥcoＲＩ部位であ
る。この〜２３０bp ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ ＩＧＦ−１フ
ラグメントをこのベクターに結合させた。所望の挿入場
所は、α−因子プロモーターおよびプレプロ配列からす
ぐ下流のＥcoＲＩ部位であった。
【００８４】結合は、標準的なライゲーション条件下で
行なわれ、形質転換宿主はＤagertおよびＥhrlich(文献
３)の方法に従って調製されたコンピテントＥ.coli２９
４であった。形質転換細胞をＬＢ−Ａmp−寒天平板に植
えた。ＢirnboimおよびＤoly(文献４)の方法に従って数
個の形質転換体をミニスクリーニングし、この様にして
調製されたプラスミドＤＮＡを適当な緩衝液中、Ｓal
ＩおよびＨind ＩＩＩの両者で消化した。〜１１０bp
ＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩフラグメントを持ったプラスミ
ドを含んでいる数個のクローンの１つを多量に増殖さ
せ、そのプラスミドを精製した。このプラスミド、ＹＥ
p９Ｔα−因子ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ ＩＧＦ−１(図１１)
を使って、Ｈinnenら(文献１７)およびＢeggsら(文献１
８)の方法のＨitzemanの改良法(文献１９)に従い、コン
ピテント酵母株２０Ｂ−１２(αtrp pep４)細胞を形質
転換した。
【００８５】この様な２つの形質転換体、およびネガテ
ィブ対照形質転換体(プラスミド中にＩＧＦ−１挿入体
を持たない)を、酵母プレ−インベルターゼ−ＩＧＦ−
１プラスミド形質転換のそれらの様に、懸濁液中で増殖
させた。上清を、分泌されたＩＧＦ−１活性について試
験し、Ｈintzらにより改良(文献２４)されたＦurlanett
oら(文献２３)の放射免疫アッセイ法により測定した。
ＩＧＦ−１挿入物を持ったプラスミドを含んでいる形質
転換体の両上清はＩＧＦ−１活性を示し、ネガティブ対
照の上清は活性を示さなかった。これらの形質転換体の
１つを１０ lの発酵器中で多量に増殖させた。この上清
は、最高レベル〜３μg／mlの分泌されたＩＧＦ−１活
性を含んでいた。発酵上清のＩＧＦ−１活性はまた、Ｈ
ornerら(文献２６)によって開発された胎盤膜放射受容
体測定法によっても明らかにされた。
【００８６】酵母インベルターゼプロモーター信号ＩＧ
Ｆ−１プラスミドの組み立て 酵母中でヘテロローガス信号配列を持った蛋白質が正し
く加工(プロセシング)および分泌されるという証拠(文
献１６)に基づき、酵母インベルターゼ発現−分泌系が
重要となって来た。最初の試みは、転写の開始点として
インベルターゼプロモーターを使用し、ＩＧＦ−１の加
工および分泌を含む、ＩＧＦ−１に融合した酵母インベ
ルターゼ信号蛋白質の発現であった。
【００８７】開始ＡＴＧコドンおよび信号ＤＮＡ配列の
５'末端を含んでいるＮcoI−ＨindＩＩＩ(〜４００bp)
フラグメントおよび標準的手法により合成した４つのＤ
ＮＡフラグメントを使って、酵母インベルターゼ信号暗
号配列をＩＧＦ−１遺伝子に結合させた: ５' ＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＣ ３' ３' ＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＡ ５' ５' ＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧ ３' ３' ＡＡＣＧＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧ ５'
【００８８】この組み立ては、Ｐvu−ＢamＨＩ消化pＢ
Ｒ３２２−Ｈu Ｓyn ＩＧＦ−１から分離した〜７３０b
p Ｐvu Ｉ−ＢamＨＩフラグメントのＡva ＩＩ消化によ
る９０bp Ａva ＩＩ−ＢamＨＩ ＩＧＦ−１ 左半分フラ
グメントの分離から開始した。
【００８９】標準的なキネーション(Ｋination)条件
で、４つの合成ＤＮＡフラグメントの全てを燐酸化した
後、この４つの合成フラグメントをＡva ＩＩ−ＢamＨ
Ｉ ＩＧＦ−１左半分フラグメントと混合し、標準的な
ライゲーション条件下で結合させた。リガーゼをフェノ
ールおよびクロロホルム抽出(２回)によって不活性化し
た後、エタノール沈澱させたＤＮＡペレットを溶解し、
適当な緩衝液中、Ｈind ＩＩＩおよびＢamＨＩで消化し
た。新たに組み立てられたＨind ＩＩＩ−ＢamＨＩ(約
１４０bp)フラグメントを分離し、６％ポリアクリルア
ミドゲルから抽出した。この物質をＨind ＩＩＩ−Ｂam
