NO172547B - Fremgangsmaate til fremstilling av nalfa-acetyl-eglin b og -c - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av egliner ved hjelp av de transformerte mikroorganismer.

Fra tysk off. skrift2808396 er kjent to av blodigler

( Hirudo medicinalis) isolerte protease-inhibitorer, som blir betegnet som eglin B og eglin C. Disse polypeptider består hver av 70 aminosyrer, har en molekylvekt av ca. 8100 og er sterke inhibitorer for cymotrypsin, subtilisin, for de animalske og humane granulocyt-proteaser elastase og cathepsin G samt for mastcelle-protease chymase (1). Mindre sterkt hemmes trypsin-lignende proteaser.

Eglin C har den følgende primærstruktur (2):

Eglin C inneholder i motsetning til de fleste kjente proteinase-hemmere ingen disulfid-broer, det viser seg også for et miniprotein som uvanlig stabilt overfor denaturering med syre, lut eller oppvarmning og overfor proteolyttisk avbygning. Primærstrukturen av eglin B adskiller seg fra den av eglin C ved erstatning av aminosyre 35, tyrosin, med histidin.

Eglinene hører til de sterkeste idag kjente hemmere av humane og animalske granulocyt-^elastase, samt av humane granulocyt-cathepsin G og av bakterielle proteaser av typen subtilisin. Ukontrollert hhv. umåtelig frigjøring av disse cellulære proteaser i organismen kan forsterke et betennelsesforløp og frembringe vevnedbygning ved uspesifikk proteolyse. Dette spesielt derfor da de for den intracellulære fordøyning kompetente enzymer er optimalt virksomme i fysiologisk (nøytralt til svakt alkalisk) miljø og er istand til raskt å ødelegge og å inaktivere nativ vevsubstans (f.eks. elastin) og humorale faktorer (f.eks.blodstreknings- og komplement-faktorer). På grunn av deres inntil nu kjente egen-

skaper er eglinene derfor av stor interesse for anvendelse i den medisinske terapi (antiinflammasjon, antiflogistik, septisk sjokk, lungeemfysem, mucoviscidose etc.).

I blodiglen dannes eglinene kun i meget små mengder

(ca. 15 ^ug/igle) .Isoleringen og rensningen av eglinene

av blodiglene er derfor meget tids- og kostnadskrevende og er ikke gjennomførbar i kommersiell målestokk.

På grunn av de store fremskritt i den såkalte rekom&inante DNA-teknologi (eller genteknologi) er det i den senere

tid mulig å fremstille de forskjelligartede fysiologisk aktive polypeptider under anvendelse av denne teknologi.

Den foreliggende oppfinnelse har derfor som oppgave, ved hjelp av genteknologiske midler å stille til rådighet ekspressjonssystemer som tillater den mikrobielle fremstilling av egliner i industriell målestokk. Denne oppgave blir løst ved den foreliggende oppfinnelse ved tilveiebringelse av hybridvektorer som inneholder en for et eglin kodende DNA-sekvens, som blir regulert av en ekspressjonskontrollsekvens slik at et eglin blir ekspressert i en med disse hybridvektorer transformert vert.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte

for fremstilling av tf-acetyl-eglin B, N<0,->acetyl-eglin C

og salter derav, kjennetegnet ved at man dyrker en Escherichia coli-stamme som er blitt transformert med en for ekspresjon i E. coli egnet vektor, inneholdende en E. coli-ekspresjons-kontroll-sekvens og en av denne kontrollerte ekspresjonskontrollsekvensen, for eglin B- eller eglin C-kodende DNA-sekvens, i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbare karbon- og nitrogenkilder, og frigjør produktet fra vert-

cellen og isolerer og, om ønskelig, overfører et oppnådd salt til det frie polypeptidet eller et oppnådd polypeptid til et salt derav.

Under den generelle betegnelse "egliner" forståes i

rammen av foreliggende oppfinnelse, når ikke spesifikt definert, polypeptider med proteinaseinhibitor-

aktivitet, hvis primærstruktur hovedsakelig overens-

stemmer med primærstrukturene av eglin B eller C (strukturhomologi generelt inntil 801), som imidlertid

også kan være endret N-terminal, f.eks. kan være Na<->acetylert, Na<->metionylert eller Na<->acetylmetionylert

på treonin.

Ved modifiserte egliner består modifiseringen fortrinns-

vis i en forkortning av primærstrukturen til de naturlige egliner, f.eks. med 1 til 10, spesielt 1 til 6, aminosyrebyggestener på N-terminus og/eller med 1 til 6, spsielt 2, aminosyrebyggestener på C-terminus, hvorved også her er inbefattet på N-terminus endrede, f.eks. acetylerte og metionylerte eller N-acetylmetionylerte derivater.

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter til frem-

stilling av "et eglin, f.eks. eglin B og spesielt eglin C, eller for et modifisert eglin, f.eks. modifisert eglin B eller spesielt modifisert eglin C, og av fragmenter derav.

Utvinnelsen av genomisk eglin-DNA og av eglin-ds cDNA skjer eksempelvis ifølge i og for seg kjente metoder. Således utvinner man genomisk eglin-DNA eksempelvis av den eglin-genbank, hvilken inneholder eglin-genet, idet man kloner eglin-DNA-fragmenter i en mikroorganisme og identifiserer kloner som inneholder eglin-DNA, eksempelvis ved kolonihybridisering under anvendelse av et radioaktivt merket eglin-DNA spesifikt oligodeoksynukleotid som inneholder minst 15, fortrinnsvis 15 til 30, deoksynukleotider. De således dannede DNA-fragmenter inneholder foruten eglin-genet som regel ytterligere uønskede DNA-bestanddeler, som kan avspaltes ved behandling med egnede ekso- eller endonukleaser.

Dobbelttrådet eglin-DNA kan eksempelvis fremstilles idet man

av egnede, fortrinnsvis til eglin-dannelse induserte eglin-celler, utvinner mRNA, anriker den således dannede mRNA-blanding på en i og for seg kjent måte på eglin-mRNA, anvender denne mRNA som templat for fremstillingen av entrådet cDNA, syntetiserer derav ved hjelp av en RNA-avhengig DNA-polymerase ds cDNAet og kloner denne i en egnet vektor. Kloner, som inneholder eglin-cDNA, identifiseres eksempelvis som beskrevet ovenfor ved kolonihybridisering under anvendelse av et radio-aktict merket eglin-DNA spesifikt oligodeoksynucleotid.

For fremstilling av DNA-sekvenser som koder for modifiserte egliner, kan den oppnåelige genomiske eglin-DNA eller eglin-cDNA behandles med egnede ekso- og/eller endonucleaser, hvilke avspalter DNA-avsnittene som koder for N- hhv. C-terminale eglin-aminosyrene.

De på denne måte utvunnede genomiske eglin-DNAer eller eglin-cDNAene blir fortrinnsvis tilknyttet på 5'- ig på 3'-enden med kjemisk syntetisert adapter-oligodeoksynucleotider, som inneholder gjenkjenningssekvensen for en eller forskjellige restriksjonsendonuklease(r) og letter dermed innbygningen i egnede vektorer. Dessuten må adaptermolekylet inneholde for 5<1->enden til eglin-DNAet hhv. eglin-cDNAet ytterligere translasjonsstartsignalet (ATG). Translasjonsstartsignalet må være slik anordnet at dette direkte følger kodonet for den første aminosyre til eglinet.

Da strukturen til de naturlige eglin-gener ikke er kjente,

og den kjemiske syntese av et eglin-gen byr p.g.a. de moderne syntesemuligheter på fordeler, spesielt m.h.t. tiden,

er sistnevnte en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

DNA omfatter på 5<1->enden en av et restriksjonsenzym klyv-bart nukleotidsekvens fulgt av translasjons-startsignalet, kodoner for et eglin eller for et modifisert eglin, som eventuelt muliggjør på et eller flere steder klyvning med et restriksjonsenzym, et translasjons-stoppsignal, og på 3<1->enden en med et restriksjonsenzym klyvbar nukleotidsekvens. Anvendbare restriksjonsenzymer er eksempelvis EcoRI, BamHI, : Hpall, Pstl, Aval eller HindiII.

Det for eglin kodende dobbelttrådede DNA består av en nukleotidsekvens med formelen I og den komplementære nukleotidsekvens

hvori nukleotidsekvensen er fremstilt begynnende med 5'-enden og for bedre forståelse er angitt aminosyrene, som koder for hvert triplett, og hvori D står for en direkte

binding eller for en nukleotidsekvens som koder for N-terminale aminosyrer til eglin og B står for en direkte binding eller for de tilsvarende N-terminale aminosyrer, utvalgt fra gruppen og D<1> står for en direkte binding eller for en nukleotidsekvens som koder for C-terminale aminosyrer til eglinet og B'står for en direkte binding eller for de tilsvarende C-terminale aminosyrer valgt fra gruppen

og hvor

A betyr deoksyadenocyl,

T betyr tymidyl,

G betyr deoksyguanosyl,

C betyr deoksycytidyl,

X betyr A, T", C eller G,

Y betyr T eller C,

Z betyr A, T, C eller G, når Y = C,

eller Z = A eller G, når Y = T,

Q betyr T eller A,

R betyr C og S = A, T, C eller G, når Q = T, eller R = G og S = T eller C, når Q = A,

M betyr A eller G,

L betyr A eller C,

N betyr A eller G, når L = A,

eller N = A, T, C eller G når L = C,

K betyr A eller G, når M = A,

eller K = A når M = G,

W betyr Tyr eller His,

og (X) n og (X) m betyr hver hvilke... som helst nukleotid-sekvenser med n og m større enn 3 og mindre enn 100, spesielt større enn 5 og mindre enn 12, hvilke kan igjenkjennes og klyves av et restriksjonsenzym, og fragmenter av en slik dobbelttrådet DNA med formelen I.

I et eglinkodende dobbelttrådet DNA med formel I står D for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen YTZ AAM QRS TTY, QRS GAM

YTZ AAM QRS TTY og ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY

og D<1> står for nukleotidsekvensen med formelen CAY GTX CCX CAY GTX GGX og de øvrige symboler har de under formel I angitte betydninger.

I et eglinkodende dobbelttrådet DNA med formel I står D for nukleotidsekvensen ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY og D<1> står for nukleotidsekvensen CAY GTX CCX CAY GTX GGX

og de øvrige symboler har de under formel I angitte betydninger.

Ved en foretrukket utførelsesform inneholder DNA-sekvensen på 5'-enden en med ECoRI spaltbar nukleotidsekvens, i midten en med Hpall spaltbar nukleotidsekvens og på 3'-enden en med BamHI spaltbar nukleotidsekvens.

Det dobbelttrådede DNA inneholder E. coli foretrukne tripletter som koder for aminosyrene av egliner hhv. modifiserte egliner. Slike tripletter er:

For fenylalanin anvendes også kodonet TTT og for prolin CCA eller CCT, for at foruten snittstedet for EcoRI på 5'-enden, for BamHI på 3'-enden og et snittsted for Hpall inneholdes ingen ytterligere snittsteder for de nevnte restriksjonsenzymer. Foretrukket stoppsignal (NON) er kodonet TAG.

En foretrukket utførelsesform til et gen for eglin C ved

den ovenfor fremstilte måte er DNA-et med formelen Ila,

en foretrukket utførelsesform til et gen .for. eglin B er DNA-ret med/ formelen Ilb, og. foretrukne ...utførelaesf ormer .av gener for ..modifiserte (N-terminalt-.forkortede) .eglin C- pp-l.y p ep ti der er DNA-ene . med formlene lic og Ild

hvori A, T, G, C har de under formel I angitte betydninger og "for bédfe forståelse er angitt aminosyrene ' som koder for hver- triplétt, og sriittstedene for restriksjonsenzymene.

I dobbelttrådede DNA-fragmenter av eglingener kan endene kløyves av restriksjonsenzymer og kan settes sammen til fullstendige eglin- eller modifiserte eglin-gener. Slike dobbelttrådede DNA-fragmenter av eglin-gener har spesielt 30 til 70 basepar.

Eksempelvis beskrives DNA-fragmentene med for-

melen Illa [F1(C)]/ DNA-et med formelen Illa' [F^C')], DNA-ene med formelen Illa" [F^(C")], DNA-ene med formelen Illb [P1(B)] og DNA-ene med formelen IV(F2):

Entrådede DNA-fragmenter av eglin- og modifiserte eglin-gener, spesielt slike som lar seg binde sammen med kjemiske og/eller enzymatiske metoder til eglin- hhv. modifiserte eglingener er beskrevet. Spesielt entrådede DNA-fragmenter med mer enn 20 nukleotider, spesielt med 20 til 30 nukleotider er beskrevet.

Det beskrives spesielt entrådede og dobbelttrådede DNA-fragmenter.

Syntesemetodene til DNA er blitt sammenfatningsvis fremstilt av S.A. Narang (11). De kjente syntesetek-nikker tillater fremstillingen av polynukleotider med en lengde av mot 20 baser med godt utbytte, høy renhet og i forholdsmessig kort tid. Egnede beskyttede nukleotider blir tilknyttet hverandre ved fosfordiester-

metoden (12), den ytterligere mere effektive fosfor-triestermetoden (13) eller fosfitt-triestermetoden (14).

de fire deoksynukleosid-trifosfater og sammenbundet med ligase til strukturgenet til eglinet eller det modifiserte eglin.

Ovennevnte fremgangsmåte er kjent, men muliggjør først

ved egnet kombinasjon av betingelsene og oppfinnelses-messige forbedringer fremstillingen av for eglin kodende DNA-er.

I trinn a) kan anvendes et flertall av faste bærematerialer som polystyren av forskjellig fornetning og svellbarhet, polyakrylamider, polyakrylamid-kopolymerer, på uorganisk materiale som kiselgur, kiselgel eller aloks belagte polyamider eller funksjonaliserte silaner. Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvendes som faste bærematerialer tverrfornettet polystyrener, som over "spacer", som alkylengrupper med 2 til 12 C-atomer er avbrutt av 1 til 5 polare toverdige funksjonelle grupper, som imino, okso, tio, oksokarbonyl eller amidokarbonyl,

på i og for seg kjent måte sammenbundet med 5<1->OH-gruppene av egnede beskyttede deoksynukleosider. Spesielt foretrukket er omsetningen av i 5'-stilling og eventuelt i basedelen beskyttede nukleosider med formelen V, hvori R"<*>" betyr en med syre avspaltbar beskyttelsesgruppe, som

en triarylmetylbeskytfeelsesgruppe, eksempelvis en 4-metoksytrityl- eller en 4,4'-dimetoksytritylgruppe, eller en trilaverealkylsilylbeskyttelsesgruppe, eksempelvis en tert.-butyldimetylsilylgruppe og hvor B betyr en eventuelt beskyttet base valgt fra tymyl, cytosyl, adenyl eller guanyl, med ravsyreanhydrid, eventuelt i nærvær av baser, som pyridin, trietylamin eller dimetylaminopyridin, fulgt av omsetningen med aminometylert polystyren som er tverrfornettet med 0,5 til 2% divinylbenzen, ved hjelp av reagenser som aktiverer karboksylsyre-resten, fortrinnsvis N-hydroksysuksinimid, eller p-nitrofenol og vannbindende midler, som karbodiimid, eksempelvis dicykloheksylkarbodi-imid (skjema 1).

En forenkling av syntesen av oligo- og polynukleotider blir muliggjort med fastfase-metoden, ved hvilken nukleo-tidkjedene blir bundet på et egnet polymer. Itakura et al. (15) anvender ved fastfase-syntesen i steden for enkelte nukleotider ved fosfotriester-metoden sammenbundne trinukleotider som kan kondenseres til et polynukleotid med 31 baser i kort tid og med gode utbytter. Det egentlige dobbelttrådede DNA kan enzymatisk oppbygges av kjemisk fremstilte korte segmenter. Khorana et al (16) anvender hertil overlappende polynukleotid-sekvenser av de to DNA-tråder som sammenholdes ved base-parring i riktig rekkefølge og kan deretter bindes sammen kjemisk med enzymet DNA-ligase. En ytterligere mulighet består deri å inkubere hver av en polynukleotid-sekvens av de to DNA-tråder med et kort overlappende segment i nærvær av de fire nødvendige de oksynukleosid-trifosfater med en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, Klenow-fragment av polymerase I, DNA-polymerase,

eller med AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transeriptase. Herved blir ved baseparring de to polynukleotid-sekvenser holdt sammen i den riktige rekke-følge og supplert av enzymet med de nødvendige nukleotider til en fullstendig dobbelttrådet DNA (17). Itakura et al. (18) beskriver hvordan basert på dette prinsipp i nærvær av DNA-polymerase (Klenow-fragment) av 4 kjemisk syntetiserte fragmenter med en lengde av 39 til 4 2 baser kan oppbygges et 132 base-par langt segment av det humane leukozyten-interferon a2~gen, hvorved kan oppnås 40% innsparing ved kjemisk syntese i forhold til metoden som kun anvender ligase.

DNA koder for egliner eller modifiserte egliner, som

er egnet for en ekspresjon i vertceller og hvis ender muliggjør en innbygning i vektorer, og av fragmenter derav, kan fremstilles ved at

a) et egnet beskyttet deoksynukleosid blir bundet til en fast bærer, b) egnede beskyttede D-, tri- eller tetranukleotider blir fremstilt ifølge fosfotriester- eller fosfitt-metoden, c) et på bæreren bundet deoksynukleotid eller oligodesoksynukleotid blir bundet sammen med egnede

beskyttede mono- eller (ifølge b) fremstilte) di-, tri- eller tetranukleotider ifølge fosfortriester-eller fosfitt-metoden,

d) ifølge c) oppnåelige, på bærer bundede oligodeoksynukleotider. med en lengde mellom ca. 20 og

ca. 70 baser blir avspaltet fra bæreren, frigjort fra beskyttelsesgrupper og de frie 5'-terminale

hydroksygrupper blir fosforylert,

el) 2 oligodeoksynukleotider med en lengde på hver ca. 20 til ca. 70 baser av den kodende og av den komplementære tråd og med minst 3, fortrinnsvis 8 til 15, overlappende basepar blir smeltet sammen og

supplert med en DNA-polymerase i nærvær av fire deoksynukleosid-trifosfater til dobbelttrådede DNA-segmenter (fragmenter til eglin-.eller modifisert ealin-aenet),

og eventuelt blir 2 dobbelttrådede DNA-segmenter med egnede ifølge d) fosforylerte ender sammenbundet med en ligase til strukturgenet til eglinet eller det modifiserte eglin, eller 2

oppnåelige dobbelttrådede DNA-segmenter blir subklonet i egnede vektorer, deretter fosforylert ifølge d) og sammenbundet med en ligase til strukturgenet til eglinet eller det modifiserte

eglin, eller

e2) alternativt blir hver 2 oligodeoksynukleotider av den kodende og av den komplementære tråd med en lengde av f.eks. 20 til 70 baser og med hver minst 3, fortrinnsvis 8 til 15, overlappende basepar smeltet sammen, oppfylt med en DNA-polymerase i nærvær av

Omsetningen skjer i et inert ikke-protisk oppløsningsmiddel, f.eks. pyridin, tetrahydrofuran, dioksan, eddiksyreetylester, kloroform, metylenklorid, dimetylformamid eller dietylacetamid eller i blandinger derav, ved værelsetemperatur eller lett forhøyet eller senket temperatur, f.eks. i et temperaturområde fra ca. -10°C til ca. 50°C, fortrinnsvis ved værelsetemperatur, omsetningen skjer i nærvær av vannbindende midler også ved lavere temperatur, f.eks. ved ca. 0°C.

Ved fremstillingen av di-, tri- eller

tetranukleotider ifølge trinn b) omsettes i 5'-stilling og eventuelt i basedelen beskyttede nukleosider med formel V, hvori R"*" og B har de ovenfor angitte betydninger, omsatt

1 2

med aktiverte fosforestere med formelen VII, hvor X og X uavhengig av hverandre betyr hydroksy eller derav avledede salter, halogen, imidazolyl, 1,2,4-triazol-l-yl, tetrazolyl eller 1-benztriazolyloksy og X 2 betyr ytterligere også 2-cyanoetyloksy, 2-trihalogenetyloksy, 2-arylsulfonyl-etyloksy, 2-laverealkyltioetyloksy, 2-aryltioetyloksy eller 2-(4-nitrofenyl)-etyloksy og R 2 betyr en med baser eller nukleofiler, som ammoniumhydroksyd, tiofenolat eller et arylaldokimat, avspaltbar beskyttelsesgruppe, som eventuelt med halogen, nitro og/eller laverealkyl substituert fenyl, metyl eller eventuelt med nitro substituert benzyl, eller betyr en med metallioner avspaltbar beskyttelsesgruppe, som"8-kinolyl eller 5-klor-8-kinolyl,

hvorved omsetningen eventuelt skjer i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser.

Deretter omsettes en på denne måte dannet forbindelse med

12 2

formelen VIII, hvor R , X og R har de ovenfor angitte betydninger, først eventuelt med et 2-substituert etanol,

2 3 3

som omdanner resten X i en gruppe OR , hvor R betyr cyanoetyl, 2-trihalogenetyl, 2-arylsulfonyletyl, 2-laverealkyltioetyl, 2-aryltioetyl eller 2-(4-nitrofenyl)-etyl, og spalter deretter beskyttelsesgruppen R^", og omsetter den på denne måte fremstilte forbindelse med formelen IX med en annen forbindelse med formelen VIII, eventuelt i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser,

til et dinukleotid X (skjema 2). Eventuelt blir en forbindelse med formelen VIII omdannet ved reaksjon med baser og vann

2

i en annen forbindelse med formelen VIII, hvor X betyr hydroksy eller derav avledede salter.

Omsetningen skjer i et av de ovenfor nevnte inerte oppløs-ningsmidler ved værelsetemperatur eller lett øket eller senket temperatur, f.eks. ved værelsetemperatur.

