<Desc/Clms Page number 1>
EXPRESSIECASSETTE VOOR HETEROLOGE EIWITTEN
De uitvinding betreft een expressiecassette, omvattende (A) een 5'-expressie controle systeem met (1) (a) een promotor met transcriptie controle sequenties (b) een transcriptie initiatie plaats ;
EMI1.1
(2) (a) translatie controle sequenties aan de 3'-kant van de transcriptie initiatie plaats (b) een translatie initiatie plaats ; (B) een voor een oligo- of polypeptide coderende sequentie, welke expressiecassette geschikt is voor het in filamenteuze schimmels tot expressie brengen van een oligo- of polypeptide.
Een dergelijke expressiecassette is beschreven door R. M. Berka en C. C. Barnett in een artikel genaamd : "The Development of Gene Expression Systems for Filamentous Fungi", Bio-tech. Adv. (1989) 7, blz. 127-154, en in WO-A-86/06097.
Zo een expressiecassette omvat de volgende componenten (1) een regio (de promotor) met 5'-transcriptie controle sequenties, en de transcriptie initiatie plaats ; (2) een regio ten behoeve van de translatie initiatie, inclusief de translatie initiatie plaats ; (3) een regio met sequenties die coderen voor het gewenste oligo- of polypeptide en voorts kan zo'n expressiecassette tevens omvatten : (4) indien extracellulaire productie dient plaats te vinden, een regio met secretie-bevorderende sequenties ;
<Desc/Clms Page number 2>
(5) een regio voor de regeling van transcriptie terminatie ; (6) een regio voor de regeling van polyadenylering.
Met een expressiecassette zoals hierboven beschreven is, kunnen heterologe eiwitten tot expressie gebracht worden in filamenteuze schimmels. Onder heteroloog eiwit wordt hier verstaan, een eiwit wiens expressie van nature niet door de in de expressiecassette aanwezige promotor wordt gecontroleerd. Voorts wordt in deze aanvrage met eiwit zowel een oligo- als een polypeptide aangeduid. Enkele voorbeelden van tot expressie gebrachte heterologe eiwitten zijn de productie van kalfs-chymosine in Aspergillus awamori (Ward, M. et al. Bio/Technology (1990) 8, 435-440), de productie van menselijk a-interferon in Aspergillus nidulans (Gwynne,
EMI2.1
D. et al. Bio/Technology (1987) 5, 713-719) en de productie van een lipase uit Humicola lanuginosus in Asperqillus oryzae (EP-A-0305216).
I.Ondanks het feit dat het met de huidige stand van de techniek mogelijk is heterologe eiwitten tot expressie te brengen in schimmels, bestaan er slechts weinig goede expressiecassettes. Daardoor is er dan ook een zeer grote behoefte aan nieuwe, verbeterde expressiecassettes, waarbij vooral een goede regulatie van de expressie van belang is. De expressiecassettes, die bijvoorbeeld zijn beschreven in WO-A-86/06097 worden o. a. geinduceerd door verbindingen, die het organisme als goed metaboliseerbare voedingsstof (C-bron) kan gebruiken zoals bijvoorbeeld threonine of ethanol. Zo'n inductor wordt dientengevolge geconsumeerd.
De onderhavige uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een expressiecassette, die de mogelijkheid biedt om de groei van het gastheerorganisme en de productie van het heterologe eiwit door dit gastheerorganisme onafhankelijk van elkaar te laten plaatsvinden.
Men spreekt dan van een gereguleerde expressiecassette,
<Desc/Clms Page number 3>
waarbij het gastheerorganisme opgekweekt kan worden tot de juiste celdichtheid, terwijl de expressie van het eiwit coderende deel in de expressiecassette op een laag niveau blijft. Het gewenste eiwit wordt dan dus niet of nauwelijks geproduceerd. Nadat de gewenste celdichtheid verkregen is, wordt vervolgens de expressie geinduceerd door toevoeging van een verbinding met inducerende werking. Met behulp van zo'n gereguleerde expressiecassette is de groei van het gastheerorganisme dus onafhankelijk te maken van de productie van het gewenste eiwit, vermits de inductor in de concentratie, waarin die in het medium voor het gastheerorganisme voorkomt niet een goed groeisubstraat is.
Een groot voordeel van het onafhankelijk zijn van groei en productie is, dat bijvoorbeeld een heteroloog eiwit dat toxisch is voor het gastheerorganisme in dit gastheerorganisme geproduceerd kan worden.
Verrassenderwijze zijn nu nieuwe expressiecassettes samengesteld, waarmee goede expressie van heteroloog eiwit verkregen wordt en waarmee bovendien groei van het gastheerorganisme onafhankelijk gemaakt kan worden van expressie van heteroloog eiwit.
Met deze nieuwe expressiecassettes is het dus mogelijk heteroloog eiwit efficiënt en effectief gereguleerd in filamenteuze schimmels tot expressie te brengen.
Dit doel is volgens de uitvinding bereikt doordat de expressiecassette een 5'-expressie controle systeem bevat waarin de promotor van het Aspergillus niger bphA gen aanwezig is en de voor een oligo- of polypeptide coderende sequentie niet codeert voor het Aspergillus niqer benzoaat-parahydroxylase (hierna te noemen BPH).
In het kader van deze octrooiaanvraag wordt onder de term heterologe eiwitten (cq. oligo- of polypeptiden) verstaan alle eiwitten anders dan het Aspergillus niger BPH. Onder de term promotor wordt verstaan een DNA fragment waarop sequenties gelegen zijn, die betrokken zijn bij de regulatie en initiatie van de transcriptie.
<Desc/Clms Page number 4>
Het is bijvoorbeeld voor een industriële toepassing van de uitvinding van groot voordeel, dat een stam met een expressiecassette volgens de uitvinding op goedkope en niet volledig gedefiniëerde media zoals bv. melasse kan groeien, zonder dat eiwitproductie geinduceerd wordt.
De promotor (la), die in de expressiecassettes volgens de onderhavige uitvinding aanwezig is, is de promotor van het bphA gen (benzoaat-parahydroxylase gen) van Aspergillus niger of een hieraan functioneel equivalente sequentie. De nucleotide sequentie van deze promotor is gegeven in figuur 1. Het is bekend dat niet de volledige sequentie essentiëel is voor de promotor activiteit, doch dat slechts een beperkt aantal van de nucleotiden, gelegen in bepaalde zones van de promotor, essentiëel zijn voor de werking ervan. De nucleotide volgorde, en het aantal nucleotiden in de niet essentiële zones, kan dan ook (binnen redelijke grenzen) gewijzigd worden zonder de werking van de promotor op essentiële
EMI4.1
wijze te beinvloeden.
Daarnaast is er ook bekend, dat bepaalde sequentiedelen in de essentiële zones vervangen kunnen worden door equivalente sequenties, zonder of met gering effect op de werking. Het zal duidelijk zijn dat dit soort nieuwe promotoren met essentiële zones van de Aspergillus niger bphA promotor of daarmee overeenkomstige sequenties ook in de nieuwe expressiecassettes gebruikt kunnen worden.
Bij voorkeur is de transcriptie-initiatie plaats (lb) tevens afkomstig van bovengenoemd bphA gen.
Ten aanzien van de translatie controlesequenties (2a) zijn in een eerste uitvoeringsvorm deze sequentie bij voorkeur afkomstig van het Aspergillus niger bphA gen. Dit heeft een voorkeur, omdat het gevormde mRNA relatief stabiel bleek te zijn. uit de nucleotide sequentie van de promotor van het bphA gen (zie figuur 1) blijkt dat de voor het mRNA coderende DNA sequentie drie ATG codons bevat, die gelegen
<Desc/Clms Page number 5>
zijn op de posities 5,48 en 287, gerekend vanaf de hoofd transcriptie initiatie plaats.
Ter vergelijking zij verwezen naar onderzoek van het trpC gen van Aspergillus niqer waarbij is gebleken dat de belangrijkste transcriptie initiatie plaatsen gelegen zijn op positie-5 en-6 vanaf het ATG initiatie codon (Kos, T. et al. ; Curr. Genet. (1988) 13,137-144). Ook op het trpC mRNA uit Aspergillus nidulans werd zo'n korte niet-coderende 5'-nucleotide sequentie aangetoond ; hierbij bleken de belangrijkste transcriptie initiatie plaatsen namelijk te liggen op positie-9 of-10 vanaf het AUG initiatie codon (Mullaney, E. J. et al. ; Mol. Gen. Genet.
