JPS63164889A - ヤロウイア・リポリテイカ形質転換体による外来蛋白質の発現および分泌 - Google Patents

ヤロウイア・リポリテイカ形質転換体による外来蛋白質の発現および分泌

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酵母蛋白質分泌技術に関し、より詳細には、は
乳類蛋白質（たとえばプロキモシン）および他のポリペ
プチド類の発現と分泌をコード化している外来ＤＮＡか
らなる組換えヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａデｒｏｗ
ｉａ　１ｉｐｏＬｙｔｉｃａ）クローニングビーヒクル
；およびヤロウイア・リポリチカ遺伝子プロモーター（
たとえばＸＰＲ２またはＬＥＵ２）、アルカリ性プロテ
アーゼシグナル（またはブレ）配列、プロ領域、および
ＸＰＲ２ターミネータ−領域、および遺伝子コードの退
化または他のヤロウイア・リポリテイカ遺伝子成分の使
用に由来するそれらの変異体または機能的に同等の物か
らなる発現ベクターに関する。さらに、本発明は上記発
現及び分泌ベクターを有する形質転換体、それらを使用
して異種蛋白質をそれらの生来の機能的状態で産生する
こと；および該産生を行う方法に関する。
従来の技術 工業に価値ある種々の蛋白質およびポリペプチド（たと
えばプロレンニン、牛生長ホルモン）ま　−たは医学用
途に価値ある蛋白質およびポリペプチド（たとえばウロ
ガストロン、組織プラスミノーゲン賦活剤、ヒトアナフ
イラトキシンＣ３ａ）および特に容易に回収できる機能
的形で高い質の産生物を与える供給源を安定して充分に
供給することによる経済上の有利性により、多くの研究
者が異種蛋白質の産生のための１工場”としての微生物
に遺伝子組換えＤＮＡ技術を適用してきた。
さらに、組換え宿主細胞、特に大腸菌（Ｅｅｅｈ−ｇｒ
ｉｃｈｔａ　ｅｏｌｉ）の細胞内蓄積物から生物学的に
活性な形で外来すなわち異種蛋白質を回収するときに遭
遇する困難を効果的に解決する手段として蛋白質分泌に
焦点をしぼって研究が続けられている。大腸菌において
は、異種蛋白質はしばしば屈折性包摂体の形で細胞内に
産生される。該蛋白質は一般に水溶性が低く、生物活性
もほとんどか全くない。上記屈折性包摂体からの該蛋白
質の抽出は一般に費用がかかり望ましい本来の生物活性
のある形で蛋白質を回収することがほとんどか全く回収
できない粗雑な化学処理を含んでいる。さらに、上記包
摂体を放出するために細胞を破壊する必要があるので、
上記蛋白質に大腸菌によって産生された望ましくない物
質が混入している可能性が一層大きくなる。大腸菌以外
の多くの微生物も不溶性細胞内物質として異種蛋白質を
産生ずる。
たとえば、１９８２年７月２８日公告の英国特許第２，
０９１，２７１号は組換えＤＮＡ技術をサツカロマイセ
ス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｇデーｖ＜ａｔａｓ　）の遺
伝子修飾を行なって、牛レンニン、すなわちキモシンを
発現させることを開示している。これらの困難から、上
記宿主微生物からの蛋白質の分泌は蛋白質を本来の活性
配置で産生ずる試みへと焦点が移った。、 異種蛋白質を含む特定の蛋白質またはポリペプチドが特
定の微生物によって分泌されるか否かは蛋白質に依って
異るようである。　１１とんどの真核細胞では、蛋白質
合成装置のいくつかは原形質膜と結合しており、発生し
ようとするポリペプチド鎖のアミノ末端近くのアミノ酸
配列（いわゆるシグナル配列）は蛋白質に原形質膜を横
切らせるのに役立つ。このシグナル配列は次いで該分泌
過程で蛋白質分解酵素により開裂されて活性な成熟蛋白
質を与える。いくつかの試みが、枯草菌（ＢａｃｉｌＬ
ｓｓ　ａｓｂｔｉｌｔｇ）とサッカａマイセスｓセレビ
シアエなどの微生物のシグナル配列を使用して培養中の
は乳類細胞において異種蛋白質を分泌させる方法を開発
するためになされた。しかし、これらの微生物は理想的
とはいえなかった。
枯草菌の生来の特性、たとえば分泌された異種蛋白質を
分解する傾向のある多くの蛋白分解酵素を含む多くの蛋
白質を分泌すること；外米ＤＮＡの欠点から生じる形質
転換株の不安定性はその開発研究をさまたげてきた。
は乳類細胞を遺伝子工学的に処理してうまく異種蛋白質
を発現させ分泌させることができるが、これらの系は操
作に技術的な問題点があり費用がかかり、はとんどの蛋
白質を製品として商業的に生産することが実施不可能で
あった。
蛋白質分泌系死が枯草菌よりもサツカロマイセス・セレ
ビシアエについてより成功していた一方テ、サツカロマ
イセス・セレビシアエさえ蛋白質分泌系としての本来の
限界を有するように見える。
ヨーロッパ特許出願第０１２３５４４号（１９８４年１
０月３１日公告）は、サツカロマイセス・セレビシアエ
α−因子遺伝子の単離、および分離した成熟蛋白質を細
胞培養により産生ずることが可　　　　′能な酵母細胞
の形質転換のためのプラスミドにおいて、酵母にとって
異種の蛋白質をコード化しているＤＮＡｌｆｆｌ合せて
、サツカロマイセス・セレビシアエのプロモーターおよ
び／またはシグナルペプチド蛋白質を使用することを記
載している。
ヨーロッパ出願第００８８６３２号（１９８３年９月１
４日公告）は、サツカロマイセス・セレピシアエ中で異
種蛋白質を発現し分泌する方法を記載している。しかし
、サツカロマイセス・セレビシアエがこれらのおよび他
の分泌系によって効果的に分泌するであろう蛋白質の大
きさは約２０．０００ダルトンに限定される。分泌微生
物としてのサツカロマイセス・セレビシアエの一般的非
効率を克服するには、スミス（Ｓｙ＋ｃｉｔ＆）ら、サ
イエンス２２９　：　１２１９−１２２４　（１９８５
）によって記載されている多くの突然変異による変化を
必要とした。この傾向に対する１つの例外は、２０．０
００ダルトンより大きなアスペルギルス（Ａａｐｅデｇ
ｉｌ１％８）酵素がサツカロマイセス・セレビシアエに
よって分泌できるということが観察されているが、これ
らの酵素はサツカロマイセス・セレビシアエによって高
度にグリコジル化されており、このことが分泌効率に影
響を及ぼす可能性がある。
ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐ
ｏ−！ｙｔｓａａ）すなわち、クエン酸および単細胞蛋
白質をつくるのに使用される工業上重要な酵母は特別重
要である。この種の酵母はエリスリトール、マンニトー
ルおよびイソプロピルリンゴ酸をつくるのにも使用でき
る。サツカロマイセス・セレビシアエとけ反対に、ヤロ
ウイア・リポリテイカは、効率よく高分子蛋白質（アル
カリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼおよびＲＮＡエ
ース）をその成育培地に分泌して異種蛋白質を、本来の
状態で、産生細胞を破壊することを必要とせずに効率よ
く回収できるようにする能力の故に特に重要で価値があ
る。さらに、ヤロウイア・リポリテイカは非常にわずか
の量の蛋白質しか分泌しないので王たる蛋白質として所
望の異種蛋白５！［を生育培地に産生し、該異種蛋白質
の回収が簡単になる。
ヤロウイア・リポリテイカは高レベルの細胞外プロテア
ーゼを産生ずる。これはヤロウイア・リポリテイカによ
って分泌される王たる蛋白質である。特定のプロテアー
ゼ（アルカリ性、酸性または中性）は使用したヤロウイ
ア・リポリテイカの株に依存している（オグリズイアク
（Ｏσデｙｄｔｉａｋ）ら、ジャーナル・ジエ／・ミク
ロパイオルＣＪ。
Ｇｇｔｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）（１９８２）　１２
８．１２２５−１２３４）。アルカリ性細胞外プロテア
ーゼのＮ−末端アミノ酸配列の部分的配列分析がオグリ
ズイアクら（上記文献）により報告されている。
係属中のアメリカ特許出願第６３４，５０５号（１９８
４年７月２５日出願）は、ヤロウイア・リポリテイカを
形質転換する方法および突然変異の補助によってヤロウ
イア・リポリテイカ遺伝子をクローニングする方法を記
載している。該出願はＸＰＲ２遺伝子（分泌されたアル
カリ性プロテアーゼをコード化）をヤロウイア・リポリ
テイカのＸｐデ２突然変異の助けによりクローニングす
ることを開示している。方法は１９８５年４月２４日に
公告のヨーロッパ出ｍ第０１３８５０８号（すなわち上
記アメリカ出願に相当）に記載のべ、　　フタ−７）Ｌ
Ｄ４０Ｖｃあるヤロウイア・リボリテイ力遺伝子ライブ
ラリーのｎｇｔ！１部分分解によるヤロワイア・リボリ
テイカ宿主菌株を形質転換することからなる。
発明が解決すべき問題点 本発明は、ヤロウイア・リポリテイカ宿主に導入された
とき宿主はいかなる源からの外米ＤＮＡ特に真核細胞の
ＤＮＡおよび合成ＤＮＡによってコード化てれた特異的
蛋白質も産生じ培地に分泌する能力を与えるベクターの
製法：は乳類蛋白質および他のポリヘプチドの発現をコ
ード化している外米ＤＮＡ　（キロ９イア・リボリテイ
力宿主の形質転換に適したプラスミド、待にＬＥＵ２遺
伝子プロモーター、ＸＰＥＺ遺伝子プロモーター、アル
カリ性プロテアーゼプレプロ領域および恩２ターミネー
ター領域を含む組込み発現ベクター）からなるｍ換えヤ
ロウイア・リポリテイカクローニング・ベーヒクル；お
よび異種蛋白質を形質転換されたヤロウイア・リポリテ
イカの中に発現し分泌することのできる。ＬＥＵＺプロ
モーターの下流のＸＰＥ２分泌シグナルヲ有する外米コ
ーディング配列を有する発現プラスミドを提供する。
問題を解決するための手段 かくして、本発明は成熟異種蛋白質の発現と分泌、特に
遺伝子的に変化をせ九ヤロウイア・リポリテイカの細胞
培養物からのプロレンニンおよびヒトアナフイラトキシ
ンＣ５ａ　　の発現と分泌を開示する。ヤロウイア・リ
ポリテイカの細胞外アルカリ性プロテアーゼについての
アミノは配列およびＤＮＡ配列の正確な同定によって、
異種蛋白質が細胞培養物中で産生ずるための′ｇｉ換え
Ｄ　Ｈ／１技術によって発現され分泌されることを決定
できるようになった。プロレンニンの場合は、チモーゲ
ン（レンニン前駆体）の成熟形は発現され分泌でれる。
ヤロウイア・リポリテイカはｍ換えＤＮＡ技術によって
遺伝子を修飾してそれらの本来の形で異捗蛋白質全発現
し分泌することができる形質転換体を製造できることが
わかった。こｎは、分泌することがＡ１れている異種蛋
白質の構造遺伝子配列に結合したＸＰＥＺ遺伝子のシグ
ナルあるいはシグナルと第一（プロ１）ｉたは両方のプ
ロ配列（プロ１＋プロ２）を有するベクターを構成する
ことによって達成される。
ＸＰＲ２遺伝子の両端に調節または構造成分を欠くＸＰ
Ｒ２遺伝子断片からなるベクターＤＮＡのＸＰＲ２座に
′ｊ６す゛る組込みによって産生された形質転換体はも
はやアルカリ性プロテアーゼを産生しない。この特徴は
異種蛋白質の分泌にとって望ましいばかりでなく、形質
転換体のスクリーニングに使用できる。
さらに、アルカリ性プロテアーゼ分泌シグナル配列のた
めのｘｐＲｚプロモーター２よび配列を有するベクター
は形質転換されたヤロウイア・リポリテイカの歯体中で
は成熟異種蛋白質を分泌することができる。このタイプ
のいくつかの組換えＤＮＡベクターはｆｉ母ゲノムの組
込み部位とは独ニして発現または分泌を達成できる。一
般に、光分な５′オよび３′　フランキングＤＮＡｆ有
するベクターは組込み部位に関係なく産生物を発現でき
る。
さらに、驚くべきことに、ｐＢＲ３２２誘導プラスミド
をヤロウイア・リポリテイカ染色体ＤＮＡへ組込むこと
によりさらに部位を指定して組込むことにより形質転換
を行うことができる相同の領域を提供できる。よって、
ｐＢＲ３Ｚ２６）組込みコピーは、入って来る、形質転
換するＤＮＡのための１ドツキングプラツトホーム”と
して役豆つ。
ｐＢＲ３２２６）レジデントコピーのヤロウイア・リポ
リテイカ染色体ＤＮＡへの組込みは、ｐＢＲ３２２がヤ
ロウイア・リボリテイ力ＤＮＡ本来のものでないにもか
かわらず、組込かの既知標的となり得る。そのような部
位を有するヤロウイア・リポリテイカ形質転換受容体は
そのような部位のない受容体に比べて２つの大きな利点
がある。
すなわち、部位指定組込みのための標的として役二つ既
知配列と既知制限地図を有する領域の存在゛および組込
み標的としてのｐＢＲ３２２’ｚ使用することにより、
入って来たプラスミドが所望の遺伝子部分にのみ対する
完全な機能的単位または遺伝子を含んでいるかどうか決
定する機会である。
たとえば、ＸＰＥ２遺伝子の３′断片のみ有するプラス
ミドはワイルドタイプコドンを有する場合にＸＰＲ２−
１００２受容体を形質転換できＸＰＥＺ座で組込んだ。
しかし、同じプラスミドでもそれ′ｆｔｐＢＲ３２２に
融合する場合、完全な機能的ユニットに欠けるとＸＰＲ
２−１００２宿主とプロテアーゼ陽性フェノタイプに形
質転換しない。
このように、外米ベクターＤＮＡと相同の領域を有する
ヤロウイア・リポリテイカ形質転換体においては、外米
ＤＮＡからなる領域はヤロウイア・リポリテイカの組込
み形質転換の間受容部位として役二つ。ｐＢＲ３２Ｚお
よびその誘導体の外に、コスミド、Ｍ１３２よびラムダ
のようなバクテリオファージ、合成ＤＮＡおよびｐＵｃ
１３のようなふつうのプラスミドを使用してドツキング
・プラットホームを有するヤロウイア・リポリテイヵ形
質転換体を産生できる。
“ＬＥＵ２＠プロモーター配列とは、すべてのでなけれ
ばほとんどの、発現に必要が特徴を備えたＡＴＣの上流
にある上流の未翻訳領域ｔ−意味する。
“ＸＰＲ２”プロモーター配列とは発現に必要なシグナ
ル（またはプレ）配列の前の上流の未翻訳領域をいう。
さらに、ＸＰＥ２遺伝子からのシグナル（プロ配列のあ
るなしにかかわらず）を使用してＸＰＥ２遺伝子の発現
コントール以外のヤロウイア・リボリテイ力プロモータ
ーの発現コントロールの下で蛋白質を分泌できる。この
ように、アルカリ性プロテアーゼ分諾シグナルのための
ＬＥび２プロモーターと配列を有するベクターは形質転
換されたヤロウイア・リポリテイカ菌体中で成熟異種蛋
白質を分泌することができる。
ヒト補体蛋白質Ｃ３ｃＬ（ヒトＣ５８）として既知のヒ
トアナフイラトキシンＣ５αは補体賦活化の結果として
インビボで生成した生物活性ポリイプチド断片である。
それは特定の体液性及び細胞゛性免疫反応を調節する場
合に免疫転調剤として働く。その−次構造および他の７
ナフイラトキシンの一次構造は解明された。化学的、物
理的且つ生物学的特徴の総括はハゲ！Ｊ　（Ｈｕｇｌｉ
）によって示されている（Ｈｗｇｌ　ｔ　、　”　Ｃｏ
ｍｐｌ　ｅｙｎａｎｔ”、ｅｄｉｔｅｄｂｙ　　Ｈ，Ｊ
、Ｍｕｌｌｔｔｒ−Ｅｂａｒｈａｒｄ　　ａｎｄ　　Ｐ
、Ａ、Ｍｉｅｓｃｈａｒ。
ｐ　７３−９９　＋　１９８５　＊　Ｓｐｒｉｎｇｔｔ
ｒ−Ｖｇｒｌａｇ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、）。
当業者は、事実上いかなる既知のアミノ酸配列コードし
ている外米ＤＮＡでも必要な変更を加えて本発明に使用
できる。本明細書は開示した方法は必要な変更を加えて
いかなる既知異種蛋白質（その代表例は１９８５年７月
３０日発行の米国特許第＋５３２２０７号に列挙しであ
る）の産生と分泌に適用できる。さらに、ヤロウイア・
リポリテイカの他のいかなる遺伝子、たとえばリボヌク
