DE3689921T2

DE3689921T2 - Menschlicher plazentarer angiogenischer Faktor, geeignet für die Reizung der Kapillarsynthese, der Endothelzellprotease, der DNS-Synthese und der Absiedlung.

Info

Publication number: DE3689921T2
Application number: DE3689921T
Authority: DE
Inventors: David A Moscatelli; Daniel B Rifkin; Andreas Sommer
Original assignee: Synergen Inc
Current assignee: Amgen Boulder Inc
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-11
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2006-12-12
Also published as: EP0226181B1; EP0226181A3; FI93843B; IE863281L; NO873437D0; KR880700820A; AU650649B2; IL80944A; NZ218631A; DK424387A; KR960015442B1; IL80944A0; ES2056787T3; AU7629991A; DK424387D0; JPH10262668A; NO873437L; WO1987003885A1; ATE107315T1; PT83939B

Description

Angiogene Faktoren sind als Proteine definiert worden, die verschiedene Eigenschaften, nämlich die Fähigkeit, (1) die Proliferationsrate endothelialer Zellen zu erhöhen, (2) die Proteasesynthese endothelialer Zellen zu steigern, (3) die Wanderung endothelialer Zellen in Richtung der Proteinansammlung zu stimulieren und (4) eine Kapillargefäßvermehrung in vivo hervorzurufen, besitzen. Insbesondere ist beobachtet worden, daß als angiogene Faktoren klassifizierte Substanzen durch Beeinflussung der DNA-Synthese in endothelialen Zellen mitogen sein können, wodurch die Proliferationsrate endothelialer Zellen und die Rate, mit welcher neue Blutgefäße gebildet werden, erhöht wird.
Mit dieser Eigenschaft steht die Fähigkeit angiogener Faktoren, die Proteasesynthese durch endotheliale Zellen zu steigern, in wechselseitiger Beziehung. Diese Proteasen umfassen Plasminogenaktivator (PA) und Kollagenase. Insbesondere sind angiogene Faktoren fähig, die Synthese von PA und latenter Kollagenase zu stimulieren, wobei PA Zymogenplasmin in aktives Plasmin, eine Protease mit breiter Spezifität, umwandeln kann, welche wiederum latente Kollagenase in aktive Kollagenase umwandeln kann. Diese beiden Proteasen, aktives Plasmin und aktive Kollagenase, sind fähig, die meisten Proteine in umgebenden Geweben abzubauen, wodurch ein gesteigertes Eindringen verschiedener Gewebe, wie endotheliale Kapillargefäßzellen, erlaubt wird. Weiterhin sind angiogene Faktoren chemotaktisch für bestimmte Zellen, insbesondere endotheliale Kapillargefäßzellen, d. h., sie induzieren diese Zellen, in Richtung des angiogenen Faktors zu wandern.
Unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften ist postuliert worden, daß die Isolierung eines angiogenen Faktors die Entwicklung einer therapeutischen Substanz erlauben würde, welche fähig ist, die Blutversorgung zu einem Organ zu steigern. Beispielsweise würde es nach bestimmten Myocardinfarkten wünschenswert sein, die Wiederherstellung der Blutversorgung zum Herz, welche infolge des Infarkts unterbrochen worden ist, oder das Neuwachstum von Gefäßen in chronischen Verschlüssen zu stimulieren. Zusätzlich kann die Verwendung eines angiogenen Faktors die Heilung von Dekubitalgeschwüren, chirurgischen Schnitten und langsam heilenden Wunden, insbesondere bei geriatrischen und diabetischen Patienten, stimulieren. Weiterhin kann das Auftragen dieses Materials auf Verbrennungen die Heilungsrate und den Heilungsgrad verbessern. Daher ist nach einem gereinigten angiogenen Faktor, welcher für therapeutische Anwendungen bei Menschen geeignet ist, gesucht worden. Zusätzlich glauben einige Wissenschaftler, daß die Untersuchung einer Substanz, welche fähig ist, Blutgefäßwachstum zu stimulieren, zu Verfahren führen kann, durch die die Blutversorgung zu einem krebsartigen Tumor verhindert werden könnte, was zum "Aushungern" des Krebses führen könnte.
Obwohl bereits eine Klasse von Proteinen identifiziert worden war, welche als "angiogene Faktoren" bezeichnet worden sind, wurden diese Proteine primär aus nicht-humanen Quellen isoliert. Aus nicht-humanen Quellen isolierte angiogene Faktoren sind aufgrund deren möglicher Fähigkeit, ungünstige immunologische Reaktionen als Antwort auf ein Fremdprotein auszulösen, vermutlich nicht geeignet für eine Verwendung als therapeutische Agenzien für Menschen. Weiterhin ist nicht gezeigt worden, ob diese nicht-humanen Proteine einzeln die vier vorstehend erwähnten Eigenschaften eines angiogenen Faktors besitzen oder ob die beobachteten Eigenschaften Wechselwirkungen zwischen einer Kombination von Proteinen zuzuschreiben waren.
Tatsächlich sind verschiedene Proteine, für die gefunden worden ist, daß sie mitogene Eigenschaften bezüglich endothelialer Zellen besitzen, in zwei Klassen eingeteilt worden: Endothelzellenwachstumsfaktor-ähnliche Moleküle, welche von Heparin-Sepharose mit 1M NaCl eluiert werden und welche einen sauren pI besitzen und Fibroblastenwachstumsfaktorähnliche Moleküle, welche fester an Heparin-Sepharose binden und welche einen basischen pI besitzen. Zusätzlich glauben die Erfinder, daß es eine dritte Spezies angiogener Faktoren gibt, die als "Angiogenin" in kürzlich von Vallee et al. von der Harvard Medical School in Biochemistry, 1985, Bd. 24, S. 5480-5499 veröffentlichten Publikationen beschrieben sind. Angiogenin ist dadurch eine verschiedene Spezies, daß ihm mitogene Eigenschaften fehlen, während es einige Eigenschaften eines wirklichen angiogenen Faktors besitzt.
In CHEMICAL ABSTRACTS (Bd. 103, 1985, S. 109-110, Abstract Nr. 48790e) offenbaren Buki, K.G. et al. ein chemisches Lockmittel mit niedrigem Molekulargewicht für endotheliale Gefäßzellen. Dieser Faktor wurde aus Extrakten humaner Plazenta durch chromatographische Verfahren isoliert und besitzt ein MG < 400. Der Faktor ist lipophil und resistent gegenüber proteolytischen Enzymen.
In BIOLOGICAL ABSTRACTS (Bd. 77, 1984, S. 1911, Abstract Nr. 17462) offenbart H. Burgos angiogene und Wachstumsfaktoren, welche aus humanem Amnion-Chorion und Plazenta-konditionierten Medien meist als Faktor-Protein-Komplexe mit hohem MG (höher als 100.000 Dalton) durch Gelfiltration isoliert werden können und welche durch Magnesiumchlorid in Komponenten mit niedrigem MG umfassend Moleküle, welche durch Dialysemembranen mit einer Ausschlußgröße von 2.000 MG leicht diffundierbar sind, dissoziieren.
Angesichts dieser bruchstückhaften Forschungsergebnisse suchten und entdeckten die Erfinder einen humanen angiogenen Faktor, welcher als ein bFGF (FGFbasisch, PAF) klassifizierbar ist und im wesentlichen homolog zu demjenigen Faktor ist, der aus humanem Plazentagewebe isolierbar ist und als ein einzelnes Molekül die vorstehend identifizierten Eigenschaften besitzt, d. h., mitogen, chemotaktisch und sowohl fähig zur Stimulierung der Proteasesynthese als auch zum Auslösen einer Gefäßvermehrung in vivo ist. Weiterhin suchten die Erfinder nach einer Möglichkeit, diesen angiogenen Faktor in einer im wesentlichen gereinigten Form aus humanen Plazentageweben zu isolieren. Die Aminosäuresequenz dieses isolierten angiogenen Faktors ist jetzt bestimmt worden. Die Bestimmung dieser Aminosäuresequenz wird vermutlich die Identifizierung von DNA-Proben erlauben, welche verwendet werden könnten, um genomische oder cDNA-Sequenzen zu erhalten, die für rekombinante DNA-Verfahren zur Synthese angiogener Faktoren verwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft als bFGF klassifizierbare angiogene Faktoren. Insbesondere betrifft diese Erfindung einen bFGF-angiogenen Faktor, welcher im wesentlichen äquivalent zu demjenigen ist, der aus humanen Plazentageweben isolierbar ist und mitogene und chemotaktische Eigenschaften besitzt und fähig ist, Proteasesynthese zu induzieren und in vivo eine Gefäßvermehrung zu verursachen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, gereinigte Formen eines angiogenen Faktors, welcher diese Eigenschaften besitzt, bereitzustellen. Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der Aminosäuresequenz eines solchen angiogenen Faktors. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung umfaßt das Bereitstellen gereinigter Formen von bFGF, welche als pharmazeutische Präparationen von Wert sein könnten, welche mitogene und chemotaktische Eigenschaften zusammen mit der Fähigkeit, Proteasesynthese zu stimulieren, ausüben.
Zusätzliche erfindungsgemäße Aufgaben und Vorteile werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt werden und werden zum Teil aus der Beschreibung offensichtlich werden oder können aus der Durchführung der Erfindung erkannt werden. Diese Aufgaben und Vorteile können mittels der insbesondere in den beigefügten Ansprüchen ausgeführten Anleitungen und Kombinationen realisiert und erreicht werden.
Um die Aufgaben zu lösen und gemäß den erfindungsgemäßen Zwecken wird ein angiogener Faktor offenbart, welcher mindestens eine aktive Stelle besitzt, die eine Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mitogener Aktivität, chemotaktischer Aktivität, der Fähigkeit, Proteasesynthese zu stimulieren und Kombinationen davon, besitzt. Der humane oder synthetische angiogene Faktor ist als bFGF klassifizierbar und besitzt wesentliche Homologie zu dem aus humanem Plazentagewebe isolierbaren, nativen angiogenen Faktor.
Es sollte bemerkt werden, daß der Ausdruck "Protease", wie er hierin verwendet wird, aktive oder Vorläuferformen umfaßt, obwohl es bevorzugt ist, daß der angiogene Faktor selbst fähig ist, Proteasesynthese zu stimulieren. Beispiele solcher Vorläuferformen umfassen latente oder Pro- Kollagenase. Weiterhin ist es möglich, daß einige angiogene Faktoren isoliert werden können, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, jedoch nicht direkt Proteasesynthese stimulieren. Diese angiogenen Faktoren verursachen jedoch biologische Antworten, welche wiederum Proteasesynthese stimulieren. Folglich stimulieren die erfindungsgemäßen angiogenen Faktoren entweder direkt oder indirekt die Proteasesynthese.
Ein erfindungsgemäßer angiogener Faktor besitzt die folgende Stamm-Aminosäuresequenz:
Zusätzlich sind Peptide mit den Sequenzen
in dem Polypeptid außerhalb der Stammsequenz vorhanden. In den hierin dargestellten Sequenzen bedeuten offene Klammern die Gegenwart eines einzelnen Aminosäurerestes, der nicht gänzlich identifiziert ist. Ein weiterer besonders bevorzugter angiogener Faktor besitzt die folgende Sequenz:
Die durch die vorstehenden Abkürzungen repräsentierten Aminosäuren sind in der nachstehenden "Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen" dargestellt.
Zur Lösung der Aufgaben und erfindungsgemäß wird weiterhin eine im wesentlichen gereinigte Form des aus humanem Plazentagewebe isolierbaren, nativen angiogenen Faktors offenbart. Zusätzlich sind zur Lösung der Aufgaben und gemäß dem erfindungsgemäßen Zweck pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend als mindestens einen der aktiven Bestandteile einen erfindungsgemäßen angiogenen Faktor, offenbart.
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende genaue Beschreibung sind als beispielhaft und nur als Erklärung zu betrachten und beschränken die beanspruchte Erfindung nicht.
Bezug wird jetzt im Detail auf die zur Zeit bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen genommen, welche zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Wie vorstehend bemerkt, betrifft die vorliegende Erfindung einen angiogenen Faktor, welcher in gereinigter Form isoliert worden ist. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße angiogene Faktor ein Einzelkettenpolypeptid-Protein, welches im wesentlichen homolog zu, immunologisch äquivalent zu und am meisten bevorzugt biologisch äquivalent zu dem aus humanen Plazentageweben isolierbaren, nativen angiogenen Faktor ist. Mit "biologisch äquivalent", wie durch diese Beschreibung und die Ansprüche hinweg verwendet, ist gemeint, daß die erfindungsgemäße Zusammensetzung mitogene und chemotaktische Eigenschaften besitzt und fähig ist, die Proteasesynthese in derselben Weise, jedoch nicht notwendigerweise im selben Maße wie der native angiogene Faktor, zu induzieren.
