FI90352C - Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI90352C
FI90352C FI864206A FI864206A FI90352C FI 90352 C FI90352 C FI 90352C FI 864206 A FI864206 A FI 864206A FI 864206 A FI864206 A FI 864206A FI 90352 C FI90352 C FI 90352C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fragment
lipolytica
plasmid
dna
gene
Prior art date
Application number
FI864206A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI864206A0 (fi
FI864206A (fi
FI90352B (fi
Inventor
Lance Steven Davidow
John Robert Dezeeuw
Arthur Ernest Franke
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of FI864206A0 publication Critical patent/FI864206A0/fi
Publication of FI864206A publication Critical patent/FI864206A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI90352B publication Critical patent/FI90352B/fi
Publication of FI90352C publication Critical patent/FI90352C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Treatment Of Sludge (AREA)
  • Magnetic Ceramics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measurement Of Velocity Or Position Using Acoustic Or Ultrasonic Waves (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Noodles (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)

Description

i 90352
MenetelmS heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelma Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi seka menetelma transformanttien valmistami-5 seen kayttOkelpoisten plasmidien valmistamiseksi
Tama keksintO koskee menetelmaa heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmaa Yarrowia lipolytica -transit) formanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi seka menetelma transformanttien valmistamiseen kayttOkelpoisten plasmidien valmistamiseksi. Kuvataan siis hiivojen prote-iinieritykseen liittyvaa tekniikkaa. Tarkemmin maaritel-tyna keksintO koskee Yarrowia lipolytica -yhdistelmakloo-15 nausvektoreita, jotka sisaitavat heterologista DNA:ta, joka koodaa nisakasproteiinin (esimerkiksi prokymosiinin) ja muiden polypeptidien tuotantoa ja erittymista; ja il-mentymisvektoreita, jotka sisaitavat Y. lipolytica -gee-nipromoottorin (esimerkiksi XPR2:n tai LEU2:n), alkalisen 20 proteaasin signaali-(eli pre-)sekvenssin, pro-alueen ja XPR2-terminaattorialueen ja niiden variantteja ja funk-tionaalisia ekvivalentteja, jotka syntyvat geneettisen koodin degeneratiivisyyden tai muun Y. lipolytica -geeni-komponentin kaytOsta. Lisaksi se koskee hiivatransfor-25 mantteja, jotka sisaitavat mainittuja ilmentymis- ja erittymisvektoreita, niiden kayttoa luonnollisessa, funk-tionaalisessa tilassaan olevien heterologisten proteiinien tuotantoon; ja menetelmia edelia mainittujen aikaan-saamiseksi.
30 Erilaisten teollisuudelle (esimerkiksi prorenniini ja naudan kasvuhormoni) tai laaketieteellisiin tarkoituk-siin (esimerkiksi urogastroni, kudosplasminogeeniakti-vaattori ja ihmisen anafylatoksiini C5a) arvokkaiden proteiinien tai polypeptidien pysyvan ja riittavan lahteen 35 ja erityisesti korkealaatuista tuotetta helposti talteen-otettavassa, funktionaalisessa muodossa tarjoavan lahteen 2 90352 taloudellinen houkuttelevuus on johtanut monet tutkijat soveltamaan yhdistelma-DNA-tekniikkaa mikro-organismeihin niiden muuttamiseksi heterologisia proteiineja tuottavik-si "tehtaiksi".
5 Paljon tutkimustydta on suunnattu proteiinien eri- tykseen mahdollisena ratkaisuna vaikeuksiin, joita kohda-taan eksogeenisen tai heterologisen (vieraan) proteiinin talteenotossa biologisesti aktiivisessa muodossa yhdis-telmaisantasoluissa olevista intrasellulaarisista kerSan-10 tymista, erityisesti Escherichia colista. E. colissa he-terologinen proteiini tuotetaan usein solun sisalla vai-keasti kasiteltavien inkluusiokappaleiden muodossa. Mai-nitun proteiinin vesiliukoisuus on yleensa alhainen ja sen biologinen aktiivisuus on pieni tai olematon. Maini-15 tun proteiinin eristaminen vaikeasti kasiteltavista in-kluusiokappaleista tapahtuu yleensa voimakkaalla kemial-lisella kasittelylia, joka voi olla kallista ja saattaa johtaa siihen, etta saadaan vain vahan tai ei ollenkaan halutussa, luontaisessa, biologisesti aktiivisessa muodo-20 ssa olevaa proteiinia. Lisaksi tarve rikkoa solut vaikeasti kasiteltavien kappaleiden vapauttamiseksi lisaa usein mainitun proteiinin mahdollisuuksia kontaminoitua E. colin tuottamilla epatoivotuilla aineilla. E. colin lisaksi muutkin organismit tuottavat liukenemattomassa 25 intrasellulaarisessa muodossa olevaa heterologista proteiinia. GB-patenttijulkaisu 2 091 271, julkaistu 28. kesa-kuuta 1982, esimerkiksi kasittelee S. cerevisiaen muunta-mista yhdistelma-DNA-tekniikan avulla vasikan renniinia eli kymosiinia (naita termeja kaytetaan tåssa toistensa 30 vastineina) tuottavaksi. Naiden vaikeuksien valossa on toiveet suunnattu mainitun proteiinin erittamiseen isan-taorganismista yritettaessa tuottaa luontaisessa, aktiivisessa muodossa olevaa proteiinia.
Se, erittaakO tietty organismi jotakin maarattya 35 proteiinia, mukaan luettuna heterologinen proteiini tai polypeptidi, nayttaa riippuvan tasta proteiinista. Useim- 3 90352 missa eukaryoottisoluissa osa proteiinisynteesilaitteis-tossa liittyy endoplasman retikulumiin ja syntyvan poly-peptidiketjun aminopédn lahelia oleva aminohapposekvenssi (jota kutsutaan "signaalisekvenssiksi") ohjaa proteiinin 5 kulkua kalvon lSpi. Signaalisekvenssi poistetaan mydhemm-in proteolyyttisesti erittymisen aikana, jolloin syntyy aktiivinen valmis proteiini. On tehty lukuisia yrityksié kehittaa menetelmia heterologisten proteiinien erittami-seksi signaalisekvenssien avulla mikro-organismeissa, mu-10 kaan luettuina Bacillus subtilis ja Saccharomyces cerevi-siae, ja nisakassoluviljelmissa. Mainitut organismit ei-vat kuitenkaan ole osoittautuneet ideaalisiksi.
B. subtilisin luontaiset ominaisuudet, esimerkiksi se, etta se erittaa monia proteiineja, mukaan lukien lu-15 kuisat proteaasit, joilla on taipumus hajottaa erittynyt-ta heterologista proteiinia, sekS heterologisen DNA:n ha-viamisesta johtuva transformoitujen kantojen pysymattO-myys ovat estaneet taman organismin kaytdn kehittamisen.
Nisakassoluja on menestyksellisesti kasitelty ge-20 neettisesti tuottamaan ja erittamaan heterologisia proteiineja, mutta nama jarjestelmat ovat teknisesti vaativia ja kalliita kayttaa ja ne ovat edelleen epakaytanndllisia useimpien proteiinien kaupalliseen tuotantoon.
Vaikka proteiinieritystutkimukset ovat olleet me-25 nestyksellisempia S, cerevisiaen kuin B. subtilisin yh-teydessa, nayttaa jopa S. cerevisialle olevan joitakin luontaisia rajoituksia proteiinien erityssysteeminå. EP-hakemusjulkaisussa 123 544, 31. lokakuuta 1984, kuvataan S. cerevisiaen α-tekijageenien eristamista ja niiden pro-30 moottori- ja/tai signaalipeptidiosien kayttGa yhdessa hiivalle heterologista proteiinia koodaavan DNA:n kanssa plasmidissa, jolla transformoidaan hiivasolut kykeneviksi tuottamaan erillista valmista proteiinia soluja viljel-taessa. EP-hakemusjulkaisussa 88 532, 14. syyskuuta 1983, 35 kuvataan menetelmaa heterologisen proteiinin tuottamisek-si ja erittamiseksi S. cerevisiaessa. Proteiinien, joita 4 90352 S. cerevisiae erittaa tehokkaasti naiden ja mulden eri-tyssysteemien avulla, koko nayttaa kuitenkin rajoittuvan noin 20 000 daltoniin. Jotta voitettaisiin tama S. cere-vlsiaen ylelnen tehottomuus erittamisorganlsmina, on tar-5 vittu useita mutatilvisia muuntamisia, kuten Smith et al. [Science 229 (1985) 1219-1224] kuvaavat. Eras poikkeus tasta suuntauksesta on se havainto, etta S. cerevisiae ilmeisesti pystyy erittamaan 20 000 daltonia suurempia Aspergillus-entsyymeja, mutta S. cerevisiae glykosyloi 10 voimakkaasti naita entsyymeja ja tama saattaa vaikuttaa eritystehoon.
Erityisen kiintoisa on Yarrowia lipolytica, teol-lisuudessa tarkea hiivalaji, jota kaytetaan sitruunahapon ja yksisoluproteiinin tuotantoon. Sita voidaan kayttaa 15 mytts erytritolin, mannitolin ja isopropyyliomenahapon tuottamiseen. S. cerevisiaeen verrattuna Y. lipolytica on erityisen kiintoisa ja arvokas, koska silia on kyky tehokkaasti erittaa suurimolekyylisia proteiineja (alkali-sta fosfataasia, hapanta proteaasia ja RNAraasia) kasvu-20 alustaansa ja se saattaa siten mahdollistaa luonnollises-sa tilassa olevien heterologisten proteiinien talteenoton ilman tarvetta rikkoa tuottavia soluja. Lisaksi Y. lipolytica erittaa hyvin harvoja proteiineja merkittavina maarina ja antaa siten mahdollisuuden tuottaa haluttua 25 heterologista proteiinia kasvualustaan vallitsevana pro- teiinilajina ja yksinkertaistaa mainitun heterologisen proteiinituotteen talteenottoa.
Y. lipolytica tuottaa suuria maaria solun ulkopuo-lista proteaasia. Tama on paaasiallinen Y. lipolytican 30 erittama proteiini. Kulloinkin kyseesså oleva proteaasi (alkalinen, hapan tai neutraali) riippuu kaytettavasta Y. lipolytica -kannasta [Ogrydziak et al., J. Gen. Microbiol. 128 (1982) 1225-1234]. Ogrydziak et al. (loc. cit.) kuvaavat alkalisen ekstrasellulaarisen proteaasin N-ter-35 minaalisen aminohapposekvenssin osittaista sekvenssiana- lyysia.
5 90352
Vireilia olevassa rinnakkaisessa US-hakemuksessa nro 634 505, joka on jatetty 25. kesMkuuta 1984, kuvataan menetelmia Y. lipolytican transformoimiseksi ja Y. lipo-lytica -geenien kloonaamiseksi mutaatioiden komplemen-5 toinnin kautta. Siina kuvataan erittynytta alkalista pro-teaasia koodaavan XPR2-geenin kloonaamista komplementoi-malla Y. lipolytican xpr2-mutaatio. Menetelmaan sisaityy Y. lipolytica -isantSkannan transformointi Y. lipolyti-ca -geenikirjaston osittaisella Bgllll-pilkkomistuotteel-10 la, joka on vektorissa pLD40, jota kuvataan EP-hakemus-julkaisussa 138 508, joka on julkaistu 24. huhtikuuta 1985 ja on edelia mainittua US-hakemusta vastaava hake-mus.
Tama keksinttt ei ole tunnettu tekniikan tason pe-15 rusteella. Tekniikan tason kuuluvissa julkaisuissa ei ole kuvattu, miten voidaan muodostaa Y. lipolytican transfor-mointiin soveltuvia ilmentymisvektoreita niin, etta saa-dut transformantit voivat ilmentaa ja erittaa heterolo-gista proteiinia. LisSksi, koska XPR-ilmentymisrakenteita 20 ei tunnettu, ei myOskaan ole voitu kuvata menetelmia Y. lipolytica -transformanttien muodostamiseksi, jotka transformantit eivat tuota alkalista proteaasia. Todet-takoon vieia, etta alan kirjallisuudessa ei mydskaan ole kuvattu menetelmia Y. lipoltica -transformanttien muodos-25 tamiseksi integroimalla ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformanttiin, jolla on heterologista DNA:ta vastaan-ottava kohta, eika tailaisten transformanttien kayttoa heterologisen proteiinin tuottamiseksi.
Kuten edelia todettiin, EP julkaisussa 138 508 ku-30 vataan menetelmaa Y. lipolytican transformoimiseksi, ta-han tarkoitukseen sopivia vektoreita ja alaklooneja, E. coli- ja Y. lipolytica -transformantteja, jotka sisai-tavat em. vektoreita, ja niiden kayttoa proteiinien tuot-tamiseen. Julkaisussa ei kuitenkaan kuvata eika ehdoteta 35 ilmentymisvektoreita, jotka sisaitavat XPR2-geenin sig-naali-, prol- tai pro2-sekvenssia ja joita voidaan kayt- 6 90352 taa Y. lipolytican transformointiin. Siten julkaisussa ei myttskaan lainkaan mainita, etta talla tavalla voidaan muodostaa transformantteja, jotka ilmentavat ja erittavat heterologista proteiinia.
5 Ep-julkaisussa 57 350 ei mydskaan kuvata, ehdote- ta tai mainita XPR2-geenin osaa sisaitavié ilmentymisvek-toreita, joita voitaisiin kayttaa Y. lipolytican trans-formointiin ja nain saada transformantteja, jotka il-mentavat ja erittavat heterologista proteiinia.
10 EP-julkaisussa 88 632 kuvataan tiettyja menetelmia hiivalle heterologisten proteiinien ilmentamista, kasit-telemista ja erittamista vårten. Menetelmat kuitenkin eroavat huomattavasti tassa julkaisussa kuvatuista mene-telmista. Esimerkkina todettakoon, etta menetelman mukai-15 sesti heterologinen esisekvenssi tai heterologinen sig-naalipolypeptidi taytyy fuusioda heterologiseen proteii-niin kun taas taman keksinnOn mukaisesti homologinen XPR2-geeni tai ainakin sen signaali- prol- tai pro2-sek-venssi lisataan vektoriin. Em. julkaisun mukaisesti siten 20 toimitaan painvastoin kuin tassa keksinnOssa.
MyOskaan US-patentissa 4 546 082 ei kuvata miten Y. lipolytican XPR2-geenin osaa sisaitavaa ilmentymisvek-toria voitaisiin muodostaa tai mihin sita voitaisiin kayttaa. Nain olien ei myttskaan kuvata Y. lipolytican 25 transformointia tailaisella vektorilla tarkoituksena muodostaa transformantteja, jotka ilmentavat ja erittavat heterologista proteiinia. US-julkaisussa 4 546 082 sen sijaan kuvataan Saccharomyces cerevisiaen α-tekijan gee-nia ja sen kayttoa.
30 Tama keksintd tarjoaa menetelmat vektorien valmis- tamiseksi, jotka vietyina Y. lipolytica -isantaan antavat isannaile kyvyn tuottaa ja erittaa alustaan spesifisia proteiineja, joita voi koodata mista tahansa lahteesta saatu heterologinen DNA, mutta erityisesti eukaryoottinen 35 ja synteettinen DNA; Y. lipolytica -yhdistelmakloonaus-vektoreita, jotka sisaitavat nisakasproteiinia ja muita 7 90352 polypeptideja koodaavaa heterologista DMA:ta, mukaan luettuina Y. lipolytica-isantien transformointiin sovel-tuvat plasmidit ja erityisesti integratiiviset ilmenty-misvektorit, jotka sisaitavat LEU2-geenipromoottorin, 5 XPR2-geenipromoottorin, alkalisen proteaasin prepro- alueen ja XPR2-terminaattorialueen; ja ilmentymisplasmi-deja, joissa on heterologinen koodausjakso ja XPR2-eri-tyssignaalit LEU2-promoottorin jaijessa ja joilla on kyky saada aikaan heterologisen proteiinin tuotanto ja eritty-10 minen niilia transformoiduissa Y. lipolytica -isannissa.
KeksintO valaisee siten valmiin heterologisen proteiinin ja erityisesti prorenniinin ja ihmisen anafyla-toksiini C5a:n tuottamista ja erittamista geneettisesti muutettujen Y. lipolytica -solujen viljelmista. Y. lipo-15 lytican eksosellulaarlsen alkalisen proteaasin aminohap- posekvenssin samoin kuin sita vastaavan DNA-sekvenssin tarkka selvittaminen on tehnyt mahdolliseksi paatelman, etta heterologista proteiinia voidaan tuottaa ja erittåa soluviljelma tuotantoon soveltuvilla yhdistelma-DNA-mene-20 telmilia. Prorenniinin ollessa kyseessa syntyva ja erit-tyva tuote on tsymogeenin (renniinin esiasteen) valmis muoto.
Nyt on havaittu, etta Y. lipolyticaa voidaan yh-distelma-DNA-tekniikan avulla muuntaa geneettisesti silia 25 tavalla, etta saadaan transformantteja, joilla on kyky tuottaa ja erittaa luontaisessa muodossaan olevia hetero-logisia proteiineja. Tama tehdaan muodostamalla vektorei-ta, joissa on XPR2-geenin signaalisekvenssi tai sen sig-naalisekvenssi ja ensimmainen esisekvenssi (prol) tai mo-30 lemmat esisekvenssit (prol - pro2) kytkettyina erittyvak-si halutun heterologisen proteiinin rakennegeenisekvens-siin.
Transformantit, joita tuotetaan sijoittamalla XPR2-lokukseen vektori-DNA, joka sisaitaa XPR2-fragmen-35 tin, josta puuttuu geenin molempien paiden alueelta saa-tely- tai rakennekomponentteja, eivat enaa tuota alkalis- β 90352 ta proteaasia, mika ei ainoastaan ole toivottavaa heterologisen proteiinin erityksen kannalta, vaan myds hyddyksi oletettujen transformanttien etsimisessa.
Vektorit, joissa on XPR2-promoottori ja alkalisen 5 proteaasin erityssignaalisekvenssia vastaavat sekvenssit, pystyvat lisaksi saamaan transformoidussa Y. lipolytica -solussa aikaan valmiin heterologisen proteiinin eritty-misen. Jotkut tamantyyppiset DNA-vektorit pystyvat saamaan aikaan ilmentymisen/erittymisen riippumatta siita, 10 mihin kohtaan hiivagenomia ne on sijoitettu. Yleensa vektorit, jotka sisaitavat riittavasti reuna-DNA:ta 5'- ja 3'-paissa, mahdollistavat tuotteen syntymisen riippumatta integraatiokohdasta.