Avspaltningen av be skyttel se sgruppen R"*" gjennomføres f. eks. ved hjelp av syrer, som mineralsyrer, f.eks. saltsyre eller svovelsyre, karboksylsyre, f.eks. eddiksyre, trikloreddik-syre eller maursyre, sulfonsyre, f.eks. metan- eller p-toluensulfonsyre, eller spesielt Lewis-syre, f.eks. sink-klorid, sinkbromid, aluminiumklorid, dialkylaluminium-halogenid, f.eks. dibutyl- eller dietylaluminiumklorid, eller bortrifluorid, ved 10°C til 50°C, spesielt ved værelsetemperatur. Ved anvendelse av et dialkylaluminium-halogenid skjer avspaltningen i et liofilt oppløsningsmid-del, spesielt i toluen, og ved anvendelse av en av de andre nevnte Lewis-syrer i en oppløsningsmiddelblanding, bestående av et halogenhydrokarbon, f.eks. metylenklorid og en laverealkanol, f.eks. etanol eller isopropanol. Fremstillingen av dinukleotider med formelen X omfatter også omsetningen av nukleosider med formel V, hvori R og B har de ovenfor angitte betydninger, med fosfitter med formelen VHA, hvori X 1 betyr halogen, spesielt klor, X<2 >betyr halogen, spesielt klor eller dilaverealkylamino, spesielt dimetylamino eller diisopropylamino, eller morfolino, piperidino eller pyrrolidino, og R 2har den for VII ovenfor angitte betydning, spesielt metyl, eventuelt i nærvær av en egnet base. De oppnåelige forbindelser med formelen VIIIA blir på sin side omsatt med en 2-substituert etanol, som omdanner resten X 2 i en gruppe OR 3, hvor R 3 har de ovenfor angitte betydninger, oksyderes deretter med et oksydasjonsmiddel, eksempelvis jod i nærvær av en base, til fosfat og avspalter beskyttelsesgruppen R"*", hvorved dannes en forbindelse med formelen IX, omsetter på den andre side med en forbindelse med formelen IX, oksyderer deretter med et oksydasjonsmiddel, eksempelvis jod i nærvær av en base, til en forbindelse med formelen X (skjema 3).

For fremstilling av trinukleotider avspaltes i dinukleotider

12 3

med formel X, hvor R , R og R har de ovenfor angitte be-

1 2 tydninger og hvori B og B betyr uavhengig av hverandre thymyl, cytosyl, adenyl eller guanyl, beskyttelsesgruppen R^" og den dannede forbindelse omsettes med en forbindelse med formelen VIII, eventuelt i nærvær av vanntrekkende midler eller i nærvær av baser, eller omsettes med en forbindelse med formelen VIIIA og etterfølgende oksydasjon, hvorved dannes en forbindelse med formelen XI (skjema 4). Avspaltningen av beskyttelsesgruppen R^" og kondensasjonen til trinukleotidene med formelen XI skjer på samme måte som beskrevet ved fremstillingen av dinukleotidene med formelen X.

For fremstilling av tetranukleotider blir trinukleotider med formelen XI bragt til omsetning som beskrevet ovenfor for dinukleotider med formel X.

Som beskyttelsesgruppe R blir det anvendt 4-metoksytritylgruppen, som beskyttelsesgruppe R 2blir anvendt en med klor substituert fenylgruppe, spesielt 2-klorfenyl, og som beskyttelsesgruppe

3 12 R anvendes 2-cyanoetylgruppen. Foretrukket rest X og X i forbindelsen med formelen VII er 1-benztriazolyl-oksy-resten.

Trinukleotider med formelen XI blir fortrinnsvis fremstilt idet i dinukleotider med formelen X avspaltes beskyttelsesgruppe R^" og den dannede forbindelse omsettes med forbindelser med formelen VIII, hvori X 2 betyr hydroksyl eller derav avledede salter, i nærvær av et vanntrekkende middel(skjema 4). Som vanntrekkende midler anvendes eksempelvis 2,4,6-trimetyl- eller triisopropylbenzol-sulfonyl-klorid, -imidazolid, -tetrazolid eller - 1,2,4-triazolid eventuelt substituert med nitro. Foretrukket vanntrekkende middel er 2,4,6-trimetylbenzolsulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazolid med formelen XII

Fortrinnsvis anvendes nukleosider hvis frie aminogruppe

er beskyttet i basedelen. Foretrukne beskyttelsesgrupper er benzoyl for adenin, benzoyl eller 4-metoksybenzoyl for cytosin, isobutyryl eller difenylacetyl for guanin. Tymin anvendes fortrinnsvis uten beskyttelsesgruppe.

Ved fremstilling av nukleotidene ifølge trinn c) anvendes en i og for seg kjent apparatur med halvautomatisk eller helautomatisk, mikroprosess-styrt tilføringssystem for oppløsning og reagenser. I en ifølge trinn a) fremstilt forbindelse med formelen VI blir beskyttelsesgruppen r\ som beskrevet ovenfor, avspaltet og deretter enten omsatt med en forbindelse med formelen VIII, eller med en forbindelse med formelen VIIIA, eller med en forbindelse med formel X eller XI, i hvilken tidligere beskyttelsesgrupper R 3 er blitt avspaltet med baser (en gruppe 2-cyanoetyl som R^ er eksempelvis blitt avspaltet med et trilaverealkylamin, f.eks. trietylamin, i et av de ovenfor nevnte oppløsningsmidler eller oppløsningsmiddel-blandinger ved 10°C til 40°C, spesielt ved værelsetemperatur) , eventuelt i nærvær av et vannbindende middel eller i nærvær av en base.

Det kan også istedenfor et dinukleotid med formelen X eller et trinukleotid med formelen XI blir anvendt et ifølge trinn b) fremstilt tetranukleotid. Dersom et fosfitt med formelen VIIIA blir anvendt så blir senere etterbehandlet med et oksydasjonsmiddel, eksempelvis jod i nærvær av en base. Den på denne måte fremstilte forbindelse med formelen XIII,

1 2

hvor R , R og B har de ovenfor angitte betydninger og n er et helt tall fra 1 til 4, blir senere ofte underkastet de for forbindelsen med formelen VI beskrevne reaksjonstrinn (avspaltning av R"<*>", reaksjon med VIII, VIIIA, X, XI eller

det tilsvarende tetranukleotid, eventuelt med oksydativ etterbehandling), inntil det dannes en forbindelse med formelen XIII, i hvilken n er et hvilket som helst utvalgt tall mellom ca. 19 og ca. 69.

Som beskyttelsesgruppe R 1 anvendes 4-metoksytrityl, og avspaltningen blir gjennomført med sinkbromid i nærvær av en CH- eller NH-acid-forbindelse, spesielt 1,2,4-triazol eller tetrazol. Anvendelsen av f.eks. 1.2.4-triazol ved avspaltningen av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen er ny og fører overraskende dertil at avspaltningen forløper hurtig, med høye utbytter og uten bireaksjoner. Spesielt foretrukket er anvendelsen av sinkbromid og 1,2,4-triazol i et molart forhold mellom 20:1 og 100:1 i en oppløsnings-middelblanding bestående av et aprotisk oppløsningsmiddel og en alkohol, eksempelvis metylenklorid og 2-propanol.

En forbindelse med formel VI eller formelen XIII i hvilken beskyttelsesgruppen R 1 er blitt avspaltet, kan omsettes med et trinukleotid med formelen XI, i hvilket beskyttelsesgruppen R 3 er blitt avspaltet, i nærvær av et vannopptagende middel som eksempelvis 2,4,6-trimetyl- eller triisopropylbenzen-sulfonyl-klorid, -imidazolid, -tetrazolid eller -1,2,4-triazolid eventuelt substituert med nitro. Spesielt foretrukket er 2,4,6-trimetylbenzolsulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazolid med formelen XII.

Den spesielt foretrukne kombinasjon består deri at som beskyttelsesgruppe R"<*>" anvendes 4-metoksytritylgruppen, for avspaltning av R^" anvendes sinkbromid i nærvær av 1,2,4-triazol og som vannbindende middel for reaksjonen av beskyttet oligonukleotid-polystyren-harpiks med formelen XIII med et avbskyttet trinukleotid med formelen XI anvendes triazolidet med formelen XII, gjør det mulig at overraskende også lange nukleotidkjeder medca. 40 til ca. 70 baser kan fremstilles i kort tid med høye utbytter og med høy renhet.

For avspaltning av oligodeoksynukleotider fra bæreren

og for fjerning av beskyttelsesgruppen ifølge trinn d) anvendes i og for seg kjente fremgangsmåter. Spesielt foretrukket reagens for avspaltning fra bæreren

og for fjernelse av den foretrukne 2-klorfenyl-beskyttelsesgruppe er et arylaldoksymat, eksempelvis 1,1,3,3-tetrametyl-guanidinium-2-nitrobenzaldoksymatet. Reaksjonen skjer i et av de ovenfor nevnte inerte oppløsningsmidler, til hvilket noe vann er tilsatt, f.eks. i 95%-ig pyridin, ved værelse-

temperatur. Deretter omsettes med vandig ammoniakk ved værelsetemperatur eller forhøyet temperatur, f.eks. ved 20°C til 70°, spesielt ved 50°C.

For ligering av oligodeoksynukleotidene

i

blir"innført på den 5'-terminale hydroksygruppe en fosfatrest. Innføringen av fosfatresten (fosforylering) skjer på i og for seg kjent måte ved hjelp av T. polynukleotid-kinase i nærvær av ATP.

Fremstilte oligodeoksynukleotider

av den kodende og av den komplementære DNA-streng inneholder overlappende sekvenser, bestående av minst 3, fortrinnsvis 8 til 15 overlappende basepar. Slike oligodesoksynukleotid-par blir sammenholdt ved blanding av hydrogenbrodbinding. De overhengende, entrådede ender tjener ifølge trinn el) og e2) som matriks (templat)

for oppbygningen av den andre (komplementære) tråd med en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, Klenow-fragment av DNA-polymerase I eller T4 DNA-polymerase eller med AMV reverse transcriptase, i nærvær av de fire deoksynukleosid-trifosfater (dATP, dCTP,dGTP og TTP). De ved komplementer-ingen dannede dupleks-DNA-er, ved hvilke det dreier seg om fragmenter av det (modifiserte) eglin-gen (fremgangs-

måte el) eller om det komplette (modifiserte) eglin-gen (fremgangsmåte e2), har butte ender.

De ifølge fremgangsmåtetrinn el) oppnåelige fragmenter til det (modifiserte) eglin-gen inneholder på endene nukleotid-sekvenser, som kan igjenkjennes og spaltes av restriksjonsendonukleaser. Alt etter valg av nukleotidsekvensene svarende restriksjonsendonukleaser dannes ved spaltning fullstendig baseparvise (butte) ender ("blunt ends") eller ender med en overhengende DNA-tråd ("staggered ends"). Restriksjons-gjenkjennelses-sekvenser blir valgt slik at ligeringen av DNA-fragmentene som er blitt behandlet med restriksjonsendonukleaser som danner en butt ende, hhv. baseparring av de kohesive ender og den tilknyttende ligeringen av DNA-fragmenter med overhengende DNA-tråder i det fullstendige (modifiserte) eglin-strukturgen. Ligeringen av to dobbelttrådede DNA-fragmenter krever en 5<1->terminal fosfatgruppe på donor-fragmentet og en fri 3'-terminal hydroksygruppe på akseptorfragmentet. De dannede DNA-fragmenter er allerede 5'-terminalt fosforylert og bindes sammen på en i og for seg kjent måte med en ligase,

spesielt T4 DNA-ligase.

Det blir fremstilt to fragmenter til eglin C- eller B-genet i tilfelle

av C-genet spesielt fragmentene (C) og F^ ifølge formel Illa hhv. spesielt fragmentene F^(C) og F2 ifølge formel Illa hhv.

IV, og i tilfelle av Eglin B-genet spesielt fragmentene

F^(B) og F2 ifølge formel Illb hhv. IV. Fragmentene

som dersom nødvendig kan bli subklonet i en egnet vektor, inneholder fortrinnsvis på tilknytningsendene hver gjen-kjennelsessekvensen for en restriksjonsendonuklease,

spesielt Hpall, hvorpå etter spaltning med nevnte restriksjonsenzym og ligering av de to fragmenter dannes den korrekt kodende eglin-DNA-sekvens. Dessuten inne-

holder delstykket 1 foran translasjonsstartsignalet (ATG)

og delstykket 2 etter translasjonsstoppsignalet (f.eks.

TAG) ytterligere "terminale" restriksjonssteder som

tillater innbygningen av det (modifiserte) eglin-gen hhv. det (modifiserte) eglin-gen-delstykket i en egnet vektor.

Eglin C-genet fremstilles i to delstykker F^ (C) og F2 med formelen Illa hhv. IV, hvilke etter fordøying med restriksjonsenzymet Hpall o< ligering gir den korrekte eglin C-DNA-sekvens og hvori F^(C) før translasjonsstartsignalet oppviser et EcoRI-restriksjonssted og F2 oppviser etter translasjonsstoppr signalet et BamHI-restriksjonssted.

Ved en annen utførelsesform (trinn e2) blir hver to oligodeoksynukleotider, som alternativt stammer fra den kodende og fra den komplementære tråd sammensmeltet ved hjelp av minst 3, fortrinnsvis 8 til 15 komplementære baser,

oppfylt med en DNA-polymerase, f.eks. en av de ovenfor nevnte, og ligert med T, DNA-ligase til det (modifiserte) eglin-strukturgen.

Fremstilling av ekspresjonsvektorer som inneholder et eglin- gen

Oppfinnelsen vedrører en ekspresjonsvektor som inne-

holder en for et eglin eller for en modifisert eglin kodende DNA-sekvens som blir regulert av en ekspresjonskontrollsekvens slik at i en med disse ekspresjonsvektorer transformert vert blir uttrykt polypeptidet med eglin-aktivitet.

Ekspressorvektorene inneholder en for eglin B, modifisert eglin B, modifisert eglin C eller spesielt eglin C kodende sekvens,

Ekspresjonsvektorene fremstilt f.eks. idet man i en vektor-DNA san inneholder en ekspresjonskontrollsekvns, innføyer en for et eglin eller et modifisert eglin kodende DNA-sekvens slik at ekspressjonskontrollsekvensen regulerer den nevnte DNA.-sekvens.

Valget av en egnet vektor gir seg av de for transformasjon bestemte vertsceller. Egnede verter er eksempelvis mikroorganismer, som gjær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, og spesielt bakteriestammer, som har ingen restriksjons-eller modifikasjonsenzym, fremforalt stammer av Escherichia coli, f.eks. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110,

E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221(37) eller E. coli K12 stamme 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, videre celler av høyere organismer, spesielt etablerte humane eller animalske cellelinjer. Foretrukket som verts-mikroorganisme er de nevnte stammer av E. coli, f.eks. E. coli HB101 og E^ coli JA221, videre Saccharomyces cerevisiae.

Hovedsakelig er alle vektorer egnet som repliserer og uttrykker DNA-sekvensene i den valgte vert.

Eksempler på vektorer som er egnet for ekspresjon av et eglin- eller modifisert eglin-gen i en E. coli- stamme er bakteriofag, f.eks. derivater av bakteriofaget eller plasmider, som spesielt plasmidet colEl og dets derivater, f.eks. pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse avleder seg fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder et fullstendig replikon og et markørgen, som muliggjør seleksjonen og identifiseringen av den med ekspresjonsplasmider transformerte verter p.g.a. fenotypisk kjennetegn. Egnede markør-gener gir verten eksempelvis resistens overfor tungmetaller, antibiotika, o.l. Dessuten inneholder foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse utenfor replikon- og markør-gene-regionene gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser slik at disse steder kan eglin-genet og eventuelt ekspresjons-kontrollsekvenser innføyes. Den foretrukne vektor, plasmidet pBR322, inneholder en intakt replikon, mot tetracyklin- og ampicillin-resistens tildelende

5 R

markeringsgener (tet og amp ) og en rekke av kun en gang forekommende gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser, f.eks. Pstl (kløyver i amp R -genet, tet R-genet forblir intakt, BamHI, Hindlll, Sali (kløyver alle i tet<R->genet, amp -genet forblir intakt) Nrul og EcoRI.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan anvendes for regulering av genekspresjon. Spesielt anvendes ekspresjonskontrollsekvenser av sterkt uttrykte gener til verten som skal transformeres. I tilfelle av pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsmikroorganisme er eksempelvis egnede ekspresjons-kontrollsekvenser (hvilke bl.a. inneholder promoteren og de ribosomale bindingssteder) til laktoseoperon, tryptofan-operon, arabinoseoperon, o.l., til B-laktamasegenet, de tilsvarende sekvenser til fag AN-genet eller til fag fd-sjiktproteingenet og andre. Mens promoteren til B-laktamasegenet ( 3-lac-gen) allerede inneholdes i plasmidet pBR322,

må de øvrige ekspresjonskontrollsekvenser innføres i plasmidet. Foretrukket som ekspresjonskontrollsekvens ved foreliggende oppfinnelse er slike til tryptofanoperonet (trp po).

For replikasjon og ekspresjon i gjær egnede vektorer inneholder en gjær-replikasjonsstart og en selektiv genisk markering for gjær. Hybridvektorer som inneholder en gjær-replikasjonsstart, f.eks. det kromosomale autonome repliserende segment (ars), forblir etter transformasjonen innenfor gjærcellen ekstra-kromosomal erholdt og blir autonom replisert av mitosen. Videre kan anvendes hybridvektorer som inneholder gjær-2^u-plasmid-DNA homologe sekvenser. Slike hybridvektorer blir inkorporert ved rekombinasjon innenfor cellen av allerede tilstedeværende 2yU-plasmider eller blir replisert autonomt. 2^u-sekvenser er spesielt egnet for plasmider med stor transformasjons-hyppighet og tillater et høyt kopitall. Egnede markeringsgener for gjær er fremforalt slike som gir verten anti-biotisk resistens eller i tilfelle av auksotrope gjær-mutanter, gener som komplementerer vertsdefektene. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens mot antibiotikumet cykloheksimid eller sørger for prototropi i en auksotrop gjærmutant, f.eks. URA3- genet, LEU2-genet, HIS3-genet eller fremfor alt TRPl-genet. Fortrinnsvis inneholder gjær-hybridvektorer dessuten en replikasjonsstart og et markeringsgen for en bakteriell vert, spesielt E. coli, foråt konstruksjonen og kloningen av hybridvektorene og deres fortrinn kan skje i en bakteriell vert. For ekspresjonen i gjær egnede ekspressjonskontrollsekvenser er eksempelvis slike av TRP1-, ADHI-, ADHJEI-, PH03- eller PH05-genet, videre i glykolytisk avbygning involvert promoter, f.eks. PGK- og GAPDH-promoteren.

Spesielt vedrører oppfinnelsen for replikasjon og fenotypisk seleksjon egnede ekspressjonsvektorer, som inneholder en ekspressjonskontrollsekvens og en for et eglin eller et modifisert eglin kodende DNA-sekvens, hvorved nevnte DNA-sekvens med transkripsjonsstartsignal og -terminasjons-signal samt translasjonsstartsignal og-stoppsignal i nevnte ekspressjonsplasmid under regulering av nevnte ekspressjonskontrollsekvens er andordnet slik at i en med nevnte ekspressjonsplasmid transformert vert blir uttrykt polypeptider med eglin-aktivitet.

For å oppnå effektiv ekspressjon må strukturgenet være anordnet riktig (i "fase") med ekspressjonskontrollsekvensen. Det er fordelaktig å binde ekspressjonskontrollsekvensen i området mellom hoved-mRNA-starten og ATG-et til gen-kodesekvensen, som naturligvis er bundet sammen med ekspressjonskontrollsekvensen (f.eks. 3-lac-kodesekvensen ved anvendelse av 3-lac-promotoren), med eglin-genet

(hhv. det modifiserte eglin-)gen, hvilket fortrinnsvis med-bringer sitt eget translasjonsstartsignal (ATG) og translasjonsstoppsignal (f.eks. TAG). Derved sikkerstilles en effektiv transkripsjon og translasjon.

Eksempelvis blir en vektor, spesielt pBR322, spaltet med

en restriksjonsendonuklease og innført, eventuelt etter modifikasjon av den således dannede lineære vektor, med en tilsvarende ekspressjonskontrollsekvens forsynt med tilsvarende restriksjonsender. Ekspressjonskontrollsekvensen inneholder på 3'-enden (i translasjonsretning) gjenkjen-nelsessekvensen til en restriksjonsendonuklease slik at vektoren som allerede inneholder ekspressjonskontrollsekvensen kan fordøyes med nevnte restriksjonsenzym og innføres med

det med passende ender forsynt eglin-strukturgen (eller det modifiserte eglin-strukturgen). Derved dannes en blanding av to hybridplasmider, som inneholder genet i riktig hhv.

i falsk orientering. Fordelaktig er det å spalte vektoren en andre restriksjonsendonuklease og å innsette i det dannede vektorfragment det med riktige ender forsynte strukturgen. Alle operasjoner på vektoren skjer fortrinnsvis på en måte slik at funksjonen av replionet og i det minste ett markeringsgen ikke blir påvirket.

Ved en foretrukken utførelsesform blir en av pBR322 avledet vektor, som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens, spesielt av den tryptofan-operon (trp po), som bærer på 3'-enden (mellom hoved-mRNA-starten og den første ATG) igjenkjennelsesekvensen for en restriksjonsendonuklease, fortrinnsvis som danner kohesive ender, f.eks. EcoRI, fordøyet med den nevnte restriksjonsendonuklease . og i vektor-DNA-delen med en andre restriksjons-nuklease, som danner flate eller foretrukket kohesive ender, f.eks. BamHI, hvoretter, den således lineæriserte vektor blir bundet sammen med den tilsvarende ende som har eglin-gen (eller modifisert eglin-gen) (f.eks. med en EcoRI-ende før ATG-starten og en BamHI-ende etter translasjonsstopp-kodonet). Sammenbindingen skjer på i og for seg kjent måte ved par-dannelse av de komplementære (kohesive) ender og ligering med f.eks. T^-DNA-ligase.

Det over mRNA-veien av genomisk DNA eller syntetisk utvunnet, med tilsvarende kohesive ender (spesielt EcoRI- og BamHI-.5 ender) forsynt eglin-gen (eller modifisert eglin-gen) kan før innbringelsen i et ekspressjonsplasmid også klones i en vektor, f.eks. pBR322, for å utvinne større mengder av strukturgen, eksempelvis for sekvensanalysen. Isoleringen av klonene, som inneholder hybridplasmidet, gjennomføres eksempelvis med en eglin-spesifikk, radioaktiv-markert oligodesoksynukleotid-prøve (se ovenfor). Karakteriseringen av eglin-genet (hhv. det modifiserte eglin-gen) skjer eksempelvis ifølge fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (3).

