KR0157411B1 - 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

폴리펩티드의 제조방법

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KR0157411B1 KR1019900021723A KR900021723A KR0157411B1 KR 0157411 B1 KR0157411 B1 KR 0157411B1 KR 1019900021723 A KR1019900021723 A KR 1019900021723A KR 900021723 A KR900021723 A KR 900021723A KR 0157411 B1 KR0157411 B1 KR 0157411B1
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베르너 발데그
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Abstract

본 발명은 유전 공학 분야에 관한 것으로 진균 프로모터를 포함하는 신규한 DNA 분자를 제공한다. 신규한 DNA 분자는 사상균 내에서 유전자를 발현하는 하이브리드 벡터의 작제에 유용하다.
본 발명의 목적을 아스퍼길러스, 니거 pki 프로모터를 포함하는 신규한 DNA 분자, 상기 프로모터의 조절하에 있는 구조 유전자 발현에 유용한 하이브리드 벡터, 신규한 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주 및, 신규 DNA 분자, 하이브리드 벡터 및 형질전환된 숙주의 제조 방법 및 상기 형질전환된 숙주로 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법이다.

Description

폴리펩티드의 제조방법
본 발명은 유전공학의 분야에 관한 것이며 진균 프로모터를 포함하는 신규 DNA 분자를 제공한다. 신규 DNA 분자는 사상균내에서 유전자를 발현하는 하이브리드 벡터의 작제에 유용하다.
유전 공학에서, 원핵 및 진핵 숙주를 위한 많은 폴리펩티드 발현 시스템이 이미 공지되어 있음에도 불구하고, 공지된 시스템 이상의 잇점을 갖는 신규 시스템이 계속해서 요구되고 있다.
원핵 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 진핵 효모[예 : 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)]가 숙주로서 매우 널리 사용되는데, 왜냐면 대부분이 플라즈미드인, 많은 수의 상이한 발현 벡터가 개발되어 있기 때문이다. 이. 콜라이 숙주의 결점은 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없다는 것이다. 효모는 글리코실화할 수 있지만, 이. 콜라이처럼 종종 폴리펩티드를 영양 배지내로 분비하지 못하며, 이를 단지 주변 세포질 공간으로만 분비한다. 포유동물의 암세포와 같은 고등한 진핵 숙주는 글리코실화하여 영양 배지로 분비할 수 있지만, 이의 배양이 매우 느리고 비싸며 종양원성 핵산이 목적하는 펩티드와 함께 분리될 수 있는 위험이 존재한다.
다른 숙주에 대한 연구에서, 사상균[예 : 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 및 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger)]가 조사되어 왔다. 유전 공학에 있어서 이들의 적용은 주로 적당한 형질전환 시스템의 부족 때문에 뒤떨어져 있다. 사카로마이세스 세레비지애와는 반대로, 사상균은 기본적으로 외부 유전자의 도입에 사용될 수 있는 플라즈미드를 포함하지 않는다. 그러나, 선별성 마커를 포함하는 외부 플라즈미드를 사용하여 사상균을 형질전환하는 것은 가능하다. 지금까지 기술된 사상균을 위한 거의 모든 벡터들은 대부분의 효모의 벡터와 같이 자동 복제하지 않지만, 진균 염색체내로 통합된다. 이런 현상은 단지 낮은 빈도로만 발생함에도 불구하고, 유리하게도 통합에 의한 형질 전환은 비-선별적 조건에서 조차, 형질전환체가 유사분열상 대단히 안정하도록 한다. 100여개 이상의 복제물의 안정된 통합이 보고되어 있다.
유성 주기를 가지므로 고전적인 유전자 조작에 수정을 가할 수 있는 아스퍼길러스 니둘란스에 있어서, 영양 요구성 마커 또는 우성 선별 마커에 근거한 음성 및 양성 선별 시스템 모두가
엔. 크라사(N. Crassa) 또는 에이. 니둘란스(A. Nidulans)에 비해, 에이. 니거(A. Niger)는 예를 들어, 식품 공업에서 사용하기 위한, 효소의 공업적 생산에서 매우 광범위하게 사용되므로, 훨씬 중요한 유기체이다. 에이. 니거는 다양한 가수분해 효소(예 : 글루코아밀라제, α-아밀라제, 펙티나제, 셀룰라제, β-글루카나제, β-갈락토시다제, 나린기나제, 펜토사나제, 산프로테아제, 및 리그니나제)를 분비하며, 글루코아밀라제 및 펙티나제 복합체가 가장 중요한 효소이다.
에이. 니거에서의 고전적 돌연변이 및 선별 방법은 가수분해 효소의 분비에 있어서 광범위한 균주의 개선이 이루어지도록 했다. 에이. 니거는 공지된 유성 주기를 가지고 있지 않다. 돌연변이는 선택된 이배체에서 감수분열 재조합에 이은 반수체화를 경유하여야만 달성될 수 있다.
에이. 니둘란스로부터 수득된 이종의 amds 유전자 [참조 : Kelly and Hynes, EMBO J. 4, 475, 1985]와 argB 유전자 [참조 : Buxton et al., Gene 37, 207, 1985 ; EP 184 438 ; WO 86/06097] 및 동종의 pyrA 유전자 [참조 : van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71-75, 1987 ; Goosen et al., Curr. Genet. 11, 499-503, 1987]는 에이. 니거 형질전환에 대한 선별성 마커로서 사용되어 왔다.
에이. 니거는 펙틴 분해 효소(예 : 폴리갈락투로나제, 펙틴 리아제 또는 펙틴 에스테라제)의 공업적 생산을 위해서 가장 중요한 생물이다.
과일 및 야채 가공(표1)에서 펙틴, 리아제, 펙틴 에스테라제, 폴리갈락투로나제 및 이의 효소 혼합물의 적용은, 압착시 쥬스와 색소의 고수율을 확보하게 하는 부드러운 과일의 처리 및 원료 압착 쥬스의 정화를 위해서 펙틴 효소의 원래 용도로부터 개발되어 왔다. 이러한 공정을 위해 사용되는 기술적 효소 제제는 다른 효소들(예 : 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 셀룰라제, β-1,4-글루카나제, 글리코시다제 및 프로테아제)과 함께 다양한 양의 펙틴에스테라제, 폴리 갈락투로나제 및 펙틴 리아제를 포함한다.
과일 및 야채 산업에서 폴리갈락투로나제 및 이의 혼합물의 용도.
펙틴 효소 및 셀룰로오스 분해성 효소의 사용을 통해 과일 펄프의 세포벽은 거의 완전한 액화해될 수 있다. 펙틴효소 뿐만 아니라 엔도 및 엑소-β-1,4-글루카나제
폴리갈락투로나제 및 이의 효소 혼합물은 생물량의 액화 및 당화, 예를 들어, 식물 세포로부터의 발효가능한 다당류의 생산[참조 : Beldman, G. et al., Enzyme Micros. Technol. 6, 503-507, 1984] 또는 펙틴의 변형[참조 : Voragen A.G.J. Food enzymes : prospects and limitations. In : Roozen J.P. et al., op. Cit]에 유용하다.
에이. 니거에서, 펙틴 복합체의 단백질은 일정하게 발현되지 않는다. 단 다른 탄소원(예 : 글루코오즈 또는 슈크로오즈)이 제한적인한, 유도 조건하에서, 즉, 펙틴 또는 이의 분해산물의 존재하에서, 에이. 니거는 상기 효소를 발현한다.
에이. 니거 및 이의 효소의 공업적 중요성 때문에 균주 개선 및/또는 동종 또는 이종 유전자 생성물의 제조를 위한 신규의 에이. 니거 발현 시스템이 계속해서 요구된다. 예를 들어, 개별적 펙틴 분해 효소 또는 이의 규정된 혼합물의 제조가 가장 중요하다.
본 발명은 사상균, 특히 에이. 니거에서 동종 또는 이종 구조 유전자의 발현을 위한 신규 벡터의 작제용으로 사용될 수 있는 에이. 니거의 피루베이트 키나제 유전자(pki)로부터 유도된 유리한 프로모터를 포함하는 신규 DNA 분자를 제공한다.
에이. 니거의 피루베이트 키나제[참조 : 체계명 ATP : 피루베이트 포스포트랜스페라제, EC 2.7.1.40]를 암호화하는 유전자는 높게 발현되며, 이 사실은 전사가 강한 프로모터의 조절하에 이루어짐을 나타낸다.
효모 피루베이트 키나제 유전자의 암호화 영역으로부터의 단편과 하이브리드화한 에이. 니거 N 400의 게놈의 5kb BglⅡ/Hind Ⅲ 제한 단편이 클론되었다. 수득한 클론을 pGW 1100이라 명명했다. 선별 마커로서 pyr A 유전자를 포함하는 플라즈미드 pGW 613 및 pGW 1100을 사용한 공형질전환 실험에서는 조사된 11개의 형질전환체 중 8개에서 피부베이트 키나제의 수준이 증가되었다. 이러한 결과로부터 pGW 1100이 에이. 니거 피루베이트 키나제를 암호화하고 완전한 작용 유전자를 포함
이러한 선행 기술에서 출발하여, pki 프로모터를 포함하는 신규 DNA 분자가 본 발명에서 개발되어 동종 유전자 생성물(예 : 펙틴 리아제)의 과생산, 또는 에이. 니거에서 이종 구조 유전자(예 : 인터페론 유전자)의 발현을 위한, 신규 발현 벡터의 작제에 사용되었다.
본 발명의 목적은 에이. 니거 pki 프로모터를 포함하는 신규 DNA분자, 상기 프로모터의 조절하에서 구조 유전자의 발현을 위해 유용한 하이브리드 벡터, 신규 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주, 및 신규 DNA 분자, 하이브리드 벡터, 및 형질전환된 숙주의 제조방법과 상기 형질전환된 숙주를 사용한 재조합 폴리펩티드의 제조 방법이다.
[에이. 니거 피루베이트 키나제 프로모터를 포함하는 DNA 분자]
본 발명은 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자내에 포함되어 있는 에이. 니거 피루베이트 키나제(pki) 프로모터, 또는 프로모터 활성을 갖는 이의 유도체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터를 포함하는 에이. 니거의 전체 작용성 피루베이트 키나제 유전자 pki를 포함한다. pki 프로모터는 뉴클레오타이드 1번 위치에서 부터 1042번 위치에 있는 피루베이트 키나제에 대한 암호화 영역의 첫번째 뉴클레오타이드까지 걸쳐있다. pki 프로모터는 조절 단백질 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제와 결합하며 이들과 작동적으로 연결되어 있는 구조 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 에이. 니거 pki 프로모터는 강한 프로모터이다.
따라서, 본 발명은 위치 약 1번 위치에서 약 1042번 위치까지 걸쳐있는 뉴클레오타이드 서열의 DNA 분자, 조절될 수 있거나 조절될 수 없는 프로모터 활성을 보유한 이 프로모터의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.
에이. 니거의 완전한 pki 프로모터는 전사 수준이 상기 프로모터를 포함하는 에이. 니거 세포를 배양하는데 사용되는 탄소원에 의존적이도록 하는 조절 요소를 포함하기 때문에 조절될 수 있다. 글루코오즈 신생합성적 탄소원(예 : 아세테이트)의 사용은 낮은 수준의 전사를 초래하는 반면 글루코오즈 분해적 탄소원(예 : 글루코오즈)는 높은 수준의 전사를 초래한다.
서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열내에 포함되어 있는 프로모터에서, 잠재적 TATA box는 뉴클레오타이드 927번 위치와 934번 위치 사이에, 잠재적 CAAT box는 830번 위치와 836번 위치 사이에 그리고 연장된 CT 풍부 영역(CT 블록)은 848번 위치와 1041번 위치 사이에 위치한다. 연장된 CT 풍부 영역은 효모 및 진균에서 기원하는 많은 고발현 유전자들의 프로모터/조절 영역내에서 발견될 수 있다.
본 발명의 단편은 예를 들어, 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열에서, 1번 위치에서 약 950번 위치까지의 뉴클레오타이드 중 어느것에서 시작하여 약 1041번 위치의 뉴클레오타이드로 종결되는 프로모터 활성을 갖는 단편들의 그룹중에서 선택되는 단편이다. 상기 뉴클레오타이드 서열에서, 약 300번 위치에 있는 뉴클레오타이드에서부터 시작하여 약 1041번 위치에 있는 뉴클레오타이드로 종결되는 단편이 바람직하다. 본 발명의 단편은, 예를 들어, 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열 내에 위치하는 제한 효소 절단 부위[예 : Bam HI 부위(약 300번 위치에 있음) 또는 다음 부위들(대략적으로 괄호안에 있는 위치에 있음) : Sph I (441), Sma I (859), Xma I (859)]에서 시작할 수 있다.
가장 바람직한 단편은 약 300번 위치에 위치하는 Bam HI 부위에서 시작하여 1041번 위치에까지 걸쳐있는 단편이다. 이 단편은 약 300번 위치에 있는 Bam HI 부위에서부터 약 1352번 위치에 있는 Puv Ⅱ 부위로까지 걸쳐있고 이후의 실시예에서 제한 효소 절단 부위를 삽입하기 위한 것으로 사용되는 Bam HI/Pvu Ⅱ 단편의 부분이다.
