HU202288B - Process for producing trombine inhibitors - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a hirudin-trombin-inhibitor aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák, az ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó hibrid-vektorok, az ilyen hibridvektorokkal transzformált gazdasejtek, az ilyen transzformált gazdasejtekkel termelt trombin-inhibitor aktivitással rendelkező új polipeptidek, ezeknek a DNS-szekvenciáknak, hibridvektoroknak és transzformált gazdasejteknek az előállítására és a trombin-inhibitorok transzformált mikroorganizmusok segitségével történő előállítására.

Az egészséges emlős szervezet plazmájában a fibrinolitikus rendszer és az alvadási rendszer között dinamikus egyensúly áll fenn, amely a működő érhálózatot fenntartja. Érsérülések esetében az alvadási rendszer fibrinmátrixot képez, amit a hemosztatikus állapot elérése után a fibrinolitikus rendszer ismét leépít. Azokban az esetekben, amikor a szervezet fibrinolitikus potenciálja nem elegendő a képződött intravascularis vérrögök lebontásához, például tromboemboliában vagy műtét utáni komplikációkban szenvedő betegeknél, elkerülhetetlen a szervezet trombolitikus vagy véralvadás elleni szerek adagolásával való segítése.

A hagyományos véralvadás elleni terápiában eddig elsősorban heparint, továbbá 4-hidroxi-kumarin- és 1,3-indandion-származékokat alkalmaztak. Bár ezekkel a szerekkel figyelemre méltó sikereket értek el, mégis van néhány hátrányuk, igy a heparin nem közvetlenül a véralvadási folyamatra hat, hanem alvadásgátló hatását közvetve fejti ki az antitrombin ΙΠ-on keresztül a trombin és az X faktor gátlásának gyorsítása révén. A szervezetben a heparin továbbá számos nem specifikus reakcióban vesz részt és a vérlemezke-faktor 4 semlegesíti, ami a diffúz intravascularis koagulopatiaban, illetve a diszszeminált intravasalis alvadásban (DIC) való alkalmazhatóságát csökkenti. Az alvadás elleni terápiában ezért szükség van alternatív és specifikusabb szerekre.

Régóta ismert az orvosi piócában (Hirudo medicinalis) előforduló természetes alvadásgátló, a hirudin. A hirudin 65 aminosavból álló, teljesen tisztázott szerkezetű (1) polipeptid, amelynek szerkezeti jellegzetessége az N-terminálison a hidrofób-aminosavak, a C-terminálison a poláros aminosavak felhalmozódása, szulfát-monoészter formájában előforduló tirozincsoport (Tyr®³) és három diszulfidhid, amelyek pontos elrendeződése azonban még nem ismeretes.

A hirudin Kj-értéke (komplex disszociációs állandó) 640¹¹ M, amivel a legerősebb ismert trombin-inhibitor, és specifikus trombinaffinitás jellemzi; a véralvadási rendszer többi enzimét nem gátolja. A heparinnal ellentétben a hirudin közvetlenül fejti ki gátló hatását a trombinra és nem antitrombin III-on keresztül, mint a heparin. A tisztított hirudin egyetlen farmakológiailag kimutatható hatása a véralvadás gátlása, illetve a trombózis profilaxisa. Intravénás adagolásban kutyákon még nagy dózisok alkalmazása mellett sem figyelhető meg a szívverés frekvenciájára, légzésre, vérnyomásra, trombocitaszómra, fibrinogénra és hemoglobinra kifejtett hatás. Patkányon, disznón és kutyán végzett kísérletekben a hirudin hatásosnak bizonyult kísérletes trombózisban (amit statis-szal vagy trombin injekcióval idéztek elő), endotoxin sokkban és DIC-ben (disszeminált intravasalis alvadás). Közvetlen összehasonlító kísérletekben, bárhol végezték is azokat, a hirudin erősebb hatást fejtett ki, mint a heparin.

Bér a hirudin már régóta ismert, eddig még nem nyert olyan széleskörű alkalmazást, amit kiváló biológ'iai tulajdonságai alapján várnánk. A gyógyászatban való általános alkalmazásának ugyanis útjában áll rendkívül korlátozott hozzáférhetősége. Mostanáig a hirudin készítményeket kizárólag drága és nehezen hozzáférhető természetes anyagból, orvosi pióca kivonatokból kiindulva időigényes és költséges izolálási és tisztítási eljárásokkal kapták (v.ö. 2. hivatkozás). A 65 aminosavat tartalmazó viszonylag hosszú szekvencia miatt gazdaságossági szempontból a klasszikus peptidszintézis sem kecsegtetett sikerrel. Elegendő mennyiségű hirudin előállításához, amely a terápiás potenciáljának megállapításához szükséges részletes klinikai vizsgálatokat és a véralvadás elleni terápiában való széleskörű alkalmazást lehetővé teszi, új utakat kell keresni. Erre különösen alkalmas a rekombináns DNS-technológia. Segitségével előállíthatók a legkülönbözőbb fiziológiai aktivitású polipeptidek, megfelelő genetikailag módosított mikroorganizmusok tenyésztésével vagy emlőssejt-kultúrákkal.

A találmány célja az, hogy géntechnológiai eszközök segitségével olyan expressziós rendszert bocsásson rendelkezésünkre, ami a hirudin aktivitású polipeptidek mikrobiológiai előállítását ipari méretben lehetővé teszi. Ezt a feladatot a találmány a hirudin-gént tartalmazó hibridvektorok elkészítésével oldja meg, amiket azután egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy a hibridvektorokkal transzformált gazdasejtben a hirudin aktivitású polipeptid kifejeződik.

Várható, hogy a transzformált gazdasejtekben (transzformált piócasejtek kivételével) az ilyen DNS-szekvenciák expressziója kiegészitőleg beépített .szulfátátvivő enzimrendszer hiányában olyan terméket eredményez, amelyet a természetes hirudintól lényegében csak a tirozin-63-ról hiányzó szulfátcsoport különböztet meg. A szulfátcsoport biológiai szerepe a fehérjékben általában és különösen a hirudinban még részletesen nem tisztázott, mindenesetre a jelenlegi ismeretek szerint a szulfátcsoport nem kis mértékben befolyásolja a fehérjék filológiai tulajdonságait. A szulfátcBoport a következő hatásokat fejtheti ki:

HU 202288 Β (1) pozitívan befolyásolja a fehérjék biológiai aktivitását (2) szabályozós alatt álló sejtfolyamatokban vesz részt (amint az a reverzibilis foszforilálás esetében ismert).

(3) stimulálja a szekréciót, azaz a szulfatálás a szekréciós fehérje felismerési jeleként szolgál; minden ismert szulfátéit fehérje elválasztást fokozó vagy transzmembrán fehérje.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az elméleti feltevéssel ellentétben a hirudin értékes biológiai tulajdonságai akkor is megmaradnak, ha a Tyr^-csoport fenolos hidroxiljáról eltávolitjuk a jellemző szulfát-monoészter csoportot. A találmány szerinti transzformáit mikroorganizmusok segítségével előállított szulfátcsoportot nem tartalmazó (.deszulfatohirudin ') hirudinszármazékok biológiai hatása, különösen alvadásgátló hatása, minőségileg és mennyiségileg legalább egyenértékű a természetes hirudinéval.

A következőkben a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák és gének alatt olyan DNS-szekvenciák és gének értendők, amelyek az expresszióban olyan hirudinhoz hasonló polipeptideket eredményeznek, amelyek a természetes hirudintól különösen a tirozin-63-ról hiányzó szulfátcsoportban különböznek (.deszulfatohirudin).

A hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNSszekvenciák előállítása

A találmány a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciákra és ezek fragmenseire vonatkozik.

A találmány továbbá eljárás a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák és azok fragmenseinek előállítására úgy, hogy a piócagenomból izoláljuk a hirudin strukturgént, vagy a hirudin-m-RNS-ről komplementer kettóe szálú DNS-t (hirudin ds cDNS) készítünk, vagy a hirudin-gént vagy annak fragmenseit kémiai és enzimatikus eljárásokkal állítjuk eló.

A genomböl származó hirudin-DNS-t és a hirudin-ds-cDNS-t önmagában ismert módszerekkel kapjuk, igy a hirudingént pióca génbankból származó piócagenomból kapjuk oly módon, hogy a pióca DNS-fragmenseket mikroorganizmusban klónozzuk és a hirudin-DNS-t tartalmazó kiónokat például kolónia-hibridizálással azonosítjuk, amihez olyan radioaktív jelzett hirudin-DNS specifikus oligodezoxinukleotidot alkalmazunk, amely legalább 15, előnyösen 15-30 dezoxinukleotidot tartalmaz. Az igy kapott DNS-fragmensek a hirudin-gén mellett rendszerint még további nem kívánt DNS-szakaszokat tartalmaznak, amiket megfelelő exo- vagy endonukleázos kezeléssel hasíthatunk le.

A kettős szálú hirudin-cDNS-t például oly módon állíthatjuk eló, hogy alkalmas, előnyösen hidrudinképzés céljából indukált piócasejtekböl mRNS-t izolálunk, a kapott mRNS-keveréket önmagában ismert módon hirudin-mRNS-re nézve dúsítjuk, ezt az mRNS-t templátként alkalmazzuk az egyfonalas cDNS előállításához, amiből RNS-függó DNS-polimeráz segitségével kettős szálú cDNS-t szintetizálunk és ezt alkalmas vektorban klónozzuk. A hirudin cDNS-t tartalmazó kiónokat például a fenti módon telep-hibridizálással, radioaktív jelzett hirudin-DNS specifikus oligodezoxinukleotidok alkalmazásával azonosítjuk.

A genomból ily módon kapott hirudin-DNS-t vagy a hirudin cDNS-t előnyösen az 5’- és 3*-végen olyan kémiailag szintetizált adapter-oligodezoxinukleotidokkal kapcsoljuk össze, amelyek egy vagy több különböző restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáit tartalmazzák és ezáltal az alkalmas vektorokba történő beépítést megkönnyítik. A hirudin-DNS, illetve -cDNS 5’-végéhez kapcsolt adaptermolekulának még kiegészítőleg tartalmaznia kell a transzláció startjelét (ATG). A transzláció startjele ügy helyezkedjen el, hogy ezt közvetlenül a hirudin első aminosavának kodonja kövesse.

Mivel a természetes hirudin-gén szerkezete nem ismeretes és a hirudin-aminosavszekvenciáját kódoló gén kémiai szintézise a modern szintézislehetőségek alapján, különösen az idő szempontjából, előnyökkel járt, utóbbi a találmány előnyös kiviteli formáját képezi.

A deszulfatohirudin-gén kémiai szintézise

A találmány eljárás különösen a deszulfatohirudin-gén vagy annak fragmentjei előállítására; a deszulfatohirudin-gén kódoló és komplementer szálának szegmenseit kémiailag szintetizáljuk és a kapott szegmenseket enzimatikusan deszulfatohirudin strukturgénné vagy annak fragmensévé alakítjuk.

A találmány továbbá azokra a kettős szálú DNS-ekre vonatkozik, amelyek a deszulfatohirudint kódolják.

A találmány szerinti DNS-ek a deszulfatohirudin kodonjain kivül tartalmazzák a transzláció start- és stop-jeleit, amik alkalmas gazdasejtben, például E. coli-bán az expressziót lehetővé teszik, továbbá a végeken olyan nukleotidszekvenciákat, amelyek vektorba való beépítésre alkalmasak.

A találmány egyik előnyös kiviteli formája olyan DNS-re vonatkozik, amelyben az 5*-végen lévő, restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvenciákat a transzláció startjele, a hirudin kodonjait - amelyek adott esetben egy vagy több helyen restrikciós enzimmel való hasítást tesznek lehetővé - a transzláció stopjele és a 3'-végen restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvencia követi. A találmány szerinti alkalmazható restrikciós enzimek például az Eco Rí, Eco

HU 202288 Β

RII, 1	Bam Hl, Hpa II, Pst I, Hinf I vagy Hind		A találmány egyik elönyöe kiviteli fór-
III.			májában a DNS-szekvencia	az 5’-végen Eco
	A találmány eljárás különösen olyan (I,		Rl-gyel hasítható, a közepén Eco RII-vel ha-
általános képletű nukleotidszekvenciából és a		sitható és a 3’-végen Bam	HI-gyel hasítható
komplementer nukleotidszekvenciából álló	5	nukleotidszekvenciát tartalmaz.
kettős szálú DNS előállítására - ahol a kép-		A találmány elsősorban olyan kettős
letben a nukleotidszekvenciát az 5'-végtól		szálú DNS-re vonatkozik,	amely a hirudin
kezdődően tűntettük fel és jobb megértés		aminosavait kódoló E.coli által előnyben ré-
kedvéért megadtuk a triplettek által kódolt		szesített tripletteket tartalmaz. Ilyen triplet-
aminosavakat, és ahol	10	tek a követezők:
A	dezoxiaderiozil		glicin (gly)	GGT
T	timidil		cieztein (cys)	TGC
G	dezoxiguanozil		valin (val,	GTT
C	dezoxicitidil		leucin (leu)	CTG
X	A, T, C vagy G,	15	szerin (ser,	TCT
Y	T vagy C,		treonin (tht,	ACC
Z	A, T, C vagy G, ha Y = C,		fenilalanin (phe)	TTC
vagy	Z = A vagy G, ha Y = T,		tirozin (tyr)	TAC
Q	T vagy A		metionin (met,	ATG
R	C és S = A, T, C vagy G, ha Q = T,	20	aszparaginsav (asp)	GAC
vagy	R = G és S = T vagy C, ha Q = A,		glutaminsav (glu)	GAA
M	A vagy G,		lizin (lys)	AAA
L	A vagy C,		izoleucin (ile)	ATC
N	T, C vagy A		hisztidin (his)	CAC
K	A vagy G, ha M = A,	25	prolin (pro)	CCG
vagy	K = A, ha M = G,		glutamin (gin)	CAG
jelentésű és (X’)n és (X*)· egyenként olyan		aszparagin (asn)	AAC
tetszés szerinti nukleotidszekvenciákat jelen-		Előnyös stopjel (NON) a TAG kodon.
tenek	:, amelyekben n és m nagyobb, mint 3		A fenti módon a hirudin aminoszekven-
és kisebb, mint 100, különösen nagyobb, mint	30	ciáját kódoló gén előnyös	kiviteli formája a
5 és	kisebb, mint 15 - amelyet egy restrikci-		(II) általános képletű DNS,	ahol a képletben
ós enzim képes felismerni és elhasitani.

MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyClnAsnLeuCysLeuCysGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA (EcoRI,

SerASnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysVal

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA (EcoRII)

ThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGlu

ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA

TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TyrLeuGlnNON

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC (BamHI,

HU 202288 Β

A, T, G, C jelentése az (I) általános képletnél megadott és jobb megértés kedvéért megadtuk a triplettek által kódolt aminosavakat és a restrikciós enzimek hasítási helyeit.

A találmány a deszulfatohirudint kódoló 5 DNS fragmenseire is vonatkozik.

A találmány továbbá a deszulfatohirudin-gén kettős szálú fragmenseire vonatkozik, különösen azokra, amelyeknek a végei restrikciós enzimekkel hasíthatok. A hirudin- 10 -gén ilyen kettős szálú DNS-fragmensei különösen 30-70 bázispárt tartalmaznak.

Például a találmány vonatkozik a III (Fi) és IV (Fi) általános képletű DNS-fragmensekre. 15

MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA (EcoRI)

SerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySer

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC (EcoRII)

IleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysPro

CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGC (EcoRII,

GlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGlnNON

CAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

GTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC (BamHI)

A találmány a deszulfatohirudin-gén egyes szálú fragmenseire is vonatkozik, különösen azokra, amelyek kémiai és/vagy enzi- 40 matikus módszerekkel deszulfatohirudin-génné illeszthetők össze. A találmány húsznál több, különösen 20-70 nukleotidot tartalmazó egyes szálú DNS-fragmensekre is vonatkozik.

A találmány előnyösen a példákban leirt 45 egyes és kettős szálú DNS-fragmensekre vonatkozik.

A DNS-szintézis módszereit S.A. Narang (3) foglalta össze. Az ismert szintézistechnikák mintegy 20 bázis hosszúságú polinukleo- 50 tidok előállítását teszik lehetővé jó kitermeléssel, nagy tisztaságban és viszonylag rövid idő alatt. A foszfodiészter módszerrel (4), a még hatékonyabb foszfotriészter módszerrel (5) vagy a foszfit-triészter módszerrel (6) 55 alkalmas védett nukleotidokat kapcsolunk össze egymással. Az oligo- és polinukleotidok szintézise a szilárdfázisú módszerrel egyszerűsíthető, amelyben a nukleotidláncot alkalmas polimerhez kötjük. Itakura és munkatár- 60 sai (7) a szilárdfázisú szintézisben egyes nukleotidok helyett foszfo-triészter módszerrel kapcsolt trinukleotidokat alkalmaznak, amelyek igy rövid idő alatt és jó kitermelés_sel például 31 bázist tartalmazó polinukleo- 65 6 tiddá kondenzáltathatók. A tulajdonképpeni kettős szálú DNS kémiailag előállított rövid szegmensekből enzimatikusan állítható össze. Khorana és munkatársai (8) ehhez mindkét DNS-szálból származó átfedő polinukleotid-szekvenciákat alkalmaznak, amelyek helyes elrendezését a bázispárosodás biztosítja, és utána ezeket a DNS-ligáz enzim kémiailag összekapcsolja. További lehetőséget jelent az, ha mindkét DNS-szálból származó, rövid átfedő szegmenst tartalmazó egy-egy polinukleotid-szekvenciát a négy szükséges dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz I-gyel, a polimeráz I Klenow-fragmensével, T« DNS-polimerázzal vagy AMV (avian myeloblastosis vírus) reverz transzkriptázzal inkubálunk. Eközben a bázispárosodás a két polinukleotid-szekvenciót a helyes elrendezésben tartja össze és azt az enzim a szükséges nukleotidokkal teljes kettős szálú DNS-sé egészíti ki (9). Itakura és munkatársai (10) leírják, hogy erre az elvre alapozva DNS-polimeráz I (Klenow-fragment, jelenlétében 4 kémiailag szintetizált 39-42 bázis hosszúságú fragmensból a humán leukocita-interferon oCz-gén 132 bázispár hosszúságú szegmense állítható össze, mimellett a kémiai szintézisben 40%-os megta-59

HU 202288 Β karitást értek el a fenti, csak ligázt alkalmazó módszerhez képest.

A találmány tárgya eljárás olyan DNS-ek előállítására, amelyek a deszulfatohirudin strukturgénjét tartalmazzák és gazdasejtekben expresszióra alkalmasak, és amelyek végei vektorokba való beépítést tesznek lehetővé, és azok fragmenseinek előállítására, úgy, hogy

a) alkalmasan védett dezoxinukleotidot szilárd hordozóhoz kapcsolunk,

b) alkalmas védett di- vagy trinukleotido-. kát állítunk elő a foszfotriészter-módszerrel,

c) a hordozóhoz kötött dezoxinukleotidot vagy oligodezoxinukleotidot alkalmas, védett mono- vagy (a b pont szerint előállított) di-' vagy trinukleotiddal kapcsoljuk össze a foszfotriéezter- mód szer segítségével,

d) a c) pont szerint előállítható, hordozóhoz kötött, kb. 20-70 bázishosszúságú oligodezoxinukleotidokat a hordozóról lehasitjuk, adott esetben tisztítjuk, a védöcsoportot eltávolítjuk és az 5’-'végen a szabad hidroxicsoportot foszforiláljuk, el) a kódoló és a komplementer szálból származó, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anellálunk és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal kettős szálú DNS-szegmensekké (a deszulfatohirudin-gén fragmenseivé) egészítjük ki, és adott esetben a d) eljáráslépés szerint foszforilált alkalmas végekkel rendelkező két kettős szálú DNS-szegmenst ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk össze, vagy 2 kapott kettős szálú DNS-szegmenst alkalmas vektorokba szubklónozunk, majd a d) eljáráslépés szerint foszforilálunk és ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk öesze, vagy e2) alternatív módon a kódoló és a komplementer szálból származó, kb. 20-70 bázishosszúságú, és egyenként legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anelláljuk, a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal feltöltünk és ligázzal deszulfatohirudin struktúrgénné kapcsolunk össze.

A találmány szerinti eljárás ónmagában ismert, azonban a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS előállítását csak a feltételek alkalmas kombinációja ée a találmány lényeges újításai teszik lehetővé.

Az a) lépésben nagyszámú szilárd hordozóanyag, igy különböző térhálósodású, és duzzadóképességű polisztirol, poliakrilamid, poliakrilamid-kopolimer, szervetlen anyagra, így kovaföldre, kovasavgélre vagy aloxra vitt poliamid vagy funkcioanalizált szilán alkalmazható. A találmány egy előnyös kiviteli formájában szilárd hordozóanyagként tárhálósitott polisztirolt alkalmazunk, amit egy .spacer-en, így 1-5 poláros kétértékű funkciós csoporttal, például imino-, oxo-, tio-, oxo-karbonil- vagy amido-karbonil-csoporttal megszakított 2-12 szénatomos alkiléncsoportón keresztül önmagában ismert módon az 5’-hidroxilcsoporttal alkalmasan védett dezoxinukleotiddal összekapcsolunk. Különösen előnyös az (V) általános képletű 5’-helyzetben és adott esetben a bázisrészben védett nukleozidok - a képletben R¹ jelentése savval lehasitható védőcsoport, igy triaril-metil-védöcsoport, például 4-metoxi-tritil- vagy 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport vagy tri(róvidszénláncú-alkil)-szilil- védőcsoport, például terc-butil-dimetil-szilil-csoport és B jelentése adott esetben védett bázis, a tímil-, citozil-, adenil- vagy guanilcsoport közül az egyik reakciója borostyánkősavanhidriddel adott esetben bázisok, így piridin, trietil-amin vagy dimetil-amino-piridin jelenlétében, amit a 0,5-2% divinil-benzollal térhálósított, amino- metilezett polisztirollal való és karbonsavmaradék aktiváló reagensekkel, előnyösen N-hidroxi-szukcinimiddel vagy p-nitro-fenollal és vizelvonőszerek, igy karbodiimid, például diciklohexil-karbodiimid segítségével lefolytatott reakció követ (1. ábra).

A reagáltatást inért, aprotonos oldószerben, például piridinben, tetrahidrofuránban, dioxánban, etil-acetátban, kloroformban, metilén-kloridban, dimetil-formamidban vagy dietil-acetamidban vagy ezek elegyében, szobahőmérsékleten vagy kissé növelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például kb. -10-50 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten, vizelvonószer jelenlétében, alacsony hőmérsékleten is, például 0 °C-on végezzük.

A di- vagy tri-nukleotidok találmány ezerinti előállításában a b) lépés (2. ábra) szerint az (V) általános képletú 5’-helyzetben és adott esetben a bázisrészben védett nukleozidokat - a képletben R^l és B jelentése a fenti - (VII) általános képletű aktíváit foszforsav-észterekkel - a képletben X¹ és X² egymástól függetlenül hidroxicsoportot vagy abból levezetett sókat, halogénatomot, imidazolil-, 1,2,4-triazol-l-il-, tetrazolil- vagy

1- benztriazolil-oxi-csoportot és X² kiegéezitőleg 2-ciano-etil-oxi-, 2-trihalogén-etil-oxi-,

2- arilszulfonil-etil-oxi-, 2-(rövidszénláncú alkil)-tio-etil-oxi-, 2-aril-tio-etíl-oxi- vagy 2-(4-nitro-fenil)-etil-oxi-csoportot is jelent, és R² jelentése bázissal vagy nukleofil reagenssel, igy ammőnium-hidroxiddal, tiofenoláttal vagy aril-aldoximáttal lehasitható védócsoport, igy adott esetben halogénatommal, nitro- és/vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport, metilcsoporttal vagy adott esetben nitrocsoporttal Bzubsztítuált benzilcsoport, vagy fémionnal lehasitha7

-611

HU 202288 Β tó védócsoport, például 8-kinolil- vagy 5-kloro-8-kinolil-csoport - reagáltatjuk adott esetben vizelvonóezerek vagy bázisok jelenlétében.

