<Desc/Clms Page number 1>
EXPRESSIECASSETTE VOOR HETEROLOGE EIWITTEN
De uitvinding betreft een expressiecassette, omvattende (A) een 5'-expressie controle systeem met (1) (a) een promotor met transcriptie controle sequenties (b) een transcriptie initiatie plaats ;
EMI1.1
(2) (a) translatie controle sequenties aan de 3'-kant van de transcriptie initiatie plaats (b) een translatie initiatie plaats ; (B) een voor een oligo- of polypeptide coderende sequentie, welke expressiecassette geschikt is voor het in filamenteuze schimmels tot expressie brengen van een oligo- of polypeptide.
Een dergelijke expressiecassette is beschreven door R. M. Berka en C. C. Barnett in een artikel genaamd : "The Development of Gene Expression Systems for Filamentous Fungi", Bio-tech. Adv. (1989) 7, blz. 127-154, en in WO-A-86/06097.
Zo een expressiecassette omvat de volgende componenten (1) een regio (de promotor) met 5'-transcriptie controle sequenties, en de transcriptie initiatie plaats ; (2) een regio ten behoeve van de translatie initiatie, inclusief de translatie initiatie plaats ; (3) een regio met sequenties die coderen voor het gewenste oligo- of polypeptide en voorts kan zo'n expressiecassette tevens omvatten : (4) indien extracellulaire productie dient plaats te vinden, een regio met secretie-bevorderende sequenties ;
<Desc/Clms Page number 2>
(5) een regio voor de regeling van transcriptie terminatie ; (6) een regio voor de regeling van polyadenylering.
Met een expressiecassette zoals hierboven beschreven is, kunnen heterologe eiwitten tot expressie gebracht worden in filamenteuze schimmels. Onder heteroloog eiwit wordt hier verstaan, een eiwit wiens expressie van nature niet door de in de expressiecassette aanwezige promotor wordt gecontroleerd. Voorts wordt in deze aanvrage met eiwit zowel een oligo- als een polypeptide aangeduid. Enkele voorbeelden van tot expressie gebrachte heterologe eiwitten zijn de productie van kalfs-chymosine in Aspergillus awamori (Ward, M. et al. Bio/Technology (1990) 8, 435-440), de productie van menselijk a-interferon in Aspergillus nidulans (Gwynne,
EMI2.1
D. et al. Bio/Technology (1987) 5, 713-719) en de productie van een lipase uit Humicola lanuginosus in Asperqillus oryzae (EP-A-0305216).
I.Ondanks het feit dat het met de huidige stand van de techniek mogelijk is heterologe eiwitten tot expressie te brengen in schimmels, bestaan er slechts weinig goede expressiecassettes. Daardoor is er dan ook een zeer grote behoefte aan nieuwe, verbeterde expressiecassettes, waarbij vooral een goede regulatie van de expressie van belang is. De expressiecassettes, die bijvoorbeeld zijn beschreven in WO-A-86/06097 worden o. a. geinduceerd door verbindingen, die het organisme als goed metaboliseerbare voedingsstof (C-bron) kan gebruiken zoals bijvoorbeeld threonine of ethanol. Zo'n inductor wordt dientengevolge geconsumeerd.
De onderhavige uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een expressiecassette, die de mogelijkheid biedt om de groei van het gastheerorganisme en de productie van het heterologe eiwit door dit gastheerorganisme onafhankelijk van elkaar te laten plaatsvinden.
Men spreekt dan van een gereguleerde expressiecassette,
<Desc/Clms Page number 3>
waarbij het gastheerorganisme opgekweekt kan worden tot de juiste celdichtheid, terwijl de expressie van het eiwit coderende deel in de expressiecassette op een laag niveau blijft. Het gewenste eiwit wordt dan dus niet of nauwelijks geproduceerd. Nadat de gewenste celdichtheid verkregen is, wordt vervolgens de expressie geinduceerd door toevoeging van een verbinding met inducerende werking. Met behulp van zo'n gereguleerde expressiecassette is de groei van het gastheerorganisme dus onafhankelijk te maken van de productie van het gewenste eiwit, vermits de inductor in de concentratie, waarin die in het medium voor het gastheerorganisme voorkomt niet een goed groeisubstraat is.
Een groot voordeel van het onafhankelijk zijn van groei en productie is, dat bijvoorbeeld een heteroloog eiwit dat toxisch is voor het gastheerorganisme in dit gastheerorganisme geproduceerd kan worden.
Verrassenderwijze zijn nu nieuwe expressiecassettes samengesteld, waarmee goede expressie van heteroloog eiwit verkregen wordt en waarmee bovendien groei van het gastheerorganisme onafhankelijk gemaakt kan worden van expressie van heteroloog eiwit.
Met deze nieuwe expressiecassettes is het dus mogelijk heteroloog eiwit efficiënt en effectief gereguleerd in filamenteuze schimmels tot expressie te brengen.