본 발명에 따른 유도체는 예를 들어, 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA 분자내에 포함되는 pki 프로모터 또는 이의 단편의 돌연변이체, 재조합 유도체, 또는 돌연변이체의 재조합 유도체이다. 본 발명에 따른 유도체는 조절될 수 있거나 없는 pki 프로모터 활성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 돌연변이체는 자연 발생적일 수 있거나 바람직하게는 인공적 돌연변이체이다. 본 발명의 pki 프로모터의 돌연변이체는 특히 예를 들어, 제한 효소 NsiI, BamHI, EcoRI, Hind Ⅲ, Pst I, Sal I, Nco I 등을 위한 새로운 제한 효소 절단 부위를 갖는 것들이다. 작동적으로 연결되어 있는 프로모터의 구조 유전자 3'를 삽입하는데 사용될 수 있는, 서열 동정 번호 제1번의 서열의 약 1041번 위치내에 또는 약 1041번 위치에 있는 새로운 제한 효소 절단 부위를 포함하는 돌연변이체가 바람직하다. 그러한 돌연변이체는 예를 들어, 서열 동정 번호 제2번의 뉴클레오타이드 서열이 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열내 1034번 위치와 1054번 위치 사이에 걸쳐 있는 서열과 대체되어 NsiI 부위가 서열 동정 번호 제1번의 1041번 위치에 바로 인접하게 위치됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 돌연변이체는 또한, 본원에서 전술한 의미를 갖는 단편의 돌연변이체이다. 단편의 바람직한 돌연변이체는 pki 프로모터의 하부 스트림에 프로모터에 대한 구조 유전자를 작동적으로 연결하기 위한 새로운 제한 효소 절단부위를 포함한다. 단편의 이러한 바람직한 돌연변이체는 예를 들어, M 13mp 18-PK(Bam HI-NsiI-Pvu Ⅱ)RF DNA내에 포함되어 있는 1053 bp Bam HI/Pvu Ⅱ 단편 또는 742 bp Bam HI/Nsi I 단편에 포함되어 있다. M 13mp 18-PK(Bam HI-NsiI-Pvu Ⅱ)의 1053 bp Bam HI/Pvu Ⅱ 단편은 서열 동정 번호 제2번의 서열이 1034번 위치에서부터 1054번 위치까지의 뉴클레오 타이드와 대체됨으로서 돌연변이된 서열 동정 번호 제1번의 서열의 약 300번 위치에 있는 Bam HI 부위에서부터 약 1352번 위치에 있는 Pvu Ⅱ 부위까지의 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 742 bp Bam HI/NsiI 단편은 치환되는 영역내에 상기 Bam HI 부위에서부터 상부로 NsiI 부위까지에 걸쳐있다.
두개 돌연변이체 모두에서, Nsi I 부위는 서열 동정 번호 제1번의 1041번 위치에 바로 인접하게 위치한다.
본 발명에 따른 유도체는 또한 재조합 DNA 분자이다. 이러한 재조합 DNA 분자는 예를 들어, 다른 DNA 분자(예 : 벡터 서열)에 대해 성공적인 연결을 제공하는 pki 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 DNA 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 부착되어 있는 올리고뉴클레오타이드 링커를 포함함을 특징으로 한다. 링커는 하나 이상의 제한 효소 절단 부위 및/또는 부분적으로 일본쇄말단 점성 말단 및/또는 평활 말단을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유도체는 pki 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 DNA 분자 및 pki 프로모터와 작동적으로 연결되어 있는, 인트론을 가지고 있거나 가지고 있지 않은 동종 또는 이종 구조 유전자 및 임의로 뉴클레오타이드 링커를 포함하는 재조합 DNA 분지이다. 본 발명에 따른 유도체는 또한 상기 구조 유전자와 작동적으로 연결되는 pki 프로모터 이외에 추가의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 조절 서열은 예를 들어, 인핸서, 전사 종결자, 리보좀 결합 영역, 번역 개시 부위 또는 번역 종결 부위, 또는 시그날 서열(예 : PLA, B, C 또는 D를 위한 에이. 니거 펙틴 리아제 유전자의 시그날 서열, 또는 PGI, PGC 또는 PGⅡ를 위한 에이. 니거의 폴리갈락투로나제 유전자의 시그날 서열)이다.
동종의 구조 유전자들은 에이. 니거로부터 기원한 것들이다. 이들은 예를 들어, 바람직하게는 공업(예 : 식품 및 사료 공업)에 유용한 효소를 암호화한다. 이러한 효소들에는 예를 들어, 펙틴 분해적 효소들(예 : 펙틴 에스테라제, 엔도 및 엑소-작용성 폴리갈락투로나제(PG), 펙틴 리아제(PL), 람노갈락투로나제 또는 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 셀룰라제, β-1,4-글루카나제, 글리코시다제 등)이 있다.
에이. 니거 PLD를 위한 구조 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 유럽 특허원 공개 공보(EP-A2-0 278355)에 기술되어 있다. 추가의 에이. 니거 PL, 특히 PLA, A, B, C, E 및 F를 위한 구조 유전자가 유럽 특허원 공개공보(EP-A2-0353188)에 기술되어 있다. 에이. 니거 PG, 특히 PGⅡ를 위한 구조 유전자가 영국 특허원 특허번호(GB-89 19884.0)에 기술되어 있다.
에이. 니거 구조 유전자를 포함하는 플라즈미드 pGW 820, 830, 850 및 1800으로 형질전환된 이. 콜라이 HB 101 또는 JM 109 세포가 부다페스트 조약에 따라 Deutshe Sammlung fuir Mikroorganismen und Zellkulturen (Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig)에 기탁되어 있다. N- 및 C- 말단을 각각 암호화하는 PGⅡ를 위한 구조 유전자의 부분들의 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. 추가의 정보가 표2에 기재되어 있다.
본 발명의 영역내에 있는 동종 유전자는 또한, 암호화되는 플로펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 비제한적 수의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 대체되는 유전자 암호에 따라 발생되는 단편, 돌연변이체 및 DNA 서열을 포함하는, 전술된 PL 및 PG 유전자의 유도체들이다.
이종 구조 유전자는 바이럿, 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 기원하고, 게놈성 DNA 또는 mRNA 루우트를 경유하여 제조된 cDNA로부터 기원할 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있으며, 매우 다양한 유용한 폴리펩티드를 암호화할 수 있는데, 그러한 유용한 폴리펩티드에는 특히 포유류와 같은 동물 또는 특히 사람 기원의 특정 고등 진핵 세포내에 있는 글리코실화된 폴리펩티드(예 : 영양원의 생산 및 화학에서 효소 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 효소), 또는 사람 및 동물 질병의 치료나 그러한 질병의 예방에 유용하고 가치있는 폴리펩티드(예 : 호르몬, 면역조절성, 항-바이러스 및 항암 특성을 갖는 폴리펩티드, 항체, 바이러스성 항원, 백신, 응괴인자, 식품 등)가 포함된다.
이러한 구조 유전자의 예에는 호르몬(예 : 세크레틴, 티모신, 릴렉신, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 멜라닌세포-자극 호르몬, β-리포트로핀, 우로가스트론 또는 인슐린), 성장 인자[예 : 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)(예 : IGF-I 및 IGF-Ⅱ), 비만 세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 글리아 기원한 신경 세포 성장 인자, 또는 형질 전환 성장 인자(TGF)(예 :TGF α 또는 TGF β, 즉 β1, β2, 또는 β3)], 성장 호르몬(예 : 사람 또는 소 성장 호르몬), 인터루킨(예 : 인터루킨-1 또는 -2,) 사람 대식 세포 이동억제 인자(MIF), 인터페론[예 : 사람-α-인터페론(예 : 인터페론-αA, αB, αD 또는 αF, β-인터페론, γ-인터페론) 또는 하이브리드 인터페론(예 : αA-αD 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB], 프로테이나제 억제제(예 : α1-안티트립신, SLPI 등), 간염 바이러스 항원(예 : B형 간염 바이러스 표면 또는 코어 항원, 또는 A형 간염 바이러스 항원), 또는 비A-비B형 간염 항원, 플라스미노겐 활성화제(예 : 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 우로키나제), 종양 괴사 인자, 소마토스타틴, 레닌, β-엔돌핀, 면역글로블린(예 : 경쇄 및/또는 중쇄의 면역 글로블린 D, E 또는 G), 또는 사람-마우스 하이브리드 면역 글로블린, 면역글로블린, 결합 인자[예 : 면역글로블린 E 결합 인자(예 : sCD)] 칼시토닌, 인체 칼시토닌-관련 펩티드, 혈액 응괴 인자(예 : 인자 Ⅸ 또는 Ⅷc), 에리트로포이에틴, 에글린(예 : 에글린 C), 히루딘, 데설파토히루딘(예 : 데설파토히루딘 변이체 HV1, HV2 또는 PA), 인체 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 바이러스성 티미딘 키나제, β-락타마제, 글루코오즈 이소머라제를 암호화하는 구조 유전자들이 있다. 바람직한 유전자들은 사람 α-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB, 사람 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA), B형 간염 바이러스성 표면 항원(HBVsAg), 인슐린-유사 성장 인자 Ⅰ 및 Ⅱ, 에글린 C 및 데설파토히루딘(예 : 변이체 HV 1)을 암호화하는 유전자들이다.
본 발명의 DNA 분자에서, 본 프로모터는 폴리텝티드의 효과적인 발현을 확보하기 위해 폴리펩티드 암호화 영역에 작동적으로 연결되어 있다.
본 발명의 DNA 분자와 DNA 분자의 단편 및 유도체는 추가의 유사한 DNAs 또는 mRNA를 위해 DNA 유전자 라이브러리 또는 mRNA를 스크링닝하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 pki 프로모터 활성을 포함하는 본 발명의 DNA 분자를 삽입체로서 포함하는 추가의 하이브리드 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 상기 DNA 분자는 pki 프로모터, 이의 단편 또는 이의 유도체(예 : 돌연변이체 또는 본원에서 전술한 구조유전자와 프로모터와의 융합, 또는 이의 단편)를 포함한다. 본 발명의 하이브리드 벡터는 숙주(예 : 세균, 진균 또는 동물세포)내에서 클로닝을 위해 사용될 수 있다. 이러한 하이브리드 벡터는 유전공학의 분야에서 유용한 어느 벡터[예 : 파아지, 코스미드, 플라즈미드 또는 염색체성 DNA ; 예를 들어, 파아지 λ의 유도체(예 : NM 989), 또는 파아지 M13의 유도체(예 : 13mp18 또는 M13mp19 파아지 DNA), 세균성 플라즈미드(예 : pBR 322, pUN 121, pUC 18), 또는 효모 플라즈마드(예 : 효모 2μ 플라즈미드), 또는 예를 들어 아스퍼길러스(예 : 에이. 니거)로부터 유도된 염색체성 DNA(예 : 유럽 특허 제184 438호에 있음), 또한 결함 파아지 또는 플라즈미드의 복제를 허용하는 헬퍼 파아지 또는 플라즈미드 존재하에서 결함 파아지 또는 결함 플라즈미드(예 : M 13K07 헬퍼파아지 존재하에서의 M13(+)KS 벡터)]로부터 기원한다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 본 발명의 DNA 분자이외에, 복제 부위 및 필요한 경우, 마커 유전자 및/또는 pki 프로모터와는 다른 부가적 발현 조절 서열(예 : 인핸서), 전사 종결자, 리보좀 결합 영역, 해독 개시 또는 종결 부위, 또는 시그날 서열[예 : 에이. 니거 펙틴리아제 A, B, C 또는 D 및 폴리갈락토로나제(예 : PGI 또는 Ⅱ)를 위한 구조 유전자의 시그날 서열)]을 포함한다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 pGW1100이 아니다.
그러나, 본 발명의 하이브리드 벡터는 pki 프로모터 활성을 갖는 pGW1100의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 하이브리드 벡터의 예는 서열 동정 번호 제1번의 서열의 뉴클레오타이드 약 300번 위치에 있는 Bam HI 부위에서부터 뉴클레오타이드 약 1352번 위치에 있는 Pvu Ⅱ 부위에까지 걸쳐 있는 1053 bp Bam HI/Pvu Ⅱ 제한 단편을 포함하는 M 13mp 18-PK(Bam HI-Pvu Ⅱ)이다.
본 발명의 또 다른 하이브리드 벡터는 에이. 니거 pki 프로모터에서의 돌연변이를 포함하는 하이브리드 벡터이다. 상기 돌연변이는 새로운 제한 효소 절단 부위, 특히 pki 프로모터와 작동적으로 연결되는 구조 유전자를 삽입하는데 적합한 새로운 제한 효소 절단부위를 발생시킬 수 있다.