Ezután az igy kapott (Vili) általános képletű vegyületet - a képletben R¹, X² és R² jelentése a fenti, először adott esetben 2-helyzetben szubsztituált etanollal reagáltatjuk, ez az X² csoportot OR^-csoporttá alakítja - a képletben R³ jelentése ciano-etil-, 2-trihalogén-etil-, 2-arilszulfonil-etil-, 2-rövidszénláncú alkil-tio-etil-, 2-aril-tio-etilvagy 2-(4-nitro-fenil)-etil-csoport - majd az Rí védőcsoportot lehasitjuk és az igy kapott (IX) általános képletű vegyületet ismét egy (VIII) általános képletű vegyülettel, adott esetben vizelvonószer vagy bázis jelenlétében, (X) általános képletű dinukleotiddá reagáltatjuk (2. ábra).

Adott esetben valamely (Vili) általános képletű vegyületet bázisokkal és vízzel reagáltatva egy másik (VIII) általános képletű vegyületté alakítunk, ahol a képletekben X² jelentése hidroxilcsoport vagy abból levezetett só.

A reakciókat a fenti inért oldószerek egyikében szobahőmérsékleten vagy kissé növelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például szobahőmérsékleten folytatjuk le.

Az R¹ védőcsoportot savval, Így ásványi savakkal, például sósavval vagy kénsavval, karbonsavakkal, például esetsavval, triklór-ecetsavval vagy hangyasavval, szulfonsavakkal, például metán- vagy p-toluolszulfonsavval, vagy különösen Lewis-savakkal, például cink-kloriddal, cink-bromiddal, alumínium-kloriddal, dialkil-aluöiínium-halogeníddel, például dibutil- vagy dietil-aluminium-kloriddal, vagy bór-trifluoriddal hasítjuk le 10-50 °C-on, különösen szobahőmérsékleten. A dialkil-alumlnium-halogeniddel való hasítást lipofil oldószerben, különösen toluolban és a fenti Lewis-savak közül egy másikat alkalmazva, halogén-szénhidrogénből, például metilén-kloridból és rövidszénláncú alkanolból, például etanolból vagy izopropanolból álló oldószerelegyben végezzük.

A (X) általános képletű dinukleotidok találmány szerinti előállítása magába foglalja az (V) általános képletű nukleozidok - a képletben R¹ és B jelentése a fenti - (VIIA) általános képletű foszfátokkal - a képletben X¹ jelentése halogénatom, különösen klóratom, X² jelentése halogénatom, különösen klóratom, vagy di(rövidszénláncú alkil)-amino-csoport, különösen dimetil-amino- vagy diizopropil-amino-csoport, vagy morfolino-, piperidino- vagy pirrolidinocsoport és R² jelentése a (VII) képletnél megadott, különösen metilcsoport - való reagáltatását adott esetben alkalmas bázis jelenlétében (3. ábra). A találmány szerint előállítható (VIIIA) általános képletű vegyületeket egyrészt 2-helyzetben szubsztituált etanollal reagáltatjuk, ami az X² csoportot OR^csoporttá alakítja - a kóplet8 ben R³ jelentése a fenti - majd oxidálószerrel, például jóddal valamilyen bázis jelenlétében, foszfáttá oxidáljuk és az R¹ védőcsoportot lehasítjuk, mimellett (IX) általános képletű vegyület képződik, másrészt valamely (IX) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, majd oxidálószerrel, például jóddal valamilyen bázis jelenlétében (X) általános képletű vegyületté oxidáljuk.

A trinukleotidok találmány szerinti előállításához a (X) általános képletű dinukleotidokról - a képletben R¹, R² és R³ jelentése a fenti és B¹ és B² jelentése egymástól függetlenül timil-, citozil-, adenil- vagy guanilcsoport - az R¹ védőcsoportot lehasitjuk, és a kapott vegyületet (Vili) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, adott esetben vízelvonószer és bázis jelenlétében, vagy egy (VIIIA) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk és ezt követően oxidáljuk, mimellett (XI) általános képletű vegyület képződik (4. ábra). Az R¹ védőcsoport lehasitását és a (XI) általános képletű trinukleotidokká kondenzáltatását a (X) általános képletű dinukleotidok előállításánál leírt módon végezzük.

A találmány egyik előnyös kiviteli formájában R¹ védócsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot, R² védócsopörtként klórral szubsztituált fenilcsoportot, különösen 2-klór-fenil-csoportot, és R³ védőceoportként 2-ciano-etil-csoportot alkalmazunk. A (VII) általános képletű vegyületben az X¹ és X² csoport előnyős jelentése 1-benztriazolil-oxi-csoport.

A (XI) általános képletű trinukleotidókat előnyösen oly módon állítjuk elő, hogy a (X) általános képletű dinukleotidokban az R¹ védőcsoportot lehasítjuk és a kapott vegyületet (VIII) általános képletű vegyülettel - a képletben X² jelentése hidroxicsoport vagy abból levezetett csoport - reagáltatjuk vízelvonószer jelenlétében (4. ábra). Találmány szerinti vizelvonószer például a 2,4,6-trimetilvagy triizopropil-benzolszulfonil-klorid, -imidazol, -tetrazol vagy -1,2,4-triazol, amely adott esetben nitrocsoporttal szubsztituált lehet. Előnyős vizelvonószer a (XII) képletű l-(2,4,6-trimetil-benzolszulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazol.

Előnyösen olyan nukleozidokat alkalmazunk, amelyekben a bázisrészen található szabad aminocsoport védett. Előnyös védőcsoport adeninre a benzoilcsoport, citozinra a benzoil- vagy 4-metoxi-benzoil-csoport, guaninra az izobutiril- vagy difenil-acetil-csoport. A timint előnyösen védőcsoport nélkül alkalmazzuk.

Az oligonukleotidok c) reakciólépésének megfelelő találmány szerinti előállításában önmagában ismert félautomatikus vagy teljesen automatikus mikroprocesszoros oldószer- és reagensadagoló rendszerrel ellátott készüléket alkalmazunk. Az a) reakciólépés szerint előállított (VI) általános képletű vegyületben az R^l védőcsoportot a fent leírt módon leha-713

HU 202288 Β sitjuk, majd a (Vili) általános képletű vegyülettel, vagy a (X) vagy (XI) általános képletű vegyülettel, amelyben előzőleg az R³ védőcsoportot bázissal lehasitottuk (a 2-ciano-etil-csoport jelentésű R³-at például tri(rövidszénláncú alkil)-aminnal, például trietilaminnal, a fenti inért oldószerek vagy oldöszerelegyek egyikében 10-40 °C-on, különösen szobahőmérsékleten), adott esetben vízelvonószer vagy bázis jelenlétében reagáltatjuk. Az ily módon előállított (XIII) általános képletű vegyülettel - a képletben R¹, R³ és B jelentése a fenti ée n jelentése az 1-4 egész szám - annyiszor ismételjük meg a (VI) általános képletű vegyületre leírt reakciólépéseket [R¹ lehasítása, a (VIII), (VIIIA), (X), (XI) általános képletű vegyületekkel vagy a megfelelő tetranukleotiddal való reagáltatás, adott eseten ezt követő oxidatív kezeléssel], amíg (XIII) általános képletű vegyület képződik, amelyben n jelentése kb. 19 és 69 közötti tetszés szerint választott egész szám.

A találmány egyik előnyös kiviteli formájában R¹ védőcsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk és a cink-bromidos hasítást CH- vagy NH-sav jellegű vegyület, különösen 1,2,4-triazol vagy tetrazol jelenlétében végezzük. Például az 1,2,4-triazol alkalmazása a 4-metoxi-tritil-védócsoport lehasitására új, és meglepő módon gyors, nagyhozamú és mellékreakciók nélküli hasítást eredményez. Különösen előnyös a cink-bromid és az 1,2,4-triazol 20:1 és 100:1 közötti mólarányban való alkalmazása aprotonos oldószerből és alkoholból, például metilén-kloridból és 2-propanolból álló oldószerelegyben.

A találmány egyik előnyös kiviteli formájában valamely (VI) vagy (XIII) általános képletű vegyületet, amelyben az R¹ védőcsoportot lehasítottuk, (XI) általános képletű trinukleotiddal - amelyben az R³ védőcsoportot lehasitottuk - reagáltatjuk vizelvonószer, például 2,4,6-trimetil- vagy triizopropil-benzolszulfonil-klorid, -imidazol, -tetrazol vagy -1,2,4-triazol, amelyek adott esetben nitrocsoporttal szubsztituáltak, jelenlétében. Különösen előnyős a (XII) képletű l-(2,4,6-trimetil-benzolszulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazol.

Az a különösen előnyös kombináció, amely szerint R¹ védöcsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk, R^et 1,2,4-triazol jelenlétében cink-bromiddal hasítjuk le és a (XIII) általános képletű nem védett oligonukleotid-polisztirolgyanta (XI) általános képletű nem védett trinukleotiddal való reakciójához (XII) képletű triazolt alkalmazunk vizelvonószerként lehetővé teszi, hogy meglepő módon kb. 40-70 bázishosszúságú nukleotidláncokat is rövid idó alatt, nagy kitermeléssel és nagy tisztaságban állítsunk eló.

Az oligodezoxinukleotidoknak a hordozóról való találmány szerinti lehasitásához és a védőcsoportok d) reakciólépés szerinti eltávolításához önmagában ismert eljárásokat alkalmazunk. A hordozóról történő lehasitáshoz és az előnyös 2-klór-fenil-védőcsoport eltávolításához különösen előnyösen alkalmazható reagens valamilyen aril-aldoximát, például az l,l,3,3-tetrametil-guanidinium-2-nitrobenzaldoximát. A reakciót a fenti inért oldószerek egyikében, amelyhez előzőleg kevés vizet adunk, például 95%-os piridinben, szobahőmérsékleten végezzük. Utána vizes ammóniával reagáltatjuk szobahőmérsékleten, például 20-70 °C-on, előnyösen 50 °C-on.

A találmány szerinti oligodezoxinukleotidok összekapcsoláséhoz az 5*-végen levő hidroxicsoportra foszfátcsoportot viszünk. A foszfátcsoport bevitele (fősz fór Hálás) önmagában ismert módon T4 polinukleotid-kináz segítségével ATP jelenlétében történik.

A kódoló és a komplementer szál találmány szerint előállított oligodezoxinukleotidjait átfedő szekvenciákat tartalmaznak, amelyek legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárból állnak. Ha ilyen oligodezoxinukleotidokat összekeverünk, a köztük kialakuló hidrogénhidak összetartják őket. Az elálló, egyes szálú végek az el) és e2) reakciólépésnek megfelelően mátrixként (templátként) szolgálnak a második (komplementer) szál felépítéséhez, amit DNS-polimeráz, például DNS-polimeráz I, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmense vagy Ti DNS-polimeráz vagy AMV reverz transzkriptáz végez a négy dezoxinukleotid-trifoszfát (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) jelenlétében. A kiegészítésnél képződő DNS-duplexek, amelyek alatt különösen a deszulfatohirudin-gén fragmensei (el eljáráslépés) vagy a teljee deszulfatohirudin-gén (e2 eljáráslépés) értendő, tompa végűek.

A deszulfatohirudin-gén el) eljáráslépéssel kapott fragmense a végeken olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaznak, amelyeket a restrikciós endonukleázok képesek felismerni és elhasitani. A nukleotidszekvenciák ée ennek megfelelően a restrikciós endonukleázok megválasztásától függően a hasításnál teljesen bázispárosodott (tompa) végek (.blunt ends', vagy elálló DNS-szálat tartalmazó végek (.staggered ends*) képződnek. A restrikciós felismerési szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy a tompa végeket képző restrikciós endonukleázokkal kezelt DNS-fragmentek összekapcsolása, illetve a kohéziv végek bázispárosodása és az elálló DNS-szálakat tartalmazó DNS-fragmensek ezt kővető összekapcsolása teljes deszulfatohirudin strukturgént eredményezzen. Két kettős szálú DNS-fragmens összekapcsolása a donor-fragmens 5'-végén foszfátcsoportot, az akceptorfragment 3’-végén szabad hidroxicsoportot igényel. Az el) lépésben keletkező DNS-fragmensek az 5’-végen már foszforiláltak és ezeket önmagában ismert módon ligázzal, különösen T« DNS-ligázzal kapcsoljuk össze.

-815

HU 202288 Β

A találmány egyik kiviteli formájában a leirt módon állítjuk eló a deszulfatohirudin-gén két fragmensét, különösen a (111), illetve (IV) általános képletű Fi és Fz fragmenseket. A szükség esetén alkalmas vektorban szubklónozható fargmensek a kapcsolódó végeken előnyösen mindig egy restrikciós endonukleáz, különösen Eco RII, felismerési szekvenciáját tartalmazzák, ami miatt az említett restrikciós enzimmel való hasítás és a két fragmens összekapcsolása után a korrekt kódoló deszulfatohirudin-DNS-szekvencia képződik. Az 1. fragmens a transzláció startjele (ATG) előtt és a 2. fragmens a transzláció stopjele (például TAG) után kiegészítóleg .terminális' restrikciós helyeket tartalmaz, amelyek a deszulfatohirudin-gén, illetve a deszulfatohiru din-gén fragmenseinek alkalmas vektorba való beépítését megengedik.

Például a találmány a deszulfatohirudin-gén két (III), illetve (IV) általános képletű Fi és Fz fragmensben való előállítására vonatkozik, amelyeket adott esetben szubklónozunk és Eco RII restrikciós enzimmel való hasítás és összekapcsolás után korrekt deszulfatohirudin-DNS-szekvenciát kapunk, és amelyekben Fi-n a transzláció startjele előtt egy Eco Rí restrikciós hely és Fr-n a transzláció stopjele után egy Bam Hl restrikciós hely található.

Egy előnyös kiviteli formában (e2 eljárás) két-két oligodezoxinukleotidot, amelyek alternetiv módon a kódoló és a komplementer szálból származnak, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 komplementer bázissal anellálunk, DNS-polimerázzal, például a fentiek egyikével feltöltünk és Ti DNS-ligázzal deszulfatohirudin strukturgénné kapcsolunk össze.

A hirudin gént kódoló aminosavszekvenciát tartalmazó expressziós vektorok előállítása

A találmány továbbá olyan expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek a deszulfatohiru dint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazzák, amelyeket egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy ezzel az expressziós vektorral transzformált gazdában hirudin aktivitású polipeptid termelődjön.

A találmány szerinti expressziós vektorokat például oly módon állítjuk eló, hogy az expressziós kontrollszekvenciát tartalmazó vektor-DNS-be úgy illesztjük a deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvenciát, hogy ezt az expressziós kontrollszekvencia szabályozza.

Az alkalmas vektor megválasztása a transzformációhoz tervbe vett gazdasejtből következik. Alkalmas gazdák például a mikroorganizmusok, így az élesztők, például Saccharomyces cerevisiae, és különösen azok a baktériumtörzsek, amelyek nem tartalmaznak restrikciós vagy modifikációs enzimet, mindenek előtt az Escherichia coli törzsei, például az E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli 10

W3110a102, E.coli HB1O1/LM1O35, E.coli JA221(30) vagy E.coli K12 törzs 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilis, Streptococcus és mások, továbbá magasabb organizmusok sejtjei, különösen az elfogadott humán vagy állati eejtvonalak. Előnyős gazdamikroorganizmusok az E.coli említett törzsei, különösen az E.coli HB101, E.coli JA221 és E.coli W3110 Δ 102.

Alapvetően minden olyan vektor alkalmas, amely a találmány szerinti heterolog, a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát a választott gazdában replikálja és kifejezi.

Például a deszulfatohirudin-gént E.coli törzsben kifejező vektorként alkalmasak a λ bakteriofágok, például a bakteriofág származékai, vagy plazmidok, így különösen a colEl plazmid és származékai, például a pMB9, pSF2124, pBR317 vagy pBR322. A találmány szerinti előnyös vektorokat a pBR322 plazmidból vezetjük le. Az alkalmas plazmidok teljes replikont tartalmaznak és egy jelzógént, ami az expressziós plazmiddal transzformáit gazda szelekcióját és azonosítását egy fenotipusos jegy alapján lehetővé teszi. Az alkalmas jelzógének például rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának nehézfémekkel, antibiotikumokkal és hasonlókkal szemben. Továbbá a találmány szerinti előnyös vektorok a replikon- és jelzógén-tartományokon kivül tartalmazzák a restrikciós endonukleázok felismerési szekvenciáit, igy ezekre a helyekre a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvencia és adott esetben az expressziós kontrollszekvencia beilleszthető. Az előnyös vektor, a pBR322 plazmid, intakt replikont, tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztenciát kölcsönöz jelzógéneket (tét⁸ és amp^R) és egy sor egyszer előforduló felismerési szekvenciát tartalmaz restrikciós endonukleázok, például PstI (az amp^R-génben hasit, a tet^R-gén érintetlen marad), BamHI, Hindlll, Sáli (mind a tet^B-génben hasítanak, az amp^s-gén érintetlen marad), Nrul és EcoRl számára.

A deszulfatohirudin-expressziójának szabályozásához több expressziós kontrollszekvencia alkalmazható. Különösen a transzformálandó gazda erősen kifejeződő génjeinek expressziós kontrollszekvenciáit alkalmazzuk. A pBR322 hibridvektor és az E.coli gazdamikroorganizmus esetében például a laktóz operon, triptofán operon, arabinóz operon és hasonlók, a β-laktamáz gén expressziós kontrollszekvenciái (melyek többek között a promotert és a riboszomális kötőhelyet is tartalmazzák), a λ N fág génjének vagy a fd fág burokfehérje-génjének megfelelő szekvenciái és mások alkalmasak. Mig a pBR322 plazmid már tartalmazza a β-laktamáz gén (ü-lac-gén) promoterét, a többi expreszsziós kontrollszekvenciát be kell vinni a plazmidba. A találmány szerint előnyös a

-917

HU 202288 Β triptofán operon (trp po) expressziós kontrollszekvenciája.

A replikációra és expresszióra élesztőben alkalmas vektorok élesztő-replikációs starti pont )ot és az élesztő számára szelektív genetikai markert tartalmaznak. Az élesztőreplikáció startpontját tartalmazó hibridvektorok, például a kromoszómáiig autonóm replikálódó szegment (ars), a transzformáció után az élesztősejten belül extrakromoszomálisak maradnak és a mitóziskor önállóan replikálódnak. Továbbá alkalmazhatunk élesztő 2 μ-plazmid-DNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó hibridvektorokat. Ezek a hibridvektorok rekombinációval a sejten belül már meglévő 2 μ-plazmidokba épülnek be vagy önállóan replikálódnak. A 2 μ-szekvenciák különösen a nagy transzformáció-gyakoriságú plazmidokhoz alkalmasak és nagyszámú másolat képzését biztosítják. Az élesztőhöz alkalmas jelzőgének mindenekelőtt azok) amelyek antibiotikus rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében a gazda defektusát komplementek} gének. Megfelelő gének például cikloheximid antibiotikum elleni rezisztenciát kölcsönöznek vagy gondoskodnak a prototrof iáról auxotróf élesztőmutánsokban, ilyen például az URA3-, LEU2-, HIS3- vagy mindenek előtt a TRP1-gén. Továbbá az élesztő-hibridvektorok előnyösen a baktériumgazda, különösen E.coli számára replikációs startpontot és egy jelzőgént tartalmaznak, igy a hibridvektorok és előtermékeik szerkesztése és klónozása egy bakteriális gazdában történhet. Az élesztőben expresszióra alkalmas expressziós kontroliszekvenciák például a TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3- vagy PHO5-gén kontrollszekvenciái, továbbá a glükolizisben résztvevő promoterek, például a PGK- és GADPH-promoter.

A találmány különösen olyan replikációra és fenotipusos szelekcióra alkalmas expreszsziós vektorokra vonatkozik, amelyek expressziós kontrollszekvenciát és a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mimellett az említett DNSszekvencia a transzkripció start- és stopjelével, valamint a transzláció start- és stopjelével együtt az említett expressziós kontroliszekvencia szabályozása alatt az említett expressziós plazmidban olyan elrendezésű, hogy az említett plazmiddal transzformált gazdában deszulfatohirudin fejeződik ki.

Hatékony expressziót akkor érünk el, ha a deszulfatohirudin-gén az expressziós kontrollszekvenciával megfelelően (.fázisban') helyezkedik el. Az expressziós kontrollszekvenciát előnyös a fó-mRNS-start és a gént kódoló szekvencia ATG-je közötti tartományban, amely természetesen az expressziós kontrollszekvenciával össze van kötve (például a ű-lac-kódszekvencia, ha ű-lac-promótert alkalmazunk), a saját transzlációs startjelét (ATG) és transzlációs stopjelét (például TAG) tartalmazó deszulfatohirudin-génnel összekapcsolni. Ezáltal biztosított a hatékony transzkripció és transzláció.

Például egy vektort, különösen a pBR322-t, restrikciós endonukleázzal hasítunk és adott esetben az igy kapott linearizált vektor modifikálása után abba megfelelő restrikciós végekkel ellátott expressziós kontrollszekvenciát juttatunk. Az expressziós kontrollezekvencia a 3’-végen (a transzláció irányába) restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáját tartalmazza, úgy, hogy az expressziós kontrollszekvenciát már tartalmazó vektor az említett restrikciós enzimmel emészthető és az illeszkedő végekkel rendelkező deszulfatohirudin-gén beilleszthető. Ekkor két hibridplazmid keveréke képződik, amelyek a gént megfelelő, illetve nem megfelelő orientációban tartalmazzák. Előnyös az expressziós kontrollszekvenciát már tartalmazó vektort még egy második restrikciós endonukleázzal a vektor-DNS-en belül elhasitani és a képződött vektor-fragmentbe a megfelelő végekkel ellátott deszulfatohirudin-gént beilleszteni. A vektoron előnyösen minden műveletet oly módon végzünk, hogy a replikon és legalább egy jelzőgén funkciója ne csökkenjen.

A találmány egyik előnyös kiviteli formájában egy pBR322-böl származó vektort, amely expressziós kontrollszekvenciával, különösen a triptofán operonéval (trp po) amely a 3’-végen (a fö-mRNS-start és az első ATG között) egy előnyösen kohéziv végeket képző restrikciós endonukleáz például Eco Rí felismerési szekvenciáját hordozza rendelkezik, az említett restrikciós endonukleázzal és a vektor-DNS részben egy tompa vagy előnyösen kohéziv végeket képző második restrikciós endonukleázzal, például Bam HI-gyel emésztünk, majd az így linearizált vektort a megfelelő végekkel rendelkező deszulfatohirudin-génnel (például Eco Rl-véggel az ATG-startkodon előtt és Bam Hl-véggel a transzláció stopkodon ja után) kapcsoljuk össze. Az összekapcsolás ismert módon a komplementer (kohéziv, végek párképzésével és például T4-DNS-ligázzal való kezeléssel történik.

A mRNS-úton át, a genomból származó DNS-ből vagy szintetikusan előállított, megfelelő kohéziv (különösen Eco Rí- és Bam HI-) végekkel ellátott deszulfatohirudin-gén az expressziós plazmidba való bevitel előtt vektorban is, például pBR332-ben, klónozható, hogy nagyobb mennyiségű deszuifatohirudin-gént kapjunk, például szekvenciaanalizis céljára. A hibridplazmidot tartalmazó kiónokat például deszulfatohirudin-génspecifikus, radioaktív jelzett oligodezoxinukleotid-próbával (lásd fent) izoláljuk. A deszulfatohirudin-gén jellemzése például Maxam és Gilbert (11) eljárásával történik.