Lisaksi on yliattavasti ja odottamattomasti ha-15 vaittu, etta pBR322-peraisen plasmidin sisailyttaminen Y. lipolytican kromosom!-DNA:han saa aikaan homologia-alueen, jolla on kyky edistaa muuta paikkaohjattua inte-gratiivista transformaatiota. Integroitunut pBR322-kopio toimii siten "telakoitumiskohtana" soluun tulevalle 20 transformoivalle DNAille. pBR322-kopion integroituminen Y. lipolytican kromosomi-DNArhan saa siten aikaan tun-netun integroitumiskohteen huolimatta siita, ettei pBR322 ole luontaista Y. lipolytica -DNA:ta. Y. lipolytica -transformaatiovastaanottajilla, joissa on tailainen koh-25 ta, on kaksi tarkeaa etua verrattuna vastaanottajiin, joista tailainen kohta puuttuu; lasna on paikkaohjatun integraation kohteeksi sopiva alue, jonka sekvenssi ja restriktiokartta tunnetaan; ja kayttamaiia pBR322 inte-graatiokohteena on mahdollista maarittaa, sisaitaakd so-30 luun sijoitettu plasmidi taydellisen funktionaalisen yk-sikOn eli geenin vai vain osan halutusta geenista. Esi-merkiksi plasmidilla, joka sisdltaa vain 3'-fragmentin XPR2-geenista, voitaisiin transformoida XPR2-1002-vas-taanottaja, jos se sisaitaa villia tyyppia olevan kodonin 35 ja integroituu XPR2-lokukseen. Samalla plasmidilla ei kuitenkaan voitaisi transformoida XPR2-1002-isantaa pro- 9 90352 teaasipositiiviseksi fenotyypiksi, jos se integroituu pBR322:een, koska siitå puuttuu kokonainen toiminnallinen yksikktt.
Siten Y. lipolytica -transformanteissa, jotka 5 sisåltåvåt homologia-alueen heterologiselle vektori- DNA:Ile, toimii mainittu, eksogeenista DNArta sisåltåvå alue vastaanottokohtana mainitun Y. lipolytican integra-tiivisen transformoinnin aikana. pBR322:n ja sen johdos-ten lisåksi kosmideja, bakteriofageja, kuten M13 ja lamb-10 da-fagia, synteettisesti valmistettua DNA:ta ja tavalli-sia plasmideja, kuten pUC13, voidaan kåyttåå telakoitu-miskohdan sisåltåvien Y. lipolytica -transformanttien tuottamiseen.
Keksinndn mukaiselle menetelmålle plasmidin pXX-15 33 valmistamiseksi on tunnusomaista, ettå pilkotaan plas- midi pXHP-24 HindIII:lla ja Aval:llå, jolloin saadaan 1 150 emåsparin fragmentti, eristetåån mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmen-tin 20 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3' 3 * CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5 ’ kanssa T4-ligaasin låsnå ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHI:llå, jolloin saadaan 1 25 196 emåsparin fragmentti, eristetåan mainittu 1 196 emås- parin fragmentti, ligatoidaan mainittu 1 196 emåsparin fragmentti 440 emåsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHI:llå ja Xmalillå ja noin 8,0 emåsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla 30 plasmidi pLS3 HindIII:llå ja Xmalrllå, T4-ligaasin låsnå ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit ja eristetåån plasmidi pXX-33 mainituista trans-formanteista.
35 KeksinnOn mukaiselle menetelmålle plasmidin pXX- 22 valmistamiseksi on tunnusomaista, ettå pilkotaan plas- >0 352 ίο midi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 890 em3sparin fragmentti, eristetaan mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmen-tin 5 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3 ' 3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5' kanssa T4-ligaasin I3sn3 ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHI:113, jolloin saadaan 10 920 emSsparin fragmentti, eristetaan mainittu 920 em3spa- rin fragmentti, ligatoidaan mainittu 920 emåsparin fragmentti 440 emSsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pil-kkomalla plasmidi pLS3 BamHIrlia ja Xmalrlia ja noin 8,0 kiloemåsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla 15 plasmidi pLS3 Hindlllrlla ja Xmal:113, T4-ligaasin 13sn3 ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transfor-mantit ja eristet33n plasmidi pXX-22 mainituista trans-formanteista.
20 Keksinndn mukaiselle menetelmålle plasmidin pXX- 11 valmistamiseksi on tunnusomaista ett8 pilkotaan plasmidi pXHP-24 Hindlllrlla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 750 emSsparin fragmentti, eristetaan mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen fragmentin 25 5’ TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3’AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' kanssa T4-ligaasin 13sn3 ollessa, pilkotaan siten saatu 30 ligaatiotuote Hindlllrlla ja BamHIrlia, jolloin saadaan 790 emdsparin fragmentti, eristetaan mainittu 790 emaspa-rin fragmentti, ligatoidaan mainittu 790 em3sparin frag-mentti 440 emåsparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrlia ja Xmalrlia ja noin 8,0 35 kiloemasparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 Hindlllrlla ja Xmalrlia, T4-ligaasin 13sna 11 90352 ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit ja eristetaan plasmidi pXX-11 mainituista trans-formanteista.
5 Keksinndn mukaiselle menetelmaile Y. lipolytica- transformantin valmistamiseksi on tunnusomaista, etta in-tegroidaan ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformant-tiin, joka sisaitaa heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisaitaa eksogeenista DNA:ta, 10 joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratii- visen transformoinnin aikana.
Alkalista proteaasia tuottamaton Y. lipolytica-transformantti valmistetaan keksinndn mukaisesti trans-formoimalla Y. lipolytican XPR*-kanta XPR-ilmentymis-15 rakenteella.
Keksinndn mukaiselle menetelmaile sellaisten Y. lipolytica-transformanttien toteamiseksi, joissa vek-tori-DNA on integroituneena XPR2-geenin, on tunnusomaista etta 20 (i) transformoidaan Y. lipolytican XPR*-kanta XPR- ilmentymisrakenteella; ja (ii) tutkitaan kohdan (i) mukaisesti tuotetuista transformanteista alkalinen proteaasi-aktiivisuuden havi aminen.
25 KeksinnOn mukaiselle menetelmaile heterologisen proteiinin tuottamiseksi Y. lipolytica-viljelman avulla on tunnusomaista, etta (i) Y. lipolyticaan viedaan ilmentymisvektori, joka sisaitaa Y. lipolyticalle heterologista proteiinia 30 koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnallisesti liit- tyneena (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai (b) vahintaan yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-geenin signaali-sekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi ja vahintaan yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai 35 XPR2-geenin promoottorisekvenssi; (ii) viljeliaan siten saatua kohdan (i) mukaista 90352 12 Y. lipolytica-transformanttia sopivassa ravintoalustassa, ja (ill) otetaan talteen heterologinen proteiinl.
Heterologlsta proteiinia voidaan tuottaa keksinniin 5 mukaisesti mytts viljelemållS Y. lipolytica -transformant-tia, joka siséltaa ilmentymisvektorin, joka sisaitaa Y-lipolyticalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sek-venssin ja siihen toiminnallisesti liittyneena (a) Y. li-polytican XPR2-geenin, tai (b) vahintaån yhden seuraavis-10 ta: Y. lipolytican XPR2-geenin signaalisekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi, ja vahintSSn yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai XPR2-geenin pro-moottorisekvenssi ja heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisaitaa eksogeenista DNA:ta, 15 joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratii-visen transformoinnin aikana, ja joka homologia-alue on perSisin pBR322:sta tai sen johdannaisesta.
Promoottorisekvenssilia "LEU2" tarkoitetaan ATG:n edelia olevaa transloitumatonta aluetta, joka sisaitaa 20 paaosan, ellei kaikkea, ilmentymisen vaatimista piirteis-ta.
Promoottorisekvenssilia "XPR2" tarkoitetaan sig-naali-(tai pre-)sekvenssin edelia olevaa transloitumatonta aluetta, joka on vaittamatfln ilmentymiselle. Lisaksi 25 XPR2-geenin signaalisekvenssia voidaan kayttaa yhdessa prosekvenssin kanssa tai ilman sita proteiinien eritta-miseen muiden Y. lipolytica -promoottorien kuin XPR2-geenipromoottorin ilmentymissaatelyn alaisena. Siten vek-torit, joissa on LEU2-promoottori ja alkalisen proteaasin 30 erityssignaalijaksoa vastaavat sekvenssit, pystyvat transformoidussa Y. lipolytica -solussa saamaan aikaan valmiin heterologisen proteiinin erittymisen.
Ihmisen anafylatoksiini C5a, joka tunnetaan myOs nimelia ihmisen komplementtiproteiini C5a (ihmis-C5a), on 35 biologisesti aktiivinen polypeptidifragmentti, jota muo- dostuu in vivo komplementin aktivoitumisen seurauksena.
Se toimii immunomodulaattorina ja sSStelee humoraalisen 90352 13 ja sellulaarisen iminuunireaktion tietty ja puolia. Sen ja mulden anafylatoksiinien primaarirakenne on kartoitettu. Yhteenvedon kemiallisesta, fysikaalisesta ja biologisesta karakterisoinnista esittaa Hugli teoksessa "Complement".
5 toim. H.J. Muller-Eberhard ja P.A. Miescher, Springer-Verlag, New York, 1985, s. 73-99.
Alan asiantuntijoille lienee selvaå, etta taman keksinnon yhteydessa voidaan tarpeellisin muutoksin kåyt-taå lahes mita tahansa tunnettua aminohapposekvenssiå koo-10 daavaa heterologista DNA:ta. Tassa esitettyja menetelmiå voidaan tarpeellisin muutoksin kåyttåa minkå tahansa heterologisen proteiinin, joista annetaan tyypillisia esimerk-keja US-patenttijulkaisussa 4 532 207, 30. kesakuuta 1985, tuottamiseen ja erittamiseen. Lisaksi mita tahansa muuta 15 Y. lipolytican erittåmåa proteiinia vastaavaa geenia, kuten ribonukleaasigeeniå ja hapanta proteaasia koodaavaa geenia, voidaan kayttaa XPR2-geenin sijasta, samoin kuin hybridi-geeneja, joita muodostetaan yhdistamalla fragmentteja kah-desta tai useammasta edella mainitusta geenista, esimer-20 kiksi XPR2-geenin signaalisekvenssi ja ribonukleaasigeenin promoottorisekvenssi.
Keksinnon piiriin sisaltyvåt myos tassa kuvattuja DNA- tai nukleotidisekvensseja funktionaalisesti vastaavat sekvenssit. Geneettisen koodin degeneratiivisuus tekee mah-25 dolliseksi korvata tiettyjS kodoneja toisilla kodoneilla, jotka koodaavat samaa aminohappoa ja johtaisivat siten sa-maan proteiiniin. DNA- tai nukleotidisekvenssi voi vaihdel-la huomattavasti, sillå metioniinia ja tryptofaania lukuun ottamatta tunnettuja aminohappoja voi koodata useampi kuin 30 yksi kodoni. Siten XPR2-geeni tai osia siita voitaisiin syntetisoida ja saada DNA-sekvenssi, joka on merkittavasti erilainen kuin kuviossa 3 esitetty. Sen koodaama aminohap-posekvenssi olisi kuitenkin ennallaan. Tietyn DNA- tai nukleotidisekvenssin tallaiset funktionaaliset muuttamiset 35 tarjoavat mahdollisuuden edistaa siihen liitettyjen vieraiden DNA-sekvenssien koodaamien heterologisten proteiinien 14 90352 eritysta ja/tai kåsittelyå, Kaikki geneettisen koodin sal-limat XPR2-geenin ja sen fragmenttien nukleotidisekvenssin variaatiot kuuluvat siten tåman keksinnon piiriin. Lisaksi on mahdollista jattåS pois kodoneja tai korvata yksi tai 5 useampi kodoni muilla kuin degeneratiivisilla kodoneilla, jolloin saadaan rakenteellisesti muunnettu polypeptidi, joka on kuitenkin suurin piirtein yhta aktiivinen ja kåyt-tokelpoinen kuin muuntamattoman DNA-molekyylin tuottama polypeptidi. Mainitut kaksi polypeptidia ovat funktionaa-10 lisesti ekvivalenttisia, samoin kuin niiden muodostumisen aikaansaavat kaksi DNA-molekyylia, vaikka mainittujen DNA-molekyylien valiset erot eivat liity geneettisen koodin degeneratiivisyyteen. Yksinkertaisin esimerkki tasta il-midsta on prorenniini A ja prorenniini B, prorenniinin kak-15 si alleelista muotoa, jotka eroavat toisistaan vain siina suhteessa, etta prorenniini A:n asemassa 286 on aspartaat-tiryhmå ja prorenniini B:n vastaavassa asemassa glysiini-ryhma.
Kayttamålla hyvåksi nåita menetelmiå, on saatu ai-20 kaan heterologisten nisåkasproteiinien prorenniinin ja ih-misen anafylatoksiini C5a:n muodostuminen ja erittyminen Y. lipolyticassa kSyttaen Y. lipolytican XPR2- ja/tai LEU2-geenien ilmentymis- ja erittymissignaaleja. Prorenniinia ja ihmisen anafylatoksiini C5a:ta koodaavat DNA-sekvenssit 25 kytkettiin synteettisten oligonukleotidien avulla XRP2- geenisekvenssiin kohtiin, joiden otaksuttiin koodaavan alkalisen proteaasin signaalipeptidia tai proteaasiesiasteen kasittelykohtia, joista kåytetaan tassa merkintoja prol ja pro2 ja muodostettiin geenirakenteita, jotka sitten sijoi-30 tettiin Y. lipolyticaan integratiivisella transformoinnil-la. Yhdistelmaviljelmat tuottivat ja kuljettivat kasvu-alustaan heterologisia proteiineja, joilla oli prorenniinin ja ihmisen anafylatoksiini C5a:n molekyylipaino ja im-muunireaktiivuus. TMten tuotetun prorenniin uskotaan ole-35 van asettuneena luontaiseen konfiguraatioon, koska se on 15 90352 propeptidin poistamisen jålkeen entsymaattisesti taysin ak-tiivista.
Termin "yhdistelmå-DNA-materiaali" piiriin sisåltyy tassa yhteydessa mika tahansa materiaali, joka sisaltaa 5 vahintåån yhden seuraavista osista: Y. lipolytican XPR2- geeni, sen signaali-(eli pre-), prol-, pro2- (jotka kak- si yhdessa muodostavat pro-alueen), promoottori- tai ter- minaattorisekvenssi; LEU2-promoottori; ja edella mainittu- jen kanssa funktionaalisesti ekvivalenttiset sekvenssit, 10 jotka ovat mahdollisia geneettisen koodin degeneratiivi- syyden perusteella. Tyypillisia esimerkkejå mainitusta yh- distelma-DNA-materiaalista ovat DNA-fragmentit, plasmidit tai vektorit tai transformantit, jotka sisåltavåt kaikki edella mainitut sekvenssit tai minka tahansa niistå.
15 Materiaalit: Restriktioendonukleaasit ja T4-ligaa- sin toimitti New England Biolabs, bakteriaalisen alkalisen fosfataasin Bethesda Research Laboratories, T4-polynukleo- 32 tidikinaasin PL-Biochemicals ja /gamma- P/ATP:n New England Nuclear. Kaikkia entsyymeja kaytettiin valmistajan 20 suosittelemissa olosuhteissa.
Alustat: GPP-alusta (glyseroli/proteoosi-peptoni-alusta) sisalsi (litraa kohden) 6,7 g glyserolia, 1,6 g Difco Proteose-peptonia, 1,7 g aminohappoja ja ammonium-sulfaattia sisaltamatonta Difco Yeast Nitrogen Basea, 25 30 mg urasiilia ja 0,5 ml/1 polypropyleeniglykolia (mole- kyylipaino 2 000, Polysciences) 40 mM fosfaattipuskurissa (pH 6,8). (Polypropyleeniglykoli jatettiin pois alustois-ta, joita kaytettiin renniinientsyymikokeisiin kasvatet-taviin viljelmiin.) Proteoosi-peptoni autoklavoitiin erik-30 seen fosfaattipuskurissa.
YEPD-alusta (hiivauute/peptoni/dekstroosi-alusta) sisalsi (litraa kohden) 5 g hiivauutetta, 10 g Bacto-hiivauutetta, 10 g natriumkloridia; pH saadettiin arvoon 7,5 natrium-hydroksidilla.
35 DNA-sekvenssianalyysit: Tassa kuvatuista eri plas- mideista peråisin olevat DNA-fragmentit eristettiin 90352 16 polyakryyliamidigeeleilla ja sekventoitiin Maxamin et al. menetelmalla /Methods in Enzymology, 65 (1980) 499,/.
Ligaatiomenettelyt: DNA-fragmentit, mukaan luettui-na pilkotut vektoriplasmidit, ligatoitiin sekoittamalla ha-5 lutut komponentit (DNA-fragmenttien paat sellaisessa muo-dossa, etta saadaan aikaan yhteensopivuus) ja T4-ligaasi. Ligaasia lisattiin noin 10 yksikkoå ^ug-maaria kohden vek-toria ja inserttifragmentteja. Tuloksena olevalla ligaa-tioreaktioseoksella transformoitiin komponentit E. coli 10 K12 -kannan MM294 (ATCC-33625) tai HB101 (ATCC-33694) solut.
Kemiallisesti syntetisoidun DNA:n valmistus; Hybri-digeenien muodostamiseksi prorenniinin tuotantoa ja eritys-ta vårten syntetisoitiin kahdeksan oligonukleotidia muunne-tulla fosforiamidiittimenettelylla /sinha et al., Tetra-15 hedron Letters 24 (1983) 58437 automaattisella DNA-synte-tisoijalla Genetic Design 6500 (Watertown, MA) ja puhdis-tettiin ne 6 M urea - 20 % polyakryyliamidigeeleilla. Yh-ta suuret måaråt komplementaarisia oligonukleotideja sekoi-tettiin keskenaMn ja saatettiin pariutumaan låmpdtilassa 20 4°C pitamalla seosta yon yli TE-liuoksessa (10 mmol/1
Tris-HCl, pH 8,01; 1 mmol/1 NaEDTA). Kaksisåikeiset oligo-nukleotidit fosforyloitiin noin 2 ^ug:n annoksina 20 ^,ul:ssa reaktioseosta, joka sisalsi 70 mmol/1 Tris (pH 7,6), 10 mmol/1 MgC^, 5 mmol/1 ditiotreitolia ja 5 mmol/1 25 ATP:ta, lampdtilassa 37°C T4-polynukleotidikinaasia kayt-taen.