이러한 벡터의 예는 특히, 에이. 니거 피루베이트 카나제 구조 유전자의 해독 개시 부위에 새로운 NsiI 부위를 갖는 본 발명의 돌연변이된 DNA 분자를 포함하는 M 13mp 18-PK(Bam HI-NsiI-Pvu Ⅱ)이다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 또한 pki 프로모터와 작동적으로 연결되는, 동종 구조 유전자(에이 니거. 피루베이드 키나제 구조 유전자는 제외), 또는 이종 구조 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 하이브리드 벡터는 예를 들어, M 12mp 18-Pk(Bam HI-Nsi I-Pvu Ⅱ)의 742 pb Bam HI/NsiI 단편 및 pGW 830의 2.6kb Bam HI/NsiI 단편을 포함하는 pPK-PLB이다. 상기 하이브리드 벡터는 상기 하이브리드 벡터의 시그날 서열을 포함하는 PLB를 암호화하는 구조 유전자를 포함한다.
바람직한 하이브리드 벡터는 pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2, pPK-PLB, M 13mp 18-PK(Bam HI-Pvu Ⅱ), M 13mp-18-PK(Bam HI-NsiI-PvuⅡ)이다.
[에이. 니거 pki 프로모터를 포함하는 DNA 분자, 그러한 DNA 분자를 포함하는 하이브리드 벡터 및 상기 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주의 제조방법.]
본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 DNA 분자의 제조방법, 예를 들어, 그러한 DNA 분자를 시험관 내에서 합성에 의해 제조하거나 그러한 DNA 서열을 포함하는 숙주를 배양함을 포함하는 방법에 관한 것이다.
숙주의 배양은 비-돌연변이체(즉, 목적하는 DNA 분자가 결실된 숙주)로부터 형질전환체(즉, 선별 마커와 함께 목적하는 DNA 분자를 포함하는 숙주)의 음성 또는 양성 선별을 가능하게 하는 화학적 화합물이 보충될 수 있거나 제거될 수 있는 통상 영양 배지내에서 수행된다.
본 분야에서 유용한 형질전환할 수 있는 숙주로는 예를 들어, 세균(예 : 이. 콜라이), 진균(예 : 사카로마이세스 세레비지애), 또는 특히 사상균[예 : 아스퍼길러스(예 : 에이. 니둘란스, 에이. 오리자이 ; A. oryzae, 에이. 카르보나리우스; A. carbonarius, 에이. 자포니쿠스 ; A. Japonicus 및 특히 에이. 니거)]이 사용될 수 있다. 숙주의 형질전환은 통상의 방법에 의해 수행된다.
본 발명의 DNA 분자는 피루베이트 키나제 유전자(pki)를 포함하는 아스퍼길러스 니거로부터, 특히 그의 게놈성 라이브러리로부터 수득될 수 있거나 또는 cDNA 분자를 제조하기 위해 사용되는 mRNA를 경우하여서도 수득될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자의 제조가 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
게놈성 라이브러리는 에이. 니거 균주[예 : NW 756 또는 N 400(예 : Sau3AI 또는 MboI를 갖는다)]의 게놈성 DNA의 부분적 분해에 의해, 그리고 적합한 숙주 벡터[예 : 이. 콜라이 플라즈미드 pUN121 또는 람다 벡터(예 : EMBL 4)]내에서 고분자량 DNA 단편을 클로닝 함에 의해 제조될 수 있다.
pki를 포함하는 DNA 서열을 위한 게놈성 라이브러리를 성공적으로 스크리닝하기 위해서는, 하이브리드화 DNA 탐침이 필수적이다. 이것은 합성 DNA 탐침이거나, 에이. 니거 pki와 하이브리드화되는 다른 피루베이트 키나제 유전자 또는 그의 부분[예 : 플라즈미드 pPYK1(Burke et al., 1983)내에 포함되는 효모 피루베이트 키나제 구조 유전자]일 수 있다.
스크리닝하는 목적을 위해, DNA 탐침은 본 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 p-ATP 및 T4 키나제를 사용하여 5' 말단에서 방사능적으로 표지시킨다. 삽입체로서 본 발명의 핵산을 수반하는 숙주 미생물은 유전자 라이브러리의 필터레플리카 상에서 표지된 DNA 탐침과 하이브리드화 함에 의해 동정된다. 탐침과 하이브리드화된 DNA 분자는 분리되고 필요한 경우, 통상의 방법에 따라 아클론된다. 플라즈미드 pGW1100은 에이. 니거 N 400 라이브러리로부터의 게놈성 클론의 이러한 아클론이다. 플라즈미드 pGW 1100은 에이. 니거 피루베이트 키나제에 대한 전체 작용성 유전자를 포함하는 에이. 니거 게놈의 5.0kbp Bg1 Ⅱ/Hind Ⅲ 단편을 포함한다.
그 다음에 동정된 pki 또는 유전자 단편을 서열 분석한다. pGW 1100에 포함되는 에이. 니거의 작용성 pki의 완전한 서열은 서열 동정 번호 제1번하의 서열 목록에 기재되어 있다.
플라즈미드 pGW 1100은 본 발명의 DNA 분자를 제조하기 위해 사용된다. 이러한 DNA 분자는 통상의 제한 효소, 링커, 돌연변이, 연결, 증폭 및 분리방법을 적용함에 의해 통상의 방법으로 제조된다. 서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA 분자 단편은 예를 들어, 상기 DNA 분자를 뉴클레아제[예 : 에소뉴클레아제(예 : Ba 131 또는 Exo Ⅲ), 또는 엔도뉴클레아제(예 : 제한 효소)]로 처리함을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA 분자의 유도체 또는 그의 단편의 유도체는 예를 들어, 본원에서는 실시예 .2.1.2에 기술되어 있는, 통상의 방법[참조 : M.J. Zoller and M. Smith, Methods Enzymol. 100,468(1983), D. Botstein and D. Shortle, Science 229, 1193(1985) or K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5103(1983)]에 따르는 돌연변이 유발에 의해 제조된다.
새로운 제한 부위를 포함하는 돌연변이체는 예를 들어, 통상의 방법에 따르는 돌연변이 유발성 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 제조될 수 있다.
서열 동정 번호 제1번의 서열내로 돌연변이를 도입하기 위한 이러한 돌연변이 유발성 올리고 뉴클레오타이드의 예는 서열 동정 번호 제2번하에 기재된 DNA 분자이다.
서열 동정 번호 제1번의 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA 분자의 재조합 유도체, 이의 단편 또는 이의 돌연변이체는 예를 들어, 재조합 DNA 기술[예 : 이러한 DNA 분자, 이의 단편 또는 돌연변이체를 제한 효소로 절단하고/하거나 다른 DNA 분자(예 : 올리고뉴클레오타이드 링커 ; 또는 구조유전자, 시그날 서열 및/또는 종결 영역을 포함하는 DNA 분자)를 사용하여 연결시킴을 포함하는 방법]에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 모든 DNA 분자는 또한 통상의 방법에 따라 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 시험관내 합성은 본 발명의 보다 작은 DNA 분자의 제조에 특히 적용될 수 있다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 예를 들어, 제한 효소로 절단시킴에 의해 선형화된 유전 공학의 분야에서 유용한 벡터를 본 발명의 DNA 분자와 연결하고, 연결 혼합물을 사용하여 적합한 숙주세포를 형질전환하고, 형질 전환체를 동정 및/또는 선별함을 포함하는 방법에 의한, 유전 공학의 통상의 방법에 따라 제조된다.
숙주 세포는 통상의 방법에 의해 형질전환되고 형질 전환체는 예를 들어, 이들의 내성(예 : 테트라사이클린에 대한 이들의 내성) 또는 영양요구성 마커(예 : pyrA)의 보충에 의해 동정 및/또는 선별된다.
특히 기술되어 있는 발현 벡터는 적합한 이. 콜라이 숙주 균주(예 : HB 101, JM 109, MH 1, DH 5α 등)내에서 증폭되고, 본 분야에서 통상적인 방법에 의해 형질전환되고 선별된다. 증폭된 플라즈미드 DNA는 특히 Birnboim Doly[참조 : Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979]에 의해 기술된 것과 같은, 통상의 방법에 의해 세균으로부터 분리된다.
특히, 동종 또는 이종 구조 유전자를 포함하는, 본 발명의 DNA 분자 또는 본 발명의 하이브리드 벡터는 사상균[예 : 아스퍼길러스(예 : 에이. 니둘란스, 에이. 자포니쿠스, 에이. 오리자이, 에이. 카르보나리우스, 에이. 아와모리(A. awamori) 및 특히 에이. 니거), 트리코데르마, 페니실리움 또는 세팔로 스포리움]을 형질전환하는데 또한 사용될 수 있다.
비형질전환된 진균으로부터 형질전환된 진균의 선별을 가능하게 하기 위하여, 본 발명의 하이브리드 벡터는 선별 마커를 포함하는 2차 벡터를 사용하여 공형질 전환시킬 수 있다.
다른 시스템에서와 같이, 이러한 선별 마커는 발현성 구조 유전자의 폴리펩티드가 수용체에 대해 독성이 있는 화합물에 대한 내성을 제공하거나 그러한 필수 폴리펩티드가 부족한 돌연변이체의 효소 시스템을 완전하게 하는 발현성 폴리펩티드이다. 이러한 마커 유전자에는 예를 들어 공지된 qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS 또는 argB 유전자가 있다.
유럽 특허 제 278,355호에 기술되어 있는 것처럼, pyrA로 명명되는 마커 유전자는 에이. 니둘란스 의 pyrG 및 엔. 크라사의 pyr4와 관련되어 있고 유사한 기능을 갖는, 즉, 효소 오로티딘 5'-인산 데카복실라제를 생성하는 에이. 니거의 게놈성 라이브러리로부터 분리된다. 이 효소는 오로티딘 5'-인산의 우리딜 산으로의 탈카복실화반응 및 또한 불소-오로트산의 독성 불소-우리딘으로의 탈카복실화 반응을 촉매한다.
DSM 3968로 도이취 삼믈룽 폰 마이크로오르가니스멘(Dutsche Sammlung von Mikroorganismen)에 기탁된 이. 클라이 Bg5183/pCG59D7로부터, pyr A 유전자를 포함하는 플라즈미드 pCG59D7이 분리되어 에이. 니거 pyr A-돌연변이체의 공형질 전환을 위해 사용된다. pyr-A-돌연변이체는 오로티딘 5'-인산 데카복실라제 유전자에 결함이 있으므로 상응하는 효소를 생성하기 위해 사용될 수 없다. 돌연변이체는 예를 들어, 에이. 니거 N593 또는 에이. 니거 An8이며, 후자가 NO DSM 3917로 도이취 삼믈룽 폰 마이크로오르가니스멘에 기탁되어 있다. 돌연변이체는 돌연변이시키는 UV-조사하에서 에이. 니거의 분생포자를 처리함에 의해 제조되고 불소-오로트 산 및 우리딘의 존재하에서 생존하는 콜로니가 선별된다. 불소오로트 산의 존재 및 우리딘의 부재에서 생존하는 콜로니는 제거된다.
본 발명은 본 발명의 하이브리드 벡터로 형질전환된 추가의 숙주에 관한 것이다. 이러한 형질전환체는 예를 들어, 세균(예 : 이. 콜라이) 또는 사상균[예 : 아스퍼길러스, 페니실리움 또는 세팔로스포리움, 및 특히 에이. 니둘란스, 에이. 자포니쿠스, 에이. 오리자이, 에이. 카르보나리우스, 에이. 아와모리 또는 바람직하게는 에이. 니거(예 : 에이. 니거 An8 또는 N 593)]이다.
pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2 또는 pPK-PLB로 형질전환된 . 콜라이 JM101 또는 DH 5α ; pPK-PLB, pPKIss-IFN-2 또는 pPKIssIFN-2 및 임의의 선별 마커 플라즈미드 pGW613 또는 pCG59D7로 형질전환된 아스퍼길러스 니거 N 593 또는 An8이 특히 바람직하다.
본 발명은 또한, 형질 전환 조건하에서 본 발명의 재조합 DNA 분자 또는 하이브리드 벡터를 사용하여, 임의로는 선별 마커 유전자를 함께 사용하여 숙주세포를 처리함을 포함하는 형질 전환체의 제조방법 및 필요한 경우, 형질 전환체를 선별하는 방법에 관한 것이다.
[폴리펩티드의 제조방법]
본 발명은, 폴리펩티드[예 : 본원에서 전술한 의미를 갖는 폴리펩티드, 바람직하게는 사람 α-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB, 사람 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA), B형 간염 바이러스 표면 항원(HBVsAg), 인슐린-유사 성장 인자 I 및 Ⅱ, 에글린 C 및 데설파토히루딘(예 : 변이체 HV 1)]를 암호화하는 구조 유전자가 pki 프로모터와 작동적으로 연결되고 적합한 숙주에서 발현됨을 특징으로 하는, 그러한 폴리펩티드의 추가의 제조방법에 관한 것이다. 필요한 경우, 폴리펩티드는 통상의 방법으로 분비된다. 벡터의 작제에 따라, 생성물은 숙주 세포에서 생성되거나, 시그날 서열이 존재하는 경우, 세포 내에서 생성되고 분비된다. 적합한 숙주는 바람직하게는 아스퍼길러스 종[예 : 에이. 니기(예 : 특히, 에이. 니거 An8 또는 N593)]이다. 적합한 숙주는 또한 또 다른 사상균[예 : 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)], 또는 효모[예 : 사카로마이세스 세레비지애 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)]이다.
