DK172480B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af moden human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) eller et human IGF-I-fusionsprotein, eksp - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af moden human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) eller et human IGF-I-fusionsprotein, eksp Download PDFInfo
- Publication number
- DK172480B1 DK172480B1 DK198402761A DK276184A DK172480B1 DK 172480 B1 DK172480 B1 DK 172480B1 DK 198402761 A DK198402761 A DK 198402761A DK 276184 A DK276184 A DK 276184A DK 172480 B1 DK172480 B1 DK 172480B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- igf
- human igf
- ecori
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title claims description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 73
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 title claims description 65
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 title claims description 52
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 title claims description 50
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 title description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 103
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 98
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 78
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 58
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 50
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 46
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 46
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 27
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 27
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 27
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 25
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 21
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 21
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 11
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 8
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 8
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- -1 ATCC No. 44 Chemical compound 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108010065349 preinvertase Proteins 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 description 1
- WNSWCXXTAZKJAS-UHFFFAOYSA-N 2h-tetrazole;2,4,6-tri(propan-2-yl)benzenesulfonyl chloride Chemical compound C1=NN=NN1.CC(C)C1=CC(C(C)C)=C(S(Cl)(=O)=O)C(C(C)C)=C1 WNSWCXXTAZKJAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021587 Embryonic testis differentiation protein homolog A Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000898120 Homo sapiens Embryonic testis differentiation protein homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000018819 Protein Translocation Systems Human genes 0.000 description 1
- 108010052646 Protein Translocation Systems Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 1
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005152 placental membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i DK PR 172480 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) i forskellige former via rekombinant-DNA-teknologi. Navnlig muliggør opfindelsen fremstillingen af human IGF-I som et modent 5 proteinprodukt af ekspression, forarbejdning og sekretion i en rekombinant-DNA-modificeret værtsorganisme. Opfindelsen muliggør yderligere produktion, isolering og anvendelse af human IGF-I i dens forskellige former såvel som den dermed forbundne rekombinant-DNA-teknologi, hvorved den fremstil-10 les.
Opfindelsen stammer delvis fra erkendelsen af et hidtil ukendt system, hvorved human IGF-I kan fremstilles af en rekombinant værtsorganisme i form af et særskilt, modent 15 protein. Dette gennemføres ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse ved hjælp af et ekspressionssystem, som muliggør ekspression af aminosyresekvensen af human IGF-I sammensmeltet med mindst en del af gær-a-faktor-signalse-kvensen efterfulgt af forarbejdning af den nævnte signal-20 sekvens og sekretion af modent human IGF-I-protein til mediet, som understøtter værtsorganismen. Således muliggør dette hidtil ukendte aspekt af opfindelsen for første gang, antages det, fremstillingen, isoleringen og udnyttelsen af human IGF-I som et særskilt, modent protein. Opfindelsen 25 omfatter imidlertid, i dens brede sigte, fremstillingen af aminosyresekvensen af human IGF-I i andre rekombinante systemer, inklusive bakterier og cellekulturer, og inkluderer derfor ekspressionen af human-IGF-I-DNA-sekvenser, som giver ikke blot moden human IGF-I, men også fusionsprodukt-30 derivater indeholdende aminosyresekvensen af IGFI som den væsentlige komponent.
Alle sådanne produkter har vist sig at være biologisk aktive og dermed nyttige som angivet.
35 DK PR 172480 B1 2
De publikationer og andre materialer, som anvendes til at belyse opfindelsens baggrund og i særlige tilfælde til at give yderligere detaljer vedrørende dens udøvelse, betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvis-5 ning og er af nemhedsgrunde samlet i den vedføjede bibliografi, til hvis numre der henvises i den følgende tekst.
Opfindelsens baggrund 10 A. Human IGF (insulinlignende vækstfaktor)
Human IGF har været genstand for en ret omfattende og intensiv undersøgelse af tidligere forskere. En stor samling litteratur er blevet udviklet vedrørende forskellige 15 aspekter af dette protein eller denne række proteiner (se referencerne A-L).
Insulinlignende vækstfaktorer I og II er blevet isoleret fra humant serum (A). Betegnelsen "insulinlignende vækst-20 faktor" eller IGF blev valgt for at udtrykke de insulinlignende virkninger og den insulinlignende struktur af disse polypeptider, der virker som mi togener på et antal celler. De komplette aminosyresekvenser af IGF-I og IGF-II er blevet bestemt (D, E). De er begge enkeltkædede polypep-25 tider med tre disulfidbroer og en sekvensidentitet på henholdsvis 49 og 47 % med human insulin A og B kæder. Det forbindende peptid eller C-området er betydeligt kortere end det tilsvarende i proinsulin og udviser ikke nogen signifikant homologi med det. (Med hensyn til en sammen-30 fatning af tidligere undersøgelser vedrørende de biologiske virkninger af IGF, se reference F).
IGF-I og IGF-II er vækstfremmende polypeptider, som forekommer i humant serum og human cerebral spinalvæske. Deres 35 struktur er homolog med proinsulin. IGF-I synes at blive produceret af leveren sammen med et specifikt IGF-bindende 3 DK PR 172480 B1 protein, idet begge er under styring af væksthormon. Således anses human IGF for at være et aktivt vækstfremmende molekyle, som formidler virkningen af humant væksthormon.
5 Det blev antaget, at anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi og dermed forbundne teknologier ville være en meget effektiv måde at tilvejebringe de nødvendige store mængder højkvalitets human-IGF på til anvendelse på mennesker som vækstfaktor. Målet var at producere human IGF enten som 10 biologisk aktivt fusionsprotein eller, mere vigtigt, som modent protein, som produkter af rekombinant-DNA-teknologi fra en værtsorganisme. Sådanne materialer ville udøve bioaktivitet, som ville tillade deres anvendelse klinisk til behandling af forskellige vækstpåvirkede tilstande.
15 B. Rekombinant-DNA-teknologi
Rekombinant-DNA-teknologi har nået en vis forfinelse. Molekylærbiologer er i stand til at rekombinere forskellige 20 DNA-sekvenser med nogen lethed og skabe nye DNA-enheder, som er i stand til at producere rigelige mængder af exogent proteinprodukt i transformerede mikroorganismer og cellekulturer. De almene midler og metoder er for hånden til in vitro ligering af forskellige DNA-fragmenter med stumpe 25 eller kohæsive ender til produktion af kraftige ekspressionsmedier, som er nyttige til transformation af bestemte organismer og dermed dirigering af deres effektive syntese af det ønskede exogene produkt. Imidlertid forbliver vejen, når det kommer til det enkelte produkt, noget omstændelig, 30 og videnskaben er ikke nået frem til et stadium, hvor regulære forudsigelser af heldige resultater kan foretages.
Faktisk løber de, som påberåber sig heldige resultater uden det underliggende forsøgsgrundlag, en betydelig risiko for, at det ikke virker.
35 DK PR 172480 B1 4 DNA-rekombination af hovedelementerne, dvs. et replika-tionsorigin, en eller flere fænotypiske selektionsegenskaber, en ekspressionspromotor, en heterolog genindsætning og resten af vektoren, gennemføres almindeligvis uden for 5 værtscellen. Det resulterende rekombinante replikerbare ekspressionsmedium, eller plasmidet, indføres i celler ved transformation, og der opnås store mængder af det rekombinante medium ved dyrkning af transformanterne. Hvor genet er rigtigt indsat med hensyn til portioner, som styrer 10 transcriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, er det resulterende ekspressionsmedium praktisk anvendeligt til at producere den polypeptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces, der betegnes som ekspression. Det resulterende produkt kan opnås ved lyse af 15 værtscellen i mikrobielle systemer, om nødvendigt, og udvinding af produktet ved passende rensning fra andre proteiner.
I praksis kan anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi 20 udtrykke helt heterologe polypeptider, såkaldt direkte ekspression, eller den kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid sammensmeltet med en del af aminosyresekvensen af et homologt polypeptid. I de sidstnævnte tilfælde gøres det ønskede bioaktive produkt bioinaktivt i det sammensmel-25 tede, homologt/heterologe polypeptid, indtil det spaltes i et ekstracellulært miljø; Se referencerne (M) og (N).
På lignende måde er anvendelsen af celle- eller vævskulturer til studium af genetik og cellefysiologi veletable-30 ret. Der rådes over midler og metoder til opretholdelse af permanente cellelinier, fremstillet ved successive rækkeoverførsler fra isolerede normale celler. Til anvendelse inden for forskning opretholdes sådanne cellelinier på en fast bærer i flydende medium eller ved vækst i suspension 35 indeholdende bærernæringsstoffer. Opskalering til præparationer i stor målestok synes kun at frembyde mekaniske DK PR 172480 B1 5 problemer. Med hensyn til yderligere baggrund rettes opmærksomheden mod referencerne (0) og (P).
Ligeledes er proteinbiokemien et nyttigt, i virkeligheden 5 nødvendigt, vedhæng til bioteknologien. Celler, som producerer det ønskede protein, producerer også hundreder af andre proteiner, endogene produkter af cellens metabolisme.
Hvis ikke disse forurenende proteiner såvel som andre forbindelser fjernes fra det ønskede protein, kunne dette 10 vise sig toxisk, hvis det indgives til et dyr eller menneske under forløbet af en terapeutisk behandling med det ønskede protein. Derfor kommer proteinbiokemiens teknikker til deres ret, idet de muliggør udformningen af adskillelsesprocedurer, som er egnede for det bestemte 15 omhandlede system og tilvejebringer et homogent produkt, som er sikkert til den påtænkte anvendelse. Proteinbiokemien beviser også identiteten af det ønskede produkt, karakteriserer det og sikrer, at cellerne har produceret det pålideligt uden nogen ændringer eller mutationer. Denne 20 videnskabsgren er altså involveret i udformningen af bioprøvninger, stabilitetsundersøgelser og andre procedurer, som det er nødvendigt at udøve, før heldige kliniske undersøgelser og markedsføring kan finde sted.
25 Sammenfatning af opfindelsen
Den foreliggende opfindelse bygger på den erkendelse, at rekombinant-DNA-teknologi kan anvendes med held til at producere human IGF-I, fortrinsvis i direkte form og i til-30 strækkelige mængder til at starte og gennemføre afprøvning på dyr og klinisk afprøvning som forudsætninger for markedsgodkendelse. I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af moden human IGF-I eller et human IGF-I-fusionsprotein, hvilken fremgangsmåde 35 er særegen ved det, der er angivet i krav l's kendetegnende del.
DK PR 172480 B1 6
Human IGF-I-produktet er egnet til brug i alle dets former, som produceres ifølge den foreliggende opfindelse, nemlig til profylaktisk eller terapeutisk behandling af mennesker for forskellige vækstafhængige tilstande eller sygdomme. I 5 overensstemmelse hermed angår opfindelsen i et vigtigt aspekt anvendelsen af human IGF-I eller et human IGF-I-fusionsprotein, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, til fremstilling af farmaceutiske præparater.
10 Opfindelsen tilvejebringer i hovedsagen ren moden human IGF-I som produkt af ekspression, forarbejdning og sekretion i en rekombinant værtsorganisme. Sådan human IGF-I er fri for forbindelse med en N-terminal aminosyresekvens afledt fra de ekspressionssystemer, som kan anvendes til at 15 fremstille materialet. Selv om den foreliggende opfindelse er rettet mod fremstillingen af polypeptider omfattende aminosyresekvensen af IGF-I, involverer et bemærkelsesværdigt aspekt af opfindelsen således produktionen af den modne humane IGF-I direkte ud i mediet for den anvendte 20 rekombinante værtsorganisme. Opfindelsen er også rettet mod replikerbare DNA-ekspressionsmedier, som indeholder gensekvenser, der koder for human IGF-I i udtrykkelig form, mikroorganismestammer eller cellekulturer transformeret med sådanne medier og mikroorganisme- eller cellekulturer af 25 sådanne t r ans f orman ter, som er i stand til at producere aminosyresekvenser af human IGF-I. I endnu andre aspekter er opfindelsen rettet mod forskellige fremgangsmåder, som er nyttige til fremstilling af de nævnte gensekvenser, DNA-ekspressionsmedier, mikroorganismer og cellekulturer og 30 specifikke udførelsesformer deraf. Endvidere er opfindelsen rettet mod fremstillingen af gæringskulturer af de nævnte mikroorganismer og cellekulturer.
DK PR 172480 B1 7
Detailbeskrivelse
Opfindelsen skal i det følgende beskrives nærmere under henvisning til tegningen på hvilken 5 fig. 1 repræsenterer de kemisk syntetiserede DNA-strenge, som anvendes ved konstruktionen af ekspressionsvektorer for human IGF-I; 10 fig. 2 viser den fuldførte dobbeltstrengede DNA i fig. 1; fig. 3 viser fragmenterne af DNA fra fig. 2 efter restriktion med EcoRI og PstI og BamHI; 15 fig. 4 af bilder ligeringen af delene 1 og 2 i fig. 3 ind i pBR322; fig. 5 viser delene 3 og 4 af IGF-I højre halvdel; 20 fig. 6 af bilder ligeringen af delene 3 og 4 fra fig. 5 ind i vektoren fra fig. 4; fig. 7 viser en sekvens af DNA og det deraf afledte fusionsprotein indeholdende IGF-I; 25 fig. 8 viser en sekvens af DNA og det deraf afledte korte fusionsprotein indeholdende IGF-I; fig. 9 afbilder et plasmid, som anvendes ved den omhandlede 30 konstruktion; fig. 10 viser DNA'en og proteinsekvensen af IGF-I sammen-smeltet med α-faktor-præ-pro-sekvensen; 35 fig. 11 er en vektor indeholdende oc-faktor-promotor og præ-pro-sekvens sammensmeltet med IGF-I; DK PR 172480 B1 8 fig. 12 viser gær-invertase-signalet sammensmeltet med IGF-I; £ig. 13 viser udgangsplasmidet indeholdende gær-PGK-promo-5 toren; fig. 14 afbilder en gærekspressionsvektor indeholdende PGK-promotor, invertasesignal og humant IGF-I-gen; 10 A. Definitioner I denne beskrivelse betyder "human IGF" human insulinlignende vækstfaktor produceret af mikroorganisme- eller cellekultursystemer og bioaktive former omfattende aminosyre-15 sekvensen svarende til human IGF som iøvrigt er nativ for humant væv. De her producerede human IGF-I-proteiner er blevet defineret ved hjælp af DNA-sekvensbestemmelse, gen-sekvensbestemmelse og deduktiv aminosyresekvensbestemmelse.