(1985) 199,37-45). Daarnaast is voor eukaryoten bekend dat voornamelijk het eerste AUG codon op het mRNA gebruikt wordt als translatie initiatie plaats. Fusie van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie met de transcriptie en translatie controle sequentie van het bphA gen zou volgens de geldende leer derhalve het best plaats vinden op de positie van het eerste ATG codon.
Bijzonder opmerkelijk is echter gevonden dat juist zo'n fusie van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie en transcriptie en translatiecontrolesequentie van het bphA gen niet of nauwelijks leidt tot productie van heteroloog eiwit.
Verrassenderwijze is nu gevonden dat fusies van een voor een heteroloog eiwit coderende sequentie met de bphA transcriptie en translatiecontrolesequentie op de positie van het tweede zowel als het derde ATG codon tot uitstekende expressie eigenschappen leidt.
In een tweede uitvoeringsstap betreffende de translatiecontrolesequentie (2a), worden expressiecassettes samengesteld waarbij de translatiecontrolesequentie afkomstig is van het heterologe gen, waarvan ook de voor een eiwit coderende sequentie afkomstig is.
In een derde uitvoeringsvorm van de uitvinding betreffende de translatiecontrolesequentie (2a) worden
<Desc/Clms Page number 6>
expressiecassettes samengesteld met de bphA promotor in het 5'expressie controle systeem (deel la), waarbij de translatiecontrolesequenties (deel 2a) afkomstig is van een of meerdere heterologe genen. In die situatie is het 5'niet vertaalde deel van het mRNA ten minste ten dele afkomstig van een heteroloog gen dat van andere origine is dan het voor het eiwit coderende gen. Hoewel dit een extra stap kan betekenen kan dit van voordeel zijn, omdat de daarmee in te voeren translatiecontrolesequenties invloed kunnen hebben op translatieefficiëntie, stabiliteit van het 5-mRNA deel e. d.
De translatie-initiatieplaats (2b), te weten een ATG triplet, kan zowel zijn origine hebben in het bphA gen als de tot expressie te brengen sequentie.
De voor een eiwit coderende sequentie (B) kan een willekeurig voor een eiwit coderend gendeel zijn dat zowel een prokariotische, eukariotische of synthetische oorsprong kan hebben.
Meer in het bijzonder kan de voor een eiwit cq. oligo- of polypeptide coderende sequentie een sequentie zijn die codeert voor een industriëel enzym, voedingseiwit of een eiwit met farmaceutische werking, of voor eiwitten (precursors) die (al dan niet in situ) daarin omgezet kunnen worden.
Voorbeelden van oligopeptiden, die vervaardigd kunnen worden in schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding zijn hormonen, neurotransmitters, antibiotica en peptiden die gemodificeerd kunnen worden tot antibiotica. Voorbeelden van polypeptiden zijn interferon, en interleukines, bloedstollingsfactoren, en humaan of dierlijk groekhormoon. Voorbeelden van peptiden
EMI6.1
met andere dan farmaceutische werking, industriële enzymen, voedingseiwitten e. zijn lipase, (gluco) cellulase, pectinase, chymosine en fylase.
<Desc/Clms Page number 7>
Het is evenzeer mogelijk polypeptiden te maken die daarna omgezet worden in actieve enzymen. Zo wordt chymosine als pro-chymosine gemaakt, kan het efficiëntie verhogend werken om een enzym met een eiwitdeel te maken, dat de excretie uit de schimmel bevordert, of kan het noodzakelijk zijn dat het peptide wordt geglycosileerd.
Het is eveneens mogelijk een eiwit tot expressie te laten komen, dat in de cel het metabolisme beïnvloedt.
De expressiecassettes volgens de uitvinding worden bij voorkeur toegepast in filamenteuze ascomyceten,
EMI7.1
en dan vooral gekozen uit de reeks der genera Aspergillus, Trichoderma, Penicillium of verwanten. In het geval dat een Aspergillus sp. gebruikt wordt, gaat de voorkeur uit naar een zwarte Aspergillus of Aspergillus nidulans. In het bijzonder hebben Aspergillus niger, Aspergillus tubiqensis en Aspergillus awamori de voorkeur.
De uitvinding betreft dus tevens filamenteuze schimmels, bij voorkeur van de klasse der ascomyceten met een expressiecassette zoals boven beschreven. Deze filamenteuze schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding hebben het voordeel dat zij opgekweekt kunnen worden in gebruikelijke groeimedia zonder dat expressie van het eiwit waarvan de coderende sequentie aanwezig is in een expressiecassette volgens de uitvinding, plaats zal vinden.
De filamenteuze schimmels met een expressiecassette volgens de uitvinding kunnen geïnduceerd worden door een breed scala van verbindingen, welke weergegeven kunnen worden door de algemene formule :
X-fenyl- (A)-Y waarbij X een amino-of hydroxygroep danwel een waterstofof halogeenatoom is, A een al dan niet met een amino- of hydroxy-groep gesubstitueerde methyleengroep of een carbonylgroep is of ontbreekt, en Y bestaat uit een carboxylgroep of zouten, amides en esters met lagere alkoholen hiervan, danwel uit een aldehyde-, hydroxy- of hydroxymethylgroep. Voorbeelden van geschikte inducerende verbindingen zijn benzoëzuur, natrium-benzoaat,
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
D, fenylglyoxylzuur, p-aminobenzoëzuur, benzaldehyde, m-hydroxybenzoëzuur, p-hydroxybenzoëzuur en fenylazijnzuur.
De voorkeur gaat uit naar L-amandelzuur,p-aminobenzoëzuur, omdat deze verbinding een sterke inductie geeft, en in vergelijking tot benzoëzuur niet of nauwelijks toxisch is.
Al deze inductoren hebben het voordeel dat ze normaliter niet of slechts in zeer lage concentraties in het groeimedium van het gastheer organisme voorkomen, zodat tijdens de groei geen inductie plaatsvindt. Ter vergelijking zij opgemerkt dat inductie van de veel gebruikte qlaA promotor uit Asperqillus niqer (Fowler et al. ; Curr. Genet. (1990) 537-545) o. a. plaatsvindt door zetmeel, glucose en maltose. Een nadeel van dit type inducerende verbindingen is echter dat ze ook makkelijk als koolstofbron gebruikt kunnen worden door het gastheer organisme, waardoor geen ontkoppeling van groei en expressie verkregen kan worden.
Met behulp van de expressiecassettes volgens de uitvinding kan dus wel een echte ontkoppeling plaatsvinden van de groei van het gastheer organisme en de productie van het heterologe eiwit, omdat als inductor een verbinding gekozen kan worden die slechts in dusdanig lage concentratie voorkomt, dat daarop geen (substantiële) groei mogelijk is.
Uit de hierna volgende voorbeelden blijkt dat de expressiecassette volgens de uitvinding, na inductie met p-aminobenzoëzuur, een onverwacht hogere expressie geeft dan de expressiecassette met de constitutieve qpdA promotor uit Aspergillus niger. De expressiecassette volgens de uitvinding is dientengevolge ten minste van vergelijkbare sterkte als de expressiecassette met de qlaA promotor uit Aspergillus niqer na inductie met maltodextrine (zie Punt et al. ; J. Biotech (1991) 12 19-34). In niet geïnduceerde toestand bedraagt het expressieniveau van de expressiecassette volgens de uitvinding minder dan 2% ten opzichte van het niveau na inductie met p-aminobenzoëzuur.
<Desc/Clms Page number 9>
Het is voorts bekend dat de hoeveelheid geproduceerd eiwit sterk verhoogd kan worden door gebruik te maken van multicopy transformanten. Het zal duidelijk zijn dat de expressiecassette volgens de uitvinding ook met voordeel toegepast kan worden in een gastheerorganisme in een multicopy situatie.
Een cellijn met een expressiecassette volgens de uitvinding vertoont cataboliet repressie, het is indien gewenst voor de vakman eenvoudig mogelijk een niet-catabolietrepressieve mutant te isoleren.
De eiwitten (oligo-en/of polypeptiden) die gemaakt worden door het tot expressie brengen van de expressiecassette volgens de uitvinding kunnen gewonnen worden, verder worden omgezet, of worden gebruikt voor in situ reacties. Indien een eiwit al dan niet verder omgezet als zodanig gewonnen wordt is het van voordeel indien het eiwit wordt uitgescheiden door de schimmel, noodzakelijk is dit echter niet. Het kan echter ook van voordeel zijn de expressiecassette volgens de uitvinding te gebruiken om b. v. een enzym te produceren waarmee in de cel een primaire of secundaire metaboliet in-in voor de cellijnhoge opbrengst gemaakt wordt. Hierbij is dus meer sprake van een gemodificeerde cellijn, die metabolieten maakt zoals bijvoorbeeld fenylalanine, para-hydroxyfenylalanine, of bijvoorbeeld vitamines, antibiotica, steroiden of terpenoiden.
