PT91190A - Processo para a producao de novas proteinas - Google Patents

Description

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NQVftS PROTEImS C presente invento e»iã relacionado com novas proteínas, métodos para m sua produção* composições farmacêuticas contende tale proteínas e sua utilização na inibição da enzimas® A hirudina* o principio anticoagu1ante natural presente na sanguessuga Hirudo medicinal is. é um polipeptídeo de 65 aminoaoldos com tris fontes dlsiulforsio* Conhecida durante muito· tempo* desde as primeiras investi*· gações sobre a saliva de eânguessuga em 1884 m do trabalho pioneiro de markwardt ( iaturuisaenchaften 42* 537 fi38§|| Flsthods Enzymole 19* 924 f 1,970) )*. só recentemente foi elucidada a estrutura da hirudina por Dodt et al** ÍESS Lette lii» 180 (1984) » Qs resultados mais recentes são que a hlsutíini exista em virias variantes* descritas como Variante 1 da hirudina fHlll)* variante 2 da hirudina (HV2), hirudina PA a outros análogos» # A hirudina e o inibidor mais forte da tromfcina conhecido* ao mesmo tampo que outras enzimas da cascada de coagulação nao são afestadas* AO contrario da heparina que I o anticoagulacte preferido na terapia antl-©õagulação convencional, a hirudina exerce a sua acção di-rectamente sobre a trombina e, ao contrario da primeira, :jf0: £ ni® açtua através da antitrombina III* A interacçao entra a hitudina e a trombina ocorre com uma potência extremamen-te iisicda* Esta potência è várias ordene da grandeza supe- *r Sr

Φ rior a ligação da irombina ao fibrinogenio, a plaqustffiS ii â anti-trombina III· Portanto, mesmo concentrações baixas de hirudina são capazes de ultrapassar todas as intsraSfiHSS da trombina e 'as suas consequências biológicas· Ainda, a hirudina tem uma toxicidade baixa, não ó antigãnílâ O S qua-se totalmente eliminada pelos rins numa forma feiôlbgâosmen-to activa. 4

Recentemente, cONAs e gsnss sintéticos codificadores da hirudina ou de variantes da hirudina fors» clõnados e expressos em hospedeiros microbianos tais como Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae (cf· Pedidos de Patente Europeia N® 158564 a 188342 )· Apesar dos produtos de expressão não possuírem o grupo monoéste® de sulfato fí3 na Tir - e terem por isso aitío designados ® dessulfate -- hirudinas í? - apresentam aproximadamente a mesma activâ-dade biológica da hirudina natural na qual o resíduo de tiros ina esta presente como monaeste® de sulfato· OJ* A hirudina tem sido administrada no homem pilas vias intravenosa e subcutânea· Por via intravenosa a semi-vida media de eliminação ohservou-ee ser de 0,84h e aproximadamente 50% da dose administrada foi extraída Intacta da urina* Após administração subcutânea encontrou-se no plasma níveis inibidores de hirudina durante pelo menos 4h· A hirudina ê portanto considerada como sendo de actua-ção relativamente curta com uma duraçao de acçad semelhante da heparina. Considerando este entrave vsrifica-se uma forte necessidade de polipeptídeos selectivoe antitrqmboli-ticamente activos tendo aaiir seml-v/ida in vivo· -í k--

Existe também uma forte ne®essídade de compostos de hirudina que apresentam potência snlitrombelí-' tica reduzida· ft redução da potência antítrombét ica resulta numa redução da capacidade destes compostos de hirudina para evitar â interseção da trombina com os seus ligandos de maior afinidade* principalmente o reeapler de plaquetas.

No entanto, através da saleçção cuidadosa da potência anti-trombotica da hirudina ela mantém a sua capacidade para i*· nibir a coagulação do fibrínogénio, uma propriedade de baixa afinidade da trombina.

Tais compostos de hirudina tem a vanta-gem de possuírem efeitos inibidores na trombose* um caso dominado pela fIbrina* mas tem pouco efeito na hemos ta si a, um efeito dominado pelas plaquetas, t ainda objectivo do presente invento proporcionar tais compostos de hirudina com potência antitrombôtica reduzida.

Surpteôndenteraente* soePnif»*se que & aumento na hidrofobicidade das hirudinas causado por mutações específicas doa núcleotídeoe codificadores de aminoé-cidos básicos (Lis) na região central e/ou por outras modificações na referida região ‘conduz a uma potência antitrom-boticã reduzida e/ou uma semi-vida maior in vivo* físsim, o presente invento proporciona novos mutantes de tíessulfato^hirudina tendo a sequência de aminoécidose

10 H-ZQ«V al- Ty r-Thr»Asp Cy s- Th r- G1 u- S er-Gly- 20 - BI n- As n-L eu«* C y sHL eu - C y s - G1 u - G1 y - S e r - As n* 30 «Vai—Cyo^Glf^Gln-Gly—As n- z ^ -C y s - Jie-* L e y- 40: —G1 y- S er- A s p « Gl y - Glu-Zj-Asn-Gln-Cys-Val- 50 »Tfi®-*GXy**Clu**Gly*thjp*Pro-z3-zA-z5-Sef* 60 -Zg-Zy-Asp-Gly-Asp-Phe-G1u-Glu-I1e-Pro»

»GluM»l«~Tyi^Leo~Gln~OH m em que IQ representa Vai ou os radicais dipeptidils Gli-Val ou riet-Val, I Lis, Glu# lkmê LSU*

If0 ou Vai, Z2 representa Lis, Arg, Asn, Vai, Leu ou Gln# Zj representa Lis, Arg, Asn, Vai ou Leu, Z^ representa Pro ou Gli, Zg é independentemente um do outro representam

Glu, ASn ou Het e representa His, Gin: ou Asn, com a 11« cepção dos compostos da fórmula I em que ZQ representa Vai, 2| representa Lis ou Gin, representa Lis ou Gin, representa Lis, Z representa Pro, í representa Gin, 1 n-Gin ou His e Z^ representa Asn & seus saio® «58®»=

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Os mutantôi de acordo com s invento di- Ψ' fereÉ da dessulfato-hirudina nativa ( ZQ i fel* I|* 1 Zg

Sao Líi* Z^ e Pro* Zg e Gin, Ig e His a Z^ e mente a 1*5# e® particular 1 a 4* radicais de aiinôáqidOí relativa-

Em particular, o invento esta relaciona» do com mutarstes de dessulfato-hirudina da formula I em que tQ representa Wal ou os radiiâife dipeptídilo Gli-Wal ou Net--Val* representa Lis* Gin* Asn ou Arg, representa Lis*

Arg* Asn, Wal ou Gin, 23 representa Lie ou Arg* represen- ta PfO ou 8Xt$ 2g representa Gin ou Met, Zg representa His ou Asn e 1η representa Asn ou Flet* com excepçãõ dos compos»

© t rj re- 0. * tõS da formula I em que 2 representa Wal, Z| SM Gin* Z2 representa Lis ou Gin, Z3 presenta Pro* Zg representa Gin, Ig presenta Asn e seus sais.

Sao exemplos de tais mutantes de dessul-t* 27 t* 36 fatpwhlwytiina Asn Ί * deseulfato-hirudina* [Asn 1 » des- tiilfato-fhirudlna* £ϋ«1Λ°3 “ dessulfate^ituiteat £g11 1" des s u If a ta-hirudina * £fiet^J * des su 1 fa to- hl ru di na* £ifet^2J- des sulfato-hiru dina® £ηθπ j » dessulfato-hirudina* £Gln

Arg^7 J * dess ulfato-hirudina, £θΙπ27, no36* 47-, u Arg J - dessul» fato-hirudina * £ftrgSS, urg^7H * dessul! fato-hj irudina, /"Arg27* * dess ííifatoMhirudinsif Glicil - [Cln21 ' r1 36 *,47 η * Gin , Arg / deesulfato-hi rudina e metionil - £θ1η2 f a ^ * fira 1 * lessulfato- -hirudina* os campostos do invento podem existir na s

m forma livre e também na forma doa seus sais* Uma vez que cantem grupos amlna livre® em vários resíduos de aminoãci-dos, os compostos do Invento podem existir ainda na forma de sais de adição acida* Sais de adição acida adequados sao em particular sais farmacologicamente aceitavais com ácidos convencionais terapêuticamente aceitáveis* Sao saíe inorgãoieos representativos os ácidos hidro-holicos (tais como loldo clorídrico) e também ácido sulfurio®* ácido fos-forico e acido pirofosfórico* Sao ácidos orgânicos representativos, em particular os ácidos aren®ssulfáni©09 (tais como ácido benzonossulfonico ou p-toluenossulfónico) ou á-cidos alcanossulfonicos inferiores fome 4aja o ácido meta-nossulfonico) assim como ácidos carboxílicos tais como e á-cidç acético, ácido lático, ácido palmítico, acido estaárí-oo, ácido raálico, ácido tartárico, ácido ascárbico cítrico* Como no entanto os compostos de acordo com vente também contem grupos carboxilo livres em vários reti* duos de aminoácidos, grupos carboxilo esses que conferem caíacter acldico a todo o peptideo, eles podem estar também na forma ds sais com bases inorgânicas ou orgânicas, e.g. Sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésios ou tambemi sais de amónio derivados de amónia ou uma base orgânica contendo φ. φ azoto que seja farmocologicsmente aceitável* No entanto.

Uma vez que contem ao mesmo tempo grupos carboxilo livres s grupos amina livres, eles podem existis também na forma de saia internos* são preferidos os sais farmacologicamente aceitáveis* 0 mltotío para a preparação de mutantes de dessulfata-hirodina de acordo com o invento compreende a cultura de uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma casse** te de expressão constituída por um promotor operacionalmen- te ligado a uma primeira sequência de MIA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequencia de DNA codificadora do mutante da deesulfato-hirudina e uma sequencia de DNA contendo sinais de terminação de transcrição e isolamento da mutante da dessulfato-hirudina e, caso se pretenda* conversão de um polipeptideo obtido tendo grupos amina e/ou carboxilo livres num sal ou conversão dê um sal obtido no composta livre,

Estirpes hospedeiras microbianas adequa·» das incluem, por exemplo, estirpes de Bacillus subtilis , Eeoheriehia coli» e Sacçharomyces cerevisiae»

As estirpes hospedeiras microbianas transformadas são cultivadas num meio líquido contendo fon- φ Λ tes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, a-£ plicando métodos conhecidos#

Podem ser usadas varias fontes de carbono* São exemplos de fontes de carbono preferidas, os açucares assimiláveis, como sejam glucose, maltose, manitol, fru-tose ou lactose ou um acetato como seja acetato de sodio, o qual pldi ser usado sozinho ou em misturas adequadas# Fontes do azoto adequadas Incluem, por exemplo, aminoácidos, tais como casaminoacidos, peptídeos e proteínas e seus produtos do degradaÇao, como seja triptona, paptoos ou ertraetos de OarnOf aindá extracto de levedura, extrseto de malte, melspt &mm com© também saia de amonio, como seja cloreto, sulfate ou nitratO’ d© amónio os quais poda® S@» usados sorinhos ou em misturas adequadas* Sais inorgânicos que poda®· sei* usados iooluamf por exemplo, sulfatos* cloretos* fosfatos e Carbonatos de sadia* potássio, magnésio e oáleio* Em adição, o meio nutritivo pode também conter substancias promotoras tío crescimento. Substancias que promovem o oreecâaento incluem* por exemplo micronutrientes, tais como ferro,zinco manganês e similares ou aminoacidos indiv/iduais® células hospedeiras microbianas trans-formadaã com veetores híbridos tendem a perder este ultimo* Tais células têm de crescer em oondigOSS selectivas, i.ê. condições que requerem a expressão de U« gene codificado por um vector híbrido para o crescimento. A maior parte das marcas selectivas normalmente usadas e presentes nOS vectoras híbridos de acordo com o invento (infra) são genes codificadores de emimas da biosslntesr de aminoacidos ou purinae* φ φ φ

Isto torna necessário o uso de meios húmidos sintéticos deficientes no correspondente eeinolcido ou base purina. Io entanto, os genes que conferem resistência a um blocitía adequado podem igualmente ser usados e.g. um gene que confere resistência ao aainoglicosido G 418 . As células hospedei ras tranaformadaã com vsetores contendo genes de resistência a antibióticos sao cultivadas em meios complexos contendo o correspondente antibiótico pelo que sao atingidas velooida-des de crescimento mais rapidas a maiores densidades celulares. ííS células hospedeiras contendo veçtôres híbridos com um promotor constitutivo expressam o gene mutan-te da deasulfato-hirudina CiRlrolado pelo referido promotor sem inclusão» Ma entanto se a gane «utante da dessulfato-hi-rudina estiver sob o controle de um promotor regulado a composição do meio de crescimento tem de ser adaptada de modo a obter-se níveis máximos de rnRNH produto da transcrição i0e0 quando se usa o; promotor PHO^ em levedura o meio de crescimento deve conter uma concentração baixa de Fosfato inorgânico para desreptsssão deste promotor# A cultura I sfectuada «pregando táeni*» wmm Convencionais» As condições de cultura, tais como temperatura» PH do maio & tempo de fermentação são seleccionados de mido a serem produzidos níveis máximos de mutarrtes de desaulfato-hirudína. Uma levedura ou estirpe de E#coli escolhida ê de preferencia cultivada em condições de aerobiose em condições de cultura submersa com agitação e ui tempera** tura de cerca de 2^ a 35 C* de preferencia ã cerca de li C a um valor de pH entre 4 e 7» per exemplo a aproximadamente pH 5 e durante pelo menos II horas a 3 dias, de preferencia durante hb período que de produções satisfatórias dos miílan-tas de dessu 1 f a t o -hirudlna.

