JPH08508892A - 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーター；その改変ヤロウィア・リポリティカＬ ＥＵ２遺伝子プロモーターを含む改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子；及びその改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むベクターに関する。また、本発明は、ヤロウィア・リポリティカの組込み形質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含むベクター；ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、それに作動可能に連結されている、ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーターとを含むベクター；本発明のベクターを含む大腸菌形質転換体；本発明による発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体；多重組込み発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体の製造方法；前記形質転換体の製造に有用なヤロウィア・リポリティカ株；或るヤロウィア・リポリティカ形質転換体によるポリペプチドの製造方法；本発明による改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの製造において有用なヌクレオチド配列；及び改変ヤロウィア・リポリティカＬ ＥＵ２プロモーターの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体 技術分野 本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙ ｔｉｃａ ）ＬＥＵ２遺伝子プロモーター、及びその改変ヤロウィア・リポリティ カＬＥＵ２遺伝子プロモーターを含む改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺 伝子に関する。更に、本発明は、前記改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺 伝子を含むベクターに関する。前記ベクターには、ヤロウィア・リポリティカの ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組込み形 質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含むベクター；及びポリ ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、それに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌ ｙ）連結されている、ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーター とを含むベクターが含まれる。後者のベクターは、また、発現ベクターとして知 られている。更に、本発明は、本発明のベクターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 形質転換体に関する。 また、本発明は、本発明による発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ 形質転換体；多重組込み発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換 体の製造方法；前記形質転換体の製造に有用なヤロウィア・リポリティカ株；及 び或るヤロウィア・リポリティカ形質転換体によるポリペプチドの製造方法に関 する。更に、本発明は、本発明による改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺 伝子プロモーターの製造において有用なヌクレオチド配列、及び改変ヤロウィア ・リポリティカＬＥＵ２プロモーターの製造方法に関する。背景技術 ヤロウィア・リポリティカの形質転換方法、それに有用なベクター、及びその ベクターを含む形質転換体は、特に、米国特許第４,８８０,７４１号及び第５, ０７１,７６４号各明細書に開示及びクレームされており、両方とも本件の譲受 人に譲渡されている。ヤロウィア・リポリティカの形質転換に有用で、異種タン パ ク質の発現及び分泌用のベクター、形質転換体、及びそれによる異種タンパク質 の製造方法は、特に、これも本件の譲受人に譲渡されている米国特許第４,９３ ７,１８９号明細書に開示及びクレームされている。また、米国特許第４,９３７ ,１８９号明細書には、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子のヌクレオ チド配列（配列番号１で表わされる配列）が開示されている。 第ＷＯ９１／００９２０号（ＰＣＴ／ＥＰ９０／０１１３８）公報（１９９１ 年１月２４日発行）には、酵母染色体中への発現ベクターの多重コピー組込みに より形質転換された酵母による、同種又は異種タンパク質の製造方法が開示され ている。この方法で使用する発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする「 発現可能な遺伝子」及び「特定の培地中で酵母の増殖に必要な欠失選択マーカー 」［例えば、欠失ＬＥＵ２遺伝子（ｌｅｕ２ｄ）］の両方を含む。また、リボゾ ームＲＮＡをコードするＤＮＡも含む前記ベクターが開示されている。 第ＷＯ９２／０１８００号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４８９９）公報（１９９２ 年２月６日発行）には、酵母染色体のあらゆるところに高いコピー数で挿入する ことが可能な組込みプラスミドベクター及び前記組込みを達成する方法が開示さ れている。開示されたベクターは、「散在型反復要素（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｒ ｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＤＲＥ′ｓ）」、例えば、酵母δ配列 、Ｔｙ配列、及びｔＲＮＡ ＤＮＡ配列を使用する。発明の開示 本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子の製造に有用な、改 変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターを提供する。特には、 本発明は、配列番号１で表わされる配列の第６９３番目〜第７９８番目のヌクレ オチド、配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオ チド配列、第７２４番目のヌクレオチドがＡからＧに変えられている配列番号１ で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第７２５番目 のヌクレオチドがＴからＧに変えられている配列番号１で表わされる配列の第７ １８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第７２２番目のヌクレオチドがＡから Ｇに変えられている配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目 のヌクレオチド、配列番号１で表わされる配列の第７４５番目〜第７９８番目の ヌクレオチド、及びそれらの機能的等価物からなる群から選んだ、改変ヤロウィ ア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターを提供する。また、本発明は、ヤ ロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺伝子コード配列に機能的に連結されてい る、本発明による改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーターを含む、改変ヤロウィア・リ ポリティカＬＥＵ２遺伝子を提供する。 更に、本発明は、前記の改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含む ベクターを供給する。更に、本発明は、前記の改変ヤロウィア・リポリティカＬ ＥＵ２ 遺伝子と、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座 におけるヤロウィア・リポリティカの組込み形質転換に充分なヤロウィア・リポ リティカＤＮＡ配列とを含むベクターを提供する。前記ベクター用の好ましいヤ ロウィア・リポリティカＤＮＡ配列は、ヤロウィア・リポリティカのリボゾーム ＤＮＡ配列である。また、本発明により、以下の発現ベクターの構築に有用なベ クターが提供される。 ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座における組込み形質転換に充分なヤロウィア ・リポリティカＤＮＡ配列を含む、本発明によるベクターは、形質転換において 、複数部位に組込みが可能であり、従って、前記ベクターの多重コピーを含むヤ ロウィア・リポリティカ形質転換体が得られる。 更に、本発明は、ヤロウィア・リポリティカの形質転換により、前記ヤロウィ ア・リポリティカによる異種ポリペプチドの発現及びその分泌の両方が起きる発 現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、（前記の）改変ヤロウィア・リポ リティカＬＥＵ２遺伝子、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座以外の 遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組込み形質転換に充分なＤＮＡ配 列、ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２プロモーター、及び前記プロモーター に作動可能に連結される、ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子のシグナ ルプロ１−若しくはプロ２−配列、又はその機能的断片若しくは等価物（従って 、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結される）を含む。ＬＥＵ２遺伝子 座以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組込み形質転換に充分な ＤＮＡ配列が、ヤロウィア・リポリティカのリボゾームＤＮＡ配列である、ヤロ ウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子のシグナルプロ１−又はプロ２−配列を 含む 前記発現ベクターが好ましい。また、前記発現ベクター、又はポリペプチドが異 種ポリペプチドである好適発現ベクターが好ましい。