A találmány egyik további kiviteli formájában a deszulfatohirudin-gén két fragmensét szintetizáljuk. A gén 1. részét tartal11

-1019

HU 202288 Β mázó 1. fragmens az ATG előtt és a végen mindig kohézív végeket képző restrikciós endonukleázok, például az ATG előtt Eco Rí és a végen Eco RII felismerési szekvenciáját tartalmazza. A gén következő részét tartalmazó 2. fragmenst megfelelő felismerési szekvenciákat tartalmaz, a fragmens elején például Eco RII és a transzláció stopjele (például TAG) után Bam Hl felismerési szekvenciát. A fragmenseket a külső felismerési szekvenciánál (az 1. fragmens Eco Rl-gyel és a 2. fragmenst Bam HI-gyel) hasítjuk és egy megfelelően hozzájuk hasított vektorban (például pBR322) szubklónozzuk. A fragmenseket tartalmazó kiónok azonosítása és a fragmensek jellemzése a fenti módon történik. A fragmenseket ezután a megfelelő restrikciós endonukleázzal kihasítjuk a hibridvektorokból (az 1. fragmentet például Eco Rl-gyel és Eco RII-vel és a 2. fragmentet Eco RII-vel és Bam HI-gyel) és kohézív végeiken, különösen Eco RH-végeiken keresztül összekapcsoljuk ezeket, mimellett a teljes deszulfatohirudin-gént kapjuk, amit a megadott módon vektor-DNS-be illesztünk.

A mikroorganizmusok transzformációja

A találmány eljárás transzformált gazdasejtek előállítására, úgy, hogy valamely gazdát expresssziós kontrollszekvenciával szabályozott, a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmiddal transzformálunk.

Alkalmas gazdasejtek például a fenti mikroorganizmusok, igy a Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis és különösen az Escherichia coli törzsei. A transzformációt a találmány szerinti expressziós plazmiddal például az irodalomban leirt módon végezzük, például S. cerevisiae-re (12), B.subtilis (13) és E.coli-ra (14). A transzformált gazdasejteket előnyösen szelektív táptalajból izoláljuk, amelyhez olyan biocid anyagot adunk, amivel szemben az expressziós plazmidban található jelzögén rezisztenciát kölcsönöz. Ha előnyösen az expressziós plazmid amp^B-gént tartalmaz, akkor ennek megfelelően a tápleveshez ampicillint adunk. Az expressziós plazmidot nem tartalmazó sejtek ilyen táplevesben elpusztulnak.

A találmány az említett úton előállított transzformált gazdasejtekre is vonatkozik.

A transzformált gazdasejtek tenyésztése és deszuifatohirudin kinyerése

A transzformált gazdasejtek hirudin-aktivitású polipeptidek előállítására alkalmazhatók. A találmány tárgya eljárás ezeknek a vegyületeknek az előállításéra, úgy, hogy a transzformált gazdasejteket tenyésztjük és a terméket a gazdasejtekből szabaddá téve izoláljuk. .Hirudin aktivitású vegyületek alatt olyan, az említett transzformált gazdasejtek12 bői kifejeződött polipeptideket értünk, amelyek trombingátló hatást és az antihirudin-antitestekkel pozitív reakciót mutatnak és amelyek a deszuifatohirudin primer struktúrájával vagy egy abból levezetett struktúrával rendelkeznek. A deszuifatohirudin primer struktúrájából levezetett struktúrája deszulfatohirudin vegyületek alatt módosított deszulfatohirudin vegyületeket értünk, mimellett a deszuifatohirudin molekula módosítását előnyösen a deszuifatohirudin primer struktúrájának például az N-termináliaon 1-10, különösen 1-6 aminosavval és/vagy a C-terminálison 1-6, különösen 2 aminosavval való megrövidítése vagy az N-terrainálison végzett módosítás, például N-terminális acetilezés vagy metionilezés jelenti.

A találmány mindenekelőtt eljárás hirudin aktivitású vegyületek és sóik előállítására, azzal, hogy valamely expressziós plazmiddal - ami expressziós kontrollszekvencia által szabályozott hirudint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz - transzformált gazdasejteket aszszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztünk és a terméket a gazdasejtekböl szabaddá teszszük és izoláljuk, és ha szükséges az eljárással kapott terméket a diszulfidhidak felnyitására alkalmas redukálószerrel elegyítjük és a kapott redukált polipeptidet a diszulfidhidak újbóli összekapcsolására alkalmas oxidálószerrel kezeljük és kívánt esetben a kapott hirudin-származékot egy másik hirudin-szarmazékká alakítjuk, és kívánt esetben az eljárással kapott hirudin-aktivitású vegyületek keverékét az egyes komponensekre szétválasztjuk és/vagy kívánt esetben a kapott sót szabad polipeptiddé és a kapott polipeptidet annak sójává alakítjuk.

VValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCyBLeuCysGluGlySerAsnValCys

GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly

ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluWleuGln (XIV)

A találmány különösen ejárás (XIV) általános képletű hirudinszármazékok - a képletben V jelentése Val vagy Met-Val é6 W jelentése Tyr vagy Tyr(-0S03H)- és sóik elóállitására.

A találmány eljárás főleg (XIV) általános képletű deszuifatohirudin - a képletben V jelentése Val és W jelentése Tyr - előállítására.

A találmány szerint előállított hirudin aktivitású vegyületekben, különösen a (XIV) általános képletű vegyületekben a Cys ciszteincsoportok előnyösen ugyanolyan elrendezésben, mint a természetes hirudin bán páronként diszulfid-hidakat képeznek.

A találmány szerint a transzformált gazdasejteket önmagában ismert módon tenyésztjük. Előnyös szénforrások például az asszimilálható szénhidrátok, igy a glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen

-1121

HU 202288 Β acetát, amely vagy egymagában vagy keverékben alkalmazható. Alkalmas nitrogénforrások például az aminosavak, igy a kozaminosav, peptidek ée fehérjék és lebomlási termékeik, például a tripton, pepton vagy húskivonatok; továbbá az élesztőkivonatok, malátakivonat, és ammóniumsók is, például ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket egyedül vagy alkalmas keverékekben alkalmazhatunk. Hasonlóképpen szervetlen sókat is alkalmazhatunk, például a nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-szulfátot, -kloridot, -foszfátot és -karbonátot.

Ezenkívül a közeg például növekedést elősegítő anyagokat tartalmaz, igy nyomelemeket, például vasat, cinket, mangánt és hasonlókat, és előnyösen olyan anyagokat, amelyek szelekciós nyomást fejtenek ki és gátolják azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek az expressziós plazmidot elvesztették, így a közeghez például ampicillint adagolnak, ha az expressziós plazmid amp^B-gént tartalmaz. Ha ilyen antibiotikus hatású anyagokat adunk a közeghez, akkor a szennyező, antibiotikum-érzékeny mikroorganizmusok elpusztulnak.

A tenyésztés önmagában ismert eljárásokkal történik. A tenyésztés feltételeit, például a hőmérsékletet, a közeg pH értékét és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy maximális hirudin-titert kapjunk, igy előnyös valamely E.coli- vagy élesztőtörzset aerob körülmények között szubmersz kultúrában rázás vagy keverés közben 20-40 °C hőmérsékleten, előnyösen 30 °C-on, és pH 4-9-en, előnyösen pH 7-en, 4-20 órán át, előnyösen 8-12 órán ét tenyészteni. Az expreszsziós termék intracellulárisan gyűlik össze.

Ha a sejtsűrűség megfelelő értéket ér el, a tenyésztést megszakítjuk és a mikroorganizmus sejtjeiből a terméket szabaddá tesszük. Ebből a célból a sejteket például detergenses, igy SDS-es vagy Triton-os kezeléssel elroncsoljuk, vagy lizozimmal vagy hasonló hatású enzimmel oldjuk. Alternatív vagy kiegészítő módon mechanikus erőt, például nyiróerőt (például X-prés, French-prés, Dyno-malom), vagy üveggyönggyel vagy aluminium-oxiddal való rázást, vagy váltakozó lefagyasztást, például folyékony nitrogénben, és felengedést, például 30-40 °C-ra, valamint ultrahangot alkalmazhatunk a sejtek feltárásához. A kapott elegyet, amely fehérjéket, nukleinsavakat és egyéb sejtalkotókat tartalmaz, centrifugálás után önmagában ismert módon fehérjére nézve töményítjük. igy például a nem-fehérjealkotók legnagyobb részét polietilénimines kezeléssel leválasztjuk és a fehérjéket, beleértve a hidrudinvegyületeket, például az oldat ammónium-szulfátoa vagy más sóval történő telítésével kicsapjuk. A bakteriális fehérjék ecetsavas savanyítással (például 0,1%, pH = 4-5) is kicsaphatok. A hirudinvegyületek további töményitése az ecetsavas maradék n-butanolos extrakciójával érhető el. További tisztítási lépés például vadamilyen kromatográfiás eljárás, Így az ioncserélő kromatográfia, gélkromatográfia, megoszlási kromtográfia, nagynyomású folyadékkromatográfia, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia és hasonlók. Az elegy komponenseit dialízissel, töltés szerint gél- vagy hordozómentes elektroforézissel, molekulanagyság szerint alkalmas Sephadex oszlopon, affinitás-kromatográfiával, például affinitás-kromatográfiara alkalmas hordozóra kapcsolt antitestekkel, különösen monoklonális antitestekkel, vagy trombinnal, vagy további, különösen az irodalomból ismert eljárással választjuk el.

Például a kifejeződött hirudin izolálása a következő lépésekből áll:

A sejtek elválasztása a tápoldatból centrif u gálással;

Nyerskivonat előállítása a sejtek elroncsolásával, például lizáló enzimmel való kezeléssel és/vagy váltakozó lefagyasztáss&l és újraf elengedéssel;

Az oldhatatlan alkotórészek lecentrifugálása;

A DNS kicsapása polietilénaminnal;

A fehérjék kicsapása ammónium-szulfáttal;

Az oldott csapadék affinitás-kromatográfiája monoklonális anti-deszulfatohirudin-antitest-oezlopon vagy trombin-oszlopon;

Az igy kapott oldat sömentesitése dialízissel vagy Sephadex G 25 vagy Sephadex G 10 kromatográfiával.

Alternatív módon a DNS elválasztása után a bakteriális fehérjéket 0,1%-os ecetsavval kicsaphatjuk, a eavas felülüszóból a hirudint n-butanollal extrahálhatjuk vagy a savas felülúszót közvetlenül ioncserélő kromatográfiának (például DEAE 53 dietil-amino-etil-cellulózon) vethetjük alá. További tisztítási lépésnek számit a Sephadex G 50 (vagy 75)-el végzett gélszűrés és a fordított fázisú HPLC. A sómentesités ismét sephadex G 25-n történik.

A hirudin-aktivitás kimutatására az anti-hirudin- vagy anti-deszulfatohirudin-antiteetekkel (például házinyúlból kapható, vagy hibridomasejtekből kapható monoklonális antitestek) végzett teszt, a trombin-teszt (15) vagy a véralvadási teszt (16) használható.

Az eljárás szerint előállítható hirudinvegyületeket önmagában ismert módon más hirudinvegyületekké alakíthatjuk.

így például a (XIV) általános képletű vegyületet - a képletben W jelentése Tyr tirozin-szulfo-transzferázzal, mint például piócasejtekból kapunk, reagáltatva olyan (XIV) általános képletű vegyületté alakíthatjuk, ahol a képletben W jelentése Tyr (-OSO3H).

Továbbá például olyan (XIV) általános képletű vegyületeket, ahol a képletben V jelentése Met-Val, olyan (XIV) általános képletű vegyületekké alakíthatunk, ahol a képletben

-1223

HÜ 202288 Β

V jelentése Val. Például a találmány szerint előállítható N-terminális metionilceoportot tartalmazó hirudinvegyületeket megfelelő N-terminális metionilcsoportot nem tartalmazó vegyületekké alakíthatjuk oly módon, hogy a terminális metionilcsoportot a szokásos módon bróm-cianiddal lehasitjuk. A bróm-cianidos reagáltatást például vizes-savas közegben, igy híg sósavban, például 0,1-0,3 N sósavban, vagy erős szerves savban, például 50-70%-os hangyasavban, szobahőmérsékleten vagy kissé növelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például 15-25 °C-on, 24 órán át végezzük.

Korábbi vizsgálatok megmutatták, hogy a természetes hirudin alvadásgátló aktivitása szempontjából a diszulfidhidak épségének jelentősége van (v.ö. 2 írod.). A gazdasejt megválasztásától függően nem zárható ki, hogy a primer transzlációs termékben a Hat ciszteincsoport összekapcsolódása a három diszulfidhiddá olyan módon történik, amely a természetes, a piócasejtben lejátszódó folyamattól különbözik. Lehetséges, hogy a termék kialakuló .hamis* tercier struktúrája az értékes farmakológiai tulajdonságok, különösen az alvadásgátló aktivitás csökkenéséhez, sót elvesztéséhez vezet, ami a fenti hirudin-tesztekkel (például trombin-teszt) megállapítható. Ilyen esetben célszerű a diszulfidkötéseket alkalmas redukálószerrel hasítani és a redukált polipeptidet a diszulfidkötések újbóli kialakítására alkalmas oxidálószerrel kezelni. A képződött termék hirudin-aktivitása (például a trombin-tesztben) alapján megállapítható, hogy a választott körülmények (redukáló- és/vagy oxidálószer) a kivánt biológiailag aktiv hirudinhoz vezettek-e vagy a körülményeket ismert módon módosítani kell. A diszulfidkötések felhasítására alkalmas redukálószerek például a tiolszármazékok, igy a tiofenol, 4-nitro-tiofenol, 1,4-butánditiol és különösen az 1,4-ditiotreitol. A redukciót előnyösen vizes-alkálikus közegben, például alkálifém-hidroxid, igy nátrium-hidroxid, alkálifém-karbonát, például nátrium-karbonát, vagy szerves bázis, különösen tri(rövidszénláncú alkil)-amin hig vizes oldatában, szobahőmérsékleten végezzük. A redukált polipeptidben a diszulfidkötések újbóli összekapcsolására alkalmas oxidálószer a levegő oxigénje, amit a polipeptid vizes oldatán, amely adott esetben katalitikus mennyiségű átmenetifémsót, például vas-(III)-szulfátot, vas-(III)-kloridot vagy réz-(II)-szulfátot tartalmaz, vezetünk át; a jód, KJ3 kálium-jodid addukt formájában is, amit előnyösen alkoholos, például metanolos, vagy vizes-alkoholos, például vizes-metanoloB oldat formájában alkalmazunk; káliumhexaciano-ferrát-(III) vizes oldatban; 1,2-dijód-etán vagy azo-dikarbonsav-dimetil-észter vagy -dietil-észter, amelyeket vízben vagy vízből és vízzel keveredő alkoholból, például metanolból álló elegyben viszünk reakcióba. Az oxidációt különösen szobahőmér14 sékleten végezzük.

A reagensek, különösen a sók és az oxidáló- illetve redukálószerek és a belőlük képződött termékek elválasztása a kivánt hirudinvegyületektől önmagában ismert módszerekkel történik, pélául molekulasúly szerinti szűréssel, például Sephadex-en vagy Biogel-en.

Az eljárás szerint előállítható hirudin-aktivitésú vegyületek elegyét önmagában ismert módszerekkel választhatjuk szét az egyes komponensekre. Alkalmas elválasztási eljárás például valamilyen kromatográfiás eljárás, például az adszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, HPLC vagy fordított fázisú HPLC, továbbá a többszörös megoszlás vagy elektroforetikus módszerek, például elektroforézis cellulózacetáton vagy gélelektroforézis, különösen poliakrilamid-gélelektroforézis (.PAGE').

A találmány továbbá az előállítható új deszulfatohirudin-vegyületekre, különösen olyan (XIV) általános képletűekre, ahol a képletben V jelentése Met-Val és W jelentése megadott, és azok sóira vonatkozik.

A találmány továbbá olyan deszulfatohirudin-vegyületekre vonatkozik, amelyeket RP-HPLC állandók [körülmények: Vydac 218TP5415; 4,6 x 150 mm; átfolyási sebesség

1,2 ml/perc; eluens: A: 0,1% trifluor-ecetsav, B: acetonitril/viz 8:2+0,07% trifluor-ecetsav. Grádiens: 2 percig 16% B, utána 3 perc alatt 20% B-re növelni, majd 27 perc alatt 64% B-re növelni] FPLC állandók [körülmények: mono Q-oszlop (Pharmacia), 4,6 mm x 150 mm. A puffer: 20 mM Tris. HCI pH=7,5; B puffer: 20 mM Tris. HC1/1 M NaCl. Lineáris sógrádiens: A: mig 9 ml 15% pufferrel eluálódik, 10,7 ml alatt 70% B puffer-re emelkedik) és UV-elnyelés (Shimedzu UV spektrométerrel /UV240-es típus/ felvéve) a következőképpen jellemeznek:

A-vegyület: RP-HPLC, retenciós idő 16,83 perc;

FPLC; elúció 390 mM NaCl koncentrációnál; UV (víz): = 275 nm;

B vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 18,43 perc;

C vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 19,6 perc;

FPLC: elúció 420 mM NaCl koncentrációnál D vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 20,6 perc;

FPLC: elúció 460 mM NaCl koncentrációnál E vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 21,53 perc;

FPLC: elúció 500 mM NaCl koncentrációnál; UV (viz): Xnu = 273 nm;

és előállítási eljárásukra transzformált gazdatörzsek segítségével.

A találmány szerint előállítható vegyületek, illetve az új (XIV) általános képletű vegyületek nemcsak szabad formában, hanem sóik, különösen farmakológiailag elfogadható sóik formájában is előfordulhatnak. Mivel

-1325

HU 202288 Β több, szabad aminocsoportot tartalmazó aminosavmaradékkal rendelkeznek, a találmány szerinti vegyületek például savaddíciós sókat képezhetnek. Savaddíciós sóként különösen a szokásos terápiásán elviselhető savakkal képzett élettanilag elviselhető sók jönnek számításba; anorganikus savként a hidrogén-halogenidek (igy a hidrogén-klorid) de a kénsav és foszfor- illetve pirofoszforsav is említhető; a szerves savak közül elsősorban a 6zulfonsavak, igy a benzol- vagy p-toluolszulfonsav vagy rövidszénláncú alkánszulfonsavak, például metánszulfonsav, valamint karbonsavak, például ecetsav, tej sav, palmitin- és sztearinsav, almasav, borkősav, aszkorbinsav és citromsav alkalmasak. Mivel a hirudinvegyűletek szabad karboxilcsoportokkal rendelkező aminosavmaradékokat is tartalmaznak, ezek fémsót, különösen alkálifémvagy alkáliföldfémsót, például nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnéziumsót vagy ammóniából vagy valamilyen élettanilag elviselhető, szerves nitrogéntartalmú bázisból levezetett ammóniumsót képezhetnek. Mivel egyidejűleg szabad karboxilcsoportokat és szabad karboxilcsoportokat és szabad aminoceoportokat tartalmaznak, belső sókat is képezhetnek.

Az előállítás módjától függően a találmány szerinti vegyületeket szabad formában vagy savaddicióe sók vagy bázisokkal képzett sók formájában kapjuk. A savaddíciós sókból és a bázisokkal képzett sókból önmagában ismert módon, például a pH izoelektromos pontra való állításával kapjuk a szabad vegyületeket. Másfelől az utóbbiakat savakkal, illetve bázisokkal, például a fenti sókat képezókkel reagáltatva, majd bepárolva és liofilizálva terápiásán elviselhető savaddíciós sókat, illetve bázisokkal képezett sókat kapunk.

Deszulfatohirudin elleni monoklonális antitestek és ilyen antitesteket tartalmazó teszt-kittek

Az antitesteknek az a tulajdonsága, hogy specifikus antigéneket kötnek meg, a szervezeten kívül a gyakorlatban az antigének kvantitatív meghatározására (immun-assay) és tisztítására ' (immun-affinitás-kromatográfia) alkalmazható. Immunizált állatok széruma rendesen nagyszámú különböző antitestet tartalmaz, amelyek ugyanazzal az antigénnel a különböző kötőhelyeken eltérő affinitással reagálnak, ráadásul más antigének elleni antitesteket is, amelyek az egyed korábbi tapasztalatait tükrözik. Az antitestek sikeres alkalmazása az antigének meghatározására és tisztítására azonban nagy specifitást és reprodukálhatóságot igényel.

Ezeket a követelményeket teljesítő homogén antitestek a Köhler és Milstein (17) által leírt hibridoma-technikával hozzáférhetők. A technika elve az, hogy immunizált állatok antitestet kiválasztó B-limfocitáit, például a lépből, tumorsejtekkel összeolvasztjuk (.fuzionáljuk). A képződött hibridomasejtek egyesítik az osztódás általi korlátlan szaporodás képességét azzal a képességgel, hogy egységes típusú antitestet képezzenek és válasszanak ki. Szelektív közegben - amelyben a nem fúzionált tumorsejtek elpusztulnak, a hibridomasejtek azonban szaporodnak - történő tenyésztéssel és alkalmas manipulációkkal kiónokat, azaz egyetlen hibridomasejtból levezetett és genetikailag azonos sejtpopulációkat kaphatunk és tenyészthetünk és a sejtek által termelt monoklonális antitesteket izolálhatjuk.

A találmány deszulfatohirudin és hirudin elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridómasejtekre és előállítási eljárásukra vonatkozik. Előnyösek azok a hibridóma-sejtvonalak és az ezekből kiválasztott monoklonális antitestek, amelyek a deszulfatohirudinnal vagy hirudinnal specifikusán reagálnak. A találmány eljárás monoklonális anti-deszulfatohirudin- ée antihirudin-antitestek előállítására oly módon, hogy egereket deszulfatohirudinnal vagy hirudinnal immunizálunk, az ilyen módon immunizált állatok B-limfocitáit mielómasejtekkel fuzionáljuk, a képződött hibridómasejteket klónozzuk, majd in vitro vagy egérbe injektálva tenyésztjük és a kultúrákból antitestet izolálunk.

A találmány további immun-affinitás-kromatográfiás oszlopokra és ezeket az antitesteket tartalmazó immun-assay kittekre vonatkozik.

A találmány szerinti eljárással egereket, például Balb/c-egereket önmagában ismert módon immunizálunk. Meglepő módon az immunizálás sikerül, bár a deszulfatohirudin és hirudin viszonylag kis fehérjemolekulák. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában a hirudint vagy deszulfatohirudint hetenként vagy több hét, például 5-12 hét alatt nagyobb időközökben injektáljuk, mig elegendő számú antitest-termelő B-limfocita képződik.

Az immunizált egerek B-limfocitákat tartalmazó szerveit, például lépsejteket, kivesszük és olyan mielómasejtekkel egyesítjük, amelyek mutáció miatt szelektív tápkőzegben nem növekednek. Ilyen mielomasejtek ismeretesek például az X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 vagy SP 2/0 jelzésűek. A találmány előnyös kiviteli formájában immunizált egerek lépsejtjeit X63-Ag8.6.5.3 sejtvonal mielómasejtjeivel egyesítjük. A fúziót önmagában ismert eljárás szerint a B-limficiták és a mielomasejtek összekeverésével végezzük sejtfúziót kiváltó szer, például polietilénglikol, Sendai-virus, kalcium-klorid vagy lizolecitin hozzáadása közben. A fúzió előnyösen 1000 és 4000 molekulatömeg közt lévő polietilénglikol jelenlétében történik. A fúzió után a képződött hibrideket önmagában ismert eljárás szerint hipoxantin15

-1427

HU 202288 Β nal, aminopterinnel és timidinnel (HAT-közeg) kiegészített szelektív tápközegben tenyésztjük. A nem fuzionált mielómasejtek ebben a közegben nem képesek növekedni és ugyanúgy elpusztulnak, mint a normál limfociták.

