PL153724B1 - Expression processing and secretion of heterologous protein by yeast - Google Patents
Expression processing and secretion of heterologous protein by yeastInfo
- Publication number
- PL153724B1 PL153724B1 PL1983240927A PL24092783A PL153724B1 PL 153724 B1 PL153724 B1 PL 153724B1 PL 1983240927 A PL1983240927 A PL 1983240927A PL 24092783 A PL24092783 A PL 24092783A PL 153724 B1 PL153724 B1 PL 153724B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ecori
- yeast
- ifn
- dna
- leu
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 135
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 76
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 42
- 238000012545 processing Methods 0.000 title description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 30
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 27
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 26
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 12
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 101150061147 preA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims 2
- DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N Ala-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N 0.000 claims 1
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 claims 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 claims 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 claims 1
- PPQRKXHCLYCBSP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N PPQRKXHCLYCBSP-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims 1
- JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N Leu-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N 0.000 claims 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N Pro-Phe-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N 0.000 claims 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 1
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims 1
- MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N Thr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 claims 1
- YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N Thr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N 0.000 claims 1
- OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N 0.000 claims 1
- 108010081985 glycyl-cystinyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 claims 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 claims 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 100
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 56
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 55
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 15
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 14
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 8
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 7
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 4
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 2
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutane Chemical compound CCCCCl VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRTNVZOWEFVIGJ-UHFFFAOYSA-N 2-anilino-4h-1,3-thiazol-5-one Chemical class S1C(=O)CN=C1NC1=CC=CC=C1 HRTNVZOWEFVIGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZRIQDWDJVLELF-UHFFFAOYSA-N 3-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical class O=C1CNC(=S)N1C1=CC=CC=C1 ZZRIQDWDJVLELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- MNGJUNUPKSRTDR-UHFFFAOYSA-N C1NC(NC2=CC=CC=C2)[S+]=C1 Chemical class C1NC(NC2=CC=CC=C2)[S+]=C1 MNGJUNUPKSRTDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- FVDYHOGCIRNKAY-UHFFFAOYSA-N benzyl thiohypofluorite Chemical compound FSCC1=CC=CC=C1 FVDYHOGCIRNKAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N dotp Chemical compound O=C1N2CCOC2=NC2=C1SC=C2 BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/30—Signal or leader sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment And Processing Of Natural Fur Or Leather (AREA)
- Lubricants (AREA)
Description
RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 724
POLSKA
Patent dodatkowy do patentu nr-—
Int. CI.' C12N15/20
Zgłoszono: 83 03 08 (P. 240927)
Pierwszeństwo: 82 03 08 Stany Zjednoczone Ameryki .i
URZĄD
PATENTOWY
RP
Zgłoszenie ogłoszono: 83 11 07
Opis patentowy opublikowano: 1992 04 30
Twórcy wynalazku: Ronald A. Hitzeman, David Wai-Hung Leung
Uprawniony z patentu: Genentech Inc.,
South San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)
Sposób wytwarzania białka heterologicznego, takiego jak ludzki interferon leukocytowy A lub D lub ludzki hormon wzrostu
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D lub ludzkiego hormonu wzrostu na drodze genetycznych zmian komórek drożdży.
Organizmy drożdży w naturalny sposób transportują pewne białka homologiczne do, a czasem przez, błonę plazmatyczną, w ramach udziału w zwiększaniu się powierzchni komórki i w jej metabolizmie. Gdy komórka pęcznieje w przypadku reprodukcyjnego przygotowywania się do tworzenia komórki potomnej, to do tworzenia ściany komórkowej, błony plazmatycznej, jak i w metabolizmie, potrzebne są dodatkowe białka. Niektóre z tych białek muszą znaleźć swoją drogą do miejsca działania, czyli uważa się, że istnieje szlak sekrecyjny. Pewna białka homologiczne zaangażowane w powyższych procesach tworzone są przez translację w retikulum endoplazmatycznym. Homologiczne są białka normalnie wytwarzane przez dane gatunki drożdży i niezbędne dla ich żywotności. Raz utworzone, migrują wykorzystując przeniesienie enzymatyczne do aparatu Golgie'ego i stąd w pęcherzykach do błon plazmatycznych, z którymi łączą się lub w pewnym stopniu penetrują do przestrzeni między błoną plazmatyczną a ścianą komórkową. Wygląda na to, że mała ilość białek homologicznych jest eksportowana przez ścianę komórkową, jak czynnik a i toksyna zabijająca.
Poza tym wydaje się, że region pączkowania komórki jest miejscem przyciągającym dla pęcherzyków i przez swoją fuzję z wewnętrzną powierzchnię pączka uczestniczą one w ogólnym wzroście błony komórkowej i przypuszczalnie ściany komórkowej. Teoria ta nie daje dowodu, że sekrecja lub migracja białka (białek) przez błonę rzeczywiście zachodzi. Podobnie, ciągle kontrowersyjne jest to, czy glikozylacja białek może towarzyszyć lub może wiązać się z tak zwanymi procesami sekrecyjnymi. Dalej, z definicji, uważa się, że białka „ulegające sekrecji mają prepeptyd sygnałowy, jak się sądzi związany z procesami transportu i inkorporacji na powierzchni błony. Działania tych modyfikacji dojrzałego białka, jeśli istnieją, w procesach sekrecyjnych i ogólna rola szlaku sekrecyjnego w przyroście powierzchni są spekulacjami nie opartymi na mocnych dowodach.
153 724
Przewidywano, że rekombinantowa technologia DNA może zapewnić cenną pomoc przy udzielaniu odpowiedzi na otwarte pytania dotyczące procesów sekrecyjnych w organizmach drożdży, biorąc pod uwagę jej udowodnioną użyteczność przy nadawaniu tym i innym organizmom zdolności do tworzenia znacznej ilości endogennie heterologicznego produktu polipeptydowego, przez osiągnięcie odpowiedniego manipulowania drożdżami-gospodarzem w celu wywołania sekrecji heterologicznego białka w oddzielnej, dojrzałej postaci.
Znane jest wytwarzanie białka heterologicznego przez drożdże, ale jak dotąd nie opisano możliwości sekrecji takiego białka z drożdży. Dotychczas wytworzone obce białko należało zawsze odzyskiwać z cytoplazmy komórkowej. Odzyskiwanie białka jest procesem trudnym i kosztownym, ponieważ drożdże wraz z białkiem wewnątrzkomórkowym zawierają o wiele więcej zanieczyszczrganizmach drożdży ekspresję, przetwarzanie i sekrecję białka, które jet heterologiczne w stosunku białko wytwarzane wewnątrz błony komórkowej do organizmu drożdży i nie jest niezbędne kową, aminokońcową resztę metionylową. Jeżeli takie białka pojawiały się w pożywce, to tylko jako wynik lizy, której poddano tę pożywkę. W każdym przypadku nie były one w dojrzałej postaci, czyli takiej, której nie towarzyszyłaby niepożądana presekwencja .albo inny artefakt ekspresji.
Stwierdzono, że drożdże mogą przetwarzać białko prekursorowe, zawierające białko sygnałowe, w innych warunkach nieobecne w drożdżach, czyi „heterologiczne białko sygnałowe, dzięki czemu obce białko wytworzone przez drożdże ulega sekrecji do środowiska hodowlanego. Jednocześnie to ulegające sekrecji białko ma normalne zakończenie aminokwasowe bez dodatkowej reszty metionylowej, czyli jet to białko w natywnej postaci, nie związane z niepożądanymi polipeptydami.
Bardziej szczegółowo stwierdzono, że można wywołać w organizmach drożdży ekspresję przetwarzanie i sekrecję białka, które jest heterologiczne w stosunku do organizmu drożdży i nie jest niezbędne dla ich żywotności, przy czym białko to można otrzymać z podłoża podtrzymującego żywe, produkujące komórki drożdży, w postaci oddzielnego produktu, bez towarzyszącej mu, niepożądanej presekwencji polipeptydowej lub innego artefaktu ekspresji. Odpowiednie komórki drożdży w żywej hodowli transformuje się nośnikami ekspresyjnymi zawierającymi DNA kodujący białko heterologiczne i heterologiczny polipeptyd sygnałowy. Po ekspresji białka wraz z heterologicznym peptydem sygnałowym, produkt ekspresji zostaje przetworzony, a dojrzałe białko heterologiczne przeniesione do podłoża hodowli komórek. Produkt wyodrębnia się z podłoża względnie łatwo, bez koniecznoci naruszenia żywych komórek drożdży przez ich rozbijanie, a z drugiej strony odzyskuje się go w natywnej postaci do użycia, bez konieczności usuwania niepożądanej presekwencji lub innych artefaktów ekspresji (np. metioniny przyłączonej do N-końcowego aminokwasu, który w nieobecności metioniny byłby pierwszym, przy czym obecność metioniny jest konsekwencją ekspresji kodonu AUG, translacyjnego sygnału startu). Tak więc, podłoże można otrzymać w postaci zasadniczo wolnej od żywych lub rozbitych (to jest poddanych lizie lub rozbitych w inny sposób) komórek i, jeśli zawiera ono żądany produkt, podłoże to podatne jest na metody oczyszczania łatwiejszego do zastosowania, aniżeli w przypadku, gdy zawiera rozbite komórki. Produkt ten, po oczyszczeniu, przeznacza się do użycia, jak to było przewidziane. Np. produkt w postaci ludzkiego interferonu leukocytowego znajduje zastosowanie jako czynnik przeciwwirusowy i/lub przeciwnowotworowy dla ludzi.
Sposób wytwarzania ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D lub ludzkiego hormonu wzrostu, których N-końcowe sekwencje aminokwasowe w postaci dojrzałej są przedstawione na rysunku fig. 13, polega na tym, że do wektora ekspresji typu YEpIPT dokonuje się funkcjonalnej insercji DNA kodującego wytwarzane białko heterologiczne, jak również heterologiczny polipeptyd sygnałowy, taki jak preA, preD, preD/A, prey, pre/J lub preHGH, których sekwencje aminokwasowe są przedstawione na rysunkach fig. 1 i fig. 13, otrzymanym wektorem transformuje się hodowlę komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, nadając im zdolność uwalniania do pożywki, bez niszczenia komórek ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D albo ludzkiego hormonu wzrostu i odzyskuje się białko w jego natywnej postaci, a usuwa się polipeptydy i inne produkty sekrecji.
Przez termin „białko heterologiczne, użyty w niniejszym opisie, rozumie się białko, które nie jest normalnie wytwarzane, lub niezbędne dla żywotności organizmu drożdży. Termin ten przewiduje funkcjonalną insercję DNA kodującego wspomniane białko via rekombinantowa technologia
153 724
DNA, do nośnika ekspresyjnego, użytego z kolei do transformacji organizmu drożdżygospodarza. Funkcjonalna insercja DNA oznacza insercję DNA kodującego białko heterologiczne i presekwencję do wektora ekspresyjnego pod kontrolą układu promotora kierującego ekspresją. Określenia „heterologiczna presekwencja lub „heterologiczny polipeptyd sygnałowy odnoszą się do wspomnianych polipeptydów, które normalnie nie są wytwarzane lub zaangażowane w Saccharomyces cerevisiae i mogą stanowić polipeptyd sygnałowy natywny w stosunku do rozważanego białka heterologicznego, albo inny polipeptyd heterologiczny (sygnałowy) połączony funkcjonalnie z białkiem heterologicznym. Korzystnie polipeptydem sygnałowym jet hybryda natywnego białka i drugiego . polipeptydu heterologicznego. Wśród białek .korzystne jest białko sygnałowe ludzkiego leukocytu A, a zwłaszcza 'hybryda polipeptydu AD leukocytów ludzkich o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na rysunku fig. 1.
Termin „sekrecjy oznacza w niniejszym opisie wydzielenie produktu przez błonę plazmatyczną co najmniej do lub przez ścianę komórkową organizmu drożdży do podłoża podtrzymującego hodowlę komórek. W związku z tym należy rozumieć, że w pewnych przypadkach, „ulegający sekreęji produkt łączy się w pewien sposób ze ścianą komórkową, przypuszczalnie wymagając innej metody oczyszczania lubmodyfikacji budowy i funkcji drożdży-gospodarza. Termin „przetwarzani* oznacza komórkowe odszczepienie polipeptydu sygnałowego od dojrzałego białka tak, że następuje wytwarzanie białka bez towarzyszącego, ubocznego peptydu, czyli w tak zwanej oddzielnej, dojrzałej postaci. Do peptydów ubocznych należą peptydowe artefakty ekspresji, takie, jak metienina. Przetwarzanie dopuszcza mało znaczące odszczepienie polipeptydu sygnałowego w miejscu nie inaktywująco bliskim dokładnie umiejscowionego punktu połączenia polipeptydu sygnałowego z dojrzałym białkiem.
Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasów sygnałowego prepeptydu ludzkiego IFNσΐ/pro D/, INF-a2/pro A/, INF-ćol,2/pro D/A/, INF-y/pro y/oraz INF-j/pro β/. Aminokwasy podkreślone przedstawiają różnice między sekwencjami aminokwasów pro A i pro D. Miejsce Ddel wskazuje połączenie presekwencji D i A przy przygotowywaniu hybrydowej presekwencji D/A, fig. 2 stanowi diagram drożdżowego plazmidu ekspresyjnego YEpIPT stosowanego jako ogólny nośnik używany w celu ekspresji różnych insertów genowych, przedstawiając niektóre miejsca restrykcyjne i różne regiony będące punktami zainteresowania, fig. 3 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoBI zawierającego gen pro-plus INF-al w celu bezpośredniej ekspresji INF-al w drożdżach, fig. 4 -konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego dojrzały gen INF-a2 do kierowania ekspresją w drożdżach, fig. 5 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus lNF-a2 z sekwencją kodującą pierwsze 14 aminokwasów w presekwencji pro-lNF-al do bezpośredniej ekspresji INF-a2 w drożdżach, fig. 6 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus INF-y z sekwencją liderową o 70 parach zasad (bp) poprzedzającą kodon inicjacji ATO do ekspresji INF-y w drożdżach, fig. 7 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus INF-y do bezpośredniej ekspresji INF-y w drożdżach, fig. 8 - przedstawia podsumowanie wszystkich konstrukcji użytych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku w ekspresji różnych genów IFN, przetwarzaniu i sekrecji w drożdżach, fig. 9 stanowi krzywą wzrostu a/YEplPT-DilFAl/ pepa-3 i b/YEplPT-proLeIFA53/pop4-3 wyznaczoną przez pomiary AeeonmPodłoża badano dla a/ i b/ pod względem aktywności interferonu za pomocą biotestu. Ozan odnosi się do godzin wzrostu w temperaturze 30°C, fig. 10 A - krzywą wzrostu YeplPTproLeIFA53t/ pop4-3 przy fermentacji prowadzonej w objętości 5 litrów. /O/ oznacza Aeeonm i /O/ milion jednostek aktywności interferonu wewnątrz komóreklitr, fig. 10 B stanowi taką samą krzywą wzrostu jak zdefiniowana w fig. 10 A z wykreśleniem aktywności podłoża, fig. 11 przedstawia profil elucji proD/A LeiF z kolumny z przeciwciałem monoklonalnym, fig. 12 - analizę śladową HPLC piku A puli interferonowej z kolumny z przeciwciałem monoklonalnym, fig. 13 -wyniki analizy sekwencji aminokwasów produktu otrzymanego po oczyszczeniu za pomocą NPLO, fig. 14 - różne konstrukcje zastosowane w celu wytwarzania ludzkiego hormonu wzrostu (HGH) sposobem według wynalazku, fig. A przedstawia schematycznie mapę restrykcyjną insertu Hindlll o 3,1 kilopar zasad (kbp) nośnika pBl, z którego został wyodrębniony promotor PGK. Wskazana jest insercja miejsca EcoBI i miejsca Xbal w 5’-skrajnym DNA genu PGK, fig. B przedstawia 5’-skrajną sekwencję plus początkową sekwencję kodującą genu PGK przed insercją miejsc Xbal i EcoRI, fig. C schematycznie przedstawia metody użyte do włączenia miejscca Xbal w pozycji 8 promotora PGK i do wyodrębnienia fragmentu o 39 bp 5’-skrajnej sekwencji PGK
153 724 zawierającego koniec Xbal i koniec Sau3A, fig. D schematycznie przedstawia konstrukcję fragmentu o 300 bp, zawierającego powyższy fragment o 39 bp, dodatkową 5’-skrajną sekwencję PGK (265 bp) od Pyul do Sau3A (patrz fig. A) i miejsce EcoBI sąsiadujące z Xbal, a fig. E schematycznie przedstawia konstrukcję fragmentu promotora PGK (Hindlll/EcoRI), który zawiera w uzupełnieniu fragmentu skonstruowanego jak na fig. 4, fragment NindIII-Pvul o 1300 bp z 5’-skrajnej sekwencji PGK (patrz fig. A).
Przykład I. Wytwarzanie IFN.
Materiały. Wszystkie enzymy restrykcyjne DNA i metaboliczne otrzymano z New England Biolaba oraz z Zethesda Research Laboratories. Enzymów restrykcyjnych DNA i metabolicznych używa się w warunkach i w buforach opisanch przez odpowiednich wytwórców. ATP i trifisforany dezoksynukleotydów, dATP, dCTP, dOTP i dTTP otrzymano z PL Biochemicals. Łączniki DNA wytwarza się znanymi metodami.
Preparatyka DNA i transformacja. Oczyszczanie kowalencyjnie zamkniętych kolistych DNA z E.coli i transformacji E.coli dokonuje się zgodnie z uprzednio opisanymi metodami. Minisita E.coli jak opisano. Transforamcję drożdży przeprowadza się jak uprzednio opisano, tym niemniej z następującymi modyfikacjami. Używa się 200 ml komórek (2 X 107 komórek/ml) i przemywa 25ml H2O przez wirowanie. Komórki te traktuje się 10ml IM sorbitu, 25mM EDTA (pH 8) i 50 mM dwutiotreitolem w ciągu 10 minut w temperaturze 30°C, a następnie przemywa 10 ml 1 M sorbitu. Osadzone komórki łagodnie zawiesza się w 10 ml SCE(1 M sorbit, 0,1 Mcytrynian sodowy o pH 5,8 i 0,01 M EDTA), po czym zadaje w temperaturze 30°C o 200//g zymolazy 60000 (Kirin Brewery). Tworzenie się sferoplastów następuje do 80% po dodaniu 100pi zawiesiny do 0,9 ml 10% SDS z pomiarem Aeoo nm, używając rozcieńczenie komórek przed dodaniem enzymu za 0% (liza w 10% SDS powoduje obniżenie Aeoo). Następnie komórki przemywa się 3 razy 10 ml IM sorbitu. Można je przechowywać w sorbicie w ciągu kilku dni w temperaturze 0°C. Następnie komórki przemywa się 1 raz 1 M sorbitem, 10 mM CaCk i 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i zawiesza ponownie w 1 ml tego samego roztworu. Następnie dodaje się 5 do 15 //g plazmidowego oczyszczonego DNA lub 20μ litrów otrzymanego z E.coli minisitowego DNA (2/5 plazmidowego DNA z fazy stacjonarnej hodowli (5 ml) E.coli w LB) do 100 μ\ ponownie zawieszonych komórek i łagodnie miesza w ciągu 15 minut.
Następnie dodaje się, przy łagodnym mieszaniu, w ciągu 15 minut 1 ml roztworu składającego się z glikolu polietylenowego (Baker) do stężenia 20% (wag/obj), CaCl2 do stężenia 10 mM i Tris-HCl do stężenia 10 mM (pH 7,5). Komórki odwirowuje się i ostrożnie ponownie zawiesza do 200μ1 SOS (1 M sorbit, 33,5% (obj/obj) bulionu YEPD oraz 6,5 mM CaCkk). Inkubację prowadzi się w ciągu 20 minut w temperaturze 30°C. B^O^^litrów otrzymanej zawiesiny umieszcza się następnie na płytce Petri’ego zaierającej 20 ml agaru dolnego (182 g sorbitu, 20 g glukozy, 6,7 g YNB i 30 g agaru Difco/litr H2O) pokrytego 10 ml agaru górnego (o temperaturze 50°C), takiego samego jak agar dolny, ale z dodatkiem 1 ml adeniny (l,2mg/ml), 1 ml uracylu (2,4mg/ml) i 1 ml mieszaniny beztryptofanowej na 50 ml agaru dolnego. Mieszanina beztryptofanowa zawiera na 100ml wody następujące aminokwasy: 0,2 g Arg, 0,1 gHis, 0,6 gile, 0,6gLeu, 0,4gLys, 0,1 gMet, 0,6gPhe, 0,5gThr). Ta selekcja Trp+ daje w wyniku 103 - 104 transformantów drożdży ^g plazmidowego DNA.
Plazmidy drożdży otrzymuje się z drożdży za pomocą przeprowadzenia hodowli drożdży o objętości 15 ml do fazy stacjonarnej (Αββϋ = 5-6) w YNB + CAA (patrz p. Szczepy i podłoża, poniżej), utworzenia sferoplastów sposobem wyżej opisanym, osadzenie komórek i wykorzystania metody minisit dotyczącej E.coli (bez lizozymu) jak opisano.
Stabilność plazmidów w drożdżach określa się przez rozrzedzenie zawiesiny komórek podczas selektywnego wzrostu w YNB + CAA i wysianie na nieselektywne płytki YEPD. Po 2 dniach wzrostu w temperaturze 30°C z płytek tych robi się repliki na płytkach YNB + CAA (selekcja Trp+). Procentową wartość odnoszącą się do stabilności plazmidów oblicza się jako ilość kolonii rosnących nieselekty wnie z odjęciem tych kolonii, które nie rosną selektywnie i z podzieleniem przez ilość kolonii rosnących nieselektywnie X 100.
Szczepy i podłoża. Do wszystkich innych transformacji bakteryjnych używa się E.coli K-12 szczep 294 (ATCC 31446). Do transformacji drożdży używa się pep4-3 (20B-12, d trpl pep4-3) i
GM3C-2 (a, leu 2-3, leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, cyp 3-1). Szczepy drożdży 20B-12 i
153 724
GM3C-2 są zdeponowane i dostępne bez ograniczeń w American Type Culture Cellection pod nr nr odpowiednio, ATCC 20626 i ATCC 20625, oba od 5 marca 1982 r. Stosować można rozmaite szczepy drożdży, patrz Lodder i wsp., The Yeasts, a Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdam. Podobnie, można użyć różnych podłoży, patrz Difco Manuał of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, wyd. 9, Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan (1953).
LB stosuje się jak to opisał Miller z dodatkiem 20/zg/ml ampicyliny (Sigma), po czym podłoża wyjaławia się w autoklawie i oziębia. Hodowlę drożdży prowadzi się w następujących podłożach: YEPD zawierające 1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu i 2% glukozy ±3% agaru Difco. YNB + CAA zawiera 6,7 g podstawowego azotu drożdżowego (bez aminokwasów) ' (YNB) (Difco), 10 mg adeniny, 10 mg uracylu, 5 g Difco casamino acids (CAA), 20 g glukozy i ±30 g agaru/litr i używane jest do selekcji Trp*.
Krzywa wzrostu i preparatyka ekstraktu. Prowadzi się hodowlę indywidualnych kolonii drożdży szczepu YEpIPT-preLeIF-A 53 t/pep4-3 i szczepu YEpIPT-A l/^p^e^p>4-3 w ciągu 7 godzin w temperaturze 30°C w 100 ml YNB + CAA do Aeeo około 1,1. 100 ml tych hodowli rozcieńcza się do objętości 1 litra YNB + CAA z otrzymaniem roztworu o Aeeo 0,1. Wzrost w tych 1 litrowych hodowlach prowadzi się następnie w temperaturze 30°C i co pewien czas pobiera się 10milimetrowe próbki do pomiaru gęstości optycznej, wytwarzania interferonu i sekrecji. Do badań każdą 10 ml próbkę wiruje się przy 7Kobr/min w ciągu 15 minut w wirówce Sorval RC3B. Supernatanty (podłoża) bada się bwz rozcieńczania. Komórki zawiesza się ponownie w 0,4 ml 7 M roztworu guanidyna-HCl zawierającego taką samą objętość kulek szklanych, po czym wiruje 2 razy przez 2 minuty przy dużej szybkości. Następnie lizat komórkowy rozcieńcza się PBS/BSA (150 mM NaCl, 20 mM fosforan sodowy o pH 7,9 i 0,5% bydlęca albumina surowicza) do biotestu.
Badanie interferonu. Ekstrakt drożdży bada się pod względem zawartości interferonu przez porównanie ze standardami interferonu w badaniu zahamowania efektu cytopatycznego. Ekstrakty drożdżowe przygotowuje się w następujący sposób: prowadzi się hodowlę w 10 ml YNB + CAA do osiągnięcia Αβ60~ 1-2. Komórki zbiera się przez odwirowanie i zawiesza ponownie w 3 ml 1,2 M sc^i^ł^iti^, 10 mM KH2PO4 o pH 6,,8 i 1% zymolazy €6)000, a następnie inkubuje w ciąąu 30 minut w temperaturze 30°C. Powstaje do 90% sferoplastów, które osadza się przy 3000 X g w ciągu 10 minut, następnie zawiesza w 150 //litrach 7M chlorowodorku guanidyny (GHC1) + 1 mM fenylometylosulf^fluorek (PMSF). Ekstrakty rozcieńcza się 20-100 X buforem PBS/BSA (20 mM NaHzPO4 o pH 7,4, 150mM NaCl, 0,5% BSA) bezpośrednio przed badaniem. Alternatywnie, 10 ml komórek przy tej smaej wartości Aeeo osadza się i ponownie zawiesza w 0,4 ml 7 M CHC1 w
1,5 mi Eppendoora zawierającee okoto 0,4 ml kulek szklanych (0,45 do 0,5 mm, B. Braun,
Melsurgen AG). Probówki te poddaje się wirowaniu 2 razy przez 2 minuty przy najwyższej szybkości wirowania, trzymając na lodzie w międzyczasie. Następnie ekstrakty odwirowuje się w ciągu 0,5 min. w wirówce Eppendorfa i rozcieńcza buforem PBS/BSA jak wyżej. Bioęetęc przeprowadza się z komórkami MDBK dla LelF A, LelF D, i ich pro-postaci, a z komórkami HeLa dla IFN-y i prelFN-y.