本発明の好ましい異種ポリ ペプチドには、プロキモシン、プロインシュリン類似体、インシュリノトロピン （ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、及びヒトＴＧＦ−β３が含まれる。 更に、本発明は、本発明の発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ形質 転換体を提供する。また、本発明は、本発明による改変ＬＥＵ２遺伝子の選択に 有用である、ＬＥＵ２遺伝子座での欠失を含むヤロウィア・リポリティカ株と、 本発明のベクターを含む大腸菌形質転換体とを提供する。 更に、本発明は、同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培 地中で、本発明のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵させることを含む 、ポリペプチドの製造方法を提供する。 また、本発明は、多重組込み発現ベクターを含むヤロウィア・リポリティカ形 質転換体の製造方法を提供する。前記方法には、前記組込み形質転換が可能な発 現ベクター（ベクターは、組込み形質転換に充分なＤＮＡ配列中で、発現ベクタ ーを切断することによって、予め線状化する）による、ＬＥＵ２遺伝子の欠失を 有するヤロウィア・リポリティカ株の形質転換と、ロイシンを欠く培地上におけ る、もっともよく増殖する形質転換体の選択とが含まれる。 また、本発明により、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２プロモーターの 製造方法が提供される。前記方法は、５′末端及び３′末端を有し、配列番号１ で表わされる配列の領域に相同性又は実質的な相同性を有するＤＮＡ配列（前記 ５′末端は、配列番号１で表わされる配列のプロモーター領域の５′末端とは末 端を共有せず、その内部にある）を調製し；（ｉ）直前の記載のようにして調製 したＤＮＡ配列の３′末端が、配列番号１で表わされる配列由来のヌクレオチド を含むＤＮＡ配列の５′末端に連結され、ＬＥＵ２の構造遺伝子が形成される、 ＤＮＡ配列と、（ii）第２のヤロウィア・リポリティカ構造遺伝子をコードする 配列とを調製し；前記第２の構造遺伝子に相当する構造遺伝子における変異又は 欠失と、ＬＥＵ２遺伝子の欠失とを有するヤロウィア・リポリティカ宿主を、直 前の記載のようにして調製したベクターであって、前記第２の構造遺伝子をコー ドする領域内部で切断したベクターで形質転換し；ロイシンを含むが、増殖に前 記 第２の構造遺伝子を必要とする培地上で、ヤロウィア・リポリティカ形質転換体 を選択し；そして、前記のヤロウィア・リポリティカ形質転換体から、ロイシン を欠く培地上で増殖が劣る形質転換体をスクリーニングすることを含む。前記方 法で使用するのに好ましい第２の構造遺伝子は、ヤロウィア・リポリティカのＵ ＲＡ３ 遺伝子である。 本明細書及び付随する請求項において、「機能的断片」とは、その語句が言及 する配列の断片であって、その完全配列の全機能の少なくとも一部の機能を有す る断片を意味する。 本明細書及び付随する請求項において、「機能的等価物」とは、その語句が言 及する配列と同一又は実質的に同一の機能を有する配列を意味する。図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＮＢ２７６構築の模式的説明図である。 図２は、プラスミドｐＮＢ２４３構築の模式的説明図である。 図３は、プラスミドｐＮＢ３０８構築の模式的説明図である。 図４は、プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の模式的説明図である。 図５は、プラスミドｐＮＢ７４７構築の模式的説明図である。材料及び方法 プラスミド調製用の宿主として、大腸菌株ＤＨ５α（ベセスダリサーチラボラ トリーズ，ゲイサーズバーグ，メリーランド州からコンピテントセルとして入手 ）を使用した。商品添付の説明書に従って大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリ ン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させた。ＬＢ培地は、バ クトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、及び塩化ナトリウム１０ｇ（１ リットル当たり）を含有した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法［Ｂｉｒｎ ｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ７，１５１３（１９７９）］又は煮沸 法［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４ ：１９３（１９８１）］を使用して調製した。 制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、クレノウ ＤＮＡポリメラーゼ、ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ、及び後述する他の必 要な酵素は、ニューイングランドバイオラブズ（ベバリー，マサチューセッツ州 ） 及び／又はベセスダリサーチラボラトリーズ（ゲイサーズバーグ，メリーランド 州）から購入し、商品添付の説明書に従って使用した。すべての分子生物学的操 作は、標準的方法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第二版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って 実施した。 ヤロウィア・リポリティカ株は、１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン 、及び２％デキストロースを含む標準的な富養酵母培地（ＹＰＤ）又はロイシン を含まない完全最少培地［Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅ ａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］で２８℃で増 殖させた。形質転換は、Ｄａｂｉｄｏｗ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ １０：３９−４８（１９８５）による記載のようにして実施した。 発現用には、メジウムＡ（Ｍｅｄｉｕｍ Ａ；５％バクトペプトン，１％グルコ ース，０．１％酵母抽出物）で培養した。酵母ＤＮＡは、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ． ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓ ｓ（１９８６）による記載のようにして調製し、サザン分析は、標準条件［Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ 第二版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を使用して実施した。参照した前 記方法は、当業者に周知である。詳細な説明 １．改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーター及び改変ヤロウ ィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子の構築 ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド配列を、以下の配列 表に配列番号１で表わされる配列として示す。ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ ２ 遺伝子のヌクレオチド配列は、特に、米国特許第４，９３７，１８９号明細書 に開示されている。前記特許は、本件の譲受人に譲渡されており、その内容は参 照により本明細書に取り込まれる。更に、ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺 伝子を含むプラスミドｐＬＤ２５が、米国特許第５，０７１，７６４号明細書に 開示され、米国特許第４，８８０，７４１号明細書に開示及びクレームされてい る。両方の特許もまた、本件の譲受人に譲渡されており、その内容は参照により 本明細書に取り込まれる。プラスミドｐＬＤ２５は、ブタペスト条約の条件下、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル，メリーランド州 ，米国）に大腸菌形質転換体（ｐＬＤ２５を伴う大腸菌ＪＣ−３５５形質転換体 ）の形で寄託され、ＡＴＣＣ３９４６４と命名されている。ＡＴＣＣ３９４６４ の入手可能性におけるすべての制限は、米国特許第４，８８０，７４１号の付与 により取り除かれ、再び制限されることはない。 図１に、プロモーターを欠失させたＬＥＵ２遺伝子の構築を模式的に示す。ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として働くプラスミドｐＮＢ２５８には 、形質転換効率用のポジティブコントロールとしての野生型ヤロウィア・リポリ ティカＵＲＡ３遺伝子が含まれ、単一コピーでロイシン欠損宿主を相補する能力 に関して、プロモーターを欠失させたＬＥＵ２遺伝子をテストする能力を提供す る。ｐＮＢ２５８を構築するために、商品添付の説明書に従って、ＳｔｕＩ及び ＳａｌＩ制限酵素でプラスミドＤＮＡを消化し、クレノウフラグメントで制限消 化物を処理することによって、ＵＲＡ３配列を含む１．６ｋｂの平滑末端化ＤＮ Ａ断片をｐＬＤ１０６から単離した。このＤＮＡ約２００ｎｇと、ＳａｌＩ消化 、クレノウ平滑化、アルカリ性ホスファターゼ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＋ＳＫベクター（ストラトジーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリフォ ルニア州）約５００ｎｇとを、商品添付の説明書に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ を使用して連結した。連結混合物１／３で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１ ００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに蒔いた。形質転換体の選ばれ た単一コロニー単離体からＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で 消化した。１％アガロースゲルで制限断片を分離し、エチジウムブロマイド染色 により目に見えるようにした。ＵＲＡ３遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片が そこに存在することを基にして、プラスミドｐＮＢ２５７を同定した。 