여러가지 방법이 적용될 수 있음에 의해, 단일 유전자 생성물을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 단일 폴리갈락투로나제 PG 또는 펙틴 리아제 PL, 바람직하게는 PLB의 제조방법은 어느 PG 또는 PL을 발현할 수 없거나 PG 또는 PL을 소량으로 발현하는 적합한 숙주가 PG 또는 PL(예 : PLB)을 암호화하는 구조 유전자를 포함하는 하이브리드 벡터로 형질 전환되어 상기 유전자가 발현됨을 특징으로 한다. 조절영역으로서 pki 프로모터를 사용하여, 단지 유도조건(예 : 펙틴 또는 펙틴 분해 생성물이 배지에 있는 경우)하에서만, 상응하는 또는 관련된 내성 유전자 생성물(예 : PLA, B, C, D, E 또는 F)를 생산할 수 있는 적합한 형질전환된 숙주를 내생 구조 유전자의 발현을 허용하지 않고 pki 프로모터의 조절하에 있는 구조 유전자의 발현만을 허용하는 조건하에 배양함에 의해, 상기 형질전환된 숙주내에서 단일 유전자 생성물(예 : PLB)를 생산하는 것이 현재, 또한 가능하다. 이러한 조건은 예를 들어, 탄소원 및 에너지원으로서 글루코오즈를 갖는 최소 배지가 사용되는 경우 수득된다. PG 또는 PL을 발현할 수 없는 숙주가 사용되거나 내성 PLs의 생성을 허용하지 않는 조건이 적용되는 경우, 상기 단일 PG 또는 PL은 다른 어떤 PG 또는 PL을 의해서 오염되지 않은, 순수한 형태로 수득될 수 있다.
단일 유전자 생성물을 암호화하는 본 발명의 DNA 분자 또는 하이브리드 벡터로 형질전환된 적합한 숙주내에서 생산되는 단일 유전자 생성물, 및 이의 생리학적으로 허용되는 염은 또한 본 발명의 대상이다. 에이. 니거의 효소, 특히 식품 및 사료 산업에서 유용한 에이. 니거 효소(예 : PGs 또는 PLs, 특히 PLB)가 바람직하다. 본 발명은 본 발명에 따르는 방법에 의해 언제라도 생산되는 상기 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따르는 방법에 의해 생산되는 하나이상의 폴리펩티드(예 : 단일 PL의 폴리펩티드 및/또는 PL 활성을 갖는 이의 유도체 및/또는 단일 PG의 폴리펩티드 및/또는 PG 활성을 갖는 이의 유도체 및/또는 직각, PL 또는 PG 활성 이외의 활성을 갖는 하나 이상의 적합한 효소를 갖는 예비결정된 혼합물 중의 임의의 이의 생리학적으로 허용되는 염)를 포함하는 효소 조성물의 추가의 제조방법에 관한 것이다.
PL 활성 이외의 활성을 갖는 적합한 효소는 세포 중합체를 분해하고 변형시킨다. 이러한 효소에는 예를 들어, 펙틴 에스테라제, 엔도 및 엑소-작용 폴리갈락투로나제, 셀룰라제, 혼합된 엔도-글루카나제, 헤미셀룰라제, 자일라나제, 아라비나제, 갈락타나제, α- 및 β-글리코시다제 등이 있다.
PG 활성 이외의 활성을 갖는 적합한 효소는 세포 중합체르 분해하고 변형시킨다. 이러한 효소에는 예를 들어, 페틴 에스테라제, 펙틴 리아제, 셀룰라제, 혼합된 엔도-글루카나제, 헤미셀룰라제, 자일라나제, 아라비나제, 갈락타나제, α- 및 β-글리코시다제 등이 있다.
본 발명의 방법에 따라 생성되는 단일 PG 또는 PL 또는 각각, PG 또는 PL 활성을 갖는 이의 유도체, 또는 이의 효소 조성물은 예를 들어, 야채 또는 과일 쥬스의 정화, 야채 또는 과일 쥬스 생산에 있어서의 쥬스 수율 및 오일함유 종자 또는 과일의 압착 수율의 향상, 야채 또는 과일 쥬스의 안정성, 야채 또는 과일 쥬스의 점도의 감소, 생물량의 액화, 유화, 천연 색소재, 방향제 및 풍미제와 같은 자연 생성물 추출의 강화, 생물량, 식품 또는 사료의 물가 안정책 등에 유용하다.
본 발명은 가장 바람직하게는 본원에서 실시예에 기술되어 에이. 니거 프로모터 또는 프로모터 활성을 갖는 이의 단편 또는 유도체, 하이브리드 벡터, 형질전환된 숙주, 에이. 니거 pki 프로모터 또는 프로모터 활성을 갖는 이의 단편 또는 유도체의 제조방법, 하이브리드 벡터의 제조방법, 형질전환된 숙주의 제조방법, 및 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만, 어떤식으로 그것을 제한하고자 하는 것은 아니다.
[약어는 하기 의미를 갖는다]
Amp 암피실린
ATP 아데노신 3인산
BSA 소 혈청 알부민
bp 염기쌍
CIP 송아지 장 알칼린 포스파타제
dATP 2'-데옥시-아데노신 3인산염
dCTP 2'-데옥시-시티딘 3인산염
d.e. 에스테르화도
dGTP 2'-데옥시-구아노신 3인산염
DNA 데옥시리보핵산
dNTP 2'-데옥시-뉴클레오타이드 3인산염
DTT 1,4-디티오트레이톨
dTTP 2'-데옥시-티미딘 3인산염
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염
EGTA 비스-(아미노에틸)-글리콜에테르-N,N,N',N'-테트라 아세트산
IFN 인테페론
kDa 킬로달톤
kbp 킬로염기쌍
Km 미카엘리스-멘텐 상수
LMP 저 융점
O.D. 흡광도
PCR 폴리머라제 쇄 반응
PEG 폴리에틸렌글리콜
pki 에이. 니거의 피루베이트 키나제 유전자
PLB 펙틴 리아제 B
RNA 리보핵산
rpm 분당 회전수
SDS 나트륨 도데실 설페이트
SSC 나트륨 나트륨 시트레이트(0.15M NaCl, 0.015M 나트륨 시트레이트)
Tc 테트라사이클린
Tris 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄
U 유니트
[배지]
LC 배지 ℓ당 1% 트립티카제 펩톤(BBL), 0.5% 효모 추출물(BBL), 0.8% NaCl, 1ml 트리스-HCl pH 7.5
2×YT 배지 ℓ당 16g 트립티카제 펩톤(BBL), 10g 효모 추출물, 5g NaCl
에이. 니거용 1ℓ가 1.5g KHPO, 0.5gKCl, 0.5g
최소 배지 MgSO·7HO, 4.0g NHCl, 10.0g 글루코오즈, 미량의 FeSO, MnSO, ZnCl을 함유하며 NaOH로 pH 6.5로 조정됨
에이. 니거용 최소배지에 ℓ당 0.1% 카스아미노산(Difco)을 위한 0.2% 트립티카제 펩톤(BBL), 0.1% 효모 추출물(BBL), 효모로부터의 0.05% 리보핵산 나트륨염(ICN, 클리브란드, USA) 2ml 비타민을 더한다.
비타민 배지 100ml 당 10㎎ 리보플라빈, 10㎎ 파토텐산, 2㎎ 바이오틴, 10㎎ p-아미노벤조산, 100㎎ 니코틴아미드, 50㎎ 피리독신-HCl
플레이트를 위해, 1.5% 아가(BBL), 톱아가로즈 용으로는 0.7% 아가(BBL) 또는 아가로즈(Seakem)의 첨가에 의해 고화된 모든 배지가 사용된다.
[하기 균주가 사용된다]
이. 콜라이 JM 101(Messing, 1979)
이. 콜라이 RZ 1032(Pharmacia)
이. 콜라이 DH5α (Bethesda Research Laboratories)
이. 콜라이 DH52F' (Bethesda Research Laboratories)
이. 콜라이 BW313 (Kunkel, 1985)
에이. 니거 An8(DSM 3917, EP-A-0278355)
에이. 니거 N593
[하기 벡터가 사용된다.]
[pBR 322]
문헌[참조 : Sutcliffe, J.G.(1979), Peden, K.W.C.(1983) 또는 Bolivar et al. (1977)]에 기술되어 있다.
[pGW 613]
이 플라즈미드는 참고문헌[참조 : Goosen dt al. (9187)]에 기술되어 있다.
[M13mp 파아지]
M13mp 18 및 M13mp 19 벡터[참조 : Norrander et al., 1983]는 일본쇄 DNA 박테리오파아지 M13의 유도체이고 다양한 폴리링커 부위에서의 DNA 단편의 클로닝 및 가능한 양쪽 방향으로의 이들 동일한 제한 단편의 클로닝을 허용함에 의해 DNA 서열 분석을 촉진하기 위해 고안된다. 이들 벡터로 클론된 서열은 쇄형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 프라이머 및 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우(Klenow) 단편을 사용하여 서열 분석 반응 및 단일-쇄 탐침의 제조를 위한 주형으로서 용이하게 사용될 수 있다. 벡터 DNA는 이. 콜라이 lac-오페론 프로모터 및 β-갈락토시다제의 첫번째 145개 아미노산의 게농성 정보를 수반한다. 다수의 제한 부위를 포함하는 폴리링커 서열은 lacZ 서열내로 삽입된다. 폴리 링커는 LacZ 판독 프레임을 보유하며 벡터는 IPTG 및 X-gal 을 함유하는 플레이트상에 파란 플라크를 생산하는, LacZα 숙주 균주의 대립상보성을 제공한다. 판독 프레임을 파괴하거나 그렇지 않으면 lacZα 펩티드의 발현을 방해하는 삽입체가 포함된 재조합 파아지는 무색 플라크로서 나타난다.
[pCG 59D7]
이 플라즈미드는 유럽 특허 제 88 101 397.3호에 기술되어 있으며 에스케리치아 콜라이 BJ5183/pCG59D7(DSM 3968)로부터 수득될 수 있다. 본 플라즈미드는 pyrA 유전자를 포함하며 에이. 니거 pyrA-돌연변이체의 공형질전환체용으로 사용된다.
[M13K07]
헬퍼 M13 파아지(예 : M 13(+)KS)
[참조 : Mead et al (1986) and Dotto and Zinder(1984)].
[pPYK1]
에스. 세레비지에 피루베이트 키나제 유전자를 포함한다[참조 : Burke 등, 1983)].
[pGW1800]
에이. 니거의 PGⅡ유전자를 포함한다. pGW1800을 포함하는 이. 콜라이 JM109 균주는 DSM(Deustche Sammlung von Mikroorganismen)에 기탁번호 DSM5505로 기탁되어 있다.
[pGW830]
에이. 니거의 pelB 유전자를 포함한다. pGW830을 포함하는 이. 콜라이 HB101 균주는 DSM에 기탁번호 DSM 4389로 기탁되어 있다.
[pTZI8R]
파마시아사(Pharmacia)로부터 입수 가능
[pGW1100]
에이. 니거 pki 유전자를 포함한다. 참조문헌[참조 : L.H. de Graaff(1989)]에 기재되어 있으며 DSM에 DSM 5747로 이. 콜라이 DH5αF'/pGW1100으로서 기탁되어 있다.
[pJDB207-IFNAM119]
유럽 특허원(EP-A-0205404)에 기재되어 있다.
[실시예 1]
[ 이. 니거 프루베이트 키나제 유전자의 분리 및 특성화]
[실시예 1.1]
[효모 피루베이트 키나제 유전자를 갖는 DNA 단편의 분리]
공급회사(BRL)의 조건에 따라, 사카로마이세스 세레비지애 피루베이트 키나제 유전자[참조 : Burke 등, 1983]로부터의 1.8kb EcoRI 단편을 갖는 플라즈미드 pPYK1을, EcoRI으로 분해한다. 생성된 단편은 0.6% 저융점(LMP) 아가로스 겔 중에서 전기 영동으로 분리한다. 1.8kb EcoRI 단편을 함유하는 LMP 아가로스 조각을 겔로부터 잘라내고, DNA는 다음의 단계에 따라 추출한다 : 아가로스 조각에 최종 용적 500ul 까지 TE 완충액(10mM 트리스/HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 가하고 이어서 250ul의 페놀을 가한다.
65℃에서 10분간 항온처리하여 아가로스를 용융시키고 이 용액을 혼합한다. 50ul CIA(클로로포롬/이소아밀알콜 24:1)을 가한 후, 14,000xg에서 10분간 원심 분리하여(에펜도르프 원심 분리기) 수성 및 유기 상을 분리한다. 유기상을 제거하고, 수성상을 65℃에서 10분간 1/2배 용적의 페놀과 항온처리하여 재추출한 후 다른 1/2배 용적의 CIA를 가하고 상을 분리시킨다. 다시 유기상을 제거시키고 수성상은 실온에서 동용적의 페놀/CIA(1:1) 및 동용적의 CIA로 연속하여 추출한다. 최종적으로 0.1배 용적의 3M Na 아세테이트(pH 5.6) 및 2배 용적의 에탄올을 가하여 수성상으로부터 DNA를 침전시킨다. DNA는 실온에서 14,000xg로 30분간 원심분리(에펜도르프 원심 분리기)시켜 침전시킨다. 상등액을 제거한 후 DNA 펠렛은 사반트 스피드벡(Savant Speeddvac, ) 진공 원심 분리기를 사용하여 건조시킨다. 최종적으로 DNA를 10ul TE 중에 용해시키고, 알고 있는 양의 동시 이동 λDNA를 참조로 사용하여, 농도를 아가로스 전기 영동으로 측정한다.