Inriepsndentemente da estirpe hospedeira» promotor a sequencia sinal usada» a maior parte do mutante de dêsswifsto-hirudina produzido I secretada para o maio de cultura ou para o espaço periplasroático enquanto qus apenas uma pequena parte permanece associada ao interior da célula# A proporção preoisa (compostos secretadse / compostos associados â célula) depende das condições is fermentação»

νν Οβ mutantes de deseulfato-hirudina podem set Isolado© por meios convencionais» Por exemplo» o primeiro passo consiste geralmente na sepataçao dae células do meio de cultura por meio de centrifugação* 0 sobre-nadante pode ser snjfiquacido em mutantes de dessulfalo-hi— rudina seoretsdos por tratamento eom polietileneivinâ de φ -Λ

modo a remover a maior parta do material nao proteico e precipitação das proteínas por ©aturaçao da solução com sulfato de amonio» fts proteínas do hospedeiro» se presentes» podem também ser precipitadas por meio de acidificação com ácido acético (por exemplo 0»1%» pH 4-5)e Um posterior enriquecimento no mutante de dessulfato-hirudifis pode ser conseguido por extracção do sobrenadante de ácido acético com n-butanoi* Outros passos de purificação incluam» por exemplo remoção de sais» processos cromatograficos» tais como croma-to grafia de permuta iónicaf cromatografia de filtracção em gel» cromatografia de partição» HPLC» HPLC de fase reversa e similares. A separação dos constituintes da mistura de proteínas e também efectuada por diálise» de sPttrÉiO com a Cârga per meio de electroforese em gel ou eleetroforese sam veículo de acordo com o peso molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada» por cromatografia de afinidade» por e-xerapl© em anticorpos» sepecialmente anticorpos monoclonais ou com trombina acoplada a um veículo adequado para cromatO-grafia ds afinidade ou por outros processos, eôpesislmente os conhecidos da literatura. vj

Caso se pretenda isolar mutantes de dessulf ato-hirudi na que se tenham acumulado no espaço peri* plasmátieo são necessários alguns passos de purificação suplementares: os mutantes de dessuifato-hirudino são recuperado© por remoção enzimática da parede celular (infra) ou por tratamento com agentes químicos» e.g. reagentes de tiol

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ou EDTA ou submetendo a parede celular a choques osmoticos que dão origem a daniflcaçao tía parede ©siular permitindo a libertação do produtOe Q testa com anticorpos aoti^hirudioa ou sntâ«rtiSSUÍfato-hirMdina (por exemplo anticorpos monoclo-nais obtidos a partir de células de hibridoma)® o testa da trombina £<%U« Bergmeyex (ed·), Pethods in Enzymatic Analy-SÍS® Vol.ll, ρ:4 314-316, Uerlag Chemie, Weinheim (FRG) 1983]] OU o teste da coagulação do sangue {j« Harxuardt et ai»®, fhrotnbe Haemoste £7® 226 (1982)] podem ser usados para de-tectar a actividade do mutante da dessulfato-hirudina em fracçÕes obtidas no decurso do processo de purificação·

Oapsndendo eh método emprepie* os com»· poatoe do invento mm obtidos no foras livre ou na foras de sais de adição acida® sois internos ou sais com bases# 0 composto livre pode mm obtido de modo conhecido m partir dos saís de adição ielda de sais com bases* Por outro lado sais de adição ácida terapeuticamente aceitáveis podem sif obtidos a partir dos compostos livres por reacção com áei·* dos® eeg· com os ácidos que formam os sais atrás referidos s por evaporação ou liofilizaçao· Os sais internos podem set obtidos ajustando o pH a um ponto neutro adequado· φ

Ae eelulss hospedeira» microbianas transformadas de acordo com o invente podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinantB compreendendo os passos de »14*

* preparação de um vector híbrido ccwpr esndendo uma casseis da sipressle consistindo mm promotor operacionalroente ligado a uma primeira sequência da DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura adequada a uma segunda sequência da õ&A codificadora do mutante da deasulfafe-hirudina e uma sequência de DNA contendo^ sinais de terminação da iranssri-Çao9 - transformação de uma estirpe hospedeira misrofci* ana com o referido: vector híbrido9 e selecçao das células hospedeiras microbianas transformadas de entre as células hospedeiras não transformadas*

Vectores de expressão

Os vectores híbridos de acordo com o invento compreendem uma cassete de expressão consistindo num promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contende Sinais de terminação da transcrição* *

â eelecção d® um ysetor adequado s determinada pela célula hospedeira microbiana escolhida para a transformação» São hospedeiros adequados os especificados atfla* espeeielmeote estirpes da Saecharamvoes ceravislas 9 estirpes bacterianãs, espeoiaImante estirpes de Eecheri-ohia coli & Saçlllus subtllia» São exemplos de vectores adequados para â expressão dô gene mutanta da dessulfato-hirudlna numa as* tirpe de E» coli os bacteriõfagos, por exe^oio derivados d® bacteriõfago ^ ou plasmídeos*, teis como o plasmídeo colEl e seus derivados, por exemplo pFB9, p3F?124, pQR317 ou pBR322. Os vectores adequados contem um replicão completo e um gene mercador que tornam possível a selecção e idertiififèaçãa dos microorganismos transformados pelos plasmídeos de expressão através de uma característica fenotípica* Os genes marcadores adequados conferem ao micronroanismo, por exemple, resistência a metais pesados, antibióticos tais como ampícili-na ou tatracielina e similares*

Varies promotores podem ser usados para a regulação da cassete de expressão em E* aoII* são usados eepeoialifflénte promotores de genes for temente expressos», ião promotores adequados os promotores lac, tac, trp e Ipp, a» inda o promotor do fago λ N ou do fago^pt e outros* ia presente invento, o promotor preferido para usar m E» coli e o Ipp e o promotor lac»

Os ueelorss adequados para a raplicação s expressão em 5, cerevislee contêm uma origem de repl inação de levedura e uma marca genetica seleciiva para levedura* Oa vedoras híbridos que contem uma origem de replica» ção de levedura, por exemplo os segmentos de replioaçao autónoma cromossómiea, são mantidos extrieromossómicamente dentro da célula de levedura apos transformação e sao replicados autonomamente durante a mitose·

Também podem ser usados os veotores híbridos que contem sequências homólogas de DMA do plasmídeo 2u.de leve» durão Tais vectorss hibridiS sao integrados por recombina-ção em plasmídeos 2u. já presentes na célula ou replicam-ss aútonomamentee Sao genes marcadores adequados para levedura especialmente aqueles que conferem resistência a antibióticos ao hospedeiro ou no caso de mutantes de levedura au-xôtróficos, genes que complementam as lesões do hospedeiro* Genes correspondentes conferem, por exemple» resistência ao antibiótico oiclo-heximida ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrafico, por exemple o gene URA3* LEU2# «133 cu TRPI*

De preferência os vectores híbridos da levedura eontlm uma origem de replicafã» e um gene marcador para um hospedeiro bacteriano, especialmente E* óoll* de modo que s construfie e a clonagam dos vectores híbridos e seu® precursores pode ser efectoada em E» ooll· 3Sa promotores adequados a expressão em levedura» por exemplo» os do gene flDHI. ÃOtflI ou PHOl e também promotores envolvidos na glicólises por exemplo o promotor PGK ou o promotor SAP* Λ sequência de SiMrcodificadora tíe um lil sinal ("sequência sinal*) deriva de um gene de hos-pedelro microbiano codificador de um polipeptideo que «βί*** roalmente s secretado·. ãuando se usa £· coli como mlorccrga-Fíismo hospedeiro pode ser escolhida a sequência sinal de ompA, lpps proteína de ligação a mal tose* rseeptorà * Pt»* teína de ligação a leueina ou da||-i«ata«ate· Para usar em levedura pede áer escolhida a sequência sinal da hirurflna obtida a partir de OKft genomico de levedura· As sequências sinal mais preferidas para usar em levedura si®* por sxem-pio, as sequências sinal s prepro dos gens© da invertas© de levedura, factoro(, f aromo na-pep· ti dose (KEãl), ntoxina assassina* e fosfatas» ácida reprimível ÇpH'05) e a sequência sinal da glucoamiiase de Aspergillus apamori» Como alternativa pode-se construir sequência sinal fundidas ligando parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligais 88 promotor usado (por exemolo PHQ5) com parte ria sequência sinal da hirudina« São favorecidas as combinações que permitem a clivagem precisa entro a sequência sinal e a sequência de aminsleidos da dessu1f atc -hirudina mutante. Sequências adicionais* tais como sequências pro ou espaçado-ras que podem· ou nao ser portadoras de sinais de processamento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar o processamento preciso de moléculas precursoras· A sequência de dfifft contando sinais de terminaçSe de transcrição I de preferência a sequência deli» mitante $* de um gene derivada do hospedeiro microbiana se-ieccionado que contém sinais correctos para terminação de transcrição· As sequências dsiimitentes 3' são, por exemplo, as do gene naturalmenta ligado ao promotor usado»

Os vsctorss híbridas de acordo com o invento podem ser preparadas por métodos conhecidos, por exemplo^ ligando a cassate de expressão consistindo num promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídao sinal ligado na g,relha de leitura correcta a uma segunda sequencia de DNA codificadora do mutante de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contenda sinais de terminação da fctansctição ou os constituintes da cassete de expressão aos fragmentos de 4 DNA Contendo marcas genéticas selectivas m origens de re-plicação para 0 hospedeiro microbiano seleccionado na ordem prédeterminada» 0 DNA codificador dos mutantes da des-sulfato-hirudina de acordo com o invento pode ser produzido por métodos conhecidos. Os métodos para a produção do DNA incluem excisão de uma porção do DNA Compreendendo õs codões dos resíduos de aminoacidos indesejados do gene parental da dessulfato-hirudina e sua substituição por um segmento de DNA em que os referidos codões foram substituí*· dos por tripletos de desoxirribonucleotídsos codificadores dos resíduos de aminoacidos pretendidos ou realização de mutaÇao por meio de mutagenese dirigida.

Para a preparação do DNA codificador do mutante de dessulfato-hirudina a excisão de uma porção do DNA da dessulfato-hirudina pode ser eféctuadâ usando enzimas de restrição. Um pré-requisito deste método é o disponibilidade desítios de restrição adequados na vizinhança dos codões a serem alterados. Por exemplo, um peque-no fragmento de restrição contendo o codao de um aminoaci-

da não desejado I removido por clivagem com endonucleasese Uma sequencia de DNA de cadeia dupla correspondente ã preparada* por exemplo por meio de síntese química* na qual são Usados tripletos codificadores dos aminoáeidos pretendidos » 0 fragmento de DMA e ligado na orientação correeta ao restante fragmento grande para dar uma sequencia de DNA Ά' de cadeia dupla codificadora do mutante* Por conveniência e para facilitar a manipulação do gene mutante este último es-ta vantajosamente contido num fragmento de DNA maior dotado tis adaptadores adequados qus permitem a inserção e clonagem d® segmento num vector de Glonagem.

Numa execução preferida do presente invento a preparação de DNA® codificadores dos muiantes da deseulfato-hirudína é efectuada por mutagenese dirigida* Este método e um processo de mutagenese in vitro pelo qual um sítio definido dentro de uma região de SNA clonado pode ser alterado cf« os artigos de revisão de fU3* Zoller e W. Sroi-th* Methods Enzymol* 100a 468 (1983) ; D· Botstein a D.Shor-tle* Science 229 a 1193 (1985) β A mutagenese pode ser efectuada no gene completo da dessulfato-tiifudânat ou em partes funcionais dele contendo o(e) cotíSo(Õee) tísa{s) aminoácido(s) indesejado(s)0 Apos o mutagenese a parte funcional mutageni-zada é ligada às outras partes do gene da rtes8ulfat»*hir®dl-na para dar o DNA completo da dsesolfaio^ftirurtina mutante* 0 método de mutagenízação do gene da iiseulfato-hirudina ou parte funcional dele é carecterizado por o gene de cadeia simples ou um DNA de cadeia simples compreendendo o gene da dessulfato-hirudina ou parte dele ser hibridado com um oligodesoxirribonucleotídeo iniciador que ê complementar da região ii gene híbrida a ser mutageni- ~*0«

zada excepto no(s) sítio(s) de desemparalhamanto que dirige (m) a mutação, o oligodesaxírribenupleolldeo hibridado e u- ,ψ sado como iniciador para Iniciar a sintas® da cadeia de DNA complementar, o DNA resultante parcialmenta de cadeia dupla é usado para transformar uma estirpe de microorganismo re- 9 cipíente, a estirpe do microorganismo e cultivada e selecci-onados os transformantes contendo DNA do gene modificado (mutante) da dessulfato-hirudiFiae HOiCadalrpiS microbianos 0 invento diz ainda respeito a uma es** tirpe hospedeira microbiana qua foi transformada com um vec-tor híbrido compreendendo uma cassete de expressão consis-tindo num promotor de levedura opera e i o na1mente ligado a uma primeira sequencia de DNA contendo sinais de terminação da transcrição e ao método para a sua prodcfib, compreendendo transformação da referida estirpe hospedeira microbiana com o referido vector híbrido»

As estirpes hospedeiras microbianas sao as especificadas atrás» A transformação com os vectores híbridos de acordo com o invento á efectuada por exemplo, Como descrito na literatura para 3» cerevisiae ΓA» Hinnen et alo, Proc. Natl0 Acad» Sei» USA 75, 1929 (1978)] , B» Subtilís [Anagnostopoulos et al», 3. Bacteriol. 81, 741 (1961)] e I» cõli [«· Mandei et al», 3· Mol. Biol* 53, 159 (1970)»] 0 isolamento das células hospedeiras transformadas § efectu-ado com a vantagem a partir da um maio nutritivo aelectivo ao qual foi adicionado, por exemplo, o biocida contra o qual c fane marcador contido no plasmídao de expressão confere re*· sistencia» Se, por exemplo, os vectores híbridos possuírem o 21- gene amp^t adicionasse pois ampicilina ao meio nutritivo, ia oiiíilas que não contem s vector híbrido são destruídas em tal meio» lee farmacêuticas

Os novos mutanteâ is dessulfato-hirudi-na obtidos de acordo com o prsssote invento tem proprieda» des farmae ol0gicas e podem tal como a hirudina extraída de sanguessugas eer usados em profilaxia ous especlalmenta, em terapia. 0@ mutantes de deasulfato-hirudina de acordo com o invento são, tal como a hirudina natural, ini-bidores potentes da trómbina. Eles possuam, por exemplo, um valor de K. (constante de dissociação do complexo mutante

X Q IO da dessulfatú-hirudina - trombina) de 10* π a 10” Os mu-tantes de dessulfato-hirudina são totalmente específicos para a trombina a não apresentam interacçõee com outras proteínas do sistema dé coagulação do sangue. A toxicidade é extremam ente baixai

De modo semelhante não se observaram re-acçoes de hiperseneíbllidade ou reacçoes alérgicas. Ainda, os mutantes do invento tem uma duração de acção in vivo com-.parávsl ou melhor do que a da dessulfato-hirudina nativa.

