NO309283B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører genteknologi, og tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid kodet for av nye DNA-molekyler omfattende en sopp-promoter. De nye DNA-molekylene er nyttige for konstruksjon av hybridvektorer som uttrykker genene i filamentøs sopp.

Til tross for at det innen genteknologi eksisterer mange polypeptid-ekspresjonssystemer for prokaryote og eukaryote verter, er det fortsatt nødvendig med nye systemer som har fordeler ifølge de kjente systemene.

Den prokaryote Escherichia coli og den eukaryote gjæren, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, blir meget anvendt som verter og et stort antall forskjellige ekspresjonsvektorer, for det meste plasmider, er blitt utviklet for disse. Ulempen med E. coli-verter er at de ikke kan glykosylere polypeptidet. Gjærorganismer glykosylerer, men som E. coli skiller de ofte ikke ut polypeptidene i næringsmediet, men utskiller dem bare i periplasmaområdet. Høyere eukaryote verter, så som pattedyrcancerceller, kan glykosylere og utskille i næringsmediet, men dyrking derav er meget sakte og kostbar og det er fare for at onkogeniske nukleinsyrer kan bli isolert sammen med det ønskede peptidet.

Ved søking etter andre verter er filamentøse sopp, så som Neurospora crassa. Aspergillus nidulans og Aspergillus niger blitt undersøkt. Anvendelse derav i genetisk modifisering har ligget etter, hovedsakelig på grunn av mangel på et hensiktsmessig transformasjonssystem. I kontrast til Saccha-rom<y>ces cerevisiae inneholder filamentøse sopp ikke naturlige plasmider som kan bli anvendt for innføring av fremmede gener. Det er derimot mulig å transformere filamentøse sopp med fremmede plasmider inneholdende en selekterbar markør. Nesten alle vektorer som inntil nå er blitt beskrevet for filamentøse sopp replikerer ikke autonomt som de fleste gjærorganismene, men blir integrert inn i kromosomet til soppen. Til tross for at denne hendelsen bare oppstår med lav frekvens gjør integrerende transformasjon transformantene mitotisk meget stabile, selv under ikke-selektive betingelser. Stabil integrasjon av mer enn ett hundre kopier er blitt rapportert.

Den første vektoren for filamentøs sopp som er beskrevet inneholdt fla-2-genet til Neuros<p>ora crassa som selekterbar markør (Case, M.E., Schweizer, M. , Kushner, S.R. og Giles,

N.H. (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263; Case, <0> M.E. (1982) i : Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D. , Kaplan, S. , Konisky, J., Savage, D. og Wolfe, R.S., red.), s. 87-100, plenum).

I As<p>er<g>illus nidulans. som har en seksuell syklus og som <5> derfor kan anvendes innen klassisk genetiske manipulasjoner, er både negative og positive seleksjonssystemer basert på auksotrofe markører eller dominante seleksjonsmarkører blitt identifisert. (Ballance et al., BBRC 112, 284, 1983; Tilburn

et al., Gene 26, 205, 1983; Yelton et al., PNAS 81, 1470, o 1984; Yelton og Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173,

1985; Johnstone et al., EMBO J. 4, 1307, 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983; Wernars et al., Curr. Genet. 9, 361, 1985; Kelly, J.M. et al., EMBO J. 4, 475, 1985). 5 Sammenlignet med N. crassa eller A. nidulans er A. niger den mest viktige organismen, idet den blir anvendt innen industriell produksjon av enzymer, f.eks. for anvendelse i matvareindustrien. A. niger utskiller forskjellige hydrolytiske enzymer, f.eks. glukoamylase, a-amylase, pektinase, <0> cellulase, p-glukanase, p<->galaktosidase, naringinase,

pentosanase, sur protease og ligninase, idet glukoamylase- og pektlnase-komplekset er de mest viktige.

Klassisk mutasjon og seleksjonsprosedyrer i A. niger har <;>5 oppnådd omfattende forbedringer i stammen for utskilling av hydrolytiske enzymer. A. niger har ingen kjent seksuell syklus. Mutasjoner kan bare bli kombinert via meiotisk rekombinasjon i valgte diploider etter haploidinering.

Det heterologe amds-genet (Kelly og Hynes, EMBO J. 4, 475, 1985 ) og argB-genet (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097), begge oppnådd fra A. nidulans. eller det homologe pyrA-genet (van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71-75, 1987; Goosen et al., Curr. Genet. 11, 499-503, 1987) er blitt anvendt som selekterbar markør for A. niger-transformasjon.

A. niger er den mest viktige organismen for industriell produksjon av pektin-nedbrytende enzymer, f.eks. polygalakturonaser, pektinlyaser eller pektinesteraser.

Anvendelser av pektinlyase, pektinesterase, polygalakturonase og enzymblandinger derav i frukt- og grønnsaksbearbeidning (Tabell 1) er blitt utviklet fra den opprinnelige anvendelsen av pektinenzymer for behandling av bløte frukter for å forsikre høyt utbytte av juice og pigmenter ved pressing og for klaring av råe pressede juicer. Tekniske enzympreparater som anvendes i disse prosessene inneholder pektinesteraser, polygalakturonaser og pektinlyaser i varierende mengder sammen med andre enzymer så som arabinanaser, galaktanaser, xylanaser, cellulaser, p<->1,4-glukanaser, glykosidaser og proteaser.

Tabell 1

(Fra Voragen, A.G.J., Food enzymes: prospects and limitations. I: J.P. Roozen et al., red. Food Science: Basic Research for Technological Progress. PTJD0C Wageningen, Nederland, 1989): Anvendelse av polygalakturonaser og blandinger derav i frukt- og grønnsaks-industrien.

Gjennom anvendelse av pektiske og cellulolytiske enzymer kan celleveggene til fruktmassene bli nedbrutt til nesten fullstendig flytendegjøring. Tilstedeværelse av både endo- og ekso-e-1,4 glukanaser (cellulaser) samt pektiske enzymer er vesentlig (ref. Eenard CM.C.G. et al., Apple Protopectin: preliminary study of enzymatic extraction. I: Roozen J.P. et al., red. Food Science: Basic Research for Technological Progress. PUDOC, Wageningen, Nederland, 1989).

Polygalakturonase og enzymblandinger derav er også nyttige for flytendegjøring og forsukring av biomasse, for eksempel for produksjon av fermenterbare polysakkarider fra plante-celler (Beldman, G. et al., Enzyme Micros. Technol. 6, 503-507, 1984) eller for modifikasjon av pektiner (for oversikt se Voragen A.G.J. Food enzymes: prospects and limitations. I: Roozen J.P. et al., op. eit.).

I A. niger blir proteinene til det pektiske komplekset ikke uttrykt konstitutivt. Under induserende betingelser, dvs. i nærvær av pektin eller nedbrytningsprodukter derav uttrykker A. niger overnevnte enzymer, forutsatt at de andre karbon-kildene, så som glukose eller sukrose, er begrensende.

På grunn av den industrielle viktigheten til A. niger og dets enzymer er det nødvendig med nye A. niger ekspresjonssystemer for forbedring av stammer og/eller produksjon av homologe eller heterologe genprodukter. Av størst interesse er for eksempel produksjon av individuelle pektin-nedbrytende enzymer eller definerte blandinger derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at et strukturelt gen kodende for et slikt polypeptid, med unntak av det homologe strukturelle pki-genet, er operativt koblet med A. niger-pyruvatkinasetranskripsjon (pki)-promoter som strekker seg fra et nukleotid i omtrent posisjon 300 opptil et nukleotid i omtrent posisjon 1042 av DNA-sekvensen beskrevet i SEK ID NR.l, og blir uttrykt i en egnet vert.

Genet kodende for A. niger pyruvat kinase (systematisk navn ATP:pyruvat fosfotransferase, EC 2.7.1.40) blir høyt uttrykt og dette tyder på at transkripsjonen er under kontroll av en sterk promoter.

Et 5 kb Bglll/Hindlll-restriksjonsfragment fra genomet til A. niger N 400 som hybridiserer med et fragment fra den kodende regionen til gjær pyruvat kinasegenet ble klonet. Den resulterende klonen ble betegnet pGWHOO. Eksperimenter med kotransformasjon med plasmid pGW613 omfattende pyrA-genet som seleksjonsmarkør og med pGWHOO førte til økte nivåer av pyruvat kinase i åtte av elleve transformanter som ble undersøkt. Ut fra disse resultatene ble det konkludert at pGWHOO koder for A. niger pyruvat kinase og at det omfatter hele det funksjonelle genet (L.H. de Graaff, The structure and expression of the pyruvase kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger. Ph.D. Thesis, Agricultural University of Wageningen, 1989).

Med utgangspunkt i tidligere teknikk ble nye DNA-molekyler omfattende pki-promoteren utviklet i foreliggende oppfinnelse og ble anvendt for konstruksjon av nye ekspresjonsvektorer for overproduksjon av et homologt genprodukt, f.eks. pektinlyase, eller for ekspresjon av et heterologt strukturelt gen i A. niger, f.eks. et interferongen.

Hensikten med oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid kodet for av nye DNA-molekyler omfattende A. niger pki-promoteren. hybridvektorer nyttige for ekspresjon av strukturelle gener, med unntak av det homologe strukturelle genet pki, under kontroll av nevnte promoter, verter transformert med de nye hybridvektorene og fremgangsmåter for fremstilling av nye DNA-molekyler, hybridvektorer og transformerte verter og for produksjon av rekombinante polypeptider ved hjelp av nevnte transformerte verter.

DNA- molekyler omfattende A. niger pyruvat kinase- promoter

Foreliggende oppfinnelse vedrører A. niger pyruvat kinase ( pki ) promoter som er innbefattet i DNA-molekylet som har nukleotidsekvensen med sekvens identifikasjonsnr. (SEK ID NR.l), eller et derivat eller et fragment derav med promoteraktivitet.

Nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1 omfatter hele det funksjonelle pyruvat kinase-genet pki til A. niger inkludert promoteren. pki-promoteren går fra nukleotidposisjon 1 opp til det første nukleotidet til den kodende regionen for pyruvat kinase i posisjon 1042. pki-promoteren bindes til RNA-polymerase samt til regulatoriske proteiner og kan kontrollere ekspresjonen til et strukturelt gen operabelt bundet dertil. A. niger pki-promoteren er en sterk promoter. Oppfinnelsen vedrører dermed et DNA-molekyl med nukleotidsekvens som rekker fra omtrent posisjon 1 opp til omtrent 1042 eller et fragment eller derivat av denne promoteren som har en promoteraktivitet som kan bli regulert eller ikke.

Den fullstendige pki-promoteren til A. niger kan bli regulert på grunn av at den omfatter regulatoriske elementer som gjør nivået av transkripsjonen avhengig av karbonkilden anvendt for dyrking av A. niger-celler omfattende nevnte promoter. Anvendelse av en glukoneogenisk karbonkilde så som acetat fører til et lavt transkripsjonsnivå mens anvendelse av en glykolytisk karbonkilde, f.eks. glukose, fører til et høyt transkripsjonsnivå.

I promoteren innbefattet i nukleotidsekvens med SEK ID NR. 1 er en potensiell TATA-boks beliggende mellom nukleotidposi-sjonene 927 og 934, en potensiell CAAT-boks mellom posisjonene 830 og 836 og omfattende CT-rike regioner (CT-blokker) mellom posisjonene 848 og 1041. Sistnevnte finnes i promoter/regulerings-regionene til mange høyt uttrykte gener med opprinnelse fra gjær og sopp.

Et fragment er for eksempel et fragment valgt fra gruppen av fragmenter med promoteraktivitet som begynner med hvilke som helst av nukleotidene i posisjon 1 opp til omtrent posisjon 950 og som slutter med et nukleotid i omtrent posisjon 1041 i nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1. Foretrukket er et fragment som begynner med et nukleotid i omtrent posisjon 300 og som slutter med en nukleotid i omtrent posisjon 1042 i nevnte nukleotidsekvens. Fragmentet ifølge oppfinnelsen kan for eksempel begynne ved et spaltningssete for et restriksjonsenzym beliggende innenfor nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1, f.eks. BamHI-setet (i omtrent posisjon 300) eller de følgende setene (omtrentlige posisjoner i parenteser): SphI

(441), Smal (859), Xmal (859).