Dit doel is volgens de uitvinding bereikt doordat de expressiecassette een 5'-expressie controle systeem bevat waarin de promotor van het Aspergillus niger bphA gen aanwezig is en de voor een oligo- of polypeptide coderende sequentie niet codeert voor het Aspergillus niqer benzoaat-parahydroxylase (hierna te noemen BPH).
In het kader van deze octrooiaanvraag wordt onder de term heterologe eiwitten (cq. oligo- of polypeptiden) verstaan alle eiwitten anders dan het Aspergillus niger BPH. Onder de term promotor wordt verstaan een DNA fragment waarop sequenties gelegen zijn, die betrokken zijn bij de regulatie en initiatie van de transcriptie.
<Desc/Clms Page number 4>
Het is bijvoorbeeld voor een industriële toepassing van de uitvinding van groot voordeel, dat een stam met een expressiecassette volgens de uitvinding op goedkope en niet volledig gedefiniëerde media zoals bv. melasse kan groeien, zonder dat eiwitproductie geinduceerd wordt.
De promotor (la), die in de expressiecassettes volgens de onderhavige uitvinding aanwezig is, is de promotor van het bphA gen (benzoaat-parahydroxylase gen) van Aspergillus niger of een hieraan functioneel equivalente sequentie. De nucleotide sequentie van deze promotor is gegeven in figuur 1. Het is bekend dat niet de volledige sequentie essentiëel is voor de promotor activiteit, doch dat slechts een beperkt aantal van de nucleotiden, gelegen in bepaalde zones van de promotor, essentiëel zijn voor de werking ervan. De nucleotide volgorde, en het aantal nucleotiden in de niet essentiële zones, kan dan ook (binnen redelijke grenzen) gewijzigd worden zonder de werking van de promotor op essentiële
EMI4.1
wijze te beinvloeden.
Daarnaast is er ook bekend, dat bepaalde sequentiedelen in de essentiële zones vervangen kunnen worden door equivalente sequenties, zonder of met gering effect op de werking. Het zal duidelijk zijn dat dit soort nieuwe promotoren met essentiële zones van de Aspergillus niger bphA promotor of daarmee overeenkomstige sequenties ook in de nieuwe expressiecassettes gebruikt kunnen worden.
Bij voorkeur is de transcriptie-initiatie plaats (lb) tevens afkomstig van bovengenoemd bphA gen.
Ten aanzien van de translatie controlesequenties (2a) zijn in een eerste uitvoeringsvorm deze sequentie bij voorkeur afkomstig van het Aspergillus niger bphA gen. Dit heeft een voorkeur, omdat het gevormde mRNA relatief stabiel bleek te zijn. uit de nucleotide sequentie van de promotor van het bphA gen (zie figuur 1) blijkt dat de voor het mRNA coderende DNA sequentie drie ATG codons bevat, die gelegen
<Desc/Clms Page number 5>
zijn op de posities 5,48 en 287, gerekend vanaf de hoofd transcriptie initiatie plaats.
Ter vergelijking zij verwezen naar onderzoek van het trpC gen van Aspergillus niqer waarbij is gebleken dat de belangrijkste transcriptie initiatie plaatsen gelegen zijn op positie-5 en-6 vanaf het ATG initiatie codon (Kos, T. et al. ; Curr. Genet. (1988) 13,137-144). Ook op het trpC mRNA uit Aspergillus nidulans werd zo'n korte niet-coderende 5'-nucleotide sequentie aangetoond ; hierbij bleken de belangrijkste transcriptie initiatie plaatsen namelijk te liggen op positie-9 of-10 vanaf het AUG initiatie codon (Mullaney, E. J. et al. ; Mol. Gen. Genet.
(1985) 199,37-45). Daarnaast is voor eukaryoten bekend dat voornamelijk het eerste AUG codon op het mRNA gebruikt wordt als translatie initiatie plaats. Fusie van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie met de transcriptie en translatie controle sequentie van het bphA gen zou volgens de geldende leer derhalve het best plaats vinden op de positie van het eerste ATG codon.
Bijzonder opmerkelijk is echter gevonden dat juist zo'n fusie van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie en transcriptie en translatiecontrolesequentie van het bphA gen niet of nauwelijks leidt tot productie van heteroloog eiwit.
Verrassenderwijze is nu gevonden dat fusies van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie met de bphA transcriptie en translatiecontrolesequentie op de positie van het tweede zowel als het derde ATG codon tot uitstekende expressie eigenschappen leidt.
In een tweede uitvoeringsstap betreffende de translatiecontrolesequentie (2a), worden expressiecassettes samengesteld waarbij de translatiecontrolesequentie afkomstig is van het heterologe gen, waarvan ook de voor een eiwit coderende sequentie afkomstig is.