Det vil forstås, at for så vidt der forekommer naturlige 20 alleliske variationer fra individ til individ som påvist ved en eller flere aminosyreforskelle i den samlede sekvens eller ved deletioner, udskiftninger, indsætninger, ombytninger eller tilføjelser af en eller flere aminosyrer i de nævnte sekvenser, skal opfindelsen omfatte alle sådanne 25 alleliske variationer af de to involverede molekyler. Desuden afhænger beliggenheden og graden af glycosylering af arten af den anvendte rekombinante værtsorganisme, og sådanne variationer, der måtte forekomme, er inkluderet i opfindelsens omfang. Endelig er der ved anvendelsen af DNA-30 teknologi mulighed for fremstilling af forskellige derivater af human IGF-I ved simpel modificering af den underliggende gensekvens for sådanne molekyler. Sådanne modifikationer kunne gennemføres ved hjælp af f.eks. steddirigeret mutagenese af den underliggende DNA. Alle sådanne modifika-35 tioner, som resulterer i derivater af human IGF-I, er Inkluderet i opfindelsens omfang, så længe de nødvendige DK PR 172480 B1 9 karakteristiske aktiviteter af human IGF-I forbliver upåvirkede i deres art.
"Hovedsageligt ren form” betyder, når det anvendes til at 5 beskrive tilstanden af human IGF-I produceret ifølge opfindelsen, at proteinerne er frie for proteiner eller andre materialer, der normalt er forbundet med human IGF-I produceret af ikke-rekombinante celler, dvs. i deres "native" miljøer.
10 "Ekspressionsvektor" Inkluderer vektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-sekvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er operabelt forbundet med andre sekvenser, som er i stand til at frembringe deres ekspression, dvs. promo-15 tor/operator-sekvenser. Sammenfattende gives ”ekspressions-vektor" en funktionel definition: enhver DNA-sekvens, som er i stand til at frembringe ekspression af en specificeret DNA-kode anbragt deri. I almindelighed er ekspressionsvektorer med anvendelighed inden for rekombinant-DNA-teknik 20 ofte i form af "plasmider", som betegner cirkulære dobbeltstrengede DNA-løkker, som i deres vektorform ikke er bundet til kromosomet. I denne beskrivelse med krav anvendes "plasmid" og "vektor" valgfrit, da plasmidet er den mest almindeligt anvendte form af vektor. Imidlertid skal opfin-25 delsen inkludere sådanne andre former af ekspressionsvektorer, som fungerer ækvivalent, og som senere måtte blive kendt inden for faget.
"Rekombinante værtsceller" henfører til celler, som er ble-30 vet transformeret med sådanne vektorer. Således kan human-IGF-I-molekylerne produceret af sådanne celler betegnes som "rekombinant human IGF-I".
DK PR 172480 B1 10 B. Værtscellekulturer og vektorer
De her angivne vektorer og fremgangsmåder er egnet til anvendelse i værtsceller over et bredt område af prokaryo-5 tiske og eukaryotiske organismer.
I almindelighed foretrækkes selvfølgelig prokaryoter til kloning af DNA-sekvenser ved konstruktion af vektorer, som er nyttige i forbindelse med opfindelsen. F.eks. er E. coli 10 K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig nyttig. Andre mikroorganismestammer, som kan anvendes, inkluderer E. coli stammer, såsom E. coli B og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537).
De førnævnte stammer såvel som E. coli W3110 (F", 1', prototroph, ATCC nr. 27325), bacilli, såsom Bacillus 15 subtilis og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, og forskellige Pseu-domonas-arter, kan anvendes. Disse eksempler er selvfølgelig tænkt som belysende frem for begrænsende.
20 I almindelighed anvendes plasmidvektorer indeholdende replicon og styresekvenser, som er afledt fra arter, der er kompatible med værtscellen, i forbindelse med disse værter.
Vektoren bærer almindeligvis et replikationssted såvel som markeringssekvenser, som er i stand til at frembringe 25 fænotypisk selektion i transformerede celler. F.eks. transformeres E. coli typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli art (Bolivar et al., Gene 2: 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclin-resistens og tilvejebringer således lette 30 midler til identifikation af transformerede celler. pBR322-plasmidet eller et andet mikrobielt plasmid må også indeholde eller modificeres til at indeholde promotorer, som kan anvendes af mikroorganismen til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, som mest almindeligt anven-35 des ved rekombinant-DNA-konstruktion, inkluderer β-lacta-mase- (penicilianase) og lactose-promotorsystememe (Chang DK PR 172480 B1 11 et al., Nature, 275: 615 (1978); Itakura et al.. Science, 198: 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)) og et tryptophan- (trp) promotorsystem (Goeddel et al.,
Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980); EP offentiiggørel- 5 sesskrift nr. 0 036 776). Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er der blevet opdaget og anvendt andre mikrobielle promotorer, og detaljer vedrørende deres nucleo-tidsekvenser er blevet offentliggjort, således at en fagmand sættes i stand til at ligere dem funktionelt med 10 plasmidvektorer (Siebenlist et al., Cell 20: 269 (1980)).
Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer. Saccharomyces cerevi-siae eller almindelig bagegær er den mest almindeligt 15 anvendte blandt eukaryotiske mikroorganismer, selvom et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige. Til ekspression i Saccharomyces anvendes f.eks. almindeligvis plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979);
Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., 20 Gene 10: 157 (1980)). Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutant stamme gær, som mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC nr. 44 076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 (1977)). Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en 25 karakteristisk egenskab ved gærværtscellegenomet giver derpå et effektivt miljø til detektering af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.
Egnede promoterende sekvenser i gærvektorer inkluderer pro-30 motorerne for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968);
Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978)), såsom eno-lase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, 35 pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phos-phat-isoroerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, DK PR 172480 B1 12 triosephosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og gluco-kinase. Ved konstruktion af egnede ekspressionsplasmider ligeres afslutningssekvenserne forbundet med disse gener også ind i ekspressionsvektoren 3' for sekvensen, der 5 ønskes udtrykt, for at give polyadenylering af mRNA'en og afslutning. Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transcriptionen styres af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med 10 nitrogenmetabolismen og den førnævnte glyceraldehyd-3-phos-phat-dehydrogenase og enzymer, som er ansvarlige for maltose- og galactoseudnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plas-midvektor indeholdende gærkompatibel promotor, replika-tionsorigin og afslutningssekvenser er egnet.
15
Foruden mikroorganismer kan også kulturer af celler afledt fra gærcelleorganismer anvendes som værter. I princippet er enhver sådan cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Imidlertid har interessen 20 været størst for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de senere år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på sådanne nyttige værtscellelinier er VERO- og HeLa-celler, kinseisk-25 hamster-ovarie-(CHO) cellelinier og W138-, BHK-, C0S-7- og MDCK-cellelinier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et replikations-origin, en promotor anbragt foran genet, som skal udtrykkes, sammen med alle nødvendige ribosombindingssteder, 30 RNA-splejsningssteder, polyadenyleringssted og transcrip-tionsterminatorsekvenser.
Til anvendelse i pattedyrceller tilvejebringes styringsfunktionerne på ekspressionsvektorerne ofte ved hjælp af 35 viralt materiale. F.eks. afledes almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2 og oftest abevirus 40 DK PR 172480 B1 13 (SV40). Den tidlige og den sene promotor fra SV49 virus er særlig nyttige, fordi begge opnås let ud fra viruset som et fragment, der også indeholder det virale SV40 replika-tionsorigin ((Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978), der 5 betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne reference). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forudsat der er inkluderet den sekvens på omkring 250 bp, som strækker sig fra Hindi 11-stedet til Bgll-stedet lokaliseret i det virale replikationsorigin. Endvidere er 10 det også muligt, og ofte ønskeligt, at anvende promotoreller styresekvenser, som normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat sådanne styresekvenser er kompatible med værtscellesysternerne.
15 Et replikationsorigin kan tilvejebringes enten ved konstruktion af vektoren, så den inkluderer et exogent origin, som det f.eks. kan afledes fra SV40 eller anden viral (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV osv.) kilde, eller kan tilvejebringes af værtscellens kromosomale replikations-20 mekanisme. Hvis vektoren integreres i værtscellekromosomet, er det sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.
C. Anvendte metoder 25 Hvis celler uden formidable cellevævægbarrlerer anvendes som værtsceller, udføres transfektion ved calciumphosphat-fældningsmetoden som beskrevet af Graham og Van der Eb,
Virology 52: 546 (1978). Imidlertid kan der også anvendes andre metoder til indførelse af DNA i celler, såsom kærne-30 injektion eller protoplastfusion.
Hvis der anvendes prokaryotiske celler eller celler, som indeholder væsentlige cellevægkonstruktioner, er den foretrukne transfektionsmetode calciumbehandling under anven-35 delse af calciumchlorid som beskrevet af Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).
DK PR 172480 B1 14
Konstruktion af egnede vektorer indeholdende de ønskede kode- og styresekvenser udføres under anvendelse af stan-dard-ligeringsteknik. Isolerede plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, tilpasses og religeres i den ønskede form 5 til dannelse af de nødvendige plasmider.
Spaltning gennemføres ved behandling med en eller flere restriktionsenzymer i en egnet puffer. I almindelighed anvendes omkring 1 mg plasmid eller DNA-fragment med 10 omkring 1 enhed enzym i omkring 20 ml pufferopløsning.
(Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret af producenten). Inkubationstider på omkring 1 time ved 37 *C er brugbare. Efter inkubationer fjernes protein ved ekstraktion med phenol og 15 chloroform, og nucleinsyren udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.
Hvis der kræves stumpe ender, behandles præparatet i 15 minutter ved 15 *C med 10 enheder Polymerase I (Klenow), 20 phenol/chloroform-ekstraheres og ethanol-fældes.
Størrelseseparation af de spaltede fragmenter gennemføres under anvendelse af 6 % polyacrylamidgel som beskrevet af Goeddel, D., et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980), der 25 betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.
Til ligering behandles omkring ækvimolære mængder af de Ønskede komponenter, passende tildannet i enderne til at 30 give korrekt tilpasning, med omkring 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 ug DNA. (Når der anvendes spaltede vektorer som komponenter, kan det være nyttigt at forhindre relige-ring af den spaltede vektor ved forbehandling med bakteriel alkalisk phosphatase).
35 DK PR 172480 B1 15
Til analyse for at bekræfte korrekte sekvenser i konstruerede plasmider anvendes ligeringsbiåndingerne til at transformere E. coli K12 stamme 294 (ATCC 31446), og heldige transformanter selekteres ved ampicillinresistens, hvor det 5 er passende. Der præpareres plasmider fra transformanterne, og de analyseres ved restriktion og/eller sekvensbestenunes ved den metode, der er beskrevet af Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller den, der er beskrevet af Maxam et al.. Methods in Enzymology 65: 499 (1980).
10
EKSEMPLER
De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opf indelsen.
15
Betingelser ved syntese og ekspression af human IGF-I Enzymer blev fremskaffet fra følgende leverandører: 20 New England Biolabs: restriktionsenzymer, T4-DNA-liga- se.
Bethesda Research Labs: restriktionsenzymer, bakteriel alkalisk phosphatase.
25
Boehringer-Mannheim: E. coli DNA polymerase I (Klenow).
P+L Biochemicals: polynucleotidkinase, terminalnucleo-tidyl-transferase.
30
Plasmid:
New England Nuclear: pBR322 [med oligo(dG)-hale] DNA Reagenser: 35 BioRad: bis-acrylamid, acrylaraid, TEMED.
Sigma: ammoniumpersulfat DK PR 172480 B1 16
Amersham: 10218 γ32Ρ ATP >5000 Ci/mmol, 10165 a32P dCTP >400 Ci/mmol.
Opløsninger og medier: IX TBE: 0,54 M "Tris"-base, 0,54 M borsyre, 0,017 M Na^EDTA.
5 Difco: Gærnitrogenbase (GNB), trypton, gærekstrakt, "Bacto"-agar, "Casamino"-syrer (CAA).
Autoradiografi: "Kodak"-X-0 mat AR XAR-2 film 10
Glasperler: 0,45-0,50 mM fra B. Braun Melsungen AG.
LB-medium (pr. liter):
15 10 g NaCl, 5 g gærekstrakt, 10 g trypton, 0,17 ral NaOH
(50 %).
LB-agar (pr.liter): 10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl, 15 g 20 "Bacto"-agar, indstillet til pH 7,5 med NaOH.
Antibiotica: tetracyclin (5 μg/ml) i alle medier, ampicillin (20 μg/ml) i alle medier (plader eller væske).
25 M9-Medium (pr. liter): 6 g Na2HP04 (vandfrit), 1 g NH4C1, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl, 1 mM MgS04, 0,5 % (vægt/vol. ) glucose, 0,5 % (vægt/vol.) "Casamino"-syrer, 0,001 thiamin-HCl.
30 GNB-CAA (pr. liter): 6,7 g gærnitrogenbase (uden aminosyrer), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g "Casamino"-syrer, 20 g glucose.
DK PR 172480 B1 17 GNB-CAA agarplader (pr. liter): samme som GNB-CAA + 30 g agar.
Standard-ligeringsbetingelser: 5 10-gange molært overskud af indsætning (eller linker) i forhold til vektor; IX T4-DNA-ligase-puffer og 400-800 enh. T4-DNA-ligase/ 14 *C, 12-16 timer.
Standard-kineringsbetingelser: 10 IX polynucleotidkinase-puffer, 15 enh. polynucleotidki- nase, 37 *C, 60 minutter; efterfulgt af reaktionsaf slutning ved opvarmning til 65 *C i 10 minutter.
IX kinase-puffer: 15 70 mM "Tris"-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl,, 5 mM DTT.
IX T4-DNA-ligase-puffer: 50 mM "Tris"-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl;, 20 mM DTT, 1 mM rATP.
20
Konstruktion, strategi og selektion af en DNA-sekvens
Den primære proteinstruktur af det humane IGF-I-molekyle er blevet bestemt (1). Baseret på denne proteinsekvens og den 25 genetiske kode blev en DNA-sekvens, som koder for modent humant IGF-I-protein, inklusive alle mulige basesubstitutioner ved hver enkelt baseposition, bestemt ved datamatanalyse (Genentech Untrans Program). Under anvendelse af et restriktionsstedanalyseprogram (Genentech Asearch Program) 30 fandtes alle potentielle restriktionssteder lokaliseret i alle mulige DNA-sekvenser, som vedblivende koder for det samme protein. Tre steder internt i kodesekvensen blev udvalgt: PstI, BamHI og Avail. To yderligere steder blev placeret ved enderne, lige ud for kodesekvensen for det 35 modne protein: et EcoRI-sted foran startkodonen AUG, og
Sall-stedet efter kodesekvensens afslutningskodon, TAG.
DK PR 172480 B1 18
Valget af disse steder lettede kloningen af kodesekvensen i separate dele, som derefter hver kunne udskæres og derpå samles til dannelse af et intakt syntetisk IGF-I-gen. Denne konstruktion involverede samlingen af fire dele: to dele, 5 som udgør den venstre halvdel, og to dele, scxn udgør den højre halvdel. Hver del bestod af to enkeltstrenge af kemisk syntetiseret DNA (se fig. 1). De foreslåede syntetiske fragmenter blev også analyseret for indre komplementaritet .