ＨＩ消化pＢＲ３２２ベクターに結合させた(これは、先
づ、適当な緩衝液中、Ｈind ＩＩＩで消化し、次いでＢ
amＨＩで消化し、６％ゲルから４０１４bpベクターフラ
グメントを精製したものである)。
【００９０】形質転換宿主は、標準的手法(文献３)によ
り調製したコンピテントＥ.coli２９４であり、形質転
換細胞はＬＢ−アンピシリン寒天プレート上に植えつけ
た。Ｂirnboim−Ｄoly法(文献４)により数個の形質転換
体をミニスクリーニングし、それらのプラスミドＤＮＡ
をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化した。〜１６７bpＥco
ＲＩ−ＢamＨＩフラグメントを含んでいる２つのプラス
ミド(Ｈind ＩＩＩおよびＢamＨＩ部位への１４０bp フ
ラグメントの挿入を示している)を多量に増殖させ、そ
れらのプラスミドを調製した。Ｍaxam−Ｇilbertの配列
決定法(文献５)を使って、ＤＮＡの全４３bp Ｈind Ｉ
ＩＩ−Ａva ＩＩ部分の配列を決定し、化学合成の正し
いこと、および組み立ての正しいことを確認した。この
正しく組み立てられたプラスミドは、pＢＲ３２２−Ｐ
−Ｉ−Ｈu Ｓyn ＩＧＦ ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ(〜４１
５４bp)と命名された。
【００９１】ＩＧＦ−１遺伝子の右半分を挿入するため
に、この新たに調製したプラスミドを適当な緩衝液中、
ＢamＨＩ−Ｓal Ｉで消化し、大きい方のフラグメント
(〜３８７９bp)をゲル分画により精製した。pＢＲ３２
２Ｈu Ｓyn ＩＧＦを適当な緩衝液中ＢamＨＩ−Ｓal Ｉ
で消化し、ＩＧＦ−１の右半分に相当する１１５bp Ｂa
mＨＩ−Ｓal Ｉフラグメントをゲル分画により分離し
た。この１１５bp ＢamＨＩ−Ｓal Ｉ ＩＧＦ−１右半
分フラグメントを、標準的なライゲーション条件下でＢ
amＨＩ−Ｓal Ｉ消化pＢＲ３２２−Ｐ−Ｉ−ＩＧＦ−１
ＬＨ Ｈind ＩＩＩ−ＢamＨＩベクターに結合させた。
ＤagertおよびＥhrlichの方法(文献３)に従って調製し
たコンピテントＥ.coli株２９４を形質転換宿主として
使用し、形質転換した細胞をＬＢ−Ａmp−寒天平板に植
えつけた。標準的手法(文献４)によって数個の形質転換
体をミニスクリーニングし、この様にして調製したプラ
スミドＤＮＡを適当な緩衝液中ＥcoＲＩおよびＳal Ｉ
で消化した。ＩＧＦ−１の右半分に相当するＢamＨＩ−
Ｓal Ｉフラグメントの挿入を示すプラスミドを、pＢＲ
３２２ Ｐ−Ｉ−Ｈu Ｓyn ＩＧＦ−１ Ｈind ＩＩＩ−
Ｓal Ｉプラスミドと命名した。pＢＲ３２２ Ｐ−Ｉ−
ＩＧＦ−１ Ｈind ＩＩＩ−Ｓal Ｉプラスミドを含有し
ているクローンの１つを多量に増殖させ、そのプラスミ
ドを分離した。このプラスミドを適当な緩衝液中、Ｈin
d ＩＩＩおよびＳal Ｉで消化し、ＩＧＦ−１遺伝子の
全てと酵母インベルターゼ信号暗号配列の３'部分を含
んでいる２５５bp Ｈind ＩＩＩ−Ｓal Ｉフラグメント
を調製した。このＤＮＡフラグメントをポリアクリルア
ミドゲル分画によって分離し、標準的手法によるライゲ
ーションに備えた。
【００９２】酵母インベルターゼプロモーターと共に、
インベルターゼ信号を暗号化しているＤＮＡ配列の５'
末端を含有している(〜４００bp)ＮcoＩ−Ｈind ＩＩＩ
フラグメントを、適当な緩衝液中、プラスミドＹＩpsp
−ＬeＩＦＡ(文献１６)のＮcoＩおよびＨind ＩＩＩ消
化により調製した。先づ、このＹＩpsp−ＬeＩＦＡプラ
スミドをＮcoＩで完全に消化し、次いでフェノール抽
出、クロロホルム抽出(２回)し、エタノール沈澱させ
た。この直線化した分子を１×Ｈind ＩＩＩ緩衝液にと
り、部分的に消化して、内部Ｈind ＩＩＩ制限部位を含
んでいる必要なＮcoＩ−Ｈind ＩＩＩ(〜４００bp)フラ
グメントを生成させた。このＮcoＩ−ＨindＩＩＩフラ
グメントをゲル分画により分離し、標準的手法によるラ
イゲーションに備えた。
【００９３】ベクターを得るために、プラスミドpＵＣ
１２−ＹＩ(ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ)(文献１６)を、ＮcoＩ
およびＳal Ｉを用い、適当な緩衝液中で消化した。ゲ
ル分画による精製後、ゲルから〜２.６kbpのベクターを
分離し、標準的手法によるライゲーションに備えた。最
後の組み立てを行なうために、標準的なライゲーション
技術を使ってスリー・パート・ライゲーションを行なっ
た。この結合に使用したＤＮＡは、ＮcoＩ−Ｓal Ｉ−