In een derde uitvoeringsvorm van de uitvinding betreffende de translatiecontrolesequentie (2a) worden
<Desc/Clms Page number 6>
expressiecassettes samengesteld met de bphA promotor in het 5'expressie controle systeem (deel la), waarbij de translatiecontrolesequenties (deel 2a) afkomstig is van een of meerdere heterologe genen. In die situatie is het 5'niet vertaalde deel van het mRNA ten minste ten dele afkomstig van een heteroloog gen dat van andere origine is dan het voor het eiwit coderende gen. Hoewel dit een extra stap kan betekenen kan dit van voordeel zijn, omdat de daarmee in te voeren translatiecontrolesequenties invloed kunnen hebben op translatieefficiëntie, stabiliteit van het 5-mRNA deel e. d.
De translatie-initiatieplaats (2b), te weten een ATG triplet, kan zowel zijn origine hebben in het bphA gen als de tot expressie te brengen sequentie.
De voor een eiwit coderende sequentie (B) kan een willekeurig voor een eiwit coderend gendeel zijn dat zowel een prokariotische, eukariotische of synthetische oorsprong kan hebben.
Meer in het bijzonder kan de voor een eiwit cq. oligo- of polypeptide coderende sequentie een sequentie zijn die codeert voor een industriëel enzym, voedingseiwit of een eiwit met farmaceutische werking, of voor eiwitten (precursors) die (al dan niet in situ) daarin omgezet kunnen worden.
Voorbeelden van oligopeptiden, die vervaardigd kunnen worden in schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding zijn hormonen, neurotransmitters, antibiotica en peptiden die gemodificeerd kunnen worden tot antibiotica. Voorbeelden van polypeptiden zijn interferon, en interleukines, bloedstollingsfactoren, en humaan of dierlijk groekhormoon. Voorbeelden van peptiden
EMI6.1
met andere dan farmaceutische werking, industriële enzymen, voedingseiwitten e. zijn lipase, (gluco) cellulase, pectinase, chymosine en fylase.
<Desc/Clms Page number 7>
Het is evenzeer mogelijk polypeptiden te maken die daarna omgezet worden in actieve enzymen. Zo wordt chymosine als pro-chymosine gemaakt, kan het efficiëntie verhogend werken om een enzym met een eiwitdeel te maken, dat de excretie uit de schimmel bevordert, of kan het noodzakelijk zijn dat het peptide wordt geglycosileerd.
Het is eveneens mogelijk een eiwit tot expressie te laten komen, dat in de cel het metabolisme beïnvloedt.
De expressiecassettes volgens de uitvinding worden bij voorkeur toegepast in filamenteuze ascomyceten,
EMI7.1
en dan vooral gekozen uit de reeks der genera Aspergillus, Trichoderma, Penicillium of verwanten. In het geval dat een Aspergillus sp. gebruikt wordt, gaat de voorkeur uit naar een zwarte Aspergillus of Aspergillus nidulans. In het bijzonder hebben Aspergillus niger, Aspergillus tubiqensis en Aspergillus awamori de voorkeur.
De uitvinding betreft dus tevens filamenteuze schimmels, bij voorkeur van de klasse der ascomyceten met een expressiecassette zoals boven beschreven. Deze filamenteuze schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding hebben het voordeel dat zij opgekweekt kunnen worden in gebruikelijke groeimedia zonder dat expressie van het eiwit waarvan de coderende sequentie aanwezig is in een expressiecassette volgens de uitvinding, plaats zal vinden.
De filamenteuze schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding kunnen geïnduceerd worden door een breed scala van verbindingen, welke weergegeven kunnen worden door de algemene formule :
X-fenyl- (A)-Y waarbij X een amino-of hydroxygroep danwel een waterstofof halogeenatoom is, A een al dan niet met een amino- of hydroxy-groep gesubstitueerde methyleengroep of een carbonylgroep is of ontbreekt, en Y bestaat uit een carboxylgroep of zouten, amides en esters met lagere alkoholen hiervan, danwel uit een aldehyde-, hydroxy- of hydroxymethylgroep. Voorbeelden van geschikte inducerende verbindingen zijn benzoëzuur, natrium-benzoaat,
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
D, fenylglyoxylzuur, p-aminobenzoëzuur, benzaldehyde, m-hydroxybenzoëzuur, p-hydroxybenzoëzuur en fenylazijnzuur.
De voorkeur gaat uit naar L-amandelzuur,p-aminobenzoëzuur, omdat deze verbinding een sterke inductie geeft, en in vergelijking tot benzoëzuur niet of nauwelijks toxisch is.
Al deze inductoren hebben het voordeel dat ze normaliter niet of slechts in zeer lage concentraties in het groeimedium van het gastheer organisme voorkomen, zodat tijdens de groei geen inductie plaatsvindt. Ter vergelijking zij opgemerkt dat inductie van de veel gebruikte qlaA promotor uit Asperqillus niqer (Fowler et al. ; Curr. Genet. (1990) 537-545) o. a. plaatsvindt door zetmeel, glucose en maltose. Een nadeel van dit type inducerende verbindingen is echter dat ze ook makkelijk als koolstofbron gebruikt kunnen worden door het gastheer organisme, waardoor geen ontkoppeling van groei en expressie verkregen kan worden.