Oczyszczanie (pre D/A) LelF A z podłoży. Prowadzi się hodowlę pojedyńczej kolonii drożdży szczepu YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3 w 500 ml YNB + CAA w temperaturze 30°C do Aeeo 2,4. 500 ml tej hodowli rozcieńcza się do 5 litrów YNB + CAA do Aeeo 0,21, po czym prowadzi się hodowlę w otrzymanej objętości 5 litrów w temperaturze 30°C do Aeeo 4. W tym czasie zbiera się komórki z 5 litrów hodowli za pomocą wirowania przy 7000 obr/min w ciągu 20 minut. W trakcie fermentacji pobiera się periodycznie 10 ml próbki dla pomiaru gęstości opęccznnj, wytwarzania interferonu i sekregi. Przed badaniem każdą próbkę wiruje się w wirówce laboratoryjnej z chłodzeniem w ciągu 5 minut, w celu oddzielenia komórek od podłoża. Podłoże i komórki bada się w sposób jak wyżej opisano (patrz fig. 9, 10A i DB).
Podłoża zagęszcza się do końcowego stężenia 200 ml i poddaje diafiltracji wobec Tn^^cys /EDTA o pH 8,0 z użyciem membrany uetrafilęracyjnnj 1000 daltonów (O-PS, Odmics) w aparacie ctnnkokαnαłowcm Amicon (TCF 10). 200 ml pozostałości przepuszcza się przez 1,5 ml
153 724 kolumnę immunopowinowactwa zaiwerającą przeciwciało monoklonalne przeciw LelF A związane kowalencyjnie z Affigel 10 (BioRad) przy szybkości przepływu 15ml/godz Ponad 80% aktywności interferonu z roztworu oryginalnego ulega związaniu z kolumną. Przepływ przez kolumnę powtarza się przy szybkości przepływu 40 ml/godzinę. Po drugim naniesieniu stwierdza się w płynie przepływającym około 7% oryginalnej aktywności interferonu. Następnie kolumnę przemywa się 0,2 M NaCl w Tris/cys/EDTA o pH 8,0. Podczas tego przemywania eluuje się około 1,7% aktywności.
Większość aktywności interferonu (około 50% oryginalnej aktywności) eluuje się z kolumny za pomocą 51,5 ml wody dejonizowanej o pH 5,5. Kolumnę przemywa się w końcu 22,5 ml 0,2 M kwasu octowego w celu usunięcia jakiegokolwiek pozostałego białka, przy czym eluuje się około 8% oryginalnej aktywności. Po eluacji kwasem octowym kolumnę ponownie równoważy się Tris/cys/EDTA o pH 8,0. Podczas przemywania wodą, kwasem i Tris/cys/EDTA zbiera się frakcje 2,25 - 4,5 ml. Frakcje o numerach 1 - 7 łączy się i liofilizuje do sucha. Pozostałość rozpuszcza się ponownie w 200 //litrach 0,1% kwasu trójfluorooctowego (TFA) o pH 2,5 i dalej oczyszcza za pomocą HPLC na kolumnie Synchropak RP-P. Kolumnę eluuje się przy szybkości przepływu 1 ml/min przy liniowym gradiencie 0-100% acetonitrylu wO,l%TFAopH2,5.1 ml frakcje zbiera się i bada po rozcieńczeniu PBS/BSA jak wyżej opisano. Jako kontrolę poddaje się także chromatografii 2,5//g próbkę oczyszczonego IFN A (fig. 12). Aktywność interferonu, eluowana z kolumny jako pojedyńczy pik, skupia się wokół frakcji 39. Frakcję tę liofilizuje się do sucha i pozostałość poddaje analizie sekwencji.
Analiza sekwencji. Analiza sekwencji opiera się na degradacji Edmana. Następnie próbkę przenosi się do części wprowadzającej aparatu Beckman 890B spinning cup seąuencer. W części wprowadzającej używa się jako nośnika Polybrene™ (polidwuoctan N, N, Ν’, N’-czterometylo-Ntrójmetylenosześciometylenodwuamoniowy). Aparat do oznaczania sekwencji modyfikuje się przy użyciu wymrażarki i pewnej zmiany programu w celu zmniejszenia tła pików. Stopień czystości stosowanych odczynników: Beckan’s seąuence grade (0,1 M bufor Quadrol, fenyloizotiocyjanian i kwas siedmiofluoromasłowy).
Modyfikacja obejmuje także automatyczną konwersję pochodnych 2-anilino-5-tiazolinowych w miarę ich ekstrahowania z aparatu do analizy sekwencji. 1-chlorobutan zbiera się w Pierce Reacti-Vial™ i suszy w atmosferze azotu. Następnie do pochodnych 2-anilino-5-tiazolinonu dodaje się 25% roztwór wodny kwasu trójfluorooctowego (TFA) i ogrzewa do temperatury 20°C przez 10 minut w celu konwersji do pochodnych 3-fenylo-2-tiohydantoiny (pochodne PTM). PTH-reszta aminokwasowa zostaje następnie automatycznie rozpuszczona w 50% acetonitrylu i wodzie i wstrzykuje się ją do cieczowego chromatografu ciśnieniowego z odwróconymi fazami. Każdy PTH-aminokwas zostaje następnie zidentyfikowany przez porównanie z czasem retencji standardowej mieszaniny aminokwasów wprowadzonej do fiolki do konwersji i potraktowanej w taki sam sposób jak materiał obiegowy z aparatu do analizy sekwencji. Wyniki podsumowuje fig. 3. Są one przedyskutowane poniżej.
Hydrydyzacja metodą Westerna. Białka najpierw poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym zawierającym siarczam sodowo-dodecylowy na płytkach przed elektroforetycznym naniesieniem na bibułę nitrocelulozową (S + S BA 85) i następującą po tym immunologiczną identyfikacją HGH. Aparat do przenoszenia (Electroblot, E. C. Apparatus Corp., St. Petersburg, FI.) znajduje się po części żelowej. Bibułę nitrocelulozową przemywa się krótko buforem do przenoszenia zawierającym Tris do stężenia 25 mM i glicynę do stężenia 192 mM, o pH 8,4. Przenoszenia dokonuje się przy 400 mA w ciągu 1 1/2 godziny, po czym skrawek umieszcza się w 50 mM Tris o pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5mM EDTA, 0,25% (wag/obj) żelatynie, 0,05% NP - 40 i miesza łagodnie przez noc. Odpowiednio rozcieńczony roztwór króliczego przeciwciała przeciw ludzkim HGH umieszcza się w plastykowym woreczku ze skrawkiem i buforem NP - 40/żelatyna (typowo 100//lltrów/cm2) i inkubuje w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej z łagodnym kołysaniem. Skrawek przemywa się krótko H2O, a następnie NP - 40/żelatyną w ciągu lgodziny i poddaje reakcji z próbką sondującą z [125J] - białkiem A (New England Nuclear) rozcieńczonym buforem NP - 40/żelatyna, w woreczku „Seal-a-Meal w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym kołysaniem. Po kilkakrotnym przemyciu wodą skrawek zawija się w celofan i eksponuje na błonę X-Omat-AR (Kodak) z intensyfikującym ekranem w temperaturze -70°C.
Barwienie żelu. Żele poliakryloamidowe zawierające białko barwi się metodą Oakley’a i wsp.
153 724 • . --- .... __________- _ “z <>. * , . ··
Sekrecyjne sekwencje sygnałowe genów interferonów ssaków. Z niedawnym wyodrębnieniem cDNA zawierających geny interferonów: leukocytowego, fibroblastowego i odpornościowego oraz ostatnio obserwowanym rozwojem stosowania drożdży jako układu ekspresyjnego dla genów heterologicznych stało się możliwe badanie ekspresji w drożdżach genów heterologicznych zawierających regiony kodujące sekwencje peptydu sygnałowego.
Figura 1 przedstawia sekwencje - sygnałowe . pięciu różnych interferonów. Uważa się, że tego rodzaju sekwencje amino-końcowe ułatwiają sekrecję białek interferonowych z komórek ssaków. Podczas przetwarzania sekwencja sygnałowa zostaje usunięta przez swoiste odszczepienie protezą, między pozycją -la. +1, dodając produkt znany jako dojrzała postać interferonu. Sekwencje - te wykazują ogólną charakterystykę 'dotyczącą innych sekwencji sygnałowych. Wszystkie one są hydrofobowe, mniej więcej tej samej długości co inne i mają na lewo od miejsca odszczepienia' aminokwas o niewielkiej cząsteczce. Aczkolwiek jednak i preLelF A i preLelF D i preIFN-y wszystkie one rozszczepiane są między glicyną a cysteiną, nie stanowi to ogólnego prawa dla innych sekwencji sygnałowych, jak to stwierdzono w przypadku preIFNj$.
I rzeczywiście, nie ma zgodności sekwencji sygnałowych w organizmach lub w tym samym organizmie. Nie ma też zgodności sekwencji w punkcie rozszczepienia między sekwencją sygnałową a dojrzałą ' postacią produktu białkowego. Tak więc, wysoce interesujące są wysiłki zmierzające do zrealizowania ekspresji tych preinterferonów w drożdżach w celu ustalenia, czy ' dojdzie do sekrecji przez drożdże tych białek heterologicznych i jaki może być sposób przetwarzania tych białek. Aczkolwiek drożdże są organizmami eukariotycznymi, podobnie do komórek ssaków, i chociaż okazuje się, że drożdże mają szlak sekrecyjny podobny pod wielu względami do występującego w wyższych organizmach eukariotycznych, są one bardzo prymitywhymi organizmami eukariotycznymi i prawidłowa funkcja i przetwarzanie tych produktów gendwych wymagałoby wysokiego stopnia konserwatywności procesu podczas ewolucji od drożdży do komórek ssaków, co nie jest wynikiem całkowicie oczywistym. ,
Konstrukcja plazmidu drożdżowego w celu ekspresji genów’ preinterferonów. Informacje dotyczące konstrukcji plazmidu w celu ekspresji genu heterologicznego w drożdżach została opublikowana. ,
Plazmid użyty do tej pracy przedstwia fig. 2. Plazmid ten zawiera część pBR322 z genem oporności na ampicylinę (ApR) i początkiem replikacji z E.coli w cel^ selekcji i stabilnego wzrostu w E.coli (użytym jako pośrednik między konstrukcją in vitro a transformacją drożdży). Plazmid zawiera także gen TRP1 we fragmencie EcoRI-Pstl pochodzący z III chromosomu drożdży. Gen ten pozwala na selekcję drożdży pod względem trp l i można go przez to użyć do selekcji komórek drożdży zawierających ten plazmid oraz do utrzymywania plazmidu. Poza tym, plazmid zawiera drożdżowy początek replikaji we fragmenrie o 2,0 kbp z endogenne^ drożdżowego 2μ plazmidu DNA. Początek ten zezwala DNA na automiczną replikację w drożdżach i utrzymywanie się w charakterze plazmidu. !
Innym z głównych składników jest układ promotora kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK), który zaczyna transkrypcję blisko jedynego miejsca EcoRI w plazmidzie, gdyż inne miejsce EcoRI usuwa się uprzednio przez uzupełnienie tego miejsca restrykcyjnego za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa), a następnie łączenie wolnych końców.
Wyodrębnienie genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK) przedyskutowano gdzie indziej, jak również jako konstrukcję fragmentu promotora o 1,6 kbp (poniżej). Fragment Hindlll/Bglll z regionu drożdżowego genu TRP1 z chromosomu III używa się jako konwertora Hindlll do BgUI, w celu połączenia z miejscem BamHI pBR322, nadając plazmidowi wrażliwość na tetracyklinę (Tcs). Dalej, należy zauważyć, że fragment o 2,0 kbp z 2μ DNA zapewnia inną funkcję, gdyż zawiera on sygnał zakończenia transkrypcji) poliadenylacji, który zwykle jest sygnałem zakończenia „zdolnego genu w 2μ plazmidzie. Region ten okazuje się zasadniczym dla dobrej ekspresji. Inserty genów jako fragmenty EcoRI w prawidłowej orientacji mogą ulegać ekspresji jako białka, gdy nośnik wprowadzi się do drożdży.
Konstrukcja plazmidów drożdżowych do ekspresji genów różnych interferonów. Drożdżowy ekspresyjny plazmid YEpIPT zaiwera pojedyńcze miejsce restrykcyjne EcoRI. Insercja obcego genu do tego unikalnego miejsca prowadzi do ekspresji tego genu pod kontrolą promotora drożdżowej kinazy fosfoglicerynianowej. Dogodnym sposobem włączenia genów różnych interferonów do miejsca EcoRI w tym plazmidzie drożdżowym jest posiadanie fragmentów DNA z
153 724 miejscami EcoRI skrajnymi w stosunku do kodonu inicjacji i kodonu zakończenia genów różnych interferonów. Opisaliśmy tutaj konstrukcję tych fragmentów EcoRI do ekspresji genów interferonów. Ważne jest użycie konwertorów do EcoRI na 3’-końcu genu tak, aby nie zatrzymywał on transkrypcji, ale pozwalał na transkrypcję do 2μ terminatora.
