NO177433B - DNA-vektor for ekspresjon av desulfatohirudin i gjær eller E.coli samt fremgangsmåte for fremstilling av desulfatohirudin og salter derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-vektor for ekspresjon av desulfatohirudin i gjær eller E.coli samt fremgangsmåte for fremstilling av desulfatohirudin og salter derav.

I plasma hos sunne pattedyrorganismer finnes en dynamisk likevekt mellom det fibrinolytiske systemet og koaguleringssystemet, derved opprettholdes et funksjonsdyktig nett av blodkar. Ved skader i blodkarene avleirer koaguleringssystemet en f ibrin-matriks som etter at den hemostatiske tilstanden er oppnådd, igjen nedbryter av det fibrinolytiske systemet. I tilfeller hvor organismens fibrinolytiske potensial ikke er tilstrekkelig til å nedbryte dannede intravaskulære tromber, f.eks. hos pasienter som lider av tromboembolier eller postoperative komplikasjoner, har det vist seg nødvendig å understøtte organismen ved administrering av trombolytiske midler eller antikoagulanter.

I den konvensjonelle antikoaguleringsterapien har man hittil fremfor alt anvendt heparin, men også 4-hydroksykumarin- og 1,3-indandion-derivater. Selv om man med disse midlene har oppnådd bemerkelsesverdige resultater oppviser de likevel noen ulemper. Heparin virker ikke direkte på blodkoagu-leringsforløpet, men utøver sin koaguleringshemmende virkning indirekte ved at den akselererer hemningen av trombin og faktoren X ved antitrombin III. Heparin inngår videre i organismen i tallrike uspesifikke reaksjoner og nøytraliseres av blodplatefaktor 4, dette påvirker spesielt anvendeligheten ved forbruks-koaguleringen, henholdsvis den disseminerte intravasale koaguleringen (DIC). Det foreligger følgelig et behov for alternative og spesifikke midler til antikoagula-sj onsterapi.

Et antikoagulasjonsmiddel, hirudin, som forekommer naturlig i blodigle (hirudo medicinalis) har lenge vært kjent. Hirudin er et polypeptid som består av 65 aminosyrer og har fullstendig oppklart primærstruktur (1) og oppviser som struk-turelt kjennetegn en opphopning av hydrofobe aminosyrer ved N—terminalen og polare aminosyrer ved C-terminalen, en som sulfatmonoester foreliggende tyrosin-rest (Tyr<63>) og tre disulfidbroer, hvis eksakte plassering riktignok ikke er kjent.

Hirudin er med en K^-verdi (kompleks-dissosiasjonskonstant) på 6'IO-<11> M den sterkeste av alle kjente trombin-inhibitorer og karakteriseres ved en spesifikk affinitet for trombin; andre enzymer i blodkoaguleringskaskaden inhiberes ikke. I motsetning til heparin utøver hirudin sin inhiberende virkning på trombin direkte og ikke, som førstnevnte, over antitrombin III. Den eneste farmakologisk påviselige effekten av renset hirudin er hemningen av blodkoagulasjonen, henholdsvis profylaksen av trombose. Ved intravenøs administrering til hunder kunne man selv ved høye doser ikke påvise noen påvirkning på hjerteslagfrekvensen, åndingen, blod-trykket, trombocytt-tallet, fibrinogen og hemoglobin. Ved forsøk med rotter, svin og hund viste hirudin seg å være virksomt ved eksperimentell trombose (fremkalt enten ved stasis eller ved injeksjon av trombin), ved endotoksinsjokk samt DIC (disseminert intravasal koagulering). Ved direkte sammenligningsforsøk med heparin viste hirudin seg overlegen sammenlignet med denne i alle undersøkte tilfeller.

Selv om det lenge har vært kjent, har hirudin inntil idag ikke oppnådd den brede terapeutiske anvendelsen som man på grunn av de utmerkede biologiske egenskapene skulle vente. Hittil har hirudin-preparater utelukkende latt seg fremskaffe som dyre og vanskelig tilgjengelige naturmaterialer, med utgangspunkt i blodigleekstrakter som var underkastet tidkrevende og dyre isolerings- og renseprosesser (se referanse 2). Den relativt lange sekvensen av 65 aminosyrer gjorde at også den klassiske peptid-syntesen fra økonomisk synspunkt syntes å være lite lovende. For å fremstille tilstrekkelige mengder hirudin, for først å gjøre detaljerte kliniske undersøker vedrørende forbindelsens terapeutiske potensial og brede terapeutiske anvendelse i koagulasjons-terapien mulig, må man gå nye veier.

I denne sammenheng synes spesielt den rekombinante DNA-teknologien å by på muligheter. Med dens hjelp er det mulig å fremstille de forskjelligste fysiologisk aktive polypeptider ved dyrking av tilsvarende genetisk modifiserte mikroorganismer eller cellekulturer fra pattedyr.

En viktig oppgave er følgelig ved hjelp av genteknologiske midler å tilveiebringe et ekspresjonssystem som tillater den mikrobiologiske fremstilling av polypeptider med hirudin-aktivitet i industriell målestokk. Denne oppgaven kan løses ved at det tilveiebringes hybridplasmider som inneholder en for aminosyresekvensen i hirudin kodende DNA-sekvens, som kontrollerer ekspresjonskontrollsekvensen på en slik måte at polypeptid med hirudin-aktivitet uttrykkes i en med denne hybridvektoren transformert vertscelle.

Det var å vente at ekspresjonen av slike DNA-sekvenser i transformerte vertsceller (med unntak av transformerte igleceller) i fravær av ekstra innbygde sulfatoverførende enzymsystemer ville føre til et produkt som hovedsakelig skiller seg fra naturlig hirudin ved at sulfatresten ved tyrosin-63 mangler. Den biologiske funksjonen av sulfatrester i proteiner generelt og i hirudin spesielt er ikke definitivt klarlagt i alle enkeltheter; likevel skal sulfatresten ifølge de kunnskaper man nå sitter inne med påvirke de fysiologiske

egenskapene for proteiner i ikke-uvesentlig grad. Slik skal sulfatresten utøve følgende funksjoner:

(1) Positiv påvirkning av den biologiske aktiviteten for proteinet; (2) Deltagelse i den regulatoriske celleprosessen (som kjent fra den reversible fosforyleringen); (3) Stimulering av sekresjonen, dvs. sulfateringen tjener som markering for gjenkjennelsen som sekretorisk protein;

alle kjente sulfaterte proteiner er sekretoriske eller transmembranproteiner.

Overraskende ble det nå funnet at i motsetning til de teoretiske forestillingene opprettholdes de verdifulle biologiske egenskapene for hirudin også når den karakte-ristiske sulfatmonoestergruppen av fenolisk hydroksyl i Tyr<63->resten fjernes. De hirudinforbindelsene uten sulfatrest ("desulfatohirudin") som fremstilles ved hjelp av de transformerte mikroorganismene viser seg nemlig, sammenlignet med naturlig hirudin når det gjelder biologiske egenskaper, og spesielt antikoagulerende virkning, kvalitativt og kvantitativt i det minste jevnbyrdige.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig DNA-vektor for ekspresjon av desulfatohirudin i gjær eller E.coli, kjennetegnet ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for desulfatohirudin med formelen

Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys

Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe

Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin

som kontrolleres av en gjær— hhv. E.coli-ekspresjonskontrollsekvens, slik at desulfatohirudin uttrykkes i en med denne ekspresjonsvektoren transformert gjær— hhv. E.coli-stamme.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av desulfatohirudin og salter derav, kjennetegnet ved at man transformerer gjær— eller E.coli-celler med en vektor som omtalt ovenfor for ekspresjon av desulfato-hirudin, de resulterende transformerte gjær— eller E.coli-cellene dyrkes i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbare karbon— og nitrogenkilder og desulfatohirudin isoleres og, om ønsket, overføres et oppnådd salt til fritt desulfatohirudin eller oppnådd fritt desulfatohirudin til et salt.

I det følgende er ved betegnelsene DNA-sekvenser eller gener som koder for aminosyre-sekvensen i hirudin, slike DNA-sekvenser eller gener å forstå som ved ekspresjon gir hirudinlignende polypeptider, som adskiller seg fra naturlig hirudin spesielt ved at sulfatestergruppen ved tyrosin-63 mangler ("desulfatohirudin").

Utvinningen av genomisk hirudin-DNA og av hirudin-ds cDNA foregår eksempelvis ved i og for seg kjente fremgangsmåter. Slik utvinner man genomisk hirudin-DNA eksempelvis fra en igle-genbank som inneholder hirudin-genet, ved at man kloner igle-DNA-fragmentet i en mikroorganisme og identifiserer klonet som inneholder hirudin-DNA, f.eks. ved kolonihybridisering ved anvendelse av et radioaktivt merket hirudin-DNA spesifikt oligodesoksynukleotid, som inneholder minst 15, fortrinnsvis 15-30 desoksynukleotider. De slikt fremstilte DNA-fragmentene inneholder ved siden av hirudin-genet som regel andre uønskede DNA-bestanddeler, disse kan avspaltes ved behandling med egnede ekso- eller endo-nukleaser.

Dobbeltkjedet hirudin-cDNA kan eksempelvis fremstilles ved at man egnede, fortrinnsvis til hirudin-dannelse induserte igleceller utvinner mRNA, den slik fremstilte mRNA-blandingen anrikes på kjent måte med hirudin-mRNA, dette mRNA anvendes som templat for fremstillingen av enkeltkjedet cDNA, derav syntetiseres det cDNA ved hjelp av en RNA-avhengig DNA-polymerase, og denne klones inn i en egnet vektor. Kloner som inneholder hirudin-cDNA identifiseres eksempelvis, som beskrevet ovenfor, ved kolonihybridisering under anvendelse av et radioaktivt merket hirudin-DNA spesifikt oligodesoksynukleotid.

De på denne måten fremstilte genomiske hirudin-DNA eller hirudin-cDNA knyttes fortrinnsvis sammen ved 5'- og ved 3'-enden med kjemisk syntetiserte adapter-oligodesoksynukleotider som inneholder gjenkjenningssekvensen for en eller forskjellige restriksjonsendonukleaser og dermed letter innbygningen i egnede vektorer. I tillegg må adaptermolekylet inneholde translasjons-startsignalet (ATG) for 5'-enden av hirudin-DNA henholdsvis —cDNA. Translasjons-startsignalet må være anbragt på en slik måte at koden for den første aminosyren følger direkte etter hirudinet.

Siden strukturen for det naturlige hirudin-genet ikke er kjent og den kjemiske syntesen av et for aminosyre-sekvensen i hirudin kodende gen (<n>desulfatohirudin-gen<w>) på grunn av de moderne syntesemulighetene byr på fordeler, spesielt tidsmessige fordeler, utgjør den sistnevnte en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

DNA i forbindelse med oppfinnelsen inneholder i tillegg til kodonene for desulfatohirudin translasjons-start- og stoppsignaler som muliggjør en ekspresjon i egnede vertsceller, eksempelvis E.coli, videre nukleotidsekvenser på endene som er egnet for innbygging i en vektor.

Det er fordelaktig at DNA ved 5'-enden innbefatter en nukleotidsekvens som kan kuttes av et restriksjonsenzym fulgt av translasjons-startsignalet, kodoner for aminosyrene i hirudin, som eventuelt muliggjør kutting på en eller flere posisjoner ved et restriksjonsenzym, et translasjons-stoppsignal og ved 3'-enden en nukleotidsekvens som lar seg kutte av et restriksjonsenzym. Restriksjonsenzymet som kan anvendes er eksempelvis EcoRI, EcoRII, BamHI, Hpall, Pstl, Hinfl eller Hindlll.

Spesielt fordelaktig er et dobbeltkjedet DNA bestående av en nukleotidsekvens av formel I og den komplementære nukleotid-sekvensen

hvor nukleotidsekvensen er angitt med begynnelse ved 5'-enden og for en bedre forståelse av aminosyrene som hver triplett koder for, har man følgende betydninger eller Z = A eller G, når Y = T, eller R = G og S = T eller C, når Q = A, og (X')n og (X</>)m betyr nukleotidsekvenser med n og m større enn 3 og mindre enn 100, spesielt større enn 5 og mindre enn 15, som kan gjenkjennes og kuttes av et restriksjonsenzym. Fordelaktig er først og fremst et dobbeltkjedet DNA som inneholder en av E.coli foretrukket og for aminosyrene i hirudin kodende triplett. Slike tripletter er spesielt

Foretrukket stoppsignal (NON) er kodonet TAG.

En fordelaktig utførelsesform av et for aminosyresekvensen i hirudin kodende gen ved den ovenfor angitte fremgangsmåten er DNA av formel II, hvor A, T, G, C har de under formel I angitte betydninger og for å lette forståelsen er de aminosyrene som hver triplett koder for, og kutteposisjonene for restriksjonsenzymene angitt.

r Anvendes kan også enkeltkjedede DNA-fragmenter av desulfato-hirudin-genet, spesielt slike som ved kjemiske og/eller enzymatiske fremgangsmåter lar seg sammenføye til desulfato-hirudin-genet. Først og fremst vedrører oppfinnelsen enkeltkjedede DNA-fragmenter med mer enn 20 nukleotider, spesielt med 20-70 nukleotider.

Fremgangsmåter til syntese av DNA er sammenfattende angitt

av S.A. Narang (3). De kjente synteseteknikkene tillater fremstilling av polynukleotider med en lengde på opp mot 20 baser i godt utbytte, høy renhet og på forholdsvis kort tid. Egnede beskyttede nukleotider knyttes sammen med hverandre ved fosfordiestermetoden (4), den mer effektive fosfortriestermetoden (5) eller fosfitt-triestermetoden (6). En forenkling av syntesen av oligo- og polynukleotider muliggjøres ved fastfase-fremgangsmåten, hvor nukleotid-kjedene bindes til en egnet polymer. Itakura et al. (7) anvender ved faststoff-syntesen istedenfor enkelte nukleotider

trinukleotider som er sammenknyttet ved fosfotriester-fremgangsmåten, som på kort tid og med godt utbytte eksempelvis kan kondenseres til et polynukleotid med 31 baser.

Det egentlige dobbeltkjedede DNA kan oppbygges enzymatisk

av kjemisk fremstilte korte segmenter. Khorana et al. (8) anvender for dette formål overlappende polynukleotid-sekvenser fra begge DNA-kjedene, som ved basepardannelse holdes sammen i riktig anordning og deretter kan knyttes sammen kjemisk ved hjelp av enzymet DNA-ligase. En ytterligere mulighet består i å inkubere en polynukleotid-sekvens fra begge DNA-kjedene med et kort overlappende segment i nærvær av de fire påkrevde desoksynukleosid-trifosfat med en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet av polymerase I, T4 DNA-polymerase, eller med AMV (avian myeloblastosis virus) revers transskriptase. Derved holdes ved basepardannelse begge polynukleotid-sekvensene sammen i riktig anordning og fullstendiggjøres ved enzymet med de påkrevde nukleotidene til et fullstendig, dobbeltkjedet DNA (9). Itakura et al. (10) beskriver hvordan man med utgangspunkt i dette prinsippet i nærvær av DNA-polymerase I (Klenow-fragment) kan oppbygge et 132 basepar langt segment av det humane leokocytt-interferon c^-genet fra fire kjemisk syntetiserte fragmenter med en lengde på 39-

42 baser, derved oppnår man en innsparing på 40% i kjemisk syntese sammenlignet med den ovenfor omtalte fremgangsmåten hvor bare ligase anvendes. En mulig fremgangsmåte til fremstilling av DNA, som inneholder et strukturgen for desulfatohirudin og er egnet for ekspresjon i vertsceller, og hvis ender muliggjør innbygging i vektorer, og fragmenter derav, omfatter at a) et egnet beskyttet desoksynukleosid bindes til en fast bærer, b) egnet beskyttet di-, tri- eller tetranukleotid fremstilles ved fosfotriester- eller f os f itt-f remgangsmåten, c) et til bæreren bundet desoksynukleosid eller oligodesoksynukleotid knyttet sammen med egnede beskyttede mono- eller

(ifølge b) fremstilte di-, tri- eller tetranukleotider ved

fosfotriester- eller fosfitt-fremgangsmåten,

d) ved c) oppnådde, til bæreren bundne oligodesoksynukleotider med en lengde mellom 20 og 70 baser avspaltes fra

bæreren, renses eventuelt, befris for beskyttelsesgruppene

og de frie 5'-terminale hydroksygruppene fosforyleres,

el) 2 oligodesoksynukleotider hver av en lengde på 20 til 70

baser fra den kodende og komplementære kjeden med minst 3, fortrinnsvis 8-15, overlappende basepar rekombineres og fullstendiggjøres med en DNA-polymerase i nærvær av fire desoksynukleosid-trifosfater til dobbeltkjedede DNA-segmenter (fragmenter og desulfatohirudin-genet),

og eventuelt knyttes 2 dobbeltkjedede DNA-segmenter med egnede ifølge d) fosforylerte ender sammen med en ligase til desulfatohirudin-strukturgenet,

eller to fremstilte dobbeltkjedede DNA-segmenter subklones i egnede vektorer, fosforyleres deretter ifølge d) og knyttes sammen med en ligase til desulfatohirudin-strukturgenet, eller

e2) alternativt rekombineres 2 oligodesoksynukleotider fra den kodende og den komplementære kjeden med en lengde på f.eks. 20-70 baser og med minst 3, fortrinnsvis 8-15, overlappende basepar, oppfylt med en DNA-polymerase i nærvær av fire desoksynukleosid-trifosfater og knyttes sammen med ligase til desulfatohirudin-strukturgenet.

I trinn a) kan et stort antall faste bærermaterialer benyttes, som polystyren med forskjellig fuktbarhet og svelleevne, polyakrylamid, polyakrylamid-kopolymerer, polyamid eller funksjonalisert silan belagt på uorganisk materiale som kiselgur, kiselgel eller aloks. Fordelaktig anvendes kryssbundne polystyren som bærermateriale, disse kan knyttes sammen ved hjelp av "spacere" som alkylengrupper med 2-12 C-atomer avbrutt av 1-5 polare toverdige funksjonelle grupper, som imino, okso, tio, oksykarbonat eller amido-karbonyl, på i og for seg kjent måte med 5'-OH-gruppen i egnede beskyttede desoksynukleosider. Spesielt foretrukket er reaksjonen av i 5'-posisjon og eventuelt i basedelen beskyttede nukleosider av formel V, hvor R<1> betyr en ved syre avspaltbar beskyttelsesgruppe, som en triarylmetylbeskyt-telsesgruppe, eksempelvis en 4-metoksytrityl- eller en 4,4'-dimetoksytritylgruppe, eller en trilaverealkylsilyl-beskyttelsesgruppe, eksempelvis en tert-butyldimetylsilyl-gruppe, og hvor B står for en eventuelt beskyttet base valgt fra tymyl, cytosyl, adenyl eller guanyl, med ravsyreanhydrid, eventuelt i nærvær av baser, som pyridin, trietylamin eller dimetylaminopyridin, etterfulgt av reaksjon med aminometylert polystyren, som er kryssbundet ved 0,5 til 2% divinylbenzen, ved hjelp av reagenser som aktiverer karboksylsyreresten, fortrinnsvis N-hydroksysuccinimid, eller p-nitrofenol og vanntrekkende midler, som karbodiimider, eksempelvis dicykloheksylkarbodiimid (reaksjonsskjerna 1).

Omsetningen foregår i et inert, ikke-protisk oppløsnings-middel, som f.eks. pyridin, tetrahydrofuran, dioksan, eddiksyreetylester, kloroform, metylenklorid, dimetylformamid eller dietylacetamid eller i blandinger derav, ved romtemperatur eller svakt forhøyet eller redusert temperatur, f.eks. i temperaturområdet fra —10<*>C til 50<*>C, fortrinnsvis ved romtemperatur, omsetningen i nærvær av det vanntrekkende midlet også ved lavere temperatur, f.eks. ved ca. 0'C.