"Im wesentlichen homolog", wie durch die folgende Beschreibung und die Ansprüche hinweg verwendet, bedeutet einen Homologiegrad zu dem nativen angiogenen Faktor, der über denjenigen hinausgeht, der durch irgendeine früher beschriebene, gereinigte, im wesentlichen homologe Zusammensetzung eines angiogenen Faktors erreicht wird. Vorzugsweise geht der Homologiegrad über 50%, vorzugsweise 60% und am meisten bevorzugt 75% hinaus, wobei besonders bevorzugte Proteine über 85% oder 90% homolog zu dem nativen Protein sind. Der vorstehend beschriebene Homologiegrad wird berechnet als der Anteil an Aminosäureresten, welche in der kleineren zweier Sequenzen gefunden werden, die sich mit identischen Aminosäureresten in den verglichenen Sequenzen ausrichten lassen, wenn vier Lücken auf eine Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um eine solche Ausrichtung zu ermöglichen, wie dargelegt von Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequences und Structure, Bd. 5, S. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., hierin durch Bezugnahme speziell eingeführt.
Wie hierin beschrieben, wird der erfindungsgemäße angiogene Faktor entweder aus einer humanen Quelle isoliert oder ist ein synthetisches Polypeptid. Es ist beabsichtigt, daß der Ausdruck "synthetisches" Polypeptid eine Aminosäuresequenz bedeutet, welche nicht früher in einer im wesentlichen gereinigten Form aus der Natur isoliert worden ist. Durch Anwenden dieser Definition umfaßt "synthetisch" unter anderem durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellte oder als Ganzes oder zum Teil in vitro synthetisierte Polypeptide. Insbesondere werden synthetische Polypeptide betrachtet, in welchen sich eine oder zwei Aminosäure(n) von denjenigen unterscheiden, die in den nachstehend dargestellten bevorzugten Sequenzen aufgeführt sind.
Der bevorzugte, erfindungsgemäße, angiogene Faktor ist in humanen Plazentagewebeextrakten entdeckt und erstmalig in einer gereinigten Form isoliert worden. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung soll "reine Form" oder "gereinigte Form" im wesentlichen frei von anderen Proteinen, welche keine angiogenen Faktoren sind, bedeuten, wenn diese Ausdrücke verwendet werden, um den hierin offenbarten angiogenen Faktor zu bezeichnen. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße, angiogene Faktor mindestens 50% rein, bevorzugter 70% rein und noch bevorzugter 80% oder 90% rein.
Zusätzlich ist der erfindungsgemäße, angiogene Faktor aus verschiedenen Tumor- und normalen Zellen isoliert worden. Diese umfassen SK-Hep1-Zellen, HeLa-Zellen und K562-Zellen, wie auch humane, embryonale Lungenfibroblasten.
Der erfindungsgemäße, angiogene Faktor kann in reiner Form aus humanen Plazentageweben durch das Verfahren isoliert werden, welches umfaßt: (a) Sammeln von humanen Plazentageweben; (b) Isolieren des angiogenen Faktors aus den humanen Plazentageweben durch Fraktionieren des proteinhaltigen Materials in den Geweben; (c) Identifizieren der Fraktionen, welche die Aktivität des angiogenen Faktors besitzen; und (d) Konzentrieren der Fraktionen, welche die Aktivität des angiogenen Faktors ausüben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das in den humanen Plazentageweben vorhandene proteinhaltige Material unter Verwendung einer Kombination aus Heparin- Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und wahlweise Gel-Permeations-Chromatographie fraktioniert. Der hierin diskutierte angiogene Faktor kann ebenso unter Verwendung monoclonaler Antikörper mit einer Spezifität für Plazentaproteine isoliert werden. In dieser Ausführungsform wird Antigen an eine Matrix (Harz) gebunden, welche monoclonale Antikörper gegen das Plazentaprotein enthält, und nicht-antigene Proteine werden durch Waschen des Harzes mit Puffer entfernt. Das Antigen wird danach unter Verwendung eines Puffers mit entweder hohem oder niedrigem pH oder hoher Ionenstärke oder von chaotropen Agenzien, allein oder in Kombination mit einem Temperaturwechsel, von dem Antikörper entfernt.
Auf diese Weise erhaltene Fraktionen werden auf die Gegenwart der Aktivität eines angiogenen Faktors getestet. Vorzugsweise wird dies zum Teil durch Bestimmen der Wirkung auf PA- und Kollagenasesynthese erreicht, wobei geeignete Endothelzellkulturen, vorzugsweise endotheliale Gefäßzellen aus Säugern, in der Gegenwart des angiogenen Faktors inkubiert und das Medium auflatente Kollagenase und die Zellen auf PA hin untersucht werden. Die Proteasemenge, die durch die Zellen produziert wird, welche durch den angiogenen Faktor stimuliert worden sind, kann ebenso mittels immunologischer Verfahren, wie ELISA oder RIA-Assays, oder Immunpräzipitationsverfahren bestimmt werden.
Die mitotische Eigenschaft des angiogenen Faktors wird vorzugsweise dadurch gemessen, daß geeignete Endothelzellen, vorzugsweise endotheliale Gefäßzellen aus Säugern, in Gegenwart des angiogenen Faktors und eines radioaktiv markierten Nucleotids, vorzugsweise ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridin (¹²&sup5;J- dU) inkubiert werden. Die Menge an in Trichloressigsäureunlöslichem Material eingebautem ¹²&sup5;J-dU wird danach als Hinweis auf das Ausmaß der DNA-Synthese gemessen. Die chemotaktischen Eigenschaften eines angiogenen Faktors werden vorzugsweise dadurch gezeigt, daß eine geeignete Endothelzellkultur, vorzugsweise endotheliale Gefäßzellen aus Säugern, in Gegenwart des angiogenen Faktors inkubiert werden und die Zellbeweglichkeit in einem geeigneten Gefäß, vorzugsweise einer modifizierten Boyden-Kammer, gemessen wird.
Wie vorstehend bemerkt, haben die Erfinder erfolgreich einen angiogenen Faktor aus humanen Plazentageweben in einer bisher nicht erhältlichen, gereinigten Form isoliert. Die Isolierung dieses Proteins in einer gereinigten Form war eine Voraussetzung für das korrekte Sequenzieren des Proteins und für die Entwicklung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche den angiogenen Faktor enthalten.
Ein erfindungsgemäßer, angiogener Faktor besitzt die folgende Stamm-Aminosäuresequenz:
Zusätzlich sind Peptide mit den Sequenzen
außerhalb der Stammsequenz vorhanden. Ein weiterer, besonders bevorzugter angiogener Faktor besitzt die folgende Sequenz:
Die vorstehenden Abkürzungen entsprechen den Standardabkürzungen für Aminosäurereste, wie beispielsweise in Biochemistry von A.L. Lehninger, 2. Auflage, Worth Publishers, Inc., New York (1975), S. 72 dargelegt ist.
Die Aktivität des beanspruchten angiogenen Faktors wird vermutlich nicht beeinflußt, wenn alle fünfzehn, sechzehn, siebzehn oder achtzehn N-terminalen Aminosäurereste oder Teile davon von dem intakten Polypeptid entfernt werden. Folglich ist beabsichtigt, daß alle diese verkürzten Sequenzen von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt sind. Weiterhin wird auch die Ausdehnung der Aminosäuresequenz durch die Zufügung von bis zu 110 Aminosäuren zu der N-terminalen Aminosäure des intakten Polypeptids von der Erfindung mit umfaßt.
Zufügungen von Polypeptidketten an den C- oder N-Terminus des vorliegenden angiogenen Faktors werden als unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet. Insbesondere können Polypeptidketten an beide Termini mittels Proteinfusionstechniken gebunden werden. Diese zusätzlichen Polypeptide können dazu dienen, die pharmakologische Wirksamkeit der vorliegenden angiogenen Faktoren zu verstärken. Beispielsweise kann das Polypeptid durch eine Fusion mit weiteren Polypeptiden dahingehend verbessert werden, daß es seine Aktivität in der Gegenwart eines niedrigen pH oder hoher Temperatur beibehält, oder das erzeugte Polypeptid kann eine längere Lebensdauer im Kreislauf, eine größere Resistenz gegenüber Abbau oder eine verbesserte Fähigkeit, durch Darmepithelien transportiert zu werden, besitzen.
Es sollte jedoch bemerkt werden, daß bei diesen Veränderungen die Variation hinsichtlich der Aminosäuresequenzen nicht derart sein sollte, daß sie eine ungünstige, immunologische Antwort in dem Organismus, dem der angiogene Faktor verabreicht wird, hervorruft, wenn eine solche ungünstige Reaktion nachweislich so schädlich für den Organismus sein würde, daß die durch den angiogenen Faktor erzielten Vorteile nicht gesichert wären. Die Verfahren zum Bestimmen, ob ein biologisches Molekül eine solche ungünstige immunologische Antwort hervorrufen würde, sind Durchschnittsfachleuten bekannt.
Der hierin offenbarte, erfindungsgemäße, angiogene Faktor und dessen Analoga werden für Verwendungen in der Human- und Veterinärmedizin in der Form pharmazeutischer Produkte ins Auge gefaßt, welche mitogene oder chemotaktische Eigenschaften besitzen oder zur Stimulierung der Proteasesynthese fähig sind. Es wird erwartet, daß pharmazeutische Präparationen, welche mindestens einen der vorliegenden angiogenen Faktoren als mindestens einen aktiven Bestandteil enthalten, auch geeignete, pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungs-, Füll-, Bindemittel und weitere Vehikel in Abhängigkeit von der ins Auge gefaßten Dosierungsform enthalten würden. Für eine orale Verabreichung müssen Schritte unternommen werden, um einen Abbau des aktiven Proteins im Verdauungstrakt zu verhindern. Magensaftresistente Dosierungsformen werden folglich als eine geeignete Form für eine orale Verabreichung betrachtet. Wenn eine parenterale Verabreichung gewählt wird, kann das Präparat Wasser oder eine Salzlösung oder ein weiteres pharmazeutisch annehmbares Suspensionsagens enthalten. Allgemein wird es bevorzugt sein, daß ein zu einer parenteralen Verabreichung beabsichtigtes Präparat Natriumchlorid in ausreichenden Konzentrationen enthält, um die Gesamtpräparate isotonisch zu den Körperflüssigkeiten zu machen. Es wird ebenso ins Auge gefaßt, daß pharmazeutische Präparate, welche den erfindungsgemäßen angiogenen Faktor enthalten, lokal, wie beispielsweise durch Injektion oder topische Anwendung, zur Behandlung von Wunden, chirurgischen Schnitten oder Hautgeschwüren verabreicht werden. Zusätzlich wird das Einbringen des angiogenen Faktors in ein zu implantierendes Element, welches den Wirkstoff langsam freisetzt, zu einer Verabreichung ins Auge gefaßt, um die Blutzufuhr zum Herz nach einem Myocardinfarkt wiederherzustellen.
Die Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung für eine Behandlung jeder der vorstehend erwähnten Krankheiten und eine Dosierung, die für eine Verwendung mit den beschriebenen Verabreichungsverfahren geeignet sind, zu bestimmen, werden routinemäßig von Durchschnittsfachleuten durchgeführt und liegen innerhalb des Aufgabenbereichs, der routinemäßig von diesen ohne übermäßige Untersuchungen, insbesondere angesichts der Standardassays und der hierin offenbarten Assays, durchgeführt werden. Diese Dosierungen können unter Verwendung etablierter Assays zum Bestimmen von Dosierungen, welche in Zusammenhang mit geeigneten Dosis- Antwort-Daten verwendet werden, ermittelt werden.
Es ist klar, daß die Anwendung der erfindungsgemäßen Lehren auf ein spezifisches Problem oder Gebiet innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns angesichts der hierin enthaltenen Lehren sein wird. Beispiele der erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren zu deren Isolierung und Herstellung erscheinen in den folgenden Beispielen.