10
De konstruktioner, som anvendtes til at skabe disse fire dele, gjorde brug af DNA-Polymerase I reparationssyntesen af syntetiske oligonucleotidsubstrater med 9-10 bp strækninger af komplementær sekvens ved deres 3’-ender. I nærvær 15 af DNA-Polymerase-I (Klenow) og de fire deoxynucleosid-triphosphater, blev disse primer-skabeloner forlænget til f uld-længde dobbeltstrengede DNA*er. For at forhindre priming ved andre steder end de ønskede portioner såvel som selv-hybridiseringer blev hvert sæt af enkelt-strengede 20 DNA'er analyseret ved hjælp af et datamat-program (Genen-tech Homology Program), og hvor det var muligt, blev sekvenser, som potentielt ville have ført til hårnåleløkker, selv-priming eller mls-priming, elimineret ved anvendelse af alternative codoner. Hver af disse fire 25 dobbeltstrengede DNA'er blev syntetiseret til at inkludere 9-12 yderligere basepar af ikke-IGF-I-kodende DNA ved hver ende (se fig. 2). Denne yderligere DNA blev inkluderet for at tillade skabelse af kohæsive ender ved restriktionsenzymnedbrydning. De således dannede kohæsive ender lettede 30 ligeringen af de dobbeltstrengede stykker til fortløbende kodesektioner af det syntetiske gen eller til et kloningsmedium .
De 9-12 ekstra basepar af dobbeltstrenget DNA ud over 35 restriktionsstedet ved enden af hver del (se fig. 2) muliggjorde den TdT-formidlede dannelse af enkeltstrengede DK PR 172480 B1 19 oligodeoxycytidinstrenge ved 3' -enderne af hver dobbeltstrenget: DNA-sektion. Disse med oligodeoxycytidinhale forsynede dobbeltstrengede DNA'er kunne derpå anneales ind i et komplementært, med oligodeoxyguanosinhale forsynet Pstl-5 sted i et kloningsmedium. Når de først er klonet og sekvensbestemt for at sikre de korrekte basesekvenser, vil delene let kunne isoleres og ligeres efter restriktionsenzymspaltning ved de valgte restriktionssteder ved enderne af hver af de fire dele til dannelse af det intakte synte-10 tiske IGF-I-gen.
Den fremgangsmåde, som her blev anvendt med held, var mage til den, der er beskrevet af Rossi et al. (28); imidlertid slog forsøg på konstruktion og kloning af den IGF-I-kodende 15 sekvens under anvendelse af Rossi et al. metoden (28) med kun to basepar af ekstra DNA ud over restriktionsenzym-genkendelsesstedeme gentagne gange fejl. Den her anvendte fremgangsmåde adskiller sig altså fra Rossi et al. proceduren (28) ved, at restriktionssteder anbragt ved begge 20 ender af en dobbeltstrenget DNA muliggør hensigtsmæssig kloning af hvert dobbeltstrenget DNA-fragment individuelt ved (dC) -halepåsætning og sammensmeltning med en med (dG)-hale forsynet vektor, en fremgangsmåde som i praksis kræver mindre af den dobbeltstrengede DNA end tre-parts-ligerin-25 ger.
Kemisk syntese
Otte fragmenter, med længder på 43, 43, 46, 46, 46, 46, 54 30 og 46 baser (se fig. 1) blev syntetiseret kemisk ifølge den metode, der er beskrevet af Crea og Horn (2), idet den eneste ændring var anvendelsen af mesitylennitrotriazol som kondenseringsmiddel fremfor 2,4,6-triisopropylbenzensulfo-nylchloridtetrazol.
35 DK PR 172480 B1 20
Synteserne af fragmenterne gennemførtes ud fra den faste bærer (cellulose) ved sekventiel addition af de passende fuldt beskyttede dimer- eller trimer-blokke. Cyclerne blev udført under de samme betingelser som beskrevet ved synte-5 sen af oligothymidilsyre (se Crea et al., ovenfor). De endelige polymere blev behandlet med base (koncentreret ammoniakvand) og syre (80 % eddikesyre), polymeren blev pelleteret af, og supematanten blev inddampet til tørhed. Remanensen, opløst i 4 % ammoniakvand, blev vasket med 10 ethylester (3 x) og anvendt til isolering af det fuldstændigt afbeskyttede fragment.
Rensning blev gennemført ved elektroforese under anvendelse af 20 % polyacrylamidgeler. Det rene oligonucleotid blev 15 ethanolfældet efterfulgt af geleluering.
225-285 pmol af hvert kemisk syntetiseret fragment blev blandet med en ækvivalent mængde af det komplementære enkeltstrengede DNA-fragment (dvs. 1L+3L; 2L+4L; 1R+3R, 20 2R+4R) i nærvær af deoxyribonucleosidtriphosphater i en slutkoncentration på 200 μΜ med undtagelse af dCTP. dCTP tilsattes til en koncentration på 5 μΜ som en a32P-mærket isotop med en specifik aktivitet på 1000-2000 Ci/mmol) for at muliggøre let kontrol af reparationssyntese-reaktions-25 produktet. Reaktionerne blev udført i en puffer indeholdende en slutkoncentration på 50 mM "Tris"-HC1 (pH 7,5), 20 mM MgCl2, 20 mM DTT og 154 DNA-polymerase I (Klenow) i et reaktionsvolumen på 200 μΐ. Reaktionerne fik lov at foregå ved 4 eC i 12-18 timer.
30
Efter fuldførelsen tilsattes ETDA til en koncentration på 25 mM. Prøvepuffer indeholdende blandingerne blev phenol-ekstraheret, CHCli-ekstraheret to gange, og produkterne blev ethanolfældet. Pillerne blev optaget i 0,3 M natrium-35 acetat, og DNA'en genudfældet med ethanol. Efter opløsning af pillerne i vand blev 1L+3L og 2L+4L produkterne nedbrudt DK PR 172480 B1 21 separat med PstI i 100 ml reaktionsblandinger indeholdende IX Pstl-puffer (50 mM (NHJ2S04, 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCla) og 70 enh. PstI. Efter 4 timer tilsattes EDTA til en koncentration på 10 mM, og materialet blev ethanol-5 fældet. Pillerne blev optaget i 0,3 M natriumacetat og genudfældet og derpå optaget i vand. Det Pstl-nedbrudte 1L+3L produkt blev nedbrudt med EcoRI ved 37 'C i en 100 ml reaktionsblanding indeholdende IX EcoRI-puffer (150 mM NaCl, 6 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2) og 70 enh.
10 EcoRI. Det Pstl-nedbrudte 2L+4L produkt blev nedbrudt ved 37 *C med BamHI i en 100 ml reaktionsblanding indeholdende IX BamHI-puffer (150 mM NaCl, 6 mM "Tris"-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 70 enh. BamHI. Efter 4 timer tilsattes EDTA til begge blandinger, og der tilsattes prøvepuffer. De blev 15 underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgelplade.
6 % gelplader blev støbt af en blanding indeholdende 6 % (vægt/vol.) acrylamid (acrylamid/bisacrylamid i forholdet 20:1) IX TBE, 1 % APS og 0,1 % TEMED. Reaktionsprodukterne blev lokaliseret på gelen ved autoradiografi, og båndet 20 svarende til det EcoRI-PstI-nedbrudte 1L+3L produkt på 45 bp (del 1) (se fig. 3) og båndet svarende til det Pstl-BamHI-nedbrudte 2L+4L produkt på 50 bp (del 2) (se fig. 3) blev udskåret fra gelen, materialet elektroelueret i 0,2X TBE, phenolekstraheret, CHC13-ekstraheret og ethanolfældet.
25 Delene 1 og 2 blev opløst i vand.
Fremstilling af kloningsvektor
Kloningsvektor blev fremstillet ved nedbrydning af 20 mg 30 pBR322 (15) med 50 enh. EcoRI og 50 enh. BamHI i IX RI-puffer ved 37 'C i 6 timer. Efter tilsætning af EDTA til en koncentration på 10 mM tilsattes prøvepuffer, og blandingen blev kørt på en 5 % polyacrylamidgel. Gelen blev udviklet ved farvning i 10 minutter i vand indeholdende 5 pg/ml 35 ethidiumbromid, skylning to gange i vand og anbringelse på en ultraviolet transilluminator (302 nm). Båndet svarende DK PR 172480 B1 22 til de EcoRI-BamHI-nedbrudte pBR322-molekyler på ca.
3712 bp blev udskåret fra gelen. DNA’en blev elektroelueret fra gelskiven, phenolekstraheret, CHCl3-ekstraheret to gange og ethanolfældet. Pillen blev opløst i vand og var 5 klar til ligering.
Ligering
Ved en tre-parts-ligering (se fig. 4) hvorved molforholdet 10 mellem indsætninger og vektor i ligeringsreaktionen var omkring 10:1, blev delene 1 og 2 ligeret ind i den EcoRI-BamHI-nedbrudte pBR322 vektor i IX T4-DNA-ligase-puffer (indeholdende 50 mM "Tris"-HCl (pH 7,8); 10 mM MgCl, 20 mM DTT, 1 mM rATP) og ca. 800 enh. T4-DNA-ligase (NEB). Reak-15 tionen blev udført ved 14 *C i 12-16 timer.
Transformationer E. coli stamme 294 blev anvendt som transformeringsvært 20 under anvendelse af den procedure, der er beskrevet af M.
Dagert og S.D. Ehrlich (3). De transformerede celler blev udsået på LB-agarplader indeholdende ampicillin (20 μg/ml? LB-Amp-plader, og transformanter blev screenet fra og dyrket i LB-medium indeholdende 20 mg/ml ampicillin. Trans-25 formanter blev screenet fra under anvendelse af en modifikation af den hurtige miniscreeningsmetode, som er beskrevet af Birnboim og Doly (4). Miniprep-DNA fremstillet som sådant blev nedbrudt med EcoRl og BamHI og kørt på polyacrylamidgelplader. Flere transformanter, som udviste 30 en ca. 218 bp EcoRI-BamHI-indsætning, blev dyrket i stor målestok, og plasmider fra hver blev isoleret og sekvens-bestemt ifølge den procedure, der er beskrevet af Maxam og Gilbert (5), for at bekræfte den korrekte kemiske syntese og konstruktion. pBR322-vektoren indeholdende den komplette 35 korrekte venstre halvsekvens af IGF-I blev kaldt IGF-I-LH-322 (se fig. 5).
DK PR 172480 B1 23
Kloning af fragmenter af den højre halvdel af IGF-I
Under anvendelse af de identiske betingelser for DNA-polymerase-I-formidlet reparationssyntese blev de to par 5 fragmenter, som udgør den højre halvdel af den syntetiske IGF-I, omdannet til dobbeltstrengede DNA’er. Efter DNA-polymerase-I reaktionerne og uden enzymatisk nedbrydning gennemførtes 1R+3R (del 3) og 2R+4R (del 4) reaktionerne på 6 % polyacrylamidgelplader. 83 bp (del 3) og 91 bp (del 4) 10 båndende blev lokaliseret ved autoradiografi og udskåret fra gelen. Efter elektroeluering blev de ethanolfældede dobbeltstrengede DNA’er forsynet med dC-hale (se fig. 6) under anvendelse af de procedurer, som er beskrevet af Villa-Komaroff et al. (6) og Rowenkamp og Firtel (7). Reak-15 tionerne udførtes i 50 μΐ volumener af IX halepåsætningsblanding (indeholdende 0,2 M kaliumcacodylat, 25 mM "Tris"-HCI (pH 6,9), 2 mM DTT, 0,5 mM CoCl2) og 22 μΜ dCTP. Efter forvarmning ved 37 *C i 10 minutter begyndtes den 150 sekunder lange reaktion ved tilsætning af 10-20 enh. ter-20 minal-nucleotidyl-transferase og afsluttedes ved tilsætning af EDTA efterfulgt af phenolekstraktion, CHClj-ekstraktion 20 gange og ethanolfældning.
Disse med oligo(dC)-haler forsynede dele 3 og 4 blev derpå 25 separat blandet med ækvimolære mængder af med PstI-skåret og med oligo(dG)-hale forsynet pBR322-vektor i 50 ml IX sammensmeltningspuffer (0,1 M NaCl, 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,8), 1 mM EDTA) med en slut-DNA-koncentration på 1-2 mg/ml. Efter opvarmning til 75 *C blev blandingerne grad-30 vist afkølet til 4 *C i løbet af 16 timer, og blandingen blev transformeret ind i kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge den procedure, som er beskrevet af Dagert og Ehrlich (3). Transformerede celler blev udsået på LB-tetracyclin-agar-plader og dyrket i LB-tetracyclin-medium 35 ved tetracyclinkoncentrationer på 5 pg/ml. Tetracyclin-resistente transformenter blev opsamlet og udsået på LB- DK PR 172480 B1 24 ampici11in-agarpiader for at kontrollere for indsætninger ved Pstl-stedet. Flere tetracyclinresistente, ampicillin-følsomme kolonier for hver af delene 3 og 4 blev mini-screenet, og de, der udviste indsætninger ved Pstl-stedet, 5 blev dyrket i stor målestok og sekvensbestemt ved Maxam- og -Gilbert-teknikken (5) for at bekræfte de korrekte DNA-sekvenser 1 delene 3 og 4.
Konstruktion af en intakt syntetisk HuIGF-I-kodesekvens 10
Fremstilling: Del 3 og 4.
Delen 3 og 4 blev separat fjernet fra deres vektorer ved nedbrydninger af 20 μg af hver vektor med Avail i IX Aval I-15 puffer (60 mM NaCl, 6 mM "Tris"-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl;, 6 mM 2-mercaptoethanol) og 30 enh. Avail. Efter 6 timer ved 37 *C tilsattes EDTA til reaktionsblandingerne på 150 μΐ til en koncentration på 15 mM, og materialet blev phenol-ekstraheret, CHCl—ekstraheret to gange og ethanol fældet.
20 Del 3 pillen blev derpå optaget i IX BamHI-puffer og nedbrudt i et volumen på 150 μΐ med 30 enh. BamHI ved 37 *C i 4 timer. Pillen indeholdende del 4 blev nedbrudt med 30 enh. Sall i 150 μΐ IX Sall-puffer ved 37 *C i 4 timer.
25 Begge nedbrydningsblandinger blev derpå kørt på 6 % poly-acrylamid-gelplader og farvet. 51 bp båndet repræsenterende del 3 og 62 bp båndet repræsenterende del 4 blev fjernet fra gelerne, og DNA'en elektroelueret, phenolekstraheret, CHCl3-ekstraheret to gange og ethanolfældet. Pillerne blev 30 derpå optaget i vand og var klar til ligering.
Vektorfremstilling 20 μg af IGF-1-LH-322-vektoren blev nedbrudt med 50 enh.
