HU210989B - Methor for the preparation of a new fungal expression system comprising aspergillus niger piruvate kinase transcription (pki) promoter - Google Patents

Description

A jelen találmány a genetikai manipulációk területére vonatkozik és olyan új DNS molekulákat szolgáltat, amelyek gomba promotort tartalmaznak. Az új DNS molekulák olyan hibrid vektorok megalkotásában használhatók, amelyek micéliumos gombákban fejeznek ki géneket.

Bár a genetikai manipulációk terén számos polipeptid kifejező rendszer ismeretes prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekhez, állandó igény van új rendszerekre, amelyek előnyösebben az ismert rendszereknél.

Nagyon széles körben alkalmazzák gazdaszervezetként a prokarióta Escherichia colit és eukarióta élesztőket, pl. Saccharomyces cerevisiae-t; ezekhez nagyszámú különböző kifejező vektort, jórészt plazmidot fejlesztettek ki. Az E. coli gazdaszervezetek hátránya, hogy nem képesek glikozilezni a polipeptideket. Az élesztők képesek glikozilezni, azonban - az E. colihoz hasonlóan gyakran nem választék ki a polipeptideket a tápközegbe, hanem csak a periplazmikus térbe választják ki ezeket. Magasabb rendű eukarióta gazdaszervezetek, pl. emlős ráksejtek, képesek glikozilezni és a tápközegbe kiválasztani, tenyésztésük azonban nagyon lassú és drága, és fennáll a veszély, hogy onkogén nukleinsavak izolálódnak a kívánt peptiddel együtt.

A további gazdaszervezetekre irányuló kutatásban micéliumos gombákat, pl. Neurospora crassat, Aspergillus nidulanst és Aspergillus nigert vizsgáltak. Ezek alkalmazása a genetikai manipulációk terén elmarad a fentebb említettektől, főleg a megfelelő transzformációs rendszer hiánya miatt. A Saccharomyces cerevisiaetől eltérően a micéliumos gombák természetes formájukban nem tartalmaznak plazmidokat, amelyeket idegen gének bevezetésére lehetne alkalmazni. Lehetséges azonban micéliumos gombákat transzformálni szelektálható markert tartalmazó idegen plazmidokkal. Az eddig leírt vektorok csaknem egyike sem képes a micéliumos gombákban autonóm módon replikálódni, mint ahogyan ez az élesztőknél történik, hanem a gomba kromoszómába integrálódik. Bár ez az esemény nagyon kis gyakorisággal megy végbe, az integratív transzformáció - előnyösen - a transzformánsokat mitotikusan nagyon stabillá teszi, még nem szelektív körülmények között is. Több, mint száz kópia stabil integrálódásáról is beszámoltak.

Az első micéliumos gombákhoz leírt vektor a Neurospora crassa qa-2 génjét tartalmazza szelektálható markerként [Case Μ. E.; Schweizer M., Kusher S. R. és Giles N. H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 52595263 (1979); Case Μ. E.: a „Genetic Engineering of Microorganism fór Chemicals” című szakkönyvben (szerkesztők: Hollander A., DeMoss D., Káplán S., Konisky J., Savage D. és Wolfe R. S.; kiadó: Plennm) 87-100 oldal (1982)].

Aspergillus nidulansban, amelynek szexuális ciklusa van és ezért megközelíthető a klasszikus genetikai manipulációk számára, azonosítottak mind negatív, mind pozitív szelekciós rendszereket, amelyek auxotróf markereken vagy domináns szelekciós markereken alapulnak [Ballance és munkatársai: BBRC 112, 284 (1983); Tilburn és munkatársai: Gene 26, 205 (1983);

Yelton és munkatársai: PNAS 81, 1470 (1984); Yelton és Timberlake: J. Cell Biochem., 9C 173 (1985); Johnstone és munkatársai: EMBO J. 4, 1307 (1983); Tilburn és munkatársai: Gene 26, 205 (1983); Wernars és munkatársai: Curr. Génét. 9, 361 (1985), Kelly J. M. és munkatársai: EMBO J. 4, 475 (1985)].

AN. crassa-val vagy az A. nidulanssal összehasonlítva az A. niger sokkal fontosabb organizmus, mivel ezt széles körben alkalmazzák enzimek ipari léptékű előállításához, amely enzimek elsősorban élelmiszeripari felhasználást nyernek. Az A. niger egy sor hidrolitikus enzimet választ ki, ilyenek pl. a glukoamiláz, α-amiláz, pektináz, celluláz, β-glukanáz, β-galaktozidáz, naringináz, pentozanáz, savas proteáz és lignináz; a glukoamilázpektináz komplex különösen fontos.

A klasszikus mutációs és szelekciós eljárások A. nigerben erőteljes törzs-javítást értek el a hidrolitikus enzimek kiválasztása szempontjából. Az A. nigemél nem ismert szexuális ciklus. A mutációkat csak meiotikus rekombinációval lehet kombinálni szelektált diploidokban haploidinációt követően.

A heterológ amds gént [Kelly és Hynes: EMBO J. 4, 4751 (1985)] és az argB gént [Buxton és munkatársai: Gene 37, 207 (1985; 184 438 lajstromszámú európai szabadalmi leírás; WO 86/06 097 számú PCT közrebocsátási irat), ahol mindkettő A. nidulansból nyerhető, vagy a homológ pyrA gént [van Hartingsveldt és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 206, 71-75 (1987); Goosen és munkatársai: Curr. Génét. 11, 439-503 (1987)] alkalmazták szelektálható markerként A. niger transzformációhoz.

Az A. niger a legfontosabb organizmus a pektin bontó enzimek pl. poligalakturonáz pektin liáz vagy pektin észteráz ipari léptékű előállításához.

A pektin liáz, pektin észteráz, poligalakturonáz és ezek enzimkeverékeinek alkalmazása a gyümölcs- és zöldségfeldolgozásban fejlődött ki (1. táblázat) a pektinbontó enzimek eredeti felhasználási területéből kindulva, vagyis a puha gyümölcsök kezeléséből a lé és színanyagok nagy kitermelésének biztosítására a préselés során, illetve a nyers préslé derítéséből. Az ezekben a folyamatokban alkalmazott technikai enzimkészítmények pektin észterázt, poligalakturonázt és pektin liázt tartalmaznak különböző mennyiségben, más enzimekkel, pl. arabinanázzal, galaktanázzal, xilanázzal, cellulázzal, β-1,4^^3ηέζζ3ΐ, glikozidázzal és peroxidázzal együtt.

1. TÁBLÁZAT

A poligalakturonáz és keverékei alkalmazása a gyümölcs- és zöldségiparban [Voragen A. G. J. közmleményéből: Food enzymes: prospects and limitations. A „Food Science: Basic Research fór Technological Progress” című könyvben (szerkesztő: Roozen J. P. és munkatársai; kiadó: PUDOC Wageningen), Hollandia (1989)]

Enzim Alkalmazás

Poligalakturonáz Puhítás; citrus-gyümölcsök stabilizálása és viszkozitásának csökkentése

HU 210 989 B

Pektin észteráz + poligalakturonáz és/vagy pektin liáz Pektin észteráz/polilakturonáz/pektin liáz + (hemi) celluláz

Lé derítés, lé/olaj extrahálás, citrus gyümölcshéj olajkinyerés, citrus gyümölcs velő cefrézés Elfolyósítás, tiszta/rostos gyümölcslevek. A természetes termékek 5 kivonásának fokozása. A biomaszsza/takarmány tápérték növelése.

A pektikus és cellulotikus enzimek alkalmazása révén a gyümölcsvelőben a sejtfalak olyan mértékben elbomlanak, hogy az elfolyósítás csaknem teljes lesz. Mind az en- 10 do-, mind az exo- -1,4-glukanáz (celluláz) jelenléte, valamint a pektikus enzimek jelenléte fontos [Renard C. M.

C. G. és munkatársai: Apple Protopectin preliminary study of enzymatic extraction. A „Food Science: Basic Research fór Technological Progress” című szakkönyv- 15 ben (szerkesztő: Roozen J. P. és munkatársai; kiadó: PUDOC Wageningen) Hollandia (1989)].

A poligalakturonáz és enzimkeverékei alkalmazhatók biomassza elfolyósításához és elcukrosításához, pl. növényi sejtekből fermentálható poliszacharidok előállításához [Beldman G. és munkatársai: Enzyme Micros. Technoi. 6, 503-507 (1984)], vagy pektinek módosításához [erről áttekintést ad az alábbi közlemény: Voragen A. G. I: Food enzymes: prospect and limitations. A Roozen J. P. és munkatársai által szerkesztett, korábban idézett könyben].

Az A. nigerben a pektikus komplex fehérjéi nem konstitutiven fejeződnek ki. Indukáló körülmények között, vagyis pektin vagy pektin lebontási terméke jelenlétében fejezi ki az A. niger a fentebb említett enzime- 30 két, feltéve, hogy a többi szénforrások, pl. glükóz vagy szacharóz, korlátozott mennyiségben vannak jelen.

Az A. niger és enzimjei ipari fontossága miatt folytonos igény van új A. niger kifejező rendszerekre a törzsjavításhoz és/vagy homológ vagy heterológ gén- 35 termékek előállításához. Nagy jelentőségű pl. az egyes pektinbontó enzimek vagy meghatározott keverékeik termelése.

A jelen találmány új DNS molekulákat szolgáltat, amelyek az A. niger piruvát kináz génből (pki) szárma- 40 zó előnyös promotort tartalmaznak, ezeket az új DNS molekulákat új vektorok megalkotásához használhatjuk homológ vagy heterológ struktúrgének kifejezésére micéliumos gombákban, elsősorban A. nigerben.

Az A. niger piruvát kinázt (rendszertani neve: ATP: 45 piruvát foszfotranszferáz) kódoló gén nagymértékben fejeződik ki, jelezve, hogy az átírás erős promotor szabályozása alatt van.

A. niger N400 genom 5 kb-s Bgin/HindlII restrikciós fragmentumát, amely hibridizál egy, az élesztő piruvát 50 kináz kódoló területéből származó fragmentummal, klónozzuk. Az így létrejött kiónt pGW 1100-nak nevezzük.

Az együtt-transzformálási kísérletek a pyrA gént, mint szelekciós markert tartalmazó pGW163 plazmiddal és a pGW 1100-zal a piruvát kináz megnövekedett szintjeihez 55 vezetnek, tizenegy vizsgált transzformáns közül nyolcnál. Ezekből az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a pGWllOO kódolja az A. niger piruvát kinázt, és hogy ez tartalmazza a teljes funkcionális gént [de Graaff L. H.: The structure and expression of the pyruvate kina- 60 se gene of Aspegrillus nidulans and Aspergillus niger. Doktori disszertáció, Agricultural University of Wageningen (1989)].

A technika fentebb említett állásából kiindulva új, pki promotort tartalmazó DNS molekulákat fejlesztünk ki a jelen találmányban, és ezeket új kifejező vektorok megalkotásához használjuk homológ géntermékek, pl. pektin liáz túltermelésére vagy heterológ struktúrgének, pl. interferon gén kifejeződésére A. nigerben.

A találmány tehát új DNS molekulákkal foglalkozik, amelyek A. niger pki promotort tartalmaznak, foglalkozik továbbá a struktúrgéneknek az említett promotor szabályozása alatti kifejezéséhez alkalmas hibrid vektorokkal, és az új hibrid vektorokkal transzformált gazdaszervezetekkel. A találmány tárgyát képezik az eljárások is az új DNS molekulák, hibrid vektorok és transzformált gazdaszervezetek előállítására, valamint a rekombináns polipeptidek előállítására az említett transzformált gazdaszervezetek segítségével.

Az A. niger piruvát kináz promotort tartalmazó

DNS molekulák

A jelen találmány foglalkozik az A. niger piruvát kináz (pki) promotorral; ez egy olyan DNS molekulában van, amely a SEQ ID NO. 1 szekvenciával jellemezhető nukleotidszekvenciával bír, vagy ennek olyan származéka vagy fragmentuma, amelynek promotor aktivitása van.

A SEQ ID NO. 1 szekvenciával jellemezhető nukleotid szekvencia tartalmazza az A. niger teljes funkcionális piruvát kináz génjét, beleértve a promotort is. A pki promotor az 1. nukleotid helytől, vagyis a piruvát kináz kódoló területének első nukleotidjától az 1042. helyig terjed. A pki promotor kötődik az RNS polimerázhoz, valamint a szabályozó fehérjékhez és képes egy struktúrgén kifejezésére, operatíven kapcsolódva ahhoz. Az A. niger pki promotor erős promotor. A találmány tehát olyan nukleotid szekvenciájú DNS molekulával foglalkozik, amely a mintegy 1. helytől az 1042. helyig terjed, foglalkozik továbbá ezen promotor olyan származékaival és fragmentumaival, amelyek még megőrzik a promotor aktivitást, amely lehet szabályozott vagy nem szabályozott.

Az A. niger teljes pki promotorja lehet szabályozott, mivel tartalmaz olyan szabályozó elemeket, amelyek az átírást szénforrás-függővé teszik az említett promotort tartalmazó A. niger sejtek tenyésztéséhez alkalmazott szénforrást illetőleg. Valamely glukonogén szénforrás, pl. acetát alkalmazása az átírás alacsony szintjéhez vezet, míg glükolitikus szénforrás, pl. glükóz alkalmazása az átírás magas szintjéhez vezet.

A SEQ ID NO. 1 szekvenciájú nukleotid szekvenciát tartalmazó promotorban egy lehetséges TATA box helyezkedik el a 927. és 934. nukleotid helyek között, egy lehetséges CAAT box helyezkedik el a 830. és 836. helyek között és kiterjedt, CT-ben dús területek (CT blokkok) helyezkednek el a 848. és 1041. helyek között. Az utóbbi megtalálható nagyon sok, élesztőkből és gombákból eredő, nagymértékben kifejezett gének promotor/szabályozó területeiben.

HU 210 989 Β

A jelen találmány szerinti fragmentumok között találjuk pl. az olyan fragmentumokat, amelyek promotor aktivitásúak és az 1. mintegy 950. helyek valamelyikével kezdődnek és a mintegy 1041. helynél végződnek a SEQ ID NO 1. szekvenciájában. Előnyösek pl. azok a fragmentumok, amelyek a mintegy 300. helynél kezdődnek és a mintegy 1041. helynél végződnek a SEQ ID NO. 1 szekvenciájában. A jelen találmány szerinti fragmentumok pl. indulhatnak a SEQ ID NO. 1 nukleotid szekvenciáján belül elhelyezkedő valamely restrikciós enzim hasítóhelynél, pl. a BamHI helynél, (a mintegy 300. helynél) vagy az alábbi helyeknél (zárójelben a hozzávetőleges helyek): Sphl (441), Smal (859), Xmal (859).

A legelőnyösebb az a fragmentum, amely a mintegy 300. helyen levő BamHI helynél kezdődik és az 1041. helyig tart. Ez a fragmentum annak a BamHI/PvuH fragmentumnak a része, amely a mintegy 300. helyen levő BamHI helytől a mintegy 1352. helyen levő PvuII helyig terjed, és amelyet ezután alkalmazni fogunk egy restrikciós enzim hasítási hely beiktatására megadott példákban.

A jelen találmány szerinti származék pl. a pki promotor mutánsa, rekombináns származéka, vagy mutánsának rekombináns származéka, amelyeket a SEQ ID NO. 1 nukleotid szekvenciájával bíró DNS molekula vagy ennek fragmentuma tartalmaz. A jelen találmány szerinti származék pki promotor aktivitású szekvenciát tartalmaz, amely lehet szabályozott vagy nem szabályozott.

A jelen találmány szerinti mutáns lehet természetesen előforduló mutáns és lehet - eló'nyösen mesterséges mutáns. A jelen találmány szerinti pki promotor mutánsok főleg olyanok, amelyek új restrikciós enzim hasító helyekkel bírnak, pl. az Nsil, BamHI, EcoRl, HindlII, PstI, Sáli, Ncol és hasonlók hasítóhelyeivel. Előnyösek az olyan mutánsok, amelyek a SEQ ID NO. 1 szekvencia mintegy 1041. helyén egy új restrikciós enzim hasítóhelyet tartalmaznak, amelyet fel lehet használni egy struktúrgén beiktatására a promotortól 3’ felé, amely azután operatívan összekapcsolódik ezzel. Egy ilyen mutáns pl. azzal jellemezhető, hogy a SEQ ID NO. 1 nuldeotidszekvenciájában levő 1034. és 1054. helyek közt kiterjedő szekvenciát a SEQ ID NO. 2 szekvencia helyettesíti, és azzal, hogy egy Nsil hely helyezkedik el közvetlenül a SEQ ID NO. 1 szomszédságában.

Egy jelen találmány szerinti mutáns egy fragmentum mutánsa is, ahol a fragmentum jelentését a korábbiakban megadtuk. Egy fragmentum előnyös mutánsa magában foglal a pki promotortól lefelé egy új restrikciós enzim hasítóhelyet egy struktúrgénnek a promotorhoz való operatív kapcsolásához. Egy fragmentum ilyen előnyös mutánsa pl. az M13mpl8-PK (BamHINsil-PvuII) RF DNS-ben található 1053 bp-s BamHI/Pvuü fragmentum vagy 742 bp-s BamHI/NsI fragmentum. Az M13mpl8-PK(BamHI-NsiI-PvuII)-nek az 1053 bp-s BamHI/PvuII fragmentuma olyan nukleotid szekvenciával bír, amely a mintegy 300. helynél levő BamHI helytől a mintegy 1352. helyen levő PvuII helyig terjed a SEQ ID NO. 1 szekvenciában, amely úgy van módosítva, hogy az 1034. és 1054. helyek közti nukleotidokat a SEQ ID NO. 2 szekvencia helyettesíti. A 742 bp-s BamHI/Nsil fragmentum az említett BamHI helytől a helyettesített terület Nsil helyéig terjed. Mindkét mutánsban egy Nsil hely helyezkedik el közvetlenül a SEQ ID NO. 1 1041. helye mellett.

A jelen találmány szerinti származékok bizonyos DNS molekulák is. Az ilyen rekombináns DNS molekulák azzal jellemezhetők, hogy pl. tartalmaznak egy oligonukleotid kapcsolót („linker”) egy találmány szerinti, pki promotor aktivitású DNS molekula 3’ és/vagy 5’ végén; ezek a kapcsolók sikeres kapcsolást biztosítanak más DNS molekulákhoz, pl. vektor szekvenciaákhoz. A kapcsoló tartalmazhat egy vagy több restrikciós enzim hasítóhelyet és/vagy részben egyszálú végeket („tapadós végek”) és/vagy tompa végeket.