消化pＵＣ１２−ＹＩ(ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ)(文献１
６)、〜４００bp ＮcoＩ−Ｈind ＩＩＩおよび〜２５５
bp Ｈind ＩＩＩ−Ｓal Ｉフラグメントである。ライゲ
ーションの後、その物質をＤagertら(文献３)の方法に
従って調製したコンピテントＥ.coli２９４細胞に導入
した。形質転換細胞をＬＢ−Ａmp−寒天平板上に置き、
ＢirnboimおよびＤolyの方法(文献４)を使って数個の形
質転換体をミニスクリーニングした。この様にして調製
したプラスミドＤＮＡを、適当な緩衝液中、ＮcoＩおよ
びＳal Ｉで消化し、〜６２５bpＮcoＩ−Ｓal ＩＤＮＡ
フラグメントの挿入を示すプラスミドを含有している数
個のクローンの１つを多量に増殖させ、そのプラスミド
を精製した。
【００９４】最終工程として、このプラスミドを、適当
な緩衝液中、Ｓal Ｉで消化して線状化した。既述した
様にして調製し、標準的なキネーション条件下でキナー
ゼ処理したＳal Ｉ−ＥcoＲＩリンカーを、標準的なラ
イゲーション条件を使って、この線状化したベクターに
結合させ、Ｓal Ｉ末端をＥcoＲＩ末端に変換した。Ｅ
ＤＴＡ１５mＭを加えてライゲーション反応を終結さ
せ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し(２回)、エ
タノール沈澱させ、ＤＮＡペレットを１×ＥcoＲＩ緩衝
液に溶解し、ＥcoＲＩで消化した。このＥcoＲＩ消化に
より、酵母インベルターゼプロモーター、酵母インベル
ターゼ信号暗号配列およびＩＧＦ−１暗号配列を１つの
連続した配列として含んでいる〜１１５０bp ＥcoＲＩ
フラグメントが遊離した。この物質を分画後６％ポリア
クリルアミド平板ゲルから〜１１５０bp 帯として分離
し、標準的手法により、ライゲーション用に調製した。
【００９５】このＥcoＲＩフラグメントを受け入れるた
めの酵母−Ｅ.coliシャトルベクターを、プラスミドＹ
Ｅp９Ｔ(文献１６)をＥcoＲＩ消化してベクターを線状
化し、そのＥcoＲＩ末端を、製造業者によって指示され
ている条件下で細菌性アルカリホスファターゼで処理し
て５'突出末端を１００％脱燐酸化することにより調製
した。このホスファターゼ反応を、ＥＤＴＡ１５mＭを
添加して終了させ、この混合物をフェノール抽出し(３
回)、クロロホルム抽出し(２回)、次いでＤＮＡをエタ
ノール沈澱させた。このＤＮＡペレットを１×ライゲー
ション緩衝液に再溶解し、ベクターをＥcoＲＩ〜１１５
０bp フラグメントと混合し、標準的なライゲーション
条件下で結合させた。Ｄagertらの方法(文献３)で調製
したコンピテントＥ.coli２９４細胞を形質転換宿主と
して使用し、この形質転換体をＬＢ−Ａmp−寒天平板上
に植えつけた。挿入の配向を決めるために、Ｂirnboim
およびＤoly(文献４)の方法を使って数個の形質転換体
をミニスクリーニングし、この様にして精製したプラス
ミドＤＮＡを適当な緩衝液中ＢamＨＩで消化した。Ｂam
ＨＩ消化によって１.３kb ＢamＨＩ−ＢamＨＩフラグメ
ント(〜４７５bpフラグメントとは反対)を生成するプラ
スミドを含有している数個の形質転換体の１つを多量に
増殖させ、そのプラスミドを精製した。このプラスミド
をＰ.Ｉ.ＩＧＦ−１ ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ Ｐ.Ｉ.プロモ
ーターと命名し、これを使って、Ｈitzeman(文献１９)
により改良されたＨinnen,Ａ.ら(文献１７)およびＢegg
s,Ｊ.Ｄ.(文献１８)の方法に従って調製したコンピテン
ト酵母細胞を形質転換した。酵母株２０Ｂ−１２(αtrp
１ pep４)を使用したが、これはＹeast Ｇenetics Ｓ
tock Ｃenterから入手した。この組み立てに於いて、
ＩＧＦ−１の発現は、インベルターゼプロモーターに於
ける転写で開始し、酵母２ミクロン配列で終了する。こ
の組み立てによって発現される融合蛋白質は、ＩＧＦ−
１蛋白質と融合した酵母インベルターゼ信号からなって
おり、この合計の分子量は９９６４ダルトンであった。
逆配向に挿入されたＥcoＲＩフラグメントを持ったもう
１つのプラスミドも、コンピテント酵母細胞の形質転換
に使用した。この組み立てでは、ＩＧＦ−１は酵母ター
ミネーター(終了暗号)と共に供給されなかった。
【００９６】数個の形質転換体を選択し、ＹＮＢ−ＣＡ
Ａ寒天平板に塗沫した。これらの内、３つの形質転換体
を選び、振盪フラスコ中のＹＮＢ−ＣＡＡ増殖培地１０
mlに接種した。同じベクターであるが、ＥcoＲＩフラグ
メントが逆配向で挿入されているベクターで形質転換さ
