FI86547B - Foerfarande foer framstaellning av en peptid som verkar farmakologiskt pao hjaercirkulationen eller skelettaemnesomsaettningen. - Google Patents

Description

86547

Menetelmä sydänverenkiertoon tai luuston aineenvaihduntaan farmakologisesti vaikuttavan peptidin valmistamiseksi

Keksintö koskee uusia peptidejä, joiden rakenne on johdettu ihmisen kaisitoniinigeenistä, eli ns. "kalsito-niinigeenille sukua olevien peptidien" (calcitonin gene related peptides, CGRP) ja niiden suoloja ja erityisesti menetelmää näiden yhdisteiden ja niiden suolojen valmistamiseksi. Keksinnössä käytetään vastaavia DNA-sekvenssejä ja mikro-organismeja, jotka sisältävät näitä DNA-sekvenssejä ja kykenevät tuottamaan mainittuja peptidejä. Voidaan myös valmistaa farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät mainittuja peptidejä tai niiden suoloja.

Näin ollen keksintö koskee ensinnäkin erityisesti menetelmää sellaisten peptidien valmistamiseksi, joissa on suuremman peptidin osasekvenssinä tai yksinomaisena sekvenssinä kaavan I mukainen aminohapposekvenssi -AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSer-ArgSerGlyGlyMetVelLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySer- (I)

LyeAlaPhe- jolloin kysteiinitähteet voivat muodostaa molekyylinsisäi-siä tai molekyylienvälisiä disulfidisiltoja, näiden peptidien johdannaisten, joissa on amidoitu terminaalinen karboksyyliryhmä ja/tai asyloitu terminaalinen aminoryhmä, sekä näiden suolojen valmistamiseksi.

Edellä mainitussa suuremmassa peptidissä on erityisesti korkentaan 90 ja pääasiassa korkeintaan 80, esimerkiksi korkeintaan 72 aminohappotähdettä. Aminohapposekvenssi on mielellään kaavan II mukainen 2 86547 -AapTyrValGlnMetLyeAlaSerGluLeuLyeGlnGluGlnGluThrClnSer— SerSerSerAlaAlaGlnLyeArgAlaCyeAenThrAlaThrCyeValThrHieArg- (II) LeuAIaGlyLeviLeuSerArgSerGlyGlyMetValLyeSerAenPheValProThr-AenValGlySerLyaAlaPheGlyArgArgArgSerAapLeuGluAla- tai tämän osa, joka sisältää vähintään yhden lisäamino-happotähteen ohella kaavan I mukaisen sekvenssin.

On edullista, jos molemmat kysteiinitähteet muodostavat molekyylinsisäisen disulfidisillan. Mutta voidaan myös muodostaa esimerkiksi dimeerejä, joissa kaksi pepti-diketjua on liittyneenä toisiinsa päistään tai mielellään päänsä ja häntänsä avulla eli antiparalleelisti molekyy-lienvälisten disulfidisiltojen avulla.

Terminaalinen aminoryhmä on mielellään vapaa, mutta se voi olla myös asyloitu, erityisesti asetyloitu.

Farmakologinen vaikutus on edellä mainituista peptideistä niillä, joissa terminaalinen karboksyyliryhmä on amidoidussa muodossa eli esiintyy erityisesti karba-moyyliryhmänä. Edellä mainitut peptidit, joissa terminaalinen karboksyyliryhmä on vapaassa muodossa tai suolamuodos--. sa, kuuluvat tähän keksintöön farmakologisesti vaikuttavien I ' amidien valmistuksen välituotteina.

Ensi sijassa keksintö koskee kaavan III mukaisen peptidiamidin valmistusta f-“-?

Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lya-Ser-Asn-Phe-Val-Pro- (III)

Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NHj (CGRP II) (CGRP II) ja sen suoloja.

Lisäksi keksintö koskee kaavan lila mukaisen N-asy-loidun peptidiamidin valmistusta 3 UZA7 CHj-E-Ala-Cy-A*n-Thr-Ale-Thr-Cy-Val-Thr-Hie-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lye-Ser-Aen-Phe- (Ilia)

Val-Pro-Thr-Aen-Val-Gly-Ser-Lye-Ala-Phe-ΝΗί.

Keksintö koskee myös kaavan Illb mukaisten peptidien valmistusta f-?

Ale-Cy-Aen-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-Hiu-Arg-Leu-Ala-Gly-Lcu-

Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lye-Ser-ABn-Phe-Val-Pro- (I Hb)

Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lya-Ala-Phe-AS^-OH

jossa kaavassa ASfi tarkoittaa aminohappoa, kuten erityisesti glysiiniä tai tyrosiinia, joka voidaan katkaista entsymaattisesti kaavan III mukaisen peptidiamidin terminaaliseksi NH2“ryhmäksi tai haluttaessa substituoida ammoniakilla sopivan entsyymin läsnäollessa, sekä näiden johdannaisia, joissa terminaalinen aminoryhmä on asetyloitu.

Kansainvälisesti hyväksyttyä nimistöä noudattaen tarkoittavat tässä selostuksessa käytetyt aminohappojen lyhenteet, esimerkiksi edellä olevat lyhenteet, vapaita ami-• : nohappoja ja, ellei toisin mainita, L-konfiguraatiota. a- aminoryhmän ajatellaan sijaitsevan lyhenteen vasemmalla puolella ja karboksyyliryhmän oikealla. Yhden vetyatomin puuttuminen α-aminoryhmästä on ilmaistu aminohapon lyhenteen vasemmalla puolella olevalla sidosviivalla. Hyd-raksyyliryhmän puuttuminen karboksyyliryhmästä on ilmaistu oikealla olevalla sidosviivalla. Aminohappojen sivuketjuissa olevat substituentit on sijoitettu sulkeisiin välittömästi aminohapposymbolin jälkeen tai ne on yhdistetty aminohapposymboliin siitä kohtisuoraan ylös- tai alaspäin suuntautuvalla viivalla. Lyhenne 0y ^y tarkoittaa kys-tiiniä.

Tähän mennessä ei ole tiedossa, esiintyvätkö keksinnön-mukaiset peptidit luonnossa eli esimerkiksi ihmisen elimistössä. Jos näin kuitenkin olisi, koskee keksintö ensi 4 86547 sijassa edellä mainittuja peptidejä ja niiden suoloja suurempana väkevyytenä kuin ne mahdollisesti luonnossa tai mahdollisesti tunnetuissa uutteissa esiintyvät. Erityisesti tämä keksintö koskee edellä mainittuja peptidejä eristetyssä tai puhdistetussa muodossa, puhtaassa tai oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa, oleellisesti ottaen toisessa ympäristössä eli muussa seosmuodossa, esimerkiksi farmaseuttisiin kantaja-aineisiin sekoitettuna, kuin ne mahdollisesti luonnossa esiintyvät, farmaseuttiseen käyttöön soveltuvassa muodossa, karakterisoidussa muodossa ja/tai elävän tai kuolleen organismin, elimen, solun, kudoksen tai kehon nesteen ulkopuolella olevassa muodossa. Erityisesti keksintö koskee synteettisesti tai geeniteknisesti valmistettuja peptidejä ja niiden suoloja.

Edellä mainitussa yhteydessä tarkoittaa käsite "eristetty" että peptidi on erotettu muista aineista ja varsinkin muista kemiallisista yhdisteistä, joiden kanssa keksinnönmukaiset yhdisteet mahdollisesti esiintyvät luonnossa. Käsite "puhdistettu" tarkoittaa kemiallisia ja/tai fysikaalisia menetelmiä käyttämällä puhdistet-- tua. "Oleellisesti ottaen puhdas" tarkoittaa yli 50 % : puhtausastetta.

Keksintö koskee myös suoloja, erityisesti keksinnön-‘ mukaisten peptidien farmaseuttisesti hyväksyttäviä, myrk- kyvaikutuksettomia suoloja. Edellä mainitut peptidit voivat muodostaa happoadditiosuoloja esimerkiksi epäorgaanisten happojen kanssa, joiksi sopivat esimerkiksi suolahappo, rikkihappo tai fosforihappo, tai orgaanisten happojen kanssa, joiksi sopivat esimerkiksi karbok-syyli-, sulfoni- tai sulfohapot, kuten etikkahappo, pro-pionihappo, glykolihappo, meripihkahappo, maleiinihappo, hydroksimaleiinihappo, metyylimaleiinihappo, fumaarihappo, omenahappo, viinihappo, sitruunahappo, bentsoehappo, ka-nelihappo, mantelihappo, salisyylihappo, 4-aminosalisyy-lihappo, 2-fenoksibentsoehappo, 2-asetoksibentsoehappo, 5 86547 embonihappo , nikotiinihappo tai isonikotiinihappo, edelleen aminohapot sekä metaanisulfonihappo, etaanisulfoni-happo, 2-hydroksietaanisulfonihappo, etaani-1,2-disulfo-nihappo, bentseenisulfonihappo, 4-metyyli-bentseenisulfo-nihappo tai naftaleeni-2-sulfonihappo, sekä muut happamat orgaaniset yhdisteet, kuten askorbiinihappo.

Ne edellä mainitut peptidit, joissa on vähintään yksi karboksyyliryhmä ja vähintään yksi emäksinen ryhmä, esimerkiksi aminoryhmä, voivat muodostaa sisäisiä suoloja.

Ne edellä mainitut peptidit, joissa on vähintään yksi vapaa karboksyyliryhmä,· voivat erityisesti enemmän karboksyyliryhmiä kuin emäksisiä ryhmiä sisältäessään muodostaa metalli- tai ammoniumsuoloja, kuten alkalimetal- li- ja maa-alkalimetallisuoloja, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuoloja, tai ammoniumsuoloja ammoniakin tai sopivien orgaanisten amiinien kanssa, jolloin tulevat kysymykseen ensi sijassa alifaattiset, syklo-alifaattiset, sykloalifaattis-alifaattiset tai aralifaat-tiset primääriset, sekundääriset tai tertiääriset mono-, di- tai polyamiinit sekä heterosykliset emäkset, kuten alempialkyyliamiinit, esim. trietyyliamiini, hydroksialem-pialkyyliamiinit, esim. 2-hydroksietyyliamiini, bis-(2-hydroksietyyli)-amiini, 2-hydroksietyylidietyyliamiini tai tri-(2-hydroksietyyli)-amiini, karboksyylihappojen emäksiset alifaattiset esterit, esim. 4-aminobentsoe-happo-2-dietyyliaminoetyyliesteri, alempialkyleeniamiinit, esim. 1-etyylipiperidiini, sykloalkyyliamiinit, esim. disykloheksyyliamiini, tai bentsyyliamiinit, esimerkiksi N,N'-dibentyylietyleenidiamiini, ja pyridiinityyppiset emäkset, esimerkiksi pyridiini, kollidiini tai kinoliini.

Eristämisessä ja puhdistamisessa voidaan käyttää myös farmaseuttisesti soveltumattomia suoloja. Terapeuttisiin tarkoituksiin sopivat kuitenkin vain farmaseuttisesti hyväksyttävät, myrkkyvaikutuksettomat suolat, josta syystä ne asetetaan etusijalle.

6 86547

Julkaisu Nature 308 (1984) s. 746-748 kuvaa ihmisen "kalsitoniini-geeniin liittyvää peptidiä" nro 1, lyhennetään hCGRP 1, kun taas esillä oleva hakemus koskee hCGRP 2:ta, joka eroaa hCGRP l:stä asemien 3 (Asn), 22 (Met) ja 25(Ser) aminohappojen suhteen. Esillä olevan hakemuksen aihe on siten uusi. Se perustuu myös keksinnölliseen työskentelyyn, sillä se ei ole syntynyt mielivaltaisesti aminohappoja vaihtamalla hCGRP l:ssä. Pikemminkin hCGRP 2 on keholle ominainen aine. Tämä tarkoittaa sitä, että ihmisen elimistössä ei muodostu sitä vastaan vasta-ainetta. Vasta-ainetta tiedetään muodostuvan silloin, kun annostus tapahtuu vieraalle lajille tai annostetaan peptidiä, joka on muutettu aminohappoja mielivaltaisesti vaihtamalla. Tällaiset peptidit elimistö voi tunnistaa immunologisesti vieraina ja elimistön niitä kohtaan suuntaamat hyökkäykset voivat johtaa ei-toivottuihin reaktioihin, kuten toivottua biologista vaikutusta voimakkaampiin haittavaikutuksiin tai jopa tehottomuuteen.

Mitä toivotulla biologisella vaikutuksella tarkoitetaan, se käy ilmi Franco-Cereceda et ai., (Circul. Res. 60. March 1987) artikkelin tiivistelmän riviltä 6, jossa mainitussa testissä CGRP 2 (tehokas konsentraatio EC5Q = 0,37 nM) ei ole ainoastaan tehokas vaan jopa selvästi aktiivisempi kuin CGRP 1 (tehokas konsentraatio EC,_0 = 0,59 nM).

Keksinnönmukaiset peptidiamidit vaikuttavat 10~15-mo-laarisina annoksina vasodilatoivasti, laskevat verenpainetta 7 86547 ja kohottavat sydämen lyöntitiheyttä sekä sydänlihaksen supistuvuutta. Sympaattisen hermojärjestelmän salpaajat, kuten metoprololi (1-isopropyyliamino-3-(4-{2-metoksietyy-li}-fenoksi)-propan-2-oli) ja Trandate (labetalolhydroklo-ridi) eivät muuta näiden peptidiamidien vaikutusta, mutta sen sijaan noradrenaliinin ja adrenaliinin vaikutus seerumissa heikkenee.

Bolus-injektiot, joilla annetaan 100 - 10 000 ng keksinnönmukaisia peptidamideja, esimerkiksi CGRP II:ta, saavat aikaan perfundoidussa rotan suolilievekerroksessa, joka on esisupistettu infusoimalla 4 vg/ml noradrenaliinia, pitoisuudesta riippuvaisen verisuonenlaajenemisen, koka ilmenee siten, että perfuusiopaine laskee jopa noin 5300 Pa:11a (40 mm Hg).

Rotilla, joilta on poistettu selkäydin (Gillesbie und Muir, Brit. J. Pharmacol. 3J), 88-98 (1967)) laskevat keksinnönmukaiset peptidiamidit, esimerkiksi CGRP II, 1 yg/kg/min annoksina verenpainetta, kohottavat sydämen lyöntitiheyttä noin 40 lyönnillä minuutissa ja estävät sympaattisen hermoston sähköstimuloinnilla tai angioten-siini II:ta tai adrenaliinia laskimonsisäisenä ruiskeena antamalla aikaansaadut painevaikutukset.

Keksinnönmukaiset peptidiamidit vähentävät mahanesteen erittymistä (eritetilavuus, hapon ja pepsiinin vapautuminen) sekä perustasolla että stimulantteina toimivan betanekolin tai histamiinin antamisen jälkeen. Ne vaikuttavat myös keskushermostoon.

Peptidiamideilla on myös kalsiumpitoisuutta alentava vaikutus eli ne alentavat veren kalsiumpitoisuutta ja suo-jaavat luustoa mimeraalihukalta.

Edellä selostettujen farmakologisten vaikutusten perusteella voidaan keksinnönmukaisia peptidiamideja käyttää lääkkeinä erityisesti verisuonten laajentamiseen ja kudosten läpi virtaavan verimäärän kohottamiseen, kuten angina pectoriksen, kohonneen verenpaineen, sydämen vajaatoiminnan tai muiden sydänverenkierron sairauksien hoidossa ja lisäksi sellaisiin indikaatioihin, joissa käytetään ih- 8 86547 misen kalsitoniinia, kuten esimerkiksi kaupallisesti £ saatavissa olevaa Cibacalcinia , esim. luuston aineenvaihduntahäiriöissä, kuten osteoporoosissa tai Pagetin taudissa.

Anndstus on noin 0,1 - 50 yg/kg, mielellään noin 1 -10 yg/ kg ruumiinpainoa.

Lämminverisillä ja erityisesti noin 70 kg painavilla ihmisillä ovat vuorokausiannokset noin 1 - 1000 yg, mielellään noin 10 - noin 100 yg, esimerkiksi noin 40 yg.

Anto tapahtuu mielellään parenteraalisesti, esimerkiksi laskimonsisäisesti 5 päivänä viikossa 3 kuukauden ajan.

Keksinnönmukaiset yhdisteet voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

Keksinnönmukaiselle menetelmälle, jolla valmistetaan edellä mainitut peptidit, peptidiamidit tai niiden johdannaiset, joissa on asyloitu terminaalinen aminoryh-mä, on tunnusomaista se, että a) tällaisen yhdisteen sisältämä amidisidos muodostetaan saattamalla tämän yhdisteen osa, jossa on vapaa karbok- syyliryhmä, tai joka on tämän osan reaktiokykyinen karboksyylihappo-johdannainen, reagoimaan vapaan aminoryhmän tai sen reaktiokykyisen johdannaisen sisältävän kompelementaarisen osan kanssa, jolloin mainittujen osien vapaat funktionaaliset ryhmät ovat reaktioon osallistuvia ryhmiä lukuunottamatta reaktion aikana tarvittaessa suojattuja, ja mahdollisesti läsnä olevat suojaryhmät poistetaan, tai b) valmistettaessa edellä mainittu yhdiste, jossa on on molekyylinsisäinen tai molekyylienvälinen disulfiäisiltä, edellä mainittu yhdiste, jossa kysteiinitähteiden merkaptoryhmät ovat vapaassa muodossa, tai jonka sisältämien kysteiinitähteiden merkaptoryhmien suojaryhmät poistuvat reaktio-olosuhteissa, hapetetaan sopivalla hapettimella, tai c) tällaisesta peptidistä, peptidiamidista tai näiden N-asyloidusta johdannaisesta, jossa on funktionaalinen ryhmä suojatussa muodossa, poistetaan suojaryhmä, tai d) edellä mainittujen peptidien valmistamiseksi viljellään 9 86547 E.coli-soluja, jotka ovat transformoituneet ilmentämisvek-torilla, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin sääte-temän, haluttua aminohappojärjestystä koodittavan DNA-sekvenssin, nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, tuote vapautetaan tarvittaessa E.coli-soluista ja eristetään ja mahdollisesti saatu dimeeri tai polymeeri käsitellään tarvittaessa disulfidisidosten katkaisuun soveltuvalla pel-kistimellä ja saatu pelkistetty tuote käsitellään tarvittaessa disulfidisidosten uudelleenmuodostumiseen soveltuvalla hapettimella, tai e) jonkun edellämainitun peptidiamidin valmistamiseksi sellainen peptidi, jossa halutun peptidiamidin aminohappo-sekvenssin C-päässä on lisäaminohappo ASrL , joka voidaan katkaista entsymaattisesti halutun peptidiamidin terminaalisen amidiryhmän Nl^-ryhmäksi tai substituoida ammoniakilla sopivan entsyymin läsnäollessa, käsitellään sopivan entsyymin avulla mahdollisesti ammoniakin läsnäollessa, ja haluttaessa missä tahansa menetelmävaihtoehdossa a-e) saatu suola muunnetaan vapaaksi yhdisteeksi tai saatu vapaa yhdiste muunnetaan suolaksi.

Menetelmä a: Tämän menetelmän mukaisesti suorite taan lopputuotteen synteesin viimeisenä reaktiovaiheena amidisidoksen muodostaminen mihin tahansa haluttuun kohtaan molekyylissä. Mainittu vapaan karboksyyliryhmän sisältävä osa voi olla joko yksittäinen aminohappo tai di-, oligo- tai polypeptidi tai, jos kyseessä on asyloi-dun terminaalisen aminoryhmän sisältävä johdannainen, myös asyloiva karboksyylihappo, kuten erityisesti etikkahappo. Edellä mainittu vapaan aminoryhmän sisältävä osa voi olla yksittäinen aminohappo, di-, oligo- tai polypeptidi tai, jos halutaan valmistaa peptidiamideja, myös amiini, kuten erityisesti ammoniakki.

Reaktio suoritetaan mielellään siten, että toisen osan reaktiokykyinen karboksyylihappojohdannainen saatetaan reagoimaan vapaan aminoryhmän sisältävän komplementaarisen 10 86547 osan kanssa, jolloin karboksyylihappojohdannaisen karbok-syyliryhmä voi aktivoitua myös in situ.

Reaktiokykyisiä karboksyylihappojohdannaisia ovat ensi sijassa reaktiokykyiset aktivoituneet esterit tai reak-tiokykyiset anhydridit tai reaktiokykyiset sykliset amidit; reaktiokykyisiä happojohdannaisia voi muodostua myös in situ.

Aktivoituneita happojen estereitä ovat erityisesti esteröivän tähteen liitoshiiliatomista tyydyttymättömät esterit, esim. vinyyliesterityyppiset, kuten varsinaiset vinyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esimerkiksi es-teröimällä vastaava esteri uudestaan vinyyliasetaatilla; aktivoituneen vinyyliesterin menetelmä), karbamoyylivi-nyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo isoksatsoliumreagenssilla; 1,2-oksatsolium- tai Woodward-menetelmä), tai 1-alempialk-oksivinyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo alempialkoksiasetyleenillä; etoksiasetyleenimenetelmä), tai amidinotyyppiset esterit, kuten N,N'-disubstituoidut amidinoesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo sopivalla Ν,Ν'-disubstituoidulla karbodi-imidillä, kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidillä; karbodi-imidi-menetelmä), tai Ν,Ν-disubtituoidut amidinoesterit (jotka voidaan valmistaa esimerkiksi käsittelemällä vastaava happo Ν,Ν-disubstituoidulla syanamidilla; syanamidi-menetelmä), sopivat aryyliesterit, erityisesti elektroneja puoleensavetävillä substituenteilla sopivasti subs-tituoidut fenyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo sopivasti substituoidulla fenolilla, esimerkiksi 4-nitrofenolilla, 4-metyylisulfo-nyylifenolilla, 2,4,5-trikloorifenolilla, 2,3,4,5,6-pentakloorifenolilla tai 4-fenyylidiatsofenolilla, kon-densointiaineen, kuten N,N1-disykloheksyylikarbodi-imi-din, läsnäollessa; aktivoituneen aryyliesterin menetelmä) , syanmetyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esimerkiksi käsittelemällä vastaava happo klooriasetonitriilil- 11 8654? lä emäksen läsnäollessa; syaanimetyyliesterimenetelmä), tioesterit, erityisesti mahdollisesti, esim. nitrolla, substituoidut fenyylitioesterit(jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo mahdollisesti, esim. nitrolla, substituoidulla tiofenolilla mm. käyttämällä apuna anhydridi- tai karbodi-imidimenetelmää; aktivoituneen tioesterin menetelmä), amino- tai amidoesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo N-hydroksi-amino- tai N-hydroksi-amidoyhdisteel-lä, esim. N-hydroksi-sukkinimidillä, N-hydroksi-pipe-ridiinillä, N-hydroksi-ftalimidillä tai 1-hydroksi-bents-triatsolilla, esim. anhydridi- tai karbodi-imidimenetel-män mukaisesti; aktivoituneen N-hydroksiesterin menetelmä) tai silyyliesterit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo silylointiaineella, esim. heksametyylidisilatsaanilla, ja jotka reagoivat helposti hydroksiryhmien kanssa, mutta eivät aminoryhmien kanssa).