Ilmentymis/erittymisvektorien muodostaminen proren-niinia vårten: Tehtiin sarja erilaisia rakenteita lopullis-ten ilmentymisvektoreiden aikaansaamiseksi. Kaikista vai-30 heista esitetaan kaaviot liitteena olevissa kuvioissa.
Yleisesti ilmaistuna DNA-fragmentit eristettiin geelielek-troforeesilla ja ligatoitiin muihin fragmentteihin tai pil-kottuun plasmidi-DNArhan 20 ^ulrssa liuosta, joka sisalsi 50 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol/1 MgC^, 20 mmol/1 35 ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP:ta ja 200 yksikkoå T4-ligaa, sia, lampotilassa 4°C. Jos tarvittiin DNA:n osittaista 17 90352 pilkkomista restriktioendonukleaasilla, optimaaliset pilk-komisajat måaritettiin kokeellisesti.
Prorenniinin identifiointi viljelmanesteesta: II-mentymisvektoreita sisåltaviå hiivatransformantteja kasva-5 tettiin yon yli GPP-alustassa (ks. edella). Kun hiivasolut oli poistettu sentrifugoimalla, lisåttiin 1 ml 50-%:ista TCA:ta/5 ml viljelmånestettå ja annettiin seoksen seista 60 minuuttia låmpotilassa 4°C. Sentrifugoimalla saadut pel-letit pestiin kahdesti 2 ml :11a kylmaa asetonia. Saostunut 10 proteiini liuotettiin SDS-nåytepuskuriin (100 ^ul) ja kå-siteltiin annoksittain elektroforeettisesti 10-%risilla SDS-polyakryyliamidigeeleilla /Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680/. Geelilla erottuneet proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosaan (Schleicher and 15 Schuell, 0,22 ^um) ja prorenniini identifioitiin levygee-lien immuunitSplaanalyysilla /Hawkes, R., et al., Anal. Biochem. 1 19 (1982) 142_7. Suodatin peitettiin kaniinin an-tiprorenniini-vasta-aineella ja inkuboitiin sitten peroksi-daasiin liitetyn vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-aineen 20 kanssa (Cappel, Malvern, Pa). Sitoutuneet vasta-aineet de-tektoitiin varjaamålla 4-kloori-1-naftolilla ja vetyperok-sidilla.
Viljelmanesteessa olevan prorenniinin maidon juok-setusaktiivisuus: Erilaisten Y. lipolytica -transformanttien 25 viljelmanesteistå tutkittiin niiden kyky juoksettaa maitoa kayttåmållå muunnosta Ernstromin menetelmasta /J. Dairy Sci. 41 (1958) 16647. Lyhyesti sanottuna kokeessa mitataan aika, joka aktivoiduissa viljelmasupernatanteissa olevalta renniiniltå kuluu puskuroidun rasvattoman maidon juokset-30 tamiseen ja verrataan nSita arvoja puhdistetulla renniini-standardilla saatuihin tuloksiin. Hiivaviljelmia (25 ml) kasvatettiin yon yli GPP-alustassa. Kun solut oli poistettu sentrifugoimalla, kylmåkuivattiin viljelmasupernatantit 5 ml:n annoksina alipaineessa. Kukin kylmåkuivattu super-35 natanttinayte suspendoitiin 300 ^ul:aan tislattua vetta. Valmistettiin myos laimennussarja puhdistetusta vasikan 18 90352 prorenniinistå vertailusarjaksi. Alustakonsentraateissa ja vertailunåytteisså oleva prorenniini aktivoitiin lisååmållå 5-10 ^,ul våkevåå suolahappoa, jolloin pH laski suunnilleen arvoon 2 ja inkuboimalla yksi tunti låmpotilassa 22°C.
5 Rasvaton maito valmistettiin lisååmållå 60 g rasvatonta kuivamaitoa (Difco) 500 ml:aan 41,5 mM natriumasetaatti-liuosta (pH 6,3), joka sisalsi 13,6 mmol/1 CaCl2 ja se-koittamalla 20 minuuttia 4°C:ssa. Substraatti kaytettiin kokeisiin heti valmistamisen jålkeen. 60 ^ul:n annos (vas-10 taa 1 ml viljelmåsupernatanttia) kutakin entsyymiprepa- raattia lisåttiin 1 ml:n annokseen rasvatonta maitoa låmpo-tilassa 37°C ja rekisteroitiin juoksettumisaika.
Synteettisten oligonukleotidien valmistaminen C5a-geenia vårten: C5a-rakennegeenin synteesissa kåytetyt oli-15 godeoksinukleotidit valmistettiin kemiallisesti muunnetul-la fosforiamidiittimenetelmalla (Sinha et al., loc. cit.) kayttamallM kontrolloitua huokoslasialustaa automaattises-sa DNA-syntetisoijassa Genetic Design 6 500 (Watertown, MA). Ohjelmassa kaytettiin detritylaatioon liuosta, joka 20 sisålsi 3 % (paino/tilavuus) dikloorietikkahappoa dikloori-metaanissa, fosforiamidiittien in line -aktivointia kyllåi-sellå tetratsoliliuoksella asetonitriilisså, cap-rakenteen muodostusta dietoksifosfiinitetratsolidillå ja hapetusta vesipitoisella jodin THF-liuoksella /Matteucci et al., J.
25 Amer. Chem. Soc. 105 (1981) 3183_7· Additiosyklin kokonais-kesto oli 14 minuuttia. Kymmenta 47-meeriå, kuvion 9 seg-mentit A-J, saatiin keskimåårin 98,8 %:n saannolla vaihetta kohden (trityylianalyysin mukaan), niistå poistettiin suo-jausryhmåt Matteuccin et al. (loc. cit.) menetelmållå, 30 saostettiin etanolilla 0,3 M natriumasetaatista ja eristet-tiin tuotteet preparatiivisella geelielektroforeesilla denaturoivilla 10-%:isilla polyakryyliamidi-ureageeleillå ennen vastinsåikeiden yhdiståmistå.
Ihmisen C5a-geenin kokoaminen, kloonaus ja sekven-35 tointi: Kuviossa 9 esitetåån halutun proteiinin aminohap-posekvenssi ja ihmisen C5a-proteiinia koodaavan geenin 19 90352 aikaansaantiin tarvittava synteettisten oligonukleotidien yhdistelmå. Kaikki oligometrit A:ta ja F:aa lukuun ottamat-ta fosforyloitiin 5'-påiståån T4-polynukleotidikinaasilla. Geenin rakentamiseen liittyi kaksi pååasiallista pariutu-5 mis/ligaatio-reaktiota, joissa liitettiin yhteen oligomee-rit A, B, I ja J; ja oligomeerit C, D, E, G ja H. Tulokse-na olevat 94 emasparin (ep) ja 141 ep:n kaksisaikeiset DNA-fragmentit eristettiin 10-%:isella polyakryyliamidigeelilla tehdyn elektroforeesin jålkeen, ligatoitiin toisiinsa ja 10 eristettiin 235 ep:n pituinen tuote geelielektroforeesilla. 235 ep:n DNA-fragmentti, joka sisalsi C5a:ta koodaavan ra-kennegeenin, sijoitettiin pBR322-vektori-DNA:n EcoRI- ja Hindlll-kohtien valiin ja transformoitiin tuotteella kompetent it E. coli K12 -kannan HB101 solut. Kuudesta trans-15 formantista eristetyn plasmidi-DNA:n restriktioanalyysi osoitti, ettå viisi kloonia kuudesta sisålsi oikean kokoisen EcoRI-HindIII-fragmentin. Kun tållaisen plasmidin C5a-geenialueen nukleotidisekvenssi mååritettiin Maxamin et al. menetelmållå /Methods Enzymol. 65 (1980) 499.7.
20 E. colille sopivan C5a-ilmentymisplasmidin muodosta- minen ja karakterisointi: DNA-fragmenttien eristysmenette-lyt ja ligaatioreaktioiden olosuhteet olivat Maniatisin et al. kuvaamat (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). E. colin trp-promoottori-ope-25 raattori saatiin alunperin ptrpLicsta /Edman et al.,
Nature, 291 (1981) 503J. 360 ep:n EcoRI-fragmentti, joka sisålsi C5a-ilmentymisplasmidissa (pC5a-48) kåytetyn trp-promoottori-operaattorisekvenssin, eristettiin prorenniini-ilmentymisplasmidista pPFZ-R2, jota kuvataan EP-hakemusjul-30 kaisussa 147 178, 3. kesåkuuta 1985.
C5a:n identifiointi Y. lipolytica -viljelmånestees-tå: Menettely oli muuten sama kuin edellå prorenniinin yh-teydesså kuvattu, mutta immuunitåplåtestisså kåytettiin vuohen anti-C5a:ta ja kaniinin anti-vnohi-IgG:tå (Cappel). 35 Vuohen anti(humaani c5a)-vasta-aine valmistettiin 20 90352
Manderinon et al. menetelmålla /j. Immunol. Methods, 53 (1982) 41-50J.
Vektorit: pLD40 - kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 138 508, 24.
5 huhtikuuta 1985.
Mikro-organismit: ATCC 20744 Yarrowia lipolytica PC-30869 ATCC 20781 XPR2:lla transformoitu Yarrowia lipolytica DL112, PC-30869 10 ATCC 20776 Yarrowia lipolytica DL-148. SnaBI-pilkotulla pLS-3;lla transformoitu Y. lipolytica ATCC 20688 ATCC 20775 Yarrowia lipolytica DL-144, pilkkomattomalla pLS-3:lla transformoitu Y. lipolytica ATCC 15 20688 ATCC 20777 SnaBI:lla pilkotulla pC5a-3:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20778 SnaBI-pilkotulla pXX-11:llå transformoitu Y. lipolytica PC-30869 20 ATCC 20779 SnaBI-pilkotulla pXX-22:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20780 SnaBI-pilkotulla pXX-33:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 ATCC 20794 pLD56:lla transformoitu Y. lipolytica PC-30869 25 ATCC 20795 Nrul-pilkotulla pLX-34:lla transformoitu Y. lipolytica ATCC 20794
Kannat on talletettu Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti the American Type Culture Collectioniin, Maryland, joka on tunnustettu talletuslaitos, joka sailyttaå talle-30 tetut kannat pysyvåsti ja luovuttaa ne julkiseen kayttoon, jos taman hakemuksen perusteella myonnetaSn patentti. Tåmån hakemuksen avoinnaoloaikana talletteet ovat niiden saata-villa, jotka Yhdysvaltain patentti- ja tavaramerkkivirasto maåraa siihen oikeutetuiksi lakien 35 CFR 1.14 ja 35 US 122 35 perusteella sekå muissa maissa, joihin taman hakemuksen vastineet tai sen jatkohakemukset jatetaan, vallitsevien 21 90352 patenttilakien mukaisesti. Kaikki talletettujen mikro-or-ganismien julkista saatavuutta koskevat rajoitukset pur-kautuvat peruuttamattomasti, kun patentti mydnnetaån.
Y. lipolytica ATCC 20774:n (Pfizer Inc:n kokoelmas-5 sa numero PC-30869) taksonomisen tutkimuksen teki tri J.R. DeZeeuw, joka antoi seuraavan kuvauksen. Kaytetyt menetel-mat ovat J.L. Lodderin suosittelemia (The Yeasts, 2. p.
N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970).
Vertailun vuoksi tutkittiin CBS 599, lajin Candida 10 lipolytica tyyppiviljelmå (The Yeasts, 2. p. N. Holland
Publishing Co., Amsterdam, 1970) ja CBS 6124, Saccharomyces lipolytica -tyyppiviljelmå (The Yeasts, 2. p.). Tasta la-jista kSytettiin myos nimea Endomycopsis lipolytica. Sen epataydellinen tila on Candida lipolytica. Lajin taksono-15 misen sijainnin vakiinnuttivat van der Walt ja von Arx /Åntonie van Leeuwenhoek, 46 (1980) 517-521_7. Nykyisin suo-siteltu nimi on Yarrowia lipolytica.
Kannan PC-30869 viljelylliset, morfologiset ja fysiologiset luonteenpiirteet sopivat yhteen standardikuvauk-20 sen kanssa, joka on annettu lajille Saccharomyces lipolytica teoksessa The Yeasts, 3. p., toim. Kreger-van Rij,,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, s. 406-408.
Taulukko 1 25 Yarrowia lipolytica -kantojen vertailu
Pfizer, nro Lahde Genotyyppi PC-30265 NRRL YB-423 (myds CBS 6124), tyvp- Villin tyy- piviljelma teoksessa The Yeasts, pin diploidi 3. p.
30 PC-30286 CBS, tyyppiviljelmå teoksessa MATA, villin
The Yeasts, 2. p. haploidi PC-30869 Katso alla olevaa tekstia MATB bio-6 leu2-40 xpr2-100 35 PC-30869 muodostettiin yhdistamalla geneettisesti Y. lipo lytica PC-22208:n (Pfizer, maasta eristetty kanta) ja 22 90352 Y. lipolytica PC-30026:n (NRRL Y-1094:n alaviljelma) sopi-vat mutantit. PC-30869 eroaa fenotyyppisesti villin tyypin vanhemmistaan siina suhteessa, ettå (1) se ei tuota aktii-vista solun ulkopuolista alkalista proteaasia, (2) se vaa-5 tii biotiinia kasvaakseen ja (3) se vaatii L-leusiinilah-teen.
ViljeltMessa PC-30869 hiivauute-peptoni-glukoosi-liemessa (YEPD-liemessa) ovat silmukoituvat solut kasvun logaritmisessa vaiheessa raunan muotoisia ja kooltaan kes-10 kimaarin 2,6 x 5,5 y.um. YEPD-agarilla pseudomyseelit ja aidot myseelit ovat vallitsevia. Blastosporeja esiintyy, etupaassa yksittSisina reuna-asemissa. Karotenoidipigment-teja ei ole havaittavissa. Viljelmå kayttaytyy "B"-pariu-tuvana haploidina risteytyksissa taman lajin autenttisten 15 testauskantojen kanssa (taulukko 5). Tyypillista askospo-rulaatiota havaitaan V8-agarilla. Hiilen assimilointiomi-naisuudet esitetaan taulukossa 2. Fermentaatiota ei esiin-ny. Kanta kayttaa ammoniumionia ja ureaa, mutta ei nitraat-tia, ainoana typpilåhteenaån (taulukko 3). Kannan PC-20 30869 tarvitsemat vitamiinit ovat tiamiini ja D-biotiini (taulukko 4). Viljelmat villin tyypin vanhenunat vaativat vain tiamiinia. Lampotilassa 37°C ei havaita kasvua.
- Taulukko 2
Hiilen assimilaatio .: 25
Referenssi- Viljelma
Lahde_kuvaus (b)_30265 30286 30869 1. L-arabinoosi - --- 2. Sellobioosi - --- 30 3. Erytritoli + +++ +++ +++ 4. D-galaktoosi - --- 5. D-glukoosi + +++ +++ +++ 6. Inositoli - --- 35 7. Laktoosi — --- 23 90352
Referenssi- Viljelmå
Lahde_kuvaus(b) 30265 30286 30~8t>9 8. Maltoosi - - - - 5 9. D-mannitoli + +++ +++ +++ 10. Raffinoosi - - - - 11. Ribitoli - - - - 12. D--riboosi -(+) ++ 10 13. L -ramnoosi - - - - 14. Liukoinen tarkkelys - - - - 15. Sakkaroosi - - - - 16 Trehaloosi - - - - 15 17. D-ksyloosi - - - - ig. .Meripihkahappo + +++ +++ +++ 19. Sitruunahappo + +++ +++ +++ 20 (a) Perusalusta oli Bacto-hiivatyppialusta, joka tayden-nettiin lisaåmalla 10 jUg/1 D-biotiinia ja 149 mg/1 L-leusiinietyyliesterihydrokloridia (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia) .
25 (b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
24 90352
Taulukko 3 (3)
Typpiassimilaatio
Referenssi- Viljelnå
Lahde_kuvaus _30265 30286 30869 5 1. (NH4) 2S04 + +++ +++ +++ 2. KN03 - - 3. Urea + +++ +++ +++ 10 (a) Perusalusta oli Bacto-hiivahiilialusta, joka taydennet- tiin 116 mg/l:lla natriumketoisokaproaattia (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia) ja 10 /Ug/lilla D-biotiinia.
(b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
Taulukko 4 15 Vitamiinivaatimukset^
Perusalustan Referenssi- Viljelmå taydennvs(c) tulos(b)_30265 30286 30869 1. Ei nitåan - tr tr - 2q 2. Tiamiini'HCl + +++ +++ 3. D-biotiini - tr tr tr 4, Tiamiini + biotiini + +++ +++ +++ 25 (a) Perusalusta oli vitamiiniton Bacto-hiiva-alusta + 149 mg/1 L-leusiinietyyliesteri-HCl (vastaa 100 mg/1 L-leusiinia).
(b) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
(c) 200 yUg/1 tiamiini-HCl ja/tai 10 /ug/1 D-biotiinia 30 merkityissa kohdissa.
„ 90352
Zd
Taulukko 5 Askosporulaatio
Pariutettu viljelma
Testauskanta 30265 30286 30869 5 Ei mitaån (pariutettu viljelma yksinåån) ++ 30264 (A-pariutuva tyyppi) ++ - +++ 30267 (B-pariutuva tyyppi) ++ +++ (a) Viljelmåt 30264 ja 30267 ovat vastakkaista pariutumis- 10 tyyppia olevia haploidikantoja, jotka tri. L.J.
Wickerham ystavallisesti antoi kayttoon. Niita kuva-taan julkaisussa Science 167 (1970) 1141.
(b) 30264 on Wickerhamin C. lipolytica YB-341 (c) 30267 on Wickerhamin C. lipolytica YB-432-12 15 Taulukko 6
Muut ominaisuudet
Referenssi- Viljelma arvo(a) 30265 30286 30869
Solun muoto Ovoidi Ovoidi Ovoidi Ovoidi 20 solun keskimåaråinen (2-4,5) x 3,3x 3,0x 2,6x koko (yum) (4-22) 9,1 8,2 5,5
Vegetatiivinen lisaan- Silmukointi Silmu- Silmu- Silmu- tyminen kointi kointi kointi
Fermentaatio Ei Ei Ei Ei 25 Pesakkeiden kasvu Nama kolme viljelmaM kasvoivat samalla tavalla ja sopivat yhteen kirjallisuuden kuvauksen kanssa Pseudomyseelit ja aidot myseelit vallitsevia. Biastosporeja esiin-tyy, etupaassa yksittaisina reunoilla.
30 Karotenoidipigmenttia ei havaittavissa.
(a) Kreger-van Rij. (loc. cit.).