レアーゼおよび酸性プロテアーゼ遺伝子も蛋白質を分泌
した。ＸＰＥ２遺伝子の代りに、２つ以上の遺伝子断片
、たとえばＸＰＥ２遺伝子のシグナル配列とりボヌクレ
アーゼ遺伝子のプロモーター配列をいっしょにすること
によって構成されたハイブリッド遺伝子を使用できた。
本発明の範囲内には、ここに記載されたＤＮＡまたはヌ
クレオチド配列と機能上等しい物も含まれる。遺伝子コ
ードの退化によって特定コドンを同じアミノ酸を特異的
に指定する他のコドンに置き換えることができ、それに
よって同じ蛋白質を生せしめよう。ＤＮＡまたはヌクレ
オチド配列は実質的に、メチオニンとトリプトファン以
外の既知アミノ酸は２つ以上のコドンによってコード化
されているので変化が可能である。このように、ＸＰＥ
２遺伝子の部分ま九はすべてを合成して第３図に示した
ＤＮＡ配列とは有意に異なるＤＮＡ配列を得ることがで
きた。しかし、そのＤＮＡ配列にコード化されたア七ノ
酸配列は保存しておく。特定のＤＮＡまたはヌクレオチ
ド配列の機能上のそのような変形により、それに組込ま
れている外米ＤＮＡ配列によってコード化されている異
種蛋白質の分泌および／ま九は処理を促進する機会が与
えられる。ＸＰＲ２，遺伝子２よび遺伝子コードによっ
て可能なその断片のヌクレオチド配列のすべての変形は
、本発明に包含される。さらに、コドンを除去し、ある
いは１つ以上のコドンを退化コドン以外のコドンで置き
換えて、構造的に修飾されてはいるが禾修飾のＤＮＡ分
子によって産生されたポリイプチドと実質的に同じ用途
と活性を有するポリ４プチドを産生ずることができる。
２つのＤＮＡ分子の間の相違が遺伝子コードの退化に関
係がないとしても、上記ポリイプチドを産生ずる限りこ
れら２つのポＩＪ　ｄブチドは機能上均等である。こノ
モつとも間単なσ１ｊはプロレンニンＡとプロレン二／
Ｂに見られる。これら２つのプロレンニン対旦形質は、
プロレンニンＡの２８６位にアスパラギン酸残基があり
、プロレンニンＺｌ）２８６位にグリシン＋ｉ基がある
点のみ異なっている。
作用 この発明の方法全使用すると、異種は乳類蛋白質である
プロレンニンとヒトアナフイラトキシン０５αの発現と
分泌で、ヤロクイア・リボリプイカＸＰＲ２および／ま
たはＬＥＵ２遺伝子からの発現および分泌シグナルを使
用してヤロウィア・リボリプイカの中で達成された。プ
ロレンニンとヒトアナフイラトキシンＣ５ＧのためのＤ
ＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドによって、アルカ
リ性プロテアーゼシグナルイプチドをコードしていると
みられる部位またはプロテアーゼ先駆体プロセシング部
位（ここではプロ１およびプロ２と表示）でＸＰＲＺ遺
伝子配列に結合され、使用されて遺伝子構成体を形成し
、次いでこれを組込み形質転換によりヤロウイア・リポ
リプイカに挿入する。この組換え体の培養物は生育培地
中にプロレンニンとヒトアナフイラトキシンＣ５αの分
子−１と免疫反応活性を有する異種蛋白質を発現し放出
した。このようにして生成したプロレンニンは、プロイ
プチドの除去後、充分に酵素活性を示したので本来の配
置で折りたたまれているものと確信される。
ここで１組換えＤＮＡ物質”とは下記の少なくとも１つ
を含む物質をいうニヤロウイア・リボリプイカのＸＰＲ
”２遺伝子、そのシグナル（またはブレ）、プロ１およ
びプロ２（これらはいっしょにプロ領域を構成）、プロ
モーターまたはターミネータ−配列；ＬＥＵ２　プロモ
ーター；および遺伝子コードの退化によって可能な上記
配列の機能上の均等物。
上記組換えＤＮＡ物質の代表例は、ＤＮＡ断片、プラス
ミドまたはベクターあるいは上述の配列のいずれかまた
はすべてを含む形質転換体である。
材料　　制限エンドヌクレアーゼ類およびＴ４リガーゼ
をニューイングランド　バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｅｉｏｌａｂｓ　）から得、細菌性アルカリ
性ホスファターゼをペセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｇｓｇａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａ−ｔｏｒｉｅｓ）から、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼをＰＬ−バイオケミカルズ（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｇ　）から、Ｂよび〔ガンマ−”Ｐ：ＡＴＰをニ
ューイングラ７　Ｆ　−ｙｔ　ｐ　Ｌ／７−　（Ｎｇｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）から得た。すべ
ての酵素を供給者によって推奨される条件下に使用した
。
培地 ａｐｐｉ地−＜グリセリン／ブロテオースーイプトン培
地）は下記の成分を含む（リットル当り）：６．７ｇの
グリセリン、１．６ｇのディフコ（ｎｉｆｃｏ）プロテ
オ−バー４ブトン、１．７ｇのディフコ酵母窒素塩基（
アミノ酸と硫酸アンモニウムを含まず）。
３０■のウラシルおよび０．５１の４０紡リン酸塩緩衝
液（ｐＨ６，８）ポリプロピレングリコール（分子ｔｒ
ｏｏｐ）（ポリサイエンシズ（Ｐｏ　ｌ　ｙ−ｓｃｉｇ
ルＣ＃＃）社製）。（レンニン酵素検定に使用するため
に生育させる培養物のために使用する場合ポリプロピレ
ングリコールは省略された。）プロテオースーイブトン
をリン酸塩緩衝液甲別々にオートクレーブで処理した。
ＹＥＰＤ培地−（酵母エキス／ペプトン／デキストリン
培地）は下記の成分を含む（リンドル当り）：５ｙの酵
母エキス、１０ｙのイブトンおよび２０ｙのデキストリ
ン。
大腸附をＬＢ培地中で３７℃で生育させた。ＬＢ培地は
下記の成分を含有した（リンドル当り〕：１０、Ｖのバ
クトドリプトン、ｌｏｇのバクト酵母エキス、１０ｇの
塩化ナトリウム；これらを水酸化ナトリ９ムでｐＨ’ｌ
−５に調節した。
ＤＮＡ配列分析　本明細書に記載の種々のプラスミドか
らのＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルで単離してマ
クサム（Ｍａｚａｒｎ　）らの方法エンチモロジー（Ｅ
ｎｚ／ｍｏ１ｏｇｙ）、６５．４９９Ｃ１９８０）で配
列決定した。
連結方法　　ＤＮＡ断片（開裂ベクタープラスミドを含
む）は、所望の成分（正しく対応させるように構成され
た末端を有するＤＮＡ断片）を１４ＤＮＡ’）ガーゼと
混合することによって連結された。ＩＰ＆のベクターお
よび挿入断片について約１０単位のりガーゼが添加され
た。得られた連結反応物は大腸菌（Ｈ：、ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２菌株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）または
ＨＥ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）の能力細胞に入
れて形質転換した。
二／ヲ発現し分泌させるためのハイブリッド遺伝子を構
成するために、８つのオリゴヌクレオチドがホスホラミ
ダイト方法の変法（５ｉｎｈｃら、Ｔｅｔｒａんｇｄｒ
ｏｎ　　Ｌａｔｔｅｒｓ　　２４　ｓ　５　ｇ　４３　
（１９８３））によってジエネテイツク・デザイン（Ｇ
ｎｇｔｉｃＤｅｓｉｇｎ）６５００　（？サチューー１
＝７：／州ウォータータクン）自動化ＤＮＡシンセナイ
ザー金使用して合成され、６Ｍ尿素−２０％ポリアクリ
ルアミドゲルにより精製された。相補性オリゴヌクレオ
チドのアリコツトを混合して４℃で一晩ＴＥ（１０ｍＭ
　　）リス−ＨＣＬ、ｐＨ８，Ｏ；　　１　ｍｕ　Ｎａ
ｇＤＴＡ）中で互いにアニールした。二本鎖オリゴヌク
レオチドのアリコツト（約２ｐｌ）を２０μｔの反応混
合物（７０ｒｒＬＭトリス（ｐｆｆ７．６）、１０　ｍ
ｕＭＱＣＬ、、５ｍＡｆジチオスレイトール、５ｍＷＡ
ＴＰ　ｋ含む）中Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用
してホスホリル化した。
プラスミドＤＮＡの調製　　プラスミドＤＮＡの大規模
調製物は、ホルメス（Ｈｏｊｍｇａ）ら、Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｇｒｎ、、’Ｊ−１４．１９５−１９７（１
９８１）の方法、続いて、エチジウムプロミド−ＣａＣ
１ブイヨン密度勾配遠心分離によって製造された。ミニ
プレブ量のプラスミドＤＮＡはバーンボイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ　）らのＮＡＲＬ、１５１３Ｃ１９７９）のア
ルカリ性−５ＤＥｉ方法によって製造された。
プロレンニンのための発現または分泌ベクターの構成 一連の異なる構成物音つくって最終発現ベクターを得た
。すべての段階を添付図面において図式化した。一般に
、ＤＮＡ断片はゲル電気泳動によって単離され、他の断
片、すなわち開裂プラスミドＤＮＡに、２０　ｐｔの５
０ｒＩＬＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７，ｓ）、１０　ｍｕ
　ＭｇＣＬ、、２０ｒｎＭジチオスレイトール、ｌ　ｒ
ｙｔＭ　ＡＴＰ　２よび２００単位の７４）Ｊガーゼ中
で４℃で連結された。制限エンドヌクレアーゼによるＤ
ＮＡの部分的消化が必要ならば、至適開裂時間は実験的
に決定された。
培養液中の１０レンニンの同定　　発現ベクターを含む
酵母形質転換体を一晩ＧＰＰ培地（上述）甲で生育させ
た。遠心分離して酵母細胞を除去後、１虹の５０％ＴＣ
Ａを各々５Ｍｔの培養液アリコツトに加え、４℃で６０
分間維持した。インットを遠心分離により集めて２回２
妃ずつの冷アセトンで洗った。沈殿した蛋白質を１００
μｔのＳＯ３試料緩衝液に溶解しアリコツトを１０％５
ＤＩ−ボＩＪ　７り１７　Ａ／７ミドゲＡ／　（Ｌａ５
ｍｍＬｉ、Ｕ、Ｋ。
（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０）上で電気
泳動した。ゲルで分割した蛋白質を電気泳動により二ト
ロセｋｃ１−ス（：ｆｌｃｈｌａｉｃｈａｒ　ＳよびＳ
ｃｈｗｇｌｌ。
０．２２ｍｍ）に移シ、プロレンニンをスラブゲルのイ
ムノ−プロット分析により同定した（Ｈａｍｋｇｓ。
Ｒら、　Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｇＷＬ、　１１９　＋１
４２（１９８２））。
このフィルターをウサギ抗プロレンニン抗体で積層し、
ペルオキシダーゼ結合山羊抗つサギＩｇＧ抗体（ペンシ
ルバニア州、マルバーン、力ぜル（Ｃａｐｐｅｌ　）社
製）と共にインキュベートした。
結合した抗体を４−クロル−１−す７トール２よび過酸
化水素で染色することにより検出した。
培養液中のプロレンニンの乳凝集活性 種々のヤロウイア・リボリプイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃα）形質転換体の培養液をＥｒｎｓｔｒｏｍ、Ｊ、
Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｔ。
４）．１６６４（１９５８）による方法の変法に従って
乳凝集について検定した。簡単にいえば、この検定は活
性化培養物上滑中のレンニンが緩衝化スキムミルクを凝
集させるに要する時間を測定し、これらの唾を精製され
たレンニン標準物と相関させることからなる。酵母培養
物（２５ｒＲｔ）を−晩ＧＰＰ培地中で生育させた。遠
心分離して細胞を除去後、培養上清の５１のアリコツト
を真空下に凍結乾燥した。凍結乾燥した各上清を３００
μｔの蒸留水に再懸濁した。一連の精製された牛プロレ
ンニン希釈物も対照参考標準物として調製した。
培養濃縮物と対照中のプロレンニンを約５〜１０μｔの
濃塩酸を加えることによって賦活化してｐＨ約２とし、
１時間２２℃でインキュベートした。６０ｐの乾燥スキ
ムミルク粉末（ディフコ）を５００紅の４）．５　ｍＭ
酢酸ナトリウム（３ｔＨ６，３）と１３．６　ｒｎＭ　
ＣａＣＬｚ　に加え、２０分間４℃で撹拌することによ
って調製した。この基質全調製後すぐ検定に使用した。
各酵素調製物の６０μｔずつのアリコート（１ｖの培養
上溝に相等）を１１のスキムミルクのアリコツトに３７
℃で加え、凝集時間を記録した。
ジエネティック・デザイン６５００（マサチューセッツ
州、ウォータータウン）自動化ＤＮＡ合成装置に制御さ
れた孔のあいたガラス支持体を使用して、ホスホラミダ
イト方法の変法によりＣ５Ｇ構造遺伝子合成に使用され
るオリゴデオキシヌクレオチドを化学的に製造した。こ
のプロトコールによれば、脱トリチル化のためにジクロ
ルメタン中３％（Ｗ／Ｖ）ジクロル酢酸を、アセトニト
リル中飽和テトラゾールによるホスホラミダイトのライ
ン賦活化、ジ−エトキシホスフィンテトラゾリドによる
キャッピングおよび水性ヨウ素／　Ｔ　、Ｉｉ　Ｆによ
る酸化において使用した。（マチューチ（Ｍａｔｔｅｕ
ｃｃｉ）ら、１９８１、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティー（Ｊ、Ａｍｔｒ。
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　）　１０５　、３１８３　）。添加
サイクルの総所要時間は１４分であった。１０個の４７
−ｍ＃ｒ、すなわち第９図の切片Ａ−Ｊを９８，８％乎
均収率／工程（トリチル分析による）で得、Ｍａｔｔｔ
ｔｗｃｃｉ　　らの上述の方法で脱ブロックし、０．３
Ｍ酢酸ナトリウムからエタノール沈殿させ、アニーリン
グの前に１０％ポリアクリルアミド−原票変性ゲル上で
ｖ４製用ゲル電気泳動によって単離した。
および配列 第９図は所望の蛋白質のアミノ酸配列およびヒ）Ｃ５ａ
蛋白質をコード化する遺伝子をつくるのに必要な合成オ
リゴヌクレオチドの配ｔｆｊＬを示している。Ａｓよび
Ｆ以外のすべてのオリゴマーを１４ポリヌクレオチドキ
ナーゼで５′末端でホスホリル化した。この遺伝子のア
センブリーは２つの最初のアニーリング／連絡反応物（
各々オリゴマーＡ、Ｂ、Ｉ’！６よびに３よびオリゴマ
ーＣ，Ｄ。
Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを含む）を含んでいた。得られた９
　４　ｈｐおよびＩ　４）　ｈｐ二本鎖ＤＮＡ断片を１
０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後に単離し
、いっしょに連結し、それらの２３５ｂｐ産生物をゲル
電気泳動によって単離した。Ｃ５αをコード化している
構造遺伝子を含む２３５ｂｐＤＮＡ断片をｐＥＥ３’２
２．ベクターＤＮＡのＥｃｏＲＩｉ６よびＨｉｎｄｆｆ
１部位の間に挿入し、大腸菌に一１２菌株ＨＢ１０１の
能力細胞の中へと形質転換した。６つの形質転換体から
単離をれたプラスミドＤＮＡの制限分析によると、これ
ら６つのクローンのうち５つは正しいサイズのＥｃｏＥ
Ｉ／Ｈｉｎｄ■断片を含んでい念。こｎらのプラスミド
の各々の０５α遺伝子領域のヌクレオチド配列はマキサ
ム（Ｍａｚａｒｎ）ら、Ｍｔｔｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｒ
ａｏｌ。
６５．４９９（１９８０）の方法により決定された。
ＤＮＡ断片単離の方法および連結反応の条件は−ｒニア
テイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）モレキュ
ラー・クローニング０１ｏ１ｅｃｗｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）；ア・ラホラトリー・マニュアル、コールド・ス
プリング−ハーバ−（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　
）によって公開されているとおりである。大腸菌ｔｒｐ
ｊロモーターーオイレーターはもともとｐｔｒｐＬｌよ
り得られた（エドマン（Ｅｄｍａ　ｎ　）ら、（１９８
１）　ネイチャー（Ｎａｔｕｒ　）２９１．５０３）。
Ｃ５ａ発現プラスミド（２Ｃ５ａ−４８）に使用された
ｔデルプロモーター−オ（レータ−配列を含む３６０　
ｂｐ　ＥｃｏＲ１断片をプロＶ７＝７発現プラスミドｐ
ＰＦＺ−ＲＺ　（１９８５年７月３日公開のヨーロッパ
出願ｍ０１４７１７８号に記載）から単離された。
ヤロクイア・リポリプイカ培養液中のＣ５ａの同定この
方法はヤギ抗Ｃ５αおよびウサギ抗ヤギｒｇａ　（カッ
（ルＣＣａｐｐｍ１）　）をイムノプロットに使用した
以外は上述のプロレンニンについて記載し念ものと同一
であった。ヤギ抗ヒ）Ｃ５ａ抗体をマンデリノ（Ｍａｎ
ｄａデｉｎｏ　）ら、Ｊ　、　Ｉｒｒａｍｎｏ　ｌ。
Ｍｅｔｈｏｄ５３．４ｌ−５０（１９８２）の方法によ
り調製した。
ゴノし辷二謂 ｐＬＤ４０−１９８５年４月２４日公開のヨーロッパ出
願に記載 微生物 ＡＴＣＣ２０７７６−ｙｏｏイア−ＩＪボリリプカｐｃ
ＡｒｃｃＺＯ７８１ヤロウイア・リポリプイカＩ）Ｌ１
１２−ＰＣ−３０８６９の ＸＰＲ２による形質転換体 ＡＴＣＣ２０７７６ヤロウイア・リポリプイカＤＬヤロ
ウイア・リボリプイカＡＴ ＣＣ２０６８Ｂの５ｎａＥ■分解 ｐＬＳ−３による形質転換体 ＡＴＣＣ２０７７６ヤロウイア・リポリプイカＤＬヤロ
クイア・リボリプイカＡＴ Ｃ（：”２０６８８の未切断ｐＬＳ −３による形質転換体 ＡＴＣＣ２０７７７５ｎａＥ（開裂ｐＣ５ａＸ−３によ
るヤロウイア・リボリプイカ ｐＣ−３０８６９の形質転換体 ＡＴＣＣ２０７７８５ｎａＢｌ開裂ｐＸＸ−１１による
ヤロワイア・リボリプイ力ＰＣ −３０８６９の形質転換体 ＡｒｃｃＺＯ７７９ＳルαＢ！開裂ｐＸＸ−２，２によ
るヤロウイア・リボリプイカＰＣ −３０８６９の形質転換体 ＡＴＣＣ２０７８０５ｎａＢＩ開裂ｐＸＸ−３３による
キロ９イア・リボリプイカＰＣ −３０８６９の形質転換体 ＡＴＣＣ２０７９４ｐＬＤ５６によるヤロクイア・リボ
リプイカＰＣ−３０８６９の 形質転換体 ＡＴＣＣ２０７９５Ｎｒｕｌ開裂ｐＬＸ−３４によるヤ
ロワイア・リボリプイカＡＴＣＣ ２０７９４の形質転換体 これらの菌株はブダイスト条約下に、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａ町ｒｉｃａルＴｙｐ
ｅ　ＣｕｌｔＳｒｇ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（メリ
ーランド州ロックビル）に寄託されており、この出願に
特許が付与されれば上記寄託機関はこれら寄託菌を永久
保存し、公衆が容易に入手し得るものである。
これらの寄託菌は、本出願が係属中は、アメリカ特許商
標庁の長官が３７ＣＦＲ１，１４および３５ＵＳＣ１２
Ｂ’Ｊ６よび本山Ｍまたはその関連出願が出願された国
の特許法にもとづき正当とみとめる者によって入手でき
る。寄託菌の公衆による入手についてのすべての制限は
、特許付与とともに不可逆的に取り除かれる。
キロ９イア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７７４（７アイ
ザー・インコーホレーテッドのカルチャー・コレクショ
ンにおいてＰＣ３０８６９として登録）の分類学的研究
はＪ、Ｒ，デジーウ（Ｄｇ　ｚｅａｕｗ）博士によって
行なわれた。使われた方法はＪ、Ｌ。
ロツダー（Ｌｏｄｄｇｒ）により０ジ・イースト（Ｔん
ｅＹｅａｓｔ）”’第二版、Ｎ、オランダ（Ｈｏｌｌａ
ｎｄ）　　パブリッシング社、アムステルダム、１９７
０において推奨されている方法である。
ＣＢ５５９９、すなわちカンジグ・リボリプイカ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　１ｉｐｏｌ／１ｉｃａ）種についてのタイ
プ・カルチャー（ジ・イースト）°（前出））およびＣ
Ｂ１６１２４、すなわちサッカロムコブシス・リポリプ
イカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｃｏｐｓｉａ　１ｉｐｏｌｙ
−ｔｉｃα）のタイプカルチャー（′ジ・イースト“第
三版）を比較のために使用した。以前には、この種はエ
ンドミコプシス・リボリプィ力（Ｅｎｄｏｍｙ−ｃｏｐ
ａｉｓ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）とも称した。その不完
全な状態がカンジグ・リボリプイカ（Ｃａｎｄｉｄα１
ｉｐｏｌ’／ｌｉｃα）である。これらの種の分類学的
位置はファン・デル・バルトおよび７オン・アルブロス
、アンドニー−ファン・リューベンホーク（ｖａｎ　　
ｄｇｒ　Ｗａｉｔ　　ａｎｄ　　Ｖｏｎ　Ａｒｘ、Ａｎ
ｔｏｎｉａＶａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ）、４６，
５１７−５２１（１９８０）によって決定きれた。今や
好ましい学名はヤロウイア・リボリプイカ（Ｙａｒｒｏ
ｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ　）である。
菌株ＰＣ−３０８６９の培養上、形態宇土および生理学
上の特性は“ジ・イースト（ＴｈｇＹａα５ｔｓ）、−
第三版、クレガーーファン・リジュ（ＫｒｅｇｇデーＶ
ａｔｓ　Ｒｉｊ、）ｆｌｊＡ著、アムステルダムのエル
スヒ７−・サイエンス・パブリツシャー（ＥＬｓｇｖｉ
ｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）Ｂ、Ｖ、
１９８４年出版の４０６−４０８頁のサツカロミコプシ
ス・リボリプイカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎ’／ｃｏｐｓ
ｉｓ　１ｉｐｏｌｆｔｉｃα）として挙げられた種の標
準的記載と一致する。
表　　　１ ＰＣ−３０２６５ＮＲＲＬ　　ＹＢ−４２３ワイルド型
（およびＣＢ５６１２４）、ディプロイド上記「ジ・イ
ースト」第 三版中の菌株 ＰＣ−３０２８６ＣＢ５５９９、「ジ・イ　ワイルド型
−スト」第二版甲の菌株　ノ・プロイドＰＣ−３０８６
９下記参照　　　　　　　　ＭＡＴＢ　　ｂｉ。
−６Ｌｇｕ２ −４０　　ｓｐｒ ＰＣ−３０８６９はヤロウイア・リポリプイカＰＣ−２
２２０８、すなわち７アイザーの土壌より単離された菌
株およびヤロウイア・リボリプイカＰＣ−３００２６、
すなわちＮＲＲＬＹ−１０９４のサブカルチャーを遺伝
子組換えてつくられたものである。ＰＣ−３０８６９は
（１）活性な細胞外アルカリ性プロテアーゼをつくらな
い、（２）生育のためにビオチンを必要とする、および
（３ＪＬ−ロイシン源を必要とする点でそのワイルド型
親株とは表現型が異なる。
酵母エキス−４プトンーグルコース（ＹＥＰＤ）ブロス
中でのＰＣ−３０８６９の長期生育の間、出芽細胞は卵
形で、平均サイズ２．６Ｘ５．５ミクロンである。ＹＥ
ＰＤ寒天においては、偽菌糸体Ｓよび真の菌糸、体が顕
著であった。発芽胞子はほとんどが複数の位置に単一物
として存在する。カロチノイド色素はほとんど見出され
ない。この培養物は上記種についての認証された試験菌
株と交叉したＢ”交配ハブロイドとして挙動する（表５
）。
典型的子のう胞子形成はＹ８寒天に見られる。炭素同化
パターンは表２に示される。発酵はない。
アンモニウムイオンと尿素（しかし硝敗塩ではない）を
単一の窒素源として使用される（表３）。
菌株ＰＣ−３０８６９はビタミン類であるチアミ／とＤ
−ビオチン（表４）を必要とする。チアミンのみがこの
培養物のワイルド型親株によって必要とされる。３７℃
で伺ら生育は見られない。
表　　　２ 炭素同化（ｉｉ１ １、Ｌ−アラビノース　　　−一一一 ２、ゼロビオース　　　　　−ｍ−− ３、エリスリトール　　　　＋　　　　十＋＋千十十　
　峠＋＋４、Ｄ−ガラクトース　　　−　　　　−−一
５、Ｄ−グルコース　　　　＋　　　　−１−１−＋−
＋＋−１−＋＋−１−６、イノシトール　　　　　−　
　　　−−−７、乳糖　　　　　　　　−一一一 ８、麦芽糖　　　　　−一一一 ９、Ｄ−マンニトール　　　＋　　　　＋十＋十＋÷　
　＋＋モ１０、．７フイノース　　　　　−−−−１１
、リビトール　　　　　　　−−一−１２、Ｄ−リボー
ス　　　　　−１）　　−−−１３、Ｌ−ラムノース　
　　　−−一−１４、可溶性でんぷん　　−−一− １５、蔗糖　　　　　　　−−一− １６、トレハロース　　　　　　−−−−１７、Ｄ−オ
キシロース　　　−−−−−１８、コハク酸　　　　　
　＋　　　−Ｈ＋−Ｈ＋　　セ→１９、クエン酸　　　
　　　＋　　　−ｆ−）−１−＋＋＋　　　−）−１−
ｔ−（αｊ　基本となる培地はさらに１０　？７ＬＣｇ
／ｌのＤ−ビオチンと１４９ｍ９／ｌのＬ−ロイシンエ
チルエステル・ＨＣＬを添加したバクト酵母窒素ベース
であって１００■／１のＬ−ロイシンを供給した。
（ｂｌ　　クレガーー７アン壷すジュ（Ｋｒｅｇｅｒ−
ταルＲｉｊ）　　（前出文献） 表　　３ ２、ＫＮＯ３−−−− ３、尿素　　　　　　　　十　　　÷　　÷　　÷（α
）基本培地は１１６■／ｌのケト−インカプロン酸ナト
リウムを添加したバクトー酵母炭素ベースであって１０
０■７ｔのＬ−ロイシンと同等量を供給し、さらに１０
ｍｃｇ／ＬのＤ−ビオチンを添加した。
（ｂｌ　　クレガーーファン拳すジュ（ＫデｅＱａデー
τａｎＲｓｊ）　（前出文献） 表　　４ １、　なし　　　　　　　　−　　　　　ｔｒ　　　ｔ
ｒ　　　−２、チアミン　　　　士　　　−Ｈ−１−利
子　　−、ＨＣｌ ３、　　Ｄ−ビオチン　　　　　　　　　　　ｔｒ　　
　　　ｔｒ　　　　　ｔｒ（ｃｌ　　基本的培地はバク
トービタミンーを含まない酵母ヘース＋１４９η７ｔの
Ｌ−ロイシンエチルエステル・ＨＣｌであって１００９
／ｌのＬ−ロイシンを供給する。
（ｂ）　　クレーガーーファン・リジ：ｘ−（Ｋｒａｇ
ｅｒ−ｖａｔｓＲ４ｊ）　（前出文献） （ｃ）　　上述の如＜　２００　ｍＣｇ／　Ｌのチアミ
／−ＨＣＬおよび／または１０　ｍｅσ／ＬのＤ−ビオ
チン表　　　５ なし　　　　　　　　　　　←　　−−３０２６４（Ａ
交配型）−＋−＋−−÷３０２６７（ｆｆ交配型）−Ｈ
−Ｈ斗　　−ｔａ＋　　培養物３０２６４と３０２６７
は、Ｌ、！、ウイツカーハム（Ｗｓｃ＆ｇｒＡｃＬｍ）
博士により提供され喪、正反対の交配型を有するハブロ
イド菌株である。これらは正式にはサイエンス（Ｓｃｉ
ｔｔルｃｇ）１６７．１１４）（１９７０）に記載され
ている。
（６１３０２６４はクイツカ−ハムのシー・リボリプィ
カ（Ｃ，１ｉｐｏｌ’／１ｉｃａ）　ＹＢ−４２１であ
る。
（ｃ）３０２６７はライツカ−ハムのシー・リポリテイ
−１）ＹＥ−４２３−Ｉ　Ｚである。
表　　　６ 細胞形態　　　　　卵形　　卵形　　卵形　　卵形生長
再生産　　　　　出芽　　出芽　　出芽　　出芽発酵　
　　　　　なし　　なし　　なし　　なし３７℃での生
育　　なし　　なし　　なし　　なしコロニー生育　　
これら３つの培養物は同じ様に生育し文献の記載とも一
致し九。偽 および真の菌糸体顕著。発芽胞子 が存在し、はとんどは単一物とし て胸膜の位置にある。
（α］　クレガーーファン・リジュ（Ｋｒｅｇｅｒ　−
ｖαルＥｉｊ　）　（前出文献） ＰＣ−３０８６９は本明細書記載のヤロウイア・リボリ
プイカの他の菌株とは、それらのフェノタイプの比較か
ら明らかなとおり、異なっている。
（表７および８） ＡＴＣＣ２０２２８（ヌーベｋ（Ｎｗｂｍｌ　）ら、米
国特許第４，１５５，８１１号）の特徴はＣＥＳ５９９
とＣＥＳ６１２４についてのタイプ菌株のように挙動す
るワイルド型栄養である。特に、生育のためにウラシル
、ロイシンまたはビオチンを必要とせず、ゼラチンを液
化する。
ＡＴＣＣ２０６２８（ドジーユ（ＤｇＺｓｇｚｕ）ら、
米国特許第４，４０７，９５３号）はＡＴＣＣ２０２２
Ｂと異なり、追加のロイシンを生育の念めに必要とする
。ＡＴＣＣ２０２２Ｂの如くウラシルまたはビオチンを
必要としない。
ＡＴＣＣ２０６８８（ヨーロッパ出願０１３８５０８）
は培地にウラシルとロイシンを両方とも添加したときの
み生育する。ＡＴＣＣ２０２２８＃よびＡＴＣＣ２０６
２８とＡＴＣＣ２０６８８との相違はＡＴＣＣ２０６８
８がウラシルを必要とする点である。ＡＴｃｃ　２０６
８８はビオチンを必要とぜず、ゼラチンを液化する。
培養物ＰＣ−３０８６９は上記菌株すべてと異なる。Ｐ
Ｃ−３０８６９は生育のためにビオチンとロイシンを必
要とするがウラシルを必要としない。そしてゼラチンを
液化しない。
表　　　７ Ｃ１３；５９９　　　　刊÷−＋＋１−−＋＋＋−刊→
ＣＥＳ６１ｚ４　　−）＋Ｉ−−）＋＋−＋＋−（−−
）−＋−＋−＋−ｃ（２ｏ２２ｓ　　＋＋−＋−−＋−
＋−＋−−ｔ−ｔ−＋−刊→ＡＴｃｃ１６２Ｂ　　−Ｈ
−１−−−）＋＋−刊→ＡＴＣＣ２０６８Ｂ　　刊÷　
　−千 ＰＣ−３０８６９＋＋＋　　　−モ→　　　−培地全体
では１６−Ｌｓ’／ｌのバクトービタミンを含まない酵
母ベース＋１００■／ｌのウラシル、１００ｒ１ｙ／ｌ
のＬ−ロイシン、１０　ｒｎｃｇ／　ＬのＤ−ビオチン
２よび２００　ｍｅｇ／　ＬのナアミンＨＣ１を含んだ
。
表　　８ ゼラチン液化 ＣＢ５５９９　十 ＣＩ？５６１Ｚ４　　　　　　＋ ＡＴＣＣ２０２２Ｂ　＋ ＡＴＣＣ２０６Ｚ８　十 ＡＴＣＣ２０６８＋ ＰＣ−３０８６９− 培地は１２０９／ｌのゼラチンおよび１ｆ３．’＃／ｌ
のバクトービタミンを含まない酵母ベース＋１００ｍｙ
／Ｌのウラシル、ｘｏｏｗ／ｌのＬ−ロイシン、１０　
ｒｎｃｇ／　ＬのＤ−ビオチン、およびＺ　００　ｍｃ
ｇ／　ＬのチアミンＨＣ１ｆ含んでいた。
ＸＰＥ２遺伝子の配列分析 プラスミドｐＬＤ５７、ｐＬＤ５Ｂ、ｐＬＤ６２（第１
図）２よびｐＬＤ８４＃よびｐｒ、ｎｓ　６　（下記参
照）からつくられた重複制限断片について化学的分解方
法（マクサム（Ｍａｒ；ａｍ　）ら、１９８０．メ７”
、／ズ−エ７チモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｘｚ！／ｒｎ
ｏＬ、）、６５゜４９９）によってクローン化ＸＰＥ２
遺伝子のＤＮＡ配列分析を行なった。その結果、クロー
ン化酵素ゲノムＤＮＡａ　は本当に細胞外アルカリ性プ
ロテアーゼのための遺伝子を含んでいることがわかった
。ＸＰＲ２，遺伝子のヌクレオチド配列と該ヌクレオチ
ド配列から導かれる、シグナル配列を有するアルカリ性
プロテアーゼ前駆体のアミノ酸配列は第３図に示されて
いる。この細胞外プロテアーゼのアミノ酸配列の大部分
は未知（オグリジアク（ＯｇＱｄｚｉσｋ）らの上記文
献）であって、この明Ｓ書で初めて示される。さらに、