Reaksjonsskjerna 1

Ved fremstillingen av di-, tri- eller tetranukleotider ifølge trinn b) (reaksjonsskjerna 2) omsettes i 5'-stilling og eventuelt i basedelen beskyttede nukleosider av formel V, hvor R<1> og B har de ovenfor angitte betydninger, med aktiverte fosforestere av formel VII, hvor X<1> og X<2> uavhengig av hverandre står for hydroksy eller derav avledede salter, halogen, imidazolyl, 1,2,4-triazol-l-yl, tetrazolyl eller 1-benztriazolyloksy og X<2> i tillegg også står for 2-cyano-etyloksy, 2-trihalogenetyloksy, 2-aryltioetyloksy eller 2-(4-nitrofenyl)-etyloksy og R<2> står for en ved en base eller et nukleofil, som ammoniumhydroksyd, tiofenolat eller et arylaldoksymat, avspaltbar beskyttelsesgruppe, som eventuelt ved halogen, nitro og/eller laverealkyl substituert fenyl, metyl eller eventuelt ved nitro substituert benzyl, eller en ved metallioner avspaltbar beskyttelsesgruppe, som 8-kinolyl eller 5-kloro-8-kinolyl, eventuelt i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser.

Deretter omsettes en slik fremstilt forbindelse av formel VIII, hvor R<1>, X<2> og R<2> har de ovenfor angitte betydninger, først eventuelt med en 2-substituert etanol som omvandler resten X<2> til en gruppe OR<3>, hvor R<3> betyr cyanoetyl, 2-trihalogenetyl, 2-arylsulfonyletyl, 2-laverealkyltioetyl, 2—aryltioetyl eller 2-(4-nitrofenyl)-etyl, og deretter avspaltes beskyttelsesgruppen R<1>, og den slik fremstilte forbindelsen av formel IX omsettes med en annen forbindelse av formel VIII, eventuelt i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser, til et dinukleotid X (reaksjons-sk jerna 2). Eventuelt omvandles en forbindelse av formel VIII ved reaksjon med baser og vann til en annen forbindelse av formel VIII, hvor X<2> betyr hydroksy eller derav avledede salter.

Omsetningen foregår i et av de ovenfor omtalte inerte oppløsningsmidler ved romtemperatur eller svakt forhøyet eller redusert temperatur, f.eks. ved romtemperatur.

Avspaltningen av beskyttelsesgruppen R<1> gjennomføres f.eks. ved hjelp av syrer, som mineralsyrer, f.eks. saltsyre eller svovelsyre, karboksylsyrer, f.eks. eddiksyre, trikloreddik-syre eller maursyre, sulfonsyre, f.eks. metan- eller p—toluensulfonsyre, eller spesielt Lewis-syrer, f.eks. sinkklorid, sinkbromid, aluminiumklorid, dialkylaluminiumhalogenid, f.eks. dibutyl- eller dietylaluminiumklorid, eller bortrifluorid, ved 10°C til 50<*>C, spesielt ved romtemperatur. Ved anvendelse av et dialkylaluminiumhalogenid foregår avspaltningen i et lipofilt oppløsningsmiddel, spesielt i toluen, og ved anvendelse av en annen av de nevnte Levis-syrene i en oppløsningsmiddelblanding som består av et halogen-hydrokarbon, f.eks. metylenklorid, og en lavalkanol, f.eks. etanol eller isopropanol.

Reaksjonsskjema 2

Fremstillingen av dinukleotider av formel X omfatter også reaksjonen mellom nukleosider av formel V, hvor R og B

har de ovenfor angitte betydninger, med fosfitter av formel

lo 2

VHA, hvor X står for halogen, spesielt klor, X halogen, spesielt klor, eller dilaverealkylamino, spesielt dimetyl-amino eller diisopropylamino, eller morfolino, piperidino eller pyrrolidmo, og R 2 har den for VII ovenfor angitte betydning, spesielt metyl, eventuelt i nærvær av en egnet base (reaksjonsskjerna 3). Forbindelsene av formel VIIIA omsettes på den ene siden med 2-substituert etanol som omvandler resten X<2> til en gruppe OR<3>, hvor R<3> har de ovenfor angitte betydninger, deretter oksyderes den til fosfat med et oksydasjonsmiddel, f.eks. jod i nærvær av en base og beskyttelsesgruppen R<1> avspaltes, hvorved en forbindelse av formel IX oppstår, på den annen side omsettes med en forbindelse av formel IX, deretter oksyderes med et oksydasjonsmiddel, f.eks. jod i nærvær av en base, til en forbindelse av formel X.

Reaksjonsskjerna 3

Til fremstilling av trinukleotider avspaltes beskyttelsesgruppen R<1> i dinukleotider av formel X, hvor R<1>, R<2> og R<3> har de ovenfor angitte betydninger og hvor B<1> og B<2> uavhengig av hverandre står for tymol, cytosyl, adenyl eller guanyl, og den fremstilte forbindelsen omsettes med en forbindelse av formel VIII, eventuelt i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser, eller med en forbindelse av formel VIIIA og etterfølgende oksydasjon, hvorved en forbindelse av formel XI oppstår (reaksjonsskjerna 4). Avspaltningen av beskyttelsesgruppen R<1> og kondensasjonen til trinukleotider av formel XI foregår på samme måte som beskrevet ved fremstillingen av dinukleotider av formel XI.

Reaksjonsskjema 4

Til fremstillingen av tetranukleotider bringes trinukleotider av formel XI til reaksjon på samme måte som beskrevet ovenfor for dinukleotider av formel X.

Det er fordelaktig at det som beskyttelsesgruppe R<1> anvendes 4—metoksytritylgruppe, som beskyttelsesgruppe R<2> en ved klor substituert fenylgruppe, spesielt 2-klorfenyl, og som beskyttelsesgruppe R<3> 2-cyanoetylgruppen. Foretrukket som rest X<1> og X<2> i forbindelsen av formel VII er 1—benz-triazolyloksy-resten.

Trinukleotider av formel XI fremstilles fortrinnsvis ved at beskyttelsesgruppen R<1> avspaltes i dinukleotidene av formel X og forbindelsen som da oppstår omsettes med forbindelser av formel VIII, hvor X<2> betyr hydroksyl eller derav avledede salter, i nærvær av et vanntrekkende middel (reaksjonsskjerna 4). Vanntrekkende midler er eksempelvis 2 ,4,6-trimetyl- eller triisopropylbenzensulfonyl-klorid, -imidazol, -tetrazol eller 1,2,4-triazol, eventuelt substituert ved nitro. Foretrukket vanntrekkende middel er l-(2,4,6-trimetylbenzensulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol (XII).

Fordelaktig anvendes nukleosider hvis frie aminogruppe er beskyttet i basedelen. Fordelaktige beskyttelsesgrupper er benzoyl for adenin, benzoyl eller 4-metoksybenzoyl for cytosin, isobutyryl eller difenylacetyl for guanin. Tymin anvendes fortrinnsvis uten beskyttelsesgruppe.

Ved fremstillingen av oligonukleotider ifølge trinn c) anvendes en i og for seg kjent apparatur med halvautomatisk eller helautomatisk, mikroprosessorstyrt tilførselssystem for oppløsningsmiddel og reagenser. I en forbindelse a formel VI fremstilt ifølge trinn a) avspaltes beskyttelsesgruppen R<1 >som beskrevet ovenfor, og deretter omsettes enten med en forbindelse av formel VIII, eller med en forbindelse av formel VIIIA eller med en forbindelse av formel X eller XI, hvor beskyttelsesgruppen R<3> på forhånd er avspaltet med baser

(en gruppe 2-cyanoetyl eksempelvis med et trilaverealkylamin, f.eks. trietylamin i et av de ovenfor nevnte inerte oppløs-ningsmidlene eller oppløsningsmiddelblandingene ved ICC til 40<*>C, spesielt ved romtemperatur) eventuelt i nærvær av et vanntrekkende middel eller i nærvær av en base. Også den reaksjonen er mulig hvor man i stedet for et dinukleotid av formel C eller et trinukleotid av formel XI anvender et tetranukleotid fremstilt ifølge trinn b). Der som et fosfitt av formel VIIIA anvendes, etterbehandler man deretter med et oksydasjonsmiddel, f.eks. jod i nærvær av en base. Den på denne måten fremstilte forbindelsen av formel XIII, hvor R<1>, R<2> og B har de ovenfor angitte betydninger og n er et helt tall fra 1 til 4, underkastes de reaksjonstrinnene som er beskrevet for forbindelsen av formel VI (avspaltning av R<1>, reaksjon med VIII, VIIIA, X, XI eller et tilsvarende tetranukleotid, eventuelt med oksyderende etterbehandling), inntil en forbindelse av formel XIII oppstår hvor n er et hvilket som helst helt tall mellom 19 og 69.

Fordelaktig anvendes som beskyttelsesgruppe R<1> 4-metoksytrityl, og avspaltningen gjennomføres med sinkbromid i nærvær av en CH- eller NH-sur forbindelse, spesielt 1,2,40-triazol eller tetrazol. Anvendelsen av f.eks. 1,2,4-triazol ved avspaltningen av 4-metoksytrietyl-beskyttelsesgruppen er ny og fører overraskende til at avspaltningen foregår raskt, med høyt utbytte og uten bireaksjoner. Spesielt foretrukket er anvendelsen av sinkbromid og 1,2,4-triazol i et molart forhold mellom 20:1 og 100:1 i en oppløsningsmiddelblanding bestående av et aprotisk oppløsningsmiddel og en alkohol, eksempelvis metylenklorid og 2-propanol.

Fordelaktig omsettes en forbindelse av formel VI eller av formel XIII, hvor beskyttelsesgruppen R<1> er avspaltet, med et trinukleotid av formel XI, hvor beskyttelsesgruppen R<3> er avspaltet, i nærvær av et vanntrekkende middel som f.eks. 2,4,6-trimetyl- eller triisopropylbenzensulfonylklor, -imidazol, -tetrazol eller -1,2,4-triazol eventuelt substituert ved nitro. Spesielt foretrukket er l-(2,4,6-trimetyl-benzensulf onyl) -3-nitro-l ,2 ,4-triazol (XII).

Den spesielt fordelaktige kombinasjonen som består i at man som beskyttelsesgruppe R<1> anvender 4-metoksytritylgruppen, til avspaltning av R<1> anvender sinkbromid i nærvær av 1,2,4-triazol og som vanntrekkende middel for reaksjonen mellom oligonukleotid-polystyren-harpiks av formel XIII hvor beskyttelsesgruppen er avspaltet med et trinukleotid av formel XI hvor beskyttelsesgruppen er avspaltet anvender triazol av formel XII, dette muliggjør at også lange nukleotidkj eder med 40 til 70 baser overraskende kan fremstilles på kort tid, i høyt utbytte og med høy renhet.

Til avspaltning av oligodesoksynukleotider fra bæreren og til fjernelse av beskyttelsesgruppen ifølge trinn d) anvendes i og for seg kjente fremgangsmåter. En spesielt foretrukket reagens til avspaltning fra bæreren og til fjernelse av den foretrukne 2-klorfenyl-beskyttelsesgruppen er et aryl-aldoksimat, f.eks. 1,1,3,3-tetrametylguanidinium-2-nitro-benzaldoksymat. Reaksjonen foregår i et av de ovenfor nevnte inerte oppløsningsmidlene som er tilsatt noe vann, f.eks. i 95% pyridin, ved romtemperatur. Deretter omsettes med vandig ammoniakk ved romtemperatur eller forhøyet temperatur, f.eks. ved 20<*>C til 70<*>0, spesielt ved 50°C.

Til ligering av oligodesoksynukleotidene innføres en fosfatrest ved den 5'-terminale hydroksygruppen. Innføringen av fosfatresten (fosforyleringen) foregår på i og for seg kjent måte ved hjelp av T4 polynukleotid-kinase i nærvær av

ATP.

Oligodesoksynukleotider fremstilt fra den kodende og den komplementære DNA-kjeden inneholder overlappende sekvenser bestående av minst 3, fordelaktig 8 til 15 overlappende basepar. Slike oligodesoksynukleotidpar holdes ved blanding sammen ved hjelp av hydrogenbrodannelse. De overhengende enkjedede endene tjener ifølge trinn el) og e2) som matriks (templat) for oppbyggingen av den andre (komplementære) kjeden ved en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, Klenow-fragment av DNA-polymerase I eller T4 DNA-polymerase, eller med AMV reversert transkriptase, i nærvær av de fire desoksynukleosid-trifosfåtene (dATP, cCTP, dGTP og TTP). De ved komplementeringen oppstående dupleks-DNA, hvor det spesielt dreier seg om fragmenter av desulfatohirudin-genet (fremgangsmåte el) eller om det komplette desulfatohirudin-genet (fremgangsmåte e2), har flate ender.

De ifølge fremgangsmåtetrinn el) fremstilte fragmentene av desulfatohirudin-genet inneholder ved endene nukleotidsekvenser som gjenkjennes av restriksjonsendonukleaser og kan spaltes. Avhengig av valget av nukleotidsekvenser og dertil hørende restriksjonsendonukleaser oppstår ved spaltningen fullstendige baseparede (flate) ender ("blunt ends") eller ender med en overhengende DNA-kjede ("staggered ends"). Restriksjons-gjenkjennningssekvensene velges slik at ligeringen av DNA-fragmentet, som er behandlet med en flat ende dannet restriksjonsendonuklease, henholdsvis basepar ingen ved de kohesive endene og den etterfølgende ligeringen av DNA-fragmentene med overhengende DNA-kjeder gir det fullstendige desulfatohirudin-strukturgenet. Ligeringen av to dobbeltkjedede DNA-fragmenter krever en 5'-terminal fosfatgruppe som ved donorfragmentet og en fri 3'-terminal hydroksygruppe ved akseptorfragmentet. De i trinn el) oppstående DNA-fragmentene er allerede 5'-terminalt fosfo-rylert og knyttes på kjente måte sammen ved hjelp av en ligase, spesielt T4 DNA-ligase.

Det er mulig på beskrevet måte å fremstille to fragmenter av desulfatohirudin-genet, spesielt fragmentene F^ og F2 ifølge formlene henholdsvis III og IV. Fragmentene, som dersom det er påkrevet kan subklones i en egnet vektor, inneholder fordelaktig gjenkjenningssekvensen for en restriksjonsendonuklease ved sammenkoplingsendene, spesielt EcoRIl, følgelig oppstår ved spaltning med det nevnte restriksjonsenzymet og ligering av begge fragmentene den korrektkodende desulfatohirudin-DNA-sekvensen. I tillegg inneholder delstykke 1 foran translasjons-startsignalet (ATG) og delstykket 2 etter translasjons-stoppsignalet (f.eks. TAG) i tillegg "terminale" restriksjonsposisjoner som tillater innbygging av desulfatohirudin-genet, henholdsvis desulfato-hirudin-genfragmentet i en egnet vektor.

I en fordelaktig variant (fremgangsmåte e2) rekombineres to oligodesoksynukleotider som alternativt stammer fra den kodende og den komplementære kjeden, ved hjelp av minst 3, fortrinnsvis 8 til 15 komplementære baser, oppfylles med en DNA-polymerase, f.eks. en av de ovenfor angitte, og ligeres med T4 DNA-ligase til desulfatohirudin-strukturgen.

Som nevnt innledningsvis vedrører oppfinnelsen ekspresjons-vektorer som inneholder en for desulfatohirudin kodende DNA-sekvens som reguleres av ekspresjonskontrollsekvens på en slik måte at polypeptid med hirudinaktivitet kan uttrykkes i en med denne ekspresjonsvektoren transformert vertscelle.

I prinsippet er alle vektorer egnet som replikerer og uttrykker de heterologe, for aminosyre-sekvensen i hirudin kodende DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen i den valgte verten.

Eksempler på vektorer som er egnet for ekspresjon av desulfatohirudin-genet i en E.coli-stamme er bakteriofager, f.eks. derivater av bakteriofagen X, eller plasmider, som spesielt plasmidet colEl og dets derivater, f.eks. mMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. Oe foretrukne vektorene ved foreliggende oppfinnelse avledes fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder en fullstendig replikasjon og et markeringsgen, som muliggjør seleksjon og identifisering av den med ekspresjonsplasmidene transformerte mikroorganisme på grunn av dens fenotypiske kjennetegn. Egnede markeringsgener gir mikroorganismen resistens f.eks. overfor tungmetaller, antibiotika og lignende. Videre inneholder de foretrukne vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse ved siden av replikasjons- og markeringsgenområder, gjenkjenningssekvenser for replikasjonsendonukleasene, slik at den for aminosyre-sekvensen i hirudin kodende DNA-sekvensen og eventuelt ekspresjons-kontrollsekvensen kan innføres ved disse posisjonene. Den foretrukne vektoren, plasmidet pBR322, inneholder en intakt replikasjon, markeringsgener (te tR og amp<11>) som gir resistens mot tetracyklin og ampicillin og en rekke gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonuklease som bare forekommer en gang, f.eks Pstl (kutter i amp^-genet, tet<R->genet forblir intakt), BamHI, Hindlll, Sali (kutter alle i tet^genet, amp^genet forblir intakt) , Nrul og EcoRI.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan anvendes til regu-lering av desulfatohirudin-ekspresjonen. Spesielt anvendes ekspresjonskontrollsekvenser av sterkt uttrykkede gener fra vertscellen som skal transformeres. I tilfelle med pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsmikroorganisme er ekspresjonskontrollsekvensene (som blant annet inneholder promotoren og den ribosomale bindingsposisjonen) eksempelvis fra laktoseoperonet, tryptofanoperonet, arabinoseoperonet og lignende, fra s-laktamasegenet, den tilsvarende sekvensen fra fag xN-genet eller fra fag fd-sjiktproteingenet og andre egnet. Mens promotoren fra e-laktamasegenet (g-lac-gen) allerede inneholdes i plasmidet pBR322, må de øvrige ekspresjonskontrollsekvensene innføres i plasmidet. Foretrukket som ekspresjonskontrollsekvens ved foreliggende ekspresjonskontrollsekvensene innføres i plasmidet. Foretrukket som ekspresjonskontrollsekvens ved foreliggende oppfinnelse er den fra tryptofanoperonet (trp po).

Vektorer som egner seg for replikasjon og ekspresjon i

gjær inneholer en gjær-replikasjonsstart og en selektiv genetisk markering for gjær. Hybridvektorer som inneholder en gjær-replikasjonsstart, f.eks. de± kromosomale autonome repliserende segmentet (ars), forblir etter transformasjonen ekstrakromosomalt inneholdt i gjærcellen og repliseres autonomt ved mytosen. Videre kan man anvende hybridvektorer som inneholder den gjær-2[i-plasmid-DNA homologe sekvensen. Slike hybridvektorer assimileres ved rekombinasjon inne

i cellen med allerede tilstedeværende 2u-plasmider eller repliserer autonomt. 2^-sekvenser er spesielt egnet for plasmider med stor transformasjonshyppighet og tillater et høyt kopiantall. Egnede markeringsgener for gjær er fremfor alt slike som gir verten antibiotisk resistens eller, i tilfelle med auksotrope gjærmutanter, gener som komplementerer vertsdefektene. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens mot antibiotikumet cykloheksimid eller sørger for prototropi i en auksotrop gjærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, HIS3- eller fremfor alt TRPl-genet. Fortrinnsvis inneholder gjær-hybridvektoren videre en replikasjons-start og et markeringsgen for en bakteriell vert, spesielt E. coli, for at konstruksjonen og kloningen av hybridvektorene og deres forstadier i en bakteriell vert kan finne sted. Ekspresjonskontrollsekvenser som egner seg for ekspresjon

i gjær er eksempelvis de fra TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03-eller PH05-genene, videre promotorer som er involvert i glykolytisk nedbrytning, f.eks. fra PGK- og fra GAPDH-promotoren.

Spesielt vedrører oppfinnelsen ekspresjonsvektorene som

er i stand til replikasjon og fenotypisk seleksjon, som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens og en for aminosyre-

sekvensen i hirudin kodende DNA-sekvens, hvor den nevnte DNA-sekvensen sammen med transkripsjons-startsignalet og —termineringssignalet samt translasjons-startsignalet og —stoppsignalet i det nevnte ekspresjonsplasmidet under reguleringen er anordnet slik i den nevnte ekspresjons-kontrollsekvensen at desulfatohirudin uttrykkes i en med det nevnte ekspresjonsplasmidet transformert vertscelle.