[실시예 1.2]
[DNA 단편의32P 표지]
실시예 1.1에 기술된 바와 같이 플라즈미드 pPYK1으로부터 분리한 1.8kb EcoRI 단편 100ng을, 필수적으로 마니아티스등[참조 : Maniatis et al., 1982, pp. 109 to 112]의 방법에 따라 니크 해독으로 표지한다. 40ul의 반응 완충액(25μM dGTP, 25μM dCTP, 25μM dTTP, 5mM MgCl2, 50mM 트리스/HCl pH 7.5 함유)에 최종 용적 50ul까지 5ul의 α-32P-dATP(10μCi/μ1,3000Ci/mMol), 1ul(5U/μ1) DNA 폴리머라제 I, 100pg DNase I, 100ng pPYK1의 1.8kb EcoRI 단편 및 멸균수를 가한다. 이 반응 혼합물을 16℃에서 2시간 동안 배양한다. 5ul 500mM EDTA, pH8.0을 가하여 반응을 정지시킨다. 혼합물로부터 비통합된 α-32P-dATO를 제거하기 위해 TE를 사용하여 용적을 100ul로 증가시키고 α-32P-dATP는 세파덱스 G50(Pharmacia) 컬럼 상에서 분획화하여 제거한다. 방사능 표지된 1.8kb EcoRI 단편을 함유한 분획을 수거하고 혼주시킨다. 표지된 DNA는 100℃에서 3분간 항온처리하여 변성시키고, 실시예 1.4.에 기술된 바와 같이 하이브리드 용액에 가하기 전에, 얼음에서 급속 냉각시켜 일본쇄를 유지시킨다.
[실시예 1.3]
[에이. 니거로부터 고분자량 DNA의 분리]
에이. 니거 DNA는, 식물체 RNA[참조 : Slater, 1985]를 분리하고자 사용되었던 방법을 약간 변형시킨 방법으로 분리한다. 액체 최소 배지중에서 밤새 성장한 균사를 수거하고 냉생리 식염수로 세척하며 액화 질소중에서 냉동시켜 -80℃에 보관한다. 미세 막제거기(micro dismembrator ; Braun)를 사용하여 0.5g의 냉동 균사를 파괴함으로써 핵산을 분리시킨다. 수득된 균사 분말을 새로 제조한 추출 완충액으로 추출한다.
추출 완충액은 다음과 같이 제조한다 : 1ml의 트리-이소프로필 나프탈렌 설폰산(TNS, 20㎎/ml)을 1ml의 p-아미노살리실산(PAS, 120㎎/ml)과 충분히 혼합하고, 0.5ml ×5RNB 완충액을 가한다(5×RNB는 1ℓ중에 121.10g의 트리스, 73.04g의 NaCl 및 95.10g의 EGTA, pH 8.5를 함유한다). 1.5ml의 페놀을 가한 후, 추출 완충액을 55℃에서 10분간 평형화시킨다. 균사 분말에 따뜻한 완충액을 가하고, 이 현탁액을 1분간 충분히 혼합한다. 1ml의 클로로포름을 가하고 현탁액을 1분간 재혼합시킨다. 104×g에서 10분간 원심 분리한 후, 수성상을 동량의 페놀/클로로포름(1:1)으로 추출하고 나서 클로로포름으로 2회 추출한다. 다음의 과정을 써서 수성상으로부터 DNA를 분리한다 : 실온에서 2배 용적의 에탄올을 사용하여 수성상으로부터 DNA를 신속하게 침전시키고 이어서 104×g에서 10분간 원심 분리하여 이를 수거하고 이 DNA를 증류된, 멸균수에 재용해시켜 2회 세척하고 에탄올로 다시 침전시킨다. 최종적으로, 이 DNA를 TE 완충액에 재용해시킨다. RNA는 RNase A(20μg/ml)를 가하여 제거한다.
[실시예 1.4]
[이종 하이브리드화 조건의 결정]
실시예 1.3에 기술된 바와 같이 에이. 니거로부터 분리한 고분자량의 DNA를 EcoRI 및 BamHI으로 분해한다. 생성된 단편은 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 마니아티스 등[참조 : Maniatis et al.(1982) pp. 383-389]이 기술한 바와 같이 니트로 셀룰로스로 이전시킨다. 이종 하이브리화 조건을 결정하고 Graff 등(1988)이 기술한 바와 같이 하이브리드화 실험을 수행한다. 라이브러리를 스크리닝하고 탐침으로서 효모 유전자의 1.8kb EcoRI 단편과 서던 블롯을 하이브리드화하기 위한 하이브리드화 조건은 : 56℃에서 3 5시간 동안, 6×SSC, 0.1% SDS, 0.05% 나트륨 피로포스페이트 및 20μg/ml의 변성시킨 청어 정자 DNA 중에서 예비 하이브리드화하고, 56℃에서 15 내지 18시간동안 6×SSC, 0.1% SDS, 0.05% 나트륨 피로포스페이트 및 20μg/ml의 변성시킨 청어 정자 DNA중에서 하이브리드화하고 이어서 56℃에서 5×SSC, 0.1% SDS 중에서 2회 세척하고 56℃에서 2×SSC로 2회 세척한다. 필터는 -70℃에서 코니카 X-레이 필름 및 균일한 강화 스크립을 가진 코닥 X-오마틱 카세트로 밤새 자기 방사선 사진을 찍는다.
[실시예 1.5]
[방사성 1.8kb EcoRI 단편을 사용한 유전자 라이브러리의 스크리닝]
에이. 니거 pki 유전자는 탐침으로서 pPYK1의 1.8kb EcoRI 단편을 사용하여 이종 하이브리드화로 분리시킨다. EP-A-0278355에 기술된 방법에 따라 제조한 에이. 니거 N 400의 게놈성 라이브러리를 실시예 1.4에 기술된 방법에 따라, pPYK1의 1.8kb EcoRI 단편과 함께 하이브리드화 방법으로 스크리닝시킨다.
스크리닝 결과 양성 클론의 분리가 나타난다. 가장 강한 하이브리드화 시그날을 나타낸 클론으로부터 플라즈미드 DNA를 미니-예비-분리[참조 : Maniatis et al., 1982, pp. 368-369]로 분리시킨다. 클론이 완전한 에이. 니거 pki 유전자를 함유하고 있는지의 여부를 알아보기 위해 서던 및 제한 분석이 사용된다.
실시예 1.1에 기술된 LMP 아가로스 방법에 따라서, 상기 클론의 5kbp BglⅡ/Hind Ⅲ 단편 및 이. 콜라이 벡터 pBR322의 4.0kbp BamHI/HindⅢ 벡터 단편을 분리시킨다. 다음의 절차에 따라서, 5kbp BgⅢ/HindⅢ 단편을 pBR322의 4.0kbp BamHI/HindⅢ 벡터 단편에 연결시켜 플라즈미드 pGW 1100을 생성시킨다 : 100ng의 pBR322 단편을 250ng의 상기 5kbp BglⅡ/HindⅢ 단편 및 4ul 5×연결 완충액(조성 : 250mM 트리스/HCl pH 7.6 ; 50mM MgCl2; 50mM DTT ; 5mM ATP ; 5mM 스퍼미딘 ; 50ug/ml BSA)과 혼합하고 최종 용적 20ul까지 1μl(1.2U/μ1) DNA 리가제(BRL)를 이 혼합물에 가한다. 14℃에서 16시간 동안 항온처리한 후 이 혼합물을 100μl의 멸균수로 희석한다. 수용체 이. 콜라이 JM101 세포를 형질전환하는데 10ul의 상기 희석 혼합물이 사용되며, 이는 M13클로닝/서열 분석 시스템을 위한 파마시아 매뉴얼에 기술된 CM1, CM2 방법에 따라 제조한다. pGW 1100을 대량으로 분리하고[참조 : Maniatis, 1982, p. 86] CsCl 밀도 구배 원심 분리로 정제하며 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시키며 TE 완충액 중에 용해시킨다. 제한 분석으로 플라즈미드 pGW1100을 더 분석하고, 실시예 1.4에 기술된 바와 같은 조건하에서, 탐침으로서 각각 1.0kbp EcoRI/BglⅡ 및 0.88kbp EcoRI/BglⅡ 단편인 5'- 및 3'- 말단의 에스. 세레비지에 피루베이트 키나제 유전자를 함유하는 단편을 사용하여 하이브리드화에 의해 pki 유전자의 배향을 결정한다.
[실시예 1.6]
[에이. 니거 피루베이트 키나제 유전자의 서열 측정]
프로모터 영역, 구조 유전자 및 종결 영역을 포함한 에이. 니거 pki 유전자의 서열은 M13mp18/mp19 중에서 pGW1100으로부터의 단편을 아 클로닝함에 의해 측정한다. 뉴클레오 타이드 서열 분석을 위해 적절한 제한 단편들은 실시예 1.1에 기술된 바와 같이 분리하고 실시예 1.5에 기술된 바와 같이 박테리오파아지 M13mp18/19 RF DNA 벡터[참조 : Messing 1983 ; Norrander 등., 1983] 중에서 선형화하여 연결시킨다. BRL로부터의 M13 클로닝/디데옥시 서열화 지침서(pp. 50-73)에 기술된 바와 같이 디데옥시 뉴클레오타이드 사슬-종결 방법[참조 : Sanger 등., 1977]을 사용하여, 뉴클레오타이드 서열을 측정한다. 측정된 서열은 서열 동정 번호 제1번이란 제목하에 서열 목록에 나타나 있다.
[실시예 2]
[발현 벡터의 작제]
[실시예 2.1]
피루베이트 키나제 유전자의 해독 개시 코돈에 신규한 제한
[부위의 도입]
[실시예 2.1.1]
[우라실 함유 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ) 주형 DNA의 제조]
실시예 1.6으로부터 수득한 박테리오파아지 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ)를 하나의 플라크를 사용하여 O.D600nm값이 0.1인 2×YT 영양 배지 중에서 5ml의 이. 콜라이 JM101 배양물을 접종하고 증식시킨다. 37℃에서 밤새 성장시킨 후, 원심 분리(10,000×g, 10분)하여 세균을 제거하고 상등액을, 우라실 함유 일본쇄 DNA 주형의 제조를 위한 팩 표준물로 사용한다.
우라실 함유 주형은 다음과 같이 쿤겔 등 및 네르 등[참조 : Kunkel et al. (1985) and Ner et al., (1988)]에 따라 제조한다 : 5mM 우리딘을 함유하는 10ml 2× YT 배치에 이. 콜라이 RZ1032를 접종하고, 이를 37℃에서 O.D550nm가 0.3이 될 때까지 배양한다. 이 배양물 2.5ml를 5mM 우리딘을 함유하는 10ml 2× YT 배지에 희석한다. 이 배양물은 상술한 바와 같이 제조된 상등액을 함유하는 12μl의 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ)를 가하여 감염시킨다. 감염된 배양물을 37℃에서 5시간 성장시킨다.
이 성장 기간 후, 상술한 바와 같이 배양물로부터 세균을 제거 하고 파아지를 함유하는 상등액을 전술한 바와 같이 이. 콜라이 RZ1032에서 파아지 성장의 두번째 주기를 수행하는데 사용한다.
성장의 세 번째 주기에서, 5mM 우리딘을 함유하는 40ml 2×YT 배지를 10ml의 이. 콜라이 RZ1032 배양물과 혼합하고 두 번째 성장 주기로부터 생성된 파아지 함유 상등액 50ul를 가한다. 세균을 37℃에서 5시간 성장시키고, 상술한 바와 같이 원심분리로 상등액에서 세균을 제거한다. 상등액은 8ml의 20% 폴리에틸렌 글리콜-6000/3M NaCl을 가하여 파아지가 침전되기 전에 2회 원심 분리한다. 파아지는 10,000×g에서 10분간 원심 분리하여 수거한다. 생성된 파아지 펠렛을 2.5ml TE 완충액중에 재현탁시킨다.
우라실 함유 파아지의 비율은 이 파아지 용액의 상이한 희석액을 이. 콜라이 JM101(비-허용성) 및 이. 콜라이 RZ1032(허용성) 상에 플레이팅하여 측정한다. 우라실 함유 파아지에 대한 비 우라실 함유 파아지의 비는 1 내지 106의 비유로 나타난다. 일본쇄 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ) DNA는, 페놀-클로로포름 추출, 실시예 1.1과 같은 에탄올에 의한 침전 및 125ul TE 완충액중에 재현탁하는 방법으로 파아지 용액으로부터 분리된다.