PC-30869 eroaa muista patenttikirjallisuudessa ku-vatuista Y. lipolytica -kannoista, kuten kay ilmi fenotyyp-pien vertailusta (taulukot 7 ja 8).
35 ATCC 20228:11a (Nubel et al., US-patenttijulkaisu 4 155 811) on villin tyypin ravintokayttaytyminen samoin 26 90352 kuin lajin tyyppiviljelmilla CBS 599 ja CBS 6124. Tarkem-min måariteltynå se ei tarvitse urasiilia, leusiinia eikå biotiinia kasvaakseen ja se nesteyttaa gelatiinia.
ATCC 2062S (DeZeeuw et al., US-patenttijulkaisu 5 4 407 953) vaatii, toisin kuin ATCC 20228, leusiinitayden- nysta kasvaakseen. Samoin kuin ATCC 20228 se ei vaadi urasiilia eika biotiiniS. Myos se nesteyttaa gelatiinia.
ATCC 20688 (EP-hakemusjulkaisu 138 508) kasvaa vain, jos alustaa taydennetaan seka urasiililla etta leu-10 siinilla. Tama urasiilin tarve erottaa ATCC 20688:n seka ATCC 20228:sta etta ATCC 20628:sta. ATCC 20688 ei vaadi biotiinia ja nesteyttaa gelatiinia.
Viljelma PC-30869 eroaa kaikista edella mainituis-ta. Se vaatii biotiinia ja leusiinia, mutta ei urasiilia, 15 kasvaakseen. Se ei nesteyta gelatiinia.
Taulukko 7
Ravintovaatimukset
Alustasta poistettu ravintoaine
Ei mi- Leu- Ura- Bio- 20 ViljelmS téisn siini siili tiini CBS 599 +++ +++ +++ +++ CBS 6124 +++ +++ +++ +++ ATCC 20228 +++ +++ +++ +++ ATCC 20628 +++ - +++ +++ 25 ATCC 20688 +++ - - +++ PC-30869 +++ - +++
Muuttamaton alusta sisalsi 16,7 g/1 vitamiinitonta Bacto- hiiva-alustaa, johon oli lisatty 199 mg/1 urasiilia, 100 mg/1 L-leusiinia, 10 mg/1 B-tioniinia ja 200 ^ug/1 tia- 30 miinihydrokloridia.
27 90352
Taulukko 8
Gelatiinin nesteytys
Viljelma Nestevtvs CBS 599 + 5 CBS 6124 + ATCC 20228 + ATCC 20628 + ATCC 20688 + PC-30869 10
Alusta sisalsi 120 g/1 gelatiinia, 16,7 g/1 vitamiinitonta Bacto-hiiva-alustaa, 100 mg/1 urasiilia, 100 mg/1 L-leu-siinia, 10 ^ug/1 D-biotiinia ja 200 ^-ug/1 tiamiinihydroklo-ridia.
15
Kuvio 1 - Y. lipolytica -kannasta DL112 eristetty-jen toistensa kanssa limittyvien plasmidien pLD 57, pLD 58 ja pLD 62 linearisoitu osittaisrestriktiokartta.
Kuvio 2 - Synteettiset oligonukleotidikoettimet 20 XPR2-geenille. Julkaistusta sekvenssista, joka kattaa suu-rimman osan valmiin proteaasin 25 ensimmåisestå aminohappo-ryhmåstå (Ogrydziak et al., loc. cit.), kaksi aluetta (I ja II) tarjoavat mahdollisuuden muodostaa 14-meerisiå oli-gonukleotidikoettimia, joiden degeneratiivisyys on korkein-25 taan 32-kertainen. Nama kaksi aluetta alkavat aminohappojen 7 ja vastaavasti 18 kohdalta. Valmistettiin neljå erilaista 8-kertaisesti degeneratiivista seoskoetinta kununallekin alueelle ja merkittiin ne numeroilla 170-186 kuvan mukai-sesti. Esitetyissa ennustetuissa nukleiinihapposekvensseis-30 så "X" tarkoittaa kaikkia neljåå emåstå, "U" kumpaakin pu-riiniemåstå ja "Y" kumpaakin pyrimidiiniemåstå.
Kuvio 3 - XPR2-geenin nukleotidisekvenssi, jossa ovat mukana promoottori, pre-jakso (-157 - -136), prol-jakso (-135 - -98), pro2-jakso (-97- -1), alkalisen ekstra-35 sellulaarisen proteaasin jakso ja terminaattorijakso.
28 90 352
Kuvio 4 - Terminaattorivektorin pterm 5 muodostaminen.
Kuvio 5 - Plasmidin pLS-3 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
Kuvio 6 - Plasmidin pXX-33 muodostaminen ja restrik-5 tiokartta.
Kuvio 7 - Plasmidin pXX-22 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
Kuvio 8 - Plasmidin pXX-22 muodostaminen ja restrik-tiokartta.
10 Kuvio 9 - Ihmisen anafylatoksiini C5a:n aminohappo- sekvenssi.
Kuvio 10 - Plasmidin pC5a-48 restriktiokartta.
Kuvio 11 - Plasmidin pC5aX-3:n muodostaminen ja restriktiokartta.
15 Kuvio 12 - LEU2-geenin nukleotidisekvenssi.
Kuvio 13 - Plasmidin pLX-34 muodostaminen ja restriktiokartta , XPR2-geenin sekvenssianalyysi: Kloonatun XPR2-gee-nin DNA-sekvenssianalyysi tehtiin kemiallisella hajotus-20 menetelmalla /Maxam et al., Methods Enzymol., 65 (1980) 499'J plasmideista pLD57, pLD58 ja pLD62 (kuvio 1) ja pLD84 ja pLD86 (katso jaljempana) valmistetuista limittåi-sista restriktiofragmenteista. Tulokset osoittivat, ettå kloonatun hiivan genomi-DNA:t todella sisalsivat eksosel-25 lulaarista alkalista proteaasia koodaavan geenin. XPR2-geenin nukleotidisekvenssi ja nukleotidisekvenssistå påa-telty alkalisen proteaasin esiasteen ja sen signaalisek-venssin aminohapposekvenssi esitetaan kuviossa 3. Suuri osa eksosellulaarisen proteaasin aminohapposekvenssistSL 30 oli tuntematon (Ogrydziak et al., loc. cit.) ja esitetcLan tassa ensimmSisen kerran. Lisaksi eksosellulaarisen proteaasin tuotannon ja erittymisen vaatimia sekvenssejå kuvataan tassa ensimmSisen kerran. DNA-sekvenssi, joka koodaa alkalista proteaasia, sen esiastetta ja signaalisekvensseja, 35 koostuu 1 362 emasparista (kuvio 3). Tåmån polypeptidiket-jun primaarirakenteen paateltiin nukleotidisekvenssin 29 90352 perusteella olevan 454 aminohapporyhmån kokoinen. Alkali-nen proteaasi syntetisoidaan solussa esiastemuotoon, joka kasitellåån proteolyyttisesti erittyneeseen eli valmiiseen muotoon. Nukleotidisekvenssista paatellyn N-terminaalisen 5 aminohapposekvenssin analyysi antoi viitteen oletetun sig-naalipeptidin låsnaolosta esiastemolekyylissa. Mainittu signaalipeptidi sisaltaa 22 aminohapporyhmaa ja sen rakenne-piirteet ovat samanlaiset kuin korkeammilla eukarioottisil-la ja prokarioottisilla signaalipeptideilla /Perlman et 10 al., J. Mol. Biol,, 167 (1983) 391_7. Ennustetun aminohapposekvenssin sita aluetta, joka sopii yleisesti yhteen valmiin alkalisen proteaasin 25 tunnetun N-terminaalisen aminohapon kanssa /bgrydziak et al., J. Gen. Microbiol.
128 (1982) 1225,/, edelsi 157 aminohapporyhmaa, joihin si-15 saltyy signaalipeptidi ja kaksi trypsiinityyppista pilkkou-tumiskohtaa (Lys-Arg). Mainittuja pilkkoutumiskohtia kay-tettiin pro-alueen jakamiseen prol:ksi (-135 - -98) ja pro2:ksi (-97 - -1) (ks. kuvio 3). Valmis alkalinen proteaasi sisaltaa nukleotidisekvenssin perusteella 297 ami-20 nohappoa. Aminohapposekvenssit, jotka ennustettiin proteaasin erilaisille muodoille nukleotidisekvenssin perusteella, sopivat yhteen entsyymin puhdistettujen muotojen koko-jen kanssa. Alkalisen proteaasin esiasteen rakennesekvens-sin lisaksi maaritettiin noin 700 emåsparin verran 5'-paan 25 reunasekvenssiS ja 600 emasparia 3'-paah reunasekvenssia. Nåiden alueiden analysointi osoitti, etta ne sisåltavåt muiden eukarioottisten promoottorien ja terminaattorien kanssa analogisia sekvensseja ja ovat todennåkoisesti vSlt-tåmSttomia alkalisen proteaasin tuotannolle.
30 Kuten edellS mainittiin, menetelmia Y. lipolytican transformoimiseksi ja Y. lipolytica -geenien kloonaamisek-si mutaatioiden komplementoinnin kautta, mukaan luettuna erittynytta alkalista proteaasia koodaavan XPR2-geenin kloonaus xpr2-mutaation komplementoinnin kautta, kuvataan 35 EP-hakemusjulkaisussa 138 508. Siinå kuvattuun menettelyyn sisåltyy Y. lipolytica -isåntakannan transformointi 30 90352 Y- lipolytica -geenikirjaston Bglll-osittaispilkkomistuot-teella sijoitettuna vektoriin pLD40, jolle on tunnusmer-killista se, etta se sisaltaa pienen, Y. lipolytican LEU2-alueen sisåltåvån segmentin ja 3 EcoRI-, 4 EcoRV-, 5 Aval-, 5 Bglli-, 1 Ncol-, 1 Apal-, 2 Xhol- ja 1 BstXI-endonukleaa-sirestriktiokohtaa. Eråstå Y. lipolytica -transformanttia kaytettiin villin tyypin geenin (pLD84 ja pLD86) talteen-ottamiseen Y. lipolytica NRRL Y-1094:sta kaytettavaksi ilmentymis/erittymisvektorin muodostamiseen esimerkissa 1 10 kuvatulla tavalla.
LEU2-geenin sekvenssianalyysi: pLD25:ssa (EP-hake-musjulkaisu 138 508) olevan kloonatun LEU2-geenin DNA-sekvenssi mååritettiin limittaisten restriktiofragmenttien kemiallisella hajotuksella /Maxam et al., Methods Enzymol., 15 65 (1980) 499J. Beeta-isopropyylimalaatti(IPM-)dehydroge- naasia koodaavan alueen ja oikean lukukehyksen paikallis-tamiseksi kaytettiin hyvaksi ennustettua aminohapposekvens-sia, joka oli aiemmin måaritetty S. cerevisiaen LEU2-gee-nille /Andreadis et al.# J, Biol. Chem., 259 (1984) 8059_7. 20 identifioitiin se Y. lipolytica -genomisekvenssin alue, joka koodaa aminohapposekvenssiM, joka on homologinen S. cerevisiaen proteiinisekvenssin alueelle. 2,8 ke:n pitui-sen LEU2-geenin nukleotidisekvenssi ja sen perusteella paa-telty beeta-IPM-dehydrogenaasin aminohapposekvenssi esite-25 taån kuviossa 12. Lisåksi sekvenssia, joka vaaditaan Y.
lipolytican beeta-IPM-dehydrogenaasin tuotantoon, kuvataan tåssa ensimmaista kertaa. TStS 405 aminohaposta koostuvaa proteiinia koodaava DNA-sekvenssi koostuu 1 215 emåsparis-ta (kuvio 12). Beeta-IPM-dehydrogenaasia koodaavan sekvens-30 sin lisåksi mååritettiin noin 798 emåsparin verran 5’-påån reunasekvenssiå ja 797 emåsparin verran 3'-påån reunasek-venssiå (translaation lopetuskodoni TAA mukaan luettuna). Nåiden alueiden analysointi osoitti, ettå ne sisåltåvåt muiden eukarioottisten promoottorien ja terminaattorien 35 kanssa analogisia sekvenssejå ja ovat oleellisia ilmenty-miselle.
31 90352 Y. lipolytican LEU2-geenin 5'-påån edella oleva alue sisåltåå TATATATA-sekvenssin 78 emasparia luennan aloituskohdan edellå ja 30 emasparia ehdotetun mRNA-aloi-tuskohdan edella. Toinen sekvenssi, joka on tårkeå tran-5 skription aloitukselle eukariooteissa, ovat CAAT-"laatik-ko", joka LEU2-geenisså sijaitsee 74 emasparia oletetun transkription aloituskohdan edella, joka on asemassa -48 ep. ATG:hen nahden (kuvio 12).
3'-paan jålkeisella alueella on lopetuskodonin 10 (TAA) jålkeisten nukleotidien 72-120 valissa sekvenssi, joka on homologinen sekvenssille 5'-TAG....ΤΑ(T)GT....TTT-3', jota Zaret et al. /Cell, 28 (1982) 563/ pitavat tarkeana S. cerevisiaessa transkription lopetukselle.
Esimerkki 1 15 Kåytetty isantåkanta oli ATCC 20774 (MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002) XPR2-transformantti, Y. lipolytica ATCC 20781, loydettiin pesakkeena, joka muodosti vyohykkeen ras-vatonta maitoa sisaltavillå indikaattorilevyilla leusiinit-tomilta levyilta tehdyn replika-siirrostuksen jålkeen.
20 Transformantista eristettiin kromosomi-DNA EP-hakemusjul-kaisun 138 508 mukaisesti ja kaytettiin siitM erittynytta proteaasia vastaavan geenin talteenottoon. Kromosomi-DNA pilkottiin osittain Bglll-entsyymillå, ligatoitiin renkaan muodostavalla tavalla fragmenttiin, joka sisalsi vektoris-25 ta seka E. coli -replikonin ettå ampisilliiniresistenssi-geenin ja transformoitiin ligaatiotuotteella E. coli. Kromosomi-DNA pilkottiin myos Sall-entsyymilla ja tehtiin Southern-koe, joka osoitti, ettå transformantin normaali LEU2-alue oli såilynyt vahingoittumattomana. (Koettimena 30 kaytettiin LEU2-alueen 520 emåsparia Sall-EcoRI-segment-tiå, joka sijaitsee vålittomåsti pLD40:sså olevan LEU2-segmentin 5'-puolella.) Koska homologia on vålttåmåton kirjastoplasmidin integroimiseksi Y. lipolyticaan, on XPR2-alueen tåytynyt olla integroitumiskohtana. Kolme li-35 mittåistå, mutta erilaista plasroidia pLD57, pLD58 ja pLD62 otettiin alunperin talteen Y. lipolytica ATCC 20781:stå.
32 90352
Ne esitetaån kuviossa 1. Hybridisaatiot, jotka tehtiin kayttåmallå synteettisesti XPR2-geenille valmistettuja oli-gonukleotidi-koettimia, jotka perustuivat valmiin eritty-neen proteiinin tunnettuun, 25 ensimmciisesta aminohaposta 5 koostuvaan sekvenssiin (kuviot 2 ja 3), osoittivat, etta erittynytta proteaasia koodaava geeni on kloonautunut. Sen mSMrittcimiseksi, oliko talteen otettu geeni villia tyyppiå oleva kopio vai mutanttikopio, Y. lipolytica -vastaanot-tajakanta transformoitiin pLD58:lla. Koska yhdestMkaan 10 leusiinista riippumattomasta transformantista ei syntynyt proteaasipositiivisia transformantteja, pååteltiin, etta pLD58 sisalsi geenin mutanttialleelin.
Villin tyypin kannassa NRRL-1094 esiintyva XPR2-geenin muoto saatiin E. coli -pesakehybridisaatiokokeella. 15 Koettimena kaytettiin 2 ke:n PvuI-EcoRI-fragmenttia, jon-ka otaksuttiin sekventointitietojen perusteella sisaltå-van koko rakennegeenin. Alkuperåisesta kirjastosta, joka koostui pLD40:n sisaltaman NRRL Y-1094 -DNA:n Sau3A-osit-taispilkkomisfragmenteista ja jota kuvataan EP-hakemusjul-20 kaisussa 138 508, loydettiin muutama pesake, jotka hybri-disoituivat koettimen kanssa. Kaksi naista pesakkeistS sisålsivat keskenåSn hyvin samanlaiset plasmidit, pLD84 ja pLD86, joita kaytettiin ilmentymisvektoreiden kehitta-miseen. Kumpikin plasmidi sisaltaa samanlaisen sekvenssin 25 XPR2-alueen 51-paasta Sau3A-kohtaan (joka liittyi vektorin BamHI-kohtaan ja regeneroi sen), josta sekvenssi alkaa kuviossa 3. Kumpikin sisMltaa proteaasirakennegeenin koko-naan ja otaksutun transkription terminaattorin ja kaik-kiaan 4-5 ke:n verran kannan NRRL Y-1094 XPR2-alueelta 30 peraisin olevaa inserttiS. pLD86:ssa oleva insertti sisSl-taa muutaman sadan emSsparin lisSjakson 3'-paassa. Koska kaytettiin 3'-paan jatketta Bglll-kohtaan asti (emåspari 2655) ilmentymisvektorin muodostamiseen, kumpikin plasmidi sisalsi saman DNA:n, joka oli sekvenssiltaan funktio-35 naalisesti identtinen kuvion 3 sekvenssin kanssa.
33 90352
Ilmentymis/erittymisvektorien muodostaminen: Suun-nitelmassa, joka tehtiin prorenniinin tuotannon ja erit-tymisen aikaansaamiseksi Y. lipolyticassa, kåytetåån eri-laisten hybridigeenien sisållyttamistå integratiiviseen 5 kloonausvektoriin. Taten saadaan useita erilaisia plasmi-deja, joissa on laajoja yhteisistå DNA-sekvensseista koos-tuvia alueita. Itse asiassa kaytettiin modulirakennesuun-nitelmaa vektorien rakentamiseksi, joissa prorenniinigeeni on sijoitettuna ennustetun XPR2-signaalipeptidin kåsitte-10 lykohdan, otaksutun Prol-kasittelykohdan ja pilkkoutumis-kohdan, jonka tiedetåMn muodostavan valmista alkalista proteaasia, 3'-puolelle, Yleensa on toivottavaa sijoittaa heterologinen geeni ilmentymisen aikaansaamiseksi hiivan promoottori- ja terminaattorisekvenssien valiin. Tiedet-15 tiin, etta hybridigeenisekvenssien N-terminaalinen osa vaihtelee erilaisissa plasmidirakenteissa, mutta proren-niinirakennegeenisekvenssi, XPR2-terminaattorisekvenssi ja sukkulavektori-DNA olisivat samoja kussakin ilmentymisplas-midivektorissa. Suunnitelman mukaan samaa prorenniinira-20 kennegeenifragmenttia ja terminaattori/vektori-plasmidia kaytettaisiin kussakin ilmentymisplasmidirakenteessa, kuten jaljempana kuvataan. Erilaiset prorenniini-ilmentymis/ erittymisplasmidirakenteet vaihtelevat XPR2-geenipromoot-torisekvenssia valittomasti seuraavalla alueella prorennii-25 nigeenisekvenssia edeltavan N-terminaalisen alkalisen pro-teaasin esiastetta vastaavan sekvenssin pituuden suhteen. Siksi kunkin ilmentymisplasmidin promoottorifragmenttikom-ponentti suunniteltiin vaihtelevaksi sekvenssiksi XPR2-prorenniinisekvenssin liittymiskohdan alueella. Kaikki il-30 mentymis/erittyroisvektorit muodostettiin samanlaisella ligaatioreaktiolla, jossa kaytettiin kolmea komponentti-fragmenttia.