Uprzednio opisaliśmy konstrukcję miejsca EcoRI bezpośrednio poprzedzającego kodon inicjacji ATP dla genu dojrzałego IFN-al genu dojrzałego IFN-a2, genu dojrzałego IFN-J i genu dojrzałego IFN-y.
Analiza restrykcyjna DNA wskazuje na to, że miejsce EcoRI jest dogodnie umiejscowione w 3’-niekodującym regionie klonu cDNA IFN-al, tak więc trwanie plazmidu pLeIFD3 za pomocą EcoRI tworzy fragment EcoRI o 583bp, zawierający nie naruszony gen IFN-al.
Figura 3 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-al. Miejsce Haelll jest zlokalizowane między pierwszym a drugim aminokwasem pre-IFN-al. Wyodrębnia się fragment o 254 bp częściowo strawiony Haelll, który rozciąga się od wspomnianego miejsca Haelll do miejsca Bglll w środku regionu kodującego. Łączy się samokomplementarny syntetyczny oligonukleotyd 5’-CCATGAATTCATGG-3’ przez wiązanie wolnych końców z fragmentem Haelll-Bgllll o 254 bp w celu wytworzenia miejsca EcoRI poprzedzającego kodon inicjacji ATG. Następnie wyodrębnia się fragment EcoRI-Bglll o 264 bp przez trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i Bglll. Ten fragment EcoRI-Bglll zawierający przednią część genu pre-IFN-al, łączy się następnie z dalszą połową genu pre-IFN-αl, fragmentem Bglll-EcoRIbp, wyodrębnionym z klonu cDNA IFN-al po strawieniu Bglll i EcoRI. Fragment EcoRI zawierający nie naruszony gen pre-IFN-al tworzy się następnie przez trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i wyodrębnienie fragmentu o 636 bp.
Figura 4 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen dojrzałego IFN-a2. Fragment EcoRI-Pstl o 876 bp, zawierający gen dojrzałego IFN-a2, miejsce EcoRI bezpośrednio poprzedzające kodon inicjacji ATG i 3’-nie kodujący region o 400 bp otrzymany z klonu cDNA wyodrębnia się przez trawienie plazmidu pLeIFA25 za pomocą EcoRI i Pstl. Następnie przeprowadza się konwersję końca Pstl wspomnianego fragmentu o 876 bp w miejsce EcoRI za pomocą użycia fragmentu łącznikowego. Ten fragment łącznikowy o 978 bp zawiera wewnętrzne miejsce EcoRI i ma miejsce Pstl na obydwu końcach. 230 bp tego fragmentu rozciągających się od jednego końca Pstl do miejsca EcoRI pochodzi z drożdżowego plazmidu 2μ DNA. 748 bp reszty fragmentu rozciągających się od miejsca EcoRI do innego końca Pstl pochodzi z bakteryjnego plazmidu pBR322 [nie naruszony fragment został otrzymany z YEpl3]. Połączenie wspomnianego fragmentu łącznikowego z fragmentem EcoRI Pstl o 876 bp zawierającym dojrzały gen IFN-y2 z następującym po tym trawieniem EcoRI tworzy fragment o 1096 bp zawierający gen IFN-a2 z miejscami EcoRI na obydwu końcach.
Figura 5 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-a2. Analiza restrykcyjna ujawnia wspólne miejsce Ddel obecne między aminokwasem 14 a 15 w presekwencji obydwóch genów pre-IFN-al i a2. Łącznie fragmentu EcoRI-Ddel o 44bp pochodzącego z fragmentu EcoRI kodującego gen pre-IFN-al i fragmentu Ddel-Pstl o 900 bp pochodzącego z klonu cDNA IFN-a2 z następnym po tym trawieniem EcoRI i Pstl tworzy fragment o 944 bp. Ten fragment EcoRI-Pstl o 944 bp zawiera sekwencję kodującą pierwsze 14 aminokwasów w prepeptydzie pochodzącym z IFN-al, sekwencję kodującą resztę prepeptydu i nie naruszone dojrzałe białko pochodzące z IFN-a2. Koniec Pstl tego fragmentu o 044 bp poddaje się następnie konwersji do miejsca EcoRI z użyciem framgnetu łącznikowego, jak w przypadku konstrukcji fragmentu EcoRI dla dojrzałego IFN-a2.
Figura 6 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-y z sekwencją liderową o 70 bp poprzedzającą kodon inicjacji ATG. Trawienie klonu cDNA IFN-y (30) tworzy fragment Sau3A o 60 bp 5’-skrajnej sekwencji, nie naruszoną sekwencję kodującą pre-IFN-y i 3’-nie dokującą sekwencję o 290 bp. Ten fragment Sau3A klonuje się następnie do nośnika pUC7, strawionego BamHI, plazmidowej kopii jednoniciowego faga M13mp7. Plazmid pUC7 otrzymuje się z pBR322 za pomocą, po pierwsze, usunięcia fragmentu EcoRI-PvuII o 2067 bp zawierającego gen oporności na tetracyklinę, a następnie wprowadzenia fragmentu Haell o 425 bp z mP7 pochodnej faga M13 do miejsca Haell powstającego plazmidu w pozycji 2352 (odpowiadającej notacji pBR322). Fragment Haell z mp7 zawiera N-końcowy region kodujący z genu E.coli lacZ, w którym w sekwencji miejsce klonujące dla wielu enzymów restrykcyjnych zostało wprowadzone
153 724 między 4 a 5 resztą aminokwasową B-galaktozydazy. Insercja fragmentu obcego DNA do tych miejsc klonujących przerywa ciągłość między promotorem lac a genem lacZ, przez co zmienia fenotyp JM83 transformowanego plazmidem z lac* do lac. Ponieważ istnieją 2 miejsca EcoRI skrajne w stosunku do miejsc BamHI w miejscu klonującym dla wielu enzymów restrykcyjnym w pUC7, trawienie . plazmidu zawierającego insert Sau3A o 842 bp za pomocą EcoRI dawałoby fragment o 862 bp zawierający nie naruszoną sekwencję pre-IFN-y między miejscami EcoRI.
Trawienie, plazmidu pIFN-ytrp48.za pomocą EcoRI i BgUI tworzy fragment o 689 bp z końcem - EcoRI poprzedzającym kodon inicjacji ATG, nie naruszoną sekwencję kodującą dojrzały IFN-y i 210 bp niekodującej sekwencji. Ten . koniec Bgll poddaje się następnie konwersji do końca EcoRI z łączeniem z fragmentem łącznikowym Bglll-EcoRI o 29 bp pochodzącym z fragmentu EcoRI odnoszącego się do pre-IFN-y uprzednio opisanego. Następujące później trawienie EcoRI tworzyłoby fragment - EcoRI o 718 bp zawierający dojrzały gen IFN-y.
Figura 7 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-σ z końcem EcoRI i sekwencją AAA poprzedzającą kodon inicjacji ATG. Fragment EcoRI zawierający uprzednio opisany gen pre-IFN-y trawi się EcoRI i MboII w celu .wytworzenia fragmentu o 184 bp. Fragment ten, zawierający przednią część genu pre-IFN-y denaturuje się cieplnie i łączy z poddanym działaniu 5’-kinazy syntetycznym . oligonukleotydem 5’-pATGAAATATACA kodującym pierwsze cztery aminokwasy genu pre-IFN-y. Z dolną nicią fragmentu EcoRI-MboII jako matrycą i z oligonukleotydem jako primerem i za pomocą polimerazy - DNA E.coli (fragment Klenowa) syntetyzuje się górną nić i usuwa wystający koniec 3’ z dolnej nici. Powstały fragment o 178 bp z wolnymi końcami, rozciągający się od kodonu inicjacji ATG „w dół“ do pierwszego miejsca MboII łączy się następnie z samokomplementarnym łącznikiem EcoRI 5’-TTTGAATTCAAA-3’. Trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i Ddel tworzy fragment EcoRI-Ddel o 165 bp, zawierający przednią część genu prelFN-y. Następnie zapewnia się utworzenie nie naruszonego genu przez przyłączenie fragmentu Ddel-EcoRI o 600 bp, zawierającego dalszą część genu IFN-y z 3’-niekodującym regionem. Mieszaninę z łączenia trawi się następnie EcoRI w celu wytworzenia fragmentu EcoRI o 765 bp zawierającego nie naruszony gen prelFN-y.
Podsumowanie tych wszystkich konstrukcji (Ι-ΙΧ) przedstawiono na fig. 8. Wszystkie te konstrukcje umieszcza się w nośniku YEpIPT (fig. 2) przeznaczonym do eksperymentów dotyczących ekspresji i sekrecji w drożdżach. Poziom ekspresji i sekrecji interferonów przez drożdże zawierające wspomniane plazmidy.
Po włączeniu do YEpIPT (fig. 2) fragmentów genowych EcoRI z Eg. 8 sprawdza się orientację i włącza do drożdży z użyciem komplementacji Trp*. Drożdże zawierające te plazmidy bada się pod względem interferonu używając do badania ekstraktów z uwolnionego materiału ściany komórkowej i podłóż testu zahamowania efektu cytopatycznego (CPE) jako biotestu. Badania intereferonu przeprowadza się dla umiejscowienia w trzech różnych przedziałach w hodowli drożdży. Wyniki tych badań przedstawia tabela.
Tabela
Poziom ekspresji interferonu | ||||||||
Konstnik- | Uwolnienie | |||||||
cja | Wewnątrz | Procent | po usunięciu | Procent | Zewnątrz | Procent | Końcówka | Procent |
genu Fragment EcoRI Drożdże | komórki | białka | ściany | białka | komórki | białka | wartość | aktywnej |
nr zawarte w plazmidzie | jedn/titr/ | komórko- komórkowej | komórko- | /podłoża/ | komórko- | Amod | sekrecji | |
YEpITP | Amo=1 | wego | jedn/litr/ | wego | jedn/litr/ | wego | ||
Aeeo | Amo | |||||||
1 2 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | !θ | 11 |
I | LelFD | GM3C-2 | 130X10* | to | 0 | 0 | 0 | 0 | io | 0 |
II | pre LelF D | GM3C-2 | 27X10* | 03 | 0,4X10* | 0,004 | 0,8X10* | 0,008 | 1.4 | 4 |
III | LelF A | pep4-3 | l30Xltf* | to | 0 | 0 | 0 | 0 | io | 0 |
IV | /pre D/A/ LelF A | pep4-3 | 19X10* | 03 | 03xl<* | 0,005 | 0,5X10* | 0,005 | 1.0 | 6 |
IV | /pre D/A/LelF A | pep4-3 | 25X10* | 03 | N.D. | — | 2X10* | 0,007 | 3-4 | 8 |
IV | /pre D/A/ LelF A | GM3C-2 | 28X10* | 03 | 03*10* | 0,003 | 0,5X10* | 0,005 | 13 | 3 |
V | IFN-y | pep4-3 | 0,6X10* | N.D. | N.D. | — | 0 | 0 | 1.0 | 0 |
VI | pre IFN-y + 5* -skrajna sekwencja cDNA | pep4-3 | 0,2X10* | N.D. | N.D. | 0,03X10* | N.D. | 13 | 15 |
153 724
ι | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
VI | prc IFN-y + 5' -skrajna sekwencja cDNA | GM3C-2 | 0,38X10® | N.D. | N.D. | 0,06X10® | N.D. | 0,93 | . 16 | |
VII | prc IFN-y | pep4-3 | 0,9X10® | N.D. | N.D. | — | 0,19X10® | N.D. | 1,0 | 17 |
VII | pre IFN-y | GM3C-2 | 1,9X11® | N.D. | N.D. | — | 0,19 X 10® | N.D. | 0,93 | to |
W powyższej tabeli użyto następujących oznaczeń:
a) Patrz metody preparatyki ekstraktu. Należy zauważyć, że używa się, w odniesieniu do ekstraktów, dwu metod. Jeżeli komórki przekształcają się w sferoplasty, ilość „wewnątrz komórki odnosi się do materiału rzeczywiście wewnętrznego. Gdy podaje się N.D. (nie oznaczono), ilość „wewnątrz komórki oraz „uwolnienie po usunięciu ściany komórkowej, obydwie stanowią część ilości „wewnątrz komórki - ten typ ekstraktu otrzymuje się z komórek rozbijanych kulkami szklanymi bez usunięcia ściany komórkowej. Należy zauważyć, że ekstrakt rozbijany kulkami szklanymi bez wytwarzania sferoplastów otrzymuje się zawsze dla IFN-y i preIFN-y i że używa się buforu PBS zamiast 7M GHC1.
b) Wyszczególnione aktywności właściwc LdFA obydwie uważa się (do obliczeń) za l<°jedn/mg Hałka. Hodowla drożdży zawfcra o^o 1° mg Haka w hodowli przy AmoI ·
c) Patrz metody wytwarzania sferoplastów.
d) Wartość A hodowli, którą badano.
e) Procent sekwencji jest to procent „uwolnienia po usunięciu ściany komórkowej plus procent „zewnątrz komórki. Kiedy nie wytwarza się sferoplastów, nie włącza się aktywności sekrecji dotyczącej ściany komórkowej i procent jest niższy (może być 1/2) aniżeli powinien wynosić w rzeczywistości.