Beispiel 1

Reinigung eines humanen angiogenen Faktors aus Plazentageweben.

A. Proteinreinigung

Humane Plazentas aus normalen Schwangerschaften wurden nach der Entbindung bei -20ºC eingefroren. Die gefrorenen Plazentas wurden in kleine Stücke gebrochen, mit einem elektrischen Lebensmittelzerkleinerer (General Slicing, Walden, NY) zerkleinert und in einem Lebensmittelverarbeitungsgerät homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden alle nachfolgenden Schritte bei 4ºC durchgeführt. Die homogenisierten Plazentas wurden mit kaltem 20 mM Tris, pH 7,5, 3 mM EDTA verdünnt und für 10 Minuten bei 50 W (Beschallungsgerät Modell 185, Branson Sonic Power Co., Plainview, NY) beschallt. Allgemein ergab 1 kg gefrorene Plazenta 2 Liter Beschallungssuspension.
Die Beschallungssuspension wurde mit HCl auf pH 4 gebracht, bei diesem pH für 2 min inkubiert und nachfolgend mit NaOH neutralisiert. NaCl wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugefügt, und die Beschallungssuspension wurde für 60 min bei 10.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 85 · 153 mm Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit 0,5 M NaCl/3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 equilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen und mit 2 M Nacl/3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 eluiert. Das Eluat wurde mit 2 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 so lange verdünnt, bis die Leitfähigkeit 24 mmho betrug, und auf eine zweite Heparin-Sepharose-Säule (16 · 190 mm) geladen. Die Säule wurde mit 0,7 M NaCl in 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen und mit einem Gradienten von 0,7 bis 2 M NaCl in demselben Puffer eluiert.
Die Fraktionen wurden auf Protease-induzierende Aktivität hin untersucht, und die aktiven Fraktionen wurden auf einer dritten Heparin-Sepharose-Säule (12 · 75 mm) konzentriert. Diese Säule wurde zuerst mit 0,8 M NaCl in 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, und danach mit 0,2 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, gewaschen und mit 2 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, eluiert. Die aktiven Fraktionen von der dritten Heparin-Sepharose-Säule wurden mit 20-fachem Volumen an 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, verdünnt.
Die Lösung wurde für 30 min bei 10.000 · g zentrifugiert und auf eine mit demselben Puffer equilibrierte 9 · 72 mm CM- Sephadex C-50-Säule (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde sequentiell mit 0,15, 0,5 und 2 M NaCl jeweils in 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, eluiert, und die Fraktionen wurden auf Protease-induzierende Aktivität hin untersucht.
Das 0,5 M Nacl-Eluat der CM-Sephadex-Säule, welches die Protease-induzierende Aktivität enthielt, wurde auf einer 0,5 ml-Heparin-Sepharose-Säule konzentriert. Diese Säule wurde durch sequentielle 0,5 ml-Waschschritte mit 2 M NaCl in 60 mM Natriumphosphat, pH 6,0, eluiert. Die gesamte Aktivität wurde im ersten 1 ml eluiert. Dieses Eluat wurde mit einer Fließrate von 0,5 ml/min durch eine FPLC Superos- 12-Säule (Pharmacia) in 2 M NaCl, 60 mM Natriumphosphat, pH 6,0, laufen gelassen.
Ein angiogener Faktor innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Ansprüche wurde aus diesem Eluat isoliert. Dieser angiogene Faktor wird zum Teil in diesem Beispiel als das "Protein" oder "Proteine" bezeichnet.

B. Proteincharakterisierung und Bestätigung der Eigenschaften des angiogenen Faktors

1. NaDodSO&sub4;-PAGE

NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgele mit 3%-igen Sammelgelen und 10 bis 18%-igen Auflösungsgradientengelen wurden hergestellt und gemäß dem Verfahren von Laemmli, wie in Nature 277 : 680-685 (1970), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, dargelegt, laufen gelassen. Proteine wurden mittels des Silberfärbeverfahrens von Wray et al., wie in Anal. Biochem. 118 : 197-200 (1981) dargestellt, nachgewiesen. Die aktiven Fraktionen von dieser Säule enthielten eine einzelne Bande im NaDodSO&sub4;-PAGE mit einem Molekulargewicht von 18.700.

2. Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio-Rad- Proteinassay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Sequenzinformation für dieses Protein wird in Beispiel 4 dargestellt.

3. Mitogene Eigenschaften - ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridin-Einbau

Endotheliale Gefäßzellen vom Rind (BCE) wurden durch das Verfahren von Folkman et al., publiziert in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 5217-5221 (1979), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, aus der Nebennierenrinde kürzlich geschlachteter, einjähriger Kälber isoliert. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in Alpha essentiellem Minimalmedium (MEM), enthaltend 10% (V/V) Kälberserum und ergänzt mit durch Maussarkom 180-Zellen konditioniertem Medium, wie beschrieben von Gross et al. in J. Cell Biol. 95 : 974-981 (1982), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, kultiviert. Als die Kulturen Konfluenz erreichten, wurde das Medium mit MEM, enthaltend 5% Kälberserum und keine konditionierenden Faktoren, gewechselt.
Konfluente Kulturen der BCE-Zellen wurden für 7 Tage in MEM mit 5% Kälberserum gehalten. Das Medium wurde danach durch frisches MEM, enthaltend 5% Kälberserum und variierende Konzentrationen des gereinigten angiogenen Plazentafaktors, ersetzt. Nach 20 Std. wurde das Medium durch Dulbecco's modifiziertes Eagles's Medium, enthaltend 5% Kälberserum und 0,3 uCi/ml ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridin (2000 Ci/mMol, New England Nuclear, Boston, MA) ersetzt. Nach einer 16-stündigen Inkubation im Markierungsmedium wurde die Markierung durch Waschen der Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gestoppt. Der Einbau von ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridin in säureunlösliches Material wurde durch Inkubieren der Zellen in kalter 5%-iger Trichloressigsäure (TCA) für 30 min, zweimaliges Waschen mit 5% TCA und destilliertem Wasser bestimmt. Das TCA-unlösliche Material wurde in 0,25 N NaOH solubilisiert und in einem Packard 5210 Gamma- Szintillationszähler gezählt.

4. Wanderungsassay

Wanderungsassays wurden in Gewebekulturschalen mit 200 ul- Vertiefungen (blind wells) (Nucleopore, Pleasanton, CA) gemäß dem Verfahren von Castellot, wie in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5597-5601, durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, beschrieben, unter Verwendung von PVP-freien Polycarbonatfiltern mit einer Porengröße von 5 um, die mit Gelatine und Fibronectin vorbeschichtet waren, durchgeführt. Zehnfach-Reihenverdünnungen des gereinigten Protease-induzierenden Faktors in MEM, enthaltend 0,5% fötales Kälberserum, wurden in die Bodenvertiefungen eingebracht. Die Filter wurden danach eingesetzt, und 5 · 10&sup4; BCE-Zellen in 200 ul MEM mit 0,5% fötalem Kälberserum wurden zu den oberen Vertiefungen zugefügt. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37ºC wurde das Medium in den oberen Vertiefungen entfernt, und die Zellen auf den oberen Oberflächen der Filter wurden vorsichtig mit einem Baumwollappen abgeschabt. Danach wurden die Filter entfernt, bei Raumtemperatur getrocknet und mit Wright-Giemsa- Färbemittel (Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) gefärbt.
Die Gesamtzellzahl auf der unteren Filteroberfläche wurde unter einem Lichtmikroskop (400X Vergrößerung) gezählt.