For å oppnå en effektiv ekspresjon, må desulfatohirudin-genet være anbragt riktig (i "fase") med ekspresjonskontrollsekvensen. Det er fordelaktig å knytte ekspresjonskontrollsekvensen i området mellom hoved-mRNA-starten og ATG for genkodesekvensen, som naturlig er knyttet sammen med ekspresjonskontrollsekvensen (f.eks. 9-lac-kodesekvensen ved anvendelse av ø-lac-promotoren), med desulfatohirudin-genet, som fortrinnsvis medbringer sitt eget translasjons-start-signal (ATG) for translasjons-stoppsignal (f.eks. TAG). Derved sikres en effektiv transkripsjon og translasjon.

Eksempelvis kuttes en vektor, spesielt pBR322, med en restriksjonsendonuklease og, eventuelt etter modifikasjon av den slik dannede lineariserte vektoren, innføres i en med tilsvarende restriksjonsender utstyrt ekspresjonskontrollsekvens. Ekspresjonskontrollsekvensen inneholder ved 3'-enden (i translasjonsretning) gjenkjenningssekvensen for en restriksjonsendonuklease, slik at den fordøyer vektoren som inneholder ekspresjonskontrollsekvensen ved det nevnte restriksjonsenzymet og det med passende ender utstyrte desulfatohirudin-genet kan settes inn. Derved oppstår en blanding av to hybridplasmider som inneholder genet i riktig, henholdsvis i gal orientering. Fordelaktig er det å spalte vektoren som allerede inneholder ekspresjonskontrollsekvensen også med en andre restriksjonsendonuklease innenfor vektor-DNA og i det vekt or fragmentet som derved oppstår innføre det med riktige ender utstyrte desulfatohirudin-genet. Alle operasjonene på vektoren foregår fortrinnsvis på en måte som ikke påvirker funksjonen av replikasjonen og minst et markeringsgen.

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir en fra pBR322 avledet vektor, som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens, spesielt den fra tryptofanoperonet (trp po) som ved 3'-enden (mellom hoved-mRNA-starten og den første ATG) bærer gjenkjenningssekvensen for en restriksjonsendonuklease som fortrinnsvis danner kohesive ender, f.eks. EcoRI, fordøyet med den nevnte restriksjonsendonukleasen og i vektor-DNA-delen med en andre restriksjonsendonuklease som danner flate eller fortrinnsvis kohesive ender, f.eks. BamHI, hvoretter den slik lineariserte vektoren knyttes sammen med de tilsvarende endene som oppviser desulfatohirudin-genet (f.eks. med en EcoRI-ende foran ATG-starten og en BamHI-ende etter translasjons-stoppkodonet). Sammenknytningen foregår på kjent måte ved paring av de komplementære (kohesive) endene og ligering f.eks. med T4-DNA-ligase.

Desulfatohirudin-genet som er fremstilt ved mRNA-fremgangsmåten, fra genomisk DNA eller syntetisk utvunnet og utstyrt med tilsvarende kohesive (spesielt EcoRI- og BamHI-) ender kan før innføring i et ekspresjonsplasmid også klones i en vektor, f.eks. pBR322, for å utvinne større mengder desulfatohirudin-gen, f.eks. sekvensanalyse. Isoleringen av klonet som inneholder hybridplasmidet gjennomføres eksempelvis med en desulfatohirudin-gen-spesifikk, radioaktivt merket oligodesoksynukleotid-probe (se ovenfor). Karakteriseringen av desulfatohirudin-genet foregår eksempelvis ved fremgangsmåten angitt av Maxam og Gilbert (11).

Det er også mulig å benytte transformerte vertsceller til fremstilling av forbindelser med hirudin-aktivitet. Fremgangsmåten til fremstilling av disse forbindelsene omfatter at de transformerte vertscellene dyrkes og produkter fra vertscellene settes fri og isoleres.

Dyrkingen av vertscellene foregår på i og for seg kjent måte. Slik kan man for dyrking anvende forskjellige karbonkilder. Eksempler på foretrukne karbonkilder er assimilerbare

karbohydrater, som glukose, maltose, mannit og laktose, eller 5 et acetat, som enten kan anvendes alene eller i en egnet blanding. Egnede nitrogenkilder er eksempelvis aminosyrer, som kasaminosyrer, peptider og proteiner og deres ned-bryt ningsprodukt er, som trypton, pepton eller kjøtt-ekstrakter; videre gjærekstrakter, maltekstrakter, som også 10 ammoniumsalter, f.eks. ammoniumklorid, —sulfat eller —nitrat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som også kan anvendes er f.eks. sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium,

magnesium og kalsium.

15

Videre inneholder mediet f.eks. vekstfremmende stoffer, som sporelementer, f.eks. jern, sink, mangan og lignende, og fortrinnsvis stoffer som utøver et seleksjonstrykk og

forhindrer veksten av cellene som har mistet ekspresjons-

20 plasmidet. Slik tilsettes mediet eksempelvis ampicillin når ekspresjonsplasmidet inneholder et amp<K->gen. En slik tilsats av antibiotisk virksomme stoff bevirker også at forurensende, antibiotika-ømfintlige mikroorganismer drepes. 25 Dyrkingen foregår etter i og for seg kjente fremgangsmåter. Dyrkingsbetingelsene, som temperatur, pH-verdi for mediet og fermenteringstiden velges slik at den maksimale hirudin-titeren oppnås. Dyrkingen av en E.coli- eller en gjær-stamme

foregår fortrinnsvis under aerobe betingelser i neddykket

5° kultur under risting eller omrøring ved en temperatur på 20-40"C, fortrinnsvis ca. 30<*>C, og en pH-verdi på 4-9, fortrinnsvis ved pH 7, i løpet av 4-20 timer, fortrinnsvis 8-12 timer. Derved ansamles ekspresjonsproduktet intracellulært.

'5 Når celletettheten har nådd en tilstrekkelig verdi avbrytes dyrkingen og produktet settes fri fra cellene av mikroorganismen. For dette formål ødelegges cellene, f.eks. ved

behandling med et rensemiddel, som SDS eller triton, eller de lyseres med lysozym eller et like sterkt virkende enzym. Alternativt eller i tillegg kan man anvende mekaniske krefter, som skjærkrefter (f.eks. <M>X-pressen, "French-presse", "Dyno-mill") eller risting med glassperler eller aluminiumoksyd, eller avvekslende nedfrysning, f.eks. i flytende nitrogen, og opptining, f.eks. til 30°C til 40°C, samt ultralyd til nedbrytning av cellene. Den resulterende blandingen som inneholder proteiner, nukleinsyrer og andre cellebestanddeler anrikes etter sentrifugeringen på i og for seg kjent måte med protein. Slik fraskilles f.eks. den største delen av ikke-proteinbestanddelene ved polyetylenimin-behandling og proteinene innbefattet hirudin-forbindelsene utfelles f.eks. ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter. Bakterielle proteiner kan også utfelles ved hjelp av surgjøring med eddiksyre (f.eks. 0,2%, pH 4-5). En ytterligere anrikning på hirudin-forbindelse kan oppnås ved ekstraksjon av den eddiksure overvæsken med n-butanol. Andre rensetrinn omfatter f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, som ionebytterkromatografi, gelpermeeringskromatografi, partisjonskromatografi, HPLC, omvendt fase-HPLC og lignende. Adskillelsen av blandebestand-delene foregår ved dialyse, etter lasting ved gel- eller bærerfri elektroforese, ved molekylstørrelser ved hjelp av en egnet r,Sephadex"-søyle, ved affinitetskromatografi, f.eks. med antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer, eller med trombin koplet til en egnet bærer for affinitetskromatografi, eller ved andre fremgangsmåter som spesielt er kjent fra 1itteraturen.

Eksempelvis omfatter isoleringen av de uttrykkede hirudin-forbindelsene følgende trinn: Adskillelse av cellen fra kulturoppløsningen ved hjelp av sentrifugering;

Fremstilling av et råekstrakt ved nedbrytning av cellene, f.eks. ved behandling med et lyserende enzym og/eller avvekslende nedfrysning og gjenopptining;

Frasentrifugering av de uoppløselige bestanddelene; Utfelling av DNA ved tilsats av polyetylenimin;

Utfelling av proteinene ved hjelp av ammoniumsulfat; Affinitetskromatografi av det oppløste bunnfallet ved en monoklonal anti-desulfato-hirudin-antistoff-søyle eller en trombin-søyle;

Avsalting av den slik fremstilte oppløsningen ved hjelp av dialyse eller kromatografi på "Sephadex G25" eller "Sephadex G10".

Alternativt kan de bakterielle proteinene utfelles ved hjelp av 1% eddiksyre etter fraskillelse av DNA, fra den sure overvæsken kan hirudin-forbindelsen ekstraheres med n-butanol eller den sure overvæsken kan direkte underkastes ionebytterkromatografi (f.eks. dietylaminoetylcellulose DEAE 53). Videre rensetrinn innbefatter gelfiltrering på "Sephadex G50"

(eller G75) og omvendt fase-HPLC. Avsaltingen foregår igjen på "Sephadex G25".

Til påvisning av hirudin-aktivitet kan man anvende testen med anti-hirudin- eller anti-desulfatohirudin-antistoffer (f.eks. fra monoklonale antistoffer som er tilgjengelige fra kanin eller fra hybridomceller) , trombin-teten (15) eller blod-koaguleringstesten (16).

Tidligere undersøkelser har vist at bestandigheten av disulfidbroene er av betydning for den strømningshemmende aktiviteten av naturlig hirudin (se litt. 2). Avhengig av valget av vertsceller kan man ikke utelukke at sammenknytningen av de seks cystein-restene i det primære translasjons-produktet under dannelse av de tre disulfidbroene forløper på en måte som adskiller seg fra det naturlige forløpet i igleceller. Det er mulig at "falske" tertiærstrukturer som innstiller seg på produktet fører til en reduksjon eller tap av verdifulle farmakologiske egenskaper, spesielt den blodkoaguleringshemmende aktiviteten, dette lar seg fastslå ved hjelp av den ovenfor omtalte hirudin-analysen (f.eks. trombin-testen). I et slikt tilfelle er det hensiktsmessig å spalte disulfid-bindingen ved hjelp av et egnet reduksjons-middel og bringe det reduserte polypeptidet til ny sammenknyt-ning av disulfid-bindingen ved hjelp av et egnet oksydasjonsmiddel. Ved hjelp av hirudin-aktiviteten for det dannede produktet (f.eks. ved trombin-testen) lar det seg fastslå

om de valgte betingelsene (reduksjons- og/eller oksydasjonsmiddel) har ført til det ønskede biologisk aktive hirudinet, eller om betingelsene må modifiseres på kjent måte.

Reduksjonsmidler som egner seg til oppspalting av disulfid-bindingen er f.eks. tiolforbindelser, som tiofenol, 4-nitrotio-.fenol, 1,4-butanditiol og spesielt 1,4-ditiotreitol. Reduk-sjonen gjennomføres fortrinnsvis i et vandig-alkalisk medium, f.eks. i den fortynnede vandige oppløsningen av et alkali-metallhydroksyd, f.eks. natriumhydroksyd, alkalimetall-karbonat, f.eks. natriumkarbonat, eller en organisk base, spesielt et trilaverealkylamin, f.eks. trietylamin, ved romtemperatur.

Oksydasjonsmidler som egner seg til ny sammenkopling av disulfid-bindingene i de reduserte polypeptidene er f.eks. luftoksyd, som ledes gjennom en vandig oppløsning av polypeptidet som eventuelt er tilsatt en katalytisk mende av et overgangsmetallsalt, f.eks. jern-(III)-sulfat, jern-(III)-klorid eller kopper-(II)-sulfat; Jod, også i form av kaliumjodid-addisjonsproduktet K, som fortrinnsvis anvendes i alkoholisk, f.eks. metanolisk eller vandig-alkoholisk, f.eks. vandig-metanolisk oppløsning; kalium-heksacyanoferrat-(III) i vandig oppløsning; l,2-dijodetan eller azodikarboksylsyredimetylester eller -dietylester, som bringes til reaksjon i vann eller i en blanding bestående av vann og et med vann blandbart alkohol, f.eks. metanol. Oksydasjonen gjennomføres spesielt ved romtemperatur. Fraskillelsen av reagensene, spesielt saltene og oksydasjons-henholdsvis reduksjonsmidlet og deres følgeprodukter, fra den ønskede hirudin-forbindelsen foregår etter i og for seg kjente fremgangsmåter, eksempelvis ved molekylvekts-filtrering, f.eks. på "Sephadex" eller "Biogel".

Forbindelsene som lar seg fremstille ifølge oppfinnelsen, kan ikke bare foreligge i fri form, men også i form av salter, spesielt farmasøytisk akseptable salter. Siden de inneholder flere aminosyre-rester med frie aminogrupper, kan forbindelsene som oppnås f.eks. foreligge i form av syreaddisjonssalter. Som syreaddisjonssalter kommer speislet fysiologisk tålbare salter med vanlige terapeutisk anvendelige syrer i betraktning; som uorganiske syrer kan nevnes halogenhydrogen-syrer, som hydrogenklorid, men også svovelsyre og fosfor-henholdsvis pyrofosforsyre; som organiske syrer er i første rekke sulfonsyrer, som benzen- eller p-toluen-sulfonsyre eller laverealkansulfonsyrer, som metansulfonsyre, samt karboksylsyrer, som eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearinsyre; eplesyre, vinsyre, askorbinsyre og sitronsyre egnet. Siden hirudin-forbindelsene også inneholder aminosyre-rester med frie karboksylgrupper, kan de også foreligge som metallsalt, spesielt som alkalimetall- eller jordalkali-metallsalt, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumsalt, eller også som ammoniumsalt, avledet fra ammoniakk eller en fysiologisk tålbar, organisk nitrogen-holdig base. Siden de imidlertid samtidig inneholder frie karboksylgrupper og frie aminogrupper, kan de også foreligge som indre salt.

Alt etter arbeidsmetoden får man forbindelsene i fri form, i form av syreaddisjonssalter eller salter med baser. Fra syreaddisjonssaltene og saltene med baser kan den frie forbindelsen utvinnes på i og for seg kjent måte, f.eks. ved innstilling av pH-verdien til det isoelektriske punktet. Fra det sistnevnte lar igjen terapeutisk akseptable syreaddisjonssalter henholdsvis salter med baser seg utvinne ved omsetning med syrer henholdsvis baser, f.eks. med slike som danner de ovenfor nevnte saltene, og inndamping eller lyofilisering.

Den egenskapen hos antistoffer at de binder spesifikke antigener, finner utenfor kroppen praktisk anvendelse ved kvalitativ og kvantitativ bestemmelse (immuno-analyse) og ved rensing av antigenene (immunoaffinitetskromatografi). Serumimmuniserte dyr inneholder normalt en lang rekke forskjellige antistoffer som reagerer med det samme antigenet på forskjellige bindingsposisjoner med forskjellig affinitet, med dertil også antistoffer mot andre antigener som gjen-speiler individets tidligere erfaringer. Vellykket anvendelse av antistoffer til bestemmelse og rensing av antigener krever imidlertid høy spesifisitet og reproduserbarhet.

Homogene antistoffer som oppfyller disse kravene er blitt tilgjengelige ved den av Kohler og Milstein (17) beskrevne hybridom-teknikken. Prinsipielt består teknikken i at antistoff-utskillende B-lymfocytter, f.eks. fra milten hos immuniserte dyr smeltes sammen med ("fusjoneres") med tumorceller. De dannede hybridom-cellene kombinerer evne til ubegrenset formering ved deling, med evnen til å danne og å utskille en enhetlig type antistoffer. Ved dyrking i et selektivt medium, hvor ikke-fusjonerte tumoreeller dør, men hybridomceller formerer seg, og ved egnet manipulasjon, kan man oppnå å kultivere kloner, dvs. cellepopulasjoner som er avledet fra en eneste hybridomcelle og som er genetisk identiske, og de ved cellene produserte monoklonale antistoffene kan isoleres.

De ifølge foreliggende oppfinnelse oppnåelige hirudiner oppviser verdifulle farmakologiske egenskaper og kan, som hirudin ekstrahert fra blodigler, anvendes profylaktisk eller spesielt terapeutisk.

Desulfatohirudin-forbindelsene som lar seg fremstille ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser en biologisk aktivitet som minst er ekvivalent med aktiviteten for naturlig hirudin. Slik oppviser eksempelvis desulfatohirudin en K.-verdi

o -11 1

pa ca. 10 M. Desulfatohirudin er fullstendig spesifikk for trombin og oppviser ingen vekselvirkning med andre proteinaser i blodkoaguleringssystemet. Den aktive toksi-siteten er ytterst lav; hos rotter kan man ved doser på f.eks. 1 g/kg ikke fastslå noen tegn på toksisitet. Tilsvarende observeres ingen typer sensitivitets- og allergi-reaksjoner.

De nye desulfatohirudin-forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan følgelig analogt naturlig hirudin anvendes til terapi og profylakse av tromboser og tromboembolier, og også til profylakse av postoperative tromboser, til akutt sjokkterapi (f.eks. ved septisk eller polytraumatisk sjokk), til terapi ved feilfunksjoner i koaguleringssystemet, ved hemodialyser, hemoseparasjoner og i det ekstrakorporale kretsløpet.

Disse preparatene kan spesielt finne anvendelse ved de ovenfor angitte indikasjonene, hvor de f.eks. kan admini-streres parenteralt, som intravenøst, intrakutant, subkutant eller intramuskulært, eller topisk.

Doseringen avhenger først og fremst av den spesifikke doseringsformen og formålet med terapien eller profylaksen. Størrelsen av enkeltdosene samt administreringsformen kan best bestemmes ved en individuell vurdering av det enkelte sykdomstilfellet; de fremgangsmåtene som ved denne vurde-ringen benyttes til bestemmelse av relevante blodfaktorer er kjent for fagmannen. I normaltilfellet ligger den terapeutisk virksomme mengden av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen ved en injeksjon i doseområdet fra 0,005 til 0,1 mg/kg legemsvekt. Foretrukket er området fra 0,01 til 0,05 mg/kg legemsvekt. Administreringen foregår ved intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon. Tilsvarende inneholder farmasøytiske preparater til parenteral administrering i enkeltdoseform avhengig av anvendelsesarten pr. dose 0,4 til 7,5 mg av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen. Ved siden av det virksomme stoffet inneholder disse farmasøytiske preparatene normalt også en buffer, f.eks. en fosfatbuffer som skal holde pH-verdien mellom 3,5 og 7, og videre natriumklorid, mannit eller sorbit for å innstille isotonien. De kan foreligge i frysetørket eller oppløst form, hvor oppløsninger med fordel kan inneholde et antibakterielt virksomt konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0,3% 4-hydroksy-benzosyremetylester eller -etylester.

Et preparat for den topiske anvendelsen kan foreligge som vandig oppløsning, lotion eller gel, oljeformig oppløsning eller suspensjon, eller fettholdig eller spesielt emulsjonssalve. Et preparat i form av en vandig oppløsning oppnår man f.eks. ved at det virksomme stoffet fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk akseptabelt salt derav oppløses i vandig bufferoppløsning med pH 4 til 6,7, og om ønsket tilsettes et annet virksomt stoff, f.eks. et anti-inflammasjonsmiddel og/eller et polymert klebemiddel, f.eks. polyvinylpyrrolidon og/eller et konserveringsmiddel. Konsentrasjonen av det virksomme stoffet utgjør 0,1 til 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg i 10 ml av en oppløsning eller 10 g av en gel.

En oljeformet påføringsform for topisk administrering får man f.eks. ved suspensjon av det virksomme stoffet fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk akseptabelt salt derav i en olje, eventuelt under tilsats av svellemidler, som aluminiumstearat, og/eller grenseflateaktive midler (ten-sider) , hvis HLB-verdi (,,hydrophilic-lipophilic-balance<M>) ligger under 10, som fettsyremonoestere av flerverdige alkoholer, f.eks. glyserinmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmonooleat. En fettholdig salve oppnår man f.eks. ved suspensjon av det virksomme stoffet fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et salt derav i et smørbart fettgrunnlag, eventuelt ved tilsats av et tensid med en HLB-verdi under 10. En emulsjonssalve oppnår man ved pulverisering av en vandig oppløsning av det virksomme stoffet eller et salt derav i et mykt, smørbart fettunderlag under tilsats av et tensid hvis HLB-verdi ligger under 10. Alle disse topiske påføringsformene kan også inneholde konserveringsmidler. Konsentrasjonen av det virksomme stoffet utgjør 0,1 til 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg, i ca. 10 g av grunnmassen.