Ook kan zo'n cellijn geschikt zijn voor de afbraak van xenobiotica zoals b. v. PCB's, tolueen, DDT en dergelijke, zodat detoxificatie van bijvoorbeeld grond plaats kan vinden.
De uitvinding zal worden toegelicht aan de hand van de volgende niet beperkende voorbeelden. Bij deze voorbeelden zullen ook de figuren worden toegelicht.
Voorbeelden Algemeen
De strategie ter verkrijging en het testen van de expressiecassette volgens de uitvinding was als volgt :
<Desc/Clms Page number 10>
Allereerst is het hele bDhA gen inclusief de promotor uit Asperqillus niger ATCC 1015 geïsoleerd in een vector ingebracht, zoals beschreven in van Gorcom et al. in Mol. Gen. Genet. (1990) 223 pp. 192-197. De basevolgorde van de promotor, de translatiecontrolesequentie en een klein deel van de voor het BPH eiwit coderende sequentie is bepaald en weergegeven in Figuur 1.
Vervolgens werd in een aantal verschillende experimenten de promotor met eventueel een gedeelte van de translatiecontrolesequentie getest. Hiertoe werd uit de bovengenoemde vector een deel van het bphA gen geknipt en in een tweede vector gebracht waarin ook de nucleotide sequentie aan het begin van het E. II. coli lacZ gen aanwezig was.
Via in vitro mutagenese met speciaal gesynthetiseerde oligonucleotiden werd het gewenste deel van het bphA gen gekoppeld aan het lacZ gen. Daarna werd het relevante stuk DNA uit de vector geknipt en in een plasmide gebracht. Dit plasmide bezat het volledige lacZ gen, en eveneens als selectie marker een mutant vvrg gen van A. niger. Het plasmide werd daarna in een Asperqillus niger stam gebracht, die een pyro- mutant stam was. Door op pyrG prototrofie te screenen, konden transformanten gewonnen worden.
Op analoge wijze werd een expressiecassette gemaakt, die bestond uit een promotor afkomstig van het bphA gen, een translatiecontrole-sequentie van het A. nidulans qpdA gen, en de voor een eiwit (ss-galactosidase) coderende sequentie van het E. coli lacz gen. Het translatiecontrolegedeelte van het qpdA gen werd hiervoor gekozen, omdat bekend is dat dit een relatief stabiel 5'-mRNA geeft. Deze transformant wordt hierna bphA-qpdA transformant genoemd.
Er werden uiteindelijk 6 stammen vergeleken en getest op mate van expressie van lacs : het wild-type (Asperqillus niqer wt N245, een afgeleide van ATCC 1015),
<Desc/Clms Page number 11>
de drie transformanten met het translatiecontrolegedeelte van het bphA gen tot de le, 2e en 3e ATG op het voor mRNA coderende DNA : de bphA-gpdA transformant en, als referentie een A. niger transformant met een expressiecassette bestaande uit een A. niqer gpda promotor, een qpda translatiecontrolesequenties en een voor het lacZ eiwit coderende sequentie. Deze expressiecassette heeft een constitutieve promotor, dit is een promotor die inductie-onafhankelijk is, en dus altijd tot expressie komt.
1) Klonering van het bphA gen met de promotor en de karakterisering van de promotor en van het 5'gedeelte van het bphA gen
De promotor van het Aspergillus niger bphA gen werd gekloneerd uit het chromosomaal DNA van Aspergillus niger ATCC 1015 op het 9. 8 kb EcoRI fragment dat aanwezig is in plasmide pAB8-2 zoals beschreven in van Gorcom et al. in Mol. Gen. Genet. (1990) 223, pp. 192-197.
De DNA nucleotiden volgorde van de promotorregio vanaf een SalI site van het bphA gen werd bepaald met de methode beschreven door Sanger et al. Proc. Natl. Acad.
Sei. USA (1977) 74 pp. 5463-5467. De volgorde is weergegeven in figuur 1. Uit verdere proeven bleek dat alle relevante sequenties die betrokken zijn bij de efficiëntie, regulatie en initiatie van de transcriptie
EMI11.1
van het bphA gen ten minste gelegen zijn op een fragment, dat begint bij de SalI site die gelegen is op circa 1650 basenparen voor de start van het bphA gen. De belangrijkste (major transcription-initiation point) initiatieplaats van de transcriptie werd bepaald en is gelegen op nucleotide nummer 1645 in figuur 1. Een paar relevante knipplaatsen van restrictieënzymen zijn daar tevens aangegeven.
De nucleotidesequentie aanwezig na de initiatieplaats van de transcriptie (de translatie controlesequentie van het bphA gen) is eveneens aangegeven
<Desc/Clms Page number 12>
in figuur 1. In dit deel van het gen bleken er drie ATG codons aanwezig te zijn respectievelijk gelegen op 1650, 1693 en 1932. De eerste twee ATG initiatiecodons behoren toe aan open leesramen die kunnen leiden tot 2 oligo-peptiden van 18 resp. 5 aminozuren. Het derde is het initiatiecodon van het open leesraam dat codeert voor de BPH sequentie 2) Testen van promotor m. b. v. een reporterqen
De efficientie van de promotor van het bphA gen werd getest met behulp van een expressieanalyse systeem ontwikkeld voor schimmels door van Gorcom en van den Hondel Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052.
In zijn algemeenheid wordt hierbij de efficientie van een promotor bepaald door de promotor te plaatsen voor een zogenaamd reportergen (in dit geval het ss-galactosidase gen (lacZ) van E. coli). Deze zogenaamde fusiegenen worden, in één kopie, getest op een vaste plaats in het genoom van de schimmel, te weten het pyrG locus van Aspergillus niqer.
De plasmiden (expressieanalysevectoren) waar vanuit gegaan is zijn beschreven in het hierboven genoemde artikel.
Voorbeeld I Vervaardiginq van een plasmide met een expressiecassette met als promotor en translatiecontrolesequentie het 5' qedeelte van het bphA gen tot de 3e ATG (bp 1932, fiquur
EMI12.1
lli
Het circa 2. 1 kb SalI fragment, dat onder andere de promotor van het bphA gen bevat (Figuur 1) werd gekloneerd in de SalI site van vector ml3mpll (deze vector is beschreven door Messing in Methods Enzymol. 1983, 101, pp. 20-78). Er werd een vector geselecteerd waarin de translatierichting van het BPH gedeelte en de translatierichting van het lacZ-a gedeelte aanwezig in m13mpll identiek waren. Deze vector werd genoemd mAB8-81 en is weergegeven in figuur 2 (vervolg).
<Desc/Clms Page number 13>
Uitgaande van deze vector werd m. b. v. in vitro mutagenese experimenten, uitgevoerd volgens de methode van Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82, pp. 488-492) met behulp van het oligonucleotide aangegeven in figuur 2, (vervolg ; bovenste rechts onder) een nieuwe vector gemaakt (mAB8-83, figuur 3), waarin het translatie initiatiecodon van het BPH (de 3e ATG) in fase werd geplaatst voor de code van lacZ-a gedeelte van m13mpll. De door in vitro mutagenese ontstane fusie werd bevestigd met behulp van DNA sequentie analyse.
De promotor van het bphA gen en het eerste gedeelte van het fusiegen, gelegen op een SalI fragment is met behulp van SalI-BamHI adapters (sequentie zie figuur 3, rechtsboven) gekloneerd in de unieke BamHI site van de expressieanalyse vector pAB94-12 (van Gorcom en van den Hondel ; Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052). Een plasmide met een expressiecassette volgens de uitvinding, genoemd pAB94-83 (figuur 3, vervolg), waarin de bphA promotor, een-in frame-translatiefusie tussen het startcodon van BPH (3e ATG) en het volledige lacZ gen aanwezig waren werd gebruikt voor het verdere onderzoek.
De relevantie sequentie in het fusiegebied werd opnieuw geverifieerd.