Met behulp van de expressiecassettes volgens de uitvinding kan dus wel een echte ontkoppeling plaatsvinden van de groei van het gastheer organisme en de productie van het heterologe eiwit, omdat als inductor een verbinding gekozen kan worden die slechts in dusdanig lage concentratie voorkomt, dat daarop geen (substantiële) groei mogelijk is.
Uit de hierna volgende voorbeelden blijkt dat de expressiecassette volgens de uitvinding, na inductie met p-aminobenzoëzuur, een onverwacht hogere expressie geeft dan de expressiecassette met de constitutieve qpdA promotor uit Aspergillus niger. De expressiecassette volgens de uitvinding is dientengevolge ten minste van vergelijkbare sterkte als de expressiecassette met de qlaA promotor uit Aspergillus niqer na inductie met maltodextrine (zie Punt et al. ; J. Biotech (1991) 12 19-34). In niet geïnduceerde toestand bedraagt het expressieniveau van de expressiecassette volgens de uitvinding minder dan 2% ten opzichte van het niveau na inductie met p-aminobenzoëzuur.
<Desc/Clms Page number 9>
Het is voorts bekend dat de hoeveelheid geproduceerd eiwit sterk verhoogd kan worden door gebruik te maken van multicopy transformanten. Het zal duidelijk zijn dat de expressiecassette volgens de uitvinding ook met voordeel toegepast kan worden in een gastheerorganisme in een multicopy situatie.
Een cellijn met een expressiecassette volgens de uitvinding vertoont cataboliet repressie, het is indien gewenst voor de vakman eenvoudig mogelijk een niet-catabolietrepressieve mutant te isoleren.
De eiwitten (oligo-en/of polypeptiden) die gemaakt worden door het tot expressie brengen van de expressiecassette volgens de uitvinding kunnen gewonnen worden, verder worden omgezet, of worden gebruikt voor in situ reacties. Indien een eiwit al dan niet verder omgezet als zodanig gewonnen wordt is het van voordeel indien het eiwit wordt uitgescheiden door de schimmel, noodzakelijk is dit echter niet. Het kan echter ook van voordeel zijn de expressiecassette volgens de uitvinding te gebruiken om b. v. een enzym te produceren waarmee in de cel een primaire of secundaire metaboliet in-in voor de cellijnhoge opbrengst gemaakt wordt. Hierbij is dus meer sprake van een gemodificeerde cellijn, die metabolieten maakt zoals bijvoorbeeld fenylalanine, para-hydroxyfenylalanine, of bijvoorbeeld vitamines, antibiotica, steroiden of terpenoiden.
Ook kan zo'n cellijn geschikt zijn voor de afbraak van xenobiotica zoals b. v. PCB's, tolueen, DDT en dergelijke, zodat detoxificatie van bijvoorbeeld grond plaats kan vinden.
De uitvinding zal worden toegelicht aan de hand van de volgende niet beperkende voorbeelden. Bij deze voorbeelden zullen ook de figuren worden toegelicht.
Voorbeelden Algemeen
De strategie ter verkrijging en het testen van de expressiecassette volgens de uitvinding was als volgt :
<Desc/Clms Page number 10>
Allereerst is het hele bDhA gen inclusief de promotor uit Asperqillus niger ATCC 1015 geïsoleerd in een vector ingebracht, zoals beschreven in van Gorcom et al. in Mol. Gen. Genet. (1990) 223 pp. 192-197. De basevolgorde van de promotor, de translatiecontrolesequentie en een klein deel van de voor het BPH eiwit coderende sequentie is bepaald en weergegeven in Figuur 1.
Vervolgens werd in een aantal verschillende experimenten de promotor met eventueel een gedeelte van de translatiecontrolesequentie getest. Hiertoe werd uit de bovengenoemde vector een deel van het bphA gen geknipt en in een tweede vector gebracht waarin ook de nucleotide sequentie aan het begin van het E. II. coli lacZ gen aanwezig was.
Via in vitro mutagenese met speciaal gesynthetiseerde oligonucleotiden werd het gewenste deel van het bphA gen gekoppeld aan het lacZ gen. Daarna werd het relevante stuk DNA uit de vector geknipt en in een plasmide gebracht. Dit plasmide bezat het volledige lacZ gen, en eveneens als selectie marker een mutant vvrg gen van A. niger. Het plasmide werd daarna in een Asperqillus niger stam gebracht, die een pyro- mutant stam was. Door op pyrG prototrofie te screenen, konden transformanten gewonnen worden.