れたコロニーを使って４つ目の培養も行なった。３０℃
で１６−２０時間増殖させた後、培養液をサンプリング
し(１ml)、エッペンドルフ・マイクロフュージ内で５分
間回転させて細胞を除いた。上清を、Ｆurlanettoら(文
献２３)の方法であってＨintzら(文献２４)により改良
された放射免疫分析法により、分泌された活性について
測定した。３つの形質転換体の上清は、１.７〜３.３mg
／mlのＩＧＦ−１活性を示したが、ネガティブ対照は活
性を示さなかった。細胞内活性を調べるために、培養液
１mlからのペレットを２５mＭトリス−ＨＣl(pＨ７.６)
中、１mＭ ＥＤＴＡで洗浄し、０.４mlのガラスビーズ
を含む上記のトリス−ＥＤＴＡ溶液０.５ml中で３〜４
分、激しくうず巻き回転させて溶菌させた。
【００９７】この細胞溶解物を分析した結果、３つのＩ
ＧＦ−１分泌形質転換体では１.５〜２.８ng／mlの活性
を示したが、ネガティブ対照の形質転換体は活性を示さ
なかった。この３つの形質転換体の最も分泌能の高いも
のを５ l の発酵容器内で増殖させた。分泌されたＩＧ
Ｆ−１活性は、最高７４ng／ml(上清)に達した。
【００９８】酵母ＰＧＫプロモータープレ−インベルタ
ーゼＩＧＦ−１プラスミドの組み立て インベルターゼプロモーターを使用する上での１つの問
題点は、それがグルコースの存在下で抑制されるという
ことであった。インベルターゼプロモーターでの高レベ
ルの転写開始にグルコースが不適合であるため、グルコ
ースは発酵過程の主要な炭素源であるので、それに代る
プロモーターとしてＰＧＫプロモーターがさがし求めら
れた。
【００９９】ＰＧＫプロモーターＰ.Ｉ.ＩＧＦ−１組立
て物を組み立てるため、全インベルターゼ信号暗号配列
を含んでいるフラグメントをクローンすることが必要で
あった。これを行なうため、プラスミドpＬeＩＦ−Ａ−
インベルターゼ信号(文献１６)を適当な緩衝液中、Ｂgl
ＩＩ、ついでＢamＨＩで消化した。この消化によって数
個のフラグメントが遊離したが、その内の１個は〜６２
５bp ＢglＩＩ−ＢamＨＩフラグメントであり、これを
６％ポリアクリルアミド平板ゲルから分離し、常法に従
ってライゲーションに備えた。このフラグメントをクロ
ーンするため、pＵＣ８ベクター(文献２０)をクローニ
ングビヒクルとして選んだ。pＵＣ８プラスミドを１×
ＢamＨＩ緩衝液中、ＢamＨＩで消化し、細菌性アルカリ
ホスファターゼで処理して５'末端を脱燐酸化し、５％
ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動させて分離した。
【０１００】ライゲーションのための標準的な調製を行
なった後、ＢamＨＩ消化ベクターを上記の〜６２５bp
ＢglＩＩ−ＢamＨＩフラグメントと混合し、通常のライ
ゲーション条件下で結合させた。この混合物を、Ｄeger
tらの方法(文献３)によって調製したコンピテントＥ.co
li２９４に導入し、この形質転換培養をＬＢ−Ａmp−寒
天平板上に植えた。数個の形質転換体を選択し、Ｂirnb
oimおよびＤolyの方法(文献４)を使ってミニスクリーニ
ングした。ミニスクリーンプラスミドＤＮＡをＥcoＲＩ
で消化し、消化物をゲル上で分析した所、長さ〜２６０
bp または〜３８５bp のＥcoＲＩフラグメントを持った
２つのタイプのプラスミドが生成していた。〜２６０bp
ＥcoＲＩフラグメントを含んでいる１つのクローンを
多量に増殖させ、そのプラスミドを精製した。このプラ
スミドをpＵＣ８Ｐ.Ｉ.プロモーターシグナルＢglＩＩ
−ＢamＨＩと命名した。
【０１０１】このタイプのクローンは、挿入されたＢgl
ＩＩ−ＢamＨＩフラグメントが所望の配向を有するが故
に選択した。このプラスミドから必要なものは、ＡＴＧ
開始コドンおよびインベルターゼ信号暗号配列の５'末
端を含んでいる〜２０bp ＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩフラ
グメントであった。完全なインベルターゼ信号暗号化Ｄ
ＮＡ配列を組み立てる為に、ＩＧＦ−１遺伝子の左半分
に融合した信号配列の３'末端を含有している〜１５０b
p Ｈind ＩＩＩ−ＢamＨＩフラグメントを、プラスミド
pＢＲ３２２Ｐ.Ｉ.ＩＧＦ−ＬＨ Ｈind ＩＩＩ−ＢamＨ
Ｉ(〜４１５４bp)のＨind ＩＩＩ−ＢamＨＩ消化物から
分離した。ポリアクリルアミド平板ゲル分画によって分
離を行ない、〜１５０bp フラグメントに相当するＤＮ
Ａ帯を切り取り、標準的手法に従ってライゲーション用
に調製した。
【０１０２】短かい(〜２０bp)ＥcoＲＩ−Ｈind ＩＩＩ
フラグメントを得るために、プラスミドpＵＣ８Ｐ.Ｉ.