[실시예 2.1.2]
시험관내 돌연변이 유발에 의한 에이. 니거 pki 유전자의 해독
[개시 부위에 NsiI 부위의 도입]
NsiI 위치는 서열 동정 번호 제2번에 해당하는 뉴클레오 타이드 서열을 갖는, 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드 5926을 사용하여 실시예 2.1.1에 기술된 우라실 함유 일본쇄 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ) DNA의 시험관내 돌연변이 유발[참조 : Ti-Zi Su and M. Raafat E1-Gewely, 1988]에 의해 피루베이트 키나제 유전자의 해독 개시 부위에서 만들어 진다.
올리고뉴클레오다이드 5926은 29개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있으며 이의 서열은, 올리고뉴글레오타이드의 12 내지 14번 위치를 제외하고 pki 유전자의 해독 개시 부위 주변의 서열과 동일하다. 최초의 pki 해독 개시 영역에서 GCC로 판독되는 위치 12 내지 14 사이의 뉴클레오타이드 서열은 올리고 뉴클레오타이드 중에서 CAT이다. 따라서, 이 올리고뉴클레오타이드는 위치 9 내지 14에서 NsI 부위를 갖는다.
pki 유전자의 시험관내 돌연변이를 위해 50pmol의 올리고 뉴클레오타이드 5926을 100pmolATP를 사용하여 5' 말단(Maniatis, 1982)에서 인산화시킨다. 이 반응은 37℃에서 30분동안 공급자가 추천한 바에 따라 50μl 키나제 완충액 중에서 10U T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(BRL)를 사용하여 수행한다. 2ul의 500mM EDTA 용액을 가하여 반응을 종료시킨다. 이 혼합물을 실시예 1.1에 기술한 바와 같이 페놀 및 클로로포름으로 추출한다.
실시예 2.1.1에 따라 제조한 0.2pmol 우라실-함유 일본쇄 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ) DNA를, 20mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 25mM NaCl 중에서 최종 용적 10μl로 0.5pMol 인산화된 올리고뉴클레오타이드 5926과 혼합한다. 이 혼합물을 65℃에서 5분간 배양시키고 60분간에 걸쳐 실온에서 서서히 냉각시켜 얼음 위에 15분 방치해 둔다. 그후, 이 혼합물에 2μl 500μM dNTP, 1.5μl 10mM ATP, 1ml T7 DNA 폴리머라제(12U/μl : 파마시아 제조) 및 1μl T4 DNA 리가제(1.2U/μl, BRL)를 가하고 이 중합화 혼합물을 37℃에서 15분 항온처리한다. 이 반응을 65℃에서 5분간 가열하여 종료시킨다. 그후 중합화 혼합물을 최종 용적 100μl까지 희석하고, 실시예 1.5에 기술한 바와 같이 제조한 수용체 이. 콜라이 JM101(비-허용성) 및 이. 콜라이 RZ1032(허용성)을 형질감염시키기 위해 희석 혼합물의 분취량을 사용한다. 형질 감염된 세포를 실시예 1.5에 기술한 바와 같이 플레이팅 시킨다.
[실시예 2.1.3]
[돌연변이된 M13mp18-PK(BamHI-PvuⅡ)의 서열분석]
12개의 플라크를 형질전환된 이. 콜라이 JM010의 플레이트로부터 취하고, 파아지를 이. 콜라이 JM101을 숙주로 하여 증식시키며 각 파아지로부터 일본쇄 DNA를 실시예 2.1.1과 같이 분리한다. 분리된 이들 파아지의 일본쇄 DNA를 BRL의 M13 클로닝 및 서열화 매뉴얼에 기술된 바와 같이 'G-트랙' 분석으로 분석한다.
목적하는 돌연변이에 대한 예견되는 G 패턴을 갖는 3개의 파아지를 실시예 1.6에 기술된 바와 같이 서열 분석으로 분석한다. 이 파아지들은, pki 유전자의 해독 개시 부위에서 NsiI 부위를 지닌 예견되는 1053bp BamHI-PvuⅡ 다편을 포함한다.
돌연변이된 파아지들은 M13mp18-PK(BamHI-NsiI-PvuⅡ)로 명명한다.
[실시예 2.2]
[pPK-PLB의 작제]
pki 프로모터 영역을 함유하는 742pb BamHI/NsiI-단편을 M13mp18-PK(BamHI-NsiI-PvuⅡ)RF DNA로부터 분리하고, 펙틴리아제 B(pel B)에 대한 구조 유전자를 함유하는 2.6Kb BamHI/NsiI-단편을 실시예 1.1과 같은 방법에 따라 플라즈미드 pGW830으로부터 분리한다. 두 단편을 모두 탈인산화시킨 pBR322-벡터내에 연결시키고 다음과 같이 BamHI(제4도)으로 분해한다 : 100ng BamHI으로 분해한 pBR322 DNA를 250ng의 2.6kb pel B BamHI/NsiI-단편 및 250ng의 742 bppki BamHI/NsiI-단편과 혼합한다. 이 혼합물을 실시예 1.5에 기술된 바와 같이 연결시킨다. 희석시킨 연결 혼합물의 분취량을 실시예 1.5에서와 같이 제조한 수용체 이. 콜라이 JM101 세포를 형질전환하는데 사용한다. 이 형질전환 혼합물을 50ug/ml의 암피실린을 함유하는 LC-플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 항온처리한다. 플레이트에서 형질전환체를 취하여, 50ug/ml 암피실린을 함유하는 액상 LC 배지중 37℃에서 5시간 동안 생장시킨다. 플라스미드 DNA는 형질 전환체로부터 미니 프렙-분리에 의해 분리한다[참조 : Maniatis, et al., 1982. pp. 368-369]. BamHI, SphI, SmaI 및 BamHI와 NsiI의 배합으로 분해한 후, 예상되는 단편을 나타내는 플라스미드를 함유하는 형질 전환체는 프라이머로서 pel B 특이적 올리고뉴클에로타이드를 사용, 서열 분석으로 더 분석한다. 이 서열은 융합 유전자 pki-pel B의 예상되는 서열에 상응한다. 이 플라즈미드는 pPK-PLB로 부르며 실시예 1.5에 기술된 바와 같이 증식 및 정제한다.
[실시예 3]
[실시예 3.1]
[에이. 니거에 pPK-PLB의 도입]
실시예 2.2에서 수득한 플라즈미드 pPK-PLB는, 에이. 니거 N593을 플라즈미드 pGW613 및 pPK-PLB로 동시 공 형질전환시켜 에이. 니거내로 도입시킨다. pGW613은 선별 마커 유전자 pyr A를 포함한다.
에이. 니거 N593의 원형질체는, 에이. 니거 N593을 0.5% 효모추출물, 0.2% 카스아미노산, 50mM 글루코오즈 및 10mM의 우리딘을 보충한 최소 배지에서, 30℃에서 20시간 동안 성장시켜, 균사로부터 제조한다. 에이. 니거 N593의 원형질체 제조와 형질전환 방법은 구센 등[참조 : Goosen et al., 1987]이 기술한 방법에 따른다. 생성된 PYR+형질전환체를 상기 보충된 최소 배지상에서 생장시키고, pel B 유전자의 발현에 대해 분석한다.
[실시예 3.2]
[에이. 니거 N593의 PK-PLB 형질전환체 분석]
실시예 3.1에서 수득한 형질전환체 에이. 니거를 pel B 유전자 생성물, PLB 단백질의 형성에 대해 분석한다. 이들을 선별하고 10g 72%-에스테르화된 펙틴, 7.5g NH4NO3, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4, 1.5g KH2PO4, 0.5g 카스아미노산, 0.5g 효모추출물 및 0.5ml의 포자 성분의 스톡용액을 함유하고 H2O 1ℓ가 가해진 pH 6.0의 배지에서 18시간 동안 생장시킨다. 포자성분의 스톡 용액은 ℓ당 10g EDTA, 4.4g ZnSO4·7H2O, 1.01g MnCl2·4H2O, 0.32g CoCl2·6H2O, 0.315g CuSO4·5H2O, 0.22g(NH4)6Mo7O24·4H2O, 1.47g CaCl2·2H2O 및 1.0g FeSO4·7H2O로 구성되어 있다.
생장후 균사를 여과하여 제거하고 배양 여과물을, 10% 아크릴 아미드를 함유한 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. PLB 단백질은, 제조공급자들의 지시에 따라, 래빗으로부토의 PLⅡ에 대해 생성된 폴리클로날 항체[참조 : Van Houdenhoven, 1975] 및 알칼린 포스파타제(Bio Rad)에 접합된 양-항-래빗 항체를 사용하여, 웨스턴-블롯 검정(LKB의 2117 멀티포어 Ⅱ 세미-드라이 블롯 장치의 매뉴얼에 기재된 바와 같이)으로 검출한다. 분석된 형질전환체중, 약 70%가 PLB 단백질을 생산한다. 하나의 형질전환체가 또 다른 연구를 위해 선택된다. 이후로 이를 에이. 니거/PK-PLB로 부른다.
[실시예 3.3]
[에이. 니거의 pPK-PLB 형질전환체의 노던 분석]
실시예 3.2에 따라 선택된 에이. 니러 형질전환체 에이. 니거/PK-PLB를 pel B 특이적 mRNA 형성에 대해 분석한다. 이 형질전환체를, 탄소원이 2%(w/v) D-글루코오즈인 점을 제외하고 실시예 3.2에 기술한 바와 같이 30℃의 배지중에서 16시간 생장시킨다. 수거후, 균사를 종이판 사이에서 압착하여 재빨리 건조시키고 즉시 액체 질소에 담가 갈아버린다. 그후 1g의 분말화된 균사를 3ml 완충액(4.0M구아니듐 티오시아네이트, 50mM 트리스/HCl pH 7.5, 10mM EDTA pH 7.5, 1% β-머캅토에탄올, 2% 나트륨 라우릴 사르코시네이트)에 현탁시키고 1분간 블텍스시킨다.
원심분리(실온 10,000×g에서 10분)후 상등액을 회수한다.
각각의 2.5ml 상등액에 1g의 CsCl을 가한다. 이 샘플들은 SW50 벡맨 초원심분리관 중에서 5.7M CsCl, 0.1M EDTA(pH 7.5)의 쿠션상에 순차적으로 층을 이룬다. 원심분리를 벡맨 SW 50 로터를 사용하여 20℃에서 30,000rpm으로 16시간 수행한다. RNA 펠렛은 멸균 증류수에 용해시킨다. 샘플의 RNA 양은 아가로스겔 전기영동후 대략 균등한 농도로 조정한다. 대략 25μg의 RNA를 글리옥살 변성[참조 : Maniatis et al. (1982) Molecular cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York Page 200]을 이용하여 전개시킨다. RNA는 10.SSC를 전이 완충액으로 사용하여 진-바인드(파마시아사 제조)상에서 블로팅하고 80℃에서 1시간 동안 굽는다. 60℃에서 방사선 표지된 2.8Kbp XhoI 단편(이위에 pel B 유전자가 위치함)을 탐침으로 사용하고 처치 및 길버트[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1991-1995(1984)]가 기술한 하이브리드화 완충액(1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaPi pH 7.2, 7% SDS)을 사용하여 16시간 동안 하이브리드화를 수행한다. 블롯은 30분동안 2·SSC, 0.1% SDS로 2회 세척하고 그후 60℃에서 0.2·SSC, 0.1% SDS로 30분간 2회 세척한다. 블롯의 노출은 -70℃에서 코니카 X-레이 필름 및 강화 스크린을 사용하여 밤새 수행한다. 이 분석은 형질전환체에서 강한 pel B 특이적 mRNA 시그날을 나타내며 유사하게 생장시킨 대조군 균주 에이. 니거 N 400 중에서도 어떤 시그날도 나타내지 않는다.
[실시예 3.4]
에이. 니거/PK-PLB로부터 펙틴 리아제 B(PL B)의 생성, 정제 및 특성화
[실시예 3.4.1]
[펙틴 분해 효소 B를 제조하기 위한 배양 조건 및 효소의 분리]
7×106포자/ml의 밀도까지 600ml의 배양배지에 접종하기 위해 에이. 니거/PK-PLB 포자가 사용된다. 이 배지는 하기의 조성을 갖는다: 20g 글루코오즈, 7.5g NH4NO3, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4·7H2O, 15g KH2PO4, 5g 효모 추출물, 0.5g 리보핵산, 0.5ml의 포자 성분의 스톡 용액을 함유하며, H2O 1ℓ를 가함.
pH 6.0. 포자성분의 스톡 용액은 리터당 10g EDTA, 4.4g ZnSO4·7H2O, 1.01g MnCl2·4H2O, 0.32g CoCl2·6H2O, 0.315g CuSO4·5H2O, 0.22g(NH4)6Mo7O24·4H2O, 1.47g CaCl2·2H2O 및 1.0g의 FeSO4·7H2O로 구성되어 있다.이 배양물을 뉴 브룬스위크 오비탈 진탕기중에서, 30℃로 3시간 배양한 후 4ℓ의 동일한 배지를 함유한 10ℓ 플라스크로 이전시킨다. 이 배양물은 플라스크의 바닥에서 압축되어 있는 공기를 분산시키기 위해 스파저(sparger)를 사용하여 통기시키고 배양물을 교반시킨다. 생장은 30℃에서 16시간 동안 지속시킨다. 이 생장시기후, 배지의 pH는 5.8이다. 여과하여 균사를 제거하고 다음의 방법에 따라 배양 여과물로부터 PLB를 분리시킨다 :
효소는 0℃에서 암모늄 셀페이트 침전(95% 포화)에 이은 원심분리(8500xg, 15분)로 거의 정량적으로 회수한다. 침전된 효소는 pH 6.0의 50mM 인산나트륨 완충액 중에 용해시키고, 동일한 완충액에 대해 투석하여, -20℃에 보관한다. 펙틴리아제의 활성은 25℃에서, 반하우덴호벤(1975, p.11)이 기술한 바와 같이 분광광도계법을 사용하고 50mM 트리스/HCl 완충액, 1mM CaCl2, pH 8.5 중에서 최종농도 0.3%(w/v) 펙틴(94.6%의 에스테르화도)을 사용하여 검정한다.
SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 및 웨스턴 블롯에서 배양 여과물의 분석결과는 PL B와 상응하는 뚜렷한 단백질 밴드 및 침전 및 투석 분획물중 거의 순수한 효소를 나타낸다. 배양 여과물중의 특이적 펙틴 리아제 활성은 48μ/㎎ 단백직이며 침전 및 투석 분회 중에서의 경우는 216μ/㎎ 단백질이고 단백질 농도는 피어스 BCA 분석에 의해 측정된 바와 같이, 각각, 380㎎ 및 82.6㎎이다.
[실시예 3.4.2]
[PL B 단백질의 특성]
실시예 3.1.3 중에서 분리된 것과 같은 PLB의 겉보기 분자량은, 10% 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 측정된 바와 같은 39.5KDa이다. 정제된 효소는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 중에서 안정하지만, 높은 pH중에서는(즉, pH 7.5의 50mM 트리스/HCl 완충액 중에서) 서서히 불활성화 된다. 이런 불활성화는 가역적이며 활성은 효소 용액을 pH 6.0의 인산 완충액에 대해 투석함으로써 대부분 회복시킬 수 있다. 실시예 3.1.3 중에서 제조된 PLB는, 고도로 에스테르화된 펙틴(에스테르화도 94.6%)에서 기원된 올리고머성 분해 생성물로부터 알 수 있는 바와 같은, 전형적인 엔도-펙틴 분해효소이다. 이 효소는 표 1에 나타낸 바와 같이 고도로 에스테르화된 펙틴을 선호한다.
a 검정조건 : 0.5M NaCl(25℃에서)을 함유하는 50mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.5)중 0.3%(w/v)의 펙틴
PL B에 대한 미카엘리스-멘텐 파라메터가, pH 6.0의 인산나트륨 완충액중에 저장된 효소를 이용하여, 또한 측정되었다. 활성은, 상이한 농도의 고도로 에스테르화된 펙틴(에스테르화도 94.6%)을 사용하여, 0.5M NaCl 존재하에 25%에서 50mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.5) 중에서 검정되었다. 9mM의 Km값(단량체 기준으로) 및 51500의 전환속도가 수득되었다.
[실시예 4]
pki 프로모터의 조절하 사람 하이브리드 인터페론 BDBB의 발현
[실시예 4.1]
[플라즈미드 pGⅡ-IFN AM119 전구체의 작제]
이. 콜라이 JM109/pGW 1800(DSM 5505)으로부터 분리한 플라즈미드 pGW1800를 EcoRI으로 분해하여 하기와 같이 T4 폴리머라제로 처리한다. 이 DNA의 재연결 및 이. 콜라이 DH5αF'의 형질전환으로, EcoRI 분해 부위가 결실된 것을 제외하면, pGW1800와 동일한 플라즈미드 pGW 1800-E가 분리된다.
플라즈미드 pGW 1800-E를 BglⅡ로 분해하고 65℃에서 1시간 동안 50mM 트리스-HCl pH 8.0 및 50mM NaCl의 존재하 세균 알칼린 포스파타제(BRL)로 처리한다. 알칼린 포스파타제를 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim)로 분해시키고 페놀 추출시켜 불활성화시킨다. 이어서 DNA를 에탄올 침전시키고, 건조시켜 물에 재용해시킨다. 이어서 점성 말단을 하기와 같이 T4 DNA 폴리머라제로 충진시킨다.
플라스키드 pJDB207-IFN AM119(EP 205 404)를 HindⅢ 및 Cla I로 분해시킨다. 이들 선형 단편의 점성 말단을 37℃에서 30분간 각각 0.1mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP + 67mM 트리스-HCl pH 7.5, 6.7mM MgCl, 16.7mM(NH)SO및 5mM DTT의 존재하 T4DNA 폴리머라제(Boehringer Manmheim)로 충진시킨다. 반응을 5분간 65℃로 가열하여 중지시킨다. 단편을 0.8% 저겔화온도 아가로스(BioRad) 겔에서 분리하고 IFN AM119 암호화 영역을 포함하는 1kbp 단편을 절단하고 DNA를 일루팁(Elutip) D(Schleicher Schull) 컬럼 상에서 정제하여, 에탄올 침전시킨다(Schmitt Cohen, 1983).
100μg의 IFN AM119 단편 및 상기 제조한 pGW 1800-E를 5μl의 20mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl, 10mM DTT, 1mM ATP 및 1 유니트의 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim)에서 2시간 동안 실온에서 함께 연결시킨다. 이 혼합물을 수용체 이. 콜라이 DH 5αF' 세포내로 형질전환시킨다. 암피실린 내성 형질 전환체를 플라즈미드 DNA의 제한 효소 분해에 의해 스크리닝하여 플라즈미드 pGⅡ-IFN AM 119 전구체를 수반하는 것들을 동정한다.
[실시예 4.2]
[PCR을 사용한 pGIIss-IFN AM119의 제조]
하기 PCR 방법을 문헌[참조 : R.M. Horton et al. (1989)]에서 기술하고 있다. pGW 1800을 XbaI로 분해시켜 선형화하고 에탄올로 침전시킨다. 물에 재현탁시킨 후 이 DNA 100μg을 자동화 열 순환기에서 25사이클 동안(각각은 94℃에서 1분, 40℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 구성) 이어서 72℃에서 10분간 올리고뉴클레오타이드 A 및 C(각각 서열 동정 번호 제5번 및 제6번)를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭 시킨다. 100pM의 각각의 올리고뉴클레오타이드 및 0.5μl의 Taq 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus)는 공급자에 의해 추천된 반응 완충액을 사용하여 용적 100μl로 각각의 반응에 사용된다. 이는 DNA 2(서열 동정 번호 제7번)을 제공한다.
유사하게 BamHI으로 선형화하여 올리고뉴클레오타이드 D(서열 동정 번호 제8번) 및 F(서열 동정 번호 제9번)로 PCR시킨 pJDB207-IFN AM119는 DNA 3(서열 동정 번호 제10번)을 제공한다.
이들 반응 혼합물을 에탄올로 침전시켜, 물에 재용해 시키고 분획을 겔 상에서 확인하여 혼합물중 DNA 단편의 농도를 결정한다.
상기 DNA 2 및 3과 동일한 조건을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 A 및 F로 PCR시켜 성숙한 하이브리드 인터페론 BDBB에 대한 암호화 영역을 가진 PGⅡ 프로모터 단편에 연결된 PGⅡ 시그날 서열의 프레임 융합에서 퍼펙트를 포함하는 DNA 서열을 수득한다.
프레임 융합에서 퍼펙트를 포함하는 이러한 DNA의 BamHI-EcoRI 단편을 BamHI-EcoR 절단된 pGⅡ-IFN AM119 전구체내로 연결시켜 플라즈미드 pGIIss-IFN AM119를 제조한다. pGⅡ 시그날 서열, BDBB 하이브리드 IFN AM 119 유전자, 효모 pH 05 터미네이터를 포함하는 pGIIss-IFN AM119으 서열의 일부는 서열 동정 번호 제11번으로 묘사되어 있다.
[실시예 4.3]
[플라즈미 pPKI-IFN-l의 작제]
2μg의 pGW1100으로 pki 유전자의 3' 말단 부위에서 제한 엔도뉴클레아제 NsiI로 개환시킨다. 이 DNA를 DNA 2μg, 67mM 트리스/HCl pH 8.8, 6.7mm MgCl, 16.7mM(NH)SO, 5mM 디티오트레이톨, 각각 50μM의 dGTP, dATP, dCTP 및 dTTP, lU T4 폴리머라제를 함유하는 반응 혼합물 20μl 중에서 30분간 37℃에서 T4 폴리머라제로 처리한다. 에탄올 침전후 이 DNA 100ng을 DNA 100ng, 100pM 링커, 20mM 트리스/HCl pH 7.5, 10mM MgCl10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP 및 lU 리가제를 함유하는 반응 혼합물 5μl에서 2시간 동안 실온에서 서열 5'GGAATTCC를 갖는 10pM의 포스포릴화되지 않은 EcoRI 올리고뉴클레오타이드 링커와 연결시킨다. 이 혼합물을 이. 콜라이 DH5αF' 내로 형질전환시키고 2xYT+μg/ml 암피실린 상에서 세포를 포함하는 플라즈미드에 대해 선별한다. 18개 콜로니로부터 DNA를 제조하고 이들을 제한 효소 분해에 의해 스크리닝한 후, EcoRI 링커 서열을 포함하고 NsiI 부위가 결손된 플라즈미드 pGW1100-E를 동정한다.
실시예 4.2에 따라 제조한 플라즈미드 pGIIss-IFN AM 119는 아스퍼길러스 니거 PGⅡ 프로모터 및 사카로마이세스 세레비지애 pH 05 터미네이터 및 PGⅡ 터미네이터가 이어지는 IFN 유전자에 융합된 시그날 서열을 포함한다. 이 플라즈미드를 pH 05 프로모터의 말단에서 Pst I로 절단하고 T4 폴리머라제로 평활 말단화하여 서열 5'GGCATGCC를 갖는 SphI 올리고뉴클레오 타이드 링커에 연결시키고 상기와 같이 정확하게, 이. 콜라이 DH5α 내로 형질전환시켜 플라즈미드 pGIIss-IFN AM 119 Sph를 제조한다.
하기의 4개의 정제된 단편의 각각 50ng를 하기와 같이 함께 연결시킨다.
- 돌연변이된 M13mp18-PK(BamHI-NsiI-PvuII) RF DNA로부터의 pki 프로모터 영역을 포함하는 742 염기쌍의 BamHI/NsiI-단편.
NsiI 부위를 BamHI으로 절단하기 전에 NsiI 절단된 플라즈미드를 T4 폴리머라제로 처리하여 제거한다.
- PGIIss-IFN AM 119 SRh로부터의 PGⅡ 프로모터의 3'말단+PGⅡ 시그날 서열+IFN 유전자를 포함하는 약 1.1kbp의 BamHI/SphI 단편. BamHI 부위를 SphI로 절단하기 전에 T4 폴리머라제로 충진시킨다.
- pGW 1100-E로부터의 pki 유전자의 터미네이터 영역을 포함하는 417bp SphI/EcoRI 단편.
- BamHI/EcoRI 절단된 pTZ18R(Pharmacia)의 약 2.8kb 단편, 이. 콜라이 DH5αF'내로 형질전환시키고 스크리닝한 후 플라즈미드 pKI-IFN-1을 동정한다.
[실시예 4.4]
pPK I-IFN-2 및 pPKIssIFN-2를 제조하기 위한 pPKI-IFN-1의 돌연변이 유발
플라즈미드 pPKI-IFN-1을 dut-unt- 이. 콜라이 균주 BW313내로 형질전환시킨다. 이를 M13K07로 초감염시켜 플라즈미드로부터 일본쇄된 우라실-치환된 파아지를 수득한다. 이 파아지 DNA를 2개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 IFN-1 및 IFN-2 각각으로 상기와 같이 제조하여 돌연변이 유발시키는데, IFN-1 및 IFN-2의 서열들은 각각 서열 동정 번호 제12번 및 제 13번으로 기재된 서열로 묘사되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 IFN-1을 사용한 돌연변이 유발로 pPKI-IFN-1을, IFN-2를 사용한 돌연변이 유발은 pPKIssIFN-2를 수득한다. 두 플라즈미드는 프레임 융합에서 퍼펙트를 포함한다. pPKI-IFN-2는 메티오닌 개시 코돈에 융합된 pki 프로모터를 가지며, 이어서 IFN 유전자 및 pPKIssIFN-2의 나머지는 PGⅡ 시그날 서열에 융합된 pki 유전자, 이어서 IFN 유전자를 갖는다. pki 프로모터로부터 상부로 터미네이터 영역까지 걸쳐있는 pPKI-IFN-2 및 pPKIssIFN-2의 영역의 뉴클레오타이드 서열을 각각 서열 동정 번호 제14번 및 제15번으로 묘사하고 있다.