Ved siden av de ovenfor omtalte og analoge farmasøytiske preparater, som anvendes for en direkte medisinsk innsats i det menneskelige legemet eller i et pattedyr, kan tilsvarende farmasøytiske preparater også anvendes utenfor det levende menneskelegemet eller pattedyret. Slike preparater anvendes først og fremst som koaguleringshemmende tilsatser til blod som utenfor legemet underkastes sirkulasjon eller behandling (f.eks. ekstrakorporalt kretsløp eller dialyse i kunstige nyrer), konservering eller modifisering (f.eks. hemosepara-sjon). Sammensetningen av slike preparater, som forråds-oppløsninger eller også som preparater i enkeltdoseform, ligner mye på de ovenfor omtalte injeksjonspreparatene; det er imidlertid hensiktsmessig at mengden eller konsentrasjonen av det virksomme stoffet innstilles etter volumet av blodet som skal behandles eller, mer nøyaktig, blodets trombin-innhold. Det bør bemerkes at det virksomme stoffet (i fri form) deaktiverer en fem ganger så stor vektmengde trombin, er fysiologisk harmløs også i større mengder, og meget raskt utskilles fra det sirkulerende blodet også i høye konsentra-sjoner slik at det ikke består noen fare for overdosering, heller ikke f.eks. ved blodoverføringer. Alt etter det spesifikke formålet utgjør den egnede doser 0,01 til 1,0 mg virksomt stoff/l blod, selv om den øvre grensen kan over-skrides uten fare.

Viktige i forbindelse ned oppfinnelsen er de DNA-sekvensene son er beskrevet i eksenplene og son koder for aminosyre-sekvensen i hirudin, ekspresjonsplasmider som inneholder slike DNA-sekvenser, mikroorganismer som er transformert ved slike ekspresjonsplasmider, monoklonale antistoffer mot hirudin, hybridomceller som produserer slike antistoffer, og forsøksinnretninger for immunoanalyser som inneholder slike antistoffer, de fremgangsmåtene som er beskrevet i eksemplene til deres fremstilling og de i eksemplene omtalte fremgangsmåtene til fremstilling av polypeptider med hirudin-aktivitet ved hjelp av de transformerte mikroorganismene, samt de i eksemplene beskrevne nye desulfatohirudin-forbindelsene.

De følgende eksemplene og tegningene tjener til illustrasjon av oppfinnelsen.

De forkortelsene som anvendes i eksemplene har følgende betydning: Eksempel 1: Fremstillin<g> av den besk<y>ttede nukleosid-polvstyren- harpiksen

2,57 g (5 mMol) 5'-(4-metoksytrityl)-tymidin (MMT-0-T-OH)

i 20 ml absolutt pyridin blandes med 750 mg ravsyreanhydrid

og 910 mg 4-dimetylaminopyridin og får stå i 16 timer ved romtemperatur. Etter inndamping av pyridinoppløsnigen tas blandingen opp i 200 ml eddiksyreetylester, utrastes to ganger, hver gang med 200 ml 0,1 M fosfatbuffer under tilsats av 10 ml mettet koksaltoppløsning, vaskes nok en gang med mettet koksaltoppløsning, tørkes, inndampes og heksan tilsettes dråpevis. Det utfelte produktet skilles fra og tritureres to ganger med eter, oppløses så i 300 ml eddiksyreetylester og utristes ved 0°C med 180 ml 0,1 M kaliumhydrogensulfat med pH 2,5. Etter to gangers vasking med vann, tørkes eddikesteroppløsningen med natriumsulfat, filtreres, blandes med 0,5 ml pyridin, inndampes og fortynnes dråpevis med heksan. Det utfelte ravsyrederivatet filtreres fra.

1,0 g av denne forbindelsen oppløses sammen med 190 mg N-hydroksysuccinimid i 4 ml eddiksyreetylester og 2 ml dimetylformamid og blandes ved 0°C med 370 mg N,N<*->dicykloheksylkarbodiimid. Etter henstand over natten i kjøleskap frafiltreres det utfelte N,N'-dicykloheksylurinstoffet, filtratet fortynnes med eddiksyreetylester, ekstraheres med kald 0,1 M natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes og inndampes i vakuum til tørrhet. Residuet kromatograferes med eddiksyreetylester på kiselgel. DC: R^ 0,4 5 i diklormetan-metanol (9:1) .

100 mg av denne N-succinimidoyl-ravsyreesteren blandes med 1 g aminometyl-polystyren (amininnhold 110 ^mol/g)

i 2 ml diklormetan og 4 ml dimetylformamid i 20 timer. Polymerharpiksen filtreres fra og utvaskes med dimetylformamid, metanol, diklormetan og metanol. Etter tørking acetyleres de ikke omsatte aminogruppene, ved at harpiksen røres i 6 ml pyridin med 1 ml eddiksyreanhydrid og 100

mg 4-dimetylaminopyridin i 30 minutter. Polymerharpiksen utvaskes med diklormetan, dimetylformamid, metanol og diklormetan og tørkes inntil konstant vekt oppnås. Den

spektroskopiske metoksytrityl (MMT)-bestemmelsen viser et innhold på 57 uMol/g.

Eksempel 2;

Analogt eksempel 1 fremstilles følgende beskyttede nukleosid-polystyren-harpiks:

fra 5'-(4-metoksytrityl)-N-isobutyryl-deoksyguanosin, innhold 32 uMol/g.

Eksempel 3: Syntese av trinukleotidet

a) Syntese avdinukleotidet; 7,73 g (15 mMol) 5'-(4-metoksytrityl)-tymidin (MMT-0-T-OH) inndampes to ganger med absolutt pyridin. Residuet renses i 20 ml absolutt tetrahydrofuran og tilsettes dråpevis til 80 ml av en 0,2 M oppløsning av 2-klorfenyl-di-(1-benzotriazolyl)-fosfat i tetrahydrofuran under omrøring og under utelukkelse av fuktighet og reaksjonsblandingen omrøres en time ved romtemperatur. Den fremstilte oppløs-ningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfatet deles i tre deler. a) Hydrolyse til trietylammonium-2-klorfenyl-5'-(4-metoksy trityl )-tymidin-31-fosfat: Til en tredjedel av den ovenfor omtalte oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5•-(4-metoksytrietyl)-tymidin-

3'-fosfat tilsettes under avkjøling 100 ml 0,5 M trietyl-ammoniumbikarbonat. Etter 15 minutter ekstraheres det med diklormetan. Diklormetanoppløsningen vaskes med vann, inndampes og blandes dråpevis med petroleumseter. Den utfellingen som oppnås filtreres, vaskes med eter-petroleumseter 1:1 og tørkes i vakuum. DC: R^ 0,35 i diklormetan-metanol-vann (75:22:3). 6) Forestring til 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-5'-(4-metoksytrityl ) -tymidin-3 1 -f osf at og avspaltning av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen: Til en tredjedel av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzo-triazolyl-5 '-( 4-metoksytrityl ) -tymidin-f osf at tilsettes 1,3 ml 2-cyanoetanol og 2 ml pyridin. Blandingen får stå over natten ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet avdestil-leres i vakuum og residuet løses i eddiksyreester og utristes flere med 0,1 M fosfatbuffer, pH 7. Den organiske fasen tørkes, inndampes og tilsettes dråpevis til heksan. Bunnfallet filtreres fra, oppløses i 50 ml diklormetan-metanol 7:3 og blandes ved 0°C med en oppløsning av 3,8 g p-toluensulfonsyremonohydrat i 75 ml diklormetan-metanol 7:3. Etter 2 timer fortynnes reaksjonsoppløsningen med diklormetan og utristes med en kald natriumhydrogenkarbonat-oppløsning. Den organiske fasen inndampes og blandes med heksan. Det utfelte 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-tymidin-3'-fosfat kromatograferes på kiselqel med diklormetan-metanol (96:4) .

DC: Rf på 0,45 i diklormetan-metanol (9:1).

y) Kondensasjon til 5'-(4'metoksytrityl)-3'-cyanoetyl)-bis-tymidin-dinukleotid: I 2,2 g 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-tymidin-3'-fosfat fjernes vannet to ganger ved inndamping med absolutt pyridin, forbindelsen løses i 20 ml absolutt tetrahydrofuran og tilsettes til den siste tredjedelen av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5 * -(4-metoksytrietyl)-tymidin-3'-fosfat.

Etter 18 timer ved romtemperatur tilsettes det til reaksjons-oppløsningen under isavkjøling 10 ml vann og 200 ml eddiksyreetylester. Den organiske fasen vaskes flere ganger med natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes til et lite volum. Det beskyttede dinukleotidet i fosfatdelen og ved 5'- henholdsvis 3<1->enden utfelles ved dråpevis tilsats til eter-heksan 1:1.

DC: Rf 0,48 i diklormetan-metanol (9:1).

b) Syntese av trinukleotidet:

1,17 g (1 mMol) av det ovenfor omtalte fullstendig beskyttede dinukleotidet oppløses i 30 ml diklormetan-metanol 7:3 og blandes under isavkjøling med en oppløsning av 1,9

g p-toluensulfonsyremonohydrat i 20 ml diklormetan-metanol 7:3. Etter 2 timer tilsettes iskald natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og det ekstraheres med diklormetan. Den organiske fasen tørkes, inndampes og tilsettes dråpevis til heksan. Det utfelte rå dinukleotidet med fri 5'-hydroksygruppe kromatograferes på kiselgel med en gradient på 2-8% metanol i diklormetan.

DC: Rf 0,33 i diklormetan-metanol (9:1).

850 mg av dette 5'-hydroksy-dinukleotidet og 1,06 g trietyl-ammonium-2-klorfenyl-5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat [se avsnitt a)a)] inndampes to ganger med pyridin, opplsøes deretter i 10 ml absolutt pyridin og blandes med 560 mg 1-mesitylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT). Etter 2 timer tilsettes 2 ml iskaldt vann og etter nok en time ekstraheres med diklormetan. Den organiske fasen vaskes med mettet natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes, inndampes og blandes med eter. Det utfelte trinukleotidet renses ved kromatografi på kiselgel. Rf 0,45 i diklormetan-metanol (9:1).

Eksempel 4:

Analogt eksempel 3 fremstilles følgende beskyttede trinukleotider av generell formel:

forkortet B<1>B<2>B<3>. For nukleosidene B1, B2, B3 anvendes følgende forkortelser:

A = N-benzoyl-deoksyadenosin

C = N-benzoyl-deoksycytidin

G = N-isobutyryl-deoksyguanosin

T = Tymidin

a) Tynnsjiktkromatogram på kiselgel i diklormetan-metanol 9:1.

Eksempel 5: Syntese av DNA- fragmentet med en lengde på

67 baser fra base nr. 96 til base nr. 162 av

DNA- kjeden ( 9 6/ 67)

a) Avspaltning av 2- cyanetylbeskyttelsesgruppen i trinukleotidet: 10 uMol av trinukletidet fra eksempel 3 eller 4 oppløses under utelukkelse av fuktighet i 60 ul pyridin-acetonitril-trietylamin 1:1:1. Etter en time ved romtemperatur tilsettes dråpevis 0,7 ml peroksydffi eter og bunnfallet sentrifugeres fra. Det råe trietylammoniumsaltet oppløses i 50 ul pyridin og utfelles nok en gang med 0,5 ml eter, frasentrifugeres og tørkes 15 timer i høyvakuum. b) Sammenkopling av det delbeskyttede trinukleotidet med den til polystyren- harpiksen bundne oligonukleotidkjeden:

Alle operasjoner utføres under utelukkelse av fuktighet i

en reaksjonsbeholder med et innhold på 220 ul og mikroprosessorstyrt oppløsningsmiddel- og reagens-tilsats. 13 mg (0,74 uMol) av tymidin-polystyren-harpiksen (eksempel 1) plasseres først i reaksjonsbeholderen og underkastes følgende operasjoner:

1. Metylenklorid, 2 ml/min., 4 min.

2. Metylenklorid-isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 min.

3. Sinkbromid 1 M og 1,2,4-triazol 0,02 M i metylenklorid-isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2-3,5 min.

4. Metylenklorid-isopropanol (85:15), 2 ml/min., 4 min.

5. Trietylammoniumacetat 0,5 M i DMF, 2 ml/min., 5 min.

6. Molekylarsikt-tørket pyridin, 2 ml/min., 3 min.

7. Tetrahydrofuran (peroksydfri, molekylarsikt-tørket),

2 ml/min., 3 min.

8. Nitrogenstrøm, 10 min.

9. Injeksjon av 10 uMol trinukleotid GTC (trimetylammonium-salt fra avsnitt a)) og 8,9 mg (30 uMol) 1-mesitylen- sulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT) løst i 150 (il pyri din . 10. 45°C, 20 min.

11. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.

12. Acetanhydrid 5% og 4-dimetylaminopyridin, 2,5% i pyridin, 2 ml/min., 4 min.

13. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.

14. Pyridin-isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 min.

Alle 14 operasjonene gjentas 21 ganger, ved den 9. opera-sjonen anvendes i stedet for GCT i hvert tilfelle følgende trinukleotider i form av trietylammoniumsalter (avsnitt a)) i den angitte rekkefølgen: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG,

TGA, CGG, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA,

TTC, GGG, CCT, CAT. Det midlere koplingsutbyttet utgjør 97%. Sluttproduktet har følgende struktur:

TCT-polystyren

c) Avspaltning av DNA- fragmentet fra bæreren og avspaltning av beskyttelsesgruppene: 40,0 mg (ca. 0,60 uMol) DNA-synteseharpiks 96/67 holdes med 66 mg (0,40 mMol) o-nitrobenzaldoksim og 50 ul (0,40 mMol) 1,1,3,3-tetrametylguanidin i 400 ul 95% pyridin i 3 timer ved 50°C og i 12 timer ved romtemperatur. Etter avblås-ing av pyridinet med nitrogen, blandes residuet med 1,6 ml vandig ammoniakk (33%) og holdes i en lukket beholder i 24 timer ved 50°C.

Den fraskilte flytende fasen befris i vakuum for ammoniakk og vaskes tre ganger, hver gang med 3 ml peroksydfri dietyl-eter. Etter fraskillelse av lavmolekylære bestanddeler på en "Biogel P6"-søyle (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 Molar trimetylammoniumhydrogenkarbonat pH 7,5, 1,5 ml/min.) isoleres 285 OD (260 nm) DNA.

Totalt 60 OD fraskilles på en HPLC-søyle ("PRP-l/Hamilton", 250 x 4,6 mm). Gradient (oppløsning A: 0,05 M trietylammoniumacetat pH 7,0; Oppløsning B: Oppløsningracetonitril 1:1):

30% B i A * 60% B i A i 20 min. ved 50°C og 2 ml/min.

Den lipofile hovedtoppen (retensjonstid ca. 14 min.) samles, oppkonsentreres på en "DE52-Cellulose" (Whatman)-søyle, elueres og utfelles med etanol. Til avspaltning av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen oppløses bunnfallet i 50 ul eddiksyre/f^O (4:1) og holdes i 45 min. ved romtemperatur. Reaksjonsproduktet lyofiliseres, utfelles med etanol og adskilles til rensing elektroforetisk med en 8% polyakrylamidgel (7 M urinstoff). Den mengden som tilsvarer den ventede DNA-størrelsen skjæres ut og produktet elektroelueres, oppkonsentreres på DE52-Cellulose" og DNA 96/67

av strukturen

utfelles med etanol.

Eksempel 6:

Analogt eksempel 5 fremstilles følgende DNA-fragmenter (5'-3' ) : 1/58 4 6/64 komplementær 154/64 komplementær

Eksempel 7: Fosforylering av fragmentene 1/ 58, 4 6/ 64 komplementær, 96/ 67 og 154/ 64 komplementær Fosforyleringen og den radioaktive merkingen på 5'-endene foregår med [y-<32>P]ATP og T4 polynukleotid-kinase (Boehringer) som beskrevet i (18).

Eksempel 8: Polymerisasjon til dupleks II ( delstykke F.,

av desulfatohirudin- genet)

50 pMol av kinasert fragment 9 6/67 og kinasert fragment 154/64 oppløses i 24 ul vann, oppløsningen oppvarmes i 3 minutter til 9 0°C og avkjøles i løpet av 5 minutter til 12°C. Etter tilsats av 4 ul endo-R-buffer (0,1 molar Tris-HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM 6-merkaptoetanol, 0,6

M NaCl), 10 ul deoksynukleosidtrisfosfat-blanding (dATP, dCTP, dGTP, TTP, i hvert tilfelle 2-10<-3> molar, innstilt til pH 7,0 med NH3) og 2 ul (10 enheter) DNA-polymerase I, Klenow-fragment (Boehringer) inkuberes det i 30 minutter ved 12°C. Reaksjonen stoppes ved 3 minutters oppvarming til 90°C og blandingen oppbevares frem til den videre bearbeidelsen ved -80°C.

På analog måte omsettes de kinaserte fragmentene 1/58 og 4 6/64 til dupleks I (delstykke F1 av desulfatohirudin-genet) .

Dupleksene I og II har følgende strukturer:

Dupleks I

Dupleks II

Fremstillingen av delstykkene F^ og F2 av desulfatohirudin-genet er gjengitt i følgende skjema I:

Skjema 5: Fremstilling av delstykkene F-^ og F2 av desulfato- hirudin-genet og F^-F2-DNA

Eksempel 9: Polymerisas jon og liqering av fragmentet 1/ 58,

46/ 64 kinasert, 96/ 67 kinasert og 154/ 64;

Fremstilling av desulfatohirudin- genet

50 mMol av hvert av fragmentene 1/58, 46/64 kinasert, 96/67 kinasert og 154/64 løses i 48 ul vann, oppløsningen oppvarmes 3 minutter til 90°C og avkjøles i løpet av 5 minutter til 12°C. Etter tilsats av 8 ul endo-R-buffer (se eksempel 8), 20 ul deoksynukleosidtrifosfatblanding (dATP, dCTP, dGTF,. TTP, hver av 0,002 molar, pH justert til 7,0 med NH^) og 2 (il (10 enheter) DNA-polymerase I, Klenow-f ragment (Boehringer) inkuberes det i 30 minutter ved 12°C. Reaksjonen stoppes ved 3 minutters oppvarming til 90°C og DNA isoleres etter fenol/kloroform-ekstraksjon ved etanolutfelling. Den fremstilte DNA-blandingen oppløses i 100 ul ligasebuffer

(66 mM tris-HCl pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol,

5 mM ATP), blandes med 50 enheter (2 ul) T4 DNA-ligase (Biolabs) og inkuberes i 20 timer ved 20°C. Reaksjonen stoppes ved 5 minutters oppvarming til 70°C og DNA isolers ved etanolutfelling etter fenol/kloroform-ekstraksjon.

Etter oppdeling av blandingen på en 8% polyakrylamidgel (denaturerende) elektroelueres ligasjonsproduktet med 217 baseparene ved elektroforese, oppkonsentreres på en "DE52-cellulose"-søyle og isoleres ved etanolutfelling etter eluering.

Desulfatohirudin-genet har følgende struktur:

Fremstillingen av desulfatohirudin-genet fra de fire fragmentene er gjengitt i følgende skjema II: Skjema 6: Fremstilling av hirudin-genet fra de fire synte tiske fragmentene. Eksempel 10: Fremstilling av plasmidet pML 300 som inne holder F-^- DNA i desulfatohirudin- genet ( fig. 1)~ a) Fremstilling av den lineariserte vektoren pBR322/ EcoRI/ PvuII 5 ug pBR322 plasmid-DNA nedbrytes med 5 enheter PvuII restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 200 ml av en oppløsning av 100 ug/ml gelatin i 1 time ved 37°C. Deretter innstilles denne oppløsningen på 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl,

og DNA nedbrytes med 30 enheter EcoRI-restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 2 timer ved 37°C. Deretter innstilles opp-

løsningen på 50 mM tris-HCl pH 8 og ved en DNA-konsentrasjon på 10 ug/ul inkuberes med 2 enheter intestinal alkalisk kalve-fosfatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved oppvarming av oppløsningen i 60 minutter til 65°C. Deretter innstilles oppløsningen på TNE, ekstraheres med 1 volumdel fenol og kloroform og det nedbrutte DNA utfelles med 2 volumdeler alkohol ved -20°C over natten.