5. Assays für die Induktion von PA und Kollagenase

Konfluente Kulturen von BCE-Zellen, die für mindestens zwei Tage in MEM, enthaltend 5% Kälberserum, gehalten worden waren, wurden mit frischem MEM, enthaltend 5% Kälberserum und die zu testende Substanz, überschichtet. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Medium von den Kulturen gesammelt und auf Kollagenase hin untersucht, wie beschrieben von Moscatelli et al. in Cell 20 : 343-351 (1980), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt. Die gesamte Kollagenase war in einer latenten Form und wurde mit Trypsin für die Bestimmung der Aktivität aktiviert. Die Zellschichten von denselben Kulturen wurden zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 0,5% (V/V) Triton X-100 in 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,1, extrahiert, und die Zellextrakte wurden auf PA-Aktivität hin untersucht, wie beschrieben von Gross et al., s. o.. Die Experimente haben gezeigt, daß die Menge an PA in den Zellextrakten proportional zu der im konditionierten Medium gefundenen Menge ist. Eine Einheit der Protease-induzierenden Aktivität wurde definiert als die Menge, die notwendig ist, die halb-maximale Stimulierung der PA- und Kollagenasesynthese zu bewirken.

Beispiel 2

Reinigung eines angiogenen Faktors aus humanem Plazentagewebe.
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde verfolgt, um ein Eluat zu erhalten, welches auf die zweite Heparin-Sepharose-Säule geladen wird. Diese Säule wurde mit 0,95 M NaCl in 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen und mit 2 M NaCl in demselben Puffer eluiert.
Das 2 M-Eluat wurde gegen 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0, dialysiert. Das Dialysat wurde durch 60-minütige Zentrifugation bei 100.000 · g geklärt und auf eine Mono-S-Säule in einem FPLC-System geladen. Die Säule wurde mit 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0, gewaschen und mit einem Gradienten von 0,2 bis 2 M NaCl in 20 mM MES, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen wurden auf Protease-induzierende Aktivität hin untersucht. Die Protease-induzierende Aktivität eluierte bei 0,45 bis 0,6 M NaCl.

Beispiel 3

Reinigung eines angiogenen Faktors aus Hepatom-Zellen.
Alle Reinigungsschritte, außer die FPLC-Schritte, wurden bei 4ºC durchgeführt. SK-Hep-1-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC) Hinterlegungsnr. HTB 52) aus konfluenten, einschichtigen Kulturen wurden in kaltes PBS abgeschabt und für 10 min bei 400 · g durch Zentrifugation pelletiert. Das Zellpellet wurde in 10 Vol PBS/0,5 M NaCl suspendiert und für 3 min bei 50 Watt mit einem Branson Beschallungsgerät (Plainview, N.Y.) beschallt. Der Extrakt wurde zentrifugiert (10.000 · g, 1 Std.), und der Überstand wurde gesammelt. Das Pellet wurde in 1 Vol PBS/0,5 M NaCl resuspendiert, beschallt und zentrifugiert.
Die zwei Überstände wurden vereinigt und durch eine 28 · 75 mm Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit PBS/0,5 M NaCl equilibriert worden war, geschickt. Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl/3 mM EDTA/100 mM Tris, pH 7,5, gewaschen und mit einem Gradienten von 0,5 bis 2 M NaCl in demselben Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden auf PA-induzierende Aktivität untersucht, und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und mit 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, so lange verdünnt, bis die Leitfähigkeit 20 mmho betrug.
Das aktive Material wurde danach durch eine zweite Heparin- Sepharose-Säule (10 · 75 mm), die mit 0,5 M NaCl in 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, equilibriert worden war, geschickt. Die Säule wurde zuerst mit 0,5 M NaCl und danach mit 0,9 M NaCl in 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen und mit einem Gradienten von 0,9 bis 2 M NaCl in demselben Puffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden an einer dritten Heparin-Sepharose-Säule (7 · 85 mm) konzentriert, welche mit 0,5 M NaCl gewaschen und danach mit 2 M NaCl jeweils in 20 mM MES, pH 6,0, eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen von der dritten Heparin-Sepharose-Säule wurden mit 20 mM MES, pH 6,0, 1 : 10 verdünnt, und die Lösung wurde durch einstündige Zentrifugation bei 100.000 · g geklärt.
Dieselbe wurde danach auf eine mit 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0, equilibrierte Mono-S FPLC-Säule (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde mit 0,2 M NaCl gewaschen, und die Eluierung wurde mit einem multilinearen NaCl-Gradienten (0,2 bis 2 M in 20 mM MES, pH 6,0) erreicht. Die Fraktionen wurden auf PA-induzierende Aktivität hin untersucht, und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, und die Reinheit wurde durch NaDodSO&sub4;-PAGE bestimmt.

Beispiel 4

Die Bestimmung der Aminosäuresequenz des aus humaner Plazenta isolierten Plazenta-Angiogenesefaktors (bFGF).

A. LYS-C-Peptide

Gereinigter bFGF in 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl wurde durch das Verfahren des vorstehenden Beispiels 2 erhalten. Das native Protein wurde wie folgt einem Verdau mit Endoproteinase Lys-C ausgesetzt: Eine Reaktionsmischung, enthaltend 2 nMol natives Protein in 350 ul 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl wurde durch Zugabe von 15 ul 2 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 9,0 auf pH 8,7 eingestellt, 1,17 Einheiten Endoproteinase Lys-C (Boehringer) wurde zugefügt, und der Verdau wurde für 7 Std. 30 min bei 37ºC durchgeführt. 2-Mercaptoethanol wurde danach zu einer Endkonzentration von 1% (V/V) zugefügt, und die Inkubation wurde für 15 min bei 37ºC fortgesetzt. Trifluoressigsäure (TFA) wurde zu einer Endkonzentration von 0,1% (V/V) vor der Fraktionierung der Verdaumischung durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Synchrom RP-8-Säule zugefügt. Die Peptide wurden von der Säule (Fließrate 1,0 ml/min) mit 0,1 % TFA in Wasser (5 min), gefolgt von einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% TFA (0-60% Acetonitril in 60 min) eluiert. Die Eluierung der Peptide wurde bei A&sub2;&sub1;&sub5; und A&sub2;&sub8;&sub0; aufgezeichnet, und die geeigneten Fraktionen wurden manuell gesammelt.
Ein bei 19% Acetonitril eluierendes Peptid wurde durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert und ergab die folgende Sequenz:
(K) -N-G-G-F-F-L-R-I-H-P-D-G-R-V-D-G-V-R-E-K
In dieser und in den folgenden Sequenzen bedeutet ein in Klammern dargestellter Aminosäurerest ein Rest, welcher nicht eindeutig identifiziert worden ist.
Ein bei 19,8% Acetonitril eluierendes Peptid wurde sequenziert und ergab das folgende Ergebnis:
(K) -G-V-( ) -A-N-( ) -Y-L-(A) -M-K-(E) -D-G- Ein weiteres Peptid aus demselben Verdau eluierte bei 17,5% Acetonitril und ergab die folgende Aminosäuresequenz:
(K) -L-Q-L-Q-A-E-E-R-G-V-V-S-I-K
Ein Peptid, das bei 26% Acetonitril eluierte, wurde einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt und ergab die folgende Aminosäuresequenz:
(K)-(C)-V-T-(D)-E-(C)-F-F-F-E-( )-L-E-S-N-N-Y-N-(T)- Zwei zusätzliche Peptide, die zusammen bei 16% Acetonitril eluierten, wurden als Mischung gesammelt und danach vor dem Sequenzieren nochmals gereinigt. Die gesammelte Peptidmischung wurde unter Vakuum getrocknet und danach in 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 8 M Harnstoff resuspendiert. 20 nmol Dithiothreitol (DTT) wurden zugefügt, und die Reduktion möglicher Disulfidbindungen ließ man für 15 min bei 37ºC fortschreiten. Die Peptide wurden danach durch Zugabe von 60 nmol ³H-Iodessigsäure carboxymethyliert, und die Mischung wurde für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Weitere 60 nmol DTT wurden zugefügt, worauf eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur folgte, und die Reaktionsmischung wurde vor der nochmaligen Fraktionierung durch HPLC unter Verwendung einer Altex C-3- Umkehrphasensäule auf 0,1% in TFA eingestellt. Die Peptide wurden von der Säule mit 0,1% TFA in Wasser (5 min), gefolgt von einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1 % TFA (0-60% Acetonintril in 120 min) eluiert (Fließrate 1 ml/min).
Das bei 13% Acetonitril eluierende Peptid wurde einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt und ergab die folgende Sequenz:
(K) -G-V-C-A-N-R-Y-L-A-M-K

B. SMP-Peptide

Zusätzliche Peptide wurden durch Verdau des nativen bFGF- Proteins mit Maus-Submaxillarprotease erzeugt.
Eine Lösung, enthaltend 2 nmol Protein in 350 ul 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl wurde durch Zugabe von 25 ul 1 M NaHCO&sub3;, pH 9,0, auf pH 8,0 eingestellt. Submaxillarisprotease (3,6 ug) wurde zugefügt, und den Verdau ließ man für 24 Std. bei 37ºC fortschreiten. 90 nmol DTT wurden zugefügt, und die Inkubation wurde für 30 min bei 37ºC fortgesetzt. Eine Carboxymethylierung der Peptide wurde durch die Zugabe von 360 nmol ³H-Iodessigsäure und einer Inkubation für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur erreicht. 360 nmol DTT wurden danach zugefügt, und die Reaktionsmischung wurde vor der Fraktionierung der Peptidmischung durch RP-8 HPLC, wie vorstehend beschrieben, auf 0,1% (V/V) in TFA eingestellt.
Eine Mischung von Peptiden, die bei 12% Acetonitril eluierten, wurde in einer Fraktion gesammelt, getrocknet und in 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 M Harnstoff resuspendiert und danach durch HPLC unter Verwendung einer Altex C-3-Säule und demselben Elutionsschema wie vorstehend für die nochmalige Reinigung der Lys-C-Peptide beschrieben nochmals fraktioniert.
Zwei bei (a) 14,8% Acetonitril und (b) 15,3% Acetonintril eluierende Peptide wurden einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt und ergaben die folgenden Aminosäuresequenzen:
a) (R) -G-V-V-( )-I-K-G-V-C-A-Nb) (R) -L-V-C-K-N-G-G-F-F- Mehrere Peptide wurden durch Verdau des nativen bFGF mit S. aureus-Protease (V8) erzeugt. Ein nmol Protein in 500 ul 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 M NaCl wurde durch HPLC unter Verwendung einer RP-8-Umkehrphasensäule entsalzt. Die salzfreie, Protein-enthaltende Fraktion wurde getrocknet, in 50 ul 50 mM Essigsäure, pH 4,0, resuspendiert, und 1 ug V8- Protease wurde zugefügt. Den Verdau ließ man 18 Std. bei 37ºC fortschreiten. Die Peptide wurden danach durch HPLC unter Verwendung einer RP-8-Umkehrphasensäule wie vorstehend beschrieben fraktioniert.
Ein bei 17% Acetonitril eluierendes Peptid wurde einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt und ergab die folgende Aminosäuresequenz:
(E)-K-S-( )-P-H-I-K-L-Q-L-( )-A-E
Ein zusätzliches Peptid vom V8-Verdau, das bei 20% Acetonitril eluierte, wurde ebenso sequenziert und ergab das folgende Ergebnis:
(E)-( )-(G)-( )-L-L-A-( )-K- Ein bei 21% Acetonitril eluierendes Peptid wurde mit dem folgenden Ergebnis sequenziert:
(E) -S-N-N-Y-N-T-Y-R-(S)- Das Ordnen aller vorstehend aufgelisteten Aminosäuresequenzen führt zu der folgenden Stammsequenz für den humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor:
L-Y-C-K-N-G-G-F-F-L-R-I-H-P-D-G-R-V-D-G-V-R-E-K- S-( )-P-H-I-K-L-Q-L-Q-A-E-E-R-G-V-V-S-I-K-G-V-C-A-N- R-Y-L-A-M-K-( )-D-G-( )-L-L-A-( )-K-()-V-T-( )-E-( )-F- F-F-E-( )-L-E-S-N-N-Y-N-T-Y-R-( )- Zusätzliche Peptide wurden isoliert und einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt. Diese Aminosäuresequenzen liegen außerhalb der vorstehend aufgeführten Stamm- Aminosäuresequenz.
Ein nach der Fraktionierung des Submaxillaris-Verdaus (siehe oben) bei 13% Acetonitril eluierendes Peptid ergab die folgende Aminosäuresequenz:
K-L-G-S-K-T-G-P-G-Q-K-A-I-L-F-L-P-M-S-A-K
Ein bei 20% Acetonitril eluierendes Lys-C-Peptid ergab die folgende Aminosäuresequenz:
Y-( )-S-W-Y-V-( )-L-(