細胞外プロテアーゼの発現と分泌のために必要な配列も
本明細書ではじめて示される。アルカリ性プロテアーゼ
、その先駆体およびシグナル配列全コードしたＤＮＡ配
列は１３６ｚ塩基対からなる。（第３図）。このポリイ
プチド鎖の一次構造はヌクレオチド配列から４５４個の
アミノ酸残基であることがわかった。アルカリ性プロテ
アーゼは細胞の中では前駆体の形で合成され、プロテア
ーゼで処理して分泌すなわち成熟形にされる。ヌクＶオ
チド配列から導かれたＮ−末端アミノ酸配列の分析によ
り前駆体分子中に推定上のシグナルペプチドが存在する
ことがわかった。このシグナルペプチドは２２個のアミ
ノ酸残基を有し、その構造上の特徴はより高等な真核お
よび原核シグナルペプチドの特徴に類似している（パー
ルマン（Ｐａｒｌｍａｎ）ら、１９８３　、Ｊ、Ｍｏ１
．ＥｔｏＥ、１旦７，３９１）成熟したアルカリ性プロ
テアーゼの公知の２５個のＮ−末端アミノ酸（オグリジ
アーク＜Ｏｇｒ’／ｄｚｔａｋ）ら、１９８２　、Ｊ、
Ｇａｎ、Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、１２８＊１２２５）と一
般的に一致する予測され九アミノ酸配列における領域は
シグナルペプチドと２つのトリプシンタイプの開裂部位
（Ｌｙｓ−ａｒｙ）’ｒ：有する１５７個のアミノ酸配
列の後にくる。この開裂部位を使用してプロ領域をプロ
１（−１３５〜−９８〕およびプロ２（−９７〜−１）
に分けることができる。第３図参照。成熟したアルカリ
性プロテアーゼは上記ヌクレオチド配列から導かれるよ
うに２９７個のアミノ酸を有する。このヌクレオチド配
列からのプロテアーゼの種々の形につい、て予測される
アミノ酸配列はこの＃累の精製された形のサイズと一致
する。アルカリ性プロテアーゼ前駆体構造配列に加えて
、約７００　ｂｐの５′−７ランキング配列および６０
０　ｈｐの３′−フランキング配列が決定された。これ
らの領域を分析すると、それらが他の真核プロモーター
およびターミネータ−に類似の配列を含み、アルカリ性
プロテアーゼ発現に不可欠のようであることがわかった
。
上述の如く、ヤロウイア・リポリプイカを形質転換し、
その遺伝子を突然変異の相補によってクローニングする
方法であって、分泌されたアルカリ性プロテアーゼをコ
ードしているＸＰＲ２，遺伝子をＸｐｒｆ３突然変異の
相補によりクローニングすることを含む方法はヨーロッ
パａｌｏ　１３８５０８に報告されている。
本明細書において記載し九方法は、ヤロウイア・リボリ
プイカ宿主菌株をベクターｐＬＤ４０甲のヤロクイア・
リポリプイカ遺伝子ライブラリー〇ＢＱｔ　１部分分解
物で形質転換することを含む。該ベクターは、ヤロワイ
ア・ＶポリプイカのＬＥＵ２領域を含む小断片ならびに
３ＥｃｏＥｌ、４Ｅｅ。
ＲＶ、　６ＡｖａＥ、　ＩＢｇｌ−ＴＩ、１＃ｃｏｌ、
ＩＡｐａｌ、２ＸｈｏＩおよびＩＪ？ａｔＺＩ　エンド
ヌクレアーゼ制限部位を有することを特徴とする。ヤロ
ワイア・リポテイカＸＰＲ２形質転換体の１つを使用し
て、例１に記載の如く発現／分泌ベクターの構成に使用
するためにヤロタイア・リボリプイカＮＲＥＬＹ−１０
９４からワイルドタイプ遺伝子（ｐＬＤ８４とｐＬＤ８
６）を回収する。
ｐＬＤ２５（１７：ＰＯ１３８５０８）のクローン化Ｌ
ＥＵ２遺伝子のＤＮＡ配列分析は、重複制限断片につい
て化学的分解方法（マクテム（Ｍａｚａｒｎ）ら、１９
８０、メンツズ・エンチモル（ＭｅｔｈｏｄｓＢｎｚ／
ｒｎｏ１．）６５．４９９）によって行なった。
マレイン酸β−インプロピルＣＩＰＭ）脱水素酵素コー
ディング領域と適当な読み取りフレームを位置決定する
ために、ニス・セレビンアエ（Ｓ、ｃｔｔｒｅｖｉ　−
ａｉａｅ）　（アンドレアディ、ｘ、　（Ａｎｄｒｅａ
ｄｉｓ　）ら、１９８４゜ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｇｒｎ、）２５９　、８０５９　）のＬ
ＨＵ２遺伝子について以前に決定されてい喪予測アミノ
酸配列を考慮すると有利であった。ニス・セレビシアエ
蛋白質配列の領域と相同のアミノ酸配列をコード化して
いるヤａクイア・リボリプイカゲノム配列の領域を同定
した。２．８Ｋｂ　ＬＥＵＺ遺伝子のヌクレオチド配列
および該ヌクレオチド配列から導かれるβ−ＩＰＭ脱水
素酵素のアミノ酸配列は第１２図に示されている。？ら
に、ヤロウイア・リボリプィカβ−ＫＰＭ脱水素＃素の
発現に必要な配列が本明細書に２いて初めて記載されて
いる。この４０５個のアミノ酸からなる蛋白！？コード
化しているＤＮＡ配列は１２１５個の塩基対からなる（
ＭＪ１２図）、、β−ＫＰＭ脱水素酵素コード化配列に
加えて、約７９８塩基対の５′−フランキング配列と７
９７個塩基対の３′−フランキング配列（ＡＴＴ翻訳終
了コドンを含む）を決定した。これらの色域を分析する
ことにより、それらの領域が他の真核プロモーター２よ
びターミネータ−を類似の配列を含み、発現にとって不
可欠であることがわかった。
ヤロウイア・リポリプイカＬＥＵ２遺伝子の５′−上流
領域は、翻訳開始部位より７８塩基対前および提案され
たｍ　ＲＮ　Ａ開始部位の３０塩基対前にＴＡＴＡＴＡ
ＴＡ配列を含む。真核細胞の転写開始の之めに重要なも
う１つの配列は、ＬＥＵ２遺伝子において、ＡＴＧより
一４８ｂｐ″′ｃある予測転写開始部位の７４６ｐ前に
位置するＣＡＡＴボックスである。
３′−下流領域は、ニス・セレビシアエの転写終了のた
めに重要なものとしてツアレット（Ｚａｒｔｔｔ）ら、
セｗ（Ｃａｌｌ）２Ｌ８．５６３（１９８２）によって
提案された５’−ＴＡＧ・・・７’Ａ（力ＧＴ・・・Ｔ
ＴＴ−３’配列と相同の終止コドン（ＦＡＡ）の後に７
２〜１２０ヌクレオチドの配列を有する。
例　　１゜ 使用された宿主菌株はＡＴＣＣ２０７７４ＣＭＡＴＢ　
　１１ｍ１２　４０　　ｂｉｎ−６ｚｐｒ２−１００２
）であった。ＸＰＲ２形質転換体であるヤロウイア・リ
ボリプイカＡＴＣ０２０７８１はスキムミルク指示平板
、続いてロイシン欠失プレートよりのレプリカ平板法に
よって帯状物を形成するコロニーとして見出された。染
色体ＤＮＡはこの形質転換体からヨーロッパ特許出願Ｍ
ＰＯ１３８５０Ｂの方法によって装造され分泌されたプ
ロテアーゼについての遺伝子を発見するのに使用した。
染色体ＤＮＡは部分的にｎｇｔｘ酵素により分解され、
結合されて大腸菌（Ａ’、ａｏＪｓ）レプリコンと上記
ベクターからのアンピシリン耐性遺伝子を有する断片を
環化し、大腸菌を形質転換するのに使用した。
染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　′ｔ−３ａＬＩ酵素で分解してサラ
リーン実験に使用し、この実験により上記形質転換体の
正常ＬＥＵ２領域はかきみだされていないことがわかっ
た。（プローブとして、ｐＬＤ４０に含まれているＬＥ
Ｕ２断片に対して正しく５′で結合するＬＥび２領域の
５２０　ｈｐ　５ａｉＩないしＥ　６　ｏ　Ｅ　Ｉ断片
を使用した。）したがって、ヤロウイア・リボリプイカ
にライブラリー・プラスミドを組込むには相同性が必要
なので、ＸＰＲお領域が組込み部位でなくてはならない
、３つの、重複してはいるが異なるプラスミド、ｐＬＤ
５７、ｐＬＤ５ＢおよびｐＬＤ６２をまずヤロウイア・
リボリプイカＡＴＣＣ２０７８１より回収した。
それらは第１図に示されている。成熟した分泌されたプ
ロテアーゼ蛋白質の最初の２５個のアミノ敗残基の公知
の配列にもとづくＸＰＲ２遺伝子の丸めの合成オリゴヌ
クレオチドプローブによるハイブリダイゼーション（第
２図および第３図）は、分泌された蛋白質のための遺伝
子がクローン化されていることを示した。回収された遺
伝子がワイルド型のコピーと突然変異体コピーのどちら
を表わしているか決定するために、受容体ヤロウイア・
リボリプイカ菌株をｐＬＤ５Ｂで形質転換した。
プロテアーゼ陽性形質転換体がいずれのロイシン依存性
形質転換体からも生じなかったので、ｐＬＤ５８は上記
遺伝子の突然変異体アレルを含むものと結論された。
ワイルド型菌株ＮＲＲＬ　１’−１０９４に存在するＸ
ＰＲ２遺伝子の形は大腸菌コロニーノ〜イブリダイゼー
ション実験によって得られた。プローブとして、配列デ
ータから全構造遺伝子を含むことが予測されていた２６
６　Ｐｗ％ＩないしＥａｏＲＩ断片を使用した。ｐＬＤ
４０のＮＲＲＬ　Ｙ−１０９４ＤＮＡの５ａｓ３Ａ部分
分解断片のオリジナルライブラリー（ヨーロッパ出願第
０１３８５０８号に記載）から、ハイブリダイゼーショ
ンでプローブを形成したいくつかのコロニーを得た。こ
れらのコロニーのうち２つは非常に類似のプラスミドｐ
ＬＤ８４とｐＬＤ８６を含み、これらを使用して発現ベ
クターとした０両方のプラスミドとも、第３図において
配列がそこから開始するＸＰＲ２領域の同一の５′末端
、すなわちＳαｓ３１部位（これは該ベクターに結合し
て該ベクターのＢａ５Ｈ１部位を再生し九、）を含む。
各々プロテアーゼのための構造遺伝子すべてと予測され
た翻訳ターミネーターを含みＮＲＲＬ　　Ｙ−１０９４
菌株のＸＰＲ２領域からの約４〜ｓｈｈ総挿入体を含む
。ｐＬＤ８６中の挿入体は、３′末端において余分の数
百の塩基対を含む。ＥｇｔＮ部位（塩基対２６５５）に
限り発現ベクター構成のために３′末端を使用したので
、これら２つのプラスミドは第３図の配列において機能
的に同一の同じＤＮＡを供給した。
ヤロウイア・リボリプイカにかいてプロレンニンを発現
させ分泌させるに使用されるために組込み可能なりロー
ユングベクター中で種々の７・イブリッド遺伝子を構成
する。そのような方法により、ふつうのＤＮＡ配列の延
長領域を占める数種の異なるプラスミドをつくれる。事
実、変調構成工程を使用して、予測され九ＸＰＥ２シグ
ナルペプチドプロセシング部位に３′で挿入されたプロ
レンニン遺伝子、予想されるプロｌ−プロセシング部位
および成熟アルカリ性プロテアーゼを生成することが知
られている開裂部位を有するベクターを組立てた。一般
に、外来遺伝子を発現のための酵母プロモーター配列と
ターミネータ−配列との間に挿入することが望ましい。
ハイ、ブリッド遺伝子配列のＮ−ターミナル部位がプラ
スミド構成が異なれば変化するが、プロレンニン構造遺
伝子配列、ＸＰＲ２ターミネータ−配列、およびシャト
ルベクターＤＮＡは各発現プラスミド構成とも同じであ
ることがわかった。この同一のプロレンニン構造遺伝子
断片とターミネータ−／ベクタープラスミドを各発現プ
ラスミド構成において下記の如く使用することを計画し
た。異なるプロレンニン発現または分泌プラスミド構成
は、プロレンニン遺伝子配列の前に位置するＮ−末端ア
ルカリ性プロテアーゼ前駆体配列の長さの分だげＸＰＲ
２遺伝子遺伝子プロモーターナぐ下流の領域で異なる。
したがって、各発現プラスミドのプロモーター断片成分
はＸＰＲ２−プロレンニン接合の領域で可変の配列とな
るよう設計された。すべての発現または分泌ベクターは
３つの成分断片を含む同様の連結反応によって組立てら
れた。
ターミネーターベクタープテーム（ｐｔａｒ惰）４を構
成するために使用される実験段階は第４図に示されてい
る。まず、合成リンカ−を、転写終了シグナルおよびポ
リアデニル化シグナルを含む、ＸＰＥ２遺伝子の３′末
端を含む断片に連結した。
かんたんにいうと、プラスミドｐＬＤＢ４をエンドヌク
レアーゼＫｐ％Ｉで開裂し、第４図に示した合成二本鎖
リンカ−ＤＮＡで連結された。この連結生成物をエンド
ヌクレアーゼＨ４％ｄＩＩＩトＢｇｔＩで開裂し、７６
０塩基対断片を上記と同じ２つのエンドヌクレアーゼで
線状化したプラスミド９ＬＤ４）に挿入してプテーム４
を得た。プラスミドプテーム４′ｆｔ：その制限地図で
同定した。ＥｅｏＲＶ、ＥｃａＲ１％Ｋｐｓｌｓ　Ｂｇ
ｌｌ−Ｈ４＊ｄｆｌおよびｓｇｔｘ−Ｂｅ＠を使用した
一連の制限エンドヌクレアーゼ分解物の結果を分析した
。これらの分解物は、ヨーロッパ出願第０１３８５０８
号に記載のシャトルプラスミドｐＬＤ４）中に合成リン
カ−とＸＰＥ２遺伝子の１完全”３′−末端が存在する
ことを確認するのに適当な断片である。この７．３＆＆
ターミネータ−ベクターの部分地図は第４図に示されて
いる。
第５図はヤロウイア・リボリプイカにおけるプロレンニ
ンの分泌に使用される当初のプラスミドの構成を概略的
に示している。その制限地図は第５図に示されて、いる
。プロレンニン分泌プラスミドの構成はプロレンニン構
造遺伝子配列のほとんどを有する断片をつくることによ
って開示された。
プロレンニン残渣６〜３６５をコード化した配列を有す
る１０８０塩基対Ｂａ１ｌ　−Ｂａ％Ｈ１（部分）ＤＮ
Ａ断片を大腸菌ＣＥ、ａｏｌｉ）プロレンニン発現プラ
スミドｐＰＦＺ−８４）から単離された。（プラスミド
ｐＰＦｊｌ−８４Ａはプロレンニン発現プラスミドｐＰ
ＦＺ−３２６）誘導体で、その構成は１９８５年７月３
日公告のヨーロッパ出願第１４７１７８号に記載され、
制限断片置換を使用する合成オリがヌクレオチドによる
突然変異によッテ生成された。特に、ｐＰＦＺ−８４Ａ
はｐｐｐｚ−Ｒ２とはプロレンニンアミノ酸残基２１４
（Ａｓ％→Ａａｐ）と２８６　（Ａｍｐ−＊Ｇ１１１）
における２つの塩基対のみが異なり、いわゆるプロレン
ニンＡアルレをコード化するが、両プラスミドとモア”
ロレンニンのための望ましい配列を含み、この実施例に
おいて機能的に均等である。ＸＰＲ２プロモーター成分
断片（アルカリ性プロテアーゼ先駆体のためのコード化
配列１〜１５７とプロレンニンのためのコード化配列１
〜５を含む）を下記の如くつくった。プロモーター領域
とアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の５′末端をＸＰＥ２
サブクローンプラスミドｐＬＤ９０から単離した。
この断片を下記構造を有する合成断片と連結した：ｒａ
ａｄｉｓｇ　　ｄｉｒｇｃｓ４ｏ＊−一−−）この配列
は、Ａｖａｌ接着末箋、次いでアルカリ性プロテアーゼ
ブローベブチドの最後の９つのコドンのための配列、次
いでプロレンニンの最初の４つのアミノ酸をコード化し
た配列およびＢ６惰Ｈ１部位における末端を含んでいる
。プロ毫−ター成分断片は、合成断片と８７０　ｂｐＨ
ｔｓｄｆｌ−ＡｖａＩ断片をＴ４リガーゼとともに使用
した標準的連結反応、次いでＨｉｎｄｍとＥａｍＨＩに
よる開裂によってつくられた。得られた連結配列は、適
当な９１６塩基対Ｈ４５ｄＴＪｉ−Ｅａｖｓ、ＨＩ　Ｄ
ＮＡを選別するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した。
このハイブリッド遺伝子の３′−末端は上述のターミネ
ータ−／ベクタープラスミドプテーム４から得られた。
プラスミドプテーム４をＨ（％ｄｌｌ［で分解し、約７
−３　ｋ　ｈ　Ｈｉｎｄｍ　−Ｂｅ１ｌターミネータ−
／ベク）−ＤＮＡ断片（ｘＰＥ２ターミネータ−１ＬＥ
Ｕ２選択可能なマーカーおよびｐＢＲ３２２を含む）を
アガロースゲルから単離した。
プロレンニン発現／分泌プラスミドｐＬＳ−３を、３つ
の成分ＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄｍ−Ｂａｔｌ開裂プテーム
４プラスミドであって、９１　Ｓ　ｂｐＨ４ｎｄ斑プロ
モーターと１０８０６Ｆ　ＥａｆＩ＠ｅｌ−Ｅｅｌｌプ
ロレンニン遺伝子を有する断片を含むもの）をインキエ
ベートすることによって組立てられ、Ｔ４リガーゼの存