Os novos routantes da dessu1fato-*hicud i « na da acordo com o invento podem portanto ser usados de modo anilog® a hirudina natural para a terapia e profilaxia de tromboses s tromboembolias, incluindo a profilaxia de tromboses pos-operatórias, para terapia de choque agudo fps® exemplo para choque séptico ou politraumático)* para a tara-pia de coagulopatiae, em hemodiálises , hsmo-separaçao e na circulação de sangue fora do corpo. 0 0 0 invento também esta relacionado com Composições farmacêuticas que conte® pelo menos um doe i®w-postos dé acordo com o invento de um seu sal farmaceutica-mente aceitável, facultativamante juntament© com im veículo farmaceuticamente aceitável s/ou aditivos0

Estas composiçoes podem ser usadas eepe-Cialmsnte nas indicações atrás referidas, quando são administradas, por exemple, parentêricamente, como seja por via intravenosa, intracutlnes, subcutânea ou intramuscular ou topicamente. 0 invento também está relacionado com a utilização dos novos compostos de acordo com o invento e Ciffl as composições farmacêuticas contendo-os pare o tratamento profilático e terapêutico de seres humanas ou animais, espe-cialmente no caso dos síndromas clínicos atrás referidos, em particular para inibição da coagulação do sangue dentro e fora do corpo humano e de animais®

A dosagem depende espeeialmsnie da fof-ma específica de adminisiraç& 8 da finalidade da terapia ou profilaxia* 0 tamanho da# dose# individuais a m regime de administração pode ser melhor determinado pala avaliação individual do 'caso particular de doença,* os mátetíi# de determinação dos factores sanguíneos importantes necessários para este fim são familiares para os que estio dentro do tasa* Normalmente no emso de uma injecçio a quantidade terapeuti-camente eficaz dos compostos de acordo com o invento está numa gama de dosagem entre aproximadamente 0,005 e aproxima-damente 0,lmg/kg de peso di corpo, t preferida uma gama en« IfS aproximadamente 0,01 e OjQSmg/kg de peso do corpo. A administração ê efectuatíã por injecção intramuscular, intravenosa ou subcutânea. Assim, as composições farmacêuticas para lÉilnietração parenterica na forma de monodose contém por

dependendo do modo de administração, entre aproximada-0,4 e aproximadamente 7,5mg do composto de acordo com o invento. Além do ingredientes activo estas composições farmacêuticas geralmente contem lambem um tampão* por exemplo um tampão de fosfatas, destinado a manter o valor do pH entre aproximadamente 3,5 e 7 e tandem clareio de sódio, ma-nitol ou sõrbitai para ajustamento da isotonicidades. Cie# podem estar na forma liofillrada ou dissolvida, sendo possível que as soluções contenham um preservativa tom aetividade t, por exemplo entre 0,2 e 0,3^ de éster mstl-ou ester stílico do ácido 4-hidroxibanzáico.

Uma composição para aplÍGação tópica pode estar na forma de uma solução aquosa, loção ou gel, uma solução oleosa ou suspensão ou eepacialmsnte, pomada emulsionada* Uma composição na forma de solução aquosa á obtida, por exemplo, dissolvendo os ingredientes nativos de acordo com d· invente, ou um seu sai farmaoeuticaraente aceitável, u- -24- mm solução: tampão aquosa entra pH4 e pB6,5 e caso se preten-da, adiçao de um outro ingrediente activo, por exemplo um a-gente anti-inflamatória e/ou um polímero liganta, por exemplo pelivinilpirrelldona e/ou praservativo. ά concentração do ingrediente as ti iro ã entre aproximadamente 0,1 e l»5mg de preferencia· entre 0,2S e l§0mg, em IQml de uma solução ou lQg de um gel·

Uma forma oleosa de administrafao para w 0 0: aplicaçao tópica e obtida, por exemplo, suspendendo os ingredientes activo© da acordo- com o invento ou um seu sal te- Ά' 0 0' rapeuticamente aceitável, num oleo, facultativemente com a adiçio de agentes gus incbem, como seja estearato de alumínio: e/ou tensoactivos |ntensidesM) tendo valor de HLB {ns-«pillbfic hidrofIlÍco-lipofíliçoB) abaixo de 10, como sejam monoestere® de ácidos gordos de álcoois poli-hidricos, por exemplo monostearato ris glicerina, monolaurato de sorbitano, monostearato de sorbitano ou monoleato ris sorbitano» Uma ρθ-mada contendo gordura I obtida, por exemplo, suspendendo um ingrediente activo de acortí© com o invento, ou um seu sal, numa base gorda espelhava!, fac ult a t i vamante com a adiçao ris um tensoactivo tendo um valor de hLU abaiie de 10« Uma pernada emulsionada e obtida por trituração de uma solução apuasa do ingrediente aclive de acorde com o invente, ou um seu sai numa base macia espalhável com a adição de um tensoactivo tendo um valor de HLS abaixo de 10» Todas estas formas para aplicação tópica podem conter também preservativos· A concentração do ingrediente activo v«l de aproximadamente 0,1 a l,5mg áé preferencia de 0,28 a l,Gmg, em aproximadamente lOg de base·

m1 êm rias composições descritas atrás destinarias ao uso directo em medicina no corpo humano ou de animal» o presente invento relaciona-se também com composições farmacêuticas para uso medíGinal fora do corpo human® oú de animais. Tais composições são UíSgriae especialmente como aditivos anticoagulantes ao sangue sujeito a oiiculâ* ção ou tratamento fora do corpo Cp©** exemplo circulação fora do corpo ou diálise em rins artificiais), preservação ou modificação (por exemplo hemo*e©pereças)# Tais composições* como sejam soluções ®sieefcH ou somo alternativa composições na forma de monodose, sao semelhantes em composição is com* posições para injecção descritas atrásj no entanto, a quantidade ou concentração de ingrediente activo i com vantagem baseada no volume de sangue a ser tratado ou, mais precisamente, no seu teor em trombinas Era relação a isto deve-se fazer a ideia de que os ingredientes activos de acordo com o invento (na forma livre) desaetivam totaiments cerca de 5 vezes a quantidade por peso de trombina, são f ia ie lógica»©©-* te inofensivos mesmo em quantidades rslsiivament© grandes de modo que não existe o risco de sobre dos agem, mesmo, por exemplo, durante transfusões. Dependendo do fim especifico, a dose.adequada é entre aproximadamente 0,01 e aproximada-mente l,0mg do ingrediente activo/litro de sangue, se bem que o limite superior possa ainda ser excedido sem risco· 0 invento relaciona-se especialmente com mutantes de deôsulfato-hirudina, vectores híbridos» estirpes hospedeiras microbianas transformadas com tale vectores híbridos e com os processos para a sua produção como descrito nos Exemplos. «26«

Breve descrição dos desenhos ia secção experimental que se segue sao descritas varias realiraiiss do presente invento com rafa* rência noa desenhos juntos em que;

Fig. I « ilustra esquematicamente m construção do p!as« mídeo pFIL3S0«

Fig. ilustra esquematicamente o mapa P3D8207/GAPFL - HIR.

Seccão experimental

Exemplo 1 : Construção do plasmídeo pMLSSO (ver Fig. 1) a) Digestão do DNA do plasmídeo plftl-111 - om p A -1

10 j^g do plasmídeo pI8«lll«ompA«2 £3* Shrsfsd et al*» Ef9I©«3*· 3S 2437 (1984)3 foram dissolvidos em 88^1 de lOOmFl Tris«HCl pH7,5, SOmM NaCl f? 100 vg/ml de gelatina com aà endonucleases de restrição EcoRI e BamHI* A solução foi ajustada para TNE e extraída com fenol/cA)rofórmio. 0 DIA foi precipitado com etanol. Após electroforese em gel de agsfOSe o DNA vector pIN-IH-ompA-2/EcoRI/8amHI foi isolado por elu-b) Digestão do DNA do plasmídeo pFOID ZOjULg do plasmídeo pFtL3lQ (ver Pedida de Patente Europeia 168342) foram digeridos eoia §0 /11 de lOQmfl Tris*HCl pH7*5

IsGX e 100 de gelatina com as endonucleases de

restrição EcoRl e BarnHI» A solução foi ajustada para TNE e extraída com fenol/olorofôrmio. 0 DNA foi precipitado com etanol# 0 Fj-Fj-DNA (gane da hirudina) foi isolado após @-SectroForsse am gel de agarose e eluição a partir do gelo c) Ligação· do f^-Fg-OSft (gene de hirudina) de pfíLIlO com o DMA vector õlfl-IIl^ogPÃ^g/EcoRI/Baitttil 1 jxQ de F^-F^-MA (gene da hirudina)/EcoRI/BamHI e SQ^jug

És DNA vestsr pIN^IlI«ompA~2/EeoRI/8amHÍ foram dissolvidos em 50^1 is iOOrfl Tris-HCl pH7*5# SOrfi iaCl e lii^*g/ml de gelatina# ajustado para TiE* A solução foi extraída com fe-nol/cloroformio e o DNA precipitado eaw etanol· 0 preeipl» tado de DNA foi dissolvido em 20^,1 de uma soluça® de 50rnW Tris-HCl (pH 7,8), 10mW PlgClg# lOwW DTT# QeWI ATP e 1 SO^ig/ /ml de gelatina a tratado com 25 unidad^^pl de DMA-llgas® de T4 (Biolabe) a 15cC durante 3h# Deste modo eriou-se o plasmídeo recombinante pl^LSSO, o qual contem © Γ^-Ε^-ΟΝΑ (gene da hirudina) Inserido# d) Transformação de E« coli HB101 com o plasmídeo plALSSQ

As células de E» coli HB101 pré-tratadss eo® caloio que foram preparadas como descrito por Randel et al. [3® fôol# Biol* 538 159 (1970)J# A solução obtida em c), a qual contém o plasmídeo recombinante pPiL350, foi aquecida a 65VC durante 10 min. de modo a inactivar a DNft-ligsss de T4 » foi então· arrefecido ata 3fíC# da mistura de reacção resultante foram adicionados a ISO jxl de células €,® coli HB101 tratadas com cálcio em iQmfi MgCl^ # lOmfl Tris*HG1 (pH 7,6) num volume total de tOD^l* «28»* ·#

5 4 ' C V.. 8.. 3 ' * I i. r l· t i r i- . à* k~

ã ϊ

Subsequentemente esta mlstota foi arte*· fecida em gelo durante 30 mim, aquecida durante f min« m 42°C e depois deixada durante 50 min. em lml de meio L (triptona Bacto 10g/l ; axtracto de levedura Bacto 5g/l; NaCl 5g/l| glucose 5g/lj ampicilina 0,lg/l) a 37°C· A mistura foi então espalhada em quantidades de 0,2ml sobre 5 placas de agár (FlcConkey Ajgar, Difco), que contem 60 jJ-g/ml de ampicilina (Serva). As placas da agar foram então mantidas a 37 C durante 16-18; horas* Obtiveram«s§ lil eolónias resistentes ã ampicilina dfe células E* ooli MllOi transfor-madasa

e) Despiste das colónias que cantem F^-Fj-DNA 6 colónias transformadas (Exemplo ld) foram transferidas pars-filtro de nitrocelulose B85 fSohieirtier and Schull)*

De asorde com Grunstein e Hogosss £Ρίθ©« is ti* Aoati* ilâ#

USA 72p 3961 (1979as colónias foram lísadas e o seu ONA desnaturado foi fixado no filtro· Subsequentemente a prê- -hibridação dos filtros foi efectuada em 20ml (por filtro) da 4x5ET [= solução de 30mfl TrieeHCl (pH 8), ISDmfl NaCi* lmPl ÊDTftj-j 0,1% (p/o) Fiooll 400, 0,2% SOS © SO^g/ml de