ＬＥＵ２コード配列を変えない一塩基変化により、その内在のＥｃｏＲＩ部位 を除去したＬＥＵ２遺伝子を構築した。ＬＥＵ２遺伝子構築物は、単一のＥｃｏ ＲＩ ＤＮＡ断片としてＬＥＵ２遺伝子を単離することができ、以降の操作をよ り便利なものにした。この構築物は、以下のようにして作製した。プラスミドｐ ＬＤ４０（ｐＢＲ３２２中にＬＥＵ２遺伝子を含み、米国特許４，８８０，７４ １号及び米国特許第５，０７１，７６４号各明細書に開示されている）由来のＤ ＮＡをＸｈｏＩで消化し、内在のＥｃｏＲＩ部位を含む２９塩基対のＤＮＡ断片 を除去し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。線状ＤＮＡを、０．７％アガ ロースゲルで電気泳動的に分離し、電気溶出した。この線状ＤＮＡ２００ｎｇと 合成リンカーＤＮＡ［相当するＬＥＵ２コドンを変化させることなくＥｃｏＲＩ 部位を除去する、一塩基対変化（第２２番目の塩基においてＣ／ＧからＴ／Ａへ ）を含む］５０ｎｇとを連結した。使用した合成リンカーの配列は、 （配列中、変化させた塩基を下線で示す）であり、以下の配列表用に、５′から ３′方向に示す以下の配列： からなる。連結混合物１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに蒔いた。形質転換体コロニー１６個から ＤＮＡを調製し、プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで消化した。０．７ ％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブロマイドに より目に見えるようにした。次に、１．６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断片でなく、 単一の２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を放出する、いくつかのプラスミド 由来のＤＮＡ５μｇをＳａｃＩで消化し、変えた内在のＸｈｏＩ断片を含む２４ ３ｂｐのＤＮＡ断片を放出した。５％ポリアクリルアミドゲルで断片を電気泳動 的に分離し、エチジウムブロマイド染色により目に見えるようにした。プラスミ ド１種類由来の２４３ｂｐのＳａｃＩ ＤＮＡ断片を電気溶出し、ＳａｃＩ消化 及びアルカリ性ホスファターゼ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ ＤＮＡ ２００ｎｇと連結した。青色／白色選択用の商品添付の説明書に従って、連結混 合物で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラトジーンクローニングシステムズ， ラホイラ，カリフォルニアリ州）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン 、ＩＰＴＧ、及びＸ−ＧＡＬを含むＬＢプレートに蒔いた。白色の形質転換体コ ロニー１０種類からプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｃＩで消化し、５％ポリア クリルアミドゲルで断片を電気泳動的に分離し、挿入の存在を確認した。挿入を 含むプラスミド２種類由来のＤＮＡを、ジデオキシチェインターミネーション法 （シークエナーゼキット，ユナイテッドステーツバイオケミカルコーポレーショ ン，クリーブランド，オハイオ州）を用いてシークエンスして、ＬＥＵ２コード 配列内部のＸｈｏＩ ＤＮＡ断片の正確な方向を確認した。変えた内在のＸｈｏ Ｉ断片を有するＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミドの１種類をｐＬＤ１０４９と命 名した。 次に、ｐＮＢ２５７由来のＤＮＡ約５００ｎｇをＥｃｏＲＩで消化することに よって、プラスミドを線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬＤ１ ０４９から単離したヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含む２．５ｋｂ のＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片約２００ｎｇと連結した。得られた連結混合物１／５ で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ プレートに形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体コロニーからプラスミドＤ ＮＡを調製し、各プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで消化した。０．７ ％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブロマイドに より目に見えるようにした。ＬＥＵ２遺伝子を含む２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ Ｄ ＮＡ断片を含む形質転換体を、ｐＮＢ２５８と命名した。プラスミドｐＮＢ２５ ８は、下記のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５− α形質転換体の形で寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９３５３が付与されている。 ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターヌクレオチド配列にお ける欠失のシリーズを以下のようにして調製した。配列番号４〜８及び１２で表 わされる配列から作製された下記の欠失は、約５０塩基対の間隔で間が開けられ ていた。配列番号９、１０、及び１１で表わされる配列から作製された欠失は、ＬＥＵ２ 遺伝子の椎定ＴＡＴＡボックス内部の一塩基変化を生じさせ、配列番号 ９で表わされる配列では、ＬＥＵ２遺伝子の第７２４位のヌクレオチドをＡから Ｇに変化させ；配列番号１０で表わされる配列では、ＬＥＵ２遺伝子の第７２５ 位のヌクレオチドをＴからＧに変化させ；配列番号１１で表わされる配列では、ＬＥＵ２ 遺伝子の第７２２位のヌクレオチドをＡからＧに変化させた。更に、作 製しようとする配列のサブクローニングにおける今後の使用のために、適当な制 限酵素部位（例えば、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）を提供するように、プライマ ーを設計した。本開示により実施可能な当業者であれば、本発明により、あるい は他の適当な制限部位の使用により、任意の間隔又は複数間隔で任意の欠失又は 一連の欠失の調製が可能であることを理解することができよう。 以下の５′プライマーを、ミリジェン・サイクロン・プラス（Ｍｉｌｌｉｇｅ ｎ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ）・シンセサイザー（モデル８４００；ミリポア コーポレーション，ベッドフォード，マサチューセッツ州）を使用して合成した 。前記のように、今後のサブクローニングに適した制限酵素部位及び種々の５′ 末端を有するヌクレオチド配列が得られるように、プライマーを設計した。調製 したプライマーを以下の表にした。 前記表１のリストにあげた各プライマーは、その５′末端方向に向かってＢａ ｍＨＩ及びEｃｏＲＩの制限酵素認識部位を含む。 ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺伝子ヌクレオチド配列は、配列番号 １で表わされる配列の第７９９番目のヌクレオチドで始まる。３′プライマーを 調製し、ＬＥＵ２遺伝子の構造的コード領域内部に便利な制限部位が含まれるよ うに、その配列を選んだ。選んだ部位は、配列番号１で表わされる配列の第９１ ９番目のヌクレオチドに位置するＳｔｕＩ部位であった。当然、他の適当な制限 酵素部位を使用することもできた。下記の構築において使用した３′プライマー は、ヌクレオチド配列：ＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧ ＧＴＧＣＣＧＧＡＧＧ ＣＣ（ 配列番号１３）を含んでいた。表１にリストアップした５′プライマーの調製用 の前記方法に従って、３′プライマーを調製した。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することによって、前記表１にリス トアップしたプライマーの５′末端に相当する５′末端と、配列番号１３で表わ される配列の３′プライマーの３′末端に相当する３′末端とを有する、ヌクレ オチド配列の多数コピーを調製した。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス（Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）ＰＣＲ試薬キット（カタログ番号Ｎ８０ １−００５５）を使用してパーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラー （Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（ノーウォーク，コネチカット州）で実施し た。反応混合物は、総容量１００μｌ中に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８． ３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭのｄ ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１μＭ５′プライマー、１μＭ３ ′プライマー、アンプリタック（ａｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ２．５ ユニット、並びにｐＮＢ２５８ＤＮＡ約１０ｎｇを含有した。反応は、以下のパ ラメーター（９４℃で１．５分間溶融、５０℃で２分間アニール、７２℃で３分 間伸長）を使用して３０回実施した。 欠失させたプロモーターを伴う改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子 は、以下のようにした、そして図１に示すようにして構築した。直前の記載のよ うにして調製したＰＣＲで作製の各ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩで消 化し、ゲルで単離した。プラスミドｐＮＢ２５８ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＳｔｕ Ｉで消化することによって、野生型ＬＥＵ２プロモーター、ＰＣＲで作製した各 ＤＮＡ断片の３′末端を構成するＳｔｕＩ部位までのＬＥＵ２コード配列、及び ＬＥＵ２遺伝子内部の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断片を除去した。６．２ ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡベクター断片、及び０．