在下に上述のように構成された（第５図参照）。この連
結混合物を使用して大腸菌に１２Ｍ株ＭＭ２９４をダシ
ヤード（Ｄ８クーデｔ）ら、ジーン（Ｇａ％−）互、２
３−２８（１９７９）のＣａＣ１ｖ法で形質転換した。
いくつかのプラスミドはアンピシリン耐性選別形質転換
体から単離され、プラスミドｐＬＥｌ−３を制限地図に
よって確認した（第６Ａ図）。このプラスミドのＸＰＲ
２−プロレンニン領域の配列を決定して合成ＤＮＡの適
当な配列および所望の断片の適当な接合を確認した。
プラスミドｐＬＤ９０はｐＬＤ８４からのサブクローン
を含む。ＸＰＲ２６）プロモーター領域のＰｖ％１部位
々いしターミネータ−領域のＥｅｏＥ１部位のＤＮＡの
領域をｐＢＲ３２２６）Ｈ４％ｄｍ部位へ次のようにし
てサブクローンした。数μｔのｐＬＤ８４を上述の２つ
の制限酵素によって分解した９次いで分解されたＤＮＡ
分子の粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラ（Ｋ
Ｊｇｓｏｗ）断片と接着した。次いでキナーゼ処理し九
Ｈ（％ｄＩＩＩリンカーにューイングランドバイオラブ
ズ（７Ｖ＃曽Ｅ＊ｇｌｔｓｓｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）製の
ＣＡＡＧＣＴＴＧ）を上記末端にＴ４ＤＮＡリガーゼと
ともに加えた。
過剰のリンカ−を除き、Ｈ４％ｄＴＪｉ粘着末端をＨ４
ｓｄｍ酵素による分解によりつくった。ＤＮＡ分子の混
合物を調製用アガロースゲルにかげ、所望の２ｈｂ帯を
切り出し、精製し、Ｈ１％ｄｍ分解、細菌性アルカリ性
ホスファターゼ処理ベクターｐＢＲ３２２との連結反応
物に加えた。この連結混合物を使用して能力大腸菌を形
質転換した。ｐＥＲ３２２６）ＥａｏＲ１部位に近いＸ
ＰＥ２ターミネータ−のＥｅ　ｔｔＲ１部位による定位
はｐＬＤ９０で逆位はｐＬＤ９１と称した。
ｐＬＳ−３に含まれるＸＰＲ２プロモーター領域の５′
末端はＦｗｓ１部位であって、第３図の配列の開始部か
ら約２８０ｂｐのところである。レジデントｚｐｒ２部
位からはなれた部位にあるゲノムに組込まれる場合、こ
の量のプロモーターのみのコントロールの下に野性型プ
ロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドは形質転換体に大量
のプロテアーゼ（スキムミルク平板上の透明帝域によっ
て判定）をつくらせることはできないことがわかった。
ｐＬＳ−３が短い“不完全な”プロモーターを含む場合
、上記プラスミドとレジデント野性型ＸＰＲ２遺伝子と
の間の組換えから得られた組込み体は、プロキモシン縮
合生成物の発現のための完全なプロモーターを生成する
がプロテアーゼ発現のための不完全プロモーターは生成
しないであろうことに注目した。類似の遺伝子分裂タイ
プの実験をエスーセレビシアエ（Ｓ、　ａｍｒｅｖｉａ
ｉａｍ）アクチン遺伝子についてジョートル（Ｓｈｅデ
ｔｉｍ）　ラ（サイエンス（Ｓｅｔａｍｏｍ）２１７，
３７１−３７３．１９８２）の方法によって行なった。
発明者らの予測どおり、ｐＬＳ−３によるいくつかのロ
イシン−欠失形質転換体は事実、今やプロテアーゼが欠
失している。プロテアーゼ欠失形質転換体は１ａｓ２に
おける遺伝子転換体のような望ましくない副生成物より
はＸＰＲ２部位での望ましい組込み体であるらしい。受
容体菌株ＡＴＣＣ２０６８８について、発明者らは、未
切断ｐＬＳ−３が６．５％プロテアーゼ欠失形質転換体
を生成し、一方、Ｓ％ａＢｌ−切断プラスミドが約７０
％のプロテアーゼ欠失形質転換体を生成することを見出
した。この形質転換の遺伝子分裂の態様を使用して、す
べての形質転換体の中の正しい組込み体をさがすための
多数のサウザーン（Ｓｏ％ｔｈ−７％）プロット実験の
必要性を回避した。
ＸＰＲ２プロモーター（第３図に配列が示されているよ
うに開始する）のコントロールの下に野性型プロテアー
ゼ構造遺伝子を含むプラスミドはリゾ２部位以外の部位
でヤロウィア・リポリプイカに組込まれると充分な量の
プロテアーゼを発現できる。しかし、これらの種類の組
込み体から外来遺伝子を充分に発現させるにはさらに、
コントロール領域のＤＮＡの変化を必要とする。
イカ菌株ＡＴＣＣ２０６８８を未切断ｐＬＳ−３ＤＮＡ
とＳ％ａｊ？１分解ｐｕｓ−３ＤＮＡで形質転換して各
々ｓｐｙ　Ｊｓｓ＋形質転換体ＡＴＣＣ２０７７５（Ｄ
Ｌ１４４）とＡＴＣＣ２θ７７６（ＤＬ１４８）を得た
。これらの形質転換体菌株をＹＥＰＤ培地を含む試欣管
に接種した。細胞を一晩２８℃で生育させた。これらの
培養物のアリコツト（２５０μｔ）を２５−ずつのａｒ
ｐ培地で１　：　１００に希釈した。これらの細胞を損
と５フラスコ中で６００％情での吸収が５．０−７．０
となるまで１６−１８時間生育させ、遠心分離により回
収した。得られた培養液または上清を濃縮し、この濃縮
物を５ＤＳ−ＰＡＧＥに付すことによりプロレンニンの
存在について検定した。スラブゲルＣａＬａｂ　ｇｅｔ
）を電気泳動により、２０惰Ｍトリスペース、１５０％
Ｍグリシン、２０％メタノールの存在下５００ｓアンペ
アで２時間４℃でニトロセルロース紙に移した。スラブ
ゲルかもの蛋白質の除去は、コーマシー　（Ｃｏｏｍａ
ａａｉｍ）青による染色によって確認した。
ニトロセルロース紙ｔ−３７℃で乾燥して１時間６５℃
で焼き、ＴＥＳ　（２θＯｓＡｆ　ＮａＣＬ、　　５０
ｆｎＭトリスーＨＣ１％ｐＨ７，５）中で洗った。この
紙を次いで室温で３０分、１０％馬血清（ギブコ（Ｇｉ
ｂｏｏ）　、オハイオ州チャグリンフォールズ）を含有
するＴＥＳ中でインキユペートシ、次いで１０％馬血清
とプロレンニン抗体の適当な希釈物を含有するＴＥＳ中
で１６時間室温でインキユベートシた。この紙を次いで
１０分ずつＴＢＳ中で３回洗い、１０％馬血清を含むＴ
ＥＳ中でインキエベートし、１０％馬血清と西洋わさび
ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗つサギＩｇＧ抗体の
適当な希釈物を含むＴＢＳ中で２時間インキュベートし
た。この紙をついで３回ｌＯ分間ずつＴＢＳ中で洗い、
４−クロル−１−ナフトール（メタノール中３１１９／
ｄ）の存在下に展開した。該ナフトールは０．０１％の
過酸化水素を含むＴＢＳ中０．５１ｎ９／−の濃度まで
加えられた。分子量４０，０００のプロレンニンの存在
は両方の上清において確認された。
濃縮培養液上清（上述）の酸賦活化後、有意の乳凝固活
性がｐＬＳ−３を含む形質転換体培養物から製造された
試料において見られた。予測どおり、受容体薗株ヤロウ
イア・リポリプイカＡＴＣＣ２０６８８の対照培養物上
清については何ら乳凝固活性は見られなかった。
発現または分泌プラスミドｐＸＸ−３３の構成ｐＩ４−
３を改良された発現プラスミドｐＸＸ−３３に転換する
ための修飾は第６図にその概略が示されている。そのよ
５な修飾によりＸＰＲ２プロモーター領域は２８０ｂｐ
増えた。ｐＬＳ−３の場合のように、発現プラスミドｐ
ＸＸ−３３はプロレンニンの全構造遺伝子配列に連結し
たアルカリ性プロテアーゼの全プレプロ−ペプチド（１
５７個のアミノ酸配列）をコード化しているハイブリッ
ド遺伝子を含む。
ｐＬＳ−３におけるＸＰＥ２プロモ一ター配列より２８
０ｂｐ多いプロレンニン発現または分泌プラスミドを構
成する前に、アルカリ性プロテアーゼ全遺伝子をＨｉ％
ｄｌ１１部位にサブクローン化する必要があった。この
サブクローンは合成リンカ−をＸＰＲ２ゲノムライブラ
リークローンｐＬＤ８６から単離された制限断片に加え
ることによって組立てられた。このＸＰＲＺサブクロー
ンを上流のＨ４５ｄｆ１部位によって構成することはア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子のすべてを含むＤＮＡ断片
をつくることによって開始した。ＸＰＲ２クローンｐＬ
Ｄ−８６のゲノム領域から２．３ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｂ
ａｍＨＩ（部分）断片はアガロースゲル電気泳動によっ
て精製され、下記配列の合成断片と連結された： ５’　ＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧ　　３’３’　　ＴＴ
ＣＧＡＡＣＴＴＡＡ　　５’このリンカ−配列は、Ｅａ
ｇ％Ｈ１接着末端（しかしＢαｓＨ１αｓ上再生しない
）、次いでＨ４％ｄｍ部位続いてＥｃｏＲＩ接着末端を
有する。この連結生成物をＨ４％ｄｍで分解し、ｐＢＲ
３２２６）Ｈ４％ｄｍ部位に挿入した。プラスミドｐＸ
ＨＰ−２４はその制限地図により同定され、将来の発現
構成のためのＸＰＥ２プロモ一ター断片源になった。
プラスミドｐＸＨＰ−２４において、サブクローン化Ｘ
ＰＲ２遺伝子はｐＬＳ−３に含まれるＸＰＥ２プロモ一
ター配列よりも約２８０塩基対多い５’ＸＰＲ２プロモ
一ター配列を有する。ｉず、プロモーター成分断片は、
合成ＤＮＡ断片（上ではｐＬＳ−３について記載）とｐ
ＸＨＰ−２４からの１１５０塩基対のＨｓｓｄＩ［Ｉ−
Ａｗａｌ　断片とを７４’）ガーゼとともに使用する標
準的連結反応、次いでＨｉ％ｄｍとＥ　ａ　ｆｌ＆ＨＩ
　　による開裂によってつくった。得られた連結された
配列を約１１９６塩基対Ｈ４％ｄｍ−ＢａｔｎＨＩを選
択するゲル電気泳動によって精製した。プロレンニンア
ミノ酸残基６〜１５１をコードする配列を含む第二の断
片を、ｐＬＳ−３からＢａｍＨｌとＸｍａｌによる開裂
および得られた４４０塩基対ＢａｍＨＩ−ＸｍａＩＤＮ
Ａ断片のゲル精製によりつくった。プロレンニン遺伝子
の残りの部分、ＸＰＲ２ターミネータ−訃よびベクター
配列を含む第三の断片は、ｐＬＳ−３からＨ４％ｄｍと
Ｘｍａｌによる開裂および約ｓ、ｏｈｂのＨ（％ｄ■−
Ｚｓｇｌベクター断片のゲルによる精製によりつくった
。これら３つの断片を次いで上述の標準的方法を使用し
て連結した。この連結反応を使用して大腸菌に１２菌株
ＭＭ２９４を形質転換した。プラスミドをアンピシリン
耐性にもとづいて選択された形質転換体から単離し、プ
ラスミドｐＸＸ−３３はその制限地図によって同定され
た（第６図）、このプラスミドのプロテアーゼ−プロレ
ンニン領域の配列を決定して上記所望の断片の適当な接
合を確認した。
ヤロウイア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７７４をＳ％ａ
Ｂｌ開裂ｐＸＸ−３３で形質転換してヤロウイア・リボ
リプイカＡＴＣＣ２０７８０を得、ｐＬＳ−３の場合に
ついて上述されたよ５にして検定した形質転換体培養物
によって培養液にプロレンニンを分泌させた。培養物上
清にプロレンニンの存在が確認された。
培養物上清の濃縮物の酸賦活化後、形質転換されたヤロ
ウイア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７８０の培養物から
つくられた試料において有意の乳凝固活性が見られた。
発現または分泌プラスミドｐＸＸ−２２を構成するのに
使用される実験段階は第７図に示されている。この発現
ベクターはｐ１４−３とは２つの点で異なる。ｐＸＸ−
３３のように、ｐＸＸ−２２はＸＰＲ２プロモーター配
列に加えて２８０６アの断片を含む。次に、ｐＸＸ−２
２はアルカリ性プロテアーゼシグナルペプチドおよびプ
ローペプチド（ｐｒｏｌ）の３８個のアミノ酸残基のみ
をコード化する配列を含む。
ｐＸＸ−２２６）ための構成計画はｐＸＸ−３３につい
て使用した計画と類似している。まず、プロモーター成
分断片を、ｐＸＨＰ−２４からの８９０塩基対Ｂ４％ｄ
ｍ−ＥｇｔＩ断片および下記配列を有する合成断片： ５’　ＧＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧ　　
３’３’　　ＡＡＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＡＴＣＣＴＡ
Ｇ　５’をＴ４リガーゼとともに使用する標準的連結反
応、次いでＨ４％ｄｌおよびＢ　ａ　ｔｎＨＩによる分
解によってつくった。得られた連絡された配列を９８０
塩基対Ｂ４％ｄｍ−Ｈａ悔ＥＩＤＮＡ断片のゲル電気泳
動単離によって精製した。プロレンニン残基６〜１５１
を；−ド化する第二の断片を、ｐＬＳ−３からＥａｓＨ
ｌとＸｍａｌによる開裂および得られた４４０塩基対Ｂ
ａｍＨ１−ＺｓａＩ　　ＤＮＡ断片のゲル精製によって
単離した。プロレンニンの遺伝子の残部、ＸＰＲ２ター
ミネータ−およびベクター配列を含む第三の断片はｐＬ
Ｓ−３のＨ４％ｄｍおよびＸｔｓａｌによる開裂と約８
．０ｋｂベクタ一断片のゲル精製によりつくられた。次
いで３つのＤＮＡ断片を標準的方法により連絡した。連
絡反応を使用して大腸菌に１２菌株ＭＭ２９４を形質転
換した。これらの選択された形質転換体から単離され、
プラスミドｐＸＸ−２２はその制限地図によって同定さ
れた（第７図）。
次いでヤロウイア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７７４を
５ｎａＢ１開裂ｐＸＸ−２２で形質転換してヤロウイア
・リポリプイカＡＴＣＣ２０７７９を得、ｐＬＳ−３の
場合に記載したように検定された形質転換培養物によっ
て培養液中にプロレンニンが分泌された。培養物上溝中
のプロレンニンの存在は、上記方法により確認された。
濃縮された培養物上清の酸賦活化後、有意の乳凝固活性
が形質転換されたヤロウイア・リポリプイカＡＴＣＣ２
０フフ９培養物からつくられた試料に見られた。
プロレンニン発現または分泌プラスミドアＸＸ−１１を
構成するための実験段階は第８図に概略が示されて、い
る。このプラスミドはプロレンニンをコード化した配列
に結合したＸＰＲ２プロモーターと２２個のアミノ酸残
基シグナルペプチドを含む、ｐＸＸ−１１について使用
された構成計画はｐＸＸ−２２とｐＸＸ−３３について
使用した構成計画と類似していた。簡単にいえば、プロ
モーター成分断片は、ｐＸＨＰ−２４からの約７５０塩
基対Ｈ４％ｄｍ−ＥｇｔＭＤＮＡ断片と下記配列：を有
する合成断片をＴ４リガーゼとともに使用する標準的連
絡反応及びそれに続くＨ４％ｄｍとＥａｍＨｌによる開
裂によってつくった。得られた連絡された配列をゲル電
気泳動で精製し７９０塩基対Ｈ４ｎｄｍ−ＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片を選択した。プロレンニン残基６〜１５１をコ
ード化する第二の断片はｐＬＳ−３から、ＪａｍＨｌと
Ｊｓａｌによる開裂および得られた４４０塩基対Ｂ　ａ
ｍＨｌ　−Ｘｍａ　１ＤＮＡ断片のゲル精製によって単
離された。プロレンニン構造遺伝子の残部、ＸＰＲ２タ
ーミネータ−およびシャトルベクター配列を含む第三の
断片は、ｐＬＳ−３をＨ（％ｄ■とＸｆ＋ｌＮα■で開
裂し、約ｓ、ｏｈｂベクター断片をグル精共することに
よって製造、した。次いで、これら３つのＤＮＡ断片を
上記標準的方法を使用して連結した。この連結反応を使
用して大腸暮に１２菌株ＭＭ２９４を形質転換した。プ
ラスミドを上記選択された形質転換体から単離し、プラ
スミドｐＸＸ−１１をその制限地図により同定した（第
８図〕。このプラスミドのＸＰＲ２プロレンニン部分を
使用して合成ＤＮＡの適当な配列および所望の断片の適
当な接合部を確認した。
ヤロクイア・リボリプイカＡｒｃｃ　　２０７７４を次