A hibridóma-kultúrák felülúszóinak specifikus antitesttartalmát önmagában ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk, például radio-immunassay-vel és agglutinációval. Meglepő módon azt találtuk, hogy a leirt eljárással olyan hibridómasejteket kaphatunk, amelyek deszulfatohirudin és hirudin elleni specifikus antitesteket választanak ki.

A kívánt specifitású antitesteket termelő hibridómasejteket a fuzionálással előállított legkülönbözőbb hibridómasejtek keverékéből klónozással szelektáljuk ki. Ehhez önmagában ismert eljárással, amit határhigításnak (.Limiting dilution*) neveznek, egyetlen növekvő sejtből kiinduló kultúrákat képezünk.

Nagyobb mennyiség előállítása céljából a kívánt specifitású antitesteket termelő hibridóma-sejtklónokat vagy önmagában ismert közegben in vitro tenyésztjük vagy szaporítás céljából egerekbe injektáljuk. A találmány előnyös kiviteli formájában a hibridómasejteket pristonnal (2,6,10,12-tetrametil-pentadekán) előkezelt egerekbe injektáljuk, az ascites folyadékot levesszük és abból ammónium-szulfát-oldattal az antitestet kicsapjuk.

A hibridómasejtek segítségével kapott deszulfatohidrudin- és hirudinspecifikus antitesteket önmagában ismert módon immun-affinitás-kromatográfiás oszlopok előállítására alkalmazhatjuk. A találmány előnyös kiviteli formájában alkalmas hordozóanyagot (pufferoldatban szuszpendálva) antitest-oldattal elegyítünk, utána a nem kötődött részeket kimossuk és a hordozóanyag el nem foglalt helyeit blokkoljuk.

A hibridómasejtek segítségével kapott deszulfatohirudin- és hirudinspecifikus antitesteket önmagában ismert módon teszt-kittek előállítására alkalmazhatjuk. Ezek különböző módszereken alapuló teszt-kittek lehetnek, például radio-immundiffúzió, latex-agglutináció, foltpróbák, kompetitív vagy szendvics-radio-immunassay, enzimimmunassay, immun-fluoreszcens vagy immunkémiai enzimtesztek. Az ilyen kittek a különböző eredetű szokásos antitestek mellett enzimekkel vagy fluoreszcens reagensekkel kapcsolt antitesteket is tartalmazhatnak, ezenkívül radioaktív izotóppal, igy I^-dal jelzett, vagy enzimmel, például tormaperoxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal kapcsolt deszulfatohirudint vagy hirudint, továbbá szubsztrátot, alkalmas puffért, géleket, latexet, polisztirolt vagy más töltőanyagot és hordozóanyagot.

Gyögyszerkészí tmények

A találmány szerint előállítható ismert (.természetes hirudin) és új (például deszulfatohirudin) hirudinok értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak és mint az orvosi piócából extrahálható hirudin, profilaktikus vagy különösen terápiás kezelésre alkalmazhatók.

A találmány szerint előállítható deszulfatohirudin-vegyületek biológiai aktivitás szempontjából legalább egyenértékűek a természetes hirudinnal. igy például a deszulfatohirudin Ki-értéke kb. 10-¹¹ M. A deszulfatohirudin tökéletesen trombinspecifikus és a véralvadási rendszer többi proteinázával semmiféle kölcsönhatást nem mutat. Az aktív toxicitás rendkívül alacsony; igy patkányban például 1 g/kg dózis mellett nem állapítható meg semmilyen toxikus tünet. Hasonlóképpen nem figyeltünk meg semmilyen túlérzékenységi és allergiás reakciót sem.

A találmány szerinti új deszulfatohirudin-vegyületeket ennélfogva a természetes hirudinnal analóg módon trombózis és tromboembólia kezelésére és profilaxisárga, beleértve a postoperativ trombózis profilaxisát, akut sokk-terápiát (például szeptikus vagy politraumatikus sokknál), diffúz intravascularis koagulopathia kezelését, hemodializist, hemoszeparációt és extrakorporális keringésben alkalmazhatjuk.

A találmány tárgya hasonlóképpen olyan gyógyszerkészítmény, amely legalább egy találmány szerinti vegyületet vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját tartalmazza, adott esetben valamilyen farmakológiailag elfogadható hordozóval és/vagy segédanyagokkal együtt.

Ezeket az összetételeket különösen a fenti javallatokban alkalmazhatjuk, ha azokat például parenterálisan, igy intravénásán, intracutan, subcutan vagy intramuszculárisan, vagy helyileg adagoljuk.

A találmány hasonlóképpen vonatkozik az új vegyületek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények alkalmazására az emberi és állati test profilaktikus és terápiás kezelésében, különösen a fenti kórképek esetében, elsősorban a véralvadás gátlására az emberi és állati testen belül és kívül.

Az adagolás elsősorban a specifikus feldolgozási formától és a terápia, illetve profilaxis céljától függ. Az egységdózis nagyságát, valamint az adagolás tervét legjobb a mindenkori kóreset egyéni megítélése alapján meghatározni; az ehhez szükséges módszerek a releváns vérfaktorok meghatározására a szakember előtt ismertek. Normál esetben egy injekcióban a találmány szerinti vegyületek terápiás hatású mennyisége 0,005-0,1 mg/kg testtömeg dózistartományban van. Előnyös a 0,01-0,05 mg/kg testtömeg tartomány. Az adagolás intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióban tör16

-1529

HU 202288 Β ténik. Ennek megfelelően a parenterális adagolásra alkalmas gyógyszerkészítmények egységdózis formája az alkalmazás módjától függően dózisonként 0,4-7,5 mg találmány szerinti vegyületet tartalmaz. Ezek a gyógyszer-összetételek a hatóanyag mellett szokásos módon puffért, például foszfátpuffert, amelynek pH-értékét 3,5 és 7 között kell tartani, továbbá az izotónia beállításához nátrium-kloridot, mannitot vagy szorbitot tartalmaznak. Liofilizált vagy oldott formában lehetnek, mimellett előnyösek az antibakteriális konzerválószert, például 0,2-0,3% 4-hidroxi-benzoesav metil-észtert vagy etil-észtert tartalmazó oldatok.

A helyi alkalmazású készítmény lehet vizes oldat, arcvíz vagy zselé, olajos oldat vagy szuszpenziö, vagy zsírtartalmú vagy különösen emulziós kenőcs. A készítmény vizes oldat formájában például úgy kapjuk, hogy a találmány szerinti hatóanyagot vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját 4-6,5 pH-jú vizes pufferoldatban oldjuk és kivánt esetben további hatóanyagot, például gyulladásgátlót, és/vagy polimer kötőanyagot, például polivinil-pirrolidont és/vagy konzerválószert adunk hozzá. A hatóanyag koncentrációja 0,1-1,5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg 10 ml oldatban, illetve 10 g zselében.

Helyi adagolásra alkalmas olajos készítményt például úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületet vagy annak terápiásán elviselhető sóját olajban szuszpendáljuk, adott esetben duzzasztószerek, igy aluminium-sztearát, és/vagy felületaktív szerek (tenzidek), amelyek HLB-értéke (.hydrophilic-lipophilic-balance') 10 alatt van, Így többértékű alkoholok zsírsav monoésztereinek, például glicerin-monosztearát, szorbitan-monolaurát, szorbitán-monosztearát vagy szorbitan-monooleát hozzáadása közben. Zsírtartalmú kenőcsöt kapunk például a találmány szerinti hatóanyagok vagy sóik kenhető zsiralapban való szuszpendálásával, adott eeetben 10-nél kisebb HLB-értékű tenzid hozzáadása közben. Emulziós kenőcsöt a találmány szerinti hatóanyagok vagy sóik vizes oldatának lágy, kenhető zsiralapban való eldörzsölésével kapunk 10-nél kisebb HLB-értékű tenzid hozzáadása közben. Mindezek a helyi alkalmazási formák konzerválószert is tartalmazhatnak. A hatóanyag koncentrációja 0,1-1,5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg, körülbelül 10 g alapmasszában.

A fenti és ezekkel analóg gyógyszerösszetételek mellett, amelyek az ember vagy emlős testén közvetlenül orvosi használatra alkalmasak, a találmány az ember vagy az emlősök élő testén kívül orvosi alkalmazásra kerülő gyógyszerösszetételekre és készítményekre is vonatkozik. Ilyen összetételeket és készítményeket elsősorban olyan vérhez adott alvadásgátló adalékként alkalmazunk, amely a testen kívüli keringésnek vagy kezelésnek (például extrakorporális keringés vagy dialízis mesterséges vesében), konzerválásnak vagy modifikálásnak (például hemoszeparáció) van alávetve. Összetételükben az ilyen készítmények, igy a készletben levő ol5 datok vagy az egységdózis formájú készítmények is a fenti injekciós készítményekhez hasonlóak; a hatóanyag mennyiségét, illetve koncentrációját azonban célszerűen a kezelendő vérre, vagy még pontosabban annak trombintartalmára vonatkoztatjuk. Megfigyelhető, hogy a találmány szerinti hatóanyagok (szabad formában) 5-szörös mennyiségű trombint teljesen dezaktiválnak, még nagyobb mennyiségben is élettanilag ártalmat15 lan, és a keringő vérből nagy koncentrációban is nagyon gyorsan kiválnak, úgy hogy a túladagolás veszélye, például transzfúzióknál, nem áll fenn. A specifikus céltól függően az alkalmas dózis körülbelül 0,01-1,0 mg ha20 tóanyag/1 vér, mimellett a felső határ veszély nélkül még túlléphető.

A találmány különösen a példákban leirt, a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciákra, ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó expressziós plazmidokra, ilyen expressziós plazmidokkal transzformált mikroorganizmusokra, hirudin elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridóma sejtekre, és ilyen antitesteket tartalma30 zó immunassay teszt-kittekre, ezeknek a példákban leírt előállítási eljárására és a példákban a hirudin aktivitású polipeptidek transzformált mikroorganizmusok segítségével történő előállítási eljárására, valamint a pél35 dákban leírt új deszulfatohirudin-vegy Öletekre vonatkozik.

A következő példák kapcsán részletesen ismertetjük a találmányt a korlátozás szándéka nélkül.

Kísérleti rész

A példákban használt rövidítések jelentése a

következő:
TNE	oldat, amely 100 mmól NaCl-t, 50 mmól Trie-HCl-t pH = 7,5 és 5 mmól EDTA-t tartalmaz
SDS	nátrium-dodecil-szulfát
EDTA	etilén- d iamin-tetraecetsav
DTT	1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto- -2,3-butándiol)
BSA	marha- szérű malbumin
EtBr	etidium-bromid
Tris	trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán
Tris.HCl	a trisz-mono-hidrokloridja

1. J. Dodt et al., FEBS Letters 165, 180 (1984)

2. P Walsmann et al., Pharmazie 36, 653 (1981)

3. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983)

4. K.L. AgarwaI et al., Angew. Chem. 84,

489 (1972)

5. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 65

-1631

HU 202288 Β

6. R.L. Letsinger and W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)

7. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)

8. H.G. Khorana et al., J. Bioi. Chem. 251, 565 (1976)

9. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)

10. K. Itakura et al., J. Bioi. Chem. 257, 9226 (1982)

11. A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977); siehe auch Meth. Enzym. 65, 499 (1980)

12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)

13. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)

14. M. Mandel et al., J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)

15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. II, 3. Auflage,

S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (1983).

16. F. Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 47, 226 (1982,

17. Köhler und Milstein, Natúré 256, 495 (1975)

18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Láb., 1982, S. 125

19. W. Müller et al., J. Mól. Bioi. 124, 343 (1978)

20. M. Grunstein und D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979)

21. Ish-Horowitz, in loc. cit. 18), S. 368

22. DE-OS 3 111 405 (Genentech,

23. A.C. Peacock et al., Biochemistry 6, 1818 (1967)

24. U.K. Laemmli, Natúré 227, 680 (1970)

25. P. Walsmann, Pharmazie 36, 860 (1981)

26. J.F. Kearney et al., J. Immunoi. 123, 1548 (1979)

27. S. Alkan et al., Mól. Immunoi. 20, 203 (1983,

28. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam 1978

29. A.E. Bolton und W.M. Hunter, Biochem.

J. 133, 529 (1973,

30. J. Clarké und J. Carbon, J. Mól. Bioi. 120, 517 (1978,

31. J.Y. Chang et al., Methods in Enzymology, 91, 41 (1983)

32. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981,

1. példa

Védett nukleozid-polisztirolgyanta előállítása ml abszulút piridinben oldott 2,57 g (5 mmól, 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-OT-OH) 750 mg borostyánkösavanhidriddel és 910 mg 4-dimetil-amino-piridinnel elegyítünk és 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A piridines oldat bepárlása után 200 ml etil-acetátban felvesszük, kétszer egyenként 200 ml 0,1 M foszfátpufferrel, 10 ml telitett konyhasó-oldat hozzáadása közben kirázzuk, mégegyszer mossuk telített konyhasó oldattal, szárítjuk, bepároljuk és hexánt csepegtetünk hozzá. A kivált terméket elválasztjuk és kétszer éterrel eldörzsőljük, majd 300 ml etil-acetátban oldjuk és 0 °C-on 180 ml pH = 2,5-ös 0,1 M kálium-hidrogén-szulfáttal kirázzuk. Kétszeri vizes mosás utána az etil-acetátos oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, 0,5 ml piridinnel elegyítjük, bepároljuk és cseppenként hexánnal hígítjuk. A kivált borostyánkösav-származékot leszűrjük. Ebből a vegyületből 1,0 g-ot 190 mg N-hidroxi-szukcinimiddel együtt 4 ml etil-acetátban és 2 ml dimetil-formamidban oldunk és 0 °C-on 370 mg N,N’-diciklohexil-karbodiimiddel elegyítjük. Egy éjszakán át hűtőszekrényben való állás után a kivált Ν,Ν’-diciklohexil-karbamidot leszűrjük, a szúrletet etil-acetáttal hígítjuk, hideg 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonáttal és vízzel extraháljuk, szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetáttal kovasavgélen kromatografáljuk.

VRK: Rf = 0,45 diklór-metán: metanol (9:1) elegyben.

Ebből az N-szukcinimidoil-borostyánkősav-észterből 100 mg-ot 1 g amino-metil-polisztirollal (amintartalom 110 pmól/g) 2 ml diklór-raetán és 4 ml dimetil-formamid elegyében 20 órán át keverünk. A polimer gyantát leszűrjük és dimetil-formamiddal, metanollal, diklór-metánnal és metanollal kimossuk. Szárítás után a nem reagált aminocsoportokat acilezzük oly módon, hogy a gyantát 6 ml piridinben 1 ml ecetsavanhidriddel és 100 mg 4-dimetil-amino-piridinnel 30 percen át keverjük. A polimer gyantát diklór-metánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és diklór-metánnal kimossuk és súlyállandóságig szárítjuk. A spektroszkópiai metoxi-tritil(MMT)-meghatározás 57 pmól/g töltöttséget ad.

2. példa

Az 1. példával analóg módon állítjuk elő a kővetkező védett nukleozid-polisztirolgyantát:

*

MMT-O-G^-OCOCHzCHzCONHCHz---{ }---^(P)

5’-(4-metoxi-tiritil)-N-izobutiril-dezoxi-guazozinból, töltöttség 32 μπιόΐ/g.

-1733

HU 202288 Β

3, példa

A trinukleotid szintézise

a) A dinukleotid szintézise

7,73 g (15 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-O-T-OH) abszolút piridinnel kétszer bepárolunk. A maradékot 20 ml abszolút tetrahidrofuránban oldjuk és keverés közben és nedvesség kizárása mellett tetrahidrofuránnal készített 0,2 M 2-klór-fenil-di-(l-benztriazolil)-foszfét-oldat 80 ml-éhez csepegtetjük és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kapott 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát oldatát három részre osztjuk.

c<) Hidrolízis trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3'-foszfáttá:

A 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát fenti oldatának egyharmadához hűtés közben 100 ml 0,5 M trietil-ammónium-bikarbonátot adunk. 15 perc elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános oldatot vízzel mossuk, bepároljuk és cseppenként petroléterrel elegyítjük. A kapott csapadékot vákuumban szűrjük, 1:1 arányú éter-petroiéter eleggyel kimossuk és vákuumban szárítjuk.

VRK: Rf = 0,35 diklór-metán/metonol/viz (75:— 22:3) elegyben.

β) 2-ciano-etil-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfáttó észterezés és a 4-metoxi-tritil védöcsoport lehasítása:

2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-foszfát-oldat harmadához

1,3 mi 2-ciano-etanolt és 2 ml piridint adunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és többször kirázzuk pH = 7-es 0,1 M foszfátpufferrel és vízzel. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A csapadékot leszűrjük, 50 ml 7:3 arányú diklór—metán/metanol-elegyben oldjuk és 0 °C-on 3,8 g p-toluol-szulfonsav-monohidrát 75 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegygyel készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével a rekcióelegyet diklór-metánnal hígítjuk és hideg nátrium-hidrogén-karbonátoldattal kirázzuk. A szerves fázist bepároljuk és hexánnal elegyítjük. A kivált 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3'-foszfátot kovasavgélen diklór-metán/metanollal 96:4 kromatografáljuk.

γ) Kondenzáció 5’-(4-metoxi-tritil)-3’-cia-no-etil-bisztimidin-dinukleotiddá:

2,2 g 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3'-foszfátot kétszeri abszolút piridines bepárlással vizmentesitünk, 20 ml abszolút tetrahidrofurónban oldjuk és a 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát-oldat maradék harmadához adjuk. A reakcióelegyhez 18 óra elteltével szobahőmérsékleten jeges hűtés közben 10 ml vizet és 200 ml etil-acetátot adunk. A szerves fázist többször mossuk nátrium-hidrogén-karbonátoldattal és vízzel, nátrium-szulfáton szárítjuk és kis térfogatra bepároljuk. A foszfétrészben és az 5’-, illetve 3'-végen védett dinukleotidot 1:1 arányú éter/hexán-elegyben való becsepegtetéssel csapjuk ki.

VRK: Rf = 0,48 diklór-metán/metanolban (9:1).

b) A trinukleotid szintézise

1,17 g (1 mmól) fenti teljesen védett dinukleotidot 30 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegyben oldunk és jeges hűtés közben 1,9 g p-toluol-szulfonsav-monohidrát 20 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegygyel készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével jéghideg nátrium-hidrogén-karbonátoldatot adunk hozzá és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A kivállt nyers szabad 5’-hidroxilcsoportot tartalmazó dinukleotidot kovasavgélen diklór-metánban 2-8% metanol grádienssel kromatografáljuk.

VRK: Rf = 0,33 diklór-metán/metanolban (9:1).

Ebből az 5*-hidroxi-dinukleotidból 850 mg-ot és 1,06 g trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3'-foszfátot (vö. a(oC) szakasz) kétszer piridinnel bepárolunk, utána 10 ml abszolút piridinben oldjuk és 560 mg l-mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4-triazollal (MSNT) elegyítjük. 2 óra állás után 2 ml jéghideg vizet adunk hozzá és további egy óra elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-hidrogén-karbonáttal és vízzel mossuk, szárítjuk, bepároljuk és éterrel elegyítjük. A kivált trinukleotidot kovasavgélen kromatográfiával tisztítjuk.

Rf = 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1).

-1835

HU 202288 Β

4. példa

A 3. példával analóg módon állítjuk elő a következő (XI) általános képletül, rövidítve Β¹, Β², B³ védett trinukleotidokat. A Β¹, B², B³ nukleozidokra a következő rövidítéseket használjuk:

A = N-benzoil-dezoxiadenozin

C = N-benzoil-dezoxicitidin

G s N-benzoil-dezoxiguanozin

T = timidin.

Vegyület	R«*>	Vegyület	Rf»>
TTT	0,45	ATG	0,48
TTC	0,55	ACT	0,53
TCT	0,46	ACC	0,48
TAC	0,56	ATT	0,55
TGC	0,44	ACA	0,53
TAG	0,60	AAC	0,46
TGT	0,42	AAA	0,51
TGA	0,44	AGT	0,45
CTT	0,53	AGG	0,38
CTG	0,46	GTT	0,45
CCT	0,45	GTC	0,44
CCC	0,59	GTG	0,35
CCG	0,47	GCA	0,49
CCA	0,51	GCG	0,48
CAT	0,55	GAT	0,44
CAC	0,51	GAC	0,48
CGC	0,46	GAG	0,48
CGA	0,38	GAA	0,50
CAG	0,44	GGC	0,42
CGG	0,38	GGT	0,46
CGT	0,49	GGG GGA	0,35 0,44

“>vékonyréteg-kromatogram kovasavgélen diklór-metán/metanolban (9:1).

5. példa

A DNS-száll96/67) 96. számú bázistól a 162. számú bázisáig terjedő 67 bázishosszúságú DNS-fragmens szintézise

a) A trinukleotid 2-ciano-etil-védócsoportjának lehasítása

A 3. vagy 4. példa szerint előállított trinukleotidból 10 pmólt- a nedvesség kizárása mellett 60 pl 1:1:1 arányú piridin/acetonitril/trietil-amin-elegyben oldunk· 1 óra eltelte után szobahőmérsékleten 0,7 ml peroxidmentes étert csepegtetünk hozzá és a csapadékot lecentrifugáljuk. A nyers trietil-ammóniumsót 50 pl piridinben oldjuk, 0,5 ml éterrel mégegyszer kicsapjuk, lecentrifugáljuk és 15 órán át nagyvákuumban Bzáritjuk.

b) A részlegesen védett trinukleotidok kapcsolása a polisztirolgyantához kötött oligon ukleoti dlánccal

1. Metilén-klorid, 2 ml/perc, 4 perc.

2. Metilén-klorid (izopropanol/85:15), ml/perc, 2 perc.

3. 1 M cink-bromid és 0,02 M 1,2,4-triazol metilén- kloridf izopropanolban/85:15), ml/perc, 2-3,5 perc.

4. Metilén-k lor id (izopropanol/85:15), ml/perc, 4 perc.

5. 0,5 M trietil-ammónium-acetát DMF-ben, ml/perc, 5 perc.

6. Molekulaszitán szárított piridin, 2 ml/perc, 3 perc.

7. Tetrahidrofurán (peroxidraentes, molekulaszitán szárított) 2 ml/perc, 3 perc.

8. Nitrogénáram, 10 perc.

9. 150 pl piridinben oldott 10 pmól GTC trinukleotid (trimetil-ammóniumsó az

a) szakaszból) és 8,9 mg (30 pmól) 1-mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT) injektálása.

10. 45 °C, 20 perc.

11. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc.

12. 5% ecetsavanhidrid és 2,5% 4-dimetil-amino-piridin piridinben, 2 ml/perc, 4 perc.

13. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc.

14. Piridin-izopropanol (1:1), 2 ml/perc, perc.

Mind a 14 műveletet 21-szer ismételjük, mimellett a 9. műveletnél GTC helyett mindig a trietil-ammóniumsó formában lévő következő trinukleotidot (a/ szakasz) alkalmazzuk: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGG, TAC,

CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA,

TTC, GGG, CCT, CAT. A közepes kapcsolási kitermelés 97%. A végtermék struktúrája a következő: MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-polisztirol

c) A DNS-fragmens lehasítása a hordozóról és a védócsoportok lehasítása mg (kb. 0,60 pmól) komplementer DNS-szintézisgyantát 96/67 66 mg (0,40 mmól) o-nitro-benzaldoximmal és 50 pl (0,40 mmól) 1,1,3,3-tetrametil-guanidinnel 400 pl 95%-os piridinben 3 órán át 50 °C-on és 12 órán át szobahőmérsékleten tartunk. A piridin nitrogénnel való elfújása után a maradékot 1,6 ml vizes ammóniával (33%) elegyítjük és zárt edényben 24 órán át 50 °C-on tartjuk.