Den fra pBR322 DNA utskårne vektoren (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 basepar) adskilles ved gelelektroforese på 1% lavtsmeltende agarose (Biorad) i tris-acetat-EDTA-buffer pH 8 fra små DNA-fragmenter (2067 basepar). Etter farging av DNA i agarosegel med EtBr kuttes den posisjonen av gelen

som inneholder DNA-mengden av pBR322/EcoRI/PvuII-vektoren (= 2297 basepar) fra gelen og flytendegjøres ved 65°C i 10 minutter. Til denne DNA-oppløsningen tilsettes 20 volumdeler TNE, DNA renses ved "DE-52"-kromatografi ifølge Mueller et al. (19), ekstraheres med fenol/kloroform og

DNA utfelles med alkohol ved -20°C over natten. DNA-bunnfallet oppløses i 50 ul 0,01 M tris-HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA og oppbevares inntil anvendelsen ved -20°C. 1,4 ug (= 3,2 pMol ender) DNA oppnås.

b) Fremstilling av F-^- DNA/ EcoRI

2 4 ng (=1,3 pMol ender) av den kjemisk syntetiserte F-^-DNA

(se eksempel 8) nedbrytes med 5 enheter EcoRI restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 50 ul 100 mM tris-HCl (pH 7,5),

50 mM NaCl og 100 ug/ml gelatin i 30 minutter ved 37°C. Deretter tilsettes oppløsningen 0,06 ug (= 0,14 pMol

ender) av den lineariserte vektoren pBR322/EcoRI/PvuII (eksempel 10a). Deretter inaktiveres enzymet ved oppvarming til 65°C i 10 minutter, oppløsningen innstilles på

TNE og ekstraheres med fenol/kloroform. DNA utfelles med alkohol. Det utfelte DNA oppbevares under alkohol ved

-20°C inntil den videre bearbeidelsen.

c) Ligering av pBR322/ EcoRI/ PvuII vektor- DNA med F^- DNA/-

EcoRI og konstruksjon av plasmidet pML300.

Det i eksempel 10b) fremstilte DNA-bunnfallet, som inneholder begge de nevnte DNA-bruddstykkene, oppløses i 20 (il av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 ug/ml gelatin og behandles med 25 enheter/ul T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. På denne måten oppstår i oppløsningen det rekombinerte plasmidet pML300 som inneholder F^-DNA.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML300

De E. coli HBlOl-cellene som er forbehandlet med kalsium

og som er nødvendige for transformasjonen fremstilles som beskrevet av Mandel et al. (14).

Den under c) fremstilte oppløsningen som inneholder det rekombinerte plasmidet pML300, oppvarmes i 10 minutter til 65°C for å inaktivere T4~DNA-ligasen og avkjøles deretter til 37°C. 10 ul av denne reaksjonsblandingen tilsettes til 150 ul kalsium-behandlet E. coli HBlOl-celler i 10 mM MgCl2 og 10 mM tris-HCl (pH 7,5) i et totalvolum på 200 ul.

Deretter avkjøles denne blandingen i 30 minutter på is, oppvarmes i 2 minutter til 42°C og får deretter stå i 50 minutter i 1 ml L-medium (se eksempel 18) ved 37°C. Deretter strykes blandingen i like store deler på 0,2 ml på 5 agarplater (McConkey-agar, Difco) som inneholder 60 ug/ml "Ampicillin" (Serva). Agarplatene holdes deretter ved 37tirC

i 16-18 timer. Det oppnås 484 ampicillin-resistente kolonier av den transformerte E. coli HB101.

e) Undersøkelse av koloniene som inneholder F^- DNA.

470 transformerte kolonier (eksempel 10d) avtrekkes på

nitrocellulosefilter B85 (Schleicher og Schull). Etter Grunstein og Hogness (20) lyseres koloniene og deres denatu-rerte DNA festes på filteret. Deretter følger en forhybri-

disering av filteret i 20 ml (pr. filter) 4 x SET [= oppløs-ning av 30 mM tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA],

0,1% (g/volum) "Ficoll 400" (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 ug/ml denaturert kalvethymus-DNA i 4 timer ved 64°C. Deretter behandles nitrocellulosefilteret i 20 ml (pr. filter)

5xSET (g/volum) "Ficoll 400", 0,2% SDS og 50 ug/ml denatu-

32

rert kalvethymus-DNA i 16 timer ved 64°C med den P-radio-

3 4

aktivt merkede proben (ca. 10 -10 Cerencov cpm pr. filter). Som probe benyttes oligonukleotidet 46/64 komplementær

(se eksempel 6).

Deretter vaskes filteret to ganger i 2xSET, 0,2% SDS ved romtemperatur, deretter to ganger i 2xSET, 0,5% SDS ved 60°C (først 30 minutter, deretter 60 minutter). Deretter tørkes filteret mellom 3 MM papir (Whatman) og legges ved -80°C på en røntgenfilm (Fuji) med en forsterkerfolie (Intensifying screen, Ilford) i 1-2 dager.

Det oppnådde autoradiogrammet viser 71 positive kolonier (kloner) som kan anvendes til videre arbeid, en av disse inneholder betegnelsen pML300.

Eksempel 11: Fremstilling av plasmidet pML305 som inneholder

F?- DNA' en av desulfatohirudin- genet ( fig. 2).

a) Fremstilling av den lineariserte vektoren pBR322/ BamHI/ NruI 5 ug pBR322 plasmid-DNA nedbrytes med 30 enheter BamHI-restriksjonsendonuklease i 30 minutter ved 37°C i en opp-løsning av 100 mM NaCl, 6 mM tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2

og 100 ug/ml gelatin. Deretter tilsettes oppløsningen 15 enheter PvuII-restriksjonsendonuklease og nedbrytes i 2 timer ved 37°C.

Reaksjonsblandingen oppvarmes i 10 minutter til 70°C for

å inaktivere enzymene. Deretter adskilles de to DNA-fragmentene fra hverandre ved gelelektroforese på 1% lavt-

smeltende agarose i tris-acetat EDTA-buffer pH 8 (se eksempel 10a).

DNA-samlingen av pBR322 BamHI/PvuII-vektoren (= 2672 basepar) skjæres ut, flytendegjøres og renses etter Mueller et al. (19) ved "DE-52"-kromatografi. Det oppnås 0,75 ug

(= 1,5 pMol ender) DNA.

b) Fremstilling av F^- DNA/ BamHI

2 5 ug (= 1,3 pMol ender) av den kjemisk syntetiserte F2~DNA

(eksempel 8) nedbrytes med 16 enheter BamHI-restriksjonsendonuklease (Biolabs) i 20 ul 150 mM NaCl, 6 mM tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 100 ug/ml gelatin i 30 minutter

ved 37°C. Deretter tilsettes oppløsningen 60 ng (= 96 nMol ender) av den lineariserte vektoren pBR322/BamHI/PvuII (eksempel lia), hele oppløsningen innstilles på TNE og ekstraheres med fenol/kloroform og DNA'en utfelles med 2 volumdeler alkohol. Den utfelte DNA lagres inntil den videre bearbeidelsen under alkohol ved -20°C.

c) Ligering av pBR322/ BamHI/ PvuII- vektor- DNA med F2- DNA/ BamHI og konstruksjon av plasmidet pML3 05

Det under eksempel 11b) fremstilte DNA-bunnfallet som inneholder begge de nevnte DNA-bruddstykkene, oppløses i 20 (il av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2,

10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 ug/ml gelatin og behandles med

15 enheter/ul T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer.

På denne måten oppstår i oppløsningen det rekombinerte plasmidet pML305 som inneholder F2~DNA. d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML305. Transformasjonen av de med kalsium behandlede E. coli HB101-cellene foregår som beskrevet i eksempel 10d). Det anvendes 10 ul av den i eksempel 12c) oppnådde reaksjonsblandingen. 313 ampicillin-resistente kolonier oppnås.

e) Undersøkelse av koloniene som inneholder F.,- DNA

65 transformerte kolonier (eksempel lid) undersøkes med

hensyn på F2~DNA som beskrevet i eksempel 10e). Som radioaktiv probe anvendes oligonukleotidet 154/64 komplementær (se eksempel 6). I autoradiogrammet oppnås 2 positive kolonier, en av disse inneholder betegnelsen pML305.

Eksempel 12: Karakterisering av klonene pML300 og pML305 DNA i de rekombinerte plasmidene pML300 og pML305 isoleres ifølge Ish-Horowitz (21). Nukleotidsekvensene i F^-DNA-

og F2~DNA-innskuddene bestemmes etter Maxam og Gilbert (11). For dette formålet spaltes 10 ug plasmid-DNA av pML300 med EcoRI-restriksjonsendonuklease og 10 ug plasmid-DNA av pML305 med BamHI-restriksjonsendonuklease og de lineariserte DNA'ene isoleres ved geleluering fra agarosegel (se eksempel 10a)., Deretter nedbrytes de isolerte DNA'ene med alkalisk fosfatase og kromatograferes over "DE-52" (se eksempel lia). Deretter merkes DNA'ene på 5<1->enden radioaktivt med [ y- 32P]ATP (spesifikk aktivitet

> 5000 Ci/mmol, Amersham) og T^-polynukleotid-kinase .

(P-L-Biochemicals).

De radioaktivt merkede DNA'ene spaltes så med en andre restriksjonsnuklease (EcoRII). De oppnådde DNA-fragmentene isoleres ved geleluering fra agarose. I tilfelle med pML300 bestemmes så fra EcoRII-EcoRI<*->fragmentet (ca. 109 basepar) nukleotidsekvensen for F^-DNA, i tilfellet med pML3 00 bestemmes F2~DNA'en i EcoRII-BamHI<*->fragmentet (ca. 122 basepar) .

(<*> angir DNA-enden som er radioaktivt merket).

Nukleotidsekvensene som er bestemt for F^-DNA og F2~DNA

er identiske med de som er angitt i eksempel 8.

Eksempel 13; Fremstilling av ekspresjonsplasmidet pML310

a) Konstruksjon av den lineariserte vektoren pHRi! 48/ EcoRI/- BamHI, som inneholder trp- promotor- operatoren ( fig. 3

og fig. 4)

A. Konstruksjon av plasmidet p! 59

10 ug plasmid pBRHtrp (22) spaltes med 50 enheter EcoRI (Biolabs) i løpet av 60 minutter ved 37°C, og nedbrytnings-blandingen fraksjoneres etter fenolekstraksjon ved en sakkarose-tetthetsgardient (5-23%) i 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA i en TST41 (Kontron AG) rotor. Sentrifugeringen varer i 14 timer ved 40.000 opm og 15°C. 0,3 ml fraksjoner samles med en ISCO-gradientkollektor ved 1 ml/min. Fraksjonene som inneholder mindre fragmenter samles, løs-ningen innstilles på TNE og det felles med 2 volumdeler etanol ved -20°C. DNA oppløses, etter sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge i 100 ul 10 mM tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5 ug av disse DNA-fragmentene spaltes med 5 enheter Bglll (Biolabs) i 60 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol og kloroform og DNA inkuberes med 2 volumdeler etanol ved -80°C i 10 minutter, DNA samles ved sentrifugering og oppløses på nytt i 50 ul 50 mM tris-HCl (pH 8,0). 2 ul av denne oppløsningen tas ut (0,2 ug DNA) og inkuberes ved en DNA-konsentrasjon på 10 ng/ul i 50 mM tris-HCl (pH 8,0) med 1 enhet intestinal alkalisk kalve-fosfatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved oppvarming av oppløsningen i 60 minutter til 65°C. 0,04 ug DNA tas ut og 5'-termi-

32

nalen med 10 uCi [Y- P]-ATP (>5000 Ci/mmol, Amersham)

og 5 enheter T^ polynukleotid-kinase (P-L Biochemicals) inkuberes i 20 ul reaksjonsvolum i 50 mM tris-HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT i 30 minutter ved 37°C. Den radioaktive proben blandes med den ikke-merkede proben (se ovenfor) og DNA-fragmentene fraksjoneres ved hjelp av en 5-23% sakkarose-tetthetsgradient i 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 1.mM EDTA i en TST60-rotor. Sentrifugeringen

foregår i 5 timer ved 60.000 opm og 15°C. Det samles fraksjoner på 0,2 ml. Radioaktiviteten av hver fraksjon bestemmes ved måling av Cerencov-strålingen og fragmentene identifiseres derved. De ønskede fraksjonene som inneholder det lille DNA-fragmentet samles, DNA utfelles med 2 volumdeler etanol og oppløses etter sentrifugering igjen i 20 ul 10 mM tris.HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA.

32

Det P-merkede EcoRI-Bglll DNA-fragmentet spaltes delvis med 0,2 enheter Taql (Biolabs) i et volum på 50 ul i 10 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen innstilles på

0,2% SDS, 10% glyserin, 10 mM EDTA, 0,05% bromfenol-blått og DNA-fragmentene adskilles på en 6% polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA (23). På autoradiogrammet identifiseres den ønskede EcoRI-Tagl-holdige mengden (det største del-fragmentet). Dette fragmentet (L, se fig. 3) ekstraheres fra gelen og renses (19) og oppløses i 10 ul 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA.

Som akseptor-plasmid anvendes pBR322 som er spaltet med Clal og EcoRI: 2 ug pBR322 nedbrytes med 4 enheter Clal (Biolabs) i et reaksjonsvolum på 20 ul i 60 minutter ved 3 7°C. Proteinet ekstraheres med fenol og DNA utfelles deretter med 2 volumdeler etanol ved -80°C i løpet av 10 minutter. DNA samles ved sentrifugering og nedbrytes deretter med 10 enheter EcoRI (Biolabs) i 30 minutter ved 37°C i et reaksjonsvolum 20 ul. Deretter blandes oppløs-ningen med 2 volumdeler 0,1 M tris-HCl (pH 8,7) og inkuberes med 1 enhet alkalisk kalve-fosfatase (Boehringer)

i 30 minutter ved 37°C. Fosfatasen inaktiveres deretter ved inkubering ved 65°C i 60 minutter.

100 ng av akseptor-plasmidet inkuberes med 5 ul fragment 1-DNA i 15 ul reaksjonsvolum i 10 mM MgCl2, 20 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP med 30 enheter pr. ul reaksjonsvolum av T4 DNA-ligase (Biolabs) i 2 timer.

5 ul av denne oppløsningen tilsettes til en blanding som inneholder 150 ml av E. coli HBlOl-celler (14) som er behandlet med kalsiumklorid i 10 mM MgCl-,, 10 mM CaCl2

og 10 mM tris-HCl (pH 7,5) i et totalvolum på 200 ul. Blandingen avkjøles i 2 0 minutter på is, oppvarmes i 1 minutt til 42°C og inkuberes i 10 minutter ved 20°C. 1 ml trypton-medium [Trypton-medium inneholder 10 g bacto-trypton (Difco); 1 g gjærekstrakt (Difco); 1 g glukose; 8 g NaCl og 294 mg CaCl2'2H20 ill destillert vann] tilsettes og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C under risting ved 300 omdr./min. Blandingen plasseres på to agarplater (McConkey agar, Difco; 0,6 ml/plate), supplert med 50 ug/ml "Ampicillin" (Sigma). Platene inkuberes i 12 til 17 timer ved 37°C.

Plasmid-DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres på følgende måte: Koloniene anvendes til inokulering av 10 ml trypton-medium supplert med 50 ug/ml "Ampicillin", som ovenfor, i en 25 ml Erlenmyerkolbe. Kulturene ristes i 15-18 timer ved 37°C og 300 omdr./min. Cellene høstes ved sentrifugering (Sorval, HS-4-rotor, 10 min. ved 4000 omdr./min., 4°C). Man oppnår ca. 0,1 g celler og disse resuspenderes i 1 ml 50 mM tris-HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysozymoppløsning [10 mg/ml i 50 mM tris-HCl (pH 8,0)] tilsettes og etter 10 minutters inkubering ved 0°C tilsettes 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Etter ytterligere 10 minutter ved 0°C tilsettes 60 ul 2% "Triton X-100" (Merck). Etter 30 minutter ved 0°C sentrifugeres proben i 30 minutter ved 15.000 omdr./min. og 4°C i en "Sorval SA-600"-rotor. Overvæsken deproteiniseres med 1 volumdel fenol (mettet i TNE). Fasene adskilles ved sentrifugering ("Sorval HB-4"-rotor)

i 10 minutter ved 5000 omdr./min. og 4°C. Den øvre fasen ekstraheres to ganger med 1 volumdel kloroform. Pankreatisk RNAse A (Sigma; 10 mg/ml i TNE, foroppvarmet

i 10 minutter ved 85°C) tilsettes til en sluttkonsentra-

sjon på 25 ug/ml og blandingen inkuberes i 4 0 minutter ved 37°C. Oppløsningen innstilles så på 1 M NaCl og 10% polyetylenglykol 6000 (Fluka, behandlet i autoklav 1 20 minutter ved 120°C) og inkuberes i 2 timer ved -10°C. Bunnfallet samles i en "Sorval HB-4"-rotor (20 minutter

ved 10.000 omdr./min, 0°C) og oppløses på nytt i 100 ul TNE. DNA-oppløsningen ekstraheres med 1 volum fenol og DNA utfelles med 2 volumdeler etanol i 10 minutter ved

-80°C. Bunnfallet samles ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og DNA oppløses på nytt i 20 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Fra en 10 ml kultur utvinner man 8-10 ug plasmid-DNA.

Plasmid-DNA analyseres etter nedbrytning med følgende restriksj onsenzymer: 0,5 ug plasmid-DNA spaltes i hvert tilfelle med Hpal (Biolabs) samt med Hpal (Biolabs) og EcoRI (Biolabs) med Clal (Biolabs) ifølge standardforskriftene som er angitt av enzymfabrikanten. DNA fraksjoneres på en 1% agarosegel i 40 mM tris-acetat

(pH 7,8) 1 mM EDTA og 0,5 ug/ml etidiumbromid. De ønskede plasmidene inneholder en Hpal-posisjon og gir etter tre gangers nedbrytning ved siden av det større DNA-fragmentet to mindre fragmenter som er større enn det lille EcoRI-Clal-fragmentet av pBR322. Et av disse plasmidene betegnes med pl59 (se fig. 3).

B. Konstruksjon av plasmidet pHRi! 4 5

2 ug pl59-DNA nedbrytes med 10 enheter EcoRI (Biolabs)

i 30 minutter ved 37°C. DNA ekstraheres med fenol,

utfelles med etanol og oppløses etter sentrifugering i 10 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. Den med EcoRI nedbrutte DNA behandles videre med 5 enheter DNA-polyme-

rase (Klenow-fragment) (Boehringer) i 10 mM MgCl2/ 10 mM 6-merkaptoetanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) i 15 minutter ved 12°C. Polymerasen inaktiveres deretter ved inkubering ved 85°C

i 5 minutter., Reaksjonsblandingen fortynnes med en faktor

10 i 20 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT,

0,5 mM ATP (Sigma) og inkuberes med 30 enheter T4 DNA-

ligase pr. ul reaksjonsblanding i 1 time ved 15°C.

50 ng av DNA transformeres i E. coli (som beskrevet ovenfor) og plasseres på McConkey-agarplate supplert med

50 ug/ml "Ampicillin".

Plasmid-DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA analyseres ved nedbryt-

ning med EcoRI. De ønskede plasmidene er EcoRI-resistente. Analysen foregår som beskrevet ovenfor. Et av de ønskede plasmidene betegnes som HRil4 5 (fig. 3).