プロモーターシグナル−ＢglＩＩ−ＢamＨＩを１×Ｅco
ＲＩ緩衝液中、ＥcoＲＩで消化した。この消化により〜
２６０bp ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフラグメントが遊離し
た。これは、消化混合物を分画した後、６％ポリアクリ
ルアミド平板ゲルから分離した。この〜２６０bp フラ
グメントを適当な緩衝液中、Ｈind ＩＩＩで消化し、２
つのＨind ＩＩＩ−ＥcoＲＩフラグメント、即ち、１つ
は長さ〜２０bp のもの、他方は〜２４０bp のものを調
製した。完全に消化した後、ＥＤＴＡを１５mＭ加えて
消化を終結させ、混合物全体をフェノール抽出し、クロ
ロホルム抽出し(２回)、エタノール沈澱させた。
【０１０３】pＢＲ３２２(文献１５)を適当な緩衝液
中、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩで消化し、このＥcoＲＩ−Ｂam
ＨＩ消化ベクターを５％ポリアクリルアミド平板ゲルか
ら精製してベクターを得た。標準的な方法でライゲーシ
ョン用に調製した後、このベクターを〜１５０bp Ｈind
ＩＩＩ−ＢamＨＩフラグメント(インベルターゼ信号の
３'末端＋左半分ＩＧＦ−１)、および２つのＨind ＩＩ
Ｉ−ＥcoＲＩフラグメント(インベルターゼ信号暗号配
列の５'末端を含んでいる〜２０bp フラグメント）と混
合し、この混合物全体を標準的なライゲーション条件下
で結合させた。ライゲーションのための形質転換宿主と
して、ＤａｇｅｒｔおよびＥhrlichの方法(文献３)に従
って調製したコンピテントＥ.coli２９４を使用し、こ
の形質転換細胞をＬＢ−Ａmp−寒天平板に植えつけた。
ＢirnboimおよびＤoly(文献４)の方法で数個の形質転換
体をミニスクリーニングし、精製したミニスクリーンＤ
ＮＡをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化した。〜１７０bp
ＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントを持った数個のクロ
ーンの１つを多量に増殖させ、そのプラスミドを精製し
た。このプラスミドはＩＧＦ−１の左半分に融合した完
全な酵母インベルターゼ信号暗号配列を含んでいた。こ
のプラスミドはＰ.Ｉ.ＩＧＦ−１ Ｌ.Ｈ.ＲＩ−ＢamＨ
Ｉと命名された。所望の〜１７０bp ＥcoＲＩ−ＢamＨ
Ｉフラグメントを、このプラスミドを適当な緩衝液中Ｅ
coＲＩとＢamＨＩで消化し、反応混合物を平板ゲル分画
することにより分離した。標準的手法を使って〜１７０
bp 帯のＤＮＡをライゲーション用に調整した。組み立
てを完成させる為に、ＩＧＦ−１の右半分を、プラスミ
ドＰ.Ｉ.ＩＧＦ−１ ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ−Ｐ.Ｉ.プロ
モーターを適当な緩衝液中でＥcoＲＩおよびＢamＨＩで
消化し、消化混合物をポリアクリルアミド平板ゲル分画
した後ゲル切片から溶出させることにより、〜１２０bp
ＢamＨＩ−ＥcoＲＩフラグメントとして分離した。こ
れらの２つのフラグメント、〜１７０bp ＥcoＲＩ−Ｂa
mＨＩおよび〜１２０bp ＢamＨＩ−ＥcoＲＩを、インビ
トロで、標準的なライゲーション条件下、両フラグメン
トをほぼ等モル濃度存在せしめて結合させた。このライ
ゲーション混合物にＥＤＴＡを〜１５mＭに加えて反応
を終結させ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し
(２回)、エタノール沈澱させた。ＤＮＡペレットを１×
ＥcoＲＩ緩衝液にとり、ＥcoＲＩで消化した。消化物を
６％ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動させ、〜２９
０bp (〜３４０bp および２４０bp と対照的に)で染色
するＤＮＡ帯を切り取り、標準的手法でライゲーション
用に調製した。この〜２９０bp ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩフ
ラグメントは、完全なＩＧＦ−１暗号配列に融合した全
酵母インベルターゼ信号暗号配列を含んでいた。
【０１０４】この蛋白質を発現する為には、プロモータ
ーを持った酵母ベクターを選択する必要があった。プラ
スミドＹＥp１ＰＴ Ｓmall(図１３参照)のＰＧＫプロモ
ーターを使用した。ＹＥp１ＰＴ Ｓmallは、適当な緩衝
液中、ＹＥp１ＰＴのＣlaＩおよびＰvu ＩＩ消化によ
り、ＹＥp１ＰＴ(文献２１)の誘導体として組み立て
た。ＣlaＩ５'突出末端を、製造業者のすすめる条件下
で、ＤＮＡポリメラーゼＩ(Ｋlenow)を使って平滑末端