Az elválasztott folyadékfázist vákuumban megszabadítjuk az ammóniától és háromszor egyenként 3 ml peroxidmentes dietil-éterrel mossuk. A kismolekulájú alkotórészek Biogel P6 oszlopon (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 M trimetil-ammónium-hidrogén-karbonát pH = 7,5, 1,5 ml/perc) történő elválasztása után 285 OD-nyi (260 nm) DNST-t izolálunk. Összesen 60 OD mennyiséget HPLC20

-1937

HU 202288 Β

-oszlopon választunk el (PRP-l/Hamilton, 250x4,6 mm). Gradiens (A oldat: 0,05 M trietil-ammónium-acetát pH = 7,0; B oldat: A oldat/acetonitril 1:1): 30% B A-bán ->60% Β A-ban 20 perc múlva 50 °C-on, 2 ml/perc. A lipofil fócsúcsot (retenciós idó kb. 14 perc) gyűjtjük, DE52-cellulóz oszlopon (Whatman) koncentráljuk, eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A 4-raetoxi-tritil-védöcsoport lehasításéhoz a csapadékot 50 pl ecetsav/viz-ben (4:1) oldjuk és 45 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióterméket liofilizáljuk, etanollal kicsapjuk és 8%-os poliakrilamid gélen (7 M karbamid) elektroforetikus elválasztással tisztítjuk. A várt DNS-méretnek megfelelő sávokat kivágjuk, a terméket elektroeluáljuk, DE52-celluloz oszlopon koncentráljuk és az 5’-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3' struktúrájú DNS-t 96/67 etanollal kicsapjuk.

6. példa

Az 5. példával analóg módon állitjuk eló a következő (5’-3*) DNS-fragmenseket:

1/58

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT

46/64 komplementer

CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTACAACCTTCGCACAGGCACAGGTT

154/64 komplementer

CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

7. példa

Az 1/58, 46/64 komplementer, 96/67 és 154/64 komplementer fragmensek foszforilálésa

Az 5’-végek foszforilálésa és radioaktív jelzése (ή-³²?, ATP-vei és T< polinukleotid-kinázzal (Boehringer) az irodalomban (18) leírt módon történik.

8. példa

Polimerizáció duplex ΙΙ-vé (a deszuifatohirudin-gén Fi fragmense)

50-50 pmól kinázzal kezelt 96/67 fragmentet és kinázzal kezelt 154/64 fragmens 24 pl vízben oldunk, az oldatot 3 perc alatt 90 °C-ra melegítjük és 5 percen belül 12 °C-ra lehűtjük. 4 pl Endo-R puffer (0,1 M Tris. HCl pH = 7,5, 66 mM HgCk, 66 mM 0-merkapto-etanol, 0,6 M NaCl) hozzáadása után 10 pl dezoxinukleozid-trifoszfát-eleggyel (dATP, dCTP, dGTP, TTP, egyenként 2·10'³ M, ammóniával pH = 7-re beállított) és 2 pl (10 egység) DNS-polimeráz I, Klenow-fragmenssel (Boehringer, 30 percen át 12 °C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 °C-ra való melegítéssel állitjuk le és az elegyet további feldolgozásig -80 °C-on tartjuk. Analóg módon a kinázzal kezelt 1/58 fragmenst és a kinázzal kezelt 46/64 fragmenst duplex I-gyé (a deszulfatohirudin-gén Fi fargmense) reagáltatjuk.

Az I és II duplexek szerkezete a következő:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTC

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCAAG

TAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG

ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

A deszulfatohirudin-gén Fi és Fz fragmenseinek előállítását a következő ábra szemlélteti:

5. ábra: A deszulfatohirudin-gén Fi és

Fi fragmentjének és az Fi-Fi-DNS-nek az előállítása

9. példa

Az 1/58, a kinázzal kezelt 46/64, a kinázzal kezelt 96/67 és a 154/64 fragmensek polimerizációja és összekapcsolása; a deszulfatohirudin-gén előállítása

50-50 pmól 1/58 fragmenst, kinázzal kezelt 46/64 fragmenst, kinázzal kezelt 96/67 fragmentet és 154/64 fragmenst 48 pl vízben oldunk, az oldatot 30 perc alatt 90 °C-ra melegítjük és 5 percen belül 12 °C-ra lehűtjük. 8 pl Endo-R puffer (vö. 8. példa) hozzáadása után 20 pl dezoxinukleozid-trifoszfát-eleggyel (dATP, dCTP, dGTF, TTP, egyenként 0,002 M, ammóniával pH = 7,0-ra beállítva) és 2 pl (10 egység, DNS-polimeráz I, Klenow-fragmenssel (Boehringer, 30 percen át 12 °C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 °C-ra való melegítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformos extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk. A képződött DNS-elegyet 100 pl ligáz-pufferben (66 mM Tris. HCl pH = 7,5, 6,6 mM MgClz, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP) oldjuk, 50 egység (2 pl) T< DNS-ligázzal (Biolabs, elegyítjük és 20 órán át 20 °C-on inkubáljuk. A reakciót 5 perces 70 °C-ra való melegítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformoE extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk. Az elegy 8% poliakrilamid-gélen (denaturáló) elektroforézissel való elválasztása után a 217 bázispárt tartalmazó kapcsolási terméket elektroeluáljuk, DE52-cellulóz oszlo21

-2039

HU 202288 Β pon koncentráljuk és eluálás után etanolos kicsapással izoláljuk.

A deszulfatohirudin-gén szerkezete a kővetkező:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA

ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA

TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC

A deszulfatohirudin-gén előállítását a négy fragmensból a következő ábra szemlélteti:

6. ábra: A hirudin-gén előállítása a négy szintetikus fragmensból

10. példa

A deszulfatohirudin-gén Fi-fragmensét (1. ábra) tartalmazó pML 300 plazmid előállítása

a) A linearizált pBR322(EcoRl )Pvu vektor előállítása ug pBR322 plazmid-DNS-t 5 egyeég PVU II restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 100 Mg/ml zselatint tartalmazó oldat 200 ml-ében 1 órán át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldatot 100 mM Tris. Hcl-re (pH = 7,5), 50 mM NaCl-re állítjuk és a DNS-t 30 egység Eco Rí restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 2 órán át 37 °C-on emésztjük. Utána az oldatot 50 mM Tris-HCl-re pH = 8 állítjuk és 10 pg/ml DNS-koncentráció mellett 2 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimet az oldat 60 percen át 65 °C-on való melegítésével inaktiváljuk. Utána az oldatot TNE-re állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a megemésztett DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 °C-on egy éjszakán át kicsapjuk.

A pBR322 DNS-ból kimetszett vektort (pBR322/EcoRI/Pvu II, 2297 bázispár) Tris-acetát-EDTA pufferben pH = 8 oldott 1%-os alacsony olvadáspontú agarózon (Biorad) választjuk el a kis DNS-fragmenttől (2067 bazispár). Az agarózgélben a DNS EtBr-os festése után azt a géldarabot, amely a pBR322/ -EcoRI/PvuII vektor (=2297 bázispár) DNS-csikját tartalmazza, a gélből kivágjuk és 65 °C-on 10 perc alatt elfolyósitjuk. Ehhez a DNS-oldathoz 20 térfogat TNE-t adunk, a DNS-t Mueller és munkatársai (19) szerint DE-52 kromatográfiával tisztítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t -20 °C-on egy éjszakén át kicsapjuk. A DNS-csapadékot 50 pl 0,01 M Tris.HCl (pH = 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. 1,4 pg (= 3,2 pmól végek) DNS-t kapunk.

b) Az Fi-DNS/EcoRI előállítása ng (=1,3 pmól végek) kémiailag szintetizált Fi-DNS-t (lásd 8. példa) 5 egység EcoRl restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 50 pl 100 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 50 mM NaCl és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldathoz 0,06 Mg (= 0,14 pmól végek) linearizált pBR322/EcoRl/Pvu II vektort (lásd 10a. példa) adunk. Ezt követően az enzimet 65 °C-on való 10 perces melegítéssel inaktiváljuk, az oldatot TNE-re állítjuk és enol/kloroformmal extraháljuk. A DNS-t alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t alkohol alatt -20 °C-on további feldolgozásig tároljuk.

c) A pBR322/EcoRI/PVu 11 vektor-DNS kapcsolása az Fi-DNS/EcoRI-sel és pML300 plazmid megszerkesztése

A 10b) példában kapott DNS-csapadékot, amely a két említett DNS-fragmentet tartalmazza, 20 pl 50 mM Tris. HCI (pH = 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 25 egység/ pl Tí DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 °C-on 3 órán át. Ily módon az oldatban Fi-DNS-t tartalmazó pML300 rekombinált plazmid képződik.

d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML300 plazmiddal

A transzformációhoz szükséges kalciummal előkezelt E.coli HB101 sejteket (GIBCO AG 530 8260 5A katalógusszámon beszerezhető) Mandel és munkatársai (14) által leirt módon állítjuk elő.

A c) pont szerint kapott oldatot, amely a rekombinált pML300 plazmidot tartalmazza, 10 percen át 65 °C-on melegítjük, hogy a T< DNS-ligázt inaktiváljuk, majd 37 °C-ra lehűtjük. Ebből a reakcióelegyből 10 pl-t adunk 150 pl kalciummal kezelt E.coli HB101 sejthez 10 mM MgCh és 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) összetételű oldatban, 200 pl össztérfogatban.

Utána az elegyet 30 percen át jégbe hűtjük, 2 perc alatt 42 °C-ra melegítjük és utána 50 percen át 1 ml L-közegben (vö. 18. példa) 37 °C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet 0,2 ml-es alik vötök bán 5 agarlemezre (McConkey-Agar, Difco) szélesztjük, amelyek 60 pg/ml ampicillint (Serva) tartalmaznak. Az agarlemezeket utána 37 °C-on 16-18 órán át állni hagyjuk. A transzformált E.coli HB101 484 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk.

-214)

HU 202288 Β

e) Az Fi-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése

470 transzformált kolóniát (lOd. példa) B85 nitrocellulóz szűrőre (Schleicher und Schüll) nyomatunk. Grunstein és Hogness (20) szerint a kolóniákat oldjuk és denaturált DNS-üket rögzítjük a szúrón. Utána a szűrőt 20 ml [szűrőnként 4xSET (= 30 mM Tris.CHl /pH = 8/, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oldata], 0,1% (g/tf) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 Mg/1 denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 4 órán át 64 °C-on előhibridizáljuk. Ezután a nitrocellulóz-szúrőt 20 ml (szűrőnként) 5xSET (g/tf) Ficoll 400, 0,2% SDS és 50 Mg/ml denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 16 órán át 64 °C-on “P-radioaktiv jelzett mintával (kb. 103-10⁴ Cserenkov beütés szűrönként) kezeljük. Mintaként a 46/64 komplementer oligonukleotidot (vö. 6. példa) alkalmazzuk. Ezt követően a szűrőt 2xDET, 0,2% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten kétszer mossuk, majd kétszer 2xSET, 0,5% SDS összetételű oldatban 60 °C-on (először 30 percig, majd 60 percig). Utána a szűrőt 3 MM papir (Whatman) között szárítjuk és -80 °C-on erősitőfóliás (Intensifying screen, Ilford) röntgenfilme (Fuji) helyezzük 1-2 napra. A kapott autodiagram 71 pozitív kolóniát (kiónok) mutat, amelyek a további munkához alkalmazhatók, ezek közül az egyik a pML300 jelölést kapja.

11. példa

A deszulfatohirudin-gén Fz-DNS-ét tartalmazó pML305 plazmid előállítása (2. ábra)

a) A lineáriséit pBR322/BamHI/PvuII vektor előállítása

Mg pBR322 plazmid-DNS-t 30 egység BamHI restrikciós endonukleázzal 30 percen ót 37 °C-on 100 mM NaCl, 6 mM Trie.HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCh és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban emésztünk. Utána az oldathoz 15 egység PvuII restrikciós endonukleózt adunk és 2 órán ót 37 °C-on emésztjük. A reakcióelegyet 10 percen át 70 °C-on tartjuk, hogy az enzim inaktiválódjon. Utána a két DNS-fragmentet 1%-os alacsony olvadáspontú agarózon Tris-acetót-EDTA pufferben pH = 8 végzett gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól (ld. 10a. példa). A pBR322 BamHI/PvuII vektro (= 2672 bázispór, DNS-sávjait kivágjuk, elfolyósitjuk és Mueller és munkatársai (19) szerint DE-52 kromatográfiéval tisztítjuk. 0,75 MS (= 1,5 pmól végek) DNS-t kapunk.

b) Az Fz-DNS/BamHI előállítása

Mg (= 1,3 pmól végek) kémiailag szintetizált Fz-DNS-t (8. példa) 16 egység BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 20 m1 150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCh és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 °C—on emésztünk. Utána az oldathoz 60 ng (= 96 nmól végek) linearizált pBR322/BamHI/PvuII vektort (lla. példa) adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk, fenol/kloroformmal extrahóljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t további feldolgozásig -20 °C-on alkohol alatt tároljuk.

c) A pBR322/BamHI/PvuII vektor-DNS kapcsolása az Fz-DNS/BamHI-sel és a pML305 plazmid megszerkesztése

A llb) példában kapott DNS-csapadékot, amely mindkét említett DNS-fragmentet tartalmazza, 20 m! 50 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/Ml T< DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 °C-on 3 órán át. Ily módon az oldatban az Fz-DNS-t tartalmazó rekombinólt pML305 plazmid képződik.

d) E.coli HB101 transzformációja pML305 plazmiddal

A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leirt módon történik. 10 m1 12c, példában kapott reakcióelegyet alkalmazunk. 313 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.

e) Az Fz-DNS-t tartalmazó kolóniák eJlenórzése transzformált kolóniát (lld. példa) a lOe) példában leírt módon vizsgálunk Fz-DNS-re. Radioaktív mintaként a 154/64 komplementer oligonukleotidot (vő. 6. példa) alkalmazunk. Az autoradiogrammon Két pizitlv kolóniát kapunk, egyikük a pML305 jelölést kapja.

12. példa

A pML300 és pML3Q5 kiónok jellemzése

A pML300 és pML305 rekombináns plazmidok DNS-ét Ish-Horowitz szerint izoláljuk (21). Az inszertólt Fi-DNS, Fz-DNS nukleotidszekvenciáját Maxam és Gilbert eljárásával határozzuk meg (11). Ebből a célból 10-10 Mg pML300 plazmid-DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal és 10 Mg pML305 plazmid-DNS-t BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk és a linearizált DNS-eket agarózgélböl gélelúcióval izoláljuk (vö. 10a. példa). Utána az izolált

-2243

HU 202288 Β

DNS-eket alkalikus foszfatázzal megemésztjük és DE 52-kromatográfiával tisztítjuk (vö. 11a. példa). Ezután a DNS-eket az 5'-végen (?-³²P/ATP-vel) fajlagos aktivitás >5000 Ci/mmól, Amersham, és T« polinukleotid-kinázzal (P-L-Biochemicals) radioaktivan jelöljük. A radioaktivan jelölt DNS-eket ezután egy második restrikciós endonukleázzal (EcoRII) hasítjuk. A képződött DNS-fragmenteket agarózból gélelúcióval izoláljuk. A pML300 esetében az EcoRII-EcoRI* fragmentból (kb. 109 bázispár) az Fi-DNS nukleotidezekvenciáját, a pML300 esetében az Fz-DNS szekvenciáját az EcoRII-BamHP-fragmentben (kb. 122 bázispár) határozzuk meg. (‘a radioaktivan jelzett DNS-véget adja meg). Az Fi-DNS-re és Fí-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a 8. példában leírtakkal.

13. példa

A pML310 expressziós plazmid előállítása

a) trp-promoter-operátort tartalmazó linearizált pHRil48/EcoRl/BamHI vektor megszerkesztése (3. ábra és 4. ábra)

A. A pl59 plazmid megszerkesztése ug pBRHtrp (22) plazmidot 50 egység

EcoRI-gyel (Biolabas) 60 percen át 37 °C-on hasítunk, és a megemésztett fenolos extrakció után szacharóz-sűrűséggradiensen-(5-23%) 50 mM Tris.HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA-TST 41 rotorban (Kontron AG) frakcionáljuk. A centrifugálás 40 000 f/p-en és 15 °C-on 14 órán át tart. ISCO-gradiensgyűjtóvel 1 ml/p áramlási sebességgel 0,3 ml-es frakciókat szedünk. A kisebb fragmentet tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatot TNE-re állítjuk és 2 térfogat etanollal -20 °C-on kicsapjuk. A DNS-t centrifugálás után Eppendorf-csőben 100 m1 10 mM Tris.HCl pH = 7,5, 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Ebből a DNS—fragmentból 5 Mg—o' 6 “ység BglII-vel (Biolabs) hasítunk 60 percen át 37 “C-on. A reakcióelegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 °C-on 10 percen át inkubáljuk, a DNS-t centrifugálással gyűjtjük és újra 50 m1 50 mM Tris.HCl (pH = 8,0)-ban oldjuk. Ebből az oldatból kiveszünk 2 pl-t (0,2 Mg DNS) és 50 mM Trie.CHl-ben (pH = 8,0) 10 ng/nl DNS-koncentráció mellett 1 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 30 percen át 37 “C-on. Az oldat 60 percen ét 65 “C-ra való melegítésével az enzimet inaktiváljuk. Kiveszünk 0,04 Mg DNS-t és az 5'-véget 10 mCí (^-“PJ-ATP-vel (>5000 Ci/mmól), Amersham és 5 egység T« · polin ukleotid- kinázzal (P- L- Biochemicals) m1 reakciótérfogatban 50 mM Tris.HCl (pH = 9,5), 10 mM MgCh, 5 mM DTT összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on való in24 kubálással jelöljük. A radioaktív mintát a nem jelölt mintával (lásd fent) keverjük és a DNS-fragmenteket 5-23% szacharóz-sürűséggradiensen -50 mM Tris.HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA TST 60 rotorban frakcionáljuk. A centrifugálést 60 000 f/p-en 15 “C-on 5 órán át végezzük. 0,2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakció aktivitását a Cserenkov-sugárzás mérésével határozzuk meg és ezzel azonositjuk a fragmenteket. A kis DNS-fragmenst tartalmazó kivént frakciókat egyesítjük, a DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk és centrifugálás után ismét 20 m1 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk.

A ³²P-jelzett EcoRI-BglII DNS-fragmenst 0,2 egység Taql-gyel (Biolabs) 50 m1 térfogatban 10 percen át 37 °C-on részlegesen haeitjuk. A reakcióelegyet 0,2% SDS-re, 10% glicerinre, 10 mM EDTA-ra, 0,05 brómfenolkékre állítjuk és a DNS-fragmenseket 6%-os poliakrilamid-gélen Tris-borát-EDTA pufferrel (23) szétválasztjuk. Az autoradiogrammon azonositjuk a kívánt EcoRI-Taql fragmentet (a legnagyobb részfragraent) tartalmazó sávot. Ezt a fragmenst (L. lásd. 9. ábra) a gélből extraháljuk és tisztítjuk (19) és 10 m1 10 mM Tris.HCl pH = 7,5, 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk.

Akceptor-plazmidként ClaX-gyel és EcoRI-gyei hasított pBR322-t alkalmazunk; 2 Mg pBR322-t 4 egység Clal-gyel (Biolabs) 20 m1 reakciótérfogatban 60 percen át 37 °C-on emésztünk. A fehérjét fenollal extraháljuk, majd a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 °C-on 10 perc alatt kicsapjuk. A DNS-t centrifugáléssal gyűjtjük, majd 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen keresztül 37 “C-on 20 pl reakciótérfogatban megemésztjük. Utána az oldatot 2 térfogat 0,1 M Tris.HCl-val (pH == 8,7) elegyítjük és 1 egység borjú alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A foszfatázt ezután 65 °C-on 60 percen inkubálással inaktiváljuk. 100 ng akceptor-plazmidot 5 μΐ L-DNS-fragmenttel 15 m1 reakciótérfogatban 10 mM MgCh, 20 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ÁTP összetételű oldatban reakciótérfogat pl-ként 30 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs) 2 órán át inkubálunk. Ebből az oldatból 5 Ml^-t adunk egy olyan 200 m1 végtérfogatú elegyhez, amely 150 m1 kalcium-kloriddal kezel E.coli HB101 (14) tartalmaz 10 mM MgCh, 10 CaCh és 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) összetételű oldatban. Az elegyet 20 percen át jégben hűtjük, 1 percre 42 “C-ra melegítjük és 10 percen ét 20 “C-on inkubáljuk. 1 ml Trypton-táptalajt (a Trypton-táptalaj 10 g Bacto-Tryptont) (Difco); 1 g élesztőkivonatot (Difco)·, 1 g glükózt; (8 g NaCl-t és 294 mg CaClz-t tartalmaz 1 1 desztillált vízben) adunk hozzá és az elegyet 30 percen át 37 °C-on rázás közben, 300 f/p, inkubáljuk. Az elegyet két, 50 Mg/ml ampicillinnel (Sigma) kiegészített agarlemezre (McConkey agar,

-2345

HU 202288 Β

Difco; 0,6 ml/lap) visszük fel. A lemezeket 12-17 órán át 37 “C-on inkubáljuk.

különböző kolónia plazmid-DNS-ét a következőképpen izoláljuk:

A kolóniákat 10 ml, 50 Mg/ml ampicillinnel kiegészített Trypton-táptalajba oltjuk, mint fent, egy 25 ml-es Erlenmeyer lombikban. A kultúrákat 15-18 órán át 37 °C-on és 300 f/p-cel rázzuk. A sejteket centrifugálással (Sorval, HS-4 rotor, 10 perc, 4000 f/p, 4 “C) gyűjtjük össze. Kb. 0,1 g sejtet kapunk és ezt 1 ml 50 mM Tris.HCl-ben (pH == 8,0) újraszuszpendáljuk. 0,25 lizozimoldatot [10 mg/ml 50 mM Tris.HCl-ben (pH = 8,0); a lizozimot a Sigma hozza forgalomba] adunk hozzá és 0 “C-on való 10 perces inkubáláe utón 0,15 ml 0,5 M EDTA-t (pH = 7,5) adunk hozzá. További 10 perces 0 °C-on való inkubálás után 60 μΐ 2%-os Triton Χ-100-at (Merck, adunk hozzá. 0 “C-on való 30 perces állás után a mintát 30 percen át 4 °C-on 15000 f/p-n Sorvas SA-600 rotorban centrifugáljuk. A felülúszót 1 térfogat fenollal (telített TNE-re, fehérje mentesítjük. A fázisokat 10 percen ét 5000 f/p-n 4 °C-on végzett centrifugálással (Sorval HB-4 rotor) választjuk szét. A felsó fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. 25 ng/ml végkoncentráció eléréséig hasnyálmirigy RN-ázt (Singma; 10 mg/ml TNE-ben 10 percig 85 °C-on előmelegítve) adunk hozzá és az elegyet 40 percen át 37 “C-on inkubáljuk. Az oldatot utána 1 M NaCl-ra és 10% polietilénglikol 6000-re (Fluka, 20 percig 120 “C-on autoklávban kezelt) állítjuk és két órán ét -10 “C-on inkubáljuk. A csapadékot Sorval HB-4 rotorban (20 perc, 10 000 f/p, 0 °C) gyűjtjük és újból 100 pl TNE-ben oldjuk. A DNS-oldatot 1 térfogat fenollal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal 10 percen át -80 “C-on kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf-centrifugában történő centrifugálással gyűjtjük ée a DNS-t 20 μΐ 10 mM Tris.HCl (pH - 7,5) ée 0,5 mM EDTA összetételű oldatban ismét oldjuk. 10 ml kultúrából 8-10 pg plazmid-DNS-t kapunk.