Ved en foretrukken utførelsesform blir syntetisert to delstykker til eglin-eller modifisert eglin-gen, eksempelvis to delstykker til eglin-C-genet. Delstykket I, som omfatter den 1. delen til genet, inneholder før ATG-et og på enden alltid igjenkjennelses-sekvensen for restriksjonsendonukleaser som danner kohesive ender, f.eks. før ATG EcoRI og på enden Hpall. Delstykket 2, som omfatter den bakre del av genet, har tilsvarende igjenkjennelsessekvenser, ved begynnelsen f.eks. Hpall og etter translasjonsstoppsignalet (f.eks. TAG) BamHI. Delstykkene blir spaltet ved de ytre igjenkjennelsessekvenser (delstykke 1 f.eks. med EcoRI og delstykket 2 tilsvarende BamHI) og subklonert i en tilsvarende tilsnittet vektor (f.eks. pBR322). Identifiseringen av klonen, som inne-

holder delstykkene og karakteriseringen av delstykkene skjer som beskrevet ovenfor. Delstykkene blir deretter utsnittet med de tilsvarende restriksjonsendonukleaser av hybridvektorene (delstykke 1 f.eks. med EcoRI og Hpall og delstykket 2 f.eks. med Hpall og BamHI) og liaert over deres kohesive ender, spesielt Hpall-ender, hvorved dannes det komplette eglin-gen (hhv. modifisert eglin-gen), som blir innføyet som angitt i en vektor-DNA.

Egnede verter som kan anvendes for transformasjon, er eksempelvis de ovenfor nevnte mikroorganismer som stammer av Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og spesielt Escherichia coli. Transformasjonen med ekspresjonsplasmider skjer eksempelvis som beskrevet i litteraturen, således for S. cerevisiae (4), B. subtilis (5) og E. coli (6). Isoleringen av den transformerte vert skjer fordelaktig ved

et selektivt isoleringsmedium som er tilsatt biocid som gir

det i ekspresjonsplasmidet inneholdende markerings-gen-resistens. Når, som foretrukket, ekspresjonsplasmidene inneholder amp -gen, blir næringsmediet derfor tilsatt ampicillin. Celler som ikke inneholder ekspresjonsplasmidet, blir drept i et slikt medium.

Kultivering av den transformerte vert og utvinning av egliner

Den transformerte vert kan anvendes til fremstilling av egliner og modifiserte egliner. Fremgangsmåten til fremstilling av egliner og modifiserte egliner er karakterisert ved at den transformerte vert blir kultivert og produktet frigjort og isolert av vertcellene.

Overraskende ble nå funnet at de transformerte verter produserer blandinger av polypeptider med eglin-aktivitet. Av blandingene lar seg isolere naturlige egliner, metionyl-eglin og N-terminal acylerte egliner. Transformerte stammer av E. coli produserer spesielt polypeptider med eglin-aktivitet, hvilke adskiller seg fra de naturlige egliner B og C ved en N-acetylrest på den N-terminale aminosyre-treonin, andre transformerte verter produserer overveiende de naturlige egliner og tredje utstøter fremfor alt polypeptider, som nøyaktig tilsvarer de i verten innførte eglin-DNA, dvs. inneholder som N-terminal aminosyremetionin. Spesielt er produksjonen av Na<->acetylerte produkter overraskende. Produksjonen av slike polypeptider ved hjelp av genteknologiske metoder er nemlig hittil ennå ikke blitt påvist. Således blir selv a-tymosin som er naturlig N-terminalt acetylert, uttrykt av tilsvarende genetiske modifiserte verter i ikke-acetylert form.

Produksjonen av N-terminal-acetylerte egliner er av stor fordel, da slike forbindelser har en forhøyet stabilitet overfor de i vertscellene tilstedeværende aminopeptidaser, hvorved den (partielle) proteolytiske degradering ut-

gående fra N-terminus blir forhindret og derved utbyttet økt. Videre blir herved rensefremgangsmåten betydelig fordelt da de ønskede produkter ikke blir forurenset av fragmenter dannet ved proteolytisk degradering.

For kultiveringen av de ved oppfinnelsen transformerte

verter kan anvendes forskjellige karbonkilder. Eksempler på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbo-

hydrater som glykose, maltose, mannit eller laktose, eller et acetat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder er eksempelvis aminosyrer,

som casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbygningsprodukter som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakter, maltekstrakt som også ammoniumsalter, f.eks. ammoniumklorid, -sulfat eller -nitrat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter, som likeledes kan anvendes, er f.eks. sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium.

Dessuten inneholder mediet f.eks. vekstfremmende substanser, som sporelementer, f.eks. jern, sink, mangan og lignende og fortrinnsvis substanser som utøver et seleksjonstrykk og forhindrer veksten av celler som har mistet ekspressjonsplasmidet. Således tilsettes mediet eksempelvis ampicillin når ekspressjonsplasmidet inneholder et amp -

gen. En slik tilsetning av antibiotiske virksomme substanser bevirker også at kontaminerende, antibiotika-følsomme mikroorganismer blir drept.

Kultiveringen skjer ifølge i og for seg kjente fremgangsmåter. Kultiveringsbetingelsene, som temperatur, pH-verdi-til mediet og fermentasjonstid blir valgt slik at maksimal eglin-titer oppnåes. Således blir en E. coli-stamme foretrukket kultivert under aerobe betingelser i submerser kultur under rystning eller omrøring ved en temperatur av ca. 20 til 40°C, fortrinnsvis ca. 30°C, og en pH-verdi av 4 til 9, fortrinnsvis ved pH 7, under ca. 4 til 20 h, fortrinnsvis 8 til 12 h. Derved ansamles ekspressjons-produktet(eglin) intracellulært.

Når celledensiteten har oppnådd en tilstrekkelig verdi tblir kultiveringen avbrutt og eglinet frigjort av cellene til verten. For dette formål blir cellene ødelagt, f.eks. ved behandling med et detergent, som SDS eller triton, eller lysert med lysozym eller et lignende virkende enzym. Alternativt eller ytterligere kan man anvende mekaniske krefter, som skjærkrefter (f.eks. X-presse, French-presse, Dyno-Mill) eller rystning med glassperler eller aluminium-oksyd, eller avvekslende innfrysning, f.eks. i flytende nitrogen og opptining, f.eks. til 30 til 40°C, samt ultra-lyd for nedbrytning av cellene. Den resulterende blanding, som inneholder proteiner, nukleinsyrer og andre celle-bestanddeler, blir etter sentrifugeringen på i og for seg kjent måte anriket på proteiner, inklusiv eglin. Således blir f.eks. den største del av ikke-protein-bestanddeler fraskilt ved polyetylenimin-behandling og proteinene inbefattet eglin blir f.eks. ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter utfelt. Bakterielle proteiner kan også bli utfelt ved hjelp av surgjøring med eddiksyre (f.eks. 0,1%, pH 4-5). En ytterligere anrikning av eglin kan oppnåes ved ekstraksjon av det eddiksure overskikt med n-butanol. Ytterligere rense-

trinn omfatter eksempelvis gelelektroforese, kromatografiske fremgangsmåter som ionebytterkromatografi, stro-eksklusjonskromatografi, HPLC, omvendt-fase-HPLC og lignende, adskillelse av blandingsbestanddeler etter molekylstørrelser ved hjelp av en egnet Sephadex-kolonne, dialyse, affinitetskromatografi, f.eks. antilegeme-, affinitetskromatografi, spesielt monoklonal antilegeme-affinitetskromatografi eller affinitetskromatografi på

en anhydrokymotrypsin-kolonne og andre, spesielt fra

litteraturen kjente fremgangsmåter.

Eksempelvis omfatter isoleringen av det uttrykte eglin

de følgende trinn:

Adskillelse av cellene av kulturoppløsningen ved hjelp

av sentrifugering, fremstilling av et råekstrakt ved ødeleggelse av cellene, f.eks. ved behandling med et lyserende enzym og/eller avvekslende innfrysning og gjen-opptining,

avsentrifugering av uoppløselige bestanddeler,

utfelling av DNA ved tilsetning av polyetylenimin,

felling av proteinene inbefattet eglin med ammoniumsulfat, affinitetskromatografi av det oppløste bunnfall på en monoklonal anti-eglin-antilegeme-kolonne eller en anhydrochymotrypsin-kolonne,

avsaltning av den således utvunne oppløsning ved hjelp av dialyse eller kromatografi på Sephadex G25.

Alternativt kan etter fraskillelen av DNA-et de bakterielle proteiner bli utfelt ved hjelp av 0,1%-ig eddiksyre, av det sure overskik kan eglinet ekstraheres med n-butanol eller det sure overskikt kan direkte underkastes ione-bytte-kromatografi (f.eks. på karboksymetylcellulose). Ytterligere rensningstrinn omfatter gelfiltrering på Sephadex G50 (eller G75) og omvendt fase-HPLC. Avsaltning skjer videre på Sephadex G25.

For bestemmelse av eglin-aktiviteten kan anvendes testen med anti-eglin-antilegemer (f.eks. oppnåelig av kaniner eller av hybridomaceller oppnåelige monoklonale antilegemer) eller hemmingen av proteasene humanleukozyt-elastase (HLE) eller cathepsin G (Cat G) (1) med eglin.

Således kan innføringen av acetylgruppen eksempelvis skje ved hjelp av en N cx-acetyl-transferase (i ren form, som ekstrakt eller lysat av en egnet mikroorganisme eller som organekstrakt), eksempelvis av E. coli, av kanin-retikulocytter eller hvetekimer (8) i nærvær av acetyl-koenzym A.

Eksempelvis kan oppnåelige eglin-forbindelser med en N-terminal metionylrest overføres i egliner uten en slik rest, idet man avspalter den terminale metionylrest på vanlig måte ved hjelp av bromcyan.

Reaksjonen med bromcyan skjer f.eks. i et vandig-surt medium, f.eks. i sterk fortynnet saltsyre, eksempelvis i 0,1-0,3 N saltsyre, eller i en sterk organisk syre,

f.eks. i 50-70%-ig maursyre, ved værelsetemperatur eller ubetydelig forhøyet eller senket temperatur, f.eks. ved ca. 15° til ca. 25°C over et tidsrom av ca. 24 timer.

Tilsvarende kan oppnåelige forbindelser med en N-terminal acetylert aminogruppe avspalte acylrester. Avspalting av acetyl-resten kan eksempelvis skje enzymatisk, som med egnede acylaser, f.eks. av svinenyrer eller av egnede mikroorganismer, eller med egnede acetyltransferaser i nærvær av koenzym A, hvorved i steden for rene enzympreparater også kan anvendes ekstrakter eller lysater av mikroorganismer hhv. organekstrakter, som inneholder slike enzymer (ved anvendelse av E. coli HB 101 som Na<->acetyl-eglin B eller C produserende stamme eksempelvis et E. coli HBlOl-lysat).

Oppnåelige blandinger av forbindelser kan oppspaltes på

en i og for seg kjent måte i de enkelte komponenter.

Egnede separeringsfremgangsmåter er eksempelvis kromatografiske fremgangsmåter, f.eks. adsorbsjons-kromatografi, ionevekslerkromatografi, HPLC eller reversed-phase HPLC, videre multiplikativ:'fordeling eller elektroforetiske metoder, f.eks. elektroforese på celluloseacetat eller gelelektroforese, spesielt polyakrylamid-gelektroforese ("PAGE").

De fremstillbare forbindelsene kan ikke bare foreligge i fri form, men også i form av deres salter, spesielt i form av deres farmasøytisk godtagbare salter. Da de inneholder flere aminosyrerester med frie aminogrupper hhv. guanidinogrupper, kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen foreligge f.eks. i form av syreaddisjonssalter. Som syreaddisjonssalter kommer i betraktning spesielt fysiologisk godtagbare salter med vanlige, terapeutisk anvendbare syrer; som uorganiske syrer syrer skal nevnes halogenhydrogensyrene (som klorhydrogensyren),

men også svovelsyre og fosfor- hhv. pyrofosforsyre, som organiske syrer er i første rekke egnet sulfonsyrer (som benzen- eller p-toluen-sulfonsyren eller laverealkansulfon-syrene, som metansulfonsyre) samt karboksylsyrer, som eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearinsyre, eplesyre, vinsyre, ascorbinsyre og sitronsyre. Da eglin-forbindelsene også inneholder aminosyre-rester med frie karboksylgrupper, som gir det hele peptid sur karakter, kan de også foreligge som metallsalt, spesielt som alkalimetall- eller jordalkali-metallsalt, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumsalt, eller også foreligge som ammoniumsalt avledet fra ammoniakk eller en fysiologisk godtagbar, organisk nitrogenholdig base. Men da de også samtidig inneholder frie karboksylgrupper og frie amino (og amidino-)-grupper, kan de også foreligge som indre salt.

Alt etter arbeidsmåte får man forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i fri form eller i form av syreaddisjonssalter, indre-salter eller salter av baser. Av syre-addis j onssaltene kan utvinnes på i og for seg kjent måte de frie forbindelser.

Av sistnevnte lar seg ved omsetning med syrer eller baser f.eks. med slike som danner de ovenfor nevnte salter, og inndampning eller lyofilisering utvinne terapeutisk godtagbare syreaddisjonssalter eller metallsalter. De indre salter kan utvinnes ved innstilling av pH på et egnet nøytralt punkt.

Monoklonale antistoffer mot egliner og test-sett, som inneholder slike antistoffer

Egenskapen til antistoffer å binde spesifikke antigener finner praktisk anvendelse utenfor kroppen ved den kvanti-tative bestemmelse (immuno-analyse) og ved rensning av antigenene (immunoaffinitetskromatografi). Av serum immuniserte dyr inneholder vanligvis et flertall av ulike antistoffer som reagerer med det samme antigen på forskjellige bindingssteder med forskjellig affinitet, men dertil også antistoffer mot andre antigener som gjenspeiler de tidligere erfaringer til individet. Den heldige anvendelse av antistoffer for bestemmelse og rensning av antigener krever imidlertid høy spesifitet og reproduserbarhet.

Homogene antilegemer, som oppfyller disse krav, er blitt tilgjengelig ved den av Kohler og Milstein (26) beskrevne hybridoma-teknikk. Prinsippielt består teknikken deri at 3-lymfocytter, som utskiller antistoffer, f.eks. av milt av immuniserte dyr med tumorceller blir sammensmeltet ("fusioniert"). De dannede hybridoma-celler kombinerer

evnen for ubegrenset formering ved deling med evnen å danne og utskille en enhetlig type av antistoffer. Ved kultivering i et selektivt medium, i hvilket ikke fusjonerte tumorceller dør, men hybridoma-celler formerer seg, og ved egnet manipula-sjon kan kloner, dvs. cellepopulasjoner, som avleder seg fra en eneste hybridoma-celle og er genetisk identisk, utvinnes og kultiveres og de av cellene produserte monoklonale antistoffer kan bli isolert.

I henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir mus, f.eks. balb/c-mus, immunisert på en i og for seg kjent, men spesifikk måte. Overraskende lykkes immuniseringe, skjønt egliner er forholdsmessig små protein-molekyler. Ved en foretrukket utførelsesform blir en oppløsning av 50 til 500, foretrukket 100 ^ug eglin B eller C, spesielt i komplett og inkomplett Freund's adjuvans og i puffret saltoppløsning, injisert subkutant omtrentlig pr. uke, eller også i større intervaller under flere uker, eksempelvis 5 til 12 uker, inntil det har dannet seg et tilstrekkelig tall av B-lymfozyter som produserer antilegemer.

Organer som inneholder B-lymfocytter, f.eks. miltceller, av immuniserte mus, blir uttatt og fusjonert med slike myeloma-celler, som ikke vokser på grunn av en mutasjon i et selektivt kulturmedium. Slike myelomaceller er kjente og er eksempelvis slike med betegnelsen X63-Ag8, X63-Ag8,6.5^3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/l eller spesielt SP 2/0.

Ved en foretrukket utførelsesform blir fusjonert miltceller av immuniserte mus med myelomaceller i celle-linje SP2/0.

Fusjonen gjennomføres ifølge en i og for seg kjent fremgangsmåte ved blanding av B-lymfocytter og myelomacellene under tilsetning av et cellefusjonsmiddel, som polyetylenglykol, sendai-virus, kalsiumklorid eller lysolecitin. Fortrinnsvis blir fusjonert i nærvær av polyetylenglykol, eksempelvis med en molekylvekt av 500. Etter fusjonen blir de dannede hybrider kultivert ifølge en i og for seg kjent fremgangsmåte i et selektivt kulturmedium, som er supplert med hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT-medium). Ikke fusjonerte myelomaceller kan ikke vokse

i dette medium og dør likeledes som normale lymfocytter.

Overskytende av hybridoma-kulturene kan prøves ifølge i og for seg kjente fremgangsmåter på deres innehold av spesifikke antilegemer, eksempelvis med en radioimmunoanalyse eller med agglutinering. Herved ble overraskende funnet at med den beskrevne fremgangsmåte kan utvinnes hybridoma-celler som utskiller antilegemer spesifikt mot eglin B

eller eglin C. Disse antilegemer reagerer også med Na-acetyleglin C og B og Na<->metionyl-eglin C og B.

Hybridomacellene som produserer antilegemene av den ønskede spesifitet, blir utselektert av den fra fusjoneringen frembragte blanding av ulike hybridomaceller ved kloning. Dertil blir etter en i og for seg kjent fremgangsmåte, som blir kalt "limiting dilution", ansatt kulturer utgående fra en eneste voksende celle.

På denne måte kan utvinnes de tre hybridomacellelinjer, som ble deponert i Institut Pasteur, Paris, Frankrike, under betegnelsen 299S18-20, 299S22-1 og 299S22-10.

For masseproduksjon blir hybridoma-celleklonene som produserer antilegemer av den ønskede spesifisitet, enten kultivert in vitro i i og for seg kjente medier injisert i mus for formering. Ved en foretrukken utførelsesform blir hybridomaceller injisert i med pristan forbehandlede mus, unntatt ascitesvæske og derav isolert antistoffer ved felling med ammoniumsulfat-oppløsning.

De med hjelp av disse hybridomaceller utvunne monoklonale antistoffer kan anvendes på en i og for seg kjent måte for fremstilling av immuno-affinitetskromatografi-kolonner. Ved en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir tilsatt et egnet bæremateriale (suspendert i en puffer-oppløsning) med en antilegeme-oppløsning, ubundne andeler blir deretter utvasket og ubesatte steder på bærematerialet blir blokkert.

De ved hjelp av hybridomacellene utvunne monoklonale antistoffer kan anvendes på en i og for seg kjent måte for fremstilling av test-sett. Disse test-sett kan bero på forskjellige metoder, eksempelvis på radio-immunodiffusjon, lateks-agglutinering, diape-tester, kompetitive eller sand-wich- radio- immunoassay , enzym-immunoassay, immuno-fluoreszenz eller immunokjemiske enzym-tests, f.eks. ELISA eller tandem ELISA. Slike sett kan foruten vanlige antistoffer av ulik opprinnelse inneholde antistoff-konjugater med enzymer eller fluorescensbærere, dertil et eglin eller modifisert eglin, f.eks. eglin B, eglin C eller Na<->acetyleglin C, merket med radioaktive isotoper som J 125, eller konjugert med enzymer, eksempelvis med reddik-peroksydase eller alkalisk fosfatase, videre enzymsubstrater, egnet puffer, gele, lateks, polystyrol eller andre fyllmaterialer og bærere

De serologiske tester kan utføres eksempelvis som følger: Foruten et kompetivt RIA kan benyttes en direkte bindings-test for å bestemme anti-eglin C antilegeme-aktivitet.

For dette formål blir eglin C fiksert ved inkubering over natten på mikrotiter-plate -fordypninger (200 ng/fordypning), deretter inkuber med hybridoma-kulturvæske og gjort synbar

125

enten med radioaktivt merket [ J]-(fastfase RIA) eller med av alkalisk fosfatase merkert (fastfase ELISA) gjet anti-mus Ig-antilegeme.

De utvalgte tre 'monoklonale antistoffer egner seg for en ikke-radioaktiv tandem ELISA, med hvis hjelp kan bestemmes kvantitativt egliner i kroppsvæske.

De egnede par av antistoffer ble utvalgt ved hjelp av en kompetiv RIA som følger: De monoklonale antistoff 299S18-20, 299S22-1 og 299S22-10 (200-300 ng/fordypning oppnådd ved ammoniumsulfat-utfelling av asciter-væske)

og en polyklonal kanin anti-eglin C-antistoff (200-300 ng/ fordypning, oppnådd av serum) blir fiksert i fordypninger

125

på mikrotiterplater. Inhiberingen av binding av J-merket eglin C ble undersøkt kryssvis.

Forsøkene ga at de monoklonale antistoff 299S18-20 og 299S22-10 inhiberer seg gjensidig ved bindingen på eglin C, hvorfra ble funnet at de to binder seg på den samme

epitop på eglin C molekylet.

De monoklonale antistoffer 299S18-20 og 299S22-1 inhiberer seg ikke gjensidig. Det betyr at de binder seg på forskjellige epitoper i eglin C-molekylet.

Den relative bindingskapasitet, bestemt ved mengden av fiksert radioaktivt merket eglin C, som ble bundet av fikserte antistoffer er størst ved 299S22-10 og minst ved 299S18-20.

På grunn av tandem ELISA-eksperimenter, i hvilke de monoklonale antistoffer ble testet parvis, hvorved alltid et antilegeme var fiksert som fastfase på mikrotiterplater og den andre var merket som væskefase med et enzym, f.eks. alkalisk fosfatase, ble funnet at de ikke-kryssreaktive par 299S18-20/299S22-1 og 299S22-1/299S22-10 egner seg best for en slik kvantitativ analyse, hvorved alltid den første av de nevnte monoklonale antilegeme-par, som binder svakt på eglin C, må anvendes som fastfase.

De monoklonale antistoffer som fastfase kan også benyttes med et polyklonalt anti-eglin C -antistoff, f.eks. fra sau, som væskefase, for kvantitativ bestemmelse av eglin C. bestemmelse av eglin C.

Følsomheten til tandem ELISA ligger ved ca. 1-10 ng eglin C/ ml av en prøve.

Betingelser

Bestemmelsen av assosiasjons-hastighetskonstantene ble utført ifølge Bieth et al (36) . K^-verdiene for veksel-virkningen av Na<->acetyl-eglin C med HLE og H.Cat.G. ble beregnet av "steady state" reaksjonshastigheter ved antagelsen av at disse vekselvirkninger er reversible. Alle verdier ble bestemt ved 37°C og pH 7,4.