Terminaattorivektorin pterm4 muodostamisessa kayte-tyt vaiheet esitetaan kuviossa 4. Ensin ligatoitiin syn-35 teettinen kytkija fragmenttiin, joka sisalsi XPR2-geenin 3'-påan transkription lopetus- ja polyadenylaatiosignaalit 90352 34 mukaan luettuina. Lyhyesti ilmaistuna plasmidi pLD84 pil-kottiin endonukleaasilla Kpnl ja ligatoitiin synteettisen kaksisåikeisen, kuviossa 4 olevan kytkijå-DNA:n kanssa. Li-gaatiotuote pilkottiin endonukleaaseilla Hindlll ja Bglll, 5 ja sijoitettiin 760 emåsparin fragmentti samoilla kahdel-la endonukleaasilla linearisoituun plasmidiin pLD41, jol-loin saatiin pterm 4, Plasmidi pterm 4 restriktiokartoitet-tiin. Sarja tuotteita, jotka saatiin pilkkomalla restrik-tioendonukleaaseilla EcoRV, EcoRI, Kpnl, Bglll-Hindlll ja 10 Bglll-Bcll, analysoitiin. Pilkkomisilla saadaan sopivia fragmentteja, jotka vahvistavat synteettisen kytkijan ja XPR2-geenin "tSydellisen" 3'-påan lasnaolon sukkulaplasmi-dissa pLD41, jota kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 138 508. Tåman 7,3 ke:n terminaattorivektorin osittainen kartta 15 esitetMån kuviossa 4.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pLS-3 muodostaminen: Kuviossa 5 esitetaan påapiirteittMin ensimmaisen plasmi-din, jota kaytettiin prorenniinin erittymisen aikaansaan-tiin Y. lipolyticassa, muodostaminen. Sen restriktiokartta 20 esitetåån kuviossa 5. Prorenniinierittymisplasmidin muodostaminen aloitettiin valmistamalla fragmentti, joka sisalsi suurimman osan prorenniinirakennegeenin sekvenssistå.
1 080 emasparin BclI-BamHl-DNA fragmentti (osittainen pilk-kominen), joka sisalsi prorenniiniryhmia 6-365 koodaavan 25 sekvenssin, eristettiin E. coli -prorenniini-ilmentymisplas-midista pPFZ-84A. (Plasmidi pPFZ-84A on johdos prorenniini-ilmentymisplasmidista pPFZ-R2, jonka muodostamista kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 147 178, 3. kesåkuuta 1985 ja joka muodostettiin synteettisilla oligonukleotideilla ohjatulla 30 mutageneesilla, jossa kaytettiin restriktiofragmenttien vaihtoa. Tarkemmin ilmaistuna pPFZ-84A eroaa pPFZ-R2:sta vain kahdella emasparilla, jotka ovat prorenniiniaminohap-pojen 214 (Asn-Asp) ja 286 (Asp-Gly) kohdalla, niin etta se koodaa nk. prorenniini A -alleelia, molemmat plasmidit 35 sisåltåvat kuitenkin halutun prorenniinisekvenssin ja ovat toiminnallisesti ekvivalenttisia taman esimerkin 35 90 352 yhteydesså.) XPR2-promoottorikomponenttifragmentti, joka sisaltaa alkalisen proteaasin esiastetta (1-157) ja pro-renniiniå (1-5) koodaavat jaksot, valmistettiin seuraa-vasti. 870 emasparin HindIII-AvaI-DNA-fragmentti, joka si-5 saltaa promoottorialueen ja alkalista proteaasia vastaavan geenin 5'paan, eristettiin XPR2-aliklooniplasmidista pLD90. Tama fragmentti ligatoitiin synteettisen fragmentin kanssa, jonka rakenne oli: 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3' 10 3' C TAAGGACGAAGAAGATTAC GGTTCGCTC GAC TC TAGTGATCC TAG 5' luentasuunta ->
Tamå sekvenssi sisaltaa tarttuvan Aval-påån, sen jålkeen alkalisen proteaasin propeptidin viimeisiå yhdeksåå kodo-15 nia vastaavan jakson, sen jålkeen prorenniinin neljaa en-simmåistå aminohappoa koodaavan jakson ja paattyy BamHI-kohtaan. Promoottorikomponenttifragmentti muodostettiin ta-vanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa kåytettiin synteet-tista fragmenttia ja 870 emasparin HindIII-AvaI-fragment-20 tia seka T4-ligaasia ja tehtiin sen jSlkeen pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:lla. Saadut ligatoidut sekvenssit puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja va-likoitiin sopiva 916 emasparin HindIII-BamHI-DNA-fragmentti· Hybridigeenin 3f-pMå saatiin terminaattori/vektori-25 plasmidista pterm 4, jota kuvattiin edella. Plasmidi pterm 4 pilkottiin HindIII:lla ja Bell :11a ja eristettiin agaroosi-geelilla noin 7,3 ke:n Hindlll-BclI-terminaattori/vektori-DNA-fragmentti, joka sisalsi XPR2-terminaattorin, valikoi-tavissa olevan LEU2-markkerin ja pBR322:n.
30 Prorenniini-ilmentymis/erittymisplasmidi pLS-3 muo dostettiin inkuboimalla kolmea rakenneosina toimivaa DNA-fragmenttia (Hindlll-BamHl-pilkottu plasmidi pterm 4, 916 emasparin Hindlll-BamHI-promoottorifragmentti ja 1 080 ep:n prorenniinigeenin sisaltSva BamHI-BclI-fragmentti), jotka 35 muodostettiin edella. kuvatulla tavalla, T4-ligaasia låsna ollessa (ks. kuvio 5). Ligaatioseoksella transformoitiin 36 90352 E. coli K12 -kanta MM294 kåyttåmalla Dagertin et al.
/Gene, 6 (1979) 23-28/ CaCl2-nienetelmåa. Plasmidit eris-tettiin ampisilliiniresistenssin perusteella valikoiduis-ta transformanteista ja plasmidi pLS-3 identifioitiin 5 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 6A). Tåma plasmidin XPR2-prorenniinialue sekventoitiin synteettisen DNA:n oi-kean sekvenssin ja haluttujen fragmenttien oikean liitty-misen varmistamiseksi.
pLD90:n muodostaminen; Tamå plasmidi sisaltåa pLD84-10 alikloonin. DNA-alue, joka ulottuu XPR2:n prcitoot torialueel-la olevasta Pvul-kohdasta terminaattorialueella olevaan EcoRI-kohtaan, alikloonattiin pBR322:n Hindlll-kohtaan. Muutamia mikrogrammoja pLD84:aå pilkottiin edella maini-tuilla kahdella restriktioentsyymilla. Pilkottujen DNA-mo-15 lekyylien "tarttuvat" pSSt tåydennettiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla. Kinaasikasitellyt Hindlll-kytki-jåt (CAAGCTTG, New England Biolags) lisattiin sitten pai-hin T4-DNA-ligaasilla. Ylimååråiset kytkijåt poistettiin, muodostettiin tarttuvat Hindlll-påMt pilkkomalla sitten 20 Hindlll-entsyymilla. DNA-molekyyliseos kasiteltiin prepa-ratiivisella agaroosigeelillM, leikattiin irti haluttu 2 ke:n vyohyke, puhdistettiin se ja lisattiin ligaatio-reaktioseokseen yhdessa Hindlll-pilkotulla, bakteriaali-sella alkalisella fosfataasilla kasitellyn vektorin pBR322 25 kanssa. Ligaatioseoksella transformoitiin kompetentti E.
coli. Orientaatiomuodolle, jossa XPR2-terminaattorin EcoRI-kohta oli låhempana pBR322:n EcoRI-kohtaan, annettiin ni-meksi pLD90 ja vastakkaiselle orientaatiomuodolle pLD91. pLS-3:n sisaltamån XPR2-promoottorialueen 5'-paa 30 on Pvul-kohta, joka on noin 280 emasparin paassa kuviossa 3 sekventoituna esitetyn alueen alusta. Havaittiin, etteivat plasmidit, jotka sisalsivat villin tyypin proteaasigeenin vain taman promoottorimåaran ohjauksessa, integroituina genomiin siina olevasta xpr2-lokuksesta kaukana olevaan 35 kohtaan pystyneet antamaan transformantille kykya valmistaa 3v 90352 suuria måariå proteaasia (pååteltynå kuorittua maitoa si-såltavillå levyilla olevista kirkastumisvyohykkeistå).
Havaittiin, etta jos pLD-3 sisalsi lyhentyneen ja siten "vajavaisen" promoottorin, integraatiotuote, joka 5 seuraa plasmidin ja villin tyypin XPR2-geenin rekombinaa-tiosta, muodostaisi tåydellisen promoottorin, joka ohjaa prokymosiinifuusiotuotteen muodostusta, mutta vajavaisen proteaasituotantoa ohjaavan promoottorin. Vastaavan geenin rikkominen -tyyppisen kokeen tekivat Shortle et al.
10 /Science 217 (1982) 371-3737· S. cerevisiaen aktiinigee-nilla. Odotusten mukaisesti olivat jotkut pLS-3:n sisalta-vat leusiinista riippumattomat transformantit proteaasin suhteen vajavaisia. Namå proteaasin suhteen vajavaiset transformantit olivat todennåkoisemmin haluttuja tuottei-15 ta, joissa integraatio on tapahtunut XPR2-lokukseen kuin epatoivottavat sivutuotteet, kuten sellaiset, joissa gee-nimuutos on tapahtunut leu2:n kohdalla. Vastaanottajakan-nan ATCC 20688 ollessa kyseessa havaittiin, etta pilkko-maton pLS-3 muodosti 6,5 % proteaasin suhteen vajavaisia 20 transformantteja, kun taas SnaBI-pilkottu plasmidi tuotti noin 70 % proteaasin suhteen vajavaisia transformantteja. Tåhån transformointiin liittyvån geenin katkaisun avulla valtettiin tarve tehda suuria maaria Southern-taplakokei-ta oikean integraatiotuotteen ldytamiseksi kaikkien trans-25 formanttien joukosta.
Plasmidit, jotka sisåltavMt villin tyypin proteaasi-rakennegeenin XPR2-promoottorin såatelyn alaisena (alku esitetaån sekventoituna kuviossa 3), mahdollistavat suur-ten proteaasimåarien tuotannon integroituina Y. lipolytica 30 -soluihin muuhun kohtaan kuin xpr2-lokukseen. Heterologis-ten geenien tehokas ilmentyminen tåman kaltaisissa inte-granteissa saattaa kuitenkin vaatia taman kaltaisissa in-tegranteissa saattaa kuitenkin vaatia taman såatelyalue-DNA:n lisSmuuntamista.
35 Prorenniinin eritys: Y. lipolytica -kanta ATCC
20688 transformoitiin pilkkomattomalla pLS-3-DNA:11a ja 38 90352
SnaBI-pilkotulla pLS-3-DNA;11a, jolloin saatiin xpr Leu+-transformantit ATCC 20775 (DL144) ja vastaavasti ATCC 20776 (DL148). Nailla transformanteilla inokuloitiin YEPD-alustaa sisåltåvå koeputki. Solu ja kasvatettiin yon yli 5 28°C:ssa. Osa nåista viljelmistå (250 yul) laimennettiin suhteessa 1:100 (25 ml:ksi) GPP-alustalla. Soluja kasvatettiin ravistuspullossa 28°C:ssa 16-18 tuntia eli kunnes absorbanssi aallonpituudella 600 nm oli 5,0 - 7,0 ja kerat-tiin sentrifugoimalla. Tuloksena olevasta viljelmanestees-10 ta eli supernatantista tutkittiin prorenniinin lasnaolo konsentroimalla supernatantti ja tekemållå konsentraatille SDS-PAGE. Levygeeli siirrettiin elektroforeettisesti nitro-selluloosapaperille 20 mM Tris-emåksen, joka sisalsi 150 mmol/1 glysiiniå ja 20 % metanolia, lasnå ollessa kå-15 sittelemållå 500 mA:n virralla kaksi tuntia 4°C:ssa. Pro-teiinin poistuminen levygeeliltå varmistettiin vårjååmål-lå Coomassie-sinisellå.
Nitroselluloosapaperi kuivattiin låmpotilassa 37°C ja pidettiin sitten yksi tunti låmpotilassa 65°C, minkå 20 jålkeen se pestiin TBS-liuoksessa (200 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris-GCl, pH 7,5). Sitten paperia inkuboitiin yksi tunti huoneen låmpdtilassa TBS:sså, joka sisalsi 10 % hevosen seerumin (Gibco, Chagrin Falls. Ohio) ja sen jål-keen TBSrsså, joka sisålsi 10 % hevosen seerumia ja sopiva-25 na pitoisuutena prorenniinivasta-ainetta, 16 tuntia huoneen låmpotilassa. Sitten paperia pestiin kolmesti 10 mi-nuuttia TBS:sså, inkuboitiin 10 % hevosen seerumia sisåltå-våsså TBSrsså ja sitten kaksi tuntia TBS:sså, joka sisålsi 10 % hevosen seerumia ja sopivana pitoisuutena piparjuuri-30 peroksidaasiin sidottua vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-ai-netta. Sitten paperi pestiin kolmesti 10 minuuttia TBS:sså ja kehitettiin 4-kloori-1-naftolin (3 mg/ml metanolissa) låsnå ollessa, jota lisåttiin pitoisuudeksi 0,5 mg/ml, TBS:sså, joka sisålsi 0,01 % vetyperoksidia. Prorenniinin, 35 jonka molekyylipaino oli 40 000, lasnaolo kummassakin su-pernatantissa varmistettiin.
39 90352
Konsentroitujen viljelmåsupernatanttien (ks. edella) happoaktivoinnin jalkeen havaittiin pLS-3 sisaltåvista transformanttiviljelmistå ATCC 20775 ja 20776 valmistetuil-la nåytteilla olevan merkittåvå maidonjuoksetusaktiivi-5 suus. Kuten oli odotettavissa, vastaanottajakannasta Y. li-polytica ATCC 20688 valmistetulla vertailuviljelmasuperna-tantilla ei ollut maidonjuoksetusvaikutusta.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-33 muodostaminen: Muuntamiset, jotka tehtiin pLS-3:n muuttamiseksi paranne-10 tuksi ilmentymisplasmidiksi pXX-33, esitetåån paapiirteit-tain kuviossa 6. Tåmå muuntaminen suurensi XPR2-promootto-rialuetta 280 emasparilla. Samoin kuin pLS-3, ilmentymis-plasmidi pXX-33 sisaltaa hybridigeenin, joka koodaa koko alkalisen proteaasin prepro-peptidia (157 aminohapporyh-15 maa), liittyneenå koko prorenniinirakennegeenisekvenssiin.
Ennen kuin voitiin muodostaa prorenniini-ilmentymis/ erittymisplasmideja, joissa on 280 emasparin verran enemman XPR2-promoottorisekvenssia kuin pLS-3:ssa, oli vålttama-tdnta alikloonata koko alkalista proteaasia vastaavan gee-20 nin sisaltava restriktiofragmentti Hindlll-kohtaan. Tama aliklooni muodostettiin lisåamallå synteettiset kytkijat XPR2-genomikirjastokloonista pLD86 eristettyyn restriktio-fragmenttiin. Tåman XPR2-alikloonin, jossa on edella Hindlll-kohta, muodostaminen aloitettiin valmistamalla 25 DNA-fragmentti, joka sisalsi koko alkalista proteaasia vastaavan geenin. XPR2-kloonin pLD-86 genomialueelta eris-tetty 2,3 kern EcoRI-BamHI-(osittais)fragmentti puhdis-tettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja ligatoitiin syn-teettisen fragmentin kanssa, jonka sekvenssi oli 30 5' GATCGAAGCTTG 3' 3' TTCGAACTTAA 5'
Tama kytkijasekvenssi sisaltaå tarttuvan BamHI-påan (mut-ta ei regeneroi BamHI-kohtaa), sen jalkeen Hindll-kohdan ja sen jalkeen tarttuvan EcoRI-paan. Ligaatiotuote pilkot-35 tiin Hindlllrlla ja sijoitettiin pBR322:n Hindlll-kohtaan. Plasmidi ρΧΗΡ-·24 identifioitiin restriktiokarttansa 40 90352 avulla ja siitå tuli XPR2-promoottorifragmenttien lahde myohempiin ilmentymisrakenteisiin.
Plasmidissa pXHP-24 alikloonattu XPR2-geeni sisål-taå noin 280 emåsparia enemmån 5'-XPR2-promoottorisekvens-5 sia kuin pLS-3:n sisMltamå XPR2-promoottorisekvenssi. En-sin muodostettiin promoottorikomponenttifragtnentti tavan-omaisella ligaatioreaktiolla, jossa kåytettiin synteettis-tå DNA-fragmenttia (kuvattu edella pLS-3:n yhteydessa) ja pXHP-24: stå. eristettyå 1 150 emasparin Hindlll-Aval-frag-10 menttia yhdesså T4-ligaasin kanssa, minka jålkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla ja BamHI:llå. Tuloksena olevat li-gatoituneet sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesil-la ja valikoitiin noin 1 196 emåsparin pituinen Hindlll-BamH-fragmentti. Toinen fragmentti, joka sisalsi proren-15 niiniaminohapporyhmia 6-151 koodaavat sekvenssit, valmis-tettiin pLS-3:sta pilkkomalla BamHI:lla ja Xmal:lla ja puhdistamalla geelilla tuloksena oleva 440 emasparin BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisalsi loppu-osan prorenniinigeenista, XPR2-terminaattorin ja vektori-20 sekvenssit, valmistettiin pLS-3:sta pilkkomalla HindIII:lla ja Xmal:lla ja puhdistamalla geelilla noin 8,0 ke:n Hindlll-Xmal-vektorifragmentti. Namå kolme fragmenttia ligatoitiin sitten edella kuvatulla tavanomaisella menettelylla. Ligaa-tiotuotteella transformoitiin sitten E. coli K12 -kanta 25 MM294. Ampisilliiniresistenssin perusteella valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pXX-33 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella (ku-vio 6). Taman plasmidin proteaasi-prorenniinialue sekven-toitiin haluttujen fragmenttien oikean liittymisen varmis-30 tamiseksi.