Et mest foretrukket fragment er fragmentet som begynner ved BamHI-setet i omtrent posisjon 300 og som rekker opp til posisjon 1042. Dette fragmentet er del av BamHI/PvuII-fragmentet som rekker fra BamHI-setet i omtrent posisjon 300 opp til PuvII-setet i omtrent posisjon 1352 og som blir anvendt nedenfor i eksemplene for innskudd av et spaltningssete for et restriksjonsenzym.

Et derivat er for eksempel en mutant, et rekombinant derivat eller et rekombinant derivat av en mutant av pki-promoteren innbefattet i DNA-molekylet som har nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1 eller av et fragment derav. Et derivat omfatter en sekvens med pki-promoteraktivitet som enten kan bli regulert eller som ikke kan bli regulert.

En mutant kan være en naturlig forekommende eller fortrinnsvis en kunstig mutant. Mutanter til pki-promoteren er spesielt slike som har nye spaltningsseter for restrik-sjon s enzymer , for eksempel for restriksjonsenzymene Nsil, BamBI, EcoRI, Hindlll, Pstl, Sali, Ncol og lignende. En mutant omfattende et nytt spaltningsete for restriksjonsenzym i eller rundt posisjon 1041 til sekvensen med SEK ID NR. 1, kan bli anvendt for innskudd av et strukturelt gen 3' for promoteren som da er operabelt bundet dertil. En slik mutant er for eksempel kjennetegnet ved at nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 2 erstatter sekvensen som rekker mellom posisjon 1034 og 1054 i nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1 og ved at et Nsil-sete er beliggende rett ved siden av posisjon 1041 til SEK ID NR. 1.

En mutant er også en mutant av et fragment der betydningen er som angitt ovenfor. En mutant av et fragment har nedstrøms for pki-promoteren et nytt spaltningssete for restriksjonsenzym for operabel binding av et strukturelt gen til promoteren. En slik mutant av et fragment er for eksempel innbefattet i 1053 bp BamHI/PvuII-fragmentet eller 742 bp BamHI/Nsil-fragmentet innbefattet i M13mpl8-PK (BamEI-Nsil-PvuII) RF DNA. 1053 bp BamHI/PvuII-fragmentet til M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) har en nukleotidsekvens som rekker fra BamHI-setet i omtrent posisjon 300 opp til PvuII-setet i omtrent posisjon 1352 til en sekvens med SEK ID NR. 1 som er mutert ved at sekvensen med SEK ID NR. 2 erstatter nukleotidene fra posisjon 1034 til 1054. 742 bp BamHI/Nsil-fragmentet rekker fra nevnte BamHI-sete opp til Nsil-setet i den substituerte regionen. I begge mutanter er et Nsil-sete beliggende rett ved siden av posisjon 1041 til SEK ID NR. 1.

Et derivat er også et rekombinant DNA-molekyl. Et slikt rekombinant DNA-molekyl er for eksempel kjennetegnet ved at det inneholder en oligonukleotidlinker koblet ved en 3'-og/eller 5'-ende av et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen med <p>ki-<p>romoteraktivitet som tilveiebringer vellykket kobling til andre DNA-molekyler, f.eks. vektorsekvenser. Linkeren kan omfatte en eller flere spaltningsseter for restriksjonsenzym og/eller delvis enkelttrådede ender ("klebrige ender") og/eller butte ender.

Et derivat ifølge oppfinnelsen er også et rekombinant DNA-molekyl omfattende et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen med <p>ki-<p>romoteraktivitet og et homologt eller heterologt strukturelt gen med eller uten introner, med unntak av det homologe strukturelle pki-genet som er operabelt bundet til <p>ki-<p>romoteren og eventuelt en oligonukleotidlinker. Et derivat kan omfatte en ytterligere ekspresjonskontrollsekvens i tillegg til pki-promoteren som også er operabelt bundet til nevnte strukturelle gen. En slik ekspresjonskontrollsekvens er for eksempel en enhancer, en transkripsjonen terminator, en ribosomal bindingsregion, et translasjonelt initieringssete eller termineringssete eller en signal sekvens, f.eks. en signalsekvens til et A. niger pektin lyase-gen, f.eks. for PLA, B, C eller D eller polygalakturonasegen, f.eks. for PGI, PGC eller PGII.

Homologe strukturelle gener er slike som er avledet fra A. niger. De koder for eksempel for enzymer, fortrinnsvis slike som er nyttige i industrien, f.eks. innen mat- eller til-førselsindustrien. Slike enzymer er for eksempel pektino-lytiske enzymer så som pektinesterase, endo- og ekso-virkende polygalakturonase (PG), pektinlyase (PL), rhamnogalakturonase eller arabinaser, galaktanaser, xylanaser, cellulaser, p<->1,4-glukanaser, glykosidaser og lignende.

Nukleotidsekvensen til det strukturelle genet for A. niger PLD er beskrevet i EP-PS med publikasjonsnr. EP-A2-0 278 355. Strukturelle gener for ytterligere A. niger PL, spesielt PLA, B, C, E og F, er beskrevet i EP-PS med publikasjonsnr. EP-A2-0 353 188. Strukturelle gener for A. niger PG, spesielt PGII, er beskrevet i GB-PS med søknadsnr. 8919884.0.

E. coli HB101- eller JM109-celler transformert med plasmidene pGW 820, 830, 850 og 1800 omfattende A. niger strukturelle gener, er deponert ifølge Budapest-avtalen til Deutsche Sammlung ftir Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig. Nukleotidsekvenser av delene av det strukturelle genet for PGII som koder for N- og C-terminalen er angitt i sekvenslisten. For ytterligere informasjon se Tabell 2.

Homologe gener er også derivater av PL- og PG-gener som er nevnt ovenfor, inkludert fragmenter, mutanter og DNA-sekvenser som er dannet i henhold til den genetiske koden idet et ubegrenset antall nukleotider er erstattet med andre nukleotider uten å forandre aminosyresekvensen til det kodede polypeptidet.

Heterologe strukturelle gener har opprinnelse fra virus, prokaryote celler eller eukaryote celler og kan bli avledet fra genomisk DNA eller fra cDNA fremstilt via mRNA-veien eller kan bli fremstilt kjemisk, og koder for forskjellige nyttige polypeptider, inkludert glykosylerte polypeptider, spesielt høyere eukaryotiske, spesielt fra pattedyr, så som dyr eller spesielt med human opprinnelse, så som enzymer som for eksempel kan bli anvendt for fremstilling av næringsmidler og for utføring av enzymatiske reaksjoner i kjemi, eller polypeptider som er nyttige og verdifulle for behandling av menneske- eller dyresykdommer eller for forhindring derav, for eksempel hormoner, polypeptider med immunmodu-lerende egenskaper, antivirale egenskaper og antitumor-egenskaper, antistoffer, virale antigener, vaksiner, koaguleringsfaktorer, matvarer og lignende.

Eksempler på slike strukturelle gener er f.eks. de som koder for hormoner så som sekretin, tymosin, relaksin, kalsitonin, luteiniserende hormon, paratyroidhormon, adrenokortikotropin, melanocytt-stimulerende hormon, p<->lipotropin, urogastron eller insulin, vekstfaktorer, så som epidermal vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor (IGF), f.eks. IGF-I og IGF-II mastcellevekstfaktor, nervevekstfaktor, glia-avledet nerve-cellevekstfaktor eller transformerende vekstfaktor (TGF), så som TGFa eller TGFp, f.eks. TGFpl, (32 eller 33, veksthormon, så som humane- eller bovine veksthormoner, interleukin, så som interleukin-1 eller -2, human makrofag migreringsinhibi-torisk faktor (MIF), interferoner, så som human a-interferon, for eksempel interferon-aA, aB, aD eller aF, p-interferon, 7-interferon eller en hybrid interferon, for eksempel en aA-aD-eller en cxB-aD-hybrid interf eron, spesielt hybrid interferon BDBB, proteinaseinhibitorer så som a^-antitrypsin, SLPI og lignende, hepatittvirusantigener, så som hepatitt B-virus overflate- eller kjerneantigen eller heptatitt A-virus antigen, eller heptatitt ikkeA-ikkeB-antigen, plasminogen-aktivatorer, så som vevsplasminogenaktivator eller urokinase, tumornekrosefaktor, somatostatin, renin, p-endorfin, immuno-globuliner, så som lette og/eller tunge kjeder av immunoglobulin D, E eller G eller humane musehydrid-immunoglobu-liner, immunoglobulinbindingsfaktorer, så som immunoglobulin E bindingsfaktor, f.eks. sCD23, kalcitonin, human kalcitonin-relatert peptid, blodkoaguleringsfaktorer, så som faktor IX eller VIIIc, erytropoietin, eglin, så som eglin C, hirudin, desulfatohirudin, så som desulfatohirudin-variant HVI, HV2 eller PA, human superoksiddismutase, viral tymidinkinase, <p>—laktamase, glukoseisomerase. Foretrukne gener er de som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, spesielt hybridinterferon BDBB, human vevsplasminogenaktivator (t-PA), heptatitt B virus overflateantigen (HBVsAg), insulinlignende vekstfaktor I og II, eglin C og desulfatohirudin, f.eks. variant HVI. I et DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er foreliggende promoter operabelt bundet til den polypeptidkodende regionen for å forsikre effektiv ekspresjon av polypeptidet.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen, inkludert fragment og derivater derav, kan bli anvendt for screening av DNA-genbibliotek eller mRNA for ytterligere lignende DNA eller mRNA.

Videre kan hybridvektorer omfatte som innskudd et DNA-molekyl omfattende pki-promoteraktivitet. Nevnte DNA-molekyler omfatter pki-promoteren. fragmenter eller derivater derav, f.eks. mutanter eller fusjon av et strukturelt gen nevnt ovenfor med promoteren eller et fragment derav. Hybridvektorene er nyttige for kloning i verter, så som bakterier, sopp eller dyreceller. Slike hybridvektorer er avledet fra en hvilken som helst vektor som er nyttig innenfor genetisk modifisering, så som fra fag, kosmider, plasmider eller kromosomalt DNA, så som derivater av fag X, f.eks. NM 989 eller fag M13, f.eks. M13mpl8 eller M13mpl9 fag DNA, bakterielle plasmider, f.eks. pBR322, pUN121, pUC18 eller gjærplasmider, f.eks. gjær 2>j-plasmid eller også kromosomalt DNA, avledet f.eks. fra Aspergillus. f.eks. A. niger, for eksempel de som er tilveiebragt fra EP 184 438, eller defekte fag eller defekte plasmider i nærvær av en hjelperfag eller et hjelperplasmid som muliggjør replikasjon av nevnte defekte fag eller plasmider, f.eks. M13(+)KS-vektor i nærvær av f.eks. M13K07 hjelperfag.

En hybridvektor omfatter, i tillegg til DNA-molekylene, et replikasjonssete og, om nødvendig, et markørgen og/eller en ytterligere kontrollsekvens for ekspresjon forskjellig fra <p>ki-promoteren, f. eks. en enhancer, en transkripsjonen terminator, en ribosomal bindingsregion, et translasjonelt initieringssete eller termineringssete eller en signalsekvens, f.eks. signal sekvensen til det strukturelle genet for A. niger pektinlyase A, B, C eller D, eller polygalakturonase, f.eks. PGI eller II.

En hybridvektor er ikke pGWllOO.

En hybridvektor kan omfatte fragmentene til pGWllOO med <p>ki-promoteraktivitet. Et eksempel på en slik hybridvektor er M13mpl8-PK (BamHI-PvuII), som omfatter 1053 bp BamHI/PvuII-restriksjonsfragmentet som rekker fra BamHI-setet i omtrent nukleotidposisjon 300 opp til PvuII-setet i omtrent nukleotidposisjon 1352 til sekvensen med SEK ID NR. 1.