Pierwszym przedziałem jet wnętrze komórki. - Pomiar tej frakcji przeprowadza się przez wytworzenie ekstraktu komórkowego po usunięciu -ściany komórkowej i oznaczenie aktywności interferonu nie ulegającego sekrecji. Innymi dwomaprzedziałami są podłoża (materiał całkowicie oddzielny w stosunku do komórek drożdży) i aktywność uwolniona przez komórkę po usunięciu ściany komórkowej zymolazą (materiał wydzielony, ale wychwycony niekowalencyjnie przez ścianę komórkową). Obie frakcje, podłoża i frakcja1 wydzielona o usunięciu ściany komórkowej, reprezentują całość materiału ulegającego sekrecji! Alternatywnie, gdy ściana komórkowa nie zostanie usunięta (patrz: metody), aktywność wewnątrz komórek obejmuje także aktywność ulegającą sekrecji, wychwyconą przez ścianę komorkową.
Należy zauważyć w tateh, że gen /preD/A/ŁHF A jest genem dojrzałego LelF A z hybrydową peptydową sekwencją sygnałową (patrz fig. 1 r 8). Konstrukcja ta została uprzednio przedyskutowana, ale przegląd dotyczył skonstruowanej $ użyciem miejsca restrykcyjnego Ddel wspólnego dla obydwu: preLelF D i preLelF A. Figura Jprzzdstawia miejsce Ddel przy aminokwasie -10. Podkreślone aminokwasy reprezentują różnicć między sekwencją aminokwasów preLelF D i preLelF A. Hybyda /preD/A/LeIF A jest bardziejjpodobna do preD niż do preA.
Obydwa geny, tak dojrzałego LelF A jak i LelF D (konstrukcja I i III) ulegają ekspresji w drożdżach na poziomie 1,0% całkowitego białka komórkowego (poziom 2,0 także bywa spotykany). Geny te lub pregeny w złej orientacji nici ulegają ekspresji. Sekrecja nie zachodzi w odniesieniu do tych dwóch genów, jak i genu dojrzałego IFN-cr.
Tym niemniej, gdy używa się tych genów z _ presekwencją, wszystkie produkty białkowe znajdowane są w podłożach jako produkty ulegające sekrecji. Poziom odpowiadający /preD/A/ LelF nawet tak wysoki jak 8% całkowitej aktywności obserwuje się w podłożach przy Aeeo 3-4. Należy zauważyć, że wszystkie te plazmidy są w 95% komórek hodowlą rosnącą pod selektywnym naciskiem Trp+, co potwierdza obecność autonomicznie replikującego się plazmidu. Krzywa wzrostu i wytwarzania w podłożach dla drożdży zawierających gen /preD/A/LeIF A.
Dwa szczepy drożdży bada się w celu dalszej charakteryzacji. Są to: YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 oraz YEplPT-LeIFAl/pep4-3. Pierwszy z nich zawiera 2 kopie o konstrukcji IV (fig. 8) w miejscu EcoRI YEplPT, o w wyniku daje aktywność wewnątrz komórki, w ścianie komórkowej i zewnątrz komórki (podłoża). Tego plazmidu, zawierającego dwie kopie genowe (w tandemie -obydwie w orientacji zapewniającej prawidłową ekspresję) używa się zamiast plazmidu zawierającego konstrukcję z kopią pojedyńczą, ponieważ niekiedy daje on wyższy poziom aktywności interferonu w podłożach. Używa się drożdży pep4-3, pónieważ w tym przypadku znacznie zmniejszony jest poziom proteaz wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, co może być korzystne dla otrzymywania z podłoży białka (interferonu) nie zdegradowanego.
Drugi szczep zawiera konstrukcję III (fig. 8) w YEplPT i wykazuje ekspresję dojrzałego LelF
A wewnątrz komórki, bez sekrecji.
Figura 9 przedstawia krzywą wzrostu tych dwóch szczepów drożdży w YNB + CAA (wzrost selektywny Trp+). Faza logarytmiczna dochodzi do Aeet>nm3-4, a następnie zaczyna się faza stacjo i
153 724 narna. Obydwie krzywe są zasadniczo takie same (co sugeruje, że wytwarzanie tych dwóch różnych białek: LelF A i /preD/A/LeIF A nie wpływa na wzrost drożdży lub ich żywotność). Biotesty przeprowadza się z podłożem w różnych okresach w czasie wzrostu komórek, w celu zbadania zależności wytwarzania interferonu od krzywej wzrostu w podłożach dla tych dwóch szczepów. Na podstawie tych wyników staje się widoczne, że presekwencja LelF A, powoduje wydzielenie interferonu do podłoży. Bez tej sekwencji aktywność w zasadzie nie uwalnia się. Jest także widoczne, że aktywność w podłożach osiąga maksimum blisko fazy stacjonarnej.
Oczyszczanie /preD/A/LeIF A z podłoży. W celu zbadania natury procesu sekrecji Zj^ireD/A/LeIF A do podłoży, w których rosną drożdże, niezbędne , jest oczyszczenie produktu białkowego z podłoży. Jeżeli drożdże są zdolne do sekrecji białka, prawdopodobnie przetwarzają w pewien sposób koniec aminowy podczas procesów sekrecji, jak to normalnie czynią komórki ssaków z białkiem preinterferonowym. Przedmiotem dalszych eksperymentów jest określenie natury tego przetwarzania, jak następuje.
A) Fermentacja w objętości 5 litrów. Fig. 10A przedstawia aktywność interferonu w ścianie komórkowej i w komórce w czasie tej samej fermentacji. Ekstrakty przygotowuje się przez osadzenie, z następującym po tym podziałaniu kulkami szklanymi, w 7M GHC1, tak, że ma się tu do czynienia zarówno z , aktywnością wewnątrzkomórkowego materiału jak i wśródściennego. Aktywność' ta osiąga maksimum około 25 X l jedn/litr przy Aeeonm 1,5-2,0, co sugeruje, że wewnątrzkomórkowego wytwarzanie interferonu kończy się w fazie logarytmicznej przed fazą stacjonarną, inaczej niż to zachodzi w przypadku materiału zewnątrzkomórkowego. I tak około 8% aktywności pojawia się w podłożu w wyniku sekrecji w stanie wolnym. Tym niemniej, taka sama aktywność może być w ścianie komórkowej (patrz tabela). Materiał ekstrahowany zawiera głównie interferon wewnątrzkomórkowy i materiał ten podddaje się oczyszczaniu, aby stwierdzić, czy jest on przetworzony, czy nie przetworzony.
Figura 10B przedstwia krzywą wzrostu w fermentacji w objętości 5 litrów YEplPT-preLełFA 53t/pep4-3 w YNB + CAA. Przy końcu fermentacji aktywność interferonu stwierdzona za pomocą badania MDBK wynosi około 2,0 X 10® jedn/litr. Poza tym, maksimum wytwarzania widoczne jest w fazie stacjonarnej. Należy zauważyć, że produkt interferonowy w tych podłożach jet bardzo stabilny, nawet w cigu 24 godzin dodatkowego wstrząsania w temperaturze 30°C po osiągnięciu fazy stacjonarnej. Podłoży tych używa się w dalszych stadiach oczyszczania.
B) Koncentraty podłoży na kolumnie immunopowinowactwa. Podłoża YEplPT-preLeIFA53t/4-3 poddaje się najpierw ultrafiltracji. Koncentrat ten wprowadza się na kolumnę zawierającą monoklonalne przeciwciało przeciw dojrzałemu LelF A. Po przemyciu0,2 M NaCl w Tris/cys/EDTA o pH 8,0 eluuje się interferon H2O o pH 5,5, jak to przedstawiono na fig. 11. Wyeluowany szczyt A (strzałka wskazuje, kiedy zastosowano H2O), uzyskany tą metodą reprezentuje 50% aktywności naniesionej na kolumnę. Frakcje piku A łączy się, jak to uwidoczniono na fig. 11, do dalszego oczyszczania. Elucja 0,2 M kwasem octowym daje pik B (strzałka wskazuje punkt zmiany buforu), a pozycja C reprezentuje punkt, w którym zastosowano oryginalny bufor do przemywania.
C) Stadium HPLC oczyszczania piku aktywności A. Frakcje piku A liofolizuje się do sucha i oczyszcza HPLC (patrz: metody). Fig. 12 przedstawia wyniki tego stadium, 2,5 //g próbkę oczyszczonego LelF A (z E.coli) stosuje się oddzielnie jako kontrolę.
Zarówno standard, jak /preD/A/LeIF A (albo preLełF A) wykazują ten sam czas retencji, co uwidoczniono na fig. Wyniki te wskazują na to, że interferon z podłoży jest interferonem przetworzonym, ponieważ preLełF A wykazuje znacznie różniący się czas retencji. Zacieniowa nej frakcji ze stadium HPLC używa się następnie do analizy sekwencji.
NH2-końcowa sekwencja /preD/A/LeIF A oczyszczonego z podłoży drożdży. Fig. 13 w części wskazuje wyniki analizy sekwencji oczyszczonego interferonu. Grna sekwencja jest sekwencją oczekiwaną dla /preD/A/LeIF A jeżeli nie zachodzi przetwarzanie. Wskazano normalny punkt rozszczepienia tego interferonu, który jest prawdopodobnie rozpoznawany przez komórki ssaków.
Sekwencję białka interpretuje się, przez stwierdzenie, który PTH-aminokwas wzrasta w każdym odpowiadającym cyklu Edmana i po tym maleje w następnym cyklu. PTH-aminokwasy, które normalnie wykazują niskie odzyskanie (Cys, Ser, Thr, Arg, His) pojawiają się gdy nie jest widoczny
153 724 inny PTH-aminokwas. Ilość mg określa się przez porównanie pola interpretowanej reszty z polem standardowej mieszaniny PTH-aminokwasów w tym samym stadium HPLC. W każdym chromatogramie wprowadza się jako wewnętrzny standard norleucynę, w celu upewnienia się, że czasy retencji są odtwarzane.
Figura 13 przedstawia wyniki analizy sekwencji białka otrzymane dla oczyszczonego /pre D/A/LeIF A. Sekwencja ta jest oczekiwana, jeżeli nie zachodziło by przetwarzanie. Wskazane normalny punkt rozszczepienia tego preinterferonu w komórkach ssaków. Przeprowadza się dwa niezależne stadia analizy sekwencji dla dwu różnych oczyszczonych próbek z komórek i podłoży. Fig. 13 wskazuje na to, że większość interferonu w podłożu została prawidłowo przetworzona (64%), lecz inna postać (36%) zawierająca 3 dodatkowe aminokwasy presekwencji jest także obecna. Wewnątrzkomórkowy interferon wykazuje także te dwie postacie, lecz w nieco różnej proporcji, jak również i trzecią postać zawierającą 8 aminokwasów presekwencji. Presekwencji o pełnej długości nigdy nie obserwuje się, co sugeruje, że drożdże w pewien sposób przetwarzają wszystkie prolFN.
Możliwe, że przetworzona postać zawierająca 3 aminokwasy presekwencji wynika z hybrydowej natury sekwencji sygnałowej preD/A. Bada się więc przetwarzanie niehybrydowego /preD/ LeiF D. PreD różni się od preD/A tylko aminokwasem w pozycji -2 (Leu zamiast Val). Gdy bada się przetwarzanie preIFN-α i oczyszczonego z podłoża, obydwie ostacie + 1i -3 są w dalszym ciągu obserwowane (fig. 13). Tym niemniej, w podłożu obecna jest w mniejszej ilości inna postać, -14, której nie obserwuje się w przypadku /preD/A/ LeiF A.
W celu zbadania wydzielania heterologicznych białek z S. cerevisiae, konstruuje się plazmidy do transkrypcji in vivo genów kilku dojrzałych interferonów (IFN) i kilku prelFN. Niezależnie od obecności sekwencji kodującej hydrofobowy peptyd sygnałowy można odzyskać aktywność przeciwwirusową IFN zarówno z komórek-gospodarzy, jak i z podłoża hodowli, podczas gdy wszystkie IFN, których syntezą kierują geny dojrzałego IFN pozostają wewnątrz komórek. Przystąpiliśmy do scharakteryzowania wymagań dla sekwencji przez podjęcie konstrukcji, w których gen interferonowy powinien być zaopatrzony w swoją własną, naturalną sekwencję sygnałową, jak /preD/ LeiF D, albo powinien być zaopatrzony w hybrydową sekwencję sygnałową wyznaczoną jako kompozycja 2 rodzajów IFN-α, jak w przypadku /preD/A/LeIF A. Ogólnie, jeżeli komórki drożdży z tymi konstrukcjami wydzielają IFN do podłoża hodowli, poziom aktywności będzie się różnić dla tych szczepów, a rodzaje oczyszczonego i poddanego analizie sekwencji IFN będą się także różnić.
Trzy postacie nie ulegającego sekrecji interferonu, stanowiące 90% całkowitego interferonu ulegającego ekspresji, oczyszcza się z komórek zawierających gen /preD/A/LeIF A. Jedna postać (33%) jest prawidłowo przetworzona (+ 1, fig. 13), druga (55%) zawiera 3 dodatkowe aminokwasy (-3, fig. 13), a trzecia (11%) zawiera 8 dodatkowych aminokwasów (-8). Tej ostatniej postaci nie obserwuje się w podłożu, podczas IFN z presekwencją pełnej długości nigdy nie obserwuje się w komórkach lub podłożu.
