JPH05192150A - 新規な真菌発現系 - Google Patents
新規な真菌発現系Info
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- JPH05192150A JPH05192150A JP2418582A JP41858290A JPH05192150A JP H05192150 A JPH05192150 A JP H05192150A JP 2418582 A JP2418582 A JP 2418582A JP 41858290 A JP41858290 A JP 41858290A JP H05192150 A JPH05192150 A JP H05192150A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】
【構成】Ａ．ニガーのピルベートキナーゼ遺伝子のプロ
モーターを含有するＤＮＡ分子、該プロモーターの制御
のもとで構造遺伝子を発現するハイブリドベクター、こ
れらの製造方法、これらを用いるポリペプチドの製造方
法が提供される。 【効果】このプロモーターを使用することにより、任意
の構造遺伝子を、Ａ．ニガー等の真核生物において発現
させることができる。
モーターを含有するＤＮＡ分子、該プロモーターの制御
のもとで構造遺伝子を発現するハイブリドベクター、こ
れらの製造方法、これらを用いるポリペプチドの製造方
法が提供される。 【効果】このプロモーターを使用することにより、任意
の構造遺伝子を、Ａ．ニガー等の真核生物において発現
させることができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野に関
し、そして真菌プロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ
分子を提供する。この新規なＤＮＡ分子は糸状真菌中で
遺伝子を発現せしめるハイブリドベクターの作製のため
に有用である。
し、そして真菌プロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ
分子を提供する。この新規なＤＮＡ分子は糸状真菌中で
遺伝子を発現せしめるハイブリドベクターの作製のため
に有用である。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学技術においては原核性又は真
核性宿主のための多くのポリペプチド発現系が知られて
いるが、従来の系に卓越する利点を有する新規な系が常
に必要とされている。非常に広く使用されている宿主は
原核生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）及び真核生物である酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）であり、これらのために多数の異なる発
現ハイブリドベクターが開発されており、そのほとんど
がプラスミドである。大腸菌宿主の欠点は、それらがポ
リペプチドをグリコシル化できないことである。
核性宿主のための多くのポリペプチド発現系が知られて
いるが、従来の系に卓越する利点を有する新規な系が常
に必要とされている。非常に広く使用されている宿主は
原核生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）及び真核生物である酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）であり、これらのために多数の異なる発
現ハイブリドベクターが開発されており、そのほとんど
がプラスミドである。大腸菌宿主の欠点は、それらがポ
リペプチドをグリコシル化できないことである。
【０００３】酵母はグリコシル化を行うが、しかしなが
ら大腸菌と同様にポリペプチドを分泌せず、例外的に少
量のみ培地中にではなくペリプラズム空間に分泌するの
みである。哺乳類癌細胞のごときより高等な真核宿主は
グリコシル化を行いそして培地中に分泌することができ
るが、しかしながらその培養は遅く、高価であり、そし
て発癌性核酸が目的ペプチドと一緒に単離される危険が
存在する。
ら大腸菌と同様にポリペプチドを分泌せず、例外的に少
量のみ培地中にではなくペリプラズム空間に分泌するの
みである。哺乳類癌細胞のごときより高等な真核宿主は
グリコシル化を行いそして培地中に分泌することができ
るが、しかしながらその培養は遅く、高価であり、そし
て発癌性核酸が目的ペプチドと一緒に単離される危険が
存在する。
【０００４】他の宿主の研究において、糸状真菌（ｆｉ
ｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）、例えばニューロス
ポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓ
ａ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・ニガ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）も研究され
ている。遺伝子工学技術におけるこれらの適用は、適当
な形質転換系が存在しないことを主な理由として、遅れ
ている。サッカロミセス・セレビシエーとは異り、糸状
真菌は外来遺伝子の導入及び表現型選択のために使用し
得るプラスミドを含有しない。しかしながら、糸状真菌
を選択マーカー遺伝子を含有する外来プラスミドにより
形質転換することは可能である。糸状真菌のために今ま
で記載されているほとんどのベクターは酵母のそれのよ
うに自律複製できず、真菌染色体に組込まれる。この現
象は一般に低頻度で起こる。しかしながら、組込み形質
転換は、非選択的条件下においてさえ形質転換体を有糸
分裂的に非常に安定なものとする。百を超えるコピーの
安定な組込みが報告されている。
ｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）、例えばニューロス
ポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓ
ａ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・ニガ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）も研究され
ている。遺伝子工学技術におけるこれらの適用は、適当
な形質転換系が存在しないことを主な理由として、遅れ
ている。サッカロミセス・セレビシエーとは異り、糸状
真菌は外来遺伝子の導入及び表現型選択のために使用し
得るプラスミドを含有しない。しかしながら、糸状真菌
を選択マーカー遺伝子を含有する外来プラスミドにより
形質転換することは可能である。糸状真菌のために今ま
で記載されているほとんどのベクターは酵母のそれのよ
うに自律複製できず、真菌染色体に組込まれる。この現
象は一般に低頻度で起こる。しかしながら、組込み形質
転換は、非選択的条件下においてさえ形質転換体を有糸
分裂的に非常に安定なものとする。百を超えるコピーの
安定な組込みが報告されている。
【０００５】糸状真菌のための記載された最初のベクタ
ーは選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサのｑ
ａ−２遺伝子を含有していた〔Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｓ
ｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．及
びＧｉｌｅｓ，Ｎ．Ｈ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５２５９−５２
６３；Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．（１９８２），Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｌｌ
ａｍｄｅｒ，Ａ．，ＤｅＭｏｓｓ，Ｄ．，Ｋａｍｐｌａ
ｎ，Ｓ．，Ｋｏｎｉｓｋｙ，Ｊ．，Ｓａｖａｇｅ，Ｄ．
及びＷｄｆｅ，Ｒ．Ｓ．編）、８７−１００頁、Ｐｌｅ
ｎｕｍ〕。
ーは選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサのｑ
ａ−２遺伝子を含有していた〔Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｓ
ｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．及
びＧｉｌｅｓ，Ｎ．Ｈ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５２５９−５２
６３；Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．（１９８２），Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｌｌ
ａｍｄｅｒ，Ａ．，ＤｅＭｏｓｓ，Ｄ．，Ｋａｍｐｌａ
ｎ，Ｓ．，Ｋｏｎｉｓｋｙ，Ｊ．，Ｓａｖａｇｅ，Ｄ．
及びＷｄｆｅ，Ｒ．Ｓ．編）、８７−１００頁、Ｐｌｅ
ｎｕｍ〕。
【０００６】性周期を有しそしてそれ故に古典的な遺伝
的操作を可能にするアスペルギルス・ニドランスにおい
ては、栄養要求性マーカー又は優性選択マーカーに基く
負及び正の両者の選択系が記載されている（Ｂａｌｌａ
ｎｃｅら、ＢＢＲＣ １１２，２８４，１９８３；Ｔｉ
ｌｂｕｍら、Ｇｅｎｅ ２６，２０５，１９８３；Ｙｅ
ｌｔｏｎら、ＰＡＮＳ ８１，１４７０，１９８４；Ｙ
ｅｌｔｏｎ及びＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．９Ｃ，１７３，１９８
５；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３０
７，１９８３；Ｔｉｌｂｕｒｍら、 Ｇｅｎｅ２６，２
０５，１９８３；Ｗｅｒｎａｒｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．９，３６１，１９８５；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４，４７５，１９８５）。
的操作を可能にするアスペルギルス・ニドランスにおい
ては、栄養要求性マーカー又は優性選択マーカーに基く
負及び正の両者の選択系が記載されている（Ｂａｌｌａ
ｎｃｅら、ＢＢＲＣ １１２，２８４，１９８３；Ｔｉ
ｌｂｕｍら、Ｇｅｎｅ ２６，２０５，１９８３；Ｙｅ
ｌｔｏｎら、ＰＡＮＳ ８１，１４７０，１９８４；Ｙ
ｅｌｔｏｎ及びＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．９Ｃ，１７３，１９８
５；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３０
７，１９８３；Ｔｉｌｂｕｒｍら、 Ｇｅｎｅ２６，２
０５，１９８３；Ｗｅｒｎａｒｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．９，３６１，１９８５；Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４，４７５，１９８５）。
【０００７】Ａ．クラッサ又はＡ．ニドランスに比べ
て、Ａ．ニガーは例えば食品工業において使用するため
の酵素類の工業的製造において広く使用されているため
非常に重要な生物である。Ａ．ニガーは、種々の加水分
解酵素、例えばグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、ペ
クチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ナリンジナーゼ、ペントサナーゼ、酸性
プロテアーゼ及びリグナーゼを分泌することが知られて
おり、グルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体は最も
重要なものである。
て、Ａ．ニガーは例えば食品工業において使用するため
の酵素類の工業的製造において広く使用されているため
非常に重要な生物である。Ａ．ニガーは、種々の加水分
解酵素、例えばグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、ペ
クチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ナリンジナーゼ、ペントサナーゼ、酸性
プロテアーゼ及びリグナーゼを分泌することが知られて
おり、グルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体は最も
重要なものである。
【０００８】古典的な変異及び選択法により加水分解酵
素の分泌における非常な菌株改良が達成されている。
Ａ．ニガーの性周期は知られていない。減数分裂組換え
により変異を導入することはできない。変異は、選択さ
れた二倍体における減数分裂組換によってのみ組合わせ
ることができる。Ａ．ニガーの形質転換のための選択マ
ーカーとして、いずれもＡ．ニドランスから得られたヘ
テロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ａｍｄｓ遺伝
子（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．４，４
７５，１９８５）、及びａｒｇＢ遺伝子（Ｂｕｘｔｏｎ
ら、Ｇｅｎｅ ３７，２０７，１９８５；ＥＰ １８４
４３８；ＷＯ ８６／０６０９７）、又は同種性ｐｙｒ
Ａ遺伝子（Ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６，７１−７５，１９
８７；Ｇｏｏｓｅｎら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．１１，
４９９−５０３，１９８７）が使用されている。
素の分泌における非常な菌株改良が達成されている。
Ａ．ニガーの性周期は知られていない。減数分裂組換え
により変異を導入することはできない。変異は、選択さ
れた二倍体における減数分裂組換によってのみ組合わせ
ることができる。Ａ．ニガーの形質転換のための選択マ
ーカーとして、いずれもＡ．ニドランスから得られたヘ
テロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ａｍｄｓ遺伝
子（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．４，４
７５，１９８５）、及びａｒｇＢ遺伝子（Ｂｕｘｔｏｎ
ら、Ｇｅｎｅ ３７，２０７，１９８５；ＥＰ １８４
４３８；ＷＯ ８６／０６０９７）、又は同種性ｐｙｒ
Ａ遺伝子（Ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６，７１−７５，１９
８７；Ｇｏｏｓｅｎら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．１１，
４９９−５０３，１９８７）が使用されている。
【０００９】Ａ．ニガーは、ペクチン分解酵素、例えば
ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンリアーゼ又はペクチ
ンエステラーゼの工業的製造のための最も重要な生物で
ある。果物及び野菜加工（表１）におけるペクチンリア
ーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ
及び酵素混合物の使用は、圧搾後のジュース及び色素の
高収量を確保するため及び圧搾原料ジュースの清澄化の
ために軟質果実を処理するためのペクチン酵素のもとも
との使用から発展した。これらの加工のための使用にお
ける技術的酵素調製物には種々の量のペクチンエステラ
ーゼ、ポリガラクチュロナーゼ及びペクチンリアーゼ、
並びに他の酵素、例えばアラビナナーゼ、ガラクタナー
ゼ、キシラナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、グリコ
シダーゼ及びプロテアーゼが含まれる。
ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンリアーゼ又はペクチ
ンエステラーゼの工業的製造のための最も重要な生物で
ある。果物及び野菜加工（表１）におけるペクチンリア
ーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ
及び酵素混合物の使用は、圧搾後のジュース及び色素の
高収量を確保するため及び圧搾原料ジュースの清澄化の
ために軟質果実を処理するためのペクチン酵素のもとも
との使用から発展した。これらの加工のための使用にお
ける技術的酵素調製物には種々の量のペクチンエステラ
ーゼ、ポリガラクチュロナーゼ及びペクチンリアーゼ、
並びに他の酵素、例えばアラビナナーゼ、ガラクタナー
ゼ、キシラナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、グリコ
シダーゼ及びプロテアーゼが含まれる。
【００１０】表１は、Ｖｏｒａｇｅｎ，Ａ．Ｇ．Ｊ．，
Ｆｏｏｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎ
ｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｎｏｓ．Ｊ．Ｐ．Ｒｏｏｚｅｎ
ら、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｆｏｒ Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ．ＰＵＤＯＣ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔ
ｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８９）からの、果
実及び野菜工業におけるポリガラクチュロナーゼ及びそ
の混合物の使用を示す。
Ｆｏｏｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎ
ｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｎｏｓ．Ｊ．Ｐ．Ｒｏｏｚｅｎ
ら、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｆｏｒ Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ．ＰＵＤＯＣ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔ
ｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８９）からの、果
実及び野菜工業におけるポリガラクチュロナーゼ及びそ
の混合物の使用を示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】ペクチン酵素及びセルロース分解酵素の使
用により、果実パルプの細胞壁はほとんど完全な液化の
段階まで分解され得る。エンド−及びエキソ−β−１，
４−グルカナーゼ（セルラーゼ）の両者及びペクチン酵
素の存在が必須である（ＲｅｎａｒｄＣ．Ｍ．Ｃ．Ｇ．
ら、Ａｐｐｌｅ Ｐｒｏｔｏｐｅｃｔｉｎ：ｐｒｅｌｉ
ｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｒｏｏｚｅｎ Ｊ．Ｐら編
集、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ．ＰＵＤＯＣ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ １９８９）。
用により、果実パルプの細胞壁はほとんど完全な液化の
段階まで分解され得る。エンド−及びエキソ−β−１，
４−グルカナーゼ（セルラーゼ）の両者及びペクチン酵
素の存在が必須である（ＲｅｎａｒｄＣ．Ｍ．Ｃ．Ｇ．
ら、Ａｐｐｌｅ Ｐｒｏｔｏｐｅｃｔｉｎ：ｐｒｅｌｉ
ｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｒｏｏｚｅｎ Ｊ．Ｐら編
集、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ．ＰＵＤＯＣ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ １９８９）。
【００１３】ポリガラクチュロナーゼ及びその酵素混合
物はまた、バイオマスの液化又は糖化のため、例えば植
物細胞からの発酵性ポリサッカライドの製造（Ｂｅｌｄ
ｍａｎ，Ｇ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｓ．Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ．６，５０３−５０７，１９８４）のため、又
はペクチンの修飾のため（概観のためにはＶｏｒａｇｅ
ｎ Ａ．Ｇ．Ｊ．Ｆｏｏｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｓ ａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｒｏｏｚ
ｅｎ Ｊ．Ｐ．ら前掲を参考のこと）にも有用である。
Ａ．ニガーにおいては、ペクチン複合体の蛋白質は構成
的に発現されない。ペクチン又はその分解生成物を用い
る誘導条件下において、他の炭素源、例えばグルコース
又はシュークロースが増殖制限的である場合に、Ａ．ニ
ガーは上記の酵素を発現する。
物はまた、バイオマスの液化又は糖化のため、例えば植
物細胞からの発酵性ポリサッカライドの製造（Ｂｅｌｄ
ｍａｎ，Ｇ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｓ．Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ．６，５０３−５０７，１９８４）のため、又
はペクチンの修飾のため（概観のためにはＶｏｒａｇｅ
ｎ Ａ．Ｇ．Ｊ．Ｆｏｏｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｓ ａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｒｏｏｚ
ｅｎ Ｊ．Ｐ．ら前掲を参考のこと）にも有用である。
Ａ．ニガーにおいては、ペクチン複合体の蛋白質は構成
的に発現されない。ペクチン又はその分解生成物を用い
る誘導条件下において、他の炭素源、例えばグルコース
又はシュークロースが増殖制限的である場合に、Ａ．ニ
ガーは上記の酵素を発現する。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】Ａ．ニガー及びその酵
素の工業的重要性のため、菌株の改良のため及び／又は
同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）もしくは異種（ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子産物の製造のための新規な
Ａ．ニガー発現系の必要性が増している。例えば、最も
関心がよせられるのは工業的ペクチン分解酵素又は定義
されたその混合物の製造である。
素の工業的重要性のため、菌株の改良のため及び／又は
同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）もしくは異種（ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子産物の製造のための新規な
Ａ．ニガー発現系の必要性が増している。例えば、最も
関心がよせられるのは工業的ペクチン分解酵素又は定義
されたその混合物の製造である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、糸状真菌特に
Ａ．ニガーにおいて同種性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又
は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）構造遺伝子を発現
させるための新規なベクターの作製のために使用し得る
Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼ遺伝子（ｐｋｉ）に由
来する有利なプロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ分
子を提供する。
Ａ．ニガーにおいて同種性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又
は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）構造遺伝子を発現
させるための新規なベクターの作製のために使用し得る
Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼ遺伝子（ｐｋｉ）に由
来する有利なプロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ分
子を提供する。
【００１６】Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼ（組織的
名称ＡＴＰ：ｐｙｒｕｖａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａ
ｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．７．１．４０）をコード
する遺伝子は高度に発現され、強力なプロモーターのも
とでの転写が示唆される。酵母ピルベートキナーゼ遺伝
子のコード領域からの断片とハイブリダイズする、Ａ．
ニガーＮ４００のゲノムの５ｋｂ ＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限断片がクローン化された。生ずるクローン
をｐＧＷ１１００と命名した。選択マーカーとしてのｐ
ｙｒＡ遺伝子を含むプラスミドｐＧＷ６１３と、ｐＧＷ
１１００との同時形質転換実験が、研究された１１個の
形質転換体の内８個においてピルベートキナーゼのレベ
ルの上昇を導いた。これらの結果から、ｐＧＷ１１００
はＡ．ニガーピルベートキナーゼをコードしているこ
と、及びこれが完全な機能的遺伝子を含んでいることが
結論された（Ｌ．Ｈ．ｄｅ Ｇｒａｆｆ，Ｔｈｅ ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ
ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．Ｐｈ．
Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，１９８
９）。
名称ＡＴＰ：ｐｙｒｕｖａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａ
ｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．７．１．４０）をコード
する遺伝子は高度に発現され、強力なプロモーターのも
とでの転写が示唆される。酵母ピルベートキナーゼ遺伝
子のコード領域からの断片とハイブリダイズする、Ａ．
ニガーＮ４００のゲノムの５ｋｂ ＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限断片がクローン化された。生ずるクローン
をｐＧＷ１１００と命名した。選択マーカーとしてのｐ
ｙｒＡ遺伝子を含むプラスミドｐＧＷ６１３と、ｐＧＷ
１１００との同時形質転換実験が、研究された１１個の
形質転換体の内８個においてピルベートキナーゼのレベ
ルの上昇を導いた。これらの結果から、ｐＧＷ１１００
はＡ．ニガーピルベートキナーゼをコードしているこ
と、及びこれが完全な機能的遺伝子を含んでいることが
結論された（Ｌ．Ｈ．ｄｅ Ｇｒａｆｆ，Ｔｈｅ ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ
ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．Ｐｈ．
Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，１９８
９）。
【００１７】この従来技術から出発して、ｐｋｉプロモ
ーターを含んで成るＤＮＡ分子が本発明において開発さ
れ、そして同種遺伝子産物、例えばペクチンリアーゼ、
の過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のための
新規な発現ベクターの作製のため、又は異種性遺伝子例
えばインターフェロン遺伝子の発現のために使用され
た。
ーターを含んで成るＤＮＡ分子が本発明において開発さ
れ、そして同種遺伝子産物、例えばペクチンリアーゼ、
の過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のための
新規な発現ベクターの作製のため、又は異種性遺伝子例
えばインターフェロン遺伝子の発現のために使用され
た。
【００１８】〔本発明の対象〕本発明の対象は、Ａ．ニ
ガーｐｋｉプロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ分
子、該プロモーターの制御のもとでの構造遺伝子の発明
のために有用なハイブリドベクター、該新規なハイブリ
ドベクターにより形質転換された宿主、並びに前記新規
なＤＮＡ分子、ハイブリドベクター及び形質転換された
宿主の製造のため並びに該形質転換された宿主を用いて
の組換ポリペプチドの製造のための方法である。
ガーｐｋｉプロモーターを含んで成る新規なＤＮＡ分
子、該プロモーターの制御のもとでの構造遺伝子の発明
のために有用なハイブリドベクター、該新規なハイブリ
ドベクターにより形質転換された宿主、並びに前記新規
なＤＮＡ分子、ハイブリドベクター及び形質転換された
宿主の製造のため並びに該形質転換された宿主を用いて
の組換ポリペプチドの製造のための方法である。
【００１９】〔Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼプロモ
ーターを含むＤＮＡ分子〕本発明は、配列番号１のヌク
レオチド配列を有するＤＮＡ分子中に含まれるＡ．ニガ
ー・ピルベートキナーゼ（ｐｋｉ）プロモーター、又は
プロモーター活性を有するその誘導体もしくは断片に関
する。配列番号１のヌクレオチド配列は、プロモーター
を含むＡ．ニガーの全体機能的ピルベートキナーゼ遺伝
子ｐｋｉを含んで成る。このｐｋｉプロモーターは１位
のヌクレオチドから１０４２位のピルベートキナーゼの