Jelen találmány szerinti származék egy olyan rekombináns DNS molekula is, amely egy jelen találmány szerinti pki promotor aktivitású DNS molekulát tartalmaz, valamint homológ vagy heterológ struktúrgéneket intronokkal vagy azok nélkül, ahol a nevezett struktúrgének operatívan kapcsolódnak a pki promotorral és adott esetben valamely oligonukleotid kapcsolóval. Egy jelen találmány szerinti származék tartalmazhat egy további kifejezést szabályozó szekvenciát is a pki promotoron kívül, amely szekvencia szintén működőképesen kapcsolódik az említett struktúrgénnel. Ilyen kifejezést szabályozó szekvencia lehet pl. fokozó, átírási terminátor, riboszomális kötő terület, transzlációs iniciációs és terminációs hely, vagy szignál szekvencia, mint az A. niger pektin liáz gén, pl. a B, C vagy D szignál szekvenciája, vagy a poligalakturonáz gén, pl. a PGI, PGC vagy PGII szignál szekvenciája.

A homológ struktúrgének azok, amelyek A. nigerböl származnak. Ezek pl. enzimeket, előnyösen az iparban, főleg élelmiszer- és takarmányiparban használatos enzimeket kódolnak. Ilyen enzimek pl. a pektinolitikus enzimek, mint a pektin észteráz, az endo- és exo-működő poligalakturonáz (PG), pektin liáz (PL) és ramnogalakturonáz, valamint az arabinázok, galaktinázok, xilanázok, cellulázok, β-1,4-glukanázok, glikozidázok és hasonlók.

Az A. niger PLD struktúrgénjének nukleotidszekvenciáját az EP-A2 0 278 355 számon publikált európai szabadalmi nyilvánosságrahozási iratban ismertetik. A további A. niger PL-ek, elsősorban a PLA, B, C, E, és F struktúrgénjét az EP-A2 0 353 188 számon publikált európai szabadalmi nyilvánosságrahozási iratban ismertetik. Az A. niger PG-k, elsősorban a PGII, struktúrgénjeit a 8 919 884.0 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés ismerteti.

Az A. niger struktúrgéneket tartalmazó pGW 820, 830, 850 és 1800 plazmidokkal transzformált E. coli HB101 vagy JM109 sejteket a Budapesti Szerződés szerint deponáltuk a Német Mikroorganizmus- és Sejttenyészet Gyűjteményben (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1 b, D-3300 Braunschweig). A PGII struktúrgénje részeinek, amelyek az N- illetve C-terminálist kódolják,

HU 210 989 B nukleotidszekvenciáit a szekvenciafelsorolásban mutatjuk be. További információkat közöl a 2. táblázat.

2. TÁBLÁZAT

Minek a struktúrgénje?	Transzformált E. coli	Deponálási szám	SEQID NO.
PLA	HB101/pGW820	DSM 4388
PLB	HB101/pGW830	DSM 4389
PLC	HB101/pGW850	DSM 4390
PGII	JM109/pGW1800	DSM 5505	3(N-terminális) 4(Nterminális)

A jelen találmány oltalmi körén belül való homológ gének a fentebb említett PL és PG gének származékai is, beleértve azokat a fragmentumokat, mutánsokat és DNS szekvenciákat is, amelyek a genetikai kóddal összhangban alakulnak ki, ahol korlátlan számú nukleotid helyettesíthető más nukleotidokkal anélkül, hogy a kódolt polipeptid aminosav szekvenciája megváltozna.

A heterológ struktúrgének vírusokból, prokarióta sejtekből vagy eukarióta sejtekből erednek és származhatnak az mRNS út segítségével készített genomikus DNSből vagy cDNS-ből vagy szintetizálható kémiai úton, és kódolhatnak igen sokféle hasznos polipeptidet, ide értve glikozilezett polipeptideket is, és főleg magasabb eukarióta, elsősorban emlős, úgymint állati vagy speciálisan emberi eredetű polipeptideket, mint enzimeket, amelyek pl. tápanyagok termelésére és enzimes kémiai reakciók kivitelezésében alkalmazhatók, vagy olyan polipeptideket, amelyek hasznosak és értékesek emberi vagy állati betegségek kezelésében vagy megelőzésében, mint pl. hormonok, immun-módosító, vírusellenes és tumorellenes tulajdonságú polipeptidek, antitestek, vírus-antigének, vakcinák, alvasztó faktorok, élelmiszerek, stb.

Az ilyen struktúrgénekre példák a hormonokat, mint szekretint, timozint, relaxint, kalcitonint, luteinizáló hormont, paratiroid hormont, adrenokortikotropint, melanocita stimuláló hormont, β-lipotropint, urogasztront vagy inzulint; a növekedési faktorokat, mint epidermális növekedési faktort, inzulin-szerű növekedési faktort (IGF), pl. IGF-I-et és IGF-H-t, maszt sejt növekedési faktort, ideg növekedési faktort, glia-eredetű idegsejt növekedési faktort; vagy transzformáló növekedési faktort (TGF) pl. TGF-a-t vagy TGF-β-ζ mint TGFpl, β2-ί vagy β3-3ΐ; növekedési hormonokat, mint humán vagy szarvasmarha növekedési hormonokat; interleukinokat, mint interleukin-1 vagy 2-t; humán makrofág vándorlást gátló faktort (MIF); interferonokat, mint humán α-interferont, pl. interferon-aA-t, aB-t, aD-t vagy ocF-et, β-interferont, γ-interferont vagy hibrid interferont, pl. cxA-aD vagy aB-aD hibrid interferont, különösen a BDBB hibrid interferont; proteináz inhibitorokat, mint c^-antitripszint, SLPI-et és hasonlókat; hepatitisz vírus antigéneket, mint hepatitisz B felületi vagy belső antigént, vagy hepatitisz A vírus antigént, vagy hepatitisz nem A - nem B antigént; plazminogén aktivátorokat, mint szöveti plazminogén aktivátort vagy urokinázt; tumor nekrózis faktort, szomasztosztatint, renint, β-endorfint, immunglobulinokat, mint D, E vagy G immunglobulinok könnyű és/vagy nehéz láncait vagy humán-egér hibrid immunglobulinokat; immunglobulin kötő faltorokat, mint immunglobulin E kötőfaktort, pl. sCD23-at; kalcitonint; humán kalcitonin-rokon peptidet, véralvasztó faktorokat, mint IX. vagy VIIIc. faktort; eritropoietint; eglint; mint eglin C-t, hirudint; deszulfatohirudint, mint HV1, HV2 vagy PAdeszulfatohirudin variánsokat; humán szuperoxid diszmutázt; vírus timidin kinázt; β-laktamázt; vagy glükóz izomerázt kódoló gének. Előnyös gének a humán α-interferont, vagy hibrid interferont, elsősorban a BDBB hibrid interferont, a humán szövet plazminogén aktivátort (t-PA), hepatitisz B vírus felületi antigént (HBVsAg), inzulin-szerű növekedési faktor I. és Π.-t, eglin C-t és deszulfatohirudint, pl. HVl-variánst kódoló gének. A jelen találmány szerinti DNS molekulában a jelen promotor működőképesen van összekapcsolva a polipeptidet kódoló területtel úgy, hogy a polipeptid hatásos kifejeződése biztosítva legyen.

A jelen találmány szerinti DNS molekulák, beleértve fragmentumaikat és származékaikat is, alkalmazhatók DNS génkönyvtárak vagy mRNR-ek átvizsgálására további hasonló DNS-ek vagy mRNS-ek megtalálása érdekében.

A találmány foglalkozik továbbá valamely találmány szerinti pki promotor aktivitású DNS molekulát beiktatásként tartalmazó hibrid vektorokkal. Az említett találmány szerinti DNS molekulák magukban foglalják a pki promotort, fragmentumait vagy származékait, pl. mutánsokat, vagy valamely korábban említett struktúrgénnek a promotorral vagy fragmentumával képzett fúziós termékeit. A jelen találmány szerinti hibrid vektorok alkalmasak gazdaszervezetben, pl. baktériumokban, gombákban vagy állati sejtekben való klónozáshoz. Az ilyen hibrid vektorok bármely, a genetikai manipulációk területén használatos vektorból származhatnak, pl. fágokból, kozmidokból, plazmidokból vagy kromoszomális DNS-ből, mint a λ-fág származékaiból (pl. NM 989), az M13 fág származékaiból (pl. M13mpl8 vagy M13mpl9 fág DNS), bakteriális plazmidokból (pl. pBR322, pUN121, pUC18), vagy élesztő plazmidokból (pl. élesztő 2 μ-os plazmid), vagy kromoszomális DNS-ekből (mint pl. Aspergillusból, pl. antibiotikumbői származó kromoszomális DNS, amelyet a 184 438 lajstromszámú európai szabadalmi leírás ismertet), vagy defektív fágokból vagy defektív plazmidokból segítő (helper) fág vagy segítő (helper) plazmid jelenlétében, amelyek lehetővé teszik a nevezett defektív fágok vagy plazmidok replikációját [pl. M13 (+) KS vektor pl. M13KO7 segítő fág jelenlétében].

Egy jelen találmány szerinti hibrid vektor a jelen találmány szerinti DNS molekulákon kívül tartalmaz egy replikád ós helyet, és - ha szükséges - egy marker gént és/vagy egy, a pki promotortól eltérő további kifejezést szabályozó szekvenciát, pl, fokozót (enhancer), átírási terminátort, riboszomális kötő területet, transzlációs beindítási vagy terminációs helyet, vagy szignál szekvenciát, pl. az A. niger pektin liáz A, B, C vagy D struktúrgénjének vagy a poligalakturonáz, pl. PGI vagy PGII struktúrgénjének szignál szekvenciáját.

HU 210 989 Β

A jelen találmány szerinti hibrid vektor nem lehet pGWllOO.

Valamely jelen találmány szerinti hibrid vektor azonban tartalmazhatja a pGWl 100-nak pki promotor aktivitású fragmentumait. Ilyen hibrid vektora példa lehet az M13mpl8-PK (BamHI-Pvill), amely tartalmazza az 1053 bp-s BamHI/PvuH restrikciós fragmentumot, amely a SEQ ID NO. 1 szekvenciában a mintegy 300. nukleotid helynél levő BamHI helytől a mintegy 1352 nukleotid helyig terjed.

Egy másik típusú, jelen találmány szerinti hibrid vektor az A. niger pki promotorban valamely mutációt tartalmaz. Az említett mutáció valamely új restrikciós enzimhelyet alakíthat ki, elsősorban olyant, amely valamely struktúrgén beiktatására alkalmas, amely struktúrgén azután operatívan összekapcsolódik a pki promotorral. Ilyen vektorra példa elsősorban az M13mpl8-PK (BamHI-NsI-PvuII), amely egy jelen találmány szerinti mutált DNS-t tartalmaz egy új Nsil hellyel az A. niger piruvát kináz struktúrgén transzlációs iniciációs helyénél.

Egy jelen találmány szerinti hibrid vektor (az A. niger piruvát kináz struktúrgén kivételével) tartalmazhat egy homológ struktúrgént vagy egy heterológ struktúrgént, amelyek operatívan kapcsolódnak a pki promotorral. Ilyen hibrid vektor pl. a pPK-PLB, amely tartalmazza az M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) 742 bp-s BamHI/NsI fragmentumát és a pGW830 2,6 kb-s BamHI/NsI fragmentumát. Az említett hibrid vektor tartalmazza a PLB-t kódoló struktúrgént szignál szekvenciájában foglalva.

Előnyös hibrid vektorok a PKI-IFN-2, pKIssIFN-2, pPK-PLB, M13mpl8-PK (BamHI-PvuH), M13mpl8PK (BamHI-Nsil-PvuII).

Eljárás A. niger pki promotort tartalmazó DNS molekulák, az ilyen DNS molekulákat tartalmazó hibrid vektorok és az ilyen hibrid vektorokkal transzformáit gazdaszervezetek előállítására A jelen találmány egyik további tárgya eljárás a találmány szerinti DNS molekulák előállítására, pl. olyan eljárás, amely egy DNS molekula valamely in vitro szintézissel történő előállításából, vagy egy ilyen DNS szekvenciát tartalmazó gazdaszervezet tenyésztéséből áll.

A gazdaszervezetek tenyésztését hagyományos tápközegben végezzük, amelyek ki lehetnek egészítve bizonyos kémiai anyagokkal, vagy meg lehetnek szabadítva bizonyos kémiai anyagoktól, amelyek lehetővé teszik a transzformánsok pozitív vagy negatív szelekcióját, vagyis a kívánt DNS molekulát valamely szelekciós markerral együtt tartalmazó gazdaszervezetek elválasztását a nem transzformált, vagyis a kívánt DNS molekulát nem tartalmazó gazdaszervezetektől.

Bármilyen transzformálható, a szakterületen alkalmazott gazdaszervezetet használhatunk, pl. baktériumokat (mint E. coli), gombákat (mint Saccharomyces cerevisiae), de főleg micéliumos gombákat (mint Aspergillusok, pl. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, A. japonicus, és elsősorban A. niger). A gazdaszervezetek transzformálását hagyományos eljárásokkal végezzük.

A jelen találmány szerinti DNS molekulát piruvát kináz gént (pki) tartalmazó Aspergillus nigerből kaphatjuk meg, elsősorban enzimek genomikus könyvtárából, vagy valamely mRNS révén, amelyet cDNS molekula előállítására alkalmazunk.

Az alábbiakban a jelen találmány szerinti DNS molekulák előállítását részletesebben is leírjuk.

Genomikus könyvtárat készíthetünk pl. valamely A. niger törzs, pl. NW 756 vagy N400, genomikus DNS-ének részleges emésztésével, majd a nagy molekulatömegű DNS fragmentumok klónozásával megfelelő gazdavektorba, pl. a pUN121 E. coli plazmidba, vagy valamely lambda vektorba, pl. EMBL4-be.

Abból a célból, hogy sikeresen átvizsgáljuk a genomikus könyvtárat pki-t tartalmazó DNS szekvenciák jelenlétére, egy hibridizáló DNS vizsgáló minta szükséges. Ez lehet valamely szintetikus DNS vizsgáló minta, vagy egy másik piruvát kináz gén vagy ennek része, amely hibridizál az A. niger pki-hoz; ilyen lehet pl. a pPYKl plazmidban levő élesztő piruvát kináz struktúrgén [Bürke és munkatársai (1983)].

Az átvizsgálás céljára a DNS vizsgáló mintákat radioaktívan jelezzük a szakterületen ismert eljárásokkal pl. az 5’ végnél, y³²p-ATP-t és T4 kinázt alkalmazva. A jelen találmány szerinti nukleinsavakat, mint beiktatást hordozó gazda mikroorganizmusokat a jelzett DNS vizsgáló mintákkal történő hibridizálással azonosítjuk a génkönyvtár szűrő replikalemezein. A vizsgáló mintával hibridizáló DNS molekulákat izoláljuk, és ha kívánatos, szubklónozzuk hagyományos eljárások szerint. A pGWllOO plazmid egy A. niger N400 könyvtárból való genomikus klón ilyen alklónja. Ez tartalmazza az A. niger genom 5,0 kbp-s Bgin/HindlII fragmentumát, amelyben megtalálható az A. niger piruvát kináz teljes funkcionális génje.

Az azonosított pki vagy génfragmentumokat azután szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Az A. niger funkcionális pki-jának, amelyet a pGWl 100 tartalmaz, teljes szekvenciáját a SEQ ID NO. 1 szekvenciasorozat mutatja be.

A pGWllOO plazmidot jelent találmány szerinti DNS molekulák előállítására alkalmazzuk. Az ilyen DNS molekulákat hagyományos módon állítjuk elő hagyományos restrikciós enzimeket, kapcsolókat, valamint mutációs, ligálási, kibővítési és izolálási eljárásokat alkalmazva.

A SEQ ID NO. 1 nukleotid szekvenciájú DNS molekula fragmentumait pl. olyan eljárással állíthatjuk elő, amely az említett DNS molekula nukleázokkal, pl. exonukleázokkal (mint Bal 31 vagy ΕχοΠΙ) vagy endonukleázokkal (pl. restrikciós enzimekkel) való kezeléséből áll.

A SEQ ID NO. 1 nukleotid szekvenciájú DNS molekula származékait vagy ezek fragmentumait pl. mutagenezissel állíthatjuk elő hagyományos eljárások szerint [ezzel kapcsolatban lásd Zoller M. J. és Smith M. összefoglaló cikkét: Methods Enzymol. 100, 468 (1983); valamint az alábbi közleményeket: Botstein D.

HU 210 989 B és Shortle D.: Science 229,1193 (1985); Norris K. és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 11, 5103 (1983)], ilyet írunk le a későbbiekben a 2.1.2 példában.

Egy új restrikciós helyet tartalmazó mutánst pl. helyre irányuló mutagenezissel állíthatjuk elő, mutagén oligonukleotidot alkalmazva hagyományos eljárások szerint. Ilyen mutagén oligonukleotidra egy mutáció bevezetéséhez példa lehet a SEQ ID NO. 1 szekvenciába a SEQ ED NO. 2 szekvenciájú DNS bevezetésére.

A SEQ ID NO. 1 nukleotidszekvenciájú DNS molekula rekombináns származékát vagy ennek fragmentumát vagy mutánsát pl. rekombináns DNS technológiával állíthatjuk elő, így pl. olyan módon, hogy egy DNS molekulát, fragmentumot vagy mutánst valamely restrikciós enzimmel elhasítunk és/vagy ligálunk más DNS molekulához, pl. valamely oligonukleotid kapcsolóhoz vagy olyan DNS molekulához, amely valamely struktúrgént, szignál szekvenciát és/vagy terminátor területet tartalmaz.

Minden jelen találmány szerinti DNS molekulát előállíthatunk in vitro szintézissel hagyományos eljárások szerint. Az in vitro szintézis különösen alkalmas a jelen találmány szerinti kisebb DNS molekulák előállítására.

Egy jelen találmány szerinti hibrid vektort a genetikai manipulációk hagyományos eljárásai szerint állíthatunk elő, pl. olyan módon, hogy valamely, a genetikai manipulációk területén használt vektort, amelyet előzetesen linearizáltunk, pl. valamely restrikciós enzimmel hasítva, valamely találmány szerinti DNS-sel, a ligálási keverékkel megfelelő gazdasejtet transzformálunk, és transzformánsokat azonosítunk és/vagy szelektálunk.