DNA desnaturado de timo de vitela durante 16 horas a 64°C 32 com a sonda marcada radioactivamente com P (aproximada-3 4 mente 10 -10 çpm Cerencov por filtro)* Uma mistura consistindo nos oligonucleotídeos complementares 46/64¾ 1/58, 56/67 e 154/64 (ver Pedido de Patente Europeia NB 168342) foi usada como sonda*

-29

Subsequentemente os filtros foram lavado» duas vazes em 2xSET9 Dg2% 3DS â temperatura ambiente* tíspols duas vezes .em 2x3 ET® 0*3^ SDS a 60°c (primeira durante 30 mift«9 depois durante 60 min·). Q» filtros foram antS© secos entre papel 3MW (Uhatman) e colocados a ÍQ9C num fil-me de raio® X (Fuji) com um iurart intensificada*· (Ilford) durante 1-2 dias· 0 a u torra d io g r am a resultante mostrou i colónias positivas (clones) que puderam ser usadas para posterior processamento» uma das puais recebeu a dssigpnafâO pWL3$Q*

Exemplo 2 g Construção do plasmídeo pBH109

Uma vez que o plasmídeo pWLSSO deriva do plasmídeo pIN-III-ompA-2 incluindo um adaptador de multi~clcoagem (sítios EcoRI» HindlII, BamHlJ ele cantam 12 pares de bases adicionais antes do gene da hirudina madura ootíifioa— dores de Ala» Gin* Phe» Hei* Pare que haja exprs®sao da dessulfato-hirudina maduras estas 12 paras de bases sa© removidos por mutagenese in vltro farendo uso de u® oligonu-cleotídeo de 27 meros· a) Preparação de pML350/XbaI/BamHI (Slj_ 5^u.g do plasmídeo pNL350 foram digeridos com as endonUf-cleaseô Xbal e BamHI» 0 maior dos dois fragmentos; Xfea! — - BamHl (SI) foi isolado por eluição do gel após electrofo-tese em agarose e dissolvido em In# Tris-HCl pH 7*5* Q*lmfl EDTA·

b) Preparação dg píU35Q/FvuI (SIl) ijxg do piasafdeo ρίΊ1350 fera® digerido® e®m a endonu* clease Pvul. 0 ΌΗΆ linearizado de pPitSSO/PtfuI foi subse** qtíOfitetttsnfce digerido com 3 unidades de fosfatas© alcalina de intestino (Boehringer) durante SC minwtos a 37*0* ft en~ zima foi inactiv/ada aquecendo a solução durante 80 mín. a 65°C* 0 Oiâ linear de pPiL350/PvuI (SII) foi isolado por e-luição do gel epos elecirofores» m «gasoso o dissolvido em lmfl fris-*HCI pH 7,8* G*M EDTft* c) Preparação do oliqonucleotídeo (27 mero) 127

Por analogia com o processo descrito no Pedido de Patente Europeia !\ia 168342 sintetizou-se o fragmento de DNA que se segue (designado I): 8* - GTA GCG CAG CCC GTT GTT TftC ACC GAC · 3» to com 1-3¾ A fosforilação dos extremos Sf foi fei m

ATP o polinyeleótideo-einase de T 4 ringer) como descrito ^Ploleeuiar Cloning* 1 Laboratory pia-nual (ede T* Planiatis et· ai»), Cold Spring Harbor Lab* (1982)$ p.

d) Construção do plaamldao pBHIQG

DMA SI e DMA $11, 0,3/x-g de cada, fora* misturados com 40 pmolee do fragmento de DMA 127 fosforilado em 27/zl de irofí Tris-HCl pH7,5, 0,1«P EB Tile 1 mistura adiciona-se 3pl tí© tampão polimerase-ligase 10M flP NaCl, 65mPl Tris-HCl pH ff| ÍOwPl'lgCl2 e 10mP^»flTQfdaptaetanol|» Esta mistura fel ague-cida durante 3 min* num banho-maria fervente para desnaturar os fragmentos de Mm* Subsequen temente,. a mistura foi gradualmente arrefecida {cerca de l’C/min) ate 30ÔC e incubada a esta temperatura durante 30 min· « mistura foi ainda incubada a 4 C durante 30 min a depois durante 10 min em ll|pl dos quatro fosfate» de desoxirri-bonucleotídeo (795mm eadal, 6/xl de lEhaW ATP, de Dlft-li-gase de T4 (2,5 U/jjJ) e ls12pl de DMA polímeras© ileoou (Boehnnger, SU/íjJ. ) foram adicionados e a mistura de DIA (volume total de 65^.1) foi incubada durantθ 16h a 12ei®C* A mistura de DIA foi digerida com % u-nidades de ©ndonuclesse Eeoil durante lh a 37°C para destruir o plasmldeo de partida inalterado pML350* Com este processo formou-se o plasmldeo pBH109« 0 plasmídeo pWlOS contem □ promotor Ipp e o promotor/operador lac operaelo-nalmente ligado a segulocia sinal ompft-2 ligada na mesma grelha de leitura ao gene codificador da dessulfato-hirudi-na madura* e) TransfeiwafSe de E« eoli HSIQ1 com o plasmldeo pSHlOf ϋ transformação dê células EI» coli HB1Q1 tratadas com cal-cio foi feita como tíessrito no Exemplo ld. A mástaia de re- acçao total usada foi de 55 1. * f) Despiste das colonias que contem o plasmideo pBH!G9 100 colónias transformadas foram cultivadas, a partir de cada uma das colonias preparou-se DMA da plasmideo e digeriu-se com EcoRI» Todos os DNAs d© plasmídeo que não são digeríveis com EcoRI sao potenciais plasmídeos pBH109 que nao possuem o sítio EcoRI# Foram identificadas duas colónias positivas idênticas# Uma delas foi seleccionada e designada p8H109* A sequência coireeta do F.-F--DNA a se- '% jjfr # ele guir a Sêifueneis líder ompA-2 foi confirmada por sequência-çao o

Exemplo 3 l Mutação do resíduo Lis27 usando M13mpl9/hirudina da hirudina para Asn27 de cadeia sim

m Cadeia codificadora Gin da hirudina 5'CAG

m 28 Gli ásn Lis Gis GGT AAC AM TGC 30 Ile Leu ATC CTG3»

iniciadorimutagenicQ 3fGTC TTT ACG TAG GAC5 *

cadeia codificadora 5 * C h G MUtadettlMada Gin CGT AAC AAT TGC ATC fTG3»

Gli Asn ftee Cis Ile Leu

SinteW*aram-s® Iniciadores mutagenicos usando o método fosforamideta Caruthers , em Chemical and Enzymatiõ Synthesis of Gene Fragments (H* G. Gassen e A« Lang* Eds*) Verlag Cheffli8f Ueinhaim*. Fsderel iepublie of iejManyi num sintetizados Applied iioafstems fModelo 3iOB|«i I ** Preparagao de H13mpl9/hirudina A ** DNA de FllSmpig cortado com Ibalyiamt·}! A 5jx,l de DNA de Fil3mpl9 di cadeia dupla ( ds MAf Õ#;i g/ml$ BRL) adicionou-se 2μ1 Reaet 2 (50QmP* tris-HCl, pH e«Q| lOOmF FgCl^ 500mF NaCl) (BRL}* Ijfi Xbal (IQ U/pl), D,S 1 BamHI (10 U/jxl) 8 12 1 HjCo Apli incubação a 37®C durante, l,5h adicionou-se 0,5μ1 de BamHI, 2,SjjjL de React 3 (500m!¥! Tris HC1, pH B,0j 100mF PlgCl^; lOOOmPI NaCl) (BRL) e 2yuJ. HjO e a incubação continuou a 37°C durante lhe Compls** tou-se o volume para 100^xl com H^Oa 0 ds-D!\)A foi isolado por extracção com fenol e precipitação com etanol e dissolvido em 30yx.l de tampao TE (Tris-HCl lOmM, EOTA ΙΐιΛ* pH Sfi|« B - DNA inscrito

Cinco jvg do plasmídeo pSHIQS foram cortada com Xbal

φ 'φφ β BamHI como descrito atras e o produto da digastao foi sujeito a electroforese durante 3h a 15Q volts usando um gel de 3,5% de pdliacrilariida com Tampiío TBE Ix (tampão TBE lOxs 108g dB Tris, 25g de ácido bórico, 9,3g de EDTAa2H2D/l)· 0 fragmento Xbal-Bamil contendo o gene da hirudina (250 pb) foi visualizado com iui UU após imersão do gel em 400ml de tampão TBE lx contende 10 ui de solução de brometo de etídio

3 J (10em agua), A parte do gel contendo 8 fragmento de restrição foi cortada em tubo de dl alies com SOO^ul de THE Q,5x e o DNA foi electroeluido num aparelho de elsotroforase para minigeis BI0-RA0 usando TBE 0,5x como tampão da corrida S 170 volts durante 30 mín* 0 DNA foi aplicado numa coluna Elutip-d (Sehieichsr & Schull) equilibrada com TBE 0,5χ· A coluna foi lauaria com 2 jjl de TBE Q,5x e o DNA eiuido com lfí isCl em fSi 0,Sx (lml), Prseipitou<-sB o DNA com etanol a redissolveu-se em 10 jú. de tampão TEi C «* Ligação da inserção Xbal- BamHI contendo hirudina a. mi.Smpig e preparação de DMa de cadeia simples

Cinco yl da inserção Xbal-BamHI contendo hirudina, 2jA de I*ll3mpl9 cortad© com Xbal-BamHI, 1 jjX de tampão li-gase lOx (SOmfl Tris-HCI* pH 7,1, lQmfl FlgCl^* lOmM diilotrei-tilli 1 jxl de ATP, 1,5 1 de DNA-ligase de T4 (BRLjl.jí. /^μΐ) fitam misturados e incubados durante a noite a 14®C» Cinço jd da mistura de ligagla foram usados para transformar células competentes de £» coli DffllDl de acordo com o metoda tíi 3* flessing flethotís In Enzymology 101, 21-78 (1983) ·

Boze placas transparentes foram repicadas e o DNA de cadeia simples (ss-DNA) foi preparado a partir de cada placa como descrito por 3« Pessing (supra)* 0 Oiífí designado f!13mpl9/ /hirudina foi r©dissolvido em 5DjjX de tampão TE (0,1-0,5jjg# dirigida

Plutaqenese i * Foeforilagao do iniciador mutaqenico 200 pmoles de iniciador myia§éniii® 1 (ver atras) foi fosforilada pela adição de 30 yl de Tampão cina-se iMm (1M Tris««Q* 0,1« «gCl2, 0,1« ditiotreitol, pH 8*3| 3 yl 10®« fl|P s 1 yl palinucleotídoo-cinase de T4 (8iL* 10 U/yl)· fipia incubação a 37°C durante lh, a reacção ?®t parada per aquecimento a 65 °C durante lOmin* B «* j^parelhamenfodo iniciador mutoaênico com o mal** de de cadeia simples «13mpl9/hirudina

Seis 1 |δ§δ jxq) de K13fflpl9/hirudiea de cadeia simples (Secção I-C) foi incubado com 3 yl (20 pmoles) do oli-gudesoxirríbonueleotídeo mutagenieo FosPorilado (6,6 pmoles/ /yl) ê 1 yl de tampão A (0S2« Tris-HCl, pH 7,5, 0,1« «gClj, Q,S« NaCl, 0,01« DTT) a 70 C durante 5min* e arrefecido len-tamente ate â temperatura ambiente durante cerca de 30miii* C - Reacção de extensao-llgaçao 1 mistura atrás emparelhada adicionou-se 1^*-1 d® tampão B {0,2« Trie-HCl, pH 7,S, 0,1« «gCl2# 0,01« DTT), 1 yl 10®« ATP* 4 /d mistura de d8TP 2m«, 5 yl d® DNA-polime-rase di T4 (Boehringer, 1 U/^μ.1)· Esta mieturg foi incubada a 16 eC durante 3h0 Parou-se a reacção ineufeande-a a 65 eC durante lomin.

Ο - Transformação s preparação de DHfl mutante ds cadeia simples ft mistura da ligação foi diluída a li10 com agua estéril a 1 jú,9 S jú. e 1 jã, de mistura da ligagao nao diluí*» da foi usado para transformar ellulas competentes £* coli BPIH 71-81 mut â jj8« Kramer* y, Kraraer m H, 3* Fritz, Cell 38 - 879-887 {1984)-} * As ellulas foram semeadas ©orna descrito no n fll3 otoning and tequencing Handbook” (publicado por A-meishaffile Repicaram-se doze placas incolores a preparou-se OS-MÁ como descrito na secção I-C» E * pBspiste de DNA mutante de cadeia simples

Para fazer o despiste de DNA de cadeia simples mu-iagenindo* cada orno das 12 amostras de ss-ONA foi sequsnci» ada pelo método de terminação de cadeias com dirissoxinúcleo» tídeos £fo Sanger* i* Niefcler m A* Re Coulsoo§, Pros* Nãfl# Acad. Sol* USA 74* S463-S4&? (1977}] * Inlciaiments* «pana® o didssoxinuoieotídso complementar da base mutagenifatía esperada foi usado na reacção. Suba equéntem ente o ss-Dl\fA de vários mutantes positivei foi sequenciado para estabelecer a sequencia completa do «yiante usando QlA-polimerase de T7 (Sequenase* USB) seguindo o método de Tabor e Richardson j^PrOCe Natl» Acad* Sei* USA 84* 4767-4771 (1987)]. As alterações de bases esperadas codificadoras da mutação GLu -> Gin nas "posições il e 62 da hirudina recombinante foram observa» das R& sequência de DNA. 0 DNA fagico tendo a sequência ee* penda foi designado P13mpl9/hir«dina K27N*

F - Preparação de ΡΝή forma replicativa (RF) a partir do D1MA fãqico de cadeia simples MlSmolÇ/hirudina K27N Células E0 coli 3M1D1 foram transformadas com 10-20ng de DMA mutante de cadeia simples ia tlirutfâna K27N 8 preparou-se ds-DNA como descrito no Hí113 Oiening and sequen-cing Handbook” (publicado pela Amersham)· Obteve-se um rendimento de 40-50 jxg de ds-DNn a partir ii ISOml de .cultura» δ - Isolamento da inserção Xbal-BamHI da hlrudina mu-fcante I inserção Xbal-iamHI de birutíina mutagenifatía' foi removida de 25 jjQ de bs-OMft e purifieeda como descrita na aeoçSa li» 0 DNA foi dissolvida em 20 jil de água esiiSrâi» H - Preparação de DNA vsetor pIN-III-ompA-2 cortado

com XbaI*BiffiHI

Apreximsdaaenie 1*5 j^g do plasmídeo pli-ill»t»pâ~2 foi digerido através da adição da 6 til de tampão React 1 (Sit,)* 2jjJL: (20 unidades) de Xbal* 1 yil de õaeHI (10 unidades)» 1 ^UL de EcoRI (10 unidades)» 3f jú. de HgO (volume total de 50& incubação durante 3h a 37°ε<ϋ Adicieneu-ss 1 jxl (10 unidades) de SãfflHl» 1 >3, (li unidades) de fiosífl* 5 jil de React 3 (BRL) e 12 de H^G e a incubação continuou durante lh a 370 E*

3fi*

I * Ligação do QMh da logargajo %fra_3>B88H I da Mradtoa mutante K27N ao plaemideo plN-III-ompfl-2 cortado com Xbal-BamHI

Novaj& ds uTsn da inserção Ibal^BamHI da hirudina ftfflj 2 jXL de D1N3A do uôctor pIM-íII-úmp-2 cortado com Xbal-wlamHIf 3 il de Tampao de ligação IGx (SBL) e 1 /1 (3, U//4} de 01â«ligass de T4 (URL) fora» mleturados e Incubado» a 14®Ε dteante lfi-20h#

III

Expressão do mutante E. coli OFtlQl deseulfato^blrudlna: em

Ãm Transfeççao de L. gojlestirpe OFIIOI

Cinco /1 ds mistura de ligação foi usado para transformar 053ml de células competentes de C. coli 3ΓΊ101 de acordo com o método de D. ftessing (supra}# * amostra adicionou-se tres tal de fiYT/ftmpicillin (50ji.q dê ampicilina/ml de 2xYT) fi % e as células foram incubado© lh a temperatura ambiente. Uma amostra de lml da cultura fõi então remov/ida e espalhada sobre uma placa de LB/Ampicillin (50jxq de amplicilina/ml de agar-LB) e crescida durante a noite a 37°Ce r 0* Selecgão de oolonias expressando ^sn

!ÍU deseulfe- to-hirudina

Dez οοΐοηϊβ® baeterisnas das placas LS/fimpieillin· foram repicadas e cultivadas saparariafflants durante 6h a 37 °C em 5ml de Ll/ftwpieillin fiO^a de empâeiiina/iBi de LB)e De cada um dos tubos com cultura removaram-se amostras de !wl e as células foram recuperarias: por centrifugação (3Q00xg duranle 5min.)e Caria uma das amostras de células foi sujei* ta s um choque osmótieo por tratamento com 100jú. de lOmfO Tris-HCle pH8sl durante 30 minutos a 0<ÍC pa:ra libertar o Φ φ '# material para o espaço periplasmatico da bactéria» As caiu* IsS foram remov/idas por centrifugação como anteriormente e O tabrtnadante testado quanto a actividade de hirudina como descrito na Secção V*B* M amostra que deu maior actividade inibidora foi seleccioitade para cultura em Bfeatch% £* Dultura em MbatshB e Isolameoto de -f atp*hirudi«ía ff

Oesaui* A restante quantidade f4»lj da células da amostra maãs acllva foi usada para Inocular illtro de LB/ftmplelliín |S0 jxq de ampieilina/ral de LSj* A cultura foi crescida durante a noite a 37 °C e as células recuperadas por oenlrifugaflo (3000xg durante ISmin)* 0 sedimento de células foi sujeito a choque osmótieo por ressuspensão em 50ml de lOmft Tris-HCl 1H 8,1 a 0°C durante lh« AS células foram removidas da frac-ção peripiasmatica por centrifugação a SEJOOug durante ISmln* D. Purificação de hsn 27 -dessulfato-hirudina

Ο ρΗ da fraeçao periplasmatica foi ajustai© a i*S com NaCl s filtrado através de um filtro de 0,« na)» A protsina foi aplieatfs num sistema de FPLC com ©©lum®

Flono-Q (Fast Protein Liquid Cdroaâtograpfíy* Pharmaoia-LMBl*: equilibrada com tampão SGrfi bis-Tris-HCl pH i>S» 0 mutante de dessulfato-hi r ud ina foi eluido da coluna usando um gradiente salino linear de KaCi 0-3CCmPí em bis-Tris-HCl pH 6*5 durante 45min» Colheram-se frseções de 0,8ml do eluato da coluna e testaram-se quanto a asiividads de hirudina como descrito na SsciçSe 111*9* As fracções contendo a dessulf ato--hirudina mutante foram reunidas* filtradas como atrás a cromatcgrafadas num sistema de HPLG Riilápora-Uaters usando uma coluna de HPLC em fase reversa Brounlee Labs 08 equili*s brada com 0*09$ (v/w) de ácido trifluoroacetico em h^O* 0 mutante de hirudina foi eluido da Coluna com um gradiente linear de 7 a 28% (v/v) de acetonitrilo em G*QS$t fv/v) de ácido trifluoroaçático em H„0 fAsn^"\ - d essul f a t o-h i ru diria tendo um grau da pureza dc cerca de 98% ou mais elui como um pico isolado aos 28 minutos® li - Caraoteri2ação química da proteína J^Aen^J -Deseulfato-hirudina purificada foi carastirl-iSda por determinação da sua composição em aminoácidos* »8-quencia N-terminal e por mapsamento de peptídaos*

Duas a çínco^jjg de proteína foram hidrolisadas em tubos de vidro no vapor de HC1 6N a 110ftC R. L. Henrikson e Se C» fieredith* Anal. Biochem. 136, 65-74 (1984)» Os atninoácidos foram secos sob vacuo* deriv/atizados com fenilisotiocianato B separada© numa coluna de fase reversa f8.A» BidHngmeysrji S. A* Cohen b T#L. Taruin, 3. Chromatography 336, 11-104 (1904)J o A composição em aminoacidos foi calculada usando um peso molecular de 6889 D, •iprossiísadaaientB 50 pmale© de jAsn^j--deesulfato-nirudina foram sujeitos a 5 ciclos de degrada» çfio automatizada de Etiman, usando um eeguenoiatior ti© fase gasosa Applied Biosyetems 470 4 j[R*Lj. Hunfcapiller s t*E»· Hood, Piethotis iui Enzymalogy 91 , 486-494 (1983)]] x para estabelecer a sequência de aainoácidos N-terminal. Os aminoáci-d08 de feniltio-hidantoína resultantes foram separados num sistema da HPLC de fase reversa R.^. Hsuick, fl,U. Hunka-piller, L.E., Hood e ι>»3» Dreyer, 3» Bifil. Chem, 256, 7990--7997 (1901) x usando um analisador Applied Bioaystems ti» po 120.

Para se obter um mapa tie peptitiso© da iBfi j -dessulfato-hirudina, 50 jjq ds proteína foram secos sob vácuo e tratados com ácido perfórmico durante lh a 37°C ["C.H.LJ. Hirs* "Piethods in Enzyrπolαgy,, 11, 197-199 (1967)] Adicionou»se 45 j& tis água fria I mistura ti© r®* acção, congelou-se e secou-se sob vácuo (duas vezes)· 0 mu-tante tis hirwdina oxidado foi dissolvido em 10 jã de SOffiP WH^HCOg e digerido com 1 ^A-g de termolisina (Boehringer) durante 4h a 37°C. Antes do fraccionamento, o produto da di-gestao foi seco sob vácuo e dissolvido em 0,1% tie ácido tri-fluoroacetico (v/v) em H^O» 0s peptídeos foram purificados por HPLC de fase reversa, usando uma coluna Ifftíac C18, equilibrada em 0,1% de acido trifluoroacetico m H^Q* Ss peptídeos foram eluidos com um gradiente linear de 0—28% de acs- •47-\ ο

W

tonitrilô durante 90 minutos* a um fluis de 1 ml/min, ft sepMlííOta de aminoacidoa do peptidao oonlsntte as mutações foi sequenelada como descrito atras para c-onfirmar as substituíções de aminoãcidos Lis 27 Asn 27«.

Exemplo 4 I FHutaçao do resíduo Lis 36 dahlrudlnj para isn 36 36 34 cadeia codificadora A&p Gly Glu Lys Aon da hirudina B*GAC GGT GM Mft AAC CAG TGC 3* 38 iniciador mutagenico % 3?CTG CLh CTT TTA TTG GTE ACG 5» cadeia codificadora 5*GAG GGT GAA AAT AAE CAG TGC 3* mutaganizada Aep Glf Glu Asn Am

Cfectuou-se fnutagsnese dirigida usando o iniciador mutagenico 2 e fil3®pl9/fiirudina exactamente como descrito no Exemplo 3 {Secção 1ϊϊ}« G DNA do plaamldeo transformante fqi designado pIN— III-ompA-*2/HIR-K36[\i e a proteína mutanta foi expressa em E» coli e purificada como das- ''Τ'·, •7

crito no Exemplo 3 {Secção III). identidade da proteína mutante em que Lis 27 foi substituída por fisn 27 foi eonfír* mada pela composição a» aminoacidos e análise da sequência !\l-terminal (Exemplo 3j Seeçeo jy) e as suas propriedades i-nibidoras foram determinadas (Exemple 19),. C mutante foi designado -dessulfato-hirudina.

Eifflaplo, 5 i ffutação rio resíduo Lis 36 da hlrudlna para Uaí56 34 36 38

SQQoeneia codificadora ;sp da hirudioa 5* GaC

Sly Slu GuT G«íí

iWA

hsh Gin AAC CAG

CfsTGC3*

iniciador 3* CTG mutagenico 3

cadeia codificadora 5f GmC mutagenizada Asp εε., CTT CAT TTG GTC ACii* uGT uri.» GTil AAC C*G TGC3» -iy Glu Uai Asm Gin Cys 0® processos descritos atrás para O® E«* xemplos 3 e 4 foram; repetidos usando o iniciador muteglfiiSO 4 para se obter s earacterizsr a proteína mutante pretendi* da em que Pro 4fi foi substituída por Gli 48* 0 Õift do; pias» mídeo transformante foi designado ρϊΚ*ϊΠ-οπιρή-2/Ηϊη-Ρ4Βε* 4 8 0 mutante foi designado Gli -dessulfgto-hirudtna. *s

Exemplo 6 i ffutatçaa do resíduo Pro 48 da,..hlrmdilhs_.para Sli 48 44 46 eadsla codificadora Gly Thr Pro Lys Pr o Gin *ter His da Mttidina 5* SGT ACC CCG λ a 4 CCS CAG TCT GftC 3* iniciador mutagénico 4 3» CCA TGG GGC TTT CCC GAC AGA GTG 5' cadeia codificadora mulaienirada S* GCT «CC CCG AAA GGG CAG TCT CAC 3» Gly Thr Pro Lys Gly tíln Ser His

Exemplo 7 : fíutagão do resíduo Gin 49 da hirudína para 47

sequencia codificadora Pro Lys da hirudina 5* CCG -,AA

Pro Gin Sar His Asn CCG CAG TCT ΕΑΠ AAC 3* iniciador mutagê-nico 5 3* GGC TTT GGC TAC AGA GT5 TTG 5* cadeia codificadora 5’ CCu hnn CCG ftTG TCT CAC AAC 3» rautaoenizada Pro lys Pro Wet Ser His Asn

D@ processos descritos âftls para os E> xempios 3 e 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 5 para ae obter e caracterizar a proteína mutante pretendida em; que Gin 49 foi substituída po» het 49, Q Mft do plas- 0 mutante foi designado^Pet^9 mídeo trmnsformante foi referido como pM-III-< «dessulfato^hirudina.,

Exemplo 8 I $utacaodoresídua Asn 52 dm hirudina para ftietSS

cadeia codificadora Gin Ser Bis da hirudina S* ΕΛ3 TCT CiC

S2 Asn fisp fiAC GAC

Sly Asp GGT CAC 3» iniciador mutagénico

3* GTE

AUA > *rrt i I u TAC CTG CCA CTG S* HG? GAC 3* TCT ChC ATS GAC Ser His Pet Asp

cadeia codificadora iiutagenizada 5* S<íG

Gin

Os processo® dssoritos atrás para os £-xemplos 3 e 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 6 para se obter e eareoterlzar a proteína «nitente pretendida em que Asn 52 foi substituída por F*et 52» 0 DMA do olas-mídeo transformante foi designado pliy«IIl»empâ~Í/HIR«N3tf!# 5 mutante foi designado f^at52^ ~tí©sswlfato«hirud£na* t t

»4fi»

Cxgapljj 9 i Ffatagão do resíduo Hls 51 da hirudina para Asn g|

cadeia codificadora Pro Glo da hirudina 5* CCu CAG

Ser Hia Asn Asp TCT CAC AAC GrtC

Cly SGT 3» iniciador mutagenico 7

3* GGC GTC AGA TTG

CTS CCA S* cadeia codificadora mutagenizada 5» CCG CAG TCT AãC AAC GAC GGT 3*

Pro GTf Ser aso Aon Asp Slf

Os processos descritos atras para os E» xetnplòs 3 e 4 fora® repetidos usando o iniciador mutagéní-co 7 para se obter e oareeieritar a proteína «utanls pretan» didã em que His 51 foi substituída por Asn 11* 0 Qj^fí do pias» tnídeo transformante foi designado pIM-IIl«ompA»t/Hli*H5lÍ* 0 mutante foi designado Γα^π51! “ dessulfato»hÍrudlna* JKK8BB&B. 10 s Flutação do resíduo Lis 27 da hirudina para Gin 27 e do resíduo Lis 47 para Arg 4? â1 Wutaslo de Lis 27 pira Gin jf 27 sequência sodifi* cadora da hirudíne! Gin Gly PCmG fiGT Asn L ys AAC Aáft Cis lie TGC ftTC Leo CTG 3 iniciador BuiaqsniÊ 8A 2 :o i»3TC CCA TTG GTT ACG tag GhC 5 cadeia codifica- 5' dora eutagenizada ‘Cnú GGT Gin Gly rtitC C.-jfV Asn Gin TGC A TC Cys lie CTG 1’ Leu e s Pytacão de Lis 47 paga árc 47

cadeia codifica- Gly Thr dora da hirudina S* GST iCC 47 Pro Lys Pro Gin Ser CCG ΛΛΛ CCG CftG TCT 3*

iniciador «yta< génico 8S 3* CCh TGS GGC TCT GGC GTC AGft 5' cadeia codifica* lf G3T ACC dora wtifeagenizada Gly Thr CCU AGA CCu CAG TCT 3* Pro Arg Pro Gin. Ser

Ga processe» descritos atras pera ae E* xemplos 3 b 4 foram repetidos usando os iniciadores mutep nicos BA © O· para se obter a csracterizar a proteína tnutan* fce pretendida em que Lis 27 fai substituída por Gin 2? ®

Lis 47 por nrg 47. 0 DN.-\ do plasmídeo transformante foi designado pIi*III*d«Pr't*2/HIS"Mt7^t K47R. 0 mutante foi desig- « f

Arg47] •“rfessu If a to-h i r u d ι π a; * sj

Exemplo 11 i Mutação do resídua Lis f 2? da h firudina para Gin 27, o resíduo Lis 35 para Cin 36. e do re- síduo Lis 47 bsjps Ara 47 h I Mutação de Lis 36 para Glp ι 36 cadela dora da 34 oodifica- Αβρ Gly Glu ; hirudina S* GsC GGT GAA Sfi Lys As AÃ A Afí 3B to Gin :E CAG Cys TGC 3* iniciad genico or muta- g 3» CTG CCh ETT GTT TI m GTC ACG 8* cadeia dora mL codifica- 5» GàC GGT GAΛ itaQsniiadt ftsp Gly Glu CA A, A# Gin As IC CAG m Gin TGC 3* Cys 8 I Mutação de Lis27 para Glr>27 A mutação de Lis 27 para Gin 27 foi afae» tuada de acordo com σ exatas lo 10.** C ι ifotasãd de Lis 47 para Aro 47

n tiiuts^ao de Lis 47 para àrg 47 foi e-fectuada de acordo eea c exemple 10E« 0 processo descrito atras para os Cxem-plos 3 e 4 foram repetidos usando os iniciadores «utaglnieos 8A* 9 e QB para se obter e caracteriaar a proteína mutanta pretendida em pus Lis 27 foi substituida por Gin 27, Lis 36 fsi substituida por Gin 3§ e Lis47 foi substituida por ítra 47* 0 DNA do piasfflídeo transforaante foi designado pIN-«III«OffipA~2/HIR-K27Li, K3S«í.*. JC47FU Q mutante foi designado Gin3®, Arg42] -dessulfa to-hi ru dl n a.

Exemplo 12 ϊ Putagao do resíduo Lis 36, para ârg 36 e do re-síduo Lis 47 para Arg 47 Á * ^otagSo de Lis 36 para ArQ 36 34 36 38 cadeia eotíifiee· Asp Glf Glu jLy.S: «so Glb Cys tísrs da hirudânaS^GAC GST GA*· AA& A8C CAG TGC 3' iniciador euta- 3*GGT CCA GTT TCT TTG GTC AEG S« genico 10

CfiG TGC 3' Gin Cys cadeia oodifi** S^GIE cadora «aitage* Asp nizada GGT GAÃ Mà AAC Giy Glu ATg Asn

1 1 Mutação d® Li a 47 pare Arg 47 tuada de acordo e 1 mutaçao de om o bkamplo lis 47 pata Arg 47 foi efso-1 U 3 « Us prooesso® deserito® atfis para os Lxem- plaa 3 © 4 foram repetidos usa ndo os iniciadores mutageni- cos 8B e XQ para '4 se obter e caractetizar a proteína mutante pretendida em ou® lis 36 foi substituída por Arg 36 b Lis47 foi substituída p or .i.rg 47* □ Ofj; do plasmídeo transforman- te fgi designado pIN-in-ompA* Z/HIH-K36Ri R47R. 0 mutante foi designado |âr 36 47 Ί g j nrg J* dessulfs to-hirudina. Eisaelo X3 i Wuta ção do resido o Lis 77 para Arq 27 & do re- síduo xis 4? para mtq 47 h 3 Potaoao de Li s 27 para Arg 27 25 27 29 cadeia esdifioa- Gin Gly ido Lys Cys Ile Leu dora da hirudíne S* Cíu OGÍ jAA TSC A TC CTG 3* iniciador «uta** gênios 11 3» GTE COft TTG TCT AEG TAS G^C i* cadeia codifica- 5» CA5 GGT A AC AGA TGC ATE CTG 3* dora mutagenizada 51n Gly ;sn irq Cys Ile Leu

S * ^otifcag de Lig 47 paira .«irg 47 „ è. Mitoses d® Lis 47 para Arg 47 foi efec-tuada d® aeerdo emn o exsatplo 100«

Os oroesssae daseritos atrás para os Exemplos 3 e 4 foram repelidos usando os iniciadores mutagéni-cos 8g e 11 para se obter ® caraeteri^ar a proteína mutaille pretendida em que Lis 27 foi substituída por Arg 27 e Lisif foi substituída por Arg 47« Π DKA do plasmídeo transformai!» te foi designado ρΐΜ»1ΙΪ«ο®ρ«·»2/ΗΙΠ-Κ27Ρί K47R, 0 mutante faí designado

m 3 dassulfato-hi rudina» » r 77 gg 471 Exemplo 14 i Extensão do oxtremo G de |Gln ê Gin Arg l· »dsssuifato-hírudina epm up res ina 1 3 S cadeia codifica- signal saa* Mal Mal Tyr Thr Asp Cys dora da hirubina 5* GCG CftG CCG«*« «3TT GTT TAC ACC GAC TGC 3<« iniciador muta gênico 12 3» CGC GTE CGC C£x CrtA CAΛ TGG CTG AEG S« cadeia codifica- S* GCG CA3 GCC CGT GTT GTT TaC ACC GAC TGC 3* dora putagenirais signal sea* Gly Mal Uai Tyr Tbt isp Cys

Os procesee® desentoe atrás nos Exemplos i e 4 foram repetidas usando os iniciadores lutagéni-cos 8A# 81| 9 e 12 para se obter e Garacterizar a proteí-

p nrt: 2 C na mutante pretendida i« pui o extremo N da I Gin ., Gin00, 47 Ί

Arg I - d e s s ulf a t o - h i r U di n a foi prolongada com Gli* ,i pro- tema foi designada Glieií- |Gin " * Gin" , «rg J-diesul-fato-hirudina*

Exemplo 15 ; Extensão do extremo N de r1r27 .47 471a-l· des* sulfato-hirudina com um resíduo.metionina cadeia codifica- signal seq»

Vai Vai Tyr Thr k&p dor a da hirudina 5' GCu Cu tG GCC * * » GT T GTT TAC ACC G‘lC TGC % iniciador mutã» # , 3* CuC G' génio© 13 rc CGG TAÇ c 'AÀ Crtri / ATS TSE CTG ftCSS cadeia codifica- 6* GCG CJ %G GCC ATS £ ÍTT GT1 e TAC ACC SitC TGC3 dora mutagenizada s&Q* sinal ftst | ?al líal Tyr thr .Isp Cys 1 Os proí 3-assoe desci 'itos £ tt itras pera os E- MSínplot 3 e 4 foram repeti ias usando c >s inic dadoras mutage- nicos 8A, 88 e 13 para se abter e cara letería ar a proteín a mutante pretendida em que ε ϊ extreme H ria jjíl n27, Arg47J m -dessulfato-hirudina foi pj rolangada eo ffi Plet» A proteína foi designada aetienil - j^Gln^* '# Ar|7J -d© seulfe bo-hirudina*

Exemplo . 16 i Expressão ris ^sr|27J "rigioulfato-ftlguriinã em levadoia j*Asn^ jj «tíeesulfsto*hârudIna i uma pro- tefnm mutante com uma troes d» amínoacidos Lis «4 «\Sn * a Qual foi conseguida por mutagénese dirigida (ver exemplo: 3)í A ilatiage® da sequência codificadora do polipeptideo mutagenizade na vector pIN-H!**»ipè*2 foi descrita no Exem» pio 3 II. Para expressão em levedura a sequência codifica* dora com a mutação adequada foi inserida num vector de ®x» pressão de levedura adequado, proporcionando um promotor constitutivo forte, uma sequencia sinal dl levedura s um terminadar da transcrição do elvedura para construir uma cassete de expressão funcional» L· * π m

Isolamento .da sequencia codificadora de dessulfeto-hirudina p m* 11I-ompA-2/HIRK m 25g do plasmídeo (vet Exemplo 3 III) foram digeridos com Xbal e BamHI* 0 fragmento Xbal-BamHI de 0,3 kb foi isolado num gel preparativo de 2% de agarose. Q D NA foi eleefcraluido e precipitado com etanol. 0 fragmenta Xbal-BamHI aompreende a sequência sinal ompA a a sequência codificadora ri© hirudino mutageni- zatíâ» 0 fragmento foi ainda cortado com Hinfl, a qual cliva Hl posição de nucleotídeo 22 dentro ria sequência da hirudi-na, D fragmento HinfI-úamHI da 176 p.b foi isolado como descrito atrás. Este fragmento de DMA codifica -des** sulfato-hirudina. - r o 7 9 1 Clonaqem da ggguBOGia_ codificadora de ,,sn -desgulfato-hlruritoa. num_vegtog de eiprassap de levedura 0 plasmídeo de levedura p3DB?07/GAPFL»HIR (ver Fige 2, pedido de petente Europeia Ne 225633) foi diga-rido com Bali. Existem três sities Bali* um na sequência sinal PHÇ35 9 dóis no vector. Isolou-se o fragmento Bali de 1,3 kb que contêm as sequências do p8R322 desde o sítio Bali ate ao sítio BamHIf uma junção BamHI/Ogin ao promotor curto constitutivo GAPFL 8 a sequência sinal PH0S atê as sitie Bali.

Dois oliqcnucleatídeos sintéticos da fOracle»

Bali Hinfl (D s* CCAftTGCAGTTGTTTACACCGACTGCnCnS 3* (2) 3* GGTTACGTCAACAiiaTaTGGCT·* ÍÍGT3GCTTA B* formam um adaptador do Dfi-i de cadeia dupla, o qual proporciona oito nucleotídaos desde o sítio Bali ata ao extremo da sequência sinal de ΊΗ05 e 21 nucleotídeos da sequência codificadora de hirudine atê ao: sítio Hinfl (não indicado na Fig. 2). Qs oligonucleotídeoe (l) e (?) foram foeforila-dos individualmento em lEjuol de êCmF Tria-HCl pH7,5, 10m^ WgClg, Smfi DTT, Ο,ΒβΡ1 .TP e 27U de po 1 inucleotídeo- c i nase d» T4 (Boetiringer) durante 4S minutos a 37Dc. As misturas de reacção para os o1igonuc1ao11deos (1) & (2) foram: combinadas aquecidas durante 10 minutos a ?SeC e deixadas arrefecer a* \

>ss« te â temperatura ambiente* 0 oligonuoleotideo adaptador emparelhado foi guardado a -20oC. uuas pieamoles do fragmento ds D'Im Bali da 1*3 kb foram incubadas durante 16h a 15°C 00« u« excesso de 100 i/ezss do oligonucleotídao adaptador emparelhada em 10jx\ de δΟιοΙ'Ί Tris-HCl pHlgS» lOsitf flgCl2» Smffl DTT* 3#5ml»l ATP e 400U de DSA-ligase de T4 (Biolabs). Após inactiuação da DNA-ligase de T4 durante 10 minutos a Ô5°C o adaptador em excesso foi removido por precipitação do DMA na presBnça de 10mn EDTA, aestato de sódio 30Q«f*i pHfi#G e 0*54 volumes de isopropassol® 0 DNU foi digerido com Sall» Os fragmentos resultantes foram separados num gel preparativo de 1^ de a-garose· 0 fragmento de 564 pb foi recuperado do gel por e-lectroeluição e precipitação com etanol* 0 Qf4A foi ressus» penso numa concentração de 0*1 pmoles/jjJI* Q fragmenta Sall--HinfI de S64 pto compreende o fragmenta de OiA do piRSH" SalI-BamHI úe ?fi pb, a'promotor UAPFL,* a ssgoaneiâ sinal de PH05 e $ saguineia codificadora da hirutílna ate I posição de nucleotídeo 22 feitio Hinfl|« 0 plasmldeo p3D92if/DAPFL~HIR (var atras) foi digerido com Sall e BamHl e isolado o fragmento: vector iall-iamHI de 6,7 kb. 0 fragmento vsetor também centsm o terminador da transcrição PH05*

Tris fragmentos de DfM* isolados goto descrito atras® foram ligados na seguinte reacçao· D^Tpmolea do fragmento Sall-Hinfl da S64 pb® 0,2 pmolBS do fragmento vector Sâlí-BamHI de 6 s 7 kb foram ligados em IQ^tti tíe SOffift Tris-HCl pH7,5, lOmf! NgClg, Sm» DTT# lm<*i ATP m 200U ris DNA* -ligase de T4 durante 6h a 15°C. Uma amestra ria 1 jXl da mistura de ligação foi adicionada a 1D0Jll de células E.coli —56—

tratadas coai cálcio compstentea para a transformação* 12 eolonias transformadas resistentes I ampieillna fora» cultivadas m maio Lô contendo 100mg/l de ampieilína* C úMã de piasmíriao foi preparado ^Holmes et* ai** Anal# iiocham« llê (1561}» 193^ e analisado por digestões duplas com 3amH3 e áall# r.s junções na mesma gralha de leitura do adaptador a sequlnoia sinal e a segutneia codificadora da hirudlna foram confirmadas por eequeneieçSo de ONA (jSsoq© et al., Proc.» fóatt» «eatí* Sei# IiSíi 74 (1977), S463 * ha olons com a seguancia cometa foi designado p30SlQ7/GAPFL-HÍR“ -K27K·

De modo anllogo sonstruiram-se plasmltíi* os para expressão em levedura de pIN-in-0«pW2/HIH*K36Sí (Exemplo 4 ), pIK«in-aapA-2/HIR-K36V (Exemplo i }* pIN— 111-omp-:'.-2/H I;R-P4BG (£Χ®«ρΧα 6 ), p I i\— 111 — om p n* 2/Hlil««4ÍF Cexemplo 1 }» plN-III-ompA"2/ri 1K*fí62F· (Exemplo 8 ), pIN-III-ompi«2/H13-H51H (Exemplo 9 ), pIN-III-ompV2/HIMTO* K47R (Exemplo 10 J, pIN-III-ompp,-2/HIR-K27'j* K36Q* R47fi (Exemplo 11/}* plÍ»IU«a®pii-2/HIfi«fi36ft* 447f? (Exemplo 12 }* 8 ρ11\1“ϊII-crnpη-2/ΗI“'ί-Κ27r5, K47R (Exemplo 13 ),

Cs plasmideos de expressão em levedura resultantes foram designados por

p30íi2u? / 3 a PFL - H K3õí\ls P3D3207 / G-xPFL - H '1:1 - K35\J, P3DB207 / GA PFL “ H slfi - P48G* P3D8207 / GftPFL - H iJR ** 749FS P3DB207 / GAPFL - H IM - N 5 2fl j P3DD207 / ET PFL » H ilR - H51N * P3DB207 / GaPfL - H !3R - K27L, K47R ρ3082ί]7 / GaPFL - H liR « Kssa P3DB207 / GTPFL - F !IR - K36R* K47R pJG62Q7 / uriPFL - h US - K27R, K47R K47R* e

Exemplo 17 : Transformação de Saccharomyces cerevisiae estirpes GHF18 e BT246

Saccharomyces cerev/isiae estirpes GRF18 (OSP* 3665 § , his3-ll, hig3-15, 18U2-3, leu2-112a canR) e KT246 *68-

(DSfa 4084 «f jeu2-3, leu2-11?, prb) foram transformados com os plasmídeos para expressão em levedura descritas na Exemplo 168 usando o protocola de transformaçao descrito por Hinnen et al* £pree* Natl» ftsad* Scie USA 75, 1129 fls sllulae de levedura transformadas foram ssleeeionadas em pises® is meio mínima para leveduras deficiente em leuoina* fts colonias de levadura transformada® individuais foram is»*· ladas e designadas

Saccharomyces cerevisiae GRF M/p3G31Gf/GAP FL -Η Ϊ R-K 2? fí * Saccharomyces cerevisiae GRF18/p3D82G7/GAPFL-H1R-K36M, Saccharomyces cerevisiae GRF 18/p308207/GA P FL-HIR-K 3 6 V, Saocharomyces cerevisiae GRFlS/p3332C7/GAPFL~HÍR~P48G, Saocharomyces cerevisiae GRFX8/p3D32G7/GAPFL~HIR-Q49PS, Saccharomyces cerevisiae GRF18/p3DB207/GAPFL»HIR-MSfP, Saccharomyces cerevisiae SRflS/p308207/GlPFL-HIR-HSli, Saccharomyces cerevisiae uRF18/o3D8207/GAPft*Hii«K27ãg K4T8* Saccharomyces cerevisiae GRfi8/p3Q82G?/GftPFl*HJíWC2?3* K36Q, «478,

Saccharomvcea cerevisiae SRF18/p3DB207/GftPFL"HIÍHK36B* K47R, SacoharomycBs cerev/isiae GRflfi/p3G8207/GAPFl-HlR-K27R, K47R, Saocharomyces cerevisiae HT146/p3D82G7/SAPFL-HIR«íC27rt* Saccharomyces cerevisiae HT246/p3D82D7/GAPFL-HIR-K36M, Saccharomyges cerevisiae !HT246/p3DS207/Gíí?FL«HIR-KSiV, Saccharomyces cerevisiae HT246/p30B207/GAPFt-HIR-P4BG, Saccharomyces cerevisiae H1t46/p3D82Q7/GftPFE«HIM49?'i9 SãCoharamvcee cerevisiae íITf46/p3D0207/GAPfL-HIR-W52Fi, Saccharomyçes cerevisiae HT246/p3P6207/GAPFL-HIR-H5lNs Saccharomyoes cerevisiae HT246/p308207/GAPFL-HIR-K273s K47R, Saccharomyces cerevisiae HT246/p3D8207/GAPFL-HlR-K27Gs K36Q, K47R,

Saccharomyces cerevisiae HT246/p3aB2D7/GSPFL-MIR-K36Ri 14711 e Saccharomyces cerevisiae HT246/p308207/GAPFL“FlR-K27R, 1471*

Eiemplis. 18 I Fermentação dos transformanteg de Saccharomy-CB3 cereyislae Células dos transf o rra antes de cerevisiae GRF18 β HT246 fora® cultivadas separadaroente em lOml de mei o mínimo para leveduras (Oifco Yeast flitrogsn iass sem a®i~ nolddos a gu« se juntou 2,1 de glusess e fQmg/l de l~histi~ dina) mau balia Erlertneyer de Sumi com agitação a S0°C du-rants 24 horas afee uma densidade de 3x10' ealulas/ml*

Pare a expressão constitutiva m secreção das ggplciss de dessulfato^hirudinas mutagenlradas as células foram cultivadas num meio complexo consistindo em |g/l) péptona (5), extracto de levedura (10), glucose (20), sucro-89 (40) , sulfato de amõnio (3), ΚΗ,,ΡΟ^ (2), FlgSO^ (0,5),

NaCl (0*1), CaCl2 (0,1), biotina (10jutg/l)· Obtiveram··®® a* proximadamente 10® célules/ml após 4Q horas de incubação a 30°C e 200 revs/min»

Exemplo 19 1 flicuperaçao de,mutantes da dessulfato^hlrueUna a.partir de 5« cerevlslae cultivada numa esoa·* la de SOI 0 caldo de cultura foi misturado ccm imberlite XA0-7 e submetido a adsorção durante caros de 4 horas a 25°Gq As células foram separadas da resina numa coluna. Apos lavagem com 111 NaCi a resina foi elulda com tampão Tris

(50mPll, pH7,0 - 8,5)* fracção principal (301) foi ajustada g pH 2,9 s aplicada rtuma coluna de S-Sepharoee (Amlesn PM, equilibrada com tampão de formiato de amónio 25mívls pH 2,9) tendo um volume de 2 1* Apô© lavagem com tampão de formia-ti de amónio (40ml% pH 3,6) a eluição foi feita com tampão de formiato d® amonio (SGmíí, pH 3,8)* A fraeçlo principal do eluato (10 1) foi concentrada por meio de iw sistema de ultrafiltração Filtron finisaftt? equilibrado digo equipado com uma membrana 31# lima quantidade ri» 0,5 1 da solução límpida de proteína resultante* foi aplicada numa eoluns de iio-Gel P-6 fine (Amicon GF equilibrada com acido goeti.se a 0,5^) tendo um volume ri» 1,5 1* Λ eluição foi feita com Q,5$ acido aeltioo* A principal fracçao do eluato (l 1) foi concentrada por meio de ultrefilfraçao © subseouantseente aplicada numa coluna d» fluio rápido w-Sepharose (Amicon PA, e-quilibrada com tampão de formiato de aaeni© 25»f!# pH 2,i)f tendo um volume de 2 1« A sluição foi feita com tampão de formiato de amónio (50mf‘, pH 4,2)* a principal fracção do eluato foi concentrada por msie de ultrafiltração § subsequentemente diafiltrada contra agua# Λ solução aquosa límpida resultante foi liofilizada* 0 sólido consiste em dessul-fat-hirudina mutante pura. S^gitpio 20 i Cgracterliaclo cinética 4 5 Preparação e caracterização da tromblnai A trombina foi purificada, a earacteirrada como deâcrito por 3.R. Stone i 3* Hofsteenge [Biochemistrf 25, 4622-4628 (1986)] « * concentração de trombina activa foi -61- determinada por tiiulaçãs de sítios actlvos com 4-metil-um--iiilfsril-p-guanidinobenKostto [dansen, Robsrtsg DeV*, âdSKSf R.U» j Kyle, y«S*A. e £Ímores D« T. Biochamistry Ώ* 131 lOi-llf (1973)] * 3 l ínsalos enzífflátiDOS ,i libertação do p-mítroanílina que resulta da bidrolis» dos substratos peptidil-p-nitreanilina pela tram-bina I seguida da medição do aumento de absorvSncia e 40inm com m «spectofotóraetro Shimadzu CU 240* Cs ensaios fera» sfseittãdos em cuvetes de polistireoo a 37°C em tampão 0*06P Tris-HCl* pH 7,8, o qual contam C#l/i de polietllenoglicol fiOOOf 0*1P NaCl s substrato p-nitroanilida* 0 substrato D--Ual-beu-ârg-p-nitreeniliria (5~226Sf Kabi Mitmm} foi usado numa «enssntração de 3ΰ*.„*ι" am experiências de titulação de ligação farte as quais são usadas para determinar a concentração de hirudines mutantes* Para tais ensaios I usada uma concentração de tfôíflbina de 1,0 nf.» C substrato D-Fen-pipa-colil-Ari-p-nitreanilido (3*2238j Kabi Uitrum) numa concentração Ú9 100 M e uma concentração de trombínã de 20 a 30 ρΓΊ foram usados «i experiência© de inibição lenta de ligação para determinar as oarasterfsticas cinlticae das hiru-dinâs mutantes (var abaixo)* 3e ensaios são. iniciados pela adição ds troabina* Quantidade de produto· formado foi cal- 1 Ϊ culada usando um coeficiente de absorção de 9920 Pi cm para p-nitroanilina a 405 nm e m concentração do substrato foi determinada por espeetofotometria a 342 nm usando ua coeficiente de adsorção de 027U i'· Vem ^ Qjattenberg, R. & 3a-* ckson C<*Fl#f Biochem, dicphys» ,,cta 742, 530 - 564 (1983Jj» C i Teoria cinstlsa 8 analise de dados

TifyljtcSo ria iisaggto fartei à inibição de um» enzima na presença de um substrato pede ser representada pelo seguinte mecanismo (Esquema 1): k E4*5 4*

ffi 7

ES ----—-r E+P I 1 4 k 2 o ESWEWft 1 «mmmmhmmmméíhímmíím: « dissociação de inibidor (Kj) a igual a Kj/K·^* Se ε ligação do inibidor 1 enzima provocar um abai* xamento significativo na concentração ria inibidor livre* a variação da velocidade do estado estacionário (\I ) sem m concentração total de inibidor (l^) será descrita pela equa* ção (1) [f^òrrisôn, 3*f** Brochem. Biophys. ftote ,181» £<36*286 ¢1969)| Henderaon> Ρ*3*Γ*#

Biochem. B* 127* 321** (1972)] ϊ \l.

+ 4Kj,Et) - (Kj, t It - Et|

ÍO onde V I m velocidade observaria na eussneia do inibidor* E. » 0 ~ψ t e a concentração total de enzima i Kj, la constante aparente de inibição. Se a inibidor e o substrato competirem para o sítio activo* Kj* esta relacionado com a constante dl tfis-

sociação do inibidor (Kj} pila equagao f2)* RIt * Kj (i - S/Kffll (2) onda § i i concentração de substrato e lR i a sua consta»·* ta da fôleheelie* Se a concentração da ©mima ou inibidos nao for conhecida com precisão, um factor adicional pede eér Incorporado na equação (1) para ter ©m conta este fse·* to 9&1ίβ*β» 3»y«» e forríson* 3*F», fiethods Enayeel. 65, 48?«4fi? (3&?9} * Para « inibição da trombina pela hirudi** na, a concentração de trombina I conhecida a partir da ti-* tulaçio do sítio activo mas a concentração de blrudina I conhecida apenas pelo peso © os resultados podem ser analisados is acordo com s equação (3}s

If UQ B —δ» |sQr ((Kjj+ + 4KpC|) * (Mj (2) onde ϊ I a concentraçlo do inibidor em termos ri» peso por volume & m ! um faetor qu»f quando multiplicado Juntaaent© com Ιχ, riarl & concentração molar do inibidor»

Kss experiências de titulação d» liga*» çãd forte, a constante dc dissociação pera m hirudina © a sua concentração Q determinada mantendo a concentração1 de trombina conetante e variando a caneantração de hiurdina numa gama qus inclui varias concentrações que são inferiores I concentração de trombina e virias concentrações que •34- *

sao superiores. Q número total tís pontos de resultados e geralmente entre 7 @ 1C. As velocidades dg fase estacionaria Obtidas para cada concentração ris hirudina é então a-dapfcads I equação (3) por regraasSe não linear pesada* Pa- •t Φ& ra a rogressasg as valores observados para a velooiddd» do êitado'eataeionlrio sao pesados tf@ acordo com o inverso do seu valor* Este tipo de pesagem verificou-se empiricamente dar os melhores resultados fstons, 3*R« 8 Hafsteenge* 3. iiíochemistry 25, 4622-4628 (1986)1 *

Inibição lenta da ligação fortes Se a velocidada da interaDção do inibidor com o enzima for lenta de modo PUS a velocidade do estado estacionário inibida é apenas lentamente conseguida5 a curva de progresso da formação d® produto para o «eeanismo do Esquema 9 sera descrita peia e-quaçao (4) jjCha, 5., Biochem· Phermacúl· ,25» 269S-270? (197Ó)$ Williams, 3*11** t”orrison# 3»F * , e Quggléby* R*G., Biochemistry 18, 2567-2573 (1979)1 § P « fL,*t + i -υ )(i-d) 0 sJ K ' i«d*8xpC-Í* d»k* l«d onde P e quantidade de produto formado no função ê!b It e KjS e K ’ são uma função m t, d s uma :es parâmetros e a constante de velocidade de aspociação df segunda ardem ,5 para a interseção entre o inibido* © a enzima (Gfta st si*! supra). Para determinar os parâmetros cinéticos dos »«·* tantss de hirudioa* os dados tír curva-progresso obtidos com -65-

pelo menos seis concentrações diferente» de hirudina fora® adaptados a equação (4) por regressão não linear* Esta análise dá estimativas pera Kjf* Kj* a a constante de velocidade de dissociação· observda (K j f)« Foi práviamente demonstrado que O valor de X^, I independente da ligação do substrato no sitio activo mas que os valores obssrvadôê de K21 e K|| deverão ser divididas por (l+[sj /«m) de modo a obter-se OS verdadeiros valores e Kjj 3.R. Stort» e 3, Hsfstsafigs* 'iloohemistrf 25$ 4622-4623 (1986) $ Stone, S#R., Braun* P*3*# e Hofsteenae* 3» Síochemistry 7Gf 4617-4624 (1987))* Pari estes cálculos foi usado 0 valor prlviamente determinado de 2S6 K para 0 d® O-Fsn-pipecfllii-Arg-p-niiroaniiida £:Hofst9enges 3., Toguchi * H«® e Stone* S.R*, Biocham* 3* HS?» 243-251 (1986)J . Usando estas métodos cinéticos obtiveram-se os seguintes valores pare Kj 8 forma de dsesulfato-lii rudina (r-H) 10“8 , f"1 * s" ki K -1 I(pn) d e s s u 1 f a t o-fi i rudina recombinante 1*37 í 0.G3 0*231 í 0.006 [Gin27, Arg^-H uca í 0.08 1*85 t 0*04 *! mtm Ml ««»*« e* *4>ο*μ· ***>·· ΓΓ, 27 36 471 [Gin * Gin , Mrg J tm mmm, mm, m.m, m m.mm.m mmmmmmmmmmmmmm, mm m. m:mmmwmmm,m 1 -H n.d. 1*39 - Q.02 (n.d. a não determinado) -66·*

Exemplo 21 I Composição farmacêutica contendo uma dessulfa-to-hirudina mutante paga administração parep»* térica

Uma slução contendo ua awtante de dessulfato--hirudina de acordo com qualquer um das Exemplos procedentes foi dialisado contra uma solução de ϋ99% de NaCl. A concentração da soulção foi então ajustada por diluição itt a mesma solução de fáaCl para 0,2 my/ml ou 2 mg/iil* Estas soluções foram esterilizadas por ultrafiltraçSe Cwsmb^enas GOfn pòros de Qs22jjjn).

As soluçoes esterilizadas podem ser usadas direotaaenits por exemplo para administração intravenosa#

Deposito de microorganismos

Os microorganiswms que se seguem fora» depositados na Deutsche Sammlung mn Rikroorganisment (D*P)* Flâscherodar y@g 1b, D-3300 Sraunsofiueig (FRG)« «ieroorganisse data de depósito/ «utiere de aceg-

Saccharomyces osrevisian Saccharotavcas carevisias 4 ds Ferço 1986 IS de Abril 1987 DSP SfiiSosr* âoai

Claims (1)

1. ****** «6?~

   BI IMIiPICfiCLLS 18 * Processe para a produção de mutantes da dsssullsto-fiirudina tenda a seauencia de amino-ácidos ie tt^2e^tfal«Ti;r'-:Tre«:’sp«Cis»Tr8«jI:u«yar-Glí« ?c *'5lP>Asn-Leu->Cis-l.eu-Cis«SlUwSli«’ijer*Asn-« 30 «¥al.-Cis-Gli-Gln»31i-Msn- Z^»Cis«Il$s-*L©u« 40 ^GliMIsr-Λs p^Bli-GIu*·* Zg^.Vsn»Gln*Cis-Mal- 5G :»Trs»BÍi*Giu*GliwTnewProw Ig~-Ser» Í0 «* Zq- Z g-* A ©p- G l i— A s p - F ê n - Glu-Clu—II e— P r o-~GlU«Glo^T ir^Leu-Gln-GB Ci) onde I represento Mal ou o* radicais dipeptídile Gii-Val ou KeMel, Zj & Lie» Glu* ssn, teu» arg ou Mel» lg repto·* ssnie Cie» Atg» «sn* Leu» Atg ou Mel, Zg representa Lie, átg, ftsn, liai. Leu ou Glu, l^ representa Lis» ,srg, :,sn, Mal ou Leu, Z^ representa Bro ou Gli, Zg e Z? indepsndentement© um do outro representam Glu» .,sn ou F.et © Zg representa His, Glu ou Asn» eos exeepção dos compostos de formule 1 em qu» ZQ representa Mal, 2« representa Lis ou Gin, Zg representa Lis ou Gin» Zj representa L is, representa Pio» Zg repte* \ \****0^ _5δ. senta Gin, 2β representa Glu ou His e Z? representa ;'sn g seus sais* caraeteriíado por compreender a cultura de uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada coi um Λ 'ÍÍ0 uector híbrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo mim promotor Operacionalmente ligado a uma primei* m aegulnoia de DiA codificadora de um peptldeo sinal liga* do na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DSíA codificadora do mutante de deeeulfafe-hirudina e ume sequência de iil ssntendo sinais ria terminação da transcrição © isolamento de mutanta ds dessulfato-hirudina e, caso se pretenda* conversão de um polipeptídeo obtido tendo grupos earboxil© e/ou amina livres* num sal* ou conversão de u» sal obtido no composto livre* 2« - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzirem mutantes da rfessulfa-tó-hirudina da formula I, m pus Z representa lísl ou os ra-dinais dipeptidilo Gli-Hal ou Ket-l/al, representa Lis, GIu, Asn ou «rg, Zg representa Lis, Arg, Asn, Vai ou Gin, 2^ representa Lis ou ãrg, Z^ representa Pro ou Gli, 7^ representa Glu ou Met, 2g representa His ou Asn e 7η representa Asn OU ftet» com excepção doe compostos da fórmula I em que ZQ representa Vai, Z^ represente Lis ou Glu* Z? representa Lis ou Glu* Zg representa Lis, t^ representa Pro, Zg rspre-senta filu* lg representa His e tj representa Asn e seus sais, 3® * Processo de acordo com a reivindi-eação X, e«afA«*iZade por produzir j>sn27J -dossuifate-hâ-ttídina* \ κ**«**~* 4**· - Trocateo rip acordo com a reivindicação I* caraotsrizado por produzir ^sn3f5J -dessuifato-hi-tudíns* SP - Processo de acordo gem a reivindi- m : Γ *í f. “] saçaa lf Cârseisrizâcfc por produzir ;_i'ar J «dessulfato-hi-rudloa. 6Γ - Processo ds acordo eo« a reivindí» cação 1, carecteriíatío por produzir joií^a rudina. ] <dessulfafe«hâ* fr » Processo da acordo com a rei yindicação 1* carecierIrado por produzir jpef^J -dessulfais-di* mâím» 0- - írocessq de acordo com a reivindicação 1* carocterlzario por produzir -dessulfato-hi-tudína* 9? cação 1* caraclerizada rudina. « Processo de acordo com a reivindi- por produzir JT-bfí^J -riessulfala-fti- lu^ « Processo da acordo cem a reivindi** MçSo l, camstaripado par !»odU>l* [31n”, i rg47J -dessul- fato-hirudina#

   0S0**** -7Γ- 11; « Processo de acordo cora o relvindi-· cafso I* saraoteriíedo por prodmir jjSln27, Glo3®* Are*7*] -d eeáírtf alo«h 1 ru dloe* m reivindica·-«deaaulfa- çao 12« » Processo de acordo com p* 3S 47' 1, cereetarixatís por produzir Ura > ira te-hárudina* 13? - Processo de acordo eow a reivindi- 2? „__47Ί ^ casão 1, «aracteriza*, por pardu»£ [\fg f m to—hirudina« *dea#ul~ 14? * Processo de acorde eo« a reivindi- [* - 27 3S Bln , Sin "' , - Arg"*' I -dessulfaio-hirudínao com a reivindi- ' 27 „ . 47 η Gin , «rg J - 1SS - Processo de acordo caçao, caracterizado por produzir Betionil--dessulfata-hirudina* 16í. * Processo para a produção de* uma composição farmacuetica caracterizado por so misturar U® mu-tanto de dessulfato-hirudina da Formula I, que pode ser pro» duzidõ de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal fana* ceuticamente aceitável oom ua veículo e/ou aditivos Ferma-ceuticamente aceitáveis* de medo a obter-se ume concentração finai de 0,001 - 75/3« 17® - listado para a utilização de um mu- 1.____******** I

   tante da dessulfato-hirudina da formula lâ que pede set produzido ds acordo com a reivindicação 1» p®r» O tratamento profiláctico ou terapêutico do corpo humano ou de animal caraeterizado por m administrar 0,001 a 20 mg do referida composto por kg do pese de corpo por dia. li?4 - f'átotío oarc a utilização de* um mu* tante da desauifato-hizudina ria formule I* de acordo com a rsivindifieçlb 17» caracterizado por o referido mutanto ser usado no tratamento ris tromboses, tromboemboliomos, eoagu-lopatias tuberculosa® 8 choque agudo* 19·” - Processo pare a produção d» um vsc-tor híbrido compreendendo um» cassete ds expressão oonsis** tindo num promotor aperaeionalmente ligado a ume primeira sequência dc DN.t oodificccora de um peptldso sinls ligado na grelha de leitura corrscta a uma segunda sequência de Oiâ codificadora ds um mutantn da dsssulfato-flirudina que pode ser produzido de acordo com 3 relvindiceção 1, e uma sequência de 0N.·’. contendo sinais de terminação ria transcrição, ca-racteriZado por compreender o ligaçao da cassete de expressão consistindo num promotor operecionelmente ligado a uma primeira sequência dr Oh., codificadora d» um peptldso sinal ligado na grelha de leitura corrscta a uma segunda sequência ds 0ΝΛ codificadora do mutanta da dessulfato-hirudina e uma sequência de QftU contendo sinais da terminação da transcrição· ou os constituintes da cassete de. expressão a fragmentos da DÍh CONTOíOO marcas gsnltiea® selsotâvas e origens fite rspiicaçl© para o hospedeiro microbiano na ordem predeterminada. 2L··· - ? recesso para a produção de uma ©a- »72* »72* £ tírpe hospedeira microbiana que foi traneformada com um veo* tor híbrida compreendendo tiws cassete de expressão eORSis* tindo mot promotor opsracíonalmente ligado s uma prlmsirit sequãnsia de 0««* «edificador» de ua peptídeo sinal na grelha de leitura correste s uma segunda sequencia de DMA codificadora de um mutante da dessulfato-hirudina, que pode ser prodíiilds· de acordo com a reivindieaçSe 1* t uma ssiulnela de 0IA contendo sinais de terminação de transcrição* sara®** terârado por compreender a transformação de uma estirpe hospedeira microbians com o referido vedor híbrido* Lisboa* 17 de 3ulho de 198$ s^J

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