コード領域の第１ヌクレオチドまで延びる。ｐｋｉプロ
モーターはＲＮＡポリメラーゼ及び制御蛋白質に結合
し、そして該プロモーターに作用可能に連結された構造
遺伝子の発現を制御することができる。従って本発明
は、およそ１位からおよそ１０４２位まで延びるヌクレ
オチド配列のＤＮＡ分子、又は制御されるか又は制御さ
れないプロモーター活性を維持している該プロモーター
の断片もしくは誘導体に関する。
ーターを含むＤＮＡ分子〕本発明は、配列番号１のヌク
レオチド配列を有するＤＮＡ分子中に含まれるＡ．ニガ
ー・ピルベートキナーゼ（ｐｋｉ）プロモーター、又は
プロモーター活性を有するその誘導体もしくは断片に関
する。配列番号１のヌクレオチド配列は、プロモーター
を含むＡ．ニガーの全体機能的ピルベートキナーゼ遺伝
子ｐｋｉを含んで成る。このｐｋｉプロモーターは１位
のヌクレオチドから１０４２位のピルベートキナーゼの
コード領域の第１ヌクレオチドまで延びる。ｐｋｉプロ
モーターはＲＮＡポリメラーゼ及び制御蛋白質に結合
し、そして該プロモーターに作用可能に連結された構造
遺伝子の発現を制御することができる。従って本発明
は、およそ１位からおよそ１０４２位まで延びるヌクレ
オチド配列のＤＮＡ分子、又は制御されるか又は制御さ
れないプロモーター活性を維持している該プロモーター
の断片もしくは誘導体に関する。
【００２０】Ａ．ニガーの完全なｐｋｉプロモーターは
制御され得る。なぜなら、これは該プロモーターを含有
するＡ．ニガー細胞の培養のために使用される炭素源に
転写レベルを依存させる制御因子を含有するからであ
る。糖新生性（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｉｃ）炭素源、
例えばアセテートの使用が低レベルの転写を導き、他方
解糖化炭素源、例えばグルコースの使用が高レベルの転
写を導く。
制御され得る。なぜなら、これは該プロモーターを含有
するＡ．ニガー細胞の培養のために使用される炭素源に
転写レベルを依存させる制御因子を含有するからであ
る。糖新生性（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｉｃ）炭素源、
例えばアセテートの使用が低レベルの転写を導き、他方
解糖化炭素源、例えばグルコースの使用が高レベルの転
写を導く。
【００２１】配列番号１のヌクレオチド配列中に含まれ
るプロモーターにおいて、潜在的ＴＡＴＡボックスはヌ
クレオチド位置９２７と９３４の間に位置し、潜在的Ｃ
ＡＡＴボックスは８３０位と８３６位の間に位置し、そ
して広範なＣＴリッチ領域（ＣＴブロック）は８４８位
と１０４１位との間に位置する。後者は、酵母及び糸状
菌由来の多くの高発現遺伝子のプロモーター／制御領域
中に見出すことができる。
るプロモーターにおいて、潜在的ＴＡＴＡボックスはヌ
クレオチド位置９２７と９３４の間に位置し、潜在的Ｃ
ＡＡＴボックスは８３０位と８３６位の間に位置し、そ
して広範なＣＴリッチ領域（ＣＴブロック）は８４８位
と１０４１位との間に位置する。後者は、酵母及び糸状
菌由来の多くの高発現遺伝子のプロモーター／制御領域
中に見出すことができる。
【００２２】本発明の断片は、例えば、配列番号１のヌ
クレオチド配列の１位〜約９５０位のヌクレオチドのい
ずれかから始まりそしておよそ１０４１位のヌクレオチ
ドで終るプロモーター活性を有する断片群から選択され
る断片である。該ヌクレオチド配列中でおよそ３００位
のヌクレオチドから始りそしておよそ１０４１位のヌク
レオチドで終る断片が好ましい。本発明の断片は、例え
ば、配列番号１のヌクレオチド配列内に位置する制限酵
素開裂部位、例えばＢａｍＨＩ部位（およそ３００位）
又は次の部位（カッコ内に示すおよその位置）：Ｓｐｈ
Ｉ（４４１），ＳｍａＩ（８５９），ＸｍａＩ（８５
９）から始まる。
クレオチド配列の１位〜約９５０位のヌクレオチドのい
ずれかから始まりそしておよそ１０４１位のヌクレオチ
ドで終るプロモーター活性を有する断片群から選択され
る断片である。該ヌクレオチド配列中でおよそ３００位
のヌクレオチドから始りそしておよそ１０４１位のヌク
レオチドで終る断片が好ましい。本発明の断片は、例え
ば、配列番号１のヌクレオチド配列内に位置する制限酵
素開裂部位、例えばＢａｍＨＩ部位（およそ３００位）
又は次の部位（カッコ内に示すおよその位置）：Ｓｐｈ
Ｉ（４４１），ＳｍａＩ（８５９），ＸｍａＩ（８５
９）から始まる。
【００２３】最も好ましい断片は、およそ３００位のＢ
ａｍＨＩから始まりそして１０４１位まで延びる断片で
ある。この断片は、およそ３００位のＢａｍＨＩ部位か
らおよそ１３５２位のＰｖｕＩＩまで延びるＢａｍＨＩ
／ＰｖｕＩＩ断片の部分であり、後で制限酵素開裂部位
を挿入するための例において使用される。本発明の誘導
体は、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡ分子中に含まれるｐｋｉプロモーター又はその断
片の変異体、組換誘導体又は変異体の組換誘導体であ
る。本発明の誘導体は、制御され得るか又は制御され得
ないｐｋｉプロモーターを含む配列を含んで成る。
ａｍＨＩから始まりそして１０４１位まで延びる断片で
ある。この断片は、およそ３００位のＢａｍＨＩ部位か
らおよそ１３５２位のＰｖｕＩＩまで延びるＢａｍＨＩ
／ＰｖｕＩＩ断片の部分であり、後で制限酵素開裂部位
を挿入するための例において使用される。本発明の誘導
体は、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡ分子中に含まれるｐｋｉプロモーター又はその断
片の変異体、組換誘導体又は変異体の組換誘導体であ
る。本発明の誘導体は、制御され得るか又は制御され得
ないｐｋｉプロモーターを含む配列を含んで成る。
【００２４】本発明の変異体は天然変異体又は好ましく
は人工変異体であることができる。本発明のｐｋｉプロ
モーターの変異体は特に、例えば制限酵素ＮｓｉＩ，Ｂ
ａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，Ｓ
ａｌＩ，ＮｃｏＩ等のための新たな制限酵素開裂部位を
有するものである。構造遺伝子をプロモーターの３′に
挿入し相互に作用可能に連結するために使用し得る新た
な制限酵素開裂部位を配列番号１の配列の１０４１位又
はその近傍に有する変異体が好ましい。この様な変異体
は、例えば次の様に特徴付けられる。すなわち、配列番
号２のヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配
列中の１０３４位と１０５４位の間に延びる配列を置換
しており、そしてＮｓｉＩ部位が配列番号１の１０４１
位にすぐ隣接して位置する。
は人工変異体であることができる。本発明のｐｋｉプロ
モーターの変異体は特に、例えば制限酵素ＮｓｉＩ，Ｂ
ａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，Ｓ
ａｌＩ，ＮｃｏＩ等のための新たな制限酵素開裂部位を
有するものである。構造遺伝子をプロモーターの３′に
挿入し相互に作用可能に連結するために使用し得る新た
な制限酵素開裂部位を配列番号１の配列の１０４１位又
はその近傍に有する変異体が好ましい。この様な変異体
は、例えば次の様に特徴付けられる。すなわち、配列番
号２のヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配
列中の１０３４位と１０５４位の間に延びる配列を置換
しており、そしてＮｓｉＩ部位が配列番号１の１０４１
位にすぐ隣接して位置する。
【００２５】本発明の変異体はまた、前記の意味におけ
る断片の変異体である。断片の好ましい変異体は、プロ
モーターに構造遺伝子を作用可能に連結するための新た
な制限酵素開裂部位をｐｋｉプロモーターの下流に有す
る断片である。断片のこの様な好ましい変異体は、例え
ば、Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−Ｐ
ｖｕＩＩ）ＲＦ ＤＮＡに含まれる１０５３ｂｐ Ｂａ
ｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ断片又は７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／
ＮｓｉＩ断片に含まれる。
る断片の変異体である。断片の好ましい変異体は、プロ
モーターに構造遺伝子を作用可能に連結するための新た
な制限酵素開裂部位をｐｋｉプロモーターの下流に有す
る断片である。断片のこの様な好ましい変異体は、例え
ば、Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−Ｐ
ｖｕＩＩ）ＲＦ ＤＮＡに含まれる１０５３ｂｐ Ｂａ
ｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ断片又は７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／
ＮｓｉＩ断片に含まれる。
【００２６】Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｎｓ
ｉＩ−ＰｖｕＩＩ）の１０５３ｂｐＢａｍＨＩ／Ｐｖｕ
ＩＩ断片は、配列番号１の配列のおよそ３００位のＢａ
ｍＨＩ部位からおよそ１３５２位のＰｖｕＩＩ部位まで
延びるヌクレオチド配列を有し、ここでこのヌクレオチ
ド配列は、１０３４位から１０５４位までのヌクレオチ
ドが配列番号２の配列により置換されていることにより
変異している。７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片
は前記ＢａｍＨＩ部位から置換された領域中のＮｓｉＩ
部位まで延びる。両変異体において、ＮｓｉＩ部位が配
列番号１の１０４１位にすぐ隣接して位置する。
ｉＩ−ＰｖｕＩＩ）の１０５３ｂｐＢａｍＨＩ／Ｐｖｕ
ＩＩ断片は、配列番号１の配列のおよそ３００位のＢａ
ｍＨＩ部位からおよそ１３５２位のＰｖｕＩＩ部位まで
延びるヌクレオチド配列を有し、ここでこのヌクレオチ
ド配列は、１０３４位から１０５４位までのヌクレオチ
ドが配列番号２の配列により置換されていることにより
変異している。７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片
は前記ＢａｍＨＩ部位から置換された領域中のＮｓｉＩ
部位まで延びる。両変異体において、ＮｓｉＩ部位が配
列番号１の１０４１位にすぐ隣接して位置する。
【００２７】本発明の誘導体はまた組換ＤＮＡ分子であ
る。この様な組換ＤＮＡ分子は例えば次の様に特徴付け
られる。すなわち、それはｐｋｉプロモーター活性を有
する本発明のＤＮＡ分子の３′及び／又は５′末端に付
加されたオリゴヌクレオチドリンカーを含有しており、
このリンカーは他のＤＮＡ分子、例えばベクター配列へ
の好結果の連結をもたらす。リンカーは１もしくは複数
の制限酵素開裂部位及び／又は部位的単鎖末端（「接着
末端」）及び／又は平滑末端を含むことができる。
る。この様な組換ＤＮＡ分子は例えば次の様に特徴付け
られる。すなわち、それはｐｋｉプロモーター活性を有
する本発明のＤＮＡ分子の３′及び／又は５′末端に付
加されたオリゴヌクレオチドリンカーを含有しており、
このリンカーは他のＤＮＡ分子、例えばベクター配列へ
の好結果の連結をもたらす。リンカーは１もしくは複数
の制限酵素開裂部位及び／又は部位的単鎖末端（「接着
末端」）及び／又は平滑末端を含むことができる。
【００２８】本発明の誘導体はまた、ｐｋｉプロモータ
ー活性を有する本発明のＤＮＡ分子及びイントロンを含
むか又は含まない同種性又は異種性の構造遺伝子（これ
はｐｋｉプロモーターに作用可能に連結されている）並
びに場合によってはオリゴヌクレオチドリンカーを含ん
で成る組換ＤＮＡ分子である。本発明の誘導体は、ｐｋ
ｉプロモーター以外の更なる発現制御配列であってやは
り前記構造遺伝子に作用可能に連結されているものを含
むことができる。この様な発現制御配列は、例えば、エ
ンハンサー、転写ターミネーター、リボゾーム結合部
位、転写開始又は停止部位、又はシグナル配列、例えば
Ａ．ニガーペクチンリアーゼ遺伝子、例えばＰＬＡ，
Ｂ，ＣもしくはＤの遺伝子、又はポリガラクチュロナー
ゼ遺伝子、例えばＰＧＩ，ＰＧＣ又はＰＧＩＩの遺伝子
のシグナル配列である。
ー活性を有する本発明のＤＮＡ分子及びイントロンを含
むか又は含まない同種性又は異種性の構造遺伝子（これ
はｐｋｉプロモーターに作用可能に連結されている）並
びに場合によってはオリゴヌクレオチドリンカーを含ん
で成る組換ＤＮＡ分子である。本発明の誘導体は、ｐｋ
ｉプロモーター以外の更なる発現制御配列であってやは
り前記構造遺伝子に作用可能に連結されているものを含
むことができる。この様な発現制御配列は、例えば、エ
ンハンサー、転写ターミネーター、リボゾーム結合部
位、転写開始又は停止部位、又はシグナル配列、例えば
Ａ．ニガーペクチンリアーゼ遺伝子、例えばＰＬＡ，
Ｂ，ＣもしくはＤの遺伝子、又はポリガラクチュロナー
ゼ遺伝子、例えばＰＧＩ，ＰＧＣ又はＰＧＩＩの遺伝子
のシグナル配列である。
【００２９】同種性構造遺伝子はＡ．ニガー由来の構造
遺伝子である。これらは例えば酵素をコードしており、
工業、例えば食品及び飼料工業において有用である。こ
れらの酵素は、例えばペクチン分解酵素例えばペクチン
エステラーゼ、エンド−及びエキソ作用ポリガラクチュ
ロナーゼ（ＰＧ）、ペクチンリアーゼ（ＰＬ）、ラムノ
ガラクチュロナーゼ又はアラビナーゼ、ガラクタナー
ゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−１，４−グルカナ
ーゼ、グルコシダーゼ等である。
遺伝子である。これらは例えば酵素をコードしており、
工業、例えば食品及び飼料工業において有用である。こ
れらの酵素は、例えばペクチン分解酵素例えばペクチン
エステラーゼ、エンド−及びエキソ作用ポリガラクチュ
ロナーゼ（ＰＧ）、ペクチンリアーゼ（ＰＬ）、ラムノ
ガラクチュロナーゼ又はアラビナーゼ、ガラクタナー
ゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β−１，４−グルカナ
ーゼ、グルコシダーゼ等である。
【００３０】Ａ．ニガーＰＬＤの構造遺伝子のヌクレオ
チド配列は、公開Ｎｏ．ＥＰ−Ａ２−０２７８３５５の
ヨーロッパ特許出願に開示されている。他のＡ．ニガー
ＰＬ、特にＰＬ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｅ及び−Ｆの構造
遺伝子は公開Ｎｏ．ＥＰ−Ａ２−０３５３１８８のヨー
ロッパ特許出願に記載されている。Ａ．ニガーＰＧ、特
にＰＧＩＩの構造遺伝子は公開番号Ｎｏ．８９１９８８
４．０の英国特許出願に開示されている。Ａ．ニガーの
構造遺伝子を含んで成るプラスミドｐＧＷ８２０，８３
０，８５０及び１８００により形質転換された大腸菌Ｈ
Ｂ１０１又はＪＭ１０９はブダペスト条約に基き、Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｏ
ｒｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ，Ｄ−
３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されてい
る。それぞれＮ−末端及びＣ−末端をコードするＰＧＩ
Ｉの構造遺伝子の部分のヌクレオチド配列が配列表に記
載されている。さらなる情報については表２を参照のこ
と。
チド配列は、公開Ｎｏ．ＥＰ−Ａ２−０２７８３５５の
ヨーロッパ特許出願に開示されている。他のＡ．ニガー
ＰＬ、特にＰＬ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｅ及び−Ｆの構造
遺伝子は公開Ｎｏ．ＥＰ−Ａ２−０３５３１８８のヨー
ロッパ特許出願に記載されている。Ａ．ニガーＰＧ、特
にＰＧＩＩの構造遺伝子は公開番号Ｎｏ．８９１９８８
４．０の英国特許出願に開示されている。Ａ．ニガーの
構造遺伝子を含んで成るプラスミドｐＧＷ８２０，８３
０，８５０及び１８００により形質転換された大腸菌Ｈ
Ｂ１０１又はＪＭ１０９はブダペスト条約に基き、Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｏ
ｒｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ，Ｄ−
３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されてい
る。それぞれＮ−末端及びＣ−末端をコードするＰＧＩ
Ｉの構造遺伝子の部分のヌクレオチド配列が配列表に記
載されている。さらなる情報については表２を参照のこ
と。
【００３１】
【表２】
【００３２】本発明の範囲内で同種遺伝子はまた、前記
のＰＬ及びＰＧ遺伝子の誘導体であり、これには断片、
変異体、及びコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
を変えることなく限定されない数のヌクレオチドが他の
ヌクレオチドにより置き換えられている遺伝子コードに
従って生ずるＤＮＡ配列が含まれる。
のＰＬ及びＰＧ遺伝子の誘導体であり、これには断片、
変異体、及びコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
を変えることなく限定されない数のヌクレオチドが他の
ヌクレオチドにより置き換えられている遺伝子コードに
従って生ずるＤＮＡ配列が含まれる。
【００３３】異種性構造遺伝子はウイルス、原核細胞又
は真核細胞に由来し、そしてゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ
経路を介して調製されたｃＤＮＡに由来することがで
き、そして広範囲の種類のポリペプチド、例えば、グリ
コシル化されたポリペプチド、特に高等真核生物、特に
哺乳類、例えば動物又は特にヒト由来のもの、例えば、
栄養素の製造のため及び酵素反応を行うために使用され
得る酵素、又はヒトもしくは動物の疾患の治療又は予防
のために有用な且つ価値あるポリペプチド、例えばホル
モン、免疫調節作用を有するポリペプチド、抗ウイルス
性又は抗腫瘍性ポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワ
クチン、血液凝固因子、食品等、をコードする遺伝子で
ある。
は真核細胞に由来し、そしてゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ
経路を介して調製されたｃＤＮＡに由来することがで
き、そして広範囲の種類のポリペプチド、例えば、グリ
コシル化されたポリペプチド、特に高等真核生物、特に
哺乳類、例えば動物又は特にヒト由来のもの、例えば、
栄養素の製造のため及び酵素反応を行うために使用され
得る酵素、又はヒトもしくは動物の疾患の治療又は予防
のために有用な且つ価値あるポリペプチド、例えばホル
モン、免疫調節作用を有するポリペプチド、抗ウイルス
性又は抗腫瘍性ポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワ
クチン、血液凝固因子、食品等、をコードする遺伝子で
ある。
【００３４】この様な構造遺伝子の例は、例えば、ホル
モン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カル
シトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アド
レノコルチコトロピン、色素細胞刺激ホルモン、β−リ
ポトロピン、ウロガストロンもしくはインシュリン、成
長因子、例えば上皮細胞成長因子、インシュリン様成長
因子（ＩＧＦ）例えばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、マ
スト細胞成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞
成長因子、又は形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴ
ＧＦαもしくはＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ１，β２もし
くはβ３、成長ホルモン、例えばヒト又はブタ成長ホル
モン、インターロイキン、例えばインターロイキン−１
もしくは−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ）、インターフェロン、例えばヒトα−インターフェ
ロン、例えばインターフェロンαＡ，αＢ，αＤもしく
はαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロン
又はハイブリドインターフェロン、例えば、αＡ−αＤ
−又はαＢ−αＤ−ハイブリドインターフェロン、特に
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼ
インヒビター、例えば、α１−アンチトリプシン、ＳＬ
ＰＩ等、肝炎ウイルス抗原、例えば肝炎Ｂウイルス表面
もしくはコアー抗原又は肝炎Ａウイルス抗原、又は肝炎
非Ａ−非Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば
組織プラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナー
ゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エン
ドルフィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン
Ｄ．ＥもしくはＧのライト鎖及び／又はヘビー鎖、又は
ヒト−マウスハイブリド免疫グロブリン、免疫グロブリ
ン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、例えば
ｓＣＤ２３、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプ
チド、血液凝固因子、例えばファクターＩＸもしくはＶ
ＩＩＩｃ、エリスロポイエチン、エグリン、例えばエグ
リンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、例えばデス
ルファトヒルジン変形体ＨＶ１，ＨＶ２又はＰＡ、ヒト
スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルスチミジンキナ
ーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ等を
コードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、ヒトα−
インターフェロン又はハイブリドインターフェロン、特
にハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウイルス
表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン様成長因子Ｉ
及びＩＩ、エグリンＣ及びデスルファトヒルジン、例え
ば変形体ＨＶ１をコードする遺伝子である。本発明のハ
イブリドベクターにおいては、本発明のプロモーター及
び／又はシグナル配列がポリペプチドコード領域に作用
可能に連結されており、これによりポリペプチドの効率
的な発現が保証される。
モン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カル
シトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アド
レノコルチコトロピン、色素細胞刺激ホルモン、β−リ
ポトロピン、ウロガストロンもしくはインシュリン、成
長因子、例えば上皮細胞成長因子、インシュリン様成長
因子（ＩＧＦ）例えばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、マ
スト細胞成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞
成長因子、又は形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴ
ＧＦαもしくはＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ１，β２もし
くはβ３、成長ホルモン、例えばヒト又はブタ成長ホル
モン、インターロイキン、例えばインターロイキン−１
もしくは−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ）、インターフェロン、例えばヒトα−インターフェ
ロン、例えばインターフェロンαＡ，αＢ，αＤもしく
はαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロン
又はハイブリドインターフェロン、例えば、αＡ−αＤ
−又はαＢ−αＤ−ハイブリドインターフェロン、特に
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼ
インヒビター、例えば、α１−アンチトリプシン、ＳＬ
ＰＩ等、肝炎ウイルス抗原、例えば肝炎Ｂウイルス表面
もしくはコアー抗原又は肝炎Ａウイルス抗原、又は肝炎
非Ａ−非Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば
組織プラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナー
ゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エン
ドルフィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン
Ｄ．ＥもしくはＧのライト鎖及び／又はヘビー鎖、又は
ヒト−マウスハイブリド免疫グロブリン、免疫グロブリ
ン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、例えば
ｓＣＤ２３、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプ
チド、血液凝固因子、例えばファクターＩＸもしくはＶ
ＩＩＩｃ、エリスロポイエチン、エグリン、例えばエグ
リンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、例えばデス
ルファトヒルジン変形体ＨＶ１，ＨＶ２又はＰＡ、ヒト
スーパーオキシドジスムターゼ、ウイルスチミジンキナ
ーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ等を
コードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、ヒトα−
インターフェロン又はハイブリドインターフェロン、特
にハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウイルス
表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン様成長因子Ｉ
及びＩＩ、エグリンＣ及びデスルファトヒルジン、例え
ば変形体ＨＶ１をコードする遺伝子である。本発明のハ
イブリドベクターにおいては、本発明のプロモーター及
び／又はシグナル配列がポリペプチドコード領域に作用
可能に連結されており、これによりポリペプチドの効率
的な発現が保証される。
【００３５】本発明のＤＮＡ分子は、その断片及び誘導
体を含めて、ＤＮＡ遺伝子ライブラリー、あるいは更な
る類似のＤＮＡ又はｍＲＮＡのためのｍＲＮＡをスクリ
ーニングするために使用することができる。本発明はさ
らに、ｐｋｉプロモーター活性を有する本発明のＤＮＡ
分子を挿入部として含んで成る更なるハイブリドベクタ
ーに関する。本発明の前記ＤＮＡ分子はｐｋｉプロモー
ター、その断片もしくは誘導体、例えば変異体、又は前
記の構造遺伝子とプロモーター又はその断片との融合体
を包含する。本発明のハイブリドベクターは宿主、例え
ば細菌、真菌、又は動物細胞でのクローニングのために
用いることができる。
体を含めて、ＤＮＡ遺伝子ライブラリー、あるいは更な
る類似のＤＮＡ又はｍＲＮＡのためのｍＲＮＡをスクリ
ーニングするために使用することができる。本発明はさ
らに、ｐｋｉプロモーター活性を有する本発明のＤＮＡ
分子を挿入部として含んで成る更なるハイブリドベクタ
ーに関する。本発明の前記ＤＮＡ分子はｐｋｉプロモー
ター、その断片もしくは誘導体、例えば変異体、又は前
記の構造遺伝子とプロモーター又はその断片との融合体
を包含する。本発明のハイブリドベクターは宿主、例え
ば細菌、真菌、又は動物細胞でのクローニングのために
用いることができる。
【００３６】この様なハイブリドベクターは遺伝子工学
の分野において有用な任意のベクター、例えばファー
ジ、コスミド、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、例えばフ
ァージλ例えばＮＭ９８９又はファージＭ１３例えばＭ
１３ｍｐ１８もしくはＭ１３ｍｐ１９ファージ、細胞プ
ラスミド、例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＮ１２１もしくは
ｐＵＣ１８又は酵母プラスミド、例えば酵母２μプラス
ミド、あるいはさらに例えばアスペルギルス例えばＡ．
ニガーに由来する染色体ＤＮＡの誘導体、例えばＥＰ１
８４，４３８により提供されるもの、又は欠損ファージ
もしくはプラスミドの複製を可能にするヘルパーファー
ジ又はヘルパープラスミドの存在下での欠損ファージも
しくは欠損プラスミド、例えばＭ１３Ｋ０７ヘルパーフ
ァージの存在下でのＭ１３（＋）ＫＳベクターである。
の分野において有用な任意のベクター、例えばファー
ジ、コスミド、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、例えばフ
ァージλ例えばＮＭ９８９又はファージＭ１３例えばＭ
１３ｍｐ１８もしくはＭ１３ｍｐ１９ファージ、細胞プ
ラスミド、例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＮ１２１もしくは
ｐＵＣ１８又は酵母プラスミド、例えば酵母２μプラス
ミド、あるいはさらに例えばアスペルギルス例えばＡ．
ニガーに由来する染色体ＤＮＡの誘導体、例えばＥＰ１
８４，４３８により提供されるもの、又は欠損ファージ
もしくはプラスミドの複製を可能にするヘルパーファー
ジ又はヘルパープラスミドの存在下での欠損ファージも
しくは欠損プラスミド、例えばＭ１３Ｋ０７ヘルパーフ
ァージの存在下でのＭ１３（＋）ＫＳベクターである。
【００３７】本発明のハイブリドベクターは、本発明の
ＤＮＡ分子に加えて、複製起点及び所望によりマーカー
遺伝子及び／又はｐｋｉプロモーター以外の追加の発現
制御配列、例えばアンカー、転写ターミネーター、リボ
ゾーム結合部位、翻訳開始及び終止部位、又はシグナル
配列、例えばＡ．ニガー・ペクチンリアーゼＡ，Ｂ，Ｃ
もしくはＤ、又はポリガラクチュロナーゼ、例えばＰＧ
ＩもしくはＩＩの構造遺伝子のシグナル配列を含んで成
る。
ＤＮＡ分子に加えて、複製起点及び所望によりマーカー
遺伝子及び／又はｐｋｉプロモーター以外の追加の発現
制御配列、例えばアンカー、転写ターミネーター、リボ
ゾーム結合部位、翻訳開始及び終止部位、又はシグナル
配列、例えばＡ．ニガー・ペクチンリアーゼＡ，Ｂ，Ｃ
もしくはＤ、又はポリガラクチュロナーゼ、例えばＰＧ
ＩもしくはＩＩの構造遺伝子のシグナル配列を含んで成
る。
【００３８】本発明のハイブリドベクターはｐＧＷ１１
００ではない。しかしながら、本発明のハイブリドベク
ターは、ｐｋｉプロモーター活性を有する ｐＧＷ１１
００の断片を含んで成ることができる。この様なハイブ
リドベクターの例はＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ）であり、このベクターは配列番号１の配
列のおよそ３０位のヌクレオチド位置のＢａｍＨＩから
始まり約１３５２位のＰｖｕＩＩまで延る１０５３ｂｐ
ＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ制限断片を含んで成る。
００ではない。しかしながら、本発明のハイブリドベク
ターは、ｐｋｉプロモーター活性を有する ｐＧＷ１１
００の断片を含んで成ることができる。この様なハイブ
リドベクターの例はＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ）であり、このベクターは配列番号１の配
列のおよそ３０位のヌクレオチド位置のＢａｍＨＩから
始まり約１３５２位のＰｖｕＩＩまで延る１０５３ｂｐ
ＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ制限断片を含んで成る。
【００３９】本発明の他のハイブリドベクターはＡ．ニ
ガーｐｋｉプロモーター中の変異を含む。この変異は、
新たな制限酵素開裂部位、特に構造遺伝子（これは次に
ｐｋｉプロモーターと作用可能に連結される）の挿入の
ために適当なものを生じさせるであろう。この様なベク
ターの例は特にＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｎ
ｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）であり、このものはＡ．ニガー・
ピルベートキナーゼ構造遺伝子の翻訳開始部位に新たな
ＮｓｉＩ部位を有する本発明の変異したＤＮＡ分子を含
んで成る。
ガーｐｋｉプロモーター中の変異を含む。この変異は、
新たな制限酵素開裂部位、特に構造遺伝子（これは次に
ｐｋｉプロモーターと作用可能に連結される）の挿入の
ために適当なものを生じさせるであろう。この様なベク
ターの例は特にＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｎ
ｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）であり、このものはＡ．ニガー・
ピルベートキナーゼ構造遺伝子の翻訳開始部位に新たな
ＮｓｉＩ部位を有する本発明の変異したＤＮＡ分子を含
んで成る。
【００４０】本発明のハイブリドベクターはまた、Ａ．
ニガー・ピルベートキナーゼ構造遺伝子以外の同種性構
造遺伝子、又はｐｋｉプロモーターに作用可能に連結さ
れた異種性構造遺伝子を含むことができる。この様なハ
イブリドベクターは例えばｐＰＫ−ＰＬＢであって、こ
れはＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−Ｐ
ｖｕＩＩ）の７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片及
びｐＧＷ８３０の２．６ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断
片を含んで成る。このハイブリドベクターは、シグナル
配列を含むＰＬＢをコードする構造遺伝子を含んで成
る。好ましいハイブリドベクターはｐＰＫＩ−ＩＦＮ−
２，ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２，ｐＰＫ−ＰＬＢ，Ｍ１３
ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）、及びＭ１
３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩ
Ｉ）である。
ニガー・ピルベートキナーゼ構造遺伝子以外の同種性構
造遺伝子、又はｐｋｉプロモーターに作用可能に連結さ
れた異種性構造遺伝子を含むことができる。この様なハ
イブリドベクターは例えばｐＰＫ−ＰＬＢであって、こ
れはＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−Ｐ
ｖｕＩＩ）の７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片及
びｐＧＷ８３０の２．６ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断
片を含んで成る。このハイブリドベクターは、シグナル
配列を含むＰＬＢをコードする構造遺伝子を含んで成
る。好ましいハイブリドベクターはｐＰＫＩ−ＩＦＮ−
２，ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２，ｐＰＫ−ＰＬＢ，Ｍ１３
ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）、及びＭ１
３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩ
Ｉ）である。
【００４１】〔Ａ．ニガーｐｋｉプロモーターを含んで
成るＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含んで成るハイブリド
ベクター、及び該ハイブリドベクターにより形質転換さ
れた宿主の製造方法〕本発明の更なる対象は、本発明の
ＤＮＡ分子の製造方法、例えば生体外合成により又はそ
の様なＤＮＡ配列を含有する宿主を培養することにより
該ＤＮＡを製造する方法である。宿主の培養は、非−形
質転換体すなわち所望のＤＮＡ分子を欠く宿主から形質
転換体すなわち選択マーカーと一緒に所望のＤＮＡ分子
を含有する宿主を負又は正に選択することを可能にする
化学物質を補充されているか又はそれに由来する常用の
栄養培地中で行われる。
成るＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含んで成るハイブリド
ベクター、及び該ハイブリドベクターにより形質転換さ
れた宿主の製造方法〕本発明の更なる対象は、本発明の
ＤＮＡ分子の製造方法、例えば生体外合成により又はそ
の様なＤＮＡ配列を含有する宿主を培養することにより
該ＤＮＡを製造する方法である。宿主の培養は、非−形
質転換体すなわち所望のＤＮＡ分子を欠く宿主から形質
転換体すなわち選択マーカーと一緒に所望のＤＮＡ分子
を含有する宿主を負又は正に選択することを可能にする
化学物質を補充されているか又はそれに由来する常用の
栄養培地中で行われる。
【００４２】当業界において有用な任意の形質転換可能
な宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は特に糸状真菌、例えば
アスペルギルス、例えばＡ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ，Ａ．ｏｒｉｚａｅ，Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉ
ｕｓ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ及
び特にＡ．ニガーを使用することができる。宿主の形質
転換は常法により行われる。
な宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は特に糸状真菌、例えば
アスペルギルス、例えばＡ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ，Ａ．ｏｒｉｚａｅ，Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉ
ｕｓ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ及
び特にＡ．ニガーを使用することができる。宿主の形質
転換は常法により行われる。
【００４３】本発明のＤＮＡ分子は、ピルベートキナー
ゼ遺伝子（ｐｋｉ）を含有するアスペルギルス・ニガー
から、特にそのゲノムライブラリーから、ｍＲＮＡを介
してｃＤＮＡ分子を調製することにより得ることができ
る。次に、本発明のＤＮＡ分子の調製をさらに詳細に記
載する。ゲノムライブラリーは、例えば、Ａ．ニガー
株、例えばＮＷ７５６又はＮ４００のゲノムＤＮＡを例
えばＳａｕ３ＡＩ又はＭｂｏＩにより部分消化し、そし
て高分子量ＤＮＡ断片を適当な宿主ベクター、例えば大
腸菌プラスミドｐＵＮ１２１又はλベクター例えばＥＭ
ＢＬ４中でクローニングすることにより調製することが
できる。
ゼ遺伝子（ｐｋｉ）を含有するアスペルギルス・ニガー
から、特にそのゲノムライブラリーから、ｍＲＮＡを介
してｃＤＮＡ分子を調製することにより得ることができ
る。次に、本発明のＤＮＡ分子の調製をさらに詳細に記
載する。ゲノムライブラリーは、例えば、Ａ．ニガー
株、例えばＮＷ７５６又はＮ４００のゲノムＤＮＡを例
えばＳａｕ３ＡＩ又はＭｂｏＩにより部分消化し、そし
て高分子量ＤＮＡ断片を適当な宿主ベクター、例えば大
腸菌プラスミドｐＵＮ１２１又はλベクター例えばＥＭ
ＢＬ４中でクローニングすることにより調製することが
できる。
【００４４】ｐｋｉを含有するＤＮＡ配列についてゲノ
ムライブラリーを好結果にスクリーニングするために
は、ハイブリダイズするＤＮＡプローブが必要である。
これは、Ａ．ニガーｐｋｉとハイブリダイズする合成Ｄ
ＮＡプローブ又は他のピルベートキナーゼ遺伝子もしく
はその部分、例えばプラスミド、ｐＰＹＫ１（Ｂｕｒｋ
ｅら、１９８３）中に含まれる酵母キルベートキナーゼ
構造遺伝子であることができる。
ムライブラリーを好結果にスクリーニングするために
は、ハイブリダイズするＤＮＡプローブが必要である。
これは、Ａ．ニガーｐｋｉとハイブリダイズする合成Ｄ
ＮＡプローブ又は他のピルベートキナーゼ遺伝子もしく
はその部分、例えばプラスミド、ｐＰＹＫ１（Ｂｕｒｋ
ｅら、１９８３）中に含まれる酵母キルベートキナーゼ
構造遺伝子であることができる。
【００４５】スクリーニング目的のため、ＤＮＡプロー
ブは当業界において知られている方法により、例えばγ
３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４キナーゼを用いて５′末端にお
いて放射能標識される。挿入部として本発明の核酸を担
持する宿主微生物は、遺伝子ライブラリーのフィルター
レプリカ上での標識されたＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーションにより同定される。プローブとハイブリ
ダイズするＤＮＡ分子が単離され、そして所望により常
法に従ってサブクローニングされる。プラスミドｐＧＷ
１１００はＡ．ニガーＮ４００のライブラリーからのゲ
ノムクローンのこの様なサブクローンである。このもの
は、Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼのための完全な機
能的遺伝子を含んで成るＡ．ニガーゲノムの５．０ｋｂ
ｐＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んで成る。
ブは当業界において知られている方法により、例えばγ
３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４キナーゼを用いて５′末端にお
いて放射能標識される。挿入部として本発明の核酸を担
持する宿主微生物は、遺伝子ライブラリーのフィルター
レプリカ上での標識されたＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーションにより同定される。プローブとハイブリ
ダイズするＤＮＡ分子が単離され、そして所望により常
法に従ってサブクローニングされる。プラスミドｐＧＷ
１１００はＡ．ニガーＮ４００のライブラリーからのゲ
ノムクローンのこの様なサブクローンである。このもの
は、Ａ．ニガー・ピルベートキナーゼのための完全な機
能的遺伝子を含んで成るＡ．ニガーゲノムの５．０ｋｂ
ｐＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んで成る。
【００４６】同定されたｐｋｉ又は遺伝子断片は次にサ
ブクローニングされる。ｐＧＷ１１００に含まれるＡ．
ニガーの機能的ｐｋｉの全配列を配列表の配列番号１に
示す。プラスミドｐＧＷ１１００は本発明のＤＮＡ分子
を調製するために使用される。この様なＤＮＡ分子は、
常用の制限酵素、リンカー、変異、連結、増幅及び単離
法を適用することにより常法に従って調製される。配列
番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子の断片
は、例えば、該ＤＮＡ分子をヌクレアーゼ、例えば、Ｂ
ａ１３１もしくはＥｘｏＩＩＩのごときエキソヌクレア
ーゼ、又は制限酵素のごときエンドヌクレアーゼにより
処理することにより調製される。
ブクローニングされる。ｐＧＷ１１００に含まれるＡ．
ニガーの機能的ｐｋｉの全配列を配列表の配列番号１に
示す。プラスミドｐＧＷ１１００は本発明のＤＮＡ分子
を調製するために使用される。この様なＤＮＡ分子は、
常用の制限酵素、リンカー、変異、連結、増幅及び単離
法を適用することにより常法に従って調製される。配列
番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子の断片
は、例えば、該ＤＮＡ分子をヌクレアーゼ、例えば、Ｂ
ａ１３１もしくはＥｘｏＩＩＩのごときエキソヌクレア
ーゼ、又は制限酵素のごときエンドヌクレアーゼにより
処理することにより調製される。
【００４７】配列番号１のヌクレオチド配列又はその断
片の誘導体は例えば常法による変異誘発〔Ｊ．Ｊ．Ｚｏ
ｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈの総説Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１００，４６８（１９８３）；Ｄ．Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ及びＤ．Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９，１１９３（１９８５）；又はＫ．Ｎｏｒｒｉｓ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，５１０３
（１９８３）を参照のこと〕により、例えば例２．１．
２．に後記するようにして調製される。新たな制限部位
を含む変異体は、例えば、常法に従って変異原性オリゴ
ヌクレオチドを用いる部位特定変異誘発により調製する
ことができる。配列番号１の配列に変異を導入するため
のこの様な変異原性オリゴヌクレオチドの例は配列番号
２に示すＤＮＡ分子である。
片の誘導体は例えば常法による変異誘発〔Ｊ．Ｊ．Ｚｏ
ｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈの総説Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１００，４６８（１９８３）；Ｄ．Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ及びＤ．Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９，１１９３（１９８５）；又はＫ．Ｎｏｒｒｉｓ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，５１０３
（１９８３）を参照のこと〕により、例えば例２．１．
２．に後記するようにして調製される。新たな制限部位
を含む変異体は、例えば、常法に従って変異原性オリゴ
ヌクレオチドを用いる部位特定変異誘発により調製する
ことができる。配列番号１の配列に変異を導入するため
のこの様な変異原性オリゴヌクレオチドの例は配列番号
２に示すＤＮＡ分子である。
【００４８】配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡ分子又はその断片もしくは変異体の組換誘導体は例
えば、組換ＤＮＡ技法により、例えばこの様なＤＮＡ分
子又はその断片もしくは変異体を制限酵素により切断し
そして／又はそれを他のＤＮＡ分子、例えばオリゴヌク
レオチドリンカー又は、構造遺伝子、シグナル配列及び
／又はターミネーター領域を含んで成るＤＮＡ分子と連
結することを含む方法により調製することができる。
ＮＡ分子又はその断片もしくは変異体の組換誘導体は例
えば、組換ＤＮＡ技法により、例えばこの様なＤＮＡ分
子又はその断片もしくは変異体を制限酵素により切断し
そして／又はそれを他のＤＮＡ分子、例えばオリゴヌク
レオチドリンカー又は、構造遺伝子、シグナル配列及び
／又はターミネーター領域を含んで成るＤＮＡ分子と連
結することを含む方法により調製することができる。
【００４９】宿主細胞は常法に従って形質転換され、そ
して形質転換体が例えばその耐性、例えばテトラサイク
リンに対する耐性により、又は栄養要求マーカー例えば
ｐｙｒＡの補完により同定及び／又は選択される。特
に、ここに記載される発現ベクターは適当な大腸菌宿
主、例えばＨＢ１０１，ＪＭ１０９，ＭＨ１，ＤＨ５α
等において増幅され、形質転換され、そして当業界にお
ける常法に従って選択される。増幅されたプラスミドは
常法により、特にＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，１５１３−１５
２３，１９７９）により記載されているようにして細菌
から単離される。
して形質転換体が例えばその耐性、例えばテトラサイク
リンに対する耐性により、又は栄養要求マーカー例えば
ｐｙｒＡの補完により同定及び／又は選択される。特
に、ここに記載される発現ベクターは適当な大腸菌宿
主、例えばＨＢ１０１，ＪＭ１０９，ＭＨ１，ＤＨ５α
等において増幅され、形質転換され、そして当業界にお
ける常法に従って選択される。増幅されたプラスミドは
常法により、特にＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，１５１３−１５
２３，１９７９）により記載されているようにして細菌
から単離される。
【００５０】本発明のＤＮＡ分子又は本発明のハイブリ
ドベクター、特に同種又は異種構造遺伝子を含むもの
は、糸状真菌、例えばアスペルギルス（Ａａｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はセ
ファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、
例えばアスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａ
ｎｓ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙａｅ）、Ａ．カルボナ
リウス（Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）、Ａ．アワモリ
（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、及び特にＡ．ニガー（Ａ．ｎ
ｉｇｅｒ）を形質転換するために用いることができる。
ドベクター、特に同種又は異種構造遺伝子を含むもの
は、糸状真菌、例えばアスペルギルス（Ａａｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はセ
ファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、
例えばアスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａ
ｎｓ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙａｅ）、Ａ．カルボナ
リウス（Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）、Ａ．アワモリ
（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、及び特にＡ．ニガー（Ａ．ｎ
ｉｇｅｒ）を形質転換するために用いることができる。
【００５１】非形質転換真菌から形質転換された真菌を
選択することを可能にするため、本発明のベクターは選
択マーカーを担持することができ、又は別の方法とし
て、真菌をその様な選択マーカーを含有する第二ベクタ
ーにより同時形質転換することができる。他の系と同様
に、この様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であ
り、この構造遺伝子の発現が受容体に対して毒性の化合
物に対する耐性を提供し、又は該構造遺伝子が必須ポリ
ペプチドを欠く変異株の酵素系を補完する。この様なマ
ーカー遺伝子は例えば既知のｑａ−２，ｐｙｒＧ，ｐｙ
ｒ４，ｔｒｐＣ，ａｍｄＳ又はａｒｇＢ遺伝子である。
選択することを可能にするため、本発明のベクターは選
択マーカーを担持することができ、又は別の方法とし
て、真菌をその様な選択マーカーを含有する第二ベクタ
ーにより同時形質転換することができる。他の系と同様
に、この様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であ
り、この構造遺伝子の発現が受容体に対して毒性の化合
物に対する耐性を提供し、又は該構造遺伝子が必須ポリ
ペプチドを欠く変異株の酵素系を補完する。この様なマ
ーカー遺伝子は例えば既知のｑａ−２，ｐｙｒＧ，ｐｙ
ｒ４，ｔｒｐＣ，ａｍｄＳ又はａｒｇＢ遺伝子である。
【００５２】ＥＰ ２７８．３５５に記載されているよ
うに、ｐｙｒＡと称するマーカー遺伝子はＡ．ニガーの
ゲノムライブラリーから単離され、これはＡ．ニドラン
スのｐｙｒＣ及びＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の
ｐｙｒ４に類似する機能、すなわち酵素オロチジン５′
−ホスフェートデカルボキシラーゼの生産、に関連しそ
して該機能を有する。この酵素はオロチジン５′−ホス
フェートからウリジル酸（ウリジン５′−ホスフェー
ト）への脱炭酸及びさらにフルオロオロチン酸から毒性
のフルオロ−ウリジンへの脱炭酸を触媒する。
うに、ｐｙｒＡと称するマーカー遺伝子はＡ．ニガーの
ゲノムライブラリーから単離され、これはＡ．ニドラン
スのｐｙｒＣ及びＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の
ｐｙｒ４に類似する機能、すなわち酵素オロチジン５′
−ホスフェートデカルボキシラーゼの生産、に関連しそ
して該機能を有する。この酵素はオロチジン５′−ホス
フェートからウリジル酸（ウリジン５′−ホスフェー
ト）への脱炭酸及びさらにフルオロオロチン酸から毒性
のフルオロ−ウリジンへの脱炭酸を触媒する。
【００５３】Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖ
ｏｎ ＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ３９６
８として寄託されている大腸菌Ｂｇ５１８３／ｐＣＧ５
９Ｄ７から、ｐｙｒＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＣ
Ｇ５９Ｄ７を単離しそしてＡ．ニガーｐｙｒＡ−変異株
の同時形質転換のために使用した。この様なｐｙｒＡ−
変異株はオロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラ
ーゼ遺伝子に欠陥があり、そしてそれ故に対応する酵素
を生産することができない。
ｏｎ ＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ３９６
８として寄託されている大腸菌Ｂｇ５１８３／ｐＣＧ５
９Ｄ７から、ｐｙｒＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＣ
Ｇ５９Ｄ７を単離しそしてＡ．ニガーｐｙｒＡ−変異株
の同時形質転換のために使用した。この様なｐｙｒＡ−
変異株はオロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラ
ーゼ遺伝子に欠陥があり、そしてそれ故に対応する酵素
を生産することができない。
【００５４】この様の変異株は例えばＡ．ニガーＮ５９
３又はＡ．ニガーＡｎ８であり、後者はＤｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎにＮｏ．ＤＳＭ３９１７として寄託されてい
る。これらの変異株は、Ａ．ニガーの分生胞子を変異性
ＵＶ−照射のもとで処理し、そしてフルオロ−オロチン
酸及びウリジンの存在下で生存するコロニーを選択する
ことにより調製される。フルオロオロチン酸の存在下及
びウリジンの非存在下で生存するコロニーは除去する。
３又はＡ．ニガーＡｎ８であり、後者はＤｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎにＮｏ．ＤＳＭ３９１７として寄託されてい
る。これらの変異株は、Ａ．ニガーの分生胞子を変異性
ＵＶ−照射のもとで処理し、そしてフルオロ−オロチン
酸及びウリジンの存在下で生存するコロニーを選択する
ことにより調製される。フルオロオロチン酸の存在下及
びウリジンの非存在下で生存するコロニーは除去する。
【００５５】本発明はさらに、本発明のハイブリドベク
ターにより形質転換された宿主に関する。この様な形質
転換体は例えば細菌、例えば大腸菌、又は糸状真菌、例
えばアスペルギルス・ペニシリウム又はセファロスポリ
ウム、そして特にＡ．ニドランス、Ａ．ジャポニカス、
Ａ．オリゼー、Ａ．カルボナリウス、Ａ．アワモリ、又
は好ましくはＡ．ニガー、例えばＡ．ニガーＡｎ８もし
くはＮ５９３である。
ターにより形質転換された宿主に関する。この様な形質
転換体は例えば細菌、例えば大腸菌、又は糸状真菌、例
えばアスペルギルス・ペニシリウム又はセファロスポリ
ウム、そして特にＡ．ニドランス、Ａ．ジャポニカス、
Ａ．オリゼー、Ａ．カルボナリウス、Ａ．アワモリ、又
は好ましくはＡ．ニガー、例えばＡ．ニガーＡｎ８もし
くはＮ５９３である。
【００５６】ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２，ｐＰＫＩｓｓＩＦ
Ｎ−２又はｐＰＫ−ＰＬＢにより形質転換された大腸菌
ＪＭ１０１又はＤＨ５α；あるいはｐＰＫ−ＰＬＢ，ｐ
ＰＫＩ−ＩＦＮ−２又はｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２により
形質転換されておりそして場合によってはさらに選択マ
ーカープラスミドｐＧＷ６１３又はｐＣＧ５９Ｄ７によ
り形質転換されているアスペルギルス・ニガーＮ５９３
又はＡｎ８が特に好ましい。
Ｎ−２又はｐＰＫ−ＰＬＢにより形質転換された大腸菌
ＪＭ１０１又はＤＨ５α；あるいはｐＰＫ−ＰＬＢ，ｐ
ＰＫＩ−ＩＦＮ−２又はｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２により
形質転換されておりそして場合によってはさらに選択マ
ーカープラスミドｐＧＷ６１３又はｐＣＧ５９Ｄ７によ
り形質転換されているアスペルギルス・ニガーＮ５９３
又はＡｎ８が特に好ましい。
【００５７】本発明はまた、この様な形質転換体の調製
方法にも関し、この方法は宿主を形質転換条件下で本発
明の組換ＤＮＡ分子又はハイブリドベクターにより、場
合によってはさらに選択マーカー遺伝子と一緒に処理
し、そして所望により形質転換体を選択することを含ん
で成る。
方法にも関し、この方法は宿主を形質転換条件下で本発
明の組換ＤＮＡ分子又はハイブリドベクターにより、場
合によってはさらに選択マーカー遺伝子と一緒に処理
し、そして所望により形質転換体を選択することを含ん
で成る。
【００５８】〔ペプチドの製造方法〕本発明はさらに、
ポリペプチドの製造方法に関し、この方法は、ポリペプ
チド例えば前記のものをコードする構造遺伝子、特にヒ
トα−インターフェロン又はハイブリドインターフェロ
ン、特にハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組
織プラスノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウイ
ルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン様成長因
子Ｉ又はＩＩ、エグリンＣあるいはデスルファトヒルジ
ン、例えば変異体ＨＶ１をコードする遺伝子をｐｋｉプ
ロモーターと作用可能に連結し、そして適当な宿主中で
発現せしめることを特徴とする。
ポリペプチドの製造方法に関し、この方法は、ポリペプ
チド例えば前記のものをコードする構造遺伝子、特にヒ
トα−インターフェロン又はハイブリドインターフェロ
ン、特にハイブリドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組
織プラスノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、肝炎Ｂウイ
ルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インシュリン様成長因
子Ｉ又はＩＩ、エグリンＣあるいはデスルファトヒルジ
ン、例えば変異体ＨＶ１をコードする遺伝子をｐｋｉプ
ロモーターと作用可能に連結し、そして適当な宿主中で
発現せしめることを特徴とする。
【００５９】必要な場合は、ポリペプチドを常法に従っ
て単離する。ベクターの構成に依存して、生成物は宿主
細胞中に生産されるか、あるいはシグナル配列が存在す
る場合には細胞内で生産されそして分泌される。適当な
宿主は好ましくはアスペルギルスの種、例えばＡ．ニガ
ー、特にＡ．ニガーＡｎ８又はＮ５９３である。適当な
宿主はまた、他の糸状真菌、例えばニューロスポラ・ク
ラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、又は
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー又はクルイ
ベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）である。
て単離する。ベクターの構成に依存して、生成物は宿主
細胞中に生産されるか、あるいはシグナル配列が存在す
る場合には細胞内で生産されそして分泌される。適当な
宿主は好ましくはアスペルギルスの種、例えばＡ．ニガ
ー、特にＡ．ニガーＡｎ８又はＮ５９３である。適当な
宿主はまた、他の糸状真菌、例えばニューロスポラ・ク
ラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、又は
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー又はクルイ
ベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）である。
【００６０】単一の遺伝子産物を製造することができ、
このために種々の方法を適用することができる。例え
ば、単一のポリガラクチュロナーゼＰＧ又はペクチンリ
アーゼＰＬ、好ましくはＰＬＢの製造方法は、ＰＧ又は
ＰＬのいずれも発現することができないかあるいはＰＧ
又はＰＬを低レベルでのみ発現する適当な宿主を、ＰＧ
又はＰＬ例えばＰＬＢをコードする構造遺伝子を含んで
成るハイブリドベクターにより形質転換し、そして該遺
伝子を発現せしめることを特徴とする。
このために種々の方法を適用することができる。例え
ば、単一のポリガラクチュロナーゼＰＧ又はペクチンリ
アーゼＰＬ、好ましくはＰＬＢの製造方法は、ＰＧ又は
ＰＬのいずれも発現することができないかあるいはＰＧ
又はＰＬを低レベルでのみ発現する適当な宿主を、ＰＧ
又はＰＬ例えばＰＬＢをコードする構造遺伝子を含んで
成るハイブリドベクターにより形質転換し、そして該遺
伝子を発現せしめることを特徴とする。
【００６１】また、制御領域としてｐｋｉプロモーター
を用いて、対応する又は関連する内因性遺伝子産物、例
えばＰＬＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ又はＦを誘導条件下でのみ
生産することができる適当な形質転換された宿主中で単
一遺伝子産物例えばＰＬＢを生産することができ、例え
ば、ペクチン又はペクチン分解生成物が培地中に存在す
る場合には、前記形質転換された宿主を、内因性構造遺
伝子の発現を許容しないがしかしｐｋｉプロモーターの
制御のもとにある構造遺伝子の発現を許容する条件下で
培養することにより単独遺伝子産物を生産せしめること
ができる。例えば炭素源及びエネルギー源としてグルコ
ースを含む最少培地が使用されれば、この様な条件が与
えられる。ＰＧ又はＰＬのいずれも発現することができ
ない宿主を用いるか、又は内因性ＰＬの生産を許容しな
い条件が適用されれば、前記単一ＰＧ又はＰＬを純粋な
形で、すなわち他のＰＧ又はＰＬが挾していない形で得
ることができる。
を用いて、対応する又は関連する内因性遺伝子産物、例
えばＰＬＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ又はＦを誘導条件下でのみ
生産することができる適当な形質転換された宿主中で単
一遺伝子産物例えばＰＬＢを生産することができ、例え
ば、ペクチン又はペクチン分解生成物が培地中に存在す
る場合には、前記形質転換された宿主を、内因性構造遺
伝子の発現を許容しないがしかしｐｋｉプロモーターの
制御のもとにある構造遺伝子の発現を許容する条件下で
培養することにより単独遺伝子産物を生産せしめること
ができる。例えば炭素源及びエネルギー源としてグルコ
ースを含む最少培地が使用されれば、この様な条件が与
えられる。ＰＧ又はＰＬのいずれも発現することができ
ない宿主を用いるか、又は内因性ＰＬの生産を許容しな
い条件が適用されれば、前記単一ＰＧ又はＰＬを純粋な
形で、すなわち他のＰＧ又はＰＬが挾していない形で得
ることができる。
【００６２】単一遺伝子産物をコードしている本発明の
ＤＮＡ分子又はハイブリドベクターにより形質転換され
た適当な宿主中で生産される単一遺伝子生成物、及びそ
の生理的に許容される塩も本発明の対象である。Ａ．ニ
ガーの酵素、特に食品又は飼料工業において有用なも
の、特にＰＬＢが好ましい。本発明は本発明の方法によ
り生産される該ポリペプチドに関する。
ＤＮＡ分子又はハイブリドベクターにより形質転換され
た適当な宿主中で生産される単一遺伝子生成物、及びそ
の生理的に許容される塩も本発明の対象である。Ａ．ニ
ガーの酵素、特に食品又は飼料工業において有用なも
の、特にＰＬＢが好ましい。本発明は本発明の方法によ
り生産される該ポリペプチドに関する。
【００６３】本発明はまた、本発明により生産されるポ
リペプチド、例えば単一ＰＬ及び／又はＰＬ活性を有す
るその誘導体及び／又は単一ＰＧ及び／又はＰＧ活性を
有するその誘導体及び／又はこれらの生理的に許容され
る塩の１種又は複数種並びに場合によってはＰＬ又はＰ
Ｇ活性以外の活性を有する適当な１又は複数の酵素を所
定の組合わせで含んで成る酵素組成物の製造方法に関す
る。
リペプチド、例えば単一ＰＬ及び／又はＰＬ活性を有す
るその誘導体及び／又は単一ＰＧ及び／又はＰＧ活性を
有するその誘導体及び／又はこれらの生理的に許容され
る塩の１種又は複数種並びに場合によってはＰＬ又はＰ
Ｇ活性以外の活性を有する適当な１又は複数の酵素を所
定の組合わせで含んで成る酵素組成物の製造方法に関す
る。
【００６４】ＰＬ活性以外の活性を有する適当な酵素は
分解及び修飾細胞性ポリマーである。この様な酵素は、
例えばペクチンエステラーゼ、エンド−及びエキソ−作
用ポリガラクチュロナーゼ、セルラーゼ、混合エンドグ
ルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナ
ーゼ、ガラクタナーゼ、α−及びβ−グリコシダーゼ等
である。
分解及び修飾細胞性ポリマーである。この様な酵素は、
例えばペクチンエステラーゼ、エンド−及びエキソ−作
用ポリガラクチュロナーゼ、セルラーゼ、混合エンドグ
ルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナ
ーゼ、ガラクタナーゼ、α−及びβ−グリコシダーゼ等
である。
【００６５】本発明の方法に従って生産されたＰＧもし
くはＰＬ又はそれぞれＰＧもしくはＰＬ活性を有するそ
の誘導体、あるいはこれらの酵素組成物は、例えば野菜
ジュース又は果物ジュースの清浄化のため、野菜ジュー
ス又は果物ジュースの製造におけるジュース収量及び油
含有種子又は果物の圧搾収量の増強のため、果物ジュー
ス又は野菜ジュースの安定化のため、野菜ジュース又は
果物ジュースの粘度の低下のため、バイオマスの液化の
ため、軟化のため、天野色素、芳香及び香味のごとき天
然抽出物の増強のため、バイオマス、食品又は飼料の価
格安定のため、等のために有用である。
くはＰＬ又はそれぞれＰＧもしくはＰＬ活性を有するそ
の誘導体、あるいはこれらの酵素組成物は、例えば野菜
ジュース又は果物ジュースの清浄化のため、野菜ジュー
ス又は果物ジュースの製造におけるジュース収量及び油
含有種子又は果物の圧搾収量の増強のため、果物ジュー
ス又は野菜ジュースの安定化のため、野菜ジュース又は
果物ジュースの粘度の低下のため、バイオマスの液化の
ため、軟化のため、天野色素、芳香及び香味のごとき天
然抽出物の増強のため、バイオマス、食品又は飼料の価
格安定のため、等のために有用である。
【００６６】本発明は最も好ましくは、次に記載する、
Ａ．ニガーｐｋｉプロモーター又はプロモーター活性を
有するその断片もしくは誘導体、ハイブリドベクター、
形質転換された宿主、Ａ．ニガーｐｋｉプロモーター又
はプロモーター活性を有するその断片もしくは誘導体の
製造方法、ハイブリドベクターの製造方法、形質転換さ
れた宿主の製造方法、ポリペプチドの製造方法に関す
る。
Ａ．ニガーｐｋｉプロモーター又はプロモーター活性を
有するその断片もしくは誘導体、ハイブリドベクター、
形質転換された宿主、Ａ．ニガーｐｋｉプロモーター又
はプロモーター活性を有するその断片もしくは誘導体の
製造方法、ハイブリドベクターの製造方法、形質転換さ
れた宿主の製造方法、ポリペプチドの製造方法に関す
る。
【００６７】
【実施例】次の例は、本発明を例示するものであり、本
発明を限定するものではない。 〔略号は次の意図を有する〕
発明を限定するものではない。 〔略号は次の意図を有する〕
【００６８】〔培地〕 ＬＣ培地 １％トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、
０．５％酵母エキス（ＢＢＬ）、０．８％ＮａＣｌ，１
ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／リットル２ｘ
ＹＴ培地 １リットル当り１６ｇトリプチカーゼペプト
ン（ＢＢＬ）、１０ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ Ａ．ニガー用最少培地 １ｌ中１．５ｇ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４，０．５ｇ ＫＣｌ，０．５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２Ｏ，４．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ，１０．０ｇグルコース、
痕跡のＦｅＳＯ４，ＭｎＳＯ４，ＺｎＣ１２，ＮａＯＨ
にてｐＨ６．５に調整Ａ．ニガー用完全培地 最少培地
＋０．２％トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、０．１
％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％酵母エキス（Ｂ
ＢＬ）、０．０５％酵母からのリボ核酸ナトリウム塩
（ＩＣＮ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，米国）、２ｍｌビタミ
ン溶液／リットル ビタミン溶液 １００ｍｌ当り１０ｍｇチアミン、１０
０ｍｇリボフラビン、１０ｍｇパントテン酸、２ｍｇビ
オチン、１０ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸、１００ｍｇニ
コチンアミド、５０ｍｇピリドキシン−ＨＣｌ プレート培地のためには、すべての培地を１．５％寒天
（ＢＢＬ）の添加により固化し、上層寒天（ｏｓｅ）の
ためには０．７％寒天（ＢＢＬ）又はアガロース（Ｓｅ
ａｋｅｍ）を用いる。
０．５％酵母エキス（ＢＢＬ）、０．８％ＮａＣｌ，１
ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／リットル２ｘ
ＹＴ培地 １リットル当り１６ｇトリプチカーゼペプト
ン（ＢＢＬ）、１０ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ Ａ．ニガー用最少培地 １ｌ中１．５ｇ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４，０．５ｇ ＫＣｌ，０．５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２Ｏ，４．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ，１０．０ｇグルコース、
痕跡のＦｅＳＯ４，ＭｎＳＯ４，ＺｎＣ１２，ＮａＯＨ
にてｐＨ６．５に調整Ａ．ニガー用完全培地 最少培地
＋０．２％トリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、０．１
％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％酵母エキス（Ｂ
ＢＬ）、０．０５％酵母からのリボ核酸ナトリウム塩
（ＩＣＮ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，米国）、２ｍｌビタミ
ン溶液／リットル ビタミン溶液 １００ｍｌ当り１０ｍｇチアミン、１０
０ｍｇリボフラビン、１０ｍｇパントテン酸、２ｍｇビ
オチン、１０ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸、１００ｍｇニ
コチンアミド、５０ｍｇピリドキシン−ＨＣｌ プレート培地のためには、すべての培地を１．５％寒天
（ＢＢＬ）の添加により固化し、上層寒天（ｏｓｅ）の
ためには０．７％寒天（ＢＢＬ）又はアガロース（Ｓｅ
ａｋｅｍ）を用いる。
【００６９】〔次の菌株を使用する〕 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
１９７９） 大腸菌ＲＺ１０３２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 大腸菌ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 大腸菌ＤＨ５αＦ′（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 大腸菌ＢＷ３１３（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５） Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ ３９１７，ＥＰ−Ａ−０２
７８３５５） Ａ．ニガーＮ５９３ 〔次のベクターを使用する〕 ｐＢＲ３２２：Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．（１９７
６），Ｐｅｄｅｎ，Ｋ．Ｗ．Ｃ．（１９８３）又はＢｏ
ｌｉｖａｎら（１９７７）に記載されるている。ｐＧＷ
６１３：このプラスミドはＧｏｏｓｅｎら（１９８７）
に記載されている。
１９７９） 大腸菌ＲＺ１０３２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 大腸菌ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 大腸菌ＤＨ５αＦ′（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 大腸菌ＢＷ３１３（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５） Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ ３９１７，ＥＰ−Ａ−０２
７８３５５） Ａ．ニガーＮ５９３ 〔次のベクターを使用する〕 ｐＢＲ３２２：Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．（１９７
６），Ｐｅｄｅｎ，Ｋ．Ｗ．Ｃ．（１９８３）又はＢｏ
ｌｉｖａｎら（１９７７）に記載されるている。ｐＧＷ
６１３：このプラスミドはＧｏｏｓｅｎら（１９８７）
に記載されている。
【００７０】Ｍ１３ｍｐファージ：Ｍ１３ｍｐ１８及び
Ｍ１３ｍｐ１９ベクター（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、文献
２４）は単鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３の誘導体
であり、多才なポリリンカー部位における種々のＤＮＡ
断片のクローニング及び同じ制限断片の可能な両方向で
のクローニングを可能にすることによりＤＮＡの配列決
定を促進するように設計されている。これらのベクター
にクローン化された配列は、標準的オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドプライマー及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
ＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用いる単鎖プローブの製造又は
配列決定反応のための鋳型として容易に使用することが
できる。ベクターＤＮＡは大腸菌ｌａｃ−オペロンプロ
モーター及びβ−ガラクトシダーゼの最初の１４５アミ
ノ酸の遺伝情報を担持している。多数制限部位を含有す
るポリリンカー配列がｌａｃＺ配列に挿入されている。
該ポリリンカーはｌａｃＺリーディングフレームを維持
しており、そして該ベクターはｌａｃＺａ宿主株の対立
遺伝子相補性を提供し、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含有
するプレート上で青色プラークをもたらす。リーディン
グフレームを破壊するか又はそれとは別にｌａｃＺａペ
プチドの発現を妨害する挿入部を含有する組換えファー
ジは無色のプラークとして示される。
Ｍ１３ｍｐ１９ベクター（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、文献
２４）は単鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３の誘導体
であり、多才なポリリンカー部位における種々のＤＮＡ
断片のクローニング及び同じ制限断片の可能な両方向で
のクローニングを可能にすることによりＤＮＡの配列決
定を促進するように設計されている。これらのベクター
にクローン化された配列は、標準的オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドプライマー及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
ＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用いる単鎖プローブの製造又は
配列決定反応のための鋳型として容易に使用することが
できる。ベクターＤＮＡは大腸菌ｌａｃ−オペロンプロ
モーター及びβ−ガラクトシダーゼの最初の１４５アミ
ノ酸の遺伝情報を担持している。多数制限部位を含有す
るポリリンカー配列がｌａｃＺ配列に挿入されている。
該ポリリンカーはｌａｃＺリーディングフレームを維持
しており、そして該ベクターはｌａｃＺａ宿主株の対立
遺伝子相補性を提供し、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含有
するプレート上で青色プラークをもたらす。リーディン
グフレームを破壊するか又はそれとは別にｌａｃＺａペ
プチドの発現を妨害する挿入部を含有する組換えファー
ジは無色のプラークとして示される。
【００７１】ｐＣＧ５９Ｄ７：このプラスミドはＥＰ８
８ １０１ ３９７．３に記載されており、そして大腸
菌ＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ ３９６８）
から得ることができる。このプラスミドはｐｙｒＡ遺伝
子を含有し、そしてＡ．ニガーｐｙｒＡ−変異株の同時
形質転換のために使用される。 Ｍ１３Ｋ０７：例えばＭ１３（＋）ＫＳのためのヘルパ
ーＭ１３ファージ。Ｍｅａｄら（１９８６）、及びＤｏ
ｔｔｏとＺｉｎｄｅｒ（１９８４）に記載されている。 ｐＰＹＫｌ：Ｓ．セレビシエー・ピルベートキナーゼ遺
伝子を含む。Ｂｕｒｋｅら、１９８２に記載されてい
る。 ｐＧＷ１８００：Ａ．ニガーのＰＧＩＩ遺伝子を含有す
る。ｐＧＷ１８００を含有する大腸菌ＪＭ１０９株はＤ
ｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ ５５０５として寄託さ
れている。
８ １０１ ３９７．３に記載されており、そして大腸
菌ＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ ３９６８）
から得ることができる。このプラスミドはｐｙｒＡ遺伝
子を含有し、そしてＡ．ニガーｐｙｒＡ−変異株の同時
形質転換のために使用される。 Ｍ１３Ｋ０７：例えばＭ１３（＋）ＫＳのためのヘルパ
ーＭ１３ファージ。Ｍｅａｄら（１９８６）、及びＤｏ
ｔｔｏとＺｉｎｄｅｒ（１９８４）に記載されている。 ｐＰＹＫｌ：Ｓ．セレビシエー・ピルベートキナーゼ遺
伝子を含む。Ｂｕｒｋｅら、１９８２に記載されてい
る。 ｐＧＷ１８００：Ａ．ニガーのＰＧＩＩ遺伝子を含有す
る。ｐＧＷ１８００を含有する大腸菌ＪＭ１０９株はＤ
ｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ ５５０５として寄託さ
れている。
【００７２】ｐＧＷ８３０：Ａ．ニガーのｐｅｌＢ遺伝
子を含有する。ｐＧＷ８３０を含有する大腸菌ＨＢ１０
１がＤｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ ４３８９として
寄託されている。 ｐＴＺ１８Ｒ：Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。 ｐＧＷ１１００：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子を含有する。
Ｌ．Ｈ．ｄｅ Ｇｒａａｆｆ，１９８９に記載されてお
り、そしてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＦ′／ｐ
ＧＷ１１００としてＤｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ ＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＮｏ．５
７４７として寄託されている。ｐＪＤＢ２０７−ＩＦＮ
ＡＭ１１９：ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２０５４
０４に記載されている。
子を含有する。ｐＧＷ８３０を含有する大腸菌ＨＢ１０
１がＤｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＤＳＭ ４３８９として
寄託されている。 ｐＴＺ１８Ｒ：Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。 ｐＧＷ１１００：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子を含有する。
Ｌ．Ｈ．ｄｅ Ｇｒａａｆｆ，１９８９に記載されてお
り、そしてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＦ′／ｐ
ＧＷ１１００としてＤｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ ＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎにＮｏ．５
７４７として寄託されている。ｐＪＤＢ２０７−ＩＦＮ
ＡＭ１１９：ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２０５４
０４に記載されている。
【００７３】例１．〔Ａ．ニガーピルベートキナーゼ遺
伝子の単離及び特徴付け〕 例１．１．〔酵母ピルベートキナーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片の単離〕 サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの１．８ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドｐＰＹＫ１（Ｂｕｒ
ｋｅら、１９８３）を、ＥｃｏＲＩにより、供給者（Ｂ
ＲＬ）により与えられた条件を用いて消化する。生ずる
断片を０．６％低融点（ＬＭＰ）アガロースゲル中での
電気泳動により分離する。１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
を含有するＬＭＰアガロースの片をゲルから切り出し、
そしてＤＮＡを次の方法により抽出する。ＴＥ緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８．０）をアガロース片に加えて最終容量５００μｌ
とし、次に５００μｌのフェノールを加える。
伝子の単離及び特徴付け〕 例１．１．〔酵母ピルベートキナーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片の単離〕 サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの１．８ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドｐＰＹＫ１（Ｂｕｒ
ｋｅら、１９８３）を、ＥｃｏＲＩにより、供給者（Ｂ
ＲＬ）により与えられた条件を用いて消化する。生ずる
断片を０．６％低融点（ＬＭＰ）アガロースゲル中での
電気泳動により分離する。１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
を含有するＬＭＰアガロースの片をゲルから切り出し、
そしてＤＮＡを次の方法により抽出する。ＴＥ緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８．０）をアガロース片に加えて最終容量５００μｌ
とし、次に５００μｌのフェノールを加える。
【００７４】アガロースを６５℃にて１０分間のインキ
ュベーションにより溶融しそして溶液と混合する。２５
０μｌのＣＩＡ（クロロホルム／イソアミルアルコール
２４：１）の添加の後、水相と有機相とを１４，０００
×ｇにて１０分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心
機）により分離する。有機相を捨て、そして１／２容量
のフェノールとの６５℃にて１０分間のインキュベーシ
ョンにより再度抽出し、次にさらに１／２容量のＣＩＡ
を添加し、そして相分離を行う。有機相を再び捨て、そ
して水相を室温にて等容量のフェノール／ＣＩＡ（１：
１）及び等容量のＣＩＡにより逐次抽出する。
ュベーションにより溶融しそして溶液と混合する。２５
０μｌのＣＩＡ（クロロホルム／イソアミルアルコール
２４：１）の添加の後、水相と有機相とを１４，０００
×ｇにて１０分間の遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心
機）により分離する。有機相を捨て、そして１／２容量
のフェノールとの６５℃にて１０分間のインキュベーシ
ョンにより再度抽出し、次にさらに１／２容量のＣＩＡ
を添加し、そして相分離を行う。有機相を再び捨て、そ
して水相を室温にて等容量のフェノール／ＣＩＡ（１：
１）及び等容量のＣＩＡにより逐次抽出する。
【００７５】最後に、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム
及び２容量のエタノールの添加によりＤＮＡを沈澱せし
める。１４，０００×ｇ、室温にて３０分間の遠心分離
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機）によりＤＮＡを沈降せし
める。上清を除去した後、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖ
ａｃ（商標）真空遠心機を用いてＤＮＡペレットを乾燥
する。最後にＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、参照と
して同時泳動するλＤＮＡの既知量を用いてアガロース
電気泳動により濃度を決定する。
及び２容量のエタノールの添加によりＤＮＡを沈澱せし
める。１４，０００×ｇ、室温にて３０分間の遠心分離
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機）によりＤＮＡを沈降せし
める。上清を除去した後、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖ
ａｃ（商標）真空遠心機を用いてＤＮＡペレットを乾燥
する。最後にＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、参照と
して同時泳動するλＤＮＡの既知量を用いてアガロース
電気泳動により濃度を決定する。
【００７６】例１．２．〔ＤＮＡ断片の３２Ｐ−標識〕 例１．１．に記載したようにしてプラスミドｐＰＹＫ１
から単離された１００ｎｇの１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断
片を、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，１０９−１１２
頁に本質的に記載されているようにしてニックトランス
レーションにより標識する。５μｌのα−３２Ｐ−ｄＡ
ＴＰ（１０μｌ Ｃｉ／μｌ，３０００Ｃｉ／ｍＭｏ
ｌ），１μｌ（５０／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼＩ、
１００ｐｇのＤＮａｓｅＩ，１００ｎｇのｐＰＹＫ１の
１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片、及び無菌水を４０μｌの
反応緩衝液（２５μＭ ｄＧＴＰ，２５μＭ ｄＣＴ
Ｐ，２５μＭ ｄＴＴＰ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に加えて最終容量
５０μｌにする。この反応混合物を１６℃にて２時間イ
ンキュベートする。
から単離された１００ｎｇの１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断
片を、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，１０９−１１２
頁に本質的に記載されているようにしてニックトランス
レーションにより標識する。５μｌのα−３２Ｐ−ｄＡ
ＴＰ（１０μｌ Ｃｉ／μｌ，３０００Ｃｉ／ｍＭｏ
ｌ），１μｌ（５０／μｌ）のＤＮＡポリメラーゼＩ、
１００ｐｇのＤＮａｓｅＩ，１００ｎｇのｐＰＹＫ１の
１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片、及び無菌水を４０μｌの
反応緩衝液（２５μＭ ｄＧＴＰ，２５μＭ ｄＣＴ
Ｐ，２５μＭ ｄＴＴＰ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に加えて最終容量
５０μｌにする。この反応混合物を１６℃にて２時間イ
ンキュベートする。
【００７７】５μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）の添加により反応を停止する。取込まれなかったた
α−３２Ｐ−ｄＡＴＰを混合物から除去するため、容量
をＴＥにより１００μｌに増量し、そしてＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上での分画
によりα−３２Ｐ−ｄＡＴＰを除去する。放射能標識さ
れた１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を含有する画分を集め
そしてプールする。標識されたＤＮＡを１００℃にて３
分間のインキュベーションにより変性し、そして例１．
４．に記載するハイブリダイゼーション溶液に添加する
前に氷上で迅速に冷却して単鎖を維持する。
０）の添加により反応を停止する。取込まれなかったた
α−３２Ｐ−ｄＡＴＰを混合物から除去するため、容量
をＴＥにより１００μｌに増量し、そしてＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上での分画
によりα−３２Ｐ−ｄＡＴＰを除去する。放射能標識さ
れた１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を含有する画分を集め
そしてプールする。標識されたＤＮＡを１００℃にて３
分間のインキュベーションにより変性し、そして例１．
４．に記載するハイブリダイゼーション溶液に添加する
前に氷上で迅速に冷却して単鎖を維持する。
【００７８】 例１．３．〔Ａ．ニガーからの高分子量ＤＮＡの単離〕 植物ＲＮＡの単離（Ｓｌａｔｅｒ，１９８５）のために
用いられた方法をわずかに変更してＡ．ニガーＤＮＡを
単離する。液体最少培地で一夜増殖した菌糸を収得し、
冷塩溶液で洗浄し、液体窒素中で凍結し、そし−８０℃
にて貯蔵する。０．５ｇの凍結した菌糸をマイクロディ
スメンブラーター（ｍｉｃｒｏ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔ
ｏｒ）により破砕することにより核酸を単離する。得ら
れた菌糸粉末を新たに調製した抽出緩衝液により抽出す
る。抽出緩衝液は次の様にして調製する。
用いられた方法をわずかに変更してＡ．ニガーＤＮＡを
単離する。液体最少培地で一夜増殖した菌糸を収得し、
冷塩溶液で洗浄し、液体窒素中で凍結し、そし−８０℃
にて貯蔵する。０．５ｇの凍結した菌糸をマイクロディ
スメンブラーター（ｍｉｃｒｏ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔ
ｏｒ）により破砕することにより核酸を単離する。得ら
れた菌糸粉末を新たに調製した抽出緩衝液により抽出す
る。抽出緩衝液は次の様にして調製する。
【００７９】１ｍｌのトリ−イソプロピルナフタレンス
ルホン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのｐ−
アミノサリチル酸（ＰＡＳ）（１２０ｍｇ／ｍｌ）とよ
く混合し、そして０．５ｍｌの５×ＲＮＢ緩衝液（５×
ＲＮＢは１リットル中に１２１．１０ｇのＴｒｉｓ、７
３．０４ｇのＮａＣｌ及び９５．１０ｇのＥＧＴＡを含
有する、ｐＨ８．５）を加える。１．５ｍｌのフェノー
ルの添加の後、抽出緩衝液を５５℃にて１０分間平衡化
する。次に、温緩衝液を菌糸粉末に加え、そして懸濁液
を１分間十分に混合する。１ｍｌのクロロホルムを添加
した後、緩衝液を１分間再混合する。１０４×ｇにて１
０分間遠心分離した後、水相を等容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）により抽出し、次にクロロホルム
により２回抽出する。
ルホン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのｐ−
アミノサリチル酸（ＰＡＳ）（１２０ｍｇ／ｍｌ）とよ
く混合し、そして０．５ｍｌの５×ＲＮＢ緩衝液（５×
ＲＮＢは１リットル中に１２１．１０ｇのＴｒｉｓ、７
３．０４ｇのＮａＣｌ及び９５．１０ｇのＥＧＴＡを含
有する、ｐＨ８．５）を加える。１．５ｍｌのフェノー
ルの添加の後、抽出緩衝液を５５℃にて１０分間平衡化
する。次に、温緩衝液を菌糸粉末に加え、そして懸濁液
を１分間十分に混合する。１ｍｌのクロロホルムを添加
した後、緩衝液を１分間再混合する。１０４×ｇにて１
０分間遠心分離した後、水相を等容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）により抽出し、次にクロロホルム
により２回抽出する。
【００８０】次の方法を用いて水相からＤＮＡを単離す
る。ＤＮＡを水相から２容量のエタノールを用いて室温
にてすぐに沈澱せしめ、次に１０４×ｇにて１０分間の
遠心分離により集め、そして無菌蒸留水にＤＮＡを溶解
しそしてそれをエタノールにより再度沈澱せしめ、これ
を２回行うことにより洗浄する。最後に、ＤＮＡをＴＥ
緩衝液中に再溶解する。ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）
を添加することによりＲＮＡを除去する。
る。ＤＮＡを水相から２容量のエタノールを用いて室温
にてすぐに沈澱せしめ、次に１０４×ｇにて１０分間の
遠心分離により集め、そして無菌蒸留水にＤＮＡを溶解
しそしてそれをエタノールにより再度沈澱せしめ、これ
を２回行うことにより洗浄する。最後に、ＤＮＡをＴＥ
緩衝液中に再溶解する。ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）
を添加することによりＲＮＡを除去する。
【００８１】例１．４．〔ヘテロロガス（ｈｅｔｅｒｏ
ｌｏｇｏｕｓ）ハイブリダイゼーション条件の決定〕 例１．３．に記載したようにしてＡ．ニガーから単離し
た高分子量ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消
化する。生ずる断片をアガロースゲル電気泳動により分
離し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載さ
れているようにしてニトロセルロースに移す。Ｇｒｏａ
ｆｆら（１９８８）によりすでに記載されているように
してヘテロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ハイブ
リダイゼーション条件を決定し、そしてハイブリダイゼ
ーション実験を行う。プローブとして酵母遺伝子の１．
８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片によりライブラリーをスクリー
ニングするため及びサザンブロットをハイブリダイズす
るためのハイブリダイゼーション条件は次の通りであ
る。
ｌｏｇｏｕｓ）ハイブリダイゼーション条件の決定〕 例１．３．に記載したようにしてＡ．ニガーから単離し
た高分子量ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消
化する。生ずる断片をアガロースゲル電気泳動により分
離し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載さ
れているようにしてニトロセルロースに移す。Ｇｒｏａ
ｆｆら（１９８８）によりすでに記載されているように
してヘテロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ハイブ
リダイゼーション条件を決定し、そしてハイブリダイゼ
ーション実験を行う。プローブとして酵母遺伝子の１．
８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片によりライブラリーをスクリー
ニングするため及びサザンブロットをハイブリダイズす
るためのハイブリダイゼーション条件は次の通りであ
る。
【００８２】６×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ，０．０５
％ピロリン酸ナトリウム及び２０μｇ／ｍｌ変性ニシン
精子ＤＮＡ中で５６℃にて３〜５時間プレハイブリダイ
ゼーションを行い、次に６×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤ
Ｓ，０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び２０μｇ／ｍ
ｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中で５６℃にて１５〜１８時間
ハイブリダイゼーションを行い、そして５×ＳＳＣ，
０．１％ ＳＤＳ中で５６℃にて２回、及び２×ＳＳＣ
中５６℃にて２回、洗浄を行う。コニカＸ線フィルム及
びコダックＸ−Ｏｍａｔｉｃカセットを用い、通常の強
化スクリーンを用いて、フィルターを−７０℃にて一夜
オートラジオグラフ処理する。
％ピロリン酸ナトリウム及び２０μｇ／ｍｌ変性ニシン
精子ＤＮＡ中で５６℃にて３〜５時間プレハイブリダイ
ゼーションを行い、次に６×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤ
Ｓ，０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び２０μｇ／ｍ
ｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中で５６℃にて１５〜１８時間
ハイブリダイゼーションを行い、そして５×ＳＳＣ，
０．１％ ＳＤＳ中で５６℃にて２回、及び２×ＳＳＣ
中５６℃にて２回、洗浄を行う。コニカＸ線フィルム及
びコダックＸ−Ｏｍａｔｉｃカセットを用い、通常の強
化スクリーンを用いて、フィルターを−７０℃にて一夜
オートラジオグラフ処理する。
【００８３】例１．５．〔放射性１．８ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片による遺伝子ライブラリーのスクリーニング〕 Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子を、ヘテロロガスハイブリダイ
ゼーションにより、プローブとしてｐＰＹＫ１の１．８
ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を用いて単離する。ＥＰ−Ａ−０
２７８３５５に記載されている方法により調製したＡ．
ニガーＮ４００のゲノムライブラリーを、ｐＰＹＫ１の
１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を用いて、例１．４．に記
載した方法によるハイブリダイゼーションにより単離す
る。スクリーニングは陽性クローンの単離をもたらす。
最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与えるクロ
ーンからプラスミドＤＮＡをミニ−プレップ−単離法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，３６８−３９６頁）
により単離する。クローンが完全なＡ．ニガー遺伝子を
含有するか否かをチェックするためサザン分析及び制限
分析を用いる。
Ｉ断片による遺伝子ライブラリーのスクリーニング〕 Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子を、ヘテロロガスハイブリダイ
ゼーションにより、プローブとしてｐＰＹＫ１の１．８
ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を用いて単離する。ＥＰ−Ａ−０
２７８３５５に記載されている方法により調製したＡ．
ニガーＮ４００のゲノムライブラリーを、ｐＰＹＫ１の
１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を用いて、例１．４．に記
載した方法によるハイブリダイゼーションにより単離す
る。スクリーニングは陽性クローンの単離をもたらす。
最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与えるクロ
ーンからプラスミドＤＮＡをミニ−プレップ−単離法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，３６８−３９６頁）
により単離する。クローンが完全なＡ．ニガー遺伝子を
含有するか否かをチェックするためサザン分析及び制限
分析を用いる。
【００８４】このクローンの５ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片及び大腸菌ベクターｐＢＲ３２２の
４．０ｋｂｐ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクター断
片を、例１．１．に記載したＬＭＰアガロース法に従っ
て単離する。５ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片をｐＢＲ３２２の４．０ｋｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩベクター断片に連結して次のようにしてプラス
ミドｐＧＷ１１００を得る。１００ｎｇのｐＢＲ３２２
断片を２５０ｎｇの前記５ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片と混合し、そしてこの混合物に４μｌの連
結緩衝液〔組成：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．６），５０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＤＴＴ，
５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭスペルミジン、５０μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ〕及び１μｌ（１．２Ｕ／μｌ）のＤＮＡリガー
ゼ（ＢＲＬ）を加えて最終容量２０μｌとする。１４℃
にて１６時間のインキュベート後、混合物を無菌水によ
り１００μｌに希釈する。
ｉｎｄＩＩＩ断片及び大腸菌ベクターｐＢＲ３２２の
４．０ｋｂｐ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクター断
片を、例１．１．に記載したＬＭＰアガロース法に従っ
て単離する。５ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片をｐＢＲ３２２の４．０ｋｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩベクター断片に連結して次のようにしてプラス
ミドｐＧＷ１１００を得る。１００ｎｇのｐＢＲ３２２
断片を２５０ｎｇの前記５ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片と混合し、そしてこの混合物に４μｌの連
結緩衝液〔組成：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．６），５０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＤＴＴ，
５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭスペルミジン、５０μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ〕及び１μｌ（１．２Ｕ／μｌ）のＤＮＡリガー
ゼ（ＢＲＬ）を加えて最終容量２０μｌとする。１４℃
にて１６時間のインキュベート後、混合物を無菌水によ
り１００μｌに希釈する。
【００８５】１０μｌの希釈された混合物を用いてコン
ピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＪＭ１０１細胞
を形質転換する。この大腸菌は、Ｍ１３クローニング／
配列決定系に関してＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍａｎｕａｌ
に記載されているＣＭ１，ＣＭ２法に従って調製する。
ｐＧＷ１１００を大規模に単離し（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２，ｐ．８６）、ＣｓＣｌ密度勾配遠心によ
り精製し、フェノールで抽出し、そしてエタノールで沈
澱せしめて、ＴＥ緩衝液中に溶解する。プラスミドｐＧ
Ｗ１１００を制限分析によりさらに分析し、そしてプロ
ーブとしてＳ．セレビシエー・ピルベートキナーゼ遺伝
子の５′−及び３′−を含有する各断片、１．０ｋｂｐ
ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ及び０．８８ｋｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片を用いて、例１．４．に記載した
条件でのハイブリダイゼーションによりｐｋｉ遺伝子の
方向を決定する。
ピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＪＭ１０１細胞
を形質転換する。この大腸菌は、Ｍ１３クローニング／
配列決定系に関してＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍａｎｕａｌ
に記載されているＣＭ１，ＣＭ２法に従って調製する。
ｐＧＷ１１００を大規模に単離し（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２，ｐ．８６）、ＣｓＣｌ密度勾配遠心によ
り精製し、フェノールで抽出し、そしてエタノールで沈
澱せしめて、ＴＥ緩衝液中に溶解する。プラスミドｐＧ
Ｗ１１００を制限分析によりさらに分析し、そしてプロ
ーブとしてＳ．セレビシエー・ピルベートキナーゼ遺伝
子の５′−及び３′−を含有する各断片、１．０ｋｂｐ
ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ及び０．８８ｋｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片を用いて、例１．４．に記載した
条件でのハイブリダイゼーションによりｐｋｉ遺伝子の
方向を決定する。
【００８６】例１．６．〔Ａ．ニガー・ピルベートキナ
ーゼ遺伝子の配列決定〕 プロモーター領域、構造遺伝子及びターミネーション領
域を含むＡ．ニガーｐｋｉ遺伝子の配列を、ｐＧＷ１１
００からの断片のＭ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９でのサブク
ローニングにより決定する。ヌクレオチド配列分析のた
め、適当な制限断片を例１．１．に記載したようにして
単離し、そして例１．５．に記載したようにして線状化
されたバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／１９ ＲＦ
ＤＮＡベクター（Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３；Ｎｏｒ
ｒａｎｄｅｒら、１９８３）と連結する。ヌクレオチド
配列を、Ｍ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎ
ｕａｌ（ＢＲＬ），５０−７３頁に記載されているジデ
オキシヌクレオチド・チェイン−ターミネーション法
（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）を用いて決定する。決定
された配列を配列表の配列番号１に示す。
ーゼ遺伝子の配列決定〕 プロモーター領域、構造遺伝子及びターミネーション領
域を含むＡ．ニガーｐｋｉ遺伝子の配列を、ｐＧＷ１１
００からの断片のＭ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９でのサブク
ローニングにより決定する。ヌクレオチド配列分析のた
め、適当な制限断片を例１．１．に記載したようにして
単離し、そして例１．５．に記載したようにして線状化
されたバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／１９ ＲＦ
ＤＮＡベクター（Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３；Ｎｏｒ
ｒａｎｄｅｒら、１９８３）と連結する。ヌクレオチド
配列を、Ｍ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎ
ｕａｌ（ＢＲＬ），５０−７３頁に記載されているジデ
オキシヌクレオチド・チェイン−ターミネーション法
（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）を用いて決定する。決定
された配列を配列表の配列番号１に示す。
【００８７】例２．〔発現ベクターの作製〕 例２．１．〔ピルベートキナーゼ遺伝子の翻訳開始コド
ンにおける新たな制限部位の導入〕 例２．１．１．〔ウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ
（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）鋳型ＤＮＡの調製〕 例１．６．において得られたバクテリオファージＭ１３
ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）拡大するた
め、大腸菌ＪＭ１０１の培養物５ｍｌを２ｘＹＴ栄養培
地にＯ．Ｄ．（１ｃｍ，６００ｎｍ）＝０．１（単一プ
ラーク）に接種する。３７℃にて一夜増殖の後、細菌を
遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）により除去
し、そしてウラシル含有単鎖ＤＮＡ鋳型の調製における
ファージストックとして上清を用いる。
ンにおける新たな制限部位の導入〕 例２．１．１．〔ウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ
（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）鋳型ＤＮＡの調製〕 例１．６．において得られたバクテリオファージＭ１３
ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）拡大するた
め、大腸菌ＪＭ１０１の培養物５ｍｌを２ｘＹＴ栄養培
地にＯ．Ｄ．（１ｃｍ，６００ｎｍ）＝０．１（単一プ
ラーク）に接種する。３７℃にて一夜増殖の後、細菌を
遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）により除去
し、そしてウラシル含有単鎖ＤＮＡ鋳型の調製における
ファージストックとして上清を用いる。
【００８８】ウラシル含有鋳型をＫｕｎｋｅｌら（１９
８５）及びＮｅｒら（１９８８）に従って、次の様にし
て調製する。５ｍＭウリジンを含有する２ｘ ＹＴ培地
１０ｍｌに大腸菌ＲＺ１０３２を接種し、そして培養物
を３７℃にてＯ．Ｄ．（１ｃｍ，５５０ｎｍ）＝０．３
まで増殖せしめる。この培養物の内２．５ｍｌを５ｍＭ
ウリジンを含有する２ｘ ＹＴ培地１０ｍｌに希釈す
る。この培養物を、前記のようにして調製したＭ１３ｍ
ｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）含有上清１２
μｌの添加により感染させる。この感染した培養物を３
７℃にて５時間増殖せしめる。この増殖期間の後、培養
物から前記のようにして細菌を除去し、そしてファージ
含有上清を用いて、前記のようにして大腸菌ＲＺ１０３
２でのファージ増殖の第二サイクルを行う。
８５）及びＮｅｒら（１９８８）に従って、次の様にし
て調製する。５ｍＭウリジンを含有する２ｘ ＹＴ培地
１０ｍｌに大腸菌ＲＺ１０３２を接種し、そして培養物
を３７℃にてＯ．Ｄ．（１ｃｍ，５５０ｎｍ）＝０．３
まで増殖せしめる。この培養物の内２．５ｍｌを５ｍＭ
ウリジンを含有する２ｘ ＹＴ培地１０ｍｌに希釈す
る。この培養物を、前記のようにして調製したＭ１３ｍ
ｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）含有上清１２
μｌの添加により感染させる。この感染した培養物を３
７℃にて５時間増殖せしめる。この増殖期間の後、培養
物から前記のようにして細菌を除去し、そしてファージ
含有上清を用いて、前記のようにして大腸菌ＲＺ１０３
２でのファージ増殖の第二サイクルを行う。
【００８９】増殖の第三サイクルにおいて、５ｍＭウリ
ジンを含有する２ｘ ＹＴ培地４０ｍｌを大腸菌ＲＺ１
０３２の培養物１０ｍｌと混合し、そして第二増殖サイ
クルからのファージ含有上清５０μｌを加える。細菌を
３７℃にて５時間増殖せしめ、そして前記の様にして遠
心分離により上清から細菌を除去する。上清を再度遠心
した後、８ｍｌの２０％ポリエチレングリコール−６０
００／３Ｍ ＮａＣｌによりファージを沈澱せしめる。
ファージを１０，０００×ｇにて１０分間の遠心分離に
より集める。生ずるファージペレットを２．５ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁する。
ジンを含有する２ｘ ＹＴ培地４０ｍｌを大腸菌ＲＺ１
０３２の培養物１０ｍｌと混合し、そして第二増殖サイ
クルからのファージ含有上清５０μｌを加える。細菌を
３７℃にて５時間増殖せしめ、そして前記の様にして遠
心分離により上清から細菌を除去する。上清を再度遠心
した後、８ｍｌの２０％ポリエチレングリコール−６０
００／３Ｍ ＮａＣｌによりファージを沈澱せしめる。
ファージを１０，０００×ｇにて１０分間の遠心分離に
より集める。生ずるファージペレットを２．５ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁する。
【００９０】ウラシル含有ファージの比率を、大腸菌Ｊ
Ｍ１０１〔非−受容性（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖ
ｅ）〕及び大腸菌ＲＺ１０３２〔受容性（ｐｅｒｍｉｓ
ｓｉｖｅ）〕上にこのファージ溶液の種々の希釈物をプ
レートすることにより決定する。非ウラシル含有ファー
ジとウラシル含有ファージの比率が１：１０６であるこ
とが見出される。単鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨ
Ｉ−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡをファージ溶液からフェノール
−クロロホルム抽出により単離し、そして例１．１．に
記載したようにしてエタノールにより沈澱せしめ、そし
て１２５μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。
Ｍ１０１〔非−受容性（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖ
ｅ）〕及び大腸菌ＲＺ１０３２〔受容性（ｐｅｒｍｉｓ
ｓｉｖｅ）〕上にこのファージ溶液の種々の希釈物をプ
レートすることにより決定する。非ウラシル含有ファー
ジとウラシル含有ファージの比率が１：１０６であるこ
とが見出される。単鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨ
Ｉ−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡをファージ溶液からフェノール
−クロロホルム抽出により単離し、そして例１．１．に
記載したようにしてエタノールにより沈澱せしめ、そし
て１２５μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。
【００９１】例２．１．２．〔Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子
の翻訳開始部位での生体外変異誘発によるＮｓｉＩ部位
の導入〕 配列番号２のヌクレオチド配列を有する変異系オリゴヌ
クレオチド５９２６を用いて、例２．１．１．に記載し
たウラシル含有単鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡのピルベートキナーゼ遺伝子の翻
訳開始部位に、生体外変異誘発（Ｔｉ−Ｚｉ Ｓｕ及び
Ｍ．Ｒａａｆａｔ Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ，１９８８）に
よりＮｓｉＩ部位を形成する。
の翻訳開始部位での生体外変異誘発によるＮｓｉＩ部位
の導入〕 配列番号２のヌクレオチド配列を有する変異系オリゴヌ
クレオチド５９２６を用いて、例２．１．１．に記載し
たウラシル含有単鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ
−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡのピルベートキナーゼ遺伝子の翻
訳開始部位に、生体外変異誘発（Ｔｉ−Ｚｉ Ｓｕ及び
Ｍ．Ｒａａｆａｔ Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ，１９８８）に
よりＮｓｉＩ部位を形成する。
【００９２】オリゴヌクレオチド５９２６は２９ヌクレ
オチドから成り、その配列は、オリゴヌクレオチドの１
２位〜１４位を除き、ｐｋｉ遺伝子の翻訳開始部位附近
の配列と同一である。もとのｐｋｉ翻訳開始領域におい
てはＧＣＣである１２位〜１４位のヌクレオチドの配列
はオリゴヌクレオチドにおいてはＣＡＴである。従っ
て、このオリゴヌクレオチドは９位〜１４位にＮｓｉＩ
部位を有する。
オチドから成り、その配列は、オリゴヌクレオチドの１
２位〜１４位を除き、ｐｋｉ遺伝子の翻訳開始部位附近
の配列と同一である。もとのｐｋｉ翻訳開始領域におい
てはＧＣＣである１２位〜１４位のヌクレオチドの配列
はオリゴヌクレオチドにおいてはＣＡＴである。従っ
て、このオリゴヌクレオチドは９位〜１４位にＮｓｉＩ
部位を有する。
【００９３】ｐｋｉ遺伝子の生体外変異のため、５０ｐ
ｍｏｌのオリゴヌクレオチド５９２６を １００ｐｍｏ
ｌのＡＴＰにより５′末端においてリン酸化する（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，１９８２）。この反応は、３７℃にて３
０分間、１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲ
Ｌ）を用いて５０μｌのキナーゼ緩衝液中で、供給者の
指示に従って行う。２μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液
の添加により反応を停止する。例１．１．に記載したよ
うにして、混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
する。
ｍｏｌのオリゴヌクレオチド５９２６を １００ｐｍｏ
ｌのＡＴＰにより５′末端においてリン酸化する（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，１９８２）。この反応は、３７℃にて３
０分間、１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲ
Ｌ）を用いて５０μｌのキナーゼ緩衝液中で、供給者の
指示に従って行う。２μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液
の添加により反応を停止する。例１．１．に記載したよ
うにして、混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
する。
【００９４】例２．１．１．に従って調製された０．２
ｐｍｏｌのウラシル含有単鎖 Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ
（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
２５ｍＭ ＮａＣｌ中０．５ｐｍｏｌのリン酸化オリゴ
ヌクレオチド５９２６と混合して１０μｌの最終容量に
する。混合物を６５℃にて５分間インキュベートし、６
０分間にわたって徐々に室温に冷却し、そして氷上に１
５分間置く。次に、この混合物に２μｌの５００μＭ
ｄＮＴＰ，１．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ，１ｍｌのＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ（１２Ｕ／μｌ）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）及び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１．２Ｕ／
μｌ）（ＢＲＬ）を加え、そしてこの重合混合物を３７
℃にて１５分間インキュベートする。
ｐｍｏｌのウラシル含有単鎖 Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ
（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
２５ｍＭ ＮａＣｌ中０．５ｐｍｏｌのリン酸化オリゴ
ヌクレオチド５９２６と混合して１０μｌの最終容量に
する。混合物を６５℃にて５分間インキュベートし、６
０分間にわたって徐々に室温に冷却し、そして氷上に１
５分間置く。次に、この混合物に２μｌの５００μＭ
ｄＮＴＰ，１．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ，１ｍｌのＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ（１２Ｕ／μｌ）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）及び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１．２Ｕ／
μｌ）（ＢＲＬ）を加え、そしてこの重合混合物を３７
℃にて１５分間インキュベートする。
【００９５】６５℃にて５分間加熱することにより反応
を停止する。次に、重合混合物を最終容量１００μｌに
希釈し、そして希釈された混合物のアリコートを用い
て、例１．５．に記載したようにして調製したコンピテ
ント大腸菌ＪＭ１０１（非−受容性）及び大腸菌ＲＺ１
０３２（受容性）をトランスフェクトする。トランスフ
ェクトされた細胞をやはり例１．５．に記載したように
してプレートする。
を停止する。次に、重合混合物を最終容量１００μｌに
希釈し、そして希釈された混合物のアリコートを用い
て、例１．５．に記載したようにして調製したコンピテ
ント大腸菌ＪＭ１０１（非−受容性）及び大腸菌ＲＺ１
０３２（受容性）をトランスフェクトする。トランスフ
ェクトされた細胞をやはり例１．５．に記載したように
してプレートする。
【００９６】例２．１．３．〔変異したＭ１３ｍｐ１８
−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）の配列分析〕 形質転換された大腸菌ＪＭ１０１を含むプレートから１
２個のプラークを拾い、そして宿主として大腸菌ＪＭ１
０１を用いてファージを拡大し、そして例２．１．１．
に記載したようにして各ファージから単鎖ＤＮＡを単離
する。これらのファージからの単離された単鎖ＤＮＡ
を、ＢＲＬのＭ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｍａｎｕａｌに記載されている「Ｇ−
トラック」分析により分析する。目的とする変異につい
て予想されるＧパターンを有するファージ３個を、例
１．６．に記載したようにして配列分析により分析す
る。これらのファージは、ｐｋｉ遺伝子の翻訳開始部位
にＮｓｉＩ部位を有する予想通りの１０５３ｂｐ Ｂａ
ｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ断片を含有する。この変異したファ
ージをＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−
ＰｖｕＩＩ）と称する。
−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ）の配列分析〕 形質転換された大腸菌ＪＭ１０１を含むプレートから１
２個のプラークを拾い、そして宿主として大腸菌ＪＭ１
０１を用いてファージを拡大し、そして例２．１．１．
に記載したようにして各ファージから単鎖ＤＮＡを単離
する。これらのファージからの単離された単鎖ＤＮＡ
を、ＢＲＬのＭ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｍａｎｕａｌに記載されている「Ｇ−
トラック」分析により分析する。目的とする変異につい
て予想されるＧパターンを有するファージ３個を、例
１．６．に記載したようにして配列分析により分析す
る。これらのファージは、ｐｋｉ遺伝子の翻訳開始部位
にＮｓｉＩ部位を有する予想通りの１０５３ｂｐ Ｂａ
ｍＨＩ／ＰｖｕＩＩ断片を含有する。この変異したファ
ージをＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ−
ＰｖｕＩＩ）と称する。
【００９７】例２．２．〔ｐＰＫ−ＰＬＢの作製〕 ｐｋｉプロモーターを含有する７４２ｂｐ ＢａｍＨＩ
／ＮｓｉＩ断片をＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−
ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）ＲＦ ＤＮＡから単離し、他方
ペクチンリアーゼＢの構造遺伝子（ｐｅｌ Ｂ）を含有
する２．６ｋｂＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片を例１．１に
記載した方法に従ってプラスミドｐＧＷ８３０から単離
する。両断片を、ＢａｍＨＩにより消化した脱リン酸化
したｐＢＲ３２２ベクターに次の様にして連結する。１
００ｎｇのＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを２５
０ｎｇの２．６ｋｂ ｐｅｌ Ｂ ＢａｍＨＩ／Ｎｓｉ
Ｉ断片及び２５０ｎｇの７４２ｂｐ ｐｋｉ ＢａｍＨ
Ｉ／ＮｓｉＩ断片と混合する。この混合物を例１．５．
に記載したようにして連結する。希釈された連結混合物
のアリコートを用いて、例１．５．に記載したようにし
て調製したコンピテント大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転
換する。
／ＮｓｉＩ断片をＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−
ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）ＲＦ ＤＮＡから単離し、他方
ペクチンリアーゼＢの構造遺伝子（ｐｅｌ Ｂ）を含有
する２．６ｋｂＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片を例１．１に
記載した方法に従ってプラスミドｐＧＷ８３０から単離
する。両断片を、ＢａｍＨＩにより消化した脱リン酸化
したｐＢＲ３２２ベクターに次の様にして連結する。１
００ｎｇのＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを２５
０ｎｇの２．６ｋｂ ｐｅｌ Ｂ ＢａｍＨＩ／Ｎｓｉ
Ｉ断片及び２５０ｎｇの７４２ｂｐ ｐｋｉ ＢａｍＨ
Ｉ／ＮｓｉＩ断片と混合する。この混合物を例１．５．
に記載したようにして連結する。希釈された連結混合物
のアリコートを用いて、例１．５．に記載したようにし
て調製したコンピテント大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転
換する。
【００９８】形質転換混合物を、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含有するＬＣ−プレートにプレートし、そして
３７℃にて一夜インキュベートする。形質転換体をプレ
ートから拾い、そして５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
有する液体ＬＣ培地中で３７℃にて５時間増殖せしめ
る。ミニプレップ単離法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２，３６８−３６９頁）により、形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを単離する。ＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ，Ｓｍａ
Ｉ、並びにＢａｍＨＩとＮｓｉＩとの組合せにより消化
した後に予想通りの断片を示すプラスミドを含有する形
質転換体を、プライマーとしてｐｅｌ Ｂ特異的オリゴ
ヌクレオチドを用いる配列分析によりさらに分析する。
配列は、融合遺伝子ｐｋｉ−ｐｅｌ Ｂの予想される配
列に対応する。このプラスミドをｐＰＫ−ＰＬＢと命名
し、そして例１．５．に記載したようにして拡大しそし
て精製する。
シリンを含有するＬＣ−プレートにプレートし、そして
３７℃にて一夜インキュベートする。形質転換体をプレ
ートから拾い、そして５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
有する液体ＬＣ培地中で３７℃にて５時間増殖せしめ
る。ミニプレップ単離法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２，３６８−３６９頁）により、形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを単離する。ＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ，Ｓｍａ
Ｉ、並びにＢａｍＨＩとＮｓｉＩとの組合せにより消化
した後に予想通りの断片を示すプラスミドを含有する形
質転換体を、プライマーとしてｐｅｌ Ｂ特異的オリゴ
ヌクレオチドを用いる配列分析によりさらに分析する。
配列は、融合遺伝子ｐｋｉ−ｐｅｌ Ｂの予想される配
列に対応する。このプラスミドをｐＰＫ−ＰＬＢと命名
し、そして例１．５．に記載したようにして拡大しそし
て精製する。
【００９９】例３． 例３．１．〔Ａ．ニガーへのｐＰＫ−ＰＬＢの導入〕 例２．２において得られたプラスミドｐＰＫ−ＰＬＢ
を、プラスミドｐＧＷ６１３及びｐＰＫ−ＰＬＢを用い
るＡ．ニガーＮ５９３の同時形質転換によりＡ．ニガー
に導入する。ｐＧＷ６１３は選択マーカー遺伝子ｐｙｒ
Ａを含有する。Ａ．ニガーＮ５９３のプロトプラストを
菌糸から調製するため、０．５％酵母エキス、０．２％
カザミノ酸、５０ｍＭグルコース及び１０ｍＭウリジン
を補充した最少培地で３０℃にて２０時間増殖せしめ
る。Ａ．ニガーＮ５９３のプロトプラストの調製及び形
質転換法はＧｏｏｓｅｎら、１９８７により記載されて
いるようにして行う。生ずるＰＹＲ＋形質転換体を前記
補充された最少培地上で増殖せしめ、そしてｐｅｌ Ｂ
遺伝子の発現について分析する。
を、プラスミドｐＧＷ６１３及びｐＰＫ−ＰＬＢを用い
るＡ．ニガーＮ５９３の同時形質転換によりＡ．ニガー
に導入する。ｐＧＷ６１３は選択マーカー遺伝子ｐｙｒ
Ａを含有する。Ａ．ニガーＮ５９３のプロトプラストを
菌糸から調製するため、０．５％酵母エキス、０．２％
カザミノ酸、５０ｍＭグルコース及び１０ｍＭウリジン
を補充した最少培地で３０℃にて２０時間増殖せしめ
る。Ａ．ニガーＮ５９３のプロトプラストの調製及び形
質転換法はＧｏｏｓｅｎら、１９８７により記載されて
いるようにして行う。生ずるＰＹＲ＋形質転換体を前記
補充された最少培地上で増殖せしめ、そしてｐｅｌ Ｂ
遺伝子の発現について分析する。
【０１００】例３．２．〔Ａ．ニガーＮ５９３のＰＫ−
ＰＬＢ形質転換体の分析〕 例３．１．において得られたＡ．ニガー形質転換体を、
ｐｅｌ Ｂ遺伝子産物であるＰＬＢ蛋白質の生成につい
て分析する。これらを選択し、そして１リットルの中に
１０ｇの７２％エステル化ペクチン、７．５ｇのＮＨ４
ＮＯ３，０．５ｇのＫＣｌ，０．５ｇのＭｇＳＯ４，
１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇのカザミノ酸、０．
５ｇの酵母エキス及び０．５ｍｌの胞子要素のストック
溶液（ｐＨ６．０）を含有する培地で１８時間増殖せし
める。
ＰＬＢ形質転換体の分析〕 例３．１．において得られたＡ．ニガー形質転換体を、
ｐｅｌ Ｂ遺伝子産物であるＰＬＢ蛋白質の生成につい
て分析する。これらを選択し、そして１リットルの中に
１０ｇの７２％エステル化ペクチン、７．５ｇのＮＨ４
ＮＯ３，０．５ｇのＫＣｌ，０．５ｇのＭｇＳＯ４，
１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇのカザミノ酸、０．
５ｇの酵母エキス及び０．５ｍｌの胞子要素のストック
溶液（ｐＨ６．０）を含有する培地で１８時間増殖せし
める。
【０１０１】胞子要素のストック溶液はリットル当り１
０ｇのＥＤＴＡ，４．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，
１．０１ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３２ｇのＣｏ
Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．３１５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ，０．２２ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ
２Ｏ，１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び１．０ｇ
のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。増殖後、菌糸を濾過に
より除去し、そして培養濾液を１０％アクリルアミド含
有ゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析する。
０ｇのＥＤＴＡ，４．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，
１．０１ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３２ｇのＣｏ
Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．３１５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ，０．２２ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ
２Ｏ，１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び１．０ｇ
のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。増殖後、菌糸を濾過に
より除去し、そして培養濾液を１０％アクリルアミド含
有ゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析する。
【０１０２】ＰＬＢ蛋白質を、ＰＬＩＩこ対するラビッ
トからのポリクローナル抗体（Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅ
ｎ，１９７５）及びアルカリホスファターゼに接合した
ヤギ−抗−ラビット抗体（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指
示に従って用いてウエスタン−ブロッティングアッセイ
（ＬＫＢの２１１７マルチホォールＩＩセミードライブ
ロット装置についてのマニュアルに記載されている）に
より検出する。分析された形質転換体の内、約７０％が
ＰＬＢ蛋白質を生産する。さらに研究するために１つの
形質転換体を選択する。以後、この形質転換体をＡ．ニ
ガー／ＰＫ−ＰＬＢと称する。
トからのポリクローナル抗体（Ｈｏｕｄｅｎｈｏｖｅ
ｎ，１９７５）及びアルカリホスファターゼに接合した
ヤギ−抗−ラビット抗体（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指
示に従って用いてウエスタン−ブロッティングアッセイ
（ＬＫＢの２１１７マルチホォールＩＩセミードライブ
ロット装置についてのマニュアルに記載されている）に
より検出する。分析された形質転換体の内、約７０％が
ＰＬＢ蛋白質を生産する。さらに研究するために１つの
形質転換体を選択する。以後、この形質転換体をＡ．ニ
ガー／ＰＫ−ＰＬＢと称する。
【０１０３】例３．３．〔Ａ．ニガーのｐＰＫ−ＰＬＢ
形質転換体のＮｏｒｔｈａｎ分析〕 例３．２に従って選択されたＡ．ニガー形質転換体であ
るＡ．ニガー／ＰＫ−ＰＬＢをｐｅｌ Ｂ特異的ｍＲＮ
Ａの形成について分析する。形質転換体を、炭素源が２
％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースである点を除き３．２に記
載した培地で３０℃にて１６時間増殖せしめる。収得し
た後、菌糸を紙のシートの間に押しつけることにより急
速に乾燥させ、そしてすぐに液体窒素に浸漬することに
よりそれを破砕する。次に、１ｇの粉末化した菌糸を３
ｍｌの緩衝液〔４．０Ｍグアニジウムチオシアネート、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５），１％β−メルカプトエタノー
ル、２％ナトリウムラウリルサンコシネート〕中に懸濁
し、そして１分間渦流撹拌する。
形質転換体のＮｏｒｔｈａｎ分析〕 例３．２に従って選択されたＡ．ニガー形質転換体であ
るＡ．ニガー／ＰＫ−ＰＬＢをｐｅｌ Ｂ特異的ｍＲＮ
Ａの形成について分析する。形質転換体を、炭素源が２
％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースである点を除き３．２に記
載した培地で３０℃にて１６時間増殖せしめる。収得し
た後、菌糸を紙のシートの間に押しつけることにより急
速に乾燥させ、そしてすぐに液体窒素に浸漬することに
よりそれを破砕する。次に、１ｇの粉末化した菌糸を３
ｍｌの緩衝液〔４．０Ｍグアニジウムチオシアネート、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５），１％β−メルカプトエタノー
ル、２％ナトリウムラウリルサンコシネート〕中に懸濁
し、そして１分間渦流撹拌する。
【０１０４】遠心分離（１０分間、室温にて１００００
×ｇ）の後、上清を回収する。２．５ｍｌずつの上清に
１ｇのＣｓＣｌを加える。次に、サンプルをＳＷ５０ベ
ックマン超遠心分離用チューブ中の５．７Ｍ ＣｓＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）のクッション上
に置く。遠心分離を３０００ｒｐｍ，２０℃にて１６時
間、ベックマンＳＷ５０ローターを用いて行う。ＲＮＡ
ペレットを無菌蒸留水に溶解する。サンプルのＲＮＡの
量をアガロースゲル電気泳動の後およそ同じ濃度に調整
する。約２０μｇのＲＮＡの量をグリオキサール変性を
用いて泳動させる〔Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク、２００
頁〕。
×ｇ）の後、上清を回収する。２．５ｍｌずつの上清に
１ｇのＣｓＣｌを加える。次に、サンプルをＳＷ５０ベ
ックマン超遠心分離用チューブ中の５．７Ｍ ＣｓＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）のクッション上
に置く。遠心分離を３０００ｒｐｍ，２０℃にて１６時
間、ベックマンＳＷ５０ローターを用いて行う。ＲＮＡ
ペレットを無菌蒸留水に溶解する。サンプルのＲＮＡの
量をアガロースゲル電気泳動の後およそ同じ濃度に調整
する。約２０μｇのＲＮＡの量をグリオキサール変性を
用いて泳動させる〔Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク、２００
頁〕。
【０１０５】ＲＮＡをＧｅｎｅ−ｂｉｎｄ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）上に移行緩衝液として１０×ＳＳＣを用いて
ブロットし、そして８０℃にて１時間ベークする。ハイ
ブリダイゼーション１６時間、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌ
ｂｅｒｔ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８１：１９９１−１９９５（１９８５）〕により
記載されているハイブリダイゼーション緩衝液〔１％Ｂ
ＳＡ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ ＮａＰｉ（ｐＨ
７．２），７％ＳＤＳ〕中で６０℃にて、プローブとし
て放射能標識された２．８ｋｂｐＸｈｏＩ断片（ｐｅｌ
Ｂ遺伝子が存在する）を用いて行う。ブロットを３０
分間２回２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより洗浄し、そ
して次に３０分間２回０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ
により６０℃にて洗浄する。ブロットの暴露を一夜−７
０℃にて、コニカＸ−線フィルム及び強化スクリーンを
用いて行う。この分析は形質転換体において強いｐｅｌ
Ｂ特異的ｍＲＮＡシグナルを示し、そして同様に増殖し
た対照株Ａ．ニガーＮ４００においてシグナルを示さな
い。
ａｃｉａ）上に移行緩衝液として１０×ＳＳＣを用いて
ブロットし、そして８０℃にて１時間ベークする。ハイ
ブリダイゼーション１６時間、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌ
ｂｅｒｔ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８１：１９９１−１９９５（１９８５）〕により
記載されているハイブリダイゼーション緩衝液〔１％Ｂ
ＳＡ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ ＮａＰｉ（ｐＨ
７．２），７％ＳＤＳ〕中で６０℃にて、プローブとし
て放射能標識された２．８ｋｂｐＸｈｏＩ断片（ｐｅｌ
Ｂ遺伝子が存在する）を用いて行う。ブロットを３０
分間２回２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより洗浄し、そ
して次に３０分間２回０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ
により６０℃にて洗浄する。ブロットの暴露を一夜−７
０℃にて、コニカＸ−線フィルム及び強化スクリーンを
用いて行う。この分析は形質転換体において強いｐｅｌ
Ｂ特異的ｍＲＮＡシグナルを示し、そして同様に増殖し
た対照株Ａ．ニガーＮ４００においてシグナルを示さな
い。
【０１０６】例３．４．〔Ａ．ニガー／ＰＫ−ＲＬＢか
らのペクチンリアーゼＢ（ＰＬＢ）の生産、精製及び特
徴付け〕 例３．４．１．〔ペクチンリアーゼＢの生産のための培
養条件及び酵素の単離〕 Ａ．ニガー／ＰＫ−ＰＬＢの胞子を６００ｍｌの培養液
に接種して７×１０６胞子／ｍｌの密度とする。培地は
次の組成を有する：２０ｇのグルコース、７．５ｇのＮ
Ｈ４ＮＯ３，０．５ｇのＫＣｌ，０．５ｇのＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ，１５ｇのＫＨ２ＰＯ４，５ｇの酵母エキ
ス、０．５ｇのリボ核酸、０．５ｍｌの胞子要素のスト
ック溶液、水を加えて１リットル（ｐＨ６．０）。胞子
要素のストック溶液は１リットル当り１０ｇのＥＤＴ
Ａ，４．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．０１ｇのＭ
ｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２
Ｏ，０．３１５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．２２ｇ
の（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，１．４７ｇの
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び１．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ
２Ｏを含有する。
らのペクチンリアーゼＢ（ＰＬＢ）の生産、精製及び特
徴付け〕 例３．４．１．〔ペクチンリアーゼＢの生産のための培
養条件及び酵素の単離〕 Ａ．ニガー／ＰＫ−ＰＬＢの胞子を６００ｍｌの培養液
に接種して７×１０６胞子／ｍｌの密度とする。培地は
次の組成を有する：２０ｇのグルコース、７．５ｇのＮ
Ｈ４ＮＯ３，０．５ｇのＫＣｌ，０．５ｇのＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ，１５ｇのＫＨ２ＰＯ４，５ｇの酵母エキ
ス、０．５ｇのリボ核酸、０．５ｍｌの胞子要素のスト
ック溶液、水を加えて１リットル（ｐＨ６．０）。胞子
要素のストック溶液は１リットル当り１０ｇのＥＤＴ
Ａ，４．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．０１ｇのＭ
ｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．３２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２
Ｏ，０．３１５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．２２ｇ
の（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，１．４７ｇの
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び１．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ
２Ｏを含有する。
【０１０７】培養物を３０℃にて３時間、Ｎｅｗ Ｂｒ
ｕｎｓｗｉｃｋ回転シェーカー中で増殖せしめ、そして
次に４ｌの同じ培地を含有する１０ｌフラスコに移す。
培養物をフラスコの底部のスパージャーを用いて通気
し、圧縮空気を分配して培養物を撹拌する。３０℃にて
１６時間増殖を続ける。この増殖期間の後培地のｐＨは
５．８である。菌糸を濾過によって除去し、そしてＰＬ
Ｂを培養濾液から次の工程により単離する。
ｕｎｓｗｉｃｋ回転シェーカー中で増殖せしめ、そして
次に４ｌの同じ培地を含有する１０ｌフラスコに移す。
培養物をフラスコの底部のスパージャーを用いて通気
し、圧縮空気を分配して培養物を撹拌する。３０℃にて
１６時間増殖を続ける。この増殖期間の後培地のｐＨは
５．８である。菌糸を濾過によって除去し、そしてＰＬ
Ｂを培養濾液から次の工程により単離する。
【０１０８】酵素は０℃での硫酸アンモニウム沈澱（９
５％飽和）及びそれに続く遠心分離（１５分間、８５０
０×ｇ）によりほとんど定量的に回収される。沈澱した
酵素を５０ｍＭリン酸ナ卜リウム緩衝液（ｐＨ６．０）
に溶解し、同じ緩衝液に対して透析し、そして−２０℃
にて貯蔵する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、１
ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）中最終濃度０．３％
（ｗ／ｖ）のペクチンを用い、ｖａｎ Ｈｏｕｄｅｎｈ
ｏｖｅｎ，１９７５，１１頁により記載されている分光
光度法を用いてペクチンリアーゼ活性を２５℃にて測定
する。
５％飽和）及びそれに続く遠心分離（１５分間、８５０
０×ｇ）によりほとんど定量的に回収される。沈澱した
酵素を５０ｍＭリン酸ナ卜リウム緩衝液（ｐＨ６．０）
に溶解し、同じ緩衝液に対して透析し、そして−２０℃
にて貯蔵する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、１
ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）中最終濃度０．３％
（ｗ／ｖ）のペクチンを用い、ｖａｎ Ｈｏｕｄｅｎｈ
ｏｖｅｎ，１９７５，１１頁により記載されている分光
光度法を用いてペクチンリアーゼ活性を２５℃にて測定
する。
【０１０９】ＳＤＳ／ポリアクリルアミド電気泳動及び
ウエスタンブロッキングでの培養濾液の分析は、ＰＬＢ
に相当する支配的な蛋白質バンド及び沈澱しそして透析
された画分におけるほとんど純粋な酵素を示す。培養濾
液中の比ペクチンリアーゼ活性は４８Ｕ／ｍｇ蛋白質で
あり、そして沈澱されそして透析された画分において２
６１Ｕ／ｍｇ蛋白質であり、そしてＰｉｅｒｃｅ ＢＣ
Ａアッセイにより決定された蛋白質濃度はそれぞれ３８
０ｍｇ及び８２．６ｍｇであった。
ウエスタンブロッキングでの培養濾液の分析は、ＰＬＢ
に相当する支配的な蛋白質バンド及び沈澱しそして透析
された画分におけるほとんど純粋な酵素を示す。培養濾
液中の比ペクチンリアーゼ活性は４８Ｕ／ｍｇ蛋白質で
あり、そして沈澱されそして透析された画分において２
６１Ｕ／ｍｇ蛋白質であり、そしてＰｉｅｒｃｅ ＢＣ
Ａアッセイにより決定された蛋白質濃度はそれぞれ３８
０ｍｇ及び８２．６ｍｇであった。
【０１１０】例３．４．２．〔ＰＬＢ蛋白質の性質〕 例３．１．３において単離されたＰＬＢの見かけ分子量
は１０％ゲルを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により決定した場合３９．５ｋＤａである。精
製された酵素は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）中で安定であるが、より高いｐＨ、例えば５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で徐々
に不活性化する。この不活性化は可逆的であり、そして
酵素溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析す
ることにより大きく再生する。例３．１．３において調
製したＰＬＢが典型的なエンド−ペクチンリアーゼであ
ることが、高度にエステル化されたペクチン（ｄ．ｅ．
９４．６％）から生ずるオリゴマー分解生成物から結論
され得る。次の表３に示すように、この酵素は高度にエ
ステル化されたペクチンを好む。
は１０％ゲルを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により決定した場合３９．５ｋＤａである。精
製された酵素は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）中で安定であるが、より高いｐＨ、例えば５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で徐々
に不活性化する。この不活性化は可逆的であり、そして
酵素溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析す
ることにより大きく再生する。例３．１．３において調
製したＰＬＢが典型的なエンド−ペクチンリアーゼであ
ることが、高度にエステル化されたペクチン（ｄ．ｅ．
９４．６％）から生ずるオリゴマー分解生成物から結論
され得る。次の表３に示すように、この酵素は高度にエ
ステル化されたペクチンを好む。
【０１１１】異るエステル化度を有するリンゴペクチン
に対するＰＬＢ活性
に対するＰＬＢ活性
【表３】 測定条件：０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．５）中０．３％（ｗ
／ｖ）ペクチン、２５℃。
ｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．５）中０．３％（ｗ
／ｖ）ペクチン、２５℃。
【０１１２】リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中
に貯蔵された酵素を用いてのＰＬＢのミカエリス−メン
テン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）パラメータ
ーも決定された。２５℃にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ 緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５Ｍ ＮａＣｌの存
在下で種々の濃度の高エステル化ペクチン（ｄ．ｅ．９
４．６％）を用いて活性を測定した。９ｍＭ（モノマー
ベース）のＫｍ値及び５１５００のターンオーバー数が
観察された。
に貯蔵された酵素を用いてのＰＬＢのミカエリス−メン
テン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）パラメータ
ーも決定された。２５℃にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ 緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５Ｍ ＮａＣｌの存
在下で種々の濃度の高エステル化ペクチン（ｄ．ｅ．９
４．６％）を用いて活性を測定した。９ｍＭ（モノマー
ベース）のＫｍ値及び５１５００のターンオーバー数が
観察された。
【０１１３】例４．〔ｐｋｉプロモーターの制御のもと
でのヒトハイブリドインターフェロンＢＤＢＢの発現〕 例４．１．〔プラスミドｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９
前駆体の作製〕 大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＷ１８００（ＤＳＭ ５５０
５）から単離されたプラスミドｐＧＷ１８００をＥｃｏ
ＲＩにより消化し、そして下記のようにＴ４ポリメラー
ゼで処理する。このＤＮＡの再連結及び大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′の形質転換がプラスミドｐＧＷ１８００−Ｅの単離
を可能にする。このプラスミドｐＧＷ１８００−ＥはＥ
ｃｏＲＩ開裂部位が除去されている点を除きｐＧＷ１８
００と同一である。
でのヒトハイブリドインターフェロンＢＤＢＢの発現〕 例４．１．〔プラスミドｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９
前駆体の作製〕 大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＷ１８００（ＤＳＭ ５５０
５）から単離されたプラスミドｐＧＷ１８００をＥｃｏ
ＲＩにより消化し、そして下記のようにＴ４ポリメラー
ゼで処理する。このＤＮＡの再連結及び大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′の形質転換がプラスミドｐＧＷ１８００−Ｅの単離
を可能にする。このプラスミドｐＧＷ１８００−ＥはＥ
ｃｏＲＩ開裂部位が除去されている点を除きｐＧＷ１８
００と同一である。
【０１１４】プラスミドｐＧＷ１８００−ＥをＢｇｌＩ
Ｉで消化し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）及び５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下、細菌性アル
カリホスファターゼ（ＢＲＬ）により６５℃にて１時間
処理する。プロテインキナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）による消化及びフェノール抽出
によりアルカリホスファターゼを不活性化する。次に、
ＤＮＡをエタノール沈澱せしめ、乾燥し、そして水に再
溶解する。次に、接着末端を下記のようにしてＴ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりフィルインする。
Ｉで消化し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）及び５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下、細菌性アル
カリホスファターゼ（ＢＲＬ）により６５℃にて１時間
処理する。プロテインキナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）による消化及びフェノール抽出
によりアルカリホスファターゼを不活性化する。次に、
ＤＮＡをエタノール沈澱せしめ、乾燥し、そして水に再
溶解する。次に、接着末端を下記のようにしてＴ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりフィルインする。
【０１１５】プラスミドｐＪＤＢ２０７−ＩＦＮ ＡＭ
１１９（ＥＰ ２０５ ４０４）をＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＣｌａＩにより消化する。これらの線状断片の接着末端
を、０．１ｍＭずつのｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ及
びｄＴＴＰ並びに６７ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），６．７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６．７ｍＭ（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４及び５ｍＭ ＤＴＴの存在下Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）により３７℃にて３０分間フィル−インする。６
５℃に５分間加熱することにより反応を停止する。断片
を０．８％低ゲル化温度アガロース（Ｂｉｏ Ｒａｄ）
ゲル中で分離し、そしてＩＦＮ ＡＭ１１９を含有する
１ｋｂｐ断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄ （Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｌｌ）上で精
製し、そしてエタノール沈澱する（Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆
Ｃｏｈｅｎ，１９８３）。
１１９（ＥＰ ２０５ ４０４）をＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＣｌａＩにより消化する。これらの線状断片の接着末端
を、０．１ｍＭずつのｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ及
びｄＴＴＰ並びに６７ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），６．７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６．７ｍＭ（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４及び５ｍＭ ＤＴＴの存在下Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）により３７℃にて３０分間フィル−インする。６
５℃に５分間加熱することにより反応を停止する。断片
を０．８％低ゲル化温度アガロース（Ｂｉｏ Ｒａｄ）
ゲル中で分離し、そしてＩＦＮ ＡＭ１１９を含有する
１ｋｂｐ断片を切り出し、そしてＤＮＡをＥｌｕｔｉｐ
Ｄ （Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｌｌ）上で精
製し、そしてエタノール沈澱する（Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆
Ｃｏｈｅｎ，１９８３）。
【０１１６】１００μｇのＩＦＮ ＡＭ１１９断片及び
上に調製したｐＧＷ１８００−Ｅベクターを、５μｌの
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ 及
び１ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で室温にて２時間一緒に
連結する。この混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡを消化して
プラスミドｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９前駆体を担持
するものを同定することにより、アンピシリン耐性形質
転換体をスクリーニングする。
上に調製したｐＧＷ１８００−Ｅベクターを、５μｌの
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ 及
び１ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で室温にて２時間一緒に
連結する。この混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α
Ｆ′細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡを消化して
プラスミドｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９前駆体を担持
するものを同定することにより、アンピシリン耐性形質
転換体をスクリーニングする。
【０１１７】例４．２．〔ＰＣＲを用いてのｐＧＩＩｓ
ｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９の形成〕 用いたＰＣＲ法は
Ｒ．Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）により記載されて
いる。ｐＧＷ１８００をＸｂａＩ消化により線状化し、
そしてエタノールにより沈澱せしめる。水中に再懸濁し
た後、このＤＮＡの１０μｇを、オリゴヌクレオチドＡ
及びＣ（それぞれ、配列番号５及び６）を用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅にかける。この場
合、自動熱循環機で２５サイクル（それぞれ、９４℃に
て１分間、４０℃にて２分間、及び７２℃にて３分間）
を行い、次に７２℃に１０分間置く。供給者により推奨
される反応緩衝液を用い、１００μｌの容量中各反応の
ために１００ｐＭの各オリゴヌクレオチド及び０．５μ
ｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ）を用いる。これがＤＮＡ２（配列番号７）
をもたらす。
ｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９の形成〕 用いたＰＣＲ法は
Ｒ．Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）により記載されて
いる。ｐＧＷ１８００をＸｂａＩ消化により線状化し、
そしてエタノールにより沈澱せしめる。水中に再懸濁し
た後、このＤＮＡの１０μｇを、オリゴヌクレオチドＡ
及びＣ（それぞれ、配列番号５及び６）を用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅にかける。この場
合、自動熱循環機で２５サイクル（それぞれ、９４℃に
て１分間、４０℃にて２分間、及び７２℃にて３分間）
を行い、次に７２℃に１０分間置く。供給者により推奨
される反応緩衝液を用い、１００μｌの容量中各反応の
ために１００ｐＭの各オリゴヌクレオチド及び０．５μ
ｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ）を用いる。これがＤＮＡ２（配列番号７）
をもたらす。
【０１１８】同様に、ＢａｍＨＩにより線状化されそし
てオリゴヌクレオチドＤ（配列番号８）及びＦ（配列番
号９）を用いてＰＣＲにかけられたｐＪＤＢ２０７−Ｉ
ＦＮＡＭ１１９がＤＮＡ３（配列番号１０）をもたら
す。これらの反応混合物をエタノールにより沈澱せし
め、水に再溶解し、そしてアリコートをゲル上でチェッ
クして混合物中のＤＮＡ断片の濃度を決定する。上記と
同じ条件を用いて、ＤＮＡ２及びＤＮＡ３をオリゴヌク
レオチドＡ及びＦを用いるＰＣＲにかけ、ＰＧＩＩプロ
モーター断片に連結されたＰＧＩＩシグナル配列と成熟
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢのコード領域との
完全なイン−フレーム融合を含むＤＮＡ配列をもたら
す。
てオリゴヌクレオチドＤ（配列番号８）及びＦ（配列番
号９）を用いてＰＣＲにかけられたｐＪＤＢ２０７−Ｉ
ＦＮＡＭ１１９がＤＮＡ３（配列番号１０）をもたら
す。これらの反応混合物をエタノールにより沈澱せし
め、水に再溶解し、そしてアリコートをゲル上でチェッ
クして混合物中のＤＮＡ断片の濃度を決定する。上記と
同じ条件を用いて、ＤＮＡ２及びＤＮＡ３をオリゴヌク
レオチドＡ及びＦを用いるＰＣＲにかけ、ＰＧＩＩプロ
モーター断片に連結されたＰＧＩＩシグナル配列と成熟
ハイブリドインターフェロンＢＤＢＢのコード領域との
完全なイン−フレーム融合を含むＤＮＡ配列をもたら
す。
【０１１９】完全なイン−フレーム融合を含む、このＤ
ＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ切断ｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９前駆体に連
結してプラスミドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を
生成せしめる。ＰＧＩＩシグナル配列、ＢＤＢＢハイブ
リドＩＦＮ ＡＭ１１９及び酵母ｐＨ０５ターミネータ
ーを含んで成るｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９の配
列の部分を配列番号１１に示す。 例４．３．〔プラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−１の作製〕
ＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ切断ｐＧＩＩ−ＩＦＮ ＡＭ１１９前駆体に連
結してプラスミドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を
生成せしめる。ＰＧＩＩシグナル配列、ＢＤＢＢハイブ
リドＩＦＮ ＡＭ１１９及び酵母ｐＨ０５ターミネータ
ーを含んで成るｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９の配
列の部分を配列番号１１に示す。 例４．３．〔プラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−１の作製〕
【０１２０】２μｇのｐＧＷ１１００を制限エンドヌク
レアーゼＮｓｉＩによりｐｋｉ遺伝子の３′−末端にお
いて開裂せしめる。このＤＮＡを、２μｇのＤＮＡ，６
７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），６．７ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１６．７ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，５ｍ
Ｍジチオスレイトール、５０μＭずつのｄＧＴＰ，ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１ＵのＴ４ポリメ
ラーゼを含有する２０μｌの反応混合物中で、Ｔ４ポリ
メラーゼにより３７℃にて３０分間処理する。エタノー
ル沈澱の後、１００ｎｇのこのＤＮＡを配列５′−ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣを有するリン酸化されていないＥｃｏＲＩ
オリゴヌクレオチドリンカー１０ｐＭと室温にて２時
間、１００ｎｇのＤＮＡ，１０ｐＭリンカー、 ２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ
及び１Ｕのリガーゼを含有する５μｌの反応混合物中で
連結する。
レアーゼＮｓｉＩによりｐｋｉ遺伝子の３′−末端にお
いて開裂せしめる。このＤＮＡを、２μｇのＤＮＡ，６
７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），６．７ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１６．７ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，５ｍ
Ｍジチオスレイトール、５０μＭずつのｄＧＴＰ，ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１ＵのＴ４ポリメ
ラーゼを含有する２０μｌの反応混合物中で、Ｔ４ポリ
メラーゼにより３７℃にて３０分間処理する。エタノー
ル沈澱の後、１００ｎｇのこのＤＮＡを配列５′−ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣを有するリン酸化されていないＥｃｏＲＩ
オリゴヌクレオチドリンカー１０ｐＭと室温にて２時
間、１００ｎｇのＤＮＡ，１０ｐＭリンカー、 ２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ
及び１Ｕのリガーゼを含有する５μｌの反応混合物中で
連結する。
【０１２１】この混合物を大腸菌ＤＨ５αＦ′に形質転
換し、そして２ｘ ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン
上でプラスミド含有細胞について選択する。１８コロニ
ーからのＤＮＡを調製し、そして制限酵素消化によりこ
れらをスクリーニングした後、ＥｃｏＲＩリンカーを含
有しそしてＮｓｉＩ部位を欠くプラスミドｐＧＷ１１０
０−Ｅを同定する。
換し、そして２ｘ ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン
上でプラスミド含有細胞について選択する。１８コロニ
ーからのＤＮＡを調製し、そして制限酵素消化によりこ
れらをスクリーニングした後、ＥｃｏＲＩリンカーを含
有しそしてＮｓｉＩ部位を欠くプラスミドｐＧＷ１１０
０−Ｅを同定する。
【０１２２】例４．２．とに従って調製されたプラスミ
ドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９は、アスペルギル
ス・ニガーＰＧＩＩプロモーター及びシグナル配列と融
合したＩＦＮ遺伝子、及びこれに続くサッカロミセス・
セレビシエーＰＨ０５ターミネーター及びＰＧＩＩター
ミネーターを含有する。このプラスミドをＰｓｔＩによ
りＰＨ０５プロモーターの末端で切断し、そしてＴ４ポ
リメラーゼにより平滑末端化し、そして配列５′−ＧＧ
ＣＡＴＧＣＣを有するＳｐｈＩオリゴヌクレオチドリン
カーに連結し、そして正確に前記のようにして大腸菌Ｄ
Ｈ５αに形質転換してプラスミドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ
ＡＭ１１９ Ｓｐｈを形成する。５０ｎｇずつの次の
４種の精製された断片を一緒に連結する。
ドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９は、アスペルギル
ス・ニガーＰＧＩＩプロモーター及びシグナル配列と融
合したＩＦＮ遺伝子、及びこれに続くサッカロミセス・
セレビシエーＰＨ０５ターミネーター及びＰＧＩＩター
ミネーターを含有する。このプラスミドをＰｓｔＩによ
りＰＨ０５プロモーターの末端で切断し、そしてＴ４ポ
リメラーゼにより平滑末端化し、そして配列５′−ＧＧ
ＣＡＴＧＣＣを有するＳｐｈＩオリゴヌクレオチドリン
カーに連結し、そして正確に前記のようにして大腸菌Ｄ
Ｈ５αに形質転換してプラスミドｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ
ＡＭ１１９ Ｓｐｈを形成する。５０ｎｇずつの次の
４種の精製された断片を一緒に連結する。
【０１２３】・変異したＭ１３ｍｐ１８−ＰＫ（Ｂａｍ
ＨＩ−ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）ＲＦＤＮＡからの、ｐｋ
ｉプロモーター領域を含有する７４２塩基対のＢａｍＨ
Ｉ／ＮｓｉＩ断片。ＮｓｉＩで切断されたプラスミドを
ＢａｍＨＩにより切断する前にＴ４ポリメラーゼで処理
することによりＮｓｉＩ部位が除去される。 ・ｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９ ＳＲｈからの、
ＰＧＩＩプロモーターの３′末端＋ＰＧＩＩシグナル配
列＋ＩＦＮ遺伝子を含有する約１．１ｋｂｐのＢａｍＨ
Ｉ／ＳｐｈＩ断片。ＳｐｈＩによる切断の前にＢａｍＨ
Ｉ部位がＴ４ポリメラーゼによりフィル−インされた。 ・ｐＧＷ１１００−Ｅからの、ｐｋｉ遺伝子のターミネ
ーター領域を含有する４１７ｂｐのＳｐｈＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片。 ・ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断されたｐＴＺ１８Ｒ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の約２．８ｋｂの断片。大腸菌
ＤＨ５αＦ′への形質転換及びスクリーニングの後、プ
ラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−１を同定する。
ＨＩ−ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）ＲＦＤＮＡからの、ｐｋ
ｉプロモーター領域を含有する７４２塩基対のＢａｍＨ
Ｉ／ＮｓｉＩ断片。ＮｓｉＩで切断されたプラスミドを
ＢａｍＨＩにより切断する前にＴ４ポリメラーゼで処理
することによりＮｓｉＩ部位が除去される。 ・ｐＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９ ＳＲｈからの、
ＰＧＩＩプロモーターの３′末端＋ＰＧＩＩシグナル配
列＋ＩＦＮ遺伝子を含有する約１．１ｋｂｐのＢａｍＨ
Ｉ／ＳｐｈＩ断片。ＳｐｈＩによる切断の前にＢａｍＨ
Ｉ部位がＴ４ポリメラーゼによりフィル−インされた。 ・ｐＧＷ１１００−Ｅからの、ｐｋｉ遺伝子のターミネ
ーター領域を含有する４１７ｂｐのＳｐｈＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片。 ・ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断されたｐＴＺ１８Ｒ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の約２．８ｋｂの断片。大腸菌
ＤＨ５αＦ′への形質転換及びスクリーニングの後、プ
ラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−１を同定する。
【０１２４】例４．４．〔ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−１の変異
によるｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２及びｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−
２の形成〕 プラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−をｄｕｔ− ｕｎｇ−大
腸菌ＢＷ３１３に形質転換した。これにＭ１３Ｋ０７を
過剰感染（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔ）させて該プラスミ
ドから単鎖ウラシル置換ファージを得た。このファージ
ＤＮＡを調製し、そして２つの異るオリゴヌクレオチド
ＩＦＮ−１及びＩＦＮ−２を用いて前記のようにして変
異誘発した。これらのオリゴヌクレオチドの配列をそれ
ぞれ配列表の配列番号１２及び１３に示す。オリゴヌク
レオチドＩＦＮ−１による変異誘発がｐＰＫＩ−ＩＦＮ
−１をもたらし、そしてＩＦＮ−２によるそれがｐＰＫ
ＩｓｓＩＦＮ−２をもたらす。
によるｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２及びｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−
２の形成〕 プラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−をｄｕｔ− ｕｎｇ−大
腸菌ＢＷ３１３に形質転換した。これにＭ１３Ｋ０７を
過剰感染（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔ）させて該プラスミ
ドから単鎖ウラシル置換ファージを得た。このファージ
ＤＮＡを調製し、そして２つの異るオリゴヌクレオチド
ＩＦＮ−１及びＩＦＮ−２を用いて前記のようにして変
異誘発した。これらのオリゴヌクレオチドの配列をそれ
ぞれ配列表の配列番号１２及び１３に示す。オリゴヌク
レオチドＩＦＮ−１による変異誘発がｐＰＫＩ−ＩＦＮ
−１をもたらし、そしてＩＦＮ−２によるそれがｐＰＫ
ＩｓｓＩＦＮ−２をもたらす。
【０１２５】両プラスミドはイン−フレーム融合を含ん
で成る。ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２はメチオニン開始コドン
（及びＩＦＮ遺伝子の残りの部分）に融合したｐｋｉプ
ロモーターを有し、そしてｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２はＰ
ＧＩＩシグナル配列（及びこれに続くＩＦＮ遺伝子）に
融合したｐｋｉ遺伝子を有する。ｐｋｉプロモーターか
らターミネーター領域まで延びるｐＰｋＩ−ＩＦＮ−２
及びｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２の領域のヌクレオチド配列
をそれぞれ配列番号１４及び１５に示す。
で成る。ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２はメチオニン開始コドン
（及びＩＦＮ遺伝子の残りの部分）に融合したｐｋｉプ
ロモーターを有し、そしてｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２はＰ
ＧＩＩシグナル配列（及びこれに続くＩＦＮ遺伝子）に
融合したｐｋｉ遺伝子を有する。ｐｋｉプロモーターか
らターミネーター領域まで延びるｐＰｋＩ−ＩＦＮ−２
及びｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２の領域のヌクレオチド配列
をそれぞれ配列番号１４及び１５に示す。
【０１２６】例４．５．〔アスペルギルス・ニガーへの
ＰＫＩ−ＩＦＮ発現プラスミドの形質転換〕 前記のようにプラスミドｐＧＷ６１３上のＡ．ニガーｐ
ｙｒＡ遺伝子を選択マーカーとして用いてプラスミドｐ
ＰＫＩ−ＩＦＮ−２又はｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２をＡ．
ニガーＮ５９３に同時形質転換する。
ＰＫＩ−ＩＦＮ発現プラスミドの形質転換〕 前記のようにプラスミドｐＧＷ６１３上のＡ．ニガーｐ
ｙｒＡ遺伝子を選択マーカーとして用いてプラスミドｐ
ＰＫＩ−ＩＦＮ−２又はｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２をＡ．
ニガーＮ５９３に同時形質転換する。
【０１２７】例４．６．〔形質転換体の分析〕 例４．５．からの形質転換体をＩＦＮの生産について例
３．２．に記載したウエスタン分析により、但し（抗−
ＰＬＩＩ抗体ではなく）ＩＦＮに対して生じた抗体を用
いて分析する。
３．２．に記載したウエスタン分析により、但し（抗−
ＰＬＩＩ抗体ではなく）ＩＦＮに対して生じた抗体を用
いて分析する。
【０１２８】〔微生物の寄託〕大腸菌ＤＨ５α′Ｆ／ｐ
ＧＷ１１００はＮｏ．ＤＳＭ５７４７として１９９０年
１月２８日に、そしてＡ．ニガーＮ５９３はＮｏ．ＤＳ
Ｍ５７５６として１９９０年１月２６日に、ブダペスト
条約に基き、 Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗ
ｅｇ ｌｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ
に寄託された。
ＧＷ１１００はＮｏ．ＤＳＭ５７４７として１９９０年
１月２８日に、そしてＡ．ニガーＮ５９３はＮｏ．ＤＳ
Ｍ５７５６として１９９０年１月２６日に、ブダペスト
条約に基き、 Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗ
ｅｇ ｌｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ
に寄託された。
【０１２９】
【０１３０】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３６０５ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド及び対応する蛋白質 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｅ 起 源：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｎ４００ 直接実験源：大腸菌ＤＨ５αＦ′／ｐＧＷ１１００から
のプラスミドｐＧＷ１１００ 配列の特徴： １−１０４１ｂｐ ｐｋｉプロモロータ
ー ８３１−８３５ｂｐ仮定ＣＡＡＴボックス ９２８−９３３ｂｐ仮定ＴＡＴＡボックス ８４９−１０４０ｂｐ ＣＴ リッチ領域 １０４２−３０９６ｂｐピルベートキナーゼのコード領
域 １１６６−１２６６ｂｐイントロン１ １３１２−１３７０ｂｐイントロン２ １４１８−１４７２ｂｐイントロン３ １５４５−１６０６ｂｐイントロン４ １７２９−１８２８ｂｐイントロン５ ２６６３−２７１１ｂｐイントロン６ ２７９４−２８５１ｂｐイントロン７
ｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｎ４００ 直接実験源：大腸菌ＤＨ５αＦ′／ｐＧＷ１１００から
のプラスミドｐＧＷ１１００ 配列の特徴： １−１０４１ｂｐ ｐｋｉプロモロータ
ー ８３１−８３５ｂｐ仮定ＣＡＡＴボックス ９２８−９３３ｂｐ仮定ＴＡＴＡボックス ８４９−１０４０ｂｐ ＣＴ リッチ領域 １０４２−３０９６ｂｐピルベートキナーゼのコード領
域 １１６６−１２６６ｂｐイントロン１ １３１２−１３７０ｂｐイントロン２ １４１８−１４７２ｂｐイントロン３ １５４５−１６０６ｂｐイントロン４ １７２９−１８２８ｂｐイントロン５ ２６６３−２７１１ｂｐイントロン６ ２７９４−２８５１ｂｐイントロン７
【０１３１】
【０１３２】配列番号：２ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴：８−１３ ＮｓｉＩ部位 １−７Ａ．ニガーｐｋｉヌクレオチド１０５４〜１０４
８ （配列番号１）に対応 １４−２１Ａ．ニガーｐ層ヌクレオチド１０４１〜１０
３４ （配列番号１）に対応 性 質：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子の１０４２〜１０４７
のＮｓｉＩ部位の導入のための変異原オリゴヌクレオチ
ド５９２６
８ （配列番号１）に対応 １４−２１Ａ．ニガーｐ層ヌクレオチド１０４１〜１０
３４ （配列番号１）に対応 性 質：Ａ．ニガーｐｋｉ遺伝子の１０４２〜１０４７
のＮｓｉＩ部位の導入のための変異原オリゴヌクレオチ
ド５９２６
【０１３３】配列番号：３ 配列の長さ：８２１ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ 起 源：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｅｇｅｒ）Ｎ４００ 直接実験源：大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＷ１８００（ＤＳ
Ｍ ５５０５）のｐＧＷ１８００ 配列の特徴： １−２０３ｂｐ ＰＧＩＩプロモーター
領域 ２０４−２６１ｂｐ シグナルペプチド ２６２−８１８ｂｐ ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＮ−末端部分 性 質：プロモーター領域、シグナル配列及びｐｒｏ−
ＰＧＩＩのＮ−末端を含んで成るＡ．ニガーのＰＧＩＩ
遺伝子の５′末端部分
Ｍ ５５０５）のｐＧＷ１８００ 配列の特徴： １−２０３ｂｐ ＰＧＩＩプロモーター
領域 ２０４−２６１ｂｐ シグナルペプチド ２６２−８１８ｂｐ ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＮ−末端部分 性 質：プロモーター領域、シグナル配列及びｐｒｏ−
ＰＧＩＩのＮ−末端を含んで成るＡ．ニガーのＰＧＩＩ
遺伝子の５′末端部分
【０１３４】
【０１３５】配列番号：４ 配列の長さ：６５３ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ 起 源：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｅｇｅｒ）Ｎ４００ 直接実験源：大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＷ１８００（ＤＳ
Ｍ ５５０５）のｐＧＷ１８００ 配列の特徴：１−１１６ｂｐ ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＣ−
末端のコード領域 性 質：ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＣ−末端を含んで成るＰＧ
ＩＩ遺伝子の３−末端部分
Ｍ ５５０５）のｐＧＷ１８００ 配列の特徴：１−１１６ｂｐ ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＣ−
末端のコード領域 性 質：ｐｒｏ−ＰＧＩＩのＣ−末端を含んで成るＰＧ
ＩＩ遺伝子の３−末端部分
【０１３６】
【０１３７】配列番号：５ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：配列番号６のＰＧＩＩ配列のコード鎖の塩
基１〜２０と同一 性 質：ＰＣＲを用いて異種性遺伝子との正確なＰＧＩ
Ｉ融合体を構成するためのオリゴヌクレオチドＡ
基１〜２０と同一 性 質：ＰＣＲを用いて異種性遺伝子との正確なＰＧＩ
Ｉ融合体を構成するためのオリゴヌクレオチドＡ
【０１３８】配列番号：６ 配Ｙ列の長さ：３２塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：１−１２成熟ＩＦＮのアミノ酸１−４をコ
ードするＩＦＮ ＡＭ１１９遺伝子の領域に相補的 １３−３２配列表６のＰＧＩＩ配列のコード鎖の塩基位
置 ２６０〜２４１に相補的 性 質：正確なＰＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９融合
体遺伝子の作製のために有用なオリゴヌクレオチドＣ
ードするＩＦＮ ＡＭ１１９遺伝子の領域に相補的 １３−３２配列表６のＰＧＩＩ配列のコード鎖の塩基位
置 ２６０〜２４１に相補的 性 質：正確なＰＧＩＩｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９融合
体遺伝子の作製のために有用なオリゴヌクレオチドＣ
【０１３９】配列番号：７ 配列の長さ：２７２塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖、コード鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：組換体 直接実験源：ＰＣＲ 配列の特徴： １−２０３ Ａ．ニガーＰＧＩＩプロモ
ーター領域 ２０４−２５８ Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列 ２５９−２７０ ＩＦＮ ＢＤＢＢハイブリド（ＩＦＮ
ＡＭ１１９）のＮ−末端 性 質：Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列１〜４と成熟
ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）のＮ−末端
アミノ酸との完全なイン−フレーム融合体を含んで成る
ＤＮＡ ２。Ａ．ニガー宿主から分泌されるＩＦＮの生
産のための発現ベクターの作製のために有用
ーター領域 ２０４−２５８ Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列 ２５９−２７０ ＩＦＮ ＢＤＢＢハイブリド（ＩＦＮ
ＡＭ１１９）のＮ−末端 性 質：Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列１〜４と成熟
ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）のＮ−末端
アミノ酸との完全なイン−フレーム融合体を含んで成る
ＤＮＡ ２。Ａ．ニガー宿主から分泌されるＩＦＮの生
産のための発現ベクターの作製のために有用
【０１４０】
【０１４１】配列番号：８ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：１−１２ｂｐ配列番号６のＰＧＩＩ遺伝子
のコード鎖の塩基 ２４９〜２６１と同一 １３−３２ｂｐ成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイ
ブリド）のＮ−末端アミノ酸１−７のコード領域と同一 性 質：Ａ．ニガーシグナル配列及びＩＦＮ ＡＭ１１
９のコード領域の完全なインフレーム融合の作製のため
のオリゴヌクレオチドＤ
のコード鎖の塩基 ２４９〜２６１と同一 １３−３２ｂｐ成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイ
ブリド）のＮ−末端アミノ酸１−７のコード領域と同一 性 質：Ａ．ニガーシグナル配列及びＩＦＮ ＡＭ１１
９のコード領域の完全なインフレーム融合の作製のため
のオリゴヌクレオチドＤ
【０１４２】配列番号：９ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢハイブリド）
遺伝子のコード鎖３′−の非コード領域中の鎖に相補
的。ＥｃｏＲＺ部位を含む。 性 質：ＩＦＮ ＡＭ１１９の発現のための発現ベクタ
ーの作製のためのオリゴヌクレオチドＦ
遺伝子のコード鎖３′−の非コード領域中の鎖に相補
的。ＥｃｏＲＺ部位を含む。 性 質：ＩＦＮ ＡＭ１１９の発現のための発現ベクタ
ーの作製のためのオリゴヌクレオチドＦ
【０１４３】配列番号：１０ 配列の長さ：１３３塩基 配列の型：ヌクレオチド及び対応するペプチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：組換体 配列の特徴：１−１２Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナルペプ
チドのＣ−末端１３−１３３成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９
（ＢＤＢＢハイブリド） 性 質：Ａ．ニガーシグナル配列Ｃ−末端及びＩＦＮ
ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）の完全なイン−フレ
ーム融合体を含んで成るＤＮＡ３。 Ａ．ニガー宿主から分泌されるＩＦＮの生産のための発
現ベクターの作製のために有用。
チドのＣ−末端１３−１３３成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９
（ＢＤＢＢハイブリド） 性 質：Ａ．ニガーシグナル配列Ｃ−末端及びＩＦＮ
ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）の完全なイン−フレ
ーム融合体を含んで成るＤＮＡ３。 Ａ．ニガー宿主から分泌されるＩＦＮの生産のための発
現ベクターの作製のために有用。
【０１４４】
【０１４５】配列番号：１１ 配列の長さ：９９０ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：組換体 直接実験源：プラスミドＰＧＩＩｓｓＩＦＮ ＡＭ１１
９ 配列の特徴： １−１７８ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩ
プロモーター１９９−２５５ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩ
シグナル配列 ２５６−７５３ｂｐ 成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢ
Ｂハイブリド） ７５６−９８４ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター １− ６ｂｐ ＢａｍＨＩ部位 ３６４−３６９ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 ８８５−９９０ｂｐ ＰｓｔＩ部位 性 質：ＰＧＩＩプロモーター及びＰＨＯ５ターミネー
ターに連結された、ＰＧＩＩシグナル配列とインターフ
ェロンＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）との完全なイ
ン−インフレーム融合体を含む、ＰＣＲにより生成した
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位を含んで成るｐＰＧＩＩｓ
ｓＩＦＮ ＡＭ１１９のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片
９ 配列の特徴： １−１７８ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩ
プロモーター１９９−２５５ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩ
シグナル配列 ２５６−７５３ｂｐ 成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢ
Ｂハイブリド） ７５６−９８４ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター １− ６ｂｐ ＢａｍＨＩ部位 ３６４−３６９ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 ８８５−９９０ｂｐ ＰｓｔＩ部位 性 質：ＰＧＩＩプロモーター及びＰＨＯ５ターミネー
ターに連結された、ＰＧＩＩシグナル配列とインターフ
ェロンＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリド）との完全なイ
ン−インフレーム融合体を含む、ＰＣＲにより生成した
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位を含んで成るｐＰＧＩＩｓ
ｓＩＦＮ ＡＭ１１９のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片
【０１４６】
【０１４７】配列番号：１２ 配列の長さ：４５塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：１−１６ｐｋｉプロモーター領域の１０２
６〜１０４１塩基（配列番号１）と同じ １７−１９開始コドンＡＴＧ ２０−４５成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリ
ド）のアミノ酸１−９ 性 質：ＰＣＲを用いてＡ．ニガーｐｋｉプロモーター
とＩＦＮ ＡＭ１１９構造遺伝子との完全な融合体を調
製するために有用なオリゴヌクレオチドＩＦＮ−１
６〜１０４１塩基（配列番号１）と同じ １７−１９開始コドンＡＴＧ ２０−４５成熟ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢハイブリ
ド）のアミノ酸１−９ 性 質：ＰＣＲを用いてＡ．ニガーｐｋｉプロモーター
とＩＦＮ ＡＭ１１９構造遺伝子との完全な融合体を調
製するために有用なオリゴヌクレオチドＩＦＮ−１
【０１４８】配列番号：１３ 配列の長さ：４２塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：単鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 配列の特徴：１−２１ｐｋｉ遺伝子のコード鎖の塩基１
０３１〜１０４１（配列番号１、プロモーター領域）と
同じ ２２−４２ＰＧＩＩ遺伝子のコード鎖の塩基２０４〜２
２４（配列番号６、シグナル配列）と同じ 性 質：ＰＣＲを用いてのＡ．ニガーｐｋｉプロモータ
ーとＡ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列との完全な融合体
の調製のために有用なオリゴヌクレオチドＩＦＮ−２
０３１〜１０４１（配列番号１、プロモーター領域）と
同じ ２２−４２ＰＧＩＩ遺伝子のコード鎖の塩基２０４〜２
２４（配列番号６、シグナル配列）と同じ 性 質：ＰＣＲを用いてのＡ．ニガーｐｋｉプロモータ
ーとＡ．ニガーＰＧＩＩシグナル配列との完全な融合体
の調製のために有用なオリゴヌクレオチドＩＦＮ−２
【０１４９】配列番号：１４ 配列の長さ：１９０１ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：組換体 直接実験源：プラスミドｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２ 配列の特徴： １− ６ｂｐ ＢａｍＨＩ部位 １− ７４２ｂｐ 配列番号１の３００位から１０４１
位に延びるｐｋｉプロモーター断片と同じ ７４２− ７４４ｂｐ 開始コドンＡＴＧ ７４５−１２４３ｂｐ ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢ
ハイブリド）の構造遺伝子 １２４４−１２４５ｂｐ 終止ＴＧＡ １２４７−１４７６ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター
断片 １４７７−１８４２ｂｐ ＳｐＨＩ部位 １４８３−１８９４ｂｐ Ａ．ニガーｐｋｉターミネー
ター １８９６−１９０１ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 性 質：ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片。開始コドン、ＩＦＮ ＡＭ１１９構造遺伝子及
び酵母ＰＨＯ５ターミネーター領域の部分を含んで成る
ＤＮＡ配列に融合したＡ．ニガーｐｋｉプロモーター断
片並びにＡ．ニガーｐｋｉ ターミネーターを含む。
位に延びるｐｋｉプロモーター断片と同じ ７４２− ７４４ｂｐ 開始コドンＡＴＧ ７４５−１２４３ｂｐ ＩＦＮ ＡＭ１１９（ＢＤＢＢ
ハイブリド）の構造遺伝子 １２４４−１２４５ｂｐ 終止ＴＧＡ １２４７−１４７６ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター
断片 １４７７−１８４２ｂｐ ＳｐＨＩ部位 １４８３−１８９４ｂｐ Ａ．ニガーｐｋｉターミネー
ター １８９６−１９０１ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 性 質：ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片。開始コドン、ＩＦＮ ＡＭ１１９構造遺伝子及
び酵母ＰＨＯ５ターミネーター領域の部分を含んで成る
ＤＮＡ配列に融合したＡ．ニガーｐｋｉプロモーター断
片並びにＡ．ニガーｐｋｉ ターミネーターを含む。
【０１５０】
【０１５１】配列番号：１５ 配列の長さ：２０２０ｂｐ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：組換体 直接実験源：プラスミドｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２ 配列の特徴： １− ６ｂｐ ＢａｍＨＩ部位 １− ７４２ｂｐ 配列番号１の配列の３００位から１
０４１位に延びるｐｋｉプロモーター断片と同じ ７４３− ７９９ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配
列 ８００−１２９７ｂｐ 成熟ＩＦＭ ＡＭ１１９（ＢＤ
ＢＢハイブリド）構造遺伝子 １２９８−１３００ｂｐ 終止コドンＴＧＡ １３０１−１５２８ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター
断片 １５１９−１５３４ｂｐ ＳｐｈＩ部位 １５３５−１９４８ｂｐ Ａ．ニガーｐｋｉ ターミネ
ーター １９５０−１９５５ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 性 質：ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２のＢａｍＨＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ断片。ＰＧＩシグナル配列とＩＦＭ ＡＭ１１９
（ＢＤＢＢハイブリド）構造遺伝子との完全なイン−フ
レーム融合体及び酵母ＰＨＯ５ターミネーター領域の部
分と融合したＡ．ニガーｐｋｉ プロモーター断片並び
にＡ．ニガーｐｋｉターミネーターを含んで成る。
０４１位に延びるｐｋｉプロモーター断片と同じ ７４３− ７９９ｂｐ Ａ．ニガーＰＧＩＩシグナル配
列 ８００−１２９７ｂｐ 成熟ＩＦＭ ＡＭ１１９（ＢＤ
ＢＢハイブリド）構造遺伝子 １２９８−１３００ｂｐ 終止コドンＴＧＡ １３０１−１５２８ｂｐ 酵母ＰＨＯ５ターミネーター
断片 １５１９−１５３４ｂｐ ＳｐｈＩ部位 １５３５−１９４８ｂｐ Ａ．ニガーｐｋｉ ターミネ
ーター １９５０−１９５５ｂｐ ＥｃｏＲＩ部位 性 質：ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２のＢａｍＨＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ断片。ＰＧＩシグナル配列とＩＦＭ ＡＭ１１９
（ＢＤＢＢハイブリド）構造遺伝子との完全なイン−フ
レーム融合体及び酵母ＰＨＯ５ターミネーター領域の部
分と融合したＡ．ニガーｐｋｉ プロモーター断片並び
にＡ．ニガーｐｋｉターミネーターを含んで成る。
【０１５２】
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヘンリエッテ カタリナ ファン デン ブロエック オランダ国，６／02 セーアー ワヘニン ヘン，トルベッケストラート 246 (72)発明者 ヤコブ フィッセル オランダ国，6703 セーカー ワヘニンヘ ン，ヒンケロールトセウェグ ４ (72)発明者 フランク ブクストン スイス国，4132 ミュッテンツ，ホルダー シュテュデリベク 32
Claims (24)
- 【請求項１】 配列番号１のＤＮＡ配列中に含まれるア
スペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ピルベートキ
ナーゼ転写（ｐｋｉ）プロモーター、又はプロモーター
活性を有するその誘導体もしくは断片。 - 【請求項２】 配列番号１のＤＮＡ配列のおよそ３００
位のヌクレオチドからおよそ１０４２位のヌクレオチド
まで延びる、請求項１に記載の断片。 - 【請求項３】 配列番号１のヌクレオチド配列に含まれ
るＤＮＡ分子の又はプロモーター活性を維持しているそ
の断片の変異体、組換誘導体、又は変異体の組換誘導体
であることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。 - 【請求項４】 構造遺伝子を挿入するために使用し得る
新規な制限酵素開裂部位を前記ｐｋｉプロモーターの下
流に有する変異体（前記構造遺伝子はｐｋｉプロモータ
ーに作用可能に連結される）である、請求項３に記載の
誘導体。 - 【請求項５】 Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｎ
ｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）ＲＦ ＤＮＡ中に含まれる７４２
ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩ断片である、請求項３に記
載の誘導体。 - 【請求項６】 ｐｋｉプロモーター活性を有するＤＮＡ
分子の３′及び／又は５′末端に付加されたオリゴヌク
レオチドリンカーを含有する、請求項３に記載の組換誘
導体。 - 【請求項７】 プロモーター活性を有し、そしてイント
ロンを含むか又は含まない同種性ｐｋｉ構造遺伝子以外
の同種性又は異種性構造遺伝子を有し、該構造遺伝子が
ｐｋｉプロモーターと作用可能に連結されており、場合
によってはさらにオリゴヌクレオチドリンカー及び／又
はｐｋｉプロモーター以外の発現制御配列であって該構
造遺伝子に作用可能に連結されているものを有する、請
求項３に記載の組換誘導体。 - 【請求項８】 挿入部として請求項１のｐｋｉプロモー
ター又はプロモーター活性を有するその断片もしくは誘
導体を含んで成ることを特徴とする、ｐＧＷ１１００で
はないハイブリドベクター。 - 【請求項９】 Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｎ
ｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）である請求項８に記載のハイブリ
ド。 - 【請求項１０】 Ａ．ニガーのピルベートキナーゼ構造
遺伝子以外の同種性又は異種性構造遺伝子であって請求
項１のｐｋｉプロモーター又はプロモーター活性を有す
るその断片もしくは誘導体と作用可能に連結されたもの
を含んで成る、請求項８に記載のハイブリドベクター。 - 【請求項１１】 ｐＫＫＩ−ＩＦＮ−２である、請求項
１０に記載のハイブリドベクター。 - 【請求項１２】 ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２である、請求
項１０に記載のハイブリドベクター。 - 【請求項１３】 ｐＰＫ−ＰＬＢである請求項１０に記
載のハイブリドベクター。 - 【請求項１４】 Ｍ１３ｍｐ−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−Ｐｖ
ｕＩＩ）である、請求項１０に記載のハイブリドベクタ
ー。 - 【請求項１５】 Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＫ（ＢａｍＨＩ−
ＮｓｉＩ−ＰｖｕＩＩ）である、請求項１０に記載のハ
イブリドベクター。 - 【請求項１６】 請求項８に記載のベクターにより形質
転換された宿主。 - 【請求項１７】 ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２，ｐＰＫＩｓｓ
ＩＦＮ−２又は ｐＰＫ−ＰＬＢにより形質転換された
大腸菌ＪＭ１０１；ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２，ｐＰＫＩｓ
ｓＩＦＮ−２又はｐＰＫ−ＰＬＢにより形質転換された
大腸菌ＤＨ５α；ｐＰＫ−ＰＬＢ，ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−
２又は ｐＰＫＩｓｓＩＦＮ−２により及び場合によっ
てはさらに選択マーカープラスミドｐＧＷ６１３又はｐ
ＣＧ５９Ｄ７により形質転換されたアスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ａｎ８；並
びにｐＰＫ−ＰＬＢ，ｐＰＫＩ−ＩＦＮ−２又は ｐＰ
ＫＩｓｓＩＦＮ−２により及び場合によってはさらに選
択マーカープラスミドｐＧＷ６１３又はｐＣＧ５９Ｄ７
により形質転換されたアスペルギルス・ニガーＮ５９３
から成る形質転換された宿主群から選択された、請求項
１６に記載の形質転換された宿主。 - 【請求項１８】 請求項１に記載のＤＮＡ分子の製造方
法であって、該ＤＮＡ分子を生体外合成により調製する
か、又は該ＤＮＡ配列を含有する宿主を培養することを
含んで成る方法。 - 【請求項１９】 請求項８に記載のハイブリドベクター
の製造方法であって、遺伝子工学の分野において有用な
ベクターを本発明のＤＮＡ分子と連結し、この連結混合
物により適当な宿主細胞を形質転換しそして形質転換体
を同定及び／又は選択する、ことを含んで成る方法。 - 【請求項２０】 請求項１に記載のＤＮＡ分子を含有す
る形質転換された宿主の製造方法であって、場合によっ
ては選択マーカー遺伝子と共に本発明のＤＮＡ分子又は
ハイブリドベクターにより形質転換条件下で宿主を処理
することを特徴とする方法。 - 【請求項２１】 ポリペプチドの製造方法であって、該
ポリペプチドをコードする構造遺伝子をｐｋｉプロモー
ター又はプロモーター活性を有するその断片もしくは変
異体と作用可能に連結し、そして宿主な宿主中で発現せ
しめる、ことを特徴とする方法。 - 【請求項２２】 ヒドハイブリドインターフェロンＢＤ
ＢＢを製造する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 Ａ．ニガーのペクチンリアーゼを製造
する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 Ａ．ニガーのポリガラクチュロナーゼ
を製造する、請求項２１に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| EP90810068 | 1990-01-29 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JP2008532533A (ja) * | 2005-03-16 | 2008-08-21 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 糸状菌におけるデフェンシンの組換え発現 |
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