いでＳ％ａＢｌ開裂ｐＸＸ−１１で形質転換してヤロウ
イア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７７８を得、これらの
形質転換された培養物によって培地へ分泌されたプロレ
ンニンはｐＬＳ−３の場合に記載されたようにして検定
された。培養物上清中のプロレンニンの存在は上記方法
によって確認された。
乳凝固検定によりｐＸＸ−１１を含む形質転換体ＡＴＣ
Ｃ２０７７８の培養物上清は有意の乳凝固活性を示すこ
とがわかった。
例　　　２゜ ドツキングプラットフォームの構成 ＡＴＣＣ２０７７４中のｂｉｏ−６アレルに相当する野
生型ＢＩＯ遺伝子を下記の如く相補性によりクローン化
した。ｐＬＤ４０ｃこれはＥａｏＲ１部位におけるｐＢ
Ｒ３２２＋ＬＥＵ２）のＢａｍＨ１部位に挿入された部
分的に５ａｓ３Ａで分解されたヤロウイア・リボリプイ
カ染色体のＤＮＡの遺伝子ライブラリーを構成し、大量
のライブラリーＤＮＡ（これはＸＰＲ２遺伝子をクロー
ニングするのに使用されたものと同じライブラリーＤＮ
Ａである。）を混合培養大腸菌（Ｅ、ａｏｌｉ）プラス
ミド調髪物として製造した。数■のライブラリーＤＮＡ
ｆＡｐａｌ　（ＬＥＵ２−領域で１度切断する）酵素で
分解した。次いで、このＤＮＡを使用してＡＴＣＣ２０
７７４（Ｊ＊ｓ２、ｚｐｒ２、ｂｉｏ）を形質転換した
。その間、形質転換混合物はロイシン欠失合成培地上に
広がった。数万個のロイシン非依存形質転換体が得られ
た。どのコロニーがＢＩＯ遺伝子を含むライブラリープ
ラスミドを含んでいるかを見つけるために、ロイシン非
依存形質転換体をビオチン選択培地を含有する寒天プレ
ートにおいてレプリカ平板法を行なった。該培地は１を
当り下記成分を含む＝２５ダのデスチオビオチン、２０
ｔのグルコース、５ｔの硫酸アンモニウム、ｌｔのＫＨ
，ＰＯ２、ｏ、ｓｒのＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ，０，１ｔ
ＯｃａｃＩ４．０．ＩＰのＮａＣＬ、５００μ？のホウ
殴、４００μ？のチアミンＨＣ１，４００μ２６）Ｚ　
＊ＳＯａ　・７Ｈ＠０　、４００μｔのＭ％５ｏｓ−Ｈ
，Ｏ１２００ｔｔｆのＨ旬ＭｏＯ，・２Ｈ２０，２００
ｆｉｔのＦｔＣ！、ｓ・６Ｈｔ０．１００μｔのＸＩお
よび４０μｆの０％ＳＯ４・５Ｈ，０ ビオチン選択培地上で生育するいくつかのヤロウイア・
リボリプイカＢＩＯ＋形質転換体の１つはＤＬ３１と命
名された０次いで発明者らは、ヤロウイア・リボリプイ
カ菌株ＤＬ３１に由来するＥＩＯ遺伝子を含む遺伝子ラ
イブラリープラスミドを回収することを続けた。、ＤＬ
３１Ｎ株の培養物から染色体ＤＮＡをつくった。この染
色体ＤＮＡ数μｔを制限酵素Ａｐａｌで分解してライブ
ラリープラスミドを切り敗った。分解されたＤＮＡのア
リコツトを連結反応に使用して未公知ライブラリープラ
スミドを環化した。次いでこの連結混合物を使用して大
腸菌培養物をアンピシリン耐性について形質転換して未
知のＢＩＯ含有プラスミドを大腸菌にとり込んだ。いく
つかの大腸菌アンピシリン−耐性形質転換体が得られた
。上記大腸菌形質転換体について少量のプラスミドを製
造した。
このようにして得られたプラスミドＤＮＡの制限分解物
は、未公知ＢＩＯ−含有プラスミドが予期された如＜Ｂ
ａｔｎＨ１部位への挿入物を有するｐＬＤ４０と相同で
あることがわかった。このプラスミドは本来発明者等の
遺伝子ライブラリーに由来しているはずなのでｐＬＤ５
１と命名された。
プラスミドｐＬＤ５６はＬＩＤび２遺伝子をｐＬＤ５１
から次のように堰出すことによりｐＬＤ５１のサブクロ
ーンとして生成され九。プラスミドｐＬＤ５１のアリコ
ツトを酵素ＨａｏＲＩで分解してＬＥＵ２領域を除去し
た。との分解されたＤＮＡをＤＮＡ連結反応に使用して
上記プラスミドを再環化した。次いで大腸菌形質転換を
行ってより小さなりＩＯ−含有プラスミドをクローニン
グした。
アンピシリン耐性大腸菌形質転換体の１つは予測より小
さなプラスミド、すなわちｐＬＤ５６を含むことがわか
った。ｐＬＤ５６のいくつかの制限分解物が得られた。
ｐＬＤ５６のＢＩＯ含有断片（ｐＢＲ３２２６）Ｂａ５
Ｈ１部位における挿入物として生じる）約３．６ｋｈの
長さであった。
ｐＢＲ３２２（ｐＬＤ５６からなる）のＢａｍＨ１部位
へのヤロウイア・リポリプイカＤＮＡの３．６ｋｂ挿入
物の非常に大ざっは彦制限地図がカッコ内に示された挿
入開始部位からの塩基対としておおよその距離が記載さ
れている。サイズはいくつかのアガロースゲルで測定さ
れ比較的大量の誤差がある： ？ｗｓｌ（８００）、Ｐｗｓｌ（１２００）、Ｆａｉｌ
（１８００）、Ｊ／ｊｓｌ（２０００）、Ｐａ１ｌ（２
３００）、ＥｅｏＡＶ（２７００）％ＪＶ６（１１（３
２００）（方向付けのため、ｐＢＲ３２２６）５ａｉ１
部位は上記各部位の前にあり、Ｈ４％ｄｍ部位は上記各
部位の後にくる。） Ｃ，ＢＲ３２２＋ＢＩＯ遺伝子を含有する約３．６＆ｂ
のヤロウイア・リポリプイカ染色体ＤＮＡ）で形質転換
した。３つの異なるビオチン非依存形質転換体を＃ｒｓ
ｌ−切断（ｐＢＲ３２２を標的として）ｐＬＤ４０（ｐ
ＢＲ３２２上のＬＥＵ２）の高頻度形質転換について親
株と比較してどちらがＢＩＯ−領域に組込まれた耐性ｐ
ＢＲ３２２を含んでいるか決定した。これら３つの形質
転換体すべてがｐＬＤ４０の耐性ｐＢＲ３２２への組み
込みのための高頻度形質転換を示した。これはサウザー
ン（Ｓｏ％ｔｈｅｆ％）プロットハイブリダイゼーショ
ン実験によって確認された。これら３つのオリジナルな
りロウイア・リボリプイカＢＩＯ形質転換体の１つはＤ
ＬｌｌＢと命名され、さらにＤＮＡ受容体として使用さ
れた。上記制限地図は、ｌ）　ＢＩＯ−特異的ハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用すべき物（Ｎａ　ｏ
　１−Ｐｗｓｌ片）、ｌｌ）　ｐＬＤ５６プラスミドを
正確に切り取るのに必要な酵素（Ｍｌｌｌ）、＋Ｈ）Ｐ
ＢＢ３２２部分においてのみ１回で切断する酵素（Ｃｊ
ａｌ）およびＩＶ）該プラスミド中では何ら切断しない
酵素（Ａｐａｌ）を決定するのに必要である。ＡＴＣＣ
２０７７４からのＤＮＡのＣＩａｌとＡｐａＩによる分
解物とＤＬｌｌＢ（ＢＩＯ断片でプローブされた）との
サウザーン交雑物は、予測のとおりＤＬｌｌＢのビオチ
ン領域がＣＡＴＣＣ２０７７４のＢＩＯ領域と比較した
場合）ｐＬＤＳ６のサイズと大体同じＤＮＡの添加によ
り開裂されることを示した。ＤＬｌｌＢＤＮＡ（ｐＢＲ
３２２でプローブされた）のＭ１％Ｉによる分解物は、
さらに、この添加が無傷のｐＬＤ５６と同じサイズであ
ることを示した。
発現または分泌プラスミドｐＬＸ−３４の構成グナル（
１５７個のアミノ酸プレプロ配列）とともにプロレンニ
ンコード化配列を含む発現プラスミドを構成した。この
発現プラスミドは、ＸＰＲ２プロモーター以外のプロモ
ーターを使用して異種蛋白質の分泌を達成できることが
わかった。さらに、この発現ベクターはヤロウイア・リ
ポリプイカゲノムにおいて組込み部位に依存せずに発現
または分泌できる。ＸＰＲ２プロモーター以外のプロモ
ーターによるプロレンニンの分泌がうまくいったので、
ヤロウイア・リボリプイカにおける別の新たな強力なプ
ロモーターを同定するために発現ベクターを構成できる
ことがわかった。さらに、この方法を使用して２つの別
々のノ・イブリッドプロレンニン遺伝子を有する発現培
養物を得ることができる。すなわち、１つはＬＥＵ２プ
ロモーターにより発現されるものであって、他方はＸＰ
Ｒ２プロモーターで発現されるものであって、これらの
プロモーターは宿主ゲノム中の異なる部位で組込まれて
いる。
ＬＥＵ２プロモーター配列により発現される、アルカリ
性プロテアーゼ分泌シグナル（１５７個のアミノ酸ＸＰ
Ｒ２プレプロ配列）を有するプロレンニン遺伝子を含む
発現ベクターの構成に使用される実験段階は第１３図に
概略が示されている。
このプラスミドの構成は、ＬＥＵ２プロモーター断片（
マレイン酸！−イソプロピル脱水素酵素遺伝子のＡＴＧ
翻訳開始コドンの前に位置する５′−未翻訳配列の約３
００塩基対を有する）をつくることから始まった。ＬＥ
Ｕ２プロモーター配列の２７０ｈｐ部分をコード化して
いる３ｏｏｂｐＨ（舊ｄｍ−ＦｏＫＩＤＮＡ断片をシャ
トルベクターｐＬＤ４０より単離した。この断片と下記
配列：・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・Ｌ
ａ５２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・ｏｋ１ ５’−ＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＴＧ３’−ＴＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＣ
ＧＴＴＣ−３’ ＴＴＣＧＡＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＧ
ＡＧＴＧＡＣＧＧＣ−５’ を有する５４ｂｐ合成リンカーとをＴ４リガーゼで連結
した。得られた連結された配列を約３６０塩基対Ｈ４％
ｄｍ−ｎｇＬＩＤｙＡ断片のゲル電気泳動によって単離
することによりＭ裂した。ＸＰＲ２プレプロ配列の残部
及びプロレンニンの最初の１５２個のアミノ酸残基をコ
ード化しているもう１つの成分断片を発現プラスミドル
ＸＸ−３３Ｃ第６図）からＢＱｔｌとＸｔｔｈａ■によ
る開裂により単離し、得られた８８７塩基対のＤＮＡ断
片をゲルにより精製した。プロレンニン遺伝子、ＸＰＲ
２ターミネータ−およびベクター配列の残部を有する第
三の断片を、ｐＸＸ−３３をＨ４ｎｄｍとｆｓａｌ　で
開裂することにより製造し、約８．０＆＆ベクタ一断片
の開裂によってゲル精製した。これら３つのＤＮＡ断片
を上述の標準的方法により連結した。
この連結反応を使用して大腸菌に１２菌株ＨＥ１０１を
形質転換した。アンピシリン耐性にもとづいて選択され
た形質転換体からプラスミドを単離し、プラスミドｐＬ
Ｘ−３４をその制限地図によって確認した（第１３図）
。
ヤロウイア・リポリプイカＡＴＣＣ２０７９４（ＤＺ、
１１８）はＮ　ｒ　ｓ　ｌ開裂ｐＬＸ−３４ＤＮＡで形
質転換してヤロウイア・リポリプイカＡＴＣＣ２０７９
５ＣＤＬ２５１）を得、ｐＬＳ−３の場合について上述
の如く検定されたロイシン非依存形質転換体培養物によ
り培養液にプロレンニンが分泌された。この形質転換方
法は、宿主のが互部位にあらかじめ導入されていたｐＢ
Ｒ３２２配列へのｐＬＸ−３４の組込みを意図した。こ
の部位のｐＬＸ−３４の組込みはサウザーンＣ８ｏ％ｔ
ｈａｒｎ）分析により確認された。
受容体としてのＤＬｌｌＢの使用　　サウザーン交雑形
成実験は次のように行なった。ＤＬｌｌＢの形質転換体
からのＤＮＡのＮ１−％１分解物（たとえばインプット
プラスミドがプロキモシン発現プラスミドである場合プ
ロキモシンプローブと交雑された）はインプットプラス
ミドを正確に切り取った。数％？のＮｒｓｌ−分解形質
転換プラスミドは交雑バンドの正確なサイズを確認する
のに役立った。これらの形質転換体（３２ｐ標識、ＢＲ
３２２でプローブされた）からのＤＮＡのＭＪｓ１分解
物（Ｊ／ｊｍｌは形質転換しているプラスミドにおいて
切断しなかった）も、ＤＬｌｌＢの実在するｐＢＲ３２
２配列が形質転換しているプラスミドの１分子以上を添
加することにより分解されることを示した。このことは
、組込みが所望の部位で生じたことを示したものである
。形質転換体ヤロウイア・リボリプイカＡＴＣＣ２０７
９５（ＤＬ２５１）の培養物はＹＥＰＤ培地中２２℃で
生育してＬＥＵ２プロモーターによる発現を有利にした
。培養物上清中の存在は酸活性化培養物上清の乳凝固検
定（上記参照）によって確認され、イムノプロット分析
（上記参照）により実記された。これらの結果は、この
ハイブリッド遺伝子ＸＰＲ２またはＬＥＵ２以外の部位
に組み込まれた場合発現および分泌できる独立した発現
ユニットであることを示している。
このことから、高いレベルの細胞外プロレンニンを強力
に達成できる複数のハイブリッド遺伝子によって、発現
培養物をつくることができる。
例　　３゜ ヒト０５ｇのための合成遺伝子の配列 ヒトアナフイラトキシン０５ｇを細菌につくらせるため
の計画はヨーロッパ出願第０１４７１７８号に記載の如
くＥＧＦの合成と発現のために使用された以前の方法に
類似している。この方法は活性化補体成分０５ｍをコー
ド化している配列が合成的につくられる遺伝子をつくる
ことからなる。
ヒト０５ｍの既知アミノ陵配列が与えられた場合、　　
　′本発明者等はその７４個のアミノ酸についての情報
をコード化しているＤＮＡ断片（第９図）を設計した０
合成遺伝子配列を選択して大腸菌とニス・セレビシアエ
の好適；トンを最大に利用していくつかの制限エンドヌ
クレアーゼ部位におけるキヤラクタライゼーションを促
進させた。この方法は、Ｃ５ａポリペプチドの最初のア
ミノ酸をコード化するトリプレットの前に蛋白質合成の
ためのＡＴＧ開始コドンを導入することによりアナフイ
ラトキシンの大腸菌における発現を行なわせる。所望の
方向でプラスミドｐＢＲ３２２にＡＴＧ開始コドンを挿
入するのを助けるために、合成Ｃ５ａ遺伝子をその末端
にＥｅｏＲｌおよびＨ４％ｄｍ制限エンドヌクレアーゼ
認識部位が含まれるように設計した。
この０５ｇ遺伝子をつくるために、１０個の４７ｔＩ＠
ｅｙをホスホラミダイト法により合成し、２３５ｈｐ二
本鎖ＤＮＡ断片に組込んだ、０５ｇ遺伝子断片を適当に
開裂したｐＢＲ３２２に挿入し、クローン化遺伝子を任
意に選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡの制限
開裂分析により同定した。
いくつかのＣ５ａクローンを次いでＤＮＡ配列について
分析し、正しい配列を有するクローンを同定した。Ｃ５
ｍ遺伝子領域のための意図され九ヌクレオチド配列が検
査した５つのクローン中の２つのクローンに見出された
。
ラスミドの構成は、Ｃ５ａサブクローンを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｒｏＲ１によって開裂することで開始さ
れ、細菌性アルカリ性ホスファターゼによる処理によっ
て説ホスホリル化によって行なわレタ。ｔｙｐフロモー
ター−オペレーターおよびリボゾーム結合部位配列を含
むｐ　ＰＦＩＩ　−Ｒ２からの３６０　ｂｐＥａｏＲＩ
　ＤＮＡ断片を使用して、Ｃ５ａ発現プラスミドを構成
した。大腸菌菌株ＨＢ１θ１の能力細胞を連結反応で形
質転換した。各形質転換体からいくつかの薬物耐性コロ
ニーを精製し、それらのプラスミドＤＮＡをエンドヌク
レアーゼ制限地図分析に付して０５ａ遺伝子の転写を行
５方向にあるｔｒｐプロモーターを有する該プラスミド
ＤＮＡを同定した。この連結反応物からの複数の単離物
を、Ｃ５ａの直接発現に必要な配置にある細菌性プロモ
ーター配列に隣接したアナフイラトキシン遺伝子を含む
プラスミドで同定した。
Ｃ５８発現プラスミドｐｃ５ｍ−４８の制限地図は第１
０図に示されている。
ヒトアナフイラトキシンＣ５Ｇの分泌をコード化する発
現または分泌ベクターｐｃ５ａＸ−３は例１でｐＸＸ−
３３について記載される技術を使用してつくられた。次
いでヤロタイア・リボリプイカＡｒｃｃ　２０７７４ｔ