Przetwarzanie /preD/LelF D. Zamiast hodowli w kolbie wstrząsanej używanej dla /preD/A/ LeiF A w drożdżach, drożdże wykazujące ekspresję /preD/LelF D hoduje się w 10-litrowym fermentorze do A550 60.
Kiedy bada się przetwarzanie /preD/LelF D oczyszczonego tak samo, jak /preD/A/LeIF A/ z podłoża, obserwuje się zarówno postać + 1 jak i -3 (fig. 13). Obserwuje się też dodatkowo w podłożu mniejszą ilość postaci -14. Nie ma danych, że w hodowli zachodzi liza komórek, co obserwuje się w elektroforezie w żelu z SDS białka podłoża wobec białek komórkowych. Interesujące jest to, że przy tym wzroście do dużej gęstości, obserwuje się dla LeiF D wysokoprocentową sekrecję (30%). Fermentacja drożdży, wykazujących ekspresję /preD/A/LeIF A, do wysokiej gęstości także wykazuje ten wysoki procent sekrecji.
Okazuje się, że drożdże przetwarzają interferon tak ulegający, jak i nie ulegający sekrecji.
Poziom aktywności ulegający sekrecji różni się w zależności od fazy wzrostu komórek, a w maksymalnym procencie następuje to w fazie stacjonarnej w kolbach wstrząsanych i przy końcu fermentacji do wysokiej gęstości (30% w podłożach). Potwierdzenie składu plazmidów w drożdżach zawierających YEplPT-preLeIFA53t i YEplPT-LelFAl.
153 724
Drożdże zawierające te dwa plazmidy, używane w uprzednich eskperymentach, sprawdza się później za pomocą odzyskiwania plazmidu z drożdży. Przeprowadza się to wyodrębniając plazmidowy DNA z ekstraktów drożdżowych przez transformację E.coli, a następnie preparatykę DNA z użyciem minisit oraz analizę restrykcyjną plazmidowych DNA. Kilka wyodrębnionych za pomocą E.coli plazmidowych DNA chrakteryzuje się dla obydwóch typów drożdży. We wszystkich przypadkach plazmidów, oczekuje się, że sekwencja restrykcyjna potwierdzi obecność presekwencji w plazmidzie zawierającym gen pre/D/A/LeIF A i brak jej w plazmidzie zawierającym gen dojrzałego LelF A.
Mapa restrykcyjna i częściowa analiza sekwencji insertu pBl o 3,1 kbp. 300pg pBl trawi ' się wyczerpująco Hindlll w 500μΐ objętości mieszaniny reakcyjnej, a następnie poddaje elektroforezie w preparatywnym, 1% żelu agarozowym (Sea Kem). Insert Hindlll o 3,1 kbp wycina się z żelu zabarwionego etidium, poddaje elektroelucji, 2 razy ekstrahuje równymi ilościami fenolu nasyconego buforem i chloroformu przed wytrąceniem etanolem. Dzieli się porcje rozpuszczonego ponownie fragmentu DNA i poddaje nacięciom restrykcyjnym przy użyciu grupy rozmaitych enzymów restrykcyjnych z uzyskaniem częściowej mapy restrykcyjnej przedstawionej na fig. A.
30^tg oczyszczonego insertu o 3,1 kbp nacina się za pomocą Sau3 A i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragmenty odpowiadające 265 bp i 141 bp oczyszcza się oddzielnie z użyciem elektroelucji, jak wyżej opisano. Każdy fragment DNA poddaje się następnie analizie sekwencji DNA. Część tej sekwencji DNA przedstawia fig. B. Aminokwasy odpowiadające Nkońcowym aminokwasom strukturalnego genu PGK wydrukowane są powyżej sekwencji DNA.
Insercja miejsca restrykcyjnego do regionu 5' promotora PGK. Syntetyzuje się zwykłymi metodami syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji 5’ ATTTGTTGTAA 3’/40/. 100 ng tego primera znakuje się na końcu 5’ za pomocą 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 μΐ zawierającej 200pCi [/“-PjATP. Tego roztworu znakowanego primera używa się w reakcji reparacyjnej związanej z primerem oznaczonej jako pierwszy stopień w wielostopniowym procesie wprowadzania miejsca restrykcyjnego EcoRI, do 5-skrajnego DNA PGK, bezpośrednio poprzedzającego sekwencję strukturalnego genu PGK. Wielostopniowy proces jest objaśniony poniżej.
Stopień 1 (fig. C). Reakcja reparacyjna związana z primerem i klonowanie fragmentu PGK XbaI-Sau3A o 39 bp.
1(0)/rg pBl trawi się całkowicie HaelU, po czym poddaje elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Najwyższe pasmo w żelu zabarwionym etidium (zawierające region promotora PGK) wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, jak wyżej opisano. Ten fragment DNA HaelU poddaje się restrykcji za pomocą Hindlll i elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Pasmo o 650 bp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. Wyodrębnia się 5//g DNA. Ten fragment DNA Haelll-Hindll o 650 bp rozpuszcza się ponownie w 20μΐ dl HSO, a następnie miesza z 20μ1 roztworu fosforylowanego primera opisanego powyżej. Mieszaninę ekstrahuje się 1 raz układem fenol-chloroform i wytrąca etanolem. Wysuszony DNA zawiesza się ponownie w 50μτ1 H2O i następnie ogrzewa na wrzącej łaźni wodnej w ciągu 7 minut. Roztwór ten szybko oziębia się w łaźni suchy lód-etanol (10-20 sekund) i przenosi do łaźni lód-woda. Do roztworu tego dodaje się 50μ1 roztworu zawierającego 10μ1 10x buforu polimerazy DNA I (Boehringer Mannheim), 10μ1 uprzednio przygotowanego roztworu zawierającego w stężeniu 2,5 mM każdy z trifosforanów dezoksynukleozydów (dATP, dTTP, dGTP i dCTP), 25 μΐ dlHaO i 5 jednostek polimerazy DN A~ (fragment Klenowa). Tę mieszaninę reakcyjną o objętości 100μΐ inkubuje się w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C. Następnie ekstrahuje sięją 1 raz układem fenol-chloroform, wytrąca etanolem, suszy za pomocą liofilizacji i poddaje wyczerpującej restrykcji za pomocą 10 jednostek Sau3A. Roztwór ten poddaje się elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Wycina się z żelu pasmo odpowiadające 39 bp i wyodrębnia je za pomocą elektroelucji jak wyżej opisano. Materiał tego pasma ma jeden koniec wolny i jeden koniec lepki Sau3A. Fragment ten klonuje się do zmodyfikowanego nośnika pFIFtrp69.1(^g pFIFtrp69 przeprowadza się w postać liniową za pomocą Xbal, ekstsrahuje się 1 raz układem fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Lepki koniec Xbal uzupełnia się za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa) w mieszaninie reakcyjnej o objętości 50μΐ zawierającej 25 μΜ każdego z trifosforanów dezoksynukleozydów. DNA ten nacina się za pomocą BamHI i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragment nośnika wyodrębnia się z
153 724 żelu z pomocą elektroelucji i ponownie zawiesza w 20μ1 dl H20.20 ng tego nośnika łączy się z 20 ng fragmentu o 39 bp zsyntetyzowanego powyżej w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. 1/5 część mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę (na płytkach z LB + 20pg/ml ampicyliny). Plazmidy z tych transformantów bada się za pomocą szybkiej metody z użyciem sit. Jeden plazmid, pPGK-39 (fig. C) selekcjonuje się w celu analizy sekwencji. 20pg tego plazmidu trawi się Xbal, wytrąca etanolem i poddaje działaniu 1000 jednostek bakteryjnej fosfatazy alkalicznej w ciągu 45 minut w temperaturze 68°C. Następnie DNA ekstrahuje się 3 razy układem fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Następnie defosforylowane końce znakuje się w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20μ1 zawierającej 200pCi [y32-P] ATP i 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Plazmid nacina się Sali i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym.
Następnie pasmo ze znakowanym insertem wyodrębnia się z żelu i oddaje analizie sekwencji metodą degradacji chemicznej. Sekwencja DNA na końcu 3’jest taką, jakiej oczekiwano w tym fragmencie promotora.
Stopień 2 (fig. D). Konstrukcja fragmentu promotora PGK Pvul-EcoRI o 312 bp. 25//g pPGK-39 (fig. C) trawi się jednocześnie Sal I i Xbal (5 jednostek każdej) i poddaje elektroforezie w 6% żelu. Pasmo o 390 bp zawierające fragment promotora o 39 bp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. Ponownie zawieszony DNA poddaje się restrykcji za pomocą Sau3A, a następnie elektroforezie w 8% żelu akryloamidowym. Pasmo zawierające fragment promotora PGK o 39 bp wyodrębnia się za , pomocą elektroelucji. Ten DNA zawiera 39 bp na końcu 5’ promotora PGK we fragmencie Sau3A-XbaI.
pg pB 1 poddaje się restrykcji za pomocą Pvul i Kpul, a następnie elektroforezie w 6% żelu. Pasmo DNA o 0,8 kbp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, poddaje restrykcji Sau3A i elektroforezie w 6% żelu. Pasmo o 265 bp z promotora PGK (fig. A) wyodrębnia się za pomocą elektroelucji.
Ten DNA łączy się następnie z fragmentem promotora o 39 bp, wyżej otrzymanym, w ciągu 2 godzin w w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną poddaje się restrykcji 'za pomocą Xbal i Pvul i elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragment restrykcyjny XbalPvul wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, dodaje do mieszaniny do łączenia zawierającej 200 ng pBR322 (33) (uprzednio wyodrębnionego, bez fragmentu restrykcyjnego Pvul-Pstl o 162 bp) i 200 ng cDNA genu LelF A Xbal-Pstl wyodrębnionego z 20/yg pLelFtrpA. Tej trójczynnikowej mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę. Kolonie transformantów bada się z zastosowaniem minisit i jedną z tych kolonii, pPGK-300 wyodrębnia jako posiadającą 5’-skrajny DNA PGK o 304 bp przyłączony do genu LelF A w nośniku na bazie pBR322. Koniec 5’ genu LelF A ma następującą sekwencję: 5’-CTAGAAATTC 3’, tak więc połączenie miejsca Xbal z fragmentu promotora PGK z tą sekwencją pozwala na dodanie do miejsca Xbal miejsca EcoRI. Tak więc pPGK-300 zawiera część promotora PGK wyodrębnionego we fragmencie Pvul-EcoRI.
Stopień 4. Konstrukcja fragmentu promotora PGK EcoRI-EcoRI o 1500 bp. 10pgpBl trawi się Pvul i EcoRI i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Pasmo DNA z 5-skrajnego DNA PGK PvuI-EcoRI o 1,3 kbp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. 10μ pPGK-300 trawi się za pomocą EcoRI i Pvul i fragment promotora o 312 bp wyodrębnia za pomocą elektroelucji po elektroforezie mieszaniny pochodzącej z trawienia w 6% żelu. 5pg pFRL4 nacina się EcoRI, wytrąca etanolem i poddaje działaniu baktryjnej fosfatazy alkalicznej w ciągu 45 minut w 68”. Po trzykrotnym potraktowaniu DNA układem fenol/chloroform, wytrąceniu etanolem i ponownym zawieszeniu w 20 ml dl H20,200 ng nośnika łączy się ze 100 ng pPGK EcoRI-PvuI o 312 bp i 100 ng DNA z pB 1 EcoRI-PvuI. Mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę. Z jednej z kolonii ApR otrzymuje się pPGR1500. Plazmid ten zawiera fragment promotora PGK o 1500 bp jako fragment DNA EcoRI-EcoRI lub HindllI-EcoRI.
Przykład II. Wytwarzanie HGH. Konstrukcja plazmidu wykazującego ekspresję dojrzałego HGH (ludzki hormon wzrostu) i preHGH.
Konstrukcję A-E na fig. 14 przeprowadza się na nośnikach z dogodnymi miejscami. W konstrukcji A powoduje się zdublowanie syntetycznym DNA sekwencji DNA na początku cDNA
153 724 preHGH od miejsca Hpall z utworzeniem miejsca EcoRI przed sygnałem startu translacji ATG. W tym przykładzie stosuje się więc peptyd sygnałowy preHGH sygnałowej sekwencji przedstawionej na fig. 13 na rysunku. Fragment Hpall-Pstl otrzymuje się z CDNA preHGH i ten fragment z syntetycznym DNA łączy się z fragmentem nonika. EcoRI do Pstl [pHGH 207-1 z usuniętym fragmentem EcoRI-Pstl zawierającym część genu ApR i obydwoma miejscami połączonymi ponownie po uzupełnieniu (Klenow) w celu usunięcia obu miejsc] zawierającym cDNA HGH od miejsca Pstl do Smal w celu wytworzenia konstrukcji A. Konstukcję B wytwarza się z plazmidu zawierającego gen dojrzałego HGH, który został uprzednio włączony w celu bezpośredniej ekspresji i zawiera syntetyczną sekwencję kodującą 23 aminokwasy końca -NH2. Plazmid zawierający ten gen nacina się PvuII w genie HGH i BamHI w genie TcR. Duży fragment zawierający większość genu łączy się następnie z syntetycznym DNA, który duplikuje koniec genu HGH (TAG) i tworzy miejsce Hindlll. To miejsce Hindlll łączy się z fragmentem Hindlll/BamHI z pBR322 jako trzecim czynnikiem z trzyczynnikowego łączenia w celu wytworzenia plazmidu zawierającego konstrukcję B.