Voorbeeld II en vergelijkend experiment A Vervaardiging van een plasmide met een expressiecassette met als promotor en translatiecontrolesequenties het 5' deel van het bphA gen tot respectievelijk het le en het 2e ATG codon (resp. bp 1650 en 1693 uit Fiquur l) :
Uitgaande van vector mAB8-81 werden door gebruik te maken van in vitro mutagenisatie technieken volgens de methode van Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82 pp. 488-492) twee vectoren gemaakt met oligonucleotiden zoals weergegeven in figuur 2 (vervolg), middelste en onderste rechts onder. Deze experimenten hebben geresulteerd in de vector mAB8-84 (le ATG fusie ; vergelijkend experiment A) en mAB8-85 (2e ATG fusie ;
<Desc/Clms Page number 14>
voorbeeld II). De door in vitro mutagenese ontstane fusies werden gecontroleerd met behulp van DNA sequentie analyse.
EMI14.1
Uit de resulterende vectoren mAB8-84 en werd het BamHI fragment met promotor en het eerste gedeelte van het fusie gen geïsoleerd, waarna deze in het grootste fragment dat ontstond na partiële BamHI digestie van vector mAB94-83 werd gecloneerd ; de gebruikte BamHI sites in mAB94-83 zijn gemerkt met een pijl (Figuur 3, vervolg).
Zodoende werd dus in pAB94-83 het BamHI fragment met het grootste gedeelte van de promotor en translatiecontrole sequenties vervangen door de overeenkomstige BamHI fragmenten uit mAB8-84 en mAB8-85. Dit heeft geresulteerd in de vectoren pAB94-84 (vergelijkend experiment A) en pAB94-85 (voorbeeld II) (figuur 4, vervolg). De relevante sequenties in het fusiegebied, werden opnieuw geverifieerd.
Voorbeeld III Vervaardiqinq van een plasmide met een expressiecassette met de promotor van het bohA-qen, en als translatiecontrolesequentie een deel van een qpdA-qen tot het ATG initiatiecodon van het cpdA open leesraam
De promotor van het bphA gen (figuur 1 t/m positie 1644) tot de transcriptiestart werd gefuseerd aan een bestaand construct waarin reeds het Aspergillus nidulans gpdA gen gefuseerd was aan het lacZ gen. Hiertoe is een PvuII-BamHI fragment dat de relevante sequenties (van voor de transcriptiestart tot na de translatiestart) van deze fusie bevat (beschreven door Punt et al. in Gene (1990) 93 101-109), geplaatst tussen de Smal en EcoRI sites van de tussenvector mAB8-81 (met behulp van een BamHI-EcoRI adapter ; zie figuur 5).
Dit heeft geresulteerd in de vector mAB8-82.
Met behulp van in vitro mutagenese volgens kunkel werden de transcriptiestartplaatsen van resp. het boha gen en het gpdA-lacZ fusiegen aan elkaar gekoppeld. Het gebruikte oligonucleotide is vermeld in figuur 5, vervolg.
<Desc/Clms Page number 15>
Op deze wijze is de vector mAB8-86 ontstaan. De door in vitro mutagenese ontstane fusie werd gecontroleerd met behulp van DNA sequentie analyse.
De promotor van het bphA gen en het eerste gedeelte van het fusiegen uit mAB8-86, gelegen op een SalI fragment werd met behulp van SalI-BamHI adapters (sequentie zie figuur 6) gekloneerd in de unieke BamHI site van de expressieanalyse vector pAB94-13 (van Gorcom en van den Hondel ; Nucleic Acids Res. (1988) 16 p. 9052).
Op deze wijze ontstond een in frame fusie van het startcodon van het bphA-gpdA-lacZ fusiegen aan het volledige lacZ gen aanwezig in de expressieanalyse vectoren. Het resultaat hiervan was de vector pAB94-86 (figuur 6, vervolg). De relevante sequentie in het fusiegebied werd opnieuw geverifieerd.
Van de vier vectoren zijn de geverifiëerde sequenties in het fusiegebied weergegeven in figuur 7.
Voorbeelden IV-XV en Vergelijkende experimenten B-N Transformatie van Asperqillus niqer N245 met de vier geconstrueerde expressieanalyse vectoren pAB94-83, -84, - 85 en-86 :
Aspergillus niqer N245 (ATCC 1015, csp, met,
EMI15.1
pyro) werd getransformeerd met de hiervoor beschreven geconstrueerde vectoren (pAB94-83,-84,-85 Tussen PyrG+ transformanten is met behulp van Southern blotting gezocht naar transformanten waarin een kopie van het betreffende plasmide geïntegreerd op het pyrG locus van het chromosomale DNA van de stam aanwezig was (overeenkomstig de methode beschreven door van Hartingsveldt et al. ; Mol. Gen. Genet. 206 (1986) pp.
71-75). Voor elk plasmide zijn op deze wijze twee onafhankelijke een-kopie transformanten geïsoleerd.
Analyse van de ss-qalactosidase expressie in wildtype Asperqillus niger, in de hiervoor genoemde geïsoleerde een-kopie transformanten en in Aspergillus niger met een
<Desc/Clms Page number 16>
constitutief tot expressie aebracht, qpdA-lacZ fusiegen :
Twee onafhankelijke een-kopie transformanten verkregen met de plasmide pAB94-83,-84,-85 en-86 werden gekweekt (en geïnduceerd) in diverse media en na oogsten geanalyseerd op hun ss-galactosidase aktiviteit. Ter vergelijking werden de uitgangsstam N245 en een
EMI16.1
Asperqillus niger-transformant waarin een kopie van een Aspergillus niger qpdA-lacZ fusie aanwezig was op het pyrG locus meegenomen (gebruikte stam (van Hartingsveldt et al. zie hiervoor) ; gebruikt plasmide pAB94-53 (figuur 8).
Dit plasmide is gedeponeerd, no.
Bij elk experiment werd gebruik gemaakt van sporen-suspensies die maximaal den week oud waren. Alle experimenten werden uitgevoerd in een New Brunswick G25 luchtincubator (roterend schudplateau) bij 300C en 300 rpm. Verder is steeds gebruik gemaakt van identieke 500 ml erlenmeyers.
De voorkweek werd uitgevoerd door 2x107 sporen te enten in 200 ml compleet medium (CM ; zie verder), + 1 mg/ml methionine (+ met), + 10 mM uridine (+ uri). Na 24 uur werden deze cultures afgefiltreerd over Miracloth (Calbiochem) en gewassen met l* DSM-medium zonder suikers (1* DSM-S ; zie verder), + met + uri. Hiervan werd 0, 3 gram na wassen met 50 ml l* DSM-S, + met, + uri, en vervolgnes met 50 mM Na-fosfaat pH 7, 1 mM MgCl2, 20 pM PMSF (proteaseremmer) ingevroren in vloeibare stikstof voor analyse voor vergelijkende experimenten B-D en voorbeelden IV-VI. Voorts werd 1 gram toegevoegd aan 125 ml 1* DSM-S, + met, + uri, + respectievelijke 0, 3%
EMI16.2
para-amino-benzoëzuur (paba) of 0, para-hydroxybenzoëzuur (phb) of 0, (benz.) (zie verder). Deze cultures werden 4 uur geincubeerd bij 30oC, 300 rpm.
Na deze inductie werd het mycelium opnieuw gefiltreerd over Miracloth en gewassen met l* DSM-S, + met, +uri en vervolgens met 50 mM Na-fosfaat pH 7, 1 mM MgCl2, 20 pm PMSF, 0, 3 gram van deze monsters werd
<Desc/Clms Page number 17>
ingevroren in vloeibare stikstof voor verdere analyse.
Alle mycellium monsters werden gemalen in een mortier in vloeibare stikstof en het mycelium poeder werd opgenomen i
EMI17.1
1 ml 50 mM Na-fosfaat buffer pH 7, 1 mM MgCl, 20 Mm PMSF (van Gorcom et al. Gene, (1985) 40, 99-106). Na ontdooien en vortexen werd deze suspensie 15'gecentrifugeerd bij ;40C (Eppendorf centrifuge 12. 000 rpm). Van het supernatant is de ss-galactosidase activiteit (Miller, in'Experiments in Molecular Genetics', Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) en de eiwitconcentratie bepaald met de Bradford methode, zoals beschreven in Anal. Biochem. (1976) 72 248-254.
De resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in de navolgende tabel.