この分泌ベクターにより形質転換し、ヒトＣ５ａはヤギ
抗Ｃ５αおよびウサギ抗ヤギＩ（ｌＧｆイムノプロット
方法で使用した以外は上述の如く検定された形質転換さ
れた培養物によって産生された。この例で記載のプラス
ミドについて、培養物上滑中のＣ５αの存在が確認され
た。
発現または分泌プラスミドｐＣ５αＸ−３の構成アナフ
イラトキシン発現または分泌プラスミドｐＣ５ａＸ−３
の構成のための実験手順の概略全第１１図に示した。こ
のプラスミドは、１完全なλに！Ｒ２プロモーター、２
よびＣ５ａの７４個のアミノ酸残基をコード化している
合成配列に結合された１５７アミノは残基シグナルとブ
ローペプチドのための配列を含む。ｐＣ５ａＸ−３のた
めに使用される構成計画は、ｐＸＸ−３３の計画と類似
している。まず、プラスミドｐＸＨＰ−２４（または所
望の配列ｔ−有するもう１つのプラスミド）をＨｉｎｄ
ｍとＡｔｅｌで開裂し、ＸＰＲ２プロモーターを含む１
１５０塩基対断片をゲル精製した。υソ２プローイプチ
ドの３′末端とＣ５ａ構造遺伝子配列を有するもう１つ
の断片を、大腸菌発現プラスミドｐＣ５ａ−４８からの
約２２０塩基対のＨｉｎｆ［−ＨｔｎｄｆｌＤＮＡ断片
と下記配列の合成断片：をＴ４リガーゼとともに使用す
る標準的連結反応と、それにつづくＡｖα！とＨ４ｎｄ
ｌＩＩによる開裂によってつくった。得られた連結配列
を約２５０塩基対Ａｖａｌ−Ｈｉｎｄｍ　断片を選別す
るゲル電気泳動で精製した。該断片と上記プロモーター
を含むＨｉ　ｎｄｍ−Ａｖａ　ｌ　Ｃ５ａ　ｆコード化
するＡｖａ）−Ｈ４ｎｄｒｌｉ断片をＴ４リガーゼで連
結し、Ｈｉｎｄｍで分解した。約１．４に６の断片をゲ
ル精製しｉｔ　ｎｄ■開裂プテーム４（上述）との連結
に使用した。
この連結反応を使用して大腸菌に１２菌株Ｍｕ２９４′
１に形質転換した。アンピシリン耐性について還択され
たプラスミドを上記の選択された形質転換体から単離し
て、プラスミドｐＣ５ａＸ−３をその制限地図によって
同定した。ヤロクィア・す、ポリティ力菌株ＰＣ−３０
８６９、すな、わちＡＴＣＣ２０７７４を次いで５ｎａ
Ｂ１開裂ｐＣ５ａＸ−３で形質転換し、アナフィラトキ
シンが上述の如く検定された形質転換培養物によって培
地に分泌された。培養物上清中のＣ５αの存在は上記方
法によって確認された。
原形質膜に結合したりボゾームによって合成された多く
の蛋白質は、糖蛋白質として産生されることが認められ
る。実際に、グリコジル化により特定蛋白質の分泌に影
響がある。
真核細胞の蛋白質のＮ−介在グリコシル化は、トリ被プ
チド配列アスパラギン−Ｘ−スレオニン３よびアスパラ
ギン−Ｘ−セリンにおいて生じている。ここで、Ｘは多
分アスバレート以外のアミノ酸ならいずれでもよいであ
ろう。（ヒュッパー）　（Ｈｗｂｂａｒｄ　）、Ｓら、
１９８１．７ニエアル・レビュー・オブ・バイオケミス
トリー（Ａｎｎ、Ｒｅｒデ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５０　；　５５５　）。ブロレンニ
７のアミノ酸配列はそのようなトリペプチド配列を２つ
有するが、ヤロウィア・リボリプィヵ培養物に分泌され
たプロレンニンのゲル電気泳動分析の結果、グリコジル
化の証拠はなかった。他の分泌された真核細胞の蛋白質
において、かならずしもすべてのアスパラギン−Ｘ−ス
レオニンまたはアスバ２ギンーＸ−セリン部位にグリコ
ジル化は生じなかった。トリペプチド配列内の特定のア
スパラギンがグリコジル化酵素にとって受容できないた
め、グリコジル化されないらしい。
ヒトｃ５ａの場合、アミノ酸配列は単一のグリコジル化
部位、すなわちトリペプチド配列（Ａｓｎ−ｌ１ａ−ｌ
１ａデ）′に含み、これは通常アスパラギンに付加した
複雑なオリゴ糖を有する（７エルナンデス（Ｆａｒｎａ
ｎｄａｔ）、Ｈｌら、１９７６、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１１１゜１６
８８）。ヤロウィア・リボリプィヵ培養物に分泌されｆ
Ｃ０５α分子の１部分は、イムノプロットの高分子部分
に広域抗原活性が見られたのでグリコジル化されている
と見られる。この不均一の電気泳動上の移動度は、他の
分泌され九蛋白質について観察されるものに似ており、
多分炭水化物添加の程度が変化することにもとづく。本
発明において、分泌された特定の異種蛋白質の見掛上の
グリコジル化は、キロ９イア・リポリプイカの発現と分
泌が多くの通常グリコジル化された真核蛋白質の産生に
有用であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
添付図面の説明は次のとおりである。 第１図はヤロウイア・リボリプイカ菌株ＤＬ１１２から
単離された重複プラスミドｐＬＤ５７、ｐＬＤ５Ｂおよ
びｐＬＤ６２６）部分的線状制限地図である。すなわち
、ＸＰＲ２形質転換体ＤＬ１１Ｂから回収されたプラス
ミドの全体図である。しるしをつけた領域は、（左から
右へ）配列未決定のヤロウイア・リボリプイカ由米ＤＮ
Ａ、ＥｃｏＲ１部位とヤロウイア・リボリプイカＤＮＡ
との継目（正式にはＢａｎＨ１部位）との間のｐＢＲ３
２２６）小断片、ヤロウイア・リボリプィカＬＥＵ２遺
伝子、ｐＢＲ３２２６）大断片、および配列決定され九
ＸＰＲ２６）突然変異アレルを含む。ＢｇｔＢ部位は１
Ｂ°としるしをつけ、ＥｃｏＲｉ部位は“Ｅ″としるし
をつけた。線状化して示した３つのプラスミドはそれら
の末端Ｅｇｆ１　部位で結合した環状分子として回収さ
れた。 第２因はＸＰＲ２遺伝子のための合成オリゴヌクレオチ
ドプローブでちる。成熟プロレンニンの最初の２５アミ
ノ酸残基のほとんどについて文献に公開された配列（オ
グリジアク（Ｏｇｒｙｄｚｉａｋ）ら、上記文献）から
、■およびｎと標識された２つの領域は３２回以下の重
複を有する１　４−　ｒｎｅデオリゴヌクレオチドプロ
ーブを構成する可能性を与える。これら２つの領域は各
々アミノ酸７および１８から開始する。４つの異なる８
回重複混成プローブを各領域についてつくり、１７０〜
１８６の番号をつけた。示された予測核酸配列において
“Ｘ”はすべて４つの塩基全意味し、Ｕ”は両方のプリ
ンを意味し、“Ｙ′″は両方のピリミジンを意味１３６
）、プロ１（−１３５〜−９８）、プロ２（−９７〜−
１）、アルカリ性細胞外プロテアーゼおよびターミネー
タ−配列を示すＸＰＲ２遺伝子のヌクレオチド配列であ
る。 第４図は、ターミネーターベクタープｆ−１４について
の構成配列である。 第５図はプラスミドｐｌＳ−３の構成配列および制限地
図である。 第６図はプラスミドｐＸＸ−３３の構成配列と制限地図
である。 第７図はプラスミドｐＸＸ−２２６）構成配列と制限地
図である。 第８図はプラスミドｐＸＸ−１１の構成配列と制限地図
である。 第９図はヒトアナフイラトキシ７Ｃ５ａのアミノ酸配列
である。 第１０図はプラスミドｐＣ５α−４８の制限地図である
。 第１１図はプラスミドｐＣ５αＸ−３の構成配列ある。 第１３図はプラスミドｐＬＸ−３４の構成配列と制限地
図である。 −１−１，。 代　理　人　弁理士　　湯　浅　恭　三　：。 −〇− （外５名） Ｉ　　　　蚤白貰配利 ｍＲＮＡ　５’ プローブ　３１ １７０　　３’ １７２　　３’ １７４　　３’ ｆ７６　　３’ Ｉｒ　　　　　％で３實ｗｉｔ：ｙす ｍＲＮＡ　５’ プローブ　３１ 嘗８０　　　３′ １８２　　３’ １８４　　３’ １８Ｇ　　　３’ ＦＪｏ、２ ｖａｌ　　ｔｈｒ　　ｇｌｎ　　ｔｒｐ　ｇｌｙＧＴＸ
　ＡＣＸ　　ＣＡＵ　ＴＧＧ　ＧＧ　　　　　３’ＣＡ
Ｘ　ＴＧＸ　ＧＴＹ　　ＡＣＣＣＣ５’ＣＡＡ　ＴＧＸ
　ＧＴＹ　　ＡＣＣＣＣ５’ＣＡＴ　ＴＧＸ　ＧＴＹ　
ＡＣＣＣＣ５’ＣＡＧ　ＴＧＸ　ＧＴＹ　ＡＣＣＣＣ５
’ＣＡＣＴＧＸ　ＧＴＹ　ＡＣＣＣＣ５’ｌｙｓ　　Ｉ
ｙｓ　　ａｌａ　　Ｑｌｎ　　ｔｈｒＡＡＵ　ＡＡυＧ
ＣＸ　ＣＡＵＡＣ！’ＴＴＹ　ＴＴＹ　ＣＧＸ　ＧＴＹ
　ＴＧ　　　　　５’ＴＴＣＴＴＹ　ＣＧＸ　ＧＴＣＴ
Ｇ　　　　　５’ＴＴＴ　ＴＴＹ　ＣＧＸ　ＧＴＣＴＧ
　　　　　５’ＴＴＴ　ＴＴＹ　ＣＧＸ　ＧＴＴ　ＴＧ
　　　　　５’ＴＴＣＴＴＹ　ＣＧＸ　　ＧＴＴ　ＴＧ
　　　　　５’コ（５ｏｏ　　　ｙト　ＯｏＯｖ＊＊　
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Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌ
    ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の￥ＬＥＵ２￥遺伝子、そのプロ
    モーターまたはターミネーター配列、ヤロウイア・リポ
    リテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
    の￥ＸＰＲ２￥遺伝子、そのシグナル、プロ１−、プロ
    ２−、プロモーターまたはターミネーター配列の少くと
    も１つからなるヌクレオチド配列。
  2. （２）（ｉ） 【ヌクレオチド配列があります】 （ｉｉ） 【ヌクレオチド配列があります】 （ｉｉｉ） 【ヌクレオチド配列があります】 からなるヌクレオチド配列。
  3. （３）特許請求の範囲第１項のヌクレオチド配列からな
    る組換えＤＮＡ物質。
  4. （４）特許請求の範囲第２項のヌクレオチド配列からな
    る組換えＤＮＡ物質。
  5. （５）上記物質がヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａｒｒ
    ｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターである
    特許請求の範囲第４項の組換えＤＮＡ物質。
  6. （６）異種蛋白質のための遺伝子を組込んだヤロウイア
    ・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の
    シグナル配列コード化領域およびプロモーター配列から
    なるベクター。
  7. （７）プロモーター配列がヤロウイア・リポリテイカ（
    Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の￥ＸＰＲ２￥遺伝子また
    はヤロウイア・リポリテイカの￥ＬＥＵ２￥遺伝子のプ
    ロモーター配列である特許請求の範囲第６項のベクター
    。
  8. （８）特許請求の範囲第２項のヌクレオチド配列からな
    るベクター。
  9. （９）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔ
    ｉｃａ）にとつての外米遺伝子のヌクレオチド配列及び
    特許請求の範囲第１項のヌクレオチド配列からなるベク
    ター。
  10. （１０）上記外来遺伝子配列が上記ヌクレオチド配列に
    操作可能に結合されており、該外来遺伝子はプロレンニ
    ン遺伝子またはヒトアナフイラトキシンＣ５ａ遺伝子で
    ある特許請求の範囲第９項のベクター。
  11. （１１）異種蛋白質を産生し分泌することができるヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体。
  12. （１２）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
    ｔｉｃａ）のシグナル配列および機能的プロモー ター配列をコード化しているＤＮＡ配列に結合された、
    異種蛋白質をコード化しているＤＮＡ配列からなる特許
    請求の範囲第１１項のヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．
    ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体。
  13. （１３）特許請求の範囲第１項のヌクレオチド配列から
    なるベクターで形質転換されたヤロウイア・リポリテイ
    カ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）。
  14. （１４）プラスミドｐＬＳ−３、プラスミドｐＸＸ−３
    ３、プラスミドｐＸＸ−２２、プラスミドｐＸＸ−１１
    、プラスミドｐＸＨＰ−２４、プラスミドｐＣ５ａＸ−
    ３、プラスミドｐＬＤ５６およびプラスミドｐＬＸ−３
    ４からなる群より選択されたプラスミド。
  15. （１５）（ｉ）プラスミドｐＸＸ−３３、すなわち特許
    請求の範囲第１４項のベクターによるヤロウイア・リポ
    リテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０７
    ７４の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ２０７８０の同定
    特性を有するもの； （ｉｉ）プラスミドｐＸＸ−２２、すなわち特許請求の
    範囲第１４項のベクターによるヤロウイア・リポリテイ
    カ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０７７４
    の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７７９の同定特
    性を有するもの； （ｉｉｉ）プラスミドｐＸＸ−１１、すなわち特許請求
    の範囲第１４項のベクターによるヤロウイア・リポリテ
    イカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０７７
    ４の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７７８の同定
    特性を有するもの； （ｉｖ）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
    ｔｉｃａ）の￥ＸＰＲ２￥遺伝子によるヤロウイア・リ
    ポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２
    ０７７４の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７８１
    の同定特性を有するもの； （ｖ）プラスミドｐＣ５αＸ−３、すなわち特許請求の
    範囲第１４項のベクターによるヤロウイア・リポリテイ
    カ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０７７４
    の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７７７の同定特
    性を有するもの； （ｖｉ）未切断プラスミドｐＬＳ−３、すなわち特許請
    求の範囲第１４項のベクターによるヤロウイア・リポリ
    テイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０６
    ８８の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７７５の同
    定特性を有するもの； （ｖｉｉ）ＳｎａＢＩ切断プラスミドｐＬＳ−３、すな