に変えた。ＣlaＩ突出末端を平滑にした後、この線状化
ベクターの平滑末端ＣlaＩおよびＰvu ＩＩを、標準的
なライゲーション条件下、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使っ
て融合させた。得られたＹＥp１ＰＴ Ｓmallベクター
は、長さ〜５.９kbp(即ち、ＹＥp１ＰＴより〜２.７kbp
小さい)であった。ＹＥp１ＰＴと同様、ＹＥp１ＰＴ Ｓ
mallは２ミクロン起源およびターミネーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＴＲＰ１遺伝子、およびβ−ラクタマーゼ
遺伝子を含むpＢＲ３２２からの配列を持っている。
【０１０５】ＹＥp１ＰＴ Ｓmallは、〜２９０bp Ｅco
ＲＩフラグメントをそのプラスミドの唯一のＥcoＲＩ部
位に挿入することにより、ベクターとして使用した。Ｅ
coＲＩ線状化ＹＥp１ＰＴ Ｓmallベクターは、ＹＥp１
ＰＴ ＳmallをＥcoＲＩ消化し、細菌性アルカリホスフ
ァターゼ(ＢＡＰ)で処理(相補末端の再結合を防ぐため)
することにより調製した。ＢＡＰをフェノール抽出(３
回)、クロロホルム抽出(２回)により除去し、エタノー
ル沈澱させた。標準的なライゲーション条件下、〜２９
０bp ＥcoＲＩフラグメントをベクターに結合させた。
【０１０６】ＤagertおよびＥhrlich(文献３)の方法に
よって調製したコンピテントＥ.coli２９４を形質転換
宿主として使用し、この形質転換した培養をＬＢ−Ａmp
−寒天平板に植えた。ＢirnboimおよびＤolyの方法(文
献４)で数個の形質転換体をミニスクリーニングし、ミ
ニスクリーンプラスミドＤＮＡを適当な緩衝液中Ｈind
ＩＩＩで消化して挿入の配向性を調べた。〜４００bp
Ｈind ＩＩＩフラグメントを含むプラスミドを持った数
個の形質転換体の１つを多量に増殖させ、そのプラスミ
ドを精製した。このプラスミドをＹＥp１ ＳmallＰ.Ｉ.
ＩＧＦ−１ ＰＧＫプロモーター(図１４参照)と命名
し、Ｈitzemanの改良(文献１９)に係るＨinnenら(文献
１７)およびＢeggsら(文献１８)の方法により、コンピ
テント酵母株２０Ｂ−１２(ＡＴＣＣ２０６２６)(α tr
p pep４)細胞を形質転換するのに使用した。
【０１０７】Ｐ.Ｉ.ＩＧＦ−１ ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ
Ｐ.Ｉ.プロモータープラスミド形質転換の場合と同様に
して、数個の酵母形質転換体を懸濁液中で増殖させ、上
清の活性を、Ｈintzら(文献２４)の改良に係るＦurlane
ttoらの放射免疫分析法(文献２３)によって測定した。
３つの形質転換体の振盪フラスコ上清は、上清１ml当た
り３８〜５３ngの活性を含んでいた。同様にして、これ
らの形質転換体の１つを選び、１０ l の発酵容器中で
多量に増殖させた。上清中に分泌されたＩＧＦ−１活性
は、最高〜７８０ng／mlに達した。また、この発酵上清
を放射受容体測定法(文献２６)にもかけた所、ＩＧＦ−
１活性を有することがわかった。
【０１０８】成熟ヒトＩＧＦ生産 成熟ＩＧＦ−１を暗号化しているＤＮＡ配列に融合した
α−因子プレプロ蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列を
組み立てるために、Ｍ−１３インビトロ突然変異誘発技
術を用いた(Ｒeginら、Ｐroc．Ａcad．Ｓcience(ＵＳ
Ａ)７５,４２６８; Ｈutchinsonら、Ｊournal Ｂiolog
ical Ｃhem．２５３,６５５１; Ｇilliamら、Ｇene８,
８１および９９; Ｇilliamら、Ｎucleic Ａcids Ｒes
earch６,２９７３; Ａdelmanら、ＤＮＡ(Ｊune,１９８
３)参照)。
【０１０９】Ｍ−１３プラスミドを組み立てるために、
プラスミドＹＥp９Ｔα−因子ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ ＩＧ
Ｆ−１(図１６)をＢglＩＩおよびＳal Ｉで消化し、Ｉ
ＧＦ−１と融合したα−因子プロモーター信号を含有し
ている約１.５kbpフラグメントをポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により分離した。このフラグメントを、標
準的なライゲーション条件下、ＢamＨＩおよびＳal Ｉ
で消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理したＭ
Ｐ−８(ＢＲＬ)ベクターに結合させた。このライゲーシ
ョン混合物をＤagertおよびＥhrlichの方法(文献３)に
従って調製したコンピテントＪＭ１０１細胞に導入し
た。これらの形質転換体を対数期まで増殖させたコンピ