６８ｋｂのＳｔｕ Ｉ間ＤＮＡ断片を、電気泳動を使用してゲルで単離した。次に、ＰＣＲで作製し た各断片約２００ｎｇを、別々の反応液中で、６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓｔｕ Ｉ ＤＮＡ断片約５００ｎｇ、及び０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断片２００ ｎｇと連結した。各連結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１ ００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相当数 の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ及びＳｔｕＩで別々に 消化することによって、正しいＤＮＡ断片を含む前記プラスミドを同定した。以 下のオリゴデオキシヌクレオチド［前記のように合成（配列番号５及び１４で表 わされる配列）、又は商品として入手可能（Ｔ３プライマー；ストラトジーンク ローニングシステム，ラホイラ，カリフォルニア州）］の１種又はそれ以上を、 プライマーとして使用する、ジデオキシチェインターミネーション法［タックト ラック（ＴａｑＴｒａｃｋ）シークエンシングシステム，プロメガ，マジソン， ウイスコンシン］によって、正しいプラスミドをシークエンスした： （１）５′−ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＧＴＣＧＧ−３′（配列番号１４で表 わされる配列）；本プライマーは、内在の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断片 内部のＬＥＵ２遺伝子配列とハイブリダイズし、ＰＣＲ ＤＮＡ断片の３′末端 のＳｔｕＩ部位から上流のＤＮＡ配列情報を与えるように設計された； （２）配列番号５で表わされる配列；本プライマーは、オープンリーディング フレームの５′でＬＥＵ２配列にハイブリダイズし、プロモーター領域の３′末 端から下流方向にＬＥＵ２オープンリーディングフレームを経由する配列情報を 与えた。 （３）ＰＣＲで作製したＤＮＡ断片の５′末端の上流のベクター配列にハイブ リダイズした市販のＴ３プライマー。 こうして得られたＤＮＡ配列情報を使用して、内在のＳｔｕＩ ＤＮＡ断片の 方向が正しいか、そしてＰＣＲで作製したＤＮＡ配列が本来のものであるかを決 定した。２．欠失させたＬＥＵ２遺伝子（ＬＥＵ２Δ）を有するヤロウィア・リポリティ カ宿主株の構築 本発明の欠失ＬＥＵ２遺伝子の配列と相同的なＬＥＵ２配列を欠失させた、ヤ ロウィア・リポリティカ宿主株を構築した。前記株を構築するために、以下のプ ラスミド（ｐＮＢ２４３）を調製した。図２に、前記プラスミドの構築を模式的 に示す。ｐＬＤ１０６由来のＵＲＡ３遺伝子を含む１．７ｋｂのＳａｌＩ断片を 、クレノウポリメラーゼのラージフラグメントで末端を埋めることにより平滑末 端に変換し、１．７ｋｂのＳａｌＩ平滑化断片約２００ｎｇを、ＥｃｏＲＩ消化 、クレノウ平滑化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺ベクター（ストラトジーンクロ ーニングシステムズ，ラホイラ，カリフォルニア州）約５００ｎｇに連結した。 また、平滑化ＵＲＡ３遺伝子も、例えば、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIによる消化 、並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化によって、前記のｐＮＢ２５８か ら回収することができる。連結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換 し、１０ ０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相当数の 形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ制限酵 素で消化した。１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離し、エチジウ ムブロマイドによる染色によって目に見えるようにした。 正しいプラスミドは、ＵＲＡ３配列を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含み、ｐ ＮＢ２４１と命名した。次に、ｐＮＢ２４１ＤＮＡ５００ｎｇを、ＳａｌＩで消 化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬＤ２８由来の５．３ｋｂのＳａ ｌＩ ＤＮＡ断片（ＬＥＵ２コード配列と、ヤロウィア・リポリティカ染色体内 のＬＥＵ２フランキングＤＮＡ配列とを含む断片）２００ｎｇと一緒に連結した 。プラスミドｐＬＤ２８は、米国特許第５，０７１，７６４号明細書に開示され 、米国特許第４，８８０，７４１号明細書に開示及びクレームされている。連結 混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシ リンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体からＤＮＡ を調製し、ＳａｌＩで消化した。１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動的に 分離し、エチジウムブロマイドによる染色によって目に見えるようにした。正し いプラスミドを消化すると、５．３ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片が放出された。 このプラスミドをｐＮＢ２４２と命名した。次に、プラスミドｐＮＢ２４２由来 のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによって、ＬＥＵ２コード配列を含む１． ６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断片を放出した。残った７．４ｋｂの線状ベクターを 、電気泳動的にゲルで単離し、連結し、連結混合物を使用して大腸菌株ＤＨ５− αを形質転換した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形質転 換体を蒔いた。相当数の形質転換体からＤＮＡを単離し、ＳａｌＩで消化し、１ ．０％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離した。正しいプラスミド（ｐＮ Ｂ２４３）は、２．８ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片を含んでいた。 プラスミドｐＮＢ２４３は、ＸｈｏＩ制限部位３箇所（ＵＲＡ３遺伝内部に２ 箇所、及びＬＥＵ２の２．８ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片内部に１箇所）を含む 。以下のようにして、ＸｈｏＩでプラスミドｐＮＢ２４３を部分的に消化するこ とによって、ベクターを線状化した。ｐＮＢ２４３ＤＮＡ約２μｇを、３７℃で ５、１０、及び２０分間、ＸｈｏＩ酵素１０ユニットでそれぞれ処理した。反応 混合 物のエタノール沈殿により反応を止め、消化したＤＮＡのサンプルを０．８％ア ガロースゲルで電気泳動的に分析した。５分の時点（この時点が、７．４ｋｂの 線状ベクターの割合がもっとも高い）を選択し、ヤロウィア・リポリティカ株Ｎ ＢＬ３６９（ＭＡＴＢ，ｂｉｏ６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），ｌｅｕ２−４０ ，ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）の形質転換用に使用した。ウラシルを欠く 最少培地上に形質転換体を蒔くことによって、Ｕｒａ＋形質転換体を選択した。 相当数のＵｒａ＋形質転換体からＤＮＡを単離し、ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで別々 に消化した。得られたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離し、ハ イボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎナイロン膜（アマーシャムコーポレーション，アー リントン・ハイツ，イリノイ州）に転写した。ｐＮＢ２４３由来のＬＥＵ２の２ ．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片と、膜とをハイブリダイズさせた 。元来あった７．５ｋｂのＳｐｈＩ ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の消失と、新しい約１ ６ｋｂのＳｐｈＩ ＤＮＡ断片の出現は、ベクターがＬＥＵ２遺伝子座に適当に 組み込まれたことを示した。５．３ｋｂのＳａｌＩ（元来あった）及び２．９ｋ ｂのＳａｌＩ（欠失）ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の両方の出現は、野生型及び欠失ＬＥ Ｕ２ 遺伝子の両方が存在することを証明した。前記形質転換体２種類をＮＢＬ４ ６１及びＮＢＬ４６２と命名した。 非選択的条件下で、ＮＢＬ４６１及びＮＢＬ４６２を、富養なＹＰＤ培地で２ 日間増殖させると、相同組換えによりＵＲＡ３マーカーの消失又は「ポップアウ ト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）」が起こった。次に、Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．らの記載［Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４：１６４−１７５（１９８ ７）］のように、ロイシン及びウラシルを補充した５−フルオロウラシル選択プ レート上に細胞を蒔いた。５−フルオロウラシル（ｕｒａ ^-）の生き残り数種か らＤＮＡを調製し、ＳａｌＩで消化し、プローブとしてｐＮＢ２４３の０．４ｋ ｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を使用する前記のサザンハイブリダイゼーション 分析によりスクリーニングした。形質転換体２種類（ＮＢＬ４６３及びＮＢＬ４ ６４）は、野生型サイズのＳａｌＩ断片を消失しており、ＬＥＵ２ΔサイズのＳ ａｌＩ断片のみを保持していた。 以下のリストにあげた株は、ブタペスト条約の条件下、アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション（１２３０１パークローン・ドライブ，ロックビル， メリーランド州２０８５２，米国）に１９９３年７月２２日に寄託された。前記 機関は、仮に本願に特許が付与された場合に、公衆による容易な入手可能性と、 寄託の永続性とを提供する、認定された寄託機関である。