A gazdasejteket hagyományos eljárásokkal transzformálhatjuk, és a transzformánsokat pl. rezisztenciájuk, pl. tetraciklin elleni rezisztenciájuk alapján vagy auxotróf markerjeik, pl. pyrA marker alapján azonosíthatjuk, és/vagy szelektálhatjuk.

A leírt kifejező vektorokat elsősorban megfelelő E. coli gazdasejtekben, pl. HB101, JM109, MH1, DH5a és hasonló gazdasejtekben sokszorozhatjuk, és a szakterületen hagyományos eljárásokkal transzformálhatjuk és szelektálhatjuk. A sokszorozott plazmid DNS-t a baktériumokból hagyományos eljárásokkal izolálhatjuk, pl. a Bimbóim és Doly által leírt eljárással [Nucleic Acids Rés. 7, 1513-1523 (1979)].

Valamely jelen találmány szerinti DNS molekulát vagy valamely találmány szerinti hibrid vektort (elsősorban olyant, amely valamely homológ vagy heterológ struktúrgént tartalmaz), alkalmazhatunk micéliumos gombák transzformálására is, ilyenek pl. az Aspergillus, Trichoderma, Penicillium vagy Cephalosporium nemzetségbe tartozó gombák, pl. az A. nidulans, az A. japonicus, az A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, és főleg az A. niger.

Abból a célból, hogy lehetővé váljék a transzformáit és nem transzformált gombák elkülönítése, a jelen találmány szerinti hibrid vektorok hordozhatnak valamely szelekciós markert, vagy - egy másik eljárás szerint - a gombák lehetnek együtt transzformálva valamely másik vektorrak, amely tartalmaz ilyen szelekciós markert. A másik rendszerekben az ilyen szelekciós marker valamely kifejezhető struktúrgén lehet, ennek kifejezett polipeptidje pl. rezisztenciát nyújt a befogadó számára toxikus vegyületek ellen, vagy pl. egy eszenciális polipeptidet nélkülöző enzimrendszerét egészíti ki. Ilyen marker gének pl. az ismert qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS vagy argB gének.

Amint ezt az EP 278 355 lajstromszámú európai szabadalmi leírásban bemutatják, egy marker gént, amelyet pyrA-nak neveznek, izolálnak A. niger genomikus könyvtárából, amely rokon az A. nidulans pyrG-jével és a N. crassa pyr4-jével és azonos funkcióval bír, nevezetesen az orotidin 5’-foszfát dekarboxiláz enzimet termeli. Ez az enzim katalizálja az orotidin 5’-foszfát dekarboxilezését uridilsavvá (uridin-5-foszfáttá), valamint a fluororotsav dekarboxilezérét a toxikus fluor-uridinné. Az E. coli Bg5183/pCG59D7-ből, amely a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél DSM 3968 számon van deponálva, izoláljuk a gént tartalmazó pCG59D7 plazmidot és azt használjuk az A. niger pyrA' mutánssal való együtt-transzformáláshoz. Az ilyen pyrA mutáns hiányos az orotidin 5’-foszfát dekarboxiláz génben, ennélfogva nem képes termelni a megfelelő enzimet. Eyen mutáns pl. az A. niger 593 vagy az A. niger An8, amely utóbbi a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél van deponálva DSM 3917. számon. Amutánsokat úgy állítjuk elő, hogy A. niger konidiospóráit mutáló UV sugárzással kezeljük és a fluor-orotsav és uridin jelenlétében túlélő telepeket kiválasztjuk. Azokat a telepeket, amelyek fluor-ecetsav jelenlétében és uritidin távollétében túlélnek, így elveszítjük.

A jelen találmány foglalkozik továbbá a valamely jelen találmány szerinti hibrid vektorral transzformált gazdasejtekkel. Ilyen transzformánsok lehetnek pl. baktériumok, mint E. coli, vagy micéliumos gombák, mint Aspergillus, Penicillin vagy Cephalosporium, elsősorban A. nidulans, A. japonicus, A. orizae, A. carbonarius, A. awamori, főleg A. niger, pl. A. niger An8 vagy N593.

Különösen előnyös az E. coli JM101 vagy DH5a, pPKI-IFN-2-vel, vagy pPK-PLB-vel transzformálva, az Aspergillus niger N593 vagy An8 pPK-PLB-vel, pKI-INF-2-vel vagy pPKIssIFN-2-vel és kívánt esetben pGW613 vagy pCG59D7 marker plazmiddal transzformálva.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás ilyen transzformánsok előállítására, amely abból áll, hogy valamely gazdaszervezet transzformáló körülmények között valamely jelen találmány szerinti rekombináns DNS molekulával kezelünk, kívánt esetben valamely szelekciós marker génnel együtt, és ha szükséges, a transzformánsokat kiválasztjuk.

Eéjárás polipeptidek előállítására

A találmány további tárgya eljárás polipeptidek előállítására; az eljárást az jellemzi, hogy valamely polipeptidet pl, azok közül, amelyek jelentését a korábbiakban megadtuk, kódoló struktúrgént, előnyösen olyan struktúrgént, amely humán α-interferont vagy hibrid interferont, főleg BDBB hibrid interferont, humán szöveti plazminogén aktivátort (t-PA), hepatitisz B vírus felületi anti7

HU 210 989 Β gént (HBVsAg), inzulin-szerű növekedési faktor I. és II.t, eglin C-t vagy deszulfatohirudint, pl. HV1 variánst kódoló, működőképesen összekapcsolunk a pki promotorral és megfelelő gazdaszervezetekben kifejezzük. Amikor szükséges, a polipeptidet izoláljuk hagyományos módon. A vektor konstrukciójától függően a termékek vagy a gazdasejtben termelődnek, vagy ha szignál szekvencia van jelen, a sejtben termelődnek, de kiválasztódnak. Megfelelő gazdaszervezet pl. valamely Aspergillus nemzetségbe, pl. A. niger fajba tartozó gomba, előnyösen az A. niger An8 vagy N593. Megfelelő gazdaszervezetek lehetnek más micéliumos gombák is, pl. a Neurospora crassa, vagy élesztők, pl. Saccharomyces cerevisiae vagy Kluyveromyces lactis. Lehet termelni egyetlen génterméket, amelyhez sokféle eljárást alkalmazhatunk. így pl. egy egyedi poligalakturonáz (PG) vagy pektin liáz PL, előnyösen (PLB) előállítására szolgáló eljárás azzal jellemezhető, hogy valamely gazdaszervezetet, amely egyáltalán nem képes kifejezni PG-t vagy PL-et, vagy csak kis mennyiségben képes kifejezni PG-t vagy PL-et, olyan hibrid vektorral transzformálni, amely valamely PG-t vagy PL-t, pl. PLB-t kódoló struktúrgént tartalmaz, majd az említett gént kifejezzük. Szabályozó területként, pki promotort alkalmazva, így lehetséges egyedi génterméket, pl. PLB-t előállítani megfelelő transzformált gazdaszervezetben, amely a megfelelő vagy rokon endogén génterméket, pl. PLA, B, C, E vagy F terméket csak indukáló körülmények között képes termelni, pl. akkor, ha pektin vagy pektin lebontási termékek vannak a tápközegben, az előállításhoz az említett transzformált gazdaszervezetet olyan körülmények között tenyésztve, amelyek nem teszik lehetővé az endogén struktúrgének kifejeződését, hanem csupán az olyan struktúrgének kifejeződését, amelyek a pki promotor szabályozása alatt állnak. Ilyen körülményeket, pl. úgy teremthetünk, ha minimál tápközeget alkalmazunk glükózzal, mint energia- és szénforrással. Ha olyan gazdaszervezetet alkalmazunk, amely nem képes semmiféle PG, vagy PL kifejezésére, vagy olyan körülményeket alkalmazunk, amely nem teszi lehetővé endogén PL-ek termelését, az említett PG-t vagy PL-et tiszta formában kapjuk meg, amelyet nem szennyez semmiféle más PG vagy PL.

A találmány foglalkozik azokkal az egyedi géntermékekkel is, amelyek egy ilyen génterméket kódoló, jelen találmány szerinti DNS molekulával vagy hibrid vektorral transzformált megfelelő gazdasejtekben termelődnek; foglalkozik továbbá ezek sóival. Előnyösek az A. niger enzimjei, különösen azok, amelyek az élelmiszer- és takarmányiparban alkalmazhatók, mint a PG-k és PL-ek, főleg a PLB. A találmány minden olyan polipeptidre vonatkozik, amelyet a jelen találmány szerinti eljárással állíthatunk elő.

Foglalkozik továbbá a találmány olyan enzim-kompozíciók előállításával, amelyek egy vagy több, jelen találmány szerinti polipeptidet tartalmaznak, pl. egy egyedi PL-t és/vagy ennek PL aktivitású származékát és/vagy egy egyedi PG-t és/vagy ennek PG aktivitású származékát, és/vagy mindezek fiziológiásán elfogadható sóit, előre meghatározott kombinációban egy vagy több, PL illetve PG aktivitástól eltérő aktivitású enzimmel.

A PL aktivitástól eltérő aktivitású megfelelő enzimek elbontják és módosítják a celluláris polimereket. Ilyen enzimek pl. a pektin észterázok, endo- és exoműködő poligalakturonázok, cellulázok, kevert endoglukanázok, hemicellulázok, xilanázok, arabinázok, galaktázok, a- és β-glükozidázok, stb.

A PG aktivitástól eltérő aktivitású megfelelő enzimek elbontják és módosítják a celluláris polimereket. Ilyen enzimek pl. a pektin észterázok, pektin liázok, cellulázok, kevert endo-glukanázok, hemicellulázok, xilanázok, arabinázok, galaktanázok, a- és β-glükozidázok, stb.

Egyedi PG-k vagy PL-ek vagy ezek PG illetve PL aktivitású származékai, amelyeket a jelen találmány szerinti eljárással állítunk elő, vagy ezek enzimes kompozíciói alkalmasak pl. zöldség- vagy gyümölcslevek derítésére, a lékinyerés fokozására a zöldség- vagy gyümölcslé termelésben, és a préselési kitermelés fokozására olajtartalmú magvak vagy gyümölcsök feldolgozásánál, a zöldség- vagy gyümölcslé stabilizálására, a zöldség- vagy gyümölcslé viszkozitásának csökkentésére, biomasszák elfolyósítására, felpuhítására, természetes termékek, pl. természetes pigmentek, aromák, és illatanyagok kivonásának fokozására, biomasszák élelmiszerek vagy takarmányok értékfokozására, stb.

A jelen találmány legelőnyösebben foglalkozik az A. niger pki promotorral, vagy promotor aktivitású fragmentumaival vagy származékaival, hibrid vektorokkal, transzformált gazdaszervezetekkel, továbbá az A. niger pki promotornak vagy promotor aktivitású fragmentumainak vagy származékainak előállítási eljárásaival, hibrid vektorok előállítási eljárásaival, transzformáit gazdaszervezetek előállítási eljárásaival, valamint polipeptidek előállítási eljárásaival.

Az alábbi példák azt a célt szolgálják, hogy részletesen bemutassák az eljárást, de nem céljuk, hogy korlátozzák annak oltalmi körét.

A kiviteli példákban alkalmazott rövidítések jelentése az alábbi:

Amp	ampicillin
ATP	adenozin trifoszfát
BSA	szarvasmarha szérum albumin
bp	bázispár
CIP	borjúbél alkálikus foszfatáz
dATP	2’-dezoxi-adenozin trifoszfát
dCTP	2’-dezoxi-citidin trifoszfát
d.e.	az észterezés mértéke
dGTP	2’-dezoxi-guanozin trifoszfát
DNS	dezoxiribonukleinsav
dNTP	2’-dezoxi-nukleotid trifoszfát
DTT	1,4-ditiotreitol
dTTP	2’-dezoxi-timidin-trifoszfát
EDTA	etilén-diamin tetraecetsav dinátriumsó
EGTA	bisz-(amino-etil)-glikoléter-N,N,N’,N’- tetraecetsav
IFN	interferon
kDa	kilodalton
kbp	kilobázispár

HU 210 989 Β

Km	Michaelis-Menten konstans
LPM	alacsony olvadáspont
O.D.	optikai sűrűség
PCR	polimeráz láncreakció
PEG	polietilénglikol
pki	az A. niger piruvát kináz génje
PLB	pektin liáz B
RNS	ribonukleinsav
rpp	fordulat/perc
SDS	nátrium-dodecil-szulfát
SSC	„nátrium-nátrium-citrát” (0,15 mól/1 NaCl, 0,015 mól/1 nátrium-citrát)
Te	tetraciklin
Trisz	trisz(hidroxi-metil)-amino-metán
E	egység

Tápközegek LC tápközeg

2xYT tápközeg minimál tápközeg A. nigerhez komplett tápközeg A. nigerhez vitaminoldat

1% triptikáz pepton (BBL), 0,5% élesztőkivonat (BBL), 0,8% NaCl, 1 ml trisz-HCl literenként literenként 16 g triptikáz pepton (BBL), 10 g élesztőkivonat 5 g NaCl 1 liter 1,5 g KH₂PO₄-et, 0,5 g KCl-t, 10,0 g glükózt, nyomokban FeSO₄-et, MnSO₄-et és ZnCl₂-t; a tápközeg pH-ja NaOHval 6,5-re van beállítva a fenti minimál tápközeg +0,25 triptikáz pepton (BBL), 0,1% kazamino-sav (Difco), 0,1% élesztőkivonat (BBL), 0,05%, élesztő eredetű ribonukleinsav nátriumsó (ICN, Cleveland, Amerikai Egyesült Államok), és 2 ml vitaminoldat literenként

100 ml-enként 10 mg tiamin, 100 mg riboflavin, 10 mg pantoténsav, 2 mg biotin, 10 mg p-amino-benzoesav, 100 mg nikotinamid és 50 mg piridoxin HC1.

A lemezöntéshez az összes tápközeget 1,5% agar (BBL) hozzáadásával szilárdítjuk meg; a fedő agárhoz illetve agarózhoz 0,7% agart (BBL) vagy agarózt (Seakem) alkalmazunk.

Az alábbi törzseket alkalmazzuk:

E. coli JM101 (Messing, 1979)

E. coli RZ1032 (Pharmacia)

E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories)

E. coli DH5a F’ (Bethesda Research Laboratories)

E. coli BW313 (Kunkel, 1985)

A. niger An8 (DSM 3917, EP-A-0 278 355)

A. niger N593 (1990. 01. 26-án deponáltuk DSM 5756 számon)

Az alábbi vektorokat alkalmazzuk: pBR322

Ennek leírása megtalálható az alábbi irodalmi helyeken: Sutcliffe J. G. (1979), Peden K. W. C. (1983), és Bolivár és munkatársai (1977).

pGW613

Ezt a plazmidot Goosen és munkatársai írják le (1987).

M13mp fág

Az M13mpl8 és M13mpl9 vektorok [Norrander és munkatársai (1983)] az M13 bakteriofág egyszálú DNSének származékai, és azért tervezték ezeket, hogy megkönnyítsék a DNS szekvenciaelemzést, lehetővé téve DNS fragmentumok klónozását egy többcélú polilinker helynél, és lehetővé téve ugyanazon restrikciós fragmentum klónozását mindkét lehetséges orientációban. Az ezekbe a vektorokba klónozott szekvenciákat könnyen alkalmazhatjuk templátként szekvenciaelemzési reakcióhoz vagy egyszálú vizsgáló minták előállításához, két15 szálú oligonukleotid prímért és az E. coli DNS polimeráz

I. Klenow fragmentumát alkalmazva. A vektor DNS hordozza az E. coli lac-operon promotort és a β-galaktozidáz első 145 aminosavának genetikai információját. A többszörös restrikciós helyeket tartalmazó polilinker szek20 venciákat beiktatjuk a lacZ szekvenciába. A polilinker megőrzi a lacz leolvasó keretet és a vektor egy laZ gazdatörzs allélikus komplementációját adja, kék tarfoltokat alakítva ki IPTG-t és X-galt tartalmazó lemezeken. Azokat a rekombináns fágokat, amelyek a leolvasó keretet el25 roncsoló vagy a lacZ peptid kifejeződésére más módon zavaró beiktatásokat tartalmaznak, színtelen tarfoltokként ismeijük fel.

pCG59D7

Ezt a plazmidot az EP 88 101 397.3 számú szabadalmi bejelentés ismerteti, és az Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 törzsből (DSM 3968) nyelhető. Ez a plazmid tartalmazza a pyr A gént, és ezért az A. niger pyr A' mutánsokkal való együtt-transzformáláskor alkalmazzuk.

M13 KO7

Ez segítő (helper) fág, pl. M13 (+)KS-hez. Ezt Mead és munkatársai (1986), valamint Dotto és Zinder (1984) írják le.

pPYKl

Ez tartalmazza a S. cerevisiae piruvát kináz gént.

Leírását Bürke és munkatársai (1983) végezték el. pGW1800

Ez tartalmazza az A. niger PGII gént. Egy E. coli JM109 törzset, amely tartalmazza a pGW1800-at, deponáltak a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen45 nél, DSM 5505 számon. pGW830

Ez tartalmazza az A. niger pelB gént. Egy E. coli HB101 törzset, amely tartalmazza a pGW83O-at, DSM 4389 számon deponáltak a Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen-nél. pTZ18R

A Pharmacia cégtől szerezhető be. pGWllOO

Ez tartalmazza az A. niger gént. Ezt Graaff L. H. 55 írja le (1989), és deponálva van a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél DSM 5747 számon, E. coli

DH5aF/pGWl 100 néven. pJDB207-IFNAM119

Ezt az EP-A-0 205 404 számú európai szabadalmi 60 közrebocsátási irat ismerteti.