35 BamHI og 50 enh. Sall i en 200 μΐ reaktionsblanding indeholdende IX BamHI-puffer ved 37 *C i 6 timer. Efter DK PR 172480 B1 25 tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM blev nedbrydningsblandingen kørt på en 5 % polyacrylamidgel-plade, ethidiumbromidfarvet, og 3814 bp båndet udskåret fra gelen.
5
Efter elektroeluering, phenolekstraktion, chloroformekstrakt ion og ethanol fældning blev DNA-pillen optaget i vand og var klar til ligering med delene 3 og 4 i en tre-parts-ligering. Ligeringen blev gennemført under betingelser, som 10 beskrevet ovenfor for en tre-parts-ligering (se fig. 7).
Delene 3 og 4 var til stede i ligeringsblandingen i et 10 gange molært overskud af indsætningerne i forhold til vektoren. Blandingen blev transformeret ind i kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge Dagert- og Ehrlich-proce-15 duren (3) og udsået på LB-ampicillin-plader. Flere trans-formanter blev mlnlscreenet, og to kloner, der udviste et ca. 115 bp BamHI-Sall-fragment, blev dyrket i stor målestok, og deres plasmider præpareret. Begge strenge af det intakte syntetiske gen blev sekvensbestemt ved Maxam-20 Gilbert-teknikken (5) for at bekræfte den korrekte sekvens. pBR322-plasmidet indeholdende den komplette korrekte sekvens, der koder for human IGF-I, blev kaldt pBR322-HuIGF-I.
25 Ekspression af human IGF-I
IGF-I-fusionsekspression i bakterier
De første forsøg gik ud på at opnå ekspression af IGF-I som 30 et fusionsprotein. For at opnå dette anvendtes både pNCV- (9) og pNCVsLE- (10) ekspressionsvektorerne. (pNCVsLE-eks-pressionsvektoren er et derivat af pNCV-vektoren og blev fremstillet som følger: pNCV blev behandlet med Bgll, som spalter ved codon 13 af LE-fusionen. Stedet blev omdannet 35 til et EcoRI-spaltningssted under anvendelse af syntetisk DNA til opnåelse af ekspressionsvektoren pNCVsLE. Den DK PR 172480 B1 26 syntetiske DNA, som blev indført i plasmidet, har sekvensen:
5'-GATCCAGAATTC 5 5'-GATCGAATTCTG
og denne sekvens blev indført i plasmidet:
GATCCAGAATTC
10 GTCTTAAGCTAG
Som en strategi til at frigøre det fusionerede humane IGF-I-protein fra trp-fusionsproteinet blev der udformet en linker således, at en enzymatisk proteolysemetode, som er 15 rapporteret af Wunsch et al. (8), kunne anvendes på dette ekspressionssystem. For at opnå dette blev der ved standardmetoder (2) kemisk syntetiseret en DNA-linker:
ProAla 20 5 *-AATTCCCTGCCG -3’ 3'- GGGACGGCCAG-5’ som, når den blev forbundet med trp-fusionsproteinet og IGF-l-genet, kodede for aminosyreresterne prolin og alanin 25 efterfulgt af glycin og prolin, som er de første to amino-syrerester i IGF-I, og som med prolin og alanin foran tilsammen udgør et genkendelsessted for en collagenase isoleret fra Clostridium histolyticum (11,12). Dette enzym virker ifølge rapporter på et sådant sted til spaltning af 30 alanin-glycin-peptidbindingen.
For at konstruere en DNA-sekvens, som koder for et fusionsprotein med et collagenase-spaltningssted, blev 30 mg pBR322-HuIGF-I-plasmid spaltet med 50 enh. BamHI og 50 enh.
35 Pvul i 200 ml IX BamHI-puffer ved 37 *C i 6 timer. Efter tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM blev DK PR 172480 B1 27 reaktionsblandingen chromatograferet på en 6 % polyacrylamid-gelplade Det mindre PvuI-BamHI-fragment (ca. 725 bp) blev Isoleret og nedbrudt med 40 enh. Avail i 150 ral IX Sau96I-puffer (60 mM NaCl, 6 mM "Tris"-HCl (pH 7,4), 15 mM 5 MgCl;, 6 raM 2-mercaptoethanol). Efter tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM blev den resulterende blanding chromatograferet på en 6 % polyacrylamid-gelplade.
Det mindre Sau961-BamHI-fragment (ca. 86 bp) blev ekstraheret fra gelen, phenolekstraheret, chloroformekstraheret to 10 gange og ethanolfældet. Dette fragment var klart til ligering.
200 pmol linker-fragmenter blev kinaseret med 100 enh. polynucleotidkinase i 20 ml IX polynucleotidkinase-puffer 15 (70 mM "Tris"-HCl (pH 7,6), 10 mM MgClc, 5 mM DTT, 1 mM
rATP) ved 37 'C i 1 time. Reaktionen blev afsluttet ved opvarmning til 65 *C i 5 minutter. 100 pmol af de kinaserede linker-fragmenter blev ligeret til 86 bp Sau96I-BamHI-fragmentet med 400 enh. T4 DNA-ligase i 30 ral IX T4-DNA-20 ligase-puffer ved 14 *C i 12-16 timer. Ligeringsreaktionen blev afsluttet ved tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM efterfulgt af phenolekstraktion, chloroformekstraktion to gange og ethanolfældning. Pillen blev derpå optaget i IX BamHI-puffer og nedbrudt i en 100 ml reak-25 tionsblanding med 50 enh. EcoRI og 50 enh. BamHI ved 37 *C i 6 timer. Efter afslutning af nedbrydningen med EDTA blev blandingen chromatograferet på en 6 % polyacrylamid-gelpla-de, og det nydannede EcoRI-BamHI-fragment (ca. 97 bp) blev ekstraheret fra gelen og præpareret til ligering. Vektoren, 30 som skulle modtage dette nye fragment, blev præpareret ved nedbrydning af 30 mg pBR322-HuIGF-I med 100 enh. EcoRI og 100 enh. BamHI i 200 ul IX BamHI-puffer ved 37 'C i 8 timer. Reaktionen blev afsluttet, og blandingen chromatograferet på en 6 % polyacrylamid-gelplade, og det største bånd 35 (ca. 3830 bp) repræsenterende det med EcoRI og BamHI nedbrudte plasmid blev isoleret, og plasmid-DNA'en ekstraheret DK PR 172480 B1 28 og præpareret til ligering som ovenfor. I en 30 ml ligeringsreaktionsblanding indeholdende et ti gange molært overskud af indsætnings fragmentet i forhold til vektoren blev EcoRI-BamHl-fragmentet ligeret ind i det med EcoRI og 5 BamHI nedbrudte plasmid pBR322 HuIGF-I under de ovennævnte standard-ligeringsbetingelser. Kompetente E. coli 294 celler, præpareret som ovenfor (3), blev anvendt som transformeringsværter, og de transformerede celler blev udsået på LB-ampicillin-agarplader. Flere transformanter blev opsam-10 let, miniscreenet som ovenfor (4), og to, der udviste en EcoRI-BamHI-indsætning, blev dyrket i stor målestok, og deres piasmider oprenset. Under anvendelse af Maxam-Gilbert-proceduren (5) blev konstruktionen sekvensbestemt for at bekræfte den korrekte syntese og indsætning af 15 EcoRI-Sau96I-collagenase-linkeren. Dette plasmid blev kaldt pBR322-HuSynIGF-1 -M.
For at fremstille denne EcoRI-Sall-IGF-I-kodesekvens til indsætning i pNCV og pNCVsLE blev 30 mg pBR322-HuSynIGF-I-M 20 nedbrudt med 70 enh. Sall i 200 μΐ IX Sall-puffer (150 mM NaCI, 6 mM "Tris,,-HCl (pH 7,9), 6 raM MgCl2, 6 mM 2-mercap-toethanol ved 37 'C i 6 timer. Efter tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM blev blandingen phenolekstra-heret, chloroformekstraheret to gange og ethanolfældet.
25
Under anvendelse af kemiske standard-synteseprocedurer (2) syntetiseredes en Sall-EcoRI-linker 5’ TCGACGTACATG 3’ 30 3’ GCATGTACTTAA 5' og 400 pmol blev kinaseret som ovenfor. 200 pmol af den kinaserede linker blev ligeret til det med Sall nedbrudte pBR322-HuSynIGF-I-M (fremstillet ovenfor) med 800 enh. T4 35 DNA-ligase i 30 μΐ IX ligeringspuffer ved 14 “C i 12-16 timer.
DK PR 172480 B1 29
Efter afslutning af reaktionen med EDTA blev blandingen phenolekstraheret, chloroformekstraheret to gange og etha-nolfældet. Pillen blev derpå optaget i IX EcoRI-puffer og nedbrudt med 100 enh. EcoRI i et volumen på 200 μΐ ved 37 5 *C i 8 timer. Efter til sætning af EDTA til en koncentration på 15 mM blev blandingen chromatograferet på en 6 % polyacrylamidgelplade. Gelen blev farvet, og båndet ved ca.
230 bp svarende til EcoRI-EcoRI-HuIGF-I-fragmentet blev ekstraheret fra gelen, phenolekstraheret, chloroformekstra-10 heret to gange og ethanol fældet. "Dette fragment var klart til ligering ind i pNCV og pNCVsLE. pNCV og pNCVsLE blev præpareret til ligering ved nedbrydning af 20 μg af hvert med 100 enh. EcoRI i 200 μΐ IX EcoRI-puffer ved 37 * C i 8 timer. Efter nedbrydningen tilsattes 200 enh. bakteriel 15 alkalisk phosphatase til hver reaktionsblanding, og blandingerne blev opvarmet til 65 *C i 2 timer. Der tilsattes EDTA til en koncentration på 15 mM, og blandingerne blev phenolekstraheret tre gange, chloroformekstraheret to gange og derpå ethanolfældet. Disse ekspressionsvektorer blev 20 præpareret til ligering.
Ligeringer af EcoRI-EcoRI HuIGF-I-fragmentet ind i de to ekspressionsvektorer blev gennemført i 30 μΐ reaktionsvolumener i IX T4-DNA-ligase-puffer med 800 enh. T4-DNA-ligase 25 ved 14 *C i 12-16 timer. EcoRI -EcoRI - Fragmentet var til stede i et ti gange molært overskud i forhold til vektoren.
Kompetente E. coli 294 celler blev præpareret (3) (ATCC 31446) og anvendt som transformeringsværter for ligering-30 erne. Transformerede celler blev udsået på LB-agarplader indeholdende tetracyclin (5 μg/ml; LB-Tet-plader), og transformanter blev miniscreenét ( 4). Miniscreehings-plas-mid-DNA fra transformanter af pNCV-IGF-I-konstruktionen blev nedbrudt med både PstI og BG1II for at bestemme orien-35 teringen af EcoRI-fragmentindsætningerne. To kloner, hvis plasmider indeholdt et ca. 570 bp Bglll-Pstl-fragment (i DK PR 172480 B1 30 modsætning til et ca. 690 bp fragment) blev dyrket i stor målestok, og deres plasmider præpareret. Konstruktionen blev sekvensbestemt under anvendelse af Maxam-Gilbert-proceduren (5) for at bekræfte den korrekte indsætning ved 5 samlingen af trp-fusionen og IGF-I-proteinkodesekvenserne såvel som bevarelse af den ønskede læseramme. Plasmider med det korrekt indsatte IGF-I-fragment blev kaldt pNCVLE-IGF-I. Transformanter af pNCV-sLE-IGF-I-konstruktionen blev også miniscreenet ved den samme procedure (5), og plasmid-10 DNA'erne blev nedbrudt med Hindi og Pstl. To kloner, som udviste et ca. 150 bp HinclI-Pstl-fragment (i modsætning til et ca. 105 bp HincII-HincII-fragment) blev dyrket i stor målestok, og deres plasmider præpareret. Under anvendelse af Maxam-Gilbert-teknikkerne (5) blev samlingerne 15 mellem trp-fusionen og IGF-I-proteinkodesekvenseme sekvensbestemt for at bekræfte rigtig orientering og bevarelse af den rigtige læseramme. De plasmider, som havde den korrekte indsætning og rigtig læseramme, blev kaldt pNCV-sLE-IGF-I.
20
For at forsøge ekspression af hver af disse konstruktioner blev to kloner, en med pNCV-IGF-I og den anden med pNCV-sLE-IGF-I, indpodet i 10 ml M9-tetracyclin-dyrkningsmedium suppleret med 0,5 mg/ml tryptophan. En klon indeholdende 25 pNCV-LE uden nogen IGF-I gen-indsætning blev også indpodet i dyrkningsmediet for at tjene som negativ kontrol ved prøvningerne.
Efter 12-16 timers vækst ved 37 *C under omrøring anvendtes 30 0,5 ml af disse kulturer til at pode 250 ml M9-tetracyclin- dyrkningsmedium. Efter dyrkning i 12-16 ved 37 *C under omrøring blev cellerne høstet ved centrifugering ved 5000 omdr./min i 10 minutter i en Sorvall GSA rotor. De lysbrydende legemer blev renset fra de pelleterede celler 35 ved: a) suspendering af værtscellerne i en pufret opløsning af en egnet ionstyrke til at solubilisere det meste af DK PR 172480 B1 31 værtsproteinet, b) udsættelse af suspensionen for celle-væg/membran-brydning, c) centrifugering af den brudte suspension med lav hastighed til dannelse af en pille, eventuelt gentagelse af de forudgående trin og d) udvinding 5 af det heterologe protein som lysbrydende legemer i pillen (reference 13). En lille mængde lysbrydende legemer fra hvert af de tre præparater blev kogt i SDS- og 2-mercapto-ethanol-holdig prøvepuffer og kørt på SDS-polyacrylamid-gelplader ifølge Laemmli-metoden (14). Proteinets størrelse 10 udtrykt ved pNCV-IGF-I (LE-IGF-I) var ca. 28 670 dalton (se fig. 7), og ca. 9770 dalton for pNCV-sLE-IGF-I-proteinet (sLE-IGF-I) (se fig. 8). Disse to udtrykte proteiner blev underkastet solubilisering i 6 M guanidin-HCl efterfulgt af 50 ganges fortynding med fortyndede puffere. Den endelige 15 puffer for pNCV-IGF-I efter fortynding var 0,12 M guanidin-HCl, 0,05 M "Tris"-HCl (pH 8), 20 % glycerol, 0,1 mg/ml
BSA, 0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA, og den endelige puffer efter fortynding af de lysbrydende legemer af pNCV-sLE-IGF-I var 0,14 M guanidin-HCl, 25 mM "Tris"-HCl (pH 7,6), 10 mM
20 CaClj. Efter udcentrifugering af partikelformet materiale blev de to opløsninger indeholdende solubiliserede trp-IGF-I-fusionsproteiner prøvet ved en radioimmunprøvningsprocedure beskrevet af Furlanetto et al. (23), som modificeret af Hintz et al. (24). Begge fusionsproteiner udviste akti-25 vitet ved denne prøvning. En negativ kontrolpræparation blev også inkluderet i prøvningen, og kontrollen udviste ingen målelig aktivitet.