本願の対応出願又はそ の派生出願が出願されている外国の特許法に従って、並びに米国特許法施行規則 第１．１４条及び米国特許法第１２２条に基づいて、資格を与えられ、米国特許 商標庁長官により決定された者は、本願の係属期間中にその寄託を利用すること ができる。寄託された微生物の公衆への入手可能性におけるすべての制限は、特 許の付与により取り除かれ、再び制限されることはない。 ３．欠失ＬＥＵ２遺伝子の評価 前記のようにして調製したＬＥＵ２遺伝子プロモーター欠失プラスミドを評価 するために、ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２Δ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７ ４２３４）を、ｐＮＢ２５８及び各ＬＥＵ２プロモーター欠失プラスミドで、別 々に形質転換した。ヤロウィア・リポリティカ染色体のｕｒａ３Δ領域を標的と して、相同組換えによる組込みを行うために、形質転換の前に各プラスミドをＰ ｓｔＩで消化した。ウラシルを含まない完全最少培地で形質転換体を選択し、次 に、ロイシンを欠く完全最少培地での増殖能により、Ｕｒａ ⁺形質転換体からＬ ｅｕ 表現型をスクリーニングした。そのスクリーニングの結果を以下の表にした 。 プラスミドｐＮＢ２７６は、弱い相補性を示すＬＥＵ２遺伝子を含み、従って 、ＬＥＵ２遺伝子の第６９３番目の位置に５′末端を有する、欠失ＬＥＵ２遺伝 子プロモーターを含む。ｐＮＢ６５６（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５′末 端）、ｐＮＢ６５２（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５′末端、及び第７２４ 番位のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、ｐＮＢ６５３（ＬＥＵ２遺伝子の第 ７１８番位の５′末端、及び第７２５番位のＴに代わりヌクレオチドＧを含む） 、ｐＮＢ６５４（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５′末端、及び第７２２番位 のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、及びｐＮＢ３１３（ＬＥＵ２遺伝子の第 ７４５番位の５′末端）と命名したプラスミドに含まれ、かつ本発明により製造 される、他のＬＥＵ２プロモーター欠失遺伝子は、同様の結果を与えた。４．ｒＤＮＡ配列を含む多重組込みベクターの構築 図３に、多重組込みベクター（ｐＮＢ３０８）の構築を模式的に示す。前記の ようにして調製及び同定したプラスミドｐＮＢ２７６を、そのプラスミドのポリ クローニング領域内部のＳａｃII部位の欠失により、改変した。欠失は、Ｓａｃ IIでｐＮＢ２７６を消化することにより行った。続いて、ＳａｃIIで消化したｐ ＮＢ２７６を、クレノウフラグメントで平滑末端化し、次に平滑末端連結を行っ た。平滑末端連結したプラスミドを使用して大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、正 しい構築物（ｐＮＢ３０５）を制限分析により同定した。ＨｉｎｄIIIでプラス ミドＤＮＡを消化することにより、ｐＮＢ６５０からリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮ Ａ）配列を単離した。ｐＮＢ６５０は、ｒＤＮＡの２．８ｋｂのＮｃｏＩ断片を 含み［Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ １０：４ ４９−４５２（１９８６）］、その中のＮｃｏＩ部位は、クレノウフラグメント による平滑化、及びＨｉｎｄIIIリンカーとの連結、それに続くＨｉｎｄIIIで消 化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ（ストラトジーンクローニングシステムズ ，ラホイラ，カリフォルニア州）との連結によって、ＨｉｎｄIII部位に変換さ れていた。プラスミドｐＮＢ６５０は、前記のように、アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５−α形質転換体の形で寄託され、寄託番 号ＡＴＣＣ６９３５４が付与されている。ｐＮＢ６５０由来の断片を含む２．８ ｋｂのＨｉ ｎｄIII ｒＤＮＡを、標準的アガロースゲル電気泳動法により単離した。次に 、単離した２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ｒＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄIII消化したｐ ＮＢ３０５に連結した。得られた連結混合物を使用して大腸菌ＤＨ５−αを形質 転換した。相当数の形質転換体由来のＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．７％ アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離した。正しいプラスミドは、２．８ｋ ｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を含み、ｐＮＢ３０８と命名した。５．多重組込みベクターを含むヤロウィア・リポリティカ株の構築 前記のようにして調製したプラスミドｐＮＢ３０８を、そのプラスミドのｒＤ ＮＡ配列内部で１回切断するＳａｃIIで消化した。宿主のヤロウィア・リポリテ ィカ株の反復ｒＤＮＡ配列を標的として、相同組換えによる線状プラスミドの組 み込みを行った。前記の標準手法に従って、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）をＳａｃII消化したｐＮＢ３０８で形質転換した 。ロイシンを含まない完全最少培地で形質転換体を選択した。大型及び小型のコ ロニータイプのＬｅｕ⁺ 形質転換体が現われた。 大型の形質転換体コロニーからＤＮＡを単離し、ＳａｌＩで消化し、アガロー スゲルで泳動し、ハイボンドＮ膜に転写し、ＵＲＡ３ＤＮＡの０．４９ｋｂのＢ ｓｔＸＩ−ＳａｌＩ断片［染色体ｕｒａ３Δ遺伝子（１．０ｋｂのＳａｌＩ断片 上）の単一コピー、及びｐＮＢ３０８由来のＵＲＡ３（３．５ｋｂのＳａｌＩ断 片上）の各コピーの両方にハイブリダイズすることができる］をプローブにして 調べた。ベータースコープ６０３ブロットアナライザー（ベータジェン，ウォル トハム，マサチューセッツ州）を使用してハイブリダイゼーションシグナルを定 量化し、１．０ｋｂバンドと比較して３．５ｋｂバンドの総カウント数が何倍で あるかを計算することによって、各形質転換体のプラスミドコピー数を決定した 。サザン分析により調べた形質転換体のコピー数を、以下の表IIIにまとめる。 ベクターがｒＤＮＡ内部に組み込まれたかを確認するために、形質転換体ＤＮ Ａを、ｒＤＮＡ配列内部のそのプラスミド内部で１回切断するＳａｃIIで消化し 、アガロースゲルで泳動し、ハイボンドＮ膜に転写し、ＵＲＡ３由来の０．４９ ｋｂのＢｓｔＸＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片をプローブにして調べた。１０．８ｋ ｂバンド（もとのままのプラスミドのサイズ）が検出され、このことは、ｒＤＮ Ａ内部にベクターが組み込まれ、しかも大きな再配列がないことを裏付けた。 形質転換体８及び９の安定性を調べた。形質転換体８及び９を、別々のＹＰＤ 培地に１：１００で接種し、２８℃で２４時間増殖させ、新しいＹＰＤ培地中に １：１００で希釈して再増殖させ、合計３サイクル行った。２４、４８、及び７ ２時間（約１２、２４、及び３６世代に相当）で、細胞をサンプリングした。細 胞サンプルからＤＮＡを調製し、前記のようにしてコピー数を分析した。富養な 非選択培地での継続的増殖中に、形質転換体８及び９のコピー数は変化しなかっ た。７．プロインシュリン類似体多重組込み発現ベクターの構築 プロインシュリン類似体多重組込み発現ベクターの構築における出発プラスミ ドは、プラスミドｐＸＰＲＵＲＡｃａｓであり、前記プラスミドは、ＸＰＲ２プ ロモーター、プレ及びプロ配列、それに続く多重クローニング部位、及びＸＰＲ ２ ターミネーター配列、更には選択マーカーとしての野生型ＵＲＡ３遺伝子を含 む。図４に、プロインシュリン類似体多重組込み発現ベクターの構築を示す。プ ラスミドｐＸＰＲＵＲＡｃａｓを、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼ処理に より平滑化し、ＳａｃIIで再消化した。このベクター断片と、サイオスノバ社（ Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａ，Ｉｎｃ．；マウンテンビュー，カリフォルニア州）によ り供給されたプロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒｐ）コード配列とを連結した 。前記プロインシュリン類似体コード配列は、以下の配列を有し、５′−平滑末 端及び３′−ＳａｃII制限末端を有した。 下記の配列表のために、前記配列の内、５′−３′一本鎖を配列番号１４で、 ３′−５′一本鎖を配列番号１５で表わす。但し、配列番号１５で表わされる配 列では相当する５′−３′鎖として表わす。 この連結は、ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２プロ領域の最後のコドンと、 プロインシュリン類似体Ａ１４ｔｒｐの最初のコドンとの間で、インフレーム（ ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合を創出した。連結混合物の一部で大腸菌ＤＨ５−αを形 質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。 相当数の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIIIで消化し、０ ．８％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離した。正しい構築物は、プロイ ンシュリン類似体遺伝子断片内部への付加的ＨｉｎｄIII部位の導入による、２ ．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片の放出を示した。ポジティブクローン数種 類を同定及びシークエンスすることによって、ＸＰＲ２プロ領域とプロインシュ リン遺伝子との間の連結部の正確さ、及びＰＣＲで作製したプロインシュリン類 似体遺伝子それ自体の正確さを保証した。ＸＰＲ２のプロ領域内部にハイブリダ イズするプライマーと、タックトラックキット及びデアザーヌクレオチド（プロ メガ，マジソン，ウイスコンシン州）とを使用してプラスミドＤＮＡをシークエ ンスすることによって、ＸＰＲ２プロープロインシュリン連結部を越え、プロイ ンシュリン遺伝子の端から端までの配列情報が得られた。プライマーの配列は、 ＴＡＣＡＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧ（配列番号１６）である。