Beispiel 5

Identifizierung von Eigenschaften des angiogenen Faktors, die dieses für eine klinische Verwendung als ein therapeutisches Agens geeignet machen.
Wir haben gezeigt, daß der durch das Verfahren der Beispiele 1 oder 2 isolierte Faktor aus Plazenta und der aus Hepatom- Zellen isolierte Faktor alle drei der für einen angiogenen Faktor vorausgesagten in vitro-Eigenschaften besitzen. Erstens stimuliert das Molekül bei Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 ng/ml die Synthese von PA und latenter Kollagenase in BCE-Zellen. PA kann Zymogen-Plasminogen in aktives Plasmin, eine Protease mit breiter Spezifität, umwandeln. Plasmin kann ebenso latente Kollagenase in aktive Kollagenase umwandeln. Unter dem Einfluß niedriger Konzentrationen dieses Faktors können folglich endotheliale Gefäßzellen mindestens zwei Proteasen erzeugen, welche fähig sind, die meisten Proteine in umgebenden Geweben abzubauen, wodurch den Zellen erlaubt würde, in Gewebe einzudringen.
Das gereinigte Molekül stimulierte die PA- und Kollagenase- Synthese in BCE-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise (Fig. 3A). Die gesamte Kollagenase war in einer inaktiven Form. Kollagenolytische Aktivität wurde nach Trypsinbehandlung nachgewiesen. Sowohl PA als auch latente Kollagenase werden gleichzeitig stimuliert. Halbmaximale Stimulierung ergab sich bei einer Konzentration des Protease-induzierenden Faktors von 1 ng/ml. Die durch unbehandelte Zellen produzierte Grundmenge an PA und Kollagenase variierte von Experiment zu Experiment, und folglich variierte auch das Ausmaß der Stimulierung. Bei sehr hohen Konzentrationen des Protease-induzierenden Faktors wurde die Stimulierung der PA-Synthese ebenso vermindert wie die chemotaktischen und mitogenen Aktivitäten. Eine 24-stündige Inkubation der BCE- Zellen mit Konzentrationen des Protease-induzierenden Faktors, die PA und Kollagenase induzierten, veränderten die Morphologie der Zellen von ihrer typischen Kopfstein- Erscheinung zu einer ausgestreckteren, spindelförmigen Erscheinung.
Zweitens ist der Faktor chemotaktisch für BCE-Zellen. In vivo würden daher endotheliale Gefäßzellen stimuliert werden, in Richtung der Quelle des Faktors zu wandern. Die Zugabe des Faktors in Konzentrationen zwischen 0,001 und 0,1 ng/ml stimulierte die BCE-Zellchemotaxis in "blind well"- Kammern. Bei höheren Konzentrationen ergab sich keine Stimulierung der Chemotaxis. Eine gesteigerte Zellbewegung von der oberen Kammer zu der unteren Kammer wurde nur festgestellt, wenn die untere Kammer eine höhere Konzentration des Faktors als die obere Kammer enthielt, was zeigt, daß wirkliche Chemotaxis zugrundelag. Durch Chemokinese konnte nicht mehr als 25% der beobachteten erhöhten Beweglichkeit erklärt werden.
Drittens ist der Faktor mitogen für BCE-Zellen. Die Fig. 3B zeigt, daß die Zugabe des Protease-induzierenden Faktors zu Kulturen von BCE-Zellen den Einbau von ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridin in DNA in einer dosisabhängigen Weise stimulierte. Bei höheren Konzentrationen des Protease-induzierenden Faktors wurde dieser stimulierende Effekt signifikant vermindert. Eine Stimulierung des ¹²&sup5;J-Ioddesoxyuridineinbaus wurde mit denselben Konzentrationen des Faktors erreicht, welche zur Induktion von PA und Kollagenase fähig waren. Wir haben früher bestimmt, daß mit rohen Plazenta- Beschallungssuspensionen der gesteigerte Einbau von ¹²&sup5;J- Ioddesoxyuridin in DNA mit anderen Messungen der Mitogenese korreliert. Folglich verhält sich dieser Faktor wie ein bona fide Mitogen für endotheliale Zellen. Folglich scheint ein einzelnes, gereinigtes Molekül die Fähigkeit zu besitzen, PA und Kollagenase in BCE-Zellen zu induzieren, deren Replikation zu stimulieren und deren Beweglichkeit zu stimulieren.

Beispiel 6

Gefäßbildungsaktivität

Unter Verwendung des Verfahrens zum Bestimmen der Gefäßbildung von Dunn et al., wie in Anat. Rec. 199 : 33-42 (1981) veröffentlicht, stimulierte der angiogene Faktor des Beispiels 2, wenn dieser auf eine Huhn-Chorionallantoismembran aufgebracht wurde, die Gefäßbildung in 81% der Eier bei einer Dosis von 65 ng.

Beispiel 7

a) N-terminale Aminosäuresequenz von bFGF

Humaner, plazentarer Gefäßbildungsfaktor wurde wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiele 1 und 2) gereinigt. Das gereinigte Protein in 20 mM MES-Puffer, pH 6,0 und 500 mM NaCl wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer RP-8-Umkehrphasensäule entsalzt. 250 bis 500 pMol entsalztes Protein wurden einem ABI 470A Gasphasen- Proteinsequenzierapparat für einen automatischen Edman-Abbau zugeführt. Die entstehenden PTH-Aminosäuren wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Cyano-Umkehrphasensäule identifiziert.
Diese Experimente ergaben die folgende Aufstellung einer N- terminalen Aminosäuresequenz für bFGF:
G-T-M-A-A-G-S-I-T-T-L-P-A-L-P-E
Zusätzlich wurde die gerade beschriebene N-terminale bFGF- Aminosäuresequenz auch durch automatisierten Edman-Abbau eines Lys-C-Peptids, das bei 23% Acetonitril in dem in Beispiel 4 (A) beschriebenen chromatographischen System eluierte, identifiziert.

b) C-terminale Aminosäuresequenz von bFGF

Ein C-terminales bFGF-Peptid wurde aus dem Lys-C-Verdau des bFGF wie in Beispiel 4 beschrieben isoliert. Das Peptid eluierte bei 22% Acetonitril. Automatisierter Edman-Abbau dieses Peptids ergab die folgende Aminosäuresequenz:
A-I-L-F-L-P-M-S-A-K-S
Wenn man die Sequenzdaten von (i) Beispiel 4, (ii) der N- terminalen Aminosäuresequenz von bFGF, (iii) der C-terminalen Aminosäuresequenz von bFGF und (iv) der cDNA kombiniert, ergibt sich für bFGF die folgende vollständige Aminosäuresequenz: 1. bFGF-Form 1

2. bFGF-Form 2: N-terminal geschützter bFGF

Aus einer Anzahl von Experimenten, in welchen gereinigter und intakter bFGF einem automatisierten Edman-Abbau ausgesetzt wurde, ergab sich, daß eine Fraktion des aufgetragenen Proteins (50-80%) in dem Edman-Verfahren nicht abgebaut wird.
Es wird daraus geschlossen, daß eine Fraktion von bFGF- Proteinmolekülen existiert, die N-terminal geschützt sind.
Die Natur der Schutzgruppe wird am klarsten durch die Untersuchung gereinigter amino-terminaler bFGF-Peptide bestimmt. Amino-terminale Peptide aus dem enzymatischen Abbau von bFGF (siehe Beispiel 4) werden durch Aminosäureanalyse identifiziert. Sie können ebenso durch Papierelektrophorese oder Dünnschichtchromatographie und einer nachfolgenden Färbung mit dem Chlor/o-Tolidin-Reagens, wie von Reindel, F. und Hoppe, W. (1954) in Chem. Ber. 87, 1103-1107, durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, beschrieben, identifiziert werden. (Geschützte Peptide werden erst, wenn sie hydrolisiert sind, mit Ninhydrin nachgewiesen (außer einer schwachen Farbentwicklung aufgrund der Seitenketten der Lysinreste)).
Zusätzlich können kleine, N-terminal geschützte bFGF-Peptide durch Chromatographie von bFGF-Verdaus mit acidifiziertem Thermolysin oder Pepsin an Dowex 50, X2 (H&spplus;-Form), wie von Narita et al. (1975) in Protein Sequence Determination, S. 30-103, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York beschrieben, oder durch Chromatographie an Sulfoethyl- Sephadex, wie beschrieben von Kluh, I. (1979) in Coll. Czech. Chem. Comm. (Eng. Ed.), 44, 145-147, beides durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, isoliert werden.
Die Struktur der kurzen, geschützten Peptide wird durch verschiedene Standardverfahren und -methoden bestimmt. Siehe beispielsweise Allen, G. (1981) in Sequencing of Proteins and Peptides; North Holland Publishing Company, Amsterdam, New York, Oxford oder dort diskutierte Literaturhinweise, die durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt werden. Diese Verfahren und Methoden umfassen den Verdau N-terminal geschützter Peptide mit Carboxypeptidasen, Proglutamat- Aminopeptidase, Hydrazinolyse, Massenspektroskopie, magnetische Kernresonanzspektroskopie, Gaschromatographie und Massenspektroskopie durch Beschießen mit schnellen Atomen, wie beschrieben von Boissel et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8448-8452.