<Desc/Clms Page number 18>
TABEL
EMI18.1
<tb>
<tb> Expe- <SEP> type <SEP> Gemiddelde <SEP> ss-galacto- <SEP> Sterkte <SEP> vergeleken
<tb> riment <SEP> schimmel <SEP> sidase <SEP> activiteit <SEP> met <SEP> A. <SEP> niger
<tb> + <SEP> spreiding <SEP> (units <SEP> promotor
<tb> per <SEP> mg <SEP> eiwit)
<tb> (Miller)
<tb> B <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 25 <SEP> (16-34)
<tb> IV <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (316-1481) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> C <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 300 <SEP> (221-462) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> V <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 275 <SEP> (32-1449) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> VI <SEP> bphA-gpdA <SEP> 650 <SEP> (215-1210) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> D <SEP> gpdA <SEP> 10. <SEP> 475 <SEP> (6833-13451) <SEP> 1
<tb> E <SEP> A. <SEP> niqer <SEP> wt <SEP> 75 <SEP> (14-274)
<tb> VII <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 3. <SEP> 550 <SEP> (847-7132) <SEP> 0.
<SEP> 22 <SEP>
<tb> F <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 550 <SEP> (242-1011) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> VIII <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 5. <SEP> 950 <SEP> (3384-8333) <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP>
<tb> IX <SEP> bphA-gpdA <SEP> 10. <SEP> 350 <SEP> (6128-18240) <SEP> 0. <SEP> 65 <SEP>
<tb> G <SEP> gpdA <SEP> 16. <SEP> 025 <SEP> (10694-19783) <SEP> 1
<tb> H <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 400 <SEP> (22-815)
<tb> X <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 20. <SEP> 450 <SEP> (13144-32222) <SEP> 1. <SEP> 31 <SEP>
<tb> J <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (339-1029) <SEP> < 0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> XI <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 24. <SEP> 675 <SEP> (14159-34050) <SEP> 1. <SEP> 58 <SEP>
<tb> XII <SEP> bphA-gpdA <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> (15091-39889) <SEP> 1. <SEP> 47 <SEP>
<tb> K <SEP> gpdA <SEP> 15. <SEP> 650 <SEP> (10785-20089) <SEP> 1
<tb> XIII <SEP> 3e <SEP> ATG <SEP> 27.
<SEP> 675* <SEP>
<tb> N <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 500*
<tb> XIV <SEP> 2e <SEP> ATG <SEP> 70. <SEP> 250* <SEP>
<tb> XV <SEP> bphA-gpdA <SEP> 41. <SEP> 675* <SEP>
<tb>
* waarden zijn een gemiddelde van twee metingen en dus minder betrouwbaar
<Desc/Clms Page number 19>
In experiment B-D en IV-VI zijn de 6 verschillende stammen getest zonder inductor. Alle typen, behalve de constitutieve stam (D) gaven een zeer lage ss-galactosidase activiteit.
In een tweede serie experimenten werden de 6 stammen geïnduceerd met parahydroxybenzoezuur. Het Asperqillus niger, wild type (exp. E), die geen expressiecassette bevatte en de niet functionele expressiecassette (fusie op het eerste ATG codon, exp. F) gaven geheel geen inductie te zien in vergelijking tot de constitutieve stam (exp. G). Voorbeelden VII, VIII en IX laten duidelijk zien dat verhoogde ss-galactosidase expressie optreedt ten opzichte van E of F.
Uit de derde serie blijkt een analoog beeld, zij het dat nu de met para-aminobenzoëzuur geinduceerde filamenteuze ascomyceten volgens de uitvinding zelfs een duidelijk grotere activiteit vertonen, dan de schimmels
EMI19.1
met het middels de gpda promotor constitutief tot expressie gebrachte lacZ gen (exp. K).
Uit de vierde serie blijkt, dat benzoëzuur ook een zeer geschikte inductor is.
Samenstelling gebruikte media : Compleet medium (CM) per liter AD : 2 g neopepton, 1 g gistextract, 20 ml 50*AspA (300 g NaN03'26 9 KCI, 76 g KH2P04 per liter ; stellen met 10 N
EMI19.2
KOH tot pH 5, 2 ml 1 M MgS04, 1 ml 1000*sporen (2, ZnS04. 5 g FeS04. 7 H2O, 0, 6 H2O, 0, 5 H2O, 0, Na2Mo04. 2 H20, 5 g EDTA in 100 ml AD na sterilisatie stellen met 10 N KOH op pH 6, 10 ml 50% glucose, 2 ml
5),vitamine oplossing (100 mg thiamine, 1000 mg riboflavine, 100 mg para-aminobenzoëzuur, 1000 mg nicotinamide, 500 mg pyridoxine, 100 mg pantotheenzuur, 2 mg biotine per liter), 10 ml 10% casaminozuren.
DSM medium zonder suikers (DSM-S) per liter kraanwater :
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
0, 7 H2O, 1, ureum.
A. niger N245 en plasmide pAB94-53 (in E. coli DH 5a) zijn op 26 september gedeponeerd bij het CBS in Baarn (NL).
<Desc / Clms Page number 1>
EXPRESSION CASSETTE FOR HETEROLOUS PROTEINS
The invention relates to an expression cassette comprising (A) a 5 'expression control system with (1) (a) a promoter with transcription control sequences (b) a transcription initiation site;
EMI1.1
(2) (a) translation control sequences at the 3 'side of the transcription initiation site (b) a translation initiation site; (B) an oligo or polypeptide coding sequence, which expression cassette is suitable for expressing an oligo or polypeptide in filamentous fungi.
One such expression cassette has been described by R. M. Berka and C. C. Barnett in an article entitled "The Development of Gene Expression Systems for Filamentous Fungi", Bio-tech. Adv. (1989) 7, pp. 127-154, and in WO-A-86/06097.
Such an expression cassette comprises the following components (1) a region (the promoter) with 5 'transcription control sequences, and the transcription initiation site; (2) a region for the translation initiation, including the translation initiation site; (3) a region of sequences encoding the desired oligo or polypeptide, and further such expression cassette may also comprise: (4) if extracellular production is to take place, a region of secretion-promoting sequences;
<Desc / Clms Page number 2>
(5) a region for the regulation of transcription termination; (6) a region for the control of polyadenylation.
With an expression cassette as described above, heterologous proteins can be expressed in filamentous fungi. Heterologous protein is here understood to mean a protein whose expression is not naturally controlled by the promoter contained in the expression cassette. Furthermore, in this application, protein refers to both an oligo and a polypeptide. Some examples of expressed heterologous proteins are the production of calf chymosin in Aspergillus awamori (Ward, M. et al. Bio / Technology (1990) 8, 435-440), the production of human α-interferon in Aspergillus nidulans ( Gwynne,
EMI2.1
D. et al. Bio / Technology (1987) 5, 713-719) and the production of a lipase from Humicola lanuginosus in Asperqillus oryzae (EP-A-0305216).
I. Despite the fact that it is possible with the prior art to express heterologous proteins in fungi, few good expression cassettes exist. As a result, there is a very great need for new, improved expression cassettes, in which especially good regulation of the expression is important. The expression cassettes described, for example, in WO-A-86/06097 are, among other things, induced by compounds which the organism can use as a highly metabolizable nutrient (C source), such as, for example, threonine or ethanol. Such an inductor is consequently consumed.
In particular, the present invention relates to an expression cassette which allows the growth of the host organism and the production of the heterologous protein by this host organism to take place independently of one another.
This is called a regulated expression cassette,
<Desc / Clms Page number 3>
wherein the host organism can be grown to the correct cell density, while the expression of the protein coding moiety in the expression cassette remains at a low level. The desired protein is then not or hardly produced. After the desired cell density is obtained, expression is then induced by adding a compound having an inducing action. Thus, with the aid of such a regulated expression cassette, the growth of the host organism can be made independent of the production of the desired protein, since the inducer in the concentration in which it occurs in the medium for the host organism is not a good growth substrate.
A great advantage of being independent of growth and production is that, for example, a heterologous protein that is toxic to the host organism can be produced in this host organism.
Surprisingly, new expression cassettes have now been assembled, which provide good expression of heterologous protein and, moreover, which make growth of the host organism independent of expression of heterologous protein.
Thus, with these new expression cassettes it is possible to express heterologous protein efficiently and effectively in filamentous fungi.
This object has been achieved according to the invention in that the expression cassette contains a 5 'expression control system in which the promoter of the Aspergillus niger bphA gene is present and the oligo or polypeptide encoding sequence does not encode the Aspergillus niqer benzoate parahydroxylase (hereinafter: to be called BPH).
For the purposes of this patent application, the term heterologous proteins (or oligo or polypeptides) is understood to mean all proteins other than Aspergillus niger BPH. The term promoter is understood to mean a DNA fragment on which sequences are located, which are involved in the regulation and initiation of the transcription.
<Desc / Clms Page number 4>
For example, it is of great advantage for an industrial application of the invention that a strain with an expression cassette according to the invention can grow on cheap and not fully defined media such as, for example, molasses, without inducing protein production.