前記のプロイン シュリン類似体発現ベクターの１つをｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳと命名した。 次に、プラスミドｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳをＭｌｕＩ（ＸＰＲ２プロモーター内 部のユニーク部位）及びＳａｃII（プロインシュリン類似体遺伝子の３′末端の ユニーク部位）で消化し、１．７ｋｂのＤＮＡ断片を電気泳動的にゲル単離した 。１．７ｋｂのＤＮＡ断片と、ＭｌｕＩ及びＳａｃIIでｐＸＰＲＬＥＵｃａｓを 消化することによって生じる７．３ｋｂのＤＮＡ断片とを連結した。プラスミド ｐＸ ＰＲＬＥＵｃａｓ（ｐＮＢ２６８とも称する）は、前記のアメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９３５５が付与され ている。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ シリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。いくつかの形質転換体からＤＮＡを 調製し、ＨｉｎｄIIIで消化することによって、図４に示す正しいプラスミド（ ｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳと命名）を同定した。 次に、プラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳをＳａｃIIで消化し、クレノウフラグ メントで処理することによって、平滑末端を作製し、再連結した。これによって プロインシュリン類似体遺伝子の３′末端のＳａｃII部位は壊されるので、ｐＮ Ｂ６５０のｒＤＮＡ断片内部のＳａｃII部位は、唯一の部位となることができ、 この部位での消化を使用することにより、多重組込み発現ベクターの組込みの標 的をｒＤＮＡ遺伝子座とすることができた。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形 質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。 形質転換体ＤＮＡを調製し、ＳａｃIIで消化した。ＳａｃIIでの消化でそれ以上 線状化されない、正しいプラスミドを同定した。このプラスミドをｐＸＰＲＬＥ ＵＩＮＳ（−ＳａｃII）と命名した。次に、ＥｃｏＲＩでｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ （−ＳａｃII）を消化することによって、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７． ４ｋｂベクター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２（（ｄ）ＬＥＵ ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物 で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上 に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化することにより［野生型１．６及 び０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含む 単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しいプラスミドを同定した。こ の正しいプラスミドをｐＸＰＲ（ｄ）ＬＥＵＩＮＳと命名した。次に、前記と同 様にして、ＨｉｎｄIIIによる部分消化によってこのプラスミドを線状化し、ウ シ小腸ホスファターゼ処理により脱リン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤＮ Ａ配列を含む２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と連結した。連結混合物で 大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に 形質転換体を蒔いた。ｒＤＮＡ配列がＸＰＲ２プロモーター上流のＨｉｎｄIII 部位に連結した、正しい プラスミドを、ＥｃｏＲＩによる制限消化（４．９、５．４、及び２．４ｋｂの 断片を放出する）によって同定した。このプラスミドをｐＭＩＶＩＮＳと命名し た。８．プロインシュリン類似体発現多重組込みベクター形質転換ヤロウィア・リポ リティカの構築 ＳａｃIIでプラスミドｐＭＩＶＩＮＳを消化することによって、その標的をｒ ＤＮＡ遺伝子座とし、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４ ２３４）を形質転換した。ロイシンを含まない完全最少培地上で、２９℃で４８ 時間後に形質転換体が得られた。以下の表IVにおいて１及び２で示す別々の実験 における形質転換体２組からＤＮＡを得た。ゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄIII及び ＥｃｏＲＩ（実験１）又はＨｉｎｄIII（実験２）で消化し、０．７％アガロー スゲルで電気泳動的に断片を分離し、ハイボンドＮ膜にブロッティングした。Ｘ ＰＲ２ のプロモーター領域から単離した０．８ｋｂのラベル化ＰｓｔＩ−Ｍｌｕ Ｉ ＤＮＡ断片をプローブにして膜を調べた。このプローブは、ＸＰＲ２のゲノ ムコピー由来の３．７ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲ Ｉ消化又はＨｉｎｄIII消化のいずれかから）と、ｐＭＩＶＩＮＳ由来の２．８ ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ消化又はＨｉｎｄII I消化のいずれかから）とにハイブリダイズした。前記ベータースコープ６０３ ブロットアナライザーを使用してブロットをスキャンすることによって、各形質 転換体株に組み込まれたｐＭＩＶＩＮＳのコピー数を決定した。また、同じ方法 により、コントロール形質転換体（ＮＢＬ４４９及びＮＢＬ４５１）（本発明の 実施には必要でなく、以下のようにして調製した）も分析した。 コントロール形質転換体ＮＢＬ４４９及びＮＢＬ４５１を、以下のようにして 調製した。ＸｈｏＩでプラスミドｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳを消化することによって 、その組込みの標的をＵＲＡ３遺伝子座とし、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢ Ｌ３６９（ＭＡＴＢ，ｂｉｏ−６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），ｌｅｕ２−４０ ，ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）を形質転換した。ウラシルを含まない完全 最少培地に形質転換体を蒔くことによって、Ｕｒａ⁺形質転換体を同定した。次 に、ＸｈｏＩでプラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを消化することによって、その 組込 みの標的をＬＥＵ２遺伝子座とし、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６９と 、直前の記載のようにして得られたＵｒａ⁺形質転換体とを別々に形質転換する のに使用した。ロイシンを含まない、又はウラシル及びロイシンを含まない完全 最少培地上に、各形質転換の形質転換体を蒔くことによって、Ｌｅｕ⁺及びＬｅ ｕ⁺Ｕｒａ⁺形質転換体をそれぞれ同定した。１コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを 含むＬｅｕ⁺形質転換体をＮＢＬ４４９と命名した。１コピーのｐＸＰＲＵＲＡ ＩＮＳ及び１コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（すなわち、２コピーのプロインシ ュリン類似体コード配列）を含むＬｅｕ⁺Ｕｒａ⁺形質転換体をＮＢＬ４５１と命 名した。以下の表IVに、前記のようにしてテストした形質転換体株、並びにコン トロール形質転換体ＮＢＬ４４９及びＮＢＬ４５１のコピー数を示す。 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、ｐＭＩＶＩＮＳの多重コピーを 含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体により分泌されるプロインシュリン類 似体関連物質の相対量を測定した。前記の形質転換体株を、メジウムＡ（５％バ クトペプトン，１％グルコース，０．１％酵母抽出物）中で４８時間増殖させ、 上清を採取した。次に、市販のキット［インクスター（Ｉｎｃｓｔａｒ）コーポ レーション，スチルウォーター，ニューメキシコ州］を使用して、インシュリン の遊離のＣペプチドを測定する、ＣペプチドＲＩＡを実施した。コピー数の増加 に伴って、Ｃペプチド抗体に反応する物質が増加することを見い出した。５コピ ーの形質転換体は、単一コピーのプロインシュリン発現株に対して、約４〜４． ５倍量のＣペプチド関連タンパク質を分泌した。９．インシュリノトロピン多重組込み発現ベクターの構築 以下の工程に従って、インシュリノトロピンをコードする合成遺伝子を調製し た。以下の配列： を有する配列番号１７、１８、１９、及び２０で表わされる配列は、ジェノシス （Ｇｅｎｏｓｙｓ）バイオテクノロジーズ社（ウッドランズ，テキサス州）から 得た。次に、１００℃で１０分間加熱し、室温までゆっくりと冷却することによ って、配列番号１７及び１８で表わされる配列を一緒にハイブリダイズさせ、同 じ条件で配列番号１９及び２０で表わされる配列を一緒にハイブリダイズさせた 。得られたハイブリダイズした配列を、ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することによって、インシュリノトロピンをコー ドし、かつＡｐａＩ粘着性５′末端及びＸｂａＩ粘着性３′末端を含む、１００ ｂｐの断片を得た。次に、配列確認に使用するために、ＡｐａＩ／ＸｂａＩ消化 したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＫＳ（ストラトジーンクローニングシ ステムズ，ラホイラ，カリフォルニア州）に前記断片を連結した。確認したコー ド配列を含むプラスミドをｐＮＢ７１６と命名した。配列を確認したところで、 図５に模式的に示したように、最初の発現ベクター（ｐＮＢ７４７）を以下のよ うに構築した。 プラスミドｐＮＢ２６８（ＡＴＣＣ６９３５５）ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで粘着性末端を平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂａＩで 消化して、前記と同様にして調製したインシュリノトロピンをコードする断片の ３′末端を得た。