En annen hybridvektor er en som omfatter en mutasjon i A. niger pki-promoteren. Nevnte mutasjon kan danne et nytt spaltningssete for restriksjonsenzym, spesielt et som er egnet for innskudd av et strukturelt gen som da er operabelt bundet til pki-promoteren. Et eksempel på en slik vektor er spesielt M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) som omfatter et mutert DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen med et nytt Nsil-sete ved translasjonsinitieringssetet til A. niger-pyruvat kinase strukturelle genet.

En hybridvektor kan også omfatte et homologt strukturelt gen unntatt A. niger pyruvat kinase strukturelt gen, eller et heterologt strukturelt gen som er operabelt bundet til <p>ki-promoteren. En slik hybridvektor er for eksempel pPK-PLB som omfatter 742 bp BamHI/NsiI-fragmentet til M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) og 2,6 kb BamHI/ Nsil-fragmentet til pGW830. Nevnte hybridvektor omfatter det strukturelle genet som koder for PLB inkludert dets signalsekvens.

Hybridvektorer kan være pPKl-IFN-2, pPKIssIFN-2, pPK-PLB, M13mpl8-PK (BamHI-PvuII), M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII ).

Fremgangsmåte for fremstilling av DNA- molekyler omfattende A. niger pki- promoter. hybridvektorer omfattende et slikt DNA-molekvl og verter transformert med nevnte hybridvektorer Hensikten er en fremgangsmåte for fremstilling av et DNA-molekyl, f.eks. en fremgangsmåte som omfatter fremstilling av et slikt DNA-molekyl ved en in vitro-syntese eller ved dyrking av en vert som omfatter en slik DNA-sekvens.

Dyrking av verter utføres i et konvensjonelt naeringsmedium som kan bli supplementert med eller utelukket fra kjemiske forbindelser som muliggjør negativ eller positiv seleksjon av transformanter, dvs. slike verter inneholdende det ønskede DNA-molekylet sammen med en seleksjonsmarkør, fra ikke-transformantene, dvs. slike verter som mangler det ønskede DNA-molekylet.

En hvilken som helst transformerbar vert som er nyttig innenfor fagområdet kan bli anvendt, f.eks. bakterier, så som E. coli. sopp, så som Saccharomyces cerevisiae. eller spesielt filamentøs sopp, så som As<p>er<g>illus. f.eks. A. nidulans. A. oryzae. A. carbonarius. A. awamori. A. japonicus og spesielt A. niger. Transformasjon av vertene blir utført ved konvensjonelle metoder.

Et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen kan bli oppnådd fra Aspergillus niger inneholdende det pyruvate kinasegenet ( Pk i). spesielt fra et genomisk bibliotek derav eller også via et mRNA anvendt for å danne et cDNA-molekyl.

Nedenfor blir fremstilling av et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen beskrevet i mer detaljert.

Et genomisk bibliotek kan bli fremstilt f.eks. ved delvis spaltning av genomisk DNA fra en A. niger-stamme. f.eks. NW756 eller N400, med f.eks. Sau3AI eller Mbol, og kloning av høymolekylvekt DNA-fragmenter i en egnet vertsvektor, f.eks. E. coli-plasmid pUN121 eller en lambdavektor, f.eks. EMBL4.

For å screene det genomiske biblioteket for DNA-sekvenser omfattende pki er en hybridiserende DNA-probe nødvendig. Dette kan være en syntetisk DNA-probe, eller et annet pyruvat kinasegen eller en del derav, som hybridiserer til A. niger <p>ki. for eksempel gjær pyruvat kinase strukturelt gen omfattende plasmid pPYKl (Burke et al., 1983).

For screening blir DNA-probene radioaktivt merket ved fremgangsmåter som er kjente innenfor fagområdet, f.eks. ved 5'-enden ved anvendelse av "Y^<p.>ATP og T4-kinase. Verts-mikroorganismer som inneholder nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse som et innskudd blir identifisert ved hybridisering med merket DNA-probe på filterreplikater av genbiblioteket. DNA-molekylene som hybridiserer med proben blir isolert og, om ønskelig, subklonet ifølge konvensjonelle metoder. Plasmid pGV/1100 er en slik subklon av en genomisk klon fra et A. niger N400 bibliotek. Det omfatter et 5,0 kbp BglII/HindiII-fragment av A. niger-genomet som omfatter hele det funksjonelle genet for A. niger pyruvat kinase.

Identifisert pki eller genfragmentene blir deretter sekven-sert. Hele sekvensen til funksjonelt pki til A. niger innbefattet i pGWllOO er vist i sekvenslisten under SEK ID NR. 1.

Plasmid pGWllOO blir anvendt for å fremstille DNA-molekylene. Slike DNA-molekyler blir fremstilt på konvensjonell måte ved anvendelse av konvensjonelle restriksjonsenzymer, linkere, mutasjon, ligering, amplifikasjon og isoleringsprosesser .

Fragmenter av et DNA-molekyl med nukleotidsekvensen til SEK ID NR. 1 blir for eksempel fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter behandling av nevnte DNA-molekyl med nukleaser, f.eks. eksonukleaser så som Bal31 eller ExoIII eller endo-nukleaser så som restriksjonsenzymer.

Derivater av et DNA-molekyl med nukleotidsekvensen til SEK ID NR. 1 eller av et fragment derav blir for eksempel fremstilt ved mutagenese ifølge konvensjonelle fremgangsmåter (se oversiktsartikkelen til M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 (1985 ) og K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983), for eksempel som beskrevet i eksempel 2.1.2 nedenfor.

En mutant inneholdende et nytt restriksjonssete kan for eksempel bli fremstilt ved seterettet mutagenese ved anvendelse av et mutagent oligonukleotid ifølge konvensjonelle metoder. Et eksempel på et slikt mutagent oligonukleotid for innføring av en mutasjon inn i sekvensen med SEK ID NR. 1 er DNA-molekylet angitt under SEK ID NR. 2.

Et rekombinant derivat av et DNA-molekyl med nukleotidsekvensen med SEK ID NR. 1, av et fragment eller en mutant derav, kan for eksempel bli fremstilt ved rekombinant DNA-teknologi, f.eks. ved en fremgangsmåte som omfatter kutting av et slikt DNA-molekyl, fragment eller mutant derav med et restriksjonsenzym og/eller ligering av dette til et annet DNA-molekyl, f.eks. med en oligonukleotidlinker eller med et DNA-molekyl omfattende et strukturelt gen, signalsekvens og/eller terminatorregion.

Alle DNA-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli fremstilt ved in vitro syntese ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. In vitro syntesen er spesielt egnet for fremstilling av mindre DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen.

En hybridvektor blir fremstilt ifølge konvensjonelle fremgangsmåter for genetisk modifisering, f.eks. ved en fremgangsmåte omfattende ligering av en vektor som er nyttig innen området genetisk omkonstruering som blir linearisert, f. eks. ved kutting med et restriksjonsenzym, med et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, transformering av en egnet vertscelle med ligeringsblandingen og identifisering og/eller selektering av transformanter.

Vertsceller blir transformert ved en konvensjonell fremgangsmåte og transformantene blir identifisert og/eller selektert for eksempel ved deres resistens, f.eks. mot tetracyklin, eller ved komplementasjon av auksotrofe markører, f.eks. pyr A.

De beskrevne ekspresjonsvektorene blir spesielt amplifisert i egnede E. coli-vertsstammer. så som HB101, JM109, MH1, DH5a og lignende, transformert og selektert ved konvensjonelle fremgangsmåter. Amplifisert plasmid DNA blir isolert fra bakteriene ved konvensjonelle fremgangsmåter, spesielt som beskrevet av Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979).

Et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen eller en hybridvektor, spesielt slike som omfatter et homologt eller heterologt strukturelt gen, kan også bli anvendt for å transformere filamentøse sopp, så som Aspergillus. Trichoderma, Penicillium eller Cephalosporium. f.eks. A. nidulans. A.. japonicus. A. oryzae. A. carbonarius. A. awamori og spesielt A. niger.

For å muliggjøre seleksjon av transformert fra ikke-transformert sopp kan hybridvektorene ifølge oppfinnelsen inne-holde en seleksjonsmarkør eller, alternativt, kan soppen bli kotransformert med en annen vektor inneholdende en slik seleksjonsmarkør. Som i andre systemer er en slik seleksjons-markør et uttrykkbart strukturelt gen, der det uttrykte polypeptidet tilveiebringer resistens mot forbindelser som er toksiske for mottakeren eller som fullfører enzymsystemet til en mutant som mangler et slikt essensielt polypeptid. Slike markørgener er for eksempel de kjente qa- 2-. pyrG-. pyr4-. trpC-. amdS- eller argB-genene.

Som beskrevet i EP 278.355 ble et markørgen betegnet py r A isolert fra det genomiske biblioteket til A. niger, som er beslektet med og har lignende funksjon som pyrG til A. nidulans og pyr 4 til N. crassa. dvs. produserer enzymet orotidin 5'-fosfatdekarboksylase. Dette enzymet katalyserer dekarboksylering av orotidin 5'-fosfat til uridylsyre (uridin 5<*->fosfat) og også av fluor-orotinsyre til toksisk fluor-uridon. Fra E. coli Bg5183/pCG59D7 som er deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under DSM 3968, plasmid pCG59D7 omfattende pyrA-genet ble isolert og anvendt for kotransformasjon av en A. niger pyrA~-mutant. En slik pyrA-mutant er defekt i orotidin 5'-fosfatdekarboksylasegenet og kan derfor ikke produsere det tilsvarende enzymet. Slike mutanter er for eksempel A. niger N593 eller A. niger An8, sistnevnte er deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nr. DSM 3917. Mutantene blir fremstilt ved behandling av konidiosporene til A. niger under muterende UV-bestrålning og kolonier som overlever i nærvær av fluor-orotinsyre og uridin blir selektert. Kolonier som overlever i nærvær av fluororotinsyre og fravær av uridin blir eliminert.

Verter kan også transformeres med en hybridvektor. Slike transformanter er for eksempel bakterier, så som E. coli eller filamentøse sopp, så som Aspergillus. Penicillium eller Cephalosporium og spesielt A. nidulans. A. japonicus. A. oryzae. A. carbonarius. A. awamori eller spesielt A. niger, f.eks. A. niger An8 eller N593.

Spesielle verter er E. coli JM101 eller DH5a transformert med pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2 eller pPK-PLB, As<p>ergillus niger N593 eller An8 transformert med pPK-PLB, pPKI-IFN-2 eller pPKIssIFN-2 og eventuelt med seleksjonsmarkørplasmid pGW613 eller pCG59D7.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av transformanter som omfatter behandling av en vert under transformerende betingelser med et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, eventuelt sammen med et seleksjonsmar-kørgen og, om nødvendig, seleksjon av transformantene.

Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider, kjennetegnet ved at et strukturelt gen kodende for et polypeptid, f.eks. slike som er angitt ovenfor, fortrinnsvis slike som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, spesielt hybridinterferon BDBB, human vevsplasminogenaktivator (t-PA) hepatitt B virusoverflate-antigen (HBVsAg), insulinlignende vekstfaktor I og II, eglin C og desulfatohirudin, f.eks. variant HVI, er operabelt bundet med pki-promoteren og blir uttrykt i en egnet vert. Når nødvendig blir polypeptidet isolert på konvensjonell måte. Avhengig av konstruksjon av vektoren blir produktene enten produsert i vertscellen eller, dersom en signalsekvens er tilstede, produsert i cellen og utskilt. En egnet vert er fortrinnsvis en Aspergillus-art, f.eks. A. niger, spesielt A. niger An8 eller N593. En egnet vert er også en annen fila-mentøs sopp, f.eks. Neuros<p>ora crassa eller en gjærorganisme, f.eks. Saccharomyces cerevisiae eller Kluyveromyces lactis.

Det er mulig å produsere et enkelt genprodukt, der forskjellige fremgangsmåter kan bli anvendt. For eksempel, en fremgangsmåte for fremstilling av en enkelt polygalakturonase PG eller pektinlyase PL, fortrinnsvis PLB, er kjennetegnet ved at en egnet vert som ikke kan uttrykke PG eller PL eller som uttrykker PG eller PL i lav mengde blir transformert med en hybridvektor omfattende et strukturelt gen kodende for en PG eller PL, f.eks. PLB og at nevnte gen blir uttrykt. Ved anvendelse av pki-promoteren som kontrollregion er det nå også mulig å fremstille et enkelt genprodukt, f.eks. PLB, i en egnet transformert vert som kan produsere det tilsvarende eller et beslektet endogent genprodukt(er) f.eks. PLA, B, C, D, E eller F, bare under induserende betingelser, f.eks. dersom pektin eller nedbrytningsprodukter av pektin er i mediet, ved dyrking av nevnte transformerte vert under betingelser som ikke muliggjør ekspresjon av det endogene strukturelle genet, men bare ekspresjon av det strukturelle genet som er under kontroll av pki-promoteren. En slik tilstand er for eksempel dersom et minimalmedium med glukose som karbon- og energikilde blir anvendt. Dersom en vert som ikke kan uttrykke PG eller PL blir anvendt eller dersom en tilstand som ikke muliggjør produksjon av endogent PL blir påført, kan nevnte PG eller PL bli oppnådd i ren form, dvs. ikke-kontaminert med andre PG eller PL.

Enkelt genprodukt som blir produsert i en egnet vert transformert med et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen som koder for et slikt genprodukt, og fysiologisk akseptable salter derav er også gjenstand for foreliggende oppfinnelse. Foretrukket er enzymer til A. niger, spesielt slike som er nyttige innen mat- og næringsmiddelindustrien, f.eks. PG eller PL, spesielt PLB. Oppfinnelsen vedrører nevnte polypeptider når de blir fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende opp-f innelse.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av enzymatiske sammensetninger som omfatter en eller flere av et polypeptid fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, f.eks. av et enkelt PL og/eller et derivat derav med PL-aktivitet og/eller en enkelt PG og/eller et derivat derav med PG-aktivitet og/eller fysiologisk akseptable salter derav eventuelt i en forutbestemt kombinasjon med en eller flere egnede enzymer med annen enn en PL- eller PG-aktlvitet.

Egnede enzymer som har annen enn PL-aktlvitet er degraderende og modifiserende cellulære polymerer. Slike enzymer er f.eks. pektinesteraser, endo- og ekso-virkende polygalakturonaser, cellulaser, blandede endo-glukanaser, hemicellulaser, xylanaser, arabinaser, galaktanaser, a- og p<->glykosidaser og lignende.

Egnede enzymer som har annen enn PG-aktivitet er degraderende og modifiserende cellulære polymerer. Slike enzymer er f.eks. pektinesteraser, pektinlyaser, cellulaser, blandede endo-glukanaser, hemicellulaser, xylanaser, arabinaser, galaktanaser, a- og P-glukosidaser og lignende.

Enkle PG eller PL eller derivater derav med PG- eller PL-aktivitet fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, eller enzymatiske sammensetninger derav er nyttige f.eks. for klaring av grønnsaks- eller fruktjuice, for å øke juiceutbyttet i grønnsaks- eller fruktjuiceproduksjon og utbytte av pressing av oljeinneholdende frø eller frukter, for stabilisering av grønnsaks- eller fruktjuice, for reduksjon av viskositeten til grønnsaks- eller fruktjuice, for flytendegjøring av biomasse, for bløtgjøring, for å øke naturlig produktekstraksjon som naturlige pigmenter, aromaer og smaksstoffer, for valorisering av biomasse, matvarer eller næringsmidler og lignende.

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.

Forkortelsene har følgende betydninger:

0 Medier:

For skålene blir alle mediene stivnet ved tilsetning av 1,5$ agar (BBL), for toppagar(ose) 0, 7% agar (BBL) eller agarose (Seakem) anvendt.

Følgende stammer blir anvendt:

E. coli JM 101 (Messing, 1979)

E. coli RZ 1032 (Pharmacia)

E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories)

E. coli DH5ocF' (Bethesda Research Laboratories)

E. coli BW313 (Kunkel, 1985)

A. niger An8 (DSM 3917, EP-A-0278355)

A. niger N593

Følgende vektorer blir anvendt:

PBR322

Beskrevet i Sutcliffe, J.G. (1979), Peden, K.W.C. (1983) eller Bolivar et al. (1977).

pGV/ 613

Dette plasmidet er blitt beskrevet av Goosen et al. (1987).

M13mp- fag

M13mpl8- og M13mpl9-vektorene (Norrander et al., 1983) er derivater av enkelttrådet DNA bakteriofag M13 og er kon-struert for å lette DNA-sekvensering ved å muliggjøre kloning av DNA-fragmentene ved et allsidig polylinkersete og kloning av det samme restriksjonsfragmentet i begge mulige orien-teringer. Sekvenser klonet inn i disse vektorene kan lett bli anvendt som templater for sekvenseringsreaksjoner eller produksjon av enkelttrådede prober ved anvendelse av trådede oligodeoksyribonukleotidprimer og Klenow-fragmentet til E. col i DNA polymerase I. Vektor DNA inneholder E. coli lac-operon-promoteren og genetisk informasjon til de første 145 aminosyrene til p-galaktosidase. Polylinkersekvensene inneholdende multiple restriksjonsseter blir skutt inn i lacZ-sekvensen. Polylinkeren beholder LacZ-leserammen og vektoren tilveiebringer allelisk komplementasjon til en LacZcx-vertsstamme og tilveiebringer blå plakk på skåler inneholdende IPTG og X-gal. Rekombinante fag inneholdende innskuddene som ødelegger leserammen eller på annen måte innvirker på ekspresjonen av lacZa-peptidet sees som farge-løse plakk.

pCG 59D7

Dette plasmidet er beskrevet i EP 88 101 397.3 og kan bli oppnådd fra Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968). Plasmidet omfatter pyrA-genet og blir anvendt for kotransformasjon av A. niger pyrA"-mutanter.

M13 K07

Hjelper M13-fag f.eks. for M13(+)KS. Beskrevet i Mead et al.

(1986) og Dotto og Zinder (1984).

<p>PYKl

Omfatter S. cerevisiae pyruvat kinase-genet. Beskrevet i Burke et al., 1983.

PGW1800

Omfatter PGII-genet til A. niger. En E. coli JM109-stamme som omfatter pGW1800 er deponert som DSM 5505 til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

pGV/ 830

Omfatter pelB-genet til A. niger. En E. coli HBlOl-stamme som omfatter pGW830 er deponert som DSM 4389 til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

PTZ18R

Oppnådd fra Pharmacia.

PGWIIOO

Omfatter A. niger pki-genet. Beskrevet i L.H. de Graaff, 1989 og deponert som E. coli DH5aF' / pGWllOO under nr. 5747 til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

PJDB207- IFNAM119

Beskrevet i EP-Patentsøknad EP-A-0 205 404.

Eksempel 1

Isolering og karakterisering av A. niger pyruvat kinase- genet

Eksempel 1. 1

Isolering av et DNA- fragment som omfatter g. iærpyruvat kinase-genet

Plasmid pPYKl omfattende 1,8 kb EcoRI-fragmentet fra Saccharomyces cerevisiae pyruvat kinase-genet (Burke et al., 1983) blir spaltet med EcoRI ved anvendelse av betingelsene gitt av forhandleren (BRL). Resulterende fragmenter blir separert ved elektroforese i en 0,6$ lavt smeltepunkt (LMP) agarosegel. LMP-agarosestykket som inneholder 1,8 kb EcoRI-fragmentet blir kuttet fra gelen og DNA blir ekstrahert ved følgende prosedyre: TE-buffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) blir tilsatt til agarosestykket til et finalt volum på 500 pl, etterfulgt av 250 jjI fenol. Agarosen blir smeltet ved inkubering ved 65"C i 10 min. og blanding av oppløsningen. Etter tilsetning av 250 pl CIA (kloroform/isoamylalkohol 24:1) blir de vandige og organiske fasene separert ved sentrifugering (Eppendorf-sentrifuge) i 10 min. ved 14.000 x g. Den organiske fasen blir fjernet og den vandige fasen ekstrahert en gang til ved inkubering med 1/2 volum fenol i 10 min. ved 65°C, deretter tilsetning av ytterligere 1/2 volum CIA og separasjon av fasene. Den organiske fasen blir på ny fjernet og den vandige fasen sekvensielt ekstrahert ved romtemperatur med et likt volum fenol/CIA (1:1) og med et likt volum CIA. Til slutt blir DNA presipitert fra den vandige fasen ved tilsetning av 0,1 volum 3 M NaAcetat, pH 5,6 og 2 vol. etanol. DNA ble sedimentert ved sentrifugering (Eppendorf-sentrifuge) i 30 min. ved 14.000 x g ved romtemperatur. Etter fjerning av supernatanten blir DNA-pelletten tørket ved anvendelse av en Savant Speedvac-vakuumsentrifuge. DNA blir til slutt løst opp i 10 pl TE og konsentrasjonen blir bestemt ved agarose-elektroforese, ved anvendelse av en kjent mengde komigrerende lambda DNA som referanse.

Eksempel 1. 2

32 P- merking av DNA- fragmenter

100 ng 1,8 kb EcoRI-fragment isolert fra plasmid pPYKl som beskrevet i eksempel 1.1 blir merket ved nicktranslasjon, vesentlig som beskrevet av Maniatis et al., 1982, s. 109 til 112. Fem pl cx-<32>P-dATP (10 pCi/pl, 3.000 Ci/mMol), 1 pl (5 U/pl) DNA polymerase I, 100 pg DNase I, 100 ng 1,8 kb EcoRI-fragment pPYKl og sterilt vann blir tilsatt til 40 pl reaksjonsbuffer (bestående av 25 pM dGTP, 25 pM dCTP, 25 pM dTTP, 5 mM MgCl2, 50 mM Tris/HCl pH 7,5) til et finalt volum på 50 pl. Reaksjonsblandingen blir inkubert i to timer ved 16° C. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 5 pl 500 mM EDTA, pH 8,0. For å fjerne uinkorporert cx-<32>P-dATP fra blandingen blir volumet øket til 100 pl med TE og a-<32>P-dATP blir fjernet ved fraksjonering på en Sephadex G50 (Pharmacia) kolonne. Fraksjoner inneholdende radioaktivt merket 1,8 kb

EcoRI-fragment blir samlet og slått sammen. Merket DNA blir denaturert ved inkubering i tre min. ved 100° C og holdt enkelttrådet ved hurtig avkjøling på is før det blir tilsatt til hybridiseringsoppløsningen beskrevet i eksempel 1.4.

Eksempel 1. 3

Isolering av høymolekylvekt DNA fra A. niger

A. niger DNA blir isolert ved en noe modifisert prosedyre anvendt for å isolere plante-RNA (Slater, 1985). Mycel som blir dyrket over natt i flytende minimalmedium blir høstet, vasket med kaldt saltvann, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C. Nukleinsyrene blir isolert ved ødelegging av 0,5 g frossent mycel ved anvendelse av en mikrodismem-brator (Braun). Mycelpulveret som blir oppnådd blir ekstrahert med friskt laget ekstraheringsbuffer. Ekstraheringsbufferen blir preparert som følger: 1 ml tris-isopropyl-naftalensulfonsyre (TNS) (20 mg/ml) blir grundig blandet med 1 ml p-aminosalisylsyre (PAS) (120 mg/ml) og 0,5 ml 5 x RNB-buffer blir tilsatt (5 x RNB inneholder 121,10 g Tris, 73,04 g NaCl og 95,10 g EGTA i 1 1, pH 8,5). Etter tilsetning av 1,5 ml fenol blir ekstraheringsbufferen ekvilibrert i 10 min. ved 55"C. Den varme bufferen blir deretter tilsatt til mycelpulveret og suspensjonen blir grundig blandet i 1 min. Etter tilsetning av 1 ml kloroform blir suspensjonen på ny blandet i 1 min. Etter sentr ifugering ved 10^ x g i 10 min. blir den vandige fasen ekstrahert med et likt volum fenol/ kloroform (1:1) og blir deretter ekstrahert to ganger med kloroform. DNA blir isolert fra den vandige fasen ved anvendelse av følgende prosedyre: DNA blir øyeblikkelig presipitert fra den vandige fasen med 2 vol. etanol ved romtemperatur, deretter samlet ved sentrifugering ved 10^ x g i 10 min. og vasket to ganger ved reoppløsning av DNA i destillert, sterilt vann og på ny presipitert med etanol. Til slutt blir DNA på ny løst opp i TE-buffer. RNA blir deretter fjernet ved tilsetning av RNase A (20 jjg/ml).

Eksempel 1. 4

Bestemmelse av heterologe hybridiseringsbetlngelser Høymolekylvekts-DNA isolert fra A. niger som beskrevet i eksempel 1.3 blir spaltet med EcoRI og BamHI. Resulterende fragmenter blir separert ved agarosegelelektroforese og overført til nitrocellulose som beskrevet av Maniatis et al.

(1982) s. 383-389. Heterologe hybridiseringsbetlngelser blir bestemt og hybridiseringseksperimentene utført som tidligere beskrevet av de Graaff et al. (1988). Hybridiseringsbetin-gelsene for screening av biblioteket og for hybridisering av Southern-blots med 1,8 kb EcoRI-fragmentet til gjaergenet som en probe er: prehybridisering i 6 x SSC, 0, 1% SDS, 0,05$ natriumpyrofosfat og 20 jag/ml denaturert laksesperm-DNA ved 56°C i 3-5 timer, hybridisering i 6 x SSC, 0, 1% SDS, 0,05$ natriumpyrofosfat og 20 pg/ml denaturert laksesperm-DNA ved 56° C i 15-18 timer, etterfulgt av to vasker i 5 x SSC, 0, 1% SDS ved 56° C og to vasker i 2 x SSC ved 56° C. Filterne blir autoradiografert over natt ved -70°C ved anvendelse av Konica røntgenfilmer og Kodak X-0matic-kassetter med vanlige intensiverende skjermer.

Eksempel 1. 5

Screening av genbiblioteket med det radioaktive 1. 8 kb EcoRI-fragmentet

A. niger pki-genet blir isolert ved heterolog hybridisering ved anvendelse av 1,8 kb EcoRI-fragmentet til pPYKl som probe. Et genomisk bibliotek av A. niger N400, som blir dannet ifølge fremgangsmåten beskrevet i EP-A-0278355, blir screenet med 1,8 kb EcoRI-fragmentet til pPYKl ved en hybridiseringsprosedyre ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1.4. Screeningen resulterer i isolasjon av positive kloner. Fra kloner som tilveiebringer sterkest hybridi-seringssignaler blir plasmid DNA isolert ved mini-prep-isolering (Maniatis, et al., 1982, s. 368-369). Southern- og restriksjonsanalyse blir anvendt for å undersøke om en klon inneholder hele A. niger pki-genet. 5 kbp Bglll/Hindlll-fragmentet til denne klonen og 4,0 kbp BamHI/HindiII-vektor-fragmentet til E. coli-vektor pBR322 blir isolert ifølge LMP-agarosemetoden beskrevet i eksempel 1.1. 5 kbp Bglll/Hindlll-fragmentet blir ligert med 4,0 kbp BamHI/Hindlll-vektorfrag-mentet til pBR322 resulterende i plasmid pGWllOO, ved følgende prosedyre: 100 ng av pBR322-fragmentet blir blandet med 250 ng av nevnte 5 kbp BglII/HindiII-fragment og 4 pl 5 x ligeringsbuffer (sammensetning: 250 mM Tris/HCl pH 7,6; 50 mM MgCl2; 50 mM DTT; 5 mM ATP; 5 mM spermidin; 50 pg/ml BSA) og 1 pl (1,2 U/pl) DNA-ligase (BRL) blir tilsatt til blandingen i et finalt volum på 20 pl. Etter inkubasjon i 16 timer ved 14°C blir blandingen fortynnet til 100 pl med sterilt vann. 10 pl av den fortynnede blandingen blir anvendt for å transformere kompetente E. coli JMlOl-celler, som blir fremstilt ifølge CMI, CM2-fremgangsmåten beskrevet i Pharmacia Manual for M13-kloning/sekvenseringssystem. pGWllOO blir Isolert i stor skala (Maniatis, 1982, s. 86), renset ved CsCl tetthetsgradientsentrifugering og ekstrahering med fenol, presipitert med etanol og løst opp i TE-buffer. Plasmid pGWllOO blir ytterligere analysert ved restriksjonsanalyse og orientering av pki-genet blir bestemt ved hybridisering under betingelsene beskrevet i eksempel 1.4 ved anvendelse av fragmentene inneholdende 5'- og 3'-enden av S. cerevisiae pyruvat kinase-genet, et 1,0 kbp EcoRI/Bglll og et 0,88 kbp EcoRI/Bglll-fragment som prober.

Eksempel 1. 6

Sekvensbestemmelse av A. niger pyruvat kinase- genet Sekvensen til A. niger pki-genet. inkludert promoter-regionen, det strukturelle genet og termineringsregionen, blir bestemt ved subkloning av fragmentene fra pGWllOO i M13mpl8/mpl9. For nukleotidsekvensanalyse blir egnede restriksjonsfragmenter isolert som beskrevet i eksempel 1.1 og ligert med linearisert bakteriofag M13mpl8/19 RF DNA-vektorer (Messing, 1983; Norrander et al., 1983) som beskrevet i eksempel 1.5. Nukleotidsekvensene blir bestemt ved anvendelse av dideoksynukleotid-kjedetermineringsprosedy-ren (Sanger et al., 1977 ) som beskrevet i M13 kloning/- dideoksy-sekvenseringsinstruksjonsmanualen fra BRL, s. 50-73. Den bestemte sekvensen er angitt i sekvenslisten under SEK ID NR. 1.

Eksempel 2

Konstruksjon av ekspresjonsvektorene

Eksempel 2. 1

Introduksjon av et nytt restriksjonssete ved initierings-kodonet for translasjon til pyruvat kinase- genet

Eksempel 2. 1. 1

Fremstilling av uracil inneholdende M13mpl8- PK ( BamHI- PvuII)-templat- DNA

Bakteriofag M13mpl8-PK (BamHI-PvulI) oppnådd i eksempel 1.6 blir propagert ved inokulering av en 5 ml kultur av E. coli JM101 i 2 x YT-næringsmedium ved O.D.^qq nm = 0,1 med en enkel plakk. Etter vekst over natt ved 37° C blir bakteriene fjernet ved sentrifugering (10.000 x g, 10 min.) og supernatanten anvendt som en fagstokk for fremstilling av uracil inneholdende enkelttrådet DNA-templat.

Den uracil-inneholdende templaten blir fremstilt ifølge Kunkel et al. (1985) og Ner et al., (1988) som følger: 10 ml 2 x YT-medium inneholdende 5 mM uridin blir inokulert med E. coli RZ1032 og kulturen dyrket ved 37°C opp til en O.D.55Q nm på 0,3. Av denne kulturen blir 2,5 ml fortynnet i 10 ml 2 x YT-medium inneholdende 5 mM uridin. Denne kulturen blir infektert ved tilsetning av 12 pl M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) inneholdende supernatanten fremstilt som beskrevet ovenfor. Den infekterte kulturen blir dyrket i 5 timer ved 37°C. Etter denne vekstperioden blir bakteriene fjernet fra kulturen som beskrevet ovenfor, og fagen inneholdende supernatanten blir anvendt for å utføre en annen syklus med fagvekst på E. coli RZ1032 som beskrevet tidligere. I en tredje vekstsyklus blir 40 ml 2 x YT-medium inneholdende 5 mM uridin blandet med

10 ml av en E. coli RZ1032 kultur og 50 pl av fagen inneholdende supernatanten resulterende fra den andre vekst-syklusen blir tilsatt. Bakteriene blir dyrket i 5 timer ved 37°C og bakteriene blir fjernet fra supernatanten ved sentrifugering som beskrevet ovenfor. Supernatanten blir sentrifugert for andre gang før fagene blir presipitert ved tilsetning av 8 ml 20% polyetylenglykol-6.000/3 M NaCl. Fagene blir samlet ved sentrifugering i 10 min. ved 10.000 x g. Den resulterende fagpelletten blir resuspendert i 2,5 ml TE-buffer. Proporsjon av uracil-inneholdende fag blir bestemt ved utsåing av forskjellige fortynninger av denne fagoppløs-ningen på E. coli JM101 (ikke-permissive) samt på E. coli RZ1032 (permissive). Et forhold mellom ikke-uracil- og uracil-inneholdende fag på 1 til IO<6> blir funnet. Enkelttrådet M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) DNA blir isolert fra fagopp-løsningen ved fenol-kloroform-ekstraksjon, presipitert med etanol som beskrevet i eksempel 1.1 og resuspendert i 125 pl TE-buffer.

Eksempel 2. 1. 2

Introduksjon av et Nsil- sete ved initieringssetet for translas. ion til A. niger pki- genet ved in vitro mutagenese Et Nsil-sete blir dannet ved initieringssetet for translasjon til pyruvat kinase-genet ved in vitro mutagenese (Ti-Zi Su og M. Raafat El- Gewely, 1988) av uracil inneholdende enkelttrådet M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) DNA beskrevet i eksempel 2.1.1 ved anvendelse av mutagenisk oligonukleotid 5926 som har nukleotidsekvensen til SEK ID NR. 2.

Oligonukleotidet 5926 består av 29 nukleotider der sekvensen er identisk med sekvensen rundt initieringssetet til trans-lasjonen av pki-genet med unntagelse av posisjonene 12 til 14 til oligonukleotidet. Sekvensen til oligonukleotidene i posisjonene 12 til 14, som er den opprinnelige pki-trans-lasjonsinitieringsregionen GCC, er CAT i oligonukleotidet. Oligonukleotidet har derfor et Nsl-sete i posisjonene 9 til 14.

For in vitro mutasjon av pki-genet blir 50 pmol av oligonukleotid 5926 fosforylert ved 5'-enden (Maniatis, 1982) med 100 pmol ATP. Denne reaksjonen blir utført i 30 min. ved 37°C med 10 U T4 polynukleotid kinase (BRL) i 50 pl kinasebuffer som anbefalt av fremstilleren. Reaksjonen blir avsluttet ved tilsetning av 2 pl 500 mM EDTA-oppløsning. Blandingen blir ekstrahert med fenol og kloroform som beskrevet i eksempel 1.1.

0,2 pmol uracil-inneholdende enkelttrådet M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) DNA fremstilt ifølge eksempel 2.1.1 blir blandet med 0,5 pmol fosforylert oligonukleotid 5926 i 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 25 mM NaCl i et finalt volum på 10 pl. Blandingen blir inkubert i 5 min. ved 65°C, sakte avkjølt til romtemperatur i løpet av 60 min. og plassert på is i 15 min. Deretter blir 2 pl 500 pM dNTP, 1,5 pl 10 mM ATP, 1 ml T7 DNA-polymerase (12 U/pl) (Pharmacia) og 1 pl T4 DNA-ligase (1,2 U/pl) (BRL) tilsatt til blandingen og denne polymerisa-sjonsblandingen blir inkubert i 15 min. ved 37°C. Reaksjonen blir avsluttet ved oppvarming ved 65" C i 5 min. Polymerisa-sjonsblandingen blir deretter fortynnet til et finalt volum på 100 pl og aliquoter av den fortynnede blandingen blir anvendt for å transfektere kompetente E. coli JM101 (ikke-permissive) og E. coli RZ1032 (permissive) som blir fremstilt som beskrevet i eksempel 1.5. Transfekterte celler blir sådd ut som også beskrevet i eksempel 1.5.

Eksempel 2. 1. 3

Sekvensanalvse av mutert M13mpl8- PK ( BamHI- PvuII)

Tolv plakk blir plukket fra skåler med transformert E. coli JM101, fag blir propagert med E. coli JM101 som en vert og fra hver fag blir enkelttrådet DNA isolert som beskrevet i eksempel 2.1.1. Isolert enkelttrådet DNA til disse fagene blir analysert ved "G-track"-analyse, som beskrevet i BRL M13 klonings- og sekvenseringsmanual. Tre av fagene med antatte G-mønstre for ønsket mutasjon blir analysert ved sekvensanalyse som beskrevet i eksempel 1.6. Fagene omfatter det antatte 1053 bp BamHI-PvulI-fragmentet med Nsil-setet ved initieringssetet for translasjon til <p>ki-<g>enet. Muterte fag blir betegnet M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII).

Eksempel 2. 2

Konstruksjon av pPK- PLB

742 bp BamHI/Nsil-fragmentet inneholdende pki-promoter-regionen blir isolert fra M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvulI) RF DNA, mens et 2,6 kb BamHI/Nsil-fragment, inneholdende det strukturelle genet for pektinlysase B ( pel B), blir isolert fra plasmid PGW830 ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1.1. Begge fragmentene blir ligert i en defosforylert pBR322-vektor spaltet med BamHI (Fig. 4) som følger: 100 ng BamHI spaltet pBR322 DNA blir blandet med 250 ng 2,6 kb pelB BamHI/ Nsil-f ragment og med 250 ng 742 bp pki BamHI/NsiI-f ragment. Blandingen blir ligert som beskrevet i eksempel 1.5. Aliquoter av den fortynnede ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere kompetente E. coli JMlOl-celler, fremstilt som beskrevet i eksempel 1.5. Transformeringsblandingen blir sådd ut på LC-skåler inneholdende 50 jjg/ml ampicillin og inkubert ved 37°C over natt. Transformanter blir plukket fra skålen og dyrket i 5 timer ved 37'C i flytende LC-medium inneholdende 50 jig/ml ampicillin. Plasmid DNA blir isolert fra transformanter ved miniprep-isolering (Maniatis et al., 1982, s. 368-369). En transformant inneholdende et plasmid som viser ventede fragmenter etter spaltning med BamHI, SphI, Smal og med kombinasjonen av BamHI og Nsil blir videre analysert ved sekvensanalyse, ved anvendelse av et pelB spesifikt oligonukleotid som primer. Sekvensen tilsvarer den antatte sekvensen til det koblede genet pki- pel B. Plasmidet blir betegnet pPK-PLB og blir propagert og renset som beskrevet i eksempel 1.5.

Eksempel 3

Eksempel 3. 1

Introduksjon av pPK- PLB i A. niger

Plasmid pPK-PLB oppnådd i eksempel 2.2, blir ført inn i A. niger ved kotransformasjon av A. niger N593 med plasmidene pGW613 og pPK-PLB. pGW613 omfatter det selektive markørgenet pyr A.

Protoplastene til A. niger N593 blir preparert fra mycelet ved dyrking av A. niger N593 på minimalmedium supplementert med 0, 5% gjærekstrakt, 0, 2% kasaminosyrer, 50 mM glukose og 10 mM uridin i 20 timer ved 30°C. Preparering av protoplaster fra A. niger N593 og transformasjonsprosedyren blir utført som beskrevet av Goosen et al., 1987. Resulterende PYR<+->transformanter blir dyrket på nevnte supplementerte minimalmedium og analysert for ekspresjon av pel B-genet.

Eksempel 3. 2

Analyse av PK- PLB- transformanter til A. niger N593

A. niger-transformanter oppnådd i eksempel 3.1 blir analysert for dannelsen av pel B-genproduktet, PLB-proteinet. De blir selektert og dyrket i 18 timer på medium inneholdende 10 g 72% forestret pektin, 7,5 g NH4NO3, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04, 1,5 g KH2PO4, 0,5 g kasaminosyrer, 0,5 g gjærekstrakt og 0,5 ml av en stamoppløsning av sporelementer, H2O til 1 1, pH 6,0. Stamoppløsningen av sporelementer består pr. liter av 10 g EDTA, 4,4 g ZnS04.7H20 1,01 g MnCl2.4H20, 0,32 g CoCl2.6H20, 0,315 g CuS04.5H20, 0,22 g (NH4)6Mo7<0>24.4H20, 1,47 g CaCl2.2H20 og 1,0 g FeS04.7H20. Etter vekst blir mycelet fjernet ved filtrering og kulturfiltratet analysert ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese ved anvendelse av en gel inneholdende 10% akrylamid. PLB-proteinet blir detektert ved Western-blot analyse (som beskrevet i manualen for 2117 multiphor II semi-tørr blotapparatur til LKB) ved anvendelse av polyklonale antistoffer fra kanin dannet mot PLII (van Houdenhoven, 1975) og geite-anti-kanin antistoff konjugert til alkalisk fosfatase (Bio Rad) ifølge fremstillerens instruksjoner. Av analyserte transformanter produserte omtrent 70% PLB-protein. En transformant blir selektert for videre arbeid. Transformanten blir nedenfor betegnet som A. ni<g>er/PK-PLB.

Eksempel 3. 3

Northern- analyse av pPK- PLB- transformanten til A. niger

A. niger-transformanten A. niger/PK-PLB selektert ifølge eksmpel 3.2 blir analysert for dannelsen av pelB spesifikt mRNA. Transf ormanten blir dyrket i 16 timer ved 30° C på et medium som beskrevet i eksempel 3.2 med unntagelse av karbonkilden som er 2% (v/v) D-glukose. Etter høsting blir mycelet hurtig tørket ved pressing av dette mellom papirark, og øyeblikkelig nedsenket i flytende nitrogen for maling. Ett gram pulverformig mycel blir deretter suspendert i 3 ml buffer (4,0 M guanidiniumtiocyanat, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA pH 7,5, 1% p-merkaptoetanol, 2% natriumlauryl-sarkosinat) og rystet i 1 min. Etter sentrifugering (10 min., 10.000 x g ved romtemperatur) blir supernatanten isolert. Til hver 2,5 ml supernatant blir 1 g CsCl tilsatt. Prøvene blir deretter lagt på en pute av 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA (pH 7,5) i et SW50 Beckman-ultrasentrifugerør. Sentrifugering blir utført i 16 timer ved 30.000 rpm ved 20 ° C ved anvendelse av en Beckman SW50-rotor. RNA-pellettene blir løst opp i sterilt destillert vann. Mengden RNA i prøvene blir justert til omtrent like konsentrasjoner etter agarosegelelektroforese. Mengder på omtrent 25 jjg RNA blir kjørt ved anvendelse av glyoksal-denaturering (Maniatis et al. (1982) Molecular doning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, side 200). RNA blir blottet på "Gene-bind" (Pharmacia) ved anvendelse av 10*SSC som overføringsbuffer og bakt i 1 time ved 80°C. Hybridisasjonen blir utført i 16 timer i hybrldiseringsbufferen beskrevet av Church og Gilbert (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1991-1995 (1984 )) ( 1% BSA, 1 mM EDTA, 0,5 M NaPj pH 7,2, 7% SDS) ved 60°C ved anvendelse som probe radioaktivt merket 2,8 kbp Xhol-fragment hvorpå pelB-genet er beliggende. Blottene blir vasket to ganger i 30 min. med 2-SSC, 0,1$ SDS og deretter to ganger i 30 min. med 0,2"SSC, 0,1$ SDS ved 60°C. Eksponering av blottene blir utført over natt ved -70°C ved anvendelse av Konica røntgenfilm og intensiverende skjermer. Denne analysen angir et sterkt pelB spesifikt mRNA-signal i transformanten, og ikke noe signal i kontrollstammen A. niger N400 dyrket på samme måte.

Eksempel 3. 4

Produksjon. rensing og karakterisering av pektinlyase B ( PLB) fra A. niger/ PK- PLB

Eksempel 3. 4. 1

Dyrkningsbetingelser for å fremstille pektinlyase B og isolering av enzymet

Sporene til A. niger/PK-PLB blir anvendt for å inokulere 600 ml kulturmedium til en tetthet på 7 x IO<6> sporer/ml. Mediet har følgende sammensetning: 20 g glukose, 7,5 g NH4NO3, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04.7H20, 15 g KH2P04, 5 g gjærekstrakt, 0,5 g ribonukleinsyrer, 0,5 ml av en stamoppløsning av sporelementer, H20 til 1 liter, pH 6,0. Stamoppløsningen av sporelementene består pr. liter av 10 g EDTA, 4,4 g ZnS04. 7H20, 1,01 g MnCl2.4H20 0,32 g CoC<l>2.6H20, 0,315 g CuS04. 5H20, 0,22 g (N<H>4)6Mo7<0>24.4H20, 1,47 g CaCl2.2H20 og 1,0 g FeS04.7H20. Kulturen blir dyrket i 3 timer ved 30°C i en New Brunswick-orbitalryster og deretter overført til en 10 liters flaske inneholdende 4 liter av samme medium. Kulturen blir utluftet ved anvendelse av en spreder i bunnen av flasken for å fordele sammentrykket luft og ryste kulturen. Veksten blir fortsatt i 16 timer ved 30°C. Etter denne vekstperioden er pH til mediet 5,8. Mycelet blir fjernet ved filtrering og PLB isolert fra kulturfiltratet ved følgende prosedyre: Enzymet blir isolert nesten kvantitativt ved ammoniumsulfat-presipitering ( 95% metning) ved 0°C etterfulgt av sentrifugering (15 min., 8.500 x g). Presipitert enzym blir løst opp i 50 mM natriumfosfatbuffer pH 6,0, dialysert mot samme buffer og lagret ved -20°C. Pektinlyaseaktiviteten blir analysert ved 25°C ved anvendelse av en final konsentrasjon på 0,3$ (v/v) pektin (f orestringsgrad 94,656) i 50 mM Tris/ HCl-buffer, 1 mM CaCl2, pH 8,5 ved anvendelse av den spektro-fotometriske prosedyren beskrevet av van Houldenhoven, 1975, ovenfor.

Analyse av kulturfiltratet i SDS-polyakrylamid-elektroforese og Western-blotting angir et hovedproteinbånd som tilsvarer PLB og nesten rent enzym i den presipiterte og dialyserte fraksjonen. Den spesifikke pektinlyaseaktiviteten i kulturfiltratet er 48 U/mg protein og i den presipiterte og dialyserte fraksjonen 216 U/mg protein og proteinkonsen-trasjonen er 380 mg og 82,6 mg, bestemt ved Pierce BCA-analyse.

Eksempel 3. 4. 2

PLB- proteinegenskaper

Den tilsynelatende molekylmassen til PLB isolert i eksempel 3.1.3 er 39,5 kDa som bestemt ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese ved anvendelse av 10$ geler. Renset enzym er stabilt i 50 mM natr iumf osf atbuf f er pH 6,0, men blir sakte inaktivert ved høyere pH f.eks. i 50 mM Tr is/HCl-buf f er pH 7,5. Denne inaktiveringen er reversibel og aktiviteten kan på ny bli oppnådd ved dialysering av enzymoppløsningen mot fosfatbuffer pH 6,0. PLB fremstilt i eksempel 3.1.3 er en typisk endo-pektin lyase, som vist fra oligomeriske nedbrytningsprodukter som oppstår fra høyt forestret pektin (dvs. 94,6$). Enzymet foretrekker høyt forestret pektin som vist i Tabell 1.

<a>Analysebetingelser: 0,356 (v/v) pektin i 50 mM Tris/HCl buffer pH 8,5 inneholdende 0,5 M NaCl ved 25°C.

Michaelis-Menten parametre for PLB er også blitt bestemt ved anvendelse av enzym som er lagret i natriumfosfatbuffer pH 6,0. Aktiviteten ble analysert ved 25°C i 50 mM tris/HCl-buffer pH 8,5 i nærvær av 0,5 M NaCl, ved anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av høyt forestret pektin (dvs. 94,656). En Km-verdi på 9 mM (på monomerbasis) og et omset-ningstall på 51.500 ble funnet.

Eksempel 4

Ekspresjon av human hybrid interferon BDBB under kontroll av pki- promoter

Eksempel 4 . 1

Konstruksjon av plasmid pGII- IFN AM119- forløper

Plasmid pGW1800, som er isolert fra E. coli JM109/pGW1800 (DSM 5505 ), blir spaltet med EcoRI og behandlet med T4 polymerase som nedenfor. Religering av dette DNA og transformering av E. coli DH5aF' muliggjør isolasjon av et plasmid pGW1800-E, som er det samme som pGW1800, med unntagelse av at EcoRI-spaltningssetet er deletert.

Plasmid pGW1800-E blir spaltet med Bglll og behandlet med bakterielt alkalisk fosfatase (BRL) i nærvær av 50 mM Tris-HC1 pH 8,0 og 50 mM NaCl i 1 time ved 65°C. Alkalisk fosfatase blir inaktivert ved spaltning med proteinase K (Boehringer Mannheim) og fenolekstrahering. DNA blir deretter etanolpresipitert, tørket og på ny løst opp i vann. De klebrige endene blir deretter ifylt med T4 DNA polymerase som nedenfor.

Plasmid pJDB207-IFN AM119 (EP 205 404) blir spaltet med Hindlll og Clal. Klebrige ender til disse lineære fragmentene blir ifylt med T4 DNA polymerase (Boehringer Mannheim) i nærvær av 0,1 mM av hver av dCTP, dGTP, dATP og dTTP pluss 67 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,7 mM MgCl2, 16,7 mM (NH4)2S04 og 5 mM DTT i 30 min. ved 37° C. Reaksjonen blir stoppet ved oppvarming til 65°C i 5 min. Fragmentene blir separert i en 0, 8% lav geltemperaturagarose (BioRad) gel og 1 kbp-fragmentet, som omfatter IFN AM119 kodende region, ble spaltet og DNA renset på en Elutip D (Schleicher & Schtill) kolonne og etanolpresipitert (Schmitt & Cohen, 1983).

100 pg IFN AM119 fragmentet og pGW1800-E vektoren preparert ovenfor blir ligert sammen i 5 pl 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 1 enhet T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) i 2 timer ved romtemperatur. Denne blandingen blir transformert inn i kompetente E. coli DH5aF'-celler. Ampicillinresistente transformanter blir screenet ved restriksjonsspaltning for plasmid-DNA for å identifisere de som inneholder plasmid pGII-IFN AM119-forløperen.

Eksempel 4. 2

Dannelse av pGIIss- IFN AM119 ved anvendelse av PCR

PCR-fremgangsmåten som følger er beskrevet av R.M. Horton et al. (1989). pGW1800 blir linearisert, ved Xbal-spaltning, og presipitert med etanol. Etter resuspensjon i vann blir 100 pg av dette DNA utsatt for ampiifikasjon ved polymerasekjede-reaksjon (PCR) ved anvendelse av oligonukleotidene A og C

(SEK ID NE. 5 og 6) i en automatisert termisk syklusinnret-ning i 25 sykluser (hver bestående av 1 min. ved 94° C, 2 min. ved 40°C og 3 min. ved 72°C) etterfulgt av 10 min. ved 72°C. 100 pM av hvert oligonukleotid og 0,5 pl Taq-polymerase (Perkin Eimer Cetus) blir anvendt for hver reaksjon i et volum på 100 pl ved anvendelse av reaksjonsbufferen anbefalt av forhandleren. Dette tilveiebringer DNA 2 (SEK ID. NE. 7).

Likeledes gir pJDB207-IFN AM119 linearisert med BamHI og d utsatt for PCE med enten oligonukleotidene D (SEK ID NE. 8)

og F (SEK ID NE. 9) gir DNA 3 (SEK ID NE. 10).

Disse reaksjonsblandingene blir presipitert med etanol, på ny

løst opp i vann og en aliquot blir undersøkt på en gel for å <5> bestemme konsentrasjonen av DNA-fragmentene i blandingene.

Ved anvendelse av samme betingelser som ovenfor blir DNA 2 og 3 utsatt for PCR med oligonukleotidene A og F for å tilveiebringe en DNA-sekvens som omfatter en perfekt i-ramme fusjon o av PGII-signalsekvensen koblet til et PGII-promoterfragment med den kodende regionen for moden hybridinterferon BDBB.

BamHI-EcoRI-fragmentet til dette DNA som inneholder den

perfekte i-ramme fusjonen blir ligert inn i BamHI-EcoRI-5 kuttet pGII-IFN AM119-forløper for å danne plasmid pGIIss-IFN AM119. Den delen av sekvensen til pGIIss-IFN AM119 som omfatter PGII-signalsekvensen, BDBB-hybrid IFN AM119-genet, gjær pH05-terminator er angitt under SEK ID NR. 11.

o Eksempel 4. 3

Konstruksjon av plasmid pPKI- IFN- 1

To pg pGWllOO blir åpnet med restriksjonsendonuklease Nsil ved et sete ved 3'-enden for pki-genet. Dette DNA blir

behandlet med T4 polymerase i 30 min. ved 37° C i 20 pl <[>5 reaksjonsblanding inneholdende: 2 pg DNA, 67 mM Tris/HCl pH 8,8, 6,7 mM MgCl2, 16,7 mM (N<H>4)2S04, 5 mM ditiotreitol, 50 pM av hver av dGTP, dATP, dCTP og dTTP, 1U T4 polymerase.

Etter etanolpresipitasjon blir 100 ng av dette DNA ligert med 10 pM ufosforylert EcoRI-oligonukleotidlinjer med sekvensen 5' GGAATTCC ved romtemperatur i 2 timer i en 5 pl reaksjonsblanding inneholdende: 100 ng DNA, 10 pM linker, 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 1 U ligase. Denne blandingen blir transformert inn i E. coli DH5aF' og selektert for plasmid inneholdende celler på 2 x YT pluss 50 pg/ml ampicillin. Etter frembringelse av DNA fra 18 koloner og screening av disse ved restriksjonsspaltning blir plasmid pGW1100-E omfattende EcoRI-linkersekvensen og som mangler Nsil-setet identifisert.

Plasmid pGIIss-IFNAM119 som blir fremstilt ifølge eksempel 4.2 inneholder Aspergillus niger PGII-promoter og signalsekvens kondensert til et IFN-gen som er etterfulgt av Sacharomyces cerevisiae PH05-terminator og PGII-terminator. Dette plasmidet blir spaltet med Pstl i enden av PH05-promoteren og gjort buttendet med T4-polymerase og ligert til en Sphl-oligonukleotidlinker med sekvensen 5' GGCATGCC og transformert inn i E. coli DH5a nøyaktig som ovenfor, for å danne plasmid pGIIss-IFNAM119Sph. 50 ng av hver av følgende fire rensede fragmenter blir ligert sammen som ovenfor: - 742 basepar BamHI/Nsil-fragmentet, inneholdende <p>ki-promoterregionen, fra mutert M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvulI) RF DNA. Nsil-setet blir fjernet ved behandling av Nsil spaltet plasmid med T4-polymerase før spaltning med BamHI. - Omtrent 1,1 kbp BamHI/SphI-fragmentet, inneholdende 3'-enden til PGII-promoter pluss PGII-signalsekvensen pluss IFN-genet, fra PGIIss-IFNAM119SRh. BamHI-setet ble ifylt med T4-polymerase før spaltning med SphI. - 417 bp SphI/EcoRI-fragmentet, inneholdende terminatorregionen til pki-genet, fra pGW1100-E. - Omtrentlig 2,8 kb fragmentet til BamHI/EcoRI spaltet pTZ18R (Pharmacia). Etter transformering inn i E. coli DH5aF' og screening ble plasmid PKI-IFN-1 identifisert.

Eksempel 4. 4

Mutagenese av pPKI- IFN- 1 for å danne pPKI- IFN- 2 og pPKIssIFN- 2

Plasmid pPKI-IFN-1 ble transformert inn i dut~ung~ E. coli-stamme BW313. Denne ble superinfisert med M13K07 for å tilveiebringe enkelttrådet uracil-substituert fag fra plasmidet. Dette fag-DNA ble preparert og mutagenisert som beskrevet ovenfor med to forskjellige oligonukleotider IFN-1 og IFN-2, der sekvensene er angitt i sekvenslisten til SEK ID NR. 12 og 13. Mutagenisering med oligonukleotid IFN-1 tilveiebringer pPKI-IFN-2, og med IFN-2 tilveiebringes pPKIssIFN-2. Begge plasmidene omfatter perfekte i-ramme funksjoner. pPKI-IFN-2 har pki-promoter koblet til et metionin-startkodon og deretter resten av IFN-genet og pPKIssIFN-2 har pki-genet koblet til PGII-signalsekvensen etterfulgt av IFN-genet. Nukleotidsekvensene til regionene til pPKI-IFN-2 og pPKIssIFN-2 som rekker fra pki-promoteren opp til terminatorregionen er angitt under SEK ID NR. 14 og 15.

Eksempel 4. 5

Transformasjon av PKI- IFN- ekspresjonsplasmid inn i Aspergillus niger

Plasmidene pPKI-IFN-2 og pPKIssIFN-2 blir kotransformert inn i A. niger N593 ved anvendelse av A. niger pyrA-genet som en selekterbar markør på plasmid pGW613 som beskrevet ovenfor.

Eksempel 4. 6

Analyse av transformanter

Transformantene fra eksempel 4.5 blir analysert for produksjon av IFN ved Western-analyse som beskrevet i eksempel 3.2, men ved anvendelse av antistoff dannet mot IFN (istedenfor et anti-PLII-antistoff).

Deponerte mikroorganismer

E. coli DH5ocF'/pGW1100 nr. dsm 5747 tole deponert 18. januar 1990 og A. niger N593 nr. DSM 5756 ble deponert 26. januar

1990 ifølge Budapest-avtalen til "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig.

Referanser

Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J. Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W. , Crosa, J.W. og S. Falkow (1977) "Construction and Characterization of new cloning vehicles II: A multipurpose cloning system". Gene 2: 95.

BRL: "M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual".

Burke, R.L., Tekamp-Olson, P. og Najarian, R. (1983): "The isolation, characterization and sequence of the pyruvate kinase gene of Saccharomyces cerevisiae". J. Biol. Chem., 258: 2193-2201.

Dotto, P.D. og Zinder, N.D. (1984). Nature 311: 279.

Goosen, T. , Bloemheuvel, G. , Gysler, C, de Bie, D.A. , van den Broek, H.W.J, og Swart, K. (1987) "Transformation of Aspergillus niger using the homologous orotidine-5'-phos-phate-decarboxylase gene", Curr. Genet., 11: 499-503.

de Graaff, L.H., van den Broek, H.W.J, og Visser, J. (1988): "Isolation and transformation of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene". Curr. Genet., 13: 315-321.

de Graaff, L.H. (1989). "The structure and expression of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger". Ph. D. Thesis. Agricultural University of Wageningen, Nederland.

Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. og Pease, CR. (1989). "Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension". Gene 77: 61-68.

Kunkel, T. (1985): "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 488-492.

Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982): "Molecular cloning, a laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Mead et al. (1986). "Protein Engineering". 1:67.

Messing, J. (1979). "A multipurpose cloning system based on single stranded DNA bacteriophage M13. Recomb. DNA Techn". Bull 2 (2): 43.

Messing, J. (1983): "New M13 vectors for cloning". Methods in Enzymol. 101C: 20-78.

Ner, Sarbjit S. , Goodin, D.B. og Smith, M. (1988): "A simple and efficient procedure for generating random polnt mutations and for codon replacements using mixed oligodeoxynucleo-tides", DNA, Vol. 7, nr. 2: 127-134.

Norrander, J., Kempe, T. og Messing, J. (1983): "Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide directed mutagenesis". Gene, 26: 101-106.

Pharmacia: "Manual for the M13-cloning/sequencing system, including M13mpl8/M13mpl9".

Peden, K.W.C. (1983). "Revised sequence of the tetracyclin-resistance gene of pBR322". Gene 22, 277-280.

Sanger, F., Nickelen, S. og Coulson, A.R. (1977): "DNA sequencing with chain terminating inhibitors". Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463-5467.

Schmitt, J.J. og Cohen, B.N. (1983). "Ouantitative isolation of restriction fragments from low-melting agarose by Elutip-a affinity chromatography". Analytical Biochemistry 133: 462-464.

Slater, R.J. (1985 ): "The extraction of total RNA by the detergent and phenol method". I: Walker J.M. (red). "Methods in Molecular Biology", vol. 2, 1985, Nucleic acids, Humana press, Cliftar, New Yersey, s. 101-108.

Sutcliffe, J.G. (1979). "Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322". Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol. 43: 77-90.

Ti-zi Su og M. Raafat El-Gewely (1988): "A multisite-directed mutagenesis using Ty-polymerase: application for reconstruc-ting a mammalian gene". Gene 69: 81-89.

van Houdenhoven, F.E.A. (1975): Ph.D. thesis, Agricultural University, Wageningen, Nederland.

Vishniac, W. og Santer (1957). Bacteriol. Rev. 21: 195-213.

SEK ID NR. 1

SEKVENSTYPE: Nukleotid med tilsvarende protein SEKVENSLENGDE: 3605 bp

TRÅDTYPE: dobbel

T0P0L0GI: lineær

MOLEKYLTYPE: genom

OPPRINNELIG ORGANISMEKILDE: Aspergillus niger N400 EKSPERIMENTELL KILDE: Plasmid pGWllOO fra E. coil DH5aF<*>/pGW1100

TREKK:

fra 1 til 1.041 bp pki-promoterregion fra 831 til 835 bp putatlv CAAT-boks fra 928 til 933 bp putatlv TATA-boks fra 849 til 1.040 bp CT-rik region

fra 1.042 til 3.096 bp kodende region for pyruvat kinase fra 1.166 til 1.266 bp intron 1

fra 1.312 til 1.370 bp intron 2

fra 1.418 til 1.472 bp intron 3

fra 1.545 til 1.606 bp intron 4

fra 1.729 til 1.828 bp intron 5

fra 2.663 til 2.711 bp intron 6

fra 2.794 til 2.851 bp intron 7

SEK ID NR. 2

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 21 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk oligonukleotid

TREKK:

fra 8 til 13 Nsil-sete

fra 1 til 7 komplementær med A. niger pki nukleotidene 1.054 til 1.048 (SEK ID NR. 1)

fra 14 til 21 komplementær med A. niger pki nukleotidene 1.041 til 1.034 (SEK ID NR. 1)

EGENSKAPER: Mutagenisk oligonukleotid 5.926 for innføring av et Nsil-sete i posisjonene 1.042 til 1.047 til A. niger pki-genet.

SEK ID NR. 3

SEKVENSTYPE: Nukleotid med tilsvarende polypeptid SEKVENSLENGDE: 821 bp

TRÅDTYPE: dobbel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: genomisk

OPPRINNELIG ORGANISMEKILDE: A. niger N400

EKSPERIMENTELL KILDE: pGW1800 til E. coli JM109/pGW1800

(DSM 5505)

TREKK: fra 1 til 203 bp PGII-promoterregion

fra 204 til 261 bp slgnalpeptid

fra 262 til 818 bp N-terminaldel til pro-PGII EGENSKAPER: 5' terminaldel til PGII-genet til A. niger omfattende promoterregion, signalsekvens og N-terminal pro-PGII.

SEK ID NR. 4

SEKVENSTYPE: Nukleotid med tilsvarende polypeptid SEKVENSLENGDE: 653 bp

TRÅDTYPE: dobbel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: genomisk

OPPRINNELIG ORGANISMEKILDE: A. niser N400

EKSPERIMENTELL KILDE: pGW1800 til E. coil JM109/pGW1800

(DSM 5505)

TREKK: fra 1 til 116 bp kodende region for C-terminal pro-PGII

EGENSKAPER: 3' terminaldel av PGII-genet omfattende C-terminal pro-PGII.

SEK ID NR. 5

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 20 baser

TRÅDTYPE: enkel

T0P0L0GI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk

TREKK: Identisk med basene 1 til 20 til kodende tråd til PGII-sekvensen med SEK ID NR. 6

EGENSKAPER: Oligonukleotid A for konstruksjon av nøyaktige PGII-fusjoner med et heterologt gen ved anvendelse av PCR.

SEK ID NR. 6

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 32 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk

TREKK: fra 1 til 12 komplementær med regionen til IFN AM119-genet kodende for aminosyrene 1 til 4 til moden IFN. fra 13 til 32 komplementær til basepos isj onene 260 til 241 til den kodende tråden til PGII-sekvensen med

SEK ID NR. 6

EGENSKAPER: Oligonukleotid C nyttig for konstruksjon av nøyaktige PGIIss-IFN AM119-fusJonsgener

SEK ID NR. 7

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 272 baser

TRÅDTYPE: enkel, kodende tråd

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: rekombinant

EKSPERIMENTELL KILDE: PCR

TREKK: fra 1 til 203 A. niger PGII-promoterregion

fra 204 til 258 A. niger PGII-signalsekvens fra 259 til 270 N-terminal til IFN BDBB-hybrid (IFN

AM119)

EGENSKAPER: DNA2 omfatter en perfekt i-ramme fusjon av A. niger PGII-signalsekvensen og de N-terminale aminosyrene 1 til 4 til moden IFN AM119 (BDBB-hybrid). Nyttig for konstruksjon av ekspresjonsvektorene for produksjon av IFN utskilt fra A. nlger-verter.

SEK ID NR. 8

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 32 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk

TREKK: fra 1 til 12 bp identisk med basene 249-261 til den kodende tråden til PGII-genet med SEK ID NR. 6

fra 13 til 32 bp identisk med den kodende regionen for N-terminale aminosyrer 1 til 7 til moden IFN

AM119 (BDBB-hybrid)

EGENSKAPER: Oligonukleotid D for konstruksjon av nøyaktig i-ramme fusjoner av kodende regioner for A. niger PGII-signalsekvens og IFN AM119.

SEK ID NR. 9

SEKVENSTYPE: Nukleotid

SEKVENSLENGDE: 20 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk

TREKK: Komplementær med et område i den 3' ikke-kodende regionen til den kodende tråden til IFN AM119 (BDBB-hybrid) genet. Omfatter et EcoRI-sete.

EGENSKAPER: Oligonukleotid F for konstruksjon av ekspresjonsvektorene for ekspresjon av IFN AM119.

SEK ID NR. 10

SEKVENSTYPE: lineær

SEKVENSLENGDE: 133 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: rekombinant

TREKK: fra 1 til 12 C-terminal for A. niger PGII-signal-peptidet

fra 13 til 133 modne IFN AM119 (BDBB-hybrid)

EGENSKAPER: DNA3 omfatter en perfekt i-ramme fusjon av A. niger signalsekvensen C-terminal og IFN AM119 (BDBB-hybrid). Nyttig for konstruksjon av ekspresjonsvektorene for produksjon av IFN utskilt fra A. nlger-vertene.

SEK ID NR. 11

SEKVENSTYPE: nukleotid

SEKVENSLENGDE: 990 bp

TRÅDTYPE: dobbel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: rekombinant

EKSPERIMENTELL KILDE: Plasmid PGIIssIFN AMI19

TREKK: fra 1 til 178 bp A. niger PGII-promoter

fra 199 til 255 bp A. niger PGII-signalsekvens fra 256 til 753 bp moden IFN AM119 (BDBB-hybrid)

fra 756 til 984 bp gjær PH05-terminator fra 1 til 6 bp BamHI-sete

fra 364 til 369 bp EcoRI-sete

fra 885 til 990 bp Pstl-sete

EGENSKAPER: BamHI-Psil-fragment til pPGIIssIFN AM119 omfattende BamHI-EcoRI-setet dannet ved PCR som inneholder perfekt 1-ramme fusjon av PGII-signalsekvensen og interferon AM119 (BDBB-hybrid) strukturelt gen koblet til PGII-promoter og PH05-terminator.

SEK ID NR. 12

SEKVENSTYPE: nukleotid

SEKVENSLENGDE: 45 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: 'syntetisk

TREKK: fra base 1 til 16 identisk med basene 1026 til 1041

til pjki-promoter regi on (SEK ID NR. 1)

fra base 17 til 19 startkodon ATG

fra base 20 til 45 aminosyrene 1 til 9 til moden IFN

AM 119 (BDBB-hybrid)

EGENSKAPER: Oligonukleotid IFN-1, nyttig for preparering av perfekte fusjoner av A. niger pki-promoter og IFN AM119 strukturelt gen ved anvendelse av PCR

SEK ID NR. 13

SEKVENSTYPE: nukleotid

SEKVENSLENGDE: 42 baser

TRÅDTYPE: enkel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: syntetisk

TREKK: fra base 1 til 21 identisk med basene 1031 til 1041

til den kodende tråden til pki-genet (SEK ID NR. 1, promoterregion).

fra base 22 til 42 identisk med basene 204 til 224 til den kodende tråden til PGII-genet (SEK ID NR. 6,

slgnalsekvens).

EGENSKAPER: Oligonukleotid IFN-2, nyttig for preparering av perfekte fusjoner av A. niger <p>ki-promoter og A. niger PGII-signalsekvensen ved anvendelse av

PCR.

SEK ID NR. 14

SEKVENSTYPE: nukleotid

SEKVENSLENGDE: 1901 bp

TRÅDTYPE: dobbel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: rekombinant

EKSPERIMENTELL KILDE: plasmid pPKI-IFN-2

TREKK:

fra 1 til 6 bp BamHI-sete

fra 1 til 742 bp identisk med pki-promoterfragmentet som rekker fra posisjon 300 opp til 1041 av sekvensen med SEK ID NR. 1

fra 742 til 744 bp startkodon ATG

fra 745 til 1243 bp strukturelt gen for IFN AM119 (BDBB-hybrid)

fra 1244 til 1245 bp stoppkodon TGA

fra 1247 til 1476 bp gjær PH05-terminatorfragment fra 1477 til 1842 bp Sphl-sete

fra 1483 til 1894 bp A. niger pki-terminator

fra 1896 til 1901 bp EcoRI-sete

EGENSKAPER: BamHI/EcoRI-fragment til pPKI-IFN-2. Omfatter et A. niger pki-promoterfragment koblet til en DNA-sekvens som omfatter et startkodon, IFN AM119 strukturelt gen og del av gjær PH05-terminatorregion samt A. niger pki-terminator.

SEK ID NR. 15

SEKVENSTYPE: nukleotid

SEKVENSLENGDE: 2020 bp

TRÅDTYPE: dobbel

TOPOLOGI: lineær

MOLEKYLTYPE: rekombinant

EKSPERIMENTELL KILDE: plasmid pPKIssIFN-2

TREKK: fra 1 til 6 bp BamHI-sete

fra 1 til 742 bp identisk med pki-promoterf rag-mentet som rekker fra posisjon 300 opp til 1041 av sekvensen med SEK ID NR. 1

fra 743 til 799 bp A. niger PGII-signalsekvens

fra 800 til 1297 bp moden IFN AM119 (BDBB-hybrid) strukturelt gen

fra 1298 til 1300 bp 6toppkodon TGA

fra 1301 til 1528 bp gjær PH05-terminatorfragment fra 1519 til 1534 bp Sphl-sete

fra 1535 til 1948 bp A. niger pki-terminator fra 1950 til 1955 bp EcoRI-sete

EGENSKAPER: BamHI/EcoRI-fragment til pPKIssIFN-2. Omfatter et A. niger pki-promoterfragment koblet til perfekt i-ramme fusjon av PGII-signalsekvensen og IFN AM119 (BDBB-hybrid) strukturelt gen og til deler av gjær PH05-terminatorregion samt A_j. niger pki-terminator.

Claims (7)

1. Fremstilling av et polypeptid, karakterisert ved at et strukturelt gen kodende for et slikt polypeptid, med unntak av det homologe strukturelle pki-genet, er operativt koblet med A. niger-pyruvatkinasetranskrips.1 on (pki.)-promoter som strekker seg fra et nukleotid i posisjon 300 opptil et nukleotid i posisjon 1042 i DNA-sekvensen beskrevet i SEKV.ID NR 1, og blir uttrykt i en egnet vert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at verten er filamentøs sopp eller gjær.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at verten ikke er istand til å uttrykke polygalakturonase i lav mengde.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at verten er selektert fra gruppen bestående av A. niger. Neurospora crassa. Saccharomyces cerevisiae og Kluyveromyces lactis.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at humant hybridinterferon BDBB blir produsert.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en A. niger-pektinlyase blir produsert.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en A. niger-polygalakturonase blir produsert.