テントでないＪＭ１０１細胞と混合し、トップ寒天と混
合してＬＢ寒天平板上に置いた。数個の明確なプラーク
を選び、Ｍ−１３ジデオキシ配列化法を使って配列決定
し、ベクターのＳal Ｉ−ＢamＨＩ部位に挿入体が存在
することを確認した。
【０１１０】上記の方法で欠失を行なうため、 ５'ＡＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＣＣＴ ＣＴＴ ＴＴＡＴ
ＣＣＡＡＡＧ３' で示される配列の１本鎖を常法(文献２)に従って化学合
成し、α−因子プロモーター／信号ＩＧＦ−１融合配列
のＩＧＦ−１暗号配列の直前の ５'ＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣ
ＴＧＣＣ３' ３'ＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＧＧ
ＡＣＧＧ５' で示されるＤＮＡ配列を欠失させるのに使用した。この
欠失を含むプラスミドで接種したＪＭ１０１細胞培養か
ら、多量プラスミド調製によって、この組み立て物を複
製型として分離した。
【０１１１】分離した複製型(１０mg)をＳal Ｉで消化
した。次いでフェノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱させ、ライゲーションに備えた。この複製型に
ＳalＩ−ＥcoＲＩリンカーを結合させた。ライゲーショ
ンを行ない、フェノール、クロロホルム抽出、次いでエ
タノール沈澱させてリガーゼを不活性化した後、この物
質を標準的な条件下で〜５０Ｕ ＥcoＲＩ酵素で消化
し、６％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。放出
された約１.５kbp のＲＩ−ＥcoＲＩフラグメントをゲ
ルから分離し、標準的な方法でライゲーションに備え
た。
【０１１２】ＹＥp９Ｔプラスミド１０mgをＥcoＲＩ ５
０単位で消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理
することにより酵母ベクターを調製した。この消化物を
数回フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱させ、ライゲーションに備えた。
【０１１３】欠失を含む約１.５kbp ＥcoＲＩ−ＥcoＲ
ＩフラグメントをＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ ＹＥp９Ｔベクタ
ーと結合させ、このライゲーション混合物をＤagertお
よびＥhrlich(文献３)の方法に従って調製したコンピテ
ント２９４細胞に導入し、ＢirnboimおよびＤoly(文献
４)の方法でミニスクリーニングした。調製したＤＮＡ
をＥcoＲＩで消化してスクリーニングし、約１.５kbpフ
ラグメントの挿入を示すＤＮＡを使って、Ｈitzermanの
改良に係る(文献１９)Ｂeggsらの方法(文献１８)によ
り、コンピテント酵母株２０Ｂ−１２(ＡＴＣＣ２０６
２６)を形質転換した。
【０１１４】形質転換体を振盪フラスコ内で増殖させ、
上清を分析すると、Ｈintzらの改良にかかる(文献２４)
Ｆurlanettoらの放射免疫測定法によってＩＧＦ−Ｉ活
性の存在することがわかった。
【０１１５】これらのクローンの１つを１０ l の発酵
容器内で多量に増殖させ、この発酵の上清からＩＧＦ−
１を精製した。この物質をアミノ末端蛋白質配列決定法
にかけ、成熟ＩＧＦ−Ｉ蛋白質であることを確認した。
以上述べた方法と類似の方法を用い、本発明に従ってヒ
トＥＧＦを調製することができる。
【０１１６】ヒトＥＧＦの組み立て、発現および分泌 ＩＧＦ−１と同様にして、化学的にあるいは重合反応に
よって合成した２本鎖ＤＮＡ(図１５)を組み合せて、成
熟蛋白質のアミノ末端アスパラギンの直前のメチオニン
(ＡＴＧ)を暗号化しているコドン、アミノ末端アスパラ
ギンから２１残基のメチオニンに代ってバリンと置き換
えるコドン(ＧＴＣ)を含んでいる成熟ＥＧＦ暗号配列を
形成させた。この組み立て物を、酵母または細菌内で発
現させると融合蛋白質を生産する暗号配列に５'末端で
結合させた。この融合蛋白質はメチオニンの位置でＣＮ
Ｂrにより開発され、バリン置換ヒトＥＧＦ分子を放出
する。
【０１１７】酵母から成熟型のＥＧＦを分泌させるため
に、成熟蛋白質を暗号化している上記の配列をα−因子
プロモーター／プレプロ配列に結合させ、残基数２１の
バリンを暗号化しているコドンをＡＴＧで置き換え、適
当な欠失を行なって、成熟ＥＧＦの暗号配列をα−因子
信号暗号配列に隣接させた。この組み立て物を酵母ベク
ターＹＥp９Ｔに挿入し、酵母に導入した。この様に調
製した形質転換体は成熟ヒトＥＧＦを発現し、分泌し