Sitten transformoitiin Y. lipolytica ATCC 20744 Snal-pilkotulla pXX-33;11a, jolloin saatiin Y. lipolytica ATCC 20780 ja tutkittiin transformoitujen viljelmien ela-tusliemeen erittSma prorenniini edella pLS-3:n yhteydessa 35 kuvatulla tavalla. Taten vahvistettiin prorenniinin lasnå-olo viljelman supernatantissa.
41 90352
Konsentroitujen viljelmasupernatanttien (ks. edella) happoaktivoinnin jalkeen havaittiin merkittava maidonjuok-setusaktiivisuus nåytteillå, jotka oli valmistettu trans-formoidun Y. lipolytica ATCC 20780:n viljelmåstå.
5 Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-22 muodostaminen:
Vaiheet, jotka liittivat ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-22 muodostukseen, esitetaan kuviossa 7. Tama ilmenty-misvektori eroaa pLS-3:sta kahdessa suhteessa. Samoin kuin pXX-33 se sisaltaa 280 emasparin lisasegmentin XPR2-pro-10 moottorisekvenssia. Lisaksi se sisaltaa alkalisen proteaa-sin signaalipeptidia ja vain 38 pro-peptidin (prol) amino-happoryhmaa koodaavan sekvenssin.
pXX-22:n muodostaminen tapahtui samalla tavalla kuin pXX-33:n. Ensin muodostettiin promoottorikomponenttifrag-15 mentti tavanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa kaytettiin pXHP-24:sta eristettya 890 emasparin HindIII-BglII-frag-menttia ja synteettista fragmenttia 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3' 3' AAC GACTCTAGTGATCCTAG 5' 20 yhdessa T4-ligaasin kanssa, minka jalkeen tehtiin pilkkomi-nen HindIII:lla ja BamHI:lla. Saadut ligatoidut sekvenssit puhdistettiin eriståmållå geelielektroforeesin avulla 920 emasparin HindIII-BamHI-DNA-fragmentti. Toinen fragmentti, joka koodaa prorenniiniryhmia 6-151 eristettiin pLS-3:sta 25 pilkkomella BamHI:llS ja Xmal:lla ja puhdistamalla geelillS tuloksena oleva 440 ep:n BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisåltaå loppuosan prorenniinigeenista, XPR2-terminaattorin ja vektorisekvenssit, valmistettiin pilkkomalla pLS-3 HindIII:lla ja XmalillM ja puhdistamalla 30 geelilla noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Sitten nåma kol-me DNA-fragmenttia ligatoitiin edella kuvattua tavanomais-ta menettelya kayttåen. Ligaatiotuottee11a transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pXX-22 identifioitiin 35 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 7).
42 90352
Sitten transformoitiin Y. lipolytica ATCC 20774 SnaBI-pilkotulla pXX-22:lla, jolloin saatiin Y. lipolytica ATCC 20779, ja tutkittiin transformoitujen viljelmien ela-tusliemeen erittåmå prorenniini edella pLS-3:n yhteydesså 5 kuvatulla tavalla. Prorenniinin lasnaolo viljelman superna-tantissa vahvistettiin edella kuvatulla menettelylla. Kun konsentroidut viljelmasupernatantit oli aktivoitu hapolla (ks. edella), havaittiin merkittava maidonjuoksetusaktii-visuus nåytteilla, jotka oli valmistettu transformoidun 10 Y. lipolytica 20779:n viljelmasta.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pXX-11 muodostaminen: Vaiheet, jotka toteutettiin prorenniini-ilmentymis/eritty-misplasmidia pXX-11 muodostettaessa, esitetåan pååpiirteit-tain kuviossa 8. Tåma plasmidi sisaltaa XPR2-promoottoria 15 ja 22 aminohapporyhmån signaalipeptidia vastaavan sekvens-sin liittyneenS. prorenniiniå koodaavaan sekvenssiin. pXX-11:n muodostamisohjelma oli samanlainen kuin pXX-22:n ja pXX-33:n. Lyhyesti ilmeistuna promoottorikomponentti-fragmentti muodostettiin tavanomaisella ligaatioreaktiol-20 la, jossa kaytettiin pXHP-24:sta eristettya noin 750 ep:n HindIII-BglII-DNA-fragmenttia ja synteettista fragmenttia 5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3 ’ 3 ' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5'-> 25 yhdessa T4-ligaasin kanssa, minkå jålkeen tehtiin pilkko-minen HindIII:lla ja BamHI:lla. Tuloksena olevat ligatoi-tuneet sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesilla ja valikoitiin 790 ep:n Hindlll-BamHI-fragmentti. Toinen fragmentti, joka koodaa prorenniiniryhmia 6-151, eristet-30 tiin pLS-3:sta pilkkomalla BamHI:llå ja Xmal:lla ja puhdis-tamalla geelilla tuloksena oleva 440 ep:n BamHI-Xmal-DNA-fragmentti. Kolmas fragmentti, joka sisaltaa loppuosan prorenniinirakennegeenistå, XPR2-terminaattorin ja sukku-lavektorisekvenssit, valmistettiin pilkkomalla pLS-3 35 Hindlll:11a ja Xmal:lla ja puhdistamalla geelilla noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Sitten nama kolme DNA- 43 90352 fragmenttia ligatoitiin kåyttamålla edella kuvattua tavan-omaista menettelyå. Ligaatiotuotteella transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Valikoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidit pXX-11 identifioitiin 5 restriktiokarttansa perusteella (kuvio 8). Tåmå plasmidin XPR2-prorenniiniosa sekventoitiin synteettisen DNA:n oi-kean sekvenssin ja haluttujen fragmenttien oikean liitty-misen varmistamiseksi.
Y. lipolytica ATCC 20774 transformoitiin sitten 10 SnaBI-pilkotulla pXX-11:11a, jolloin saatiin Y. lipolytica 20778 ja tutkittiin transformoitujen viljelmien elatus-liuokseen erittama prorenniini edella pLS-3:n yhteydesså kuvatulla tavalla. Prorenniinin låsnåolo viljelmån superna-tantissa vahvistettiin edella kuvatulla tavalla.
15 Maidonjuoksetuskokeet (ks. edella) osoittivat, ettS
pXX-11 sisåltavien transformanttien ATCC 20778 viljelmåsu-pernatantilla oli merkittåva maitoa juoksettava vaikutus.
Esimerkki 2
Telakoitumiskohdan muodostaminen: Villin tyypin 20 ΒΙΟ-geeni, joka vastaa ATCC 20774:n bio-6-alleelia, kloo-nattiin komplementaation kautta seuraavasti. Muodostettiin pLD40:n (joka on pBR322 + LEU2 EcoRI-kohdassa) BamHI-koh-taan sijoitetusta, Sau3A:lla osittain pilkotusta Y. lipolytica -kromosomi-DNA:sta koostuva geenikirjasto ja val-25 mistettiin suuri maarå kirjasto-DNA:ta seosviljelma - E. coli -plasmidivalmisteena. (Tata samaa kirjastoa kaytet-tiin XPR2-geenin kloonaamiseen.) Muutamia mikrogranunoja kirjasto-DNA:ta pilkottiin Apal-entsyymilla (joka saa ai-kaan yhden katkeamisen LEU2-alueella). Sitten transformoi-30 tiin ATCC 20774 (leu2 xpr2 bio) talla DNArlla siirrostaen transformaatioseos leusiinittomalle synteettiselle alus-talle. Saatiin kymmenia tuhansia leusiinista riippumatto-mia transformantteja. Sen selvittamiseksi, mitkå, jos mit-kåan, pesMkkeet sisMlsivåt kirjastoplasmideja, joissa on 35 ΒΙΟ-geeni, leusiinista riippumattomat transformantit rep-likasiirrostettiin agarlevyille, jotka sisålsivat 44 90 3S2 biotiinivalikointialustaa (sisSltaa litrassa 25 mg detio-biotiinia, 20 g glukoosia, 5 g ammoniumsulfaattia, 1 g KH2P04, 0,5 g MgS04-7H20, 0,1 g CaCl2, 0,1 g NaCl, 500 ^ug boorihappoa, 400 ^ug tiamiinihydrokloridia, 400 ^ug ZnSo4· 5 7H20, 400 yug MnS04.H20, 200 ^ug Na2Mo04.2H20, 200 /ug
FeCl3.6H20, 100 jug Kl ja 40 ^,ug CuS04.5H20),
Yksi muutamasta biotiinivalikointialustalla kasva-vasta Y. lipolytica BI0+ -transformantista nimettiin DL31:ksi. Sitten pyrittiin eriståmåan Y. lipolytica -kan-10 nasta DL31 BIO-geenin sisaltavan geenikirjastoplasmidin. Kannan DL31 viljelmMstå preparoitiin kromosomi-DNA. Muu-tama mikrogramma tåtå kromosomi-DNA:ta pilkottiin restrik-tioentsyymillå Apal kirjastoplasmidin irrottamiseksi. Osa pilkotusta DNA:sta kaytettiin ligaatioreaktiossa tuntemat-15 toman kirjastoplasmidin sulkemiseen renkaaksi. Ligaatio-seoksella transformoitiin sitten E. coli -viljelma ampi-silliiniresitentiksi tuntemattoman BIO-geenin sisaltavan plasmidin keraamiseksi E. coliin. Saatiin muutamia ampisil-liiniresitenttejS E. coli -transformantteja. E. coli -trans-20 formanteista valmistettiin pienet plasmidipreparaatit. Siten saadun plasmidi-DNA:n restriktioentsyymipilkkomiset osoittivat, etta tuntematon BIO-geenin sisaltava plasmidi oli, kuten odotettiin, ekvivalenttinen pLD40:n kanssa, joka sisåltaå insertin BamHI-kohdassa. Tamån plasmidin t&y-25 tyy olla peraisin geenikirjastosta ja se nimettiin pLD51:ksi. Plasmidi pLD56 muodostettiin pLD51:n alikloonina poistamalla pLD51:stS LEU2-geeniseuraavasti. Osa plasmidis-ta pLD51 pilkottiin EcoRI:lla LEU2-alueen poistamiseksi. Pilkottu DNA kaytettiin DNA-ligaatioreaktiossa plasmidin 30 sulkemiseen uudelleen renkaaksi. Sitten transformoitiin E. coli pienemman BIO-geenin sisåltåvån plasmidin kloonaa-miseksi. Yhden ampisilliiniresitenteista E. coli -trans-formanteista osoitettiin sisaltavan odotetun pienemman plasmidin, joka nimettiin pLD56:ksi. pLD56:lle tehtiin useita 35 restriktioentsyymipilkkomisia. pLD56:n BIO-geenin sisaltava 45 90352 segmentti, joka esiintyy inserttina pBR322:n BamHI-kohdas-sa, oli noin 3,6 ke;n pituinen.
pBR322:n BamHI-kohdassa olevan 3,6 ke:n Y. lipoly-tica -DNA-insertin (muodostuu pLD56:sta) hyvin karkeaa 5 restriktiokarttaa kuvataan seuraavassa; approksimatiivinen etåisyys (emåsparia) insertion alusta annetaan suluissa. Kokoarvioinnit tehtiin muutamalta agaroosigeeliltå ja niis-sa voi olla suhteellisen suuria kvantitatiivisia virheitå: PvuII (800), PvuII (1 200), PstI (1 800), Mlul (2 000), 10 PstI (2 300), EcoRV (2 700) ja Ncol (3 200) (orientaatio on sellainen, etta pBR322;n Sall-kohta edeltåisi kuvattuja kohtia ja Hindlll-kohta olisi niiden jålkeen).
Kanta ATCC 20744 (MATB leu2-40 bio-6 spr-2-1002) transformoitiin koskemattomalla pLD56:lla (pBR322 + noin 15 3,6 ke y. lipolytica -kromosomi-DNA:ta, joka sisaltaa ΒΙΟ-geenin). Kolmesta erilaisesta biotiinista riippumatto-masta transformantista tutkittiin suuritiheyksinen Nrul-pilkotun (kohdistuu pBR322:een) pLD40:n (LEU2 pBR322:ssa) transformaatio verrattuna låhtokantaan, sen måarittåmisek-20 si, mika transformantti sisålsi ΒΙΟ-alueeseen integroitu-neen pBR322:n. Kaikissa kolmessa havaittiin suuritiheyksinen transformaatio, joka aiheutui pLD40:n integroitumises-ta transformantissa olleeseen pBR322:een. Tåmå vahvistet-tiin Southern-tåplåkokein. Yksi kolmesta alkuperåisestå 25 Y. lipolytica BIO -transformantista nimettiin DL118:ksi ja sitå kåytettiin edelleen DNA-vastaanottajana. Edellå esi-tettyå restriktiokarttaa tarvittiin mååritettåesså (i) mi-tå osaa kaytetåån ΒΙΟ-spesifisenå hybridisaatiokoettimena (Ncol-PvuII-pala), (ii) mitå entsyymiå tarvitaan pLD56-30 plasmidin oikeaan irrottamiseen (Mlul), (iii) mika entsyy-mi tekee kerran katkaisun vain pBR322-osassa (Clal) ja (iv) mika entsyymi ei pilko plasmidia ollenkaan (Apal).
ATCC 20774:n ja DL118;n DNA:n Clal- ja Apal-pilkkomistuot-teiden Southern-hybridisaatiot (koettimena ΒΙΟ-fragmentti) 35 osoittivat, kuten odotettiin, ettå kooltaan pLD56 vastaa-va DNA-additio oli katkaissut DLl18:n biotiinialueen 46 9 0 3 5 2 (verrattuna ATCC 20774:n ΒΙΟ-alueeseen). DL118-DNA:n Mlul-pilkkomistuotteet (koettimena pBR322) osoittivat lisaksi, etta additio oli saman kokoinen kuin koskematon pLD56.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pLD-34 muodostaminen: 5 On muodostettu ilmentymisplasmidi, jossa XPR2-erittymis-signaaleilla (157 aminohapon prepro-sekvenssit) varustettu prorenniiniå koodaava sekvenssi sijaitsee LEU2-promootto-rin jaljessa. Tama ilmentymisplasmidi osoittaa, etta muu-takin kuin XPR2-promoottoria voidaan kayttaa heterologis-10 ten proteiinien ilmentymisen aikaansaantiin. Talla ilmen-tymisvektorilla on lisaksi kyky saada aikaan ilmentyminen/ erittyminen riippumatta integraatiokohdasta Y. lipolytica -genomissa. Prorenniinin menestyksellinen eritys muulla promoottorilla kuin XPRslla osoittaa, miten kåyttokelpoi-15 nen ilmentymisvektorirakenne on vaihtoehtoisten uusien pro-moottorien identifioinnissa Y. lipolyticassa. Tatå låhes-tymistapaa voidaan lisaksi kayttaa ilmentymisviljelman aikaansaantiin, jossa on kaksi erillista hybridiprorennii-nigeenia, joista toinen ilmentyy LEU2-promoottorin ja toi-20 nen XPR2-promoottorin ohjaamana, integroituina isåntåge-nomin eri kohtiin.
Vaiheet, joita kåytettiin muodostettaessa ilmenty-misvektori, joka sisåltåå LEU2-promoottorisekvenssin oh-jauksessa ilmentyvan, alkalisen proteaasin erittymissignaa-25 leilla (157 aminohapon XPR2-prepro-sekvenssi) varustetun prorenniinigeenin, esitetåan pååpiirteittåin kuviossa 13. Taman plasmidin muodostaminen aloitettiin valmistamalla LEU2-promoottorifragmentti, joka sisalsi noin 300 emaspa-ria 5'-paån transloitumatonta sekvenssia, joka edeltaa bee-30 ta-isopropyylimalaattidehydrogenaasigeenin (kuvio 12) luen-nan aloituskodonin ATG. 300 ep:n HindIII-FokI-DNA-fragmentti, joka sisaltaa 270 ep:n osan LEU2-promoottorisekvens-sista, eristettiin sukkulavektorista pLD40. Tama fragmentti ligatoitiin 54 ep:n pituiseen synteettiseen kytkijaan 47 90352 —---—---Leu2-------
Fokl
5 ' - ATACAACCACACACATCCACAATG 3 ' - TTGGTGTGTGTAGGT GTTAC
5 -----------------Xpr2----------------
Bgll AAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3 ’ TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5’ T4-ligaasia kayttåen, minka jalkeen tehtiin pilkkominen 10 HindIII:lla. Tuloksena olevat ligatoidut sekvenssit puh-distettiin eristamalla geelielektroforeettisesti noin 360 ep:n pituinen HindIII-BglI-DNA-fragmentti. Toinen ra-kenneosana toimiva fragmentti, joka koodaa loppuosaa XPR2-prepro-sekvenssista ja prorenniinin 152 ensimmaista amino-15 happoryhmaa, eristettiin ilmentymisplasmidista pXX-33 (kuvio 6) pilkkomalla Bgll:11a ja Xmalrlla ja puhdistamal-la saatu 887 ep:n DNA-fragmentti geelilla. Kolmas fragmentti, joka sisaltaa loppuosan prorenniinigeenista, XPR2-terminaattorin ja vektorisekvenssit, valmistettiin pilkko-20 malla pXX-33 HindIII:lla ja Xmalrlla ja puhdistamalla gee-lillå noin 8,0 ke:n vektorifragmentti. Nama kolme DNA-fragmenttia ligatoitiin edella kuvatulla tavanomaisella me-nettelylla. Ligaatiosekseoksella transformoitiin E. coli K12 -kanta HB101. Ampisilliiniresistenssin perusteella va-25 likoiduista transformanteista eristettiin plasmidit ja plasmidi pLX-34 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella (kuvio 13).
Y. lipolytica ATCC 20794 (DL118) transformoitiin Nrul-pilkotulla pLX-34-DNA:11a, jolloin saatiin Y. lipo-30 lytica ATCC 20975 (DL251), ja tutkittiin leusiinista riip-pumattoman transformanttiviljelman alustaan erittamM pro-renniini edella pLS-3:n yhteydessa kuvatulla tavalla. Ta-må transforrnointimenettely ohjasi pLX-34:n integroitumaan pBR322-sekvenssiin, joka oli aiemmin viety isantakromoso-35 min (kuvattu edella) bio-lokukseen. pLX-34:n integroitu-minen tahan kohtaan varmistettiin Southern-analyysilla.