Op analoge wijze werd een expressiecassette gemaakt, die bestond uit een promotor afkomstig van het bphA gen, een translatiecontrole-sequentie van het A. nidulans qpdA gen, en de voor een eiwit (ss-galactosidase) coderende sequentie van het E. coli lacz gen. Het translatiecontrolegedeelte van het qpdA gen werd hiervoor gekozen, omdat bekend is dat dit een relatief stabiel 5'-mRNA geeft. Deze transformant wordt hierna bphA-qpdA transformant genoemd.
Er werden uiteindelijk 6 stammen vergeleken en getest op mate van expressie van lacs : het wild-type (Asperqillus niqer wt N245, een afgeleide van ATCC 1015),
<Desc/Clms Page number 11>
de drie transformanten met het translatiecontrolegedeelte van het bphA gen tot de le, 2e en 3e ATG op het voor mRNA coderende DNA : de bphA-gpdA transformant en, als referentie een A. niger transformant met een expressiecassette bestaande uit een A. niqer gpda promotor, een qpda translatiecontrolesequenties en een voor het lacZ eiwit coderende sequentie. Deze expressiecassette heeft een constitutieve promotor, dit is een promotor die inductie-onafhankelijk is, en dus altijd tot expressie komt.
1) Klonering van het bphA gen met de promotor en de karakterisering van de promotor en van het 5'gedeelte van het bphA gen
De promotor van het Aspergillus niger bphA gen werd gekloneerd uit het chromosomaal DNA van Aspergillus niger ATCC 1015 op het 9. 8 kb EcoRI fragment dat aanwezig is in plasmide pAB8-2 zoals beschreven in van Gorcom et al. in Mol. Gen. Genet. (1990) 223, pp. 192-197.
De DNA nucleotiden volgorde van de promotorregio vanaf een SalI site van het bphA gen werd bepaald met de methode beschreven door Sanger et al. Proc. Natl. Acad.
Sei. USA (1977) 74 pp. 5463-5467. De volgorde is weergegeven in figuur 1. Uit verdere proeven bleek dat alle relevante sequenties die betrokken zijn bij de efficiëntie, regulatie en initiatie van de transcriptie
EMI11.1
van het bphA gen ten minste gelegen zijn op een fragment, dat begint bij de SalI site die gelegen is op circa 1650 basenparen voor de start van het bphA gen. De belangrijkste (major transcription-initiation point) initiatieplaats van de transcriptie werd bepaald en is gelegen op nucleotide nummer 1645 in figuur 1. Een paar relevante knipplaatsen van restrictieënzymen zijn daar tevens aangegeven.
De nucleotidesequentie aanwezig na de initiatieplaats van de transcriptie (de translatie controlesequentie van het bphA gen) is eveneens aangegeven
<Desc/Clms Page number 12>
in figuur 1. In dit deel van het gen bleken er drie ATG codons aanwezig te zijn respectievelijk gelegen op 1650, 1693 en 1932. De eerste twee ATG initiatiecodons behoren toe aan open leesramen die kunnen leiden tot 2 oligo-peptiden van 18 resp. 5 aminozuren. Het derde is het initiatiecodon van het open leesraam dat codeert voor de BPH sequentie 2) Testen van promotor m. b. v. een reporterqen
De efficientie van de promotor van het bphA gen werd getest met behulp van een expressieanalyse systeem ontwikkeld voor schimmels door van Gorcom en van den Hondel Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052.
In zijn algemeenheid wordt hierbij de efficientie van een promotor bepaald door de promotor te plaatsen voor een zogenaamd reportergen (in dit geval het ss-galactosidase gen (lacZ) van E. coli). Deze zogenaamde fusiegenen worden, in één kopie, getest op een vaste plaats in het genoom van de schimmel, te weten het pyrG locus van Aspergillus niqer.
De plasmiden (expressieanalysevectoren) waar vanuit gegaan is zijn beschreven in het hierboven genoemde artikel.
Voorbeeld I Vervaardiginq van een plasmide met een expressiecassette met als promotor en translatiecontrolesequentie het 5' qedeelte van het bphA gen tot de 3e ATG (bp 1932, fiquur
EMI12.1
lli
Het circa 2. 1 kb SalI fragment, dat onder andere de promotor van het bphA gen bevat (Figuur 1) werd gekloneerd in de SalI site van vector ml3mpll (deze vector is beschreven door Messing in Methods Enzymol. 1983, 101, pp. 20-78). Er werd een vector geselecteerd waarin de translatierichting van het BPH gedeelte en de translatierichting van het lacZ-a gedeelte aanwezig in m13mpll identiek waren. Deze vector werd genoemd mAB8-81 en is weergegeven in figuur 2 (vervolg).