Ekspression og sekretion i gær 30
For at undgå nødvendigheden af rensning og solubilisering af lysbrydende legemer fra bakteriecellelysater søgtes gærekspressions-sekretions-systemer som et alternativ.
Bortset fra fordelen ved at undgå proteinrensning fra 35 cellelysater vil det måske være muligt ved hjælp af koblede ekspressions-sekretionssystemer at undgå et efterfølgende DK PR 172480 B1 32 in vitro forarbejdningstrin for at fjerne et tilknyttet protein. Til rådighed var tre gærekspressions-sekretionssystemer. Disse var: 1) gær-a-faktor (22), hvorved der anvendes gær-a-faktor-promotor- og -præprosekvens, 2) gærin-5 vertase (16) bestående af invertase-promotor- og -signalsekvensen, og 3) en hybrid sammensat af PGK-promotoren (25) og invertase-signalet (16).
Konstruktion af et gær-g-faktor-promotor-præ-g-faktor-IGF-10 I-plasmid
For at opnå ekspression af IGF-I under anvendelse af a-faktor-promotoren og præprosekvensen anvendtes et plasmid konstrueret af Singh (22). Plasmidet p65 (fig. 9) indehol-15 der sekvenser af α-faktor-promotoren, a-faktor-præprose-kvensen, gær-2-p-terroinatoren, gær-Trp 1 genet såvel som portioner af pBR322-plasmidet. På grund af righoldigheden af hensigtsmæssige restriktionssteder i a-faktor-præprose-kvensen blev der til indsætning af IGF-I-kodesekvensen 20 anvendt det identiske EcoRI-EcoRI-HuSynIGF-I-M-£ragment på ca. 230 bp, som var ligeret ind i pNCV og pNCVsLE (som tidligere nævnt ved bakteriekonstruktionen). Dette EcoRI-EcoRI-fragment Indeholdt collagenase-genkendelsesstedet Pro-Ala-Gly-Pro og muliggjorde nedbrydning med collagenase, 25 hvis IGF-I skulle blive secerneret som et fusionsprotein.
Det protein, som udtrykkes i denne konstruktion (se fig. 4) består af præ-pro-a-faktorprotein knyttet til IGF-I.
For at indsætte EcoRI-EcoRI-fragmentet på ca. 230 bp blev 30 plasmidet p65 delvist nedbrudt i IX EcoRI-puffer med EcoRI og derpå størrelsesbestemt på 0,7 % horisontal agarosegel.
Båndet svarende til det lineariserede, på et enkelt sted restriktionsspaltede plasmid blev udskåret, og DNA'en blev elueret fra gelen og phenolekstraheret, chloroformekstrahe-35 ret to gange og derpå ethanolfældet. Denne DNA-pille blev derefter optaget i 50 mM "Tris"-HCl (pH 8) og behandlet med DK PR 172480 B1 33 bakteriel alkalisk phosphatase under betingelser, som sikrer 100 % dephosphorylering af de 5'-udragende ender.
Efter denne behandling blev phosphataseaktiviteten fjernet ved først at tilsætte EDTA til en koncentration på 15 mM og 5 derpå ekstraheret DNA'en med phenol tre gange, med chloroform to gange og udfældevektoren med ethanol. Dette materiale indeholdt så den lineariserede p65-vektor, nedbrudt med EcoRI i et af to steder: det ene ved EcoRI-stedet ovenfor α-faktor-promotoren og -præprosekvensen eller det andet ved 10 EcoRI-stedet lige nedenfor a-faktorpromotoren og -præprosekvensen. EcoRI-EcoRI-IGF-1-fragmentet på ca. 230 bp blev ligeret ind i vektoren. Den ønskede placering af indsætningen var ved EcoRI-stedet lige nedenfor a-faktor-promotoren og -præprosekvensen.
15
Ligeringen blev udført under standardligeringsbetingelser, og transf ormeringsværteme var kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge Dagert og Ehrlich (3). De transformerede celler blev udsået på LB-ampicillin-agarplader.
20 Flere transformenter blev miniscreenet ifølge metoden beskrevet af Bimboim og Dolly (4), og plasmid-DNA præpareret som sådant blev nedbrudt med både Sall og Hindi 11 i de passende puffere. En af flere kloner, som indeholdt et plasmid med et EcoRI-Hindlll-fragment på ca. 110 bp, blev 25 dyrket i stor målestok, og dets plasmid blev oprenset.
Dette plasmid, YEp9T-a-faktor-EcoRI-EcoRI-IGF-I (se fig.
11), blev anvendt til at transformere kompetente gærstamme 20B-12 (atrp pep4) celler ifølge Hitzeman-modifikationen (19) af procedurerne beskrevet af Hinnen et al. (17) og 30 Beggs et al. (18).
To sådanne transformanter såvel som en negativ kontrol-transformant (uden IGF-I-indsætning i plasmidet) blev dyrket i suspension ligesom transformanterne af gær-præ-inver-35 tase-IGF-I-plasmidet. Supernatanter blev prøvet for secerneret IGF-I-aktivitet målt ved radioimmunprøvnlngsprocedu- DK PR 172480 B1 34 ren beskrevet af Furlanetto et al. (23) som modificeret af Hintz et al. (24). Begge supernatanter af transformanter, der indeholdt plasmider med IGF-I-indsætninger, indeholdt IGF-I-aktivitet, og supernatanten af den negative kontrol 5 gjorde ikke. En af disse transformanter blev dyrket i stor målestok i en 10 liters fermentor, og supernatanten indeholdt secerneret IGF-I-aktivitet i et maksimumsniveau på ca. 3 μg/ml. IGF-I-aktiviteten af gæringssupernatanten blev også påvist ved en placentamembran-radioreceptor-prøv-10 ning udviklet af Horner et al. (26).
Konstruktion af et gærinvertase-promotor-signal-IGF-I-plas-mid 15 Baseret på vidnesbyrd om korrekt forabejdning og sekretion i gær af proteiner med heterologe signalsekvenser (16) blev gærinvertase-ekspressions-sekretions-systemet af interesse.
Først forsøgtes ekspression af gærinvertase-signal-protei-net knyttet til IGF-I (fig. 12) koblet med forarbejdning og 20 sekretion af IGF-I under anvendelse af invertase-promotoren som udgangspunkt for transcription.
Gærinvertase-signal-kodesekvensen blev knyttet til IGF-I-genet ved anvendelse af et Ncol-Hindlll (ca. 400 bp) frag-25 ment indeholdende ATG-startcodonen og 5'-enden af signal-DNA-sekvensen og 4 DNA-fragmenter syntetiseret ved standardprocedurer (2): 5' AGCTTTCCTTTTCCTTTTGGC 3’ 30 3' AAGGAAAAGGAAAACCGACCAA 5’ 5' TGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG 31 3 * AACGTCGGTTTTATAGACGTCCAG 5' 35 Konstruktionen begyndte med isolering af AvaII-BamHI-IGF-I-venstre halvdels-fragmentet på 90 bp ved AvalI-nedbrydning DK PR 172480 B1 35 af et Pvul-BamHI-fragment på ca. 730 bp isoleret fra pBR322-HuSynIGF-I nedbrudt med Pvul og BamHI.
Efter phosphorylering af alle fire syntetiske DNA-fragmen-5 ter tinder anvendelse af standardkineringsbetingelser blev de fire syntetiske fragment er blandet med AvlI-BamHI-IGF-I-venstre halvdels-fragmentet og ligeret under anvendelse af standardligeringsbetingelser. Efter inaktivering af ligasen ved phenol- og chloroformekstraktion to gange blev 10 den ethanolfældede DNA-pille opløst og nedbrudt med HindiII og BamHI i de passende puffere. Det nykonstruerede Hindlll-BamHI-fragment (ca. 140 bp) blev isoleret og ekstraheret fra en 6 % polyacrylamid-gel. Dette materiale blev derpå ligeret ind i HindiII-BamHI-nedbrudt pBR322-vektor, som 15 først var blevet nedbrudt med HindiII og derpå med BamHI i de passende puffere, efterfulgt af rensning af 4014 bp vektorfragmentet fra en 6 % gel.
Transformationsværten var kompetent E. coli 294 præpareret 20 ved standardprocedurer (3), og de transformerede celler blev udsået på LB-ampicillin-agarplader. Flere transfor-manter blev miniscreenet ved Birnboim-Doly-proceduren (4), og deres plasmid-DNA1er blev nedbrudt med EcoRI og BamHI.
To plasmider Indeholdende et EcoRI-BamHI-fragment på ca.
25 167 bp (som belyser indsætningen af et 140 bp fragment i
Hindlll- og BamHI-stederne) blev dyrket i stor målestok, og deres plasmider præpareret. Under anvendelse af Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelsesteknikkerne (5) blev hele 43 bp Hindlll-Avall-sektionen af DNA sekvensbestemt for at be-30 kræfte den korrekte kemiske syntese og konstruktion. Det korrekt konstruerede plasmid blev kaldt pBR322-P-I-HuSynlGF-HindlII-BamHI (ca. 4154 bp).
For at indsætte den højre halvdel af IGF-I-genet blev dette 35 nyskabte plasmid nedbrudt med BamHI og Sall i de passende puffere, oq det store fragment (ca. 3879 bD) blev renset DK PR 172480 B1
JO
ved gelfraktionering. pBR322-HuSynIGF blev nedbrudt med BamHI og Sall i de passende puffere, og BamHI-Sall-fragmen-tet på 115 bp svarende til den højre halvdel af IGF-I-genet blev isoleret ved gelfraktionering. Dette 115 bp BamHI-5 SalI-IGF-I-højre halvdels-fragment blev derpå ligeret ind i den med BamHI-Sall-nedbrudte pBR322-P-IGF-l-LH-HindIII-BamHI-vektor under anvendelse af standardligeringsbetingel-ser. Kompetente E. coli stamme 294 celler præpareret ifølge Dagart og Ehrlich (3) blev anvendt som transformationsvær-10 ter, og transformerede celler blev udsået på LB-amplcillin-agarplader. Flere transformanter blev miniscreenet under anvendelse af standardteknikker (4), og plasmid-DNA præpareret som sådant blev nedbrudt med EcoRI og Sall i de passende puffere, og de plasmider, der belyste en indsæt-15 ning af BamHI-Sall-fragmentet svarende til den højre halvdel af IGF-I, blev kaldt pBR322-P-I-HuSynIGF-I-HindIII-Sall. En af klonerne indeholdende pBR322-P-I-IGF-I-HindIII-Sall-plasmidet blev dyrket i stor målestok, og plasmidet blev isoleret. Dette plasmid blev derpå nedbrudt med 20 Hindlll- og Sall i de passende puffere til fremstilling af et 255 pb Hindlll-Sall-fragment indeholdende hele IGF-I-genet og 3'-portionen af gærinvertase-signal-kodesekvensen.
Dette DNA-fragment blev isoleret ved polyacrylamidgel-frak-tionering og præpareret til ligering ved standardteknikker.
25
Ncol-HindiII-fragmentet (ca. 400 bp) indeholdende 5'-enden af DNA-sekvensen, som koder for invertasesignalet såvel som gær-invertase-promotoren, blev skabt ved Ncol- og Hindlll-nedbrydning af plasmidet YIpsp-LelFA (16) i de passende 30 puffere. YIpsp-LelFA-plasmidet blev først nedbrudt fuld stændigt med Ncol i den passende puffer og derpå phenoleks-traheret, chloroformekstraheret to gange og ethanolfældet.
De lineariserede molekyler blev derefter optaget i IX HindiII-puffer og delvis nedbrudt til skabelse af det 35 nødvendige Ncol-HindiII-fragment (ca. 400 bp), som indeholder et indre Hindlll-restriktionssted. Dette Ncol-Hindlll- DK PR 172480 B1 37 fragment blev derpå isoleret ved gelfraktionering og præpareret til ligering under anvendelse af standardteknikker.
Til fremskaffelse af en vektor blev plasmidet pUC12-YI S (EcoRI-BamHI) (16) nedbrudt med Ncol og Sall i de passende puffere. Efter rensning ved gelfraktionering blev vektoren på ca. 2,6 kbp elueret fra gelen og præpareret til ligering ved standardteknikker. Til gennemførelse af den endelige konstruktion blev der arrangeret en tre-parts ligering 10 under anvendelse af standardligeringsteknikker. Den ved ligeringen anvendte DNA inkluderede det med Ncol og Sall nedbrudte pUCl2-YI (EcoRI-BamHI) (16), Ncol-Hindlll-fragmentet på ca. 400 bp og Hindlll-Sall-fragmentet på ca.
255 bp. Efter ligering blev materialet transformeret ind i Ί5 kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge Dagert et al. (3). Transformerede celler blev udsået på LB-ampicil-lin-agarplader, og flere transformanter blev mini-screenet under anvendelse af proceduren beskrevet af Birnboim og Doly (4). Plasmid-DNA præpareret som sådant blev nedbrudt 20 med Ncol og Sall i de passende puffere, og en af flere kloner indeholdende plasmider, der udviste indsætningen af et Ncol-Sall-DNA-fragment på ca. 625 bp, blev dyrket i stor målestok, og dens plasmid blev oprenset.
25 Som et afsluttende trin blev dette plasmid lineariseret ved nedbrydning med Sall i den passende puffer. SalI-EcoRI-linker, fremstillet som nævnt ovenfor og kinaseret under standardkinaseringsbetingelser, blev ligeret til den linea-riserede vektor for at omdanne Sall-enderne til EcoRI-ender 30 under anvendelse af standardligeringsbetingelser. Efter afslutning af ligeringsreaktionen ved tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 mM, efterfulgt af phenolekstraktion, chloroformekstraktion to gange og ethanolfældning, blev DNA-pillen opløst i IX EcoRI-puffer og nedbrudt med EcoRI.
35 EcoRI-nedbrydningen frigjorde et EcoRI-fragment på ca. 1150 bp, som indeholdt gærinvertase-promotoren, gærinvertase- DK PR 172480 B1 38 signal-kodesekvensen og IGF-I-kodesekvensen i en fortløbende sekvens. Dette materiale blev isoleret som et ca. 1150 bp bånd fra en 6 % polyacrylamid-gelplade efter fraktionering og præpareret til ligering under anvendelse af stan-5 dardprocedurer.
Gær-E.-coli skyttelvektoren, som skulle modtage dette EcoRI-fragment, blev præpareret ved EcoRI-nedbrydning af plasmidet YEp9T (16) for at linearisere vektoren, efter-10 fulgt af behandling af EcoRI-enderne med bakteriel alkalisk phosphatase under anvendelse af betingelser, som anbefales af producenten til frembringlse af 100 % dephosphorylering af de 5'-udragende ender. Phosphatasereaktionen blev afsluttet ved tilsætning af EDTA til en koncentration på 15 15 mM, og blandingen blev phenolekstraheret tre gange, chloroformekstraheret to gange, og DNA'en derpå udfældet med ethanol. Efter genopløsning af DNA-pillen i IX ligeringspuffer blev vektoren blandet med EcoRI-fragmentet på ca. 1150 bp og ligeret under standardligeringsbetingelser.