    わち特許請求の範囲第１４項のベクターによるヤロウイ
    ア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣ
    Ｃ　２０６８８の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０
    ７７６の同定特性を有するもの；（ｖｉｉｉ）外来ベク
    ターＤＮＡと相同の領域からなるヤロウイア・リポリテ
    イカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体であつて
    、該領域は上記ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐ
    ｏｌｙｔｉｃａ）の組込み形質転換の間受容部位として
    役立つ外来ＤＮＡからなるもの； （ｉｘ）外来ベクターＤＮＡと相同の領域からなるヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体であつて、該相同の領域がｐＢＲ３２２または
    その誘導体から得られるもの； （ｘ）アルカリ性プロテアセーゼを産生しないヤロウイ
    ア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転
    換体であつて、該形質転換体はＸＰＲ発現構成物で形質
    転換されたＸＰＲ＾＋株からなる もの； （ｘｉ）ＮｒｕＩ開裂ｐＬＸ−３４、すなわち特許請求
    の範囲第１４項のプラスミドによるヤロウイア・リポリ
    テイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０９
    ７４の形質転換体であつて、ＡＴＣＣ　２０７９５の同
    定特性を有するものからなるヤロウイア・リポリテイカ
    （Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体；および（ｘ
    ｉｉ）ｐＬＤ５６、すなわち特許請求の範囲第１４項の
    プラスミドによるヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉ
    ｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０７７４の形質転換体
    であつて、ＡＴＣＣ　２０７９４の同定特性を有するも
    のからなるヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌ
    ｙｔｉｃａ）形質転換体からなる群から選択されたヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ−ｔｉｃａ）
    形質転換体。
  16. （１６）ＡＴＣＣ　２０７７４の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）。
  17. （１７）（ｉ）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐ
    ｏｌｙ−ｔｉｃａ）にヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．
    ｌｉｐｏ−ｌｙｔｉｃａ）にとつて異種の蛋白質をコー
    ド化するＤＮＡ配列；ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．
    ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子、またはヤロウイア・リ
    ポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーター
    、ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
    ａ）遺伝子のシグナルおよび転写ターミネーターＤＮＡ
    配列からなる発現ベクターを導入し； （ｉｉ）このように産生された（ｉ）のヤロウイア・リ
    ポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を
    適当な栄養培地中で培養し； （ｉｉｉ）異種蛋白質を回収する ことからなる、ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐ
    ｏｌｙｔｉｃａ）培養物によつて異種蛋白質を産生し分
    泌する方法。
  18. （１８）（ｉ）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐ
    ｏｌｙ−ｔｉｃａ）にヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．
    ｌｉｐｏｌｙ−ｔｉｃａ）にとつて異種蛋白質をコード
    化したＤＮＡおよび下記の少くとも１つからなる発現ベ
    クターを導入し： ￥ＬＥＵ２￥遺伝子、そのプロモーターまたはターミネ
    ーター配列、￥ＸＰＲ２￥遺伝子、￥ＸＰＲ２￥遺伝子
    のプロモーター、シグナル、プロ１、プロ２またはター
    ミネーターＤＮＡ配列； （ｉｉ）このようにして産生した（ｉ）のヤロウイア・
    リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を適当な栄
    養培地中で培養し； （ｉｉｉ）異種蛋白質を回収する ことからなるヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉ−ｐ
    ｏｌｙｔｉｃａ）培養物による異種蛋白質を産生する方
    法。
  19. （１９）上記遺伝子が￥ＸＰＲ２￥遺伝子または￥ＬＥ
    Ｕ２￥遺伝子である特許請求の範囲第１８項の方法。
  20. （２０）異種蛋白質ＤＮＡ配列がプロレンニンまたはヒ
    トアナフイラトキシンＣ５ａ配列である特許請求の範囲
    第１９項の方法。
  21. （２１）ＡＴＣＣ　２０７８０の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体を適当な栄養培地中で培養することからなる異
    種蛋白質を産生する方法。
  22. （２２）ＡＴＣＣ　２０７７９の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体を適当な栄養培地中で培養することからなる異
    種蛋白質を産生する方法。
  23. （２３）ＡＴＣＣ　２０７７８の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体を適当な栄養培地中で培養することからなる異
    種蛋白質を産生する方法。
  24. （２４）ＡＴＣＣ　２０７７７の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形
    質転換体を適当な栄養培地中で培養することからなる異
    種蛋白質を産生する方法。
  25. （２５）外来蛋白質のための遺伝子が￥ＸＰＲ２￥遺伝
    子のプロモーター配列とターミネーター配列との間に挿
    入される特許請求の範囲第１９項の方法。
  26. （２６）異種蛋白質のための遺伝子がプロレンニンまた
    はヒトアナフイラトキシンＣ５ａ遺伝子である特許請求
    の範囲第２３項の方法。
  27. （２７）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
    ｔｉｃａ）のＸＰＲ＾＋株をＸＰＲ発現構成物で形質 転換することからなる、アルカリ性プロテアーゼを産生
    しないヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉ−ｐｏｌｙ
    ｔｉｃａ）形質転換体の製造方法。
  28. （２８）（ｉ）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐ
    ｏｌｙ−ｔｉｃａ）のＸＰＲ＾＋株をＸＰＲ発現構成物
    で形質転換し； （ｉｉ）（ｉ）で製造された形質転換体をアルカリ性プ
    ロテアーゼ活性の欠失についてスクリーニングする ことからなるＸＰＲ２遺伝子の位置で合成されたベクタ
    ーＤＮＡを有するヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉ
    ｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の検出方法。
  29. （２９）上記ＸＰＲ＾＋ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ
    ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が未切断プラスミドｐＬＳ
    −３またはＳｎａＢ I で切断されたｐＬＳ−３ＤＮＡ
    で形質転換される特許請求の範囲第２８の方法。
  30. （３０）ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙ
    ｔｉｃａ）がヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏ
    ｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ　２０６８８の同定特性を有し
    ている特許請求の範囲第２８項の方法。
  31. （３１）外来ベクターＤＮＡと相同の領域からなるヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｔｉｃａ）形質
    転換体に発現ベクターを組込むことからなり、該領域は
    上記ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏ−ｌｙｔ
    ｉｃａ）の組込み形質転換の間受容体部位として役立つ
    外来ＤＮＡからなる、ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．
    ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を製造する方法。
  32. （３２）ＡＴＣＣ　２０７９５の同定特性を有するヤロ
    ウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を
    適当な栄養培地中で培養することからなる異種蛋白質の
    製造方法。
  33. （３３）外来ベクターＤＮＡと相同の領域であつて、上
    記ヤロウイア・リポリテイカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
    ａ）の組込み形質転換の間受容体部位として役立つ外来
    ＤＮＡからなるものからなるヤロウイア・リポリテイカ
    （Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を培養するこ
    とからなる異種蛋白質の製造方法。
  34. （３４）相同の領域がｐＢＲ３２２またはその誘導体か
    ら得られる異種蛋白質の製造のための特許請求の範囲第
    ３３項の方法。
  35. （３５）プラスミドＸＨＰ−２４をＨｉｎｄIII−Ａｖ
    ａ I で開裂して１１５０ｂｐ断片をつくり、該断片を
    単離し、該断片と下記合成ＤＮＡ断片： 【ヌクレオチド配列があります】 とをＴ４リガーゼの存在下に結合し、このようにして生
    成した結合生成物をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨ I で開裂し
    て１１９６ｂｐ断片を生成し、該１１９６ｂｐ断片を単
    離し、該１１９６ｂｐ断片をプラスミドｐＬＳ３のＢα
    ｍＨ I −Ｘｍａ I 開裂で得られた４４０ｂｐ断片およ
    びプラスミドｐＬＳ３のＨｉｎIII−Ｘｍａ I 開裂によ
    つて得られた〜８．０ｐｂでＴ４リガーゼの存在下に結
    合させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をこのようにして生成
    された結合生成物で形質転換し、アンピシリン耐性形質
    転換体を選択し、プラスミドｐＸＸ−３３を該形質転換
    体から単離することからなるプラスミドｐＸＸ−３３を
    製造する方法。
  36. （３６）プラスミドｐＸＨＰ２４をＨｉｄIII−Ｂｇｌ
    IIで開裂して８９０ｂｐ断片を生成し、該断片を単離し
    、該断片と下記合成ＤＮＡ断片： 【ヌクレオチド配列があります】 とをＴ４リガーゼの存在下に結合し、このようにして生
    成された結合生成物をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨ I で開裂
    して９２０ｂｐ断片を生成し、この９２０ｂｐ断片を単
    離し、該９２０ｂｐ断片とプラスミドｐＬＳ３のＢａｍ
    Ｈ I −Ｘｍａ I 開裂によつて得られた４４０ｂｐ断片
    およびプラスミドｐＬＳ３のＨｉｎｄIII−Ｘｍａ I 開
    裂により得られた〜８．０ｋｂ断片とをＴ４リガーゼの
    存在下に結合し、このようにして生成した結合生成物で
    大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン耐
    性形質転換体を選択し、該形質転換体からプラスミドｐ
    ＸＸ−２２を単離することからなるプラスミドｐＸＸ−
    ２２を製造する方法。
  37. （３７）プラスミドｐＸＨＰ２４をＨｉｎｄIII−Ｂｇ
    ｌIIで開裂して７５０ｂｐ断片を生成し、該断片を単離
    し、該断片を下記合成ＤＮＡ断片： 【ヌクレオチド配列があります】 とＴ４リガーゼの存在下に結合し、このようにして生成
    された結合生成物をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨ I で開裂し
    て７９０ｂｐ断片を生成し、この７９０ｂｐ断片を単離
    し、この７９０ｂｐ断片をプラスミドｐＬＳ３のＢａｍ
    Ｈ I −Ｘｍａ I による開裂で得られた４４０ｂｐ断片
    およびプラスミドｐＬＳ３のＨｉｎｄIII−Ｘｍａ I に
    よる開裂で得られた〜８．０ｋｂ断片とＴ４リガーゼの
    存在下に結合し、このようにして生成した結合生成物で
    大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン耐
    性形質転換体を選択し、該形質転換体からプラスミドｐ
    ＸＸ−１１を単離することからなるプラスミドｐＸＸ１
    −１を製造する方法。
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