<Desc/Clms Page number 13>
Uitgaande van deze vector werd m. b. v. in vitro mutagenese experimenten, uitgevoerd volgens de methode van Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82, pp. 488-492) met behulp van het oligonucleotide aangegeven in figuur 2, (vervolg ; bovenste rechts onder) een nieuwe vector gemaakt (mAB8-83, figuur 3), waarin het translatie initiatiecodon van het BPH (de 3e ATG) in fase werd geplaatst voor de code van lacZ-a gedeelte van m13mpll. De door in vitro mutagenese ontstane fusie werd bevestigd met behulp van DNA sequentie analyse.
De promotor van het bphA gen en het eerste gedeelte van het fusiegen, gelegen op een SalI fragment is met behulp van SalI-BamHI adapters (sequentie zie figuur 3, rechtsboven) gekloneerd in de unieke BamHI site van de expressieanalyse vector pAB94-12 (van Gorcom en van den Hondel ; Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052). Een plasmide met een expressiecassette volgens de uitvinding, genoemd pAB94-83 (figuur 3, vervolg), waarin de bphA promotor, een-in frame-translatiefusie tussen het startcodon van BPH (3e ATG) en het volledige lacZ gen aanwezig waren werd gebruikt voor het verdere onderzoek.
De relevantie sequentie in het fusiegebied werd opnieuw geverifieerd.
Voorbeeld II en vergelijkend experiment A Vervaardiging van een plasmide met een expressiecassette met als promotor en translatiecontrolesequenties het 5' deel van het bphA gen tot respectievelijk het le en het 2e ATG codon (resp. bp 1650 en 1693 uit Fiquur l) :
Uitgaande van vector mAB8-81 werden door gebruik te maken van in vitro mutagenisatie technieken volgens de methode van Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82 pp. 488-492) twee vectoren gemaakt met oligonucleotiden zoals weergegeven in figuur 2 (vervolg), middelste en onderste rechts onder. Deze experimenten hebben geresulteerd in de vector mAB8-84 (le ATG fusie ; vergelijkend experiment A) en mAB8-85 (2e ATG fusie ;
<Desc/Clms Page number 14>
voorbeeld II). De door in vitro mutagenese ontstane fusies werden gecontroleerd met behulp van DNA sequentie analyse.
EMI14.1
Uit de resulterende vectoren mAB8-84 en werd het BamHI fragment met promotor en het eerste gedeelte van het fusie gen geïsoleerd, waarna deze in het grootste fragment dat ontstond na partiële BamHI digestie van vector mAB94-83 werd gecloneerd ; de gebruikte BamHI sites in mAB94-83 zijn gemerkt met een pijl (Figuur 3, vervolg).
Zodoende werd dus in pAB94-83 het BamHI fragment met het grootste gedeelte van de promotor en translatiecontrole sequenties vervangen door de overeenkomstige BamHI fragmenten uit mAB8-84 en mAB8-85. Dit heeft geresulteerd in de vectoren pAB94-84 (vergelijkend experiment A) en pAB94-85 (voorbeeld II) (figuur 4, vervolg). De relevante sequenties in het fusiegebied, werden opnieuw geverifieerd.
Voorbeeld III Vervaardiqinq van een plasmide met een expressiecassette met de promotor van het bohA-qen, en als translatiecontrolesequentie een deel van een qpdA-qen tot het ATG initiatiecodon van het cpdA open leesraam
De promotor van het bphA gen (figuur 1 t/m positie 1644) tot de transcriptiestart werd gefuseerd aan een bestaand construct waarin reeds het Aspergillus nidulans gpdA gen gefuseerd was aan het lacZ gen. Hiertoe is een PvuII-BamHI fragment dat de relevante sequenties (van voor de transcriptiestart tot na de translatiestart) van deze fusie bevat (beschreven door Punt et al. in Gene (1990) 93 101-109), geplaatst tussen de Smal en EcoRI sites van de tussenvector mAB8-81 (met behulp van een BamHI-EcoRI adapter ; zie figuur 5).
Dit heeft geresulteerd in de vector mAB8-82.
Met behulp van in vitro mutagenese volgens kunkel werden de transcriptiestartplaatsen van resp. het boha gen en het gpdA-lacZ fusiegen aan elkaar gekoppeld. Het gebruikte oligonucleotide is vermeld in figuur 5, vervolg.
<Desc/Clms Page number 15>
Op deze wijze is de vector mAB8-86 ontstaan. De door in vitro mutagenese ontstane fusie werd gecontroleerd met behulp van DNA sequentie analyse.
De promotor van het bphA gen en het eerste gedeelte van het fusiegen uit mAB8-86, gelegen op een SalI fragment werd met behulp van SalI-BamHI adapters (sequentie zie figuur 6) gekloneerd in de unieke BamHI site van de expressieanalyse vector pAB94-13 (van Gorcom en van den Hondel ; Nucleic Acids Res. (1988) 16 p. 9052).