48 90352 DL118:n kaytto vastaanottaj ana; Southern-hybridi- saatiot tehtiin seuraavasti: DL118-transformantti:DNA:n (hybridisoitui esimerkiksi prokymosiinikoettimen kanssa, kun sijoitettu plasmidi oli prokymosiini-ilmentymisplas- 5 midi) pilkkominen Nrul :113. irrotti tarkasti transformant- tiin sijoitetun plasmidin. Muutamalla nanogrartunalla Nrul- pilkottua transformointiplasmidia tarkistettiin hybridi- soituvan vyohykkeen oikea koko. Myos naiden transformant- 32 tien DNA:n (koettimena P-leimattu pBR322) pilkkominen 10 Mlul:lla (Mlul ei katkaissut transformointiplasmideja) osoitti, etta DL118:ssa olleen pBR322-sekvenssin oli katkaissut yksi tai useampia molekyylejå lisattya transformointiplasmidia. Tama osoitti, etta integroituminen tapah-tui haluttuun kohtaan.
15 Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251) -transformantti- viljelmaa kasvatettiin YEPD-alustassa 22°C:ssa LEU2-pro-moottorin ohjauksessa tapahtuvan ilmentymisen edistamisek-si, Prorenniinin lasnaolo viljelmien supernatanteissa var-mistettiin happoaktivoitujen viljelmSsupernatanttien mai-20 donjuoksetuskokeella (ks. edella) ja vahvistettiin viela immuunitaplaanalyysillå (ks. edellS). Nama tulokset osoit-tavat, etta tama hybridigeeni on riippumaton ilmentymisyk-sikko, jolla on kyky saada aikaan ilmentyminen/erittyminen integroituna muuhun kuin XPR2- tai LEU2-kohtaan. Tama piir-25 re antaa mahdollisuuden muodostaa ilmentymisviljelma, jos-sa on useita hybridigeenejS ja jolla on mahdollisesti kyky saada aikaan ekrasellulaarisen prorenniinin tuotantomaåran lisSantyminen.
Esimerkki 3 30 Ihmisen C5a;ta koodaava synteettinen geenisekvenssi;
Suunnitelma, jota noudatettiin ihmisen anafylatoksiini C5a:n tuottamiseksi bakteereissa, oli analoginen aiempien menetelmien kanssa, joita kåytettiin EGF:n syntetisoimi-seen ja tuottamiseen ja joita kuvataan EP-hakemusjulkai-35 sussa 147 178. Siina kaytettiin geenirakennetta, jossa aktivoitunutta komplementtikomponenttia C5a koodaava 49 90352 sekvenssi valmistettiin synteettisesti. Ihmisen C5a:n tun-netun aminohapposekvenssin perusteella suunniteltiin DNA-fragmentti, joka koodaa sen 74 aminohappoa (kuvio 9). Syn-teettinen geenisekvenssi valittiin siten, ettå kåytettiin 5 mahdollisinunan paljon E. colin ja S. cerevisiaen suosimia kodoneja ja muodostettiin useita restriktioendonukleaasi-kohtia karakterisoinnin helpottamiseksi. Tamå låhestymis-tapa raahdollisti anafylatoksiinigeenin suoran ilmentamisen E. colissa sijoittamalla proteiinisynteesin aloituskodoni 10 ATG C5a-polypeptidin ensimmåistå aminohappoa koodaavan tripletin eteen. Jotta helpotettaisiin synteettisen C5a-geenin sijoittamista oikein orientoituneena plasmidiin pBR322, se suunniteltiin sisåltamåån EcoRI- ja Hindlll-restriktioendonukleaasitunnistuskohdat paissaSn. Valmistet-15 tavan C5a-geenisekvenssin muodostamiseksi syntetisoitiin 10 47-meeriå ja koottiin niistå 235 emasparin kaksisaikeinen DNA-fragmentti. C5a-geenifragmentti insertoitiin asianmu-kaisesti avattuun pBR322:een ja kloonattu geeni identifioi-tiin tekemalla sattumanvaraisesti valituista transforman-20 teista eristetyille plasmidi-DNA:ille restriktiopilkkomis-analyysi. Useiden C5a-kloonien DNA sekventoitiin sitten oikean sekvenssin sisaltavSn kloonin identifioimiseksi. Haluttu C5a-geenialueen nukleotidisekvenssi loydettiin kah-desta kloonista tutkittujen viiden kloonin joukosta.
25 ihmisen C5a:n tuottaminen bakteerissa: C5a-ilmen- tymisplasmidien muodostaminen aloitettiin pilkkomalla C5a-aliklooni restriktioendonukleaasilla EcoRI, minkå jalkeen tehtiin defosforylaatio kSsittelemalla bakteriaalisella alkalisella fosfataasilla. C5a-ilmentymisplasmidi muodos-30 tettiin kayttåmSlla pPFZ-R2:sta eristettya 360 ep:n EcoRI-DNA-fragmenttia, joka sisSlsi trp-promoottori-operaattorin ja ribosomin sitoutumiskohdan. E. coli -kannan HB101 kom-petentit solut transformoitiin ligaatioseoksella. Kustakin transformaatioseoksesta puhdistettiin useita laakkeelle 35 resistentteja pesakkeitå ja tehtiin niiden plasmidi-DNA:ille restriktiokartoitus niiden DNA:iden loytamiseksi, joissa 50 90 352 trp-promoottori on sellaisessa orientaatiossa, joka joh-taisi C5a-geenin transkriptioon. Tasta ligaatioreaktio-seoksesta identifioitiin useita naytteita, joissa oleva plasmidi sisalsi rinnakkaiset anafylatoksiinigeenin ja 5 bakteriaalisen promoottorin C5a-geenin suoran ilmentymisen vaatimassa konfiguraatiossa. C5a-ilmentymisplasmidin pC5a-48 restriktiokartta esitetåån kuviossa 10.
Ihmisen anafylatoksiinin tuottaminen ja erittaminen Y. lipolyticassa: Ihmisen anafylatoksiini C5a:n eritysta 10 koodaava ilmentymis/erittymisvektori pC5aX-3 valmistettiin kayttåmalla menetelmiå, joita kuvattiin esimerkissa 1 pXX-33:n yhteydessa. Y. lipolytica ATCC 20774 transfor-moitiin sitten tållå ilmentymisvektorilla ja tutkittiin transformoitujen viljelmien tuottama ihmis-C5a muuten edel-15 lå kuvatulla tavalla, mutta kåytettiin immuunitåplåkokeis-sa vuohen anti-C5a:ta ja kaniinin anti-vuohi-IgG: tå. C5a:n låsnåolo viljelmåsupernatantissa vahvistettiin tåmån kek-sinnon mukaiselle plasmidille.
Ilmentymis/erittymisplasmidin pC5aX-3:n muodostami-20 nen: Anafylatoksiini-ilmentymis/erittymisplasmidin pC5aX-3:n muodostamiseen liittyneet vaiheet esitetåån pååpiir-teittåin kuviossa 11. Tåmå plasmidi sisåltåå "tåydellistå" XPR2-promoottoria vastaavan sekvenssin ja 157 aminohapon signaalia ja propeptidiå vastaavan sekvenssin liittyneenå 25 synteettiseen sekvenssiin, joka koodaa 74 C5a-aminohappo-ryhmåå. pC5aX-3:n muodostamissuunnitelma oli samanlainen kuin pXX-33:n yhteydesså kåytetty. Ensin pilkottiin plasmidi pXHP-24 (tai muu halutun sekvenssin sisåltåvå plasmidi) HindIII:lla ja Aval:llå ja puhdistettiin geelillå 30 XPR2-promoottorin sisåltåvå 1 150 ep:n fragmentti. Toinen fragmentti, joka sisålsi XPR2-propeptidin 3'-pååtå koodaa-van jakson ja C5a-rakennegeenisekvenssin, muodostettiin ta-vanomaisella ligaatioreaktiolla, jossa kåytettiin E. coli -ilmentymisplasmidista pC5a-48 eristettyå 220 emåsparin 35 HinfI-HindIII-DNA-fragmenttia ja synteettistå fragmenttia 51 90352 5 ’ CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA 3' 3 ' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5' yhdesså T4-ligaasin kanssa, minka jalkeen tehtiin pilkko-5 minen Aval :11a ja HindIII:lla. Tuloksena olevat ligatoidut sekvenssit puhdistettiin geelielektroforeesilla ja vali-koitiin noin 250 ep:n AvaI-HindIII-fragmentti. Promootto-rin sisåltåvå Hindlll-Aval-fragmentti ja C5a:ta koodaava AvaI-HindIII-fragmentti ligatoitiin sitten T4-ligaasilla, 10 minka jalkeen tehtiin pilkkominen HindIII:lla. Noin 1,4 ke:n fragmentti puhdistettiin geelilla ja ligatoitiin Hindm-pilkotun pterm 4:n (kuvattiin edellM) kanssa. Li-gaatioseoksella transformoitiin E. coli K12 -kanta MM294. Ampisilliiniresistenssin perusteella valikoidut plasmidit 15 eristettiin valikoiduista transformanteista ja plasmidi pC5aX-3 identifioitiin restriktiokarttansa perusteella.
Y. lipolytica -kanta PC-30869, ATCC 20774, transformoitiin sitten SnaBI-pilkotulla pC5aX-3:lla ja tutkittiin transfor-moitujen viljelmien alustaan erittåmå anafylatoksiini edel-20 lå kuvatulla tavalla. C5a:n låsnåolo viljelmåsupernatan-tissa vahvistettiin edellå kuvatulla tavalla.
On tunnettua, etta monet endoplasman retikulumiin sitoutuneiden ribosomien syntetisoimat proteiinit tuote-taan glykoproteiineissa. Glykosylaatio saattaa itse asias-25 sa vaikuttaa kyseessa olevan proteiinin erittymiseen. Euka-rioottisten proteiinien N-sidottu glykosyloituminen tapah-tuu tripeptidisekvensseissa asparagiini-X-treoniini ja asparagiini-X-seriini, jossa X voi olla mikå tahansa amino-happoryhma, paitsi mahdollisesti aspartaatti /Hubbard, S.
.. . 30 et al., Ann. Rev. Biochem. 50 (1981) 555./. Prorenniinin aminohapposekvenssi sisåltåå kaksi tållaista tripeptidi-sekvenssiå; Y. lipolytica -viljelmien erittåmån prorenniinin geelielektroforeesianalyysisså ei kuitenkaan havaittu mitåån merkkejå glykosyloitumisesta. On todennåkoistå, et-35 teivat tripeptidisekvenssien sisaltåmåt tietyt asparagiinit 52 90352 glykosyloidu, koska ne ovat glykosylaatioentsyymien tåvoit-tamattomissa.
Ihmisen C5a;n ollessa kyseessa aminohapposekvenssi sisåltaå yhden glykosylaatiokohdan eli tripeptidisekvens-5 sin (Asn-Ile-Ser), jossa normaalisti on monimutkainen oli-gosakkaridi liittyneena asparagiiniin /Fernandez, H. et al., J. Immunol. 117 (1976) 1688/. Osa Y. lipolytican kasvu-alustaan erittyvistå C5a-molekyyleistå nåyttåå olevan gly-kosyloituneita, koska immuunitåplakokeessa havaitaan suu-10 ria molekyylipainoja vastaavassa osassa laaja antigeeni-aktiivisuusalue. Tama heterogeeninen liikkuvuus elektrofo-reesissa vastaa muiden erittyneiden proteiinien yhteydessa havaittua kåyttåytymistå ja aiheutuu todennakoisesti vaih-televassa maarin tapahtuvasta hiilihydraattien liittymi-15 sesta. Taman keksinnon yhteydessa tiettyjen heterologis-ten proteiinien ilmeinen glykosyloituminen viittaa siihen, etta ilmentymistå ja erittymista Y. lipolyticassa voidaan kåyttaa monien normaalisti glykosyloituneiden eukaryoot-tisten proteiinien tuotantoon.

Claims (41)

  1. 53. O 3 5 2
  2. 1. Menetelma heterologisen proteiinin tuottamisek-si Y. lipolytica -viljelman avulla, tunnettu 5 siita, etta (i) Y. lipolyticaan viedaan ilmentymisvektori, joka sisaltaa Y. lipolyticalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnallisesti liit-tyneena (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai (b) vahintaan 10 yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-geenin signaali-sekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi ja vahintéån yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promoottorisekvenssi tai XPR2-geenin promoottorisekvenssi; (ii) viljeliaan siten saatua kohdan (i) mukaista
  3. 15 Y. lipolytica -transformanttia sopivassa ravintoalustas- sa; ja (iii) otetaan talteen heterologinen proteiini.
  4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta heterologista proteiinia 20 koodaava DNA-sekvenssi on prorenniinia tai ihmisen anafy-latoksiini C5a:ta koodaava sekvenssi.
  5. 3. Menetelma heterologisen proteiinin tuottamisek-si, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20780 tunnis- 25 tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  6. 4. Menetelma heterologisen proteiinin tuottamisek-si, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -tranformanttia, jolla on kannan ATCC 20779 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  7. 5. Menetelma heterologisen proteiinin tuottamisek- si, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20778 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  8. 6. Menetelma heterologisen proteiinin tuottamisek- 35 si, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan ATCC 20777 tunnis-tusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa. 54 90352
  9. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta heterologista proteiinia koodaava geeni sijoitetaan XPR2-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssin vaiiin.
  10. 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta heterologista proteiinia koodaava geeni on prorenniinia tai ihmisen anafylatok-siini C5a:ta koodaava geeni.
  11. 9. Menetelma alkalista proteaasia tuottamattoman
  12. 10 Y. lipolytica -transformantin valmistamiseksi, tun nettu siita, etta transformoidaan Y. lipolytican XPR+-kanta XPR-ilmentymisrakenteella.
  13. 10. Menetelma Y. lipolytica -tranformanttien tote-amiseksi, joissa vektori-DNA on integroituneena XPR2-gee- 15 niin, tunnettu siita, etta (i) transformoidaan Y. lipolytican XPR*-kanta XPR-ilmentymisrakenteella; ja (ii) tutkitaan kohdan (i) mukaisesti tuotetuista transformanteista alkalisen proteaasin aktiivisuuden ha- 20 viaminen.
  14. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta Y. lipolytican XPR+-kanta transformoidaan pilkkomattomalla plasmidin pLS3 DNArlla tai Snal-pilkotulla pLS3-DNA:11a.
  15. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta Y. lipolyticalla on Y. lipolytica -kannan ATCC 20688 tunnistusominaisuudet.
  16. 13. Menetelma Y. lipolytica -transformantin valmistamiseksi, tunnettu siita, etta integroidaan 30 ilmentymisvektori Y. lipolytica -transformanttiin, joka sisaitaa heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka sisaitaa eksogeenista DNArta, joka toimii vastaanottokohtana Y. lipolytican integratiivisen trans-formoinnin aikana.
  17. 14. Menetelma heterologisen proteiinin tuotta- 55 90352 miseksi, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -transformanttia, jolla on kannan 20795 tunnistusominaisuudet, sopivassa ravintoalustassa.
  18. 15. Menetelma heterologisen proteiinin tuotta-5 miseksi, tunnettu siita, etta viljeliaan Y. lipolytica -transformanttia, joka sisaitaa ilmentymis-vektorin, joka sisaitaa Y-lipolyuicalle heterologista proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen toiminnal-lisesti liittyneenå (a) Y. lipolytican XPR2-geenin, tai 10 (b) vahintaan yhden seuraavista: Y. lipolytican XPR2-gee- nin signaalisekvenssi, prol- tai pro2-sekvenssi, ja va-hintaan yhden seuraavista: LEU2-geeni tai sen promootto-risekvenssi tai XPR2-geenin promoottorisekvenssi ja heterologisen vektori-DNA:n kanssa homologisen alueen, joka 15 sisaitaa eksogeenista DNA:ta, joka toimii vastaanottokoh-tana Y. lipolytican integratiivisen transformoinnin aika-na, ja joka homologia-alue on peraisin pBR322:sta tai sen johdannaisesta.
  19. 16. Menetelma plasmidin pXX-33 valmistamiseksi, 20 tunnettu siita, etta pilkotaan plasmidi pXHP-24 Hindlllrlla ja Aval:lia, jolloin saadaan 1 150 emasparin fragmentti, eristetaan mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-25 fragmentin 5'CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3'
  20. 3. CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5' 30 kanssa T4-ligaasin lasna ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllilla ja BamHI:lia, jolloin saadaan 1 196 emasparin fragmentti, eristetaan mainittu 1 196 emasparin fragmentti, 35 ligatoidaan mainittu 1 196 emasparin fragmentti 56 90 352 440 emasparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrlia ja Xmalrlia ja noin 8,0 emésparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 Hindlllrllå ja Xmalrlia, T4-ligaasin lasnå ollessa, 5 transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio- tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit ja eristetaan plasmidi pXX-33 mainituista transfor-10 manteista.
  21. 17. Menetelmå plasmidin pXX-22 valmistamiseksi, tunnettu siita, etta pilkotaan plasmidi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 890 emasparin fragmentti, 15 eristetaan mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen DNA-fragmentin 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3’ 20 3 * AACGACTCTAGTGATCCTAG 5 * kanssa T4-ligaasin lasna ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllrllå ja 25 BamHI:lia, jolloin saadaan 920 emasparin fragmentti, eristetaan mainittu 920 emasparin fragmentti, ligatoidaan mainittu 920 emasparin fragmentti 440 emasparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHI:lia ja Xmalrlia ja noin 8,0 kiloemås-30 parin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 HindIIl:lla ja Xmalrlia, T4-ligaasin lasnå ollessa, transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio-tuotteella, 35 valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit 57 90352 ja eristetaan plasmidi pXX-22 mainituista transfor-manteista.