[실시예 4.5]
[에이. 니거내로 PKI-IFN 발현 플라즈미드의 형질전환]
플라즈미드 pPKI-IFN-2 및 pPKIssIFN-2는 상기한 바와 같이 플라즈미드 pGW613 상에서 선별가능한 마커로서 에이. 니거 pyr A를 사용하여 에이. 니거 N593내로 공형질 전환시킨다.
[실시예 4.6]
[형질전환체의 분석]
실시예 4.5로부터 작제한 형질전환체를 실시예 3.2에서 기술한 웨스턴 분석에 의한 IFN의 생성에 대해, 분석하지만, IFN에 대해 생성된 항체(항-PLⅡ 항체 대용)를 사용하여 분석 한다.
[수탁된 미생물]
부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen(Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig)에 이. 콜라이 DH5αF'/pGW1100을 1990년 1월 18일에 NO. DSM 5747로 기탁하고 에이. 니거 N593을 1990년 1월 26일에 NO. DSM 5756으로 기탁하였다.
[서열목록]
[서열 동정번호 제1번]
서열형 : 상응하는 단백질을 갖는 뉴클레오타이드
서열 길이 : 3605bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈
유기체 기원 : 아스퍼길러스 니거 N400
직접 실험원 : 이. 콜라이 DH5αF'/pGW1100로부터의 플라즈미드 pGW1100
특징 : 1에서부터1041bp까지 ; pki 프로모터 영역
831에서부터 835bp까지 ; 추정의 CAAT box
928에서부터 933bp까지 ; 추정의 TATA box
849에서부터 1040bp까지 ; CT 풍부영역
1042에서부터 3096bp까지 ; 피루베이트 키나제에 대한 암호화 영역
1166에서부터 1266bp까지 ; 인트론 1
1312에서부터 1370bp까지 ; 인트로 2
1418에서부터 1472bp까지 ; 인트로 3
1545에서부터 1606bp까지 ; 인트로 4
1729에서부터 1828bp까지 ; 인트론 5
2663에서부터 2711bp까지 ; 인트론 6
2794에서부터 2851bp까지 ; 인트론 7
[서열 동정번호 제2번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열 길이 : 21개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성 올리고뉴클레오타이드
특징 : 8번에서부터 13번까지 ; NsiI 부위
1번에서부터 7번까지 ; 에이. 니거 pki 뉴클레오타이드
1054번에서 1048까지(서열 동정 번호 제1번)에 대해 상보적
14번에서부터 21번까지 ; 에이. 니거 pki 뉴클레오타이드
1041번에서 1034번까지(서열 동정 번호 제1번)에 대해 상보적
성질 : 에이. 니거 pki 유전자의 1042번에서 1047번 위치에 있는 NsiI 부위의 도입을 위한 돌연변이 유발성 올리고 뉴클레오타이드 5926
AGCTGGCATG CATCTTGACG G 21
[서열 동정 번호 제3번]
서열형 : 폴리펩티드에 상응하는 뉴클레오타이드
서열길이 : 821bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
유기체의 기원 : 에이. 니거 N400
직접 실험원 : 이. 콜라이 JM109/pGW 1800(DSM 5505)의 pGW 1800(DSM5505)
특징 : 1에서부터 203bp까지 ; PGⅡ프로모터 영역
204에서부터 261bp까지 ; 시그날 펩티드
262에서부터 818bp까지 ; 프로-PGⅡ의 N-말단부분
성질 : 프로모터 영역, 시그날 서열 및 프로-PGⅡ의 N-말단을 포함하는 에이. 니거의 PGⅡ 유전자의 5' 말단 부위
[서열 동정 번호 제4번]
서열형 : 상응하는 폴리펩티드를 갖는 뉴클레오타이드
서열길이 : 653bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
유기체 기원 : 에이. 니거 N400
직접 실험원 : 이. 콜라이 JM109/pGW1800(DSM 5505)로부터의 pGW1800
특징 : 1에서부터 116bp까지 ; 프로-PGⅡ의 C-말단에 대한 암호화 영역
성질 : 프로-PGⅡ의 C말단을 포함하는 PGⅡ 유전자의 3'말단 부분
[서열 동정 번호 제5번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 20개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : 서열 동정 번호 제6번을 갖는 PGⅡ서열의 암호화 쇄의 1번에서 20번 염기까지와 동일하다.
성질 : PCR을 사용하는 이종 유전자를 갖는 정확한 PGⅡ 융합의 작제용 올리고뉴클레오타이드 A
AACGAGGATC CAGGGTCCTA 20
[서열 동정 번호 제6번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 32개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : 1번에서부터 12번까지 ; 성숙한 IFN의 아미노산 1번 내지 4번을 암호화하는 IFN AM 119 유전자의 영역에 대해 상보적
13번에서부터 32번까지 ; 서열 동정 번호 제6번을 갖는 PGⅡ서열의 암호화 쇄의 염기 260번에서 241번 위치에 대해 상보적
성질 : 정확한 PGIIss-IFN AM119 융합 유전자의 작제용으로 유용한 올리고-뉴클레오타이드 C
AGGCAGATCA CAAGCGAAGG TGGCGCGGC GA 32
[서열 동정 번호 제7번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 272개 염기
본쇄형 : 일본쇄, 암호화 쇄
형태 : 선형
분자형 : 재조합
직접 실험원 : PCR
특징 : 1번에서부터 203번까지 ; 에이. 니거 PGⅡ 프로모터 영역
204번에서부터 258번까지 ; 에이. 니거 PGⅡ 시그날 서열
259번에서부터 270번까지 ; IFN BDBB 하이브리드(IFN AM 199)의 N-말단
성질 : DNA2는 에이. 니거 PGⅡ 시그날 서열 및 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)의 N-말단 아미노산 1 내지 4의 프레임 융합에서 페펙트를 포함한다. 에이. 니거 숙주로부터 분포된 IFN의 생성물을 위한 발현 벡터의 작제를 위해 유용함.
[서열 동정 번호 제8번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 32개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : 1에서부터 12bp까지 ; 서열 동정 번호 제6번을 갖는 PGⅡ유전자의 암호화 쇄의 염기 249 내지 261과 동일함
13에서부터 32bp까지 ; 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)의 N-말단 아미노산 1 내지 7을 위한 암호화 영역과 동일함
성질 : 에이. 니거 PGⅡ시그날 서열에 대한 암호화 영역 및 IFN AM 119를 위한 암호화 영역의 프레임 융합에서 정확한 작제를 위한 올리고 뉴클레오타이드 D
[서열 동정 번호 제9번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 20개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : IFN AM 119(BDBB 하이브리드)유전자의 암호화 쇄의 3' 비-암화영역에 뻗쳐있는 것과 상보성, EcoRI 부위를 포함한다.
성질 : IFN AM 119의 발현을 위한 발현 벡터의 작제를 위한 올리고뉴클레오타이드 F
서열 동정 번호 제10번]
서열형 : 선형
서열길이 : 133개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 재조합
특징 : 1번에서부터 12번까지 ; 에이. 니거 PGⅡ 시그날 펩티드의 C 말단
13번에서부터 133번까지 ; 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)
성질 : DNA3은 에이. 니거 시그날 서열 C-말단 및 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)의 프레임 융함에 퍼펙트를 포함한다.
에이. 니거 숙주로부터 분비된 IFN의 생산용 발현 벡터의 작제를 위해 유용하다.
[서열 동정 번호 제11번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 990bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 재조합
직접 실험원 : 플라스미드 PCIIss IFN AM 119
특징 : 1에서부터 178bp까지 ; 에이. 니거 PGⅡ 프로모터
199에서부터 255bp까지 ; 에이. 니거 PGⅡ 시그날 서열
256에서부터 753bp까지 : 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)
756에서부터 984bp까지 : 효모 PHO5 터미네이터
1에서부터 6bp까지 : BamHI 부위
364에서부터 369bp까지 : EcoRI 부위
885에서부터 990bp까지 : PstI 부위
성질 : PGⅡ 시그날 서열과 PGⅡ 프로모터 및 PHO5 터미네이터에 연결된 인터페론 AM 119(BDBB 하이브리드)구조 유전자의 프레임 융합에서 퍼펙트를 포함하는 PCR에 의해 제조되는 BamHI-EcoRI 부위를 포함하는 pPGIIssIFN AM 119의 BamHI-PstI-단편.
[서열 동정 번호 제12번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 45개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : 염기 1번에서부터 16번까지, pki 프로모터 영역(서열 동정 번호 제1번)의 염기 1026번에서 1041번까지와 동일
염기 17번에서부터 19번까지 ; 개시코돈 ATG
염기 20번에서부터 45번까지 ; 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드)의 아미노산 1에서 9까지
성질 : PCR을 사용하여 에이. 니거 pki 프로모터 및 IFN AM 119 구조 유전자의 퍼펙트 융합의 제조에 유용한, 올리고 뉴클레오타이드 IFN-1
[서열 동정 번호 제13번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 42개 염기
본쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
분자형 : 합성적
특징 : 염기 1번에서부터 21번까지 ; pki 유전자(서열 동정 번호 제1, 프로모터 영역)의 암호화 쇄의 염기 1031번에서 1041번까지와 동일
염기 22번에서 42번까지 ; PGⅡ유전자(서열 동정 번호 제6, 시그날 서열)의 암호화 쇄의 염기 204번에서 224번까지와 동일.
성질 : PCR을 사용하여 에이. 니거 pki 프로모터 및 에이. 니거 PGⅡ 시그날 서열의 퍼펙트 융합의 제조에 유용한 , 올리고 뉴클레오타이드 IFN-2
[서열 동정 번호 제14번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 1901bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 재조합
직접실험원 : 플라즈미드 pPKI-IFN-2
특징 : 1에서부터 6bp까지 ; BamHI 부위
1에서부터 742bp까지 ; 서열 동정 번호 제1번을 갖는 서열의 300번 위치에서 상부로 1041번 위치까지 걸쳐있는 pki 프로모터 단편과 동일
742에서부터 744bp까지 ; 개시코돈 ATG
745에서부터 1243bp까지 ; IFN AM 119(BDBB 하이브리드)용 구조유전자
1244에서부터 1245bp까지 ; 정지코돈 TGA
1247에서부터 1476bp까지 ; 효모 PHO5 터미네이터 단편
1477에서부터 1842bp까지 ; SphI 부위
1483에서부터 1894bp까지 ; 에이. 니거 pki 터미네이터
1896에서부터 1901bp까지 ; EcoRI 부위
성질 : pPKI-IFN-2의 BamHI/EcoRI-단편, 개시 코돈, IFN AM119 구조 유전자 및 에이. 니거 pki 터미네이터 뿐만 아니라 효모 PHO5 터미네이터 영역의 부분을 포함하는 DNA 서열에 융합된 에이. 니거 pki 프로모터 단편을 포함한다.
[서열 동정 번호 제15번]
서열형 : 뉴클레오타이드
서열길이 : 2020bp
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 재조합
직접실험원 : 플라즈미드 pPKIssIFN-2
특징 : 1에서부터 6bp까지 ; BamHI 부위
1에서부터 742bp까지 ; 서열 동정 번호 제1번을 갖는 서열의 위치 300번 위치에서 상부로 1041번 위치까지 걸쳐있는 pki 프로모터 단편과 동일
743에서부터 799bp까지 ; 에이. 니거 PGⅡ시그날 서열
800에서부터 1297bp까지 ; 성숙한 IFN AM 119(BDBB 하이브리드) 구조 유전자
1298에서부터 1300bp까지 ; 정지 코돈 TGA
1301에서부터 1528bp까지 ; 효모 PHO5 터미네이터 단편
1519에서부터 1534bp까지 ; SphI 부위
1535에서부터 1984bp까지 ; 에이. 니거 pki 터미네이터
1950에서부터 1955bp까지 ; EcoRI 부위
성질 : pPKIss IFN-2의 BamHI/EcoRI-단편, PGⅡ 시그날 서열 및 IFN AM 119(BDBB 하이브리드) 구조 유전자의 프레임 융합에 있어서 퍼펙트 및 에이. 니거 pki 터미네이터 뿐만 아니라 효모 PHO5 터미네이터 영역의 부분에 융합된 에이. 니거 pki 프로모터 단편을 포함한다.

Claims (7)

  1. 동종 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 프루베이트 키나제(pki) 구조 유전자 이외의 폴리펩티드를 암호화하는 구조 유전자를, 서열 동정 번호 제1번에 기술된 DNA 서열의 약 300번 위치의 뉴클레오타이드로부터 약 1042번 위치의 뉴클레오타이드까지 걸쳐있는 아스퍼길러스 니거 피루베이트 키나제 전사(pki) 프로모터와 작동적으로 연결시키고, 이를 적합한 숙주내에서 발현시킴을 특징으로 하는, 폴리펩티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 숙주가 사상균 또는 효모인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 숙주가 폴리갈락투로나제 또는 펙틴 리아제를 발현할 수 없거나 폴리갈락투로나제 또는 펙틴 리아제를 소량으로 발현하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 숙주가 아스퍼길러스 니거, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 사람 하이브리드 인터페론 BDBB가 생산되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 아스퍼길러스 니거 펙틴 리아제가 생산되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 아스퍼길러스 니거 폴리갈락투로나제가 생산되는 방법.
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