Op deze wijze ontstond een in frame fusie van het startcodon van het bphA-gpdA-lacZ fusiegen aan het volledige lacZ gen aanwezig in de expressieanalyse vectoren. Het resultaat hiervan was de vector pAB94-86 (figuur 6, vervolg). De relevante sequentie in het fusiegebied werd opnieuw geverifieerd.
Van de vier vectoren zijn de geverifiëerde sequenties in het fusiegebied weergegeven in figuur 7.
Voorbeelden IV-XV en Vergelijkende experimenten B-N Transformatie van Asperqillus niqer N245 met de vier geconstrueerde expressieanalyse vectoren pAB94-83, -84, - 85 en-86 :
Aspergillus niqer N245 (ATCC 1015, csp, met,
EMI15.1
pyro) werd getransformeerd met de hiervoor beschreven geconstrueerde vectoren (pAB94-83,-84,-85 Tussen PyrG+ transformanten is met behulp van Southern blotting gezocht naar transformanten waarin een kopie van het betreffende plasmide geïntegreerd op het pyrG locus van het chromosomale DNA van de stam aanwezig was (overeenkomstig de methode beschreven door van Hartingsveldt et al. ; Mol. Gen. Genet. 206 (1986) pp.
71-75). Voor elk plasmide zijn op deze wijze twee onafhankelijke een-kopie transformanten geïsoleerd.
Analyse van de ss-qalactosidase expressie in wildtype Asperqillus niger, in de hiervoor genoemde geïsoleerde een-kopie transformanten en in Aspergillus niger met een
<Desc/Clms Page number 16>
constitutief tot expressie aebracht, qpdA-lacZ fusiegen :
Twee onafhankelijke een-kopie transformanten verkregen met de plasmide pAB94-83,-84,-85 en-86 werden gekweekt (en geïnduceerd) in diverse media en na oogsten geanalyseerd op hun ss-galactosidase aktiviteit. Ter vergelijking werden de uitgangsstam N245 en een
EMI16.1
Asperqillus niger-transformant waarin een kopie van een Aspergillus niger qpdA-lacZ fusie aanwezig was op het pyrG locus meegenomen (gebruikte stam (van Hartingsveldt et al. zie hiervoor) ; gebruikt plasmide pAB94-53 (figuur 8).
Dit plasmide is gedeponeerd, no.
Bij elk experiment werd gebruik gemaakt van sporen-suspensies die maximaal den week oud waren. Alle experimenten werden uitgevoerd in een New Brunswick G25 luchtincubator (roterend schudplateau) bij 300C en 300 rpm. Verder is steeds gebruik gemaakt van identieke 500 ml erlenmeyers.
De voorkweek werd uitgevoerd door 2x107 sporen te enten in 200 ml compleet medium (CM ; zie verder), + 1 mg/ml methionine (+ met), + 10 mM uridine (+ uri). Na 24 uur werden deze cultures afgefiltreerd over Miracloth (Calbiochem) en gewassen met l* DSM-medium zonder suikers (1* DSM-S ; zie verder), + met + uri. Hiervan werd 0, 3 gram na wassen met 50 ml l* DSM-S, + met, + uri, en vervolgnes met 50 mM Na-fosfaat pH 7, 1 mM MgCl2, 20 pM PMSF (proteaseremmer) ingevroren in vloeibare stikstof voor analyse voor vergelijkende experimenten B-D en voorbeelden IV-VI. Voorts werd 1 gram toegevoegd aan 125 ml 1* DSM-S, + met, + uri, + respectievelijke 0, 3%
EMI16.2
para-amino-benzoëzuur (paba) of 0, para-hydroxybenzoëzuur (phb) of 0, (benz.) (zie verder). Deze cultures werden 4 uur geincubeerd bij 30oC, 300 rpm.
Na deze inductie werd het mycelium opnieuw gefiltreerd over Miracloth en gewassen met l* DSM-S, + met, +uri en vervolgens met 50 mM Na-fosfaat pH 7, 1 mM MgCl2, 20 pm PMSF, 0, 3 gram van deze monsters werd
<Desc/Clms Page number 17>
ingevroren in vloeibare stikstof voor verdere analyse.
Alle mycellium monsters werden gemalen in een mortier in vloeibare stikstof en het mycelium poeder werd opgenomen i
EMI17.1
1 ml 50 mM Na-fosfaat buffer pH 7, 1 mM MgCl, 20 Mm PMSF (van Gorcom et al. Gene, (1985) 40, 99-106). Na ontdooien en vortexen werd deze suspensie 15'gecentrifugeerd bij ;40C (Eppendorf centrifuge 12. 000 rpm). Van het supernatant is de ss-galactosidase activiteit (Miller, in'Experiments in Molecular Genetics', Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) en de eiwitconcentratie bepaald met de Bradford methode, zoals beschreven in Anal. Biochem. (1976) 72 248-254.
De resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in de navolgende tabel.