  22. 18. Menetelma plasmidin pXX-11 valmistamiseksi, 5 tunnettu siita, etta pilkotaan plasmidi pXHP-24 HindIII:lla ja Bglllrlla, jolloin saadaan 750 emasparin fragmentti, eristetaan mainittu fragmentti, ligatoidaan mainittu fragmentti synteettisen frag- 10 mentin
  23. 5. TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3'AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5’ 15 kanssa T4-ligaasin lasna ollessa, pilkotaan siten saatu ligaatiotuote Hindlllilla ja BamHl:lia, jolloin saadaan 790 emasparin fragmentti, eristetaan mainittu 790 emasparin fragmentti, ligatoidaan mainittu 790 emasparin fragmentti 20 440 emasparin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 BamHIrlia ja Xmalrlia ja noin 8,0 kiloemas-parin fragmentin kanssa, joka saadaan pilkkomalla plasmidi pLS3 HindIII:lla ja Xmal:lia, T4-ligaasin lasna ollessa, ' 25 transformoidaan E. coli siten saadulla ligaatio- tuotteella, valikoidaan ampisilliiniresistentit transformantit Ja eristetaan plasmidi pXX-11 mainituista transfor-30 manteista. 58 » 50352 X. FOrfarande fOr framstållning av ett heterologt protein med en odling av Y. lipolytica, k å η n e -5 tecknat dårav, att (i) en expressionsvektor infiirs i Y. lipolytica, vilken expressionsvektor innehåller en DNA-sekvens som kodar ett protein vilket år heterologt i fOrhållande till Y. lipolytica, och, funktionellt bunden dårmed, (a) XPR2- 10 genen i Y. lipolytica, eller (b) åtminstone en av fdljan-de: signal-, prol- eller pro2-sekvensen av XPR2-genen i Y. lipolytica och åtminstone en av f01jånde: LEU2-genen och dess promotorsekvens eller promotorsekvensen av XPR2-genen; 15 (ii) den således erhållna Y. lipolytica-transfor- manten enligt punkt (i) odlas i ett låmpligt nåringsmedium, och (iii) det heterologa proteinet tillvaratas.
  24. 2. Fdrfarande enligt patentkrav 1, k å η n e - 20 tecknat dårav, att DNA-sekvensen som kodar det heterologa proteinet år sekvensen som kodar prorennin eller humant anafylatoxin C5a.
  25. 3. Fttrfarande fdr framstållning av ett heterologt protein, kånnetecknat dårav, att man odlar 25 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20780 i ett låmpligt nå-ringsmedium.
  26. 4. FOrfarande fOr framstållning av ett heterologt protein, kånnetecknat dårav, att man odlar 30 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20779 i ett låmpligt nåringsmedium.
  27. 5. FOrfarande fttr framstållning av ett heterologt protein, kånnetecknat dårav, att man odlar 35 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande ka- 59 9 0 3 5 2 rakteristika hos stammen ATCC 20778 i ett låmpligt nå-ringsmedium.
  28. 6. FOrfarande fOr framstållning av ett heterologt protein, kånnetecknat dårav, att man odlar 5 en Y. lipolytica-transformant med de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20777 i ett låmpligt nåringsmedium.
  29. 7. FOrfarande enligt patentkrav 1, kånne- t e c k n a t dårav, att genen som kodar det heterologa 10 proteinet placeras mellan promotor- och terminatorsekvensen av XPR2-genen.
  30. 8. FOrfarande enligt patentkrav 5, kånne- t e c k n a t dårav, att genen som kodar det heterologa proteinet år genen som kodar prorennin eller humant ana-15 fylatoxin C5a.
  31. 9. FOrfarande fOr framstållning av en Y. lipolyti-ca -transformant som inte producerar alkaliskt proteas, kånnetecknat dårav, att en XPR’-stam av Y. lipolytica transformeras med en XPR-expressionskons-20 truktion.
  32. 10. FOrfarande fOr påvisning av Y. lipolytica -transformanter, i vilka vektor-DNA har integrerats i XPR2-genen, kånnetecknat dårav, att (i) en XPR’-stam av Y. lipolytica transf ormeras ' : 25 med en XPR-expressionskonstruktion; och (ii) fOrlusten av alkalisk proteas -aktivitet hos transformanter producerede enligt punkt (i) undersOks.
  33. 11. FOrfarande enligt patentkrav 10, kånne-t e c k n a t dårav, att XPR*-stammen av Y. lipolytica 30 transformeras med ospjålkt DNA från plasmiden pLS3 eller med pLS3-DNA som spjålkts med Snal.
  34. 12. FOrfarande enligt patentkrav 10, kånne-tecknat dårav, att Y. lipolytica har de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20688.
  35. 13. FOrfarande fOr framstållning av en Y. lipoly tica-transformant, kånnetecknat dårav, att en 60 90352 expressionsvektor integreres i en Y. lipolytica-transfor-mant, som innehåller ett område homologt med det heterologa vektor-DNA:t och innehållande exogent DNA, som fungerer som recipientstalle under den integrativa transfor-5 mationen av Y. lipolytica.
  36. 14. FOrfarande f6r framstailning av ett heterologt protein, kannetecknat darav, att man odlar en Y. lipolytica-transformant med de identifierande karakteristika hos stammen ATCC 20795 i ett lampligt na- 10 ringsmedium.
  37. 15. Fcirfarande fOr framstailning av ett heterologt protein, kannetecknat darav, att man odlar en Y. lipolytica-transformant, som innehåller en expressionsvektor innehållande en DNA-sekvens som kodar ett 15 protein vilket ar heterologt i fdrhållande till Y. lipolytica, och, funktionellt bunden darmed, (a) XPR2-genen i Y. lipolytica, eller (b) åtminstone en av foljande: signalsekvensen, prol- eller pro2-sekvensen av XPR2-genen i Y. lipolytica, och åtminstone en av f01jånde: LEU2-ge-20 nen och dess promotorsekvens eller promotorsekvensen av XPR2-genen, och ett område homologt med det heterologa vektor-DNA:t och innehållande exogent DNA, som fungerar som recipientstalle under den integrativa transformationen av Y. lipolytica, och harstammande från pBR322 eller 25 ett derivat av denna.
  38. 16. FOrfarande fOr framstailning av plasmid pXX-33, kannetecknat darav, att plasmiden pXHP-24 spjaiks med HindiII och Aval, varvid ett fragment med 1 150 baspar erhålls, 30 namnda fragment isoleras, namnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet 1 ' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3 2 35 3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5' 2 61 90352 i nårvaro av T4-ligas, den således erhållna ligationsprodukten spjaiks med Hindlll och BamHl, varvid ett fragment med 1 196 baspar erhålls, 5 namnda fragment med 1 196 baspar isoleras, namnda fragment med 1 196 baspar ligateras med ett fragment med 440 baspar, som erhålls genom att spjålka plasmiden pLS3 med BamHl och Xmal, och med ett fragment med ca 8,0 baspar, som erhålls genom att spj&lka plasmi-10 den pLS23 med Hindlll och Xmal i nårvaro av T4-ligas, E. coli transformeras med den således erhållna ligat ionsprodukten , ampicillinresistenta transformanter utvåljs och plasmiden pXX-33 isoleras från nåmnda transforman- 15 ter.
  39. 17. FOrfarande fttr framstållning av plasmid pXX-22, kånnetecknat dårav, att plasmiden pXHP-24 spjålks med Hindlll och Bglll, varvid ett fragment med 890 baspar erhålls, 20 nåmnda fragment isoleras, nåmnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG. 3' 25 3’ AAC GACTCTAGTGATCCTAG 5’ 1 nårvaro av T4-ligas, den således erhållna ligationsprodukten spjålks med Hindlll och BamHl, varvid ett fragment med 920 baspar - 30 erhålls, nåmnda fragment med 920 baspar isoleras, nåmnda fragment med 920 baspar ligateras med ett fragment med 440 baspar, som erhålls genom att spjålka plasmiden pLS3 med BamHl och Xmal, och med ett fragment 35 med ca 8,0 kilobaspar, som erhålls genom att spjålka 62 90352 plasmiden pLS3 med Hindlll och Xmal, i nérvaro av T4-li-gas, E. coli transformeras med den således erhållna ligat ionsproduk ten, 5 ampicillinresistenta transformanter utvaljs och plasmiden pXX-22 isoleras från n&mnda transforman- ter.
  40. 18. Fdrfarande fdr framstållning av plasmid pXX-11, kånnetecknat d&rav, att 10 plasmiden pHPX-24 spjålks med HindiII och Bglll, varvid ett fragment med 750 baspar erhålls, nåmnda fragment isoleras, namnda fragment ligateras med det syntetiska DNA-fragmentet 15 5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3' 3'AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' i nSrvaro av T4-ligas, 20 den således erhållna ligationsprodukten spjSlks med Hindlll och BamHI, varvid ett fragment med 790 baspar erhålls, n&mnda fragment med 790 baspar isoleras, nåmnda fragment med 790 baspar ligateras med ett 25 fragment med 440 baspar, som erhålls genom att spjålka plasmiden pLS3 med BamHI och Xmal, och med ett fragment med ca 8,0 kilobaspar, som erhålls genom att spj&lka plasmiden pLS3 med Hindlll och Xmal, i nSrvaro av T4-li-gas,
  41. 30 E. coli transformeras med den således erhållna li gat ionsprodukten, ampicillinresistenta transformanter utvåljs och plasmiden pXX-11 isoleras från nSmnda transformanter.
FI864206A 1985-10-18 1986-10-17 Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi FI90352C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78920685A 1985-10-18 1985-10-18
US78920685 1985-10-18
US84112186 1986-03-18
US06/841,121 US4937189A (en) 1985-10-18 1986-03-18 Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI864206A0 FI864206A0 (fi) 1986-10-17
FI864206A FI864206A (fi) 1987-04-19
FI90352B FI90352B (fi) 1993-10-15
FI90352C true FI90352C (fi) 1994-01-25

Family

ID=27120892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI864206A FI90352C (fi) 1985-10-18 1986-10-17 Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi

Country Status (24)

Country Link
US (1) US4937189A (fi)
EP (1) EP0220864B1 (fi)
JP (1) JP3096297B2 (fi)
KR (1) KR900008950B1 (fi)
CN (3) CN1034428C (fi)
AT (1) ATE86302T1 (fi)
AU (1) AU586041B2 (fi)
CA (1) CA1340837C (fi)
DD (7) DD267995A5 (fi)
DE (1) DE3687878T2 (fi)
DK (1) DK496886A (fi)
EG (1) EG18142A (fi)
ES (1) ES2038966T3 (fi)
FI (1) FI90352C (fi)
HU (1) HU209150B (fi)
IE (1) IE59774B1 (fi)
IL (7) IL99893A (fi)
NO (2) NO177318C (fi)
NZ (1) NZ217985A (fi)
PH (3) PH27026A (fi)
PL (2) PL154427B1 (fi)
PT (1) PT83562B (fi)
RU (2) RU2157845C2 (fi)
YU (2) YU46412B (fi)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH082304B2 (ja) * 1987-12-17 1996-01-17 オリエンタル酵母工業株式会社 プラスミドとその製造方法
FR2626584B1 (fr) * 1988-01-28 1990-07-13 Agronomique Inst Nat Rech Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation
EP0382332A3 (en) * 1989-01-06 1990-11-14 Collaborative Research Inc. Improved supersecreting mutants of saccharomyces cerevisiae
JPH0669365B2 (ja) * 1989-05-22 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法
EP0402226A1 (en) * 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
JPH08508892A (ja) * 1993-09-02 1996-09-24 ファイザー・インク． 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体
US5837499A (en) * 1993-12-06 1998-11-17 Ciba-Geigy Corporation DNA encoding C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity and methods of expressing same
US5807824A (en) * 1993-12-06 1998-09-15 Ciba-Geigy Corporation C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity
DE19513152A1 (de) 1995-04-07 1996-10-10 Bundesrep Deutschland Verwendung eines "Immundefizienzvirus-supprimierenden Lymphokins (ISL)" zur Hemmung der Virusvermehrung, insbesondere von Retroviren
AU6125096A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Novartis Ag C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity and methods for preparation
EP0747484A1 (en) 1995-06-08 1996-12-11 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Upstream activator sequences and recombinant promoter sequences functional in yarrowia and vectors containing them
EP0922109A1 (en) 1996-05-21 1999-06-16 Novo Nordisk A/S Novel yeast promoters suitable for expression cloning in yeast and heterologous expression of proteins in yeast
FR2782733B1 (fr) 1998-09-01 2002-02-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede de transformation non-homologue de yarrowia lipolytica
US20110059496A1 (en) * 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7459546B2 (en) 2003-06-25 2008-12-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7259255B2 (en) * 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7202356B2 (en) * 2003-11-14 2007-04-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructose-bisphosphate aldolase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7264949B2 (en) * 2004-09-15 2007-09-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glycerol-3-phosphate o-acyltransferase promoter for gene expression in oleaginous yeast
US20060094102A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
EP2371967B1 (en) 2005-03-18 2015-06-03 DSM IP Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
WO2008042338A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
FR2927089B1 (fr) * 2008-02-05 2011-03-25 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Procede d'integration ciblee de multicopies d'un gene d'interet dans une souche de yarrowia
US8597931B2 (en) * 2008-07-11 2013-12-03 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Mutant yeast strains capable of accumulating a large quantity of lipids
FR2962133B1 (fr) 2010-07-01 2014-09-12 Agronomique Inst Nat Rech Optimisation de la synthese et de l'accumulation de lipides
JP2014503216A (ja) * 2010-12-30 2014-02-13 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー スクロース利用のための、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子の使用
WO2012135773A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia diacylglycerol acyltransferase promoter regions for gene expression in yeast
EP2694657A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 E. I. Du Pont de Nemours and Company Yarrowia n-alkane-hydroxylating cytochrome p450 promoter regions for gene expression in yeast
WO2012138612A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia peroxisomal 2,4-dienoyl-coa reductase promoter regions for gene expression in yeast
GB201106188D0 (en) * 2011-04-12 2011-05-25 Csir Production of extracellular polypeptides
FR3002774A1 (fr) 2013-03-04 2014-09-05 Agronomique Inst Nat Rech Levures mutantes ayant une production accrue de lipides et d'acide citrique
FR3005317B1 (fr) 2013-05-02 2016-03-18 Agronomique Inst Nat Rech Levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel
EA035512B1 (ru) 2014-01-31 2020-06-29 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Промоторы, подходящие для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах
US20170145449A1 (en) 2014-06-11 2017-05-25 Institut National De La Recherche Agronomique Improved lipid accumulation in Yarrowia lipolytica strains by overexpression of hexokinase and new strains thereof
WO2016075314A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-19 Institut National De La Recherche Agronomique Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica affectant la production de proteines
FR3028527A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-20 Pivert Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica
WO2017100158A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Danisco Us Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2017194424A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yeast strains with enhanced production of erythritol or erythrulose
EP3348647A1 (en) 2017-01-13 2018-07-18 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yeast strain capable of producing medium chain fatty acids

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
IN163393B (fi) * 1983-10-06 1988-09-17 Pfizer
US4628033A (en) * 1983-10-06 1986-12-09 Pfizer Inc. Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica
EP0166659B1 (fr) * 1984-06-26 1989-08-30 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Vecteurs de transformation de la levure yarrowia lipolytica, procédé de transformation et levure transformée

Also Published As

Publication number Publication date
PL154427B1 (en) 1991-08-30
IL99893A0 (en) 1992-08-18
PH27171A (en) 1993-04-02
YU46412B (sh) 1993-10-20
DD267995A5 (de) 1989-05-17
IL99892A (en) 1993-02-21
AU6416186A (en) 1987-05-14
IE59774B1 (en) 1994-04-06
PH27198A (en) 1993-04-16
DE3687878D1 (de) 1993-04-08
YU177386A (en) 1989-04-30
AU586041B2 (en) 1989-06-29
DD269397A5 (de) 1989-06-28
EG18142A (en) 1992-08-30
RU2157845C2 (ru) 2000-10-20
NO177318C (no) 1995-08-23
IL80297A0 (en) 1987-01-30
US4937189A (en) 1990-06-26
NO178793B (no) 1996-02-26
IE862754L (en) 1987-04-18
DD269396A5 (de) 1989-06-28
EP0220864B1 (en) 1993-03-03
PL261912A1 (en) 1987-10-19
IL99894A (en) 1993-02-21
KR870004138A (ko) 1987-05-07
NO864148L (no) 1987-04-21
IL99892A0 (en) 1992-08-18
KR900008950B1 (ko) 1990-12-15
DD267996A5 (de) 1989-05-17
FI864206A0 (fi) 1986-10-17
DD267997A5 (de) 1989-05-17
IL99893A (en) 1993-02-21
YU124588A (en) 1989-08-31
JP3096297B2 (ja) 2000-10-10
RU2069694C1 (ru) 1996-11-27
NO923616D0 (no) 1992-09-17
PL155850B1 (en) 1992-01-31
HUT43632A (en) 1987-11-30
YU46571B (sh) 1993-11-16
FI864206A (fi) 1987-04-19
CN1138632A (zh) 1996-12-25
NO923616L (no) 1987-04-21
EP0220864A1 (en) 1987-05-06
PH27026A (en) 1993-02-01
HU209150B (en) 1994-03-28
NZ217985A (en) 1991-06-25
DK496886D0 (da) 1986-10-17
DD276886A5 (de) 1990-03-14
ATE86302T1 (de) 1993-03-15
NO177318B (no) 1995-05-15
DE3687878T2 (de) 1993-07-15
IL80297A (en) 1993-02-21
IL99894A0 (en) 1992-08-18
JPS63164889A (ja) 1988-07-08
PT83562B (pt) 1989-05-31
CN1034428C (zh) 1997-04-02
PT83562A (en) 1986-11-01
DD267998A5 (de) 1989-05-17
CN1069346C (zh) 2001-08-08
CN86106522A (zh) 1987-09-16
CA1340837C (en) 1999-12-07
CN1141339A (zh) 1997-01-29
DK496886A (da) 1987-06-11
FI90352B (fi) 1993-10-15
ES2038966T3 (es) 1993-08-16
NO178793C (no) 1996-06-05
NO864148D0 (no) 1986-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI90352C (fi) Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi
US5102789A (en) Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
EP0123544A2 (en) Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor
JPS62104585A (ja) ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾
EP0213593B1 (en) Repressible yeast promoters
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
IL90170A (en) Method and yeast strains lacking ACSY Carboxypeptidase activity that have been transformed to form non-C-terminal polypeptides
WO1992013951A1 (en) Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
WO1991013971A1 (en) Neurospora expression system
US5217891A (en) DNA constructs containing a kluyveromyces α factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
EP0362183B1 (en) Process for the production of human lysozyme
EP0220689B1 (en) Method of using bar1 for secreting foreign proteins
FI96121B (fi) DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi
KR970005584B1 (ko) 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법
RU2198923C2 (ru) Нуклеотидная последовательность гена leu2 yarrowia lipolytica (варианты), рекомбинантный днк-материал (варианты), штамм дрожжей yarrowia lipolytica (варианты)
CA2002480C (en) Process for the production of human lysozyme
CA2089752A1 (en) Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom
PL156255B1 (pl) Sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych do transformowania Yarrowia lipoiytica

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: PFIZER INC.

MA Patent expired