A plazmid-DNS-eket a kővetkező restrikciós enzimekkel megemésztve analizáljuk:

0,5-0,5 pg plazmíd-DNS-t Hpal-gyel (Biolabs) valamint Hpal-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs), Clal-gyel (Biolabs) az enzimgyártó adatainak megfelelő szabvány előírás szerint hasítunk. A DNS-eket 1%-os agarózgélen 40 mM Tris. Acetát (pH = 7,8) 1 mM EDTA és 0,5 Mg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kivánt plazmidok egy Hpal-helyet tartalmaznak és a háromszori emésztés után a nagy DNS-fragment mellett 2 kisebb fragmentet eredményeznek, amelyek nagyobbak, mint a pBR322 kis EcoRI-Clal-fragmentje. Ezeknek a plazmidoknak az egyikét pl59-cel jelöljük (lásd 9. ábra,.

B. A pHRil45 plazmid megszerkesztése pg pl59-DNS-t 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs, 30 percen át 37 “C-on emésztünk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és centrifugálás után 10 μΐ 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az EcoRI-gyel emésztett DNS-t ezután 15 percen át 12 “C-on 5 egység DNS-polimerázzal (Klenow-fragmens) (Boehringer) kezeljük 10 mM MgCh, 10 mM ű-merkapto-etanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (PítL Biochemicals, 0,1 mM dTTP (P4L Biochemicals, összetételű oldatban. A polimerázt 5 perces 85 “C-on való inkubálással inaktiváljuk. A reakcióelegyet 20 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM MgClz, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) összetételű oldatban tízszeresre hígítjuk és reakcióelegy pl-ként 30 egység T< DNS-ligázzal 1 órán át 15 “C-on inkubáljuk.

ng DNS-sel E.coli-t transzformálunk (a fenti módon, és 50 Mg/ml ampicillinnel kiegészített McConkey-agarlemezekre visszük. 10 különböző kolóniából a fenti módon izoláljuk a plazmid-DNS-t. A plazmid-DNS-eket EcoRI-gyel való emésztéssel analizáljuk. A kivánt plazmidok EcoRI-rezisztensek. Az analízist a fent leírt módon végezzük. A kívánt plazmidok egyikét HR145-tel jelöljük. (9. ábra).

C. A pHRil48 plazmid megszerkesztése

Mg pHRil45 DNS-t 5 egység Clal-gyel (Boehringer) 60 percen át 37 “C-on kezelünk, majd fenolos extrakcióval fehórjementesitjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és utána 20 pl 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az elálló végeket a fenti módon DNS-polimeráz I (Klenow-fragmens)-el feltöltjük, azzal a változtatással, hogy dATP és dTTP helyett dCTP-t (P4L Biochemicals) és dGTP-t (P&.L Biochemicals) alkalmazunk. A polimerázt 5 perces melegítéssel 85 “C-on inaktiváljuk. A reakcióelegyet 2 térfogat 0,1 M Tris.HCl-lel (pH = 8,7) elegyítjük és 0,5 egység borjú foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 “C-on inkubáljuk. A reakció elegyet fenolos extrakcióval fehérjementesitjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 8 pl 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. A kémiailag szintetizált 5‘-GAATTCCATGGTACCATGAATTC-3’ képletű linker-DNS-t az 5’-végen foszforiláljuk oly módon, hogy 8 pmól linkért 5 uCi (?^MP,-ATP-vel (5500 Ci-mmól*¹ Aroersham) inkubálunk 30 percen át 37 °C-on 8 μ1 reakciótérfogatban, amely 0,1 mM γΑΤΡ-t (Sigma), 50 mM Tris.HCl-t (pH = 9,5), 10 mM MgCh-t, 5 mM DTT-t és 2 egység polinukleotid-kinázt (P&L Biochemicals) tartalmaz. A reakciót -80 “C-on való befagyasztással állítjuk le.

A radioaktív jelzett linkért utána 1 Mg Clal-gyel és foszfatázzal kezeljük és pHRi25

-2447

HU 202288 Β

145-DNS-sel (lásd fent) kapcsoljuk 20 μί reakciótérfogatban, amely 0,5 mM gATP-t (Sig— ma), 10 mM DTT-t (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl-t (pH = 7,8), 1 mM MgCb-t és 800 egység T< DNS-ligázt (Biolabs) tartalmaz. 15 °C-on 2 órán át inkubáljuk. A ligázt 85 °C-on 10 perces inku hálással inaktiváljuk. Utána 2 térfogat vizet adunk hozzá, a konyhasó koncentrációt 10 mM-ra állítjuk és 20 egység kPNI-et (Biolabs) adunk hozzá 30 perc alatt 37 °C-on. Fenolos és kloroformos extrakció után az elegyet 0,9%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (Biorad) 40 mM Tris.acetát (pH = 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 pg/ml etidium- bromid összetételű pufferben frakcionáljuk. Az UV-sugárzásban látható, hogy azonos nagyságú marker-DNS-sel megegyező mozgékonyságú sávokat szikével kivágjuk. A géldarabot 65 °C-on 5 perc alat megolvasztjuk, majd 37 °C-ra hútjük. Kb. 20 pl térfogatú oldatot kapunk. Az oldatból 5 pl-t kiveszünk és 400 egység Tt-ligázzal (Biolabs) inkubáljuk 12 órán át 15 °C-on 10 pl reakciótérfogatban, amely 0,5 mM ATP-t, 10 mM DTT-t, 10 mM MgCh-t, 20 mM Tris.HCl-t (pH = 7,8) tartalmaz. 1/10 térfogat 100 mM Tris.HCl-t (pH = 7,5), 100 mM CaCb-t és 100 mM MgClz-t tartalmazó oldatot adunk a ligáz-elegyhez (15 °C-on megszilárdul) és 65 °C-on 5 percig inkubáljuk. Utána az oldatot a fenti módon kalciummal kezelt E.coli HBlOl-sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített McConkey-agarlemezekre visszük. 10 különböző kolónia plazmid-DNS-ét a fenti módon izoláljuk, és a DNS-t a következő restrikciós enzimekkel analizáljuk: 0,5-0,5 pg plazmid-DNS-t egymásután KpnI-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs) hasítunk az enzimgyártó előiratai szerint. A hasítási terméket 1% agarózgélen 40 mM Tris.acetát (pH = 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 pg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt módon mindegyik plazmid egy-egy, a fenti enzimekhez tartozó hasítási helyet mutat. Az egyik plazmidot HRÍ148 jelöléssel látjuk el.

A HRÍ148 plazmid triptofán-promoter-operátort ATG-ig és vele egy riboszómális kötőhelyet tartalmaz. A hirudin gént akárcsak más heterológ géneket közvetlenül a plazmidban egyszer előforduló EcoRI, Ncol, KpnI-helyekre kapcsolhatjuk. Ez a szerkesztés lehetővé teszi a heterológ gének közvetlen összekapcsolását és kifejeződését anélkül, hogy az iniciációhoz és a transzlációhoz szükséges ATG jelenléte a megfelelő génen szükséges lenne. Ezt Ncol-gyel való hasítással és az elálló végek DNS-polimeráz I-gyel való feltöltésével a leirt módon, vagy Kpnl-gyel történő hasítással és az elálló végek Sí nukleázzal való eltávolításával könnyen elérhetjük. A HRÍ148 plazmid így egy széles körben alkalmazható expressziós plazmid.

D. A linearizált pURil48/EcoRI/BamHI vektor előállítása pg pHRil48 plazmid-DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal megemésztünk. A kimetszett pHRil48/EcoRI/BamHI vektort BÜrűséggradiens centrifugálással izoláljuk.

b) Az Fi-DNS/EcoRI/EcoRII és az F2-DNS/BamHI/EcoRII előállítása

I. Az Fi-DNS/EcoRI/EcoRII előállítása pg pML 300 plazmid DNS-t először 10 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal megemésztünk 50 pl 100 mM Tris.HCl (pH = = 7,5), 50 mM NaCl és 100 pg/ml zselatin őszszetételű oldatban 1 órán ét 37 °C-on. A linearizált DNS/EcoRI plazmid alikvot ját (0,5 pg) agarózgélből gélelúcióval izoláljuk (vö. 10a. példa) és (K*^KP/ATP-vel radioaktlvan jelezzük) (vö. 12. példa). A DNS/EcoRI plazmid fótömegét ezután a radioaktív jelzett DNS-sel összekeverjük, EcoRII restrikciós endonukleázzal megemésztjük és az EcoRI*DNS-fragmentet (109 bázispár) 8%-os poliakrilamidon gélelektroforézissel elválasztjuk. 200 pg Fi-DNS/EcoRI*/EcoRII-t gélelúcióval izolálunk.

II. Az Fi-DNS/BamHI/EcoRII előállítása pg pML305 plazmid DNS-t 10 egység BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Ennek a linearizált DNS/BamHl plazmidnak egy alikvotját (0,5 pg) agarózgélből gélelúcióval izoláljuk (vö. 10a. példa) és (γ'^Ρ)-tal radioaktivan jelezzük (vö. 12. példa). A DNS/BamHI plazmid fótömegét ezzel a radioaktív jelzett DNS-sel összekeverjük, EcoRII restrikciós endonukleázzal megemésztjük és az EcoRII-BamHI’DNS-fragmentet (122 bázispár) 8%-os poliakrilamidon gélelektroforézis8el elválasztjuk. 250 pg F2-DNS/BamHI‘/EcoRH-t izolálunk.

c) Az Fi-DNS összekapcsolása az Fi-DNS-sel és a pML310 expressziós plazmid megszerkesztése ng (= 473 nmól végek) Fi-DNS/EcoRI/EcoRII-t és 9 ng (= 495 nmól végek) Fz-DNS/BamHI/EcoRIJ-t 20 pl térfogatban T«-DNS ligázzal kezelünk és a 10c) példában már leírt módon. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot utána a 10c) példában leirt módon oldjuk és EcoRI- és BamHI-reetrikciós endonukleázzal megemésztjük. Az oldatot ezután TNE-re állítjuk és 30 ng (= 50 nmól végek) pHR148/EcoRI/BamHI vektor-DNS-t (vö. 13aD példa) adunk hozzá. Utána az oldatot ismét fenol/kloroform elegygyel extraháljuk és a DNS-t alkohollal ki26

-2549

HU 202288 Β csapjuk. A kicsapott DNS-keveréket a 10c) példában megadott módon T«-DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük. Az oldatban ily módon rekombináns plazmid képződik, amely beillesztett Fi-Fí-DNS-t (deszulfatohirudin-gén) tartalmaz.

d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML310 plazmiddal

A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leírt módon történik. A 13c) példában kapott reakcióelegyből 10 μΐ-t használunk fel. 420 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.

e, Az Fi-Fi-DHS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése

A lOe) példában leírt módon 18 transzformáit kolóniában (13d példa) megvizsgáljuk az Fi-Fí-DNS-tartalmat. Radioaktív mintaként az 5. és 6. példákban leirt oligodezoxinukleotidok keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammban 12 pozitív kolóniát kapunk, ezek közül ót a pML310, pML311, pML312, pML313, pML314 jelölést kapja.

14. példa

A pML310 klón jellemzése

A rekombinált pML310 plazmidban az Fi-Fz-DNS-szekvencia jellemzése a 12. példában leirt módon az Fi-Fz-DNS Maxam és Gilbert (11) szerint végzett szekvenálásával történik. 10 pg plazmid-DNS-t vizsgálunk. Az Fi-Fz-DNS nukleotidszekvenciája a szintetikus deszulfatohirudin-génre leírttal azonos.

15. példa

A pML315 expressziós plazmid előállítása

a) Az F\-DNS összekapcsolása az Fz-DNS-sel és a pML315 expressziós plazmid megszerkesztése

Mg (= 1(3 pmól végek), illetve 26 Mg (= 1,3 pmól végek) kémiailag szintetizált Fi-, illetve Fz-DNS-t (lásd 8. példa és I vázlat) 20 m1 térfogatban 50 mM Tris.HCl (pH = 8), 5 mM MgCh, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 Mg/ml összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on 5 egység EcoRII restrikciós endonukleázzal (Biolabs) megemésztünk. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk ée a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot utána a 10c) példában leirt módon oldjuk és Tí-DNS-ligázzal 3 órán át 15 °C-on kezeljük. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a 10b) példában leirt módon kicsapjuk. A DNS-csapadékot ezután oldjuk (vö.

10c példa) és EcoRI- és BamHI-restrikciós endonukleázzal 30 percen át 37 “C-on megemésztjük. Utána az oldathoz 70 ng (= 0,1 pmól végek) linearizált pHRil48/EcoRI/BamHI vektort (13aD példa) adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk és fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal extraháljuk. A kapott DNS csapadékot, amely mindkét DNS-fragmentet (Fi-Fz-DNS/EcoRI/BamHI és pHRil48/EcoRI/BamHI/ tartalmazza, 20 m1 50 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM

MgCh, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/jul Tí-DNS ligázzal (Biolabs) kezeljük 3 órán át 15 “C-on. Ily módon az oldatban a rekombináns pML315 plazmid képződik, amely az Fi-Fz-DNS-t (= deszulfatohirudin-gén) tartalmazza.

b) Az E.coli HB101 transzformációja a pML313 plazmiddal m1 PML315 plazmidot tartalmazó elegyet (15a példa) alkalmazunk a kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára. Kb. 236 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.

c) Az Fi-Fz-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése

A transzformált kolóniákat (15b példa) a 13e) példában megadott módon vizsgáljuk Fi-Fz-DNS előfordulására. Öt pozitív kolóniát kapunk, amelyeket pML315-pML319-el jelölünk.

16. példa

A pML320 expressziós plazmid előállítása

a) A szintetikus Ei-Ez-DNS összekapcsolása a pHRH48/EcoRI/BamHI vektor-DNS-sel

Mg teljesen szintetikusan elóáliitott deszulfatohirudin-gént Fi-Fz-DNS, (vö. 9. példa) 50 m! 100 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 50 mM NaCl és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldat 20 Ml-ében EcoRI, majd BamHI restrikciós enzimekkel megemésztünk. Az oldatot TNE-re állítjuk, majd 30 Mg (= 50 nmól végek) pHRil48/EcoRl/BamHl vektor-DNS-t (vö. 13aD példa) adunk hozzá. Az oldatot fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot a 10c) példában megadott módon T«-DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük. Ily módon az oldatban rekombináns plazmid (pML320) képződik, amely az Fj-Fz-DNS-t (hirudin-gén) tartalmazza.

b) Az E.coli HB101 transzformációja a pML320 plazmiddal

A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leírt módon 27

-2651

HU 202288 Β

történik. 10 >4 16a) példában kapott reakció-	Az M9-táptalaj összetétele a	következő:
elegyet alkalmazunk. 173 ampiciUin-rezisztens	NazHPO«-7HzO	13,25 g
kolóniát kapunk.	KHzPOs	3,0 g
	NaCl	0,5 g
c) Az Fí-Fi-DNS-t tartalmazó kolóniák el-	5 NHsCl	1,0 g
lenőrzése	CaCÍ2-2H2O	0,015 g
	MgSO«-7H2O	0,25 g
Megvizsgáljuk 11 transzformált kolónia	kazein-hidrolizátum	2,5 g
(16b. példa) F1-F2-DNS tartalmát a lOe) pél-	Bi vitamin	0,0099 g
dában leírt módon. Radioaktív mintaként az	10 glükóz	5,0 g
5. és 6. példákban leirt oligodezoxinukleoti-	ampicillin	0,1 g

dók keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammon 14 pozitív kolóniát kapunk. Ezek közül öt a pML320, pML321, pML322, pML323 ée pML324 jelölést kapja.

17. példa

A pML315 és pML320 kiónok jellemzése

A pML315 és pML320 plazmidokban az Fi-F2-szekvenciák jellemzése az F1-F2-DNS Maxam és Gilbert (11) szerint végzett szekvenáiásával történik a 12. példában leírt módon. Mindkét plazmid DNS-inszertjének nukleotidszekvenciája a szintetikus hirudin-gén szekvenciájával azonos.

18. példa

Hirudin-aktivitású polipeptidek szintézise olyan E.coli sejtekkel, amelyek rekombináns hirudin-géneket hordozó plazmidokat tartalmaznak

a)

Hirudin-aktivitású polipeptidek szintézise

Mind a 15 rekombináns deszulfatohirudin-gént tartalmazó kiónt, éspedig

E.coli	HB101	pML310, E.coli	HB101	PML311,
E.coli	HB101	pML312, E.coli	HB101	PML313,
E.coli	HB101	pML314, E.coli	HB101	PML315,
E.coli	HB101	pML316. E.coli	HR101	PML317,
E.coli	HB101	pML318, E.coli	HB101	PML319,
E.coli	HB101	pML320, E.coli	HB101	PML321,
E.coli	HB101	pML322, E.coli	HB101	pML323,
E.coli	HB101 pML324.

megvizsgáljuk hirudin-aktivitás képződésére. Ebből a célból a fenti kiónokat 5 ml L-táptalajban egy éjszakán át (16 óra) 37 °C-on és 250 f/p-en tenyésztjük. Az L-táptalaj összetétele a következő:

Bacto Tryptone 10 g

Bacto élesztő-kivonat 5 g

NaCl 5 g glükóz 5 g ampicillin 5 g

Az éjszakai kultúrából 1 ml-t a következő napon 25 ml M9-táptalajba viszünk át.

A tenyésztést 37 °C-on és 250 f/p-en addig folytatjuk, amíg a baktériumszuszpenzió kb. 0,9-1,0 optikai sűrűséget (ODsa) el nem ér. Utána a sejteket összegyűjtjük (a szaporító kultúra 5 ml-e) és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris.HCl (pH = 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraazuezpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozimkoncentrációra (Boehringer, állítjuk ée 30 percre jég közé tesszük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyaaztásával és váltakozó felengedésével a baktériumokat szétroncsoljuk. Ezt a műveletet ötször ismételjük, utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszót megvizsgáljuk deszulfatohirudin-tartalomra oly módon, hogy antitestekkel elegyítjük (vö. 18. példa) a felülúszót HPLC-vel vizsgáljuk vagy mérjük a trombin (15) gátlását. A kővetkező eredményeket kapjuk:

Baktériumkivonat	Deszulfato- hirudin képződése
E.coli HB101 pML310	+
E.coli HB101 pML311	+
E.coli HB101 pML312	+
E.coli HB101 pML313	+
E.coli HB101 pML314	+
E.coli HB101 pML315	+
E.coli HB101 pML316	+
E.coli HB101 pML317	+
E.coli HB101 pML318	+
E.coli HB101 pML319	+
E.coli HB101 pML320	+
E.coli HB101 pML321	+
E.coli HB101 pML322	+
E.coli HB101 pML323	+
E.coli HB101 pML324	+
E.coli HB101 pHRil48
(kontroll,
E.coli HB101 pBR322
(kontroll)	-
E.coli HB101
(kontroll)

-2753

HU 202288 Β

19. példa

A hirudin-aktivitás kimutatása

Kb. 5-10 μΐ mintát, amely hirudin-aktivitású polipeptidet (vö. 18. példa) 1 cm² nitrocellulóz-papírra (NC) (BIORAD) cseppentünk és 30 percig szobahőmérsékleten szárítjuk. Utána az NC-t 1 órán át 37 °C-on 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldatban inkubáljuk. Ezt követően az NC-t 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldatban 30 percig mossuk. Az oldatot 5-ször váltjuk. Utána a mosott NC-t 2 órán át 25 °C-on 2 Mg/ml hirudin elleni antitestet (nyúlból előállított, vagy monoklonális antitest) tartalmazó 3% szérumálbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH = 8) és 0,9% NaCl összetételű oldattal kezeljük. Utána az NC-t a fenti módon mossuk.

Utána az NC-t 2-3 órán át 25 °C-on 0,2 MCi/ml ^I-fehérje A-t (faji. aktivitás 89,8 MCi/mg) (NEN) tartalmazó 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris.HCl (pH -8) és 0,9 3 NaCl összetételű oldattal kezeljük. Utána az NC-t a fenti módon újból mossuk, szárítjuk és számlálóban/Multi Gamma, 1250 gamma counter, LKB, Wallace/ meghatározzuk a kötött radioaktivitást, ami az NC-n levő hirudin-aktívitású polipeptid mértéke. Egy alternatív eljárásban a mintát SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek (PAGE) vetjük alá. A PAGE-elektroforetogrammot elektro-blottinggal NC-ra visszük át. Ezutána az NC-t a fenti módon kezeljük és/vagy egy éjszakán át röntgenfilmmel (Fuji) autoradiograféljuk. Az NC-n a hirudin-aktivitású polipeptidet tartalmazó helyek a filmen fekete foltokként jelennek meg.

20. példa

A deszulfatohirudin izolálása és tisztítása trombin-oszlop segítségével

a) A polipéptidoldat előállítása a trombin-oszlophoz

150 ml táplevest (a 18. példa szerint kapottat) 4 °C-ra lehűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó nem tartalmaz hirudin-aktivitást.

Ezt követően a sejteket 12 ml oldó pufferben (50 mM Tris.HCl (pH = 8), 30 mM NaCl] szuszpendáljuk. Ehhez az elegyhez 15 mg lizozimot (Boehringer) adunk és utána 30 percen át 4 °C-on tartjuk. Utána a sejteket négyszeri lefagyasztással folyékony nitrogénben és ezt követő 37 °C-ra való felengedéssel elroncsoljuk. Ezt követően 30 percen át 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza a hirudin-aktivitást. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátot oldunk. A zavaros elegyet 4 °C-on 30 percen állni hagyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris.HCl (pH = 8) pufferben oldjuk és megkapjuk a kivánt polipeptidoldatot.

b) A hirudin tisztítása trombin-oszlopon

A trombin-oszlopot (4 ml ágytérfogat) 0,05 M Tris.HCl pH = 8 pufferei egyensúlyba hozzuk. A fenti polipeptidoldatot 0,5 ml-ee adagokban 4 °C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 25 ml 0,05 M Tris.HCl (pH = 8) pufferrel mossuk. Az első frakciók tartalmazzák a nem adszorbeált polipeptideket, ezeket eldobjuk. Ezt követően az oszlopot 10 ml 1,5 M benzamidin (Merc) (vö. 25), 0,05 M Tris.HCl (pH = 8) öszszetételű oldatban mossuk és a kapott frakciókat a trombin-teszttel (15) vizsgáljuk hirudin-ak ti vitásra. A polipeptideket tartalmazó frakciókat OD2so méréssel határozzuk meg. A

25. és 26. frakciók tartalmaznak hirudin-aktivitást; ezeket -20 °C-on tartjuk vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben. A hirudin-aktivitás a 25. frakcióban 20 Mg/ml és a

26. frakcióban 52 Mg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex G25-ön (Pharmacia) sómentesitjük.

A termék SDS-poliakrilamidgél-elektroforézise (24) kb. 7000-8000 Dalton molekulasúlyt és ennek egész-számú többszöröseit (oligomerek) adta.

c) A trombin-oszlop előállítása

Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) a gyártó adatai szerint hideg desztillált vízzel és pH = 8,5-ös kapcsolópufferrel (0,1 M NaHCOs/NazCOa-oldat) mossuk. A gél kapcsolópufferrel készített (4 ml) 50%-os szuszpenzióját múanyagcsóbe visszük, azonos mennyiségű tisztított trombin-oldattal (120 mg 4 ml kapcsolópufferben) (Calbiochem) elegyítjük és egy éjszakán át 4 °C-on forgatjuk. Utána a gélt kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad aktív helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gél ml-ként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-dal (pH = 8,0) kezeljük 3 órán át 4 °C-on, majd foszfátpufferrel készített, gél ml-ként 10 mM nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 °C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15s30 mg hirudin/ml gél.

Az affinitás-oszlop készítéséhez 4 ml kapott trombin gélt alkalmazunk.

-2855

HU 202288 Β

21. példa

Különböző E.coli törzsek transzformációja a pML310 plazmiddal és a transzformált gazdasejtek tenyésztése

A lOd) példában leírttal analóg módon az E.coli JA221, E.coli LM1O35 és E.coli W3110 102 törzseket a pML310 plazmiddal transzformáljuk. A transzformált kolóniákat a lOe) példában leírt módon vizsgáljuk az Fi-Fí-DNS előfordulására. 5, 3, illetve 5 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a következő jelöléseket kapják:

E.coli JA221/pML310/l

E.coli JA221/pML310/2

E.coli JA221/pML310/3

E.coli JA221/pML310/4

E.coli JA221/pML310/5

E.coli LM 1035/pML310/l

E.coli LM 1035/pML310/2

E.coli LM 1035/pML310/3

E.coli W3110 A 102/pML310/l

E.coli W3110A 102/pML310/2

E.coli W3110A 102/pML310/3

E.coli W3110A 102/pML310/4

E.coli W3110A102/pML310/5

Az említett kiónokat módosított M9-kö-

zegben tenyésztjük,	amelynek az összetétele
a kővetkező:
Na2HPO4-7HzO	9 g
KH2PO4	3 g
NaCl	0,5 g
NH4CI	3,5 g
CaCh-2H2O	0,015 g
MgSO4-7H2O	0,25 g
kazein-hidrolizátum	7,0 g
élesztőkivonat	5,0 g
Bi vitamin	0,0099 g
vas(III)-citrát	0,006 g
MOPS (3-morfolino-propán-
-1-szulfonsav)	34,0 g
glükóz	20,0 g
ampicillin	0,1 g
37 °C-on és 180 f/p-en addig folytatjuk
a tenyésztést, amíg	a baktériumszuszpenzió
optikai sűrűsége (ODez3) kb. 1-et el nem ér.

Ezt követően a sejteket (5 ml tenyészetből) összegyűjtjük és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris.HCl (pH = 8) és 30 mM NaCl öszszetételű oldatban ujraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozim (Boehringer) koncentrációra állítjuk és 30 percre jég közé helyezzük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyasztásával és 37 °C-ra való felengedésével a baktériumokat elroncsoljuk. Ezt a folyamatot ötször ismételjük. Utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. Mindegyik kiónt megvizsgáljuk hirudin-aktivitású polipeptid képződésére oly módon, hogy a trombin gátlást (15) mérjük. Mindegyik baktériumkivonatban megállapítottunk hirudin-aktivitást (300-600 ng/ml tenyészlé).

Például a következő hirudin-aktivitásokat mérjük:

Törzs	Hirudin- -aktivitáe (üg/l tápoldat)
E.coli LM1035/pML310/l	300
E.coli JA221/pML310/l	500
E.coli W3110Á102/pML310/l	600

22. példa

A transzformált E.coli 143110 A 102/pML310/l törzs fermentálása 5000 literes fermentorban és a tápleves feldolgozása

A 21. példában leírttal analóg módon egy 5000 1-es fermentorban 3000 1 módosított M9 táptalajon. E.coli W3110 Δ 102/pML310/l-sejteket tenyésztünk, mig a szuszpenzió kb. 10-13-as optikai sűrűséget (ODsu) el nem ér. A táplevest (pH = 7,4) 10 °C-ra hűtjük, és a sejteket oC-Laval BRPX-207 iszaptalanító berendezéssel kezeljük. A tiszta felülúszó nem tartalmaz hirudin-aktivitást, ezt eldobjuk. Az iszaptalanitás folyamán az iszapteret A oldópufferei (50 mM Tris.HCl, 30 mM NaCl, HCl-val pH = 8-ra állítva) folyamatosan rész-iszaptalanitjuk és végül a centrifugacsésze tartalmát (7 1) oldópuff errel való teljes iszaptalanitás közben kiürítjük. A kapott sejttömeget pufferrel 375 1-re állítjuk, a pH-ja 7,6. 5-10 °C-ra való hűtée után a szuszpenziót Dyno-malmon (Typ KD5) vezetjük keresztül, ami 4,2 1 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyönggyel van megtöltve. Ezzel elroncsoljuk a sejteket. Az így kapott szuszpenziót ecetsavval 2% ecetsavtartalomra (v/v) állítjuk és egy éjszakán át 10 °C-on keverjük. A 3,9 pH-jú szuszpenziót a fenti technikával iszaptalanitjuk. A 300 1 tiszta felülúszót ejtőfilmbe pár ló bán (teljesítmény 60 1 viz/óra) 35 1-re koncentráljuk. Az enyhén zavaros koncentrátumot centrifugáljuk és az így kapott tiszta felülúszót GR 81 PP membránnal (2,5 m² felület) felszerelt DDS = Láb 35 ultraszűrö berendezésben 2% ecetsavval szemben diafiltráljuk. A végtérfogat 31 1.

A tiszta fehécjeoldat 2 1-es alikvotját 96 1 ágytérfogatú Sephadex G50 oszlopra (KS 370 Pharmacia) visszük, mimellett az oszlopot 2% ecetsavval hozzuk egyensúlyba. A 15 1 eluátumban kapott fófrakciót ultraszűréssel töményítjük, majd vízzel szemben diafiltráljuk. A kapott tiszta, vizes oldatot liofilizáljuk. A feldolgozást a következő példákbanleirt módon végezhetjük.

-2957

HU 202288 Β

23. példa

Az E.coli W3110A 102/pML310/l törzs tenyésztése laboratóriumi méretekben

Az E.coli W3110 Δ 102/pML310/l 37 “C-on 24 órán át 200 f/p-el rázott lombikban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő (g/1):

Na2HPO«-7H2O 9,0

KH2PO< 3,0

NaCl 0,5

CaClj 0,015

MgSO<-7H2O 0,25 vaa(III)-citrát 0,006

MOPS 40

NH«C1 3,5 kazein-hidrolizátum 7,0 élesztőkivonat 5,0 cereloz (glükóz) 20 ampicillin 0,1

A közeg pH-értéke 6,54. A tenyésztés alatt 14,9-es optikai sűrűséget (ODeos) érünk el. A sejteket (a szaporító kultúra 50 ml-e) összegyűjtjük és 5 ml 50 mM Tris.HCl (pH = 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 5 g hűtött üveggyönggyel (átmérő 0,5 mm) vagy lizozimmal (Boehringer), végkoncentráció 1 mg/ml, 30-45 perc alatt időközönként Multi-Tube Vortexer-rel nagy intenzitással rázzuk. 0,5 ml elegyhez 0,5 ml 2%-os ecetsavat adunk és az elegyet 20 percig 4 °C-on 12 000 f/p-en centrifugáljuk. A felülúszót hiru din-aktivitásra vizsgáljuk (trombingátlás). A trombingátlási tesztet a következőképpen végezzük: A teszt a p-nitro-anilin Chromozym TH (tozil-glicil-prolil-arginin-4-nitroanilid-acetát) szubsztrátból való enzimatikus kihasitásán alapul. A képződött p-nitroanilint 405 nm-es kolorimetriásan mérjük (Micro-Elisa Autó Reader, Dynatech, Kloten). A tesztet simaaljú mikrotitráló lemezekben (Coster, Serocluster, Catalog Nr. 3590) végezzük. A reakcióidő 2 óra 37 °C-on inkubátorban. A tesztet 20 pl meghatározandó oldatot 30 pl töltőpufferrel (0,2 M Tris.HCl pH = 7,5, 1 M NaCl, 100 pg/ml marhaszérumalbumin) hígítunk és 20 pl enzim-oldattal (10 mg liofilizált trombin humán plazmából (Boehringer) 1 ml-ben oldva és a fenti töltőpufferrel kb. 1:400 arányban hígítva) és 150 pl szubsztrátoldattal [20 ng Chromozym TH Boehringer)] 4 ml .bidesztillált vízben oldva és a fenti töltőpufferrel 1:15 arányban hígítva) elegyítünk. Minden oldatot összehasonlító oldattal szemben, amely 70 pl töltőpufferből (ld. f.) és 150 pl szubsztrát-oldatból áll, és enzim-kontrolloldattal szemben, amely 50 pl töltőpufferböl, 20 pl enzimoldatból és 150 pl szubsztrátoldatból áll, mérünk. Az enzim-kontrolloldat OD«os-értéke 2 óra után 37 °C-on 100% aktivitást ad és kb. 0,8 t 0,2 legyen. A minta trombingátlását (%-bán) a képlet szerint számítjuk %-trombin- 100 x OD«s a mintáé gátlás = 100 - - ........

ODws az enzim- kontrolloldaté

A felülüszó trombin-gátlása 49,7%/20 pl.

24. példa

Tisztítási eljárás a hirudinvegyűletek dúsítására a táplevesből

A 22. példában leírttal analóg módon az E.coli W3110 Δ 102/pML310/l törzset fermentorban tenyésztjük. Utána a sejteket feltárjuk, lecentrifugáljuk és a töményitett felülüszót ecetsavas kezelés után ultraszürjük vagy dializáljuk. Az ily módon kapott oldatokat például ioncserélő kromatográfiával tisztíthatjuk.

a) Anioncseréló kromatográfia MONO Q oszlopon (Pharmacia) trombint gátló frakciók kinyeréséhez

8,5 ml fehérjeoldatot [20 mM Tris.HCl pH*= 7,5 (150 mM NaCl) a Pharmacia cég kromatográfiás rendszerével (.fást protein liquid chromatography FPLC) Mono Q oszlopra viszünk és a következő feltételek mellett eluáljuk. Kísérleti feltételek: Oszlop: Mono Q, 4,6 mm x 150 mm. A puffer: 20 mM Tris.HCl pH = 7,5; B puffer: 20 mM Tris.HCl/1 M NaCl. Lineáris sógradiens: A: 9 ml alatt 15% B pufferrel eluálni, 10,7 ml folyamán 70% B pufferre növelni. AUFS 1,0 280 nm-en, 1 ml-es frakciók. A kizárási térfogatban (1-10 frakció) egy nagy fehérjecsúcs elválik az utána eluálódó hidrudinvegyűletektől. A 17-23 frakciók a trombin tesztben 20-100% közötti trombingátlási mutatnak, mimellett a 92% gátlást mutató főfrakció (20. és 21. frakció) kb. 500 mM NaCl koncentrációnál eluálódik.

b) Anioncserélő kromatográfia DEAE cellulóz-oszlopon a hirudinvegyűletek dúsítására ml dializátumot anioncseréló kromatográfiának vetünk alá DE 53 (Whatman) oszlopon pH = 7,5-n (kromatográfiás feltételek: oszlop 1 x 5 cm (10 ml). Az eluáló puffer: 20 mM ammónium-acetát, 100 mM NaCl, pH = = 7,5. B eluáló puffer: 20 mM ammónium-acetát, 1 M NaCl, pH = 4. Lineáris sógradiens 4 oszloptérfogat A illetve B pufferenként. A hirudinvegyűletek 0,4 M NaCl koncentrációtól eluálódnak. A kimutatást trombingátlási teszttel végezzük.

c) Sómentesités P-6 DG .Desalting gél'-lel (Biorad)

110 ml dializátumot (20 mM Tris.HCl, pH = 7,5, koncentrált fehérjeoldat 2,6 1 felülúezóból) a 24b példában leírt módon DE 53

-3059

HU 202288 Β oszlopon elválasztunk. A hirudinvegyületek a 46. és 52. frakció között (150 ml) eluálódnak, elválasztva a különböző gyorsan eluálódó nem aktiv fehérjecsúceoktól, és az egyesitett frakciókat rotációs bepárlóval kb. 12 ml-re koncentráljuk. Az igy kapott tiszta fehérjeoldatot Biogel P-6 DG oszlopra visszük ée vizzel eluáljuk.

Kísérleti feltételek:

2,5 x 9 cm oszlop, álló fázis 45 ml Biogel P-6 DG sómentesitó gél, átfolyási sebesség 1,15 ml/perc, 4,6 ml-es frakciók. A sótartalmat vezetőképesség méréssel vagy ezüst-nitrátos próbával (AgCl-kicsapás) vizsgálhatjuk. A fó aktivitás a 7. és 10. frakciók között eluálódik, mimellett a kimutatást trombingátlási teszttel végezzük. A 8-10 (13,5 ml) frakciókat egyesítjük, rotációs bepárlóval 1 ml-re koncentráljuk és a tiszta oldatot 160 ml ágytérfogatú Sephadex G 50 fine oszlopra (Pharmacie) visszük, mimellett az oszlopot IX ecetsavva hozzuk egyensúlyba.

d) Gélszűrés Sephadex G 50 fine-en (Pharmacie)

Kísérleti feltételek: Oszlop: Sephadex G 50 fine (31 g), 2,5 cm x 64 cm, térfogat 310 ml; oldószer: IX ecetsav; átfolyási sebesség 43/ml/óra, 3,8 ml frakciók. AUFS: 0,1 282 nm-en. Papirsebesség 3,0 cm/óra. Az eluálódott aktivitást trombingátláei teszttel mutatjuk ki. Az 50 ml eluátumban (39-52 frakciók) kapott fófrakció gyorsabban eluálódik, mint az inaktív kisérló fehérje. (53-80 frakciók). Az aktív frakciók trombingátlása 80 és 100X gátlást mutat.

e) Kationcserélő kromatográfia CM-cellulőzon az aktiv oldott anyag elódúsitásához ml dializátumot [20 mM Tris.HCl, koncentrátum (1:20) 200 ml felülúszóból, 3 ml 4 N HCl-val pH = 2,0-re beállítva) kationcserélón (CM-cellulóz) elválasztunk. A hirudinvegyületek a kizárási térfogatban a 4-8 frakciókban eluálódnak. A kimutatást trombingátlási teszttel végezzük. Az 5. és 6. frakciókból vett 20 μΐ eluátum 89X, illetve 88X-os gátlást idéz el.

Kísérleti feltételek: oszlop: 1,5 x 8 cm, álló fázis: 19 ml CM-cellulóz (MZ-3146). Átfolyási sebesség 43 ml/óra, 3,8 ml-es frakciók. Lineáris sógradiens A puffer: 20 mM NHtóAc, 4 N HCl-val pH = 2-re beállítva, B puffer: 200 mM NHtóAc pH = 6,5 5-5 oszloptérfogat, AUFS 1,0 282 nm-en.

25. példa

A transzformált E.coli W3110 Δ 102/pML310/l törzs fermentálása és a tápleves feldolgozása

A 22. példában leírt módon egy fermentorban E.coli W3110 Δ 102/pML310/l sejteket 8 1 L táptalajban 5 órán át tenyésztünk, mig a szuszpenzió optikai sűrűsége (ODs25) kb. 5-öt ér el.

A táplevesből (pH = 7,2) lecentrifugált sejteket 10 °C-ra lehűtjük, lizozimos kezeléssel és többször (4x) váltakozó lefagyasztással folyékony nitrogénben és 30 °C-ra való felengedéssel feltárjuk. Az így kapott szuszpenziót (2,5 1) l,5X-os ecetsavval (2,4 1) hígítjuk és 30 percen át 4 “C-on keverjük. A kivált bakteriális fehérjéket és egyéb sejtalkotórészeket 30 percen át 4 °C-on 9000 f/p-en lecentrifugáljuk. A 3,2 1 felülúszót rotációs bepárlóban (Büchi) 320 ml-re koncentráljuk. A koncentrátumot egy éjszakán át 20 mM Tris.HCl-el (pH = 7,5) szemben dializáljuk és az enyhén zavaros dializátumot mégegyszer centrifugáljuk. A végtérfogat 300 ml. A tiszta fehérjeoldatot (0,02 M Tria.HC1 pH = 7,0) dietil-amino-etil-cellulóz-(De 53 Whatman) (20 g) oszlopra - agytérfogat 20 ml - visszük fel, mimellett az oszlopot A pufferrel hozzuk egyensúlyba (A puffer: 20 mM ammónium-acetát/100 mM NaCl, pH = 7,5). Először 1 oszloptérfogat (45 ml) pufferrel mossuk állandó áramlási sebességgel (43 ml/óra), majd lineáris sógradiessel 5-5 oszloptérfogat A pufferrel, illetve B pufferrel (B puffer: 20 mM ammónium-acetát) 4 M NaCl, pH = 5,0. A 100 ml eluátumban kapott, trombingátlási tesztben aktiv fófrakciót (24-26 frakció) egy éjszakán át 4 “C-on 20 mM Tris.HCl-lel (pH = 7,5) szemben dializáljuk, majd rotációs bepárlón 35 °C-on 5 ml végtérfogatra koncentráljuk. Az igy kapott tiszta vizes oldatot 160 ml ágytérfogatú Sephadex G-50 fine oszlopra visszük, mimellett az oszlopot (2,5 xx 64 cm Biorad) 5X ecetsavval hozzuk egyensúlyba. Az 50 ml eluátumban (5-7 frakciók, áramlás 50 ml/óra, 25 perc/frakció) kapott fóaktivitás rotációs bepárlóval töményltjük, majd fordított fázisú HPLC-s elválasztásnak vetjük alá. Az egyes frakciók alikvotját (500 μΐ) .speed vac’ koncentrátoron (Savant) 1:10 arányban koncentráljuk és fordított fázisú HPLC-s elemzéssel megvizsgáljuk deszulfatohirudin tartalmukat. Az oldatok deszulfatohirudin vegyületeket tartalmaznak. A 6. frakció (18 ml) tartalmazza százalékosan a legkisebb mennyiségű mellékkomponenst és az félpreparativ fordított fázisú HPLC segítségével tovább tisztítjuk. Kísérleti körülmények: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-oszlop, 10 x 250 mm; a 6 frakció alikvotjai (200 ul 1:10 arányban koncentrált) elválasztásonként; AUFS 0,5 220 nm-en; átfolyási sebesség ml/perc. Eluens: A. 0,lX trifluor-ecetsav, B: acetonitril/viz 8:2 + 0,07X trifluor-ecetsav, 1 perc 16X B, majd 40 perc alatt 64X B-re

-3161

HU 202288 Β növelni. Az igy kapott frakciókat vizzel 1:1 arányban hígítjuk és liofilizáljuk. A maradék tiszta deszulfatohirudin-vegyületekból áll.

26. példa

Az E.coli W3110 A 102/pML310/l fermentációjával kapott termékkeverék analízise

A 25. példa szerint kapott, trombingátlási tesztben aktiv frakciókat két különböző körülmények között végrehajtott HPLC-analizisnek vetjük alá.

a) Kísérleti körülmények 1: Nucleosil (MN) C 18, 5 pm RP-HPLC oszlop, 4,6 x 120 mm; 50 ul hirudinvegyület· elválasztásonként, Att. 6 214 nm-en; átfolyási sebesség: 1,2 ml/perc;

Eluens: A: 0,1% trifluor-ecetsav, B: acetonitril/víz 8:2 0,07% trifluor-ecetsawal, 2 perc 16% B, utána 30 perc alatt 64% B-re növelni. Ellennyomás: 107 bar. Egyperces időközökben frakciókat veszünk (összesen 30-at), amelyekkel elvégezzük a trombingátlási tesztet és az antitest tesztet (vö. 19. példa). A 12-15 frakciók aktivak. Ezenkívül a 14. frakció aktív hirudinvegyületének meghatározzuk az aminosavösszetételét, az N-terminálÍ6át és a C-terminálisát. Ezt a frakciót (14.) ezenkívül még deszulfatohirudinnal hasonlítjuk össze, amelyet a 28. példában leirt módon orvosi piócából származó természetes hirudin aril15 szulfatáz enzimmel való átalakításával kapunk. Az eredményeket az I. táblázatban foglaltuk össze.

I. táblázat

Frakció	Retenciós idő (perc)	Trombin- gátlás	%	Antitest teszt<	(cpm)
Fr 12	11,75	+	35	+
Fr 13	12,50	++		+
Fr 14	12,80	++	79	+	13850
Fr 15	13,14	+	27	+	12440
Kontroll	-	-	9	-	250
Deszulfato-
hirudin	12,8	++	86	+

Az E.coli W3110 Δ 102 kontrolltörzsei (.kontrollok*) nem aktivak sem a trombingátlási tesztben sem az antitesttesztben. Ilyen frakciókat a nem transzformált E.coli W3110Ó 102 törzsnek a 22. példában leirt feltételek között való tenyésztésével és a táplevesnek a 25. példa ezerinti feldolgozásával kapunk.

b) Kísérleti körülmények: 2: RP-HPLC-oszlop, Vydac 218 TP 5415 4,6 x 150 mm; 100 μΐ (1:10 arányban koncentrált) 6. frakció (vő. 25. példa) elválasztásonként; AUFS 0,1 214 nm-en; átfolyási sebesség 1,2 ml/perc; eluens: A: 0,1 trifluor-ecetsav, B: acetonitril/viz 8:2 + 0,07% trifluor-ecetsav. Gradiens: 2 percig 16% B, utána 3 perc alatt 20 3 B-re növelni, utána 15 perc alatt 25% B-re növelni, utána 27 perc alatt 64% B-re növelni. Ellen40 nyomás 160 bar.

A II. táblázatban a trombingátlási tesztben és az antitest-tesztben aktiv frakciókat tüntettük fel. A táblázat tartalmazza továbbá a frakciók Mono Q-oszlopról (anioncserélő kromatográfia) való eluálásához szükséges NaCl koncentrációkat mM-ben, valamint néhány frakció legnyagyobb hullámhosszú UV-elnyelési sávját. Minden frakció ezenfelül pozitív reakciót ad anti-hirudin-antitestekkel (vö. 30. példa).

-3263

HU 202288 Β

II. táblázat

Frakció szám	Retenciós idő (perc) RP-HPLC	Trombingátlás %	Antitest teszt Δ/cpm	FPLC	UV/A«x/ nM NaCl	Kitermelés Mg
1	15,63	97,8 ± 2	16Ί96	350	2238, 274	4
2	16,83	91,9 ± 2	14Ί57	390	275	1,6
3	18,43	79,9 ± 2	9’257			1
4	19,6	81,7 ± 5	1V877	420		1,5
5	20,6	50,4 ± 5	7’647	460		1,5
6	21,53	66,1 ± 5	9’584	500	273	1,5
Kontroll	-	0	508			-
PBS-puffer	-	-	66			-
Deszulfato-
hirudin	15,45	97,3 ± 2	15’400	350	274	ca.4.

27. példa

Az E.coli W3110 Δ 102/pML310/l törzs fermentálásával kapott deszulfatohirudin-vegyületek jellemzése 25

I. A 14 frakcióból (vó. 26. példa a .Kísérleti körülmények 1* között, I. táblázat) vagy az 1 frakcióból (vö. 26. példa .Kísérleti körülmények 2*, II. táblázat) származó hirudin- 30 vegyületet a kővetkezőképpen jellemezzük:

a) Az aminosavősszetétel meghatározása

Kb. 2,5 Mg hirudinvegyületet 6N HCl-lel 35 100 °C-on 24 órán keresztül hidrolizálunk, majd Chang és munkatársai (DABS-CL-módszer) (31) szerint analizáljuk. A hidrolizátum a következő összetételt mutatja:

Aminosav	Hidrolizátum	Aminosav	Hidrolizátum
Asp	9,8	(9)	Ile	1,8	(2)
Thr	4,2	(4)	Leu	3,9	(4)
Ser	4,4	(4)	Tyr	1,5	(2)
Glu	12,6	(13)	Phe	1	(1)
Pro	3,7	(3,	His	1,1	(1)
Gly	9,3	(9)	Lys	3,4	(3)
Val	3,5	(4)	Met	0	(0)
Cisztin	2,2	(2)	összesen		(65)

-3365

HU 202288 Β

b) Részleges szekvenciaanalizis pg (750 pmól) hirudinvegyületet klasszikus Edman-lebontásban vetünk alá és az N-terminális fenil-tio-hidantoin (PTH)-ami- 5 nosavakat RP-HPLC-vel meghatározzuk.

Eredmény:

Ciklus:	1	5
Aminosav:	Val Val Tyr Thr	Asp n.m. Thr
Ciklus: Aminosav:	10 Glu Ser Gly 11 15 Gin Asn Leu n.m.	Leu n.m. Glu
(n.m. nincs	meghatározva)

A vizsgált bioezintetikus hirudinvegyü- 15 let N-terminális szekvenciája következésképpen azonos a természetes hirudinéval (1).

c) A C-terminális aminosavak meghatározása karboxipeptidáz Y-nal való lebontás- 20 sál

A C-terminális aminosavak időfüggő lebontása karboxipeptidáz Y-nal a következő C-terminálist adja 25

65

- He - Pro - Glu - Glu - Tyr - Leu - Gin Az aminosavakat aminosav-analizátorral határozzuk meg. Azt találjuk, hogy a Tyr⁶³ nem szulfátéit (deszulfatohirudin). Az E.coli 30 W311Qál02/pML310/l transzformált törzs fermentációjával kapott főtérinek deszulfatohirudin, mint azt a szerkezeti adatok és a természetes hirudinból kapott deszulíatohirudinnal való összehasonlítás bizonyítják. 35

Π. A több fermentációs termék szerkezete még nem teljesen tisztázott. A 2-6. frakciókban (vö. II. táblázat) definiált vegyületekről van szó, amelyek a HPLC-s és FPLC-b adatok, valamint az UV-abszorpciós maximum 40 alapján kielégítően jellemezhetők. Biztonsággal állítható, hogy ezek a deszulfatohirudinhoz hasonló vegyületek, amelyek a deszulfatohirudintól szerkezeti mikroheterogenitásban (például eltérő kapcsolódott S-S-hidak) vagy 45 az N- illetve C-terminálison található módosításban (például N-terminális metionilcsoport, vagy acilezett, így formilezett vagy acetilezett N-terminális) különböznek.

Az E.coli LM1035/pML310/l, E.coli JA- 50 221/pML310/l és E.coli HB101/pML310 törzsek fermentációjánál is főtermékként a deszulfatohirudin azonosítható.

28. példa

Deszulfatohirudin elállítása természetes hirudinból összehasonlítási célokból

Természetes hirudint 2 mg/ml koncentrációban pufferben (0,1 M ammónium-acetát, pH = 5,5) oldunk. 20 Mg hirudinhoz (10 μί oldat) 100 m1 sómentesitett arilszulfatáz (Boehringer)-oldatot adunk, amely 16 Mg arilszul- 65 fatázt tartalmaz. 25 °C-on inkubáljuk és a reakciót HPLC-analízissel követjük. 6 órán inkubáció után a hirudin 90%-a deszulfatált. A képződött deszulfatohirudin retenciós ideje a 26. példában (.Kísérleti feltételek a') leirt körülmények között 12,8 perc és a 26. példában (.Kísérleti feltételek b.) leírt körülmények között 15,45 perc.

Az aminosavósszetétel, az Edman-lebontással végzett szekvenciaanalizis és a C-terminális aminosavak meghatározása karboxipeptidáz Y-nal történő lebontással a deezulfatohirudinra várt eredményt adják.

29. példa

Deszulfatohiru din - vegyületek expressziója élesztőben (S.cerevisiae)

Idegen fehérjék élesztőben való expressziója definiált expressziós rendszert igényel. Ez erős élesztő-promotert, előnyösen indukálható élesztópromotert, és alkalmas transzkripciós stopjelet tartalmaz a plazmidvektoron, amellyel az élesztősejteket transzformálhatjuk. A vektor olyan DNS-szekvenciákat, előnyösen éleszt 2 μ szekvenciákat is tartalmaz, amelyek nagyszámú másolatra vezető extrakromoszőmális replikációt biztosítanak. Ezekivül az élesztő számára szelekciós markert, előnyösen az élesztő LEU2 gént, és replikációs eredetű pBR322 DNS-szekvenciákat és szelekciós markert, előnyösen az ampicillin-rezesztencia gént kell tartalmaznia az E.coli-ban való alkalmazáshoz. Az ilyen vektorok ún. shuttle-vektorként E.coli-ban és élesztőben való szaporításhoz alkalmasak.

Ezeket a feltételeket teljesítő expreszsziós rendszert a 100,561 számú Európa szabadalomban írtak le és az élesztőben hatékony expresszió példáival illusztráltak. Idegen gének az élesztő savanyú foszfatázának indukálható PH05 promoterének kontrollja alatt fejeződnek ki élesztőből. A PH05 promoter, idegen gén és PH05 transzkripciós stopjel sorban vannak beépítve az élesztő pJDB207 vektorba, amely az élesztő 2 μ plazmid DNS-szekvenciáit, az élesztő LEU2 gént, az ampicillin-rezisztencia gént és az E.coli replikációs origót is tartalmazza. A pJDB207R/RH05-HIR expressziós plazmidot a következőképpen állitjuk eló.

a) A pJDB207 vektor fragmens izolálása

Mg pJDB2O7R/IF/oC-3/ (100.561 sz. Európai szabadalom) plazmidot BamHI restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A képzódó DNS fragmenseket (6,85 kb. és 1,15 kb.) etanollal kicsapjuk és 400 m1 50 mM Tris.HCl pH pufferben felvesszük. 4,5 egység borjúbél-foszfatázt (Boehrínger, Mannheim) adunk hozzá. Az elegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a foszfatázt 65 °C-on 1,5

-3467

HU 202288 Β órán át inaktiváljuk. Az oldatot 150 mM NaCl koncentrációra állítjuk, majd DE 52 (Whatman) anioncserélő oszlopra (100 pl térfogat) visszük, amit előzőleg 10 mM Tris.HCl pH = = 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA összetételű oldattal hoztuk egyensúlyba. Ugyanazzal a pufferrel végzett mosás után a DNS-t 400 pl 1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA összetételű oldattal eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A nagy 6,85 kb. BamHI fragmenst a kis fragmenstől 1,2%-os agarózgélen Tris-borát-EDTA pufferben pH = 8,3 választjuk el.

b) Az 534 bp PH05 promoter fragmens izolálása pg p31/R plazmidot (100 561 sz. Eur. sz.) EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A képződő 3 DNS-fragmenst 1,2%-os agarózgélen Tris-borát-EDTA pufferban pH 8,3 választjuk el. Az 535 bp BamHI-EcoRI fragmenst izoláljuk. Ez tartalmazza a PH05 promotert és a transzkripciós starthelyet.

c) Hírű dint kódoló szekvenciájú 206 bp

DNS-fragmens izolálása pg pML310 plazmidot (vő. 13c példa) BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal teljesen megemésztünk. A képződő két DNS-fragmenst 1,2%-os agarózgélen Tris-borát-EDTA pufferben pH 8,3 elválasztjuk. A 206 bp EcoRI-BamHI fragmenst izoláljuk.

d) A DNS-f ragmentek összekapcsolása

Az a-c) bekezdésben említett három DNS-fragmenst agarőzgél darabokból elektroelúcióval kapjuk, DE52 (Whatman) anioncserélón tisztítjuk, etanoilal kicsapjuk és vízben újraszuszpendáljuk.

0,1 pmól (0,45 pg) 6,85 kb BamHI vektorfragmentet, 0,3 pmól (0,1 pg) 534 bp BamHI-EcoRI PH05 promoterfragmentet és 0,25 pmól (34 ng) 206 bp EcoRI-BamHI fragmentet a pML310-ből 15 pl 60 mmól Tris.HCl pH = 7,5, 10 mmól MgCh, 10 mmól ATP s 600 egység T4 DNS-ligáz (Biolabs) összetételű oldatban 15 °C-on 16 órán át kapcsolunk.

transzformált, amp* kolóniát 100 pl/ml ampicillint tartalmazó LB közegben külön tenyésztünk. A piazmid DNS-t Holmes és munkatársai (32) módszerével izoláljuk ée HindlII/EcoRI kettős emésztéssel analizáljuk. Körülbelül 600 bp nagyságú EcoRI-HindlII fragment megjelenése arra mutat, hogy az illető klón a pH05 promote-hirudin DNS-fragmentet a transzkripciós stopjelhez képest helyes orientációban tartalmazza a vektoron. A várt módon a kiónok körülbelül 50%-a helyes orientációban tartalmazza az inszert DNS-t. Ezeknek a kiónoknak az egyike pJDB207R/PH05-HIR jelölést kap.

e) A Saccbaromyces cerevisiae GRF18 transzformációja

Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset (oC, his3-ll, his3-15, leu-2-3, leu2-112, can^B) pHDB207R/PH05-HIR plazmiddal transzformálunk Hinnen és munkatársai (12) leirása szerint. A transzformált élesztősejteket leucint nem tartalmazó élesztő minimálkózeggel készített agarlemezeken szelektáljuk. Egy transzformáit élesztőkolóniát izolálunk és Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR jelöléssel látjuk el.

f) Az S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR tenyésztése

Az S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR sejteket 20 ml élesztő minimál táptalajon (Difco Yeast Nitrogén Base aminosavak nélkül, hozzáadva 2% glükóz és 20 mg/ml L-hisztidin, 30 “C-on rázzuk és 3.10’ sejt/ml sejtsűrúségig tenyésztjük. A sejteket 0,9% NaCl-oldatban mossuk, majd 50 ml-es kultúrák alacsony Pt-minimál táptalajba való átoltásához használjuk.

Az alacsony Pt-minimál táptalajt a Difco Yeast Nitrogén Base Médium (aminosavak nélkül; gyártja a Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) összetételének megfelelően készítjük, ez 0,03 g/1 KH2PO«-et, 1 g/1 KC1-ot, (NH4/2SO4 helyett 10 g/1 L-aszparagint, 2% glükózt és 1 g/1 L-hisztidint tartalmaz. A kultúrákat 4.10* sejt/ml sejtsűrűségig oltjuk át és 30 “C-on 24 órán át 200 f/p-en rázzuk.

g) Az S, cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR fermentációjával kapott termékkeverék analízise

A sejteket (vő. 29f példa) a szokásos módon feltárjuk (vő., pl. 100,561 számú európai szabadalom). Az 1,5% ecetsavval kezelt felülúszót centrifugáljuk és a tiszta oldat 2-2 ml-ét .Speed Vác’ koncentrátorban és nagyvákuumban szárítjuk. A mintákat egyenként 100 pl vízben oldjuk és HPLC-analízisnek (feltételek: mint a 26a példában) vetjük alá. Az egyes frakciók trombingátlását teszteljük. A 12,8 perc retencióe idejű frakció 89,6% trombingátlást mutat. Az aminosav-öszBzetétel alapján ez deszulfatohirudin.

-3569

HU 202288 Β

30. példa

Monoklonális anti-hirudin-sntitesteket tartalmazó teszt-kitt hirudin meghatározásához, kompetitív radio-immunassay

a) Monoklonális anti-hirudin-antitest előállítása

A) Egerek immunizálása

Liofilizált, tiszta hirudint (3 mg/kevée 0,1%-os ecetsavban oldunk, majd foszfátpufferral készített konyhasó-oldattal 3' ml-re egészítjük ki. A pH-t 7,2-re állítjuk. Ennek az antigén-oldatnak az adagjait azonos mennyiségű komplett Freund adjuvánssal vagy foszfátpufferral készített söoldattal elegyítjük.

Balb/c nőstény egerekbe (8 hetesek, a Sisselni állatfarmról, Svájc) 100 pg hirudint tartalmazó foszfátpufferral készített sóoldatot injektálunk. Négy nappal később kivesszük a lépet a fúzióhoz.

B) A hibridóma és az antitest-teszt előállítása

A hibridómasejteket a kapott lépsejtek X63-Ag8.6.5.3 (26) myeloma-sejtvonallal való összeolvasztásával állítjuk elő. 10⁸ lépeejtet és 10’ myelőmasejtet alkalmazunk. A fúziót a leirt módon (27) végezzük.

Az anti-hirudin aktivitást a hibridóma felületű ezóban radioimmunsassay segítségével határozzuk meg (RIA), (28).

C) Az anti-hirudin-antitest izolálása és tisztítása ascitesből

Balb/c egereket 0,4 ml Pristan.nal (Cári Roth) intraperitoneálisan előkezelünk. Egy héttel kéeóbb 2 - 5x10® klónozott hibridóma sejtet injektálunk intraperitoneálisan. Mindegyik egérből ismételten ascites folyadékot veszünk, és -80 °C-on lefagyasztjuk. Az öszszegyújtőtt folyadékot felengedjük és 30 percen ét 4 °C-on 16 000 f/p-en centrifugáljuk. A zsirt leszívjuk és a visszamaradó törmelékmentes felülúszóhoz lassú keverés közben 0 °C-on 0,9 térfogatekvivalens telített ammónium-szulfát-oldatot csepegtetünk. A kapott nyers immunglobulin frakciót 0,1 mól Tris.HCl (pH 8,2) pufferral Sephacryl G 2000 (Pharmacia) oszlopra visszük a gyártó adatai szerint.

Az aktív frakciókat egyesítjük és Amicon XM 50-szürővel (Amicon) koncentráljuk.

b) Teszt kitt kompetitív radio-immunassay-hez

Anti-hirudin antitestek 30aC/példa szerint előállított oldatát foszfát-pufferral készített konyhasó-oldattal (PBS-oldat) 1 pg/

100 pl koncentrációra hígítjuk. Ebból az oldatból 100 pl-t 2 órán át 37 °C-on műanyag csövecskében vagy műanyag mikrotitráló-lemezen inkubálunk, mimellett az antitestek nem specifikusan a műanyag felületre adszorbeálódnak. A műanyag felületen a még' szabad, aktív helyeket marhaazérum-albuminoldattal (BSA-oldat) utánkezelve telítjük. A vizsgálandó mintaoldat vagy a standard oldat BSA-oldattal készített hígítást sorát egyenként 50 pl, radioaktív ^I-dal ismert módon (29) jelzett, 50 pl-enként 10 000 beütés/perc aktivitású hirudin oldattal elegyítjük, majd a műanyag-felületen 2 órán át 37 °C-on, és utána 12 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A csöveket vagy mikrotitráló lapokat foszfátpufferral készített söoldattal mossuk, és mérjük a radioaktivitást. A mintaoldat hirudinkoncentrációját standardoldattal mért kalibrációs görbével határozzuk meg.

A leirt radio-immunassay-hez alkalmas teszt kitt tartalmaz:

ml anti-hirudin antitest oldatot (a 30aC/példa szerint), amelynek a koncentrációja 1-10 mg/ml, 100 ml foszfát-pufferral készített sóoldatot (PBS-oldat),

100 ml 0,3% marhaszérum-albumint és 0,1% nátrium-azidot PBS-oldatban (BSA-oldat), ml radioaktív hirudin oldatot, amelynek aktivitása 200 000 beütés/perc, ml standardoldatot, amely 100 ng/ml hirudint tartalmaz, 1 ml-es műanyag csöveket vagy műanyag mikrotitráló lapokat.

31. példa

Deszulfatohirudin-vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmény parenterális alkalmazáshoz

A 27. példa szerint előállított deszulfatohirudin-vegyületet tartalmazó oldatot 0,9%-os NaCl-oldattal szemben dializáljuk. Az oldat koncentrációját ugyanazzal a NaCl-oldattal hígítva 0,2 mg/ml-re vagy 2 mg/ml-re állítjuk. Ezt az oldatot ultraszűréssel (0,22 pm pórusú membrán) sterilizáljuk. A sterilizált oldat közvetlenül alkalmazható például intravénás adagolásra. Analóg módon állítunk elő parenterálisan alkalmazható oldatokat, amelyek a 27. példa szerint előálUtott deszulfatohirudin-vegyületeket tartalmaznak.

-3671

ÖSSZEFOGLALÁS

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   A találmány a trombin-inhibitor hirudin aminoaavazekvenciáját kódoló DNS-szekvenciákra, az ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó hibridvektorokra, a hibridvektorokkal transzformált gazdasejtekre, a transzformált gazdasejtekból előállított trombin-inhibitor aktivitású új polipeptidekre, ezeknek a DNS-szekvenciáknak, hibridvektoroknak és transzformált gazdasejteknek az előállítási eljárására és a trombin-inhibitoroknak a transzformált gazdasejtekkel történő előállítási eljárására vonatkozik. A találmány szerint előállítható hirudinvegyületek értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak.

   1. Eljárás deszulfatohirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák és fragmenseik előállítására, azzal jellemezve, hogy a deszulfatohirudin-gán kódoló és komplementer szálának szegmenseit kémiailag szintetizáljuk és a kapott szegmenseket enzimatikusan egy deszulfatohirudin strukturgénné vagy annak fragmensévé alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

   a) alkalmasan védett dezoxinukleotidot szilárd hordozón rögzítünk,

   b) alkalmas védett di- vagy trinukleotidokat állítunk elő a foszfotriészter módszerrel,

   c) a hordozó rögzített dezoxinukleotidot vagy oligodezoxinukleotidot alkalmas védett mono- vagy (b) szerint előállított di- vagy trinukleotiddal kapcsolunk össze a foszfotriészter-módszer segítségével,

   d) a c) pont szerint kapott, hordozó rögzített 20-70 bázis hosszúságú oligodezoxinukleotidot a hordozóról lehasitjuk, adott esetben tisztítjuk, a védőcsoporttól megszabadítjuk és a szabad 5’-terminális hidroxicsoportot foszforiláljuk, el) a kódoló és a komplementer szálból származó, egyenként körülbelül 20-70 bázis hosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedd bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anellálunk ás a négy dezoxinukleozid-trifoszfét jelenlétében DNS-polimerázzal kettős szálú DNS-szegmensekké (a deszulfatohirudin-gén fragmenseivé) egészítünk ki, és adott esetben a d) eljáráslépés szerint foszforilált alkalmas végekkel rendelkező két kettős szálú DNSszegmenst ligázzal deszulfatohirudin etrukturgénné kapcsolunk össze, vagy két kapott kettős szálú DNS-szegmenst megfelelő vektorokba szubklónozunk, majd a d) eljáráslépés szerint foszforiláljuk és ligázzal deszulfatohirudin strukturgénné kapcsoljuk össze, vagy e2) alternatív módon a kódoló és a komplementer szálból származó körülbelül 20-70 bázis hosszúságú és egyenként legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó két oligodezoxinukleotidot anellálunk, a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal feltöltünk és ligázzal deszulfatohirudin strukturgénné kapcsolunk össze.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti ejárás olyan (I) általános képletű DNS-szekvencia - ahol a képletben a nukleotidezekvenciét az 5'-végével kezdődően ábrázoljuk ás mindegyik triplett által kódoló aminosavat megadunk, és ahol

   A dezoxiadenozil,

   T timidil,

   G dezoxiguanozil,

   C dezoxicitidil,

   X A, T, C vagy G,

   Y T vagy C,

   -3773

   HU 202288 Β

   2 A, T, C vagy G, ha Y = C, vagy Z = A vagy G, ha Y = T,

   Q T vagy A,

   R C és S = A, T, C vagy G, ha Q = T, vagy R = G, és S = T vagy C, ha Q = A,

   M A vagy G,

   L A vagy C,

   N T, C vagy A,

   K A vagy G, ha M = A, vagy K = A, ha M = G, jelentésű és (X’)n és (X*)· nukleotidszekvenciákban n és m nagyobb mint 3 és kisebb mint 100, különösen nagyobb, mint 5 és kisebb mint 15 jelentésű - előállítására, amelyet egy restrikciós enzim képes felismerni és elhasitani, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körnek megfelelő DNS-szekvenciát szintetizáljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, a (II) általános képletű DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körnek megfelelő szekvenciát szintetizáljuk.
5. 5. Eljárás a deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektor előállítására, amelyet egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy az expressziós vektorral transzformált gazda egy hirudin-aktivitású polipeptidet fejez ki, azzal jellemezve, hogy expressziós kontroliszekvenciát tartalmazó vektor DNS-be egy az 1-4. igénypontok bármelyike Bzerint előállított deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvenciát úgy illesztünk be, hogy azt az expreszsziós kontrollszekvencia szabályozza.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kontrollszekvenciaként az E.coli triptofán operon szekvenciáját tartalmazó vektorba illesztünk be.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kontrollszekvenciaként az élesztő PH05-gén szekvenciáját tartalmazó vektorba illesztünk be.
8. 8. Eljárás transzformált baktériumvagy élesztősejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy a baktérium vagy élesztősejtet a hirudint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó, az 5-7. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós vektorral, amelyet expressziós kontrollszekvencia szabályoz, transzformálunk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti ejáráe, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként az Escherichia coli vagy Saccharomyces cerevisiae egyik törzsét transzformáljuk.
10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Escherichia coli törzset transzformálunk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Saccharomyces cerevisiae törzset transzformálunk.
12. 12. Eljárás hirudin aktivitású vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti eljárással kapott transzformáit gazdasejteket valamilyen asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztjük és a hirudin-aktivitású vegyületeket a gazdasejtekből szabaddá tesszük és izoláljuk.

    5
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás (XIV) általános képletű vegyületek - a képletben V jelentés Val vagy Met-Val és W jelentése Tyr vagy Tyr(-OSÖ3H) - és sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő

    10 kódoló szekvenciát tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás (XIV) általános képletű deszulfatohirudin - a képletbén V jelentése Val és W jelentése Tyr
15. 15 - előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kódoló szekvenciát tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk.

    15. A 14. igénypont szerinti eljárás deszulfatohirudin-vegyületek előállítására, arae20 lyeket RP-HPLC állandókkal [Feltételek: Vydac 2 18TP54 15; 4,6 x 150 mm, átfolyási sebesség 1,2 ml/perc; eluens: A: 0,1% trifluor-ecetsav; B: acetonitril/vlz 8:2 + 0,07% trifluor-ecetsav. Gradiens: 2 perc 16%, B, utána 3

    25 perc alatt 20% B-re növelni], utána 15 perc alatt 25% B-re növelni, majd 27 perc alatt 64% B-re növelni, FPLC-állandókkal [körülmények: mono Q-oszlop (Pharmacia), 4,6 mm x x 150 mm. A: puffer 20 mmól, Tris.HCl pH =

    30 = 7,5; B puffer: 20 mmól Tris.HCl/1 M NaCl. Lineáris sógradiens: A: 9 ml alatt 15% B pufferral eluálni, 10,7 ml alatt 70% B pufferra növelni], és UV-elnyeléssel a következőképpen jellemezhetünk: A vegyület: RP-HPLC,

    35 retenciós idő 16,83 perc; elúció 390 mmól NaCl-dal; UV/víz/: delta··» = 275 nm.

    B vegyület: RP-HPLC: retenciós idó 18,43 perc;

    C vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 19,06

    40 perc;

    FPLC: elúció 420 mmól NaCl-dal;

    D vegyület: RP-HPLC: retenciós idó 20,06 perc;

    FPLC: elúció 460 mmól NaCl-dal;

    45 E vegyület: RP-HPLC: retenciós idó 21,53 perc;

    FPLC: elúció 500 mmól NaCl-dal; UV/viz/:delta«ax = 273 nm, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kódoló

    50 szekvenciát tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk.
16. 16. Teszt-kitt hirudin és deszulfatohirudin meghatározására, azzal jellemezve, hogy hibridómasejtekkel termeltetett monoklonális

    55 antihirudin-antitesteket puffereket, szubsztrátokat, STANDARDOKAT és adott esetben mikrotitráló lemezt tartalmaz.
17. 17. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 12.

    60 igénypont szerinti eljárással előállított hirudin-aktivitású vegyületet a gyógyBzertechnológiában szokásos hordozó- és/vagy segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé alakítunk.