20 Kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge Dagert et al. (3) blev anvendt som transformeringsværter, og transformanterne blev udsået på LB-ampicillin-agarplader. For at bestemme orienteringen af indsætningen blev flere trans-formanter miniscreenet under anvendelse af metoden beskre-25 vet af Birnboim og Doly (4), og plasmid-DNA'er renset som sådanne blev nedbrudt med BamHI i den passende puffer. En af flere transformanter, som indeholdt plasmider, der producerede et 1,3 kb BamHI-BamHI-fragment ved nedbrydning med BamHI (i modsætning til et fragment på ca. 475 bp) blev 30 dyrket i stor målestok, og dets plasmid oprenset. Dette plasmid, kaldt P.I.IGF-I-EcoRI-EcoRI-P.I.promotor, blev anvendt til at tranformere kompetente gærceller præpareret i hovedsagen ifølge metoderne beskrevet af Hinnen, A. et al. (17) og Beggs, J.D. (18), men med modifikationerne 35 ifølge Hitzeman (19). Der blev anvendt gærstammen 20B-12 (atrpl pep4), som blev fremskaffet fra Yeast Genetics Stock DK PR 172480 B1 39
Center. I denne konstruktion begynder ekspressionen af IGF-I med transcription ved invertasepromotoren og slutter i gær-2μ-sekvensen. Fusionsproteinet udtrykt ved denne konstruktion bestod af gær-invertase-signalet knyttet til IGF-5 I-proteinet, hvor den kombinerede molekylvægt var 9964 dalton. Et andet plasmid med EcoRI-fragmentet indsat i den omvendte orientering blev også anvendt til at transformere kompetente gærceller. I denne konstruktion var IGF-I-kodesekvensen ikke forsynet med gærterminatoren.
10
Flere transformanter blev opsamlet og udstrøget på GNB-CAA-agarplader. Blandt disse blev tre transformanter samlet og podet i 10 ml GNB-CAA-opdyrkningsmedium i rystekolber. Den fjerde kultur blev også startet under anvendelse af en 15 koloni transformeret med den samme vektor, men med EcoRI-fragmentet indsat i vektoren i den omvendte orientering.
Efter 16-20 timers vækst ved 30 *C blev prøver af kulturerne (1 ml) udtaget og befriet for celler ved centrifugering i 5 minutter i en "Eppendorf microfuge". Supernatanter blev 20 udtaget og prøvet for secerneret aktivitet under anvendelse af radioimmunprøvningsproceduren beskrevet af Furlanetto et al. (23) som modificeret af Hintz et al. (24). Supernatan-terne af de tre transformanter udviste aktiviteter på 1,7- 3,3 ng/ml IGF-I-aktivitet, og den negative kontrol viste 25 ingen aktivitet. For at bestemme intracellulær aktivitet blev pillerne fra 1 ml kultur vasket en gang i 25 mM "Tris"-HCl (pH 7,6) og derpå lyseret ved 3-4 minutters kraftig omrøring i 0,5 ml af den ovenstående "Tris"-EDTA-opløsning med 0,4 ml glasperler. Prøvning af cellelysateme 30 viste IGF-I-aktiviteter på 1,5-2,8 ng/ml i de tre IGF-I-secernerende transformanter og ingen aktivitet i den negative kontroltransformant. Den højeste sekretor af de tre transformanter blev dyrket i en 5 liters forgæring, og den secernerede IGF-I-aktivitet nåede et maksimum på 74 ng/ml 35 supernatant.
DK PR 172480 B1 40
Konstruktion af et gær-PGK-promotor-præ-invertase-IGF-I-plasmid
En vanskelighed ved anvendelsen af invertase-promotoren 5 var, at den var underkastet repression i nærvær af glucose.
På grund af uforeneligheden af glucose med høje niveauer af transcriptionsstart ved invertasepromotoren søgtes PGK-pro-motoren anvendt som en alternativ promotor, eftersom glucose er den mest anvendte carbonkilde ved gæringsprocesser.
10
For at begynde konstruktionen af PGK-promotor-P.I.IGF-I-plasmidet var det nødvendigt at klone et fragment indeholdende hele invertase-signal-kodesekvensen. For at gøre dette blev plasmidet pLelF-A-invertase-signal (16) nedbrudt 15 med Bglll og derpå med BamHI i de passende puffere. Denne nedbrydning frigjorde flere fragmenter, hvoraf et var et Bgl 11-BamHI-fragment på ca. 625 bp, som blev isoleret fra en 6 % polyacrylamid-gelplade og præpareret til ligering under anvendelse af standardteknikker. Til kloning af dette 20 fragment valgtes pUC8-vektoren (20) som kloningsmedium. pUC8-plasmidet blev nedbrudt med BamHI i IX BamHI-puffer, behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase for at dephos-phorylere 5'-enderne og derpå kørt på og renset fra en 5 % polyacrylamid-gelplade.
25
Efter standardpræparation til ligering blev den med BamHI nedbrudte vektor blandet med det ovenstående ca. 625 bp BglII-BamHI-fragment og ligeret under typiske ligeringsbetingelser. Blandingen blev derpå transformeret ind i kompe-30 tent E. coli 294 præpareret ved den af Dagert et al. be-skrevne metode (3), og den transformerede .kultur blev udtaget på LB-ampicillin-agarplader. Flere transformanter blev opsamlet og miniscreenet under anvendelse af Blrnboim.....
og Doly-teknikken (4). Miniscreenings-plasmid-DNA blev ned-35 brudt med EcoRI, og en analysegel af nedbrydningsblandingerne viste to typer af plasmider med EcoRI-fragmenter på DK PR 172480 B1 41 enten ca. 260 bp eller ca. 365 bp 1 længde. En klon Indeholdende et EcoRI-fragment på ca. 260 bp blev dyrket i stor målestok, og dets plasmid oprenset. Dette plasmid blev kaldt pUC8-P.I.-promotor-signal-Bglll-BamHI.
5
En klon af denne type blev valgt på grund af den ønskede orientering af det indsatte BglII-BamHI-fragment. Hvad der behøvedes fra dette plasmid var et ca. 20 bp EcoRI-Hindlll-fragment indeholdende ATG-startcodonen og 5'-enden af in-10 vertase-signal-kodesekvensen.
For at konstruere den intakte invertase-signal-kodesekvens blev der isoleret et Hindlll-BamHI-fragment på ca. 150 bp indeholdende 3'-enden af signalsekvensen knyttet til den 15 venstre halvdel af IGF-I-genet fra HindiII-BamHI-nedbrydning af plasmidet pBR322-P.I.-lGF-LH-HindIII-BamHI (ca.
4154 bp). Isolering skete ved polyacrylamid-gelplade-fraktionering, og DNA-båndet svarende til fragmentet på ca.
150 bp blev udskåret og præpareret til ligering under an-20 vendelse af standardteknikker.
Til opnåelse af det korte (ca. 20 bp) EcoRI-HindiII-fragment blev plasmidet pUC8-P.I.-promotor-signal-Bglll-BamHI nedbrudt med EcoRI i IX EcoRI-puffer. Denne nedbrydning 25 frigjorde EcoRI-EcoRI-fragmentet på ca. 260 bp, som blev isoleret fra en 6 % polyacrylamid-gelplade efter fraktionering af nedbrydningsblandingen. Dette ca. 260 bp fragment blev derpå nedbrudt med HindiII i den passende puffer, hvilket skabte to Hindlll-EcoRI-fragmenter, det ene på ca.
30 20 bp og det andet på ca. 240 bp i længde. Efter fuldstæn dig nedbrydning blev nedbrydningen afsluttet ved tilsætning af EDTA til en koncentration på. 15 mM, og hele blandingen blev phenolekstraheret, chloroformekstraheret to gange og derpå ethanolfældet.
35 42 DK PR 172480 Bi
En vektor blev fremstillet ved EcoRI-BamHI-nedbrydning af pBR322 (15) i de passende puffere efterfulgt af rensning af den med EcoRI og BamHI nedbrudte vektor fra en 5 % poly-acrylamid-gelplade. Efter præparation til ligering under 5 anvendelse af standardteknikker blev vektoren blandet med Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 150 bp (3'-enden af inver-tase-signal-kodesekvensen + kodesekvensen for venstre halvdel af IGF-I) og de to Hindi 11-EcoRI-fragmenter (hvor fragmentet på ca. 20 bp indeholdt 5’-enden af invertase-signal-10 kodesekvensen), og hele blandingen blev ligeret under stan-dardligeringsbetingelser. Kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge Dagert og Ehrlich (3) blev anvendt som transformeringsværter for ligeringsblandingen, og de transformerede celler blev udsået på LB-ampicillin-agarplader.
15 Flere transformanter blev miniscreenet ifølge Bimboim og Doly (4), og de rensede miniscreenings-DNA’er blev nedbrudt med EcoRI og BamHI. En af flere kloner, som Indeholdt et EcoRI-BamHI-fragment på ca. 170 bp, blev dyrket i stort volumen, og dens plasmid oprenset. Dette plasmid indeholdt 20 den komplette gær-invertase-signal-kodesekvens knyttet til kodesekvensen for den venstre halvdel af IGF-I og blev kaldt P.I.-IGF-I-L.H.RI-BamHI.
Det ønskede EcoRI-BamHI-fragment på ca. 170 bp blev isole-25 ret fra dette plasmid ved nedbrydning af plasmidet med EcoRI og BamHI i de passende puffere efterfulgt af gelplade- fraktionering af reaktionsblandingen. Under anvendelse af standardteknikker blev DNA-båndet svarende til ca.
170 bp præpareret til ligering. For at fuldføre konstruk-30 tionen blev den højre halvdel af IGF-I isoleret som et BamHI-EcoRI-fragment på ca. 120 bp fra plasmidet P.I.-IGF-I-EcoRI-EcoRI-P.I.-promotor ved nedbrydning med EcoRI og BamHI i de passende puffere efterfulgt af eluering fra en gelskive efter polyacrylamid-gelplade-fraktionering af ned-35 brydningsblandingen. Disse to fragmenter, ca. 170 bp EcoRI-BamHI og ca. 120 bp BamHI-EcoRI, blev ligeret sammen In DK PR 172480 B1 43 vitro under standardligeringsbetingelser, hvor begge fragmenter var til stede i stort set ækvimolære koncentrationer. Ligeringen blev derpå afsluttet ved tilsætning af EDTA til en koncentration på omkring 15 mM, efterfulgt af 5 phenolekstraktion, chlorof ormekstrakt ion to gange og etha-nolfældning. DNA-pillen blev optaget i IX EcoFI-puffer og nedbrudt med EcoRI. Nedbrydningsblandingen blev derpå kørt på en 6 % polyacrylamid-gelplade, og DNA-båndet, som farvede ved ca. 290 bp (i modsætning til ca. 340 bp og 240 bp), 10 blev udskåret og præpareret til ligering under anvendelse af standardteknikker. Dette EcoRI-EcoRI- fragment på ca.
290 bp indeholdt hele gær-invertase-signal-kodesekvensen knyttet til den komplette IGF-I-kodesekvens.
15 For at udtrykke dette protein var det nødvendigt at vælge en gærvektor med en promotor. PGK-promotoren i plasmidet YEplPT-Small (se fig. 13) blev anvendt. YEplPT-Small blev konstrueret som et derivat af YEplPT (21) ved nedbrydning af YeplPT med Clal og PvuII i de passende puffere. Den 5'-20 udragende ende efter Clal blev omdannet til en stump ende ved anvendelse af DNA-polymerase-1 (Klenow) under betingelser, som anbefalet af sælgeren. Efter afstumpning af de Clal-udragende ender blev de stumpe ender (Clal og PvuII) af den lineariserede vektor ligeret under anvendelse af T4-25 DNA-ligase under standardligeringsbetingelser. Den resulterende YEplPT-Small-vektor havde en størrelse på ca. 5,9 kbp (eller ca. 2,7 kbp mindre end YEplPT). Ligesom YEplPT indeholder YEplPT-Small 2 μ-originet og terminatoren, PGK-promotoren, TRP1-genet og sekvenser fra pBR322, inklusive 30 β-lactamase-genet.
YEplPT-Small blev anvendt som vektor ved indsætning af EcoRI-fragmentet på ca. 290 bp i det unikke EcoRI-sted i plasmidet. EcoRI-lineariseret YEplPT-Small-vektor blev 35 fremstillet ved EcoRI-nedbrydning af YEplPT-Small efterfulgt af behandling med bakteriel alkalisk phosphatase (for DK PR 172480 B1 44 at forhindre religering af de komplementære ender). Phos-phatasen blev fjernet ved phenolekstraktion tre gange, chloroformekstraktion to gange og ethanolfældning. Under standardligeringbetlngelser blev EcoRI-fragmentet på ca.
5 290 bp ligeret ind i vektoren.
Kompetente E. coli 294 celler fremstillet ifølge Dagert og Ehrlich (3) blev anvendt som transformeringsværter, og den transformerede kultur blev udsået på LB-ampicillin-agarpla-10 der. Flere transformanter blev miniscreenet ved Bimboim og Doly proceduren, og miniscreenings-plasmid-DNA'er blev nedbrudt med Hindlll i den passende puffer for at bestemme orienteringen af indsætningen. En af flere transformanter, som indeholdt et plasmid med et Hindlll-fragment på ca.
15 400 bp, blev dyrket i stor målestok, og dets plasmid blev oprenset. Dette plasmid blev kaldt YEplPT-Small-P.I.-IGF-I-PGK-promotor (se fig. 14) og blev anvendt til at transformere kompetente celler af gærstamme 20B-12 (ATCC 20626) (atrp pep4) under anvendelse af Hitzeman-modifikationen 20 (19) af procedurerne ifølge Hinnen et al. (17) og Beggs et al. (18).
Flere gærtransformanter blev dyrket i suspension på identisk måde ligesom dem opnået ved transformation med P.I.-25 IGF-1-EcoRI-EcoRI-P.I.-promotor-plasmidet, og supematanter blev målt for aktivitet bestemt ved en radioimmunprøvnings-metode beskrevet af Furlanetto et al. (23) som modificeret af Hintz et al. (24). Rystekolbe-supernatanter af de tre transformanter indeholdt aktiviteter i området 38-53 ng/ml 30 supernatant. På lignende måde blev en af disse transformanter udvalgt og dyrket i stor målestok under anvendelse af en 10 liters fermentor, og den secernerede IGF-I-aktivitet i supernatanten nåede et maksimum på ca. 780 ng/ml. Denne forgæringssupernatant blev også underkastet en radiorecep-35 torprøvning (26) og blev vist at indeholde IGF-I-aktivitet.