HU 210989 Β

1. példa

Az A. niger piruvát kináz gén izolálása és jellemzése 1.1 példa:

Az élesztő piruvát kináz gént tartalmazó DNS fragmentum izolálása és jellemzése A Saccharomyces cerevisiae piruvát kináz génből [Bürke és munkatársai (1983)] származék 1,8 kb-s EcoRI fragmentumot tartalmazó pPYKl plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, olyan körülmények között, amelyeket a szállító (BRL) ajánl. Az így létrejövő fragmentumokat elektroforézissel elkülönítjük 0,6%os, alacsony olvadáspontú (LMP) agaróz gélen. Az LMP agaróznak az 1.8 kb-s EcoRI fragmentumát tartalmazó darabját a gélből kihasítjuk és a DNS-t kivonjuk ebből az alábbi munkamenetet alkalmazva. TE puffért [10 mmól/1 trisz-HCl, 1 mmól/1 EDTA (pH 8,0)] adunk az agaróz darabhoz 500 μΐ végső térfogatig; ezt 250 μΐ fenol követi. 250 μΐ CIA (kloroform/izoamil-alkohol 24:1) hozzáadása után a vizes fázist és a szerves fázist centrifugálással különítjük el, Eppendorf centrifugában 10 percen át 1 400 000 xg-nél centrifugálva. A szerves fázist eldobjuk és a vizes fázist még egyszer extraháljuk 1/2 térfogat fenollal inkubálva 10 percen át 65 °C hőmérsékleten, majd további 1/2 térfogat CIA-t hozzáadva és a fázisokat szétválasztva. A szerves fázist ismét eldobjuk és a vizes fázist szobahőmérsékleten egymás után extraháljuk azonos térfogatú fenol/CIA (l:l)-gyel és azonos térfogatú CIA-val. Végül a DNS-t a vizes fázisból olymódon csapjuk ki, hogy hozzáadunk 0,1 térfogat 3 mól/literes Na-acetátot (pH 5,6) és 2 térfogat etanolt. A DNS-t centrifugálással (Eppendorf centrifuga, 30 perc, 14 000 g, szobahőmérséklet) ülepítjük. A felülúszó eltávolítása után a DNS üledéket szárítjuk Savant Speedvac vákuum centrifuga alkalmazásával. A DNS-t végül 10 μΐ TE-ben feloldjuk és a koncentrációt agaróz elektroforézissel meghatározzuk, ismert mennyiségű együtt vándorló lambda DNS-t alkalmazva referens anyagként.

1.2. példa

A DNS fragmentumok -jelzése

100 mg 1,8 kb-s fragmentumot, amelyet az 1.1 példában leírt módon pPYkl plazmidból izoláltunk, „hégaz” (nick) transzlációval jelzünk, lényegében olyan módon, ahogyan ezt Maniatis és munkatársai (1982) leírták a 109-112 oldalon. 5 μΐ a-³²P-dATP-t (10 μΙΟί/μΙ, 300 Ci/mmól/1), 1 μΐ (5 E/μΙ) DNS polimeráz I-et, 100 pg DNáz -I-et, pPYK-, 1,8 kb-s EcoRI fragmentumából 100 ng-ot és steril vizet adunk 40 μΐ reakciópufferhoz [amely 25 μπιόΐ/ΐ dGTP-t 25 μιηόΐ/ΐ dCTP-t, 25 μιηόΐ/ΐ d/TTP-t, 5 mól/1 MgCl₂-t és 50 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5) tartalmaz] 50 μΐ végső térfogatig. A reakciókeveréket két órán át inkubáljuk 16 °C hőmérsékleten. A reakciót 5 μΐ, 500 mmól/l-es EDTA (pH 8) hozzáadásával állítjuk le. Abból a célból, hogy eltávolítsuk a be nem épült a-³²P-dATP-t a keverékből, a térfogatot 100 μΐ-re növeljük TE-vel és az a-³²P-dATP-t Sephadex G50 oszlopon (Pharmacia) végzett frakcionálással eltávolítjuk. A radioaktívan jelzett 1,8 kb-s EcoRI fragmentumot tartalmazó frakciókat gyűjtjük és egyesítjük. A jelzett DNS-t három percig 100 °C hőmérsékleten inkubálva denaturáljuk és egyszálúként tartjuk meg jégen való gyors lehűtéssel, mielőtt hozzáadnánk az 1.4. példában leírt hibridizációs oldathoz.

1.3. példa:

Nagy molekulatömegű DNS izolálása A. nigerből

Az A. niger DNS-t a növényi RNS izolálásához alkalmazott munkamenet [Slater (1985)] kissé módosított formája szerint izoláljuk. Micéliumot növesztünk egy éjszakán át folyékony minimumnál tápközegen, és ezt kinyerjük, hideg fiziológiás konyhasóoldattal mossuk, folyékony nitrogénben fagyasztjuk és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A nukleinsavakat úgy izoláljuk, hogy 0,5 g fagyasztott micéliumot mikrodiszmembrátort (Braun) alkalmazva szétzúzzuk. A kapott micélium-port frissen készített extrakciós pufferral extraháljuk. Az extrakciós puffért az alábbiak szerint készítjük: 1 ml tri-izopropil-naftalinszulfonsavat (TNS) (20 mg/ml) alaposan összekeverünk 1 ml p-amino-szalicilsavval (PÁS) (120 mg/ml), és 0,5 ml 5xRNB puffért [5xRNB tartalmaz 121,0 g triszt, 73,04 g NaCl-t és 95,10 g EGTA-t 1 literben (pH 8,5)] adunk hozzá. 1,5 ml fenol hozzáadása után az extraháló puffért kiegyensúlyozzuk 10 percig 55 °C hőmérsékleten. A meleg puffért azután hozzáadjuk a micéliumporhoz, és a szuszpenziót alaposan átkeverjük 1 percig. 1 ml kloroform hozzáadása után a szuszpenziót újból átkeverjük 1 percig. 10 percen át 10⁴ x g-nál végzett centrifugálás után a vizes fázist azonos térfogatú fenol/kloroform (1 :l)-gyel extraháljuk, majd kétszer extraháljuk kloroformmal. A DNS-t a vizes fázisból az alábbi munkamenetet követve izoláljuk. A DNS-t a vizes fázisból azonnal kicsapjuk 2 térfogat etanollal szobahőmérsékleten, majd 10⁴x g-nél 10 percen át végzett centrifugálással összegyűjtjük és kétszer mossuk olyan módon, hogy a DNS-t steril desztillált vízben újra feloldjuk, majd etanollal újra kicsapjuk. Végül a DNS-t újra feloldjuk TE pufferban. Az RNS-t azután olyan módon távolítjuk el, hogy RN-áz A-t (20 μg/ml) adunk az oldathoz.

1.4. példa:

A heterológ hibridizálás körülmények meghatározása

A. nigerből az 1.3 példában leírt módon izolált nagy molekulatömegű DNS-t emésztünk EcoRI-gyel és BamHI-gyel. Az így létrejövő fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel különítjük el, és nitrocellulózra visszük át, amint ez Maniatis és munkatársai (1982) a 383-389. oldalon leírtak. A heterológ hibridizálási körülményeket meghatározzuk és a hibridizációs kísérleteket elvégezzük olyan módon, ahogyan ezt de Graaff és munkatársai (1988) leírták. A hibridizációs körülmények a könyvtár átvizsgálásában és a Southern folt hibridizálásához, vizsgáló mintaként az élesztő gén 1,8 kb-s EcoRI fragmentumát alkalmazva, az alábbiak: előhibridizálás 6 x SSC-t, 0,1% SDS-t, 0,05% nátriumpirofoszfátot és 20 μg/ml denaturált hering sperma DNS-t tartalmazó oldatban 56 °C hőmérsékleten 310

HU 210 989 Β órán át, hibridizálás 6 X SSC-t, 0,1% SDS-t, 0,05% nátrium-pirofoszfátot és 20 pg/ml denaturált hering sperma DNS-t tartalmazó oldatban 56 ’C hőmérsékleten 15—18 órán át, majd két mosás 5 x SSC-t és 0,15 SDS-t tartalmazó oldatban 56 °C hőmérsékleten, és két mosás 2 x SSC-ben 56 ’C hőmérsékleten. A szűrőket autoradiográfiának vetjük alá egy éjszakán át -70 °C hőmérsékleten, Konica röntgensugárfilmet és Kodak X-Omatic kazettákat alkalmazva szabályos erősítő szűrőkkel.

7.5. példa:

A génkönyvtár átvizsgálása a radioaktív 1,8 kb-os

EcoRI fragmentummal

Az A. niger pki gént heterológ hibridizálással izoláljuk, vizsgáló mintaként az 1,8 kb-s EcoRI fragmentumot alkalmazva. Az A. niger N400 genomikus könyvtárat, amelyet az EP-A-0 278 355 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban leírtak szerint állítunk elő, átvizsgáljuk a pPYKl 1,8 kb-s fragmentumával az 1.4 példában leírt eljárás szerinti hibridizációs munkamenettel. Az átvizsgálás pozitív kiónok izolálásához vezet. A legerősebb hibridizációs szignálokat adó klónokból plazmid DNS-t izolálunk „mini-prep” izolálási eljárással [Maniatis és munkatársai (1982), 368-369 oldal]. Southern-elemzést és restrikciós elemzést alkalmazunk annak ellenőrzésére, vajon egy klón tartalmazza-e a teljes A. niger pki gént. Ennek a kiónnak az 5 kbp-s BglII/HindlII fragmentumát és pBR322 E. coli vektor 4,0 kbp-s BamHI/HindlII vektor-fragmentumát izoláljuk az 1.1 példában leírt LMP agaróz eljárás szerint. Az 5 kbp-s BglII/HindlII fragmentumot ligáljuk a pBR322 4,0 kbp-s BamHI/HindlII vektor fragmentumával, ilyen módon kapjuk a pGWllOO plazmidot a következő eljárással: 10 ng pBR322 fragmentumot összekeverünk 250 mg említett 5 kbp-s BglII/HindlII fragmentummal és 4 pl 5 x ligáló pufferral [összetétel: 250 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6); 50 mmól/1 MgCl₂; 50 mmól/1 DTT; 5 mmól/1 ATP; 5 mmól/1 spermidin; és 50 pg/ml BSA], és 1 pl (1,2 E/μΙ) DNS ligázt (BRL) adunk ehhez a keverékhez 20 μΐ végső térfogatot alakítva ki. 16 órán át 14 ’C hőmérsékleten végzett inkubálás után a keveréket 100 μΐ-re hígítjuk steril vízzel. 10 μΐ hígított keveréket alkalmazunk kompetens E. coli JM101 sejtek transzformálására, amelyeket a Pharmacia Manualban az M13 klónozó/szekvencia elemző rendszerben leírt CM1, CM2 eljárás szerint állítunk elő. pGWllOO-et izolálunk nagy léptékben [Maniatis (1982), 86. oldal], tisztítjuk CsCl sűrűséggradiens centrifugálással és fenolos extrahálással, majd etanollal kicsapjuk és TE pufferban újból feloldjuk. A pGWllOO plazmidot tovább elemezzük restrikciós elemzéssel, és meghatározzuk a pki gén orientációját hibridizálással az 1.4 példában leírt körülmények között, vizsgáló mintaként az S. cerevisiae piruvát kináz gén 5’- és 3’-végét tartalmazó fragmentumokat alkalmazva, vagyis egy 1,0 kbs-s EcoRI/BglII, illetve egy 0,88 kbp-s EcoRI/BglII fragmentumot.

7.6. példa:

A. niger piruvát kináz gén szekvencia meghatározása

Az A. niger pki gén szekvenciáját, beleértve a promotor területet, a struktúrgént és a terminációs területet, meghatározzuk olyan módon, hogy a pGWllOOból való fragmentumokat szubklónozzuk M13mpl8/mp 19-be. A nukleotid szekvenciaelemzéshez megfelelő restrikciós fragmentumokat izolálunk, amint 1.1 példában leírtuk, és ligáljuk linearizált, M13mpl8/19-ben RF DNS vektorokkal [Messing (1983); Norranden és munkatársai (1983)], amint ezt az 1,5 példában leírtuk. A nukleotid-szekvenciát a didezoxi láncterminációs eljárást [Sanger és munkatársai (1977)] alkalmazva határozzuk meg, amint ezt a BRL cég „Ml3 Cloning/Didezoxy Sequencing Instruction Mannual” című kézikönyve leírja az 50-73. oldalon. A meghatározott szekvenciát a szekvencia-felsorolásban ismertetjük SEQ ID NO. 1 néven.

2. példa:

Kifejező vektorok megalkotása

2.1. példa:

Új restrikciós hely bevezetése a piruvát kináz gén transzlációs iniciációs kodonjával

2.1.1. példa:

Uracilt tartalmazó M13mpl8-PK (BamHI-PvuH) templát DNS előállítása

Az 1.6 példában kapott M13mpl8-PK (BamHI/PvuII) bakteriális fágot szaporítjuk olyan módon, hogy E. coli JM101-nek 5 ml-es, 2 x YT tápközegen O. D. 6oo nm = értékig nőtt tenyészetét egy egyedi tarfolttal beoltjuk. Egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten végzett növesztés után a baktériumokat centrifugálással (10 000 x g, 10 perc) eltávolítjuk és a felülúszót használjuk fág törzsoldatként az uracilt tartalmazó egyszálú DNS templát előállításánál.

Az uracilt tartalmazó templátot Kunkel és munkatársai (1985) és Ner és munkatársai (1988) szerint állítjuk elő a következőképpen. 10 ml 2 x YT tápközeget, amely 5 mól/1 uridint is tartalmaz, inokulálunk E. coli RZ1032-vel és a tenyészetet növeljük 37 ’C hőmérsékleten addig, amíg az O. D. 55o^mnn> érték 0,3 lesz. Ezt a tenyészetet megfertőzzük 12 μΐ, M13mpl8-PK (BamHI-PvuII)-t tartalmazó, a fentebb leírtak szerint készített felülúszó hozzáadásával. A fertőzött tenyésztetet 5 órán át 37 ’C hőmérsékleten növesztjük. Ez után a növesztési periódus után a baktériumokat a tenyészetből a korábban leírtak szerint eltávolítjuk, és a fágot tartalmazó felülúszót egy második fágnövesztési ciklus végrehajtásához alkalmazzuk E. coli RZ1032-n, úgy ahogy korábban leírtuk. Egy harmadik növesztési ciklus 40 ml, 5 mmól/1 uridint is tartalmazód xYT tápközeget összekeverünk 10 ml E. coli RZ1032 tenyészettel és 50 μΐ, a második növesztési ciklusban keletkezett fágtartalú felülúszót adunk hozzá. A baktériumokat 5 órán át növesztjük 37 ’C hőmérsékleten, majd a baktériumokat a felülúszóból a fentebbek sze11

HU 210 989 Β rint végzett centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót még egyszer centrifugáljuk, mielőtt a fágokat kicsapnánk 8 ml 20%-os polietilénglikol-6000 (3 mól/1 NaClban) hozzáadásával. A fágokat 10 percen át 10 000 X gnél végzett centrifugálással összegyűjtjük. Az így létrejött fág-üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml TE pufferban. Az uracilt tartalmazó fágok arányát meghatározzuk olyan módon, hogy ennek a fág-oldatnak különböző hígításait szélesztjük E. coli JMlOl-en („megengedő”), valamint E. coli RZ1032-n („nem-megengedő”). Az uracilt nem tartalmazó és uracilt tartalmazó fágok hányadosát l:10⁶-mak találjuk. Az egyszálú M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) DNS-t olyan módon izoláljuk, amint ezt az 1.1 példába leírtuk, vagyis fenol-kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk 125 μΐ TE pufferban.

2.1.2. példa:

Nsil hely bevezetése az A. niger pki gén transzlációs iniciációs helyénél in vitro mutagenezissel A 2.1.1. példában leírt, uracilt tartalmazó, egyszálú

M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) DNS in vitro mutagenezisével [Ti-Zi Su és Raafat El-Gewely M. (1988)] Nsil helyet alakítunk ki a piruvát kináz gén transzlációs iniciációs helyénél, ehhez az 5926. mutagenikus oligonukleotidot alkalmazva, amely a SEQ ID NO. 2 nukleotid-szekvenciával bír.

Az 5926. oligonukleotid 29 nukleotid szekvenciából áll, amelynek szekvenciája azonos a pki gén transzlációs iniciációs helye körüli szekvenciával, az oligonukleotid 12-14. helyei kivételével. A nukleotid szekvenciája a 12.-14. helyeken, amely az eredeti pki transzlációs iniciációs területben GCC, itt CAT. Ennek megfelelően ez az oligonukleotid a 9. és 14. helyek közt egy Nsl hellyel bír.

A pki gén in vitro mutációjához 50 pmól 5926. oligonukleotidot foszforilezünk az 5’ végnél [Maniatis (1982)] 100 pmól ATP-vel. Ezt a reakciót 30 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 E T4 polinukleotid kinázzal (BRI) 50 μΐ kináz pufferban, a gyártó cég ajánlásai szerint. A reakciót úgy fejezzük be, hogy hozzáadunk 2 μΐ, 500 mmól/literes EDTA oldatot. A keveréket fenollal és kloroformmal extraháljuk, amint ezt az 1.1. példában leírjuk.

0,2 pmól, uracilt tartalmazó egyszálú M13mpl8PK (BamHI-PvuII) DNS-t, amelyet a 2.1.1. példa szerint állítottunk elő, összekeverünk 0,5 pmól/1 foszforilezett 5926. oligonukleotiddal 10 μΐ végső térfogatú olyan oldatban, amely 20 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t és 25 mmól/1 NaCl-t tartalmaz. A keveréket 5 percen át inkubáljuk 65 °C hőmérsékleten, majd lassan lehűtjük szobahőmérsékletre 60 perc alatt, végül 15 percre jégre tesszük. Ezután 2 μΐ 500 pmól/l dNTP keveréket, 1,5 μΐ 10 mmól/1 ATP-t, 1 μΐ T₇ DNS polimerázt (12 E/μΙ; Pharmacia) és 1 μΐ T4 DNS ligázt (1,2 E/μΙ; BRL) adunk a keverékhez, és ezt a polimerizációs keveréket 15 percen át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A reakciót olyan módon állítjuk le, hogy 65 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át. A polimerizációs keveréket ezután hígítjuk 100 μΐ végső térfogatra, és a hígított keverék alikvotjait kompetens E. coli JM101 (megengedő) és E. coli RZ1032 (nem-megengedő) sejtek transzformálására alkalmazzuk, amelyeket úgy készítünk elő, ahogyan ezt az 1.5. példában leírtuk. Az átfertőzött sejteket szélesztjük, ahogyan ezt az 1.5. példában leírtuk.

2.1.3. példa:

A mutált Ml3mpl8-PK (BamHI-PvuII) szekvencia elemzése tarfoltot a transzformált E. coli JMlOl-et tartalmazó lemezekről felvesszük, a fágokat E. coli JMlOl-gyel, mint gazdasejtekkel szaporítjuk, és az egyes fágokból egyszálú DNS-t izolálunk, amint ezt a

2.1.1. példában leírtuk. Ezeknek a fágoknak az izolált egyszálú DNS-eit a „G-nyom” elemzéssel elemezzük, amint ez a BRL „Ml3 Cloning and Sequencing Manual” című útmutatójában le van írva. Három iágot, amelyekről a kívánt mutációnak megfelelő G minta tételezhető fel, szekvenciaelemzésnek vetünk alá, amint ezt az 1.6. példában leírtuk. A fágok tartalmazzák a megjósolt 1053 bp-s BamHI-PvuII fragmentumot, Nsil hellyel a pki gén transzlációs iniciációs helyénél. A mutált fágokat M13mpl8-PK (BamHI-NsiI-PviII)-nek nevezzük.