Happoanhydridit voivat olla näiden happojen symmetrisiä tai mielellään seka-anhydridejä, esim. epäorgaanisten happojen, kuten happohalogenidien, erityisesti happoklori-dien kanssa muodostuneita (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo tionyylikloridilla, fosfo-ripentakloridilla tai oksalyylikloridilla; happokloridi-menetelmä), atsideja (jotka voidaan valmistaa esim. muodostamalla vastaavasta happoesteristä vastaava hydratsi-di ja käsittelemällä tämä typpihapokkeella; atsidimene-telmä), anhydridejä, jotka ovat muodostuneet puolihiili-happojohdannaisten kanssa, kuten vastaavien esterien, esim. hiilihappoalempialkyylipuoliesterien kanssa (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo halogeeni-, kuten kloorimuurahaishappoalempialkyylies-terillä, tai 1-alempialkoksikarbonyyli-2-alempialkoksi- 1,2-dihydrokinoliinilla, esim. 1-alempialkoksikarbonyyli- 2-etoksi-1,2-dihydrokinoliinilla; seka-O-alkyylihiili-happoanhydridimenetelmä) tai anhydridejä, jotka ovat muodostuneet dihalogenoidun, erityisesti diklooratun fosfo- 12 B 6 5 4 7 rihapon kanssa (jotka voidaan valmistaa käsittelemällä vastaava happo fosforioksikloridilla; fosforioksikloridimene-telmä), tai orgaanisten happojen kanssa muodostuneita anhydridejä, kuten orgaanisten karboksyylihappojen kanssa muodostuneita seka-anhydridejä (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo mahdollisesti substi-tuoidulla alempialkyyli- tai fenyylialkaanikarboksyylihappo-halogenidilla, esim. fenyylietikkahappo-, pivaliinihappo-tai trifluorietikkahappokloridillä; karboksyylihapposeka-anhydridimenetelmä) tai orgaanisten sulfonihappojen kanssa muodostuneita anhydridejä (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaavan hapon suola, kuten alkalimetalli-suola, sopivalla orgaanisella sulfonihappohalogenidilla, kuten alempialkaani- tai aryyli-, esim. metaani- tai p-tolueenisulfonyy lihappokloridilla: sulfonihappo seka - anhy d r i d i - menetelmä) sekä symmetrisiä anhydridejä (jotka voidaan valmistaa esim. kondensoimalla vastaava happo karbodi-imidin tai 1-dietyyliaminopropiinin läsnäollessa; symmetristen anhydridien menetelmä).

Sopivia syklisiä amideja ovat erityisesti luonteeltaan aromaattisten viisijäsenisten diatsarenkaiden kanssa muodostuneet amidit, kuten imidatsolien, esim. imidatsolin kanssa muodostuneet (jotka voidaan valmistaa käsittelemällä vastaava happo N,N'-karbonyyli-imidatsolilla; imid-atsolidimenetelmä) tai pyratsolien, esim. 3,5-dimetyyli-pyratsolin kanssa muodostuneet (jotka voidaan valmistaa esim. muodostamalla happohydratsidi ja käsittelemällä se asetyyliasetonilla; pyratsolidimenetelmä).

Kuten edellä mainittiin, voidaan karboksyylihappojohdannaiset muodostaa myös in situ. Niinpä voidaan esimerkiksi valmistaa N,N'-disubstituoitu amidinoesteri saattamalla vapaan aminoryhmän sisältävä komplementaarinen osa reagoimaan vapaan karboksyyliryhmän sisältävän pep-tidiosan kanssa sopivan N,N-disubstituoidun karbodi-imidin , esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin, läsnäollessa. Lisäksi voidaan muodostaa hapon amino- tai amido- 13 86547 estereitä asyloitavan amiinin läsnäollessa siten, että vastaavien happo- ja aminolähtöaineiden seos saatetaan reagoimaan N,N'-disubstituoidun karbodi-imidin, esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin, ja N-hydroksiamii-nin tai N-hydroksiamidin, esim. N-hydroksisukkinimidin, läsnäolessa käyttämällä reaktiossa mahdollisesti myös sopivaa emästä, esim. 4-dimetyyliaminopyridiiniä.

Vaihtoehtoisesti voidaan menetelmävaihtoehto a) toteuttaa myös niin, että vapaan karboksyyliryhmän sisältävä osa saatetaan reagoimaan komplementaarisen osan kanssa siten, että aminohappo on reaktiokykyisessä muodossa. Aminoryhmä voidaan aktivoida esimerkiksi reaktiolla fos-fiitin kanssa, esim. dietyylikloorifosfiitin, 1,1-feny-leenikloorifosfiitin kanssa, etyylidikloorifosfiitin kanssa, etyleenikloorifosfiitin kanssa tai tetraetyylipyrofos-fiitin kanssa.

Aminoryhmä voidaan myös aktivoida muodostamalla ha-logeenikarbonyyli-, esim. kloorikarbonyyliryhmä, tai iso-syanaattiryhmä.

Edellä mainittujen osien vapaat funktionaaliset ryhmät, erityisesti karboksyyli-, amino-, hydroksi- ja merkap-toryhmät, ovat mielellään suojatussa muodossa, ellei niiden ole tarkoitus osallistua reaktioon.

Suojaryhmiä, niiden liittämistä ja poistamista on selostettu esimerkiksi seuraavissa teoksissa: "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London,

New York, 1973; "Methoden der organischen Chemie", Hoyben-Weyl, 4. Auflage, Bd. 15/1, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974; ja Theodora W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York, 1981. Suojaryhmille on ominaista se, että ne voidaan poistaa helposti ilman ei-toivottuja sivureaktioita esim. solvo-lyyttisesti, pelkistämällä, fotolyyttisesti tai myös fysiologisissa olosuhteissa.

Hydroksyyliryhmien suojaryhmiä ovat esim. asyyli-ryhmät, kuten mahdollisesti esim. halogeenilla substi- 14 86547 tuoidut alempialkanoyyliryhmät, kuten 2,2-diklooriase-tyyli, tai hiilihappopuoliesterien asyyliryhmät, erityisesti tert.-butyylioksikarbonyyli, mahdollisesti substi-tuoitu bentsyylioksikarbonyyli, esim. 4-nitrobentsyyli-oksikarbonyyli, tai difenyylimetoksikarbonyyli, tai 2-halogeeni-alempialkoksikarbonyylit, kuten 2,2,2-tri-kloorietoksikarbonyyli, edelleen trityyli tai formyyli tai orgaaniset silyyli- tai stannyyliryhmät, edelleen helposti poistettavissa olevat eetteröivät ryhmät, kuten tert.-alempialkyyliryhmät, esim. tert.-butyyli, 2-oksa- tai 2-tia-alifaattiset tai -sykloalifaattiset hiilivetyryhmät, ensi sijassa 1-alempialkoksialempi-alkyyli- tai 1-alempialkyylitioalerapialkyyliryhmät, esim. metoksimetyyli, 1-metoksietyyli, 1-etoksietyyli, metyyli-tiometyyli, 1-metyylitioetyyli tai 1-etyylitioetyyli, tai 5-6 rengashiiliatomia sisältävät 2-oksa- tai 2-tia-sykloalkyyliryhmät, esim. tetrahydrofuryyli tai 2-tetrahydropyranyyli tai vastaavat tia-analogit, sekä mahdollisesti substituoidut 1-fenyylialempialkyyliryhmät, kuten mahdollisesti substituoitu bentsyyli tai difenyyli-metyyli, jolloin fenyyliryhmien substituentteina tulevat kysymykseen esim. halogeenit, kuten kloori, alempialkoksi-ryhmät, kuten metoksi, ja/tai nitro.

Karboksyyliryhmät suojataan yleensä esterimuotoon siten, että esteriryhmät on helppo poistaa miedoissa olosuhteissa. Tällä tavoin suojatuissa karboksyyliryhmissä on esterin muodostavina ryhminä ennen kaikkea 1-asemasta haarautuneita tai 1- tai 2-asemasta sopivalla tavalla substituoitu ja alempialkyyliryhmiä. Etusijalle asetettavia esteröidyssä muodossa olevia karboksyyliryhmiä ovat mm. tert.-alempialoksikarbonyyliryhmät, esim. tert.-butyylioksikarbonyyli, yksi tai kaksi aryylitähdettä sisältävät aryyli-metoksikarbonyyliryhmät, jolloin näissä voi olla esim. alempialkyyliryhmillä, kuten tert.-alempialkyyliryhmillä, esim. tert.-butyylillä, alempialkoksiryhmillä, kuten nietoksilla, hydroksyyliryhmällä, halogeenilla, esim. kloorilla, ja/tai nitroryhmällä mono- tai polysubstituoituja is 86547 fenyyliryhmiä, kuten esim. substituoitu bentsyylioksikar-bonyyli, esim. 4-metoksibentsyylioksikarbonyyli tai 4-nitrobentsyylioksikarbonyyli, tai kuten esim. kuten edellä on mainittu mahdollisesti substituoitu difenyyli-metoksikarbonyyli, esim. difenyylimetoksikarbonyyli tai di-(4-metoksifenyyli)-metoksikarbonyyli, 1-alempi-alkoksialempialkoksikarbonyyliryhmät, kuten metoksimetok-sikarbonyyli, 1-metoksietoksikarbonyyli tai 1-etoksimetoksi-karbonyyli, 1-alempialkyylitioalempialkoksikarbonyyliryh-mät, kuten 1-metyylitiometoksikarbonyyli tai 1-etyylitio-etoksikarbonyyli, aroyylimetoksikarbonyyliryhmät, joissa aroyyliryhmä voi olla haluttaessa esim. halogeenilla, kuten bromilla substituoitu bentsoyyliryhmä, kuten fen-asyylioksikarbonyyli, 2-halogeenialempialoksikarbonyyli-ryhmät, esim. 2,2,2,trikloorietoksikarbonyyli, 2-bromi-(etoksikarbonyyli tai 2-jodietoksikarbonyyli, tai 2- tri-substituoitu silyyli)-etoksikarbonyyli, jossa kukin substi-tuentti voi toinen toisestaan riippumatta olla mahdollisesti esim. alempialkyylillä, alempialkoksilla, aryylillä, halogeenilla ja/tai nitrolla substituoitu alifaattinen, aralifaattinen, sykloalifaattinen tai aromaattinen hii-livetyryhmä, kuten vastaava, mahdollisesti substituoitu alempialkyyli, fenyylialempialkyyli, sykloalkyyli tai fenyyli, kuten esim. 2-trialempialkyylisilyylietoksikarbo-nyyli, 2-trimetyylisilyylietoksikarbonyyli tai 2-(di-n-butyylimetyylisilyyli)-etoksikarbonyyli tai 2-triaryyli-silyylietoksikarbonyyli, kuten 2-trifenyylisilyylietoksi-karbonyyli.

Edellä ja jäljempänä mainitut orgaaniset silyyli-tai stannyyliryhmät sisältävät pii- tai tina-atomien substituentteina mielellään alempialkyyliryhmiä, erityisesti metyyliryhmiä. Vastaavia silyyli- tai stannyyliryh-miä ovat ensi sijassa trialempialkyylisilyyliryhmät, erityisesti trimetyylisilyyli ja dimetyyli-tert.-butyyli-silyyli, tai vastaavasti substituoidut stannyyliryhmät, kuten tri-n-butyylistannyyli. Edellä ja jäljempänä mainitut orgaaniset silyyli- tai stannyyliryhmät sisältävät ,6 8£S<:7 mielellään alempialkyyliryhmiä, erityisesti metyyliryhmiä, pii- ja tina-atomien substituentteina. Tällöin kyseeseen tulevia silyyli- tai stannyyliryhmiä ovat ensi sijassa trialempialkyylisilyyliryhmät, erityisesti trimetyylisi-lyyli, ja dimetyyli-tert.-butyylisilyyli, ja vastaavasti substituoidut stannyyliryhmät, kuten tri-n-butyyli-stannyyli.

Etusijalle asetettavia suojattuja karboksyyliryhmiä ovat tert.-alempialkoksikarbonyyli, kuten tert.-butoksi-karbonyyli, ja ensi sijassa esim. edellä mainitulla tavalla substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten 4-nitrobentsyylioksikarbonyyli, tai difenyylimetoksikarbo-nyyli ja ennen kaikkea 2-(trimetyylisilyyli)-etoksikar-bonyyli sekä 4-bentsyylioksikarbonyylibenstyylioksikarbo-nyyli, jolloin ensin mainitun bentsyylioksikarbonyyli-ryhmän fenyyliryhmä on kantaja-ainepolymeerin osa eli esim. divinyylibentseenillä silloitetun polystyreenin osa.

Suojattu aminoryhmä voi olla esim. helposti lohkaistavissa olevan asyyliamino-, aryylimetyyliamino-, eet-teröidyn merkaptoamino-, 2-asyyli-alempialk-1-enyyliamino-, silyyliamino- tai stannyyliaminoryhmän muodossa.

Vastaavassa asyyliaminoryhmässä on asyyli esimerkiksi korkeintaan 18 hiiliatomia sisältävän orgaanisen karboksyy-lihapon asyyliryhmä, ja erityisesti se on peräisin mahdollisesti esim. halogeenilla tai aryylillä substituoi-dusta alkaanikarboksyylihaposta tai mahdollisesti esim. halogeenilla, alempialkoksilla tai nitrcryhmällä substi-tuoidusta bentsoehaposta tai hiilihappopuoliesteristä. Tällaisia asyyliryhmiä ovat esim. alempialkanoyyliryhmät, kuten formyyli, asetyyli tai propionyyli, halogeenialempi-alkanoyyliryhmät, kuten 2-halogeeniasetyyli, erityisesti 2-kloori-, 2-bromi-, 2-jodi-, 2,2,2-trifluori- tai 2,2,2-triklooriasetyyli, mahdollisesti esim. halogeenilla, alempialkoksilla tai nitroryhmällä substituoitu bentso-yyli, esim. bentsoyyli, 4-klooribentsoyyli, 4-metoksi-bentsoyyli tai 4-nitrobentsoyyli, tai alempialkyyliryh- 17 86547 män 1-asemasta haarautuneet tai 1- tai 2-asemasta sopivasti substituoidut alempialkoksikarbonyyliryhmät, erityisesti tert.-alempialkoksikarbonyyliryhmät, esim. tert.-butoksikarbonyyli, aryylimetoksikarbonyyliryhmät, joissa on yksi tai kaksi aryyliryhmää, jotka ovat mielellään mahdollisesti esim. alempialkyylillä, erityisesti tert.-alempialkyylillä, kuten tert.-butyylillä, alempialkokseil-la, kuten nietoksilla, hydroksyylillä, halogeenilla, esim. kloorilla, ja/tai nitroryhmällä mono- tai polysubstituoitu-ja fenyyliryhmää, Kuten mahdollisesti substituoitu bentsyy-lioksikarbonyyli, esim. 4-nitrobentsyylioksikarbonyyli, tai substituoitu difenyylimetoksikarbonyyli, esim. bentshydryy-lioksikarbonyyli tai di-(4-metoksifenyyli)metoksikarbonyy-li, aroyylimetoksikarbonyyliryhmät; joissa aroyyliryhmä on mielellään mahdollisesti esim. halogeenilla, kuten bromilla, substituoitu bentsoyyli, esim. fenasyylikarbonyyli, 2-halogeenialempialkoksikarbonyyliryhmät, esim. 2,2,2-trikloorietoksikarbonyyli, 2-bromietoksikarbonyyli tai 2-jodietoksikarbonyyli, tai 2-(trisubstituoitu silyyli)etoksi-karbonyyliryhmät, joissa kukin substituentti voi toinen toisestaan riippumatta olla mahdollisesti esim. alempialkyylillä, alempialkoksilla, aryylillä, halogeenilla ja/tai nitrolla substituoitu korkeintaan 15 hiiliatomia sisältävä alifaattinen, aralifaattinen, sykloalifaatti-nen tai aromaattinen hiilivetyryhmä, kuten vastaava, mahdollisesti substituoitu alempialkyyli, fenyylialempial-kyyli, sykloalkyyli tai fenyyli, kuten esim. 2-trialempi-alkyylisilyylietoksikarbonyyli, kuten 2-trimetyylisilyyli-etoksikarbonyyli tai 2-(di-n-butyylimetyylisilyyli)etoksi-karbonyyli, tai 2-triaryylisilyylietoksikarbonyyli, kuten 2-trifenyylisilyylietoksikarbonyyli.

Muita aminoryhmän suojaryhminä kysymykseen tulevia asyyliryhmiä ovat orgaanisten fosfori-, fosioni- tai fosfiinihappojen vastaavat tähteet, kuten dialempialkyy-lifosforyyli, esim. dimetyylifosforyyli, dietyylifosfo-ryyli, di-n-propyylifosforyyli tai di-isopropyylifosforyy- 18 86 5-:7 li, disykloalkyylifosforyyliryhmät, esim. disyklohek-syylifosforyyli, mahdollisesti substituoidut difenyyli-fosforyyliryhmät, esim. difenyylifosforyyli, mahdollisesti, esim. nitroryhmällä, substituoidut di(fenyyli-alempialkyyli)fosforyyliryhmät, esim. dibentsyylifosfo-ryyli tai di(4-nitrobentsyyli)fosforyyli, mahdollisesti substituoidut fenyylioksifenyylifosfonyyliryhmät, esim. fenyylioksifenyylifosfonyyli, dialempialkyylifosfinyyli-ryhmät, esim. dietyylifosfinyyli, tai mahdollisesti substituoidut difenyylifosfinyyliryhmät, esim. difenyy-lifosfinyyli.

Aryylimetyyliaminoryhmässä, joissa on mono-, di-tai erityisesti triaryylimetyyliaminoryhmä, ovat aryy-liryhmät erityisesti mahdollisesti substituoituja fe-nyyliryhmiä. Tällaisia ryhmiä ovat erityisesti bentsyyli-, difenyylimetyyli- ja erityisesti trityyliamino.

Eetterin muodostava merkaptoryhmä tällaisella ryhmällä suojatussa aminoryhmässä on ensi sijassa aryylitio tai aryylialempialkyylitio, jolloin aryyli on erityisesti mahdollisesti, esim. alempialkyylillä, kuten metyylillä tai tert.-butyylillä, alempialkoksilla, kuten nietoksilla, halogeenilla, kuten kloorilla, ja/tai nitrolla, substi-tuoitu fenyyli. Vastaava aminoryhmän suojaryhmä on esim.

4-nitrofenyylitio.

Aminoryhmän suojaryhmänä käytettävässä 2-asyyli-alempialk-1-en-1-yyliryhmässä on asyyli esim. ryhmä, joka on peräisin alempialkaanikarboksyylihaposta, mahdollisesti esim. alempialkyylillä, kuten metyylillä tai tert.-butyylillä, alempialkoksilla, kuten nietoksilla, halogeenilla, kuten kloorilla, ja/tai nitrolla substituoidusta befttsoehaposta tai erityisesti hiilihappopuolieste-ristä, kuten hiilihappoalempialkyyliesteristä. Vastaavia suojaryhmiä ovat ensi sijassa 1-alempialkanoyyliprop-1-en-2-yyliryhmät, esim. 1-asetyyliprop-1-en-2-yyli, tai 1-alempialkoksikarbonyyliprop-1-en-2-yyliryhmät, esim.

1-etoksikarbonyyliprop-1-en-2-yyli.

Aminoryhmä voidaan myös suojata protonoituun muotoon, 19 86547 jolloin vastaavina anioneina tulevat ensi sijassa kysymykseen vahvojen epäorgaanisten happojen, kuten halogee-nivetyhappojen, vastaavat anionit, esim. kloori- tai bromi-anioni, tai orgaanisten sulfonihappojen, kuten p-toluee-nisulfonihapon, anionit.

Etusijalle asetettavia aminoryhmän suojaryhmiä ovat hiilihappopuoliesterien asyyliryhmät, erityisesti tert.-butyylioksikarbonyyli, mahdollisesti esim. edellä mainitulla tavalla substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, esim. 4-nitrobentsyylioksikarbonyyli, tai difenyylimetoksi-karbonyyli tai 2-halogeenialempialkoksikarbonyyliryhmät, kuten 2,2,2-trikloorietoksikarbonyyli, ja edelleen tri-tyyli tai formyyli.

Merkaptoryhmä, kuten esimerkiksi kysteiinin sisältämä, voidaan suojata erityisesti S-alkyloimalla mahdollisesti substituoiduilla alkyyliryhmillä, tioasetaalinmuo-dostuksella, S-asyloinnilla tai saamalla aikaan asymmetrisiä disulfidiryhmiä. Etusijalle asetettavia merkapto-ryhmän suojaryhmiä ovat esimerkiksi mahdollisesti fe-nyyliryhmästä, esim. nietoksilla tai nitrolla, substituoi-dut bentsyyliryhmät, kuten 4-metoksibentsyyli, mahdollisesti fenyyliosasta, esim. nietoksilla, substituoidut di-fenyylimetyyliryhmät, kuten 4,4'-dimetoksidifenyylimetyyli, trifenyylimetyyli, trimetyylisilyyli, bentsyylitiometyy-li, tetrahydropyranyyli, asyyliaminometyyliryhmät, esim. asetyyliaminometyyli, bentsoyyli, bentsyylioksikarbonyyli tai aminokarbonyyliryhmät, kuten etyyliaminokarbo-nyyli.

Primääriset karboksyylihappoamidiryhmät (-CONI^) voidaan suojata esimerkiksi N-(9-ksantenyyli)-johdannaisten tai N-(mono-, di- tai triaryylimetyyli)-johdannaisten muotoon, jolloin aryyli tarkoittaa erityisesti substitu-oimatonta tai korkeintaan viidellä eri- tai samanlaisella substituentilla substituoitua fenyyliä. Tällaisia fenyyliryhmän substituentteja ovat ensi sijassa alempial-kyyli, kuten metyyli, alempialkoksi, kuten metoksi, tai 20 86547 varsinkin myös polymeeriset kantaja-aineet. Esimerkkeinä tällaisista aryylimetyylisuojaryhmistä voidaan mainita 4-metoksibentsyyli, 2,4,6-trimetoksibentsyyli, di-fenyylimetyyli, di-(4'-metoksifenyyli)metyyli, di-(4-metyylifenyyli)metyyli ja (4-metyylifenyyli)-(/polymeerinen kantaja-ainej-fenyyli)-metyyli.

Guanidinoryhmät suojataan esim. tolueenisulfonaat-teina.

Suojaryhmiksi ja erityisesti karboksyyliryhmän suoja-ryhmiksi sopivat tämän patenttihakemuksen alueella suojattavista funktionaalisista ryhmistä, kuten erityisesti karboksyyliryhmistä, helposti irrotettavissa olevat polymeeriset kantaja-aineet erityisesti, kuten sellaiset, jotka soveltuvat Merrifield-synteesiin. Tällainen sopiva polymeerinen kantaja-aine on esim. divinyylibentseenin kanssa kopolymeroimalla aikaansaatu heikosti silloittu-nut polystyreenihartsi, joka sisältää peptiditähteiden re-versiibeliin sitomiseen sopivia sillanmuodostajia.

Reaktio voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin reaktio-olosuhteet riippuvat ensi sijassa siitä, onko osallistuva karboksyyliryhmä aktivoitu ja kuinka se on aktivoitu, ja reaktiossa käytetään taval- . , i .

lisesti sopivaa liuotinta tai laimennusainetta tai jotakin näiden seosta ja tarvittaessa toimitaan konden-sointiaineen läsnäollessa, joka voi olla myös esim. happoa sitova aine, jos reaktioon osallistuva karboksyyliryhmä on anhydridimuodossa, jäähdytystä tai kuumennusta käyttäen, esim. lämpötila-alueella noin -30 - noin +150°C, suljetussa reaktioastiassa ja/tai inerttikaasu-atmosfäärissä, kuten typpiatmosfäärissä. Tavallisia kon-densointiaineita ovat esim. karbodi-imidit, esim. N,N'-dietyyli-, N,N'-dipropyyli-, Ν,Ν'-disykloheksyyli-tai N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, sopivat karbonyyliyhdisteet, esim. karbonyylidi-imidat-soli, tai 1,2-oksatsoliumyhdisteet, esim. 2-etyyli-5-fenyyli-1,2-oksatsolium-3'-sulfonaatti ja 2-tert.-bu-tyyli-5-metyyli-isoksatsoliumperkloraatti, tai sopivat 21 86547 asyyliaminoyhdisteet, esim. 2-etoksi-1-etoksikarbonyyli- 1,2-dihydrokinoliini. Sopivia haponsitojakondensointi-aineita ovat esim. alkalimetallikarbonaatit tai -vety-karbonaatit, esim. natrium- tai kaliumkarbonaatti tai -vetykarbonaatti (tavallisesti yhdessä sulfaatin kanssa), tai orgaaniset emäkset, kuten tavallisesti steerisesti estetyt trialempialkyyliamiinit, esim. N,N-di-isopropyy-pi-N-etyyliamiini.

Suojaryhmät, kuten karboksyyliryhmien,aminoryhmien, hydroksyyliryhmien,karboksyylihappoamidiryhmien ja merkapto-ryhmien suojaryhmät, voidaan poistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. solvolyysillä, erityisesti hydrolyysillä, alkoholyysillä tai asidolyysillä, tai pelkistämällä, erityisesti hydrogenolyysillä tai kemiallisella pelkistyksellä, mahdollisesti vaiheittain tai samanaikaisesti, jolloin voidaan käyttää myös entsymaattisia menetelmiä.

Niinpä voidaan tert.-alempialkoksikarbonyyli tai 2-asemastaan orgaanisella silyyliryhmällä tai 1-asemastaan alempialkoksiryhmällä tai alempialkyylitioryhmällä substituoitu alempialkoksikarbonyyliryhmä tai mahdollisesti substituoitu difenyylimetoksikarbonyyliryhmä muuntaa esimerkiksi käsittelemällä sopivalla hapolla, kuten muurahaishapolla tai trifluorietikkahapolla, mahdollisesti lisäämällä reaktioon nukleofiilista yhdistettä, kuten fenolia tai anisolia, vapaaksi karboksyyliryhmäksi. Mahdollisesti substituoitu bentsyylioksikarbonyyliryhmä voidaan vapauttaa esim. hydrogenolyysillä eli käsittelemällä vedyllä hydrauskatalyyttinä toimivan metallin, kuten palladiumin, läsnäollessa. Edelleen voidaan sopivasti substituoitu bentsyylioksikarbonyyliryhmä, kuten 4-nitrobentsyy-lioksikarbonyyliryhmä, muuntaa vapaaksi karboksyyliryhmäksi myös kemiallisella pelkistyksellä, esim. käsittelemällä alkalimetalli-, esim. natriumdi-tioniitilla tai pelkistävällä metallilla, esim. sinkillä tai metallisuolalla, kuten kromi(2)suolalla, esim. kromi(2)kloridilla, tavallisesti vetyävapauttavan aineen läsnäollessa, joka kykenee yhdessä metallin kanssa vapauttamaan vetyä in nas- 22 S£547 cendi, joka aine voi olla esim. happo, ensi varsinkin sopiva karboksyylihappo, kuten mahdollisesti esim. hydrok-syyliryhmällä substituoitu alempialkaanikarboksyylihappo, esim. etikkahappo, muurahaishappo, glykolihappo, difenyy-liglykolihappo, maitohappo, mantelihappo, 4-kloorimanteli-happo tai viinihappo, tai alkoholi tai tioli, jolloin mielellään lisätään vettä. Edellä kuvatulla tavalla pelkistävällä metallilla tai metallisuolalla käsittelemällä voidaan myös 2-halogeenialempialkoksikarbonyyli-ryhmä (mahdollisesti muuntamalla ensin 2-bromialempialk-oksikarbonyyliryhmä vastaavaksi 2-jodialempialkoksikarbo-nyyliryhmäksi) tai aroyylimetoksikarbonyyliryhmä muuntaa vapaaksi karbonyyliryhmäksi, jolloin aroyylimetoksikarbonyyliryhmä voidaan yhtä lailla lohkaista käsittelemällä nukleofiilisellä, mielellään suolanmuodostajareagenssilla, kuten natriumtiofenolaatilla tai natriumjodidilla. Substituoitu 2-silyylietoksikarbonyyliryhmä voidaan myös muuntaa vapaaksi karboksyyliryhmäksi käsittelemällä fluorive-tyhapon fluoridianionin antavalla suolalla, kuten alka-limetallifluoridilla, esim. natrium- tai kaliumfluoridilla, makrosyklisen polyeetterin ("kruunueetterin") läsnäollessa tai orgaanisen, kvartäärisen emäksen fluoridilla, kuten tetra-alempialkyyliammoniumfluoridilla tai trialem-pialkyyliaryyliammoniumfluoridilla, joita ovat esim. tetra-etyyliammoniumfluoridi tai tetrabutyyliammoniumfluoridi, aproottisen polaarisen liuottimen, kuten dimetyylisulfoksi-din tai Ν,Ν-dimetyyliasetamidin, läsnäollessa.

Suojattu aminoryhmä vapautetaan sinänsä tunnetulla tavalla suojaryhmän luonteesta riippuen, mielellään sol-volyysillä tai pelkistämällä. Vapauttaminen voidaan suorittaa 2-halogeenialempialkoksikarbonyyliaminoryhmästä (mahdollisesti muuntamalla 2-bromialempialkoksikarbonyyli-aminoryhmä 2-jodialempialkoksikarbonyyliaminoryhmäksi), aroyylimetoksikarbonyyliaminoryhmästä tai 4-nitrobentsyy-lioksikarbonyyliaminoryhmästä esim. käsittelemällä sopivalla kemiallisella pelkistimellä, kuten sinkillä sopivan karboksyylihapon, kuten vesipitoisen etikkahapon, 23 86 3 47 läsnäollessa. Aroyylimetoksikarbonyyliaminoryhmän lohkai-su voidaan myös suorittaa käsittelemällä nukleofiilisel-lä, mielellään suolanmuodostusreagenssilla, kuten natrium-tiofenolaatilla, ja 4-nitrobentsyylioksikarbonyyliamino-ryhmän lohkaisu voidaan myös suorittaa käsittelemällä al-kalimetalli-, esim. natriumditioniitilla. Aminoryhmä voidaan vapauttaa mahdollisesti suojatusta difenyylimetoksi-karbonyyliaminoryhmästä, tert.-alempialkoksikarbonyyli-aminoryhmästä tai 2-trisubstituoidusta silyylietoksikarbo-nyyliaminoryhmästä käsittelemällä sopivalla hapolla, esim. muurahaishapolla tai trifluorietikkahapolla, mahdollisesti substituoidusta bentsyylioksikarbonyyliaminoryhmästä esim. hydrogenolyysillä eli käsittelemällä vedyllä sopivan hydrauskatalyytin, kuten palladiumin, läsnäollessa, mahdollisesti susbtituoidusta triaryylimetyyliamino- tai formyyliaminoryhmästä esim. käsittelemällä hapolla, kuten mineraalihapolla, esim. kloorivetyhapolla, tai orgaanisella hapolla, esim. muurahais-, etikka- tai trifluorietikkahapolla, mahdollisesti veden läsnäollessa ja orgaanisesta silyyliryhmästä esim. hydrolyysillä tai alkoholyysillä.

2-halogeeniasetyylillä, esim. 2-klooriasetyylillä suojattu aminoryhmä voidaan vapauttaa käsittelemällä tioure-alla emäksen läsnäollessa tai käsittelemällä tiourean tiolaattisuolalla, kuten alkalimetallitiolaatilla, ja suorittamalla sen jälkeen näin syntyneen kondensaatio-tuotteen solvolyysi, kuten alkoholyysi tai hydrolyysi.

2-substituoidulla silyylietoksikarbonyyliryhmällä suojattu aminoryhmä voidaan muuntaa vapaaksi aminoryhmäksi myös käsittelemällä fluorivetyhapon fluoridianioneja vapauttavalla suolalla, kuten edellä selostettiin vastaavasti suojatun karboksyyliryhmän vapauttamisen yhteydessä.

Atsidoryhmän muotoon suojattu aminoryhmä voidaan esim. pelkistämällä muuntaa vapaaksi aminoryhmäksi, jolloin voidaan käyttää esim. katalyyttistä hydrausta vedyllä hydrauskatalyytin, kuten platinaoksidin, palladiumin tai Raney-nikkelin, läsnäollessa, tai käsitellä sinkillä hapon, kuten etikkahapon läsnäollessa. Kata- 24 86547 lyyttinen hydraus on edullista suorittaa inertissä liuottimessa, kuten halogenoidussa hiilivedyssä, esim. metyleenikloridissa, tai vedessä tai veden ja orgaanisen liuottimen, kuten jonkun alkoholin tai dioksaanin, läsnäollessa 20 - 25°C:ssa tai jäähdytyksen tai kuumennuksen alaisena.

Sopivalla asyyliryhmällä, orgaanisella silyyliryh-mällä tai mahdollisesti substituoidulla 1-fenyylialempi-alkyyliryhmällä suojattu hydroksyyli- tai merkaptoryhmä voidaan vapauttaa samoin kuin vastaavasti suojattu ami-noryhmä. 2,2-diklooriasetyyIillä suojattu hydroksyyli-tai merkaptoryhmä vapautetaan esim. emäksisellä hydro-lyysillä, tert.-alempialkyylillä tai 2-oksa- tai 2-tia-alifaattisella tai -sykloalifaattisella hiilivetyryhmäl-lä eetteröity hydroksyyli- tai merkaptoryhmä vapautetaan asidolyysillä, esim. käsittelemällä mineraalihapolla tai vahvalla orgaanisella hapolla, esim. trifluorietikkaha-polla. Kaksi hydroksyyliryhmää, jotka on suojattu yhdessä metyleeniryhmällä, joka on mielellään substituoitu, kuten alempialkylideenillä, esim. isopropylideenillä, syklo-alkylideenillä, esim. sykloheksylideenillä, tai bentsy-lideenillä, voidaan vapauttaa happamalla solvolyysillä erityisesti mineraalihapon tai vahvan orgaanisen hapon läsnäollessa.

9-ksantenyylillä suojattu karboksyylihappoamidiryhmä vapautetaan esim. bromivedyllä jääetikassa tai fluorive-dyllä anisolin läsnäollessa.

Mono-, di- tai triaryylimetyyIillä suojattu karboksyylihappoamidiryhmä voidaan vapauttaa esim. fluorivedyl-lä anisolin läsnäollessa; lisäksi voidaan difenyylimetyy-lisuojaryhmä poistaa hydrogenolyyttisesti palladium-hiilikatalyytin läsnäollessa ja di(4-metoksifenyyli)me-•tyylisuojaryhmä sekä 2,4,6-trimetoksibentsyylisuojaryhmä voidaan poistaa trifluorietikkahapolla. Myös diaryyli-metyylisuojaryhmä, jonka aryyliryhmä on polymeerisen 25 86547 kantaja-aineen osa, voidaan poistaa fluorivedyllä aniso-lin läsnäollessa.

Jos suojattavia funktionaalisia ryhmiä on samanaikaisesti useita, valitaan suojaryhmät mielellään niin, että useampia kuin yksi tällainen suojaryhmä voidaan poistaa samanaikaisesti esim. käsittelemällä trifluori-etikkahapolla tai muurahaishapolla tai pelkistämällä, kuten käsittelemällä sinkillä ja etikkahapolla tai vedyllä hydrauskatalyytin, kuten palladium-hiilikatalyy-tin, läsnäollessa.

Reaktiovaihtoehto a) sisältää erityisesti myös sen toteutustavan peptidiamidien valmistamiseksi, jossa peptidin terminaalinen karboksyyliryhmä irrotetaan polymeerisestä kantaja-aineesta artmoniakin avulla ja muunnetaan samalla, tavallaan in situ, amidiksi. Tässä tapauksessa muo dostaa ammoniakki vapaan aminoryhmän sisältävän komplementaarisen osan.

Menetelmä b: Sopivia hapettimia merkaptoryhmien hapettamiseksi disulfidiryhmien muodostamistarkoitukses-sa ovat esim. ilman happi, joka johdetaan polypeptidin vesiliuokseen, johon mahdollisesti on lisätty katalyyttinen määrä siirtymämetallisuolaa, esim. rauta(3)sulfaattia, rauta(3)kloridia tai kupari(2)sulfaattia; jodi, myös kaliumjodidiadduktin KI^ muodossa, lisättynä alkoholi-liuoksen, esim. metanoli tai vesi-alkoholiseos, esim. vesi-metanoliseos, muodossa; kaliumheksasyanoferraatti(3) vesiliuoksena; 1,2-dijodietaani tai atsodikarboksyylihap-podimetyyliesteri tai -dietyyliesteri, jotka tuodaan reaktioon vedessä tai seoksessa, joka muodostuu vedestä ja veteensekoittuvasta alkoholista, esim. metanolista. Hapetus on edullista suorittaa huoneenlämpötilassa.

Merkaptoryhmän suojaryhmä, joka voidaan poistaa reaktio-olosuhteissa, ja joka soveltuu menetelmään b), on esimerkiksi asetyyliaminometyyli. Rin kyseessä on asetyyliaminometyylisuojaryhmä, on menetelmä b) edullista suorittaa etikkahapossa, johon on lisätty hieman suolahappoa, käyttämällä hapettimena jodia, esim. kuten esi-

26 ZCZM

merkkiosassa on selostettu.

Menetelmä c: Kyseeseen tulevat funktionaaliset ryhmät, jotka suojataan ja vapautetaan suojaryhmistä, on selostettu menetelmän a) yhteydessä. Menetelmä c) kattaa erityisesti myös kantaja-aineeseen sidottujen suojaryh-mien poistamisen, joita voidaan käyttää esim. Merrifield-synteesissä. Tässä tapauksessa kattaa menetelmä c) myös peptidin tai peptidiamidin irrottamisen kantaja-aineesta.

Menetelmä d; Transformoitaviksi sopivia isäntäso-luja ovat esim. mikro-organismit, kuten hiivat, esim. Saccharomyces cerevisiae, ja erityisesti bakteerikannat, jotka eivät ole alttiita millekään restriktio- tai modi-fikaatioentsyymeille, kuten ennen kaikkea E. coli-kannat, esim. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 (J. Clarke ja J. Carbon, J. Mol. Biol. 1^0, 517 (1978)) tai E. coli Kl2-kanta 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus tms. ja lisäksi korkeampien organismien solut, erityisesti ihmisen tai eläi-ten vakiintuneet solulinjat. Etusijalle asetettavia isäntä-soluja ovat mainitut E. coli-kannat, erityisesti E. coli HB101 ja E. coli JA221.

Periaatteessa ovat kaikki sellaiset vektorit sopivia, jotka monistavat ja ilmentävät keksinnönmukaisen heterologisen, keksinnönmukaista aminohappojärjestystä koodittavan DNA-sekvenssin.

Esimerkkejä vektoreista, jotka soveltuvat CGRP-geenin ilmentämiseen E. coli-kannassa, ovat bakteriofaagit, esim. bakteriofaagi-λ:n johdannaiset, ja varsinkin plasmidit, kuten erityisesti plasmidi colEl ja sen johdannaiset, esim. pMB9, pSF2124, pBR317 tai pBR322. Esillä olevassa keksinnössä etusijalle asetettavat vektorit ovat plasmidin pBR322 johdannaisia. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja merkkigeenin, joka mahdollistaa ilmentä-misplasmideilla transformoituneiden mikro-organismien valinnan ja tunnistamisen fenotyyppisen merkin perusteella. Sopivat merkkigeenit antavat mikro-organismille esi- 27 86547 merkiksi vastustuskyvyn raskasmetalleja, antibiootteja tms. vastaan. Edelleen sisältävät tämän keksinnön mukaiset edulliset vektorit replikoni- ja merkkigeenialuei-den lisäksi restriktioendonukleaasien tunnistuskohtia, jotta näihin kohtiin voidaan sijoittaa keksinnönmukais-ta aminohappojärjestystä koodittava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti ilmentymistä ohjaava sekvenssi. Edullisena pidetty plasmidi pBR322 sisältää ehjän replikonin, merkkigeenit, jotka antavat vastustuskyvyn tetrasyklii-

R R

nin ja ampisilliinin suhteen (tet ja amp ) ja joukon vain kerran esiintyviä restriktioentsyymien tunnistuskoh-

R R

tia, esim. PstI (leikkaa amp -geenin, tet -geeni säilyy ehjänä), BamHI, Hindin, Sali (leikkaavat kaikki tetR- p geenin, amp -geeni säilyy ehjänä), NruI ja EcoRI.

Cfrr crlema&sa useita ilmentymisenohjaussekvenssejä, joita voidaan käyttää CGRP:n ilmentymisen säätelyyn. Erityisesti käytetään transformoitavan isäntäsolun voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvenssejä. Jos yhdistelmävektorina käytetään pBR322:ta ja isän-täorganismina E. colia, voidaan käyttää esimerkiksi lak-toosioperonin, tryptofaanioperonin, arabinoosioperonin tms. tai β-laktamaasigeenin ilmentymisenohjaussekvenssiäi (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribosominsitoutu-miskohdan) jaA-faagin N-geenin tai fd-faagin kerrospro-teiinigeenin vastaaja sekvenssejä, β-laktamaasigeenin promoottori (β-lac-geeni) on valmiina plasmidissa pBR322, kun taas muut ilmentymisenohjaussekvenssit pitää liittää plasmidiin. Tryptofaanioperonin ilmentymisenohjausgeeni (trp po) asetetaan etusijalle esillä olevassa keksinnössä.

Hiivassa tapahtuvaan monistumiseen ja ilmentymiseen sopivat vektorit sisältävät hiivassa tapahtuvan monistumisen aloituskohdan ja hiivalle sopivan geneettisen va-lintamerkin. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hii-vaperäisen monistumisenaloituskohdan, esim. kromosomaa-lisen autonomisesti monistuvan jakson (ars), säilyvät transformoinnin jälkeen hiivasolun sisällä kromosomin β f C / 7 28 O ϋ w ί / ulkopuolella ja replikoituvat mitoosissa autonomisesti. Edelleen voidaan käyttää yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät hiivan 2y-plasmidi-DNA:n kanssa homologisia DNA-sekvenssejä. Tällaiset yhdistelmävektorit liittyvät solun sisällä jo ennestään oleviin 2y-plasmidei-hin rekombinaation kautta ja monistuvat autonomisesti. 2y-sekvenssit sopivat erityisesti suuren transformointi-kyvyn omaaviin plasmideihin ja antavat suuren kopiomää-rän. Sopivia hiivassa käytettäviä merkkigeenejä ovat ennen kaikkea sellaiset, jotka antavat isännälle vastustuskyvyn antibiootin suhteen, ja auksotrofisten hii-vamutanttien ollessa kyseessä sellaiset geenit, jotka täydentävät isännän vajavuuden. Tällaiset geenit antavat esim. vastustuskyvyn sykloheksimidiantibiootille tai pitävät huolen prototrofiästä auksotrofisessa hiivamu-tantissa, esim. URA3-, LEU2-, HIS3- ja ennen kaikkea TRP1-geeni. Hiivan yhdistelmävektorien tulisi mielellään sisältää bakteeri-isännän, esityisesti E. colin, monistu-misenaloituskohta ja merkkigeeni, jotta yhdistelmävektorien ja niiden esiasteiden rakentaminen ja kloonaus voidaan suorittaa bakteeri-isännässä. Hiivassa tapahtuvaan ilmentämiseen sopivia ilmentymisenohjaussekvens-sejä ovat TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03- tai PH05-geenin ilmentymisohjaussekvenssi sekä glykolyyttiseen hajoamiseen liittyvät promoottorit, esim. PGK- ja GAPDH-promoot-tori.

Erityisen edullisia ovat monistumiskykyiset ja fe-notyyppisen valinnan mahdollistavat ilmentämisvektorit, jotka sisältävät ilmentymisenohjaussekvenssin ja keksin-nönmukaista aminohappoa koodittavan DNA-sekvenssin siten, että mainittu DNA-sekvenssi on varustettu trans-kriptionaloitussignaalilla ja -lopetussignaalilla ja luennanaloitus ja -lopetussignaalilla, jotka kaikki ovat mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyn alaisina mainitussa ilmentämisplasmidissa niin, että mainitulla ilmentämisplasmidilla transformoituneet isäntäsolut ilmentävät kyseisen keksinnönmukaisen ami- 29 8654 7 nohapposekvens s in.

Jotta saavutettaisiin tehokas ilmentyminen, pitää keksinnönmukaisia aminohapposekvenssejä koo-dittavien geenien olla oikeassa kohdassa ("faasissa") il-mentymisenohjaussekvenssin suhteen. On edullista liittää ilmentymisenohjaussekvenssi kyseistä aminohapposekvenssiä koodittavaan geeniin, joka mielellään sisältää oman luennanaloitussignaalinsa (ATG) ja luennanlo-petussignaalinsa (esim. TAG), pää-mRNA:an alun ja sellaisen geenin koodittavan sekvenssin ATG:n väliin, joka on luonnostaan liittyneenä ilmentymisenohjaussekvenssiin (esim. [3-lac:ia koodittava sekvenssi, kun käytetään 6-lac:n promoottoria) .

Voidaan esimerkiksi katkaista vektori, erityisesti pBR322, sopivalla restriktioendonukleaasilla ja liittää näin saatuun, mahdollisesti vielä muunneltuun lineaariseen vektoriin vastaavilla restriktiopäillä varustettu ilmentymisenohjaussekvenssi. Ilmentymisenohjaussekvenssi sisältää 3'-päässään (luentasuunta) restriktioendonukle-aasin tunnistuskohdan, jotta ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisältävä vektori voidaan katkaista mainitulla rest-riktioentsyymillä js syntyneisiin päihin liittää vastaavilla päillä varustettu, kyseistä keksinnönmukaista aminohapposekvenssiä koodittava geeni. Tällöin syntyy kahta yhdistelmäplasmidia sisältävä seos, joista toisessa geeni on oikeassa suunnassa ja toisessa väärässä. Näin ollen on edullista leikata ilmentymisenohjaussekvenssin jo ennestään sisältävä vektori vektori-DNA-alueelta toisella restriktioendonukleaasilla ja sen jälkeen liittää näin syntyneeseen vektorijaksoon oikeilla päillä varustettu keksinnönmukaista aminohapposekvenssiä koodittava geeni. Kaikki vektoriin kohdistuvat toimenpiteet pitäisi suorittaa niin, ettei replikoniin eikä vähintään yhteen merkkigooniin vaikuteta.

Esillä olevan keksinnön edullisessa toteutustavassa katkaistaan plasmidista pBR322 johdettu vektori, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin, erityisesti tryp- 30 86 547 tofaanioperonin ilmentymisenohjaussekvenssin (trp po), jonka 3'-päässä (pää-mRNA:an alun ja ensimmäisen ATG:n välissä) on mielellään kohesiivisia päitä muodostavan restriktioendonukleaasin, esim. EcoRI, tunnistuskohta, mainitulla restriktioendonukleaasilla ja vektori-DNA-osa katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa tasaisia tai mieluummin kohesiivisia päitä, esim. BamHI, jonka jälkeen näin linearisoituun vektoriin liitetään vastaavilla päillä (esim. EcoRI-pää ennen ATG-kodonia ja BamHI-pää luennanlopetussig-naalin jälkeen) varustettu, keksinnönmukaista aminohappojärjestystä koodittava sekvenssi. Liittäminen tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla pariuttamalla komplementaariset (kohesiiviset) päät ja liittämällä yhteen esim. T4-DNA-ligaasilla.

mRNA-tietä perimän DNA:sta saatu tai synteettisesti valmistettu, vastaavilla kohesiivisilla päillä (erityisesti EcoRI ja BamHI) varustettu CGRP-geeni voidaan ennen ilmentämisplasmidiin sijoittamista kloonata myös vektoriin, esim. pBR322, jotta saadaan valmistetuksi suurempia määriä CGRP-geeniä esim. sekvenssin-määritystä varten. Yhdistelmäplasmidin sisältävät kloonit voidaan eristää esim. CGRP-spesifisellä, radioaktiivisesta merkityllä oligodeoksinukleotidikoettimella. CGRP-geeni voidaan karakterisoida esim. Maxamin ja Gil-gertin menetelmällä (A.M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 560 (1977); ks. myös Meth.

Enzym. 65 499 (1980)).

Isäntäsolujen transformointi keksinnönmukaisilla il-mentämisplasmideilla voidaan suorittaa esim. kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä; S. cerevisiae (A. Hin-nen et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75' 1929 (1978)), B. subtilis (Anagnostopoulus et ai., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)) ja E. coli (M. Mandel et ai., J. Mol Biol.

53, 159 (1970)). Transformoituneet isäntäsolut on edullista eristää selektiivisestä elatusaineesta, johon on lisätty sitä biosidiä, jota vastaan ilmentämisplasmidin 31 86547 sisältämä merkkigeeni antaa vastustuskyvyn. Jos, kuten on edullista, ilmentämisplasmidi sisältää amp -geenin, lisätään elatusaineeseen ampisilliinia. Solut, jotka eivät sisällä ilmentämisplasmidia, kuolevat tällaisessa elatusaineessa.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään edellä mainitulla tavalla valmistettavissa olevia, transformoituneita isän-täsoluja, jotka kykynevät tuottamaan keksinnönmukaista peptidiä.

Keksinnönmukaisesti transformoituneiden isäntäsolu-jen viljely menetelmän d) mukaisesti tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä voidaan keksinnönmukaisten, transformoituneiden isäntäsolujen viljelyssä käyttää erilaisia hiililähteitä. Esimerkkejä sopivista hiililähteis-tä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi tai asetaatit, joita voidaan käyttää joko yksin tai seoksina. Sopivia typpi-lähteitä ovat esim. aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet; edelleen hiivauutteet, mallasuute sekä ammoniumsuolat, esim. ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan käyttää yhtä hyvin, ovat esimerkiksi natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.

Lisäksi elatusaine sisältää kasvua edistäviä hivenaineita, kuten rautaa, sinkkiä ja mangaania, ja mielellään aineita, jotka saavat aikaan valintapaineen ja estävät sellaisten solujen kasvun, jotka ovat menettäneet ilmen-tämisplasmidin. Niinpä elatusaineeseen lisätään esimer- p kiksi ampisilliinia, jos ilmentämisplasmidi sisältää amp -geenin. Tällainen antibioottisesti vaikuttavien aineiden lisäys saa aikaan myös sen, että kontaminoivat, antibiooteille herkät mikro-organismit kjolevat.

Itse viljely tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH-arvo ja 32 86 547 fermentointiaika valitaan siten, että keksinnönmukaisel-le peptidille saavutetaan maksimaalinen tiitteri. Niinpä E. coli- tai hiivakantaa kasvatetaan mielellään aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen lämpötila-alueella noin 20 - 40°C, mielellään noin 30°C:ssa, pH-alueella 4-9, mielellään pH:ssa 7, noin 4-20 tuntia, mielellään 8-12 tuntia. Tällöin ilmentymistuote (CGRP) kertyy solujen sisään.

N-pään metioniini voi tietyissä isäntäsoluissa poistua luennan jälkeen. Lisäksi voi eräissä isäntäsoluissa N-pään aminohappo asyloitua.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, kasvatus keskeytetään ja keksinnönmukainen peptidi vapautetaan mikro-organismisoluista. Tätä tarkoitusta varten solut rikotaan, esim. detergenttikäsittelyllä, kuten SDSillä tai Tritonilla, tai lysotsyymillä tai vastaavasti vaikuttavalla ensyymillä. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi voidaan käyttää mekaanisia voimia, kuten leikkaus-voimaa (esim. X-puristin, ranskalainen puristin, Dyno-mylly) tai ravistelua lasihelmien tai alumiinioksidin kanssa tai vuorottaista jäädytystä, esim. nestetypellä, ja sulatusta, esim. 30 - 40°C:een, sekä ultraääntä solujen rikkomiseen. Näin saatu seos, joka sisältää proteiineja, nukleiinihappoja ja muita solunosia, rikastetaan sentrifugoinnin jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla proteiinien suhteen, keksinnönmukaiset peptidit mukaanlukien. Niinpä esimerkiksi suurin osa ei-proteiiniaine-osista erotetaan polyetyleeniamiinikäsittelyllä ja proteiinit, keksinnönmukaiset peptidit mukaanluettuina, saostetaan esim. kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Bakteeriproteiinit voidaan myös saostaa lisäämällä etikkahappoa (esim. 0,1 %, pH 4 - 5). Rikastaminen keksinnönmukaisten proteiinien suhteen voidaan viedä pitemmälle uuttamalla etikkahapolla happamaksi tehty jäännös n-butanolilla. Muita puhdistus-vaiheita ovat esim. geelielektroforeesi, kromatografiset menetelmät, kuten ioninvaihtokromatografia, kokoekskluu- 33 86547 siokromatografia, HPLC, käänteisfaasi-HPLC tms., seoksen aineosien erottaminen toisistaan molekyylikoon mu-kaan käyttämällä sopivaa Sephadex -pylvästä, dialyysi, affiniteettikromatografia, esim. vasta-aine- ja erityisesti monoklonaalinen vasta-aineaffiniteettikromatografia ja lisäksi erityisesti kirjallisuudesta tunnetut menetelmät.

Keksinnönmukaisesti ilmentyneet peptidit voidaan eristää esimerkiksi seuraavalla tavalla:

Solut erotetaan kasvuliuoksesta sentrifugoimalla. Valmistetaan raakauute rikkomalla solut esim. käsittelemällä lysoivalla entsyymillä ja/tai vuorottaisella jäädytyksellä ja sulatuksella.

Sentrifugoidaan pois liukenemattomat aineosat.

Saostetaan DNA lisäämällä polyetyleeniamiinia.

Saostetaan proteiinit, keksinnönmukaiset peptidit mukaanlukien, ammoniumsulfaatilla.

Liuotetulle sakalle suoritetaan affiniteettikromatografia monoklonaalisessa CGRPrn vasta-ainepylväässä ja näin saadusta liuoksesta poistetaan suola dialyysillä tai kromatografisesti Sephadex C25:llä.

Vaihtoehtoisesti voidaan DNA:n erottamisen jälkeen saostaa bekteeriproteiinit 0,1-prosenttisella etikkahapol-la ja uuttaa keksinnönmukainen peptidi n-butanolilla happamasta jäännöksestä tai suorittaa happamalla jäännökselle suoraa ioninvaihtokromatografia (esim. karboksimetyylisel-luloosalla). Muita puhdistusvaiheita ovat geelisuoda-tus Sephadex G50:llä (tai G75:llä) ja käänteisfaasi-HPLC. Suolanpoisto tapahtuu jälleen Sephadex G25:llä.

Keksinnönmukaisten peptidien läsnäolo voidaan osoittaa CGRPrn vasta-aineilla (esim. kanista saaduilla tai hybridoomasoluista saaduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) .

Menetelmä e: Aminohappo ASfi , joka voidaan entsymaattisesti lohkaista halutun peptidiamidin terminaalisen ami-diryhmän NH2~ryhmäksi, on esim. glysiini. Tähän tarkoitukseen sopiva entsyymi voidaan ottaa talteen aivoli- 34 86547 säkkeestä, erityisesti sian aivolisäkkeestä, kuten julkaisussa A.F. Bradbury, M.D.A. Finnie ja D.G. Smyth,

Nature 298, 686-688 (1982) on selostettu.

Aminohappo AS^ , joka voidaan substitu-oida ammoniakilla sopivan entsyymin läsnäollessa, on esim. tyrosiini. Tässä tapauksessa sopiva entsyymi on esim. karboksipeptidaasi Y (Carlsberg Biotechnology Ltd., Kööpenhamina, Tanska), vrt. esim. Klaus Breddam et ai., Carlsberg Res. Commun. 4_6, 121-128 (1981 ).

Lisätoimenpiteitä: Suolat, jotka ovat muodostuneet kaavan I mukaisen sekvenssin tai sen osan sisältävistä yhdisteistä ja suoloja muodostavista ryhmistä, voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä voidaan muodostaa sellaisten yhdisteiden suoloja, joissa on kaavan I mukainen osasekvenssi, joka viimeksimainittu sisältää enemmän happamia kuin emäksisiä ryhmiä, esim. käsittelemällä metalliyhdisteillä, kuten sopivien orgaanisten kar-boksyylihappojen alkalimetallisuoloilla, esim. a-etyyli-kapronihapon natriumsuolalla, tai epäorgaanisilla alka-limetalli- tai maa-alkalimetallisuoloilla, esim. natrium-vetykarbonaatilla, tai ammoniakilla tai sopivalla orgaanisella amiinilla, jolloin mielellään käytetään stökiomet-ristä määrää tai pientä ylimäärää suolanmuodostusainetta. Kaavan I mukaisen sekvenssin sisältävien yhdisteiden hap-poadditiosuolat saadaan esim. käsittelemällä hapolla tai sopivalla anioninvaihtoreagenssilla. Kaavan I mukaisen sekvenssin sisältävien yhdisteiden, joissa on esim. vapaa karboksyyliryhmä ja vapaa aminoryhmä, sisäiset suolat voidaan muodostaa esim. neutraloimalla suolat, kuten hap-poadditiosuolat, isoelektriseen pisteeseen, esim. heikoilla emäksillä, tai käsittelemällä nestemäisillä io-ninvaihtajilla.

Suolat voidaan muuttaa vapaiksi yhdisteiksi tavalliseen tapaan, metallisuolat ja ammoniumsuolat esim. käsittelemällä sopivilla hapoilla ja happoadditiosuolat esim. käsittelemällä sopivilla emäksisillä aineilla.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään DNA-sekvenssejä, 35 86547 jotka koodittavat keksinnönmukaisia peptidejä.

Keksinnönmukaiset DNA-sekvenssit sisältävät pitemmän sekvenssin osasekvenssinä kaavan IV mukaisen sekvenssin d(GCETGYAAYACXGCEACXTGYGTXACXCAYNGKYTZGCEGGXYTZYTZQRSNGK AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHlsArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArg (IV) QRSGGXGGXATGGTXAAMQRSAAYTTLGTXCCXACXAAYGTXGGXQRSAAMGCETTL)

SerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAenValGlySerLyeAlaPhe jossa on esitetty vain koodittavan säikeen deoksinukleo-tidisekvenssi 5'-päästä alkaen, ja alapuolelle on merkitty kunkin tripletin koodittama aminohappo, jolloin A = adenosyyli, T = tymidyyli, G = guanosyyli, C = sytidyyli, E = A, T, C tai G, K = A, T, C tai G, kun N = C, tai A tai G, kun N = A, L = T tai C, M = A tai G, N = A tai C, Q = T tai A, R, S: R = C ja S = A, T, C tai G, kun Q on T; tai R = G ja S = T tai C, kun Q = A, X = A, T, C tai G, Y = T tai C ja Z = A, T, C tai G, kun Y = C, tai A tai G, kun Y = T, ja ennen sulkumerkkejä oleva "d” tarkoittaa, että sulkeissa olevat nukleosidit ovat 2-deoksinukleosideja.

Keksinnönmukaisten DNA-sekvenssien kooditta-vassa säikeessä on mielellään korkeintaan 290, pääasiassa korkeintaan 230, erityisesti korkeintaan 200 ja mielellään korkeintaan 150, esim. 136 deoksinukleotidia.

Keksinnönmukaiset DNA-sekvenssit on tarkoituksenmukaista varustaa jo valmistusvaiheessa ryhmillä, jotka „ 86547

Jo mahdollistavat liittämisen vektoreihin, esim. restriktio-entsyymien tunnistussekvensseillä, aloituskodonilla ATG ja lopetuskodonilla, esim. TAG. Jos tarkoituksena on myöhemmin valmistaa peptidiamideja, voidaan DNA-sekvenssi varustaa esim. kodonilla, joka koodittaa sellaista aminohappoa, joka voidaan myöhemmin hajottaa entsymaattisesti niin, että seurauksena on peptidiamidin terminaalisen amidiryhmän Nl^-ryhmä. Eräs tässä mielessä lohkaistavissa oleva aminohappo on esim. glysiini. Vaihtoehtoisesti voidaan myöhempää peptidiamidien valmistusta varten varustaa DNA-sekvenssi kodonilla, joka koodittaa sellaista aminohappoa, erityisesti tyrosiinia, joka voidaan substituoida ammoniakilla sopivan entsyymin, kuten pääasiassa sopivan eksopeptidaasin, esim. karboksipeptidaasi Y:n, läsnäollessa.

Keksintö koskee ensi sijassa sellaisia edellä mainittuja DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät E. colin suosimia ja keksinnönmukaisten peptidien sisältämiä aminohappoja koodittavia triplettejä.

Tällaisia triplettejä ovat varsinkin Alaniini (Ala) GCT

Arginiini (Arg) CGT

Glysiini (Gly) GGT

Kysteiini (Cys) TGC

Väliini (Vai) GTT

Leusiini (Leu) CTG

Seriini (Ser) TCT

Treoniini (Thr) ACC

Fenyylialaniini (Phe) TTC

Tyrosiini (Tyr) TAC

Metioniini (Met) ATG

Asparagiinihappo (Asp) GAC Glutamiinihappo (Glu) GAA

Lysiini (Lys) AAA

Isoleusiini (Ile) ATC

Histidiini (His) CAC

Proliini (Pro) CCG

37 86547

Glutamiini (Gin) CAG

Asparagiini (Asn) AAC

Etusijalle asetettava lopetussignaali (NON) on TAG-kodoni.

Etusijalle asetetaan sellaiset DNA-sekvenssit, joiden koodittavassa säikeessä on korkeintaan 200, esim. 136 deoksinukleotidia, ja jotka sisältävät seuraavan kaavan IVa mukaisen 5'-päästä alkavan koodittavan sekvenssin, johon kaavaan on myös selvyyden vuoksi merkitty kutakin triplettiä vastaava aminohappo

AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArg

d(GCCTGCAACACTGCCACCTGTGTGACTCATCGGCTGGCAGGCTTGCTGAGCAGA

(IVa)

SerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPhe TCAGGGGGCATGGTGAAGAGCAACTTCGTGCCCACCAATGTGGGTTCCAAAGCCTTT)

Erityisen edullisia E. colissa tapahtuvaan ilmentämiseen ovat sellaiset koodittavassa säikeessään korkeintaan 200, esim. 136 deoksinukleotidia sisältävät DNA-sekvenssit, joissa on kaavan IVb mukainen 5'-päästä alkava koodittava säie, johon kaavaan on myös selvyyden vuoksi merkitty kutakin triplettiä vastaava aminohappo

AlaCysAanThrAlaThrCysValThrHiaArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArg

diGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCTGGTCTGCTGTCTCGT

(IVb)

SerGlyGlyMetValLyaSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPhe TCTGGTGGTATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGACCAACGTTGGTTCTAAAGCTTTC)

Keksinnönmukaiset DNA-sekvenssit valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla.

DNA:n synteesimenetelmistä on esitetty yhteenveto julkaisussa S.A. Narang, Tetrahedron 39^ 3 (1983). Ennestään tunnetuilla synteesimenetelmillä voidaan valmis- 38 86547 taa polydeoksinukleotideja, joiden pituus on noin 20 emästä, hyvällä saannolla, hyvin puhtaina ja suhteellisen lyhyessä ajassa. Sopivasti suojatut deoksinukleoti-dit liitetään toisiinsa fosfodiesterimenetelmällä (K.L. Agarwal et ai., Angew. Chem. 84, 489 (1972)), vielä tehokkaammalla fosfotriesterimenetelmällä (C.B. Reese, Tetrahedron 3143 (1972)) tai fosfiitti-triesterime-netelmällä (R.L. Letsinger and W.B. Lunsford, J.Am.Chem. Soc. ^8, 3655 (1976)). Yksinkertaistettu tapa syntetisoida oligo- ja polydeoksinukleotideja on käyttää kiin-teäfaasimenetelmää, jossa deoksinukleotidiketjut ovat sopivaan kantaja-aineeseen sidottuina. K. Itakura et ai. (J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)) käyttävät kiinteä— faasisynteesissa yksittäisten deoksinukleotidien tilalla fosfotriesterimenetelmällä valmistettuja trideoksinukleo-tideja, jotka voidaan lyhyessä ajassa ja hyvällä saannolla kondensoida esim. 31 emästä sisältäviksi polydeok-sinukleotideiksi. Varsinainen kaksisäikeinen DNA voidaan rakentaa entsymaattisesti lyhyistä, kemiallisesti valmistetuista jaksoista. H.G. Khorana et ai. (J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)) käyttävät tähän kummankin säikeen päällekkäin ulottuvia polydeoksinukleotidisekvenssejä, jotka pysyvät oikealla tavalla yhdessä parinmuodostuksen seurauksena, ja jotka voidaan sen jälkeen liittää yhteen kemiallisesti DNA-ligaasientsyymin avulla. Vielä eräs mahdollisuus on inkuboida kummankin DNA-säikeen polydeoksinukleotidisekvensse jä, joissa on lyhyt yli menevä jakso, neljän tarvittavan deoksinukleosiditrifosfaatin kanssa DNA-polymeraasin, esim. DNA-polymeraasi I, poly-meraasi I:n Klenow-jakso tai T4-DNA-polymeraasi, tai AMV-käänteistranskriptaasin (avian myeloblastosis virus) läsnäollessa. Tällöin kumpikin polynukleotidisekvenssi muodostaa parin emäspariutumisen tuloksena ja entsyymi suorittaa täydentämisen tarvittavilla deoksinukleoti-deilla niin, että muodostuu täydellinen kaksisäikeinen DNA (S.A. Narang et ai., Anal. Biochem. 121, 356 (1981)).

K. Itakura et ai. (J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982)) se- 39 86 547 lostavat, kuinka tällä periaatteella voidaan DNA-polyme-raasi I:n (Klenow-jakso) avulla valmistaa ihmisen leukosyytti-interferonin o^-geenin 132 emäsparin pituinen jakso lähtemällä 4 kemiallisesti syntetisoidusta jaksosta, joiden pituus on 39 - 42 emäsparia, jolloin saavutetaan 40 % säästö kemiallisessa synteesissä verrattuna edellä kuvattuun menetelmään, jossa käytetään vain ligaasia.

Tässä patenttihakemuksessa selostetulle menetelmälle keksinnönmukaisten DNA-sekvenssien valmistamiseksi on tunnusmerkillistä se, että а) sopivalla tavalla suojattu deoksinukleosidi kiinnitetään sopivaan kiinteään kantaja-aineeseen, 3) valmistetaan sopivalla tavalla suojattuja di-, tri-tai tetranukleotideja käyttämällä fosfotriesteri- tai fosfiittimenetelmää, γ) kantaja-aineeseen sidottuun deoksinukleosidiin tai oligodeoksinukleotidiin liitetään sopivasti suojattuja mono- tai (kohdan 3) mukaisesti valmistettuja di-, tri-tai tetranukleotideja fosfotriesteri- tai fosfiittimenetelmää käyttäen, б) kohdan γ) mukaisesti saatu, kantaja-aineeseen sidottu oligodeoksinukleotidi, jossa on haluttu määrä emäksiä, irroitetaan kantaja-aineesta, mahdollisesti puhdistetaan, vapautetaan suojaryhmistä ja vapaat 5'-pään hydroksyyli-ryhmät fosforyloidaan, c) 2 kohdan 6) mukaisesti valmistettua oligodeoksinukleo-tidia, joista toinen edustaa koodittavaa ja toinen komplementaarista säiettä, ja joissa kummassakin on vähintään 3, mielellään 8 - 15, limittäin menevää emäsparia, emäs-pariutetaan, täydennetään DNA-polymeraasin avulla neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa kaksisäikei-seksi DNA-jaksoksi, joka sisältää CGRP-geenin, ja liitetään ligaasilla halutuksi rakennegeeniksi.

Kaavan IV mukaisen DNA-sekvenssin synteesi voidaan näin ollen suorittaa esim. siten, että kiinteäfaasime- 40 86547 netelmää käyttäen liitetään trinukleotidirakenneosia kondensoimalla asteittain toisiinsa kasvavaksi nukleo-tidisekvenssiksi, ja tällä tavalla valmistetaan kaksi oligodeoksinukleotidia, nimittäin negatiivinen ja positiivinen säie, joissa on suunnilleen yhtä suuri määrä emäksiä, mutta jotka osalla pituuttaan kykenevät muodostamaan keskenään vetysiltoja, yksittäiset nukleoti-diketjut irrotetaan kantaja-aineesta, läsnäolevat suojaryhmät poistetaan, suoritetaan puhdistus, esim. geelielektroforeesilla, kinasoidaan, hybridisoidaan ja suoritetaan täydentäminen täydelliseksi DNA-kahdenteek-si mielellään DNA-polymeraasi I:tä (Klenow-jakso) käyttäen.

Vaiheessa a) voidaan käyttää monenlaisia kiinteitä kantaja-aineita, kuten eriasteisesti silloitettuja ja eri turpoamiskyvyn omaavia polystyreenejä, polyak-ryyliamideja, polyakryyliamidikopolymeerejä, polyamidilla päällystettyä epäorgaanista materiaalia, kutan piimaata, silikaqeeliä tai aloksia tai funktionalisoituja silaaneja. Edullisessa toteutustavassa käytetään kiinteinä kantaja-aineina silloitettuja polystyreenejä, joihin voidaan vä-liryhmän ("spacer"), kuten 2-12 hiiliatomia sisältävän alkyleeniryhmän, joka voi olla 1-4 polaarisen, kahdenarvoisen funktionaalisen ryhmän, kuten imino, okso, tio, oksokarbonyyli tai amidokarbonyyli, keskeyttämä, välityksellä sinänsä tunnetulla tavalla kiinnittää deoksinukleosidi, jonka 5'-0H-ryhmä on suojattu. Erittäin edullista on saattaft 5'-asemastaan ja mahdollisesti emäsosastaan suojattu kaavan V mukainen nukleo-sidi, jossa on hapolla poistettavissa oleva suoja-ryhmä, kuten triaryylimetyylisuojaryhmä, esim. 4-met-oksitrityyli- tai 4,4'-dimetoksitrityyliryhmä, tai trialempialkyylisilyylioksisuojaryhmä, esim. tert.-butyylidimetyylisilyyliryhmä, ja jossa Ba on mahdollisesti suojattu emäs, joka voidaan valita tymyylin, sytosyylin, adenyylin tai guanyylin joukosta, reagoimaan meripihkahappoanhydridin kanssa mahdollisesti 41 86547 emäksen, kuten pyridiinin, trietyyliamiinin tai di-metyyliaminopyridiinin kanssa, ja sen jälkeen suorittaa reaktio aminometyloidun polystyreenin kanssa, joka on silloitettu 0,2-2 %illa divinyylibentseeniä, käyttämällä apuna karboksyyliryhmiä aktivoivaa rea-genssia, mielellään N-hydroksisukkinimidiä tai p-nitro-fenolia, ja vettä poistavaa ainetta, kuten karbodi-imidiä, esim. disykloheksyylikarbodi-imidiä (kaavio 1). Kaaviossa 1 ja jäljempänä käytetään deoksiriboosi-ryhmästä tavallisesti käytössä olevaa symbolia.

Reaktio suoritetaan inertissä, aproottisessa liuot-timessa, kuten pyridiinissä, tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, etikkahapon etyyliesterissä, kloroformissa, metyleenikloridissa, dimetyyliformamidissa tai dietyyliasetamidissa tai jossakin näiden seoksessa^ huoneenlämpötilassa tai hieman korotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. lämpötila-alueella noin -10 - noin 50°C, mielellään huoneenlämpötilassa, ja vettäpoistavan aineen läsnäollessa voidaan toimia myös alennetussa lämpötilassa, esim. noin 0°C:ssa.

Kaavio 1 f>

Ba \ / Ba

U

Ri0 "OH -► RlQ -O|CH2CH2C00H

(V) j _ N-hydroksisukkinimidi disykloheksyylikarbodi-imidi • — · 2. H2NCH2—^ ^·- polystyreehi • aa ]>a • — · R>0S -OgCHiCHigNHCH,-/ polysty reeni (VI) 42 86 547

Valmistettaessa keksinnönmukaisesti di-, tri- tai tetranukleotideja kohtaa β) noudattaen (kaavio 2) saatetaan 5'asemastaan ja mahdollisesti emäsosastaan suojattu, kaavan V mukainen nukleosidi, jossa R1 ja Ba ovat edellä määriteltyjä, reagoimaan mahdollisesti vettäpoistavan aineen tai emäksen läsnäollessa kaavan VII mukaisen aktivoidun fosfoesterin kanssa, jossa kukin 1 2 ryhmistä X ja X voi toinen toisestaan riippumatta olla hydroksi tai siitä johdettu suola, halogeeni, imidatsolyyli, 1,2,4-triatsol-1-yyli, tetratsolyyli 2 tai 1-bentstriatsolyylioksi ja X voi lisäksi olla myös 2-syanoetyylioksi, 2-trihalogeenietyylioksi, 2- aryylisulfonyylietyylioksi, 2-alempialkyylitioetyyli- oksi, 2-aryylitioetyylioksi tai 2-(4-fenyyli)-etyyli-2 oksi ja R on emäksellä tai nukleofiilillä, kuten am-moniumhydroksidilla, tiofenolaatilla tai aryylialdoksi-maatilla, poistettavissa oleva ryhmä, kuten mahdollisesti halogeenilla, nitroryhmällä ja/tai alempialkyy-lillä substituoitu fenyyli, metyyli tai mahdollisesti nitroryhmällä substituoitu bentsyyli, tai metalli-ioneilla poistettavissa oleva suojaryhmä, kuten 8-kinolyyli tai 5-kloori-8-kinolyyli.

Seuraavaksi saatetaan näin muodostunut kaavan 1 2 2

Vili mukainen yhdiste, jossa R , X ja R ovat edellä- määriteltyjä, ensin reagoimaan mahdollisesti 2-subs- 2 tituoidun etanolin kanssa niin, että ryhmä X muuttuu 3 3 ryhmäksi OR , jossa R on syanoetyyli, 2-trihalogeeni-etyyli, 2-aryylisulfonyylietyyli, 2-alempialkyylitio-etyyli, 2-aryylitioetyyli tai 2-(4-nitrofenyyli)etyyli, ja sen jälkeen poistetaan suojaryhmä ja näin saatu kaavan IX mukainen yhdiste saatetaan reaktioon kaavan VIII mukaisen toisen yhdisteen kanssa vettäsitovan aineen tai emäksen läsnäollessa niin, että muodostuu kaavan X mukainen dinukleotidi (kaavio 2). Kaavan VIII mukainen yhdiste voidaan emästen ja veden kanssa tapahtuvalla reaktiolla muuntaa toiseksi kaavan 2 VIII mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X on hydroksi tai 43 86547 siitä johdettu suola.

Reaktiot suoritetaan jossakin edellämainituista inerteistä liuottimista huoneenlämpötilassa tai korotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. huoneenlämpötilassa.

Suojaryhmä R poistetaan esim. käyttämällä apuna happoja, kuten mineraalihappoja, esim. suolahappoa tai rikkihappoa, karboksyylihappoja, esim. etikkahap-poa, trikloorietikkahappoa tai muurahaishappoa, sul-fonihappoja, esim. metaani- tai p-tolueenisulfonihappoa, tai erityisesti Lewis-happoja, esim. sinkkikloridia, sinkkibromidia, alumiinikloridia, dialkyylialumiini-halogenidia, esim. dibutyyli- tai dietyylialumiiniklo-ridia, tai booritrifluoridia, 10 - 50°C:ssa, erityisesti huoneenlämpötilassa. Kun käytetään dialkyyli-alumiinihalogenidia, tapahtuu lohkaisu lipofiilisessa liuottimessa, erityisesti tolueenissa, ja käytettäessä jotakin muuta edellämainittua Lewis-happoa liuotin-seoksessa, joka koostuu halogeenihiilivedystä, esim. metyleenikloridistä, jaalempialkanolista, esim. etanolista tai isopropanolista.

Kaavio 2 n. T* f* »v» * *'lr—- -v-b* — H0^t‘ (V) (VII) (VIII) (IX) ha1 _ »a* p viii + ix -- -°:k -°-r°Ri (x)

RiO. R*ö O OR2

Kaavan X mukaiset dinukleotidit voidaan myös valmistaa saattamalla kaavan V mukainen nukleosidi, jossa kaavassa R^ ja Ba ovat edellämääriteltyjä, reagoimaan kaavan VIIA mukaisen fosfiitin kanssa, jossa kaa- 44 8 6547 1 2 vassa X on halogeeni, erityisesti kloori, X on halogeeni, erityisesti kloori, tai dialempialkyyliamino, erityisesti dimetyyliamino tai di-isopropyyliamino, tai 2 morfolino, piperidino tai pyrrolidino ja R on sama kuin edellä on mainittu kaavan VII yhteydessä, erityisesti metyyli, mahdollisesti sopivan emäksen läsnäollessa (kaavio 3) . Näin saatu kaavan VIHA mukainen yhdiste saatetaan ensinnäkin reagoimaan 2-substituoidun 2 3 etanolin kanssa, joka muuntaa ryhmän X ryhmäksi OR , jossa R^ on edellämääritelty, sen jälkeen suoritetaan hapettimella, esim. jodilla emäksen läsnäollessa, hape- tus fosfaatiksi ja suojaryhmä R poistetaan, jolloin saadaan kaavan IX mukainen yhdiste, ja toisaalta kaavan VIIIA mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan IX mukaisen yhdisteen kanssa, sitten hapetetaan hapettimella, esim. jodilla emäksen läsnäollessa, niin, että saadaan kaavan X mukainen yhdiste.

Kaavio 3

)\a Ba 1. R3OH

2· hapetus i -OH + Χΐ-Ρ-Χ* -> , -O-P-X* -> (IX) K U\ ÖR* K \ OR2 3. R1 :n poisto • · (V) (VIIA) (VIIIA)

1. IX

2. hapetus (X)

Trinukleotidien valmistamiseksi kaavan X mukaises- 12 3 ta dinukleotidista, jossa R , R ja R ovat edellämää- 1 2 riteltyjä ja kukin ryhmistä Ba ja Ba voi toinen toisestaan riippumatta olla tymyyli, sytosyyli, adenyyli tai guanyyli, poistetaan suojaryhmä R^ ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa mahdollisesti vettäsitovan aineen tai emäksen läsnäollessa tai kaavan VIIIA mukaisen yhdisteen kanssa, jonka viimeksimainitun reaktion jälkeen suoritetaan 45 C C Γ * *7 o o o *;· / vielä hapetus, jolloin saadaan kaavan XI mukainen yh- diste (kaavio 4). Suojaryhmän R poisto ja konden-sointi kaavan XI mukaiseksi trinukleotidiksi tapahtuu samoin kuin kaavan X mukaisen dinukleotidin valmistuksen yhteydessä on selostettu.

Kaavio 4

Ha1 Ba2

Q 0 VIII

X -► -O-f -O-f-OR3 -:-►

\ r20non OR2 tai i. viIA

* 2. hapetus

Ha3 Ba1 Ba2

Rl n “Ο-Pv -O-f-OR3 (XI) R \ r2ö\>s R2ixox 6r* • ·

Tetranukleotidien valmistamiseksi saatetaan kaavan XI mukaiset trinukleotidit reagoimaan samoin kuin edellä on kaavan X mukaisten dinukleotidien reaktion kohdalla selostettu.

Edullisessa toteutustavassa käytetään suojaryhmä- 1 2 nä R 4-metoksitrityyliryhmää, suojaryhmänä R kloorilla substituoitua fenyyliryhmää, erityisesti 2-kloorifenyy-

liä, ja suojaryhmänä R^ 2-syanoetyyliryhmää. Kaavan VII

1 2 mukaisen yhdisteen ryhminä X ja X on edullista käyttää 1-bentstriatsolyylioksiryhmiä.

Kaavan XI mukaiset trinukleotidit on edullista valmistaa siten, että kaavan X mukaisesta dinukleotidista lohkaistaan suojaryhmä R^ ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa, jossa 2 X on hydroksyyli tai siitä johdettu suola, vettäsito-van aineen läsnäollessa (kaavio 4). Keksinnönmukaisia vettäsitovia aineita ovat esim. 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyylibentseenisulfonjylikloridi, -imidatsoli, -tetratsoli tai -1,2,4-triatsoli, joka on mahdollisesti substituoitu nitroryhmällä. Etusijalle asetettava vettäsitova aine on 1 - (2,4,6-trimetyylibentseenisul- 46 86 547 fonyyli)-3-nitro-1,2,4-triatsoli (XII).

Mielellään käytetään sellaisia nukleosideja, joiden emäsosan vapaa aminoryhmä on suojattu. Etusijalle asetettavia suojaryhmiä ovat bentsoyyli adeniinissa, bent-soyyli tai 4-metoksibentsoyyli sytosiinissa ja isobuty-ryyli tai difenyyliasetyyli guaniinissa. Tyrniini on mielellään ilman suojaryhmää.

Kohdan γ) mukaisessa oligonukleotidien valmistuksessa käytetään sinänsä tunnettua puoliautomaattista tai täysautomaattista, mikroprosessoriohjattua liuosten-ja reagenssiensyöttöjärjestelmää. Kohdan a) mukaisesti valmistetusta kaavan VI mukaisesta yhdisteestä pois- tetaan suojaryhmä R edellä kuvatulla tavalla ja sen jälkeen suoritetaan reaktio joko kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa tai kaavan VIHA mukaisen yhdisteen kanssa tai kaavan X tai kaavan XI mukaisen yhdisteen kanssa, joista sitä ennen on poistettu suojaryh-3 3 mä R emäksen avulla (jos R on 2-syanoetyyliryhmä, se voidaan poistaa esim. trialempialkyyliamiinilla, esim. trietyyliamiinilla, jossakin edellämainitussa inertis-sä liuottimessa tai liuotinseoksessa 10 - 40°C:ssa, erityisesti huoneenlämpötilassa), mahdollisesti vettä-sitovan aineen läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa. Kaavan X mukaisen dinukleotidin tai kaavan XI mukaisen trinukleotidin tilalla voidaan käyttää kohdan β) mukaisesti valmistettua tetranukleotidia. Jos käytetään kaavan VIIIA mukaista fosfiittia, suoritetaan vielä jälkikäsittely hapettimella, esim. jodilla emäksen läsnäollessa. Näin saatu kaavan XIII mukainen yhdiste, 1 2 jossa R , R ja Ba ovat edellämääriteltyjä ja n on välillä 1-4 oleva kokonaisluku, saatetaan niin monta kertaa kuin tarpeen samoihin reaktioihin kuin kaavan VI mukainen yhdiste edellä (ryhmän R lohkaisu, reaktio kaavan VIII, VIHA, X tai XI mukaisen yhdisteen tai vastaavan tetranukleotidin kanssa, mahdollinen hapettava jälkikäsittely), jolloin syntyy kaavan 47 8 6 5 4 7 XIII mukainen yhdiste (n = kokonaisluku).

] la Ba R‘\ lio -°fH=CH'FHCH'—)-polystyreeni \

Jn (XIII)

Keksinnön edullisessa toteutustavassa käytetään suojaryhmänä 4-metoksitrityyliä ja lohkaiseminen suoritetaan sinkkibromidilla CH- tai NH-happaman yhdisteen, erityisesti 1,2,4-triatsolin tai tetratsolin läsnäollessa. Esimerkiksi 1,2,4-triatsolin käyttö suojaryhmänä käytetyn 4-metoksitrityylin poistamisessa on uusi ja johtaa yllättäen siihen, että lohkeami-nen tapahtuu hyvällä saannolla ja ilman sivureaktioita. Erittäin edullista on käyttää sinkkibromidia ja 1,2,4-triatsolia moolisuhteessa 20:1 - 100:1 liuo-tinseoksessa, joka koostuu aproottisesta liuottimesta ja alkoholista, esim. metyleenikloridista ja 2-propa-nolista.

Edullisessa toteutustavassa saatetaan kaavan VI tai kaavan XIII mukainen yhdiste, josta on poistettu suoja-1 ryhmä R , reagoimaan kaavan XI mukaisen trinukleotidin 3 kanssa, josta on poistettu suojaryhmä R , kanssa vettä-sitovan aineen, kuten 2,4,6-trimetyyli- tai tri-iso-propyylibentseenisulfonyylikloridin, -imidatsolin,-tetratsolin tai -1,2,4-triatsolin, joka on mahdollisesti substituoitu nitroryhmällä, läsnäollessa. 1-(2,4,6-trimetyylibentseenisulfanyyli) -3-nitro-1,2,4- triatsoli (XII) on erittäin edullinen.

Erityisen edullinen yhdistelmä, jossa käytetään 1 1

suojaryhmänä R 4-monometoksitrityyliryhmää, ryhmän R

poistamisessa sinkkibromidia 1,2,4-triatsolin läsnäollessa ja kaavan XIII mukaisen oligonukleotidi-polysty-reenihartsin, josta suojaus on poistettu, ja kaavan XI mukaisen trinukleotidin, josta suojaus on pois- 48 8 £ S 4 7 tettu, välisessä reaktiossa vedensitoja-aineena kaavan XII mukaista triatsolia mahdollistaa myös pitkien nukleotidiketjujen valmistuksen hyvin puhtaassa muodossa ja hyvillä saannoilla.

Oligodeoksinukleotidien irrottamiseen kantaja-aineesta ja suojaryhmien poistamiseen kohdan 6) mukaisesti käytetään sinänsä tunnettuja menetelmiä. Erittäin edullinen reagenssi käytettäväksi kantaja-aineesta irrottamiseen ja edullisen suojaryhmänä käytetyn 2-kloori-fenyyliryhmän irrottamiseen on aryylialdoksimaatti, esimerkiksi 1,1,3,3-tetrametyyliguanidinium-2-nitro-bentsaldoksimaatti. Reaktio suoritetaan jossakin edellä mainituista liuottimista, joihin lisätään hieman vettä, esim. 95-prosenttisessa pyridiinissä. Sen jälkeen suoritetaan reaktio ammoniakin vesiliuoksen kanssa huoneenlämpötilassa tai korotetussa lämpötilassa, esim.

20 - 70°C:ssa, erityisesti 50°C:ssa.

Oligodeoksinukleotidien myöhempää liittämistä varten liitetään kohdan 6) mukaisesti 5'-pään hydroksyyliryh-mään fosfaattitähde. Fosfaattiesterin aikaansaaminen (fosforylointi) tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla käyttämällä apuna T4-polynukleotidikinaasia ATP:n läsnäollessa.

Edellä kuvatulla tavalla valmistetuissa oligodeoksi-nukleotideissa, jotka edustavat koodattavaa ja komplementaarista DNA-säiettä, on emäspariutuvia sekvenssejä, jotka muodostavat vähintään 3, mielellään 8-15 emäsparia. Keskenään sekoitettaessa tällaiset oligo-deoksinukleotidiparit pysyvät yhdessä vetysiltojen välityksellä. Yli ulottuvat yksisäikeiset päät toimivat kohdan ε) mukaisesti matriisina (templaattina) valmistettaessa komplementaarinen säie käyttämällä DNA-poly-meraasia, esim. DNA-polymeraasi I:tä, DNA-polymeraasi I:n Klenow-osaa tai T4-DNA-polymeraasia tai AMV-kään-teistranskriptaasia neljän deoksinukleosiditrifos-faatin (dATP, dCTP, dGTP ja TTP) läsnäollessa. Tällä tavalla täydentämällä syntyneissä DNA-kahdenteissa on 49 8654 7 tasaiset päät.

Kohdan e) mukaisesti valmistettujen DNA-sekvens-sien päissä on nukleotidisekvenssejä, jotka restrik-tioentsyymit kykenevät tunnistamaan ja katkaisemaan. Riippuen siitä, miten nämä nukleotidisekvenssit ja vastaavasti restriktioendonukleaasit valitaan, muodostuu katkaisussa tasaisia päitä ("blunt ends") tai epätasaisia päitä, joissa on ulostyöntyvä DNA-säie ("staggered ends").

Keksinnön mukaisista peptideistä voidaan valmistaa farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät vaikuttavana aineena vaikuttavan annoksen, erityisesti edellä mainittujen sairauksien hoidossa terapeuttisesti vaikuttavan annoksen, kek-sinnönmukaista peptidiamidia tai sen suolaa sekä tarpeellisen määrän eli yli 50 paino-%, mielellään yli 95 paino-%, erityisesti yli 99 paino-% farmaseuttista kantaja-ainetta, ja erityisesti sellaisia valmisteita, jotka soveltuvat nenän kautta tai parenteraalisesti, kuten lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti tapahtuvaan antoon lämminverisille ja ennen kaikkea ihmisille.

Vaikuttavan aineen annostus riippuu lämminveris-lajista, ruumiinpainosta, iästä ja yksilöllisestä tilasta, hoidettavasta sairaudesta sekä antotavasta.

Jos nämä uudet farmaseuttiset valmisteet on tarkoitettu annettavaksi parenteraalisesti, sisältävät käyttövalmiit muodot noin 0,001 painopromillea - noin 1 painoprosenttia, mielellään noin 0,005 - noin 0,1 painopromillea, esim. 0,01 painopromillea, vaikuttavaa ainetta. Keksinnönmukaiset farmaseuttiset valmisteet voivat olla esim. yksikköannosmuodossa, kuten ampulleina.

On edullista käyttää vaikuttavan aineen liuoksia, mutta myös suspensioita, ja erityisesti isotoonisia vesiliuoksia, jolloin nämä voidaan valmistaa ennen käyttöä esim. lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät vaikuttavaa ainetta yksin tai yhdessä kan- 50 p c rr 4 ·-> 0 J -r / taja-aineen, esim. mannitolin, kanssa. Nenänsisäisesti annettuna ovat erityisesti öljyyn tehdyt suspensiot sopivia. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida ja/ tai ne voivat sisältää apuaineita esim. säilöntä-, stabilointi-, kostutus- ja/tai emulgointiaineita, liuotusaineita, osmoottisen paineen säätelyaineita ja/tai puskurointiaineita, ja ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla esim. tavallisilla liuotus- ja lyofilisointimenetelmillä. Mainitut liuokset tai suspensiot voivat sisältää viskositeettia kohottavia aineita, kuten natriumkarboksimetyyliselluloosaa, karboksi-metyyliselluloosaa, dekstraania, polyvinyylipyrroli-donia tai mielellään liivatetta.

Ö1jysuspensiot sisältävät injektio tarkoituksiin tavallisesti käytettyjä kasviperäisiä, synteettisiä tai puolisynteettisiä öljyjä. Tällaisina voidaan mainita erityisesti nestemäiset rasvahappoesterit, joissa rasvahappokomponenttina on 8 - 22, erityisesti 12-22 hiiliatomia sisältävä pitkäketjuinen rasvahappo, esim. lauriinihappo, tridekyylihappo, myristiinihappo, penta-dekyylihappo, palmitiinihappo, marqariinihappo, stea-riinihappo, maapähkinähappo, behenhappo tai vastaavat tyydyttymättömät hapot, esim. öljyhappo, elaidiini-happo, erukahappo, cis-13-dokoseenihappo tai linolihappo. Alkoholiosassa on korkeintaan 6 hiiliatomia ja se on yhden- tai useammanarvoinen, esim. yhden-, kahden- tai kolmenarvoinen alkoholi, esim. metanoli, etanoli, pro-panoli, butanoli tai pentanoli tai joku näiden isomeeri, mutta ennen kaikkea glykoli tai glyseriini. Rasva-happoestereistä voidaan näin ollen mainita esim. etyy-lioleaatti, isopropyylimyristaatti, isopropyylipalmi-taatti, "Labrafil M 2735" (polyoksietyleeniglyserolitri-oleaatti, Gattefossö-yhtiö, Pariisi), "Miglyol 812" (tyydytettyjen Cg-C^2~rnsvahappojen triglyseridi, Chemische Werke, Witten/Ruhr, Länsi-Saksa), mutta erityisesti kasviöljyt, kuten puuvillansiemenöljy, manteliöljy, oliiviöljy, risiiniöljy, seesamöljy, soijaöljy ja ennen 86547.

kaikkea maapähkinäöljy.

Injektiovalmisteet tehdään tavalliseen tapaan steriileissä olosuhteissa, samoin ampullien tai lääke-pullojen täyttö sekä säiliöiden sulkeminen.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä. Lämpötilat ovat Celsius-asteita.

Ilmoitetut R^-arvot on, ellei toisin ole mainittu tai yhteydestä muuten ilmene, saatu silikagee-liohutkerroslevyillä seuraavassa liuotinsysteemissä: I: dikloorimetaani-metanoli (9:1) Näin ollen tarkoittaa esim. Rf (I) liuotinsysteemissä I saatua R^-arvoa.

Lyhenteet abs. = absoluuttinen

Acm = asetamidometyyli

Boc = tert.-butyylioksikarbonyyli BSA = naudan seerumialbumiini BZL = bentsyyli 2CZ = 2-kloori-bentsyylioksikarbonyyli d = deoksi dest. = tislattu DMF = dimetyyliformamidi DTT = 1,4-ditiotreitoli(1,4-dimerkapto-2,3-butaani- dioli) EDTA = etyleenidiamiinitetraetikkahappo

EtBr = etidiumbromidi FAB = fast atom bombardment

Fmoc = 9-fluorenyyli-metyylioksikarbonyyli h = tunti HPLC = korkeapainenestekromatografia HV = suurtyhjö iBu = isobutyryyli M = molaarinen MBHA = mono-(4-metyyli)-bentshydryyliamiini

Me = metyyli 52 86547

Min = minuuttia mmt = (mono-4-metoksi)trityyli MOB = 4-metoksibentsyyli MS = massaspektroskopia

Mtr = 4-metoksi-2,3,4-trimetyylibentseenisulfonyyli N = normaalinen OD = optinen tiheys RG = reaktioseos RT = huoneenlämpötila SDS = natriumdodekyylisulfaatti tBu = tertiäärinen butyyli TNE = Liuos, jossa on 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 5 mM EDTA TOS = 4-tolueenisulfonyyli

Tris = tris(hydroksimetyyli)aminometaani

Tris.HCl = Tris:n monohydrokloridi upm = kierrosta minuutissa V = tilavuus XANT = 9-ksantenyyli

Esimerkki 1: Seokseen, jossa on 0,26 ml jodin 0,1 M jää- etikkaliuosta, 0,33 ml 50-prosenttista etikkahappoa ja 16 μΐ 0,1 N suolahappoa, lisätään tipoittain 5 minuutin kuluessa huoneenlämpötilassa samalla sekoittaen 15 mg (3,8 umol) Ala-Cys(Acm)-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys(Acm)-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2:ta 2 ml:ssa 50-prosenttista etikkahappoa. Kun on käsitelty 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, poistetaan väri lisäämällä 40 μΐ askorbiinihapon 1 M vesiliuos-ta ja suodatetaan Sephadex G-25:n läpi 50-prosenttises-sa etikkahapossa. Eluaatti haihdutetaan tyhjössä noin 1 ml tilavuuteen ja suoritetaan puhdistus HPLCtllä jäljempänä kuvatulla tavalla.

Näin saadaan kaavan III mukainen CGRP II.

o r r » 53 ! υ^η/ ?-?

Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lye-Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (III) Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 1.1: 30,0 g kloorimetyylipolystyreeniä (20,1 irunol Cl) ja 6,1 g (40,2 mmol) p-hydroksimetyylibentsoe-happoa sekoitetaan keskenään 150 ml:ssa kaasuvapaata di-metyyliformamidia ja sen jälkeen lisätään 3 minuutin kuluessa 6,0 ml (40,2 mmol) 1,8-diatsabisyklo(5,4,0)un-dek-7-een(1,5,5):ttä. Reaktioseosta sekoitetaan 20 tuntia 50°C:ssa. Saatu hartsi suodatetaan ja pestään 3 kertaa noin 150 ml:11a kullakin seuraavista nesteistä: di-metyyliformamidi, dimetyyliformamidi/vesi (9:1), metanoli, metyleenikloridi ja metanoli. Hartsi kuivataan suurtyh-jössä vakiopainoon, jolloin saadaan hydroksi-p-karbonyyli-oksimetyylipolystyreenisynteesihartsi.

Vaihe 1.2: 1,1 g (4 mmol) Boc-Phe ja 3,0 g (n. 2 mmol) vaiheen 1.1 mukaisesti saatua hartsia suspendoidaan noin 5 minuutin kuluessa samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa seokseen, jossa on 20 ml metyleenikloridia ja 1,5 ml dimetyyliformamidia. Seos jäähdytetään 0 - 5°C:een ja lisätään 5 minuutin kuluessa kolmessa erässä liuos, jossa on 865 mg (4,3 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä 1,8 ml: ssa metyleenikloridia. Tästä 5 minuutin kuluttua lisätään 24 mg (0,2 mmol) 4-dimetyyliaminopyridiiniä ja vielä 10 minuutin kuluttua 220 yl N-metyylimorfoliinia (2 mmol) 1 ml:ssa metyleenikloridia. Seosta sekoitetaan 1 tunti 0 °C:ssa ja sen jälkeen pidetään 20 tuntia huoneenlämpötilassa. Hartsi suodatetaan talteen ja pestään 5 kertaa noin 50 ml :11a kutakin seuraavista liuottimista: metyleenikloridi, dime- tyyliformamidi, metanoli, metyleenikloridi ja metanoli.

Kun kuivataan suurtyhjössä, saadaan painoksi 3,34 g. Reagoimattomien hydroksiryhmien salpaamiseksi suspendoidaan hartsi 20 ml:aan metyleenikloridia, lisätään 1 ml pyridiiniä, jäähdytetään jäähauteella ja saatetaan reagoimaan 1 ml:n kanssa bentsoyylikloridia. KUi on käsi- 54 86547 telty 15 minuuttia 0°C:ssa ja 1 tunti huoneenlämpötilassa, hartsi suodatetaan ja pestään peräkkäisesti 2 kertaa 50 ml:11a kutakin seuraavista liuottimista: mety- leenikloridi, diraetyyliformamidi, metanoli, metyleeni-kloridi ja metanoli. Hartsi kuivataan suurtyhjössä vakiopainoon. Aminohappolataus on N-pitoisuuden perusteella laskettuna 0,35 mmol/g.

Vaihe 1.3: Boc-Phe-hartsista (1,0 g, 0,35 mmol) pois tetaan puoliautomaattisessa peptidisyntetisaattorissa Boc-ryhmä, liitetään toinen aminohappo Boc-Ala ja poistetaan tästä Boc-ryhmä seuraavilla toimenpiteillä (kaikissa pesuissa käytetään liuotinta aina noin 20 ml kerralla): 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 3 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 3 kertaa 5,0 min, 1 kerta 15 minuuttia trifluorietikkahappo/ etyleenikloridi Boc-ryhmän poistamiseksi, 3 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 1 kerta 2,0 minuuttia isopropanoli, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton 3 kertaa 2,0 minuuttia 2 % di-isopropyylietyyliamiinia di- metyyliasetamidissa, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridiy 3 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidia, tislattu, 1 kerta 120 minuuttia liittäminen: 1,5 mmol Boc-Ala, 221 mg (1,5 mmol) hydroksibentsotriatsolia, 320 mg (1,6 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä seoksessa, jossa on 0,32 ml etyleenidikloridia ja 3,5 ml dimetyyliasetamidia, 20 minuuttia huoneenlämpötilassa, 100 minuuttia 45°C:ssa.

1 kerta 2,0 minuuttia 10 ml asetanhydridi/pyridiini/dime-tyyliasetamidi ((10:10:80 v/v) reagoimattomien aminohappojen salpaamiseksi, 1 kerta 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi ja 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 55 86547 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 3 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 3 kertaa 5,0 minuuttia, 1 kerta 15 minuuttia trifluori-etikkahappo/etyleenikloridi Boc-ryhmän poistamiseksi , 3 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 1 kerta 2,0 minuuttia isopropanoli, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 3 kertaa 2,0 minuuttia 2 % di-isopropyylietyyliamiinia dirnetyyliasetamidissa, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 3 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, tislattu.

Vaihe 1.4: Seuraavat aminohapot kondensoidaan pe räkkäisesti edellä mainittua peptidisyntetisaattoria käyttäen kohdassa 1.3 saatuun tuotteeseen:

Fmoc-Lys(Boc), Fmoc —Ser(tBu), Fmoc—Gly, Finoc—Vai, Fmoc—Aan, Fmoc— Thr(tBu), Fmuc-Pro, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Met, Fmoc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(Mtr), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc -Leu, Fmoc-

Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Mtr), Fmoc-Hie(Fmoc), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Cya(Acm), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Aen, Fmoc-Cye(Acm) ja Boc-Ala.

Tällöin suoritetaan joka kerta seuraava toimenpide-kierto, jolloin aina poistetaan kyseisen aminohapon Fmoc-suo j aryhmä: 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 1 kerta 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 3 kerta 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 4 kertaa 2,0 minuuttia 20 tilavuus-% piperidiiniä dime- tyyliasetamidissa, 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 2 kertaa 1,0 minuuttia vesi/peroksiditon dioksaani (1:2 v/v), 56 86547 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 2 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi, 3 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, tislattu, 1 kerta 120 minuuttia liittäminen: 1,5 mmol Fmoc-amino-happo tai lopuksi Boc-Ala, 221 mg (1,5 mmol) hydr-oksibentsotriatsoli, 320 mg (1,6 mmol) disyklo-heksyylikarbodi-imidiä seoksessa, jossa on 0,32 ml etylee-nidikloridia ja 3,5 ml dimetyyliasetamidia; 20 minuuttia huoneenlämpötilassa, 100 minuuttia 45°C:ssa, 1 kerta 2,0 minuuttia 10 ml asetanhydridi/pyridiini/di-metyyliasetamidi (10:10:80 v/v), 1 kerta 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton, 1 kerta 1,0 minuuttia isopropanoli, 3 kertaa 0,5 minuuttia etyleenidikloridi ja 2 kertaa 0,5 minuuttia dimetyyliasetamidi, kaasuton.

Liittämisreaktion täydellisyys tutkitaan kvalitatiivisesti ninhydriinireaktiolla (Kaiser-testi), joka ilmaisee reagoimattomat aminoryhmät. Jos testi antaa positiivisen tuloksen, hartsi pestään etyleenikloridilla ja suoritetaan jälkikytkentä käyttämällä 1,5 mmol aminohappo johdannaista ja 1,6 mmol disykloheksyylikarbodi-imidiä 3,8 ml:ssa etyleenidikloridijtrif luorietanoliseosta (75: 25) 120 minuutin aikana huoneenlämpötilassa. Hartsi pestään viimeisen liittämisen jälkeen perusteellisesti dimetyyliasetamidilla, etyleenidikloridilla ja isopro-panolilla ja kuivataan suurtyhjössä.

Vaihe 1.5: Vaiheessa 1.4 saatu tuote käsitellään huoneenlämpötilassa tBu- ja Boc-suojaryhmien poistamiseksi seuraavalla tavalla (joka kerta 30 ml): 2 kertaa 2 minuuttia metyleenikloridi, 1 kerta 5 minuuttia trifluorietikkahappo/metyleeniklori-di/1 , 2-etaaniditioli/m-kresoli (50:43:2:5), 1 kerta 30 minuuttia trifluorietikkahappo/metyleeniklori-di/1 ,2-etaaniditioli/ m-kresoli (50:43:2:5) , 1 kerta 60 minuuttia trifluorietikkahappo/metyleeniklori- di/1 , 2-etaaniditioli/m-kresoli (50:43:2:5), 2 kertaa 2 minuuttia metyleenikloridi ja 57 86 547 2 kertaa 2 minuuttia metanoli.

Vaihe 1.6: Kohdassa 1.5 saatu tuote kuivataan suurtyhjössä ja suspendoidaan 30 ml:aan dimetyyliform-amidia, jotta peptidi saadaan irroitetuksi hartsista ja terminaalinen karboksyyliryhmä amidoiduksi. -70°C: ssa kondensoidaan 10 ml ammoniakkia. Yli määräinen ammoniakki haihdutetaan pois 0°C:ssa ja saatua seosta sekoitetaan 20 tuntia paineastiassa huoneenlämpötilassa. Hartsi suodatetaan pois ja pestään 2 kertaa vedellä (kukin kerta 20 ml), 3 kertaa metanoli-vesiseoksella (1:1) ja 10 kertaa trifluorietanoli-vesi-seoksella (1:1) ja suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 30 ml:aan etikkahappo-vesiseosta (9:1) ja lyofi-lisoidaan.

Vaihe 1.7: Kohdan 1.6 mukaisesti saatu lyofili- saatti liuotetaan 20 ml:aan trifluorietikkahapon ja 1,2-etaaniditiolin seosta (99:1), jotta Mtr-ryhmät saadaan poistetuiksi. Lisätään 1,5 ml m-kresolia ja saatua seosta pidetään 2 tuntia 50°C:ssa. Epäpuhdas di-Acm-peptidi saostetaan lisäämällä 100 ml dietyylieet-teriä, suodatetaan ja pestään dietyylieetterillä. Tuote liuotetaan 25 ml saan etikkahappo-vesiseosta (1:1), sameus suodatetaan pois ja suodos erotetaan analyyttisesti HPLC:llä. HPLC-suoritetaan seuraavissa olosuhteissa:

Pylväs: Nucleosil 10 jjm C^g (Macherey, Diiren, Länsi-Saksa) , 200x4,8 mm, lineaarinen gradientti 0 % - 90 % B, 60 minuuttia A: trifluorietikkahapon 0,1 % vesiliuos, B: trifluorietikkahapon 0,1 % asetonitriililiuos.

Pääpiikkiä vastaava materiaali otetaan talteen ja sen laatua verrataan haluttuun lopputuotteeseen FAB-MS-menetelmällä (massapiikki: 3937,6).

Mikropreparatiivinen erotus: 100 mg epäpuhdasta tuotetta erotetaan 250x21 mm:n pylväässä. Kerätyt jakeet haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 2 ml: aan vettä, suodatetaan ja lyofilisoidaan.

58 86547

Esimerkki 2; Eschericia coli-klooneja, jotka sisältävät kaavan XIV mukaisen DNA-liitännäisen

d(GAATTCATGGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCT d(CTTAAGTACCGAACGTTGTGGCGATGGACGCAATGGGTGGCAGACCGA

GGTCTGCTGTCTCGTTCTGGTGGTATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGACC (XIV)

CCAGACGACAGAGCAAGACCACCATACCAATTTAGATTGAAGCAAGGCTGG

AACGTTGGTTCTAAAGCTTTCTACTAGGATCC) TTGCAACCAAGATTTCGAAAGATGAT CCTAGG) kasvatetaan yön yli (16 tuntia) 37°C:ssa sekoitusnopeu-den ollessa 250 1/min 5 ml:ssa L-alustaa. L-alustan koostumus on seuraava:

Bacto-tryptoni 10 g

Bacto-hiivauute 5 g

NaCl 5 g

Glukoosi 5 g

Ampisilliini 0,1 g 1 ml tätä yön yli kasvanutta viljelmää siirretään seuraavana päivänä 25 ml:aan M9-alustaa. M9-alustan koostumus on seuraava:

Na2HP04.7H20 13,25 g KH2P04 3,0 g

NaCl 0,5 g NH4C1 1,0 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgS04.7H20 0,25 g kasaminohapot 2,5 g vitamiini B.| 0,0099 g glukoosi 5,0 g ampisilliini 0,1 g

Kasvatusta jatketaan 37°C:ssa sekoitusnopeudella 62 3 250 1/min, kunnes bakteerisuspension optinen tiheys (OD ) on noin 0,9 - 1,0. Sitten solut otetaan talteen (5 ml kasvavaa viljelmää) ja suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Sitten suspensioon lisätään 1 mg/ml lysotsyymiä (Boeh- 59 86347 ringer) ja sijoitetaan 30 minuutiksi jäähän. Bakteerit menevät rikki, kun ne vuorotellen jäädytetään nes-tetypessä ja sulatetaan 37°C:ssa. Tämä jäädytys-su-latustoimenpide toistetaan 5 kertaa ja sen jälkeen seosta sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 16000 1/min. Emäliuoksista tutkitaan CGRPIIa-pi-toisuus HPLC:n tai vasta-aineiden avulla.

Vaihtoehtoisesti voidaan edellämainittu bakteeri-suspensio käsitellä seuraavalla tavalla:

Solut erotetaan kasvatusliuoksesta sentrifugoimalla yli 8000 1/min nopeudella ja sen jälkeen ne rikotaan mekaanisesti Dyno-Mill-myllyllä tai entsymaattisesti lysointipuskurilla (pH 8).

Sitten suoritetaan peräkkäin seuraavat käsittelyvaiheet: 1. Bakteeriproteiinien pH-saostus etikkahapolla (lop-puväkevyys 1 %, pH 4,0), jolloin CGRP II jää emäliuok-seen ja sedimentti erotetaan pois.

2. Epäpuhdas peptidi adsorboidaan ioninvaihtopylvääseen (CH 52, Whatman) ja eluoidaan ammoniumasetattigradientil-la 10 mM (pH 4,5) - 300 mM (pH 6,5). Pääkomponentista poistetaan suola lyofilisoimalla useita kertoja tislatusta vedestä tai dialysoimalla.

3. Tuote puhdistetaan Craigin mukaisella moneen kertaan toistetulla jakamisella kaksifaasisysteemissä, jossa on 0,1-prosenttista etikkahappoa ja n-butanolia (1:1) (200 siirtoa). Liuotin poistetaan kiertohaiduttimessa ja yhteen kootut fraktiot lyofilisoidaan.

4. Mahdolliset jäännösproteiinit ja pienimolekyyliset

D

aineosat poistetaan geelisuodattamalla Sephadex G 50: ssä (Pharmacia) käyttämällä eluenttina seosta, jossa on 2 % etikkahappoa ja 1 % β-merkaptoetanolia, tai kään-teisfaasi-HPLC:llä Watersin preparatiivisessa laitteessa (LC-Prep 500) Nucleosil C-18-pylväässä (Dydac 300 A, 15-20 jim) käyttämällä liuotingradienttia.

60 86547 Näin saadaan kaavan XV mukainen CGRP Ha.

f-?

Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-Hia-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-Tyr-OH (XV)

Tuotannossa käytetty E. coli-klooni saadaan seuraa-valla tavalla:

Vaihe 2.1:

Seokseen, jossa on 3,05 g (5 mmol) 5'-(4-monometok-sitrityyli)-N-isobutyryyli-deoksiguanosiinia 20 ml:ssa absoluuttista pyridiiniä, lisätään 750 mg meripihkahap-poanhydridiä ja 910 mg 4-dimetyyliaminopyridiiniä ja jätetään 16 tunniksi huoneenlämpötilaan. Pyridiiniliuos haihdutetaan, jäännös sekoitetaan 200 ml:aan etikkahapon etyyliesteriä ja ravistellaan kahdesti käyttämällä kummallakin kerralla 200 ml 0,1 M fosfaattipuskuria ja 10 ml kyllästettyä ruokasuolaliuosta, pestään vielä kyllästetyllä ruokasuolaliuoksella, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaania. Saostunut tuote erotetaan ja hierretään kahdesti dietyylieetterillä ja liuotetaan sen jälkeen 300 ml:aan etikkahapon etyyliesteriä ja ravistellaan 0°C:ssa 180 ml:n kanssa 0,1 M kaliumvetysulfaattia (pH 2,5). Pestään kahdesti vedellä ja näin saatu etikkaesteriliuos kuivataan, suodatetaan, lisätään 0,5 ml pyridiiniä, haihdutetaan ja laimennetaan lisäämällä heksaania tipoittain. Saostunut meripihkahappojohdannainen suodatetaan talteen.

1,15 g tätä yhdistettä sekä 190 mg N-hydroksisuk-kinimidiä liuotetaan seokseen, jossa on 4 ml etikkahapon etyyliesteriä ja 2 ml dimetyyliformamidia, ja 0°C:ssa lisätään 370 mg Ν,Ν'-disykloheksyylikarbodi-imidiä. Annetaan seisoa yön yli jääkaapissa ja saostunut N,N'-disykloheksyyliurea suodatetaan pois ja suodos laimennetaan etikkahapon etyyliesterillä, uutetaan kylmällä 0,1 M natriumvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan 61 86547 ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa. Jäännös kromato-g^foidaan etikkahapon etyyliesterillä silikageelissä.

DC: 0,55 dikloorimetaani:metanoli (9:1).

100 mg tätä N-sukkinimidoyyli-meripihkahappoeste-riä ja 1 g aminometyyli-polystyreeniä (amiinipitoisuus 110 ymol/g) lisätään seokseen, jossa on 2 ml dikloori-metaania ja 4 ml dimetyyliformamidia, ja sekoitetaan 20 tuntia. Polymeerihartsi suodatetaan talteen ja pestään dimetyyliformamidilla, metanolilla, dikloorime-taanilla ja metanolilla. Kuivataan ja sen jälkeen reagoimattomat aminoryhmät asetyloidaan siten, että hartsi saatetaan 6 ml:ssa pyridiiniä reagoimaan etikkahappo-anhydridin (1 ml) ja 4-dimetyyliaminopyridiinin (100 mg) kanssa sekoittamalla 30 minuuttia. Saatu polymeerihartsi, jossa aminometyylipolystyreenin aminoryhmiin on nyt liittyneenä 5'-(4-monometoksitrityyli)-N-isobuty ryyli-deoksiguanosyyli-3'-O-sukkinyyliryhmiä, pestään perusteellisesti dikloorimetaanilla, dimetyyliformamidilla, metanolilla ja dikloorimetaanilla ja kuivataan vakiopainoon. Spektroskooppinen metoksitrityylimääritys antaa lataukseksi 32 ymol/g.

Vaihe 2.2.: 7,73 g (15 mmol) 51-(4-monometoksitrityyli)-tyrni-diiniä haihdutetaan kahdesti absoluuttisen pyridiinin kanssa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan absoluuttista tet-rahydrofuraania ja saatu liuos lisätään tipoittain 80 ml:aan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotriatsolyyli)-fosfaatin 0,2 M tetrahydrofuraaniliuosta kosteudelta suojattuna ja saatua reaktioseosta sekoitetaan 1 tunti huoneenlämpötilassa. Saatu 2-kloorifenyyli-1-bentsotri-atsolyyli-5'-(4-monometoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaat-tiliuos jaetaan kolmeen osaan.

a) Hydrolyysi trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-5'-(4-monometoksitrityyli)-tymidiini-31-fosfaatiksi:

Kolmasosaan edellä saadusta 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-31- 62 8 e S 7 fosfaattia lisätään jäähdytyksen alaisena 100 ml 0,5 M trietyyliammoniumbikarbonaattia. 15 minuutin kuluttua uutetaan dikloorimetaanilla. Dikloorimetaaniliuos pestään vedellä, haihdutetaan ja siihen lisätään tipoittaan petrolieetteriä. Muodostunut sakka suodatetaan talteen, pestään dietyylieetteri-petrolieetteriseoksel-la (1:1) ja kuivataan vakuumissa. DC: Rf 0,35 dikloori-metaani-metanoli-vesi (75:22:3).

6) Reaktio 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-5'-(4-mono-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatiksi ja 4-monomet-oksitrityylisuojaryhmän poistaminen:

Kolmasosaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-monometoksitrityyli)-tymidiini-fosfaattia lisätään 1,3 ml 2-syanoetanolia ja 2 ml pyridiiniä. Seos jätetään yöksi seisomaan huoneenlämpötilaan. Liuotin tislataan pois vakuumissa ja jäännös liuotetaan etik-kahapon etyyliesteriin ja ravistellaan useaan kertaan 0,1 M fosfaattipuskurin pH 7 ja veden kanssa. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin. Sakka suodatetaan, liuotetaan 50 ml:aan dikloorimetaani-metanoliseosta 7:3 ja saatetaan 0°C: ssa reagoimaan liuoksen kanssa, jossa on 3,8 g p-tolu-eenisulfonihappo-monohydraattia 75 ml:ssa dikloorimetaani-metanoliseosta 7:3. 2 tunnin kuluttua reaktioseos lai mennetaan dikloorimetaanilla ja ravistellaan kylmän natriumvetykarbonaattiliuoksen kanssa. Orgaaninen faasi haihdutetaan ja lisätään heksaania. Saostunut 2-syano-etyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfaatti kromato-grafoidaan silikageelissä käyttämällä dikloorimetaani-metanoliseosta (96:4). DC: R^ 0,45 dikloorimetaani-metanoli (9:1) .

γ) Kondensointi 5'-(4-metoksitrityyli)-31-syano-etyyli)-bis-tymidiini-dinukleotidiksi: 2,2 g:sta 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3·-fosfaattia poistetaan vesi haihduttamalla kahdesti absoluuttisesta pyridiinistä, liuotetaan 20 ml:aan abso- 63 86547 luuttista tetrahydrofuraania ja lisätään 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-51 - (4-monometoksitrityyli)-tymidii-ni-31-fosfaattiliuoksen viimeinen kolmannes. Reaktio-seosta pidetään 18 tuntia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen siihen lisätään jääjäähdytyksessä 10 ml vettä ja 200 ml etikkahapon etyyliesteriä. Orgaaninen faasi pestään useaan kertaan natriumvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen. Fosfaattiosa ja 5'- tai 3'-päästä suojattu dinukleotidi saostetaan lisäämällä tipoit-tain dietyylieetteri-heksaaniseokseen 1:1; Rf = 0,48 dikloorimetaani-metanoli (9:1).

Vaihe 2.3.: 9,20 g (15 mmol) 5'-(4-monometoksitrityyli)-N-isobutyryylideoksiguanosiinia haihdutetaan kahdesti absoluuttisen pyridiinin kanssa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan absoluuttista tetrahydrofuraania ja saatu liuos lisätään tipoittain 75 ml:aan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotriatsolyyli)-fosfaatin 0,2 M liuosta, samalla sekoittaen ja kosteudelta suojattuna ja sen jälkeen sekoitetaan 1 tunti huoneenlämpötilassa. Saatu 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-monometoksitrityyli) -N-isobutyryyli-guanosyyli-31-fosfaattiliuos jatkokäsitellään vaiheessa 2.4.

Vaihe 2.4: 1,17 g (1 mmol) edellä kuvattua täysin suojattua dinukleotidia liuotetaan 30 ml:aan dikloorimetaani-metanoliseosta (7:3) ja sen jälkeen siihen lisätään jääjäähdytyksessä liuos, jossa on 1,9 g p-tolueenisul-fonihappomonohydraattia 20 ml:ssa dikloorimetaani-me-tanoliseosta (7:3). 2 tunnin kuluttua lisätään jääkyl mää natriumvetykarbonaattiliuosta ja uutetaan dikloori-metaanilla. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin. Saostunut epäpuhdas dinukleotidi, jossa on vapaa 5'-hydroksiryhmä, kro- 64 86547 matografoidaan silikageelillä käyttämällä gradienttia, jossa on 2 - 8 % metanolia dikloorimetaanissa. = 0,33 dikloorimetaani-metanoli (9:1).

900 mg tätä 51-hydroksi-dinukleotidia haihdutetaan kahdesti pyridiinin kanssa, sen jälkeen liuotetaan 5 ml:aan absoluuttista tetrahydrofuraania ja lisätään 10 ml vaiheessa 2.3 saatua liuosta. 2 tunnin kuluttua lisätään jääkylmää vettä ja tästä 1 tunnin kuluttua uutetaan dikloorimetaanilla. Orgaaninen faasi pestään kyllästetyllä natriumvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään eetteriä. Saostunut tri-nukleotidi puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä; = 0,45 dikloorimetaani-metanoli (9:1).

Vaihe 2.5:

Kohtien 2.2, 2.3 ja 2.4 mukaisesti valmistetaan seuraavat yleisen kaavan XVI mukaiset suojatut trinukleo- tldlt TOmt—0—Ba1 —O—P—0—Ba2 —O—P—O—Ba3 —O—P—OCH > CH z CN (XVI) K > K > K > • m· ·» ··· ci ci ci 1 2 . 3 jossa kukin ryhmistä Ba , Ba 3a Ba voi toinen toisestaan riippumatta olla jonkin seuraavan nukleosidis:. kahdenarvoinen tähde: N-bentsoyyli-deoksiadenosiini (A') N-bentsoyyli-deoksisytidiini (C*), N-isobutyryyli-deoksiguanosiini (G') tai tymidiini (T).

65 86547 trinukleotidi

Ba1 Ba2 Ba3 Rf (I)

T T C 0,5S

T C T 0,46 T C’ G* 0,45 T A' C 0,56 T A’ A' 0,53 T A' G' 0,60 T G' C 0,44 T G' G' 0,43 C T T 0,53 C T G' 0,46 C C T 0,45 C C A’ 0,51 C A' C 0,51 C A’ A’ 0,52 C A' G’ 0,44 C G’ T 0,49 C* G’ A’ 0,38 A' T T 0,55 A' T G' 0,48 A’ C' C 0,48 A' A' C’ 0,46 A' A’ G' 0,51 A' G* T 0,45 A' G' A' 0,49 G* C’ T 0,55 G’ A* T 0,44 G' A' A' 0,50 G' G' T 0,46 66 86547

Vaihe 2.6:

Jokainen vaiheissa 2.4 ja 2.5 kuvattu trinukleo-tidi käsitellään 2-syanoetyylisuojaryhmän poistamiseksi seuraavalla tavalla: 10 ymol trinukleotidia liuotetaan kosteudelta suojattuna 60 yltään pyridiini-asetonitrii- li-trietyyliamiiniseosta (1:1:1). Seosta pidetään 1 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen lisätään tipoittaan 0,7 ml peroksidivapaata dietyylieetteriä ja sakka suodatetaan talteen. Epäpuhdas trietyyliammo-niumsuola liuotetaan 50 yl:aan pyridiiniä ja saostetaan uudestaan 0,5 ml:11a dietyylieetteriä, sentrifugoidaan talteen ja kuivataan 15 tuntia suurtyhjössä.

Vaihe 2.7:

Vaiheen 2.6 mukaiset osittain suojatut trinukleo-tidit liitetään vaiheen 2.1 mukaisesti saatuun suojattuun guanosiini-polystyreenihartsiin seuraavalla tavalla:

Kaikki toimenpiteet suoritetaan kosteudelta suojattuina 150 yl:n vetoisessa reaktioastiassa ja liuottimien ja reagenssien lisäys suoritetaan mikroproses-soriohjauksella. Reaktioastiaan sijoitetaan ensin 15 mg (0,48 ymol) guanosiini-polystyreenihartsia (vaihe 2.1) ja sitten suoritetaan seuraavat toimenpiteet: 1. metyleenikloridi, 2 ml/min, 4 min.

2. metyleenikloridi-isopropanoli (85:15), 2 ml/min, 2 min.

3. sinkkibromidi 1 M ja 1,2,4-triatsoli 0,2 M metyleeni-kloridi-isopropanoliseoksessa (85:15), 2 ml/min, 2 - 3,5 min.

4. metyleenikloridi-isopropanoli (85:15), 4 min.

5. trietyyliammoniumasetaatti, 0,5 M DMF:ssä, 1 ml/min, 5 min.

6. molekyyliseula, kuivattu pyridiinissä, 1 ml/min, 3 min.

7. tetrahydrofuraani (peroksidivapaa, molekyyliseu-lalla kuivattu), 2 ml/min., 3 min.

8. typpivirta, 10 min.

67 86547 9. injektio 10 ymol trinukleotidia (ks. jäljempänä) ja 8,9 mg (30 ymol) 1-mesityleenisulfonyyli-3-nitro- 1,2,4-triatsolia (MSNT) liuotettuina 150 ylraan pydi-diiniä 10. 45°C, 20 min.

11. pyridiini, 2 ml/min, 4 min.

12. asetanhydridi 5 % ja 4-dimetyyliaminopyridiini 2,5 % pyridiinissä, 2 ml/min., 4 min.

13. pyridiini, 2 ml/min., 4 min.

14. pyridiini-isopropanoli (1:1), 2 ml/min., 3 min.

Kaikki 14 toimenpidettä toistetaan 24 kertaa, mutta 9.

toimenpiteessä käytetään peräkkäin seuraavia deoksitri-nukleotideja triaimnoniumsuolamuodossa (ks. vaihe 2.6): d(A’A'C’, C'A'G', C'A'C', TA'C', C'C'A’, TA'A', A'TT, TA’G', A'G'T, C’G'A', G'A'A', TC'G*, TG'G', C'G'T, C'A'A’, A'A'C', TA'G’, C’TT, A’A’G’, A'G'A', A'G'T, C'C'T, C'A'T ja G'TC').

Keskimääräinen liittämissaanto on 97 %. Lopputuotteella on seuraava rakenne ja se sisältää lisäksi 2-kloorifenyylisuojaryhmät: d(1^nt-G,TC,C,A,TC,C,TA,G,T,A,G,A,A,A,G,C,TTTA,G,A,A,C,C'A,A,C,G'TTG, G’TC'G'G'A'A'C'G'A'A'G'TTA'G'A'TTTA'A'C'C'A'TA'C’C'A'C'C'A'G’A'A' C’C’G')- polystyreenisynteesihartsi

Vaihe 2.8:

Vaiheessa 2.7 saatu polydeoksinukleotidi-polysty-reenisynteesihartsi käsitellään seuraavalla tavalla polynukleotidin irrottamiseksi kantaja-aineesta ja suojaryhmien poistamiseksi:

Seosta, jossa on 35,0 mg (n. 0,35 ymol) polydeoksi-nukleotidi-synteesihartsia 64/73, 66 mg (0,40 mmol) o-nitrobentsaldoksiimia ja 50 yl (0,40 mmol) 1,1,3,3-tetrametyyliguanidiinia 400 yl:ssa 95-prosenttista py-ridiiniä, pidetään 3 tuntia 50°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Pyridiini puhalletaan pois typellä ja jäännökseen lisätään 1,6 ml ammoniakin 33 % vesi- 68 86547 liuosta ja sen jälkeen pidetään 24 tuntia 50°C:ssa suljetussa astiassa.

Erotetusta nestefaasista poistetaan ammoniakki vakuumissa ja pestään peroksidittomalla dietyylieetteril-lä (3x3 ml). Kun on erotettu pienimolekyyliset aineosat Biogel P6-pylväässä (100-200 mesh, 3 x 66 cm, 0,01 M trimetyyliammoniumvetykarbonaatti pH 7,5, 1,5 ml/min), erotetaan 250 OD (260 nm) polydeoksinukleo-tidia.

Kaikkiaan erotetaan 60 OD:tä HPLC-pylväässä (PRP-1/ Hamilton, 250x4,6 mm). Gradientti( liuos A: 0,05 M trietyyliammoniumasetaatti pH 7,0; liuos B: liuos A:ase-tonibfciili 1:1): 30 % B:tä A:ssa-^60 % B:tä A:ssa 20

minuutissa 50°C:ssa 2 min/min. Lipofiilinen pääpiik-ki (retentioaika n. 14 minuuttia) otetaan talteen, konsentroidaan DE52-selluloosapylväässä (Whatman), eluoidaan ja saostetaan etanolilla. 4-metoksitrityyli-suojaryhmän poistamiseksi liuotetaan sakka 50 yl:aan etikkahappo-vesiseosta (4:1) ja pidetään 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Reaktiotuote lyofilisoidaan, saostetaan etanolilla ja puhdistetaan elektroforeet-tisesti 8 % polyakryyliamidigeelissä (7 M ureaa). Odotettua polynukleotidikokoa vastaava vyöhyke leikataan irti ja tuote elektroeluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosan' avulla ja polydeoksinukleotidi 64/73, jolla on seuraava rakenne d(GTCCATCCTAGTAGAAAGCTTTAGAACCAACGTTGGTCG

GAACGAAGTTAGATTTAACCATACCACCAGAACG) saostetaan etanolilla. Vaihe 2.9:

Vaiheiden 2.7 ja 2.8 mukaisesti saadaan polydeoksinukleotidi 1/73 d(CTGGAATTCATGGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCTGGTCTGCTGTCTCG TTCTGGTG).

Vaihe 2.10:

Vaiheiden 2.8 ja 2.9 mukaisesti saatujen polynuk-leotidien (64/73 ja 1/73) 5'-päät fosforyloidaan radio- 69 86547 32 aktiivisesti käyttämällä /γ- P/ATP:tä ja T4-polynuk-leotidikinaasia (Boehringer, Länsi-Saksa), kuten julkaisussa Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab. 1982, s.125, on selostettu.

Vaihe 2.11:

Jotta vaiheessa 2.10 saadut kinasoidut polynukleo-tidit saataisiin polymeroiduksi kahdenteeksi, liuotetaan 50 pmol kinasoitua fragmenttia 1/73 ja 50 pmol kinasoitua fragmenttia 64/73 24 yl:aan vettä, saatua liuosta kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja jäähdytetään 5 minuutin kuluessa 12°C:een. Lisätään 4 yl Endo-R-puskuria (0,1 M Tris.HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2/ 66 mM

β-merkaptoetanoli, 0,6 M NaCl),10 yl deoksinukleosidi- -3 trifosfaattiseosta (dATP, dCTP, dGTP, TTP, kukin 2 x 10 M, pH säädetty ammoniakilla arvoon 7,0) ja 2 yl (10 yksikköä) DNA polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia (Boehringer) ja saatua liuosta inkuboidaan 30 minuuttia 12°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 3 min. 90°C:ssa ja saatua reaktioseosta säilytetään -80°C:ssa jatkokäsittelyä varten.

Näin saadulla kahdenteella on seuraava rakenne:

d( CTGGAATTCATGGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCT d ( GACCTTAAGTACCGAACGTTGTGGCGATGGACGCAATGGGTGGCAGACCGA

GGTCTGCTGTCTCGTTCTGGTGGTATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGACC

CCAGACGACAGAGCAAGACCACCATACCAATTTAGATTGAAGCAAGGCTGG

AACGTTGGTTCTAAAGCTTTCTACTAGGATCCTG) TTGCAACCAAGATTTCGAAAGATGATCCTAGGAC) Tästä kahdenteesta käytetään jäljempänä merkintää"Fo". Vaihe 2.12: 10 yg plasmidia pBRHrrp (Saksan hakemusjulkaisu 3 111 405 (Genentech)) pilkotaan 60 minuuttia 30°C:ssa 50 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs), pilkkomisseos uutetaan fenolilla ja fraktioidaan sen jälkeen sakka- 70 86547 roositiheysgradientilla (5 - 23 %), jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA, käyttämällä TST41-roottoria (Kontron AG). Sentrifugointi kestää 14 tuntia kierrosnopeudella 40 000 1/min 15°C:ssa. 0,3 ml:n jakeet kerätään ISCO-gradientinkeräyslaitteella nopeudella 1 ml/min. Jakeet, jotka sisältävät pienemmän fragmentin, puhdistetaan, liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. DNA sentrifugoidaan Eppendorf-sentrifugis-sa ja liuotetaan sen jälkeen 100 ui:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA. 5 yg tätä DNA-fragmenttia pilkotaan 60 minuuttia 37°C:ssa 5 yksiköllä Bglllrta (Biolabs). Reaktioseos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja DNA:ta inkuboidaan 2 tilavuuden kanssa etanolia 10 minuuttia -80°C:ssa ja DNA sentrifugoidaan talteen ja liuotetaan uudestaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0).