C. Konstruksjon av plasmidet pHRi! 48

2 ug pHRil45-DNA behandles med 5 enheter Clal (Boehringer)

i 60 minutter ved 37°C, deretter blir den deproteinert ved hjelp av fenol-ekstraksjon. DNA utfelles med etanol og oppløses deretter i 20 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 0,5

mM EDTA. De overhengende endene utfylles som beskrevet ovenfor med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) med den endringen at dATP og dTTP erstattes av dCTP (P&L Biochemicals) og dGTP (P&L Biochemicals). Polymerasen inaktiveres ved inkubering ved 85°C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen blandes med 2 volumdeler 0,1 M tris-HCl (pH 8,7) og inkuberes med 0,5 enheter kalve-fosfatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen deproteineres ved fenol-ekstraksjon. DNA utfelles med etanol og oppløses i 8 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA.

En kjemisk syntetisert DNA-binder av formelen

5<1->GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3'

fosforyleres ved 5'-enden, ved at 8 pMol av binderen inkuberes med 5uCi [ y- 32 P]-ATP (5500 Ci-mmol -1 Amersham) i et 8 ul reaksjonsvolum som inneholder 0,1 mM rATP (Sigma),

50 mM tris*HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 2

enheter T4 polynukleotid-kinase (P&L Biochemicals) i

30 minutter ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved nedfrysning til -80°C.

Den radioaktivt merkede binderen behandles deretter med

1 ug Clal og fosfatase og ligeres med pHRil45-DNA (se ovenfor) i et 20 ul reaksjonsvolum som inneholder 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM tris-HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 og 800 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs). Inku-beringen foregår ved 15°C i 2 timer. Ligasen inaktiveres ved inkubering ved 85°C i 10 minutter. Deretter tilsettes 2 volumdeler vann, koksalt-konsentrasjonen innstilles på

10 mM og 20 enheter Kpnl (Biolabs) tilsettes i løpet av

3 0 minutter ved 37°C. Etter ekstraksjonen med fenol og kloroform fraksjoneres blandingen ved en 0,9% lavtsmeltende agarosegel (Biorad) i 40 mM tris.acetat (pH 7,8), 1 mM

EDTA og 0,5 ug/ml etidiumbromid. Den ved UV-bestråling synlige samlingen som oppviser samme mobilitet som en merker-DNA av samme størrelse, skjæres ut med en skalpell. Gelstykket smeltes i 5 minutter ved 65°C og avkjøles deretter til 37°C. Man oppnår et volum på ca. 20 ul. 5 (il av denne oppløsningen tas ut og inkuberes med 4 00 enheter T4~ligase (Biolabs) i 10 ul reaksjonsvolum, som er innstilt på 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM tris-HCl (pH 7,8) i 12 timer ved 15°C. 1/10 volumdel av en oppløsning med 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 tilsettes til ligase-blandingen (størknet ved 15°C) og det inkuberes ved 65°C i 5 minutter. Oppløsningen anvendes så for å transformere de med kalsium behandlede E. coli HBlOl-cellene, som beskrevet ovenfor. Blandingen plasseres på McConkey-agarplate supplert med 50 ug/ml "Ampicillin".

Plasmid-DNA fra 10 forskjellige kolonier isoleres som beskrevet ovenfor og DNA underkastes følgende restriksjons-enzymanalyse: Porsjoner på 0,5 ug plasmid-DNA spaltes etter tur med Kpn) (Biolabs), Ncol (Biolabs) og EcoRI (Biolabs) etter forskriftene gitt av enzymfabrikanten. Spaltnings-produktene fraksjoneres på 1% agarose-geler i 40 mM tris«acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 ug/ml etidiumbromid. Hvert plasmid viser som ønsket en av disse enzymspaltnings-posisjonene. Et betegnes som HRil48.

Plasmidet HRil48 inneholder en tryptofan-promotor-operator og en ribosomal bindingsposisjon til og med ATG. Hirudin, på samme måte som andre heterologe gener, kan koples direkte til de EcoRI, Ncol, Kpnl-posisjonene som forekommer en gang i plasmidet. Dessuten muliggjør denne konstruksjonen direkte kopling og .uttrykking av heterologe gener, uten at ATG som er nødvendig for initieringen av translasjonen må være tilstede på det tilsvarende genet. Dette kan lett oppnås ved spaltning med Ncol og oppfylling av de overhengende endene med DNA-polymerase I, som beskrevet, eller ved spaltning med Kpnl og fjerning av de overhengende endene ved nuklease S^. Plasmidet HRil48 er følgelig et svært anvendelig ekspresjonsplasmid.

D. Fremstilling av den lineariserte vektoren pHRi! 48/ EcoRI/-

BamHI

5 ug plasmid-DNA av pHRil48 nedbrytes med restriksjonsendo-nukleasene EcoRI og BamHI. Den utsnittede vektoren pHRil48/EcoRI/BamHI isoleres ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering.

b) Fremstilling av F^- DNA/ RcoRI/ EcoRII og av F^- DNA/- BamHI/ EcoRII

I. Fremstilling av F-^- DNA/ EcoRI/ EcoRII

5 ug plasmid-DNA fra<->pML300 nedbrytes først med 10 enheter EcoRI-restriksjonsendonuklease i 50 ul av en oppløsning

av 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og 100 ug/ml gelatin i en time ved 37°C. En prøve (0,5 ug) av dette lineariserte plasmidet DNA/EcoRI isoleres ved geleluering fra en agarosegel (se eksempel 10a)) og merkes radioaktivt med [y- 3 2P]ATP

(se eksempel 12). Hovedmengden av plasmid DNA/EcoRI

blandes så med denne radioaktivt merkede DNA, nedbrytes med EcoRII-restriksjonsendonuklease og EcoRII-EcoRI<*> DNA-fragmentet (109 basepar) adskilles ved gelelektroforese på 8% polyakrylamid. 200 ug av F1-DNA/EcoRI<*>/EcoRII isoleres ved geleluering.

II) Fremstilling av F2- DNA/ BamHI/ EcoR11

5 ug plasmid DNA fra pML305 spaltes med 10 enheter BamHI-restriksjonsendonuklease. En prøve (0,5 ug) av dette lineariserte plasmid DNA/BamHI isoleres ved geleluering fra en agarosegel (se eksempel 10a)) og merkes radioaktivt med [y- 32P] (se eksempel 12)). Hovedmengden av plasmid DNA/BamHI blandes så med denne radioaktivt merkede DNA, nedbrytes med EcoRII-restriksjonsendonuklease og EcoRII-BamHI<*> DNA-fragmentet (122 basepar) adskilles ved gel-elektrof orese på 8% polyakrylamid. 250 ug av F2-DNA/BamHI<*>/- EcoRII isoleres.

c) Legering av F-^- DNA med F2~ DNA og konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pML310

10 ng (= 473 nMol ender) F^DNA/EcoRI/EcoRII og 9 ng (=

495 nMol ender) F2-DNA/BamHI/EcoRII behandles i et volum på 20 ul med T4~DNA-ligase som beskrevet under eksempel 10c). Deretter ekstraheres blandingen med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. DNA-bunnfallet oppløses deretter som beskrevet i eksempel 10c) og nedbrytes med EcoRI-og BamHI-restriksjonsendonuklease. Oppløsningen innstilles deretter på TNE og 30 ng (= 50 nMol ender) av vektor-DNA pHRl48/EcoRI/BamHI (se eksempel 13aD) tilsettes. Deretter ekstraheres oppløsningen igjen med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. Den utfelte DNA-blandingen behandles, som angitt i eksempel 10c), med T4~DNA-ligase (Biolabs). På denne måten oppstår i oppløsningen et rekombinert plasmid som inneholder F-^-F2-DNA (desulfatohirudin-genet) som innskudd.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML310 Transformasjonen av de med kalsium behandlede E. coli

HBlOl-cellene foregår som beskrevet i eksempel 10d).

Det anvendes 10 ul av den i eksempel 13c) fremstilte reaksjonsblandingen. Det oppnås 420 "Ampicillin"-resistente kolonier.

e) Undersøkelse av koloniene som inneholder F1- F2- DNA

18 transformerte kolonier (eksempel 13d) undersøkes ved-rørende F1-F2~DNA-innhold som beskrevet i eksempel 10e). Som radioaktiv probe anvendes en blanding av de i eksemplene 5 og 6 beskrevne oligodeoksynukleotidene. I autoradiogrammet oppnås 12 positive kolonier, fem av disse inneholder betegnelsene pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.

Eksempel 14: Karakterisering av klonet pML310 Karakteriseringen av F^-F2~DNA-sekvensen i det rekombinerte plasmidet pML310 foregår ved sekvensering av F^-F2~DNA ifølge Maxam og Gilbert (11) som beskrevet i eksempel 12. 10 ug plasmid-DNA undersøkes. Nukleotid-sekvensen av F^-F2~DNA er identisk med den som er beskrevet for det syntetiske desulfatohirudin-genet.

Eksempel 15: Fremstilling av ekspresjonsplasmidet pML315

a. Ligering av F-^- DNA med F2~ DNA og konstruksjon av

ekspresjonsplasmidet pML315

25 ug (= 1,3 pMol ender) henholdsvis 26 ug (= 1,3 pMol ender) av de kjemisk syntetiserte F^- henholdsvis F2~DNA (se eksempel 8 og skjema I) nedbrytes i et volum på 2 0 ul med 5 enheter EcoRII-restriksjonsendonuklease (Biolabs)

i 50 mM tris-HCl (pH 8), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 ug/ml gelatin i 30 minutter ved 37°C. Deretter ekstraheres blandingen med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. DNA-bunnfallet oppløses deretter som beskrevet i eksempel 10c) og behandles med T4~DNA-ligase i tre timer

ved 15°C. Deretter ekstraheres blandingen med fenol/kloroform og det utfelles som beskrevet i eksempel 10b). DNA-bunnfallet oppløses deretter (se eksempel 10c) og nedbrytes med EcoRI- og' BamHI-restriksjonsendonuklease i 30 minutter ved 37°C. Deretter tilsettes oppløsningen 70

ng (= 0,1 pMol ender) av den lineariserte vektoren pHRil4 8/EcoRI/BamHI (eksempel 13aD), hele oppløsningen innstilles på TNE og ekstraheres med fenol/kloroform og DNA utfelles med 2 volumdeler alkohol.

Det fremstilte DNA-bunnfallet som inneholder begge DNA-bruddstykkene (F1-F2-DNA/EcoRI/BamHI og pHRil48/EcoRI/BamHI), oppløses i 20 ul av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 ug/ml gelatin og behandles med 15 enheter/ul T4~DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. På denne måten oppstår i oppløsningen det rekombinerte plasmidet pML315, som inneholder F]_~F2~

DNA (= desulfatohirudin-genet).

b) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML315

10 ul av blandingen som inneholder plasmidet pML315 (eksempel 15a) anvendes for transformasjonen av de kalsium-behandlede E. coli HBlOl-cellene. Ca. 236 "Ampicillin"-resistente kolonier oppnås.

c) Undersøkelse av koloniene som inneholder F-^-F^-DNA Transformerte kolonier (eksempel 15b) undersøkes<->vedrørende

tilstedeværelsen av F^-F2~DNA som angitt i eksempel 13e).

Det oppnås fem positive kolonier som inneholder betegnelsen pML315 - pML319.

Eksempel 16: Fremstilling av ekspresjonsplasmidet pML320

a. Ligering av den syntetiske F^- F.,- DNA med vektor- DNA

pHRil48/ EcoRI/ BamHI

20 ug av det totale syntetisk fremstilte desulfatohirudin-genet (F^-F2~DNA, se eksempel 9) nedbrytes i 20 ul av en oppløsning av 50 ul 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og 100 ug/ml gelatin med restriksjonsenzymet EcoRI og deretter med BamHI. Oppløsningen innstilles på TNE, hvoretter 30 ug (= 50 nMol ender) av vektor-DNA pHRil48/EcoRI/- BamHI (se eksempel 13aD) tilsettes. Oppløsningen ekstraheres med fenol/kloroform og DNA utfelles med alkohol. DNA-bunnfallet behandles, som angitt i eksempel 10c), med T4~DNA-ligase (Biolabs). På denne måten oppstår i opp-løsningen et rekombinert plasmid (pML320) som inneholder F^-F2~DNA (hirudin-gen) som innskudd.

b. Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML320 Transformasjonen av de med kalsium behandlede E. coli HBlOl-cellene foregår som beskrevet i eksempel 10d). Det anvendes 10 ul av den i eksempel 16a) fremstilte reaksjonsblandingen. 172 "Ampicillin"-resistente kolonier oppnås.

c. Undersøkelse av koloniene som inneholder F-^- F^- DNA

11 transformerte kolonier (eksempel 16b) undersøkes, som beskrevet i eksempel 10e), vedrørende F^-F2-DNA-innhold. Som radioaktiv probe anvendes en blanding av de i eksemplene 5 og 6 beskrevne oligodesoksynukleotidene. I autoradiogrammet oppnås 14 positive kolonier. Fem av disse inneholder betegnelsene pML320, pML321, pML322, pML323 og pML324.

Eksempel 17: Karakterisering av klonene pML315 og pML320 Karakteriseringen av F^-F2~sekvensene i plasmidene pML315 og pML320 foregår ved sekvensering av F^-F2~DNA ifølge Maxam og Gilbert (11), som beskrevet i eksempel 12. Nukleotid-sekvensene i DNA-innskuddene for begge plasmidene er identisk med de i det syntetiske hirudin-genet.

Eksempel 18: Syntese av polypeptider med hirudin- aktivitet ved E. coli- celler som inneholder plasmider med rekombinerte hirudin- gener.

a. Syntese av polypeptider med hirudin- aktivitet Hver av de 15 klonene som inneholder det rekombinerte desulfatohirudin-genet, dvs.

E.coli HB101 pML310, E.coli HB101 pML314, E.coli HB101 pML312, E.coli HB101 pML313, E.coli HB101 pML314, E.coli HB101 pML315, E.coli HB101 pML316, E.coli HB101 pML317, E.coli HB101 pML318, E.coli HB101 pML319, E.coli HB101 pML320, E.coli HB101 pML321, E.coli HB101 pML322, E.coli HB101 pML323, E.coli HB101 pML324

undersøkes vedrørende dannelse av hirudin-aktivitet.

Por dette formålet dyrkes de ovenfor nevnte klonene i

5 ml L-medium over natten (16 timer) ved 37°C og 250 opm.

L-medium har følgende sammensetning:

1 ml av denne kulturen som har stått over natten overføres neste dag til 25 ml M9-medium. M9-medium har følgende sammensetning:

Det dyrkes ved 37°C og 250 opm inntil bakteriesuspensjonen har nådd en optisk tetthet { OD^ 2^ på 0,9-1,0. Deretter høster man cellene (5 ml av den voksende kulturen) og resuspenderer bakteriene i 0,5 ml av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 8) og 30 mM NaCl. Deretter innstilles suspensjonen på 1 mg/ml lysozym (Boehrihger) og stilles på is i 3 0 minutter. Ved avvekslende nedfrysning av suspensjonen i flytende nitrogen og opptining ved 37°C ødelegges bakteriene. Denne prosedyren gjentas fem ganger, deretter sentrifugeres blandingen i 30 minutter ved 16000 opm ved 4°C. Overvæskene undersøkes med hensyn på desulfatohirudin-innhold ved at man blander med antistoffér (se eksempel 18), undersøker overvæskene ved HPLC eller måler hemningen av trombin (15).

Følgende resultater oppnås:

Eksempel 19: Påvisning av hirudin- aktivitet Ca. 5-10 ul av en probe som inneholder polypeptid med hirudin-aktivitet (se eksempel 18) dryppes på 1 cm<2 >nitrocellulosepapir (NZ) (Biorad) og tørkes i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter inkuberes nitrocellulosepapiret i en time ved 37°C i en oppløsning av 3% serumalbumin i 0,01 M tris-HCl (pH 8) og 0,9% NaCl.

Deretter vaskes nitrocellulosepapiret i en oppløsning av 0,01 M tris-HCl (pH 8) og 0,9% NaCl i 30 minutter. Under dette skiftes oppløsningen 5 ganger. Deretter behandles det vaskede nitrocellulosepapiret i 2 timer ved 25°C i en oppløsning av 3% serumalbumin i 0,01 M tris-HCl (pH 8)

og 0,9% NaCl som inneholder 2 ug/ml antistoffer (fremstilt fra kaniner eller monoklonale antistoffer) mot hirudin. Deretter vaskes nitrocellulosepapiret som beskrevet ovenfor.

Deretter behandles nitrocellulosepapiret i 2-3 timer ved 25°C med en oppløsning av 3% serumalbumin i 0,01 M tris-HCl

125

(pH 8) og 0,9% NaCl som inneholder 0,2 uCi/ml I-protein A (sp. aktivitet 89,8 uCi/mg) (NEN). Deretter vaskes nitrocellulosepapiret igjen som beskrevet ovenfor, tørkes og den bundne radioaktiviteten bestemmes i en r-teller ("Multi gamma, 1260 gamma counter", LKB, Wallace), dette er et mål for det på nitrocellulosepapiret tilstedeværende polypeptidet med hirudin-aktivitet.

Ved en alternativ fremgangsmåte underkastes proben ovenfor en SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) [se (24)]. PAGE-elektroferogrammet overføres ved elektro-blotting på nitrocellulosepapiret. Deretter behandles nitrocellulosepapiret som beskrevet ovenfor og/eller autoradiogra-feres over natten sammen med en røntgenfilm (Fuji). Posisjoner på nitrocellulosepapiret som inneholder polypeptider med hirudin-aktivitet fremstår på filmen som svarte flek-ker.

Eksempel 20: Isolering og rensing av desulfatohirudin

ved hjelp av en trombin- søyle

a. Fremstilling av polypeptidoppløsning for trombin- søylen 150 ml kulturbuljong (fremstilt ifølge eksempel 18) avkjøles til 4°C og cellene fraskilles ved sentrifugering (5000 opm, 150 minutter, "Sorvall RC 3B"). Den klare overvæsken inneholder ingen hirudin-aktivitet.

Deretter suspenderes cellene i 12 mllyseringsbuffer (50 mM tris-HCl, pH 8, 30 mM NaCl). Denne blandingen tilsettes 15 mg lysozym (Boehringer) og oppbevares deretter 30 minutter ved 4°C. Deretter ødelegges cellene ved fire gangers nedfrysning i flytende nitrogen og deretter opptining ved 37°C. Deretter sentrifugeres de i 30 minutter ved 16.000 opm ved 4°C. Overvæsken inneholder hirudin-aktiviteten. I overvæsken (15 ml) oppløses deretter 7,7 g fast ammoniumsulfat. Den uklare blandingen får stå ved 4°C i 3 0 minutter og sentrifugeres deretter (se ovenfor). Det våte sedi-mentet oppløses i 1 ml 0,05 mM tris-HCl pH 8 buffer og man oppnår den ønskede polypeptidoppløsningen.

b. Rensing av hirudin på en trombin- søyle.

Trombin-søylen (sjiktvolum 4 ml) bringes til likevekt med 0,05 M tris-HCl pH 8. 5 ml porsjoner av den ovenfor fremstilte polypeptid-oppløsningen påføres søylen ved 4°C med en strømningshastighet på 7 ml/time. Det vaskes deretter med 25 ml 0,05 M tris-HCl (pH 8). De første fraksjonene inneholder de ikke-adsorberte polypeptidene, hvilke kastes. Deretter vaskes søylen med 10 ml 5 M benzamidin (Merck)

[se (25)] i 0,05 M tris-HCl (pH 8) og de oppnådde fraksjonene undersøkes vedrørende hirudin-aktivitet ved hjelp av trombin-testen (15). De fraksjonene som inneholder polypeptidene bestemmes ved måling av OD280nm* Fraksjonene 25 og 26 inneholder hirudin-aktiviteten; de oppbevares ved

-20°C, eller inntil viderebearbeidelse på isbad. Hirudin-aktiviteten utgjør i fraksjon 25 20 ug/ml og i fraksjon 26 52 ug/ml. Deretter dialyseres fraksjonene eller avsaltes over "Sephadex-G2 5" (Pharmacia).

SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (24) av produktet gir en molekylvekt på 7000-8000 dalton eller heltallige multiplum av dette (oligomerer).

c. Fremstilling av trombin- søylen

"Affi-gel 10" (Bio Rad) vaskes ifølge fabrikantens angivelser med kaldt destillert vann og koplingsbuffer pH 8,5 (0,1 M NaOCH-j/Na^O^-oppløsning) . En 50% suspensjon av gelen i koplingsbufferen (4 ml) overføres i et plastrør, blandes med samme mengde trombin-oppløsning (120 mg i 4 ml koplings-buf f er) (Calbiochem) og roteres ved 4°C over natten. Deretter vaskes gelen med koplingsbuffer. Til blokkering av de fremdeles frie aktive posisjonene behandles gelen med 0,1

ml IM etanolamin-HCl (pH 8,0) pr. gel i løpet av 3 timer ved 4°C, vaskes deretter med fosfatbufret saltoppløsning som inneholder 10 mM natriumazid pr. ml gel og holdes i denne ved 4°C. Koplingsgraden bestemmes ved måling av ekstinksjonen ved 280 nm og utgjør 15-30 mg hirudin pr.

ml gel.

4 ml av den fremstilte trombin-gelen anvendes til å fremstille affinitetssøylen.

Eksempel 21: Transformasjon av forskjellige E. coli- stammer med plasmidet pML310 og dyrking av de

transformerte vertscellene.

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 10d) transformeres stammene E. coli JA221, E. coli LM1035 og E. coli W3110A102 med plasmidet pML310. Transformerte kolonier undersøkes vedrørende tilstedeværelse av F^-F2~DNA, som beskrevet i eksempel 10e). Det oppnås 5, 3 henholdsvis 5 positive kolonier som inneholder følgende betegnelser:

E. coli JA221/pML310/l

E. coli JA221/pML310/2

E. coli JA221/pML310/3

E. coli JA221/pML310/4

E. coli JA221/pML310/5

E. coli LM 1035/pML310/l

E. coli LM 1035/pML310/2

E. coli LM 1035/pML310/3

E. coli W3110Al02/pML310/l

E. coli W3110Al02/pML310/2

E. coli W3110Al02/pML310/3

E. coli W3110Al02/pML310/4

E. coli W3110Al02/pML310/5

De nevnte klonene dyrkes i et modifisert M9-medium som har følgende sammensetning:

Det dyrkes ved 37°C og 180 opm inntil bakteriesuspensjonen har nådd en optisk tetthet (0Dg23^ pa ca* ^* Deretter høster man cellene (5 ml av den voksende kulturen) og resuspenderer bakteriene i 0,5 ml av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 8) og 30 mM NaCl. Deretter innstilles suspensjonen på 1 mg/ml lysozym (Boehringer) og stilles på is i 30 minutter. Ved vekselvis nedbrytning av suspensjonen i flytende nitrogen og opptining ved 37°C ødelegges bakteriene. Denne prosedyren gjentas fem ganger. Deretter sentrifugeres blandingen i 30 minutter ved 16000 opm ved 4°C.

Alle klonene undersøkes vedrørende dannelsen av polypeptider med hirudin-aktivitet ved at hemningen av trombin (15) måles. I alle bakterieekstraktene fastslås hirudin-aktivitet (300-600 ng/ml kulturoppløsning). Eksempelvis bestemmes følgende hirudin-aktiviteter:

Eksempel 22; Fermentering av den transformerte stammen

E. coli W3110Al02/ pML310/ l i en 5000 1 fermenteringsbeholder og opparbeiding av kulturbuljongen.

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 21 dyrkes i en 5000 1 fermenteringsbeholder E.coli W3110A102/pML310/l-celler i 3000 1 modifisert M9-medium, inntil suspensjonen har nådd en optisk tetthet (OD523) på 10-13.

Kulturbuljongen (pH 7,4) avkjøles til 10<*>C, og cellene behandles med en "Alfa-Laval BRPX-207w<->avslemmingsinnretning. Den klare overvæsken inneholder ingen hirudin-aktivitet og kastes. Under avslemmingen blir slamrommet stadig del av slammet med lyseringsbuffer A (50 mM tris*HCl, 30 mM NaCl, innstilt med HC1 på pH 8,0) og tilslutt blir innholdet av sentrifugeskålen (7 1) utstøtt under full avslemming med lyseringsbufferen A. Den oppnådde cellemassen innstilles ved hjelp av buffer A på et volum på 375 1 og har en pH-verdi på 7,6. Etter avkjøling til 5-10% føres suspensjonen gjennom en <n>Dyno-mølle<N> (Type KD5) som er utrustet med 4,2 1 glassperler med et tverrsnitt på 0,5-0,75 mm. Derved ødelegges cellene. Den slik oppnådde suspensjonen innstilles med eddiksyre på et eddiksyreinnhold på 2% (volum/volum) og omrøres over natten ved 10°C. Suspensjonen med en pH på 3,9 avslemmes ved den ovenfor omtalte teknikken. Den klare overvæsken på 300 1 71

oppkonsentreres på en innretning for fordampning i tynne sjikt (timesydelse 60 1 vann) til 35 1. Det lett uklare konsentratet sentrifugeres og den klare overvæsken som oppstår diafiltreres på et ultrafiltreringsanlegg "DDS = Lab 35" som er utstyrt med <M>GR 81 PP"-membraner (flate 2,5 m<2>) mot 2% eddiksyre eller 0,02 M tris-HCl pH 7,5 buffer. Sluttvolumet utgjør 31 1.

En del av 2 1 av denne klare proteinoppløsningen påføres på en "Sephadex G50F"-søyle (KS 370 Pharmacia) med et sjiktvolum på 96 1, hvor søylen er bragt i likevekt med 2% eddiksyre. Hovedfraksjonen som inneholdes i 15 1 eluat samles ved hjelp av ultrafiltrering og diafiltreres deretter mot vann. Den slik fremstilte klare vandige oppløsningen lyofiliseres. Opparbeidelsen kan gjennomføres som beskrevet i de følgende eksemplene.

Eksempel 23: Dyrking av «t-.a mmen E. coli W3110A102/ pML310/ l Stammen E.coli W3110A102/pML310/l inkuberes ved 37<*>C i 24 timer i en kolbe med risting på 200 opm. Mediet oppviser følgende sammensetning (g/l):

Mediet har en pH-verdi på 6,54. Under dyrkingen oppnås

en optisk tetthet (OD--.,. ) på 14,9.

oOonm

Cellene (50 ml av den voksende kulturen) festes og resuspenderes i 5 ml av en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 8,0)

og 30 mM NaCl. Deretter ristes suspensjonen med 5 g av-kjølte glassperler (diameter 0,5 mm), eller ved tilsats av lysozym (Boehringer), sluttkonsentrasjon 1 mg/ml, i 30-45 minutter i intervaller på en "Multi-Tube Vortexer"

ved høy intensitet. Til 0,5 ml av blandingen tilsettes 0,5 ml 2% eddiksyre og blandingen sentrifugeres i 20 minutter ved 4°C og 12000 opm. Den overstående oppløsningen under-søkes vedrørende hirudin-aktivitet (hemning av trombin). Testen for trombin-hemning utføres på følgende måte:

Testen bygger på bestemmelsen av den enzymatiske avspaltningen av p-nitroanilin fra substratet kromozym TH (tosyl-glysyl-prolyl-arginin-4-nitroanilid-acetat). Det dannede p-nitroanilinet måles kolorimetrisk ved 405 nm. Testen gjennomføres i mikrotiterplater med flat bunn (Costar, Serocluster). Reaksjonstiden utgjør 2 timer ved 37°C i dyrkningsskap. Til testen blandes 20 ul av oppløsningen som er fortynnet med 30 ul fyllbuffer (0,2 M tris-HCl pH 7,5, 1 M NaCl, 100 ug/ml okseserumalbumin) med 20 ul enzym-oppløsning-[10 mg lyofilisert trombin fra humanplasma (Boehringer) oppløst i 1 ml dobbeltdestillert vann og fortynnet i forhold ca. 1:400 med den ovenfor nevnte fyll-bufferen] og 150 ul substratoppløsning [20 ng kromozym TH (Boehringer) oppløst i 4 ml dobbeltdestillert vann og fortynnes i forholdet 1:15 med den ovenfor nevnte fyll-bufferen]. Alle oppløsningene måles mot en blind-oppløsning bestående av 70 ul fyllbuffer (se ovenfor) og 150 ul substrat-oppløsning og mot en enzym-kontrolloppløsning bestående av 50 ul fyllbuffer, 20 ul enzym-oppløsning og 150 ul substrat-oppløsning. OD405nm~verdien for enzym-kontrolloppløsningen etter 2 timer ved 37°C viser 100% aktivitet og skulle utgjøre ca. 0,8 ± 0,2. Trombin-hemningen (i %) for probene kan beregnes etter formelen

Oppløsningen ovenfor oppviser en trombin-hemning på 49,7%/ 20 ul.

Eksempel 24: Rensefremgangsmåte til anrikning av hirudin-forbindelser fra kulturbuljonger

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 22 dyrkes stammen E. coli W3110Al02/pML310/l i fermenteringsbeholderen. Deretter utelukkes cellene, frasentrifugeres og den opp-konsentrert overvæsken ultrafiltreres eller dialyseres etter eddiksyrebehandling. Oppløsninger som er utvunnet på denne måten kan f.eks. renses ved hjelp av ionebytterkromatografi. a) Anionbytterkromatografi over en " MONO Q"- søyle ( Pharmacia) til utvinning av fraksjoner som hemmer trombin.

8,5 ml proteinoppløsning (20 mM tris-HCl pH 7,5/150 mM

NaCl) tilføres på en "Mono Q"-søyle ved hjelp av et kroma-tograf isystem ("Fast protein liquid chromatography" FPLC)

og elueres ved følgende betingelser.

Eksperimentelle betingelser: Søyle: "Mono Q", 4,6 mm x

150 mm. Buffer A: 20 mM tris-HCl pH 7,5; Buffer B: 20 mM tris-HCl/1 mM NaCl. Lineær saltgradient: A: I løpet av 9 ml elueres med 15% buffer B, i løpet av 10,7 ml økes til 70% buffer B. AUFS 1,0 ved 280 nm, 1 ml fraksjoner.

I de utskilte volumene (fraksjonene 1-10) adskilles en

stor proteintopp fra de deretter eluerte hirudin-forbindelsene. Fraksjonene 17-23 viser i trombin-testen en trombin-hemning mellom 20 og 100%, hovedfraksjonen (fraksjonene 20 og 21) har 92% hemning, eluert ved en konsentrasjon på ca. 500 mM NaCl.

b) Anionbytterkromatografi på en " DEAE"- cellulose- søyle

til anrikning av hirudin- forbindelser.

10 ml av et dialysat underkastes anionbytterkromatografi på "DE 53" (Whatman) ved pH 7,5 (kromatografibetingelser: søyle 1 x 5 cm (10 ml). Elueringsbuffer A: 20 mM ammoniumacetat, 100 mM NaCl, pH 7,5. Elueringsbuffer B: 20 mM ammoniumacetat, 1 M NaCl, pH 4,0. Lineær saltgradient i hvert tilfelle 4 søylevolum buffer A, henholdsvis B). Hirudin-forbindelsene elueres fra 0,4 M NaCl. Påvisningen kan foretas ved trombin-hemningstesten.

c) Avsaltning på P- 6 DG " Desalting Gel" ( Bio- Rad)

110 ml dialysat (20 mM tris-HCl, pH 7,5, konsentrert protein-oppløsning fra 2,6 1 overvæske) ble adskilt på tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 24b) på "DE 53". Hirudin-forbindelsene elueres mellom fraksjonene 46 og 52 (150

ml), adskilles fra forskjellige, raskt eluerende ikke-aktive proteintopper, og konsentreres på en rotasjonsfordamper til ca. 12 ml. Den slik fremstilte, klare proteinoppløs-ningen tilføres på en "Biogel P-6 DG"-søyle og elueres vandig.

Eksperimentelle betingelser; Søyle 2,5 x 9 cm, stasjonær fase 45 ml "Biogel P-6 DG Desalting Gel", gjennomstrøm-ningshastighet 1,15 ml/min., 4,6 ml fraksjoner. Saltinn-holdet kan overvåkes ved ledningsevnemålinger eller ved testing med sølvnitrat (AgCl-utfelling). Hovedaktiviteten elueres mellom fraksjonene 7 til 10, påvisningen utføres ved hjelp av trombin-hemningstesten. Fraksjonene 8-10

(13,5 ml) samles, oppkonsentreres til 1 ml på en rotasjonsfordamper og den klare oppløsningen påføres på en "Sephadex G50 fine"-søyle (Pharmacia) med et sjiktvolum på 160

ml, søylen er bragt til likevekt med 1% eddiksyre.

d) Gelfiltrering på " Sephadex G50 fine"

Eksperimentelle betingelser: Søyle: "Sephadex G50 fine"

(31 g), 2,5 cm x 64 cm, volum: 310 ml; Oppløsningsmiddel:

1% eddiksyre; Gjennomstrømningshastighet 43 ml/time,

3,8 ml fraksjonsstørrelse. AUFS: 0,1 ved 282 nm. Papir-bevegelse 3,0 cm/time. Påvisningen av den eluerte aktiviteten foregår ved hjelp av trombin-hemningstesten. Hovedfraksjonen som inneholdes i 50 ml eluat (fraksjonene 39-52) elueres raskere enn ikke-aktive bikomponenter, (fraksjonene 53-80). Trombin-hemningen ved de aktive fraksjonene utgjør mellom 80 og 100% hemning.

e) Kationbytterkromatografi på en CM- cellulose til foran-rikning av aktive lysater 10 ml dialysat [20 mM tris-HCl, konsentrat (1:20) fra 200 ml overvæske, pH 2,0 innstilt med 3 ml 4N HC1] ble adskilt på en kationbytter (CM-cellulose). Hirudinforbindelsene elueres i de utskilte volumene mellom fraksjonene 4-8. Påvisningen foregår ved hjelp av trombin-hemningstesten. Fraksjonene 5 og 6 hemmer henholdsvis til 89% og 88% pr. 20ul eluat.

Eksperimentelle betingelser: Søyle: 1,5 x 8 cm, stasjonær fase: 19 ml CM-cellulose (kvalitet MZ-3146). Gjennom-strømningshastighet: 43 ml/time, 3,8 ml fraksjoner. Lineær saltgradient buffer A: 20 mM NH4OAc, pH 2 innstilt med 4N HC1, Buffer B: 200 mM NH4OAc, pH 6,5, hver gang fem søylevolum, AUFS 1,0 ved 282 nm.

Eksempel 25: Fermentering av den transformerte stammen

E. coli W3110Al02/ pML310/ l og opparbeiding

av kulturbuljongen

På tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 22 dyrkes

i en fermenteringsinnretning E. coli W3110Al02/pML310/l-celler i 8 1 medium L i 5 timer, da har suspensjonen nådd en optisk tetthet (0Dg23^ Pa <c>a* ^'

De cellene som sentrifugeres fra kulturbuljongen (pH 7,2) avkjølés til 10°C, og åpnes ved lysozymbehandling og ved gjentatt (4 ganger) vekslende nedfrysning i flytende nitrogen og opptining til 30°C. Den slik fremstilte suspensjonen (2,5 1) fortynnes med 1,5% eddiksyre (2,4 1) og omrøres i 30 minutter ved 4°C. De utfelte bakterielle proteinene og andre cellebestanddeler frasentrifugeres i 30 minutter ved 4°C ved 9000 opm. Den klare overvæsken på 3,2 1 oppkonsentreres i en rotasjonsfordamper til 320 ml. Konsentratet dialyseres over natten mot 20 mM tris-HCl pH 7,5 ved 4°C og det lett uklare' dialysatet sentrifugeres flere ganger. Sluttvolumet utgjør 300 ml. Den klare pro-teinoppløsningen (0,02 M tris-HCl, pH 7,0) tilføres til en dietylaminoetyl-cellulose-("DE53") (20 g)-søyle med et sjiktvolum på 20 ml, hvor søylen er bragt i likevekt med buffer A (buffer A: 20 mM ammoniumacetat/l00 mM NaCl, pH 7,5). Først vaskes de med et søylevolum (45 ml) ved konstant strømning (43 ml/time) og deretter elueres det med en lineær saltgradient med i hvert tilfelle fem søyle-volum av buffer A, henholdsvis buffer B (Buffer B: 20 mM ammoniumacetat/4 M NaCl, pH 5,0). Hovedfraksjonen som inneholdes i 100 ml eluat og som er aktiv ved trombin-hemningstesten (fraksjonene 24-26) dialyseres over natten ved 4°C mot 20 mM tris-HCl, pH 7,5 og oppkonsentreres deretter på rotasjonsfordamper ved 35°C til et sluttvolum på 5 ml.

Den slik fremstilte klare, vandige oppløsningen tilsettes på en "Sephadex G-50 fine"-søyle med et sjiktvolum på 160 ml, hvor søylen (2,5 x 64 cm, Biorad) er bragt i likevekt med 5% eddiksyre. Den i 50 ml eluat (fraksjonene 5-7, strøm 50 ml/time, 25 min./fraksjon) inneholdte hovedaktiviteten oppkonsentreres på rotasjonsfordamper og underkastes deretter en "Reverse Phase" HPLC-adskillelse. En porsjon (500 (il) av de enkelte fraksjonene oppkonsentreres i forholdet 1:10 på en "speed vac"-konsentrator og under-søkes ved hjelp av "Reversed Phase"-HPLC-analyse vedrørende innholdet av desulfatohirudin-forbindelser. Oppløsningene inneholder desulfatohirudin-forbindelser. Fraksjon 6

(18 ml) inneholder prosentuelt den minste andelen bikompo-

nenter og renses videre ved hjelp av semipreparativ "Reversed Phase"-HPLC.

Eksperimentelle betingelser: "Vydac 218 TP 510 RP"-HPLC-søyle, 10 x 250 mm, like store andeler av fraksjon 6

(200 ul 1:1 konsentrert) pr. adskillelse; AUFS 0,5 ved

220 nm; gjennomstrømningshastighet: 2 ml/min.; Elueringsmiddel: A: 0,1% trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann 8:2 + 0,07% trifluoreddiksyre, 1 min. 16% B, deretter økes i løpet av 40 minutter til 64% B. Fraksjonene fremstilt på denne måten fortynnes i forholdet 1:1 med vann og lyofiliseres. Residuet består av rene sulfatohirudin-forbindelser .

Eksempel 26: Analyse av produktblandingen fra fermenteringen

av E. coli W3111QÅ102/ pML310/ l

De fraksjonene, fremstilt ifølge eksempel 25, som er aktive ved trombin-hemningstesten underkastes en HPLC-analyse under to forskjellige betingelser.

a) Eksperimentelle betingelser nr. 1: Nukleosil (MN) C18,

5 (im RP-HPLC-søyle, 4,6 x 120 mm; 50 ul hirudin-f orbindelser

pr. adskillelse, Att. 6 ved 214 nm; gjennomstrømningshastig-het 1,2 ml/min.; elueringsmiddel: A: 0,1% trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann 8:2 med 0,07% trifluoreddiksyre, 2 min.

16% B, deretter økes i løpet av 30 min. til 64% B. Mottrykk: 107 bar.

Med intervallet på 1 minutt tas det ut fraksjoner (totalt 30), disse underkastes trombin-hemningstesten og antistoff-testen (se eksempel 19). Fraksjonene 12-15 viser seg å være aktive. Videre bestemmes aminosyresammensetningen, N-terminalen og C-terminalen for den aktive hirudin-forbindelsen fra fraksjon 14. Denne fraksjonen (nr. 14) sammenlignes videre med desulfatohirudin som er fremstilt analogt eksempel 28 ved omsetning av naturlig hirudin fra blodigle med enzymet arylsulfatase. Resultatene er sammen-fattet i den følgende tabell 1:

Fraksjonen av kontrollstammen E. coli W3110A102 ("kontroll") er hverken aktiv i trombin-hemningstesten eller i antistoff-testen. Slike fraksjoner fremstilles ved kultivering av den ikke-transformerte stammen E. coli W3110A102 under de betingelsene som er beskrevet i. eksempel 22, og ved opparbeiding av kulturbuljongen ifølge eksempel 25.

b) Eksperimentelle betingelser nr. 2; RP-HPLC-søyle,

"Vydac 218 TP 5415" 4,6 x 150 mm; 100 ul (1:10 konsentrert)

fraksjon 6 (se eksempel 25) pr. adskillelse; AUFS 0,1 ved 214 nm; gjennomstrømningshastighet 1,2 ml/min.; elueringsmiddel: A: 0,1% trifluoreddiksyre, B: acetonitril/vann 8:2 + 0,07% trifluoreddiksyre. Gradient: 2 min. 16% B, deretter økes i løpet av 3 min. til 20% B, deretter økes i løpet av 15 min. til 25% B, deretter økes i løpet av 27 min. til 64% B. Mottrykk 160 bar.