2.2. példa:

A pPK-PLB megalkotása

A pki promotor területet tartalmazó 742 bp-s BamHI/Nsii fragmentumot izoláljuk az M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) RF DNS-ből, miközben a pektin liáz B (pelB) struktúrgént tartalmazó 2,6 kb-s BamHI/Nsil fragmentumot izoláljuk a pGW830 plazmidból az 1.1. példában leírt eljárás szerint. Mindkét fragmentumot ligáljuk egy BamHI-gyel emésztett, defoszforilezett, pBR322 vektorba (4. ábra9 az alábbiak szerint. 100 ng BamHI-gyel emésztett pBR322 DNS-t összekeverünk 250 ng 2,6 kb-s pelB BamHI/Nsil fragmentummal és 250 ng 742 bp-s pki BamHI/Nsil fragmentummal. A keveréket az 1.5. példában leírtak szerint ligáljuk. A hígított ligálási keverék alikvotjait kompetens, 1.5. példa szerint előállított E. coli JM101 sejtek transzformálására alkalmazzuk. A transzformációs keveréket 50 μg/ml ampicillint is tartalmazó LC-lemezekre szélesztjük és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A lemezről transzformánsokat veszünk fel és növesztjük 5 órán át 37 °C hőmérsékleten folyékony, 50 pg/ml penicillint is tartalmazó LC tápközegben. A transzformációkból plazmid DNS-t izolálunk „miniprep” izolálási eljárással [Maniatis és munkatársai (1982), 368-369. oldal]. Az azt a plazmidot tartalmazó transzformánst, amely BamHI-gyel, SphI-gyel, Smal-gyel végzett emésztés után és BamHI-gyel és Nsil-gyel végzett kombinált emésztés után a várt fragmentumokat mutatja, szekvenciaelemzéssel tovább elemezzük, primerként pelB-specifikus oligonukleotidot alkalmazva. A szekvencia megfelel a pki-pelB fuzionált gén jósolt szekvenciájának. A plazmidot pPKPLB-nek nevezzük el, és úgy szaporítjuk és tisztítjuk, amint ezt az 1.5. példában leírjuk.

HU 210 989 Β

3. példa

3.1. példa:

A pPK-PLB bevezetése A. nigerbe

A 2.2. példában kapott pK-PLB plazmidot olyan módon vezetjük be az A. nigerbe, hogy A. niger N593at együtt transzformáljuk pGW613 és pPK-PLB plazmidokkal. A pGW613 tartalmazza a szelektív pyrA marker gént.

Az A. niger N593 protoplasztjait a micéliumból úgy állítjuk elő, hogy az A. niger N593-at 0,5% élesztőkivonattal, 0,25 kazaminosavval, 50 mmól/1 glükózzal és 10 mmól/1 uridinnel kiegészített minimál tápközegen növesztjük 20 órán át 30 ’C hőmérsékleten. Az A. niger N593 protoplasztjainak előállítását és a transzformálási eljárást úgy hajtjuk végre, amint ezt Goosen és munkatársai leírják (1987). A létrejött PYR+ transzformánsokat az említett kiegészített minimál tápközegen növesztjük és a pelB gén kifejezésére elemezzük.

3.2. példa:

Az A. niger N593 PK-PLB transzformánsainak elemzése

A 3.1. példa szerint kapott A. niger transzformánsokat a pelB géntermék, vagyis a PLB fehéije képződésére elemezzük. A transzformánsokat kiválasztjuk és 18 órán keresztül növesztjük olyan tápközegen, amely 10 g 72%ban észterezett pektint, 7,5 g NH₄NO₃-at, 0,5 g KCl-t, 0,5 g MgSO₄-et, 1,5 g KH₂PO₄-et, 0,5 g kazaminosavat, 0,5 g élesztőkivonatot, 0,5 ml nyomelemoldatot tartalmaz vízzel 1 literre kiegészítve (pH 6,0). A nyomelemek törzsoldata literenként 10 g EDTA-t, 4,4 g ZnSO₄ x 7H₂O-t, 1,01 g MnCl₂ x 4H₂O-t, 0,32 g CoCl₂ x 6H₂O-t, 0,315 g CuSO₄ x 5H₂O-t, 0,22 g (ΝΗ₄)₆Μθ7θ₂₄ x 4H₂O-t, 1,47 g CaCl₂ x 2H₂O-t és 1,0 g FeSO₄ x 7H₂O-t tartalmaz. A kinövés után a micéliumot szűréssel eltávolítjuk és a tenyészet szűrletét SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elemezzük, 10% akrilamidot tartalmazó gélt alkalmazva. A PLB fehérjét Westem-folt elemzéssel mutatjuk ki (amint ez az LKB 2117 Multiphor félszáraz folt készülékéhez tartozó kézikönyben le van írva), PLII ellen nyulakban kialakult poliklonális antitesteket [van Houdenhoven (1975)] és alkálikus foszfatázhoz konjugált kecske-anti nyúl antitesteket (Bio Rád) alkalmazva a gyártók útmutatásai szerint. Az elemzésnek alávetett transzformánsok közül mintegy 70% termeli a PLB fehérjét. Egy transzformánst kiválasztunk a további munkához. Ezt a transzformánst a továbbiakban A. niger/PK-PLB-nek nevezzük.

3.3. példa:

Az A. niger pPK-PLB transzformánsának Northern elemzése

A 3.2. példa szerint kiválasztott A. niger/PK-PLB transzformánst elemezzük pelB-specifikus mRNS képzősédére. A transzformánst 16 órán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten, olyan tápközegen, mint amelyet a 3.2. példában leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a szénfonás 2% (tömeg/térfogat) glükóz. A kinyerés után a micéliumot gyorsan megszántjuk olyan módon, hogy papírlapok közt összepréseljük és azonnal folyékony nitrogénbe mártjuk, hogy megőrőlhessük. 1 g porított micéliumot azután 3 ml pufferban szuszpendálunk [4,0 mól/1 guanidium-tiocianát, 50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 10 mmól/1 EDTA (pH 7,5), 1% β-merkaptoetanol és 2% nátrium-lauril-szakrozinát] és Vortex berendezésben keverjük 1 percen át. Centrifugálás után (10 perc, 10 00 x g szobahőmérsékleten) a felülúszót kinyerjük. A felülúsző minden 2,5 ml-éhez 1 g CsCl-t adunk. A mintákat ezután 5,7 mól CsCl-ból és 0,1 mól/1 EDTA-ból álló párnára (pH 7,5) rétegezzük egy SW50 Beckman ultracentrifuga csőben. Centrifugálást végzünk 16 órán át 30 000 fordulat/perccel 20 ’C hőmérsékleten, Beckman SW50 rotort alkalmazva. Az RNS üledékeket feloldjuk desztillált vízben. A minták RNS tartalmát mintegy azonos koncentrációra állítjuk be az agaróz gél elektroforézis után. Mintegy 25 gg RNS-t futtatunk, glioxálos denaturálást alkalmazva [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982); 200. oldal]. Az RNS-ből foltot képzünk Gene-bind-en (Pharmacia) 10 x SSC-t alkalmazva átvivő pufferként, és 1 órán át sütjük 80 ’C hőmérsékleten. Hibridizálást végzünk 16 órán át a Church és Gilbert által leírt hibridizáló pufferben [Proc. Natí. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995 (1984)] [1% BSA, 1 mmól/1 EDTA, 0,5 mól/1 nátrium-foszfát (pH 7,2) 7% SDS] 60 ’C hőmérsékleten, vizsgáló mintaként azt a radioaktívan jelzett 2,8 kbp-s Xhol fragmentumot alkalmazva, amelyen a pelB gén elhelyezkedik. A foltokat kétszer mossuk 30-30 percen át 2 X SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal, majd kétszer mossuk 3030 percen át 0,2 x SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 60 ’C hőmérsékleten. A foltok exponálását 1 órán át végezzük -70 °C hőmérsékleten, Konica röntgensugárfilmet és erősítő szűrőket alkalmazva. Az elemzés erős pelB-specifikus mRNS szignált jelez a transzformánsban, míg a hasonló körülmények között nőtt A. niger N400 kontroll törzsben nincs szignál.

3.4. példa:

Pektin Ház B (PLB) termelése, tisztítása és jellemzése A. niger/PK-PLB-ből

3.4.1. példa:

Tenyésztési körülmények a pektin Ház B előállításához, és az enzim izolálása A. niger/PK-PLB spóráit 600 ml tenyésztő tápközeg inokulálására használjuk 7 x 10⁶ spóra/ml mennyiségben. A tápközeg összetétele az alábbi: 20 g glükóz, 7,5 g NH₄NO₃, 0,5 g KC1, 0,5 g MgSO₄x7H₂O, 15 g KH₂PO₄,5 g élesztőkivonat, 0,5 g ribonukleinsav, 0,5 ml nyomelem-törzsoldat, és H₂O 1 literig (pH 6,0). Anyomelem-törzsoldat 10 g EDTA-t, 4,4 g ZnSO₄ x 7H₂O-t, 1,01 g MnCl₂x4H₂O, 0,32 g CoCl₂ x 6H₂O-t, 0,315 g CuSO₄ x 5H₂O-t, 0,22 g (ΝΗ^ΜογΟ^ x 4H₂O-t, 1,47 g CaCl₂ x 2H₂O-t és 1,0 g FeSO₄ x 7H₂O-t tartalmaz. A tenyészetet 3 órán át növesztjük 30 ’C hőmérsékleten New Brunswick orbitális rázógépen, majd átvisszük 10 literes, 4 literes azonos tápközeget tartalmazó üvegedénybe. 1 tenyészetet az üvegedény fenekén levő elosz13

HU 210 989 Β tót alkalmazva levegőztetjük, ilyen módon osztva el a sűrített levegőt, és keverve a tenyészetet. A növesztést 16 órán át 30 °C hőmérsékleten folytatjuk. Ezután a növesztési periódus után a tápközeg pH-ja 5,8. A micéliumot szűréssel eltávolítjuk és a PLB-t a tenyészet szűrletéből az alábbi eljárással izoláljuk.

Az enzimet csaknem kvantitatíve kinyerjük ammónium-szulfátos kicsapással 0 °C hőmérsékleten, majd az ezt követő centrifugálással (15 perc, 8500 x g). A kicsapott enzimet feloldjuk 50 mmól/1 nátrium-foszfát pufferben (pH 6,0), dializáljuk azonos pufferral szemben, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A pektin liáz aktivitást 25 °C hőmérsékleten mérjük 0,3% (tömeg/térfogat) pektin (az észterezettség mértéke 94,6%) végső koncentrációt alkalmazva 50 mmól/1 trisz-HCl puffért és 1 mmól/1 CaCl₂-t tartalmazó oldatban (pH 8,5), a van Houdenhoven által közölt szakcikk (1975) 11. oldalán leírt spektrofotometriás eljárás szerint.

A tenyészet szűrletének SDS-poliakrilamid elektroforézise és Western-folt elemzése egy uralkodó fehérje csíkot jelez a kicsapott és dializált frakcióban, amely a PLB-nek felel meg és csaknem tiszta enzim. A tenyészet szűrletének specifikus pektin liáz aktivitása a tenyészet szűrletében 48 E/mg fehérje, míg a kicsapott és dializált frakcióban 216 E/mg fehérje, és a fehérje koncentráció 380 mg, illetve 82,6 mg, amint ezt Pierce BCA vizsgálattal meghatározzuk.

3.3.2. példa:

A PLB fehérje tulajdonságai

A 3.1.3. példában izolált PLB látszólagos molekulatömege 39,5 kDa, amint ezt SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározzuk, 10%-os géleket alkalmazva. A tisztított enzim stabil 50 mmól/literes foszfát pufferban (pH 6,0), de magasabb pH-η lassan inaktiválódik, pl. 50 mmól/literes trisz-HCl pufferban (pH 7,5). Ez az inaktiválás reverzibilis és az aktivitás nagy mértékben helyreáll az enzimet foszfát puffénál szemben (pH 6,0) dializálva. A 3.1.3. példában elkészített PLB tipikus endo-pektin liáz, amelyre az oligomer bomlástermékekből lehet következtetni, amelyek a nagymértékben észterezett pektinekből (lásd 94,6%) alakulnak ki. Az enzim előnyben részesíti a nagymértékben észterezett pektineket, amint ez az 1. táblázatból látható.

1. TÁBLÁZAT:

A PLB aktivitása különböző észterezettségi fokú almapektineken.⁰

A pektin szubsztrátum észterezettségének mértéke (%)	A PLB relatív enzimaktívitása (%)
94,6	100
72,8	29
61,2	20
50,6	11
34,8	5

a Vizsgálati körülmények; 0,3% (tömeg/térfogat) pektin 50 mmól/1 trisz-HCl-t és 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldatban (pH 8,5); 25 ’C hőmérséklet.

Meghatározzuk a PLB Michaelis-Menten paramétereit is, olyan enzimet alkalmazva, amelyet nátriumfoszfát pufferban (pH 6,0) tárolunk. Az aktivitás 25 °C hőmérsékleten vizsgáljuk 50 mmól/1 trisz-HCl pufferban (pH 8,5), 0,5 mól/1 NaCl jelenlétében, nagy mértékben észterezett pektin (lásd 94,6%) különböző koncentrációit alkalmazva. A Km értéket 9 mmól/l-nek (monomer alapon), és a forgási (tumover) számot 51 500-nak találjuk.

4. példa:

Humán hibrid BDBB interferon kifejezése a pki promotor szabályozó alatt

4.1. példa:

A pGII-IFN AMI 19 prekurzor plazmid megalkotása

A pGW1800 plazmidot, amelyet E. coli JM109/pGWl 800-ból (DSM 5505) izolálunk, emésztjük EcoRI-gyel és T4 polimerázzal kezeljük az alábbiak szerint. Ennek a DNS-nek az újra ligálása és az E. coli DH5aF’ transzformálása lehetővé teszi a pGW1800-E plazmid izolálását, amely azonos a pGW1800-zal, azzal a kivétellel, hogy az EcoRI hasítási hely ki van iktatva.

A pGW1800-E plazmidot BGlII-vel emésztjük és bakteriális alkálikus foszfatázzal (BRL) kezeljük 50 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0) és 50 mmól/1 NaCl jelenlétében 1 órán át 65 “C hőmérsékleten. Az alkálikus foszfatázt K. proteinázzal (Boehringer Mannheim) végzett emésztéssel inaktiváljuk, és fenolos extrakciót végzünk. Ezután a DNS-t etanollal kicsapjuk, szárítjuk és újra oldjuk vízben. A „ragadós” végeket ezután betöltjük T4 DNS polimerázzal, amint ezt később leírjuk.

pJDB20 -IFN AMI 19 plazmidot (lásd 205 404 lajstromszámú európai szabadalmi leírás) emésztünk HindlII-mal és Clal-gyel. Ennek a lineáris fragmentumnak a ragadós végeit betöltjük T4 polimerázzal (Boehringer Mannheim) 0,1-0,1 mmól/1 dCTP, dGTP, dATP és d’l’l'P, valamint 67 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 6,7 mmól/1 MgCl₂, 16,7 mmól/1 (NH₄)₂SO₄ és 5 mmól/1 DTT jelenlétében, 30 percig 37 °C hőmérsékleten. A reakciót 65 °C hőmérsékleten 5 percig történő melegítéssel állítjuk le. A fragmentumokat 0,8%-os alacsony gélesedési hőmérsékleti agaróz (Bio Rád) gélen különítjük el, és az 1 kbp-s fragmentumot, amely tartalmazza azIFN AM 119 kódoló területet, kimetszszük, és a DNS-t Elutip D (Schleicher és Schüll) oszlopon tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk [Schmitt és Cohen (1983)].

100 pg IFN AMI 19 fragmentumot és a fentebb előállított pGW1800-E vektort együtt ligáljuk 5 μΐ olyan oldatban, amely 20 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t, 10 mmól/1 DTT-t, 1 mmól/1 ATP-t és 1 egység T4 DNS ligázt (Boehringer Mannheim) tartalmaz, 2 órán át szobahőmérsékleten. A keveréket kompetens E. coli DH5ocF’ sejtekbe transzformáljuk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós emésztésével átvizsgáljuk, hogy azonosítsuk azokat, amelyek a pGII-IFN AMI 19 prekurzor plazmidot hordozzák.

HU 210 989 Β

4.2. példa:

A pGIIss-IFN AMI 19 kialakítása, PCR eljárást alkalmazva

A most következő PCR (polimer láncreakció, Polymerase Chain Reaction) eljárást a Horton R. M. és munkatársai (1989) által leírtakat követve hajtjuk végre. A pGW1800-at Xbal emésztéssel linearizáljuk és etanollal kicsapjuk. Vízben újra szuszpendálás után 100 gg ilyen DNS-t kibővítésnek amplifikációnak vetünk alá polimeráz láncreakcióval (PCR) az A és C oligonukleotidokat (SEQID NO. 5 illetve SEQID NO. 6) alkalmazva automatizált hőközlőben 25 cikluson át (minden ciklus 1 perc 94 °C hőmérsékleten, 2 perc 40 ’C hőmérsékleten és 3 perc 72 ’C hőmérsékleten), majd 72 ’C hőmérsékleten 10 percen át. Az egyes oligonukleotidokból 100 pmól/litert és 0,5 ml Taq polimeráz (Perkin Elmer Cetus) alkalmazunk az egyes reakciókhoz 100 μΐ térfogatban, a forgalmazó cég által javasolt reakció puffért alkalmazva. így alakul ki a 2. DNS (SEQIDNO. 7).

A pJDB207-IFN AM119-et hasonlóképpen linearizáljuk BamHI-gyel és PCR-nek vetjük alá a D oligonukleotid (SEQ ID NO. 8), vagy az F oligonukleotid (SEQ ID NO. 9) valamelyikével, így kapjuk meg a 3. DNS-t (SEQIDNO. 10).

A reakciókeveréket etanollal csapjuk ki, újra szuszpendáljuk vízben és egy alikvotot ellenőrzünk gélen, hogy meghatározzuk a DNS fragmentumok koncentrációját a keverékekben.