Dataene viser at assosiasjons-hastighetskonstantene for reaksjonen av Na<->acetyl-eglin C samt av de naturlige inhibitorer a.. PI og a-M med HLE hhv. H.Cat.G. ligger i den samme størrelsesorden. Den høye stabilitet av N a-acetyl-eglin-enzym-komplekser (I^-verdier!), den påviste, ytterst lille toksisitet av eglinene, samt deres spesifitet (signi-fikant vekselvirkning med andre pattedyr-proteinaser, spesielt med slike blodstørknings-, fibrinolyse- og komplement-systemene ble ikke påvist), deres på grunn av de N-terminale acetylgrupper forhøyede stabilitet overfor proteolyttisk avbygning med aminopeptidaser og den i sammenligning til de kroppsegne faktorer a^PI og a^ K lette tilgjengelighet av større mengder ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anbefaler disse forbindelser for den farmakologiske evaluering ved sykdomsbilder som er karakterisert med av HLE forårsakede vevsødeleggelser.

Virkningen av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen viser seg eksempelvis i den eksperimentelle emfysem-modell. En time før emfysem-induksjon ved intratrakal applikasjon av 0,3 mg HLE på hamster ble likeledes intratrakalt applisert 0,3 mg hhv. 2 mg Na<->acetyl-eglin C (på hver 8 dyr). Ved ikke beskyttede dyr (ikke forbehandlet med Na<->acetyl-eglin C) viste de etter to måneder gjennomført lungefunksjonstest og histologiske undersøkelser alvorlige lungeobstruksjoner og emfysema. I motsetning hertil oppviser alle med Na-acetyl-eglin C forbehandlede dyr normale lungefunksjoner. Den histologiske undersøkelse av lungene ga kun ved to av åtte dyr av lavdose-gruppen (0,5 mg Na<->acetyl-eglin C), uvesentlige, lokale emfysematiske forandringer, de øvrige dyr oppviste ingen forandringer, hvorved er bevist beskyt-telses virkningen av det intratrakalt appliserte Na<->acetyl-eglin C og samtidig dens lille toksisitet.

De nye eglin-forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, spesielt Na<->acetyl-eglin-forbindelsene, kan derfor anvendes for profylakse og for den terapeutiske behandling av lunge-sykdommer, f.eks. av leukocyt-elastase frembragte lunge-sykdommer, som lungeemfysem og ARDS ("acute respiratory distress syndrome"), mucoviscidose, videre ved septisk sjokk samt som antiflogistika og antiinflammatorika.

Farmasøytiske sammensetninger som inneholder forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan finne anvendelse spesielt ved de ovenfor angitte indikasjoner, når de administreres f.eks. parenteralt ( som intravenøst eller intrapulmonalt) eller topisk. Doseringen avhenger i første rekke av den spesifikke forarbeidelsesform og av formålet for terapien

hhv. profylaksen.

Administreringen skjer ved intravenøs injeksjon eller intrapulmonalt, ved inhalering, f.eks. med et Bird-

apparat. I overensstemmelse hermed inneholder farmasøytiske preparater for parenteral administrering i enkeltdose-form i avhengighet av applikasjonsarten pr. dose ca. 10 til 50 mg av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Foruten det virksomme stoff inneholder disse farmasøytiske sammensetninger vanligvis ytterligere natriumklorid, mannit eller sorbit for innstilling av isotoni. De kan foreligge i frysetørket eller oppløst form, hvorved oppløsninger med fordel kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0,3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller

-etylester.

Et preparat for den topiske anvendelse kan foreligge som vandig oppløsning, lotion eller gelé, oljeholdig oppløsning eller suspensjon eller foreligge som fettholdig eller spesielt emulsjons-salve. Et preparat i form av en vandig oppløsning får man eksempelvis ved at man oppløser virke-stoffet fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk godtagbart salt derav i en vandig bufferoppløsning med pH 4 til 7,5

og tilsetter dersom ønsket et ytterligere virksomt stoff, f.eks. et antiinflammatorikum og/eller et polymert hefte-middel, f.eks. polyvinylpyrrolidon, og/eller et konserveringsmiddel. Konsentrasjonen av det virksomme stoff er ca. 0,1

til ca. 5 mg, fortrinnsvis o,25 til 1,0 mg, i 10 ml av en oppløsning hhv. 10 g av en gel.

En oljeholdig applikasjonsform for den topiske administrering fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk godtagbart salt derav i en olje, eventuelt ved tilsetning av svellemidler, som aluminiumstearat, og/eller overflateaktive midler (tensider) hvis HLB-verdi ("hydrophilic-lipophilic-balance") ligger under 10, som fettsyremonoestere av flerverdige alko-holer, f.eks. glycerinmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbi-tanmonostearat eller sorbitanmonooleat. En fettholdig salve får man f.eks. ved suspendering av det'virksomme stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen eller deres salter i en strykjbar fettbase, eventuelt under tilsetning av et tensid med HLB-verdi under 10. En emulsjonssalve får man ved findeling av en vandig oppløsning av det virksomme stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen eller deres salter i en myk, strykbar fettbase under tilsetning av et tensid, hvis HLB-verdi ligger under 10.

Alle disse topiske applikasjonsformer kan også inneholde konserveringsmidler. Konsentrasjon av det virksomme stoff er ca. 0,1 til ca. 5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg i ca. 10 g av grunnmassen.

Inhalasjonspreparater for behandling av luftveiene ved intrapulmonal administrering er f.eks. aerosoler eller sprays, hvilke kan fordele det farmakologiske virksomme stoff i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater, i hvilke det farmakologiske virksomme stoff fore-ligger i oppløsning, inneholder foruten dette et egnet drivmiddel, videre, dersom nødvendig, et ytterligere opp-løsningsmiddel og/eller en stabilisator. I steden for drivgassen kan også anvendes trykkluft, hvorved denne kan frembringes etter behov ved hjelp av en egnet kompremerings-og trykkavlastningsinnretning.

Spesielt egnet for administreringen er Bird-pusteapparater, som er innført og kjent i medisinen, herved blir en oppløsning av det virksomme stoff innført i apparatet og findelt med lett overtrykk og bragt i lungene til den pustende pasient.

Alt etter alder, individuell tilstand og arten av sykdommen er ved et varmblodig vesen (menneske eller dyr) med ca.

70 kg vekt doseringen ved intrapulmonal administrering ca.

10 til ca. 30 mg pr. inhalering (en til to ganger daglig) og ved intravenøs administrering, f.eks. også ved kontinuerlig infusjon, ved ca. 10 til ca. 1000 mg pr. dag.

Terapeutisk virksomme sputum- og plasmakonsentrasjoner,

som kan bestemmes ved hjelp av immunologiske fremgangsmåter, som ELISA, ligger mellom 10 og 100 ^ug/ml (ca. 1 til lO^UMol/1).

Noen utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse som er beskrevet i den etterfølgende eksperimentelle del blir illustrert ved hjelp av de vedlagte tegninger.

I fig. 1 er syntesen av delstykkene (C) og F2 til

eglin C-genet fremstilt skjematisk.

Figur 2 viser fremstillingen av plasmidet pML.87, kloningsvektoren for delstykket F^{ C) til eglin C-genet. Fig. 3 viser i overensstemmelse dermed fremstillingen av plasmidet pMLl36, kloningsvektoren for delstykket F2 til eglin C- hhv. eglin B-genet.

I fig 4 er illustrert konstruksjonen av kloningsvektoren pMLl41, hvilken inneholder F^(C)-F2~DNA-et.

I fig. 5 er skjematisk fremstilt fremstillingen av vektoren pHRil4 8, hvilken inneholder trp-promoteren.

Fig. 6 viser skjematisk fremstillingen av ekspressjonsplasmidet pML147, som inneholder eglin C-Genet [F^(C)-F2~DNA under kontrollen av trp-promoteren.

De følgende eksempler tjener for illustrasjon av oppfinnelsen og skal på ingen måte begrense denne.

Eksperimentell del

De i eksemplene anvendte forkortninger har den følgende betydning: TNE Oppløsning som inneholder 100 mM NaCl, 50 mM

Tris-HCl pH 7,5 og 5 mM EDTA,

SDS Natriumdodecylsulfat

EDTA Etylendiamintetraeddiksyre

DTT 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butandiol) BSA Kveg-serumalbumin

EtBr Etidiumbromid

Tris Tris-(hydroksymetyl)-aminometan

Tris*HCl Monohydroklorid av Tris

Eksempel 1

Fremstilling av den beskyttede nukleosid- polystyren- harpiks

3,1 g (5 mMol) 5<1->(4-metoksytrityl)-N-benzoyl-deoksycytidin i 20 ml abs. pyridin tilsettes 750 mg ravsyreanhydrid og 910 mg 4-dimetylaminopyridin og lar stå 16 timer ved værelsetemperatur.

Etter inndampning av pyridinoppløsningen opptas i 200 ml eddiksyreetylester, utrystes to ganger med hver gang 200 ml 0,1 M fosfatbuffer under tilsetning av 10 ml mettet koksalt-oppløsning, vaskes ytterligere med mettet koksaltoppløsning, tørkes, inndampes og tildryppes heksan. Det utfelte produkt fraskilles og findeles to ganger med eter, oppløses deretter i 300 ml eddiksyreetylester og utrystes ved 0°C med 180 ml 0,1 M kaliumhydrogensulfat av pH 2,5. Etter to gangers vasking med vann tørkes eddikesteroppløsningen med natriumsulfat, filtreres, tilsettes 0,5 ml pyridin, inndampes og fortynnes dråpevis med heksan. Det utfelte rav-syrederivat frafiltreres.

1,17 g av denne forbindelse oppløses sammen med 190 mg N-hydroksysuksinimid i 4 ml eddiksyreetylester og 2 ml dimetylformamid og tilsettes ved 0°C med 370 mg N,N'-dicykloheksylkarbodiimid. Etter oppbevaring over natten i kjøleskap avfiltreres det utfelte N,N<1->dicykloheksylurin-stoff, filtratet fortynnes med eddiksyreetylester,

ekstraheres med kald 0,1 M natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes og inndampes i vakuum til tørrhet. Residuumet kromatograferes med eddiksyreetylester på kiselgel. DC:

R_ 0,58 i diklormetan-metanol (9:1).

88 mg av denne N-suksinimidoyl-ravsyreester omrøres 20 timer med 1 g aminometyl-polystyren (amininnhold 110 ^uMol/g)

i 2 ml diklormetan og 4 ml dimetylformamid. Den polymere harpiks avfiltreres og utvaskes med dimetylformamid, metanol, diklormetan og metanol. Etter tørkingen acetyleres de ikke omsatte aminogrupper, idet harpiksen omrøres 30 minutter i 6 ml pyridin med 1 ml eddiksyreanhydrid og 100 mg 4-dimetylaminopyridin. Den polymere harpiks utvaskes med diklormetan, dimetylformamid, metanol og diklormetan og tørkes inntil vekten blir konstant. Den spektroskopiske metoksytrityl (MMT)-bestemmelse gir en belastning av 85^uMol/g.

Eksempel 2

Analogt eksempel 1 blir fremstilt følgende beskyttede nukleosid-polystyren-harpikser:

av 51 -(4-metoksytrityl)-

tymidin, belastning

92^uMol/g.

Eksempel 3

Syntese av trinukleotidet

a) Syntese av dinukleotidet

7,73 g (15 mttol) 5'-(4-metoksytrityl)-tymidin (MMT-0-T-OH)

inndampes to ganger med abs. pyridin. Residuumet oppløses i 20 ml abs. tetrahydrofuran og dryppes til 80 ml av en

0,2 M oppløsning av 2-klorfenyl-di-(1-benzotriazolyl)-fosfat i tetrahydrofuran under omrøring og utelukkelse av fuktighet og reaksjonsblandingen omrøres 1 time ved værelsetemperatur. Den dannede oppløsning av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5<1->

(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfatet blir delt i tre deler.

a) Hydrolyse til trietylammonium-2-k.lorfenyl-5 1 - (4-metoksy trityl) -tymidin-31-fosfat: Til en tredjedel av den ovenfor nevnte oppløsning av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5<1->(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat gis under kjøling 100 ml 0,5 M trietylammoniumbi-karbonat. Etter 15 minutter ekstraheres med diklormetan. Diklormetan-oppløsningen vaskes med vann, inndampes og tilsettes dråpevis med petroleter. Den dannede felling avfiltreres, utvaskes med eter-petroleter 1:1 og tørkes i vakuum. DC: R^O,35 i diklormetan-metanol-vann (75:22:3). &) Forestring til 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-51 -(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat og avspaltning av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen: Til en tredjedel av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzo-triazolyl-5 '- (4-metoksytrityl) -tymidin-fosf at gis 1,3 ml 2-cyanoetanol og 2 ml pyridin. Blandingen oppbevares over natten ved værelsetemperatur. Oppløsningsmidlet avdestil-leres i vakuum og residuumet oppløses i eddiksyreetylester og utrystes flere ganger med 0, 1 M fosfatbuffer pH 7 og vann. Den organiske fase tørkes,•. inndampes og inndryppes i heksan. Bunnfallet frafiltreres, oppløses i 50 ml diklormetan-metanol 7:3 og tilsettes ved 0°C med en opp-løsning av 3,8 g p-toluensulfonsyremonohydrat i 75 ml diklormetan-metanol 7:3. Etter 2 timer fortynnes reaksjons-oppløsningen med diklormetan og utrystes med en kold natriumhydrogenkarbonat-oppløsning. Den organiske fase inndampes og tilsettes heksan. Det utfelte 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-tymidin-3'-fosfat kromatograferes på kiselgel med diklormetan-metanol 96:4. DC: R_ av 0,45 i diklormetan-metanol (9:1).

Y) Kondensasjon til 5'-(4-metoksytrityl)-3'-cyanoetyl)-bis-tymidin-dinukleotidet: 2,2 g 2-cyanoetyl-2-klorfenyl-tymidin-3'-fosfat avvannes to ganger ved inndampning med abs. pyridin, oppløses i 20 ml abs. tetrahydrofuran og gis til den restlige tredjedel av oppløsningen av 2-klorfenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-metoksytrityl) -tymidin-3'-fosfat. Etter 18 timer ved værelsetemperatur blir tilsatt til reaksjonsoppløsningen under iskjøling 10 ml vann og 200 ml eddiksyreetylester. Den organiske fase vaskes flere ganger med natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes over natriumsulfat og inndampes til et lite volum. Det i fosfat-delen og på 5'- hhv. 3'-enden beskyttet dinukleotid utfelles ved inndrypping i eter-heksan 1:1. DC: R f 0,4 8 i diklormetan-metanol (9:1).

b) Syntese av trinukleotidet

1,17 g (1 mMol) av det ovenfor beskrevne fullstendige

beskyttede dinukleotid oppløses i 30 ml diklormetan-metanol 7:3 og tilsettes under iskjøling med en oppløsning av 1,9 g p-toluensulfonsyremonohydrat i 20 ml diklormetan-metanol 7:3. Etter 2 timer tilsettes iskald natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og ekstraheres med diklormetan. Den organiske fase tørkes, inndampes og inndryppes i heksan. Det utfelte råe dinukleotid med fri 5'-hydroksygrupper kromatograferes på kiselgel med en gradient av 2-8% metanol i diklormetan. DC: R^ 0,33 i diklormetan-metanol (9:1).

850 mg av dette 5'-hydroksy-dinukleotid og 1,06 g trietyl-ammonium-2-klorfenyl5'-(4-metoksytrityl)-tymidin-3'-fosfat [jfr. avsnitt a)a)] inndampes to ganger med pyridin, opp-løses deretter i 10 ml abs. pyridin og tilsettes 560 mg mesitylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazolid (MSNT). Etter 2 timer tilsettes 2 ml iskaldt vann og etter en ytterligere time ekstraheres med diklormetan. Den organiske fase vaskes med mettet natriumhydrogenkarbonat og vann, tørkes, inndampes og tilsettes eter. Det utfelte trinukleotid renses ved kromatografi på kiselgél. R^ 0,45 i diklormetan-metanol (9:1) .

Eksempel 4

Analogt eksempel 3 fremstilles følgende beskyttet trinukleotid med den generelle formel 12 3 12 3 avkortet B B B . For nukleosidene B , B , B anvendes følgende forkortninger:

A = N-benzoyl-deoksydenosin

C = N-benzoyl-deoksycytidin

G = N-isobutyryl-deoksyguanosin

T = tymidin

a) Tynnskiktkromatogram på kiselgel i diklormetan-metanol 9:1.

Eksempel 5

Syntese av DNA-fragmentet med en lengde av 61 baser av

base nr. 172 til base nr. 232 til den komplementære DNA-

tråd ( 172/ 61 komplementær)

a) Avspaltning av 2-cyanetylbeskyttelsesgruppen til tri nukleotidet: 15^,uMol av trinukleotidene fra eksempel 3 eller 4 oppløses under utelukkelse av fuktighet i 60 ^,ul pyridin-acetonitril-trietylamin 1:1:1. Etter 1 time ved værelsetemperatur tildryppes 0,7 ml peroksydfri eter og bunnfallet avsentri-fugeres. Det råe trietylammoniumsalt oppløses i 50 ^ul pyridin og utfelles ytterligere med 0,5 ml eter, avsentri-fugeres og tørkes 15 timer i høyvakuum.

b) Kobling av det delbeskyttede trinukleotid med den på polystyren- harpiks bundne oligonukleotidkjede

Alle operasjoner blir gjennomført under utelukkelse av fuktighet i et reaksjonskar med 2 80 ^ul innhold og med mikro-prosesstyrte oppløsningsmiddel- og reagens-tilførsler.

17,6 mg (1,5 ^uMol) av cytidin-polystyren-harpiksen

(eksempel 1) blir forlagt i reaksjonskaret og underkastet følgende operasjoner:

1. Metylenklorid, 2 ml/min, 5 min.

2. Metylenklorid-isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 min.

3. Sinkbromid IM og 1,2,4-triazol 0,02 M i metylenklorid-isopropanol (7:3), 1 ml/min., 2-3,5 min.

4. Metylenklorid-isopropanol (85:15), 2 ml/min., 3 min.

5. Trietylammoniumacetat 0,5 M i DMF, 2 ml/min., 10 min.

6. Molekylsikt-tørket pyridin, 2 ml/min., 5 min.

7. Tetrahydrofuran (peroksyd-fri, molekylsikt-tørket) , 2 ml/ min., 5 min.

8. Nitrogenstrøm, 10 min.

9. Injeksjon 15yuMol trinukleotid AAA (trimetylammoniumsalt fra avsnitt a)) og 13,3 mg (45 ^uMOL) mesitylensulfonyl-3-

nitro-1,2,4-triazolid (MSNT) oppløst i 160 ^ul pyridin. 10.40°C, 30 min.

11. Pyridin, 2 ml/min., 5 min.

12. acetanhydrid 5% og 4-dimetylaminopyridin 2,5% i pyridin,

2 ml/min., 5 min.

13. Pyridin, 2 ml/min., 5 min.

14. Pyridin-isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 min.

Alle 14 operasjoner blir gjentatt 19 ganger, hvorved ved

9. operasjonen i steden for AAA alltid blir anvendt følgende trinukleotider i form av deres trietylammoniumsalter

(avsnitt a)): AGA, TGT, GGT, CTG, TAC, TAG, CGT, CAA, TAA,

GGT, CAT, GAA, GCG, CAT, CAA, AAC, CCT, GAT, CAG. Det

midlere koblingsutbytte er .96%. Sluttproduktet har følgende struktur:

c) Avspaltning av DNA-fragmentet fra bæreren og avspaltning av beskyttelsesgruppene

40,2 mg (ca. 0,66 ^uMol) DNA-synteseharpiks/172/61 komplementær blir holdt med 66 mg (0,40 mMol) o-nitrobenzaldoksim og 50,ul (0,40 mMol) 1,1, 3, 3-tetrametylguanidin i 400 ,ul 95%ig pyridin i 3 timer ved 50 oC og 12 timer ved værelsetemperatur. Etter avblåsningen av pyridinet med nitrogen tilsettes residuumet 1,6 ml vandig ammoniakk (33%) og holdes i det lukkede kar i 24 timer ved 50°C.

Den fraskilte flytende fase befries i vakuum fra ammoniakk og vaskes 3 ganger med hver gang 3 ml peroksydfri dietyleter. Etter fraskillelsen av de lavmolekylære bestanddeler på en biogel P6 kolonne (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 molar trimetyl-ammoniumhydrogenkarbonat pH 7,5, 1,5 ml/min) isoleres 285 ODs (260 nm) DNA.

Totalt blir 60 OD-er adskilt på en HPLC-kolonne (PRP-1/ Hamilton, 250 x 4,6 mm). Gradient(oppløsning A: 0,05 M trietylammoniumacetat pH 7,0; oppløsning B: oppløsning A: acetonitril 1:1) : 30% B i A —<=>s> 60% B i A i 20 min. ved 50°C

og 2 ml/min. Den lipofile hovedtopp (retensjonstid ca. 14 min.), blir samlet, oppkonsentrert på en DE52-cellulose

(Whatman) kolonne, eluert og felt med etanol. For avspaltning av 4-metoksytrityl-beskyttelsesgruppen blir bunnfallet oppløst i 50yUl eddiksyre/H20 (4:1) og holdt 45 min. ved værelsetemperatur. Reaksjonsproduktet blir lyofilisert,

felt med etanol og for rensning elektroforetisk oppspaltet på en 8% polyakrylamidgel (7 M urinstoff). De tilsvarende bånd med de ventede DNA-størrelser blir utsnittet og produktet elektroeluert, oppkonsentrert på DE52-cellulose og DNA med strukturen 5<1->CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACC-TGGGTTGTAGAAAAC-3' felt med etanol.

Eksempel 6

Analogt eksempel 5 blir fremstilt følgende DNA-fragmenter (5'-3«) : 1/40 3 0/37 komplementær: 67/34 91/37 komplementær (C) 91/37 komplementær (B) 124/61

Videre blir fremstilt de følgende forkortede fragmenter: 1/40 ( A12) (C) og 1/40 {/\ 18) (C<n>)

Eksempel 7

Fosforylering av fragmentene 30/ 37, 67/ 34, 124/ 61 og 172/ 61 Fosforyleringen og den radioaktive merking på 5'-endene skjer med [y- 32P]ATP og polynukleotid-kinase (Boehringer) som beskrevet (19).