I den følgende tabell 2 er de ved trombin-hemningstesten

og ved antistoff-testen aktive fraksjonene oppført.

Tabellen inneholder videre konsentrasjonene av NaCl i mM

som er påkrevet for eluering av fraksjonene fra en "Mono Q"-søyle (anionbytterkromatografi) (se eksempel 24a), samt de mest langbølgede UV-absorpsjonsbåndene for enkelte fraksjoner. Alle fraksjonene viser videre en positiv reaksjon

med anti-hirudin-antistoffer (se eksempel 30).

Eksempel 27: Karakterisering av desulfatohirudin- forbindelsene fra fermenteringen av stammen E. coli

W311QAlQ2/ pML310/ l

I. Hirudin-forbindelsen fra fraksjon 14 (se eksempel 2 6

under eksperimentelle betingelser nr, 1, tabell 1) eller fraksjon 1 (se eksempel 25, eksperimentelle betingelser nr. 2, tabell 2) karakteriseres på følgende måte:

a) Bestemmelse av aminosyresammensetningen

Ca. 2,5 ug hirudin-forbindelse hydrolyseres med 6N HC1

ved 110°c i 24 timer og analyseres deretter etter Chang et al. (DABS-Cl-metoden) (31). Hydrolysatet oppviser følgende sammensetning.

b) Partiell sekvensanalyse

5 ug (750 pMol) av hirudin-forbindelsen underkastes en

klassisk sekvensanalyse ifølge Edman og de N-terminale fenyltiohydantoin (PTH)-aminosyrene bestemmes ved hjelp av RP-HPLC.

Resultat;

Aminosyre Val Val Tyr Thr Asp i.b. Thr Glu Ser Gly

Aminosyre Gin Asn Leu i.b. Leu i.b. Glu

(i.b. ikke bestemt)

Den N-terminale sekvensen av den undersøkte biosyntetiske hirudin-forbindelsen er følgelig identisk med den for naturlig hirudin (1).

c) Bestemmelse av de C- terminale aminosyrene ved hjelp karboksypeptidase Y- nedbrytning

Den tidsavhengige nedbrytningen av de C-terminale aminosyrene med karboksypeptidase Y gir som C-terminal

60 65

- Ile - Pro - Glu - Glu- Tyr- Leu- Gin

Bestemmelsen av aminosyrene er utført med aminosyre-analysatoren. Det viser seg at Tyr^"<3> ikke er sulfatert (desulfato-hirudin!).

Ved hovedproduktet for fermenteringen av den transformerte stammen E. coli W3110Al02/pML310/l dreier det seg, som strukturdata og sammenligning med den fra naturlig hirudin fremstilte desulfatohirudin viser, om desulfatohirudin.

II. Strukturen for de øvrige fermenteringsproduktene er

ennå ikke fullstendig klarlagt. Ved fraksjonene 2-6 (se tabell 2) dreier det seg om definerte forbindelser som ved hjelp av HPLC- og FPLC-data, samt ved UV-absorpsjons-maksimumet er tilstrekkelig definert. Med sikkerhet dreier det ved disse forbindelsene om desulfatohirudin-lignende forbindelser, som skiller seg fra desulfatohirudin ved en strukturell mikroheterogenitet (f.eks. forskjellige sammenknyttede S-S-broer) eller ved modifikasjon ved N-henholdsvis C-terminalen (f.eks. N-terminal metionylrest eller N-terminal acylert, som formylert eller actylert).

Også ved fermenteringen av stammene E. coli LMl035/pML310/l, E. coli JA221/pML3 01/l og E. coli HB101/pML310 kan desulfato-hirudin identifiseres som hovedprodukt.

Eksempel 28: Fremstilling av desulfatohirudin fra naturlig

hirudin til sammenligningsformål

Naturlig hirudin oppløses i konsentrasjon 2 mg/ml buffer (0,1 M ammoniumacetat, pH 5,5). Til 20 ug hirudin (10 (il oppløsning) tilsettes 100 ul av en avsaltet arylsulfatase (Boehringer)-oppløsning som inneholder 16 ug arylsulfatase. Det inkuberes ved 25°C og omsetningen følges ved hjelp

av HPLC-analyse. Etter 6 timers inkubering er mer enn 90% av hirudinet desulfatert. Retensjonstiden for det dannede desulfatohirudinet utgjør ved de betingelsene som er beskrevet i eksempel 2 6 (eksperimentelle betingelser

a) 12,8 minutter og under de betingelsene som er beskrevet i eksempel 26 (eksperimentelle betingelser b) 15,45 minutter.

Aminosyresammensetningen, sekvensanalysen ifølge Edman-nedbrytning og bestemmelsen av de C-terminale aminosyrene ved karboksypeptidase Y-nedbrytning gir de for desulfato-hirudin ventede resultatene.

Eksempel 29; Ekspresjon av desulfatohirudin- forbindelsene

i gjær ( S. cerevisiae)

Ekspresjonen av fremmedproteiner i gjær krever et definert ekspresjonssystem. En sterk gjærpromotor, fortrinnsvis en induserbar gjærpromotor, og egnede transkripsjons-stoppsignaler må inneholdes på en plasmidvektor hvorved gjærcellene kan transformeres. Vektoren inneholder også DNA-sekvenser, fortrinnsvis gjær 2u sekvenser, som sikrer ekstrakromosomal replikasjon med høyt kopiantall. Den må også inneholde en seleksjonsmerkeforbindelse for gjær, fortrinnsvis gjær LEU2-genet, og pBR322-DNA-sekvensen med replikasjonsutgangspunkt og seleksjonsmerke, fortrinnsvis for "Ampicillin"-resistensgenet for anvendelse i E. coli. Slike vektorer er egnet som såkalte "Shuttle"-vektorer

for formering i E. coli og gjær.

Et ekspresjonssystem som oppfyller disse kravene er det som er beskrevet i europeisk patentpubl. nr. 100.561 og som er belagt med eksempler på effektiv ekspresjon i gjær. Fremmedgener uttrykkes under kontrollen av den indu-serbare PH05-promotoren for den sure fosfatasen fra gjær. PH05-promotoren, fremmedgen og PH05-transkripsjons-stoppsignalet er integrert i serie i gjærvektoren pJDB207 som også inneholder DNA-sekvensen for gjær 2u-plasmidet, gjær-LEU2-genet, "Ampicillin"-resistensgenet og E. coli replika-sj onsutgangspunktet.

Ekspresjonsplasmidet pJDB207R/PHO5-HIR fremstilles på følgende måte:

a) Isolering av pJDB207- vektorfragmentet:

6 ug av plasmidet pJDB207R/IF(a-3) (EP 100.561) nedbrytes

fullstendig med restriksjonsendonukleasen BamHI. DNA-fragmentene som oppstår (6,85 kb og 1,15 kb) utfelles med etanol og opptas i 400 ul 50 mM tris-HCl pH 8,0.

4,5 enheter kalvetarm-fosfatase (Boehringer) tilsettes. Blandingen inkuberes en time ved 37°C, deretter inaktiveres fosfatasen ved 65°C i 1,5 timer. Oppløsningen bringes til 150 mM NaCl og tilføres deretter på en "DE52" (Whatman) anionbyttersøyle (volum 100 ul), som på forhånd er bragt til likevekt med 10 mM tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, og 1 mM EDTA. Etter vasking med den samme bufferen elueres DNA med 400 ul 1,5 M NaCl, 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM

EDTA og utfelles med etanol. Det store 6,85 kb BamHI-fragmentet adskilles fra det mindre fragmentet på en 1,2% agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. b) Isolering av 534 bp PH05- protomorfragmentet 6 ug av plasmidet p31/R (EP 100.561) nedbrytes med restrik-sjonsendonukleasene EcoRI og BamHI. De tre DNA-fragmentene som oppstår adskilles på en 1,2% agarosegel i tris-borat-EDTA-buf f er, pH 8,3. 534 bp BamHI-EcoRI-fragmentet isoleres. Det inneholder PH05-promotoren innbefattet transkripsjons-startposisjonene. c) Isolering av et 206 bp DNA- fragment med den for hirudin kodende sekvensen. 9 ug av plasmidet pML310 (se eksempel 13c) nedbrytes fullstendig med restriksjonsenzymene BamHI og EcoRI. De to DNA-fragmentene som oppstår adskilles på en 1,2% agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres.

d) Ligering av DNA- fragmentene

De tre i punkt a-c (se ovenfor) nevnte DNA-fragmentene

utvinnes fra agarosegelstykkene ved elektroeluering, renses over "DE52" anionbytter, utfelles med etanol og resuspen-

deres i H20.

0,1 pMol (0,45 ug) av 6,85 kb BamHI-vektorfragmentet, 0,3

pMol (0,1 ug) av 534 bp BamHI-EcoRI PH05-promotorfrag-

mentet og 0,25 pMol (34 ng) av 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentet av pML310 ligeres i 15 ul 60 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM

MgCl2/ 10 mM DTT, 1 mM ATP med 600 enheter T4-DNA-ligase

ved 15°C i 16 timer.

24 transformerte, amp -kolonier adskilles i LB-medium kul-

tivert med 100 ug/ml "Ampicillin". Plasmid-DNA isoleres ved fremgangsmåten ifølge Holmes et al. (32) og analyseres ved en Hindlll/EcoRI dobbeltnedbrytning. Opptredenen av et ca. 600 bp stort EcoRI-HindIII-fragment viser at ved det aktuelle klonet foreligger PH05-promotor-hirudin-DNA-fargmentet i den riktige orienteringen til transkripsjons-stoppsignalene på vektoren. Som ventet har ca. 50% av klonene den riktige orienteringen av innskuddet. En av disse klonene betegnes som pJDB207R/PHO5-HIR.

e) Transformering av Saccharomyces cerevisiae GRF18: Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) transformeres med plasmidet pJDB2 07R/PHO5-HIR ved fremgangsmåten angitt av Hinnen et al. (12). For transformerte gjærceller seleksjoneres på agarplater med gjær-minimalmedium uten leucin. En transformert gjærkoloni isoleres og betegnes som Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJD207R/PHO5-HIR. f) Dyrking av S. cerevisiae GRFl8/ pJDB207R/ PHO5- HIR;

Celler av S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR ristes

i 20 ml gjær-minimalmedium ("Difco Yeast Nitrogen Base"

uten aminosyrer med tilsats av 2% glukose og 2 0 mg/l L-histidin) ved 30°C og dyrket til en celletetthet på 3.10^ celler/ml. Cellene vaskes i 0,9% NaCl og benyttes så til okulering av 50 ml kulturer i lav P^-minimalmedium. Lav P^-minimalmedium er sammensatt tilsvarende "Difco Yeast

Nitrogen Base"-mediet (uten aminosyrer), den inneholder likevel 0,03 g/l KH2P04, 1 g/l KC1, 10 g/l L-asparagin istedenfor (NH4)2S04, 2% glukose og 1 g/l L-histidin. Kulturen okuleres til en celletetthet på 4-10^ celler/ml

og ristes ved 30°C i 24 timer ved 200 opm.

g) Analyse av produktblandingen fra fermenteringen av

S. cerevisiae GRF18/ pJDB207R/ PHO5- HIR

Cellene (se eksempel 29f) oppsluttes på vanlig måte (se f.eks. europeisk patentpubl. nr. 100.561). Overvæsken som er behandlet med 1,5% eddiksyre sentrifugeres og porsjoner på 2 ml av den klare oppløsningen konsentreres på "Speed Vac"-konsentratoren og tørkes i høyvakuum. Prøvene oppløses enkeltvis i 100 ul vann og underkastes en HPLC-analyse (betingelser som i eksempel 26a). Trombin-hemningen for de enkelte fraksjonene undersøkes. Fraksjonen med en retensjonstid på 12,8 minutter oppviser en trombin-hemning på 89,6%. Ifølge aminosyresammensetningen dreier det seg om desulfatohirudin.

Eksempel 30: Forsøksanordning med monoklonale anti- hirudin-antistoffer til bestemmelse av hirudin, kompetitiv radio- immunoanalyse.

a. Fremstilling av de monoklonale anti- hirudin- antistoffene A) Immunisering av mus

Rent hirudin (3 mg) i lyofilisert form oppløses i litt

0,1% eddiksyre og tilsettes deretter fosfatbufret koksalt-oppløsning til et volum på 3 ml. pH reguleres til 7,2. Porsjoner av denne antigen-oppløsningen blandes med like store mengder komplett Freunds adjuvans eller fosfatbufret saltoppløsning.

Hunnmus Balb/c (8 uker gamle, fra dyrefarmen Sisseln, Sveits) injiseres intravenøst med 100 ug hirudin-oppløsning i bufret saltoppløsning. Fire dager senere fjernes milten for å benyttes ved sammensmeltningen.

B) Fremstillin<g> av hvbridom oa antistoff-test

Fremstillingen av hybridomcellene foregår ved sammen-smeltning av de oppnådde miltcellene med myelom-cellelinjen X63-Ag8.6.5.3 (26). Det anvendes IO<8> miltceller og IO<7 >myelomceller. Sammensmeltningen gjennomføres som beskrevet i (27).

Bestemmelse av anti-hirudin-aktiviteten i hybridom-overvæskene foregår ved hjelp av en radioimmunoanalyse [RIA, (28)].

C) Isolering oa rensing av anti-hirudin-antistoffene fra

bukvæskene

Balb/c-mus forbehandles intraperitonealt med 0,4 ml "Pristan"

(Carl Roth). Etter en uke injiseres 2 til 5xl0<6> klonede hybridomceller intraperitonealt. Bukvæske tas flere ganger fra hver mus og nedfryses til -80°C. Den samlede væsken opptines og sentrifugeres i 30 minutter ved 4<*>C med 16.000 opm. Fettet suges av og den gjenværende overvæsken som er fri for nedbrutt materiale, blir under omrøring ved 0<*>C langsomt og dråpevis tilsatt 0,9 volumekvivalenter av en mettet ammoniumsulfatoppløsning. De oppnådde rå immunoglobulin-fraksjonene blir under anvendelse av 0,1 mM tris*HCl (pH 8,2) ført gjennom "Sephacryl G 2000" (Pharmacia) ifølge fabrikantens anvisninger. Aktive fraksjoner samles og konsentreres med et "Amicon XM50<n->filter (Amicon).

b. Forsøksanordnina for kompetitiv radio- immunoanalyse En oppløsning av anti-hirudin-antistoffer fremstilt ifølge eksempel 30aC) fortynnes med fosfatbufret saltoppløsning (PBS-oppløsning) til en konsentrasjon på 1 ug pr. 100 ul. 100 ul av denne oppløsningen inkuberes 2 timer ved 37'C

i plastrør eller på plast-mikrotiterplater, hvorved antistoffer adsorberes uspesifikt på plastoverflaten. Til metning av de fremdeles frie aktive posisjonene på plastoverflaten etterbehandles det med en bovinserum-albumin-

oppløsning (BSA-oppløsning).

Fortynningsrekker av en prøveoppløsning eller standard-oppløsningen i BSA-oppløsning blandes enkeltvis med 50 ul av en oppløsning av hirudin som på kjent måte (29) er

125

radioaktivt merket med jod av aktivitet 10.000 cpm pr.

50 ul, og inkuberes deretter på plastoverflaten i 2 timer ved 37°C og deretter i 12 timer ved 4°C. Rørene eller mikrotiterplatene vaskes med fosfatbufret saltoppløsning og radioaktiviteten måles. Konsentrasjonen av hirudin i prøveoppløsningen bestemmes ved hjelp av en kalibrerings-kurve som er konstruert ved hjelp av standardoppløsninger.

En forsøksanordning for den omtalte radio-immunoanalysen inneholder: 2 ml oppløsning av anti-hirudin-antistoffer fra eksempel 30aC) med en konsentrasjon på 1-10 mg pr. mol,

100 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS-oppløsning),

100 ml 0,3% bovinserum-albumin og 0,1% natriumazid i PBS-oppløsning (BSA-oppløsning), 2 ml oppløsning av radioaktivt hirudin med aktivitet 200.000 cpm/ml,

2 ml standardoppløsning som inneholder 100 ng/ml hirudin,

1 ml rør eller mikrotiterplater av plast.

Eksempel 31: Farmasøytisk preparat som inneholder en desulfato-hirudin- forbindelse for parenteral anvendelse

En oppløsning som inneholder en desulfatohirudin-forbindelse ifølge eksempel 27, dialyseres mot en 0,9% NaCl-oppløsning. Konsentrasjonen av oppløsningen innstilles deretter ved fortynning med den samme NaCl-oppløsningen til 0,2 mg/ml eller 2 mg/ml. Disse oppløsningene steriliseres ved ultrafiltrering (membraner med 0,22 um porer).

De steriliserte oppløsningene kan anvendes direkte, f.eks.

for intravenøs administrering. På tilsvarende måte fremstilles oppløsninger for parenteral anvendelse som innehol-

der blandinger av desulfatohirudin-forbindelser ifølge eksempel 27.

Litteraturreferanser

1. J. Dodt et al., FEBS Letters 16_5, 180 (1984)

2. P. Walsmann et al., Pharmazie 3_6, 653 (1981)

3. S.A. Narang, Tetrahedron 3_9, 3 (1983)

4. K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 84_, 489 (1972)

5. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972)

6. R.L. Letsinger og W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)

7. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)

8. H.G. Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)

9. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)

10. K. Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982)

11. A.M. Maxam og W. Gilbert, Proe. Nati. Acad. Sei. USA

74, 560 (1977); se også Meth. Enzym. 65, 499 (1980)

12. A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_5, 1929

(1978)

13. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)

14. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)

15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. II, 3. opplag, s. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim 1983. 16. F. Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 4_7, 226 (1982)

17. Kohler og Milstein, Nature 256, 495 (1975).

18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (utg. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 125

19. W. Muller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978)

20. M. Grunstein og D.S. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei.

USA 72, 3961 (1979)

21. Ish-Horowitz, in loe. eit. 18), s. 368

22. DE-OS 3.111.405 (Genentech)

23. A.C. Peacock et al., Biochemistry 6, 1818 (1967)

24. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970)

25. P. Walsmann, Pharmazie 3_6, 860 (1981)

26. J.F. Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548 (1979)

27. S. Alkan et al., Mol. Immunol. 20, 203 (1983)

28. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam 1978 29. A.E. Bolton og W.M. Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973) 30. J. Clarke og J. Carbon, J. Mol. Biol. 120, 517 (1978) 31. J.Y. Chang et al., Methods in Enzymology, 91, 41 (1983)

32. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981)

Claims (4)

1. DNA-vektor for ekspresjon av desulfatohirudin i gjær eller E.coli, karakterisert ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for desulfatohirudin med formelen som kontrolleres av en gjær— hhv. E.coli-ekspresjonskontrollsekvens, slik at desulfatohirudin uttrykkes i en med denne ekspresjonsvektoren transformert gjær— hhv. E.coli-stamme.

2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen er den for E.coli-tryptofanoperonet.

3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen er den for gjær—PH05-genet.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av desulfatohirudin og salter derav, karakterisert ved at man transformerer gjær- eller E.coli-celler med en vektor ifølge krav 1 for ekspresjon av desulfatohirudin, de resulterende transformerte gjær- eller E.coli-cellene dyrkes i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbare karbon— og nitrogenkilder og desulfatohirudin isoleres og, om ønsket, overføres et oppnådd salt til fritt desulfatohirudin eller