3. bFGF Form 3: Verkürzter und verlängerter PAF (bFGF)

Es ist gezeigt worden, daß dem Rindernieren- Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) eine Anzahl an Aminosäuren vom N-Terminus fehlen (Baird, A. et al. (1985); Regul. Pept; im Druck) (Gospodarowicz, D. (1986) Meth. Enzymol., im Druck). Der verkürzte Fibroblastenwachstumsfaktor behält seine Fähigkeit, an den FGF-Rezeptor zu binden, wie von Neufeld, G. und Gospodarowicz, D. (1985) in J. Biol. Chem. 260, 13860-13868 gezeigt, was andeutet, daß der N-Terminus des Proteins keine kritische Rolle bei der Wechselwirkung von FGF mit dessen Zelloberflächenrezeptor spielt. Daher wird vorausgesehen, daß sowohl verkürzte als auch verlängerte Formen des bFGF Rezeptorbindungsaktivität beibehalten werden. Die maximale N-terminale bFGF-Deletion oder - Extension, die noch die biologische bFGF-Aktivität erlaubt, bleibt zu bestimmen.

Beispiel 8: Ein cDNA-Klon von bFGF

SK-HEP-1-Zellen wurden in Eagles essentiellem Minimalmedium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, nicht-essentiellen Aminosäuren und Pen-Strep, kultiviert. RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des NP-40 Lyseverfahrens, wie von Maniatis et-al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, S. 191-193), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, beschrieben, isoliert. Poly(A)&spplus; mRNA wurde durch oligo-dT-Chromatographie (BRL) unter Verwendung des Verfahrens von H. Aviv und P. Leder, beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USWA 69, 1972, 1408, durch Bezugnahme spezifisch eingeführt, selektiert. Fünf ug mRNA wurden verwendet, 8 ug doppelsträngige cDNA mittels oligo-dT-Primer-unterstützter Erststrangsynthese und RNase H-DNA Polymerase-vermittelter Zweitstrangsynthese, wie beschrieben von Gubler und Hoffmann in Gene, 25 (1983) 263-296, durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, beschrieben, zu synthetisieren. Amersham-Reagenzien wurden in diesem Verfahren verwendet. Die folgenden Reaktionen wurden, wenn nichts anderes angegeben ist, gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Diese cDNA wurde unter Verwendung von 10 Einheiten T4-DNA-Polymerase (Amersham) mit glatten Enden versehen. EcoRI-Stellen wurden mit 400 Einheiten EcoRI-Methylase (New England Biolabs) und 100 mM S-Adenosylmethionin geschützt. Die gleiche Gewichtsmenge an EcoRI-Linkern (New England Biolabs, 8 mer) wurden mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Promega Biotec.) angehängt. Überschußlinker wurden durch Spaltung mit 200 Einheiten EcoRI (New England Biolabs) entfernt, und 100 ng dieser cDNA wurden in 1 ug EcoRI-geschnittener, mit alkalischer Phosphatase behandelter Lambda gt-10 DNA (Vector Cloning Systems) ligiert. Die DNA wurde in vitro (Vector Cloning Systems) verpackt und ergab 8,2 · 10&sup5; Rekombinanten nach Ausplattieren auf E. coli, C600 HFLa.

Entwurf der Oligonucleotidproben

Zwei Oligonucleotidproben gemischter Sequenz wurden für die Isolierung des SK-HEP-1 cDNA-Klons verwendet. Die Proben bestanden aus Pools aller möglichen DNA-Sequenzen für eine gegebene Aminosäuresequenz. Die Proben wurden hergestellt, um Aminosäuresequenzen in der in dieser Anmeldung beschriebenen Stamm-Aminosäuresequenz des bFGF zu selektieren. Die Probe Nr. 5 wurde so hergestellt, daß sie an DNA, welche für die Aminosäuresequenz Ile-Lys-Gly-Val-Cys-Ala codiert, hybridisiert und ist ein 17-mer, bestehend aus 192 Sequenzen:
Code X = A, T, G oder C
N = A oder G
Y = T oder C
Z = T, C oder A
Die Probe #8 wurde derart hergestellt, daß sie an DNA, welche für die Aminosäuresequenz Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe codiert, hybridisiert und ist ein 20-mer, bestehend aus 256 Sequenzen:
Beide Proben wurden mittels eines DNA-Syntheseapparats von Applied Biosystems synthetisiert. Sie wurden Gel-gereinigt und unter Verwendung von T4 Polynucleotidkinase (Pharmacia) mit [γ-³²p] ATP (Amersham) zu einer spezifischen Aktivität von 4-6 · 10&sup6; cpm/pmol radioaktiv markiert.
Die Hybridisierungstemperaturen wurden derart gewählt, daß sie 2ºC unter dem berechneten Tm für die AT-reichsten Mitglieder des jeweiligen Pools sind, wie beschrieben von S.V. Suggs et al., (Developmental Biology Using Purified Genes (Herausgeber D.D. Brown und C.F. Fox), 683-693 (1982) Academic Press, New York), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt. Der letzte Waschschritt wurde bei dem für die AT-reichsten Mitglieder des Pools berechneten Tm durchgeführt (d. h., 2ºC über der Hybridisierungstemperatur).

Screening

Die cDNA-Bank wurde zu einer Dichte von 50.000 Plaques pro 150 mm Luria-Bertoni-Agarplatte mit E. coli C600 HFLa-Zellen und NZCYM-Top-Agarose (0,7%) ausplattiert. Phagen-DNA wurde auf Nitrocellulosefilterduplikate (Schleicher und Schuell, BA 85) überführt und für die Hybridisierung präpariert, wie beschrieben von Benton und Davis in Science, 196: (1979) 180-182, durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt. Die Filter wurden für 2 Std. bei 48ºC in einer Lösung, enthaltend 6 · SSC (20 · SSC ist 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,5), 2 · Denhardt's Lösung (100 · Denhardt's Lösung ist 2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrrolidon und 2% BSA), 0,1% SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 100 mg/ml Hefe-tRNA vorhybridisiert. Die Probe Nr. 8 wurde zu 0,2 pmol/ml zugefügt, worauf man sie für 16 Std. hybridisieren ließ. Nach der Hybridisierung wurden die Filter wie folgt gewaschen: 3 Mal für jeweils 15 min in 6 · SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur, gefolgt von einem letzten 8-minütigen Waschschritt bei 50ºC. Die Filter wurden danach getrocknet und für 24 Std. auf einem Kodak XAR5-Film und einem "lightening plus"-Verstärkerfilm bei -70ºC autoradiographiert. Positive Signale ergebende Plaques auf Filterduplikaten wurden zur Reinigung abgenommen. Diese Plaques wurden mit den Proben #5 und #8 in einer zweiten Reinigungsrunde getestet, und ein an beide Proben hybridisierender Plaque wurde als bester Kandidat, der für den Gefäßbildungsfaktor codiert, ausgewählt.
DNA wurde durch Plattenlysate und Formamidextraktion aus diesem Phagen präpariert, wie beschrieben von R.W. Davis, D. Botstein und J. R. Roth in Advanced Bacterial Genetics: A Manual for Genetic Engineering (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt. Eine EcoRI-Spaltung dieser DNA entließ ein 1,1 kb-Insert, wobei die Größe in einem 1%igen Agarosegel bestimmt wurde. Dieses Insert wurde aus einem 5%-igen Acrylamidgel für die Subclonierung gereinigt, wie beschrieben von Maniatis et al., s. o. auf den Seiten 173-178. Das Insert wurde in EcoRI-geschnittene Bakteriophagen M13 mp 19 RF-DNA ligiert, und dessen Sequenz wurde unter Verwendung des Didesoxynucleotidverfahrens von Sanger et al., beschrieben in J. Mol. Biol. 94, 441 (1975), durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt, bestimmt. Die erhaltene Sequenzanalyse zeigte ein offenes Leseraster, welches für die Primärstruktur des bFGF codiert.
Auf der Grundlage der Proteinsequenzdaten (siehe Beispiel 7) und der veröffentlichten FGF-Information (Esch et al. (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6507-6511) scheint es, daß mehrere aktive bFGF-Formen produziert werden können: Form 1 bFGF (siehe auch Beispiel 7) kann von dieser DNA durch Translationsinitiation an irgendeinem Punkt 5' zu der Sequenz AGTMAA . . . und nachfolgendem post-translationalem Schneiden der AG-Bindung durch ein noch zu bestimmendes Verfahren produziert werden. Zusätzlich kann ein Form 3-bFGF durch Translationsinitiation an der MAA-Sequenz produziert werden, da dies eine Konsensusinitiationsstelle ist (M. Kozak, Microbiol. Rev. 1983, Bd. 47, 1-45), wobei das Methionin wahlweise proteolytisch entfernt werden kann. Form 3-bFGF kann ebenso durch Initiation an weiteren funktionellen Initiationsstellen produziert werden. Diese Stellen sind von Durchschnittsfachleuten, insbesondere in Kenntnis der hier enthaltenen Lehre, leicht unterscheidbar. Zusätzlich kann danach eine post-translationale Prozessierung des ursprünglichen Translationsprodukts folgen, obwohl eine solche Prozessierung nicht notwendig ist. Form 2-bFGF kann aus Form 1 oder Form 3 des b-FGF durch ein bisher unbekanntes Verfahren, welches zu einem Schutz der freien Aminogruppe am N-Terminus führt, produziert werden.