インシュリノトロピンをコードする配列を含むプラスミドｐＮ Ｂ７１６のＤＮＡをＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで粘着性末端を 平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂａＩで消化した。得られた１００ｂｐ断片を、 ２．０％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ，ロ ックランド，メイン州）ゲルで電気泳動的に単離し、ＫｐｎＩ消化、平滑化、及 びＸｂａＩ消化したｐＮＢ２６８のＤＮＡと連結した。得られた連結混合物を用 いて大腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。正しい構築物を有するプラスミドを制限 酵素分析により同定し、平滑化連結部領域をシークエンスすることによって、Ｘ ＰＲ２ プレプロ配列とインシュリノトロピンをコードする配列との間のインフレ ーム融合を確認した。このようなプラスミドの１つであるｐＮＢ７４７を図５に 示す。 プラスミドｐＮＢ７４７をＥｃｏＲＩで消化して野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去 し、７．４ｋｂベクター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２（（ｄ ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片とを連結した。連 結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含 むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化することにより［野生型 １．６及び０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝 子を含む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しいプラスミドを同定 した。正しいプラスミドをｐＮＢ７５１と命名した。 次に、プラスミドｐＮＢ７５１をＳａｃIIで消化し、クレノウフラグメントで 処理して平滑末端を作製し、再連結した。これによってインシュリノトロピン遺 伝子の３′末端のＳａｃII部位は壊されるので、ｐＮＢ６５０のｒＤＮＡ断片内 部のＳａｃII部位は、唯一の部位となることができ、この部位での消化を使用す ることにより、多重組込み発現ベクターの組込みの標的をｒＤＮＡ遺伝子座とす ることができた。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍ ｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。形質転換体ＤＮＡを調製し 、ＳａｃIIで消化した。ＳａｃIIでの消化でそれ以上線状化されない、正しいプ ラスミド を同定した。このプラスミドをｐＸＰＲＬＥＵＩＳＴ（−ＳａｃII）と命名した 。次に、ＥｃｏＲＩでプラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＳＴ（−ＳａｃII）を消化す ることによって、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７．４ｋｂベクター断片と、 ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋ ｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形 質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。 ＥｃｏＲＩで制限消化することにより［野生型１．６及び０．９ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含む単一の２．２ｋｂのＤＮ Ａ断片を放出する］、正しいプラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＸＰ Ｒ（ｄ）ＬＥＵＩＳＴと命名した。次に、前記と同様にして、ＨｉｎｄIIIによ る部分消化によってこのプラスミドを線状化し、ウシ小腸ホスファターゼ処理に より脱リン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤＮＡ配列を含む２．８ｋｂのＨ ｉｎｄIII ＤＮＡ断片と連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換 し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ｒＤＮ Ａ配列がＸＰＲ２プロモーター上流のＨｉｎｄIII部位に連結した、正しいプラ スミドを、ＥｃｏＲＩによる制限消化（４．９、５．４、及び２．４ｋｂの断片 を放出する）によって同定した。このプラスミドをｐＭＩＶＩＳＴと命名した。１０．インシュリノトロピン発現多重組込みベクター形質転換ヤロウィア・リポ リティカの構築 プラスミドｐＭＩＶＩＳＴを使用し、ＳａｃIIで消化した後に、ヤロウィア・ リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）を形質転換体した。ロイシ ンを含まない完全最少培地上で得た、得られた形質転換体は、多重組込みベクタ ーを含んでいた。組み込まれたコピー数とインシュリノトロピンの発現レベルと の相互関係は、不明であった。 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ジェイムス，ラリー Ｃ． ストリック，クリスチン Ａ． ファイザー・インク（非米国） （ii）発明の名称：多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転 換体 （iii）配列の数：２０ （iv）通信住所 （Ａ）受取人：グレッグ Ｃ．ベンソン，ファイザー・インク （Ｂ）通り：イースタン・ポイント・ロード （Ｃ）市：グロトン （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０６３４０ （ｖ）コンピュータ読込可能な形式： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１． ２５ （vi）本出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （Vii）原出願情報 （Ａ）出願番号：ＵＳ０８／１１７，３７５ （Ｂ）出願日：１９９３年９月２日 （Viii）弁理士／代理人情報 （Ａ）氏名：ベンソン，グレッグ Ｃ． （Ｂ）登録番号：３０，９９７ （Ｃ）照会／処理番号：ＰＣ８１５４ＡＧＣＢ （ix）遠隔通信情報 （Ａ）電話：（２０３）４４１−４９０１ （Ｂ）ファクシミリ：（２０３）４４１−５２２１ （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２８１０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：１ （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：２ （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：３ （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：４ （２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：５ （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：６ （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：７ （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：８ （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：９ （２）配列番号１０の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１０ （２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１１ （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１２ （２）配列番号１３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１３ （２）配列番号１４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２７９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１４ （２）配列番号１５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２７１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１５ （２）配列番号１６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１６ （２）配列番号１７の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１７ （２）配列番号１８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：４４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１８ （２）配列番号１９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：６２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：１９ （２）配列番号２０の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：６１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列：配列番号：２０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号１で表わされる配列の第６９３番目〜第７９８番目のヌクレオチ ド、配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド 配列、第７２４番目のヌクレオチドがＡからＧに変えられている配列番号１で表 わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第７２５番目のヌ クレオチドがＴからＧに変えられている配列番号１で表わされる配列の第７１８ 番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第７２２番目のヌクレオチドがＡからＧに 変えられている配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌ クレオチド、配列番号１で表わされる配列の第７４５番目〜第７９８番目のヌク レオチド、及びそれらの機能的等価物からなる群から選んだ、改変ヤロウィア・ リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーター。 ２． ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺伝子コード配列に機能的に連結 されている請求項１に記載の改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーターを含む、改変ヤロ ウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子。 （配列番号１２）、及びそれらの機能的等価物からなる群から選んだヌクレオチ ド配列。 ４． 請求項２に記載の改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むベ クター。 ５． ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤ ロウィア・リポリティカの組込み形質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤ ＮＡ配列を含む、請求項４に記載のベクター。 ６． 組込み形質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列が、ヤロウ ィア・リポリティカのリボソームＤＮＡ配列である、請求項５に記載のベクター 。 ７． 請求項５に記載のベクター、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 、及び前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されて いる、ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーターを含む発現ベク ター。 ８． 請求項６に記載のベクター、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 、及び前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されて いる、ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーターを含む発現ベク ター。 ９． ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーターが、ヤロウィア ・リポリティカのＸＰＲ２プロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター 。 １０． ヤロウィア・リポリティカにおいて機能的なプロモーターが、ヤロウィ ア・リポリティカのＸＰＲ２プロモーターである、請求項８に記載の発現ベクタ ー。 １１． ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される 、ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子のプロ１−若しくはプロ２−シグ ナル配列、又はその機能的断片若しくは等価物を含む、請求項９に記載の発現ベ クター。 １２． ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される、 ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子のプロ１−若しくはプロ２−シグナ ル配列、又はその機能的断片若しくは等価物を含む、請求項１０に記載の発現ベ クター。 １３． ポリペプチドが異種のポリペプチドである、請求項１１に記載の発現ベ クター。 １４． ポリペプチドが異種のポリペプチドである、請求項１２に記載の発現ベ クター。 １５． 異種のポリペプチドが、プロキモシン、プロインシュリン、インシュリ ノトロピン、又はヒトＴＧＦ−β３である、請求項１３に記載の発現ベクター。 １６． 異種のポリペプチドが、プロキモシン、プロインシュリン、インシュリ ノトロピン、又はヒトＴＧＦ−β３である、請求項１４に記載の発現ベクター。 １７． プラスミドｐＮＢ２５８。 １８． 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５３。 １９． プラスミドｐＮＢ６５０。 ２０． 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５４。 ２１． プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ。 ２２． プラスミドｐＮＢ２６８。 ２３． 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５５。 ２４． ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ７４２３４。 ２５． プラスミドｐＭＩＶＩＳＴ。 ２６． プラスミドｐＮＢ３０８。 ２７． 請求項４に記載のベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形質転換 体。 ２８． 請求項７に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形質 転換体。 ２９． 請求項８に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形質 転換体。 ３０． 請求項１０に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形 質転換体。 ３１． 請求項１２に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形 質転換体。 ３２． 請求項１５に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形 質転換体。 ３３． 請求項１６に記載の発現ベクターを含む、ヤロウィア・リポリティカ形 質転換体。 ３４． 請求項２１に記載のプラスミドｐＭＩＶＩＮＳを含む、ヤロウィア・リ ポリティカ形質転換体。 ３５． 請求項２５に記載のプラスミドｐＭＩＶＩＳＴを含む、ヤロウィア・リ ポリティカ形質転換体。 ３６． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項２８に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ３７． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項２９に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ３８． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３０に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ３９． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３１に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ４０． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３２に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ４１． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３３に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 ポリペプチドの製造方法。 ４２． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３４に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 Ａ１４ｔｒｐプロインシュリンの製造方法。 ４３． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３３に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 インシュリノトロピンの製造方法。 ４４． 同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水性栄養培地中で、請 求項３５に記載のヤロウィア・リポリティカ形質転換体を発酵することを含む、 インシュリノトロピンの製造方法。 ４５． （ａ）組込み形質転換に充分なＤＮＡ配列中で、発現ベクターを切断す ることによって線状化した請求項７に記載の発現ベクターで、そのＬＥＵ２遺伝 子の欠失を有するヤロウィア・リポリティカ株を形質転換し； （ｂ）ロイシンを欠く培地上で、もっともよく増殖する形質転換体を選択する ことを含む、多重組込み発現ベクターを含有するヤロウィア・リポリティカ形質 転換体の製造方法。 ４６． （ａ）５′末端及び３′末端を有し、配列番号１で表わされる配列の領 域に相同性又は実質的な相同性を有するＤＮＡ配列（前記５′末端は、配列番号 １で表わされる配列のプロモーター領域の５′末端とは末端を共有せず、その内 部にある）を調製し； （ｂ）（ｉ）工程（ａ）で調製したＤＮＡ配列の３′末端が、配列番号１で表わ される配列のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の５′末端に連結され、ＬＥＵ２の 構造遺伝子が形成される、ＤＮＡ配列、及び（ii）第２のヤロウィア・リポリテ ィカ構造遺伝子を含むベクターを調製し； （ｃ）前記第２の構造遺伝子に相当する構造遺伝子における変異又は欠失と、Ｌ ＥＵ２ 遺伝子の欠失とを有するヤロウィア・リポリティカ宿主を、工程（ｂ）で 調製したベクターであって、前記第２の構造遺伝子をコードする領域内部で切断 したベクターで形質転換し； （ｄ）ロイシンを含むが、増殖に前記第２の構造遺伝子を必要とする培地上で、 ヤロウィア・リポリティカ形質転換体を選択し；そして （ｅ）工程（ｄ）のヤロウィア・リポリティカ形質転換体から、ロイシンを欠く 培地上で増殖が劣る形質転換体をスクリーニングする ことを含む、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２プロモーターの製造方法。 ４７． 前記第２の構造遺伝子がＵＲＡ３である、請求項４６に記載の方法。