The promoter (1a) present in the expression cassettes of the present invention is the promoter of the bphA gene (benzoate parahydroxylase gene) from Aspergillus niger or a functionally equivalent sequence. The nucleotide sequence of this promoter is given in Figure 1. It is known that not the complete sequence is essential for the promoter activity, but only a limited number of the nucleotides located in certain zones of the promoter are essential for the action. of it. The nucleotide sequence, and the number of nucleotides in the non-essential zones, can therefore be changed (within reasonable limits) without the action of the promoter on essential
EMI4.1
influence in a way.
In addition, it is also known that certain sequence parts in the essential zones can be replaced by equivalent sequences, with no or little effect on activity. It will be understood that this type of new promoters with essential zones of the Aspergillus niger bphA promoter or corresponding sequences can also be used in the new expression cassettes.
Preferably, the transcription initiation site (lb) also originates from the above bphA gene.
Regarding the translation control sequences (2a), in a first embodiment, this sequence preferably originates from the Aspergillus niger bphA gene. This is preferred because the mRNA formed was found to be relatively stable. the nucleotide sequence of the promoter of the bphA gene (see figure 1) shows that the DNA sequence encoding the mRNA contains three ATG codons located
<Desc / Clms Page number 5>
are at positions 5.48 and 287 from the main transcription initiation site.
For comparison, reference is made to research of the trpC gene from Aspergillus niqer where it has been found that the major transcription initiation sites are located at position-5 and -6 from the ATG initiation codon (Kos, T. et al.; Curr. Genet. 1988) 13,137-144). Such a short non-coding 5 'nucleotide sequence was also demonstrated on the trpC mRNA from Aspergillus nidulans; namely, the major transcription initiation sites were found to lie at position-9 or-10 from the AUG initiation codon (Mullaney, E. J. et al .; Mol. Gen. Genet.
(1985) 199, 37-45). In addition, it is known for eukaryotes that mainly the first AUG codon on the mRNA is used as translation initiation site. Accordingly, fusion of a heterologous protein coding sequence with the transcription and translation control sequence of the bphA gene would best take place at the position of the first ATG codon.
It has been found particularly remarkable, however, that precisely such a fusion of a sequence encoding a heterologous protein and transcription and translation control sequence of the bphA gene hardly, if at all, lead to production of heterologous protein.
Surprisingly, it has now been found that fusions of a heterologous protein coding sequence with the bphA transcription and translation control sequence at the position of the second as well as the third ATG codon lead to excellent expression properties.
In a second execution step regarding the translation control sequence (2a), expression cassettes are assembled in which the translation control sequence originates from the heterologous gene, from which also the protein coding sequence originates.
In a third embodiment of the invention concerning the translation control sequence (2a)
<Desc / Clms Page number 6>
expression cassettes assembled with the bphA promoter in the 5 'expression control system (part 1a), the translation control sequences (part 2a) coming from one or more heterologous genes. In that situation, the untranslated portion of the mRNA is at least in part derived from a heterologous gene of different origin than the gene encoding the protein. Although this may represent an additional step, it may be advantageous, because the translation control sequences to be introduced therewith can influence translation efficiency, stability of the 5-mRNA part e. d.
The translation initiation site (2b), namely an ATG triplet, may originate in the bphA gene or the sequence to be expressed.
The protein coding sequence (B) may be any protein coding gene part which may have a prokariotic, eukariotic or synthetic origin.
More in particular, the protein or. oligo or polypeptide coding sequence are a sequence encoding an industrial enzyme, food protein or a protein with pharmaceutical activity, or proteins (precursors) that can be converted (in situ or otherwise) therein.
Examples of oligopeptides that can be made in fungi with an expression cassette according to the invention are hormones, neurotransmitters, antibiotics and peptides that can be modified into antibiotics. Examples of polypeptides are interferon, and interleukins, blood clotting factors, and human or animal growth hormone. Examples of peptides
EMI6.1
with other than pharmaceutical action, industrial enzymes, food proteins e. are lipase, (gluco) cellulase, pectinase, chymosin and phylase.
<Desc / Clms Page number 7>
It is equally possible to make polypeptides which are subsequently converted into active enzymes. For example, chymosin is made as pro-chymosin, it may increase the efficiency of making an enzyme with a protein moiety that promotes excretion from the fungus, or it may be necessary for the peptide to be glycosylated.
It is also possible to express a protein that affects metabolism in the cell.
The expression cassettes according to the invention are preferably used in filamentous ascomycetes,
EMI7.1
and especially chosen from the series of genera Aspergillus, Trichoderma, Penicillium or relatives. In the event that an Aspergillus sp. black Aspergillus or Aspergillus nidulans is preferred. In particular, Aspergillus niger, Aspergillus tubiqensis and Aspergillus awamori are preferred.
The invention therefore also relates to filamentous fungi, preferably of the class of ascomycetes with an expression cassette as described above. These filamentous fungi with an expression cassette according to the invention have the advantage that they can be grown in conventional growth media without expression of the protein whose coding sequence is present in an expression cassette according to the invention.
The filamentous fungi with an expression cassette according to the invention can be induced by a wide variety of compounds, which can be represented by the general formula:
X-phenyl- (A) -Y where X is an amino or hydroxy group or a hydrogen or halogen atom, A is an methyl or group substituted or not substituted with an amino or hydroxy group or a carbonyl group, and Y is a carboxyl group or salts, amides and esters with lower alcohols thereof, or from an aldehyde, hydroxy or hydroxymethyl group. Examples of suitable inducing compounds are benzoic acid, sodium benzoate,
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
D, phenylglyoxylic acid, p-aminobenzoic acid, benzaldehyde, m-hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid and phenylacetic acid.
Preference is given to L-mandelic acid, p-aminobenzoic acid, because this compound gives a strong induction and is hardly, if at all, toxic compared to benzoic acid.
All these inducers have the advantage that they do not normally occur in the growth medium of the host organism, or only in very low concentrations, so that no induction takes place during growth. For comparison, it should be noted that induction of the widely used qlaA promoter from Asperqillus Niqer (Fowler et al .; Curr. Genet. (1990) 537-545) among others is effected by starch, glucose and maltose. However, a drawback of this type of inducing compounds is that they can also be easily used as a carbon source by the host organism, whereby no decoupling of growth and expression can be obtained.
With the aid of the expression cassettes according to the invention a true decoupling of the growth of the host organism and the production of the heterologous protein can thus take place, because as inducer a compound can be chosen which only occurs in such a low concentration that no ( substantial) growth is possible.
The following examples show that the expression cassette according to the invention, after induction with p-aminobenzoic acid, gives an unexpectedly higher expression than the expression cassette with the constitutive qpdA promoter from Aspergillus niger. The expression cassette according to the invention is therefore at least of comparable strength to the expression cassette with the qlaA promoter from Aspergillus niqer after induction with maltodextrin (see Punt et al.; J. Biotech (1991) 12 19-34). In the uninduced state, the expression level of the expression cassette according to the invention is less than 2% compared to the level after induction with p-aminobenzoic acid.
<Desc / Clms Page number 9>
It is further known that the amount of protein produced can be greatly increased by using multicopy transformants. It will be clear that the expression cassette according to the invention can also advantageously be used in a host organism in a multicopy situation.
A cell line with an expression cassette according to the invention shows catabolite repression, if desired it is easily possible for the skilled person to isolate a non-catabolite repressive mutant.
The proteins (oligo and / or polypeptides) made by expressing the expression cassette of the invention can be recovered, further converted, or used for in situ reactions. If a protein is recovered or not further converted as such, it is advantageous if the protein is secreted by the fungus, however this is not necessary. However, it may also be advantageous to use the expression cassette according to the invention to b. v. produce an enzyme that makes a primary or secondary metabolite in-in to the cell line yield in the cell. This therefore refers more to a modified cell line, which makes metabolites such as, for example, phenylalanine, para-hydroxyphenylalanine, or, for example, vitamins, antibiotics, steroids or terpenoids.
Such a cell line can also be suitable for the breakdown of xenobiotics such as b. v. PCBs, toluene, DDT and the like, so that detoxification of, for example, soil can take place.
The invention will be illustrated by the following non-limiting examples. The figures will also be elucidated in these examples.
Examples General
The strategy for obtaining and testing the expression cassette of the invention was as follows:
<Desc / Clms Page number 10>
First, the whole bDhA gene including the promoter from Asperqillus niger ATCC 1015 isolated has been inserted into a vector, as described in van Gorcom et al. In Mol. Gene. Genet. (1990) 223 pp. 192-197. The promoter base sequence, translation control sequence, and a small portion of the BPH protein coding sequence is determined and shown in Figure 1.