Beispiel 9: Expression des bFGF

Das Prinzip der Expression des bFGF ist wie folgt. Ein aus dem Lambda gt10-Klon isoliertes 1,1 kb EcoRI-Fragment kann in das Plasmid pUC9 subcloniert werden. Dieses Fragment enthält die gesamte für bFGF codierende Sequenz. Zwei kleinere Fragmente von diesem Subclon sind für das Konstruieren des Expressionssystems von Nützlichkeit. Das eine ist ein 367 bp-Fragment von AvaI bis BamHI, welches die für die Aminosäuren 17 bis 137 des bFGF codierende Sequenz enthält, wobei die Reste GTMAA des plazentaren Form 1-Proteins als 1-5 gezählt werden.
Das andere ist ein 405 bp-Fragment von NcoI bis BamHI, welches die für die Aminosäurereste 4 bis 137 des bFGF codierende Sequenz enthält. Synthetische Adaptoren können zur Vervollständigung der codierenden Sequenz an beide Enden dieser Restriktionsfragmente angehängt werden, um eine translationale Initiation, Termination oder Verknüpfungssequenzen bereitzustellen und die für das Einbringen in den geeigneten Expressionsvektor notwendigen Sequenzen zu liefern.
Aus humaner Plazenta isolierter bFGF enthält eine Sequenz, welche mit GTMAA beginnt. Die ausgehend von SK-Hep-1-Zellen isolierten cDNA-Klone deuten an, daß weitere Formen des bFGF synthetisiert werden können, welche wenigstens 100 Aminosäuren stromaufwärts von der GTMAA-Sequenz oder mit MAA beginnen. Die plazentare Form wurde für die Expression in Hefe (S. cerevisiae) und Bakterien (E. coli) ausgewählt. Die mutmaßliche SK-Hep-1-Form und jede weitere amino-terminal verkürzte Form kann durch kleinere Modifizierungen der nachstehend beschriebenen Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann nahegelegt sein sollten, exprimiert werden. Sie bestehen aus dem Abändern der verwendeten synthetischen Adaptoren, um das amino-terminale Ende des cDNA- Fragments (entweder die NcoI-Stelle oder die AvaI-Stelle) an die Expressionsvektoren anzuhängen. Alternativ können Plasmide, welche verkürzte Formen exprimieren, durch Oligonucleotid-gerichtete Deletionsmutagenese ausgehend von den nachstehend beschriebenen GTMAA-Formen konstruiert werden (wie beschrieben von M. Inouye, K. Nakamura, S. Inouye und Y. Masui in "Nucleic Research Future Development", K. Mizobuci, I. Watanabe und J.D. Watson (Herausgeber), Academic Press, New York, S. 419-436, 1983, durch Bezugnahme hierin spezifisch eingeführt).

Adaptoren

Die folgenden Adaptoren wurden mittels eines DNA- Syntheseapparates von Applied Biosystems synthetisiert und Gel-gereinigt. Die 5'-Enden wurden mit T4- Polynucleotidkinase (Pharmacia) phosphoryliert. Paare komplementärer Oligonucleotide wurden wie folgt hybridisiert (annealed), um den doppelsträngigen Adaptor zu bilden. Equimolare Mengen des jeweiligen Oligonucleotids wurden zu einer Lösung von 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 und 1 mM EDTA zugefügt. Diese Lösung wurde in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Das Wasserbad wurde danach von der Hitzequelle entfernt und zum Abkühlen auf Raumtemperatur über zwei Stunden hinweg stehengelassen. Das folgende ist eine Liste und eine Beschreibung der verwendeten Adaptoren. bFGF-Adaptoren für das Anhängen an den Promotor des α-Faktors von Hefe NH&sub3; terminale Adaptoren: GT-Form HindIII-Stelle des Faktors zur NcoI- Stelle des bFGF COOH-terminaler Adaptor: BamHI-Stelle des bFGF zur SalI- Stelle des α-Faktors Adaptoren für die Expression in E. coli Für cytoplasmatische Produktion NH3-terminale Adaptoren für GT-Form PvuI-Stelle von Omp AvaI-Stelle von bFGF Omp-Fragment von EcoRI bis PvuI COOH-terminaler Adaptor; BamHI-Stelle von bFGF zur PstI-Stelle von pCJ-1 Adaptoren für die Sezernierung von bFGF in E. coli unter Verwendung der Omp-Leader-Sequenz NH&sub3; terminale Adaptoren GT-Form: zur AvaI-Stelle des bFGF Diese beiden Adaptoren werden an den nachstehend beschriebenen Omp-Leader ligiert werden COOH-terminaler Adaptor: BamHI-Stelle des bFGF Zur PstI-Stelle des pCJ-1

Beispiel 9: Konstruktion der Hefe-Expressionsplasmide

Ein Plasmid, pGS185, das von pUC8 abgeleitet ist, welchem jedoch die Restriktionsstellen von der Hind III-Stelle bis zur SmaI-Stelle im Polylinker fehlen, wurde durch Schneiden von pUC 8 mit Hind III, durch Ligieren an einen Hind III/SmaI-Adaptor (Amersham, Cat. Nr. DA1006), welcher nicht die Hind III-Stelle wiederherstellt, durch Schneiden mit SmaI und durch Ligieren in verdünnter Lösung (1 ng/ml) konstruiert, worauf eine Transformation von E. coli JM 83 folgte. Das korrekte Plasmid wurde durch Schneiden von aus den Transformanten isolierter Plasmid-DNA mit EcoRI, SmaI oder Hind III identifiziert. Eine Transformante, die ein Plasmid enthielt, welchem die Hind III-Stelle fehlte, welches jedoch die EcoRI-Stelle und SmaI-Stelle enthielt, wurde auf diese Weise identifiziert.
Ein EcoRI-Fragment, welches das Hefe-MFα1-Gen enthielt, wurde ausgehend vom Plasmid pCY17, beschrieben von J. Kurgan und I. Herskowitz in Cell 30 : 933 (1982), durch Gel- Elektrophorese gereinigt und in mit EcoRI geschnittenem pGS185 ligiert. Diese Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, worauf auf Ampicillinresistenz selektiert wurde. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert, und die Gegenwart des korrekten Inserts wurde durch Schneiden der DNA mit EcoRI bestätigt. Dies ist das Plasmid pGS285.
Das Plasmid pGS285 wurde vollständig mit Hind III geschnitten und unter verdünnten Bedingungen (1 ng/ml) religiert, um drei der vier internen Hind III-Stellen im MFα1-Gen, wie von Kurjan und Herskowitz, s. o., angeführt, zu entfernen. Das korrekte Konstrukt wurde wie vorstehend beschrieben selektiert. Dies ist das Plasmid pGS385.
Für die ortsspezifische Mutagenese wurde das MFα1-Gen durch Schneiden mit EcoRI aus pGS385 entfernt, Gel-gereinigt (1,5 Kb) und an EcoRI-geschnittenem M13 mp18 RF ligiert. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli 71-18 zu transformieren, und Klone, welche das MFα1-Gen in der korrekten Orientierung enthielten, wurden durch Hybridisierung an das mit [³²P] markierte MFα1-Gen identifiziert. Die MFα1- Sequenz wurde von GTA TCT TTG GAT AAA AGA zu GTA AGC TTG GAT AAA AGA unter Anwendung ortsgerichteter in vitro Mutagenese- Standardverfahren, beschrieben von Zoller und Smith (Methods in Enzymology, Bd. 100, 1983, Academic Press, Inc., S. 468) geändert. Die Sequenz des mutierten α-Faktor-Gens, MFα-H, wurde durch Didesoxysequenzierung bestätigt.
Das MFα-H-Gen wurde durch Schneiden der RF-Form des M13 mp18-Klons mit EcoRI, Gel-Reinigen des entstandenen 1,5 kb EcoRI-Fragments durch Acrylamidgelelektrophorese und durch Ligieren an mit EcoRI-geschnittenem pGS185 entfernt. Die entstandene Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und Kolonien, welche die Plasmide mit dem MFα-H-Gen enthielten, wurden durch Hybridisierung mit dem ³²p-markierten 1,5 kb EcoRI-Fragment, welches das MF α-H-Gen enthält, identifiziert. Dieses Plasmid wird pGS286 bezeichnet.
Das bFGF-Gen wurde wie folgt in pGS 286 eingebaut. Die Adaptoren #1 und #2 wurden an das NcoI/BamHI bFGF-Fragment ligiert. Die Ligierungsmischung wurde in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, und bFGF-DNA mit den angehängten Adaptoren wurde durch den Anstieg des MG identifiziert. Dieses korrekt adaptierte DNA-Fragment wurde aus dem Gel eluiert und an Hind III/SalI-verdautem pGS286 ligiert. E. coli HB101 wurde mit der Ligierungsmischung transformiert, und Ampicillin-resistente Kolonien wurden selektiert. Transformanten, welche Plasmide mit den korrekten Inserts enthielten, wurden durch Hybridisierung mit dem Adaptor 1A und 2A identifiziert, welche durch Inkubation mit [γ-³²P]ATP und T4-Polynucleotidkinase markiert worden waren. Ein auf diese Weise konstruiertes und isoliertes Plasmid ist als pGS286-PAF bezeichnet worden. Dieses Plasmid enthält das MFα-H-Gen, im Leseraster an das bFGF-Gen fusioniert, und zwar an der Hind III-Stelle in der "prä-pro"-Region des MFα- H-Gens. Es ist gezeigt worden, daß solche Konstrukte, wenn sie in Hefe eingebracht werden, die Synthese, die Prozessierung und Sezernierung heterologer Proteine dirigieren, wie von A.J. Brake et al., 1981, (PNAS (USA) 81 : 4642) gezeigt.
Das EcoRI-Fragment, welches die Fusion des MFα-H-Gens und bFGF enthält, ist pGS286-PAF. Dieses Fragment wurde durch Schneiden mit EcoRI und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese isoliert. Mit T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden erzeugt, und PstI-Adaptoren (Pharmacia) wurden mit T4-DNA-Ligase angehängt. Das Fragment wurde danach in PstI-geschnittenen Vektor pCl/1 (A.J. Brake et al. 1981) (PNAS, (USA) 81 : 4642) ligiert, E. coli HB101 mit der Ligierungsmischung transformiert, und TETr-Kolonien wurden selektiert. Korrekte Konstrukte wurden durch Hybridisierung an das bFGF-Gen identifiziert. Dieses Plasmid wurde in S. cerevisiae DBY 746 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA), durch Standard- Transformationsprotokolle eingebracht, wobei das 2u-DNA- Plasmid von dem Hefestamm deletiert worden war, wie beschrieben von Toh-E und Wickner (Journal of Bacteriology, 145, 1981, 1421-1424). Die bFGF-exprimierenden Transformanten wurden durch deren Reaktivität mit affinitätsgereinigtem anti-bFGF-IgG selektiert.

Beispiel 10: Periplasmatische Sezernierung in E. coli

Um die Expression von bFGF in einer für das Ausschleusen in das Periplasma von E. coli geeigneten Form zu regulieren, wurden die folgenden regulatorischen Elemente verwendet: ein tac-Promotor auf dem Plasmid pCJ-1 für eine Transkriptionsinitiation zu hohen Raten, ein lac-Operator auf dem Plasmid pCJ-1 für die Transkriptionsregulation, einen lac-Repressor (lac Iq), codiert auf dem Chromosom des E. coli-Stammes JM107. Um den periplasmatischen Export von bFGF zu erleichtern, wurde die für das Omp A-Leaderpeptid codierende DNA an die für bFGF codierende DNA derart angehängt, daß das C-terminale Ala dieses Peptids an das N-terminale Gly von bFGF Form 1 so fusioniert wird, daß die Ala- Gly-Bindung des ursprünglichen Produkts durch die E. coli- Leaderpeptidase geschnitten werden wird, um den reifen bFGF zu erzeugen.
Der E. coli-Sezernierungsvektor wurde wie folgt konstruiert. Die Adaptoren #5 und #4 wurden an das AvaI/BamHI bFGF- Fragment ligiert. DNA der korrekten Größe wurde aus einem Polyacrylamidgel eluiert und an die Omp A-Leader-DNA und EcoRI/PstI-geschnittenem M13 mp19 RF ligiert. E. coli JM-107 wurde mit der Ligierungsmischung transformiert. Das bFGF-Gen enthaltende Transformanten wurden durch Restriktionskartierung nachgewiesen, und die Sequenz des Konstrukts wurde durch Didesoxysequenzierung bestätigt. Das EcoRI/PstI-Fragment, welches das bFGF-Gen enthielt, wurde aus der RF-DNA durch Restriktion mit EcoRI und PstI und Elution aus einem Polyacrylamidgel isoliert. Dieses wurde in EcoRI/PstI-geschnittenen pCJ-1 ligiert, und E. coli JM107 wurde mit der Ligierungsmischung transformiert. bFGF-produzierende Kolonien wurden durch Wachstum auf Tet-Platten und Immunscreening mit Affinitäts-gereinigtem anti-bFGF-IgG selektiert.