Eksempel 8

Polymerisering til Duplex III (delstykke til eglin C og eglin B- enet

50 pMol fragment 124/61/kinasebehandlet og 50pMol fragment 172/61/kinasebehandlet blir oppløst i 24,ul vann, oppløsningen oppvarmes 3 mm. til 90 oC og avkjøles i løpet av 5 min. til 12°C. Etter tilsetning av 4^ul endo-R buffer (0,1 molar Tris-HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2 66 mM 3~merkaptoetanol, 0,6 M NaCl), 10 ,ul deoksynukleosidtrifosfat-blanding (dATP, dCTP, dGTP, TTP, hver 2*10 molar, innstilt med NH^ på pH 7,0)

og 2 ,ul (10 enheter) DNA-polymerase I, Klenow-fragment (Boehringer) inkuberes i 30 min. ved 12 oC. Reaksjonen stoppes ved 3 minutters oppvarmning til 90°C og blandingen oppbevares ved -80°C inntil videre forarbeidelse.

På analog måte polymeriseres fragmentene 1/40 og 30/37, 67/34

og 91/37 (C) hhv. 67/34 og 91/37 (B) til dupleksene I, II (C) hhv. II (B).

Dupleksene I-III har de følgende strukturer:

Dunleks I Dupleks II (C) Dupleks II (B) Dupleks III (delstykke F-til eglin C- og eglin B-genét)

Pa samme

måte polymeriseres fragmentene l/40 (/\12) (C) og. 30/37 samt fragmentene 1/40 (^18) (C") og 30/37 til dupleksene I

(C)og " I (C").

Dupleksene I (C<1>) og I (C") har de følgende strukturer:

Dupleks I (C)

Dupleks I (C")

Eksempel 9

Ligering av dupleks I med dupleks II (C), fremstilling av delstykket F. ( C) til eglin C- genet 60 pMol dupleks I og 60 pMol dupleks II (C) (jfr. eksempel 8, kun kinasebehandlet på A og G 5'-endene) oppløses i 54^ul ligase-buffer (66 mM Tris<*>HCl pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP), tilsettes 6 ,ul (= 6 enheter T -DNA-o 4 ligase og inkuberes i 21 timer ved 20 C. Reaksjonen blir stoppet ved 5 minutters oppvarming ved 70°C og DNA-et blir isolert etter fenol/kloroform-ekstraksjon ved etanolfelling.

Etter oppspalting av blandingen av en 8% polyakrylamidgel (nativ) ved elektroforese blir ligeringsproduktene 122-132 basepar elektroeluert, oppkonsentrert på en DE52-cellulose-kolonne og isolert etter eluering ved etanolfelling.

Delstykket F^ (C) til eglin C-genet har den følgende struktur:

På analog måte blir 60 pMol dupleks I (C) hhv. I (C") og SOpMol dupleks II sammenbundet til deltstykkene F, (C) hhv. F1 (C") til det forkortede eglin C-genet.

Delstykkene F^ (C) og F^ (C") har de følgende strukturer:

Eksempel 10

Ligering av dupleks I med dupleks II (B), fremstilling av delstykket ( B) til eglin B- genet

På analog måte som beskrevet i eksempel 9, blir 60 pMol dupleks I og dupleks II (B) ligert med hverandre.

Delstykket F1 (B) til eglin (B)-genet har den følgende struktur:

Eksempel 11

Fremstilling av plasmidet pML87, inneholdende F1 (C)-DNA-et til eglin C- genet ( fig. 2) a) Fremstilling av den lineæriserte vektor pBR322/ EcoRI/ BalI.

30 ^ug pBR322 plasmid-DNA fordøyes med 5 enheter Ball

restriksjonsendonuklease i 200 ml av en oppløsning av 100^,ug/ml gelatin i 5 timer ved 37UC. Deretter innstilles oppløsningen på 100 mM Tris'HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og DNA-et fordøyes med 30 enheter EcoRI-restriksjonsendonuklease i 2 timer ved 37°C. Deretter innstilles oppløsningen på TNE, ekstraheres med 1 volum fenol og kloroform og den fordøyde DNA utfelles med 2 volum alkohol ved -20°C over natt.

Den av pBR322 DNA-et utsnittede vektor (pBR322/EcoRI/BalI, 2916 basepar fraskilles ved densitetsgradiens-sentrifugering i sukrose (5-23%) i 50 mM Tris'HCl (pH 8) og 1 mM EDTA fra det lille DNA-fragment (1445 basepar). Sentrifugeringen gjennomføres ved 36.000 opm. i en TST 41rotor (Kontron AG)

i 16 timer ved 15°C. Deretter utvinnes fra den sentrifugerte oppløsning fraksjoner å0,2 ml med en ISCO gradient-samler.

De fraksjoner som inneholder det store DNA-fragment (2916 basepar), forenes og DNA-et utfelles med alkohol. Bunnfallet oppløses i 100 ,ul 10 mM Tris-HCl (oH 8). 0,1 mM EDTA og oppbevares ved -20 oC inntil dens anvendelse som klone-vektor. 5,1 ^ug (= 10,5 pMol ender) DNA blir oppnådd.

b) Fremstilling av F^( C)- DNA/ EcoRI

16 ng (= 0,84 pMol ender) av den kjemisk syntetiserte F^(C)-DNA (se eksempel 9) fordøyes med 5 enheter EcoRI restriksjonsendonuklease i 50/ul 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl og 100 yug/ml gelatin i 1 time ved 37°C. Deretter tilsettes oppløsningen 0,5 ^ug (= 1 pMol ender) av den lineæriserte vektor pBR322/EcoRI0BalI (eksempel lia). Deretter inaktiveres enzymet ved oppvarming til 65°C etter 10 min., oppløsningen innstilles på TNA og ekstraheres med fenol/kloroform. DNA-et blir utfelt med alkohol. Det utfelte DNA lagres under alkohol ved -20°C inntil videreforarbeidelse. c) Ligiering av pBR322/EcoRI/BalI vektor-DNA-et med F^(C)-DNA/ EcoRI- et og konstruksjon av plasmidet pML8 7.

Det i eksempel 11b) dannede DNA-bunnfall, som inneholder de to nevnte DNA-bruddstykker, oppløses i 30^ul av en oppløs-ning av 50 mM Tris<*>HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 /Ug/ml gelatin og behandles med 25 enheter /^ul T4 DNA-ligase ved 15°C i 16 timer. På denne måte

dannes i oppløsningen det rekombinerte plasmid pML87, som inneholder F1 (C)-DNA-et.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML87

De for transformasjonen nødvendige med kalsium forbehandlede

E. coli HB101 celler blir fremstilt som beskrevet av Mandel

et. al. (6).

Den under c) oppnådde oppløsning som inneholder det rekombinerte plasmid pML 87, oppvarmes i 10 min. ved 65°C

for å innaktivere T^-DNA ligasen og avkjøles deretter til 3 7 C. lOyUl av denne reaksjonsblanding tilsettes til 150

yUl kalsium-behandlede E. co1i HBlOl-celler i 10 mM MgC^ og

10 mM Tris-HCl (pH 7,5) i et totalt volum av 200 ^ul.

Deretter kjøles denne blanding i 30 min. i is, oppvarmes

2 min. til 42°C og las deretter stå 50 min. ved 37°C i

1 ml L-medium (jfr. eksempel 21). Derpå utstrykes blandingen i aliquote deler å 0,2 ml på 5 agarplater (McConkey-Agar, Difco), som inneholder 60 ,ug/ml ampicillino. Agar-

platene holdes deretter 16-18 timer ved 37 C. 470 ampicillin-resistente kolonier av den transformerte E. coli HB 101 blir oppnådd.

e) Utsortering av kolonier som inneholder F.. ( C)- DNA

470 transformerte kolonier (eksempel lid) blir avtrykt på

nitrocellulosefilter B85 (Schleicher und Schiill) . Ifølge Grunstein og Hogness (24) lyseres koloniene og deres denaturerte DNA fikseres på filteret. Deretter skjer en forhybridisering av filteret i 20 ml (pr. filter) 4xSET [= oppløsning av 30 mM Tris"HCl (pH 8), 150 mM NaCl, ImM EDTA], 0,1% (g/v Ficoll 400 (Pharmacia) , 0,5% SDS, SOAig/ml denaturert kalvtymus-DNA i 4 timer ved 64 oC. Deretter behandles nitro-cellulosef ilteret i 20 ml (pr. filter) 5xSET (g/v) Ficoll 400, 0,2% SDS og SO^ug/ml denaturert kalvtymus-DNA i. 16 timer ved 64°C med den "^P-radioaktivt merkede prøve (ca. 10^-10^ Cerencov cpm pr. filter). Som probe anvendes oligonukleotidet 91/37 komplementært (C) (jfr. eksempel 6.)

Deretter vaskes filteret 2 ganger i 2xSET, 0,2% SDS ved værelsetemperatur, deretter to ganger i 2XSet, 0,5% SDS ved 60°C (først 30 min., deretter 60 min.). Deretter tørkes filteret mellom 3MM papir og legges ved -80°C på en røntgen-film med en forsterkningsfolie i 1-2 dager.

Det oppnådde autoradiogram viser 71 positive kolonier (kloner), som kan anvendes for viderearbeide, en av disse får betegnelsen pML87.

På analog måte fordøyes det kjemisk syntetiserte F^ (C<1>)-

DNA hhv. F1 (C")-DNA (jfr. eksempel 9) med EcoRI og ligeres med den lineæriserte vektor pBR322/EcoRI/BalI, hvorved dannes plasmidet pML87 (C), inneholdende F1 (C)-DNA, hhv. plasmidet pML87 (C"), inneholdende F^(C")-DNA-et. E. coli HBlOl-celler transformeres med plasmidet pML87 (C) hhv.

pML87 (C") og kultiveres på ampicillin-holdige agar-plater.

95 hhv. 120 ampicillin-resistente kolonier blir oppnådd. Utsorteringen av de transformerte kolonier med oligonukleotidet 91/37 komplementært (C) fører til identifisering av 37 kolonier som inneholder F^ (C')-DNA-et, hhv. av 58

kolonier som inneholder F^ (C")-DNA-et.

Eksempel 12

Fremstilling av plasmidet pML90, inneholdende F1(B)-DNA-et

til eglin B- genet

På analog måte, som beskrevet i eksempel 11b) fordøyes 16^ug av det kjemisk syntetiserte F^ (B)-DNA med 5 enheter EcoRI-restriksjonsendonuklease og blandes med den lineæriserte vektor pBR322/EcoRI/BalI. Enzymet inaktiveres og DNA-et utfelles med alkohol. DNA-bunnfallet behandles ifølge eksempel lic) med T^-DNA-ligase, hvorved dannes et plasmid, som inneholder F^(B)-DNA-et.

De~t rekombinerte plasmid inneholdende oppløsning anvendes tilsvarende eksempel lid) for transformasjonen av kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. 310 ampicillin-resistente kolonier av den transformerte E. coli HB101 blir oppnådd.

De 310 kolonier prøves i analogi med eksempel lie) på tilstedeværelsen av F, (B)-DNA, hvorved som prøve anvendes oligonukleotidet 91/37 komplementært (B). I det oppnådde autoradiogram er 55 positive, for viderearbeide anvendbare kloner erkjennelig. En derav fikk betegnelsen pML90.

Eksempel 13

Fremstilling av plasmid pMLl3 6, som inneholder F2-DNA-et

( fig. 3)

a) Fremstilling av den lineæriserte vektor pBR322/ BamHI/ NruI 15 ,ug pBR322 plasmid-DNA fordøyes med 30 enheter BamHI restriksjonsendonuklease 30 min. ved 37 oC i en oppløsning av 100 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 100 ^ug/ml gelatin . Deretter tilsettes oppløsningen-15 enheter Nrul restriksjonsendonuklease og fordøyes 2 timer ved 37°C.

Reaksjonsblandingen oppvarmes i 10 minutter ved 70°C for

å innaktivere enzymene. Deretter adskilles de to DNA-fragmenter fra hverandre ved gelelektroforese på 1%-ig lav-smeltende agarose i tris-acetat EDTA buffer pH 8. Etter farving av DNA-ene i agarosegelen med EtBr blir stedet på

gelen som inneholder DNA-båndet til pBR322/BamHI/NruI vektoren (= 3766 basepar) utsmittet fra gelen og gjort flytende 10

min. ved 65°C. Deretter tilsettes til det flytende agar-osegelstykket 2 volum 100 mM Tris<*>HCl (pH 8,7) og blandingen avkjøles til 37°C. Denne DNA-blanding fordøyes med 0,5 enheter alkalisk fosfatase av kalvtarm (Boehringer) i 30 min.

ved 37°C. Ved oppvarming av oppløsningen i 60 min. ved 65°C inaktiveres enzymet.

Til denne fosfatasebehandlede DNA-oppløsning tilsettes

20 volum TNE og DNA-et renses ifølge Mueller et al. (23)

med DE-52 kromatografi, ekstraheres med fenol/kloroform og

DNA-et utfelles ved -20°C over natten med alkohol. DNA-bunnfallet oppløses i 50 ^ul 0,01 M Tris<*>HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA og oppbevares ved -20°C inntil anvendelse. l,5^ug

(=2,4 pMol ender) DNA blir oppnådd.

b) Fremstilling av F^- DNA/ BamHI- et

l,6yug (= 90 pMol ender) av det kjemisk syntetiserte F2~DNA

(eksempel 8) fordøyes ved 37°C i 30 minutter med 16 enheter BamHI restriks jonsendonuklease i 20 ^ul 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 og 100 ^ug/ml gelatin. Deretter tilsettes oppløsningen 60 ng (=96 nMol ender) av den lineæriserte vektor pBR322/BamHI/NruI (eksempel 13a), hele oppløsningen innstilles på TNE og ekstraheres med fenol/kloroform og DNA-et utfelles med 2 volumer alkohol. Det utfelte DNA lagres inntil videre forarbeidelse under alkohol ved -20°C.

c) Ligering av pBR322/BamHI/NruI vektor-DNA-et med F2~DNA/

BamHI- et og konstruksjonav plasmidet pML136

Det under eksempel 13b) dannede DNA-bunnfall, som inneholder de to nevnte DNA-bruddstykker oppløses i 20^ul av en oppløsning av 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 ^ug/ml gelatin og behandles med 15 enheter/^,ul T4 DNA-ligase ved 15°C i 3 timer.

På denne måte dannes i oppløsningen det rekombinerte plasmid pMLl36, som inneholder F2~DNA-et.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML! 36 Transformasjonen av de med kalsium behandlede E. coli HB101

celler skjer som beskrevet i eksempel lid). Det anvendes 10^,ul av den i eksempel 13c) dannede reaksjonsblanding.

65 ampicillin-resistende kolonier blir oppnådd.

e) Utsortering av koloniene som inneholder F2~ DNA- ene

65 transformerte kolonier (eksempel 13d) prøves på F2~DNA,

som beskrevet i eksempel lie). Som radioaktiv prøve anvendes oligonukleotidet 172/61 komplementært (jfr. eksempel 5).

I autoradiogrammet fåes 2 positive kolonier, en av disse får betegnelsen pMLl36.

Eksempel 14

Karakterisering av klonene pML87, pML90 og pML13 6

DNA-ene av de rekombinerte plasmider pML87, pML90 og pMLl36 isoleres ifølge Ish-Horowitz (25). Nukleotidsekvensene til F1(C)-DNA-, (B)-DNA- og F2~DNA-inserts bestemmes ifølge Maxam og Gilbert (3). For dette formål spaltes 10 ^ug plasmid-DNA av hver pML87 og pML90 med EcoRI-restriksjonsendonuklease og lOyug plasmid-DNA av pMLl36 med BamHI-restriksjonsendonuklease og de lineæriserte DNA-ene isoleres ved gelelusjon av agarosegel [jfr. eksempel lia) hhv. 13a)]. Deretter fordøyes de isolerte DNA med alkalisk fosfatase og kromatograferes over DE-52 (jfr. eksempel 13a). Deretter merkes radioaktivt DNA-ene på 5'-enden med [ y- 32P]ATP (spesifik, aktivitet ^ > 5000 Ci/mmol, Amersham) og T4~ polynukleotid-kinase (P-L-biochemicals).

De radioaktivt merkede DNA spaltes deretter med en andre restriksjonsendonuklease (PvuII). De dannede DNA-fragmenter isoleres ved gelelusjon av agarose. I tilfelle av pML87 og pML90 bestemmes deretter av PvuII-EcoRI fragment (ca. 2190 Basepar) nukleotidsekvensen til F1 (C)- hhv. F^(B)-DNA, i tilfelle av pMLl3 6 bestemmes det av F--DNA-et i PvuII-BamHI fragmentet (ca. 1815 basepar). angir DNA-enden som er radioaktivt merket).

Nukleotidsekvensene, som er bestemt for F^ (C)-DNA-et, F^B)-DNA-et og F^-DNA-et, er identisk med de fremstilte i eksemplene 8-10.

Eksempel 15

Fremstilling av plasmidet pMLl41, inneholdende F^ (C)-F2~DNA-et

( fig. 4)

a) Fremstilling av den lineæriserte vektor pBR322/ EcoRI/ BamHI 10^,ug pBR322 plasmid-DNA fordøyes med hver 10 enheter EcoRI-og BamHI-restriksjonsendonuklease i 100 /ul av en oppløsning av 50 mM Tris-HCl ( H 7,5), 50 mM NaCl, 6mM MgCl~ og 100 ^ug/ml gelatin i 1 time P ved 37 oC. Deretter innstilles denne oppløsning på TNE, ekstraheres med 1 volum fenol og kloroform og DNA-et utfelles med 2 volum alkohol ved -20°C over natten.

Den av pBR322-DNA-et utsnittede vektor (pBR322/EcoRI/BamHI

3986 basepar) fraskilles ved densitetsgradientsentrifugering i sukrose (5-23%) i 50 mM Tris-HCl (pH8) og 1 mM EDTA fra det mindre DNA-fragment (3 76 basepar). Sentrifugeringen gjennomføres ved 30.000 omdr./min. i en TST 41 rotor (Kontron AG) i 15 timer ved 15°C. Deretter utvinnes fra den sentrifugerte oppløsning fraksjoner å 0,2 ml med en ISC0 gradient-samler. De fraksjoner som inneholder det store DNA-brudd-stykke (3986 basepar), forenes og DNA-et utfelles med alkohol. Bunnfallet fordøyes i 100 ^ul 50 mM Tris-HCl (pH 8) med

0. 3 enheter alkalisk fosfatase av kalvtarm i 30 min. ved 3 7°C. Ved oppvarming av oppløsningen til 65°C i

1 time inaktiveres enzymet. Deretter ekstraheres oppløs-ningen med fenol/CHCl^ og DNA-et utfelles med alkohol over natten ved -20°C. Bunnfallet oppløses i 50 ^ul 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA og oppbevares inntil dens anvendelse som klone-vektor ved -20°C. 3,75 ^ug DNA (=

5,7 pMol ender) ble oppnådd.

b) Fremstilling av F1 (C)-DNA/EcoRI/Hpall og F^-DNA/ BamHI/ Hpall

1. Fremstilling av F1 ( C)- DNA/ EcoRI/ Hpall

lO^ug plasmid DNA av pML87 fordøyes først med 20 enheter Hpall restriksjonsendonuklease i 100 ^ul av en oppløsning av 10 mM Tris"HCl (pH 7,4), 6 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT og 100^ug/ml gelatin. Deretter følger en fenol/kloroform ekstraksjon av oppløsningen og utfelling av de dannede DNA-fragmenter med alkohol ved -20°C.

DNA-fragmentblåndingen oppspaltes deretter ved elektroforese på en 6% polyakrylamidgel i Tris-acetat-EDTA buffer pH 8.

Det største DNA-fragment (= 586 basepar) isoleres ved gelelusjon og spaltes deretter med EcoRI-restriksjonsendonuklease (jfr. eksempel lia). Den dannede DNA-fragmentbland-ing underkastes på nytt en elektrofores på 8% polyakrylamid. Derav isoleres 40 ng av F1(C)-DNA/EcoRI/Hpall (127 basepar).

II Fremstilling av F^- DNA/ BamHI/ Hpall- et

20 ^,ug plasmid DNA av pML136 spaltes med 20 enheter BamHI restriksjonsendonuklease. En aliquot del (l^ug) av dette lineæriserte plasmid DNA/BamHI isoleres ved gelelusjon av en agarosegel (jfr. eksempel 13a) og merkes radioaktivt med 32

[y- P]ATP (jfr. eksempel 14). Hoveddelen av plasmidet DNA/ BamHI blandes deretter med dette radioaktivt merkede DNA, fordøyes med PvuII restriksjonsendonuklease og PvuII-BamHI DNA fragmentet (1203 basepar) isoleres etter gelelektroforese på 1% agarose. 14^ug av PvuI-BamHI fragmentet fordøyes med Hpall restriksjonsendonuklease (se ovenfor), deretter oppspaltes DNA-blandingen med 8% polyakrylamidgel-elektroforese og 150 ng av F2-DNA/BamHI<*>/HpaII-et (109 basepar) isoleres ved gelelusjon.

c) Ligering av D^ (C)-DNA med F2~DNA og konstruksjon

av plasmidet pML! 41

10 ng (= 473 nMol ender) F1(C)-DNA/EcoRI/Hpall og 9 ng (=

495 nMol ender) F2~DNA/BamHI/Hpall behandles i et volum av 20^,ul med T ^ - DNA ligase, som allerede beskrevet under eksempel 13c). Deretter ekstraheres blandingen med fenol/kloroform og DNA-et utfelles med alkohol. DNA-bunnfallet oppløses deretter som beskrevet i eksempel 13a) og fordøyes med EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonuklease. Oppløsningen innstilles deretter på TNE og tilsettes 30 ng(= 50 nMol ender) av vektor-DNA pBR322/EcoRI/BamHI (sammenlign eksempel 15a). Deretter ekstraheres oppløsningen på nytt med fenol/kloroform og DNA-et utfelles med alkohol. Den utfelte DNA-blanding behandles som angitt i eksempel 13c) med T^-DNA ligase

(Biolabs). På denne måte dannes i oppløsningen rekombinerte plasmider, som inneholder F^ (C)-F2~DNA (eglin C-genet) som insert.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML! 41 Transformasjonen av de med kalsium behandlede E. coli HB101

celler skjer som beskrevet i eksempel lid). Det anvendes lGyl av den i eksempel 15c) dannede reaksjonsblanding.

Det fåes 2586 ampicellinresistente kolonier.

e) Utsortering av kolonier, som inneholder F^ ( C)- F^- DNA

18 transformerte kolonier (eksempel 15d) prøves på deres

F1 (C)-F2~DNA-innhold som beskrevet i eksempel lie). Som radioaktiv prøve anvendes en blanding av de i eksemplene 5 og 6 beskrevne oligonukleotider. I autoradiogrammet fåes 13 positive kolonier, fire av disse får betegnelsen pMLl41, pMLl43, pML144, pML14 5.

På analog måte spaltes plasmidet pML87 (C<*>) hhv. pML87

(C") med restriksjonsendonukleasene Hpall og EcoRI, den dannede F1 (CÅ)-DNA/EcoRI/HpaII-et og den dannede F^^ (C')~ F2-DNA/EcoRI/BamHI hhv. F± (C")-F2-DNA/EcoRI/BamHI ligeres med den lineæriserte vektor pBR 322/EcoRI/BamHI. De dannede plasmider, som inneholder F1 (C')-F2-DNA hhv. F^(C")-F2~DNA anvendes for transformasjon av kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. Kultiveringen av de transformerte celler gir 850 hhv. 585 ampicillin-resistente kolonier. De transformerte kolonier prøves med oligonukleotidet 91/3 7 komplementært (C) på tilstedeværelsen av F^ (C')-F2-DNA hhv. F^^ (C")-F2-DNA. Det identifiseres 18 kolonier som inneholder F^(C1)-F2~DNA og 31 kolonier som inneholder F^(C")_F2~DNA• Hver gang utvelges en koloni og den får betegnelsen pML141 (C) hhv. pML 141 (C").

Eksempel 16

Fremstilling av plasmidet pML 160, inneholdende F^ ( B)- F^- DNA

a) Fremstilling av F1 ( B)- DNA/ EcoRI/ Hpall

På analog måte som beskrevet for F^ (C)-DNA/EcoRI/Hpall

(eksempel 15bl), spaltes lCyug plasmid-DNA av pML90 først med Hpall og deretter med EcoRI. Fragmentblandingen renses, som beskrevet, med PAGE.

b) Ligering av F^ (B)-DNA med F2~DNA og konstruksjon

av et rekombinert plasmid

Ligeringen skjer som beskrevet i eksempel 15c utgående

fra lCyug F1 (B)-DNA/EcoRI/Hpall (s.o.) og 9 ^,ug F2"DNA/ BamHI/Hpall (eksempel 15bII). Den dannede F^ (B)-F2~DNA/ EcoRI/BamHI ligeres som beskrevet med 30 ^ug av vektor-DNA pBR322/EcoRI/BamHI-et (jfr. eksempel 15a).

Den dannede, rekombinerte plasmid-inneholdende oppløsning anvendes for transformasjon av med kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. 15 transformerte kloner prøves på deres F^ (B)-F2~DNA- innehold som beskrevet i eksempel lie. Som radioaktiv prøve benyttes igjen en blanding av de i eksemplene 5 og 6 beskrevne oligonukleotider. I autoradiogrammet fåes 6 positive kolonier, en av disse får betegnelsen pMLl60.

Eksempel 17

Karakterisering av klonene pML! 41 og pML160

10 ^,ug av plasmid-DNA-ene av pMLl41 og pMLl60 fordøyes hver med EcoRI- hhv. BamHI-restriksjonsendonuklease (jfr. eksempel lia hhv. 13a). Karakteriseringen av pMLl41 og pMLl60 skjer som allerede beskrevet i eksempel 14.

De for F^ (C)-F2~DNA og F1 (B)-F2~DNA bestemte nukleo-tidsekvenser er identisk med de av de ovenfor fremstilt syntetiske eglin C- og eglin B-gener.

Eksempel 18

Fremstilling av ekspressjonsplasmidet pML14 7

a) Konstruksjon av den lineæriserte vektor pHRil4 8/EcoRI/BamHI, som inneholder trp- promotor- operatøren ( fig» 5 og fig. 6)

A. Konstruksjon av plasmidet p! 59

10/Ug plasmid pBRH^^ (21) spaltes med 50 enheter EcoRI

6 0 min. ved 37°C, og fordøyningsblandingen frak-

sjoneres etter fenolekstraksjon med en sakarose-densitetsgradient (5-23%) i 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA i en TST41 (Kontron AG) rotor. Sentrifugeringen varer 14 timer

ved 40 000 omdr./min og 15°C. 0,3 ml fraksjoner oppsamles med en iSCO-gradientkollektor ved 1 ml/min. Fraksjonene som inneholder det mindre fragment, blir forenet, oppløsningen innstilles på TNE og felles med 2 volum etanol ved -20°C. DNA-et oppløses etter sentrifugeringen i en Eppendorf-sentrifuge i 100 ^ul 10 mM Tris<*>HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5^ug av dette DNA-fragment spaltes med 5 enheter Bglll 60 min. ved 37°C. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol og kloroform og DNA-et inkuberes med 2 volum. etanol ved

-80°C i 10 min. og DNA-et samles ved sentrifugering og opp-løses på nytt i 50 ^ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). 2^ul av denne oppløsning uttas (0,2 ^.ug DNA) og inkuberes ved en DNA-konsentrasjon av 10 ng/^ul i 50 mM Tris<*>HCl (pH 8,0) med

1 enhet intestinal alkalisk kalv-fosfatase (Boehringer)

i 30 min. ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved oppvarming av oppløsningen i 60 min. ved 65°C. 0,04 3277ug DNA uttas og inkuberes 5'-terminal med 10 ^uCi [y- P]-ATP ( >5000 Ci/mmol, Amersham) og 5 enheter T^ polynukleotid-kinase (P-L Bic-chemicals) i 20 yUl reaksjonsvolum i 50 mM Tris<*>HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT, under 30 min. ved 37°C. Den radioaktive prøve blandes med den ikke-merkede prøve (se ovenfor) og DNA-fragmentene fraksjoneres med en 5-23% sakarose-densitetsgradient i 50 mM Tris<*>HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA i en TST60 rotor. Sentrifugeringen skjer under 5 timer ved 60 000 omdr./min og 15°C. Det samles 0,2 ml fraksjoner.

Radioaktiviteten av hver fraksjon bestemmes ved måling

av Cerencov-strålingen og fragmentene identifiseres dermed. De ønskede fraksjoner, som inneholder det mindre DNA-fragment, forenes, DNA-et helles med 2 volum etanol og oppløses igjen etter sentrifugering i 20yul 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA.

32

Det P-merkede EcoRI-Bglll DNA-fragment spaltes partielt med 0,2 enheter Taql i 50 .ul volum under 10 min. ved 37 oC. Reaksjonsblandingen innstilles på

0,2% SDS, 10% glycerin, 10 mM EDTA, 0,05% bromfenol-blå og DNA-fragmentene oppspaltes på en 6% polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA (22). På autoradiogrammet identifiseres båndet som inneholder det ønskede EcoRI-Taql (det største del-fragment). Dette fragment (L, se fig. 5) ekstraheres fra gelen og renses (23) og oppløses i 10 ^ul 10 mM Tris"HCl pH 7,5, 1 mM EDTA.

Som akseptor-plasmid anvendes pBR322, som er spaltet med Clal og EcoRI: 2 yug pBR322 fordøyes med 4 enheter Clal

i 2 0 ^ul reaksjonsvolum i 60 min. ved 3 7°C.

Proteinet ekstraheres med fenol og DNA-et felles deretter med 2 volumina etanol ved -80°C i 10 min. DNA-et samles ved sentrifugering og fordøyes deretter med 10 enheter EcoRI i 30 min. ved 37°C i 20 ^ul reaksjons-

volum. Deretter tilsettes oppløsningen med 2 volum.

0,1 M Tris<*>HCl (pH 8,7) og inkuberes med 1 enhet alkalisk kalv-fosfatase i 30 min. ved 37°C. Fosfatasen inaktiveres deretter ved inkubering ved 65°C i 60 min.

100 ng av akseptor-plasmidet inkuberes med 5^ul fragment L-DNA i 15 .ul reaks jonsvolum i 10 mM MgCl2, 20 mM Tris'HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP med 30 enheter pr. ul reaksjonsvolum T4 DNA-ligase i 2 timer.

5 yUl av denne oppløsning tilsettes til en blanding som inneholder 150 ml med kalsiumklorid behandlede E. coli

HBlOI-celler (6) i 10 mM MgCl2, 10 mM Tris<*>HCl (pH 7,5)

i et totalvolum av 200yUl. Blandingen kjøles 20 min.

i is, oppvarmes i 1 min. til 42°C og inkuberes 10 min. ved 20°C. 1 ml Trypton-medium (Trypton-medium inneholder 10 g Bacto-trypton; 1 g gjærekstrakt; 1 g glukose; 8 g NaCl og 294 mg CaCl2'2H20 i 1 1 destillert vann) tilsettes, og blandingen inkuberes 3 0 min. ved 37 C under rysting ved 300 o/min. Blandingen legges på to agarplater (McConkey Agar; 0,6 ml/plate), supplert med 50^ug/ml ampicillin. Platene inkuberes ved 12 til 17 timer ved 3 7°C.

Plasmid-DNA av 10 forskjellige kolonier isoleres som følger: Koloniene anvendes for inokulering av 10 ml Trypton-medium, supplert med 50yug/ml ampicillin som ovenfor i en 25 ml erlenmeyerkolbe. Kulturene rystes 15 til 18 timer ved 37°C og 300 omdr./min. Cellene høstes ved sentrifugering HS-4 Rotor, 10 min. ved 4000 omdr./min., 4°C. Man får ca. 0,1 g celler, og disse resuspenderes i 1 ml 50 mM Tris*

HC1 (pH 8,0) 0,25 ml lysozymoppløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris*HCl (pH 8,0); tilsettes og etter 10 minutters inkubasjon ved 0°C tilsettes 0,15 ml 0,5 m EDTA (pH 7,5). Etter ytterligere 10 min. ved 0°C tilsettes 60^ul 2%-ig Triton X-100. Etter 30 min. ved 0°C sentrifugeres prøven 30 min. ved 0°C sentrifugeres prøven 3 0 min. ved 15.000 omdr./min. og 4°C i en Sorval SA-600 rotor. Oversjiktet blir de-proteinisert med 1 vol. fenol (mettet i TNE). Fasene skilles ved sentrifugering (Sorval HB-4 rotor) i 10 min. ved 5.00 0 omdr./min. og 4°C. Den øvre fase ekstraheres to ganger med 1 vol. kloroform. Pankeatisk RNAse A (10 mg/ml foroppvarmet i TNE 10 min. ved 85°C) tilsettes inntil en sluttkonsentrasjon av 25^ug/ml, og blandingen inkuberes 40 min. ved 37°C. Oppløsningen innstilles deretter på 1M NaCl og 10% polyetylenglykol 6.0 00 (20 min. ved 120°C behandlet i autoklav) og inkuberes 2 timer ved -10°C, sentrifugeres i en Sorval HB-4 rotor (20 min. ved 10.000 omdr./min., 0°C) og oppløses på nytt i 100^ul TNE. DNA-oppløsningen ekstraheres med 1 vol. fenol, og DNA utfelles 10 min. ved -80°C med 2 vol. etanol. Presipatet samles ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og DNA-et oppløses på nytt i 20 ^ul 10 mM Tris<*>HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Av en 10 ml kultur utvinner man 8 til 10 ^ug plasmid-DNA.

Plasmid-DNA-ene analyseres etter fordøying med de følgende restriksjonsenzymer: Hvert 0,5^ug plasmid-DNA spaltes med Hpal sårat med Hpal og EcoRI med Clal etter standard-forskrifter, ifølge angivelser fra enzym-produsenten. DNA-ene fraksjoneres på en 1% agarose-gel i 40 mM Tris"Acetat (pH 7,8) 1 mM EDTA og 0,5 7ug/ml ethidiumbromid. De ønskede plasmider inneholder et Hpal-sete og gir etter 3 ganger fordøyning foruten det store DNA-fragment 2 mindre fragmenter, som er større enn det lille EcoRI-Clal-fragment av pBR322. Et av disse plasmider betegnes med pl59

(se fig. 5).

B. Konstruksjon av plasmidet pHRi! 4 5

2 ^ug pl59-DNA fordøyes med 10 enheter EcoRI (Biolabs)

i 30 irfin. ved 37°C. DNA-et ekstraheres med fenol, felles med etanol og oppløses etter sentrifugeringen i 10 ^ul 10 mM Tris<*>HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. Det med EcoRI fordøyede DNA behandles videre med 5 enheter DNA-polymerase (Klenow-fragment) i 10 ml mM MgCl2, 10 mM fi-me rkaptoetanol, 50 mM NaCl- 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) i 15 min. ved 12°C. Polymerasen inaktiveres deretter ved inkubasjon ved 85°C i

5 min. Reaksjonsblandingen fortynnes 10 ganger i 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP

(Sigma) og inkuberes med 30 enheter T^ DNA-ligase pr.

yul reaksjonsblanding i 1 time ved 15 C.

50 ng av DNA-et transformeres i E. coli (som ovenfor beskrevet) og det legges på McConkey-agarplater supplert med 50yug/ml

ampicillin.

Plasmid-DNA av 10 forskjellige kolonier isoleres som ovenfor beskrevet. Plasmid-DNA analyseres ved fordøyning med EcoRI. De ønskede plasmider er EcoRI-resistent. Analysen skjer som ovenfor beskrevet. Et av de ønskede plasmider betegnes som HRil45 (fig. 5).

C. Konstruksjon av plamsidet pHRi! 48

2/Ug pHRil45-DNA behandles med 5 enheter Clal 60 min. ved 37°C, deproteiniseres deretter ved hjelp av fenol-ekstraksjon. DNA utfelles med etanol og oppløses deretter i 20 ^,ul mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. De overhengende ender blir, som ovenfor beskrevet, oppfylt med DNA polymerase I (Klenow-fragment) med den endring at dATP og dTTP blir erstattet med dCTP og dGTP. Polymerasen inaktiveres ved inkubasjon ved 85°C i 5 min. Reaksjonsblandingen tilsettes 2 volum 0,1M Tris-HCl (pH 7,8) og inkuberes med 0,5 enheter kalvefosfatase i 30 min. ved 37°C. Reaksjonsblandingen deproteiniseres ved fenol-ekstraksjon. DNA utfelles med etanol og oppløses i 8^ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA.

En kjemisk syntetisert DNA-linker med formelen:

fosforyleres på 5'-enden, idet 8 pMol av linkeren med 5 /UCi { X- 3 2 P)-ATP (5500 Ci'mmol — 1) i 8^ul reaksjonsvolum, som inneholder 0,1 mM rATP, 50 mM Tris'HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 2 enheter T^ polynukleotid-kinase, inkuberes 30 min. ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved innfrysning ved -80°C.

Den radioaktivt merkede linker behandles deretter med 1 ^,ug Clal og fosfatase og ligeres med pHRil45-DNA (se ovenfor)

i et 20/ml reaksjonsvolum, som inneholder 0,5 mM rATP,

10 mM DTT, 20 mM Tris'HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 cg 800 enheter T4 DNA-ligase. Inkubasjon skjer ved 15°C i 2 timer. Ligasen inaktiveres

ved inkubasjon ved 85°C i 10 min. Deretter tilsettes

2 volum vann, koksalt-konsentrasjonen innstilles på

10 mM og 20 enheter Kpnl tilsettes i 30 min.

ved 37°C. Etter ekstraksjonen med fenol og kloroform fraksjoneres blandingen med en 0,9% lavtsmeltende

agarose-gel i 40 mM Tris-acetat (pH 7), 1 mM

EDTA og 0,5 ^ug/ml Ethidiumbromid. Det ved UV-bestråling synbare bånd, som oppviser den samme mobilitet som en markør-DNA av samme størrelse, blir utsnittet med skalpell. Gelstykket smeltes 5 min. ved 65°C og avkjøles deretter til 37°C. Man får et volum av ca. 20 yul. 5^ul av denne oppløsning uttas og inkuberes med 400 enheter T4~ligase (Biolabs) i 10^,ul reaks jonsvolum, som innstilles på 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM Tris'HCl (pH 7,8), i

12 timer ved 15°C. 1/10 volum av en oppløsning med 100 mM Tris"HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 tilsettes

til ligase-blandingen (størknet ved 15°C) og inkuberes

i 15 min. ved 65°C. Oppløsningen anvendes deretter for å transformere med kalsiumbehandlet E. coli HBlOl-celler,

som ovenfor beskrevet. Den belegges på McConkey-agarplater, supplert med 50 ^,ug/ml ampicillin.

Plasmid-DNA-ene av 10 forskjellige kolonier isoleres, som ovenfor beskrevet, og DNA-et blir underkastet den følgende restriksjonsenzymanalyse: Hvert 0,5 7ug plasmid DNA spaltes i rekkefølge med Kpnl, Ncol og EcoRI ifølge forskriftene til enzymprodusenten.

Spaltproduktene fraksjoneres på 1% agarose-gel i 40 mM Tris" Acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5^ug/ml Ethidiumbromid. Alle plasmider oppviser hvert ett av disse enzymspaltesteder,

som ønsket. Et blir betegnet som HRil48.

Plasmidet HRil48 inneholder en tryptofan-promotor-operatør

og et ribosomalt bindingssted til og med ATG. Eglin C som også andre heterologe gener kan direkte tilkobles over de

engangs i plasmidet tilstedeværende EcoRI, Ncol, Kpnl-steder. Dessuten muliggjør denne konstruksjon den direkte tilkobling og uttrykk av heterologe gener, uten at det for initieringen av translasjonen nødvendig ATG må være tilstede på det tilsvarende gen. Dette kan lett oppnåes ved spaltning med NcOI og oppfylling av de overhengende ender med DNA-polymerase I, som beskrevet, eller ved spaltning med Kpnl og fjernelse av de overhengende ender med nuklease S^. Plasmidet HRil48 er dermed et vidt anvendbart ekspressjonsplasmid.

D. Fremstilling av den lineæriserte vektor pHRil48/EcoRI/

BamHI

5^ug plasmid-DNA av pHRil48 fordøyes med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI, som beskrevet i eksempel 15a. Den utsnittede vektor pHRil48/EcoRI/BamHI isoleres ved hjelp av densitetsgradientsentrifugering (jfr. eksempel 5a). b) Fremstilling av F^^ ( C)- F2- DNA/ EcoRI/ BamHI ( fig- 6) 5 yug plasmid-DNA av pMLl41 fordøyes med EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonuklease som beskrevet i eksempel lia og 13a). Etter fenol/kloroform-ekstraksjon og alkoholfelling adskilles F1 (C)-F2-DNA/EcoRI/BamHI-et fra plasmidet (pBR322/EcoRI/ BamHI) med gelelektroforese på 1%-ig lavtsmeltende agarose (Biorad) (eksempel 13a) og gjøres synbart med EtBr.

Deretter utsnittes gelstedet, som inneholder DNA-båndet av

F^ (C)-F2~DNA (=236 basepar), av gelen og gjøres flytende

10 min. ved 65°C.

c) Ligering av pHRil48/EcoRI/BamHI vektor-DNA med F^O-F^ DNA/EcoRI/BamHI og konstruksjon av plasmidet pML147

( fig. 6)

100 ng (ca. 100 nMol ender) plasmid DNA pHRil4 8/EcoRI/BamHI og 28 ng (713 nMol ender) av F1 (C)-F2~DNA/EcoRI/BamHI-et (oppløst i 10 yul av den i eksempel 18b) dannede flytende gel) blandes med hverandre ved 3 7°C i et volum av 20 yUl og behandles som beskrevet i eksempel 13c), med T^-DNA ligase ved 15 C i 16 timer. På denne måte dannes i denne blanding

ekspressjonsplasmidet pMLl47, som inneholder eglin C-genet

(F1 (C)-P2-DNA.

d) Transformasjon av E. coli HB101 med plasmidet pML147

10 ,ul av blandingen som inneholder plasmidet pMLl47 (eksempel

18c), gjøres flytende i 10 min. ved 65 oC og anvendes for transformasjon av det kalsium-behandlede E. coli HB101 celler. Det fåes ca. 6000 ampicillin-resistente kolonier. e) Utsortering av kolonier som inneholder F^ ( C)- F^- DNA Transformerte kolonier (eksempel 18d) prøves på tilstedeværelsen av F.^ (C)-F2-DNA, som angitt i eksempel 15e.

Det fåes syv positive kolonier som får betegnelsen pMLl4 7-pMLl53.

På analog måte ligieres F1 (C')-F2_DNA/EcoRI/BamHI hhv. F1 (C")-F2-DNA/EcoRI/BamHI, fremstilt av plasmidene pMLl47 (C<1>) hhv. pML147 (C"), med pHRil4 8/EcoRI/BamHI. På denne måte dannes plasmider, som inneholder eglin C'-genet [F.^ (C<1>)-F2-DNA] hhv. eglin C"-genet [F^(C")-F2~DNA. Plasmidene anvendes for transformasjon av kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. Kultiveringen av de transformerte celler

gir 940 hhv. 1080 ampicillin-resistente kolonier. Koloniene prøves med oligonukleotidet 91/3 7 komplementært (C) på tilstedeværelsen av F1 (C')-F2-DNA hhv. F1 (C")-F2-DNA.

9 kolonier, inneholdende F^ (C')-F2-DNA (eglin C'-gen), og

17 koloner inneholdende F1 (C")-F2-DNA (eglin C"-gen) identifiseres. Hver gang utvelges en koloni og får betegnelsen pML147 (C) hhv pML147 (C") .

Eksempel 19

Fremstilling av ekspressjonsplasmidet pML 199

a. Fremstilling av F^ ( B)- F2- DNA/ EcoRI/ BamHI

Analogt eksempel 18b) fordøyes 5^,ug plasmid-DNA av pML 160 med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI. F^(B)-F2~DNA/EcoRI/

BamHI-et adskilles som beskrevet ved hjelp av gelelektroforese.

b. Ligering av pHRil48/EcoRI/BamHI-véktor-DNA-et med F-^B)-F2~DNA/EcoRI/BamHI-et og konstruksjon av rekombinerte

plasmider

100 yug plasmid-DNA pHRil48/EcoRI/BamHI (jfr. eksempel 18aD) ligeres med 28 ^ug F1 (B)-F2-DNA/EcoRI/BamHI ifølge eksempel 18c). Den dannede oppløsning, som inneholder rekombinerte plasmider, anvendes for å transformere kalsium-behandlede E. coli HBlOl-celler. Transformerte kolonier prøves på tilstedeværelsen av F^ (B)-F2~DNA, som beskrevet i eksempel 15e).

Det fåes seks positive kolonier som får betegnelsen pML199-204.

Eksempel 20

Karakterisering av klonene pML147 og pML199

Karakteriseringen av F1 (C)-F2~ hhv. F1 (B)-F2~DNA-sekvensene i de rekombinerte plasmider pML147 og pML 199 skjer ved sekvensering av F (C)-F2~ hhv. F1 (B)-F2~DNA ifølge Maxam og Gilbert (3), som beskrevet i eksempel 17. 10yug plasmid-DNA blir prøvet. Nukleotidsekvensen til F^ (C)-F2~DNA-et er identisk med det beskrevne syntetiske eglin C-gen, den til F.^ (B)-F2~DNA er identisk med det beskrevne syntetiske eglin B-gen.

Eksempel 21

Syntese av polypeptider med eglin-aktivitet med E. coli-celler som inneholder plasmidene med rekombinerte eglin- gener.

a. Syntese av polypeptider med eglin C- aktivitet Hver av de 7 klonene som inneholder det rekombinerte eglin C-gen, nemlig

E. coli HB101 pML 14 7

E. coli HB101 pML 148

E. coli HB101 pML 14 9

E. coli HB101 pML 150

E. coli HB101 pML 151

E. coli HB101 pML 152

E, coli HB101 pML 153

E. coli HB101 pML 14 7 (C)

E. coli HB101 pML 147 (C")

testes på dannelsen av eglin C-aktivitet.

For dette formål kultiveres de ovenfor nevnte kloner i 5 ml L-medium over natten (16 timer) ved 37°C og 250 omdr./min.

L-medium er sammensatt som følger:

1 ml av denne overnattskultur overføres den neste dag i 25 ml M9-medium. M9-medium er sammensatt som følger:

Det kultiveres ved 37°C og 250 omdr./min sålenge inntil bakteriesuspensjonen har oppnådd en optisk tetthet (°Dg23^ av ca. 0,9-1,0. Deretter høster man cellene (5ml av den voksende kultur) og resuspenderer bakteriene i 0,5 ml av en oppløsning av 50 mM Tris*HCl (pH 8) og 30 mM NaCl. Deretter innstilles suspensjonen på 1 mg/ml lysozym og stilles 30 min. i is. Ved avvekslende innfrysning av suspensjonen i flytende nitrogen og opptining ved 37°C ødelegges bakteriene. Denne operasjon gjentas 5 ganger, deretter sentrifugeres blandingen ved 4°C i 30 min. ved 16000 omdr./min. Overskiktene undersøkes på eglin C-aktivitet, idet hemmingen av humanleukocytt-elastase (1) blir målt.

Det oppnåes følgende aktiviteter:

b. Syntese av polypeptider med eglin B- aktivitet På analog måte, som beskrevet i eksempel 21a), blir hver av de 6 kloner som inneholder det rekombinerte eglin B-gen, nemlig

E. coli HB101 pML 19 9

E. coli HB101 pML 200

E. coli HB101 pML 201

E. coli HB101 pML 202

E. coli HB101 pML 203

E. coli HB101 pML 204

testet på dannelsen av eglin B-aktivitet.

De nevnte kloner kultiveres som beskrevet i L-medium og overføres deretter på M9-medium. Etter oppnåelse av en optisk tetthet (°Dg23^ av ca* 0, 9- 1, 0 høstes cellene, lyseres og ødelegges ved avvekslende innfrysning og opptining. Blandingene sentrifugeres og overskiktene prøves ved måling av hemmingen av humanleukocytt-elastase (1) på eglin B-aktivitet.

Det oppnåes følgende aktiviteter:

Eksempel 22

Kultivering av stammen E. coli HB101 pML14 7

20 ml L-medium (se eksempel 21) impes med E. coli HB101 pMLl47-cellene av en godt voksende agarplate og rystes i rystekolber på en ved 150 omdr./min roterende rysteinnretning ved 37°C i 12 timer. 5 ml av denne forkultur overføres i 120 ml M9 næringsmedium. Denne kultur rystes ved 250 omdr./ min. og 37°C. Etter ca. 8-10 timer har kulturen oppnådd den høyeste titer på polypeptidet med eglin C-aktivitet og blir høstet.

Eksempel 23

Bestemmelse av eglin C- aktivitet

Ca. 5-10yUl av en prøve, som inneholder polypeptider med eglin C-aktivitet (jfr. eksempler 21 og 22), pådryppes på

1 cm 2 nitrocellulosepapir (NZ) og tørkes 30 min.

ved værelsetemperatur. Deretter inkuberes NZ-et i 1 time ved 37°C i en oppløsning av 3% serumalbumin i 0,01 M

Tris-HCl (pH 8) og 0,9% NaCl.

Deretter vaskes NZ- et i en oppløsning av 0,01 M Tris-HCl (pH 8) og 0,9% NaCl i 30 min. Herved byttes oppløsningen 5 ganger. Deretter behandles det vaskede NZ i 2 timer ved 25°C i en oppløsning av 3% serumalbumin i 0,01 M Tris<*>HCl (pH 8) og 0,9% NaCl, som inneholder 2 ^ug/ml antilegemer (fremstilt av kaniner eller monoklonale antilegemer) mot eglin C. Deretter vaskes NZ-et som beskrevet ovenfor.

Deretter behandles NZ-et i 2-3 timer ved 25°C med en opp-løsning av 3% serumalbumin i 0,01 M Tris'HCl (pH 8) og

125

0,9% NaCl, so inneholder O^^Ci/ml I-protein A (sp. aktivitet 89,8 ^,uCi/mg) (NEN). Deretter vaskes på nytt NZ-et, som beskrevet ovenfor, tørkes og i en y-teller (Multi Gramma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace) bestemmes den bundne radioaktivitet som er et mål for det på NZ-et tilstedeværende polypeptid med eglin C-ativitet.

Ved en alternativ fremgangsmåte blir den ovenfor angitte prøve underkastet en SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) [jfr. (7)]. PAGE-elektroferogrammet overføres ved elektro-blottin på NZ. Deretter behandles NZ-ene som ovenfor beskrevet og/eller autoradiograferes over natten sammen med en røntgenfilm. Steder på NZ-et, som inneholder polypeptider med eglin C-aktivitet, synes på filmen som sorte flekker.

Eksempel 24

Isolering og rensning av Na<->acetyl-eglin C med hjelp av en monoklonal antistoff- kolonne

a. Fremstilling av polypeptidoppløsninger for den

monoklonale antistoff- kolonne

150 ml kulturnæringsoppløsning (dannet ifølge eksempel 22) avkjøles til 4°C og cellene fraskilles ved sentrifugering (5000 omdr./min., 15 min., Sorvall RC 3B). Det klare overskikt inneholder ingen eglin C-aktivitet.

Deretter suspenderes cellene i 12 ml Lyse buffer (50 mM Tris'HCl pH 8, 30 mM NaCl). Denne blanding tilsettes 15 mer lysozym og denne oppbevares deretter 3 0 min.

ved 4°C. Deretter ødelegges cellene ved 4 ganger innfrysning i flytende nitrogen og etterfølgende opptining ved 37°C

Deretter sentrifugeres 30 min. ved 16000 omdr./min. og 4°C. Overskiktet inneholder Na<->acetyl-eglin C-aktivitet. I overskiktet (15 ml) oppløses deretter 7,7 g fast ammoniumsulfat. Den grumsede blanding blir latt stå ved 4°C i 30 min. og deretter sentrifugert (se ovenfor). Det våte sediment oppløses i 1 ml 0,05 mM Tris<*>HCl pH 8 buffer og man får den ønskede polypeptidoppløsning.

b. Rensning av Na<->acetyl-eglin C på en monoklonal

antistoff- kolonne

Den monoklonale antistoff-kolonne 1K-F299-22-10 (Sjikt--volum 0,8 ml, se nedenfor) er kalibrert med 0,05 M Tris-HCl (pH 8). 0,5 ml-porsjoner av den ovenfor angitte polypeptid-oppløsning påføres ved 4°C på kolonnen med en strømningshatighet av 7 ml/time. Deretter vaskes med 10 ml 0,05 M Tris'HCl pH 8. De første fraksjoner inneholder de ikkeadsorberte polypeptider, som blir kastet. Deretter vaskes kolonnen med 5 ml 5 M natriumtiocyanat (Merck) i 0,05 M Tris"HCl (pH 8) og de oppnådde fraksjoner prøves på Na-acetyl-eglin C-aktivitet med HLE testen (1). Fraksjonene som inneholder polypeptidene, bestemmes ved måling av OD280nm" Fraksjonen 19 og 20 inneholder Na<->acetyl-eglin C-aktiviteten, de oppbevares ved -20°C eller i isbadet inntil videreforarbeidelse. Na<->acetyl-eglin C-aktiviteten er i fraksjon 19 61 ^,ug/ml og i fraksjon 20 4 9^ug/ml. Deretter dialyseres fraksjonene eller avsaltes over Sephadex-G25 (Pharmacia). SDS-polyakrylamidgel-elektroforesen (7) gir en molekylvekt for Na<->acetyl-eglin C av ca. 8100 Dalton.

Pa analog mate kan N -acetyl-eglin B, eglin C og eglin B renses ved hjelp av den monoklonale antistoff-kolonne 1K-F299-22-10.

c. Fremstilling av den monoklonale antistoff-kolonne

1K- F299- 22- 10

A) Immunisering av mus

Rent naturlig eglin C (6mg) i lyofilisert form oppløses i litt 0,1% eddiksyre og suppleres deretter med fosfatbuffert koksaltoppløsning og pH innstilles på 7,2, slik at sluttkonsentrasjonen er 2 mg/ml. Porsjoner av denne antigen-oppløsning blandes og emulgeres med samme mengder komplett Freund's Adjuvans, ukomplett Feund's Adjuvans eller fosfatbuffret saltoppløsning.

Hunnlige Balb/c mus (8-14 uker gamle, levert av dyrefarmen Sisseln, Sveits) immuniseres ved injeksjon av en slik emulsjon som inneholder 100 ^ug eglin, i potene. Under de følgende seks uker blir hver uke ytterligere injisert subkutant 100 ^ug eglin, emulgert som tidligere, men i ukomplett Freund's adjuvans og tilslutt injisert intravenøst 200 ^ug eglin i fosfatbuffret saltoppløsning. Fire dager senere blir milten uttatt for fusjonen.

B) Fremstilling av hybridoma og antistoff- prøve Fremstillingen av hybridomacellene skjer ved forsmeltning av oppnådde miltceller med Myeloma-cellelinjen SP 2/0. Derved

8 7

anvendes 10 milt-celler og 10 Myeloma-celler. Fusjonen gjennomføres som beskrevet ( 9, 26)).

Bestemmelsen av anti-eglin C-aktiviteten i hybridoma-overskiktene skjer ved hjelp av en kompetitiv radio-immunoassays [RIA, (10].

For dette formål blir eglin C merket med radioaktivt <125>jod ifølge den vanlige kloramin T-metode (30 000 cpm). Ved

blandet med den samme mengde renset antistof f-oppløsning

(19 mg monoklonale anti-eglin-C-antistoff 239S22-10)

og rotert 4 timer ved værelsetemperatur. Deretter blir gelen vasket med koblingsbuffer. For blokkering av de ennu frie aktive steder blir gelen behandlet med 0,1 ml 1 M etanolamin-HC1 (pH 8,0) pr. ml gel i 2 timer ved værelsetemperatur, deretter vasket med fosfatbufferet saltoppløsning, inneholdende 10 mM natriumazid pr. ml gel og holdt deri ved 4°C. Koblingsgraden blir bestemt ved måling av ekstinksjonen

ved 280 nm og er 15 til 30 mg antilegemer pr. ml gel.

0,8 ml av den dannede immunogel blir anvendt for å fremstille den monoklonale antistoff-kolonne 1K-F299-22-10.

Eksempel 25

Isolering og rensning av N^-acetyl-eglin C med hjelp av en anhydrochymotryps in- kolonne

a. Fremstilling av polypeptidoppløsningen for anhydrochYmotrypsin- kolonnen. ^_

150 ml kulturoppløsning (oppnådd ifølge eksempel 22) blir avkjølt til 4°C og cellene fraskilt ved sentrifugering (5000 omdr./min, 15 min., Sorvall RC 3B). Det klare overskikt inneholder ingen eglin C-aktivitet.

Deretter suspenderes cellene i 12 ml lyse buffere (50 mM Tris<*>HCl pH 8, 30 mM NaCl). Denne blanding tilsettes 15 mg lysozym (Boehringer) og denne oppbevares 30 min. deretter ved 4°C. Deretter ødelegges cellene ved 4 ganger innfrysning i flytende nitrogen og etterfølgende opptining ved 37°C. Deretter sentrifugeres 30 min. ved 16000 omdr./min. og ved 4°C. Overskiktet inneholder Na<->acetyl-eglin C-aktiviteten.

I overskiktet (15 ml) oppløses deretter 7,7 g fast ammoniumsulfat. Den grumsede blanding blir latt stå ved 4°C i 30 min. og deretter sentrifugert (se ovenfor). Det våte sediment blir oppløst i 1 ml 0,05 mM Tris<*>HCl pH 8 buffer og man får den ønskede polypeptidoppløsning.

b. Rensning av Na<->acetyl-eglin C på en anhydrochymotrypsin

( AnCht)- kolonne

AnCht-kolonnen (skiktvolum 4 ml) er kalibrert med 0,05

M Tris-HCl pH 8. 2,5 ml-porsjoner av den ovenfor dannede polypeptid-oppløsning blir påført ved 4°C på kolonnen med en strømningshastighet på 7 ml/time. Deretter vaskes med 25 ml 0,05 M Tris'HCl (pH 8). De første fraksjoner inneholder de ikke adsorberte polypeptider, som blir kastet. Deretter blir kolonnen vasket med 10 ml 5 M natriumtiocyanat (Merck) i 0,05 M Tris<*>HCl (pH 8) og de dannede fraksjoner prøvd på Na<->acetyl-eglin C-aktivitet med HLE testen (1). Fraksjonene som inneholder polypeptidene, blir bestemt ved måling av 0D2gQnm. Fraksjonene 30 og 31 inneholder Na<->acetyl-eglin C-aktiviteten; De blir oppbevart ved -20°C eller i isbad inntil videreforarbeidelse. Na<->acetyl-eglin C-aktiviteten er i fraksjon 30 30 ^ug/ird og i fraksjon 31 64 -g/ml. Deretter blir R fraksjonene dialysert eller avsaltet over Sephadex-G25 . SDS-polyakrylamidgel-elektroforesen (7) gir en molekylvekt for Na<->acetyleglin C

av ca. 8100 Dalton.

c Fremstilling av anhydrochymotrypsin- kolonne

A. Fremstilling av anhydrochymotrypsin ( AnCht) Fremstillingen av AnCht skjer som beskrevet av Ako et al.

27: 500 mg chymotrypsin oppløses i 50 ml 0,1 M Tris-HCl

(pH 8)-buffer, som inneholder 0,1 M NaCl, 0,12 M CaCl2 og

13% (v/v) metanol. Til denne oppløsning tilsettes 7 ganger 0,1 ml aliquote deler av fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)

(oppløsning av 7 mg/ml i aceton) under omrøring og hver gang bestemmes minskningen av chymotrypsinaktiviteten (28). Etterat chymtrypsinaktiviteten er sunket under 1%, blir oppløsningen dialysert mot 1 mM HC1 over natten ved 4°C (3 x 10 liter) og deretter lyofilisert.

Det dannede fenylmetylsulfonyl-chymotrypsin (PMS-Cht) blir oppløst i 100 ml iskoldt 0,1 M KOH, latt stå 1 time i is og deretter innstilt med 6 N HC1 på pH 3. Den dannede opp-løsning blir dialysert over natten ved 4°C mot 1 mM HC1

(3 x 10 liter) og deretter lyofilisert. AnCht fåes som hvitt pulver ( 120 mg).

B. Fremstilling av AnCht- kolonne

Affi-gel 10 blir vasket ifølge angivelsene fra produsenten med kaldt destillert vann og koblingsbuffret pH 8,5 (0,1 M NaHC03/ Na2C03~oppløsning. En 50%-ig suspensjon av gelen i koblingsbuffer (4 ml) blir overført i et plastikkrør, blandet med den samme mengde anhydrochymotrypsin-oppløsning (120 mg i 4 ml koblingsbuffer) og rotert over natten ved 4°C. Deretter blir gelen vasket med koblingsbuffer. For blokkering av de ennu frie aktive steder blir gelen behandlet med 0,1 ml 1 M etanolamin-HCl (pH 8,0) pr. gel i 3 timer ved 4°C, deretter vasket med fosfatbuffret saltoppløsning, inneholdende 10 mM natriumazid pr. ml gel og holdt deri ved 4°C. Koblingsgraden blir bestemt ved måling av ekstinksjonen ved 280 nm og er 15 til 30 mg AnCht pr. ml gel. 4 ml av den dannede AnCht-gel blir anvendt for å fremstille affinitetskolonnen.

På samme måte kan også Na<->acetyl-eglin B, eglin C og eglin B bli renset.

Eksempel 26

Alternative rensningsfremgangsmåter for Na- acetyl- eqlin C Alternativ eller i tillegg til de ovenfor beskrevne rensningsfremgangsmåter (jfr. eksempel 24 og 25) kan anvendes følgende rensningstrinn:

a. Butanol- ekstraksjon av lysåtet

De etter lyseringen ved fire gangers innfrysning og opptining ødelagte celler (jfr. eksempel 24a) blir tilsatt eddiksyre (sluttkonsentrasjon 0,1%; pH 4,5). De utfellende bakterielle proteiner blir fraskilt ved hjelp av sentrifugering. Na<->acetyl-eglin C forblir i overskiktet.

Tofaseblandingen n-butanol-iseddik-vann 5:1:4 (25 ml) forblandes grundig. Man lar den deretter oppnå likevekt 2 timer ved værelsetemperatur, hvorved blandingen adskiller seg i to faser. 0,5 ml av 0,1% eddiksyre-lysat-prøven (se ovenfor) fortynnes med 250 ^ul underfase og Na<->acetyl-eglin C ekstraheres med 750 ^ul overfase (5 min. Vortex, Fa.

Bender Hobein). Deretter adskiller man fasene ved 60 min. sentrifugering (5400 omdr./min) ved værelsetemperatur.

(Hettich bordsentrifuge EBA 3S). Prøven inndampes til tørrhet i høyvakuum med et apparat fra firmaet Savant (Speed Vac Concentrator). Påvisning av Na<->acetyl-eglin C lykkes ved hjelp av HLE-test, RP-HPLC og SDS-gelelektroforese.

b. Gelfiltrering på Sephadex G50®

31 mg av det således oppnådde materiale suspenderes i 600yUl 30% eddiksyre, sentrifugeres 5 min. ved værelsetemperatur ved 5000 omdr./min og det klare overskikt påføres på Sephadex-kolonne G50 fine (kolonnedimensjon: 1,5 cm x 30 cm; de,tektering: LKB8300 Uvicord II; 254 nm, transmission 500 mV; strømsningshastighet: 0,4 ml/min.

Det elueres med 50 ml 2% eddiksyre. Na<->acetyl-eglin C inneholdes i fraksjonene 6-8 (2,5 ml). Utbytte: 3 mg rent lyofilisat, renhet ca. 95%.

c) Anionevekslerkromatografi på DEAE-cellulose for

utvinning av Na- acetyl- eglin C og eglin C

100 ml av et overskikt etter proteinfellingen ved hjelp av eddiksyre (sammenlign eksempel 26a) konsentreres og underkastes en anionevekslerkromatografi på DEAE-53

ved pH 6,6 (kromatografibetingelser: Kolonne: 1,5 x 80 cm, elusjonsbuffer: 30 mM ammoniumacetat, pH 6,6, strømnings-hastighet 15 ml/time. Fraksjonsvolum 3,5 ml). Kolonnen blir

kalibrert med elusjonsbufferen og fremkalt inntil den første topp (eglin C) elueres mellom fraksjon 18-25. Fra frak-

sjon 50 utesluttes en lineær saltgradient av 300 ml elusjonsbuffer og 300 ml 0,06 M amoniumacetat/0,4 M NaCl pH 4,5. Na<->acetyl-eglin C eluerer mellom fraksjoner 70-85. Bestemmelsen lykkes ved hjelp av RP-HPLC, PAGE og HLE-test. Renheten av produktene er ca. 90% med hensyn til protein-innhold.

IP (pool frakt. 18-25): 6,5

IP (pool frakt. 70-85): 5,4.

På den beskrevne måte kan også Na<->acetyl-eglin B, Eglin B

og andre eglin-forbindelser fraskilles og renses.

Eksempel 27

Strukturbevis og fysikalsk-kjemisk karakterisering av Na- acetyl- eglin C

a. Bestemmelse av aminosyresammensetningen

200^ug Na<->acetyl-eglin C hydrolyseres med 6N HC1 ved 110°C

i 24 timer og analyseres deretter ifølge S. Moore et al. (29). Hydrolysatet oppviser den følgende sammensetning:

b_ Peptid-kartlegging av Na<->acetyl-eglin C.

I det følgende skjema er aminosyresekvensen av Na<->Acetyl-eglin C oq spaltstedene for trypsin og > Staphylococcus aureus-Protease merket (jfr. sitat 31) :

T: Spaltsteder for trypsin; V8: Spaltsteder- for Staphylococcus aureus-protease (V8)

IX Tryptisk avbygning av Na- acetyl- eglin C

Na<->acetyl-eglin C(9,6 mg, 1,18 ,uMol suspenderes i 2 ml 0,1 N ammoniumacetat-buffer; 10 -3 M CaC^/ pH-verdien innstilles med fortynnet ammoniakk på 7,5 og det inkuberes med TPCK-trypsin, 500^ug) i 90 timer ved 37°C. Enzym-

reaksjonen stoppes ved tilsetning av 50 ^,ul iseddik. Ved sentrifugering fjerner man et tryptisk fragment (T4) og adskiller derpå ved hjelp av omvendt-fase-HPLC det klare

oversikt i de øvrige tryptiske fragmenter (T-^T^) (jfr. ovenfor angitte skjema). Analysen skjer ved hjelp av PAB-kartlegging (3).

Den tryptiske avbygning av Na<->acetyl-eglin C (200 pMol) og

den mikropreparative RP-HPLC-isolering av DABTC-peptider ifølge metoden av R. Knecht et al. (32), samt sammenligningen med naturlig eglin C bekrefter identiteten av de tryptiske peptider T^, , T^ r T,-, Tg og T^ (jfr. ovenfor angitte skjema)

Peptidet T. (treonin på N-terminusen) oppviser i de to eksperimenter en gjenførelse til det naturlige eglin C forskjellig retensjonstid i en HPLC-analyse (nukleosil 5/C18, 4,6x120 mm; 1,2 ml/min.; elusjonsmiddel: 0,1% trifluoreddiksyre; acetonitril-vann 8:2 med 0,07% trifluoreddiksyre):

Rfc 9,44 min. (for sammenligning peptid T med naturlig

eglin C: Rfc 7,34 min.).

II. Staphylococcus aureus-protease V8-avbygning av det

tryptiske fragment av Na- acetyl- eglin C

Degradering av ca. 100 ,ug av det tryptiske fragment av N -acetyleglin C (se ovenfor) med Staphylococcus aureus-protease V8 gjennomføres i 100 ,ul 0,1 M ammoniumacetat pH

8,0 ved 3 7°C i 4 timer. Degradering gir de ventede fragmenter (jfr. ovenfor anførte skjema, blandingsanalyse

ved hjelp av FAB-MS).

c. Partiell sekvensanalyse

I) Edman- degradering

Det negative resultat av den klassiske sekvensanalyse ifølge Edman under standardbetingelser (3 3) (ingen N-terminale aminosyrerester blir identifisert) henviser til et modifisert (blokkert) N-terminus ved Na<->acetyl-eglin C.

II) Sekvensering ved hjelp av FAB- MS

Det N-terminale tryptiske fragment "Tn" har ifølge FAB ("hurtig atombombardement")—MS en nominell molekylvekt på 951. Denne ligger dermed 42 høyere enn i det korresponderende T^-fragment av naturlig eglin C (909). På grunn av masse-forskjellen må modifikasjonen foreligge på den N-terminale aminosyre treonin.

Molekylvekten av de øvrige tryptiske fragmenter fra det ovenfor angitte eksperiment (eksempel 2 7bl) tilsvarer forventningene.

d) Molekylvektbestemmelse av Na- acetyl- eglin C

(jfr. med naturlig eglin C)

De kjemiske molekylvekter er bestemt av 3 forskjellige målinger (C 12,011; H 1.0079; N 14.0067; 0 15.)))4).

Eksperimentelle betingelser: ca. 30<y>ug prøve oppløses direkte i tioglycerin som matrix på prøvegiveren og måles med et Xenon-bombardement; ioneenergi 3keV; scanning lineær mode; kalibrering: SsI/Rbl-referanseblanding.

e. Isoelektrisk fokusering

Bet<i>ngelser: Hver 2o/Ug prøve påføres i 20 ^ul H20. PAGplate LKB-ampholine pH 3,5-9,5, 5% PAG 1 rom.

Elektrolyt: anode (+) IM H3P04, katode(-) IN NaOH, 20 mA, 700V, 2,5 time. Farving ved hjelp av 10% (vekt/vol). trikloreddiksyre-oppløsning eller Coomassie Brilliant Blue R-250 på vanlig måte.

f. celluloseacetat- elektroforese ( økende)

Na<->acetyl-eglin C: 4,7 cm fra start retning katode

Eglin C : 5,8 cm fra start retning katode

Betingelser: Hver 2/Ug prøve påføres i 2^ 1 H^O på cello-gel 8 x 17 cm folie: Horifor flatsjiktelektroforesekammer, elektrolytt pH 1,9, 250 volt. 1 time; bestemmelse med de vanlige farvereagenser som TDM, ninhydrin, ponceau S-oppløsning.

g. Bestemmelse av N- acetyl- grupper i Na- acetyl- eglin C

I) 100 ^ug Na<->acetyl-eglin C hydrolyseres partielt i

100 ^,ul 0,03 N saltsyre i 16 timer ved 110°C og tørkes i høyvakuum. Ved hjelp av gasskromatografi identifiseres mer enn 0,5 ekvivalenter eddiksyre (34).

II) Acetylfunksjonen identifiseres entydig ved hjelp av

360 MHz-proton-resonansspektroskopi i det tryptiske fragment "T.^' (jfr. eksempel 27BI) : 400/,ug fragment "1^" av Na<->acetyl-eglin C tørkes 2 timer i høyvakuum og oppløses i 1 ml D00. 360 MHz H-NMR-spektrumet måles ved 297 K med 4000 SW over natten. Referanse H20 (& 4,95 ppm).

6 2,15 ppm singlett (3H) CH3 av N-acetyl-gruppe

5 1,2 ppm dublett (3H, J = 7Hz) Y-CH3 av treonin.

Eksempel 28

Transformasjon av forskjellige E. coli-stammer med plasmidet pML! 47 og kultivering av de transformerte vertceller

På analog måte som beskrevet i eksempel 18d transformeres stammene E. coli LM1035, E. coli JA221 og E. coli W3110 trpR, trp /\ ED24 (jfr. referanse 38) med plasmidet pMLl47. Transformerte kolonier prøves på tilstedeværelsen av F1(C)-F2~ DNA, som beskrevet i eksempel 15e. Det fåes 3, 5 hhv. 3 positive kolonier, som får de følgende betegnelser:

E. coli LM1035/pMLl4 7/l

E. coli LMl035/pMLl4 7/2

E. coli LM1035/pMLl4 7/3

E. coli JA221/pMLl4 7/l

E. coli JA221/pML147/2

E. coli JA221/pMLl47/3

E. coli JA221/pMLl4 7/4

E. coli JA221/pML147/5

E. coli W3110trpR, /\ trpED24/pML147/l

E. coli W3110trpR, / ± trpED24/pMLl47/2

E. coli W31l0trpR, /\ trpED24/pML14 7/3

De nevnte kloner kultiveres i et modifisert M9-medium,

som har den følgende sammensetning:

Det kultiveres ved 37°C og 180 omdr./min inntil bakteriesuspensjonen har fått en optisk tetthet (0D,-„<o>) av c. 13,0. Deretter høster man cellene (5 ml av den voksende kultur) og resuspenderer bakteriene i 0,5 ml av en oppløsning av 50 mM Tris'HCl (pH 8) o 30 mM NaCl. Deretter innstilles suspensjonen på 1 mg/ml lysozym og stilles 30 min. i is. Ved avvekslende innfrysning av suspensjonen i flytende nitrogen og opptining ved 37°C ødelegges bakteriene. Denne metode gjentas 5 ganger. Deretter sentrifugeres blandingen 30 min. ved 16000 omdr./min.ved 4°C.

Hver av klonene blir testet med hensyn til dannelsen av eglin C-aktivitet, som beskrevet i eksempel 21. I bakterie-ekstraktene fåes eglin C-aktiviteter av 3,0-13 ^ug/ml kultur. Eksempelvis fåes de følgende aktiviteter:

Eksempel 2 9

Fermentering av den transformerte stamme E. coli W3110trpR, trp /\ED24/pMLl47/1 og opparbeidelse av kulturnæringsmediet

På analog måte som beskrevet i eksempel 28 kultiveres i et 5000 1 gjærkar E. coli W3110trpR,trp2\ED24/pMLl4 7/l-celler i 3000 1 modifisert M9-medium, inntil suspensjonen har oppnådd en optisk tetthet (°Dg23^ av ca" 10-13.

Kulturnæringsmediet (pH 7,4) avkjøles til 10°C og cellene behandles med en Alfa-Laval BRPX-207 avslammingsanordning. Det klare overskikt inneholder ingen eglin-aktivitet og blir kastet. Under avslamningen blir slamrommet kontinuerlig partielt avslammet med lysebuffer A (50 mM Tris<*>HCl, 30 mM NaCl, innstilt med HC1 på pH 8,0) og til slutt blir innholdet i sentrifugeskålen (7 1) utstøtt under fullstendig avslam-ming med lysebuffer A. Den oppnådde cellemasse innstilles med buffer A på 375 1 og har en pH-verdi av 7,6. Etter kjøling til 5-10°C ledes suspensjonen gjennom en Dyno-

mølle (type KD5) som er utrustet med 4,2 1 glasskuler med en diameter av 0,5-0,75 mm. Derved blir cellene ødelagt. Den således oppnådde suspensjon innstilles medeeddiksyre

på et eddiksyreinnhold på 2% (v/v) og omrøres over natten ved 10°C. Suspensjonen med en pH av 3,9 avslammes ved hjelp av den ovenfor beskrevne teknikk. Det klare overskikt av 300 1 oppkonsentreres i en fallfilmfordamper (time-kapasitet 60 1 vann) til 35 1. Det lett uklare konsentrat sentrifugeres og det således oppnådde klare overskikt diafiltreres på et ultrafiltreringsanlegg DDS = Lab 35,

2

som er forsynt med GR 81 PP membraner (flate 2,5 m ), mot 2% eddiksyre. Sluttvolumet er 31 1.

En aliquot test av 2 1 av denne klare proteinoppløsning påføres på en Sephadex G-50 F-kolonne® med

et sjiktvolum på 96 1, hvorved kolonnen er bragt i likevekt med 2% eddiksyre. Den i 15 1 eluat inneholdende hoved-fraksjon bringes til et mindre volum ved hjelp av ultrafiltrering og diafiltreres deretter mot vann. Den således oppnådde klare, vandige oppløsning blir lyofilisert. Residuumet består av rene eglin C-forbindelser.

Eksempel 30

Analyse av produktblandingen av fermenteringen av E. coli W3110trpR, trp A ED24/ pMLl47/ l

De i eksempel 29 oppnådde, av eglin C-forbindelser bestående residuum blir underkastet en HPLC-analyse.

Eksperimentelle betingelser

Vydac 218 TP510-RP-HPLC-kolonne, 10 x 250 mm; 1 mg eglin-forbindelser pr. separasjon; AUFC: 2,0 ved 220 nm, gjennom-strømningshastighet: 2 ml/min; eluent: A: 0,1%. Trifluoreddiksyre, B: Acetonitril/vann 8:2 + 0,07% trifluoreddiksyre, 1 min. 40% B, deretter økende i 30 min. til 60% B.

Resultat

Det blir identifisert syv produkter, som blir fraksjonert og de enkelte blir underkastet HLE-prøven. Dessuten blir bestemt det isoelektriske punkt (IP; isoelektrisk fokusering som beskrevet i eksempel 27e, LKB-ampholine pH 4,0-6,5). Resultatene er oppstilt i den følgende tabell:

Ved hovedproduktet (fraksjon F2) dreier det seg på grunn av det målte isoelektriske punk, HPLC-verdien og den for kontroll gjennomførte molekylvektbestemmelse (funnet molekylvekt: 813 3,2) om N^- acetyl-eglin C. Substansen i fraksjon 0 (FO) er naturlig eglin C, som bevist av det isoelektriske punkt, HPLC-verdien og den for kontroll gjen-nomførte molekylvektbestemmelse (funnet molekylvekt: 8091,2).

Eksempel 31

Syntese av modifisert eglin C-forbindelser med E. coli HBlOl-celler, som ble transformert med plasmidet pML147(C) hhv. pML147 ( C") .

Stammene E. coli HB101 pML147 (C) og E. coli HB 101 pMLl47 (C") kultiveres som beskrevet i eksempel 22, og etter oppslutning av cellene blir kulturmediet renset ved kromatografi på en anhydrochymotrypsin-kolonne (jfr. eksempel 25).

Ved HPLC-separasjon (betingelser: se eksempel 30) blir isolert av kulturnæringsmediet til E. coli HB 101 pML147 (C) to produkter (A og B). Produkt A oppviser ved dist-elektroforesen (pH 8,9, 15%-ig gel, tilsvarende et Maurer-system nr. 2) en Rf-verdi av 0,42. Degradering med trypsin gir 7 fragmenter, av hvilke 6 er identisk med de

ot

ved degradering av N - acetyl-eglin C utvunne fragmenter

(jfr. eksempel 27b). Det 7. fragment, tilsvarende N-terminusen til peptider, består ifølge aminosyre-sekvensanalyse ifølge Edman (33) av sekvensen Ser-Glu-Leu-Lys. Produkt A har dermed den for eglin C ventede struktur:

Produkt B gir ved tryptisk degradering likeledes 7 fragmenter. En forskjell fra produkt A består kun i det N-terminale fragment, som bærer en ytterligere N-acetylgruppe på serin-resten og oppviser dermed sekvensen N-acetyl-Ser-Glu-Leu-Lys. Produkt B er dermed å betegne som N -acetyl-eglin C

Av oppslutningen av de kultiverte E. coli HB101pML147 (C")-celler lar seg identifisere etter kromatografi på en anhydro-cymotrypsin-kolonne og finrensing med HPLC kun et produkt, (produkt C). Produkt C oppviser ved dis-elektroforesen (betingelser som ovenfor) en R^-verdi av 0,30. Den tryptiske degradering gir som N-terminalt fragment dipeptidet Leu-Lys; de øvrige fragmenter er identisk med de tilsvarende, ved tryptisk avbygning av N -acetyleglin C isolerte fragmenter. Produkt C har dermed den for eglin C" ventede struktur:

Eksempel 32

Enzymatisk syntese av - acetyl- eglin C

8 mg (1 ^uMOL) eglin C (utvunnet ifølge eksempel 26 c med etterfølgende finrensning med HPLC) tilsettes i en 0,06

M fosfatbuffer pH 7,5 med 0,5 ^uMol acetyl-koenzym A og ca. 200 yug av et N<*->acetyltransferase inneholdende E. coli HBlOl-ekstrakt. Inkubasjonen gjennomføres ved 37°C. Etter 3 timer inaktiveres enzymet ved oppvarming til 60°C og blandingen underkastes HPLC-rensingen. Det fraskilte N<61->acetyl-eglin C er identisk med det biosyntetiske produkt (jfr. eksempel 26 c).

Eksempel 33

Test-sett med monoklonale anti-eglin-antistoffer for bestemmelse av eglin C, kompetitiv radio- immunoanalyse En ifølge eksempel 24cC) fremstilt oppløsning av anti-eglin C-antistoffer fortynnes med fosfatbufferet saltopp-løsning (PBS-oppløsning) til en konsentrasjon av l^ug pr. 100 yUl. 100 yUl av denne oppløsning inkuberes 2 timer ved 37°C i små plastikk-rør eller på plastikk-mikrotiterplater, hvorved antistoffet blir uspesifikt adsorbert på plastikkoverflåtene. For avmetning av de ennu frie aktive steder på plastikkoverflåtene etterbehandles med en bovinserum-albumin-oppløsning (BSA-oppløsning).

Fortynningsrekker av en prøveoppløsning eller standard-oppløsning i BSA-oppløsning tilsettes hver 50 ^ul av en oppløsning av ifølge kjent måte (20) med radioaktivt <125>jod merket eglin C med aktivitet 10 000 cpm pr. SCyil og inkuberes deretter på plastikkoverflåtene 2 timer ved 37°C og deretter 12 timer ved 4°C. De små rør eller mikrotiterplatene vaskes med fosfatbufferet saltoppløsning og radioaktiviteten måles. Konsentrasjonen av eglin C i prøveoppløsningen bestemmes med standardoppløsning målt justeringskurve.

Et test-sett for den beskrevne radio-immunoanalyse inneholder: 2 ml oppløsning av anti-eglin^antistoffer fra eksempel 24cC) med en konsentrasjon av 1 til 10 mg pr. ml,

100 ml fosfatbufferet saltoppløsning (PBS-oppløsning)

100 ml 0,3% bovinserum-albumin og 0,1% natriumazid i

PBS-oppløsning (BSA-oppløsning),

2 ml oppløsning av radioaktivt eglin C med aktivitet 200 000 cpm/ml,

2 ml standardoppløsning inneholdende 100 ng/ml eglin C,

1 ml rør eller mikrotiterplater av plastikk.

Eksempel 34

Test-sett for tandem ELISA med monoklonale anti-eglin C antistoffer

På mikrotiterplater fikseres 300 ng/fordypning monoklonale antistoffer 299S18-20, oppløst i natriumbikarbonat-fikseringsbuffer (pH 9,6), ved inkubasjon over natten ved 4°C. Platene vaskes tre ganger med fosfatbufferet koksaltoppløsning, inneholdende 0,005% Tween 20 (H 7,2) og fordypningene behandles deretter over natten ved 4°C med fosfatbuffret kokesaltoppløsning inneholdende 0,2% gelatin og 0,02% natriumazid (PBS + gelatin + A).med 200 ^ul/fordypning. Som tidligere blir det vasket tre ganger. Forskjellige konsentrasjoner av eglin C fortynnet i PBS + gelatin + A blir tilsatt og inkubert 4 timer ved værelsetemperatur. Etter tre gangers vasking som tidliger, kobles med 100 yul/fordypning med en blanding av det andre monoklonale antilegeme (299S22-1) tilsatt på alkalisk fosfatase ved optimal titer (0,5 mg/ml konjugat, for testen fortynnet 1:200 med PBS + gelatin +A) og inkuberes 2 timer ved værelsetemperatur, hvoretter etter tilsetning av 150^ul p-nitrofenylfosfat i dietanolaminbuffer (pH 9,8) fremkalles farven. Farveintensiteten (0D405) blir bestemt under en time ved hvert 15.minutt med et Multiscan ELISA avlese instrument.

På grunnlag av en justeringskurve med kjente mengder naturlig eglin C, f.eks. fra 10 1 til 10 3 ng/ml bestemmes ved sammenligning av de målte OD4Q5 innholdet av eglin C i den prøve som skal undersøkes.

Metoden er også anvendbar for bestemmelse av eglin B eller et annet eglin, F.eks. N -acetyl-eglin C, og er ogsa anvendbar når eglinet som skal bestemmes forefinnes i plasma, f.eks. i rotte-, katte- eller kanin-plasma.

Et test-sett for denne tandem ELISA omfatter de herfor nødvendige reagenser, spesielt monoklonale anti-eglin antilegemer, f.eks. 299S18-20 og 299S22-1, eventuelt som oppløsning i bufferen som skal benyttes, bufferen som skal benyttes, inklusiv substratbufferen, vaskeoppløs-ningene, p-nitrofenylfosfat som substrat, en standard-oppløsning inneholdende eglinet som skal bestemmes, f.eks. eglin C, en plastikkmikrotiterplate og/eller eventuelt en tabell eller justeringskurve, f.eks. den følgende som er oppnådd i henhold til den ovenfor beskrevne Tandem ELISA:

Eksempel 35

Farmasøytisk preparat som inneholder N -acetyl-eglin C for parenteral applikasjon

En ifølge eksempel 24 eller 25 fremstilt,N^-acetyl-eglin C inneholdende oppløsning dialyseres mot en 0,9%-ig NaCl-oppløsning. Konsentrasjonen av oppløsningen blir der-

etter innstilt etter fortynning med den samme NaCl-oppløsning på 1 mg/ml eller 10 mg/ml. Disse oppløsninger steriliseres ved ultrafiltrering (membraner med 0,22 ^um porer).

De steriliserte oppløsninger er direkte anvendbare for

den intravenøse forarbeidelse, for den kontinuerlige dråpeinfusjon, samt for findeling i et inhalasjonsapparat (f.eks. Bird).

De oppnådde monoklonale enti-eglin-antistoffer produserende hybridomaceller ble deponert i oktober 1984 i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" til Institut Pasteur, Paris, Frankrike, under de følgende nummer: Deponering 6. november 1984, deponert hybridomaceller nr. 1-362,299822-10nr 1-363.

Referanser

1. U. Seemiill<e>r et al, Hoppe-Seyler' s Z. Ph/siol. Chem. 358, 1105

(1977)

2. R. Knecht et al., Anal. Biochem. _130, 65 (1983)

3. A.M. Maxam og W. Gilbert, Proe. Nati. Acad. Sei. USA _74, 560

(1977); se også: Meth. Enzym. 65, 499 (1980)

4. A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)

5. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 8_1., 741 (1961)

6. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)

7. U.K. Laemrali, Nature 227, 680 (1970)

8. S. Tsunasawa og F. Sakiyama, i: Methods Enzymol. 106, 165

(1984)

9. S. Alkan et al., Mol. Iinmunol. 20, 203 (1983)

10. T. Chardj An Introduction to Radioimmunoassay and related

Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam 1978

11. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983)

12. K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 84, 489 (1972)

13. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972)

14. R.L. Letsinger and W.3. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. j)8, 3655

(1976)

15. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)

16. H.G. Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)

17. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)

18. K. Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982)

19. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.),

Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125

20. A.E. Bolton og W.M. Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973)

21. DE-0S 3 111 405 (Genentech)

22. A.C. Peacock et al., Biochemistry _6, 1818 (1967)

23. W. Muller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978)

24. M. Grunstein og D.S. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, 3961 (1979)

25. Ish-Horowitz, in loe. eit. 19), S. 368

26. Kohlerog Milstein, Nature 256, 495 (1975)

27. H. Ako et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. , 46_, 1639 (1972)

28. H. Fritz et al., in: "Methoden der enzymatischen Analyse" (utgiver H.U. Bergmeyer), 3. opplag Weinheim 1974, b. 1105 29. S. Moore et al., J. Biol. Chem. 192, 663 (1951), D.H. Spadman et al., Anal. Chem. 30, 1190 (1958) 30. H. Morris et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 117, 299 (1983) 31. U. Seemiiller et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 361, 1841

(1980)

32. R. Knecht et al., Analyt. Biochem. 130, 65 (1983)

33. W.F. Brandt et al., Z. Physiol. Chem. 357, 1505 (1976)

34. A. Goldstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 725 (1977) 35. R. Wetzel und D.V. Goeddel, in "The Peptides" (utgiver E. Gross og1* J. Meienhofer), Academic Press, New York 1983, S. 1-64 36. J.G. Bieth, Bull. europ. physiopath. respirat. _16_ (suppl.), 183

(1980)

37. L. Clarke og J. Carbon, J. Mol. Biol.120, 517 (1978)

38. D.S. Oppenheim oq* C. Yanofsky, J. Mol. Biol. 144, 143 (1980)

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av Na<->acetyl-eglin B, Na-acetyl-eglin C og salter derav, karakterisert ved at man dyrker en Escherichia coli-stamme, som er blitt transformert med en for ekspresjon i E.coli egnet vektor, inneholdende en E.coli-ekspresjonskontroll-sekvens og en av denne kontrollerte ekspresjonskontrollsekvensen, for eglin B- eller eglin C-kodende DNA-sekvens, i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbare karbon- og nitrogenkilder, og frigjør produktet fra vertscellen og isolerer og, om ønskelig, overfører et oppnådd salt til det frie polypeptidet eller et oppnådd polypeptid til et salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at vektoren er pML147 (figur 6).