Then, in a number of different experiments, the promoter was tested with possibly a portion of the translation control sequence. To this end, a part of the bphA gene was excised from the above vector and brought into a second vector which also contains the nucleotide sequence at the beginning of the E. II. coli lacZ gene was present.
The desired portion of the bphA gene was linked to the lacZ gene via in vitro mutagenesis with specially synthesized oligonucleotides. The relevant piece of DNA was then cut from the vector and placed in a plasmid. This plasmid had the complete lacZ gene, and also as a selection marker a mutant vvrg gene of A. niger. The plasmid was then placed in an Asperqillus niger strain, which was a pyromutant strain. Transformants could be recovered by screening for pyrG prototrophy.
An expression cassette consisting of a promoter from the bphA gene, a translation control sequence of the A. nidulans qpdA gene, and the protein (ss-galactosidase) encoding sequence of the E. coli lacz gene was made in an analogous manner. . The translation control portion of the qpdA gene was chosen for this, because it is known to give a relatively stable 5 'mRNA. This transformant is hereinafter referred to as bphA-qpdA transformant.
Finally, 6 strains were compared and tested for expression of lacs: the wild type (Asperqillus niqer wt N245, a derivative of ATCC 1015),
<Desc / Clms Page number 11>
the three transformants with the translation control portion of the bphA gene to the 1st, 2nd and 3rd ATG on the mRNA-encoding DNA: the bphA-gpdA transformant and, for reference, an A. niger transformant with an expression cassette consisting of an A. niqer gpda promoter , a qpda translation control sequences and a sequence encoding the lacZ protein. This expression cassette has a constitutive promoter, which is a promoter that is induction independent and thus always expressed.
1) Cloning of the bphA gene with the promoter and characterization of the promoter and of the 5 'portion of the bphA gene
The promoter of the Aspergillus niger bphA gene was cloned from the chromosomal DNA of Aspergillus niger ATCC 1015 on the 9.8 kb EcoRI fragment contained in plasmid pAB8-2 as described in van Gorcom et al. In Mol. Gene. Genet. (1990) 223, pp. 192-197.
The DNA nucleotide sequence of the promoter region from a SalI site of the bphA gene was determined by the method described by Sanger et al. Proc. Natl. Acad.
Sei. USA (1977) 74 pp. 5463-5467. The sequence is shown in Figure 1. Further tests showed that all relevant sequences involved in transcription efficiency, regulation and initiation
EMI11.1
of the bphA gene are located at least on a fragment starting at the SalI site which is located approximately 1650 base pairs before the start of the bphA gene. The major (major transcription initiation point) initiation site of the transcription was determined and is located at nucleotide number 1645 in Figure 1. A few relevant restriction enzyme sites are also indicated there.
The nucleotide sequence present after the transcription initiation site (the translation control sequence of the bphA gene) is also indicated
<Desc / Clms Page number 12>
in Figure 1. In this part of the gene, there were found to be three ATG codons located at 1650, 1693 and 1932, respectively. The first two ATG initiation codons belong to open reading frames which can lead to 2 oligo-peptides of 18 resp. 5 amino acids. The third is the open reading frame initiation codon encoding the BPH sequence 2) Testing promoter m. B. v. a reporter
The efficiency of the promoter of the bphA gene was tested using an expression analysis system developed for fungi by van Gorcom and van den Hondel Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052.
In general, the efficiency of a promoter is determined by placing the promoter in front of a so-called reporter gene (in this case the ss-galactosidase gene (lacZ) of E. coli). These so-called fusion genes are tested, in one copy, on a fixed place in the genome of the fungus, namely the pyrG locus of Aspergillus niqer.
The starting plasmids (expression analysis vectors) are described in the above article.
Example I Manufacture of a plasmid with an expression cassette promoted and translation control sequence the 5 'portion of the bphA gene to the 3rd ATG (bp 1932, fiquur
EMI12.1
lli
The approximately 2.1 kb SalI fragment, which contains, inter alia, the promoter of the bphA gene (Figure 1) was cloned into the SalI site of vector ml3mpll (this vector is described by Messing in Methods Enzymol. 1983, 101, pp. 20 -78). A vector was selected in which the translation direction of the BPH portion and the translation direction of the lacZ-a portion contained in m13mpl1 were identical. This vector was named mAB8-81 and is shown in Figure 2 (continued).
<Desc / Clms Page number 13>
Starting from this vector, m. B. v. in vitro mutagenesis experiments performed according to the method of Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, pp. 488-492) using the oligonucleotide indicated in Figure 2, (continued; upper right bottom ) made a new vector (mAB8-83, Figure 3), in which the translation initiation codon of the BPH (the 3rd ATG) was placed in phase for the code of lacZ-a portion of m13mpll. The fusion resulting from in vitro mutagenesis was confirmed by DNA sequence analysis.
The promoter of the bphA gene and the first part of the fusion gene, located on a SalI fragment, has been cloned into the unique BamHI site of the expression analysis vector pAB94-12 using SalI-BamHI adapters (sequence see figure 3, top right). Gorcom and van den Hondel; Nucleic Acids Res. (1988) 16, p. 9052). A plasmid with an expression cassette according to the invention, called pAB94-83 (figure 3, continued), in which the bphA promoter, an in-frame translation fusion between the start codon of BPH (3rd ATG) and the complete lacZ gene were used for the further investigation.
The relevance sequence in the fusion region was re-verified.
Example II and comparative experiment A Manufacture of a plasmid with an expression cassette promoted and translation control sequences the 5 'part of the bphA gene to the 1e and the 2nd ATG codon (bp 1650 and 1693 from Fiquur 1, respectively):
Starting from vector mAB8-81, using in vitro mutagenization techniques according to the method of Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82 pp. 488-492), two vectors were made with oligonucleotides as shown in Figure 2 (continued), bottom middle and bottom right. These experiments resulted in the vector mAB8-84 (1st ATG fusion; comparative experiment A) and mAB8-85 (2nd ATG fusion;
<Desc / Clms Page number 14>
example II). The fusions resulting from in vitro mutagenesis were monitored by DNA sequence analysis.
EMI14.1
From the resulting vectors mAB8-84 and the BamHI fragment with promoter and the first part of the fusion gene was isolated, after which it was cloned into the largest fragment generated after partial BamHI digestion of vector mAB94-83; the BamHI sites used in mAB94-83 are marked with an arrow (Figure 3, continued).
Thus, in pAB94-83, the BamHI fragment containing most of the promoter and translation control sequences was replaced by the corresponding BamHI fragments from mAB8-84 and mAB8-85. This has resulted in the vectors pAB94-84 (comparative experiment A) and pAB94-85 (example II) (Figure 4, continued). The relevant sequences in the fusion region were re-verified.
Example III Manufacture of a plasmid with an expression cassette with the promoter of the bohA-qen, and as translation control sequence part of a qpdA-qen to the ATG initiation codon of the cpdA open reading frame
The promoter of the bphA gene (Figure 1 to position 1644) until the transcription start was fused to an existing construct in which the Aspergillus nidulans gpdA gene was already fused to the lacZ gene. To this end, a PvuII-BamHI fragment containing the relevant sequences (from before the transcription start to after the translation start) of this fusion (described by Punt et al. In Gene (1990) 93 101-109) has been placed between the Smal and EcoRI sites of the intermediate vector mAB8-81 (using a BamHI-EcoRI adapter; see figure 5).
This has resulted in the vector mAB8-82.
Using in vitro mutagenesis according to kunkel, the transcription start sites of resp. the boha gene and the gpdA-lacZ fusion gene are linked together. The oligonucleotide used is reported in Figure 5, continued.
<Desc / Clms Page number 15>
In this way, the vector mAB8-86 was created. The fusion resulting from in vitro mutagenesis was checked by DNA sequence analysis.
The promoter of the bphA gene and the first part of the fusion gene from mAB8-86, located on a SalI fragment, was cloned into the unique BamHI site of the expression analysis vector pAB94-13 using SalI-BamHI adapters (sequence see figure 6). (van Gorcom and van den Hondel; Nucleic Acids Res. (1988) 16 p. 9052).
In this way, an in frame fusion of the start codon of the bphA-gpdA-lacZ fusion gene to the complete lacZ gene present in the expression analysis vectors was generated. The result of this was the vector pAB94-86 (Figure 6, continued). The relevant sequence in the fusion region was re-verified.
Of the four vectors, the verified sequences in the fusion region are shown in Figure 7.
Examples IV-XV and Comparative experiments B-N Transformation of Asperqillus niqer N245 with the four constructed expression analysis vectors pAB94-83, -84, -85 and -86:
Aspergillus niqer N245 (ATCC 1015, csp, with,
EMI15.1
pyro) was transformed with the constructed vectors described above (pAB94-83, -84, -85). Between PyrG + transformants, Southern blotting was used to search for transformants in which a copy of the relevant plasmid integrated at the pyrG locus of the chromosomal DNA of the strain was present (according to the method described by van Hartingsveldt et al .; Mol. Gen. Genet. 206 (1986) pp.
71-75). Two independent one-copy transformants have been isolated in this way for each plasmid.
Analysis of the ss-qalactosidase expression in wild-type Asperqillus niger, in the aforementioned isolated one-copy transformants and in Aspergillus niger with a
<Desc / Clms Page number 16>
constitutively expressed, qpdA-lacZ fusion gene:
Two independent one-copy transformants obtained with the plasmid pAB94-83, -84, -85 and -86 were grown (and induced) in various media and analyzed for their ss-galactosidase activity after harvesting. For comparison, the starting strain N245 and a
EMI16.1
Asperqillus niger transformant in which a copy of an Aspergillus niger qpdA-lacZ fusion was present at the pyrG locus (strain used (van Hartingsveldt et al. Supra); uses plasmid pAB94-53 (Figure 8).
This plasmid has been deposited, no.
Spore suspensions up to one week old were used in each experiment. All experiments were performed in a New Brunswick G25 air incubator (rotating shaker tray) at 300C and 300rpm. Furthermore, identical 500 ml conical flasks have always been used.
The preculture was performed by inoculating 2x107 spores in 200 ml complete medium (CM; see further), + 1 mg / ml methionine (+ met), + 10 mM uridine (+ uri). After 24 hours, these cultures were filtered over Miracloth (Calbiochem) and washed with 1 * DSM medium without sugars (1 * DSM-S; see below), + with + uri. Of these, 0.3 grams after washing with 50 ml of 1 * DSM-S, + with, + uri, and sequences with 50 mM Na phosphate pH 7.1, 1 mM MgCl2, 20 µM PMSF (protease inhibitor) were frozen in liquid nitrogen for analysis for comparative experiments BD and examples IV-VI. Furthermore, 1 gram was added to 125 mL of 1 * DSM-S, + with, + uri, + 0.3%, respectively
EMI16.2
para-amino-benzoic acid (paba) or 0, para-hydroxybenzoic acid (phb) or 0, (benz.) (see further). These cultures were incubated at 30 ° C, 300 rpm for 4 hours.
After this induction, the mycelium was again filtered over Miracloth and washed with 1 * DSM-S, + with, + uri and then with 50 mM Na phosphate pH 7.1 mM MgCl2, 20 µm PMSF, 0.3 grams of these samples became
<Desc / Clms Page number 17>
frozen in liquid nitrogen for further analysis.
All mycellium samples were ground in a liquid nitrogen mortar and the mycelium powder was taken up i
EMI17.1
1 ml 50 mM Na-phosphate buffer pH 7.1, 1 mM MgCl, 20 Mm PMSF (van Gorcom et al. Gene, (1985) 40, 99-106). After thawing and vortexing, this suspension was centrifuged at 40 ° C (Eppendorf centrifuge 12,000 rpm). The supernatant's ss-galactosidase activity (Miller, in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) and protein concentration was determined by the Bradford method, as described in Anal. Biochem. (1976) 72 248-254.
The results of these experiments are shown in the following table.
<Desc / Clms Page number 18>
TABLE
EMI18.1
<tb>
<tb> Expe- <SEP> type <SEP> Average <SEP> ss-galacto- <SEP> Strength <SEP> compared
<tb> riment <SEP> mold <SEP> sidase <SEP> activity <SEP> with <SEP> A. <SEP> niger
<tb> + <SEP> spread <SEP> (units <SEP> promoter
<tb> per <SEP> mg <SEP> protein)
<tb> (Miller)
<tb> B <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 25 <SEP> (16-34)
<tb> IV <SEP> 3rd <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (316-1481) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> C <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 300 <SEP> (221-462) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> V <SEP> 2nd <SEP> ATG <SEP> 275 <SEP> (32-1449) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> VI <SEP> bphA-gpdA <SEP> 650 <SEP> (215-1210) <SEP> 0. <SEP> 06 <SEP>
<tb> D <SEP> gpdA <SEP> 10. <SEP> 475 <SEP> (6833-13451) <SEP> 1
<tb> E <SEP> A. <SEP> niqer <SEP> wt <SEP> 75 <SEP> (14-274)
<tb> VII <SEP> 3rd <SEP> ATG <SEP> 3. <SEP> 550 <SEP> (847-7132) <SEP> 0.
<SEP> 22 <SEP>
<tb> F <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 550 <SEP> (242-1011) <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP>
<tb> VIII <SEP> 2nd <SEP> ATG <SEP> 5. <SEP> 950 <SEP> (3384-8333) <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP>
<tb> IX <SEP> bphA-gpdA <SEP> 10. <SEP> 350 <SEP> (6128-18240) <SEP> 0. <SEP> 65 <SEP>
<tb> G <SEP> gpdA <SEP> 16. <SEP> 025 <SEP> (10694-19783) <SEP> 1
<tb> H <SEP> A. <SEP> niger <SEP> wt <SEP> 400 <SEP> (22-815)
<tb> X <SEP> 3rd <SEP> ATG <SEP> 20. <SEP> 450 <SEP> (13144-32222) <SEP> 1. <SEP> 31 <SEP>
<tb> J <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 600 <SEP> (339-1029) <SEP> <0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> XI <SEP> 2nd <SEP> ATG <SEP> 24. <SEP> 675 <SEP> (14159-34050) <SEP> 1. <SEP> 58 <SEP>
<tb> XII <SEP> bphA-gpdA <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> (15091-39889) <SEP> 1. <SEP> 47 <SEP>
<tb> K <SEP> gpdA <SEP> 15. <SEP> 650 <SEP> (10785-20089) <SEP> 1
<tb> XIII <SEP> 3rd <SEP> ATG <SEP> 27.
<SEP> 675 * <SEP>
<tb> N <SEP> le <SEP> ATG <SEP> 500 *
<tb> XIV <SEP> 2nd <SEP> ATG <SEP> 70. <SEP> 250 * <SEP>
<tb> XV <SEP> bphA-gpdA <SEP> 41. <SEP> 675 * <SEP>
<tb>
* values are an average of two measurements and therefore less reliable
<Desc / Clms Page number 19>
In experiments B-D and IV-VI, the 6 different strains were tested without an inductor. All types, except the constitutive strain (D), showed very low ss-galactosidase activity.
In a second series of experiments, the 6 strains were induced with parahydroxybenzoic acid. The Asperqillus niger, wild type (exp. E), which did not contain an expression cassette and the non-functional expression cassette (fusion to the first ATG codon, exp. F) showed no induction at all compared to the constitutive strain (exp. G) . Examples VII, VIII and IX clearly show that increased ss-galactosidase expression occurs relative to E or F.
The third series shows an analogous picture, albeit that now the filamentous ascomycetes induced with para-aminobenzoic acid according to the invention show an even greater activity than the fungi
EMI19.1
with the lacZ gene constitutively expressed by the gpda promoter (exp. K).
The fourth series shows that benzoic acid is also a very suitable inductor.
Media used: Complete medium (CM) per liter AD: 2 g neopepton, 1 g yeast extract, 20 ml 50 * AspA (300 g NaN03'26 9 KCI, 76 g KH2P04 per liter; set with 10 N
EMI19.2
KOH to pH 5.2 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 1000 * spores (2, ZnSO 4 .5 g FeSO 4 .7 H2O, 0.6 H2O, 0.5 H2O, 0.1 Na2MoO. 2 H 2 O, 5 g EDTA in 100 ml AD after sterilization with 10 N KOH to pH 6, 10 ml 50% glucose, 2 ml
5), vitamin solution (100mg thiamine, 1000mg riboflavin, 100mg para-aminobenzoic acid, 1000mg nicotinamide, 500mg pyridoxine, 100mg pantothenic acid, 2mg biotin per liter), 10ml 10% casamino acids.
DSM medium without sugars (DSM-S) per liter of tap water:
<Desc / Clms Page number 20>
EMI20.1
0.7 H2O, 1.1 urea.
A. niger N245 and plasmid pAB94-53 (in E. coli DH 5a) were deposited on 26 September at the CBS in Baarn (NL).