DK PR 172480 B1 45
Produktion af moden human IGF-I
Til konstruktion af en DNA-sekvens, som koder for a-faktor-præ-pro-proteinet, knyttet til DNA-sekvensen, som koder for 5 moden IGF-I, anvendtes en M-13 in vitro mutagenese-teknik (se Regin et al., Proc. Acad. Science (USA) 75, 4268;
Hutchinson et al., Journal Biological Chem. 253, 6551;
Gilliam et al., Gene 8, 81 og 99; Gillam et al., Nucleic Acids Research £, 2973; Adelman et al., DNA (juni 1983)).
10
Til konstruktion af M-13-plasmidet blev plasmidet YEp9T-a-faktor-EcoRI-EcoRI-IGF-I (fig. 11) nedbrudt med Bglll og Sall, og fragmentet på ca. 1,5 kbp indeholdende α-faktor-promotor-signalet knyttet til IGF-I blev isoleret ved poly-15 acrylamidgel-elektroforese. Dette fragment blev derpå ligeret under standardligeringbetingelser til en MP-8 (BRL) vektor nedbrudt med BamHI og Sall og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Denne ligeringsblanding blev derpå transformeret ind i kompetente JMlOl-celler fremstillet 20 ifølge den metode, som er beskrevet af Dagert og Ehrlich (3). Disse transformanter blev derpå blandet med ikke-kompetente JM101 celler dyrket til log-fase, blandet med top-agar og udsået på LB-agarplader. Flere klare plakker blev opsamlet og sekvensbestemt under anvendelse af M-13-25 dideoxy-sekvensbestemmelsesteknikken for at bekræfte tilstedeværelsen af en indsætning i vektorens Sall-BamHI-steder.
Til gennemførelse af fjernelsen ifølge den ovenstående 30 metode blev der ved standardmetoder (2) kemisk syntetiseret en enkelt streng af DNA med sekvensen 5' AGAGTTTCCGGACCT CTT TTATCCAAAG 3' 35 DK PR 172480 B1 46 som blev anvendt til at deletere DNA-sekvensen 5’ GAGGCTGAAGCTCTAGAATTCCCTGCC 3' 3' CTCCGACTTCGAGATCTTAAGGGACGG 5' 5 lige forud for IGF-1-kodesekvensen i a-faktor-promotor-signal-IGF-I-fusionssekvensen. Denne konstruktion blev derpå isoleret som en replikativ form under anvendelse af en plasmidfremstillingsprocedure i stor målestok ud fra en 10 JM101-cellekultur podet med dette plasmid indeholdende deletionen.
Den isolerede replikative form (10 mg) blev nedbrudt med Sall og derpå phenol/chloroform-ekstraheret, ethanolfældet 15 og præpareret til ligering. Til denne replikative form blev der ligeret Sall-EcoRI-linkere. Efter ligering og inaktivering af ligasen ved phenol/chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning blev materialet nedbrudt med ca.
50 enh. EcoRI-enzym under standardbetingelser og derpå kørt 20 på en 6 % polyacrylamidgel. Det frigjorte EcoRI-EcoRI-fragment på ca. 1,5 kbp blev isoleret fra gelen og præpareret til ligering under anvendelse af standardbetingelser.
Gærvektoren blev fremstillet ved nedbrydning af 10 mg 25 YEp9T-plasmid med 50 enh. EcoRI efterfulgt af behandling med bakteriel alkalisk phosphatase. Nedbrydningsblandingen blev derpå gentagne gange phenol/chloroformekstraheret og derpå ethanolfældet og præpareret til ligering.
30 EcoRI-EcoRI-fragmentet på ca. 1,5 kbp indeholdende deletionen blev derpå ligeret til EcoRI-EcoRI-YEp9T-vektoren, og ligeringsblandingen blev overført til kompetente E. coli 294 celler præpareret ifølge metoden beskrevet af Dagert og Ehrlich (3) og minlscreenet under anvendelse af metoden 35 beskrevet af Birnboim og Doly (4). Den fremstillede DNA blev screenet ved nedbrydning med EcoRI, og de DNA'er, som DK PR 172480 B1 47 viste en indsætning af fragmentet på ca. 1,5 kbp, blev anvendt til at transformere kompetent gærstanune 20B-12 (ATCC 20626) ifølge Hitzemans (19) modifikation af procedurerne ifølge Hinnen et al. (17) og Beggs (18).
5
Transformanter blev derpå dyrket i rystekolber, og super-natanterne prøvet og vist at have IGF-I-aktivitet ved radioimmunprøvningsproceduren beskrevet af Furlanetto et al. (23) som modificeret af Hintz et al. (24).
10
En af disse kloner blev dyrket i stor målestok i en 10 liters fermentor, og IGF-I oprenset fra supernatanten af denne forgæring. Dette materiale blev derpå underkastet aminoterminal proteinsekvensbestemmelse og påvist at være 15 modent IGF-I-protein.
Farmaceutiske præparater
Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfin-20 delsen kan sammensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved den humane IGF-I eller produkter heraf kombineres med et farmaceutisk acceptabelt bæremedium. Egnede medier og deres sammensætning, herunder med andre humane proteiner, f.eks.
25 humant serumalbumin, er f.eks. beskrevet i Remington’s
Pharmaceutical Sciences af E. W. Martin, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.
Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det omhandlede protein sammen med en egnet mængde bæremedium 30 for at fremstille farmaceutisk acceptable præparater, der er egnet til effektiv indgivelse.
DK PR 172480 B1 48
Bibliografi A. Rinderknecht, E. W., et al., Proceedings National Academy of Sciences (USA) 73, 2365 (1976).
5 B. Rinderknecht et al., Proceedings National Academy of Sciences (USA) 73, 4379 (1976).
C. Blundell et al., Proceedings National Academy of Scien- 10 ces (USA) 75, 1980 (1978).
D. Rinderknecht et al., Journal of Biological Chemistry 253, 2769 (1978), 2365 (1976).
15 E. Rinderknecht et al., FEBS Letters 89, 283 (1978).
F. Zaph et al., Metabolism 27, 1803 (1978).
G. Hintz et al., Journal of Clinical Endocrinology and 20 Metabolism 50, 405 (1980).
H. Blundell et al., Nature 287, 781 (1980).
I. Hintz et al., Journal of Clinical Endocrinology and 25 Metabolism 51, 672 (1980).
J. Baxter et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 54, 474 (1980).
30 K. Hintz et al., Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism 54, 442 (1982).
L. Schoenle et al., Nature 296, 252 (1982).
35 M. GB offentliggørelsesskrift nr. 2 007 676 A.
DK PR 172480 B1 49 N. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
O. Microbiology, Second Edition, Harper and Row Publications Inc., Hagerstown, Maryland (1973), især side 1122 5 og fortsættelsen.
P. Scientific American 245, 106 (1981).
1. Rinderknecht, E., and Humbel, R.E., J. Biol. Chem. 253, 10 8, 2769-2775 (1978).
2. Crea, R., and Horn, T., Nucleic Acids Research 8, 2331-2348 (1980).
15 3. Dagert, M., and Ehrlich, S.D., Gene 6, 23-28 (1979).
4. Birnboim, H.C., and Doly, J., Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979).
20 5. Maxam, A., and Gilbert, W., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).
6. Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727 (1979).
25 7. Rowenkamp and Firtel, Dictyostelium Dev. Biol. 79, 409 (1980).
8. Wunsch, E., et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
30 362, 1285-1237 (Sept. 1931).
9. Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, 425 (1982).
10. Kleid, D.G., New York Acad, of Sci., Annals (in press).
35 DK PR 172480 B1 50 11. Seifter, S., and Gallop, P.M., The Proteins, 2nd Ed.
(H. Neurath, Vol. V, p. 659 (1966).
12. Nordwig, A., Leder 13, 10 (1962).
5 13. Lin, N., (US patentansøgning nr. 06/452 363, Indleveret 22. december 1982).
14. Laemmli, U.K. Nature (London) 227, 680-685 (1970) 10 15. Bolivar, F. et al., Gene 2, 95 (1977).
16. Chang, C.N., (US patentansøgning nr. 05/488 337, indleveret 25. april 1983).
15 17. Hinnen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).
18. Beggs, J.D., Nature 275, 104-109 (1978).
20 19. Hitzeman, R.A., et al., DK patentansøgning nr. 1112/83, indleveret 7. marts 1983 (DK patent nr"Ύ63Γ'932): "Heterologt protein udtrykt, forarbejdet'^g" secerneret af en gærvært".
25 20. Capon, D., DK patentansøgning nr. 1111/83, indleveret 7. marts 1983 (DK patent nr. 171 790): iPåTypeptid omfattende aminosyresekvensen af et dyreinterferon".
30 21. Hitzeman, R.A., et al., Science 219, 620-625 (1983).
22. Singh, A., (US patentansøgning nr. 06/488323, indleveret 25 april 1983).
35 23. Furlanetto, R.W., Underwood, L.E., Van Wyk, J.J., D’Ercole, A.J., J. Clin. Invest. 60, 648 (1977).
DK PR 172480 B1 51 24. Hintz, R.L., Liu, F., Marshall, L.B., Chung, D., J.
Clin. Endocrinol. Metab. 50, 405 (1980).
25. Hitzeman, R.A., et al., Proceedings of the Berkeley 5 Workshop on Recent Advances in Yeast Molecular Biology:
Recombinant DNA. U.C. Press, Berkeley, p. 173 (1982).
26. Horner, J.M., Liu, F., Hintz, R.A., J. Clin. Endocrinol. Metab. 47, 6, p. 1287 (1978).
10 27. Rossi, J.J., Zierzek, R., Huang, T., Walker, P.A., Ita-kura, K., J. Biol. Chem. 257, 16, 9226 (1982).
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af moden human IGF-I eller et human IGF-I-fusionsprotein, kendetegnet ved 5 (a) dyrkning af en rekombinant prokaryotisk værtscelle transformeret med en replikerbar ekspressionsvektor, som er i stand til at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for human IGF-I, under betingelser, som tillader udtrykkelse 10 af den nævnte kodende DNA-sekvens, og udvinding derfra af moden human IGF-I med den rette aminoterminus (Gly), eller (b) dyrkning af en rekombinant prokaryotisk værtscelle 15 transformeret med en replikerbar ekspressionsvektor, som er i stand til at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for human IGF-I fusioneret ved dens N-terminus med en amino-syresekvens, der er exogen for human IGF-I, under betingelser, som tillader udtrykkelse af DNA-sekvensen, og ud-20 vinding derfra af fusionsproteinet og, om ønsket, spaltning af fusionsproteinet til frigørelse af moden human IGF-I med den rette aminoterminus (Gly).
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den 25 dannede IGF-I har den aminosyresekvens, der er afbildet i figur 7 for moden human IGF-I.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at spaltningen ved metode (b) frembringes med et enzym. 30
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningen ved metode (b) finder sted under betingelser, som tillader ekspression af human IGF-I-fusionsproteinet som uopløselige refraktile legemer. 35 DK PR 172480 B1 53
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at de refraktile legemer solubiliseres til dannelse af et fusionsprotein med en egenskab ved human IGF-I.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at den exogene aminosyresekvens er afledt fra bakterielt protein.
7. Ekspressionsvektor, som er i stand til, i en egnet 10 prokaryotisk værtscelle transformeret dermed, at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for human IGF-I fusioneret ved dens N-terminus .med en exogen aminosyresekvens forskellig fra sekvensen af Staphylococcus-protein A.