Azonos körülményeket alkalmazva, mint fentebb, a 2. és 3. DNS-t is PCR-nek vetjük alá az A és F oligonukleotidokkal; így olyan DNS szekvenciát kapunk, amely egy PGII promotor fragmentumhoz kapcsolt PGII szignál szekvencia tökéletes kereten belüli fúziós termékét tartalmazza az érett hibrid BDBB interferont kódoló területtel.

Ezen DNS BamHI-EciRI fragmentumát, amely tartalmazza a tökéletes kereten belüli fúziós terméket, a BamHI-EcoRI-gyel hasított pGD-IFN AMI 19 prekurzorba Egáljuk, hogy kialakítsuk a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidot. A pGüss-IFN AMI 19 szekvenciájának azt a részét, amely tartalmazza a PGII szignál szekvenciát, a BDBB hibrid IFN AMI 19 gént és az élesztő pHO5 terminátort, a SEQ ID NO. 11 ábrázolja.

4.3. példa:

A pPKl-IFN-1 plazmid megalkotása gg pGWllOO-at kinyitunk NsiO restrikciós endonukleázzal a pki gén 3’ végénél levő helyen. Ezt a DNS-t T4 polimerázzal kezeljük 30 percen át 37 ’C hőmérsékleten 20 gl reakciókeverékben, amely az alábbiakat tartalmazza: 2 gg DNS, 67 mmól/l trisz-HCl (pH 8,8), 6,7 mmól/l MgCl₂, 16,7 mmól/l (NH₄)₂SO₄, 5 mmól/l ditiotreitol, 50-50 gmól/1 dGTP, dATP, dCTP és dTTP, és 1 Ε T4 polimeráz. Etanolos kicsapás után ennek a DNS-nek 100 ng-ját Egáljuk 10 pmól/1 foszforilezetlen, 5’ GGAATTCC szekvenciájú EciRI oligonukleoúd kapcsolóval szobahőmérsékleten 2 órán át 5 gl reakciókeverékben, amelynek összetétele a következő: 100 ng DNS, 10 pmól/1 kapcsoló, 20 mmól/l trisz-HCl (pH 7,5), 10 mmól/l ditiotreitol, 1 mmól/l ATP és 1E ligáz. A keveréket E. coli DH5aF’-be transzformáljuk és szelektáljuk plazmidtartalmú sejtekre 50 gg/ml ampicillint is tartalmazó 2 x YT-n. Miután 18 telepből DNS-t állítottunk elő és átvizsgáltuk ezeket restrikciós emésztéssel, azonosítjuk az EcoRI kapcsoló szekvenciát tartalmazó és az Nsil helyet nélkülöző pG W1100-E plazmidot.

A 4.2. példa szerint előállított pGIIss-IFNAM119 plazmid tartalmazza az Aspergillus niger PGII promotor és szignál szekvenciát egy IFN génhez fuzionálva, ezt követi a Saccharomyces cerevisiae PHO5 terminátor és a PGII terminátor. Ezt a plazmidot Pstl-gyel hasítjuk a PHO5 promotor végénél, T4 polimerázzal tompa végűvé tesszük és Egáljuk egy 5’GGCATGCC szekvenciájú Sphl oligonukleotid kapcsolóval, majd pontosan a fenüek szerint E. coli DH5a-ba transzformáljuk, így alkotva meg a pGIIss-IFNAM119Sph plazmidot.

Az alábbi négy tisztított fragmentumból 50-50 ngot Egálunk együtt a következők szerint:

- A pki promotor területet tartalmazó, 742 bázispáros

BamHI/Nsil fragmentum, a mutált M13mpl8-PK (BamHI-Nsil-PvuII) RF DNS-ből. Az Nsil helyet eltávolítjuk olyan módon, hogy az Nsil-gyel hasított plazmidot T4 polimerázzal kezeljük, mielőtt BamHi-gyel hasítanánk.

- A PGII promotor 3’ végét, a PGII szignál szekvenciát és az IFN gént tartalmazó mintegy 1,1 kbp-s BamHI/Sphl fragmentum a PGIIss-IFNAM119Sph-ból. Mielőtt SPHI-gyel hasítanánk, a BamHI helyet betöltjük T4 polimerázzal.

- A pki gén terminátor területét tartalmazó 417 bp-s SphI/EciRI fragmentum a pGWl 100-E-ből.

- A pTZ18R (Pharmacia) mintegy 2,8 kb-os BamHI/EciRI hasítási fragmentuma.

Az E. coli DH5aF’-be történő transzformálás és átvizsgálás után a PKI-IFN-1- plazmidot azonosítjuk.

4.4 példa:

A pPKl-IFN-1 mutagenezise a pPKI-IFN-2 és pPKlssIFN-2 megalkotására A pPKI-IFN-1- plazmidot egy dut-ung E. coli

BW313 törzsbe transzformáljuk. Ezt felülfertőzzük M13KO7-tel, hogy a plazmidból egyszálú, uracillal helyettesített fágot kapjunk. Ezt a fágot kinyerjük és mutagenizáljuk a fentebb leírtak szerint a két különböző IFN-1, illetve IFN-2 oligonukleotiddal, amelyek szekvenciáját a szekvencialistában a SEQ ID NO. 12, illetve SEQ ID NO. 13. mutatja be. Az IFN-1 oligonukleotiddal végzett mutagenizálás a pPKIssIFN-2-t alakítja ki. Mindkét plazmid tökéletesen keretben levő fúziós terméket tartalmaz. A pPKI-IFN-2 rendelkezik a pki promotorral egy metionin start kodonhoz, majd az IFN gén maradékához fuzionálva, a pPKIssIFN-2 pedig rendelkezik a pki génnel a PGII szignálhoz fuzionálva, amelyet az IFN gén követ. A pPKI-IFN-2 és pPKIssIFN-2 pki promotortól a terminátor területig terjedő területeinek nukleotid szekvenciáit a SEQ ID NO. 14 illetve SEQ ID NO. 15 szekvenciák mutatják be.

HU 210 989 Β

4.5. példa:

A PKI-IFN kifejező plazmid transzformálása Aspergillus nigerbe

A pPKI-IFN-2 és pPKIssIFN-2 plazmidokat együtt transzformáljuk A. niger N593-ba, szelektálható markerként a pGW613 plazmidon levő A. niger pyrA gént alkalmazva, ahogyan ezt már korábban leírtuk.

4.6. példa: A transzformánsok elemzése

A 4.5. példában kapott transzformánsokat IFN termelésre elemezzük Western elemzéssel, amint ezt a

3.2. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy itt anti-PLII antitest helyett IFN ellen kialakult antitestet alkalmazunk.

Deponált mikroorganizmusok

Az E. coli DH5aF’/pGW1100 törzset 1990. január 18-án deponáltuk DSM 5747 számon, az A. niger N593 törzset 1990. január 26-án deponáltuk DSM 5756 számon a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen-nél (Mascheroder Weg lb, D-3300, Braunschweig), a Budapesti Szerződés szerint.

IRODALMI HIVATKOZÁSOK

- Bolivár F., Rodriguez R. L., Greene P. J., Betlach

M. C., Heyneker H. L., Boyer H. W., Crosa J. W. és

Falkow S.: Construction and Characterization of new cloning vehicles II: A multipurpose cloning system, Gene 2:95 (1977).

- BRL: Ml3 Coning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual.

- Bürke R. L., Tekamp-Olson P. és Najarian R.: The isolation, characterization and sequence of the pyruvate kinase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Bioi. Chem., 258: 2193-2201 (1983).

- Dotto P. D. és Zinder N. D.: Natúré 311: 279 (1984).

- Goosen T., Bloemheuvel G., Gysler C., de Bie D. A. van den Broek H. W. J. és Swart K.: Transformation of Aspergillus niger using the homologous orotidine-5’-phosphate-decarboxylase gene, Curr Génét., 77: 499-503 (1987).

- de Graaff L. H., van den Broek H. W. J. és Visser J.: Isolation and transformation of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene. Curr. Génét., 73; 315— 321 (1988).

- de Graaff L. H. The structure and expression of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger. Doktori disszertáció. Agricultural University of Wageningen, Hollandia (1989).

- Horton R. M., Hunt H. D. Ho S. N., Pulién J. K. és Pease C. R.: Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77: 61—68 (1989).

- Kunkel T: Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selestion, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985).

- Maniatis T., Fritsch E. E, Sambrook J.,: Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982).

- Mead és munkatársai; Protein Engeneering 7: 67 (1986).

- Messing J.: A multipurpose cloning system based on single stranded DNA bacteriophage M13. Recomb. DNATechn. Bull 2 (2): 43 (1979).

- Messing J.: New Ml3 vectors fór cloning. Methods in Enzymol., 101C: 20-78 (1983).

- Ner Sarbjit S., Goodin D. B. és Smith M.: Asimple and efficient procedure fór generating random point mutations and fór codon replacements using mixed oligodeoxynucleotides, DNA 7, (2): 127-134 (1988).

- Norrander I, Kempe T. és Messing J.: Construction of improved Ml3 vectors using oligodezoxynucleotide directed mutagenesis. Gene, 26: 101-106 (1983).

- Pharmacia: Manual fór the M13-cloning/sequencing system, including M13mpl8/M13mpl9.

- Peden K. W. C.: Revised sequence of the tetracyclin-resistance gene of pBR322. Gene 22,277-280 (1983).

- Sanger E, Nickelen S. és Coulson A. R.: DNA sequencing with chain terminating inhibitors; Proc. Natl. Acad. USA, 74: 5463-5467 (1977).

- Schmitt J. J. és Cohen Β. N.: Quantitative isolation of restriction fragments from low-melting agarose by Elutip-α affinity chromatography. Analytical Biochemistry 133: 462-464 (1983).

- Slater R. J.: The extraction of totál RNA by the detergent and phenol method. A „Methods in Molecular Biology” című szakkönyv 2. kötetében („Nucleic acids”), a 101-108 oldalon [szerkesztő: Walker J. M„ kiadó: Humana Pressm Cliftar, New Yersey (1985)].

- Sutcliffe J. G.: Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symposia Quant. Bioi. 43: 77-90 (1979).

- Ti-zi Su s Raafat El-Gewely M.: A multisite-directed mutagenesis using T₇-polymerase: application fór reconstruction a mammalian gene, Gene 69: 81-89 (1988).

- van Houdenhoven F. E. A.: Doktori disszertáció. Agricultural University, Wageningen, Hollandia (1975).

- Vishniac W. és Santer: Bacteriol. Rév. 27: 195-213 (1957).

SZEKVENCIA LISTA

SEQIDNO. 1
A SZEKVENCIA	Nukleotid az ennek megfelelő fe-
TÍPUSA:	hérjével együtt
A SZEKVENCIA
HOSSZA:	3605 bp
SZÁLKÉPZÉS:	kettős
TOPOLÓGIA:	lineáris
A MOLEKULA TÍ-
PUSA:	genom
AZ EREDETI
FORRÁS-ORGA-
NIZMUS:	Aspergillus niger N400
KÖZBENSŐ KÍ-	pGWllOO plazmid E. coli
SÉRLETI FORRÁS:	DH5aF7pGWl 100-ból.

HU 210 989 Β

JELLEMZŐ VONÁSOK:	1312-től 1370 bp-ig	2. intron;
1-től 1041 bp-ig	pki promotor terület;	1418-tól 1472 bp-ig	3. intron;
831-től 835 bp-ig	feltétezetett CAAT box;	1545-től 1606 bp-ig	4. intron;
928-től 933 bp-ig	feltételezett TATA box;	1729-től 1828 bp-ig	5. intron;
849-től 1040 bp-ig	CT-ben dús terület; 5	2663-tól 2711 bp-ig	6. intron;
1041-től 3096 bp-ig	a piruvát kináz kódoló területe;	2794-től 2851 bp-ig	7. intron;
1166-tól 1266 bp-ig	1. intron;

AAACCTCCAA ATGGAAGAGA AAACCTCCGA GTACTTACTT	40
AGGGTCCCTG TCTACTGGCC AGAGTCTCGT CCTCATTACT	80
ATGATTAATT ACCCACTGGA CAAAAAAATA AAATAAAATA	120
AAAATAAAAA GGGAGACAGC TTCTCCATAA CTGGCAACTG	160
GGTCCGTCCG AGCAGAGCAA AATTCAGCCT TATGGGTTCC	200
GATGGAGTCA GGGAAATAGT TCTTGCGAAG GGCATTGGGC	240
TTTTTTGCGA GGAGAAAATT CAGCACCGAC AAAGCATCCA	280
AATCCACCTC GCTAGGAGAG AATGGATCCG CGACGATGTG	320
GGGTCAACTG GACAGAGTGA GAGGGTATCA TGTGGTCCTG	360
CCAGATACTT CGCAGAATGT TGTGTGGGTG TCTGATTGTG	400
GCTTGGGCGT GAATTGCTTT TGGTCTTCCC AACCAATTAT	440
TATGCAAGCC GCCGAAGAAA GCCCGAAAAG CCCCGAAGGA	480
AAGGGCCCGA AGAAGGAAGG GAAAAAAGCC GCCGAACCCC	520
GGGCCGAAAA CCCTGGCCGA ACAAGGAAAA AAACCGAACG	560
AAGCAACAAG GGGAACCAAC AACAAAAAAA AAGAACAAAA	600
CAAGGAAAAG GGGAACAACC AACAAAAAAA TGAAGTTTGA	640
AAACCAACCA AAAGGCCCGG GGGGAAAAAA AAGTCATTAA	680
TAATGGGAAT TATGTAGGCG ATGGGAAGTG TGATTGTAAC	720
TACTCCGTAG CTGGAGGCAC AACTAACAAG CCAGCTCTCA	760
ACCCGCGGGG AACCGACCGA CAGAAAAAAG CGTCCCAAAG	800
CAGGAATCCC ACCAAAAAGG GCCGATCCAG CCAATCACCG	840
CCGCCAACAT TTTTCCTTCC CGGGCACCCC TCCTCTAGTC	880
CACCATCTCT CTCTTCTCTC GCTCACCGGC CCCGTCTTTT	920
CCTTCCCTAT TATCTCTCCC TCTTCTCCTC CCTTCTCTCC	960
CTCCATTCTT TCTCCCATCT TCATCAATCC CTTCTCTTCT	1000
GTCTTCCCCC CCGGTTCAGT AGAGATCAAT CATCCGTCAA	1040
G ATG GCC GCC AGC TCT TCC CTC GAC CAC CTG AGC AAC	1077

Met Alá Alá

Ser

Ser 5

Ser Leu Asp His

Leu 10

Ser Asn

CGC

ATG

AAG

TTG

GAG

TGG

CAC

TCC

AAG

CTC

AAC

ACT

1113

Arg

Met

Lys

Leu

Glu

Trp

His

Ser

Lys

Leu

Asn

Thr

15

20

GAG

ATG

GTG

CCC

TCC

AAG

AAC

TTC

CGC

CGC

ACC

TCC

1149

Glu

Met

Val

Pro

Ser

Lys

Asn

Phe

Arg

Arg

Thr

Ser

25

30

35

ATC

ATC

GGA

ACC

ATC

GGTACGTTCC '

TGCCAGTTGT GTCGTTGCGA

1194

Ile

Ile

Gly

Thr

Ile

TTGCCATCTC TTGATGAGGA CCTCGCACCC CGCACTTGAC 1234

CTCATCCGAG CTAACCTGCG ATTTTTCTTC AG GC CCC AAG ACC 1277

Gly Pro Lys Thr 45

AAC TCC GTG GAG AAG ATC AAC TCT CTC CGC ACT 1310

Asn Ser Val Glu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Thr

55

GGTACGAGCG ATAAAACATA TAACCTCTGG GAGTTATCAA 1350

TCAGCTGACT AGCTTGCAG CC GGT CTT AAC GTT GTT CGC ATG 1393

Alá Gly Leu Asn Val Val Arg Met 60

ACC TTC TCC CAC GGT TCT TAT GAG GTAAGAAGGG AACCCATCCG 1437

Asn Phe Ser His Gly Ser Tyr Glu

70

HU 210 989 B

TGCATTGGCA CATGACGATA TGCTGACCCG CCCAG TAC CAC CAA 1481

Tyr His Gin

TCT

GTT

ATC

GAC

AAC

GCC

CGC

GAG

GCC

GCC

AAG

ACC

1517

Ser

Val

He

Asp

Asn

Ala

Arg

Glu

Ala

Ala

Lys

Thr

80

85

CAG

GTC

GGA

CGT

CCT

CTC

GCC

ATT

GCT

CTT

GAT

ACC

1553

Gin

Val

Gly

Arg

Pro

Leu

Ala

He

Ala

Leu

Asp

Thr

90

95

GTAAGTTCGG GTCCCTTGGC TGGTCGCGAT CCTCCAAATT 1593

AACTCCTCTG TAG AAA GGA CCC GAG ATC CGT ACC GGA 1630

Lys Gly Pro Glu lle Arg Thr Gly 100 105

AAC

ACC

CCC

GAT

GAT

AAG

GAT

ATC

CCT

ATC

AAG

CAG

1666

Asn

Thr

Pro

Asp

Asp

Lys

Asp

He

Pro

lle

Lys

Gin

110

115

GGC

CAC

GAG

CTC

AAC

ATC

ACC

ACC

GAC

GAG

CAA

TAT

1702

Gly

His

Glu

Leu

Asn

He

Thr

Thr

Asp

Glu

Gin

Tyr

120

125

130

GCC

ACC

GCC

TCC

GAC

GAC

AAG

AAC

AT GTAAGATTCC

1738

Ala

Thr

Ala

Ser

Asp

Asp

Lys

Asn

Met

135

140

TCCCCGCGTC CTTCCGATCT TGCCAGTGGA TTCGGGAGAC 1778 CAGCGCAGAT GTAGTCTGTG CATAGACTCC GCTGACAAGT 1818 CGGATTGTAG G TAC CTC GAC TAC AAG AAC ATC ACC AAG 1856

Tyt Leu Asp Tyr Lys Asn lle Thr Lys 145

GTG ATC	TCT CCT GGC AAG	CTC ATC TAT	GTT	GAT	GAC	1892
Val lle	Ser Pro Gly Lys	Leu lle Tyr	Val	Asp	Asp
150	155			160
GGT ATC	CTT TCC TTC GAG	GTC CTC GAA	GTC	GTA	GAT	1928
Gly He	Leu Ser Phe Glu	Val Leu Glu	Val	Val	Asp
	165	170
GAC AAG	ACC ATC CGC GTC	CGG TGC TTG	AAC	AAC	GGC	1964
Asp Lys	Thr lle Arg Val	Arg Cas Leu	Asn	Asn	Gly
175		180			185
AAC ATC	TCT TCC CGC AAG	GGT GTT AAC	TTG	CCC	GGC	2000
Asn lle	Ser Ser Arg Lys	Gly Val Asn	Leu	Pro	Gly
	190		195
ACT GAC	GTT GAC CTC CCC	GCC CTT TCC	GAG	AAG	GAC	2036
Thr Asp	Val Asp Leu Pro	Ala Leu Ser	Glu	Lys	Asp
	200	205
ATT GCC	GAT CTC AAG TTC	GGT GTT AGG	AAC	AAG	GTC	2072
He Ala	Asp Leu Lys Phe	Gly Val Arg	Asn	Lys	Val
210	215			220
GAC ATG	GTC TTC GCT TCT	TTC ATC CGC	CGC	GGT	AGC	2108
Asp Met	Val Phe Ala Ser	Phe lle arg	Arg	Gly	Ser
	225		230
GAC ATT	CGC CAC ATC CGT	GAG GTT CTG	GGT	GAG	GAG	2144
Asp lle	Arg His He Arg	Glu Val Leu	Gly	Glu	Glu
235		240			245
GGC AAG	GAG ATC CAG ATC	ATT GCC AAG	ATT	GAG	AAC	2180
Gly Lys	Glu lle Gin lle	lle Ala Lys	lle	Glu	Asn
	250		255
CAG CAG	GGT GTC AAC AAC	TTC GAC GAG	ATC	CTC	GAA	2216
Gin Gin	Gly Val Asn Asn	Phe Asp Glu	lle	Leu	Glu
	260	265
GAG ACT	GAC GGT GTC ATG	GTT GCC CGT	GGT	GAC	CTT	2252
Glu Thr	Asp Gly Val Met	Val Ala Arg	Gly	Asp	Leu
270	275			280

HU 210 989 Β

GGT ATC GAG ATC	CCC GCC	CCC	AAG GTC	TTC ATC GCC	2288
Gly Ile Glu Ile	Pro Alá	Pro	Lys Val	Phe Ile Alá
285			290
CAG AAG ATG ATG	ATC GCC	AAG	TGT AAC	ATC AAG GGT	2324
Gin Lys Met Met	Ile Alá	Lys	Cys Asn	Ile Lys Gly
295		300		305
AAG CCC GTC ATC	TGT GCC	ACT	CAG ATG	CTC GAG TCC	2360
Lys Pro Val Ile	Cys Alá	Thr	Gin Met	Leu Glu Ser
	310			315
ATG ACA TAC AAC	CCT CGT	CCT	ACT CGT	GCC GAG GTG	2396
Met Thr Tyr Asn	Pro Arg	Pro	Thr Arg	Alá Glu Val
320			325
TCC GAT GTT GCC	AAC GCC	GTC	CTT GAC	GGT GCC GAC	2432
Ser Asp Val Alá	Asn Alá	Val	Leu Asp	Gly Alá Asp
330	335			340
TGT GTC ATG CTG	TCG GGA	GAG	ACC GCC	AAG GGT AAC	2468
Cys Val Met Leu	Ser Gly	Glu	Thr Alá	Lys Gly Asn
345		350
TAC CCC AAC GAG	GCC GTC	AAG	ATG ATG	TCC GAG ACC	2504
Tyr Pro Asn Glu	Alá Val	Lys	Met Met	Ser Glu Thr
355		360		365
TGC CTG CTC GCC	GAG GTT	GCC	ATC CCC	CAC TTC AAT	2540
Cys Leu Leu Alá	Glu Val	Alá	Ile Pro	His Phe Asn
	370			375
GTG TTC GAT GAG	CTC CGC	AAC	CTT GCT	CCT CGC CCC	2576
Val Phe Asp Glu	Leu Arg	Asn	Leu Alá	Pro Arg Pro
380			385
ACC GAC ACT GTC	GAG TCC	ATC	GCC ATG	GCT GCC GTT	2612
Thr Asp Thr Val	Glu Ser	Ile	Alá Met	Alá Alá Val
390	395			400
AGC GCC AGT CTG	GAA CTC	AAC	GCT GGT	GCC ATT GTC	2648
Ser Alá Ser Leu	Glu Leu	Asn	Alá Gly	Alá Ile Val
405			410
GTC TTG ATC ACC	AG GTGAGTTGTA AATATCCAGA TGGGTAGGAT	2692
Val Leu Thr Thr	Ser

415

GATTGTCGAC AGATCGCAGC GGT AAA ACT GCT CGC TAC CTT 2733

Gly Lys Thr Alá Arg Tyr Leu 420 425

TCC	AAG TAC CGC CCC GTC TCG CCC ATT	GTC ATG GTT	2769
Ser	Lys Tyr Arg Pro Val Cys Pro Ile	Val Met Val... .
	430	435
ACC	CGT AAC CCC GCT GCC TCC CGG GTAAGTCGAG	2803
Thr	Arg Asn Pro Alá Alá Ser Arg

440 445

AAGCGTAGTG TTGTTTCGAG AGGTCGTGTG CTAACGTGTT 2843

GAATCCAG TAC TCT CAC CTG TAC CGT GGT GTC TGG CCC 2883

Tyr Ser His Leu Tyr Arg Gly Val Trp Pro 450 455

TTC

CTC

TTC

CCC

GAG

AAG

AAG

CCC

GAC

TTC

AAC

GTC

2919

Phe

Leu

Phe

Pro

Glu

Lys

Lys

Pro

Asp

Phe

Asn

Val

460

465

AAG

GTC

TGG

CAG

GAG

GAT

GTT

GAC

CGC

CGT

CTC

AAG

2955

Lys

Val

Trp

Gin

Glu

Asp

Val

Asp

Arg

Arg

Leu

Lys

470

475

TGG

GGT

ATC

AAC

CAC

GCT

CTT

AAG

CTC

GGC

ATC

ATC

2991

Trp

Gly

Ile

Asn

His

Alá

Leu

Lys

Leu

Gly

Ile

Ile

480

485

490

HU 210 989 Β

AAC

AAG

GGT

GAC

AAC

ATC

GTC

TGT

GTC

CAG

GGA

TGG

3027

Asn

Lys

Gly

Asp

Asn

Ile

Val

Cys

Val

Gin

Gly

Trp

495

500

CGC

GGC

GGT

ATG

GGC

CAC

ACC

AAC

ACC

GTC

CGT

GTG

3063

Arg

Gly

Gly

Met

Gly

His

Thr

Asn

Thr

Val

Arg

Val

505

510

515

GTC

CCT

GCT

GAG

GAG

AAC

CTT

GGC

CTG

GCT

GAG

TAA

3099

Val

Pro

Ala

Glu

Glu

Asn

Leu Gly

Leu

Ala

Glu

520 525

ATGCAAAAGC AGTCTGGCAT GCCACCGGTT ACGGTAACGA CAGCGATTGG ATAGAAAGCG GTCTCTGGAT ATCGTAGACC GGTCTCGCCG ACTCAGGTAG TCTCCCCGCG GGCAGGCTGC ACTGCGAGAC TCGTTAGTCG GGGCAGGACG GGAGTGCGCA CTTGCGTCTA CCACCACATT CCGAAACGCG CTGGGGGAAG ACACACACCT ATGTGTATGT ATCTTGATTT GACGTTAGTT GTTTGGTGGA CTTTGCTGCG ATCAAAAGCT GAGTTGTTCA CAATGCCTCG ATGAGATAAA CTGAGTGTCA GTCAGTATGA TTTGTTAGTG CCGAATCCCT TGAGGATCAG TTTCTGAAGG ACCCCCAAGC TGGCTATATA GAAACC

GGTGGATGAC	3139
TCAAGGGTGT	3179
CCATGCCATG	3219
TTGTGTCTTC	3259
AGGAGCACCA	3299
CACTTTGAGC	3339
TGGGAACGTA	3379
AGCCAGCCAT	3419
AGAATTTAAT	3459
GCACAGCATC	3499
GAAATGCATT	3539
TAAACTCATC	3579 3605

SEQIDNO.2		25	SEQ ID NO. 3
A SZEKVENCIA			A SZEKVENCIA	Nukleotid a megfelelő polipeptid-
TÍPUSA:	nukleotid		TÍPUSA:	del együtt
A SZEKVENCIA			A SZEKVENCIA
HOSSZA:	21 bázis		HOSSZA:	821 bp
SZÁLKÉPZÉS:	egyes	30	SZÁLKÉPZÉS:	kettős
TOPOLÓGIA:	lineáris		TOPOLÓGIA:	lineáris
A MOLEKULA TÍ-			A MOLEKULA TÍ-
PUSA:	szintetikus oligonukleotid		PUSA:	genomikus
JELLEZMO VONÁSOK:		AZ EREDETI	A. niger N400
8-tól 13-ig	Nsil hely	35	FORRÁS-ORGA-
1-től 7-ig	komplementer az A. niger pki		NIZMUS:
	1054-1048 nukleotidjaival a SEQ		KÖZBENSŐ KÍ-
	ID NO. 1 szerint		SÉRLETIFOR-	Az E. coli JM109/pGW1800
14-től 21-ig	komplementer az A. niger pki		RÁS:	(DSM 5505)-ből a pGW1800
	1041-1034 nukleotidjaival a SEQ	40	JELLEMZŐ VONÁSOK:
	ID NO. 1 szerint		1-től 203 bp-ig	PGII promotor terület
TULAJDONSÁ-	Az 5926. mutagenikus oligonuk-		204-től 261 bp-ig	szignál peptid
GOK:	leotid egy Nsil hely bevezetésére		262-től 818 bp-ig	a pro-PGII N-terminális része
	az A. niger pki gén 1042-1047		TULAJDONSÁ-	Az A. niger PGH génjének 5’-ter-
	helyeibe	45	GOK:	minális része, amely tartalmazza a
AGCTGGCATG CATCTTGACG G 21			pro-PGII promotor területét, szig-
				nál szekvenciáját és N-terminálisát

AACGAGGATC

GGCAGTTATG

TCGTGAGTAT

TACTTGCTCA

CAACACTCCT

CAGGGTCCTA

AACTTTTCGA

AAGAACCTCG

TCATTCCACA

TCTGTCATTC

CATTTCCTCC

CCGGAAAAGA

TACCTGCTCA

CTCATTCAAA

TTTTCTATTG

AGGGGCTGTC TTCGCAATAG CACTGATGTC ATCTTACCAA TTAACAATTA ATC ATG

MET

120

160

206

CAC	TCG	TTT	GCT	TCT	CTT	CTC	GCC
His	Ser	Phe	Ala -15	Ser	Leu	Leu	Ala
GCC	GGC	GCC	ACC	TTC	GCT	TCT	GCC
Ala	Gly -5	Ala	Thr	Phe	Ala	Ser	Ala

TAC	GGC	CGT	GTC	242
Tyr	Gly	Leu	Val
-10
TCT	CCT	ATC	GAA	278
Ser	Pro	Ile	Glu

HU 210 989 B

GCT

CGA

GAC

AGC

TGC

ACG

TTC

ACC

ACC

GCT

GCC

GCT

314

Alá

Arg

Asp

Ser

Cys

Thr

Phe

Thr

Thr

Alá

Alá

Alá

10

15

GCT

AAA

GCG

GGC

AAG

GCG

AAA

TGC

TCT

ACT

ATC

ACC

350

Alá

Lys

Alá

Gly

Lys

Alá

Lys

Cys

Ser

Thr

Ile

Thr

20

25

30

CTT

AAC

AAC

ATC

GAA

GTT

CCA

GCT

GGA

ACC

ACC

CTC

386

Leu

Asn

Asn

Ile

Glu

Val

Pro

Alá

Gly

Thr

Thr

Leu

35

40

GAC

CTG

ACC

GGT

CTC

ACC

AGC

GGT

ACC

AAG

GTC

ATC

422

Asp

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Val

Ile

45

50

TTC

GAG

GGC

ACC

ACG

ACC

TTC

CAG

TAC

GAA

GAA

TGG

458

Phe

Glu

Gly

Thr

Thr

Thr

Phe

Gin

Pyr

Glu

Glu

Trp

55

60

65

GCA

GGC

CCC

TTG

ATC

TCC

ATG

AGT

GGC

GAA

CAT

ATC

494

Alá

Gly

Pro

Leu

Ile

Ser

Met

Ser

Gly

Glu

His

Ile

70

75

ACC

GTC

ACT

GGT

GCC

TCC

GGC

CAC

CTC

ATC

AAT

TGC

530

Thr

Val

Thr

Gly

Alá

Ser

Gly

His

Leu

Ile

Asn

Cys

80

85

90

GAT

GGT

GCG

CGC

TGG

TGG

GAT

GGC

AAG

GGA

ACC

AGC

566

Asp

Gly

Alá

Arg

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Gly

Thr

Ser

95

100

GGA

AAG

AAG

AAG

CCC

AAG

TTC

TTT

TAC

GCC

CAT

GGC

602

Gly

Lys

Lys

Lys

Pro

Lys

Phe

Phe

Tyr

Alá

His

Gly

105

110

CTT

GAC

TCC

TCG

TCT

ATT

ACT

GGA

TTA

AAC

ATC

AAA

638

Leu

Asp

Ser

Ser

Ser

Ile

Thr

Gly

Leu

Asp

Ile

Lys

115

120

125

AAC

ACC

CCC

CTT

ATG

GCG

TTT

AGT

GTC

CAG

GCG

AAT

674

Asn

Thr

Pro

Leu

Met

Alá

Phe

Ser

Val

Gin

Alá

Asn

130

135

GAC

ATT

ACG

TTT

ACC

GAT

GTT

ACC

ATC

AAT

AAT

GCG

710

Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

Asp

Val

Thr

Ile

Asn

Asn

Alá

140

145

150

GAT

GGC

GAC

ACC

CAG

GGT

GGA

CAC

AAC

ACT

GAT

GCG

746

Asp

Gly

Asp

Thr

Gin

Gly

Gly

His

Asn

Thr

Asp

Alá

155

160

TTC

GAT

GTT

GGC

AAC

TCG

GTC

GGG

GTG

AAT

ATC

ATT

782

Phe

Asp

Val

Gly

Asn

Ser

Val

Gly

Val

Asn

Ile

Ile

165

170

AAG

CCT

TGG

GTC

CAT

AAC

CAG

GAT

GAC

TGT

CTT

GCG

GTT

821

Lys

Pro

Trp

Val

His

Asn

Gin

Asp

Asp

Cys

Leu

Alá

Val

175

180

185

SEQ ID NO. 4	KÖZBENSŐ KÍSÉRLETI FÓR-
A SZEKVENCIA	Nukleotid a megfelelő polipeptid- 50
TÍPUSA:	dél együtt	RAS:	Az E. coli JM109/pGWl 800-ból
A SZEKVENCIA			(DSM 5505) apGW1800
HOSSZA:	653 bp	JELLEMZŐ VONÁSOK:
SZÁLKÉPZÉS:	kettős	1-től 116 bp-ig a pro-PGII C-terminálisának kódoló
TOPOLÓGIA:	lineáris 55	területe
A MOLEKULA TÍ-		TULAJDONSÁ-	A pro-PGII C-terminálisát tartal-
PUSA:	genomikus	GOK:	mazó PGI1 gén 3’-terminális ré-
AZ EREDETI			sze
FORRÁS-ORGA-
NIZMUS:	A. niger N400 60

HU 210 989 B

AG ATC TAT CTT CTT TGC GGG TCT GGT AGC TGC TCG GAC lle Tyr Leu Leu Cys Gly Ser Gly Ser Cys Ser Asp

5

10

TGG

ACC

TGG

GAC

GAT

GTG

AAA

GTT

ACC

GGG

GGG

AAG

74

Trp

Thr

Trp

Asp

Asp

Val

Lys

Val

Thr

Gly

Gly

Lys

15

20

AAG

TCC

ACC

GCT

TGC

AAG

AAC

TTC

CCT

TCG

GTG

GCC

110

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Lys

Asn

Phe

Pro

Ser

Val

Ala

25

30

35

TCT

TGT

TAG

GCTGCTAGGT '

rGGTGAGTTG TAGCCCTAGC

149

Ser

Cys

END

TGAAATTCGT CTGCTTCGTC TGCTTCGTCT	GCTTCGTCTG	189
CTTCGTCTGC TTCTTCTGCT TCGTCTGCTT	TGTCTGCTTT	229
GTCTGCTTCG TCCACTTCGT CCACTTCGAC	TGGTTAGATG	269
GGCCTTGTAA TAGTTTTTAG AGAGAACAGA	ATATGTACAG	309
TAAGCCTTAG AGGTGGTACC GAGTTGTATA	TTTATTTAAA	349
ATGTTACCTA TCGCGTGTCT TTATATTTAT	AGCCTTTTAC	389
ATATATACGG AGCTACAGTG GATTATCTTA	CAGCCCACAC	429
TCATCGTGCT GGGAACTACG TGAATGAATG	CTCGGTTAGA	469
AGGCCTTGCT CACTGCCACA ACCAACCAGG	AACCTTGGCA	509
GGTACATGCT TGGGCATTTT TGTCTGGCCC	TATCTCTTTC	549
CAGATGGTGG TCTGGATGAG TCACGGCACG	AGTAGATTGA	589
CCGCTACTCC AACCCGCGCA TAAAGCATAC	GCCAGAAGTG	629
CAAGGGATAC AAGACAGCCA GCTG		653
	TULAJDONSÁ-	„C” oligonukleotid pontos
SEQIDNO.5	GOK:	PGIIss-IFN AMI 19 fúziós gének
A SZEKVENCIA		megalkotásához
TÍPUSA: nukleotid	30
A SZEKVENCIA	AGGCAGATCA CAAGCGAAGG TGGCGCCGGC GA32
HOSSZA: 20 bázis
SZÁLKÉPZÉS: egyes	SEQIDNO. 7
TOPOLÓGIA: lineáris	A SZEKVENCIA
A MOLEKULA TÍ-	35 TÍPUSA:	nukleotid
PUSA: szintetikus	A SZEKVENCIA
JELLEMZŐ VONÁSOK:	HOSSZA:	272 bázis
azonos SEQ ID NO. 3 szekvenciájú PGII szekven-	SZÁLKÉPZÉS:	egyes, kódoló szál
cia kódoló szálának 1-20 bázisával	TOPOLÓGIA:	lineáris
TULAJDONSA- „A” oligonukleotid precíz PGII	40 A MOLEKULA TÍ-
GOK: fúziók megalkotásához heterológ	PUSA:	rekombináns
génnel, PCR-t alkalmazva	KÖZBENSŐ KÍ-
AACGAGGATC CAGGGTCCTA 20	SÉRLETI FOR-	PCR
SEQIDNO. 6	RÁS:
A SZEKVENCIA	45 JELLEMZŐ VO-	1-tól 203-ig A. niger promotor te-
TÍPUSA: nukleotid	NÁSOK:	rület
A SZEKVENCIA		204-től 258-ig. A. niger PGII
HOSSZA: 32 bázis		szignál szekvencia
SZÁLKÉPZÉS: egyes		259-től 270-ig az IFN BDBB hin-
TOPOLÓGIA: lineáris	50	rid (IFN AMI 19) N-terminálisa
A MOLEKULA TÍ-	TULAJDONSÁ-	A 2. DNS tökéletesen keretben
PUSA: szintetikus	GOK:	tartalmazza az A. niger PGII szig-
JELLEMZŐ VONÁSOK:		nál szekvenciát, és az érett IFN
1-12-ig komplementes az IFN AMI 19-		AMI 19 (BDBB hibrid) 1.-4. N-
nek az érett IFN 1-4. aminosavait	55	terminális aminosavat kódoló gé-
kódoló területével		nek fúziós termékét. Ez A. niger
13—32-ig komplementer a SEQ ID NO. 3		gazdaszervezetekből kiválasztott
szekvenciájú PGII szekvencia kó-		IFN termeléséhez alkalmas kife-
doló szálának 260-241. bázishe-		jező vektorok megalkotásához
lyeivel	60	használható.

HU 210 989 B

AACGAGGATC CAGGGTCCTA CATTTCCTCC AGGGGCTGTC 40 GGCAGTTATG AACTTTTCGA CCGGAAAAGA TTCGCAATAG 80 TCGTGAGTAT AAGAACCTCG TACCTGCTCA CACTGATGTC 120 TACTTGCTCA TCATTCCACA CTCATTCAAA ATCTTACCAA 160 CAACACTCCT TCTGTCATTC TTTTCTATTG TTAACAATTA ATC ATG MET 206

CAC	TCG	TTT	GCT	TCT	CTT	CTC	GCC	TAC	GGC CTG	GTC	242
His	Ser	Phe	Alá	Ser	Leu	Leu	Alá	Tyr	Gly Leu	Val
			-15					-10
GCC	GGC	GCC	ACC	TTC	GCT	TGT	CAT	CTG	CCT		272
Alá	Gly	Alá	Thr	Phe	Alá	Cys	Asp	Leu	Pro
	-5

SEQIDNO. 8	15	JELLEMZŐ VO	komplementer az IFN AMI 19
A SZEKVENCIA			NÁSOK:	(BDBB hibrid) gén kódoló szála
TÍPUSA:	nukleotid			3’ nem-kódoló területében lévő
A SZEKVENCIA				kitérj esztésssel.
HOSSZA:	32 bázis		TULAJDONSÁ-	„F” oligonukleotid az IFN
SZÁLKÉPZÉS:	egyes	20	GOK:	AMI 19 kifejezésére szolgáló ki-
TOPOLÓGIA:	lineáris			fejező vektorok megalkotásához.
A MOLEKULA TÍ-
PUSA:	szintetikus		CCTGGGGGAA	TTCAAAGTCA 20

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1-12.	bp-ig azonos a SEQ ID NO. 3	25	SEQIDNO. 10
	szekvenciájú PGII gén kódoló		A SZEKVENCIA	nukleotid, aminosavakkal
	szálának 249,-261. bázisaival		TÍPUSA:
13-32.	bp-ig azonos az érett IFN AMI 19		A SZEKVENCIA	133 bázis
	(BDBB hibrid) 1.-7. N-terminális		HOSSZA:
	aminosavait kódoló területtel.	30	SZÁLKÉPZÉS:	egyes
TULAJDONSÁ-	„D” oligonukleotid az A. niger		TOPOLÓGIA:	lineáris
GOK:	PGII szignál szekvencia kódoló		A MOLEKULA TÍ-
	terület és az IFN AMI 19 pontos		PUSA:	rekombináns
	keretben fuzionált termékeinek		JELLEMZŐ VONÁSOK:
	megalkotására	35	1-12-ig	az A. niger PGII szignál peptid C-terminálisa
GCCACCTTCG CTTGTGATCT GCCTCAGACT CA32		13-133-ig	az érett IFN AMI 19 (BDBB hib-
			TULAJDONSÁ-	rid)
SEQ ID NO. 9			A 3. DNS az A. niger szignál
A SZEKVENCIA		40	GOK:	szekvencia C-terminálisának és
TÍPUSA:	nukleotid			az IFN AMI 19 (BDBB hibrid)-
A SZEKVENCIA				nek tökéletesen keretben levő fú-
HOSSZA:	20 bázis			ziós termékét tartalmazza. Fel-
SZÁLKÉPZÉS:	egyes			használható az A. niger gazda-
TOPOLÓGIA:	lineáris	45		szervezetekből kiválasztott IFN
A MOLEKULA TÍ-				termelésére alkalmas kifejező
PUSA:	szintetikus			vektorok megalkotására.

GCC

ACC

TTC

GCT

TGT

GAT

CTG

CCT

CAG

ACT

CAC

AGC

36

Alá

Thr

Phe

Alá

Cys

Asp

Leu

Pro

Gin

Thr

His

Ser

CTG

GGT

AAC

AGG

AGG

GCC

TTG

ATA

CTC

ATG

GCA

CAA

72

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Alá

Leu

Ile

Leu

Leu

Alá

Gin

ATG

CGA

AGA

ATC

TCT

CCT

TTC

TCC

TGC

CTG

AAG

GAC

108

Met

Arg

Arg

Ile

Ser

Pro

Phe

Ser

Cys

Leu

Lys

Asp

AGA

CAT

GAC

TTT

GAA

TTC

CCC

CAH

G

133

Arg

His

Asp

Phe

Glu

Phe

Pro

Gin

HU 210 989 Β

SEQIDNO. 11

A SZEKVENCIA nukleotid TÍPUSA:

A SZEKVENCIA 390 bp

HOSSZA:

SZÁLKÉPZÉS: kettős

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍ- rekombináns

PUSA:

KÖZBENSŐKÉ PGIIssIFN AMI 19 plazmid SÉRLETI FORRÁS:

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1-178 bp-ig A. niger PGII promotor

199-255 bp-ig A. niger PGII szignál szekvencia

256-753 bp-ig 756-984 bp-ig 1-6 bp-ig 364-396 bp-ig

885-990 bp-ig

TULAJDONSÁGOK·.

érett IFN AMI 19 (BDBB hibrid) élesztő PH05 terminátor BamHI Hely EciRI hely PstI hely

A pPGIIssIFN AMI 19 BamHIPstl fragmentuma tartalmazza a PCR-rel kialakított BamHI-EcoRI helyet, és a fragmentum tökéletesen keretben tartalmazza a PGII szignál szekvencia és az interferon AMI 19 (BDBB hibrid) struktúrgén fúziós termékét a PGII promotorhoz és a PH05 terminátorhoz kapcsolva.

GG ATCCAGGGTC CTACATTTCC TCCAGGGGCT GTCGGCAGTT 42

ATGAACTTTT CGACCGGAAA AGATTCGCAA TCGTACCTGC TCACACTGAT GTCTACTTGC AAAATCTTAC CAACAACACT CCTTCTGTCA TTAATCATGC ACTCGTTTGC TTCTCTTCTC CGCCACCTTC GCTTGTGATC TGCCTCAGAC GGGCCTTGAT ACTCCTGGCA CAAATGCGAA CTGAAGGACA GACATGACTT TGAATTCCCC ACAGTTCCAG AAGGCTCAAG CCATCTCTGT AGATCTTCAA CCTCTTTACC ACAAAAGATT GACCTCCTAG ACAAATTCTG CACCGAACTC GGAGTCCTGT GTGATGCAGG AAGTGGGGGT ACGAGGACTC CATCCTGGCT GTGAGGAAAT TATCTGACAG AGAAGAAATA CAGCTCTTGT AGAAATCATG AGATCCTTCT CTTTATCAAT AGAGTAAGGA ATGAGACCTG GTACAACACG ATACAGCAGC TCACACTTCG TCGAGGGTCA GAATTGACCT TCTACTGGGA CTGGAACACT ATTGAGACAA TAGTTTTGTA TAACTAAATA ATACCCAAAT TTTTTATCTA AATTTTGCCG

TAGTCGTGAG TATAAGAACC	92
TCATCATTCC ACACTCATTC	142
TTCTTTTCTA TTGTTAACAA	192
GCCTACGGCC TGGTCGCCGG	242
TCACAGCCTG GGTAACAGGA	292
GAATCTCTCC TTTCTCCTGC	342
CAGGAGGAGT TTGATGATAA	392
CCTCCATGAG ATGATCCAGC	442
CATCTGCTGC TTGGGATGAG	492
TACCAGCAGC TGAATGACCT	542
GATAGAGTCT CCCCTGATGT	592
ACTTCCAAAG AATCACTCTA	642
GCCTGGGAGG TTGTCAGAGC	692
CAACTTGCAA AAAAGATTGA	742
GAAATGATTC TTATAGACTA	792
GCAGCGTCAG TAACTCTACT	842
ACTCATTACA ACGCCAGTCT	892
ATATTGGAAA CTAAATACGA	942
AAAGATTAAA ATCTGCAG	990

SEQIDNO. 12	SEQIDNO. 13
A SZEKVENCIA			A SZEKVENCIA
TÍPUSA:	nukleotid	40	TÍPUSA:	nukleotid
A SZEKVENCIA			A SZEKVENCIA
HOSSZA:	45 bázis		HOSSZA:	42 bázis
SZÁLKÉPZÉS:	egyes		SZÁLKÉPZÉS:	egyes
TOPOLÓGIA:	lineáris		TOPOLÓGIA:	lineáris
A MOLEKULA TÍ-		45	A MOLEKULA TÍ-
PUSA:	szintetikus		PUSA:	szintetikus

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1-16. bp-ig

17-19 bp-ig 20-25 bp-ig

TULAJDONSÁGOK:

azonos a pki promotor terület (SEQ ID NO. 1) 1026-1041 bázisaival ATG start kodon az érett IFN AMI 19 (BDBB hibrid) 1-9. aminosavait kódoló terület Az IFN-1 oligonukleotid az A. niger pki promotor és az IFN AM 119 struktúrgén tökéletesen keretben levő fúziós termékeinek előállítására alkalmas, PCR-t alkalmazva.

TCAATCATCC GTCAAGATGT GTGATCTGCC

TCAGACTCAC

AGCCT

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1-21. bázisig azonos a pki gén (SEQ ID NO. 1, promotor terület) 1031.-1041 bázisaival

22-42. bázisig azonos PGII gén (SEQ ID NO. 3 szignál szekvencia) kódoló szálának 204.-224. bázisaival.

TULAJDONSA- Az IFN-2 oligonukleotid az A. niGOK: ger pki promotor és az A. niger

PGII szignál szekvencia tökéletesen keretben levő fúziós termékeinek előállítására alkalmas, PCRt alkalmazva

Claims (24)

1. Eljárás A. niger piruvát kináz transzkripciós (pki) promotor, amely a SEQ ID NO. 1 DNS szekvenciájának 1-1042. nukleotidjai között helyezkedik el, vagy valamely promotor aktivitású fragmentuma előállítására, azzal jellemezve, hogy egy ennek megfelelő DNS szekvenciát állítunk elő in vitro szintézissel vagy rekombináns DNS technikával, vagy az említett DNS szekvenciát egy ilyen DNS szekvenciát tartalmazó gazdaszervezetből izoláljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO. 1 szekvenciában a 300. és 1042. nukleotid között elhelyezkedő fragmentumot állítjuk elő.

3. Eljárás a SEQ ID NO. 1 DNS molekula 1-1042. nukleotidjai között elhelyezkedő pki promotor valamely promotor aktivitású származékának előállítására, ismert módon, azzal jellemezve, hogy az említett DNS molekula mutánsát, rekombináns származékát vagy a DNS molekula mutánsának rekombináns származékát, vagy mindezek promotor aktivitású fragmentumát állítjuk elő.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pki promotortól lefelé elhelyezkedő új restrikciós enzim hasító helyet tartalmazó, amely a pki promotorhoz működőképesen kapcsolódó struktúrgén beiktatására használható, mutánst állítjuk elő.

5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M13mpl8-PK (BamHI-NsI-PvuII) RF DNSben levő 742 bp BamHI/NsI promotor aktivitású fragmentumot állítjuk elő.

6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pki promotor aktivitású DNS molekula 3 és/vagy 5 végéhez rögzítve valamely oligonukleotid kapcsolót tartalmazó rekombináns származékot állítjuk elő.

7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns származékként olyan rekombináns származékot állítunk elő, amely valamely pki promotort és valamely homológ vagy heterológ struktúrgént tartalmaz, intronokkal vagy intronok nélkül, azzal a feltétellel, hogy a homológ pki struktúrgén működőképesen kapcsolódik a pki promotorral, valamint kívánt esetben valamely oligonukleotid kapcsolóval és/vagy a pki promotoron kívül további kifejeződést szabályozó szekvenciával, mely a pki promotorhoz hasonlóan szintén működőképesen kapcsolódik az említett struktúrgénnel.

8. Eljárás hibrid vektor előállítására, amely beiktatásként tartalmazza a SEQ ID NO. 1 DNS szekvenciájának 1-1042. nukleotidjai között található pki promotort vagy valamely promotor aktivitású fragmentumát, azzal a megkötéssel, hogy ez a pGWl 100-tól eltérő, azzal jellemezve, hogy valamely, a genetikai manipulációkban használatos linearizált vektort Egálunk a SEQ ID NO. 1-1042. nukleotidjai között található A. niger piruvát kináz transzkripciós (pki) promotorral vagy ennek promotor aktivitású fragmentumaival, a ligálási keverékkel megfelelő gazdasejtet transzformálunk, a transzformánsokat azonosítjuk és/vagy szelektáljuk és a hibrid vektort izoláljuk.

9. Eljárás hibrid vektor előállítására, mely beiktatásként tartalmazza a SEQ ID NO. 1 DNS szekvenciájának 1-1042. nukleotidjai között elhelyezkedő pki promotor valamely promotor aktivitású származékát, amely az említett DNS molekula mutánsa, rekombináns származéka vagy a DNS molekula mutánsának rekombináns származéka, vagy mindezek még promotor aktivitást megőrző fragmentuma, azzal a megkötéssel, hogy ez a pGWllOOtól eltérő, azzal jellemezve, hogy valamely, a genetikai manipulációkban használatos linearizált vektort a SEQ ID NO. 1-1042. nukleotidjai között található A. niger piruvát kináz transzkripciós (pki) promotorral vagy ennek promotor aktivitású fragmentumaival Egálunk, a ligálási keverékkel megfelelő gazdasejtet transzformálunk, a transzformánsokat azonosítjuk és/vagy szelektáljuk és a hibrid vektort izoláljuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás olyan hibrid vektor előállítására, mely az A. niger piruvát kináz struktúrgéntől eltérő struktúrgént tartalmaz, amely működőképesen kapcsolódik az 1. igénypont szerinti pki promoterrel, vagy promotor aktivitással rendelkező fragmentumával vagy származékával, azzal jellemezve, hogy a pki promotonal együtt az említett struktúrgént is Egáljuk.

11. A 8. igénypont szerinti eljárás pPKI-IFN-2 hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy vektorként pGWllOO (DSM 5747), pGW1800 (DSM 5505) és pJDB207-IFNAM 119 plazmidokat használunk.

12. A 8. igénypont szerinti eljárás pPKJssIFN-2 hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a pki promotorral együtt az INF-2 struktúrgént is Egáljuk.

13. A 8. igénypont szerinti eljárás a pPK-PLB hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy vektorokként pGW83O (DSM 4389) és M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) plazmidokat használunk.

14. A 9. igénypont szerinti eljárás M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy vektorként pGWlOO és M13mpl8 plazmidokat használunk.

15. A 9. igénypont szerinti eljárás M13mpl8-PK (BamHI-PvuII) hibrid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy vektorként pGWlOO és M13mpl 8 plazmidokat használunk.

16. Eljárás valamely hibrid vektorral, amely vektor beiktatásként tartalmazza a SEQ ID NO. 1 11042. nukleotidjai között található pki promotort vagy valamely promotor aktivitású fragmentumát, azzal a megkötéssel, hogy ez PGWl 100-tól eltérő, vagy a SEQ ID NO. 1 1-1042. nukleotidjai között található DNS molekula mutánsának rekombináns származékát vagy valamely promotor aktivitással rendelkező fragmentumát, azzal a megkötéssel, hogy ez PGWl 100-tól eltérő, [transzformált gazdaszervezet előállítására], azzal jellemezve, hogy megfelelő gazdaszervezetet transzformáló körülmények között kezelünk a fenti hibrid vektorral, kívánt esetben valamely szelekciós marker génnel együtt.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás [pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2 vagy pPK-PLB hibrid vektorral], azzal jellemezve, hogy E. coli JM 101 törzset transzformálunk.

HU 210 989 Β

18. A 16. igénypont szerinti eljárás [pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2 vagy pPK-PLB hibrid vektorral transzformáinak], azzal jellemezve, hogyE. coli DH5a törzset.

19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Aspergillus niger An 8 törzset pPK-PLB, pPKI-IFN-2 vagy pPKIssIFN-2 hibrid vektorral és adott esetben pGW613 vagy pCG59D7 szelekciós marker plazmáddal transzformálunk.

20. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Aspergillus niger N 593 törzset pPK-PLB, pPKI-IFN-2 vagy pPKIssIFN-2 hibrid vektorral és adott esetben pGW613 vagy pCG59D7 szelekciós marker plazmiddal transzformálunk.

21. Eljárás polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló struktúrgént működőképesen összekapcsoljuk az 1. igénypont szerint előállított pki promotorral vagy valamely promotor aktivitású fragmentumával vagy a 3. igénypont szerint előállított DNS molekula valamely promotor aktivitású mutánsával, rekombináns származékával vagy a DNS molekula mutánsának rekombináns származékával, vagy annak promotor aktivitással rendelkező fragmentumával, és a kapcsolási terméket megfelelő gazdaszervezetben kifejezzük.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a BDBB humán hibrid interferont kódoló struktúrgént kapcsoljuk és fejezzük ki.

23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A. niger pektin liázt kódoló struktúrgént kapcsoljuk és fejezzük ki.

24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A. niger poligalakturonáz enzimet kódoló struktúrgént kapcsoljuk és fejezzük ki.