Beispiel 11: Cytoplasmatische Expression in E. coli

Um die Expression von bFGF in einer solchen Form zu regulieren, daß bFGF im E. coli-Zytoplasma verbleibt, wurden die folgenden zweckorientierten Elemente verwendet: Der tac- Promotor auf dem Plasmid pCJ-1, der lac-Operator des Plasmids pCJ-1 und den lac-Repressor (lac Iq) auf dem Chromosom des E. coli-Stammes JM107, eine Shine-Dalgarno- Konsensussequenz und zur Initiation einer hohen Translationsrate ein als ein translationaler Kuppler zu verwendendes Omp A-Leaderpeptid. Die translationale Kupplungssequenz umfaßt die DNA, welche für die Translationsinitiationsregion des Omp A-Gens codiert, die ersten acht Aminosäuren des Omp A-Leaderpeptids, die vorstehend beschriebene Shine-Dalgarno-Konsensussequenz und einen translationalen Terminator. Die translationale Kupplungssequenz muß zwischen den lac-Operator und die Translationsinitiationsstelle des PAF-Gens eingebaut werden, wobei sie die letztere überlappt. (Die Merkmale des translationalen Kupplers sind in der DNA-Sequenz eingebracht, die mit den Adaptoren für sezernierende Expression in E. coli gezeigt ist.)
Das bFGF-Gen wurde wie folgt in das pCJ-1-Plasmid mit dem translationalen Kuppler eingebaut. Der Adaptor #3 und der Omp A-Translationskuppler wurden an das AvaI/PstI bFGF- Fragment aus dem in Beispiel 10 beschriebenen M13 mp19- Konstrukt angehängt. Dieses Fragment wurde aus einem Polyacrylamidgel gereinigt. Dieses Fragment wurde danach in EcoRI/PstI-geschnittenen M13 mp19 RF ligiert, und die Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli JM107-Zellen zu transformieren. Plaques, welche die bFGF-Genfusion enthielten, wurden durch Restriktionskartierung selektiert. Die Sequenz des Konstrukts wurde danach durch Didesoxysequenzierung bestätigt. Das EcoRI/PstI-Fragment, welches die bFGF-Genfusion enthielt, wurde aus einem Polyacrylamidgel eluiert und in EcoRI/PstI-geschnittenen pCJ-1 ligiert, und E. coli JM107-Zellen wurden mit der Ligierungsmischung transformiert. Tetracyclinresistenz zeigende Kolonien wurden selektiert, und die bFGF-Produktion wurde durch Immunscreening mit affinitätsgereinigtem antibFGF IgG bestätigt.
Fachleuten wird offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen in den erfindungsgemäßen Verfahren und Produkten hergestellt werden können. Folglich ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung diese erfindungsgemäßen Modifikationen und Variationen umfaßt, vorausgesetzt, daß sie innerhalb des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche und deren Äquivalente liegen.

Beispiel 12: Cytoplasmatische Expression in E. coli

Das in Beispiel 10 beschriebene M13 mp19- Sezernierungskonstrukt wurde mit NruI und NcoI geschnitten, und das große Fragment wurde aus einem Gel eluiert. Der Adaptor #6 wurde danach in die mit NruI/NcoI geschnittenen DNA ligiert. E. coli-Stamm JM107 wurde mit der Ligierungsmischung transformiert. Plaques, welche die bFGF- Genfusion enthielten, wurden durch Didesoxysequenzierung bestätigt. Das EcoRI/PstI-Fragment, welches die bFGF- Genfusion enthielt, wurde aus einem Polyacrylamidgel eluiert und in EcoRI/PstI-geschnittenen pCJ-1 ligiert, und E. coli JM107-Zellen wurden mit der Ligierungsmischung transformiert. Tetracyclinresistenz zeigende Kolonien wurden selektiert, und die bFGF-Produktion wurde durch Immunscreening mit Affinitäts-gereinigtem anti-bFGF IgG bestätigt. Adaptor #6 Nru-I-Stelle OF Omp Zur NcoI-Stelle von bFGF

Beispiel 13: Identifizierung von mRNA

Gesamt-RNA wurde aus den folgenden Zellinien isoliert: SK- HEP-1 humane Hepatomzellen, humane embryonale Lungen (HEL)- Zellen, RPMI 7272 humane Melanomzellen und Maussarkom-180- Zellen. Poly A plus Boten-RNA (mRNA) wurde danach mittels oligo (dT)-Zellulosechromatographie isoliert. 15 ug poly A plus RNA aus jeder der vorstehenden Zellinien wurde durch Elektrophorese in einem 1,25%-igem Agarose/Formaldehyd-Gel getrennt. Diese RNAs wurden auf eine Zeta-Probe-Membran transferiert. Eine cDNA-Probe für humanen basischen FGF aus SK-HEP-1 humanen Hepatomzellen (FGF 15, das EcoRI-Insert) wurde durch das NICK-Translationsverfahren mit ³²P-dCTP zu einer spezifischen Aktivität von 8,64 · 108 cpm/ug markiert. Hybridisierung der ³²P-bFGF-cDNA-Probe an die transferierte RNA wurde in 50% Formamid, 6 · SSC, 2 · Denhardt's Lösung, 1% SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 175 ug/ml tRNA für 16 Std. bei 42ºC durchgeführt. Die Zeta-Probe-Membran wurde danach in jeweils 1 Liter von 0,5 · SSC/1% SDS, 0,2 · SSC/1 % SDS, 0,1 · SSC/1% SDS für 15 min bei 65ºC und in 0,1 · SSC/1% SDS für 15 min bei 70ºC gewaschen. Die Membran wurde danach getrocknet und die Autoradiographie wurde für 1 und 3 Tage bei -80ºC durchgeführt. SK-HEP-1-Zellen, HEL-Zellen und RPMI 7272-Zellen enthielten jeweils vier RNA-Spezies mit Größen von 8,0 kb, 4,3 kb, 2,3 kb und 1,0 kb, welche an die vorstehend beschriebene cDNA-Probe hybridisierten. Die cDNA- Probe hybridisierte nicht an irgendeine RNA-Spezies aus Maussarkom-180-Zellen.

Claims

1. Angiogener Faktor (bFGF), umfassend ein gereinigtes, humanes oder synthetisches Einzelkettenpolypeptid-Protein, welches wesentliche Homologie zu dem aus humanem Plazentagewebe (post partum) isolierbaren, nativen angiogenen Faktor besitzt, worin der angiogene Faktor mindestens eine aktive Stelle aufweist, die eine Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mitogener Aktivität, chemotaktischer Aktivität, der Fähigkeit, Proteasesynthese zu stimulieren und Kombinationen davon, besitzt, wobei der angiogene Faktor die Aminosäuresequenz umfaßt:

und wahlweise

Y-()-S-W-Y-V-()-L-()

2. Angiogener Faktor nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz:

3. Angiogener Faktor, worin sich die Aminosäuresequenz des Proteins von der Sequenz in Anspruch 2 durch einen Aminosäurerest unterscheidet.

4. Angiogener Faktor, worin sich die Aminosäuresequenz des Proteins von der Sequenz in Anspruch 2 durch zwei Aminosäurereste unterscheidet.

5. Angiogener Faktor nach Anspruch 2, worin das Protein N-terminal geschützt ist.

6. Angiogener Faktor nach Anspruch 1, worin der angiogene Faktor aus humaner Plazenta (post partum) in einer im wesentlichen gereinigten Form isoliert ist.

7. Verfahren zum Gewinnen eines angiogenen Faktors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in reiner Form aus Gewebe, umfassend:

(a) Sammeln von Gewebe, welches fähig ist, den angiogenen Faktor herzustellen;

(b) Isolieren des angiogenen Faktors aus dem Gewebe durch Fraktionieren des proteinhaltigen Materials in dem Gewebe;

(c) Identifizieren der Fraktionen, welche die Aktivität des angiogenen Faktors besitzen;

(d) Konzentrieren der Fraktionen, welche die Aktivität des angiogenen Faktors ausüben.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Gewebe, welches fähig ist, den angiogenen Faktor herzustellen, humanes Plazentagewebe ist.

9. Verfahren zur Herstellung des angiogenen Faktors nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend:

(a) Exprimieren des angiogenen Faktors in einem transformierten Mikroorganismus; und

(b) in beliebiger Reihenfolge, Isolieren und Reinigen des exprimierten angiogenen Faktors.

10. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend die weiteren Schritte des:

(1) Isolierens einer DNA-Sequenz, die für den angiogenen Faktor kodiert;

(2) Einsetzens der DNA-Sequenz in einen Vektor, welcher zur Expression in einem Wirtsmikroorganismus fähig ist;

(3) Transformierens des die DNA-Sequenz enthaltenden Vektors in einen Wirtsmikroorganismus, welcher zur Expression des angiogenen Faktors fähig ist, vor der Durchführung der Schritte (a) und (b).

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der Wirtsmikroorganismus mit pGS286-PAF transformiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der Wirtsorganismus E. coli ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der Wirtsorganismus eine Hefe ist.

14. DNA-Sequenz, welche eine protein-kodierende Sequenz umfaßt, die für den angiogenen Faktor nach den Ansprüchen 1 bis 6 kodiert.

15. DNA-Sequenz nach Anspruch 14, worin die Protein-kodierende Sequenz erhältlich ist durch Screenen genomischer oder cDNA-Banken mit DNA-Proben, die auf der Basis der Aminosäuresequenz nach Anspruch 2 hergestellt sind.

16. DNA-Sequenz nach Anspruch 14 oder 15, worin die Proteinkodierende Sequenz für den angiogenen Faktor nach den Ansprüchen 1 bis 6 kodiert und der Faktor aus humaner Plazenta (post partum) isoliert ist.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 14 bis 16, umfassend die Protein-kodierende Sequenz:

18. Rekombinanter Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, welche für einen angiogenen Faktor nach den Ansprüchen 1 bis 6 kodiert.

19. Wirtsmikroorganismus, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 17.