8. Rekombinant prokaryotisk vært transformeret med en vektor ifølge krav 7.
9. Anvendelse af human IGF-I eller et human IGF-I-fu-sionsprotein, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et 20 hvilket som helst af kravene 1-6, ved fremstilling af et farmaceutisk præparat.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50135383A | 1983-06-06 | 1983-06-06 | |
| US50135383 | 1983-06-06 | ||
| US50607883A | 1983-06-20 | 1983-06-20 | |
| US50607883 | 1983-06-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK276184D0 DK276184D0 (da) | 1984-06-04 |
| DK276184A DK276184A (da) | 1985-01-21 |
| DK172480B1 true DK172480B1 (da) | 1998-10-05 |
Family
ID=27053789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198402761A DK172480B1 (da) | 1983-06-06 | 1984-06-04 | Fremgangsmåde til fremstilling af moden human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) eller et human IGF-I-fusionsprotein, eksp |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6331609B1 (da) |
| EP (1) | EP0128733B1 (da) |
| JP (2) | JP2608870B2 (da) |
| KR (1) | KR850000525A (da) |
| AU (1) | AU594301B2 (da) |
| DE (1) | DE3485693D1 (da) |
| DK (1) | DK172480B1 (da) |
| ES (1) | ES8603955A1 (da) |
| IE (1) | IE58317B1 (da) |
| IL (1) | IL71991A (da) |
Families Citing this family (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| EP0123228B1 (en) * | 1983-04-25 | 1993-09-29 | Chiron Corporation | Hybrid dna synthesis of mature insulin-like growth factors |
| US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| JPS60501989A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-11-21 | アムジエン | インシュリン様成長因子の微生物発現 |
| WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
| US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| EP0154434B1 (en) * | 1984-02-17 | 1993-01-27 | Genentech, Inc. | Human transforming growth factor and precursor or fragment thereof, cells, dna, vectors and methods for their production, compositions and products containing them, and related antibodies and diagnostic methods |
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| WO1986000619A1 (en) * | 1984-07-13 | 1986-01-30 | Chiron Corporation | Prepro insulin-like growth factors i and ii |
| US4738921A (en) * | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
| EP0193112A3 (en) * | 1985-02-22 | 1987-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cdna encoding mammalian insulin-like growth factor ii |
| GB8507666D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Wellcome Found | Epidermal growth factor production |
| US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
| GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
| US4783524A (en) * | 1985-09-17 | 1988-11-08 | Monsanto Company | Growth factors |
| ES2029785T3 (es) * | 1985-10-21 | 1992-10-01 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Procedimiento para producir factor de crecimiento tipo insulina i y plasmido para su produccion. |
| GB8529014D0 (en) * | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
| US5298603A (en) * | 1985-12-21 | 1994-03-29 | Hoechst Aktiengesellschaft | GM-CSF protein, its derivatives, the preparation of proteins of this type, and their use |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| IN165717B (da) * | 1986-08-07 | 1989-12-23 | Battelle Memorial Institute | |
| AU613876B2 (en) * | 1986-10-01 | 1991-08-15 | Merck & Co., Inc. | Synthetic genes encoding proteins from plasmid containing eucaryotic secretory signal peptides and process for secreting encoded proteins |
| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
| ES2063033T3 (es) * | 1987-04-28 | 1995-01-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Empleo de igf-ii en el tratamiento de la enfermedades de los huesos. |
| US5688763A (en) * | 1987-06-12 | 1997-11-18 | Hammonds, Jr.; R. Glenn | Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein |
| US5222978A (en) | 1987-08-26 | 1993-06-29 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5366081A (en) | 1987-08-26 | 1994-11-22 | United States Surgical Corporation | Packaged synthetic absorbable surgical elements |
| US5226912A (en) | 1987-08-26 | 1993-07-13 | United States Surgical Corporation | Combined surgical needle-braided suture device |
| US5306289A (en) * | 1987-08-26 | 1994-04-26 | United States Surgical Corporation | Braided suture of improved characteristics |
| US5472702A (en) * | 1987-08-26 | 1995-12-05 | United States Surgical Corporation | Sterilization of growth factors |
| SE8703625D0 (sv) * | 1987-09-18 | 1987-09-18 | Kabivitrum Ab | New medical use |
| US5102789A (en) * | 1989-03-15 | 1992-04-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells |
| WO1990012877A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5359831A (en) | 1989-08-01 | 1994-11-01 | United States Surgical Corporation | Molded suture retainer |
| KR920003787B1 (ko) * | 1990-03-05 | 1992-05-14 | 한국과학기술 연구원 | 신규 플라스미드 제조 및 그를 함유한 균주를 배양하여 아이 지 에프-1(igf-1)을 생산하는 방법 |
| US5681814A (en) * | 1990-06-07 | 1997-10-28 | Genentech, Inc. | Formulated IGF-I Composition |
| US5374620A (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Growth-promoting composition and its use |
| EP0548267A4 (en) * | 1990-09-04 | 1994-11-23 | Salk Inst Biotech Ind | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| CA2059245C (en) * | 1991-02-08 | 2004-07-06 | Michael P. Chesterfield | Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures |
| CA2105064A1 (en) * | 1991-04-01 | 1992-10-02 | Martin Anthony Gleeson | Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor |
| AU2368892A (en) * | 1991-07-29 | 1993-03-02 | British Bio-Technology Limited | Igf-ii analogues |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5643867A (en) * | 1992-08-26 | 1997-07-01 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating catabolic conditions |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| WO1995008567A1 (en) * | 1993-09-20 | 1995-03-30 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of immunologic and hematologic disorders with igfbp alone or complexed with igf |
| JPH09509141A (ja) * | 1993-11-15 | 1997-09-16 | セルトリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | Ｉｇｆ‐ｉおよびｉｇｆｂｐ‐３を投与することによる腎臓疾患処置の方法 |
| US5728676A (en) * | 1994-09-08 | 1998-03-17 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
| EP0779927A1 (en) * | 1994-09-08 | 1997-06-25 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
| US5904716A (en) * | 1995-04-26 | 1999-05-18 | Gendler; El | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof |
| US5789547A (en) * | 1995-06-07 | 1998-08-04 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method of producing insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) with correct folding and disulfide bonding |
| US5948757A (en) * | 1996-03-01 | 1999-09-07 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | High dose IGF-1 therapy |
| US5783556A (en) * | 1996-08-13 | 1998-07-21 | Genentech, Inc. | Formulated insulin-containing composition |
| US5985830A (en) * | 1996-09-16 | 1999-11-16 | Dalhousie University | Use of IGF-I for the treatment of kidney disorders |
| US6593290B1 (en) | 1996-11-01 | 2003-07-15 | Genentech, Inc. | Treatment of inner ear hair cells |
| US6156728A (en) | 1996-11-01 | 2000-12-05 | Genentech, Inc. | Treatment of inner ear hair cells |
| US6025368A (en) * | 1997-02-25 | 2000-02-15 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating the symptoms of chronic stress-related disorders using IGF |
| US6015786A (en) * | 1997-02-25 | 2000-01-18 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for increasing sex steroid levels using IGF or IGF/IGFBP-3 |
| US6514937B1 (en) | 1997-02-25 | 2003-02-04 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating psychological and metabolic disorders using IGF or IGF/IGFBP-3 |
| US6121416A (en) | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
| US6420518B1 (en) | 1997-04-04 | 2002-07-16 | Genetech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
| US7087580B2 (en) * | 1998-04-23 | 2006-08-08 | Genesense Technologies, Inc. | Neuropilin antisense oligonucleotide sequences and methods of using same to modulate cell growth |
| ATE284415T1 (de) | 1999-01-06 | 2004-12-15 | Genentech Inc | Mutierte variante des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor-i (igf-i) |
| DK1141015T3 (da) | 1999-01-06 | 2010-01-25 | Genentech Inc | Insulin-lignende vækstfaktor (IGF) I-mutantvarianter |
| IL145597A0 (en) | 1999-04-08 | 2002-06-30 | Genentech Inc | Composition based on oppositely-charged polypeptides |
| US20030100505A1 (en) * | 1999-11-01 | 2003-05-29 | Chiron Corporation | Compositions and methods of therapy for IGF-I-responsive conditions |
| DE60133271T2 (de) | 2000-05-16 | 2009-04-23 | Genentech, Inc., South San Francisco | Behandlung von knorpelerkrankungen |
| WO2002024216A2 (en) | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Bioexpertise, Llc | Method for use of igf-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
| US6887851B2 (en) | 2001-09-18 | 2005-05-03 | Bioexpertise, Llc | IGF-binding protein-derived peptide |
| ATE382364T1 (de) | 2001-09-18 | 2008-01-15 | Bioexpertise Llc | Von igf-bindungsprotein stammendes peptid |
| US6914049B2 (en) | 2001-09-18 | 2005-07-05 | Bioexpertise, Llc | IGF-binding protein-derived peptide or small molecule |
| EP1667521B1 (en) | 2003-09-12 | 2011-12-07 | Tercica, Inc. | Methods for treatment of insulin-like growth factor-1 (igf-1) deficiency |
| US7595160B2 (en) * | 2004-01-13 | 2009-09-29 | U.S. Genomics, Inc. | Analyte detection using barcoded polymers |
| WO2005067692A2 (en) | 2004-01-13 | 2005-07-28 | U.S. Genomics, Inc. | Detection and quantification of analytes in solution using polymers |
| EP1674113A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
| EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
| ES2388932T3 (es) | 2005-12-02 | 2012-10-19 | Genentech, Inc. | Polipéptidos de unión y usos de los mismos |
| CL2007002502A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
| MX2009001691A (es) | 2006-08-31 | 2009-02-25 | Hoffmann La Roche | Metodo para produccion del factor de crecimiento i tipo insulina. |
| US8580935B2 (en) | 2007-02-26 | 2013-11-12 | Alltech Associates, Inc. | Ultra-fast chromatography |
| WO2008130315A1 (en) | 2007-04-18 | 2008-10-30 | Premacure Ab | Method and product for treatment and/or prevention of complications of prematurity |
| EP1988154B1 (en) | 2007-04-30 | 2013-08-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing human insulin-like growth factor I |
| AU2008262387A1 (en) * | 2007-06-08 | 2008-12-18 | Massachusetts Institute Of Technology | IGF for the treatment of Rett Syndrome and synaptic disorders |
| US20090192554A1 (en) | 2008-01-29 | 2009-07-30 | Confluent Surgical, Inc. | Bioabsorbable block copolymer |
| US20100316639A1 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-16 | Genentech, Inc. | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
| EP2454368A4 (en) | 2009-07-17 | 2013-01-09 | Aaron Thomas Tabor | COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE GENETIC MODIFICATION OF COSMETIC FUNCTION CELLS FOR IMPROVING THE COSMETIC APPEARANCE PICTURE |
| BR112012011539A8 (pt) | 2009-11-17 | 2017-12-26 | Ipsen Pharma Sas | formulação para a combinação de hgh e rhigf-1 |
| US20110152188A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
| KR101687815B1 (ko) | 2015-06-19 | 2016-12-20 | 이영근 | 파력 발전 장치 및 이 파력 발전 장치를 복수 개 연결한 파력 발전 시스템 |
| JP2020533344A (ja) | 2017-09-11 | 2020-11-19 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | 慢性肺疾患を治療するための方法および組成物 |
| KR102015116B1 (ko) * | 2018-05-04 | 2019-10-21 | (주)메디톡스 | 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도 |
| US20210008172A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
| MX2023004426A (es) | 2020-10-19 | 2023-08-04 | Oak Hill Bio Ltd | Composiciones adecuadas para su uso en neonatos. |
| WO2023139115A1 (en) | 2022-01-19 | 2023-07-27 | Oak Hill Bio Limited | Compositions and methods for reducing oxidation of igf‐1/igfbp |
Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5210872B2 (da) | 1973-07-14 | 1977-03-26 | ||
| NL7607683A (nl) | 1976-07-12 | 1978-01-16 | Akzo Nv | Werkwijze ter bereiding van nieuwe peptiden en peptide-derivaten en de toepassing hiervan. |
| US4440859A (en) | 1977-05-27 | 1984-04-03 | The Regents Of The University Of California | Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms |
| US4366246A (en) | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4652525A (en) | 1978-04-19 | 1987-03-24 | The Regents Of The University Of California | Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes |
| US4411994A (en) | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| US4565785A (en) | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
| FR2441659A1 (fr) | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| IL60184A (en) | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
| US4342832A (en) | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US4431740A (en) | 1979-09-12 | 1984-02-14 | The Regents Of The University Of California | DNA Transfer vector and transformed microorganism containing human proinsulin and pre-proinsulin genes |
| GR70279B (da) * | 1979-09-12 | 1982-09-03 | Univ California | |
| US4425437A (en) | 1979-11-05 | 1984-01-10 | Genentech, Inc. | Microbial polypeptide expression vehicle |
| US4350764A (en) | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
| US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| IE53166B1 (en) | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
| NZ199391A (en) | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| JPS57200343A (en) | 1981-06-02 | 1982-12-08 | Wakunaga Yakuhin Kk | 27-desamidosecretin and its preparation |
| IE53517B1 (en) | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| NZ201918A (en) | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| EP0108132A1 (en) | 1982-05-06 | 1984-05-16 | Applied Molecular Genetics Inc. | The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof |
| US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| US4530904A (en) | 1982-09-03 | 1985-07-23 | Eli Lilly And Company | Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria |
| DE3382547D1 (de) | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
| SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
| GB8308483D0 (en) | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US5015575A (en) | 1983-04-07 | 1991-05-14 | Chiron Corporation | Hybrid DNA synthesis of insulin |
| WO1984004330A1 (en) | 1983-04-22 | 1984-11-08 | Amgen | Secretion of exogenous polypeptides from yeast |
| NZ207926A (en) | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| EP0123228B1 (en) * | 1983-04-25 | 1993-09-29 | Chiron Corporation | Hybrid dna synthesis of mature insulin-like growth factors |
| US4755465A (en) | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| US4588684A (en) | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| SE8303626D0 (sv) | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Kabigen Ab | A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced |
| NL8302324A (nl) | 1983-06-30 | 1985-01-16 | Rijksuniversiteit Utrecht De | Escherichia coli stam, een voor deze stam karakteristiek plasmide, een werkwijze ter bereiding van dit plasmide, een precursor van een somatomedine, alsmede een groeibevorderend preparaat. |
| WO1985000831A1 (en) | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
| DK108685A (da) | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| US4745179A (en) * | 1984-04-02 | 1988-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof |
| WO1986000619A1 (en) | 1984-07-13 | 1986-01-30 | Chiron Corporation | Prepro insulin-like growth factors i and ii |
| US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
| GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
-
1984
- 1984-06-01 IL IL7199184A patent/IL71991A/en unknown
- 1984-06-04 DK DK198402761A patent/DK172480B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-06-05 EP EP84303783A patent/EP0128733B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-05 DE DE8484303783T patent/DE3485693D1/de not_active Revoked
- 1984-06-05 IE IE140084A patent/IE58317B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-06-05 KR KR1019840003134A patent/KR850000525A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-06-06 ES ES533170A patent/ES8603955A1/es not_active Expired
- 1984-06-06 AU AU29133/84A patent/AU594301B2/en not_active Expired
- 1984-06-06 JP JP59117422A patent/JP2608870B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-08 JP JP6126496A patent/JPH0759578A/ja active Pending
-
1995
- 1995-06-05 US US08/464,361 patent/US6331609B1/en not_active Ceased
- 1995-06-05 US US08/464,255 patent/US6331414B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-13 US US10/461,712 patent/USRE39355E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6069029A (ja) | 1985-04-19 |
| AU2913384A (en) | 1984-12-13 |
| IL71991A (en) | 1994-05-30 |
| AU594301B2 (en) | 1990-03-08 |
| IE58317B1 (en) | 1993-09-08 |
| JP2608870B2 (ja) | 1997-05-14 |
| KR850000525A (ko) | 1985-02-27 |
| ES8603955A1 (es) | 1986-01-16 |
| EP0128733B1 (en) | 1992-05-06 |
| USRE39355E1 (en) | 2006-10-17 |
| EP0128733A1 (en) | 1984-12-19 |
| JPH0759578A (ja) | 1995-03-07 |
| US6331609B1 (en) | 2001-12-18 |
| IE841400L (en) | 1984-12-06 |
| DK276184A (da) | 1985-01-21 |
| ES533170A0 (es) | 1986-01-16 |
| DK276184D0 (da) | 1984-06-04 |
| IL71991A0 (en) | 1984-10-31 |
| DE3485693D1 (de) | 1992-06-11 |
| US6331414B1 (en) | 2001-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172480B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af moden human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) eller et human IGF-I-fusionsprotein, eksp | |
| CA1254527A (en) | Expression vectors for enhanced production of polypeptides, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods | |
| JP4341859B2 (ja) | 酵母での異種タンパク質の発現の方法 | |
| EP0200655B1 (fr) | Vecteurs d'expression et de sécrétion de l'hirudine par les levures transformées | |
| JP2572952B2 (ja) | 置換されたプロモーターを使用する宿主による異種起源蛋白質の製造方法 | |
| EP0518587A2 (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| WO1984004330A1 (en) | Secretion of exogenous polypeptides from yeast | |
| JPS6236183A (ja) | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 | |
| NO830780L (no) | Uttrykking, behandling og sekresjon av heterologt protein av gjaer | |
| US20070010439A1 (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
| US5010003A (en) | Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins | |
| EP0658170A1 (en) | Glucagon antagonists and methods for detecting glucagon antagonists | |
| JPH085797B2 (ja) | 細胞増殖刺激剤 | |
| EP0127304A1 (en) | Process for producing heterologous protein in yeast, expression vehicle therefor, and yeast transformed therewith | |
| JP2834111B2 (ja) | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 | |
| WO1985005125A1 (fr) | Vecteur d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix | |
| CA1341491C (en) | Preparation of human igf and egf via recombinant dna technology | |
| NZ208339A (en) | Preparation of insulin-like growth factor (igf) by recombinant dna technology | |
| De Silva et al. | A study of the expression of a protein proteinase inhibitor from sweet corn |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |