KR920009522B1 - 트롬빈 억제제의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

트롬빈 억제제의 제조방법

제1도는 데술페이토 히루딘 유전자의 F₁-DNA를 함유하는 플라스미드 pML 300의 구조이다.

제2도는 데술페이토 히루딘 유전자의 F₂-DNA를 함유하는 플라스미드 pML 305의 구조이다.

제3도는 플라스미드 pHRi 148의 구조이다.

제4도는 발현 플라스미드 pML 310의 구조이다.

본 발명은 트롬빈 억제제인 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA서열, 이와 같은 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 벡터, 이와 같은 하이브리드 벡터로써 형질전환된 숙주세포, 이 형질전환된 숙주 세포로부터 생성된 트롬빈-억제 활성을 갖는 신규 폴리펩타이드, 상기 DNA 서열, 하이브리드 벡터 및 형질전환된 숙주 세포의 제조방법 및 형질전환된 숙주세포를 사용하여 트롬빈 억제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

건강한 포유동물체의 혈장내에는 피브린분해계와 응혈계간의 동적평형이 존재하며 따라서 혈관계의 효과적인 작용이 유지된다. 혈관 손상이 생기면 응혈계에 의해, 지혈 상태가 일어난 후 피브린분해계에 의해 다시 분해되는 피브린 기질이 침전된다. 혈전-색전증 또는 수술후 합병증 환자와 같이 유기체의 피브린 분해능이 이미 생성된 혈관내 혈전을 분해시킬 만큼 충분하지 않을 경우에는 혈전분해제 또는 항응혈제를 투여하는 것이 불가피하다.

통상의 항응혈 요법상 4-하이드록시쿠마린 유도체 및 1,3-인단디오 유도체 외에도 특히 헤파린이 지금까지 사용되어 왔다. 이와 같은 약제를 사용함으로써 현저한 효과가 있었으나 몇가지의 단점을 갖고 있다.

예를 들면 헤파린을 혈액응고 경로에 직접 작용하지 않고 안티트롬빈 Ⅲ에 의해 트롬빈과 인자 X의 억제를 가속화시킴으로써 응혈억제 작용을 나타낸다. 또한 헤파린은 유기체의 수많은 비선택적 반응에 관여하며 혈소판 인자 4에 의해 중화되기 때문에, 특히 소비성 응혈 이상증 및 전염성 혈관내 응혈증(DIC)에 사용해서는 안된다. 그러므로 항응혈 요법제로 보다 선택적인 다른 약제가 필요하다.

거머리(Hirudo medicinalis)에 존재하는 항응혈제인 히루딘이 오랫동안 알려져 있다. 히루딘은 완전히 확인된 1차구조(1)를 갖는 65개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이며 구조적 특징으로 N-말단에 소수성 아미노산의 집합체와 C-말단에 극성 아미노산의 집합체를 함유하며 설페이트 모노에스테르로 티로신잔기(Tyr⁶³)가 존재하나 3개의 디설파이드 브리지의 정확한 배열은 알려져 있지 않다.

히루딘은 Ki-치(착화합물 해리 상수)가 6×10^-11M로서, 알려진 물질중 가장 강력한 트롬빈 억제제이며 트롬빈에 대한 선택적 친화성이 특징이고 혈액 응고계의 다른 효소는 히루딘에 의해 억제되지 않는다. 헤파린에 비해 히루딘은 트롬빈에 대해 직접 억제작용을 나타내며 헤파린과는 달리 안티트롬빈 Ⅲ을 통해 작용하지 않는다. 정제된 히루딘의 약물학적으로 확인 가능한 효과는 혈액 응고의 억제 및 혈전증의 예방이다. 히루딘을 개에 고용량으로 정맥투여했을 때에도 심박속도, 호흡, 혈압, 혈소판 수치, 피브리노겐 및 헤모글로빈에 대한 효과는 측정할 수 없었다. 래트, 돼지 및 개에 대한 시험에서 히루딘은(울혈 또는 트롬빈 주사에 의해 유발된)실험적 혈전증, 체내독소 쇼크 및 DIC(전염성 혈관내 응혈)에 유효한 것으로 입증되었다. 직접 비교 시험을 수행할 때마다 히루딘이 헤파린에 비해 효과가 우수함이 입증되었다.

히루딘이 오랫동안 알려져 있는 물질이지만 탁월한 생물학적 특성에 기인하여 광범위하게 치료제로 사용되고 있지는 않다. 히루딘이 약제로 광범위하게 사용되지 못하게 된 중요한 단점은 생산가능성이 극히 한정되어 있기 때문이다. 지금까지 히루딘 제제는 거머리 추출물을 사용하고 시간과 비용이 많이 드는 분리 및 정제공정(참조 2)을 이용하여 천연 물질로부터 수득할 수 있었다. 비교적 긴 65개 아미노산 서열은 경제적인 이유 때문에 통상의 펩타이드 합성법으로 성공 가능성이 거의 없다. 그러므로 히루딘의 치료적 효능의 임상 시험 및 항응혈 요법제로 광범위하게 사용할 수 있을만큼 충분한 양으로 제조하기 위해서는 신규의 방법이 적용되어야 한다.

상기의 신규 방법중 어떤 것은 특히 재조합체 DNA 기법에 의한 것이다. 이 방법에 의해서는 상응하게 유전적으로 변형된 미생물 또는 포유동물 세포 배양물을 배양시켜 생리학적 활성이 가장 다양한 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

그러므로 본 발명의 요지는 유전기법에 의해 히루딘 활성을 갖는 폴리펩타이드를 공업적 규모로 미생물학적 방법에 따라 제조할 수 있도록 하는 발현 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명에서는 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열을 함유하는 히이브리드 플라스미드의 제조에 의해 상기 문제를 해결하였는데 이 DNA 서열은 상기 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주세포내에서 히루딘 활성을 갖는 폴리펩타이드가 발현되는 바와 같이 발현 조절 서열에 의해 조절된다.

형질전환된 숙주 세포(형질전환된 거머리 세포는 제외)내에서, 추가로 설페이트-전달 효소계를 삽입하지 않고 상기는 DNA 서열을 발현시켜, 천연 히루딘과는 달리 티로신-63잔기에서 설페이트 라디칼이 거의 없는 생성물이 수득된다. 일반적으로 단백질, 특히 히루딘 중 설페이트 라디칼의 생물학적 기능은 자세히 규명되지는 않았으나 현재로서는 설페이트 라디칼이 단백질의 생리학적 특성에 중요한 영향을 주는 것은 아닌 것으로 알려져 있다. 그러므로 설페이트 라디칼은 하기와 같은 기능을 갖는다.

(1) 단백질의 생물학적 활성에 대한 정(positive)효과

(2) 조절 세포 공정중에 관여(가역적 인산화에서 알려짐)

(3) 분비 자극, 즉 술페이트기가 분비 단백질로 인식 특이 형질로 작용한다. 공지의 술페이트 단백질은 모두 분비 또는 전이막 단백질이다.

경이롭게도 이론과는 달리 Try⁶³잔기의 페놀성 하이드록시로부터 특징적인 설페이트 모노에스테르 그룹을 제거한다 하더라도 히루딘의 생물학적 유용성은 유지됨이 알려졌다. 본 발명에 따라 형질전환된 미생물에 의해 생성된 설페이트 라디칼을 함유하지 않는 히루딘 화합물(데술페이토 히루딘)은 천연 히루딘과 비교할 때 생물학적 특성, 특히 항응혈 활성은 정성적으로 및 정량적으로 최소한 동등함이 입증되었다.

하기에서 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열 또는 유전자에 의해 이들이 발현됨에 따라 또는 유전자에 의해 이들이 발현됨에 따라 특히 티로신-63 잔기에서 설페이트 에스테르 그룹이 없는(데술페이토 히루딘) 천연 히루딘과 다른 히루딘 유사 폴리펩타이드가 생성됨을 알 수 있다.

히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열의 제조

본 발명의 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열 및 그의 단편에 관한 것이다.

또한 본 발명은 제놈성 거머리 DNA로부터 히루딘 구조유전자를 분리하거나, 히루딘 mRNA로부터 상보적 이중 나선 히루딘 DNA(히루딘-ds cDNA)를 생성하거나, 화학공정 및 효소적 공정에 의해 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 유전자 또는 그의 단편을 생성시킴을 특징으로 하여 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열 및 그의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.

제놈성 히루딘 DNA 및 히루딘-ds cDNA는 예를 들면 공지된 방법으로 수득한다. 예를 들면 제놈성 히루딘 DNA는 미생물 내에서 거머리 DNA 단편을 콜론화시키고 방사활성적으로 표지된, 15이상, 바람직하게는 15 내지 30개의 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 히루딘 DNA-선택적 올리고 데옥시뉴클레오티드를 사용하여 콜로니 하이브리드화 방법에 의해 히루딘 DNA를 함유하는 클론을 동정하는 방법으로 히루딘 유전자를 보유하는 거머리 유전자 은행으로부터 수득한다. 일반적으로 생성된 DNA 단편은 히루딘 유전자외에 적절한 엑소-또는 엔도-뉴클레아제로 처리하여 제거할 수 있는 다른 바람직스럽지 못한 DNA 성분을 함유한다.

이중나선 히루딘 cDNA는 적절한 거머리 세포로부터 바람직하게는 히루딘의 생성을 유도시키는 mRNA를 수득하고 공지된 방법으로 수득된 mRNA 혼합물 중의 히루딘-mRNA를 증식시킨후 이 mRNA를 단일나선 cDNA의 제조 템플리트(template)로 사용하여 RNA-의논성 DNA 폴리머라아제, ds cDNA에 의해 합성하여 ds cDNA를 적절한 벡터에 클로닝시켜 제조할 수 있다. 히루딘 cDNA를 함유하는 클론은 예를 들면 전술한 바와같이 방사활성적으로 표지된 히루딘 DNA-선택적 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하여 콜로니 하이브리드화시켜 동정한다.

이와 같은 방법으로 수득된 제놈성 히루딘 또는 히루딘 DNA는 바람직하게는 5'- 및 3'-말단에서 하나 또는 여러가지의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유하는 화학적으로 합성된 어뎁터 올리고데옥시뉴클레오티드와 연결시켜 적절한 벡터에의 삽입은 용이하게 한다. 또한 히루딘 DNA 또는 cDNA의 5'-말단에 대한 어뎁터 분자는 해독개시 시그널(ATG)을 함유해야 한다. 해독 개시 시그널은 히루딘의 제1아미노산에 대한 코돈이 바로 다음에 오도록 배열되어져야 한다.

천연 히루딘 유전자의 구조가 알려지지 않았고, 현재의 합성법 때문에 히루딘의 아미노산 서열은 코드화 하는 유전자(데술페이토 히루딘 유전자)의 화학적 합성이 시간적인 면에서 특히 유리하기 때문에 화학적 합성법이 본 발명의 공정에서는 바람직하다.

데술페이토 히루딘 유전자의 화학적 합성

본 발명은 코드화단면 및 데술페이토 히루딘 유전자의 상보적 쇄의 단편을 화학합성한 다음 생성된 단편을 효소적으로 데술페이토 히루딘의 구조 유전자 또는 그의 단편으로 전환시킴을 특징으로 하여 데술페이토 히루딘의 구조 유전자 또는 그의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 데술페이토 히루딘을 코드화 하는 이중나선 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 DNA는 데술페이토 히루딘에 코돈외에 E·coli와 같은 적절한 숙주세포내에서 발현을 가능하게 하는 해독 개시 및 정지 시그널외에 말단에서 벡터 내에 삽입되기 적절한 뉴클레오티드 서열도 함유한다.

본 발명의 바람직한 공정에서는 DNA는 5'-말단에 제한 효소에 의해 분해될 수 있으며 해독개시 시그널을 수반하는 뉴클레오티드 서열, 하나이상의 부위에서 제한 효소에 의해 임의로 분해시키는 히루딘의 아미노산에 대한 코돈, 해독 정지시그널을 함유하고, 3'-말단에 제한 효소에 의해 분해될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 본 발명에 사용될 수 있는 제한 효소의 예로는 Eco RⅠ EcoRⅡ, Bam HⅠ, HpaⅡ, PstⅠ, Hin fⅠ 또는 HindⅢ를 들 수 있다.

본 발명은 특히 일반식(Ⅰ)의 뉴클레오티드 서열 및 상보적 뉴클레오티드 서열로 이루어진 이본쇄 DNA에 관한 것이다.

[일반식 I]

상기 식에서, 뉴클레오티드 서열은 이해를 돕기 위해 5'-말단에서 시작하여 나타내었으며; 각 트리플리코트가 코드화하는 아미노산을 나타내었고; 각 문자에 대한 설명은 다음과 같다 :

K=M=A이면, A 또는 G이거나, M=G이면, A이고, (X')n 및 (X')m은 뉴클레오티드 서열을 나타내며 n 및 m은 3이상 100이하, 특히 5이상 15이하이고 제한 요소에 의해 인식되며 분해될수 있다.

바람직한 공정에 있어서, DNA 서열은 5'-말단에 EnoRⅠ으로 분해될 수 있는 뉴클레오티드 서열, 중앙에 EcoRⅡ에 분해될 수 있는 뉴클레오티드 서열 및 3'-말단에 BamHⅠ으로 분해될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.

본 발명은 특히 E, coli에 의해 바람직하며 히루딘의 아미노산을 코드화하는 트리플리트를 함유하는 이중나선 DNA를 포함한다. 이와 같은 트리플리트는 특히 다음과 같다.

바람직한 정지시그널(NON)은 코돈 TAG이다. 전술된 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 유전자의 바람직한 태양은 일반식(Ⅱ)의 DNA이다.

[일반식 Ⅱ]

상기식에서, A, T, G 및 C는 일반식(Ⅰ)에서 정의된 바와 같고 이해를 돕기 위해 각 트리플리트가 코드화하는 아미노산 및 제한 요소에 대한 절단 부위를 표시하였다.

또한 본 발명은 데술페이토 히루딘을 코드화하는 DNA의 단편을 포함한다.

특히 본 발명은 데술페이토 히루딘 유전자의 이중나선 DNA 단편, 특히 말단이 제한 요소에 의해 절단될수 있는 데술페이토 히루딘 유전자의 이중나선 DNA 단편을 포함한다. 이와 같은 히루딘 유전자의 이중나선 DNA 단편은 특히 30 내지 70개의 염기쌍을 함유한다.

예를 들면 본 발명은 일반식(Ⅲ)의 DNA 단편(F₁) 및 일반식(Ⅳ)의 DNA 단편(F₂)을 함유한다:

[일반식 Ⅲ]

또한 본 발명은 데술페이토 히루딘 유전자의 단일나선 DNA 단편, 특히 화학 및/또는 효소적 방법에 의해 결합되어 데술페이토 히루딘 유전자를 형성할 수 있는 데술페이토 히루딘 유전자의 단일나선 DNA 단편을 포함한다. 본 발명은 특히 20개이상, 특히 20 내지 70개의 뉴클레오티드를 함유하는 단일나선 DNA 단편에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명은 실시예에 기술된 단일 나선 및 이중나선 DNA 단편에 관련된다.

DNA 합성법은 에스.에이.나랑(S.A.Narang)에 의해 요약되었다(3). 공지된 합성기술에 의해 20개의 염기 길이의 폴리펩타이드를 고수율, 고순도 및 비교적 단시간내에 제조할 수 있게 되었다. 적절히 보호된 뉴클레오티드를 포스포디에스테르법(4), 보다 효율적인 포스포트리에스테르법(5) 또는 포스파이트 트리에스테르법(6)에 의해 연결시킨다. 뉴클레오티드 쇄를 적절한 중합체에 결합시키는 고체상법에 의해 올리고- 및 폴리-뉴클레오티드 합성법이 단순화되었다. 이다구라등(Itakura et, al.(7)은 고체상법에 있어서 개개의 뉴클레오티드 대신 포스포트리에스테르법에 의해 연결된 트리뉴클레오티드를 사용하여 단시간에 좋은 수율로 축합시켜 31개의 염기를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있었다. 확인된 구조의 2중나선 DNA는 화학적으로 생성된 단편으로부터 효소적으로 구성할 수 있다. 코라나 등(Khorama et al.(8)은 이와 같은 목적에 두개의 DNA 나선으로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 중첩시키고 염기 짝짓기법에 의해 정확한 배열로 결합시킨 후 DNA 리가아제에 의해 화학적으로 연결시켰다. 그외에 이용할 수 있는 다른 방법으로는 4가지의 필요한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에 중첩 단편을 함유하는 2개의 DNA 쇄 각각으로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 DNA 폴리머라제Ⅰ, 폴리머라제Ⅰ의 Klenow 단편, T₄DNA 폴리머라아제와 같은 DNA 폴리머라아제 또는 AMV(조류 골수성 백혈병 비루스)리버스 트랜스크립타제와 같이 배양시키는 방법이 있다. 이공정에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 염기 짝짓기에 의해 정확한 배열로 결합시키고 필요한 뉴클레오티드와 같이 효소를 보충하여 완전한 이본쇄 DNA(9)를 형성한다. 이다구라(10)은 상기 원리에 입각하여 인체 백혈구 인터페론 α₂-유전자의 132염기쌍 단편이 39 내지 42개의 염기를 함유하는 화학 합성된 단편으로부터 DNA 폴리머라제Ⅰ(Klenow 단편) 존재하에 리가아제만을 사용하는 전술된 방법과 비교시 화학합성 공정이 40% 절감되면서 형성될 수 있는 이유를 기술하였다.

본 발명은 a) 적절히 보호된 데옥시뉴클레오시드를 고형담체에 결합시키고, b) 포스포트리에스테르 또는 포스파이트법에 따라 적절히 보호된 디-, 트리-또는 테트라-뉴클레오티드를 제조하고 c) 담체에 결합된 데옥시뉴클레오시드 또는 올리고데옥시 뉴클레오티드를 포스포트리에스테르 또는 포스파이트 법에 따라 적절히 보호된 모노-뉴클레오티드 또는 디-, 트리-또는 테트라-뉴클레오티드(B항에서 제조됨)와 연결시키고, d) 담체에 결합하여 약 20내지 70개의 염기를 함유하는 c)항의 방법에 따라 수득할 수 있는 올리고데옥시뉴클레오티드를 담체로부터 회수하고 필요하면 정제시키고 보호그룹을 제거하며 유리 5'-말단 하이드록시그룹을 인산화시키고, e1) 코드화 부위로부터 3이상, 바람직하게는 8내지 15개의 중첩 염기쌍을 함유하는 코딩쇄 및 상보적 쇄에서 약 20내지 70개의 염기인 2개의 올리고데옥시뉴클레오티드를 아닐링시키고 4가지의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에 DNA 폴리머라아제를 보충시켜 이본쇄 DNA 단편(데술페이토 히루딘 유전자의 단편)을 형성하고 임의로 d)항의 방법에 따라 인산화된 적절한 말단과 2개의 이본쇄 DNA 단편을 리가아제를 사용하여 연결시켜 데술페이토히루딘 구조 유전자를 제조하거나, 생성된 2개의 이본쇄 DNA 단편을 적절한 백터내에서 서브클론화시킨후 d)항의 방법에 따라 인산화시키고 리가아제를 사용하여 연결시켜 데술페이토히루딘 구조유전자를 형성시키거나, e2) 예를 들어 20 내지 70개의 염기를 함유하고 3개이상, 바람직하게는 8 내지 15개의 중첩 염기쌍을 함유하는 코딩쇄 및 상보적 쇄에서 유래된 2가지의 올리고 데옥시뉴클레오티드를 아닐링하고 4가지의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에 DNA 폴리머라제를 보충한 다음 리가아제를 사용하여 데술페이토히루딘 구조유전자를 형성시킴을 특징으로 하여 데술페이포히루딘의 구조유전자를 함유하며 숙주세포내에서 발현되기에 적절하고 말단이 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 및 그의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 조작 조건과 진보성을 적절히 조합함으로써 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA를 제조할 수 있게 하였다.

상기 단계 a)에 있어서 다양한 가교결합 및 팽창성을 갖는 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴 아미드 공중합체, 카이젤구르, 실리카겔 또는 알록스(Alox)와 같은 무기물질상에 지지된 폴리아미드 또는 작용화된 실란과 같은 여러가지의 고형담체를 사용할 수 있다. 본 발명이 바람직한 공정에 있어서 사용되는 고형 담체는 1 내지 5개의 2가 작용기(예;-이미노, 옥소, 티오, 옥시카보닐 또는 아미도카보닐)에 의해 차단된 C₂내지 C₁₂의 알킬렌 그룹과 같은 ＂스페이서(Spacer)＂에 의해 적절히 보호된 데옥시뉴클레오시드의 5'-OH 그룹과 연결된 가교결합된 폴리스티렌이다. 특히 바람직한 방법은 5'-위치 및 임의로 염기 부위가 보호된 일반식(Ⅴ)의 뉴클레오시드의 석신산 무수물[여기서 R¹은 트리아릴메틸 보호 그룹(예; 4-메톡시트리틸 그룹 또는 4,4'-디메톡시트리틸 그룹), 트리-저급 알킬실릴 보호그룹(예; 3급-부틸디메틸 실릴그룹)와 같이 산에 의해 제거될 수 있는 보호그룹이고,; B는 티밀, 시토실, 아데닐 및 구아닐 중에서 선택된 임의 보호된 염기그룹을 나타낸다]과 임의로 피리딘, 트리에틸아민 또는 디메틸아미노피리딘과 같은 염기 존재하에 반응시킨후, 카복실산 라디칼을 활성화시키는 시약, 바람직하게는 N-하이드록시 석신이미드 또는 P-니트로페놀 및 카보디이미드(예; 디시클로헥실 카보디이미드)와 같은 탈수제를 사용하여 0.5 내지 2%의 디비닐벤젠에 의해 가교결합된 아미노메탈화 폴리스티렌과 반응시키는 방법이다(도식1).

상기 반응은 피리딘, 테트라하이드로푸탄, 디옥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디메틸 포름아미드 또는 디에틸 아세트아미드와 같은 비양자성 용매 또는 그의 혼합물 중에서 실온 또는 약간 승온 또는 감온에서(예; 약-10 내지 50℃, 바람직하게는 실온) 수행하며 탈수제의 존재하에 저온(예: 약 0℃)에서 수행할 수도 있다.

[도식 1]

[일반식 Ⅴ, Ⅵ]

본 발명의 단계 b)에 따라 디-, 트리- 또는 테트라-뉴클레오티드를 제조함에 있어서(도식2), 5'-위치 및 임의로 염기 부위가 보호된 일반식(Ⅴ)의 뉴클레오시드 [R¹및 B는 전술한 바와 같다]를 임의로 탈수제의 존재하에 또는 염기 존재하에 일반식(Ⅶ)의 활성화 인산에스테르 [X¹및 X²는 각각 독립적으로 하이드록시 또는 이로부터 유도된 염, 할로겐, 이미다졸릴, 1,2,4-트리아졸-1-일, 테트라졸릴 또는 1-벤즈트리아졸릴옥시이거나 X²는 2-시아노에톡시, 2-트리할로에톡시, 2-아릴설포닐에톡시, 2-저급알킬-티오에톡시, 2-아릴티오에톡시 또는 2-(4-니트로페닐)-에톡시이고 R²는 염기 또는 친핵성 화합물(수산화암모늄, 티오페놀레이트) 또는 아릴 알톡시메이트(예; 할로겐, 니트로 및/또는 저급알킬, 메틸로 임의치환된 페닐, 니트로로 임의 치환된 벤질)에 의해 제거될 수 있는 보호그룹이거나 8-퀴놀릴 또는 5-클로로-8-퀴놀릴과 같이 금속이온에 의해 제거될 수 있는 보호그룹을 나타낸다]와 반응시킨다.

다음에 생성된 일반식(Ⅷ)의 화합물 [R¹, X²및 R²는 전술된 바와 같다]을 임의로 X²라디칼을 OR³(여기서 R³는 시아노 에틸, 2-트리할로에틸, 2-아릴설포닐에틸, 2-저급알킬티오 에틸, 2-아릴티오에틸 또는 2-(4-니트로페닐)-에틸이다)그룹으로 전환시키는 2-치환된 에탈올과 반응시킨후 보호그룹 R¹을 제거하고 생성된 일반식(Ⅸ)의 화합물을 임의로 탈수제 존재하에 또는 염기 존재하에 일반식(Ⅷ)의 다른 화합물과 반응시켜 디뉴클레오티드 X를 생성시킨다. (도식 2)의 임의로 일반식(Ⅷ)의 화합물을 염기 및 물과 반응시켜 X²가 하이드록시 또는 이로부터 유도된 염인 일반식(Ⅷ)의 다른 화합물로 전환시킨다.

상기 반응은 전술한 용매 중에서 및 실온 또는 약간 승온 또는 감온에서 수행한다.

보호그룹 R¹의 제거공정은 무기산(예; 염산 또는 황산), 카복실산(예; 아세트산, 트리클로로 아세트산 또는 포름산), 설폰산(예; 메탄-또는 P-톨루엔-설폰산), 특히 루이스산(예; 염화아연, 브롬화아연, 염화알루미늄, 디부틸-또는 디에틸-알루미늄 클로라이드와 같은 디알킬 알루미늄 할라이드 또는 브론트리플루오라이드)과 같은 산에 의해 10℃ 내지 50℃, 특히 실온에서 수행한다. 디알킬알루미늄 할라이드를 사용할 경우 상기 보호그룹 제거공정은 친유성 용매, 특히 톨루엔중에서 수행하고 언급된 루이스 산을 사용할 경우에는 할로겐화 탄화수소(예;메틸렌 클로라이드) 및 저급 알칸올(예;에탄올 또는 이소프로판올)로 이루어진 용매 혼합물중에서 수행한다.

[도식 2]

[일반식 Ⅴ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ, Ⅹ]

일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드의 제조공정 또는 일반식(Ⅴ)의 뉴클레오시드(여기서, R¹및 B는 전술된 바와 같다)와 일반식(ⅦA)의 포스파이트(여기서, X¹은 할로겐, 특히 염소이고 X²는 할로겐, 특히 염소 또는 디-저급알킬아미노, 특히 디메틸아미노 또는 디이소 프로필아미노이거나 모르폴리노, 피페리디노 또는 피롤리디노이고 R²는 일반식(Ⅶ)에서 정의된 바와 같으나 특히 메틸이다)와의 임의로 적절한 염기 존재하에서의 반응(도식 3)을 포함한다. 본 발명에 따라 수득할 수 있는 일반식(ⅧA)의 화합물은 라디칼 X²를 그룹 OR³(R³는 상기 정의된 바와 같다)로 전환시키는 2-치환된 에탄올과 반응시킨후 염기 존재하에서 요드와 같은 산화제로 산화시켜 포스페이트를 생성시킨후 보호그룹 R¹을 제거하여 일반식(Ⅸ)의 화합물을 수득하거나, 일반식(Ⅸ)의 화합물과 반응시킨후 염기 존재하에 요드와 같은 산화제로 산화시켜 일반식(Ⅹ)의 화합물을 생성시킨다.

[도식 3]

[일반식 Ⅴ, ⅦA, ⅧA, Ⅸ, Ⅹ]

본 발명에 따라 트리뉴클레오티드를 제조하기 위해서 일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드(여기서 R¹, R²및 R³는 전술한 바와 같고 B¹및 B²는 각각 독립적으로 티밀, 시토실, 아데닐 또는 구아닐이다)의 보호그룹 R¹을 제거한 후 생성된 화합물을 탈수제의 임의 존재하에 또는 염기의 존재하에 일반식(Ⅷ)의 화합물과 반응시키거나, 일반식(ⅧA)이 화합물과 반응시킨후 산화시켜 일반식(XI)의 화합물을 수득한다(도식 4).

보호그룹 R1¹의 제거공정 및 축합시켜 일반식(XI)의 트리뉴클레오티드를 생성하는 공정은 일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드의 제조공정에서 기술한 바와 같은 방법으로 수행한다.

[도식 4]

[일반식 Ⅷ, XI]

본 발명 방법에 따라 테트라뉴클레오티드를 제조하기 위해서는 일반식(XI)의 트리뉴클레오티드를 일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드의 제조공정에 대해 기술한 바와 같이 반응시킨다.

본 발명의 바람직한 배열에 있어서, 보호그룹으로 4-메톡시트리틸 그룹은, 보호그룹 R¹로 염소로 치환된 페닐그룹, 특히 2-클로로페닐을 사용하고 보호그룹 R²로 2-시아노에틸그룹을 사용한다. 일반식(Ⅶ)의 화합물 중 라디칼 X¹및 X²로는 1-벤즈트리아졸릴옥시가 바람직하다.

일반식(XI)의 트리뉴클레오티드는 일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드로부터 보호그룹 R¹은 제거한 다음 생성된 화합물을 일반식(Ⅷ)의 화합물(여기서 X²는 하이드록시 또는 이로부터 유도된 염이다)과 탈수제의 존재하게 반응시켜 제조하는 것이 바람직하다(도식 4).

본 발명에 사용되는 탈수제의 예로는 니트로로 임의 치환된 2,4,6-트리메틸벤젠설포닐 또는 트리이소 프로필벤젠설포닐 클로라이드, 이미다졸, 테트라졸 또는 1,2,4-트리아졸을 들수 있다. 탈수제로는 1-(2,4,6-트리메틸벤젤설포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(XII)이 바람직하다.

뉴클레오티드는 유리 아미노 그룹의 염기 부분이 보호된 것이 바람직하다. 바람직한 보호그룹은 아데닌에 대해서는 벤조일이고, 시토신에 대해서는 벤조일 또는 4-메톡시벤조일이며, 구아닌에 대해서는 이소부티릴 또는 디페닐아세틸이다. 티민은 보호그룹 없이 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단계 c)에 따라 올리고뉴클레오티드를 제조할 경우 용매 및 시약에 대한 반자동 또는 전자동 미생물 조절계로 알려진 장치를 사용한다. 단계 a)에 따라 제조된 일반식(Ⅵ)의 화합물에 있어서 전술한 바와 같이 보호그룹 R¹을 제거한 다음 생성된 화합물을 탈수제의 임의 존재하에 또는 염기 존재하에 보호그룹 R³가 염기에 의해 제거된(2-시아노에틸 그룹은 트리에틸아민과 같은 트리-저급 알킬아민을 사용하여 상기 언급된 불활성 용매 또는 용매 혼합물 중에서 10 내지 40℃, 특시 실온에서 제거) 일반식(Ⅷ), (ⅧA), (Ⅹ) 또는 (XI)의 화합물과 반응시킨다. 또한 본 발명은 일반식(Ⅹ)의 디뉴클레오티드 또는 일반식(XI)의 트리뉴클레오티드 대신 단계 b)에 따라 제조된 테트라뉴클레오티드를 사용하는 반응도 포함한다.일반식(ⅧA)의 포스파이트를 사용할 경우 염기 존재하에서 요드와 같은 산화제로 처리한다. 상기와 같은 방법으로 제조된 일반식(ⅩⅢ)의 화합물(여기서, R¹, R²및 B는 전술한 바와 같고 n은 1 내지 4의 정수이다)을 n이 약 19 내지 69의 정수인 일반식(ⅩⅢ)의 화합물을 생성하기 위해 자주 필요하며 일반식 (Ⅵ)의 화합물에 대해 기술한 바와 같이 (R¹을 제거하고 일반식(ⅩⅢ), (ⅧA), (Ⅹ), (XI)의 화합물 또는 상응하는 테트라뉴클레오티드와 반응시킨 후 임의로 산화 후 처리) 반응시킨다.

[일반식 XIII]

본 발명의 바람직한 공정에서는 4-메톡시트리틸을 보호그룹 R¹으로 사용하고 이 그룹의 제거공정은 CH- 또는 NH-산 화합물, 특히 1,2,4-트리아졸 또는 테트라졸의 존재하에 브롬화 아연을 사용하여 수행한다. 4-메톡시트리틸 보호그룹을 제거하기 위해 1,2,4-트리아졸을 사용하는 점이 신규이며 이와 같이함으로써 부반응없이 제거공정이 신속하게 진행되며 고수율로 생성물이 수득되는 놀라운 결과를 얻었다. 특히 바람직한 것은 비양성자성 용매 및 알코올로 이루어진 용매 혼합물(예; 메틸렌클로라이드 및 2-프로판올)중에서 브롬화 아연 및 1,2,4-트리아졸을 20:1 내지 100:1의 몰비로 사용하는 방법이다.

본 발명의 바람직한 공정에서는 보호그룹 R¹이 제거된 일반식(Ⅵ) 또는 (ⅩⅢ)의 화합물을 보호 그룹 R³가 제거된 일반식(XI)의 트리뉴클레오티드와 니트로로 임의 치환된 2,4,6-트리메틸벤젠설포닐 또는 트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드, 이미다졸, 테트라졸 또는 1,2,4-트리아졸과 같은 탈수제의 존재하에 반응시킨다. 이중 특히 바람직한 것은 1-(2,4,6-트리메틸벤젠설포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(XII)이다.

보호그룹 R¹으로 4-메톡시트리틸 그룹을 사용하고 R¹을 제거하기 위해 1,2,4-트리아졸의 존재하에 브롬화 아연을 사용하며 보호그룹이 제거된 일반식(ⅩⅢ)의 올리고 뉴클레오티드 폴리스티렌 수지와 보호그룹이 제거된 일반식(XIII)의 트리뉴클레오티드와의 반응에서 탈수제로 일반식(XII)의 트리아졸을 사용하는 특히 바람직한 조합방법에 의해 약 40 내지 70개의 염기를 함유하는 보다 긴 뉴클레오티드도 단시간내에 고수율 및 고순도로 제조할 수 있게 되었다.

담체로부터 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드를 회수하고 단계 d)에 따라 보호그룹을 제거하기 위해 공지된 방법을 이용한다. 담체로부터 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드를 회수하고 바람직한 2-클로로페닐 보호그룹을 제거하기 위해 특히 바람직한 시약은 1,1,3,3-테트라메틸구아니디늄 2-니트로-벤즈알독시메이트와 같은 아릴 알독시메이트이다. 상기 반응은 상기 언급된 불활성 용매중에서 95%피리딘을 가하여 실온에서 수행한다. 다음에 실온 또는 승온 (예 : 20 내지 70℃, 특히 50℃)에서 수성 암모니아와 반응시킨다.

본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드를 연결시키기 위해 5'-말단 하이드록시 그룹에 포스페이트 라디칼을 도입시킨다. 포스테이트 라디칼의 도입(인산화)공정은 ATP의 존재하에 T₄폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 공지된 방법으로 수행한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 코드화 및 상보적 DNA 쇄로 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드는 3이상, 바람직하게는 8 내지 15개의 중첩염기쌍으로 이루어진 중첩 서열을 함유한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드 쌍은 혼합되는 동안 수소결합에 의해 결합된다. 제2(상보적) 쇄를 합성하기 위해 4가지의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP,dCTP,dGTP 및 TTP) 존재하에 DNA 폴리머라제Ⅰ, DNA 폴리머라제Ⅰ 또는 T₄DNA 폴리머라제의 Klenow 단편과 같은 DNA 폴리머라제 또는 AMV 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 단계 e1) 및 e2)에 따라 수행할 경우 계획된 단일 쇄 말단은 매트릭스(템플리트)를 작용한다. 상보되는 동안 특히 데술페이트 히루딘 유전자의 단편(공정 e1)이거나 완전한 데술페이토히루딘 유전자(공정 e2)인 생성된 듀플렉스 DNA는 블런트 엔드를 함유한다.

단계 e1)에 따라 수득할 수 있는 데술페이토히루딘 유전자의 단편을 말단에 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및 절단되는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 사용된 뉴클레오티드 서열 및 제한 엔도뉴클레아제에 따라 절단되는 동안 완전히 염기 짝지은(블런트) 말단 또는 중첩 DNA 나선(스테거드 엔드)이 생성된다. 제한인식 서열은 블런트엔드를 생성하는 제한 엔도뉴클레아제로 처리된 DNA 단편 또는 코히시브 엔드의 염기 짝짓기를 수행한 후 DNA 단편을 계획된 DNA 나선과 연결시키면 완전한 데술페이토히루딘 구조 유전자가 생성되도록 선택하여야 한다. 2개의 이중나선 DNA 단편의 연결에는 공여 단편상의 5'-말단 포스페이트 그룹과 수용 단편 상의 유리 3'-말단하이드록시 그룹이 필요하다. e1)단계 e1)에서 수득된 DNA 단편은 이미 5'-말단 인산화되었고 리가아제, 특히 T₄DNA 리가아제를 사용하여 공지된 방법으로 연결시킨다.

본 발명의 한 공정에서는 데술페이토히루딘 유전자의 2단편, 특히 각각 일반식(Ⅲ) 및 (Ⅳ)의 F₁및 F₂단편을 전술된 방법으로 제조한다. 필요하다면 이 단편을 바람직하게는 연결 말단에 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열, 특히 EcoRⅡ를 함유하는 적절한 벡터내에서 서브클론화시킬 수 있는데, 이와 같이 하는 이유는 상기 효소로 절단한 후 2개의 단편을 연결시키면 정확하게 코드화된 데술페이토히루딘 DNA 서열이 수득된다. 또한 해독개시 시그널(ATG) 앞의 단편1과 해독정치 시그널(예: TAG) 다음의 단편 2는 데술페이토히루딘 유전자 또는 데술페이토히루딘 유전자 단편이 적절한 벡터내에 이입될 수 있도록 하는 추가의 ＂말단＂ 제한부위를 함유한다.

본 발명은 예를 들면 일반식(Ⅲ) 및 (Ⅳ)의 화합물의 단편 F₁및 F₂에서 임의로 서브클론화되고 제한 효소 EcoRⅡ로 절단하고 연결시켜 확인된 구조와 일치하는 데술페이토히루딘 DNA 서열이 수득되며 해독개시시그널 앞의 F₁에 EcoRⅠ 제한부위가 존재하며 해독정지 시그널 다음의 F₂에 BamHⅠ제한 부위가 존재하는 데술페이토히루딘 유전자의 제조방법에 관련된다.

바람직한 공정(공정 e2)에 있어서, 코드화 나선 및 상보 나선에서 유래되는 2가지의 올리고뉴클레오티드를 3이상, 바람직하게는 8 내지 15개의 상보 염기와 아닐링시키고 전술된 DNA 폴리머라제중 하나와 같은 DNA 폴리머라제를 가한 다음, T₄DNA 리가아제를 사용하여 연결시켜 데술페이토히루딘 구조 유전자를 생성시킨다.

히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터의 제조

또한 본 발명은 히루딘 활성을 갖는 폴리펩타이드가 발현 벡터로써 형질전환된 숙주세포내에서 발현되도록 발현조절 서열에 의해 조절되며 데술페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터에도 관련된다.

본 발명의 발현 벡터는 예를 들면, 데술페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열을 발현 조절 서열이 이 DNA 서열을 조절하도록, 발현 조절 서열을 함유하는 벡터 DNA에 삽입함으로써 제조한다.

적절한 벡터의 선별은 형질전환용으로 제공되는 숙주세포에 의해 결정한다. 적절한 숙주의 에로는 효모(예 : 사카로마이세스 세레비지아에)와 같은 미생물, 특히 제한 또는 변형 효소를 함유하지 않는 세균, 특히 E.coli(예; E.coli X 1776, E.coli HB 101, E.coli W 3110△102, E.coli HB101/LM 1035, E.coli JA221(30) 또는 E.coli K12 균주 294), 바실루스 서브틸리스, 바실루스 스테아로써모필루스, 슈도모나스,헤모필루스, 스트랩터코커스, 고등 생물 세포, 특히 인체 또는 동물 셀라인을 들 수 있다. 이들 중 바람직한 숙주 세포는 E.coli, 특히 E.coli HB 101, E.coli JA 221 및 E.coli W 3110△102균주이다.

원칙적으로 특정한 숙주내에서 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 본 발명의 이종의 DNA 서열을 복제 및 발현시키는 벡터가 적절한 벡터이다.

E.coli 균주내에서 데술페이토 히루딘을 발현시키는데 적절한 벡터의 예로는 박테리오파지(예;박테리오파지 λ의 유도체), 플라스미드, 특히 플라스미드 colE₁및 그의 유도체(예; pMB 9, pSF 2124, pBR317 또는 pBR 322)를 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 벡터는 플라스미드 pBR 322로부터 유도된다. 적절한 벡터는 완전한 리플리콘 및 발현 플라스미드의 표현형에 의해 형질전환된 미생물을 선별 및 동정할 수 있도록 하는 마커유전자를 함유한다. 적절한 마커 유전자는 미생물에 예를 들면 중금속, 항생제등에 대한 내성을 부여한다. 또한 본 발명의 바람직한 벡터는 리플리콘과 특이형질 유전자 부위 바깥부분에 제한 엔도뉴클 레아제에 대한 인식 서열을 함유하여 이 부분에 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열 및 임의로 발현 조절서열이 삽입될 수 있도록 한다. 바람직한 벡터인 플라스미드 pBR 322는 원래의 리플리콘, 테트라사이클린 및 암피실리에 대한 내성을 부여하는 특이형질 유전자(tet^R및 amp^R), 제한 엔도뉴클레아제[예; amp^R유전자를 절단시키고 tet^R유전자는 원래대로 있게 하는 PstⅠ, tet^R유전자를 절단시키고 amp^R유전자는 원래대로 있게 하는 BamHⅠ, HindⅢ, SalⅠ, NruⅠ 및 EcoRⅠ]에 대한 일련의 인식서열 단지 하나만을 함유한다.

여러가지 발현 조절 서열을 데술페이토히루딘 발현 조절에 사용할 수 있다. 특히 형질전환시킬 숙주 세포의 강하게 발현된 유전자의 발현 조절 서열을 사용한다. 하이브리드 벡터로 pBR 322를, 숙주 미생물로 E.coli를 사용할 경우, (프로모터 및 리보솜 결합 부위를 함유하는) 적절한 발현 조절 서열은 락토즈 오페론, 트립토판 오페론, 아라비노즈 오페론 및 β-락타마제 유전자의 발현 조절 서열, 파지λN-유전자 또는 파지 fd-층 단백 유전자의 상응하는 서열이다. β-락타마제 유전자(β-lac-유전자)의 프로모터는 플라스미드 pBR 322에 이미 함유되어 있지만, 그외의 발현 조절 서열은 플라스미드내에 삽입되어야 한다. 본 발명에 있어서 바람직한 발현 조절 서열은 트립토판 오페론(trp po)의 발현조절 서열이다.

효모내에서 복제 및 발현되기 적절한 벡터는 효모-복제원 및 효모에 대한 선택적 유전자 마커를 함유한다. 염색체 자발적 복제 단편(ars)과 같은 효모 복제원을 함유하는 하이브리드 벡터는 형질전환 후에 효모세포내에서 염색체외적으로 유지되며 유사분열동안 자발적으로 복제된다. 또한, 효모 2μ플라스미드 DNA와 동증인 서열을 함유하는 하이브리드 벡터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 하이브리드 벡터는 세포내에 이미 존재하는 2μ플라스미드에 재조합됨으로써 결합되거나 자발적으로 복제된다. 2μ서열은 형질 전환 빈도가 높고 카피수가 높은 플라스미등;P 특히 적절하다. 효모에 대해 적절한 마커 유전자는 특히 숙주에 항생제 내성을 부여하는 것이거나 생장인자를 필요로 하는 효모 돌연변이체일 경우에는 숙주의 장해를 보충하는 유전자이다. URA 3, LEU 2, HIS 3, 특히 TRPⅠ 유전자와 같은 상응하는 유전자는 항생제인 시클로헥시미드에 대한 내성을 부여하거나 생장인자를 필요로 하는 효모 돌연변이체에 프로토트로피를 부여한다. 바람직하게는 효모 하이브리드 벡터는 복제원 및 세균 숙주, 특히 E.coli에 대한 마커 유전자를 함유하여 세균 숙주내에서 하이브리드 벡터 및 그의 전구체의 구성 및 클로닝이 수행하도록 한다. 효모내에서 발현되기에 적절한 발현 조절 서열의 예로는 TRPⅠ, ADHⅠ, ADHⅡ, PHO3 또는 PHO5 유전자; PGK 및 GAPDH 프로모터와 같은 당분해에 관련된 프로모터를 들 수 있다.

본 발명은 특히 복제 및 표현형 선택 능력을 가지며, 발현 조절 서열 및 히루딘의 아미노산 서열을 코드화한 서열을 함유하며, DNA 서열이 상기 발현 플라스미드 중의 전사 개시 시그날 및 정지 시그날 및 번역개시 시그날 및 정지 시그날과 함께, 상기 발현 조절 서열의 조절하에 상기 발현 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포중에서 데술페이토히루딘이 발현되도록 배열된 발현 벡터에 관한 것이다.

효과적으로 발현시키기 위하여 데술페이토히루딘 유전자를 발현 조절 서열과 함께 바르게 배열하여야 한다. 발현 조절 서열은, 바람직하게는 그 자신은 번역 개시 시그날(ATG) 및 번역 정지 시그날(예 : TAG)을 갖는 데술페이토히루딘 유전자와 함께 자연적으로 발현 조절 서열(예를 들어 β-lac프로모터를 사용하는 경우에는 β-lac 코드화 서열)에 결합되는 유전자 코드화 서열의 ATG 및 mRNA주형 사이에 결합되는 것이 유리하다. 이와 같이 하여 효과적으로 전사 및 번역할 수 있다.

예를 들어, 벡터 특히 pBR 322 벡터를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 임의로는 생성된 선형화 벡터를 변형시킨 후 상응하는 제한 말단을 갖는 발현 조절 서열을 도입시킨다. 발현 조절 서열은 3'-말단(해독 방향으로)에 제한 엔드뉴클레아제의 감지 서열을 함유하므로 발현 조절 서열을 이미 함유하는 벡터는 상기 제한효소로 분해할 수 있으며, 상응하는 말단을 갖는 데술페이토히루딘 유전자를 삽입시킬 수 있다. 생성물은 각각 정상(correct) 및 비정상(incorrect) 배향의 유전자를 함유하는 두 가지 혼성 플라스미드의 혼합물이다. 발현 조절 서열을 이미 함유하는 벡터를 벡터 DNA내에서 두 번째의 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 정상 말단을 갖는 데술페이토히루딘 유전자를 생성된 벡터 단편으로 삽입시킨다. 벡터상에서 행하여지는 모든 조작은 리플리콘 및 적어도 하나의 표지 유전자의 기능이 손상되지 않도록 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 태양은, 발현 조절 서열, 특히 트립토판 오페론(trp po)의 서열을 함유하고 3'-말단(mRNA) 주형 및 첫번째 ATG의 사이)에 예를 들어 EcoRⅠ와 같이 바람직하게는 결합 말단을 형성하는 제한 엔도뉴클레아제의 감지 서열을 수반하는 pBR 322 유래 벡터를 언급한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 벡터 DNA 단편내에서, 평활 말단, 또는 바람직하게는 결합 말단을 형성하는, 예를 들어 BamHⅠ와 같은 두번째의 제한 엔도뉴클라아제로 분해한 다음, 이와 같이 선형화된 벡터를 상응하는 말단(예를 들어, ATG 개시부 및 BamHⅠ 말단의 전반부와 해독 정지 코돈의 후반부의 EcoRⅠ 말단)을 갖는 데술페이토히루딘 유전자와 결합시키는 것이다. 결합조작은 상보적(결합) 말단을 짝지우고, 예를 들어 T₄DNA 리가제로 결합시키는 공지의 방법으로 수행한다.

상응하는 결합 말단(특히, EcoRⅠ 및 BamHⅠ 말단)을 갖는 합성시키거나 mRNA 경로에 의해 유전자성 DNA로부터 수득된 데술페이토히루딘 유전자는, 예를 들어 서열 분석을 위해 다량의 디술페이토히루딘 유전자를 수득하기 위하여, 발현 플라스미드로 도입시키기 전에, 예를 들어 pBR 322와 같은 벡터내로 클론화시킬 수 있다. 혼성플라스미드를 함유하는 클론의 단리는, 예를 들어, 데술페이토히루딘 유전자 특이성이며 방사성 원소로 표지한 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다(상기 참조). 데술페이토히루딘 유전자의 검측은, 예를 들어, 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert)(11)의 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 데술페이토히루딘 유전자의 두 단편을 합성하는 것이다. 단편 1은 유전자의 전반부를 포함하며 ATG 전반부 및 말단 각각에, 결합 말단을 형성하는 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열, 예를 들어, ATG EcoRⅠ 및 말단 EcoRⅡ을 함유한다. 단편 2는 유전자의 후반부를 포함하며 상응하는 감지서열, 예를 들어 개시부에 EcoRⅡ 및 번역정지 시그날(예: ATG) 뒤에 BamHⅠ를 갖는다. 단편들은 외부 인식 서열(단편 1의 경우에는, 예를 들어, EcoRⅠ를 갖고, 단편 2의 경우에는 BamHⅠ를 갖는다)에서 절단되고 상응적으로 절단된 벡터(예를 들어 pBR 322)내로 서브클론화된다. 단편을 함유하는 클론의 확인 및 단편의 검출은 상기한 바와 같이 수행한다. 이어서 단편을 상응하는 제한 엔도뉴클레아제(단편 1의 경우에는, 예를 들어, EcoRⅠ 및 EcoRⅡ이고, 단편 2의 경우 EcoRⅡ 및 BamHⅠ이다)를 사용하여 하이브리드 벡터로부터 잘라내고, 그들의 결합 말단, 특히 말단에서 결합시켜 완전한 데술페이토히루딘 유전자를 생성하고 이것을 상기한 바와 같이 벡터 DNA내로 도입시킨다.

미생물의 형질전환

본 발명은 발현 조절 서열에 의해 조절되며, 히루딘의 아미노산 서열을 코오드화한 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하는, 형질전환된 숙주 세포의 제조방법에 관한 것이다.

적절한 숙주 세포로는, 예를 들어, 상기 언급한 미생물로서 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및, 특히 에셰르키아 콜리(Escherichia coli)가 있다.

본 발명에 따른 발현 플라스미드를 이용한 형질전환은 문헌에 기록된 방법으로 수행한다[참조 : S. cerevisiae(12), B. subtilis(13) 및 E.coli(14)]. 형질 전환된 숙주 세포는, 발현 플라스미드에 함유된 내성을 제공하는 특이형질 유전자에 대하여 생물저해제를 첨가한 선택적 영양 배지로부터 유리하게 분리할 수 있다. 바람직한 예로서, 발현 플라스미드가 amp^R유전자를 함유하는 경우에는 영양 배지에 암피실린을 첨가한다. 이러한 배치중에서 발현 유전자를 함유하지 않은 세포는 사멸하게 된다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 수득할 수 있는 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

형질전환된 숙주 세포의 배양 및 데술페이토히루딘의 제조

형질전환된 숙주세포는 히루딘 활성을 갖는 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 제조 공정은 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고 생성물을 숙주세포로부터 유리시킨 다음 분리하는 것을 특징으로한다.

히루딘 활성을 갖는 화합물이란 상기 형질전환된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩타이드로서 트롬빈 억제 작용 및 항히루딘 항체와의 양성 반응을 가지며 데술페이토히루딘의 1차구조 또는 그로부터 유도된 구조를 갖는 화합물이다.

데술페이토히루딘의 1차 구조로부터 유도된 구조를 갖는 데술페이토히루딘 화합물이란, 예를 들어, 데술페이토히루딘 분자 중 N-말단의 1 내지 10, 특히 1 내지 6개의 아미노산 구조 단위 및/또는 C-말단의 1 내지 6, 특히 2개의 아미노산 구조 단위가 변형되거나 N-말단이, 예를 들어, N-말단 아세틸화 또는 메티오닐화에 의해 변형된 구조의 데술 페이토히루딘 화합물을 의미한다.

따라서 본 발명은, 히루딘의 아미노산 서열을 코오딩화한 DNA 서열을 함유하는 발현 플라스미드에 의해 형질 전환되며, 발현 조절 서열에 의해 조절된 숙주 세포를 동화성 탄소 및 질소원을 함유하는 액체 영양배지중에서 배양시키고, 생성물을 숙주 세포로부터 유리시켜 분리하며, 필요에 따라서는 공정에 따라 수득할 있는 생성물에 디설파이드 결합을 분해하기에 적절한 환원제를 첨가하고, 생성된 환원된 폴리펩타이드를 새로운 디술파이드 결합을 형성시키기에 적절한 산화제로 처리하고, 경우에 따라서는, 생성된 히루딘 화합물을 다른 히루딘 화합물로 전환시키고, 경우에 따라서는 본 공정에 따라 수득할 수 있는 히루딘 활성을 갖는 화합물의 혼합물을 개개의 성분으로 분리하고/하거나, 경우에 따라서는, 생성된 염을 유리 폴레펩타이드로 전환시키거나, 생성된 폴리펩타이드를 그의 염으로 전환시킴을 특징으로하여 히루딘 활성을 갖는 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 다음 구조식의 히루딘 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[식 XIV]

상기식에서, V는 Val 또는 Met-Val이고 W는 Tyr 또는 Tyr(-OSO₃H)이다.

본 발명은 특히 V가 Val이고 W가 Tyr인 구조식(ⅩⅣ)의 데술페이토히루딘을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 공정에 따라 수득할 수 있는 히루딘 활성을 갖는 화합물, 특히 구조식(ⅩⅣ)의 화합물에서, 시스테인 잔기 Cys는 천연 히루딘과 동일한 배열로 디설파이드 결합에 의해 짝지워 결합되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 형질 전환된 숙주 세포의 배양은 그 자체로 공지된 방법으로 수행한다. 예를 들어, 여러가지 탄소원을 사용할 수 있다. 바람직한 탄소원의 예로는, 글루코오즈, 말토오즈 만니톨 또는 락토오즈, 또는 아세테이트와 같은 동화성 탄화수소가 있으며, 이들은 단독 또는 적절한 혼합물로서 사용할 수 있다. 적절한 질소원으로는 카사미노산과 같은 아미노산, 펩타이드 및 프로테인, 및 트립톤, 펩톤 또는 육추축물과 같은 그들의 분해 생성물; 효모 추출물, 맥아 추출물, 및 염화 암모늄과 같은 암모늄염, 설페이트 또는 니트레이트가 있으며, 이들은 단독 또는 적절한 혼합물로서 사용할 수 있다. 또한 사용할 수 있는 무기염으로는, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 염화물, 인산염 및 탄산염이 있다.

더욱이 배지는 예를 들어, 철, 아연, 망간등의 미량 원소와 같은 생육-촉진 물질, 및 바람직하게는 선택특이성(selection pressure)을 나타내고 발현 플라스미드를 상실한 세포의 생육을 방지하는 물질을 함유한다. 따라서, 예를 들어 발현 플라스미드가 amp^R유전자를 함유하는 경우 배지에 암피실린을 첨가한다. 이러한 항생적 활성 물질의 첨가는 오염된 항생물질-감수성 미생물을 사멸하는 효과를 갖는다.

배양은 그 자체로 공지된 방법에 따라 수행한다. 배양액의 온도 및 pH, 및 발효시간과 같은 배양 조건은 최대한의 히루딘 생성물을 수득할 수 있도록 선택한다. 따라서, 이 콜리 또는 효모 균주는 호기성 조건하에 침지하여 진탕 또는 교반하며 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 30℃, 및 pH4 내지 9, 바람직하게는 pH7에서, 약 4 내지 20시간, 바람직하게는 8내지 12시간 동안 배양시키는 것이 유리하다. 배양중 발현 생성물이 세포내 축적된다.

세포 밀도가 적정선에 이르렀을때 배양을 중지하고 생성물을 미생물 세포로부터 유리시킨다. 이와 같이 하기 위하여 세포를 SDS 또는 트리톤(Triton)과 같은 세척제로 처리하여 파괴시키거나 리소짐 또는 유사 작용 효소로 분해한다. 또다른 방법으로서, 또는 이와 병용하여, 전단력(예를 들어, X-프레스, 프렌치 프레스, 디노-밀(Dyno-mill)), 또는 글래스 비이드 또는 산화 알루미늄과 진탕하는 것과 같은 기계적 힘, 예를 들어 액체 질소중에서 냉동시키고 30 내지 40℃에서 행동시키는 방법, 및 초음파등을 사용하여 세포를 파괴시킬 수 있다. 이와 같이 생성된, 단백질 핵산 및 다른 세포성분을 함유하는 혼합물을 그 자체로 공지된 방법에 따라 원심 분리 후 단백질 성분에 대하여 집적한다. 따라서, 예를 들어, 비-단백질 성분은 대부분 폴리에틸렌이민 처리로 제거되고 히루딘 화합물을 함유하는 단백질 성분은, 예를 들어, 황산 암모늄 또는 다른 염으로 용액을 포화시킴으로써 침전된다. 또한 세균 단백질은 아세트산(예를 들어, 0.1%, pH4-5)으로 산성화시켜 침전시킬 수 있다. 아세트산 상등액을 n-부탄올로 추출하여 히루딘 화합물을 더욱 집적시킬수 있다. 다른 정제 방법에는, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, HPLC, 역상 HPLC등이 크로마토그래피 공정이 포함된다. 따라서 혼합물중 성분의 분리는, 투석; 전하량에 따른 겔-전기영동 또는 담체를 사용치 않은 전기영동; 분자량에 따른 적절한 세파덱스(Sephadex) 컬럼; 예를들어, 항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 적절한 담체에 착상된 트롬빈을 사용한 친화성 크로마토그래피, 또는 특히 문헌에 공지된 다른 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

예를 들어, 발현된 히루딘 화합물의 분리는 다음의 단계로 구성된다: 세포를 배양 용액으로부터 원심분리하여 분리하고, 분해 효소로 처리하고/하거나 냉동 및 해동시켜 세포를 파괴함으로써 조추출물을 생성하고, 원심분리하여 불용성 성분을 제거하고, 폴리에틸렌이민을 가형 DNA를 침전시키고, 황산 암모늄으로 단백질을 침전시키고, 모노클론성 항-데술페이토히루딘 항체 칼럼 또는 트롬빈 칼럼 상에서 용해된 침전물을 친화성 크로마토그래피한 다음 투석 또는 세파덱스 G25 또는 세파덱스 G10상에서 크로마토그래피하여 생성된 용액을 탈염시킨다.

또한, DNA를 분리해낸 후 세균 단백질을 1% 아세트산을 사용하여 침전시키고 히루딘 화합물을 산성상등액으로부터 n-부탄올로 추출할 수 있으며, 또는 산성 상등액을 직접 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 디에틸아미노 에틸셀룰로오즈 DEAE 53)할 수 있다. 다른 정제 단계에는 세파덱스 G50 (또는 G75)상에서의 겔 여과 및 역상 HPLC가 포함된다. 탈염은 세파덱스 G25에서 다시 수행한다.

항-히루딘 또는 항-데술페이토히루딘 항체(예를 들어, 토끼 또는 하이브리도마(hybridoma) 세포로부터 수득할 수 있는 모노클로날 항체) 시험, 트롬빈 시험(15) 또는 혈액 응집 시험(16)은 히루딘 활성 측정에 사용할 수 있다. 본 발명의 공정에 따라 수득할 수 있는 히루딘 화합물은 그 자체로 공지된 방법에 따라 다른 히루딘 화합물로 전환시킬 수 있다.

예를 들어, W가 Tyr인 구조식(ⅩⅣ)의 화합물은, 예를 들어, 거머리 세포로부터 수득할 수 있는 티로신 설포트랜스퍼라아제와 반응시켜 W가 Tyr(-OSO₃H)인 구조식(ⅩⅣ)의 화합물로 전환시킬 수 있다. 또는 V가 Met-Val인 구조식 XⅣ의 화합물로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조할 수 있는, N-말단 메티오닐 잔기를 함유하는 히루딘 화합물은 시아노겐브로마이드를 사용한 공지의 방법으로 말단 메티오닐 잔기를 제거하여 N-말단 메티오닐 잔기를 함유하지 않는 상응하는 화합물로 전환시킬 수 있다. 시아노겐브로마이드와의 반응은 산성수용액 매질, 예를 들어, 매우 희석된 염산, 예를 들어, 0.1내지 0.3N 염산중에서나 또는 강유기산, 예를 들어 50 내지 70% 포름산 중, 실온, 약간의 승온 또는 감온, 예를 들어 약 15 내지 약 25℃에서, 약 24시간 걸쳐 수행한다.

선행 시험에 의하면 디설파이드 결합의 손상받지 않은 상태가 천연 히루딘의 응집 억제 활성에 매우 중요한 것으로 나타났다[참조: 문헌참조 2]. 숙주 세포의 선택에 따라서, 거머리 세포에서 일어나는 자연적 방법과는 다른 방식으로 일차 해독 생성물중 6개의 시스테인 라디칼이 결합하여 3개의 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 생성물의 ＂잘못된＂ 3차 구조로 인하여 전술한 히루딘분석(예를 들어, 트롬빈 테스트)에 의해 확인될 수 있는 유용한 약리학적 성질, 특히 응고 억제작용이 감소 또는 소멸될 수 있다. 이런 경우, 적절한 환원제를 사용하여 디술파이드 결합을 절단하고, 환원된 폴리펩티드를 적절한 산화제로 처리하여 새로운 디술파이드 결합을 형성시켜야 한다. 형성된 생성물의 히루딘 활성(예를 들어, 트롬빈테스트에서)을 기준으로 하면 선택조건(환원 및/또는 산화제)이 바람직하게 생리학적으로 활성히루딘을 생성시키는지의 여부 또는 상기 조건이 기지의 방법으로 수정되어야 할 것인지의 여부를 확인할 수 있다.

디술파이드 결합을 분해하기에 적합한 환원제는, 예를 들어, 티오페놀, 4-니트로티오페놀, 1,4-부탄디티올 및, 특히, 1,4-디티오트레이톨과 같은 티올 화합물이다. 환원 공정은 수성 알카리 배지중에서, 예를 들어, 알카리 금속 수산화물(예; 수산화나트륨), 알카리 금속 탄산염(예; 탄산 나트륨), 또는 유기 염기, 특히 트리-저급 알칼아민(예; 트리에틸아민)의 회수용액중, 실온에서 수행하는 것이 바람직하다.

환원된 폴리펩타이드중의 디설파이드의 새로운 연결 공정에 적합한 산화제는, 예를 들면, 대기 산소이며, 이것은 촉매량의 전기 금속 염(예; 황산 제2철, 염화 제2철 또는 황산 구리); 요오드화 칼륨 부가물, KI₃형태의 요오드(이때, 이것은 알코올성, 예를 들어, 메탄올성, 또는 수성 알코올성, 예를 들어 수성 메탄올성 용액중에서 사용되는 것이 바람직하다): 수용액중의 칼륨 헥사시아노-페레이트(Ⅲ); 및 물 및 수-혼화성 알코올, 예를 들어 메탄올로 이루어진 혼합물중에서 또는 물중에서 반응할 수 있는 1,2-디요오도에탄 또는 아조-디카복실산 디메틸에스테르 또는 디에틸 에스테르가 임의로 부가된 폴리-펩타이드의 수용액을 통해 전달된다. 산화 공정은 특히 실온에서 수행한다. 목적하는 히루딘 화합물로부터 시약, 특히 그 염, 및 산화 및 환원제 및 그의 2차 생성물을 제거하는 공정은 그 분야에서 공지된 방법에 따라, 예를 들면 분자량 여과(예; 세파덱스 또는 바이오겔상에서)에 의해서 이루어진다.

그 방법에 따라 얻을 수 있는 히루딘 활성을 갖는 화합물들의 혼합물은 공지의 방법으로 개개성분으로 분리할 수 있다. 적당한 분리 방법에는, 예를 들어, 크로마토그래피법(예; 흡착크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC), 또는 중 분배(multiplicative partitioning) 또는 전기영동법(예; 셀룰로즈 아세테이트상의 전기영동법 또는 겔전기영동법, 특히 폴리아크릴 겔전기영동법(＂PAGE＂)이 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 얻을 수 있는 신규의 데술페이토히루딘 화합물, 특히 V가 Met^-Val을 나타내고 W가 정의된 바와 같은 일반식(ⅩⅣ)의 화합물 및 그의 염에 관한 것이다.

본 발명은 또한 RP-HPLC 상수[조건 : 비닥 218 TP5415; 4.6X150MM; 유속 1.2ML/min; 용출 : A : 0.1%트리플루오로아세트산, B : 아세토니트릴/물 8 : 2+0.07% 트리플루오로아세트 산. 변화율 : 2분. 16%B, 이어서 3분 동안 20%B로 증가, 다시 15분간 25% B로 증가, 다시 27분간 64% B로 증가], FPLC 상수[조건 : 모노 큐-칼럼, 4.6mm×150mm·완충액 A : 20mM 트리스·HC1 pH7.5; 완충액 B : 20mM 트리스·HC1/1M NaC1염의 변화율 : A : 15% 완충액 B로 9ml 용출 70% 완충액 B로 증가시켜 10.7ml 용출] 및 다음과 같은 UV 흡수에 의해 특징지어지는 신규의 데술페이토히루딘 및 형질전환된 숙주 균에 의한 그의 제조방법에 관한 것이다.

화합물 A : RP-HPLC, 보유시간 16.83분;

FPLC : 390mM NaC1에서 용출; UV(물) : λmax=275mm;

화합물 B : RP-HPLC : 보유시간 18.43분;

화합물 C : RP-HPLC : 보유시간 19.6분;

FPLC : 420mM NaC1에서 용출;

화합물 D : RP-HPLC : 보유시간 20.6분;

FPLC : 460mM NaC1에서 용출;

화합물 E : RP-HPLC : 보유시간 21.53분;

FPLC : 500mM NaC1에서 용출; UV(물); λmax=273mm;

본 발명에 따라 제조될 수 있는 화합물 및 신규의 화합물, 예를 들면, 일반식(ⅩⅣ)의 화합물은 유리형 뿐아니라 그의 염형태 특히, 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 그들은 유리 아미노 그룹을 갖는 여러가지 아미노산 잔기를 함유하고 있기 때문에 본 발명에 따른 화합물은, 예를 들어, 산 부가염의 형일수 있다. 상기의 산부가 염으로는 특히 통상의 치료적으로 유용한 산과에 생리적으로 무독한 염을 들 수 있고; 무기산으로는 염산과 같은 할로겐화 수소산, 및 황상 및 인산 또는 피로인산을 들 수 있으며; 적합한 유기산은 특히 벤젠 또는 P-톨루엔-설폰산 또는 저급 알칸설폰산(예; 메탄설폰산)과 같은 설폰산, 및 또한 아세트산, 락트산, 팔미트, 스테아르산; 말산, 타타르산, 아스코르브산 및 시트르산과 같은 카복실산이다. 또한 히루딘 화합물은 유리 카복실 그룹을 갖는 아미노산 잔기를 함유하고 있으므로, 금속염, 특히 알카리 금속 또는 알카리 토금속염, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘염의 형태일 수 있거나, 또는 암모니아로부터 유도된 암모늄 염 또는 생리적으로 무독한 유기 질소-함유 염기의 형태일 수 있다. 그러나, 그들은 유리 카복실 그룹과 유리 아미노 그룹을 동시에 함유할 수 있기 때문에, 내부 염 형으로 존재할 수도 있다.

공정에 따라, 본 발명에 따른 화합물은 유리형, 산 부가염의 형 또는 염기염의 형으로 수득된다. 유리 화합물은 그 분야에 공지된 방법으로, 예를 들면 pH값을 등전점으로 조절함으로써 산 부가염 및 염기염으로부터 수득될 수 있다. 유리화합물로부터, 차례로 산 또는 염기, 예를 들어 상기 언급된 염을 형성하는 산 또는 염기와 반응시키고, 증발 또는 동결건조시킴으로써 각각 치료적으로 허용되는 산부가염 또는 염기 염을 수득할 수 있다.

데술페이토히루딘에 대한 모노클로날 항체와 그와 같은 항체를 함유하는 실험 키트(kit)

특정 항원에 결합하는 항체의 능력으로 항원의 정성 정량 분석(면역 검정) 및 항원의 정제(면역친화성 크로마토그라피)의 체외 실제 사용이 가능하다. 면역된 동물의 혈청에는 통상적으로 다른 친화성을 갖는 다른 결합 부위에서 동일한 항원과 반응하는 다수의 다른 항체가 함유되어 있으나, 그외에도 개개인의 그 이전의 경험을 반영하는 다른 항원에 대한 항체도 있다. 그러나 항원의 분석 및 정제를 위한 항체의 연속적 이용에는 높은 특이성 및 재생성이 요구된다.

이러한 요구에 부합되는 균질 항체는 퀼러 및 밀스타인(Kohler Milstein)이 기술한 하이브리도마법(hybridoma technique)에 의해 제조되었다(17). 원칙적으로, 그 기법은 면역화된 동물의 예를 들어 비장으로부터 방출되는 항체-분비B-임파구를 종양 세포와 융합시킴을 특징으로한다. 생성된 하이브리도마 세포는 그 능력을 분할하여 단일형의 항체를 생성, 분비함으로써 그 능력을 무한정한 크기로 증폭시킨다. 비 융합 종양 세포는 사멸 제거되고, 하이브리도마 세포는 증폭된 선택성 배지중에서 배양시키므로써, 및 적절한 처리에 의해서, 클론(Clone), 즉 단일 하이브리도마 세포로부터 유도되고 유전적으로 동일한 세포 집단은 수득 및 배양될 수 있으며, 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체는 단리될 수 있다.

본 발명은 데술페이토히루딘 및 히루딘에 대한 모노클로날 항체, 그와 같은 항체를 생성하는 하이브리도마세포 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 데술페이토히루딘 또는 히루딘과 특이적으로 반응하는 것들로부터 선택된 하이브리도마 세포계 및 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항-데술페이토히루딘 및 항-히루딘 항체의 제조 방법은 마우스에 데술페이토히루딘 또는 히루딘을 투여하여 면역이 생기게 하고, 그와 같은 방법으로 면역이 생긴 동물이 B-임파구를 골수종 세포(myeloma cell)와 융합시킨 후, 생성된 하이브리도마 세포를 클론화시키고, 시험관내에서 또는 마우스에 주사함으로써 배양시킨 후, 그 배양물로부터 항체를 분리함을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 면역친화성 크로마토그래피 칼럼 및 이들 항체를 함유하는 면역검정용 실험 키트에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라, 마우스 예를 들어 Balb/C 마우스를 공지의 방법으로 면역화시킨다. 놀라웁게도 데술페이토히루딘 및 히루딘이 비교적 작은 프로테인분자일지라도 면역화가 성공적으로 이루어진다. 바람직한 태양에 있어서, 항체-생성 B-임파구의 적당수가 생성될때까지 데술페이토히루딘 또는 히루딘 각각을 매주 또는 수주, 예를 들어 5 내지 12주 간격으로 주사한다.

면역화된 마우스의 B-임파구-함유 기관, 에를들어 비장 세포를 회수하여 돌연변이로 선택성 배양 배지중에서는 성장하지 않는 골수종 세포와 융합시킨다. 그와 같은 골수종 세포는 공지이며, 예를 들어 X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 또는 SP 2/0으로 표시되는 것들이다. 바람직한 태양에 있어서, 면역화된 마우스의 비장세포를 세포계 X63-Ag8.5.6.3의 골수종 세포와 용합한다.

융합공정은 B-임파구와 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜, 센다이 바이러스, 염화 칼슘 또는 라이소레시틴과 같은 세포 융합 제의 첨가제와 혼합하므로써 그 분야 공지의 방법에 따라 수행한다. 바람직하게는, 융합 공정은 분자량이 1000 내지 4000인 폴리에틸렌 클리콜의 존재하에서 수행한다. 융합후에, 생성된 하이브리드를 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘으로 보족된 선택성 배양 배지(HAT 배지) 중에서 그 분야에서 공지된 방법에 따라 배양시킨다. 비융합 골수종 세포는 이 배지에서는 성장할 수 없으며 정상의 임파구처럼 사멸한다.

하이브리도마 배양물의 상등액으로 그 분야 공지의 방법, 예를 들어 방사성 면역검정법 또는 응집 반응에 따라 그의 특이 항체의 함량을 측정할 수 있다. 그와 같은 실험에서는 놀라웁게도 그 방법으로 데술페이토히루딘 또는 히루딘에 특이적인 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 수득할 수 있음이 확인된다.

융합으로 생성되는 여러가지 하이브리도마 세포의 혼합물로부터 클로닝에 의해 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 분리한다. 이 목적을 위해, ＂제한희석(limiting dilution)＂이라 불리는 그 분야 공지의 방법에 따라, 단일 성장 세포로부터 출발하여 배양물을 준비한다.

대량 생산을 위해, 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 클론을 그 분야에서 공지된 배지중의 시험관내에서 배양하거나 마우스에 주사하여 증식시킨다. 바람직한 태양에 있어서는, 프리스탄으로 전처리된 마우스에 하이브리도마 세포를 주사하고, 복수를 제거한 후 황산 암모늄 용액으로 예비침전시켜 이것으로부터 항체를 단리한다.

이 하이브리도마 세포에 의해 얻어지는 데술페이토히루딘 및 히루딘-특이 항체를 면역친화성 크로마토그라피 컬럼에 그 분야 공지의 방법으로 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서 항체 용액을 적절한 담체(완충용액에 현탁된)에 가하고, 이어서 비결합 부분을 세척하여 담체상의 빈곳을 차단한다.

하이브리도마 세포에 의해 얻어지는 데술페이토히루딘- 및 히루딘-특히 항체를 실험 키트를 제조하기 위하여 그 분야 공지의 방법으로 사용할 수 있다. 이들 실험 키트는 여러가지 방법 예를 들어, 방사성-면역확산, 라텍스 응집, 반점 테스트(spot test), 경쟁 또는 샌드 위치 방사성면역검정, 효소 면역검정, 면역형광법 또는 면역화학 효소 실험에 기준을 둘 수 있다. 그와 같은 기트 여러가지 기원의 통상의 항체와는 달리 효소 또는 형광 담체와의 혼합물과, 그 위에 I¹²⁵와 같은 방사성 동위원소로 표지된, 또는 효소, 예를 들어 호저라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 또는 히루딘, 또한 효소 기질, 적절한 완충액, 겔, 라텍스, 폴리스티렌 또는 다른 충진제 및 담체를 함유할 수 있다.

약제학적 제제

본 발명에 따라 얻을 수 있는 공지(＂천연＂히루딘) 및 신규한(예;데술페이토히루딘)히루딘은 유용한 약물학적 특성을 가지며, 거머리로부터 추출되는 히루딘과 같이 예방적으로 또는 특히, 치료적으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 제조될 수 있는 데술페이토히루딘 화합물은 그들의 생물학적 활성이 천연의 히루딘과 적어도 동등하다. 따라서, 예를 들어, 데술페이토히루딘은 약 10^-11M의 Ki값을 갖는다. 데술페이토히루딘은 트롬빈에 완전히 특이적이며 혈액 응고계의 다른 프로테이나제와의 상호작용은 전혀 나타나지 않는다. 활성독성은 극히 낮다. 예를 들어, 래트에서는, 1g/KG용량에서 어떤 독성효과도 관찰되지 않는다. 마찬가지로, 과민 반응 또는 알러지 반응도 전혀 나타나지 않는다.

따라서 본 발명에 따른 신규의 데술페이토히루딘 화합물은 천연의 히루딘과 마찬가지로 수술후 혈전의 예방을 포함하여, 혈전 및 혈전 색전증의 치료 및 예방에, 급성 쇼크 치료에(예를 들어 폐혈병성 또는 폴리외상성 쇼크 치료에), 폐결핵성 응고질환의 치료에, 혈액투석, 혈액 분리 및 체외의 혈액 순환에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염의 적어도 하나를, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제와 함께 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

이들 조성물은 예를 들어 정맥주사, 피내주사, 피하주사 또는 근육주사와 같이 비경구적으로 또는 국소적으로 투여되는 경우에는, 상기 언급된 증상들에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 인체 또는 동물의 예방 및 치료에, 특히 상기 언급한 임상 증상에, 특히 인체 및 동물의 신체내 및 신체외의 혈액응고 억제에의 본 발명에 따른 신규한 화합물의 용도 및 그들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

용량은 투여 형태에 따라 치료 또는 예방의 목적에 따라 조절된다. 개개의 일회 용량의 크기는 투여 방법은 특정한 질병의 개개의 판단에 의해서 가장 최선으로 결정할 수 있다; 이 목적에 필요한 상대적 혈액 인자를 특정하는 방법은 그 분야에 숙련가들에게는 잘 알려져 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 화합물의 치료적 유효량을 주사하는 경우에 용량범위는 체중 kg당 약 0.005 내지 약 0.1mg이다. 체중 kg당 약 0.01내지 약 0.05mg의 범위가 바람직하다. 투여는 정맥, 근육 피하주사한다. 따라서 단일 용량의 비경구 투여용 약제학적 제제는, 투여양식에 따라, 1회용량당 본 발명의 화합물을 약 0.4 내지 약 7.5mg 함유한다. 활성 성분 외에도 이들 약제학적 조성물은 통상, 약 3.5 내지 7의 pH값을 유지시켜주는 완충액, 예를 들어 인산염 완충액 및 등장도를 조절하기 위한 염화나트륨, 만니톨 또는 소르비톨을 함유한다. 그들은 동결-건조형 또는 용해형일 수 있으며, 용액이 유리하게는 살균적으로 활성인 보존제, 예를 들어 0.2 내지 0.3% 4-하이드록시벤조산 메틸에스테르 또는 에틸 에스테르를 함유할 수 있다.

국소 적용제제는 수용액, 로션 또는 겔, 유성용액 또는 현탄액 또는 지방-함유 또는, 특히, 유화연고형일 수 있다. 수용액 형태의 제제는, 예를 들어, 본 발명에 따른 활성 성분, 또는 치료적으로 유용한 그의 염을 pH4 내지 6.5의 완충 수용액중에 용해시키고, 필요하면, 추가로 활성 성분 예를 들어 소염제 및/또는 폴리머성 결합제, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈, 및/또는 보존제를 가하므로써 얻어진다. 활성 성분의 농도는 10ml의 용액 또는 10g의 겔중에 약 0.1 내지 1.5mg, 바람직하게는 약 0.25 내지 1.0mg이다.

국소용 오일 형은, 예를 들어, 임의로 알루미늄 스테아레이트와 같은 팽창제 및/또는 다가 알코올(예; 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테아레이트 또는 소르비탄 모노올레이트)과 같은 HLB치(＂친수성-친유성평형＂) 10이하의 계면활성제(텐사이드)를 부가하면서 본 발명에 따른 활성 성분 또는 치료적으로 유용한 그의 염을 오일중에 현탁시키므로써 얻어진다. 지방-함유 연고는(예를 들어, 임의로 10 이하의 HLB 치를 갖는 텐사이드를 부가하면서, 본 발명에 따른 활성성분을, 또는 그의 염을 퍼질 수 있는 지방 기제중에 현탁시킴으로써 얻어진다. 유화 연고는 10 이하의 HLB치를 갖는 텐사이드를 부가하면서, 연성, 퍼짐성 지방 기제중에 본 발명에 따른 활성 성분, 또는 그의 염의 수용액을 연마시킴으로써 얻어진다. 국소용의 이들 제제는 또한 모두 보존제를 함유할 수 있다. 활성 성분의 성분의 농도는 약 10g의 기제중에 약 0.1 내지 약 1.5mg, 바람직하게는 0.25 내지 1.0mg이다.

상기에 기술된 조성물 및 인체 및 동물에 직접 의학적 용도로 쓰여지는 이들과 유사한 약제학적 조성물외에, 본 발명은 또한 사람 또는 동물의 생체 외부에 사용되는 의약품용 약제학적 조성물 또는 제제에 관한 것이다. 그와 같은 조성물 및 제제는 특히 체외에서 순환 또는 치료(예를 들어 인공 신장중에서의 체외 순환 또는 투석), 보존 또는 변형(예를 들어 혈액 분리)시키고자 하는 혈액에 항응고 보조제로서 사용된다. 그와 같은 제제는, 스톡용액 도는 단일 용량형의 선택적 제제와 같이 전술된 주사제와 조성이 유사하나; 활성성분의 양 또는 농도는 유리하게는 치료할 혈액 용적, 더욱 정확하게는, 그의 트롬빈 함량에 준한다. 이 관계에서 트롬빈의 활성을 약 5배(중량기준)소실시키는 본 발명에 따른 활성 성분은 (유리 형) 비교적 대량에서도 생리적으로 해가 없으며 과량의 위험이 심지어 예를 들어, 수혈하는 동안에도 일어나지 않도록 높은 농도에서도 순환 혈액으로부터 아주 신속히 제거된다. 비록 상한선이 위험없이 초과될 수 있더라도 특정 목적에 따라, 적절한 용량은 혈액 ℓ당 활성성분 약 0.01 내지 1.0mg이다.

본 발명은 특히 실시예에 기술되는 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열, 그와 같은 DNA 서열을 함유하는 발현 플라스미드, 그와 같은 발현 플라스미드로 형질전환된 미생물, 히루딘에 대한 모노클로날 항체, 그와 같은 항체를 생성하는 하이브리도마세포, 및 그와 같은 항체를 함유하는 면역 검정용 실험키트, 실시예에 기술된 그들의 제조방법 및 형질 전환된 미생물을 사용하여 히루딘 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 실시예에서 기술된 방법에 관한 것이며, 또한 실시예에서 기술된 신규한 데술페이토히루딘 화합물에 관한 것이다.

다음 실시예 및 도면은 본 발명을 이해하는데 도움을 주고자 제시된 것으로 결코 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예에서 사용되는 약어의 의미는 다음과 같다 :

TNE 100mM NaC1, 50mM 트리스, HC1 pH7.5 및 5mM EDTA로 이루어진 용액

SDS 나트륨 도데실 설페이트

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

DTT 1,4-디티오트레이톨(1,4-디머캅토-2,3-부탄디올)

BSA 소혈청 알부민

EtBr 에티듐 브로마이드

트리스트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄

트리스.HC1 트리스 모노하이드로클로라이드

[실시예 1]

보호된 뉴클레오사이드 폴리스티렌 수지의 제조

750mg의 석신산 무수물 및 910mg의 4-디메틸아미노피리딘을 20ml의 절대 피리딘중의 2.57g(5밀리몰)의 5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘(MMT-O-T-OH)에 가하고 실온에서 16시간동안 방치한다. 피리딘용액을 농축시킨후에, 이것을 200ml의 에틸 아세테이트 중에 취하여, 10mL의 염화나트륨 포화 용액을 가하면서 매회 200ml의 0.1M 인산염 완충액과 함께 2회 진탕시킴으로써 추출하고, 다시 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고, 건조, 농축시킨 후 헥산을 적가한다. 침전된 생성물을 분리하여 에테르로 2회 연마한 다음, 300ml의 에틸 아세테이트중에 용해시키고 pH2.5의 0.1M 중황산 칼륨 180ml와 함께 0℃에서 진탕시켜 추출한다. 물로 2회 세척한 후에, 황산 나트륨상에서 에틸 아세테이트를 제거하고, 여과한 다음, 0.5ml의 피리딘을 가하여 농축시키고 헥산을 적가하여 희석시킨다. 침전된 석신산 유도체를 여과로 제거한다.

1.0g의 이 화합물을 4ml 에틸아세테이트 및 2ml의 디메틸포름아미드 중에 190mg의 N-하이드록시석신이미드와 함께 용해시키고, 370mg의 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드를 0℃에서 가해준다. 동결건조기중에서 밤새 정치시킨 후에, 침전된 N,N'-디사이클로헥실 우레아를 여과 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 차가운 0.1M 중탄산나트륨 및 물로 추출하고, 진공하에서 증발시킴으로써 탈수 및 농축시켜 건조시킨다. 잔사를 실리카겔상에서 에틸 아세테이트로 크로마토그라피시킨다.

TLC : 디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf치 0.45.

100mg의 이 N-석신이미도일석신산 에스테르를 2ml의 디클로로메탄 및 4ml의 디메틸포름아미도중의 1g의 아미노메틸폴리스티렌(아민 함량 110μmol/g)과 함께 20시간동안 교반한다. 폴리머 수지를 여과제거하고 디메틸포름 아미드, 메탄올, 디클로로메탄 및 메탄올로 세척하여 추출한다. 건조시킨후에, 1ml의 아세트산 무수물 및 100mg의 4-디메틸아미노 피리딘과 함께 6ml의 피리딘중의 수지를 30분간 교반시키므로써 반응하지 않은 아미노 그룹을 아세틸화시킨다. 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하여 폴리머 수지를 추출하고, 일정 중량에 도달할 때까지 건조시킨다. 분광학적 메톡시트리틸(MMT)-측정은 57μmol/g을 나타낸다.

[실시예 2]

다음 보호된 뉴클레오사이드/폴리스티렌 수지를 실시예 1과 유사하게 제조한다 :

5'-(4-메톡시-트리XLF)-N-이소부티XLF-데옥시구아노신으로부터 MMT-Q-G^1b-OCOCH₂CH₂

수득. 수율 32μmol/g.

[실시예 3]

트리뉴클레오티드의 합성

a) 디뉴클레오티드의 합성

7.73g(15밀리몰)의 5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘(MMT-O-T-OH)를 절대 피리딘으로 증발시키므로써 2회 농축시킨다. 잔사를 20ml의 절대 테트라하이드로푸란중에 용해시키고 테트라하이드로푸란중에 2-클로로페닐-디-(1-벤조트리아졸)-포스페이트 80ml의 0.2M액에 적가하면서 교반하고 습기를 제거한 다음 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한다. 생성된 2-클로로페닐-1-벤조-트리아졸릴 5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트의 용액을 세부로 나눈다.

a) 트리에틸암모늄-2-클로로페닐-5'(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트로 가수분해 :

100ml의 0.5M트리에틸암모늄 비카보네이트를 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트의 상기 용액의 3번째에 교반하면서 가한다. 15분 후에 디클로로메탄으로 추출한다. 디클로로메탄 용액을 물로 세척하고, 능축시킨 다음, 석유 에테르를 적가한다. 생성된 침전물을 흡인으로 여과 제거하고, 에테르/석유 에테르 1:1로 세척하므로써 추출한 다음 진공하에서 건조시킨다.

TLC : 디클로로메탄/메탄올/물(75 : 22 : 3) 중의 Rf치 0.35.β) 2-시아노 에틸-2-클로로페닐-5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트로 에스테르화 및 4-메톡시트리틸 보호 그룹의 제거:1.3ml의 2-시아노에탄올 및 2ml의 피리딘을 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트의 세 번째 용액에 가한다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 정치시킨다. 진공하에서 용매를 증류시키고 잔사를 에틸 아세테이트 중에 용해시킨 후 pH7의 0.1M 인산염 완충액 및 물과 함께 진탕시키므로써 반복적으로 추출한다. 유기산을 탈수, 농축시킨 후 헥산을 적가한다. 침전물을 여과 회수하며, 50ml의 디클로로메탄/메탄올 7:3중에 용해시키고, 0℃에서, 75mL의 디클로로메탄/메탄올중의 3.8g의 P-톨루엔-설폰산 모노하이드레이트 용액을 가한다. 2시간 후에, 반응 용액을 디클로로메탄으로 희석하고 차가운 중탄산나트륨 용액과 진탕시키므로써 추출한다. 유기산을 농축시키고 헥산을 가한다. 침전된 2-시아노에틸-2-클로로페닐-티미딘-3'-포스페이트를 디클로로메탄/메탄올 96 : 4로 실리카겔상에서 크로마토그라피시킨다.

TLC : 디클로로메탄/메탄올(9 : 1)에서의 Rf치 0.45.γ) 5'-(4-메톡시트리틸)-3'-시아노에틸-비스티미딘 디뉴클레오티드로의 축합

2.2g의 2-시아노에틸-2-클로로페닐-티미딘-3'-포스페이트를 무수피리딘과 함께 증발시켜 2회 농축시키므로써 탈수시키고, 생성물을 20ml의 절대 테트라하이드로푸란중에 용해시키고 세 번째 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트용액의 나머지에 가한다. 실온에서 18시간후에 얼음으로 냉각하면서 반응용액에 10ml의 물 및 200ml의 에틸 아세테이트를 가한다. 유기산을 중탄산 나트륨 및 물로 반복적으로 세척하고, 황산 나트륨상에서 건조시킨후 소 용적으로 농축한다. 인산잔기의 5'- 및 3'-말단이 보호된, 디뉴클레오티드를 에테르/헥산 1:1에 적가하여 침전시킨다.

TLC : 디클로로메탄/메탄올 0 : 1)에서의 Rf치 0.48.

b) 트리뉴클레오티드의 합성

1.17G(1밀리몰)의 전술된 완전히 보호된 디뉴클레오티드를 30ml의 디클로로메탄/메탄올 7 : 3중에 용해시키고, 얼음으로 냉각시키면서, 20ml의 디클로로메탄/메탄올 7 : 3중의 1.9g의 P-톨루엔설폰산 모노하이드레이트 용액을 가한다. 2시간후에, 빙냉된 중탄산나트륨 용액을 가하고 디클로로메탄으로 추출시킨다. 유기산을 건조, 농축시키고 헥산을 적가한다. 침전된 조 디뉴클레오티드와 유리 5'-하이드록시 그룹을 디클로로메탄중의 2 내지 8% 메탄올의 구배를 사용하여 실리카겔상에서 크로마토그라피한다.

TLC : 디클로로메탄/메탄올(9 : 1)에서 Rf치 0.33

850mg의 이 5'-하이드록시-디뉴클레오티드 및 1.06g의 트리에틸암모늄-2-클로로페닐-5'-4-메톡시트리틸)-티미딘-3'-포스페이트[비교. 패러그래프 a)α)]를 피리딘으로 증발시키므로써 2회 농축시킨 다음, 10ml의 절대 피리딘중에 용해시키고 560mg의 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT)를 가한다. 2시간후에, 2ml의 빙수를 가하고, 또 한시간 후에, 디클로로메탄으로 추출한다. 유기산을 중탄산 나트륨 포화용액 및 물로 세척하고 탈수, 농축시킨 후 에테르를 첨가한다. 침전된 트리뉴클레오티드를 실리카겔상에서 크로마토그라피로 정제한다. 디클로로메탄/메탄올(9 : 1)에서 Rf치 0.45

[실시예 4]

실시예 3과 유사하게, B¹B²B³로 표시되는 다음 일반식의 보호된 트리뉴클레오티드를 제조한다.

뉴클레오사이드 B¹, B², B³에 쓰여진 약어는 다음과 같다 :

A=N-벤조일-데옥시아데노신

C=N-벤조일-데옥시시티딘

G=N-이소부티릴-데옥시구아노신

T=티미딘

a) 디클로로메탄/메탄올(9 : 1)을 사용한 실리카겔 상에서의 박층 크로마토그라피

[실시예 5]

DNA 나선 96/97의 염기 제96번 내지 염기 제162번까지 67 염기 길이의 DNA 단편 합성

a) 트리뉴클레오티드로 부터 2-시아노에틸 보호그룹을 제거 :

실시예 3 또는 4로 부터 얻어지는 10μmol의 트리뉴클레오티드를 습기를 차단하면서 60μl의 피디딘/아세토니트릴/트리에틸아민(1 : 1 : 1)중에 용해시킨다. 실온에서 1시간후에 0.7ml의 과산화물-유리 에테르를 적가하고 원심분리하여 침전물을 제거한다. 조 트리에틸암모늄염을 50μl의 피리딘 중에 용해시키고 다시 0.5ml의 에테르로 침전시킨 뒤, 원심분리하고 고진공하에서 15시간동안 건조시킨다.

b) 부분적으로 보호된 트리뉴클레오티드를 폴리스티렌 수지에 결합된 올리고뉴클레오티드쇄와 커플링시킴 :

모든 조작은 220μl 용량의 반응 용기에서 용매 및 시약을 미세처리장치로 조절하면서 가하고 습기를 차단하면서 수행한다. 13mg(0.74μmol)의 티미딘/폴리스티렌 수지(실시예 1)를 반응용기에 넣고 다음과 같이 처리한다 :

1. 메틸렌 클로라이드, 2ml/분, 4분.

2. 메틸렌 클로라이드/이소프로파놀(85 : 15), 2ml/분, 2분.

3. 메틸렌 클로라이드/이소프로파놀(85 : 15)중의 아연 브로마이드 1M 및 1,2,4-트리아졸, 2ml/분, 2내지 3.5분.

4. 메틸렌클로라이드/이소프로파놀(85 : 15), 2ml/분, 4분.

5. DMF 중의 트리에틸암모늄 아세테이트 0.5M, 2ml/분, 5분.

6. 분자체-무수 피리딘, 2ml/분, 3분.

7. 테트라하이드로푸란(과산화물-유리, 분자체-건조됨), 2ml/분, 3분.

8. 질소 증기, 10분.

9. 150μl의 피리딘중에 용해된 10μmol의 트리뉴클레오티드 GTC(패러그래프 a)로부터의 트리메틸암모늄염) 및 8.9mg(30μmol)의 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT)를 주사.

10. 45℃, 20분.

11. 피리딘, 2ml/분, 4분.

12. 피리딘 중의 아세트산 무수물 5% 및 4-디메틸아미노피리딘, 2.5%, 2ml/분, 4분.

13. 피리딘, 2ml/분, 4분.

14. 피리딘/이소프로파놀(1 : 1), 2ml/분, 3분.

14단계의 조작모두를 21번 반복하되, 9번째 조작에서 GTC 대신 다음 트리뉴클레오티드를 그들의 트리에틸암모늄 염의 형태로(패러그래프 a), 각각 사용한다 : GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. 평균 커플링 수율은 97%이다. 최종 생성물은 다음 구조를 갖는다 :

c) 담체로 부터 DNA 단편을 회수하고 보호 그룹을 제거함 :

40.0mg(약 0.60μmol)의 DNA 합성수지 96/97를 400μl의 95% 피리딘중의 66mg(0.40밀리몰)의 0-니트로벤즈알독심 및 50μl(0.40밀리몰)의 1,1,3,3-테트라메틸 구아니딘과 함께 50℃에서 세시간동안, 실온에서 12시간 유지시킨다. 피리딘을 질소와 함께 날려보내고 잔사에 1.6ml의 수성 암모니아(33%)를 가한다음 밀폐 용기중 50℃에서 24시간동안 유지시킨다.

분리된 액상에서 진공하에서 암모니아를 제거하고 매회 3ml의 과산화물-유리 디에틸 에테르로 3회 세척한다. 바이오겔P6칼럼(100 내지 200 메쉬 3×66cm, 0.01몰 트리메틸암모늄 비카보네이트 pH7.5, 1.5ml/분)상에서 저분자 성분을 제거한 후에, 285ODS(260nm)의 DNA를 단리한다.

총 60ODS의 DNA를 HPLC칼럼(PRP-1/해밀톤, 250×4.6mm)상에서 분리한다. 변화율(용액 A:0.05M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH7.0 : 용액 B : 용액 A : 아세토니트릴1 : 1) : A중 30% B A중 60% B 50℃, 2ml/분에서 20분. 친유성 주 피이크(보유시간 약 14분)을 모아서, DE52 셀룰로즈(와트만) 칼럼상에서 농축시킨후, 용출시키고 에탄올로 침전시킨다. 4-메톡시트리틸 보호 그룹을 제거하기 위하여 침전물을 50μl의 아세트산/H₂O(4 : 1)중에 용해시키고 실온에서 45분간 놓아둔다. 반응 생성물을 동결건조시키고, 에탄올로 침전시키며, 8% 폴리아크릴아미드 겔(7M 우레아)상에서 전기영동적으로 분리하여 정제한다. 목축시켜, 다음 구조의 DNA 96/67을 에탄올로 침전시킨다.

[실시예 6]

실시예 5와 유사한 방법으로 다음 DNA 단편(5' 내지 3')을 제조한다:

[실시예 7]

단편 1/58, 46/64(상보적), 96/67 및 154/65(상보적)의 인산화

5'-말단에서의 인산화 및 방사성 표지는(18)에서 기술된 바와 같이[γ^-32P] ATP 및 T₄폴리뉴클레오티드키나제(Boehringer)로 이루어진다.

[실시예 8]

듀플렉스(duplex)Ⅱ로 폴리머화(데술페이토히루딘 유전자의 단편F₂)

키나제드 단편(kinased fragment) 96/67 및 키나제드 단편 154/64 각각 50Pmol씩을 24μl의 물에 용해시키고, 용액을 90℃에서 3분간 가열한 다음 5분 이내에 12℃로 냉각시킨다. 4μl의 엔도-R완충액(0.1몰트리스. HC1 pH7.5, 66mM MgCl₂, 66mM β-머캅토에탄올, 0.6M NaC1), 10μl의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, TTT, 각각 2×1-^-3몰, NH₃로 pH7.0으로 조절) 및 2μl(10단위)의 DNA 폴리머라제 Ⅰ을 첨가한 후에, 클레노우 단편(Boehringer) 인큐베이션을 12℃에서 30분간 실시한다. 90℃에서 3분간 가열하여 반응을 중단시키고 혼합물을 -80℃에서 저장하였다가 추가 공정에 필요할 때에 사용한다.

유사한 방법으로 키나제드 단편 1/58 및 46/64를 반응시켜 듀플렉스Ⅰ(데설페이토히루딘 유전자의 단편F₁)을 생성시킨다.

듀플렉스 Ⅰ 및 Ⅱ는 다음 구조를 갖는다 :

데설페이토히루딘 유전자의 단편 F₁및 F₂의 제조 공정은 다음 도식 5에 설명되어 있다:

도식 5 : 데술페이토히루딘 유전자 및 F₁-F₂의 단편 F₁및 F₂의 제조

[실시예 9]

폴리머화 및 단편 1/58, 키나제드 46/64, 키나제드 96/67 및 154/64의 연결, 데술페이토히루딘 유전자의 제조

단편 1/58, 키나제드 46/64, 키나제드 96/67 및 154/64 각각을 50pmol 씩 48μl의 물중에 용해시키고, 그 용액을 90℃에서 3분간 가열하고, 5분 이내에 12℃로 냉각시킨다. 8μl의 엔도-R 완충액(비교 실시예8), 20μl의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물(dATP, dCTP, dGTF, TTP 각각 0.002몰, NH₃로 pH7.0으로 조절) 및 2μl(10단위)의 DNA 폴리머라제Ⅰ을 가한 후에, 클레노우 단편(Boehringer) 인큐베이션을 12℃에서 30분간 실시한다. 90℃에서 3분간 가열하여 반응을 중지시키고, 페놀/클로로포름으로 추출한후에, 에탄올로 침전시켜 DNA를 단리한다. 생성된 DNA 혼합물을 100μl의 리가제/완충액(66mM 트리스. HC1 pH7.5, 6.6mM MgC1₂10mM 디티오트레이톨, 5mM ATP)중에 용해시키고, 50단위(2μl)의 T₄DNA 리가제(Biolabs)를 가한후에 20℃에서 20시간동안 인큐베이션시킨다. 70℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시키고, 페놀/클로로포름으로 추출한 후에 에탄올로 침전시켜 DNA를 단리한다. 전기영동법에 의해 8%폴리아크일아미 겔상에서 혼합물을 분리한 후에, 217염기 쌍의 연결 생성물을 전기용출시키고, DE 52셀룰로즈 칼럼상에서 농축시키고, 용출시킨후에 에탄올로 침전시켜 단리한다.

데술페이토히루딘 유전자는 다음 구조를 갖는다 :

4개의 단편으로 부터 데술페이토히루딘 유전자를 제조하는 이 다음 도식 6에 설명되어 있다 :

도식 6 : 4개의 합성단편으로부터 히루딘 유전자의 제조

[실시예 10]

데술페이토히루딘 유전자의 F₁-DNA를 함유하는 플라스미드 pML300의 제조(제1도)

a) 직선화된 벡터 pBR322/EcoRⅠ/PvuⅡ의 제조

100μg/mL의 젤라틴을 함유하는 200ml 용액 중에서 5μg의 pBR322플라스미드 DNA를 5단위의 PvuⅡ 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 37℃에서 1시간동안 분해한다. 그후에 용액을 100mM 트리스.HC1(pH7.5), 50mM NaC1로 조절하고 DNA를 30단위의 EcoRⅠ 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 37℃에서 2시간동안 분해한다. 이어서 용액을 50mM트리스.HC1(pH8)로 조절하고, 10μg/μl의 DNA 농도에서 2단위의 소장관의 알카리성 포스파타제(베링거)와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션한다. 그 용액을 65℃에서 60분간 가열하여 효소를 불활성화시킨다. 이어서 용액을 TNE로 표준화하고 1용적의 페놀 및 클로로포름으로 추출한 다음, 분해된 DNA를 2용적의 알코올로 -20℃에서 일야로 침전시킨다.

트리스-아세테이트-EDTA 완충액(pH8)중 1% 저융점 아가로즈(Biolabs) 상에서 겔 전기영동법에 의해 소DNA 단편(2067 염기 쌍)으로 부터 pBR322 DNA로 부터 잘라낸 벡터(pBR322/EcoRⅠ/PvuⅡ, 2297 염기쌍)를 분리해낸다. 아가로즈 겔중의 DNA를 EtBr로 착색시킨 후에, pBR322/EcoRⅠ/PvuⅡ 벡터(=2297 염기쌍)의 DNA 밴드를 함유하는 겔의 부분을 절단해내어 65℃에서 10분간 액화시킨다. 이 DNA 용액에 20용적의 TNE를 가하고, DE-52 크로마토그라피에 의해 뮬러등에(19) 따라 DNA를 정제하고, 페놀/클로로포름으로 추출하여 알코올로 -20℃에서 밤새 DNA를 침전시킨다. DNA 침전물을 50μl의 0.01M트리스.HC1(pH8), 0.1mM EDTA중에 용해시키고 다시 사용할 때 까지 -20℃로 보관한다. 1.4μg(=3.2pmol)의 DNA를 수득한다.

b) F₁-DNA/EcoRⅠ의 제조

24mg(=1.3pmol)의 화학적으로 합성된 F₁-DNA(실시예 8참조)를 5μl의 100mM트리스.HC1(pH7.5), 50mM NaCl 및 100μg/ml 젤라틴중, 37℃에서 30분간 5단위의 EcoRⅠ 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 분해한다. 그 후에, 이 용액에 0.06μg(=0.14pmol)의 선형화된 벡터 pBR 322/EcoRⅠ/PvuⅡ(실시예 10a)를 가한다. 이어서 65℃에서 가열하여, 효소를 불활성화시키고 10분후에 TNE를 표준화한 다음 페놀/클로로포름으로 추출한다. 알코올로 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNA를 다시 사용할 때까지 -20℃의 알코올하에서 보관한다.

c) pBR322/EcDRⅠ/PvuⅡ벡터 DNA의 F₁-DNA/EcoRⅠ와의 연결 및 플라스미드 pML300의 제조

두개의 언급된 DNA 단편을 함유하는 실시예 10 b)에서 얻어지는 DNA 침전물을 50mM 트리스.HCl(pH7.8), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP 및 100μg/ℓ 젤라틴의 20μl 용액중에 용해시키고 15℃에서 30분간 25단위/μl T₄DNA 리가제(Biolabs)로 처리한다. 이 방법으로 F₁-DNA를 함유하는 재조합체 플라스미드 pML300을 용액중에서 수득한다.

d) 플라스미드 pML300으로 E.coli HN101을 형질 전환시킴

형질전환에 필요한 칼슘으로 예비 처리된 E.coli HB101 세포를 만델 등(Mandel et al.)(14)이 기술한 바와 같이 제조한다.

재조합체 플라스미드 pML300을 함유하는 c)에서 얻어진 용액을 65℃에서 10분간 가열하여 T₄DNA 리가제를 불활성화시키고 이어서 37℃로 냉각시킨다. 10μl의 이 반응 혼합물을 총용적 200μl 중의 10mM MgCl₂및 10 mM 트리스.Hc1(pH7.5)중의 150μl의 칼슘-처리된 E.coli HB101 세포에 가한다.

그 후에, 이 혼합물을 얼음중에 30분간 냉각시키고 42℃에서 2분간 가열한 다음 1ml의 L-배지(비교실시예 18)중, 37℃에서 50분간 정치시킨다. 이어서 그 혼합물을 0.2ml 분취량으로 5개의 한천 평판상(맥콘케이 아가, 디프코)에 도표시키며, 이 한천 평판은 60μg/ml의 암피실린(Serva)을 함유한다. 이이서 한천평판을 37℃에서 16내지 18시간 동안 유지시킨다. 형질전환된 E.coli HB101의 484암피실린-내성 콜로니가 얻어진다.

e) F₁-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝

470개의 형질전환된 콜로니(실시예 10d)를 니트로셀룰로즈 필터 B85(Schleicher and Schull) 상으로 압축시킨다. 그룬스타인 및 호그네스(Grunstein and Hogness)(20)에 따라, 콜로니를 용해시키고 그들의 변성된 DNA를 필터에 고정시킨다. 그후에 20ml(필터당)의 4×SET[=30mM 트리스.HCl(pH8), 150mM NaCl 1mM EDTA의 용액], 0.1%(W/V) 피콜 400, (pharmacia) 0.5% SDS, 50μg/ml 변성된 소 타이무스 DNA 중, 64℃에서 4시간동안 필터의 프리하이브리드화 공정을 수행한다. 그후에 나트로셀룰로즈 필터를 20ml(필터당)의 5×SET(W/V)필콜 400, 0.2% SDS 및 50μg/ml 변성된 소 타이무스 DNA 중 64℃에서 16시간 동안 32p 방사표지된 프로브(probe)(필터당 약 10³내지 10⁴세렌코브 cpm)로 처리한다 . 상보적 올리고뉴클레오티드 46/64(비교, 실시예 6)를 방사성 프로브로서 사용한다.

그 후에, 필터를 실온에서 2×SET, 0.2% SDS 중에서 2회 세척하고(30분간), 이어서 2×SET, 0.5% SDS중, 60℃에서 2회 세척한다(60분간). 이어서 필터를 3MM페이퍼(whatman) 사이에서 건조시키고 -80℃에서 X-선필름(Fuji)상에 증감 스크린(일포드)과 함께 1 내지 2일 동안 놓아둔다.

생성된 오오토라디오그램은 추가 공정에 사용될 수 있는 71개의 양성 콜로니(클론)을 나타내며, 이들중의 하나를 pML 300으로 표시한다.

[실시예 11]

데술페이토히루딘 유전자의 F₂-DNA를 함유하는 플라스미드 pML305의 제조(제2도)

a) 직선화된 벡터 pBR 322/BamHⅠ/NruⅠ의 제조

100mM Nacl 6mM 트리스. HCl(pH 7.9) 6mM MgCl₂및 100μg/mL 젤라틴의 용액중 37℃에서 5μg의 pBR 322 플라스미드 DNA를 30단위의 BamHⅠ 제한 엔도뉴클레아제로 30분간 분해한다. 이어서 그 용액에 15단위의 PvuⅡ제한 엔도뉴클레아제를 가하고 37℃에서 2시간동안 분해한다.

반응 혼합물을 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨다. 그후에 트리스-아세테이트-EDTA완충액(pH8)중의 1% 저융점 아가로즈 상에서 겔 전기영동법에 의해 각각으로 부터 2개의 DNA 단편을 분리한다(참조 실시예 10a).

pBR 322 BamHⅠ/PvuⅡ벡터(=2672염기쌍)의 DNA 밴드를 절단해서 동결건조시키고, DE-52 크로마토그라피에 의해 뮬러 등(19)의 방법에 따라 정제한다. 0.75μg(=1.5pmol)의 DNA를 수득한다.

b) F₂-DNA/BamHⅠ의 제조

25μg(=1.3pmol)의 화학적으로 합성된 F₂-DNA(실시예 8)을 20μl의 150mM Nacl 6mM 트리스. HCl(pH7.9), 6mM MgCl₂및 100μg/ml 젤라틴중, 37℃에서 30분간 16단위의 BamHⅠ 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 분해한다. 이어서 이 용액에 60mg(=96 나노물)의 선형화된 벡터 pBR 322/BamHⅠ/PvuⅡ(실시예 11a)를 가하고 TNE로 표준화한 후, 페놀/클로로포름으로 추출한다. 2용적의 알콜올로 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNE를 추가의 공정에 사용할때까지 -20℃의 알코올하에서 보관한다.

c) pBR 322/BamHⅠ/PvuⅡ벡터 DNA의 F₂-DNA/BamHⅠ과의 연결 및 플라스미드 pML305의 제조.

상기 언급된 두개의 단편을 함유하는, 실시예 11b)에서 얻어지는 DNA 침전물을 50mM 트리스. HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP 및 100μg/ml 젤라틴의 20μl의 용액중에 용해시키고 15℃에서 30분간 15단위/μl T₄DNA 리가제(Biolabs0로 처리한다. 이 방법으로, F₂-DNA를 함유하는 재조합체 플라스미드 pML 305를 용액중에서 수득한다.

d) 플라스미드 pML305로 E.coli HB 101을 형질전환시킴

칼슘-처리된 E.coli HB 101세포의 형질전환 공정은 실시예 10 d)에 기술된 바와 같이 수행한다. 실시예 12c)에서 얻어지는 10μl의 반응 혼합물을 사용한다. 313 암피실린-내성 콜로니를 수득한다.

e) F₂-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝

65개의 형질전환된 콜로니 실시예 11d)를 실시예 10e)에서 기술된 방법으로 F₂-DNA에 대해 실험한다. 상보적올리고뉴클레오티드 154/64(비교 실시예 6)를 방사성 프로브로 사용한다. 오오토라디오그램에서 2개의 양성 콜로니를 수득하며, 이들중의 하나를 pML 305로 표시한다.

[실시예 12]

클론 PML 300 및 pML 305의 특징화

재조합체 플라스미드 pML 300 및 pML 305의 DNA를 이쉬-호로비츠(Ish-Horowitz)(21)의 방법에 따라 단리한다. F₁-DNA 및 F₂-DNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 맥삼 및 길버트(11)의 방법에 따라 확인한다. 이 목적을 위하여, 각각 10μg의 PML 300의 플라스미드 DNA를 EcoRⅠ 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 10μg의 PML 305의 플라스미드 DNA를 BamHⅠ 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 다음 아가로즈 겔로부터 겔용출에 의해 직선화된 DNA_S를 단리한다[비교, 실시예 10a)]. 이어서 DNA의 5²-말단을[γ^-32p] ATP 및 T₄폴리뉴클레오티드 키나제(P-L-B-바이오 케미칼스)로 방사능 표지한다(고유 활성 5000ci/밀리몰, 아머샴).

방사능 표지된 DNA를 두번째 제한 엔도뉴클레아제(EcoRⅡ)로 절단한다. 생성된 DNA 단편을 아가로즈로부터 겔용출시킴으로써 분리한다. PML 300의 경우에, F₁-DNA의 뉴클레오티드 결합서열은 EcoRⅡ-EcoRⅠ^*단편(약 109개의 염기쌍)으로 부터 결정하고, F₂-DNA의 뉴클레오티드 결합서열은 EcorⅡ-BamHⅠ^*단편(약 122개의 염기쌍)으로부터 결정한다(*는 방사능 표지된 DNA 말단을 표시한다).

F₁-DNA 및 F₂-DNA의 결정된 뉴클레오티드 결합서열은 실시예 8에서 설명된 것과 동일하다.

[실시예 13]

발현 플라스미드 pML 310의 제조

a) trp 프로모터-오퍼레이터를 함유한 선형화된 벡터 pHRi 148/EcoRⅠ/BamHⅠ의 구성(제3도 및 제4도)

A. 플라스미드 p159의구성

10μg의 플라스미드 pBRHtrp(22)를 37℃에서 60분 동안 50단위의 EcoRⅠ(Biolabs)로 절단시키고, 이 분해혼합물을 페놀 추출시킨 후에, TST 41(Kontron AG) 회전기 중에서 50mM 트리스 .HCl(pH8.0), 1mM EDTA 중의 사카로즈 밀도 변화(5내지 23%)에 따라 분별시킨다. 원심분리는 15℃에서 40,00회전/분의 속도로 14시간 동안 계속한다. 0.3ml획분을 ISCO 변화 수집기로써 1ml/분으로 수거한다. 보다 작은 단편을 함유한 분획들을 혼합하여, 그 용액을 TNE로 표준화시킨 다음, -20℃에서 2용적의 에탄올을 사용하여 침전물을 형성시킨다. 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 중에서 원심 분리시킨 후에, DNA를 10μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 0.5mM EDTA 중에서 용해시킨다. 이 DNA 단편 5μg을 37℃에서 60분 동안 5단위의 BglⅡ(Biolabs)로 절단한다. 반응 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출시킨 다음, DNA를 -80℃에서 2용적의 에탄올로 10분 동안 인큐베이트하고, DNA를 원심분리에 의해 수거하여, 50μl의 50mM. HCl(pH8.0)중에 다시 용해시킨다. 이 용액중 2μl(0.2μg의 DNA)를 취하여, 37℃의 온도하에, 50mM 트리스. HCl(pH8.0)중의 DNA 농도 10mg/μl에서, 소 장기의 알칼리성 포스파타제(Boehringer) 1단위를 사용하여 30분 동안 배양한다. 용액을 65℃에서 60분 동안 가열시킴으로써 효소를 비활성화시킨다. 0.04μg의 DNA를 취하여, 37℃의 온도하에, 50mM 트리스. HCl(pH9.5), 10mM MgCl₂및 5mM DTT 중에서, 20μl의 반응 용적에서 10μci[γ^-32p]-ATP(5000ci/mmol, Amersham) 및 5단위의 T₄폴리뉴클레오티드 키나제(P-L Biochemicals)를 사용하여 30분 동안 5¹-말단적으로 배양한다.

방사성 시료를 방사능 표지되지 않는 시료(상기 참조)와 혼합하고, DNA 단편을 TST 60회전기중에서 50mM 트리스. HCl(pH8.0), 1mM EDTA 중의 5내지 23%사카로즈 밀도 변화에 따라 분별시킨다. 원심분리는 15℃에서 60,000회전/분의 속도로 5시간 동안 수행한다. 0.2ml획분을 수거한다. 각 분획의 방사능은 카렌코프선(carencov radiation)을 측정함으로써 확인되고, 그에 의해 각 단편들이 확인된다. 작은 DNA 단편이 함유된 목적한 분획들을 혼합하여, 원심분리시킨 후에 2용적의 에탄올로 DNA를 침전시키고, DNA를 20μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 0.5mM EDTA 중에 다시 용해시킨다.

32p-표지된 EcoRⅠ-BglⅡ DNA 단편을 37℃의 온도하에 50μl 용적에서 02. 단위의 TaqⅠ(Biolabs)로 10분 동안 부분적으로 절단한다. 반응 혼합물을 0.2% SDS, 10%글리세린, 10mM EDTA 및 0.05% 브로모페놀-블루가 되도록 조절하고, DNA 단편들을 트리스-보레이트-EDTA 중의 6% 폴리아크릴아미드겔상에서 분리시킨다(23). 목적한 EcoRⅠ-TaqⅠ(가장 큰 부분 단편)를 함유한 밴드는 방사선 사진에 의해 확인된다. 이 단편(제3도 참조)을 겔로부터 추출하여, 정제시킨 다음(19), 10μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 1mM EDTA 중에 용해시킨다.

수용체플라스미드로서 사용된 pBR 322는 ClaⅠ 및 EcoRⅠ로 절단한다 : 2μg의 pBR 322를 37℃의 온도하에서 20μg의 반응 용적에서 4 단위의 claⅠ(Biolabs)로 60분 동안 분해시킨다. 단백질을 페놀로 추출한 다음, DNA를 -80℃에서 2용적의 에탄올로 10분 동안 침전시킨다. DNA를 원심분리에 의해 수거하여, 37℃의 온도하에 20μl의 반응용적에서 10단위의 EcoRⅠ(Biolabs)로 30분 동안 분해시킨다. 계속해서 2용적의 0.1M 트리스. HCl(pH 8.7)을 용액에 가한 다음, 전체를 37℃에서 소의 알칼리성 포스파타제(Boehringer) 1단위로 30분 동안 배양한다. 65℃에서 60분 동안 인큐베이트 시킴으로써 포스파타제를 비활성화시킨다. 100ng의 수용체 플라스미드를 15μl의 반응 용적에서, 반응용적 1μl당 30단위의 T₄DNA 리가제(Biolabs)를 함유한 10mM MgCl₂, 20mM 트리스. HCl(PH7.8), 10mM DTT, 0.5mM ATP중에서 5μl의 L-DNA 단편을 사용하여 2시간 동안 인큐베이트한다.

이 용액 5μl을 전체용적 200μl의 10mM MgCl₂, 10mM Cacl₂및 10mM 트리스. HCl(pH7.5)중의 염화칼슘(14)으로 처리된 150ml의 이. 콜리 HB 101(E.coli HB 101)세포를 함유한 혼합물에 가한다. 혼합물을 얼음중에서 20분 동안 냉각시킨 다음 42℃에서 1분동안 가열하고, 20℃에서 10분 동안 인큐베이트한다. 1ml의 트립톤 매질[트립톤 매질은 증류수 1ℓ당 10g의 박토-트립톤(Difco):1g의 효모 추출물(Difco):1g의 글루코즈 8g의 Nacl 및 294mg의 cacl₂·2H₂O를 함유한다]을 가하고, 혼합물을 37℃에서, 300회전/분의 속도로 교반시키면서 30분 동안 인큐베이트한다. 혼합물을 50μl/ml의 앰피실린(sigma)이 첨가된 두개의 아가판에 펴바른다(McConkey Agar, Difco:0.6ml/판). 이 판을 37℃에서 12 내지 17시간 동안 인큐베이트한다.

상이한 10개의 콜로니의 플라스미드 DNA는 하기와 같이 분리한다.

상기 콜로니들은 50μg/ml의 앰피실린이 첨가된 10ml의 트립톤 매질을 25ml들이 삼각 플라스크중에서 주입시키는 데에 사용된다. 배양액을 37℃에서 300회전/분의 속도로 15 내지 18시간동안 교반한다. 세포를 원심분리(Sorval, Hs-4회전기, 4000회전/분의 속도로 10분 동안, 4℃)에 의해 수거한다. 약 0.1g의 세포를 수득하여 1ml의 50mM EDTA(pH7.5)를 가한다. 0℃에서 10분 동안 더 인큐베이트한 후에, 60μl의 2%트리톤 x-100(Merck)을 가한다. 0℃에서 30분 경과후에, 시료를 4℃의 온도하에 소르발 SA-600회전기 중에서 15,000회전/분의 속도로 30분 동안 원심분리 시킨다. 상등액을 1용적의 페놀(TNE로 포화됨)로 탈단백질화 시킨다. 4℃에서 5000회전/분의 속도로 10분 동안 원심분리(Sorval HB-4회전기)시킴으로써 상을 분리시킨다. 상부 상을 1용적의 클로로포름으로 2회 추출한다. 췌장 RNAse A(Sigma : TNE중에서 10mg/ml을 85℃에서 10분 동안 예비 가열한다)를 최종 농도 25μg/ml에 도달할 때까지 가하고, 혼합물을 37℃에서 40분 동안 인큐베이트한다.

용액을 1M Nacl 및 10%폴리에틸렌글리콜 6000(Flaka;120℃의 온도하에 오토클레이브 중에서 20분 동안 처리함)으로 조정한 다음, -10℃에서 2시간 동안 인큐베이트한다. 소르발 HB-4 회전기 중에서 침전물을 수거하여(0℃에서 10000회전/분의 속도로 20분 동안), 100μl의 TNE에 다시 용해시킨다.

DNA 용액을 1용적의 페놀로 추출하고, DNA를 -80℃에서 10분 동안 2용적의 에탄올로 침전시킨다. 에펜도르포 원심분리기중에서 원심분리시킴으로써 침전물을 수거하고, DNA를 20μl의 10mM 트리스.HCl(pH7.5) 및 0.5mM EDTA 중에 다시 용해시킨다.

10ml의 배양액으로부터 8내지 10μg의 플라스미드 DNA를 수득한다.

플라스미드 DNA는 하기의 제한 효소로 분해시킨 후에 분석한다.

각 경우에, 0.5μg의 플라스미드 DNA를 효소 제조업체의 지시에 따라, HpaⅠ(Biolabs)로 절단하고, HpaⅠ(Biolabs) 및 표준지시에 따라 ClaⅠ(Biolabs)을 함유한 EcoRⅠ(Biolabs)로 절단한다. DNA를 40mM 트리스.아세테이트(pH7.8) 1mM EDTA 및 0.5μg/ml 에티듐브로마이드 중의 1% 아가로즈 겔상에서 분별시킨다. 목적한 플라스미드는 HpaⅠ 위치를 포함하며, 3회 분해후에는 큰 DNA 단편외에도 pBR322의 작은 EcoRⅠ-ClaⅠ 단편보다 큰 2개의 작은 단편이 수득된다. 이들 플라스미드중의 하나를 p159라고 명명한다(제3도 참조).

B. 플라스미드 pHRi 145의 구성

2μg의 p159 DNA를 37℃에서 10단위의 EcoRⅠ(Biolabs)로 30분 동안 분해한다. DNA를 페놀로 추출시켜, 에탄올로 침전시키고, 원심분리시킨 후에, 10μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 0.5mM EDTA 중에 용해시킨다. EcoRⅠ로 분해시킨 DNA를 12℃에서 10mM MgCl₂, 10mM β-머캅토 에탄올, 50mM Ncal, 0.1mM dATP(PL Biochemicals), 0.1mM dTTP(PL Biochemicals) 중의 DNA 폴리머라제(클레노우단펀)(Boehringer) 5단위로 15분 동안 더욱 처리한다. 폴리머라제는 85℃에서 5분 동안 인큐베이트시킴으로써 비활성화시킨다. 반응 혼합물을 20mM 트리스. HCl(pH7.8), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP(sigma)중에서 10배 회석한 다음, 15℃에서, 반응 혼합물 1μl당 30단위의 T₄DNA 리가제로 1시간동안 인큐베이트한다.

50mg의 DNA를(상기 기술한 방법으로) 이.콜리(E.coli)중에서 형질전환시킨 다음. 50μg/ml의 앰피실린이 첨가된 맥콘케이(Mc Conkey)아가판에 펴 바른다.

상이한 10개콜로니의 플라스미드 DNA는 상기 기술한 방법으로 분리시킨다. 플라스미드 DNA는 EcoRⅠ로 분해하여 분석한다. 목적한 플라스미드는 EcoRⅠ-내성이다. 분석은 상기 기술한 방법으로 수행한다. 목적한 플라스미드중의 하나를 Hri 145(제3도)라고 명명한다.

C. 플라스미드 PHRi 148의 구성

2μg의 pHRi 145-DNA를 37℃에서 5단위의 ClaⅠ(Boehringer)로 60분 동안 처리한 다음, 페놀 추출에 의해 탈단백질화시킨다. DNA를 에탄올로 침전시킨 다음, 20μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 0.5mM EDTA 중에 용해시킨다. dATP 및 dTTP 대신에 dCTP(PL Biochemicals) 및 dGTP(PL Biochemicals)를 사용함을 제외하고는 상기 기술한 바와 같이 프로젝팅(projecting)말단을 DNA 폴리머라제Ⅰ(클레나우 단편)로 처리한다.

폴리머라제는 85℃에서 5분 동안 인큐베이트함으로써 비활성화시킨다. 37℃에서 소의 포스파타제(Boehringer) 0.5단위로 30분 동안 인큐베이트시킨 반응 혼합물에 2용적의 0.1M 트리스. HCl(pH8.7)을 가한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출시킴으로써 탈단백질화시킨다. DNA를 페놀로 침전시킨 다음, 8μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 0.5mM EDTA중에 용해시킨다.

구조식 5¹-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3¹의 화학적으로 합성된 DNA 링커는 0.1mMγATP(sigma), 50mM 트리스. HCl(pH9.5), 10mM MgCl², 5mM DDT 및 T₄폴리뉴클레오티드 키나제2단위(PL Biochemicals)을 함유하는 반응용적 8μl중에서 5μ ci[γ^-32p]-ATP(5500ci mmol^-1Amersham)와 8pmol 링커를 30분 동안 37℃에서 인큐베이트시켜 5²말단에서 포스포릴화 시킨다. 반응을 -80℃에서 냉동시켜 중단시킨다.

그후 방사능 표시된 링커를 ClaⅠ μl 및 포스페타아제로 처리하고, 0.5mM rATP(Sigma), 10mM DTT(calbiochem), 20mM 트리스. HCl(pH7.8), 1mM MgCl₂및 T₄DNA 리가아제 800단위(Biolabs)를 함유하는 반응용적 20μl중 pHRi 145-DNA(상기 참조)와 연결시킨다. 2시간동안 15℃에서 인큐베이션 시킨다. 리가제는 85℃에서 10분동안 인큐베이트시켜 탈활성화시킨다. 이어서 물 2용적을 가하고 염화나트륨 농도를 10mM로 조절하고, KpnI(Biolabs) 20단위를 30분 동안 37℃에서 가한다. 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 40mM 트리스.아세테이트(pH7.8), 1mM EDTA 및 0.5μg/ml 브롬화 에티듐중 0.9%저용해 아가로오즈 겔(Biorad)에 분배한다. uV방사에 의해 나타낸, 같은 크기의 표지 DNA와 같은 이동성을 나타내는 밴드를 메스로 자른다. 겔의 일부를 5분 동안 65℃에서 용해시킨 후, 37℃로 냉각시킨다. 용적 약 20μl를 수득한다. 이 용액 5μl을 채취하여, 12시간 동안 15℃에서 0.5mM ATP, 10mM DTT, 10mM MgCl₂, 20mM 트리스. HCl(pH7.8)로 조절된 반응 용적 10μl중 T₄리가제 400단위(Biolabs)로 배양한다. 100mM 트리스. HCl(pH7.5), 100mM Cacl²및 100mM MgCl₂와의 용액용적의 1/10을 리가제 혼합물에 가하고 전체를 65℃에서 5분동안 배양한다. 그 후 용액을 상술된 방법으로 칼슘-처리된 E.coli HB101로 형질전환시킨다. 앰피실린 50μg/ml를 첨가한 맥콘키(McConkey) 한천판 상에 플랫팅시킨다.

10개의 다른 콜로니의 플라스미드 DNA를 상술된 방법으로 분리시키고, DNA는 다음의 제한 효소분석시킨다.

각각의 경우에 플라스미드 DNA 0.5μg을 효소 제조자의 지침에 따라 KpNⅠ(Biolabs), NcoⅠ(Biolabs) 및 EcoRⅠ(Biolabs)로 연속적으로 분해한다. 분해 생성물을 40mM 트리스. 아세테이트(pH7.8), 1mM EDTA 0.5μg/ml 브롬화에티듐 중 1% 아가로즈 겔상에 분배시킨다. 모든 플라스미드는 바람직하게는 각각 이러한 효소절단 부위중 하나를 갖는다. 하나를 HRi 148로 표시한다.

플라스미드 HRi 148은 트립토판 프로모터오퍼레이터 및 리보소옴 결합 위치 내지 ATG를 포함한다. 히루딘 및 또 다른 이종 유전자는 플라스미드 중의 EcoRⅠ, NcoⅠ, KpnⅠ부위를 통해 직접 커플링될 수 있다. 또한 이 구조는 직접 커플링 및, 상응하는 유전자에 존재하는 번역의 시작에 필요한 ATG없이 이종유전자의 발현을 가능하게 한다. 이것은 상술한 방법에 의해 NcoⅠ로 절단하고, 프로젝팅 말단을 DNA 폴리머라제 Ⅰ로 보충하거나, 또는 KpnⅠ로 절단하고 프로젝팅 말단을 뉴클레아제 s₁으로 제거하여 쉽게 수행할 수 있다. 즉, 플라스미드 HRi 148은 광범하게 적용되는 발현 플라스미드이다.

D. 선형화 벡터 pHRi 148/EcoRⅠ/BamHⅠ의 제조

pHri 148의 플라스미드 DNA 5μg를 제한엔도뉴클레아제 EcoRⅠ 및 RamHⅠ로 절단한다. 절단된 벡터 pHRi 148/EcoRⅠ/BamHⅠ를 밀도변화 원심분리에 의해 분리시킨다.

b) F₁-DNA/EcoRⅠ/EcoRⅡ 및 F₂-DNA/BamHⅠ/EcorⅡ의 제조

Ⅰ. F₁-DNA/EcoRⅠ/EcoRⅡ의 제조

pML 300의 플라스미드 DNA 5μg를 먼저 1시간동안 37℃에서 100mM 트리스. HCl(pH7.5), 50mM Nacl 및 100μ/ml 젤라틴의 용액 50μg중 EcoRⅠ제한 엔도뉴클레아제 10단위로 절단한다. 이 선형화된 플라스미드 DNA/EcoRⅠ 0.5μg을 아가로즈겔(참조·실시예10a)로 부터 겔용출에 의해 단리시키고[γ^-32p]ATP(참조, 실시예 12)로 방사능 표지시킨다. 그후 플라스미드 DNA/EcoRⅠ의 대부분을 이 방사능 표지된 DNA와 혼합하고, EcoRⅡ 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, EcoRⅡ-EcoRⅠ* DNA 단편(109 염기쌍)을 8% 폴리아크릴아미드 상에서 겔 전기영동에 의해 분리시킨다.

F₁-DNA/EcoRⅠ^*/EcoRⅡ 200μg를 겔용출에 의해 단리시킨다.

Ⅱ. F₂-DNA/BamHⅠ/EcoRⅡ의 제조

pML 305의 플라스미드 DNA 5μg를 제한 엔도뉴클레아제 10 단위로 절단한다. 이 선형화된 플라스미드 DNA/BamHⅠ 0.5μg를 아가로즈 겔(참조. 실시예 10a)로 부터 겔용출에 I의해 단리시키고, [γ^-32p](참조·실시예 12)로 방사능 표지시킨다. 그후 플라스미드 DNA/BamHⅠ의 대부분을 이 방사능 표지된 DNA와 혼합시키고, EcoRⅡ 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고, EcoRⅡ-BamHⅠ_nDNA 단편(122염기쌍)을 8% 폴리아크릴아미드상에서 겔 전기영동에 의해 분리시킨다. F₂-DNA/BamHⅠ^*/EcoRⅡ 250μg을 단리시킨다.

c) F₁-DNA와 F₂-DNA의 연결 및

발현 플라스미드 PML 310의 구성

F₁-DNA/EcoRⅠ/EcoRⅡ 10ng(=473nmol 말단) 및 F₂-DNA/BamHⅠ/EcoRⅡ9ng(=495nmol말단)을 (실시예 10c)에 상술한 방법으로 T₄DNA 리가제로 20μl 용적중에서 처리한다. 이어서, 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, DNA를 알코올로 침전시킨다. 침전된 DNA 혼합물을 실시예 10c)에 상술된 방법으로 T₄DNA 리가아제(Biolabs)로 처리한다. 이 방법으로, 용액중에서 삽입 F₁-F₂-DNA(데술페이토-히루딘 유전자)로서 함유하는 재결합 플라스미드를 제조한다.

d) 플라스미드 pMl 310으로 E.coli HB 101의 형질전환

칼슘-처리된 E.coli HB 101 세포의 형질전환은 실시예 10d)에 상술된 방법으로 수행한다. 실시예 13c)에서 수득된 반응 혼합물 10μl을 사용한다. 420앰피실린-내성 콜로니를 수득한다.

e) F₁-F₂-DNA를 함유하는 콜로니 스크리닝(Screening)

18개의 형질전환된 콜로니(실시예 13d)를 실시예 10e)에 상술된 방법으로 이들의 F₁-F₂-DNA 성분을 시험한다. 실시예 5 및 6에 기술된 올리고 데옥시 뉴클레오티드의 혼합물을 방사능 프로브로 사용한다.

자동방사능 사진 12에서의 양성 콜로니를 수득하고, 그중에서 5개를 pML 310, pML 311, pML 312, pML 313, PML 134로 표시한다.

[실시예 14]

클론 pML 310의 특성화

재결합 플라스미드 pML 310중 F₁-F₂-DNA 서열 결합의 특성화는 실시예 12에 기술된 방법으로 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert)(11)에 따라 F₁-F₂-DNA를 서열 결합시켜 수행한다.

플라스미드 DNA10μg를 시험한다. F₁-F₂-DNA의 뉴클레오티드 서열은 합성 데술페이토히루딘 유전자에 기술된 것과 동일하다.

[실시예 15]

발현 플라스미드 pML 315의 제조

a) F₁-DNA와 F₂-DNA의 연결 및 발현 플라스미드 pML 315의 구성

화학적으로 합성된 F₁-DNA 및 F₂-DNA 24μg(=1.3pmol 말단) 및 26μg(=1.3pmol 말단) 각각을 30분 동안 37℃에서 50mM 트리스. HCl(pH8), 5mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM DTT, 100μg/ml 젤라틴중 EcoRⅡ 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs) 5단위로 용적 20μl 중에서 분해시킨다. 이어서, 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, DNA를 알코올로 침전시킨다. 그후 DNA 침전물을 실시예 10c)에 기술된 바와 같이 용해시키고, T₄DNA 리가제로 3시간동안 15℃에서 처리한다. 그후 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 실시예 10b)에 기술된 방법으로 침전시킨다. 이어서 DNA 침전물을 용해시키고(참조: 실시예 10c)), EcoRⅠ 및 BamHⅠ 제한 엔도뉴클레아제로 30분동안 37℃에서 용해시킨다. 그후 선형화벡터 pHRi148/EcoRⅠ/BamHⅠ(실시예 13a D) 70ng(=0.1mol 말단)를 용액에 가하고, 전 용액을 TNE로 정치시키고, 페놀/클로로포름으로 추출하고, DNA를 알코올 2용적으로 침전시킨다.

DNA단편(F₁-F₂-DNA/EcoRⅠ/BamHⅠ 및 pHRi 148/EcoRⅠ/BamHⅠ)둘다를 함유하는 생성된 DNA 침전물을 50mM 트리스. HCl(pH7.8), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP, 100μg/ml 젤라틴의 용액 20μl에 용해시키고, 15℃에서 3시간동안 15단위/μI T₄DNA 리가제(Biolabs)로 처리한다. 이 방법으로, 용액중에서 F₁-F₂-DNA(=데술페이토 히루딘 유전자)를 함유하는 재결합 플라스미드 pML 315를 제조한다.

b) E. coli HB 101을 플라스미드 pML 315로 형질전환

플라스미드 pML 315를 함유하는 혼합물(실시예 15a) 10μl을 칼슘-처리된 E.coli HB 101세포의 형질전환에 사용한다. 약 236개의 앰피실린-내성콜로니가 수득된다.

c) F₁-F₂-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝

실시예 13(e)의 방법에 의해서 상기 형질 전환된 콜로니(실시예 15b)에 대하여 F₁-F₂-DNA의 존재여부를 시험한다.

다섯 개의 콜로니가 수득되었으며, 이들을 pLM 315내지 pML 319로 명명하였다.

[실시예 16]

발현 플라스미드 PML 320의 제조

a. 벡터 DNA pHRi 148/EcoRⅠ/BamHⅠ를 사용하여 합성 F₁-F₂-DNA의 연결

완전히 합성적으로 제조된 디술페이토히루딘 유전자(F₁-F₂-DNA, 실시예 9참조) 20μg을 제한효소 EcoRⅠ 및 BamHⅠ를 함유하는 50μl의 10mM 트리스. HCl(pH7.5), 50mM Ncal 및 100μg/ml 젤라틴의 용액 20μl에 소화시킨다. 이 용액을 TNE로 표준화시키고 30μg을(=50mmol)의 벡터 DNA pHRi148/EcoRⅠ/BamHⅠ(실시예 13aD 참조)을 가한다. 이 용액을 페놀/클로로포름으로 추출한다음 알코올을 사용하여 DNA를 침전시킨다.

DNA 침전물을 실시예 10C의 방법대로 T₄DNA 리가제(Biolabs)로 처리한다. 이 방법으로 용액내에서, 삽입물로서 F₁-F₂-DNA(히루딘 유전자)를 함유하는 재조합 플라스미드(pML 320)가 제조된다.

b. 플라스미드 pML 320을 사용한 E.coli HB 101의 형질전환

실시예 10(d)에 기재된 대로 E.coli HB 101세포를 칼슘으로 형질전환시킨다. 실시예 16(a)에서 수득된 반응 혼합물 10μl가 사용된다. 173 암피실린-내성 콜로니가 수득된다.

c. F₁-F₂-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝

11개의 형질전환시킨 콜로니(실시예 16b)에 대하여 실시예 10(e)의 방법대로 그의 F₁-F₂-DNA 함량을 시험한다. 실시예 5 및 6에 기술된 올리고데옥시 뉴클레오티드의 혼합물을 방사능 소식자로서 사용한다. 14개의 양성 콜로니가 오토라디오그램으로 확인된다. 이들 중 다섯이 지적된 pML 320, pML 321, pML 322, Pml 323 및 pML 324 이다.

[실시예 17]

클론 pML 315 및 pML 320의 특성화

플라스미드 pML 315 및 pML 320내의 F₁-F₂서열의 특성화는 실시예 12에 기재된 맥삼 및 길버트(1)의 방법대로 F₁-F₂-DNA를 차례로 연결시켜 수행한다. 상기 두개의 플라스미드의 DNA 삽입 뉴클레오티드 서열은 합성 히루딘 유전자의 서열과 동일하다.

[실시예 18]

재조합 히루딘 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 E.coli 세포를 사용하여 히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드 합성

a. 히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드의 합성

재조합 디술페이토 히루딘 유전자를 함유하는 각각의 15개 클론, 즉, E.coli HB 101 pML 310, E.coli HB 101 pML 311, E.coli HB101 pML 312, E.coli HB 101 pML 313, E.coli HB101 pML 314, E.coli HB 101 pML 315, E.coli HB101 pML 316, E.coli HB 101 pML 317, E.coli HB101 pML 318, E.coli HB 101 pML 319, E.coli HB101 pML 320, E.coli HB 101 pML 321, E.coli HB101 pML 322, E.coli HB 101 pML 323, E.coli HB101 pML 324을 히루딘 활성의 형성에 대해 시험한다.

상기 목적을 위하여, 상기에 언급한 콜론을 37℃ 및 250revs/min에서 5ml의 L-배지중에 밤새(16시간)배양한다. L-배치는 하기의 조성을 갖는다.

다음날 상기의 배양액 1ml를 25ml의 M9-배지와 교환한다. M9-배지는 다음의 조성을 갖는다.

박테리아성 현탁액의 광학밀도(OD₆₂₃)가 약 0.9 내지 1.0에 도달될 때까지 37℃ 및 250revs/min에서 배양한다. 세포(5ml의 성장배양액)을 수확한다음 박테리아를 50mM 트리스·HCl(pH8) 및 30mM Ncal의 용액 0.5ml에 재현탁시킨다. 연속하여 현탁액을 1mg/ml의 리소짐(베링거)으로 조절하고 30분간 얼음에 위치시킨다. 현탁액을 반복하여 액화질소에서 냉동시키고 37℃에서 해동시켜 박테리아를 파괴시킨다. 이 조작을 5회 반복한 다음 이혼합물을 4℃에서 16000revs/min으로 30분간 원심분리시킨다. 항체(실시예 18참조)를 가하고 HPLC에 의해 상청액을 시형하거나 트롬빈(15) 억제(15)를 측정하여 상청액의 데술페이토히드린함량을 시험한다.

하기의 결과가 수득된다.

[실시예 19]

히루딘 활성의 검출

히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드(실시예 18참조)를 함유하는 시료 약 5 내지 10μl를 1㎠의 니트로셀룰로스지(NZ)(BIORAD)상에 떨어뜨리고, 실온에서 30분동안 건조시킨다. 연속하여, NZ를 0.01M 트리스. HCl(pH.8) 및 0.9% NaCl중의 3% 혈청 알부민 용액중에서 37℃에서 1시간동안 인큐베이트 시킨다.

그다음 NZ를 0.1M 트리스. HCl(PH8) 및. 0.9% NaCl 용액으로 30분간 용액을 5회 교환하여 세척한다. 연속하여 세척된 NZ를 히루딘에 대한 항체(토끼 또는 모노클로날 항체에서 생성된 항체) 2μg/ml를 함유하는 0.01M 트리스. HCl(pH8) 및 0.9%중의 3% 혈청 알부민 용액중에서 25℃에서 2시간동안 처리한다.

그 다음 NZ를 전술한 바와 같이 세척한다.

이어서 NZ를¹²⁵I-단백질 A(고유 활성도 89.8%μci/mg)(NEN) 0.2μci/ml를 함유하는 0.01M 트리스. HCl(pH8) 및 0.9% NaCl 중의 3% 혈청 알부민 용액으로 25℃에서 2내지 3시간동안 처리한다. 그 다음 NZ를 다시 전술한 방법으로 세척하고 건조시킨 후 γ-계수기(Multi Gramma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace)로 히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드가 NZ상에 존재하는지 결합 방사능을 측정한다.

이와 다른 방법으로, 상기의 시료를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)[(24)참조]에 적용한다. PAGE 일렉트로 페로그램은 NZ상에서 전기적-반점으로 전환한다. 연속하여 NZ를 상기와 같은 방법으로 처리하고/하거나 X-선필름(Fuji)과 함께 밤새 자동방사 그래피한다. 히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드를 함유하는 NZ상의 부위가 필름에 흑색 반점으로 나타난다.

[실시예 20]

트롬빈 컬럼을 사용하여 데술페이토 히루딘의 단리 및 정제

a. 트롬빈 컬럼용 폴리펩티드 용액의 제조

150ml의 배양액(실시예 18에서 수득)을 4℃까지 냉각시키고 원심분리(5000revs/min. 15분, Sorvall RC 3B)시켜 세포를 제거한다. 맑은 상청액은 히루딘 활성을 갖지는 않는다.

이 세포를 12ml의 세포용해완충액(50mM 트리스. HCl pH8.3mM NaCl)에 현탁시킨다. 이 혼합물에 15mg의 리소짐(Boehringer)을 가하고 전체를 4℃로 30분간 유지시킨다. 그다음 4회에 걸쳐 액화 질소에서 냉동시키고 37℃로 해동시켜 세포를 파괴시킨다. 연속하여 이 혼합물을 30분간 16000revs/min 및 4℃에서 원심분리한다. 상청액은 히루딘 활성을 갖는다. 이 상청액(15ml)에 7.7g의 고체황산 암모늄을 용해시킨다. 이 혼탁혼합물을 4℃에서 30분간 방치시킨후 원심분리(상기 조건 참조)한다. 젖은 침전물을 1ml의 0.05mM 트리스. HCl pH8 완충액에 용해시켜 목적하는 폴리펩티드 용액을 수득한다.

b. 트롬빈 컬럼상에서 히루딘의 정제

트롬빈 컬럼(비드 용적 4ml)을 0.05M 트리스. HCl pH 8을 사용하여 평형화시킨다. 상기에서 수득한 폴리펩티드 용액 5ml를 4℃에서 7ml/h의 속도로 컬럼에 용출시킨다. 그다음 25ml의 0.05M 트리스. HCl(pH8)을 사용하여 세척한다. 흡수되지 않은 폴리펩티드를 함유하는 첫번째 분획물은 버린다. 그 다음 컬럼을 0.05M 트리스. HCl(pH8)중의 1.5M 벤즈아미딘(Merk)[(25)참조] 10ml를 사용하여 세척하고 생성되는 분획을 트롬빈 테스트(15)를 사용하여 히루딘 활성을 검사한다. CD_280mm측정에 의해서 폴리펩티드를 함유하는 분획을 확인한다. 25 및 26분획이 히루딘 활성을 갖는다. 이 분획물을 -20℃에서 저장하거나, 더 이상의 후속과정이 필요할 때까지 빙조에 보관한다. 25분획의 히루딘 활성은 20μg/ml이며 26분획은 52μg/ml이다. 이 분획물을 세파덱스-G25(pharmacia)상에서 투석시키거나 탈염화시킨다.

생성물은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(24)에 의해서 분자량이 약 7000내지 8000달톤 및 이의 정수 배(올리고머)임이 밝혀졌다.

c. 트롬빈 컬럼의 제조

제조 지시에 따라 아피겔 10(Bio Rad)을 냉각 증류수 및 커플링 완충액 pH 8.5(0.1M NaHCO₃/Na₂co₃용액)으로 세척한다. 커플링 완충액(4ml)의 50%현탁액을 플라스틱 튜브로 옮기고 동량의 트롬빈 용액(4ml의 커플링 완충액중 120mg)(calbiochem)과 혼합시킨 다음 4℃에서 밤새 회전시킨다. 그다음 이 겔을 커플링 완충액으로 세척한다. 아직 유리되어 있는 활성부위를 차단하기 위하여 이 겔을 4℃에서 3시간동안 겔당 0.1ml의 1M 에탄올아민-HCl(pH8.0)으로 처리하고, 겔1ml당 10mM 아지드화 나트륨을 함유하는 인산염 염화나트륨 완충 용액으로 세척한다음이 용액을 4℃로 유지시킨다. 커플링의 정도는 280mm에서 소멸을 측정하여 확인되며, 겔 1ml당 히루딘 15내지 30mg이다.

생성되는 트롬빈 겔 4ml는 친화 컬럼을 제조하는데 사용된다.

[실시예 21]

플라스미드 pML 310을 사용하여 여러가지 E.coli균주의 형질전환 및 형질전환된 숙주 세포의 배양

실시예 10(d)에 기재된 방법과 유사하게, 균주 E.coli JA 221 E.coli LM 1035 및 E.coli W3110⊃102을 플라스미드 pML 310을 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환된 콜로니에 대하여 실시예(10e)의 기재대로 F₁-F₂-DNA 존재를 검사한다. 하기의 각각 5, 3 및 5개의 양성 콜로니가 수득되었다.

언급된 클론은 하기 조성을 갖는 변형 M9-배지에서 배양한다.

박테리아 현탁액의 광학밀도(OD₆₂₃)가 약 1에 도달될 때까지, 37℃ 및 180。revs/분에서 배양한다. 그 다음 세포(성장 배양액 5ml)를 수확하여 박테리아를 50mM 트리스. HCl(pH8) 및 30mM Ncal용액 0.5ml에 재현탁시킨다. 연속하여, 이 현탁액을 1mg/ml 리소짐(Boehringer)로 조절하고 30분간 얼음에 놓는다. 교대로 현탁액을 액화질소로 냉동시키고, 37℃에서 해동시켜 박테리아를 파괴시킨다. 이 조작을 5회 반복한다. 연속하여 이 혼합물을 30분간 16000revs/분, 4℃에서 원심분리한다.

모든 클론에 대하여 트롬빈 억제를 측정하여 히루딘 활성을 갖는 폴리펩티드의 형성을 검사한다(15). 모든 박테리아 추출물에서 히루딘 활성(300 내지 600ng/ml 배양용액)이 검출되었다. 예를 들어, 다음과 같이 히루딘 활성이 나타났다.

[실시예 22]

5000ℓ발효기 내에서 형질전환된 균주 E.coli W3110△102/pML310/1의 발효 및 배양 배지의 후처리

실시예 21과 유사한 방법으로, 3000ℓ의 변형 M9-배지 중의 E.coli W3110⊃102/pML310/1 세포를 현탁액의 광학밀도(OD₆₂₃)이 약 10 내지 13이 될때까지 용적 5000ℓ의 발효기 내에서 배양한다.

배양배지(pH 7.4)를 10℃까지 냉각시키고, 이 세포를 Alfa-Laval BRPX-207 슬라임 제거기를 사용하여 처리한다. 맑은 상처액에는 히루딘 활성이 없으므로 버린다. 슬라임 제거시, 슬라임 실(chamber)은 세포용해 완충액(50mM 트리스. HCl, 30mM NaCl, HCl로 pH를 8.0으로 조절한다)을 사용하여 연속하여 부분적으로 슬라임을 제저하며, 슬라임 제거가 완결되면, 원심분리 용기의 내용을(7ℓ)을 세포용해 완충액 A로 완전히 슬라임을 제거하여 방충시킨다. 생성되는 세포 덩어리를 375ℓ까지의 완충액 A로 조절하고, pH를 7.6이 되도록 한다. 5 내지 10℃로 냉각시킨후, 이 현탁액을 디노밀(KD5형)을 통과시켜 직경 0.5내지 0.75mm의 글라스비드를 4.2ℓ 생성한다. 이 세포를 파괴한다. 생성되는 현탁액을 아세트산 함량이 약 2%(V/V)가 되도록 아세트산으로 조절하여 10℃에서 밤새 교반시킨다. pH가 3.9인 현탁액을 상기의 방법과 같이 슬라임을 제거한다. 300ℓ의 맑은 상청액을 강하막 증발기 내에서 35ℓ까지 농축시킨다(용량: 시간당 물 60ℓ). 약간 혼탁한 농축물을 원심분리하고 생성되는 맑은 상청액을 GR81 PP막(표면적 2.5m²)이 부착된 한외 여과 유니트 DDS=Lab 35상에서 2% 아세트산 또는 0.02M 트리스. HCl pH 7.5 완충액에 대하여 투과시킨다. 최종 용적은 31ℓ이다.

상기의 맑은 단백질 용액을 2ℓ취하여 비드 용적이 96ℓ이며, 2%아세트산으로 평형화시킨 세파덱스 G-50 F-컬럼(KS 370 pharmacia)에 적용시킨다. 용출액 15ℓ에 함유된 주분획을 한외 여과법으로 농축시킨다음 물에 대하여 투과시킨다. 생성되는 맑은 수성 용액을 동결건조시킨다. 발효는 하기의 실시예의 기재와 같이 수행할 수 있다.

[실시예 23]

균주 E.coli W3110△102/pML310/1의 실험실내 배양

균주 E.coli w3110△102/pML310/1을 37℃ 및 200 revs/분의 진탕 플라스크에서 24시간동안 인큐베이트한다. 배지는 하기의 조성(g/ℓ)을 갖는다.

배지는 pH가 6.54이다. 배양중 광학밀도(OD_605mm)가 14.9에 도달되었다.

세포(성장 배양액 50ml)를 수확하여 50mM 트리스·HCl(pH8,0) 및 30mM NaCl 용액 5ml에 재현탁시킨다. 연속하여 5g의 냉각시킨 글라스비드(직경 0.5mm)를 사용하거나, 고감도 멀티-튜브 보르텍서(Multi-Tube Vortexer) 상에서 30내지 45분 간격으로 최종농도가 1mg/ml가 되도록 리소짐(Boehringer)을 가하여 진탕시킨다. 0.5ml의 2% 아세트산을 0.5ml의 상기 혼합물에 가하고 4℃에서 20분간 12,000revs/min으로 원심분리시킨다. 상청액의 히루딘 활성(트롬빈 억제)를 시험한다. 트롬빈-억제 테스트는 다음과 같이 수행한다:

이 테스트는 기질 크로모짐 TH(토실-글리실-프롤일-아르기닌-4-니트로 아닐리드-아세테이트)로부터 p-니트로 아닐린의 효소적 제거를 측정함에 기초를 둔다. 형성된 p-니트로 아닐린은 비색계로 405nm에서 측정된다,(Micro-Elisa Auto Reader, Dynafech, Kloten). 이 테스트는 기저가 평평한 미소 적가판(Costar, Serocluster, catalogue No. 3590)에서 수행된다. 반응 시간은 배양실내에서 37℃에서 2시간이다. 이 테스트를 위하여, 측정할 용액 20μl를 30γl의 충진 완충액(0.2M 트리스. HCl pH 7.5, 1M NaCl, 100μg/ml 소의 혈청 알부민)으로 희석시키고, 20γl의 효소 용액[인체의 혈장으로부터 동결 건조시킨 트롬빈(Boehringer) 10mg을 이차증류수 1ml에 용해시키고 상기의 충진 완충액으로 약 1:400으로 희석시킴] 및 150μl의 기질용액[크로모짐 TH(Boehringer) 20ng을 4ml의 이차 증류수에 용해시키고 상기의 충진 완충액으로 1:15로 희석시킴]을 가한다. 모든 용액은70μl의 충진 완충액(상기참조) 및 150μl의 충진 완충액, 20μl의 효소 용액 및 150μl의 기질 용액으로 구성되는 효소 대조 용액에 대하여 측정한다. 2시간후 37℃에서 효소 대조 용액의 OD_405mm값은 100% 활성을 나타내며 약 0.8±0.2이다. 시료의 트롬빈 억제(%로서)는 하기의 식에 의해 계산된다:

상청액은 49.7%/20μl의 트롬빈 억제를 갖는다.

[실시예 24]

배양 배지로부터 강화시킨 히루딘 화합물의 정제방법

실시예 22의 기재와 유사한 방법으로 균주 E.coli W3110⊃102/pML 310/1을 발효기 내에서 배양한다.

그 다음 이 세포를 파괴시키고 원심분리시켜 농축된 상청액을 아세트산으로 처리한다음 한외여과시키거나 투석시킨다. 이러한 방법으로 수득된 용액은 예를 들어, 이온교환크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

(a) 트롬빈을 억제하는 분획을 수득하기 위한 MONO Q 컬럼(Pharmacia) 상에서의 음이온 교환크로마토그래피

8.5ml의 단백질 용액(20mM 트리스. HCl pH7.5/100mM NaCl)을 Pharmacia 사제품 크로마토그래피 장치(fast protein 1iquid chromatography FPLC)의 MONO Q 컬럼에 적용시키고 하기의 조건하에 용출시킨다.

실험조건 : 컬럼 : Mono Q, 4.6mm×150mm, 완충액A : 20mM 트리스·HCl pH 7.5, 완충액B : 20mM 트리스. HCl/1M NaCl, 염의 변화율 : 15%완충액 B를 사용하여 90ml용출시키고 70%완충액 B까지 증가시켜 10.7ml 용출. 280mm에서 AUFS 1.0, 1ml 분획물.

배제체적(분획물 1 내지 10)에서 큰 단백질 피크는 연속하여 용출된 히루딘 화합물과 분리되었다. 트롬빈 테스트에서, 분획물 17 내지 23은 20% 내지 100%의 트롬빈 억제작용이 나타나며 주 분획물(분획물 20 및 21)은 약 50mM NaCl의 농도에서 용출되며 92%의 억제작용이 나타난다.

(b) 히루딘 화합물을 강화시키기 위한 DEAE 셀룰로오스 컬럼상에서의 음이온 교환크로마토 그래피

10ml의 투석물을 pH 7.5의 DE53(Whatman)상에서 음이온 교환 크로마토그래피한다(크로마토그래피조건 : 컬럼 1×5cm(10ml). 용출완충액A : 20mM 암모늄 아세테이트, 100mM NaCl, pH7.5. 용출완충액B : 20mM 암모늄 아세테이트, 1M NaCl, pH 4.0. 완충액A 및 완충액B를 각각 4배 컬럼 용적으로 사용하여 염을 점차로 증가시킨다). 히루딘 화합물은 0.4M NaCl로부터 용출한다. 이것은 트롬빈 억제 테스트에 의하여 감지된다.

(c) p-6 DG ＂탈염화 겔＂(Bio-Rad) 상에서의 탈염화

110ml의 투석물(20mM 트리스.HCl pH 7.5, 2.6ℓ의 상청액으로부터 농축시킨 단백질 용액)을 실시예 24b의 기재와 유사한 방법으로 DE 53상에서 분리시킨다. 히루딘 화합물은 더 빠르게 용출되는 여러가지 비-활성 단백질 피크와 분리되어 분획물 46 및 52(150ml)사이에 용출되는데, 회전 증발기를 사용하여 약 12ml까지 농축시킨다. 생성되는 맑은 단백질 용액을 바이오겔 p-6컬럼에 적용시켜 물로 용출시킨다.

실험조건; 컬럼 2.5×9cm, 고정상 45ml 바이오겔 p-6 DG 탈염화 겔, 용출속도 1.15ml/분, 46ml 분획물, 염함량은 전기전도도를 측정하거나 질산은을 사용하여(Agcl 침전)테스트하여 알 수 있다. 주 활성 화합물은 분획물 7 내지 10에서 용출되며 트롬빈 억제 테스트로 확인된다. 분획물 8내지 10(13.5ml)를 수집하고 회전 증발기로 1ml까지 농축시키고 맑은 용액을 160ml의 비드 용적을 가지며, 1%아세트산으로 평형화시킨 세파덱스 G50 미세컬럼(Pharmacia)에 적용시킨다.

(d) 세파덱스 G50미세컬럼(Pharmacia) 상에서 겔여과

실험조건 : 컬럼 : 세파덱스 G50 미세컬럼(31g) 2.5cm×64cm, 용적310ml, 용매 : 1%, 아세트산 : 용출속도 43ml/h, 38ml 분획물 AUFS : 282mm에서 0.1, 용지공급 3.0cm/h 용출되는 활성도의 검출은 트롬빈 억제 테스트에 의해서 수행한다. 50ml의 용출물을 함유하는 주 분획물(분획물 39 내지 52)는 비-활성2차 조성물(분획물 53내지 80)보다 더 빨리 용출한다. 활성 분획물의 트롬빈 억제는 80내지 100%이다.

(e) 활성용해질의 예비 강화를 위한 CM 셀룰로오스상에서의 양이온 교환 크로마토그래피

10ml의 투석물[20mM 트리스. HCl 3ml의 4N HCl을 사용하여 조절한 200ml의 상청액으로 부터의 농축물(1 : 20) pH]을 양이온 교환기(CM-셀룰로오스)상에서 분리한다. 히루딘 화합물은 분획물 4내지 8의 배제 용적에서 용출된다. 트롬빈 억제 테스트로 검출한다. 분획물 5 및 6은 20μl의 용출물당 각각 89% 및 88%억제한다.

실험조건: 컬럼 1.5×8cm, 고정상 : 19ml, cm-셀룰로오스(los MZ-3146). 용출속도: 43ml/h, 38ml 분획물, 염 변화율 완충액A: 20mM NH₄OA_c ⁴N HCl로 pH를 2로 조절함. 완충액A : 20mM NA₄OAC 4N HCl로 pH를 2로 조절함. 완충액B : 200mM NH₄OAC pH 6.5, 각각의 컬럼용적의 5배를 사용함. AUFS : 282nm에서 1.0

[실시예 25]

형질전환된 균주 E.coli W3110△102/pML301/2의 발효 및 배양배지의 후처리

실시예 22의 기재와 유사한 방법으로, 8ℓ의 배지L중의 E.coli W3110⊃102/pML310/1세포를 이 현탁액의 광학 밀도(OD₆₂₃)이 약 5에 도달할 때까지 발효기에서 5시간동안 배양한다. 배양배지(pH 7.2)로 부터 원심분리시킨 세포를 10℃까지 냉각시키고 리소짐 처리 및 액화 질소에서 냉동 및 약 30℃로 해동을 반복하여 4회 실시하여 상기 세포를 파괴시킨다. 생성되는 현탁액(2.5ℓ)를 1.5% 아세트산(2.4ℓ)로 희석시키고 4℃에서 30분간 교반시킨다. 침전되는 박테리아성 단백질 및 그밖의 세포 성분을 4℃에서 30분간 9000revs/min으로 원심분리하여 제거한다. 3.2ℓ의 맑은 상청액을 회전증발기(Buchi)로 320ml까지 농축시킨다. 이 농축물을 20mM 트리스. HCl pH 7.5에 대하여 4℃에서 밤새 투석시키고 약간 혼탁한 투석물을 다시 원심분리한다. 최종부피는 300ml이다. 맑은 단백질 용액(0.02M 트리스.HCl pH 7.0)을 20ml의 비드용적을 가지며 완충액A(완충액A : 20mA 암모늄 아세테이트/100mM NaCl pH7.5)으로 평형화시킨 디에틸 아미노에틸 셀룰로오스(DE 53, 화트만)(20g) 컬럼에 적용시킨다. 우선, 컬럼 용적(45ml) 일정한 용출속도(43ml/h)로 세척한다음 각각 완충액 및 완충액A(완충액B : 20mM 암모늄 아세테이트/4M NaCl pH 5.0)를 5배의 컬럼 용적으로 사용하여 염을 증가시키며 용출시킨다. 100ml의 용출물이 함유되며 트롬빈 억제 테스트에서 활성인 주 분획물(분획물 24 내지 26)을 20mM 트리스. HCl pH 7.5에 대하여 4℃에서 밤새 투석시키고 회전증발기를 사용하여 35℃에서 최종부피 5ml로 농축시킨다.

생성되는 맑은 용액을 160ml의 비드 용적을 갖는 세파덱스 G-50. 미세컬럼(Pharmacia)에 적용시키고, 이 컬럼(2.5×64cm Biorad)을 5% 아세트산으로 평형화한다. 50ml의 용출물(분획물 5내지 7, 용출속도 50ml/h, 25분/분획)에 함유된 주활성물질은 회전 증발기를 사용하여 농축시킨 다음 가역상 HPLC로 분리시킨다. 개개의 분획물을 500μl씩 취하여 ＂speed vac＂ 농축기(Savant)를 사용하여 1 : 10으로 농축시키고 그의 데술페이토 히루딘 화합물의 함량을 가역상 HPLC 분석에 의하여 검사한다. 이 용액은 데술페이토히루딘 화합물을 함유한다. 분획물 6(18ml)은 부산물을 가장 적게 함유하며 세미 프레파라티브(semipreparative) 역상 HPLC에 의해 정제한다.

실험조건 : Vy dac 218 TP 510 RP-HPLC 컬럼, 10×250mm : 분리당 분획물 6의 일정분량(1 : 10으로 농축된 220μl) : 220mm에서 AUFS 0.5, 용출속도: 2ml/min. 용출액 : A : 0.1%, 트리플루오로 아세트산, B : 아세토니트릴/물 8 : 2+0.07% 트리플루오로아세트산, 1분 일때 16% B, 40분이 경과하는 동안 64% B로 증가. 생성된 분획물은 물을 사용하여 1 : 1로 희석시키고 동결건조시킨다. 잔류물은 순수한 디술페이토 히루딘 화합물로 구성된다.

[실시예 26]

E.coli W3110△102/pML310/1의 발효로 부터 생성혼합물의 분석

실시예 25에 따른 트롬빈 억제작용 테스트에서 활성 분획물을 두가지 다른 조건하에서 HPLC로 분석한다.

(a) 실험조건1 : 뉴클레오실(MN) C18, 5μm RP-HPLC 컬럼, 4.6×120mm, 분리당 50μl 히루딘 화합물, 214mm에서 att.6, 용출속도 : 1.2ml/min : 용출제 : A : 0.1% 트리플루오로 아세트산, B : 0.07% 트리플루오로아세트산을 함유하며, 아세토니트릴/물 8 : 2, 2분 16% B, 30분이 경과하는 동안 64% B까지 증가, 대응압력 : 107바아.

분획물은 1분 간격(총 30)으로 수집하고 트롬빈 억제작용 테스트 및 항체 테스트(참조 : 실시예 19)를 수행한다. 또한, 분획물 14의 활성 히루딘 화합물에 대하여 아미노산 조성물, N-말단 및 C-말단을 측정한다. 이 분획물(No. 14)을 실시예 28과 유사하게 효소 아릴술파타제를 갖는 거머리로 부터의 천연의 히루딘을 반응시켜 수득되는 데술페이토 히루딘과 비교한다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

대조 균주 E.coli W3110△102의 분획물(대조군)은 트롬빈 억제 테스트 또는 항체테스트에서 모두 활성이 없다. 상기의 분획물들은 형질전환되지 않은 균주 E.coli W3110△102를 실시예 22의 기재조건과 같은 조건하에 배양하고 실시예 25에 따라 배양배지를 발효시켜 수득한다.

(b) 실험조건2 : Rp-HPLC

컬럼, vydac 218 TP5415 4.6×150mm: 분리당 분획물6 100μl) 1 : 10농축) (실시예 25참조 9 : 214mm에서 AUFS 0.1 : 용출속도 1.2m : 1/min, 용출제 : A : 1.0% 트리플루오로 아세트산, B : 아세토니트릴/물 8 : 2+0.07% 트리플루오로아세트산, 변화율 : 2분 16% B, 3분이 경과하는 동안 20% B로 증가, 15분 경과시 25% B로 증가: 27분 경과시 64%로 증가, 대응압력 160바아, 트롬빈 억제 테스트 및 항체 테스트에서 활성분획물은 하기 표 2에 수록하였다. 또한 이 표는 Momo-Q-컬럼(음이온 교환 크로마토그래피)로부터 분획물을 용출시키는 데 필요한 NaCl의 농도를 mM로 나타내었으며, 몇가지 분획물의 가장 긴 파장에서 UV흡수를 나타내었다. 또한, 모든 분획은 항-히루딘 항체와 양성반응을 나타낸다(실시예 30참조).

[표 2]

[실시예 27]

균주 E.coli W3110△102/pML310/1의 발효로부터 데술페이토히루딘 화합물의 특성화

Ⅰ. 분획물 14(참조, ＂실험조건 1＂하의 실시예 26, 표 1) 또는 분획물 1(참조, 실시예 26 ＂실험조건 2＂, 표 2)의 히루된 화합물은 하기의 특성을 갖는다.

(a) 아미노산 조성물의 측정

약 2.5μg의 히루딘 화합물을 100℃에서 6N HCl를 사용하여 24시간동안 가수분해시킨 다음 창(chang)등(DABS-cl법)의 방법으로 분석한다(참조 31). 가수분해물은 하기의 조성을 갖는다.

(b) 부분 서열 분석

5μg(750pmol)의 히루딘 화합물을 에드만(Edman)의 통상적 서열 분석법에 적용시키고, N-말단의 페닐티오히단토인(PTH)-아미노산을 RP-HPLC에 의해 측정한다.

즉, 시험된 생합성 히루딘 화합물의 N-말단서열이 천연의 히루딘의 서열과 동일하다(참조 1).

(c) 카복시펩티다제 Y분해에 의한 C-말단 아미노산의 결정

카복시펩티다제Y를 사용하여 C-말단아미노산의 시간-의존 분해로 C-말단으로서

이 지적된다. 아미노산의 측정은 아미노산 분석기로 수행하였다. Tyr⁶³이 술페이트화 되지 않았음(데술페이토히루딘)이 나타난다.

형질전환된 균주 E.coli W3110△102/pML310/1의 발효로부터 주생성물은, 구조적 데이타 및 천연의 히루딘으로부터 수득된 데술페이토-히루딘과의 비교에 나타난 대로, 데술페이토히루딘이다.

Ⅱ. 나머지 발효 생성물의 구조는 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 분획물 2 내지 6(참조, 표 2)은 HPLC 및 FPLC 데이타의 방법 및 UV-흡수 최대치에 의해서 충분히 규정된 화합물로 정의된다. 이 화합물은 구조적 미세-비균질성(예를 들어 결합된 S-S 브리지 차이) 또는 N-또는 N-말단의 변형(예를 들어, N-말단의 메티오닐잔기 또는 N-말단의 아실화 즉, 포밀화 또는 아세틸화)에 의해 데술페이토히루딘이 아닌 데술페이토히루딘-유사 화합물 임이 확실하다.

균주 E.coli LM1035/pML310/1, E.coli JA221/pML310/1 및 E.coli HB 101/pML310의 발효의 경우에도 역시 데술포이토히루딘이 주생성물로서 확인될 수 있다.

[실시예 28]

비교하기 위하여 천연의 히루딘으로부터 데술페이토 히루딘의 제조

천연의 히루딘을 2mg/ml의 완충액(0.1M 암모늄 아세테이트 pH5.5)에 용해시킨다. 16μg의 아릴술파타제를 함유하는 100μl의 탈염화된 아릴술파타제(Boehringer)를 20μg의 히루딘(10μl 용액)에 가한다.

전체를 25℃에서 인큐베이트하고 HPLC 분석을 수행한다. 6시간 인큐베이션 한 후에 히루딘의 90% 이상 이 데술 페이트화시킨 형성된 데술페이토 히루딘의 보유시간은 실시예 26의 조건(＂실험조건2＂)하에서 12.8분이며, 실시예 26의 ＂실험조건6＂하에서 15.45분이다.

에드만분해에 의해 서열을 분석하고 카복시 펩티다제 Y분해에 의해 C-말단 아미노산을 결정하여 아미노산 조성물은 데술페이토 히루딘에서 기대되는 결과를 수득하였다.

[실시예 29]

효모(S, cerevisiae)에서 데술페이토 히루딘 화합물의 발현

효모에서 이종 단백질의 발현에는 규정된 발현 시스템이 필요하다. 효모세포를 형질전환 시킬 수 있는 플라스미드 벡터상에 강력한 효모 프로모터, 바람직하게 유발 효모-프로모터 및 적절한전사 정지 시그날을 함유하여야 한다. 이 벡터는 또한 많은 카피수를 갖는 여분의 염색체의 복제(replication)를 보장하는 DNA 서열, 바람직하게는 효모 2μ서열을 함유한다. 또, 효모, 바람직하게는 효모 LEU2 유전자에 대한 선택 특히 형질, 및 E.coli에 사용하기 위한 복제 개시점 및 선택 특이형질, 바람직하게는 암피실린 내성 유전자를 갖는 pBR 322 DNA 서열을 함유하여야 한다. 상기의 벡터는 E.coli 및 효모를 증식시키기 위한 소위 셔틀벡터로서 적절하다.

전술한 요구 조건을 만족하는 발현시스템은 유럽 특허원 제100,561호에 기재되어 있으며 효모에서 효과적으로 발현시키기 위한 실시예로 설명되었다. 이종 유전자는 산성 포스파타제의 유발 pH05프로모터의 조절하에 효모로 부터 발현된다. pH05프로모터, 이종 유전자 및 pH05전사 정지는 효모 2μ 플라스미드, 효모 LEU2 유전자 임피실린 내성유전자 및 E.coli 복제개시점의 DNA 서열을 함유하는 효모 벡터 pJDB 207에 연속하여 합쳐진다.

발현 플라스미드 pJDB 207R/pH05-HIR은 하기와 같이 제조된다.

(a) pJDB 207 벡터 단편의 단리

6μg의 플라스미드 pJDB 207R/IF(α-3)(EP 100,561)을 제한 엔도 뉴클레아제 BamHI를 사용하여 완전히 분해시킨다. 생성되는 DNA단편(6.85kb 및 1.15kb)를 에탄올로 침전시키고 400μl의 50mM 트리스. HCl Ph80에 가한다. 4.5단위의 송아지 장의 포스파타제(Boehringer, Mammheim)를 가한다. 이 혼합물을 37℃에서 1시간동안 인큐베이트 시킨 후 포스파타제를 65℃에서 1.5시간동안 비활성화한다. 이 용액을 150mM NaCl로 조절한 다음 사전에 10mM 트리스. HCl pH7.5 150mM NaCl, 1mM EDTA를 사용하여 평형화시킨 DE52(whatman) 음이온 교환컬럼(100μl 용적)에 적용한다.

상기의 완충액으로 세척한 후 400μl의 1.5M NaCl, 10mM 트리스 HCl pH 7.5 1mM EDTA를 사용하여 DNA를 용출시키고 에탄올로 침전시킨다. 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중의 1.2% 아가로스 겔상에서 큰 6.85kb BamHi 단편과 작은 단편이 분리된다.

(b) 534bp pH05 프로모터 단편의 단리

6μg의 폴라스미드 p 31/R(EP 100, 561)을 제한엔도 뉴클레아제 EcoRⅠ 및 BamHⅠ으로 분해시킨다. 생성되는 3개의 DNA 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중의 1.2%아가로스 겔 상에서 분리시킨다. (b) 534bp BamHⅠ-EcoRⅠ단편을 단리한다. 이 단편은 전사개시 부위를 포함하는 pH 05프로모터를 함유한다.

(c) 히루딘을 코드화하는 서열로 206bp DNA 단편의 단리

9μg의 플라스미드 pML310(참조, 실시예 13C)를 제한 효소 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 완전히 분해시킨다. 생성되는 두 DNA 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH8.3중의 1.2% 아가로스 겔 상에서 분리한다. 206bp EcoRⅠ-BamHⅠ단편이 단리된다.

(d) DNA 단편의 연결

상기(a) 내지 (c)에서 언급된 세가지 DNA 단편은 전기용출에 의해서 아가로스 겔 블록으로부터 수득되며 DE52(whatman) 음이온 교환기 상에서 정제하고 에탄올로 침전시킨 후 H₂O에 재현탁시킨다.

0.1pmol(0.45μg)의 6.85kb BamHⅠ벡터 단편, 0.3pmol(0.1μg)의 534bp BamHⅠ-EcoRⅠpH05 프로모터 단편 및 0.25pmol(34mg)의 pML310의 206bp EcoRⅠ- BamHⅠ단편을 15μl의 60mM 트리스. HCl pH7.5 10mM Mgcl₂, 10mM DTT, T₄DNA 리가제(Biolabs) 600단위를 갖는 1mm ATP 중에서 15℃에서 16시간 동안 연결시킨다.

24개의 형질전환된 amp^R클로니를 각각 100μg/ml의 임피실린을 함유하는 LB배지에서 배양한다. 흘름스(Holmes)등의 방법(32)에 따라 폴라스미드 DNA를 단리하고, Hind Ⅲ/EcoRⅠ 이중분해에 의해 분석한다. 약 600bp의 거대한 EcoRⅠ-Hind Ⅲ단편의 출현은 관련된 클론에서 pH05-Hind Ⅲ단편의 출현은 관련된 클론에서 pH05-프로모터-히루딘 DNA 단편이 벡터상의 전사중지시그널에 대하여 옮은 배향을 하고 있는가로 지적된다. 예측한 대로, 약 50%의 클론이 옳은 방향으로 삽입되었다. 이 콜론들중의 하나를 pJDB207 R/pH 0.5-HIR로 명명한다.

(e) 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) GRE18의 형질전환 사카로마이세스 세레비시아에 균주 GRE 18(α, his 3-11, his 3-15, Leu 2-3 leu2-112, Cam^R)을 힌넨(Hinnen)등의 프로토콜(12)에 따라 플라스미드 pJDB207 R/pH05-HiR을 사용하여 형질전환시킨다. 로이신이 결핍된 효모 최소배지를 사용하여 아가플레이트 상에서 형질 전환된 효모세포를 선택한다. 형질전환된 효모 콜로니를 단리시키고 사카로마이세스 세레비시아에 GRF18/pJDB 207 R/pH05-HIR로 명명한다.

(f) S. 세레비비사에 GRE18/pJDB207 R/pH05-HIr의 배양

S. 세레비시아에 GRE18/207R/pH05-HiR의 세포를 20ml의 효모 최소배지(아미노산 부재의 디프코 효모질소 염기에 2% 글루코스 및 20mg/ℓ L-히스티딘을 가함)중에서 30℃에서 요동시키고 세포 밀도가 3x10⁷세포/ml로 될 때까지 배양한다. 이 세포를 0.9% NaCl로 세척한 다음 저급 pi-최소 배지 중에서 50ml 배양액을 접종하는데 사용한다. 저급 Pi-최소배지는 디프코 효모 질소염기 배지(아미노산 결핍)의 조성물과 상응하게 제조되나, (NH₄)₂2% 글루코스 및 1g/ℓ L-히스티딘 대신에 0.03g/ℓ의 kH₂PO₄, Ig/ℓ및 10g/ℓ의 L-아스파라긴을 함유한다. 이 배양액을 세포밀도가 4×10⁶세포/ml가 될때까지 주입하고 30℃에서 24시간동안 200revs/min으로 요동시킨다.

(g) S. 세레비시아에 GRE 8/pJDB207 R/pH05-HIR의 발효로부터 생성혼합물의 분석

세포를(참조, 실시예 29f)통상의 방법(참조, 예를 들어, 유럽 특허원 제100,561호)으로 분해한다. 1.5%아세트산으로 처리한 상청액을 원심분리시키고 맑은 용액 각 2ℓ를 ＂speed vac＂ 농축기에서 고진공으로 건조시킨다. 이 사료를 각각 100μl의 물에 용해시키고 HPLC 분석(실시예 26의 조건)을 수행한다. 개개의 분획물의 트롬빈억제를 테스트한다. 보유시간의 12.8분인 분획물은 89.6%의 트롬빈 억제 작용을 갖는다. 아미노산 조성물에 따라 이 분획물은 데술페이토히루딘이다.

[실시예 30]

경쟁적 방사면역 분석에 의해 히루딘을 측정하기 위해 모노클로날 항-히루딘 항체를 사용하는 데스트 키트

(a) 모노클로날 항-히루딘 항체의 제조

A. 마우스 면역

동결건조된 정제히루딘(3mg)을 소량의 0.1% 아세트산에 용해시키고 인산염-염화 나트륨 완충용액을 3ml까지 가한다.

pH를 7.2로 조절한다. 이 항원용액일부를 동일한 양의 완전한 프로운트 부형제 또는 인산염 염화나트륨 완충용애과 혼합한다.

암컷의 Bal b/c 마우스(8주, 스위스의 시슬른 소재의 동물농장에서 수득)에 염화나트륨 완충용액중의 100μg의 히루딘 용액을 정맥주사한다. 4일 후 비장을 적출한다.

B. 하이브리도마의 제조 및 항체 테스트

하이브리도마 세포의 제조는 수득된 비장세포를 골수종 셀라인 X'63-Ag, 8, 6, 5, 3으로 용해시켜 수행한다(26). 10⁸비장세포 및 10⁷골수종세포가 사용된다. 용해는 (27)의 기재대로 수행한다.

하이브리도마 상청액의 항-히루딘 활성의 측정은 방사면역분석법에 의해 수행한다[RIA(28)].

C. 복수로부터 항-히루딘 항체의 단리 및 정제

Bal b/c 마우스를 0.4ml의 프리스탄(Carl Roth)로 장내 예비 처리한다. 일주일 후, 2내지 5×10⁶의 클론화된 하이브리도마 세포를 복막내 주사한다. 복수액을 각각의 마우스에서 채취하여 -80℃로 냉동시킨다. 축적된 액체를 해동시키고 4℃로 냉동시킨다. 축적된 액체를 해동시키고 4℃에서 30분간 16,000 revs/분으로 원심분리시킨다. 지방을 흡인여과 제거하고, 0℃에서 교반시키며 포화 암모늄 술페이트 용액을 0.9배의 용적으로 서서히 적가하여 조각이 없는 상청액을 남긴다.

생성되는 조면역글로부린 분획물을 제조업자의 지시대로 0.1mM 트리스. HCl(pH 8.2)를 사용하여 세파크릴 G 2000(pharmacia)를 통과시킨다. 활성 분획을 수집하고 Amicon XM50 여과기(Amicon)로 농축시킨다.

(b) 경쟁적 방사면역 분석용 테스티키트

실시예 30a(c)에서 생성된 항-히루딘 항체용액을 인산염-염화나트륨 완충용액(PBS 용액)으로 100μl 당 1μg의 농도까지 농축시킨다. 이 용액 100μl를 항체가 플라스틱 표면에 비-특이적으로 흡착되는 작은 플라스틱 튜브내 또는 플라스틱 미세적가판상에서 37℃로 2시간동안 인큐베이트 한다. 플라스틱 표면상에 남아있는 활성부위를 포화시키기 위하여 소의 혈청알부민용액(BSA용액)으로 후처리한다.

시료용액 또는 BAS 용액중의 표준용액의 일련의 희석액에, 기지의 방법(29)에 의해 125I으로 방사능 표지되고 50μl당 10,000cpm의 활성을 갖는 히루딘 용액50μl을 각각 가하고, 플라스틱 표면상에서 37℃로 2시간 인큐베이트한 다음 이어서 4℃에서 12시간동안 인큐베이트한다. 작은 튜브 또는 미소적가판을 인산염-염화나트륨 완충용액으로 세척하고 방사능을 측정한다. 시료용액중의 히루딘 농도는 표준용액으로 측정된 보정곡선에 의해 측정된다. 전술한 방사면역 분석용 테스트키트는 하기의 조성을 갖는다 :

ml당 1 내지 80mg 농도의 항-히루딘

[실시예 31]

데술 페이토히루딘 화합물을 함유하는 비경구 투여용 약제학적 제제

실시예 27의 데술페이토히루딘 화합물을 함유하는 용액을 0.9% NaCl 용액에 대하여 투석한다. 그 다음 동일한 NaCl용액으로 회석시켜 용액의 농도를 0.2mg/ml 또는 2mg/ml로 조절한다. 이 용액을 한외여과(0.22μm 크기의 막)하여 멸균시킨다.

멸균 용액을 직접 정맥내 투여할 수 있다. 실시예 27의 데술페이토히루딘 화합물의 혼합물을 함유하는 비경구 투여용 용액은 유사한 방법으로 제조된다.

참고문헌

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Claims (6)

1. 히루딘의 아미노산 서열을 코오드화하는 DNA서열을 함유하는 발현 플라스미드에 의해 형질전환되고 발현 조절 서열에 의해 조절되는 숙주 세포를 동화성 탄소 및 질소원을 함유하는 액체 영양 배지 중에서 배양시키고, 생성물을 숙주 세포로부터 유리시켜 단리하며, 필요에 따라서는 공정에 따라 수득할 수 있는 생성물에 디술파이드 결합을 분해하기에 적절한 환원제를 첨가하고, 생성된 환원된 폴리펩타이드를 새로운 디술파이드 결합을 형성시키기에 적절한 산화제로 처리하고, 경우에 따라서는, 생성된 히루딘 화합물을 다른 히루딘 화합물로 전환시키고, 경우에 따라서는 본 공정에 따라 수득할 수 있는 히루딘 활성을 갖는 화합물의 혼합물을 개개의 성분으로 분리하고/하거나, 경우에 따라서는, 생성된 염을 유리 폴리펩타이드로 전환시키거나, 생성된 폴리-펩타이드를 그의 염으로 전환시킴을 특징으로하여, 히루딘 활성을 갖는 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 하기 일반식(ⅩⅣ)의 히루딘 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법.

   [식 XⅣ]

   

   상기식에서, V는 Val 또는 Met-Val이고 W는 Tyr 또는 Tyr(-OSO₃H)이다.
3. 제2항에 있어서, V가 Val이고 W가 Tyr인 일반식(ⅩⅣ)의 데술페이토 히루딘을 제조하는 방법.
4. 데술페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열을 조절하는 발현조절 서열을 함유하는 벡터 DNA내에 상기 DNA 서열을 삽입시킴을 특징으로 하여, 히루딘 활성을 갖는 폴리펩타이드가 상기의 발현벡터로 형질전환된 숙주내에서 발현되도록 상기 서열이 발현조절 서열에 의해 조절되는, 데술페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열을 함유하는 발현벡터를 제조하는 방법.
5. 히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열을 함유하고 발현조절 서열에 의해 조절되는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 형질전환된 숙주 세포를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 숙주세포가 에세르키아 콜리(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 균주임을 특징으로 하는 방법.

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