A i B łączy się następnie jak pokazano na fig. 14 z wytworzenie konstrukcji C. C dalej modyfikuje się z wytworzeniem D, w której miejsce Hindlll uległo przekształceniu do miejsca EcoRI (lub EcoRI). Tak otrzymany fragment EcoRI lokuje się w miejscu EcoRI w drożdżowym plazmidzie ekspresyjnym YEpIPT do ekspresji genu HGH w drożdżach. Konstrukcję E także przygotowuje się z zastosowaniem konwertora użytego w D do wytworzenia genu dojrzałego interferonu (bez sekwencji sygnału sekrecji) we fragmencie EcoRI do ekspresji w YEpIPT.
Ekspresja dojrzałego HGH i preHGH w drożdżach. Konstrukcję mHGH (E) w YEpIPT wprowadza się do szczepu pep4-3trpl (20B-12) i przygotowuje ekstrakty z użyciem kulek szklanych, jak opisano w metodach. Tak więc, kulki szklane dodaje się do 10 ml osadzonych komórek z 0,5 ml 0,1% SDS. Rozcieńczeń dokonuje się z użyciem osocza końskiego i przeprowadza RIA jak uprzednio opisano.
Na podstawie RIA można stwierdzić, że HGH ulega ekspresji w około 0,5% całkowitego białka drożdży przy Αββο 1,0 (0,5 mg) litr/Aeeo). Nie wykrywa się HGH w podłożu.
Konstrukcję preHGH (D) w YEpIPT wprowadza się także do drożdży i bada komórki i podłoże pod względem HGH. Ekspresję wykrywa się w komórkach na niskim poziomie (0,08 mg/li^i7^6f^o), albo około 0,08% całkowitego białka drożdży. Tak więc poziom osiąga 1/6 poziomu ekspresji dojrzałego HGH, co jest bardzo podobne do wyników dla interferonu leukocytowego. Jednakże, nie można prawidłowo porównywać tych danych, ponieważ użycie kodonów dojrzałego HGH różni się pod względem 23 aminokwasów przy tych samych aminokwasach dla preHGH. Ta różnica może rzutować na różnice w poziomie ekspresji tych dwóch produktów. 10% lub 8 //g/litr/A66o = 1 poziom ekspresji w komórkach znaleziono w podłożu drożdży wykazujących ekspresję preHGH. W 10-litrowym fermentorze przy Asso85 także występuje około 10% sekrecji z 1 mg/litr HGH w podłożach.
Natura ekspresji preHGH. Porównanie ekspresji białka HGH w komórce z występującą zewnątrz komórki przeprowadza się za pomocą hybrydyzacji metodą Westerna jak wyżej opisano. Wyniki daje podłoże z fermentacji do dużej gęstości (A55085) drożdży wykazujących ekspresję preHGH. Obecne jest pojedyńcze pasmo odpowiadające wielkości cząsteczki dojrzałego HGH. Pasmo to odpowiada 1-2% drożdżowych białek podłoża.
W przypadku oczyszczania tego HGH z podłoża za pomocą chromatografii powinowactwa do przeciwciała (Hybritech Ab) używa się HPLC jak w przypadku interferonów. Analiza sekwencji końca NH2 wykazuje, że blisko 100% HGH stanowi dojrzały HGH analizę sekwencji przeprowadza się dla 10 aminokwasów, jak to przedstawiono, częściowo, na fig. 13. Tak więc, cały HGH podłoża jest przetworzony dokładnie tak, jak to czynią komórki ludzkie.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania białka heterologicznego, takiego jak ludzki interferon leukocytowy A lub D lub ludzki hormon wzrostu, których N-końcowe sekwencje aminokwasowe w postaci dojrzałej są przedstawione na rysunku fig. 13, znamienny tym, że do wektora ekspresji typu YEpIPT153 724 dokonuje się funkcjonalnej insercji DNA kodującego wytwarzane białko heterologiczne, jak również heterologiczny polipeptyd sygnałowy, taki jak preA, preD, preD/A, prey, pre/J lub preHGH, których sekwencje aminokwasowe są przedstawione na rysunkach fig. 1 i fig. 13 otrzymanym wektorem transformuje się hodowlę komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, nadając im zdolność uwalniania do pożywki, bez niszczenia komórek, ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D albo ludzkiego hormonu wzrostu i odzyskuje się wytwarzane białko w jego natywnej postaci, a usuwa się niepożądane polipeptydy i inne produkty sekrecji.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się insercję DNA kodującą heterologiczny polipeptyd sygnałowy w postaci hybrydy natywnego białka i kodującą drugi polipeptyd heterologiczny, będący w przypadku ludzkiego interferonu leukocytowego A hybrydą polipeptydu AD 'leukocytów ludzkich o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na rysunku fig. 1.
- 3. Sposób według 1 albo 2, znamienny tym, że hoduje się komórki drożdży zawierające żywe komórki Saccharomyces cereisiae transformowane wektorami ekspresji nadającymi im zdolność wytwarzania heterologicznego białka w pożywce hodowlanej zawierającej białko heterologiczne.CMIo.I οι I o s|-v·CMT a- s< < t/ (Z)O oOl l/<IZ) IZ) -Je2? 2? S o o </>£| 3^1 3 3 fej φ <ΰ aj <l uo «IZ) <z><z> ωΙΖ ΙΖ)Λ & -2-2$ 5 31 $| «Ζ» >> — CJ oΛ-S _0 _0 — Q_ ω « .>> >ο οι χ:CLII I ο = .3 23 ιηΤ £|3 3 w 3 £1 — ο 21 > 2 3 Λ ĆΟ fc «Λ α .c >>-S .S < <¥CM7* mcm <αι-CCL οΟ.Λ ο<ς:ΙΖ» <ΙΛ <ο >- αχ £ £ £2 £153 724AATTCArGGCC AGCTTAA GATCJ ^MŚ«MU ONA EcoRIHem B1H636 bpEcoRIPre-IFN-«1 RIEcoRI153 724153 724Pre-IFN-~1Fig.5.u ^===^RI I Ontel EcoPstl_ ι-J.IFN-««2 cONAPstlEgdRI DdlE«»RIEroRIEcoRIEcc^f^I. Ddel 44 bpÓà Del DdelOdo l, Pst I900 bpOdlT
- 4 DNA EcoRI, Pstl944 bpDdlΉPstlEcoRIIFN-7cCWADelJPstl230bp2p 740 bpDNA pDR322 0NAPstl EroRIPstlT4 DNA EcoRI1174 bpPrt-IFN-«2 RIPstl EroRIFig.6.ΉSou 3ASau3A Sou 3 A —I—Sou 3ASau 3A842 bpPSau3A _gl ΊSou 3AAATTTCCCCGATC—r GGGOCCTAi—H ONAEcoRI pONA 862 bp EcoRIEcoRI862 bp pUC7Bat I —I-GATCCGGGG -CTAOGCCCCTTAAPrn-IFN- 7 RI70 bp153 724Fig.8.099yFig.lOb.I I I_I_I-L-1-1-L
- 5
- 6
- 7 β 9 10 11 12 13 (M/n^-ou153 724Fig.1 3.-23 -22 -21 -20 -19 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -β -7Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Ala Len tal Wil Leu Ser Cys Lys t(W/o)-ΝΟΝΕ (90%)111%-1- LelF A-6-5-4-3^-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Lu Pro Gn Thr His Ser leu Gly ί t36% 64%55% 33%- ---1- LelF .O “ «. „ o LLp „ „ γ, „ γ, H s (30%)-8% 45% 47%- -1Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cy Leu Pro Trp leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe (1%)-100%AATWGGCIACAGGCTCC UxiHTAOGATGTCCGAGGGC ~DNA 181-» mi m| HB,lWł tą»
- 8 &»RI ATGPsH pHGH 20*7-1) | HmnΡνυΠ CTGTGGCTTCT^-AAGCTT ' GACACCGAAGAICCIICGAAΡνυΠH&n cDNAC EcoW ATGHMinD EcoRI* ATGE EcoRI ATGPsi i —ł—MI —f—PsHFig.A.PvulHindOI AGCTGAATTC ' CTTAAGTCGAHindOI EcoRI mm £CoRI 1HityflD Pvul | 1M)0tip|HI bp H——H $qu3A HincH I «g| Sa3* £coM-XbelΗβΒPGK —rc BgiH ίHndlDJ153 724-40 -30 -20 -10 -1 MET SER LEU SER SER LYS LEU LEU VAL-GATCATAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACA ATG TCT TTA TCT TCA AAG TTG CTC GTCEcoRIXba IKLENOW Pol. !♦ 4dNTP'sHoe ΙΠ Pyul Sou 3A Hinc UPGKATG — 31- 5' Sou 3A u 39 bpAAATGTTGTTTA TTTACAACAAAT pPGK-395 -ATTTGTTGTAAAKLENOW Pol. I*Sou BA υ 4 dNTP'sAAATGTTGTTTA-51 TTTACAACAAAT-31Fig.E.pf>GK-1OOZOkład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 eg.. Cena 3000 zł
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US35529782A | 1982-03-08 | 1982-03-08 | |
US06/438,236 US4775622A (en) | 1982-03-08 | 1982-11-01 | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL240927A1 PL240927A1 (en) | 1983-11-07 |
PL153724B1 true PL153724B1 (en) | 1991-05-31 |
Family
ID=26998782
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL1983240927A PL153724B1 (en) | 1982-03-08 | 1983-03-08 | Expression processing and secretion of heterologous protein by yeast |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4775622A (pl) |
EP (1) | EP0088632B1 (pl) |
JP (2) | JPH0829111B2 (pl) |
AU (1) | AU574323B2 (pl) |
BG (1) | BG46159A3 (pl) |
BR (1) | BR8301150A (pl) |
CZ (1) | CZ282905B6 (pl) |
DD (1) | DD207220A5 (pl) |
DE (2) | DE3308215C2 (pl) |
DK (1) | DK163932C (pl) |
DZ (1) | DZ513A1 (pl) |
ES (1) | ES8500324A1 (pl) |
FI (1) | FI830774L (pl) |
FR (1) | FR2523152B1 (pl) |
GB (1) | GB2116567B (pl) |
GR (1) | GR78506B (pl) |
IE (1) | IE55743B1 (pl) |
IL (1) | IL68058A (pl) |
MX (1) | MX163813B (pl) |
NO (1) | NO830780L (pl) |
NZ (1) | NZ203494A (pl) |
OA (1) | OA07338A (pl) |
PH (1) | PH24804A (pl) |
PL (1) | PL153724B1 (pl) |
PT (1) | PT76360B (pl) |
RO (1) | RO88582A (pl) |
YU (1) | YU46723B (pl) |
ZW (1) | ZW6283A1 (pl) |
Families Citing this family (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
US4769238A (en) | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
US4943529A (en) * | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
US5618697A (en) * | 1982-12-10 | 1997-04-08 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing a desired protein |
DE3382547D1 (de) * | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
US4859600A (en) * | 1983-04-25 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone |
NZ207925A (en) * | 1983-04-25 | 1988-05-30 | Genentech Inc | Yeast expression vehicle consisting of a yeast promoter and signal peptide encoding region linked to a heterologus peptide coding region; expression and culture |
US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
EP0143081B1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-08-23 | Ciba-Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
PH23920A (en) * | 1983-12-20 | 1990-01-23 | Cetus Corp | Glucoamylase cdna |
FI841500A0 (fi) * | 1984-04-13 | 1984-04-13 | Valtion Teknillinen | Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar. |
US7273695B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-09-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HIV immunoassays using synthetic envelope polypeptides |
US7393949B1 (en) | 1987-12-24 | 2008-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences |
CA1341482C (en) | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
US7285271B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-10-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide |
ATE88754T1 (de) * | 1984-12-06 | 1993-05-15 | Fina Research | Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung. |
US4902620A (en) * | 1985-04-25 | 1990-02-20 | Eli Lilly And Company | Novel DNA for expression of delta-aminolevulinic acid synthetase and related method |
EP0226639B1 (en) * | 1985-05-29 | 1990-11-14 | The Green Cross Corporation | Process for preparing heterogenic protein |
US5164485A (en) * | 1985-08-20 | 1992-11-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof |
JPS62175183A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-07-31 | ジエネンコ− インコ−ポレ−テツド | 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドとその製造方法及びその製造のためのベクタ− |
DE3650202T3 (de) * | 1985-08-29 | 2004-06-03 | Genencor International, Inc., South San Francisco | Expression von heterologen Polypeptiden in filamentösen Pilzen, Verfahren zu deren Herstellung und Vektoren zu deren Herstellung. |
US4937189A (en) * | 1985-10-18 | 1990-06-26 | Pfizer Inc. | Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants |
CA1295567C (en) * | 1988-07-25 | 1992-02-11 | Lawrence T. Malek | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte, macrophage-colony stimulating factor (gm-csf) and other heterologous proteins from streptomyces |
GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
US5024941A (en) * | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
US5766912A (en) * | 1986-03-17 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Humicola lipase produced in aspergillus |
US5536661A (en) * | 1987-03-10 | 1996-07-16 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of protein products in aspergillus |
FR2599753B1 (fr) * | 1986-06-05 | 1989-12-08 | Sanofi Sa | Sequence d'adn composite et son application pour la production de l'hormone de croissance |
GB8615701D0 (en) * | 1986-06-27 | 1986-08-06 | Delta Biotechnology Ltd | Stable gene integration vector |
JPH0616716B2 (ja) * | 1986-10-14 | 1994-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | 酵母におけるヒトpstiの製造法 |
MY103358A (en) * | 1987-04-15 | 1993-06-30 | Novartis Ag | Process for the production of protiens. |
US5610034A (en) * | 1987-04-29 | 1997-03-11 | Alko Group Ltd. | Immunoglobulin production by trichoderma |
JP2791418B2 (ja) * | 1987-12-02 | 1998-08-27 | 株式会社ミドリ十字 | 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 |
CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
US5149544A (en) * | 1989-11-13 | 1992-09-22 | Research Corporation Technologies, Inc. | Method of inhibiting progenitor cell proliferation |
US6172039B1 (en) | 1990-04-16 | 2001-01-09 | Apex Bioscience, Inc. | Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast |
CA2092717C (en) * | 1990-09-13 | 2001-06-12 | Klim King | Expression of g protein coupled receptors in yeast |
AU8740491A (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-28 | Protein Engineering Corporation | Proteinaceous anti-dental plaque agents |
US5932483A (en) * | 1990-10-16 | 1999-08-03 | Northwestern University | Synthetic peptide and its uses |
US5364930A (en) * | 1990-10-16 | 1994-11-15 | Northwestern University | Synthetic C1q peptide fragments |
ATE254179T1 (de) * | 1990-11-29 | 2003-11-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Neue type-i-interferon varianten, ihre verfahren zur herstellung, und ihre verwendungen |
FR2669931B1 (fr) * | 1990-11-29 | 1995-03-31 | Transgene | Nouveaux variants derives des interferons-alpha et leur procede de production. |
CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5538863A (en) * | 1993-07-01 | 1996-07-23 | Immunex Corporation | Expression system comprising mutant yeast strain and expression vector encoding synthetic signal peptide |
US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
JP3763924B2 (ja) * | 1997-03-17 | 2006-04-05 | フクダ電子株式会社 | 超音波診断装置 |
US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
AU7466998A (en) | 1997-04-14 | 1998-11-11 | Byron E. Anderson | Method and material for inhibiting complement |
FR2768743B1 (fr) * | 1997-09-23 | 2001-09-14 | Bio Merieux | Procede de lyse de micro-organisme |
GB2338236B (en) | 1998-06-13 | 2003-04-09 | Aea Technology Plc | Microbiological cell processing |
US6268178B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-07-31 | Phage Biotechnology Corp. | Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides |
US6890730B1 (en) | 1999-12-10 | 2005-05-10 | The Salk Institute | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems |
US20030171267A1 (en) | 2000-04-12 | 2003-09-11 | Rosen Craig A. | Albumin fusion proteins |
US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US6358733B1 (en) | 2000-05-19 | 2002-03-19 | Apolife, Inc. | Expression of heterologous multi-domain proteins in yeast |
US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
ES2252261T3 (es) * | 2000-06-28 | 2006-05-16 | Glycofi, Inc. | Metodos para producir glicoproteinas modificadas. |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
WO2002039951A2 (en) * | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Globe Immune, Inc. | Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof |
US7507413B2 (en) * | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP1997829A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-12-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU2002364587A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ES2343518T3 (es) * | 2002-09-09 | 2010-08-03 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Polipeptidos interferon alfa modificados resistentes a proteasas. |
KR101164509B1 (ko) | 2002-12-16 | 2012-07-10 | 글로브이뮨 | 면역 요법으로서의 효모계 백신 |
US8343502B2 (en) * | 2002-12-16 | 2013-01-01 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based vaccines as immunotherapy |
US7439042B2 (en) * | 2002-12-16 | 2008-10-21 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection |
EP1594530A4 (en) | 2003-01-22 | 2006-10-11 | Human Genome Sciences Inc | HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN |
US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
WO2005014825A2 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Methods of protein production in yeast |
PT1678314E (pt) | 2003-10-22 | 2012-11-27 | Keck Graduate Inst | Métodos de síntese de polipéptidos heteromultiméricos em levedura utilizando uma estratégia de conjugação haplóide |
WO2005048985A2 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Baxter International Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and treatment methods using such compositions |
JP2008500275A (ja) * | 2003-12-31 | 2008-01-10 | セントカー・インコーポレーテツド | N末端の遊離チオールを有する新規な組み換えタンパク質 |
CA2559379A1 (en) | 2004-01-20 | 2005-07-28 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for producing human serum albumin by heating in presence of divalent cation |
JP2008516610A (ja) * | 2004-10-18 | 2008-05-22 | グローブイミューン,インコーポレイテッド | 酵母を用いた慢性c型肝炎感染の治療 |
US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
US20070105768A1 (en) * | 2004-11-10 | 2007-05-10 | Rajiv Nayar | Dry recombinant human alpha 1-antitrypsin formulation |
US20100034840A1 (en) * | 2005-07-11 | 2010-02-11 | David Apelian | Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies |
US20070172503A1 (en) * | 2005-12-13 | 2007-07-26 | Mycologics,Inc. | Compositions and Methods to Elicit Immune Responses Against Pathogenic Organisms Using Yeast Based Vaccines |
US7745128B2 (en) * | 2006-03-27 | 2010-06-29 | Globeimmune, Inc. | Ras mutation and compositions and methods related thereto |
JP2008174489A (ja) * | 2007-01-18 | 2008-07-31 | Nitto Denko Corp | 微生物とペプチド性薬物を含む新規製剤 |
JP5570819B2 (ja) | 2007-02-02 | 2014-08-13 | グローブイミューン,インコーポレイテッド | 酵母を含む組成物および酵母を増殖させる方法 |
CA2681246A1 (en) * | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Globeimmune, Inc. | Compositions and methods for targeted ablation of mutational escape of targeted therapies for cancer |
WO2010033841A1 (en) | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Globeimmune, Inc. | Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection |
EP3320915A1 (en) | 2009-04-17 | 2018-05-16 | Globeimmune, Inc. | Combination immunotherapy compositions against cancer and methods |
AU2010291985B2 (en) | 2009-09-14 | 2016-05-05 | The Regents Of The University Of Colorado | Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses |
ES2696551T3 (es) | 2010-12-17 | 2019-01-16 | Globeimmune Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano |
ES2643389T3 (es) | 2011-02-12 | 2017-11-22 | Globeimmune, Inc. | Producto terapéutico basado en levadura para infección por hepatitis B crónica |
EP3238731B1 (en) | 2011-03-17 | 2021-02-17 | Globeimmune, Inc. | Yeast-brachyury immunotherapeutic compositions |
WO2012174220A1 (en) | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection |
BR112014003477B1 (pt) | 2011-08-17 | 2021-11-03 | Globeimmune, Inc. | Composição imunoterapêutica de muc1 de levedura |
US9653272B2 (en) | 2012-06-26 | 2017-05-16 | Biodesix, Inc. | Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies |
LT2872644T (lt) | 2012-07-12 | 2017-10-10 | Uab Baltymas | Natyvių rekombinantinių sekretuojamų žmogaus endoplazminio tinklo šaperonų gamyba, panaudojant jų natyvias signalines sekas, mielių raiškos sistemose |
RU2679806C2 (ru) | 2013-03-19 | 2019-02-13 | Дзе Юнайтед Стейтс Оф Эмерика, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Дипартмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз | Дрожжевая иммунотерапия хордомы |
WO2014160747A2 (en) | 2013-03-26 | 2014-10-02 | Globeimmune, Inc. | Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection |
TWI654200B (zh) | 2013-08-30 | 2019-03-21 | 環球免疫公司 | 治療或預防結核病的組合物及方法 |
US11066455B2 (en) * | 2014-02-24 | 2021-07-20 | The Johns Hopkins University | Tmem100 peptides and variants thereof and their use in treating or preventing diseases or conditions |
US10799567B2 (en) | 2014-04-11 | 2020-10-13 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based immunotherapy and type I interferon sensitivity |
US11065313B2 (en) | 2015-08-03 | 2021-07-20 | Globeimmune, Inc. | Modified yeast-brachyury immunotherapeutic compositions |
US11739166B2 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-29 | Davol Inc. | Reactive polysaccharide-based hemostatic agent |
CN113549639B (zh) * | 2021-07-21 | 2022-07-29 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种降低烟叶总蛋白及烟气苯酚含量的调控基因 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
US4503035B1 (en) | 1978-11-24 | 1996-03-19 | Hoffmann La Roche | Protein purification process and product |
ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
GB2068969B (en) * | 1980-02-05 | 1983-07-27 | Upjohn Co | Gene expression |
US4370417A (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-25 | Abbott Laboratories | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
GB2079288B (en) * | 1980-05-12 | 1984-05-16 | Biogen Nv | Dna sequences recombinat dna molecules and processes for producing polypeptides with the specificity of foot and mouth disease viral antigens |
CH657141A5 (de) * | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
NZ198445A (en) * | 1980-09-25 | 1984-05-31 | Genentech Inc | Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology |
US4506013A (en) * | 1980-10-03 | 1985-03-19 | Eli Lilly And Company | Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells |
US4456748A (en) * | 1981-02-23 | 1984-06-26 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
US4414150A (en) * | 1980-11-10 | 1983-11-08 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
US4666847A (en) * | 1981-01-16 | 1987-05-19 | Collaborative Research, Inc. | Recombinant DNA means and method |
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
US4615974A (en) * | 1981-08-25 | 1986-10-07 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
-
1982
- 1982-11-01 US US06/438,236 patent/US4775622A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-03-05 DZ DZ836783A patent/DZ513A1/fr active
- 1983-03-06 IL IL68058A patent/IL68058A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-03-07 NO NO830780A patent/NO830780L/no unknown
- 1983-03-07 NZ NZ203494A patent/NZ203494A/en unknown
- 1983-03-07 DK DK111283A patent/DK163932C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-03-07 BG BG060015A patent/BG46159A3/xx unknown
- 1983-03-08 PT PT76360A patent/PT76360B/pt unknown
- 1983-03-08 GB GB08306285A patent/GB2116567B/en not_active Expired
- 1983-03-08 MX MX196514A patent/MX163813B/es unknown
- 1983-03-08 DE DE3308215A patent/DE3308215C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-08 DE DE8383301269T patent/DE3382694T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-08 FI FI830774A patent/FI830774L/fi not_active Application Discontinuation
- 1983-03-08 PL PL1983240927A patent/PL153724B1/pl unknown
- 1983-03-08 ES ES520416A patent/ES8500324A1/es not_active Expired
- 1983-03-08 BR BR8301150A patent/BR8301150A/pt unknown
- 1983-03-08 RO RO83110268A patent/RO88582A/ro unknown
- 1983-03-08 PH PH28614A patent/PH24804A/en unknown
- 1983-03-08 YU YU55683A patent/YU46723B/sh unknown
- 1983-03-08 ZW ZW62/83A patent/ZW6283A1/xx unknown
- 1983-03-08 AU AU12152/83A patent/AU574323B2/en not_active Expired
- 1983-03-08 IE IE498/83A patent/IE55743B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-03-08 JP JP58038116A patent/JPH0829111B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-08 FR FR8303755A patent/FR2523152B1/fr not_active Expired
- 1983-03-08 OA OA57932A patent/OA07338A/xx unknown
- 1983-03-08 EP EP83301269A patent/EP0088632B1/en not_active Revoked
- 1983-03-08 CZ CS831608A patent/CZ282905B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1983-03-08 GR GR70725A patent/GR78506B/el unknown
- 1983-03-08 DD DD83248613A patent/DD207220A5/de unknown
-
1993
- 1993-04-20 JP JP5093196A patent/JPH06181779A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL153724B1 (en) | Expression processing and secretion of heterologous protein by yeast | |
JP3577311B2 (ja) | インスリン様成長因子結合タンパク質の製造 | |
EP0123544A2 (en) | Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor | |
US7166446B2 (en) | Method for expression of heterologous proteins in yeast | |
CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
US20070010439A1 (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
JPS6236183A (ja) | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 | |
US5010003A (en) | Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins | |
JPS6143991A (ja) | B型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法 | |
NO302301B1 (no) | Fremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktivt HSA fra en metylotrof gjær av slekten Pichia, samt ekspresjonsvektorer og gjærstammer deri | |
Oberto et al. | Expression of chicken egg white lysozyme by Saccharomyces cerevisiae | |
JPS63119682A (ja) | 細胞増殖刺激剤 | |
US6962796B1 (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
EP0127304A1 (en) | Process for producing heterologous protein in yeast, expression vehicle therefor, and yeast transformed therewith | |
US7198919B1 (en) | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems | |
Lang et al. | Lack of actin III in fibrillar flight muscle of flightless Drosophila mutant raised | |
AU629820C (en) | Production of insulin-like growth factor binding protein | |
Calderón-Cacia et al. | Incomplete process of recombinant human platelet-derived growth factor produced in yeast and its effect on the biological activity | |
CS274401B2 (en) | Method of polypetide production with sequence of animal interferon's amino acids |