た。更に、成熟ＥＧＦを暗号化している配列をプレイン
ベルターゼ信号配列(図１７)に結合させた。この組み立
て物をＰＧＫプロモーター含有酵母ベクターＹＥp１Ｐ
Ｔ smallに挿入し、酵母に導入すると、ヒトＥＧＦが発
現、分泌された。
【０１１８】ヒトＩＧＦ−ＩＩの組み立て、発現および分泌 合成ＤＮＡ配列および天然のＤＮＡ配列を組み合せて、
成熟ＩＧＦ−ＩＩを暗号化している２本鎖ＤＮＡ配列を
組み立てた(図１８)。内部メチオニンを含んでいないこ
の暗号配列をＴrpＥリーダー蛋白質暗号配列に結合さ
せ、融合蛋白質として発現させた。精製したこの融合生
成物から、この成熟蛋白質の最初の残基(アラニン)の前
のメチオニン残基にＣＮＢrを作用させることにより、
成熟ＩＧＦ−ＩＩを化学的に開裂させた。
【０１１９】このＩＧＦ−ＩＩ暗号配列をα−因子プロ
モーター／プレプロ配列に結合させ、適当な欠失を行な
ってα−因子信号暗号配列の３'末端を成熟ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ暗号配列の５'末端に隣接させた後、この組み立て物
をＹＥp９Ｔベクターに挿入し、酵母に導入した。得ら
れた形質転換体は成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩを発現し、分泌
した。同様にして、成熟ＩＧＦ−ＩＩを暗号化している
配列をプレインベルターゼ暗号配列に結合させた。得ら
れた組み立て物をＹＥp１ＰＴ smallに挿入し、酵母に
導入した。この様にして調製した形質転換体は成熟ヒト
ＩＧＦ−ＩＩを発現し、分泌した。
【０１２０】医薬製剤 ヒトＩＧＦおよびヒトＥＧＦまたは本発明の生産物は、
薬学的に許容し得る担体と混合し、既知の方法で薬学的
に有用な組成物に製剤化することができる。ヒトの他の
蛋白質、例えばヒトの血清アルブミンを包含する、好適
な担体や製剤化については、例えばＷ.Ｍartin Ｒeming
tons Ｐharmacentical Ｓciencesを参照することができ
る。
【０１２１】本明細書に於いては、好ましい態様につい
てのみ記載したが、本発明がこれらに限定されるものと
解釈してはならない。
【０１２２】以下に明細書中で引用し、記号化した文献
を列挙する。 Ａ．Ｒinderknecht,Ｅ.Ｗ.et al.,Ｐroceeding Ｎation
al Ａcademy of Ｓciences(ＵＳＡ)７３,２３６５(１９
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＩＧＦ−１のための発現ベクターの組み
立てに使用される化学合成されたＤＮＡの模式図。
【図２】 図１のＤＮＡから完成された２本鎖ＤＮＡの
模式図。
【図３】 制限酵素で切断した図２のＤＮＡのフラグメ
ントの模式図。
【図４】 図３のパーツ１およびパーツ２のpＢＲ３２
２への結合を示す模式図。
【図５】 ＩＧＦ−Ｉの右半分のパーツ３および４の模
式図。
【図６】 図５のパーツ３および４の、図４のベクター
への結合を示す模式図。
【図７】 ＤＮＡ配列および推定融合蛋白質配列を示す
模式図。
【図８】 ＤＮＡ配列および推定の短い融合蛋白質の配
列を示す模式図。
【図９】 本発明の組み立てに使用するプラスミドの模
式図。
【図１０】 α因子プレプロ配列と融合したＩＧＦ−Ｉ
のＤＮＡおよび蛋白質配列を示す模式図。
【図１１】 ＩＧＦ−Ｉと融合した、α因子プロモータ
ーおよびプレ−プロ配列を含有しているベクターの模式
図。
【図１２】 ＩＧＦ−Ｉと融合した酵母インベルターゼ
信号を示す模式図。
【図１３】 酵母ＰＧＫプロモーターを含有している親
プラスミド(ＹＥp１ＰＴ Ｓmall)の模式図。
【図１４】 ＰＧＫプロモーター、インベルターゼ信号
およびヒトＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含んでいる酵母発現ベク
ターの模式図。
【図１５】 成熟ヒトＥＧＦの暗号配列の組み立てに使
用される合成ＤＮＡの模式図。
【図１６】 ヒトＥＧＦ暗号配列と融合した酵母α因子
「プレ−プロ」配列を示す模式図。
【図１７】 ヒトＥＧＦ暗号配列と融合した酵母インベ
ルターゼ信号配列を示す模式図。
【図１８】 ヒトＩＧＦ−ＩＩの暗号配列を示す模式
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 形質転換組換え原核宿主中でヒトＩＧＦ
    を暗号化しているＤＮＡ配列を発現することができる発
    現ベクター。
  2. 【請求項２】 形質転換組換え原核宿主中でヒトＩＧＦ
    を暗号化しているＤＮＡ配列を発現することができる発
    現ベクターで形質転換された細菌宿主。
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