<Desc/Clms Page number 18>
TABEL
EMI18.1
<tb>
<tb> Expe- <SEP> type <SEP> Gemiddelde <SEP> ss-galacto- <SEP> Sterkte <SEP> vergeleken
<tb> riment <SEP> schimmel <SEP> sidase <SEP> activiteit <SEP> met <SEP> A. <SEP> niger
<tb> + <SEP> spreiding <SEP> (units <SEP> promotor
<tb> per <SEP> mg <SEP> eiwit)
<tb> (Miller)
<tb> B <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 25 <SEP> (16-34)
<tb> IV <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (316-1481) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> C <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 300 <SEP> (221-462) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> V <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 275 <SEP> (32-1449) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> VI <SEP> bphA-gpdA <SEP> 650 <SEP> (215-1210) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> D <SEP> gpdA <SEP> 10. <SEP> 475 <SEP> (6833-13451) <SEP> 1
<tb> E <SEP> A. <SEP> niqer <SEP> wt <SEP> 75 <SEP> (14-274)
<tb> VII <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 3. <SEP> 550 <SEP> (847-7132) <SEP> 0.
<SEP> 22 <SEP>
<tb> F <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 550 <SEP> (242-1011) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> VIII <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 5. <SEP> 950 <SEP> (3384-8333) <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP>
<tb> IX <SEP> bphA-gpdA <SEP> 10. <SEP> 350 <SEP> (6128-18240) <SEP> 0. <SEP> 65 <SEP>
<tb> G <SEP> gpdA <SEP> 16. <SEP> 025 <SEP> (10694-19783) <SEP> 1
<tb> H <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 400 <SEP> (22-815)
<tb> X <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 20. <SEP> 450 <SEP> (13144-32222) <SEP> 1. <SEP> 31 <SEP>
<tb> J <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (339-1029) <SEP> < 0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> XI <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 24. <SEP> 675 <SEP> (14159-34050) <SEP> 1. <SEP> 58 <SEP>
<tb> XII <SEP> bphA-gpdA <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> (15091-39889) <SEP> 1. <SEP> 47 <SEP>
<tb> K <SEP> gpdA <SEP> 15. <SEP> 650 <SEP> (10785-20089) <SEP> 1
<tb> XIII <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 27.
<SEP> 675* <SEP>
<tb> N <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 500*
<tb> XIV <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 70. <SEP> 250* <SEP>
<tb> XV <SEP> bphA-gpdA <SEP> 41. <SEP> 675* <SEP>
<tb>
* waarden zijn een gemiddelde van twee metingen en dus minder betrouwbaar
<Desc/Clms Page number 19>
In experiment B-D en IV-VI zijn de 6 verschillende stammen getest zonder inductor. Alle typen, behalve de constitutieve stam (D) gaven een zeer lage ss-galactosidase activiteit.
In een tweede serie experimenten werden de 6 stammen geïnduceerd met parahydroxybenzoezuur. Het Asperqillus niger, wild type (exp. E), die geen expressiecassette bevatte en de niet functionele expressiecassette (fusie op het eerste ATG codon, exp. F) gaven geheel geen inductie te zien in vergelijking tot de constitutieve stam (exp. G). Voorbeelden VII, VIII en IX laten duidelijk zien dat verhoogde ss-galactosidase expressie optreedt ten opzichte van E of F.
Uit de derde serie blijkt een analoog beeld, zij het dat nu de met para-aminobenzoëzuur geinduceerde filamenteuze ascomyceten volgens de uitvinding zelfs een duidelijk grotere activiteit vertonen, dan de schimmels
EMI19.1
met het middels de gpda promotor constitutief tot expressie gebrachte lacZ gen (exp. K).
Uit de vierde serie blijkt, dat benzoëzuur ook een zeer geschikte inductor is.
Samenstelling gebruikte media : Compleet medium (CM) per liter AD : 2 g neopepton, 1 g gistextract, 20 ml 50*AspA (300 g NaN03'26 9 KCI, 76 g KH2P04 per liter ; stellen met 10 N
EMI19.2
KOH tot pH 5, 2 ml 1 M MgS04, 1 ml 1000*sporen (2, ZnS04. 5 g FeS04. 7 H2O, 0, 6 H2O, 0, 5 H2O, 0, Na2Mo04. 2 H20, 5 g EDTA in 100 ml AD na sterilisatie stellen met 10 N KOH op pH 6, 10 ml 50% glucose, 2 ml
5),vitamine oplossing (100 mg thiamine, 1000 mg riboflavine, 100 mg para-aminobenzoëzuur, 1000 mg nicotinamide, 500 mg pyridoxine, 100 mg pantotheenzuur, 2 mg biotine per liter), 10 ml 10% casaminozuren.
DSM medium zonder suikers (DSM-S) per liter kraanwater :
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
0, 7 H2O, 1, ureum.
A. niger N245 en plasmide pAB94-53 (in E. coli DH 5a) zijn op 26 september gedeponeerd bij het CBS in Baarn (NL).