Tästä liuoksesta otetaan 2 yl (0,2 yg DNA:ta) ja sen jälkeen sitä inkuboidaan pitoisuudessa 10 ng/yl, joka on tehty liuokseen 50 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 yksikön kanssa vasikan sisäelinten alkalista fosfataa-sia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65 °C:ssa. Otetaan 0,04 μ g DNA:ta ja se käsitellään 5'- 32 terminaalisesti 10 yCi:llä /γ- P/-ATP:tä (>5000 Ci/mmol, Amersham) ja 5 yksiköllä T4-polynukleotidikinaasia (P-L Biochemicals) 20 ylin reaktiotilavuudessa, joka on tehty liuokseen, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgC^ ja 5 mM DTT, 30 minuuttia 37°C. Radioaktiivinen nävte sekoitetaan ei-leimatun näytteen kanssa (ks. edellä) ja DNA-fragmentit fraktioidaan 5 - 23 % sakkaroositiheysgradientissa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA, käyttämällä TST60-root-toria. Sentrifugointi kestää 5 tuntia nopeudella 60 000 1/min 15°C:ssa. Kerätään 0,2 ml:n jakeet. Jokaisen jakeen radioaktiivisuus mitataan Cerenkov-säteilynä ja fragmentit tunnistetaan sen avulla.

7i 86547

Halutut jakeet, jotka sisältävät pienen DNA-fragmentin, yhdistetään, DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia ja liuotetaan sentrifugoinnin jälkeen uudelleen 20 μΐ: aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA.

32 P:llä leimattu EcoRI-Bglll DNA-fragmentti pilkotaan osittaisesti inkuboimalla 10 minuuttia 37°C:ssa 0,2 yksikön kanssa Taqlrtä (Biolabs) 50 Pl:n reaktio-tilavuudessa. Reaktioseoksen pitoisuudeksi säädetään *0,2 % SDS, 10 % glyserolia, 10 mM EDTA ja 0,05 % bromi-fenolisinistä ja DNA-fragmentit erotetaan 6 % polyak-ryyliamidigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA: hän (A.C. Peacock et ai., Biochemistry 6, 1818 (1967)). Halutun EcoRI-TaqI-fragmentin sisältävä vyöhyke (suurin osafragmentti) tunnistetaan autoradiogrammista.

Tämä fragmentti (L, ks. kuva 1) uutetaan geelistä ja puhdistetaan (W. Miiller et ai., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978)) ja liuotetaan 10 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA.

Vastaanottajaplasmidina käytetään plasmidia pBR322, joka on katkaistu Clalrllä ja EcoRI:llä: 2 yg plasmidia pBR322 pilkotaan 4 yksiköllä Cla I:tä (Biolabs) 20 yl:n reaktiotilavuudessa 60 minuuttia 37°C:ssa. Proteiini uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan sen jälkeen 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutissa.

DNA sentrifugoidaan talteen ja pilkotaan sen jälkeen 30 minuuttia 37°C:ssa 10 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) 20 ylin reaktiotilavuudessa ja näin saatuun liuokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl (pH 8,7) ja inku-boidaan 30 minuuttia 37 C:ssa 1 yksikön kanssa vasikan alkalista fosfataasia (Boehringer). Sitten fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 60 minuuttia 65°C:ssa.

100 ng vastaanottajaplasmidia ja 5 yl L-DNA-frag-menttia inkuboidaan 2 tuntia 15 ylin reaktiotilavuudessa, jossa on 10 mM MgCl2, 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, 30 yksikön kanssa T4-DNA-ligaasia per yl reaktiot!lavuutta.

72 86547 5 μΐ tätä liuosta sekoitetaan 200 yl:n kokonaistilavuuteen seosta, jossa on 150 μΐ kalsiumkloridilla käsiteltyjä E. coli HBl01-soluja (14) liuoksessa, joka sisältää 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 raM Tris.HCl (pH 7,5). Seosta jäähdytetään 20 minuuttia jäällä, kuumennetaan 1 minuutti 42°C:ssa ja inkuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisätään 1 ml tryptonialustaa (Tryptonialusta sisältää 10 g Bacto-tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia; 8 g NaCl ja 294 mg CaCl2.2H20 litrassa tislattua vettä) ja saatua seosta inkuboidaan ravistelemalla nopeudella 300 1/min 30 minuuttia 37°C:ssa. Seos levitetään kahdelle agar-levylle (McConkey-agar, Difco; 0,6 ml/levy), joihin on lisätty 50 yg/ml ampisilliinia (Sigma). Levyjä inkuboidaan 12-17 tuntia 37°C:ssa.

Plasmidi-DNA erotetaan 10 eri pesäkkeestä seu-raavalla tavalla:

Pesäkkeillä siirrostetaan 25 ml:n Erlenmeyer-pulloissa 10 ml tryptoni-alustaa, johon on lisätty 50 yg/ml ampisilliiniä. Viljelmiä ravistellaan 15-18 tuntia 37°C:ssa nopeudella 300 1/min. Solut otetaan talteen sentrifugoimalla (Sorval, HS-4-rootto-ri, 10 minuuttia, 4000 1/min, 4°C). Näin saadaan noin 0,1 g soluja, jotka suspendoidaan 1 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään 0,25 ml ly-sotsyymiliuosta (10 mg/ml liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0); lysotsyymi on Sigman tuottamaa), inkuboidaan 10 minuuttia 0°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 0,15 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5). Inkuboidaan 10 minuuttia 0°C:'ssa ja sen jälkeen lisätään 60 μΐ 2 %:sta Triton X-100 (Merck). Inkuboidaan 30 minuuttia 0°C:ssa ja sen jälkeen näytettä sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 15 000 1/min Sorval SA-600-roottorissa. Emä-liuoksesta poistetaan proteiini 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE:hen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla (Sorval HB-4-roottori) 10 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 5000 1/min. Ylempi faasi uutetaan kahdesti 73 86547 1 tilavuudella kloroformia. Lisätään haiman RNAaasia A (Sigma, 10 mg/ml TNE, esilämmitetty 10 minuuttia 85°C: ssa) loppuväkevyyteen 25 yg/ml ja saatua seosta inku-boidaan 40 minuuttia 37°C:ssa. Liuoksen pitoisuudeksi säädetään sen jälkeen 1 M NaCl ja 10 % polyetyleenigly-kolia (Fluka, käsitelty 20 minuuttia autoklaavissa 120°C: ssa) ja inkuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka kerätään talteen Sorval HB-4-roottorissa (20 min, 10 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNE. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia (10 minuuttia, -80°C). Sakka kerätään talteen sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugis- sa ja DNA liuotetaan uudestaan 20 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 mlrsta viljelmää saadaan 8 - 10 yg plasmidi-DNA:ta.

Plasmidi-DNA:t analysoidaan sen jälkeen, kun on suoritettu pilkkominen seuraavilla restriktioentsyy-meillä: 0,5 yg kutakin plasmidi-DNA:ta pilkotaan Hpal:llä (Biolabs) sekä Hpal:llä (Biolabs) ja EcoRIrllä (Biolabs) ja Clal:llä (Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan.

DNA:t fraktioidaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Toivotut plasmidit sisältävät yhden Hpal-kohdan ja antavat 3-kertaisen pilkkomisen jälkeen suuren DNA-fragmentin lisäksi 2 pienempää fragmenttia, jotka ovat suurempia kuin plasmidin pBR322 pieni EcoRI-Clal-fragmentti. Yhdelle plasmideista annetaan nimi p159.

Vaihe 2.13:

2 yg p159-DNA:ta pilkotaan 10 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) 30 minuuttia 37°C:ssa. DNA uutetaan fenolilla,saostetaan etanolilla ja liuotetaan sentrifugoinnin jälkeen 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH

7,5) ja 0,5 mM EDTA. EcoRI:llä pilkottua DNA:ta käsitellään vielä 15 minuuttia 12°C:ssa 5 yksiköllä DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) (Boehringer) liuoksessa, 74 86547 jossa on 10 riM MgCJ^r 10 mM 3-merkaptoetanolia, 50 nM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals) ja 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals). Sen jälkeen polymeraasi inaktivoidaan kuumentamalla 5 minuuttia 85°C:ssa. Reaktioseos laimennetaan 10-kertaisesti liuoksella, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, ja inkuboidaan 1 tunti 15°C:ssa 30 yksikön kanssa T4-DNA-ligaasia per μΐ.

E. coli transformoidaan 50 ngrlla DNA:ta (kuten edellä on esitetty) ja levitetään McConkey-agarlevyille, joihin on lisätty 50 yg/ml ampisilliiniä.

Plasmidi-DNA eristetään 10 eri pesäkkeestä edellä kuvatulla tavalla. Plasmidi-DNA:t analysoidaan pilkkomalla EcoRIsllä. Halutut plasmidit ovat vastustuskykyisiä EcoRI:lle. Analyysi tapahtuu edellä kuvatulla tavalla. Yhdelle halutuista plasmideista annetaan nimi HRi145.

Va ihe 2.14: 2 yg pHRil45-DNA:ta käsitellään 5 yksiköllä Clal:tä (Boehringer) 60 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen poistetaan proteiini fenoliuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan sen jälkeen 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. Ulostyöntyvät päät täytetään edelläkuvatulla tavalla DNA-po-lymeraasin (Klenow-fragmentti) avulla paitsi, että dATP ja dTT korvataan dCTP:llä (P&L Biochemicals) ja dGTP:llä (P&L Biochemicals). Polymeraasi inaktivoidaan inkuboi-malla 5 minuuttia 85°C:ssa. Reaktioseokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl (pH 8,7) ja inkuboidaan 0,5 yksikön kanssa vasikanfosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Reaktioseoksesta poistetaan proteiini fenoliuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan 8 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA.

Kemiallisesti syntetisoitu DNA-kytkijä, jonka kaava on seuraava 75 8 6 5 4 7 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosforyloidaan 5'-päästään siten, että 8 pmol kytkijää o 3 2 inkuboidaan 30 minuuttia 37 Crssa 5 yCi:n kanssa /γ p/- _i ATP:tä (5500 Ci.mmol Amersham) 8 yl:n reaktiotila-vuudessa, joka sisältää 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM Tris.HCl (pH 9,5) , 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ja 2 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia (P&L Biochemicals). Reaktio pysäytetään jäädyttämällä -80°C:een.

Sitten tämä radioaktiivinen kytkijä käsitellään 1yg:llä Clalrtä ja fosfataasilla ja liitetään pHRi145-DNArhan (ks. edellä) 20 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 ja 800 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Biolabs). Inkubointi kestää 2 tuntia 15°C:ssa. Ligaasiinaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Sitten lisätään 2 tilavuutta vettä, keit-tosuolapitoisuus säädetään 10 mM:ksi ja lisätään 37°C:ssa 30 minuutin kuluessa 20 yksikköä Kpn I:tä (Biolabs). Uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja saatu seos fraktioidaan 0,9 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelis-sä (Biorad), jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. UV-säteilyn näkyväksi tekemä vyöhyke, jolla on sama liikkuvuus kuin yhtä suurella merkki-DNA:11a, leikataan irti leikkaus-veitsellä. Geelipala sulatetaan 5 minuutissa 65°C:ssa ja jäähdytetään sen jälkeen 37°C:een. Näin saadaan tilavuudeksi n. 20 ui. Tästä liuoksesta otetaan 5 ui ja sitä inkuboidaan 12 tuntia 15°C:ssa 400 yksikön kanssa T4-ligaasia (Biolabs) 10 ylin reaktiotilavuudessa, jossa on 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2 ja 20 mM Tris.HCl (pH 7,8). 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM Tris.

HC1 (pH 7,5), 100 mM CaCl2 ja 100 mM MgCl2, lisätään li-gaasiseokseen (kiinteytyy 15°C:ssa) ja inkuboidaan 5 minuuttia 65°C:ssa. Näin saadulla liuoksella transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HBl01-solut, kuten edellä on selostettu. Seos levitetään McConkey-agarle- 76 86547 vyille, joihin on lisätty 50 yg/ml ampisilliiniä.

10 eri pesäkkeestä erotetaan plasraidi-DNA edellä kuvatulla tavalla ja DNA analysoidaan käyttämällä seuraa-via restriktioentsyymejä. 0,5 yg kutakin plasmidi-DNA:ta katkaistaan peräkkäin Kpnl:llä (Biolabs), Ncolillä (Bio-labs) ja EcoRI:llä valmistajan ohjeita noudattaen. Kat-kaisutuotteet fraktioidaan 1 % isissä agaroosigeeleissä, joissa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 μg/ml etidiumbromidia. Kaikissa plasmideissa on kullakin näillä entsyymeillä yksi katkaisukohta. Yhdelle plasmidille annetaan nimeksi HRi148.

Plasmidi HRi148 sisältää tryptofaanin promoottorin ja operaattorin ja yhden ribosomin sitoutumiskohdan ATG-kodoniin asti, se mukaanluettuna, ja on laajasti käyttökelpoinen ilmentämisplasmidi.

Vaihe 2.15: 5 yg plasmidin pHRi148 DNA:ta katkaistaan restrik-tioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Leikkauksessa saatu pHRil48/EcoRI/BamHI-vektori-DNA eristetään tiheysgra-dienttisentrifugoinnilla.

Saadun lineaarisen vektorin valmistus on selostettu myös julkaisussa Hans Rink et ai.. Nucleic Acids Research 12, 6369-6387 (1984), jossa tämän patenttihakemuksen plasmidista pHRi148 käytetään nimeä plasmidi pHR148.

Vaihe 2.16: 20 yg vaiheessa 2.11 saatua DNA-sekvenssiä F kä-sitellään 20 ylrssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml liivatetta, peräkkäisesti restriktioentsyymeillä EcoRI ja BamHI. Liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja sen jälkeen lisätään 30 yg (= 50 nmol päitä) pHRil48/EcoRI/BamHI-vektori-DNA:ta. Liuos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Sakkaa käsitellään 3 tuntia 150°C:ssa 20 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mmol Tris.HCl (pH 7,8), 10 mmol MgCl2, 10 mmol DTT, 0,5 mmol ATP ja 100 yg/ml liivatetta, 25 yksiköllä/ yl T4-DNA-ligaasia (Biolabs).

77 86 547 Tällä tavalla liuokseen syntyy rekombinoitu plasmidi (pMLl050).

Vaihe 2.17: E. coli HB101 transformoidaan vaiheessa 2.16 saadulla plasmidilla pML1050 seuraavalla tavalla:

Transformoinnissa tarvittavat kalsiumilla esikäsi-tellyt E. coli HB101-solut valmistetaan julkaisussa Mandel et ai., J. Mol. Biol. 5^, 159 (1970) kuvatulla tavalla.

Vaiheessa 2.16 saatua liuosta, joka sisältää rekom-binoidun plasmidin pML1050, kuumennetaan 10 minuuttia 65°C:ssa, jotta T4-ligaasi inaktivoituu ja sen jälkeen jäähdytetään 37°C:een. 10 yl tätä reaktioseosta lisä tään 200 μ1:η kokonaistilavuuteen seosta, jossa on 150 μΐ kalsiumkloridilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja liuoksessa, joka sisältää 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH7,5).

Sitten seosta jäähdytetään 30 minuuttia jäässä, kuumennetaan 2 minuuttia 42°C:ssa ja sen jälkeen annetaan seisoa 50 minuuttia 37°C:ssa 1 ml:ssa L-alustaa (vrt. esimerkin 2 alku). Sen jälkeen seos viirutetaan 0,2 ml:n erinä 5 agarlevylle (McConkey-agar, Difco), jotka sisältävät 60 yg/ml ampisilliinia (Serva). Sitten agar-levyjä pidetään 16 - 18 tuntia 37°C:ssa. Näin saadaan 109 transformoitunutta E. coli HB101-pesäkettä.

Vaihe 2.18: 30 näin vaiheessa 2.17 saadusta transformoituneesta pesäkkeestä tutkitaan seuraavalla tavalla vaiheen 2.11 mukaisen DNA-sekvenssin F läsnäolo.

o

Transformoituneet pesäkkeet siirretään painamalla nitroselluloosasuotimelle B85 (Schleicher & Schiill) . Pesäkkeet lysoidaan Grunsteinin ja Hognessin menetelmällä (Proc.Natl.Acad. Sei. USA 72, 3961 (1979)) ja niiden denaturoitu DNA kiinnitetään suotimeen. Sitten suodinta esihybridisoidaan 4 tuntia 64°C:ssa 20 ml:ssa liuosta (per suodin), jossa on 4xSET (= liuos, jossa on 30 mM Tris.HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 0,1 % ( g/v) 78 86547

Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5 % SDS ja 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkorvan DNA:ta. Sitten nitrosellu- loosasuodinta käsitellään 16 tuntia 64°C:ssa ^P:llä 3 4 radioaktiivisesti leimatulla koettimella (n. 10-10 Ce-renkov-cpm per suodin) 20 ml:ssa liuosta (per suodin), jossa on 5 x SET (g/v), Ficoll 400, 0,2 % SDS ja 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkorvan DNA:ta. Koettimena käytetään oligodeoksinukleotidia 64/73 (vrt. vaihe 2.10) .

Sitten suotimet pestään kahdesti huoneenlämpötilassa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,2 % SDS, ja sen jälkeen kahdesti liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,5 % SDS, 60°C:ssa,(ensin 30 minuuttia ja sitten 60 minuuttia). Sitten suotimet kuivataan 3 MM-paperin välissä (Whatman) ja aseteaan -80°C:een 1-2 vuorokaudeksi röntgen filmil le (Fuji) vahvistusvarjostimella varustettuna (Intensifying screen, Ilford).

Saatu autoradiogrammi näyttää 20 positiivista pesäkettä (kloonia), joita voidaan käyttää jatkotyöskentelyssä. Niistä viidelle annetaan nimet pML1050, pML1051, pMLl052, pMLl053 ja pMLl054.

Vaihe 2.19:

Vaiheessa 2.18 saadun kloonin pMLl050 sisältämän liitetyn DNA-sekvenssin eli DNA-insertin tunnistaminen tapahtuu seuraavalla tavalla:

Yhdistelmäplasmidin pMLl050 DNA eristettiin Ish-Horowitzin menetelmällä (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab. 1982, s. 368). Fo~DNA-liitännäisen nukleotidi-sekvenssi määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (Proc.Natl.Acad.Sei.USA 74, 560 (1977), ks. myös Meth. Enzym. 65, 499 (1980)). Tätä tarkoitusta varten pilkotaan 10 yg plasmidin pML1050 DNA:ta EcoRI- tai BamHI-restriktioendonukleaasilla ja linearisoidut DNA:t erotetaan geelieluutiolla agaroosigeelistä. Tätä tarkoitusta varten puhdistetaan linearisoidut DNA:t geeli-elektroforeesilla käyttämällä 1 %:ista matalalla sulavaa „ 86547 agaroosia (Biorad) , joka on tehty Tris-asetaatti-EDTA-pusku-riin pH 8. Agaroosigeelin sisältämä DNA värjätään eti-diumbromidilla ja DNA-vyöhykkeen sisältävä kohta leikataan irti geelistä ja nesteytetään 10 minuutissa 65°C:ssa. Tähän DNA-liuokseen lisätään 20 tilavuutta TNE-liuosta, DNA puhdistetaan Mueller at al.:n menetelmällä (J. Mol. Biol. 124, 343 (1978)) käyttämällä DE- 52-kromatografiaa, uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla yön kuluessa -20°C:ssa. DNA-sakka liuotetaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,1 mM EDTA, ja säilytetään -20°C:ssa käyttöön asti. Sen jälkeen erotetut DNA:t pilkotaan alkalisella fosfataasilla ja kromatografoidaan DE-52: 11a. Sitten DNA-palojen 5'-päät leimataan radioak- 32 tiivisesti käyttämällä /γ P/ATP:tä (ominaisaktiivisuus >5000 Ci/mmol, Amersham) ja T4-polynukleotidikinaasia (P-L-Biochemicals).

Radioaktiivisesti leimatut DNA:t katkaistaan seu-raavaksi toisella restriktioentsyymillä, esim. PvuII: 11a tai Pstl:llä. Syntyneet DNA-fragmentit eristetään geelieluutiolla agaroosista. Sitten PvuII-EcoRI*-fragmentista tai PstI-BamHI*-fragmentista määritetään FQ-DNA:n nukleotidisekvenssi (* tarkoittaa radioaktiivisesti leimattua DNA:n päätä).

Esimerkki 3: Testipakkaus, joka sisältää CGRPII:een koh distuvia monoklonaalisia vasta-aineita CGRP IIa:n määrittämiseksi, kompetitiivinen radioimmunomääritys a. CGRP II:een kohdistuvien monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen A) Hiirten immunisointi

Lyofilisoidussa muodossa oleva puhdas CGRP II (3 mg) (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) liuotetaan pieneen määrään 0,1 %:sta etikkahappoa ja täydennetään sen jälkeen 3 ml:ksi fosfaatilla puskuroidulla ruokasuolaliuoksella. pH säädetään arvoon 7,2. Tämä antigeeniliuos jaetaan eriin.

8o 86547 joihin sekoitetaan sama määrä täydellistä Freundin adju-vanttia tai fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta.

Naaraspuolisiin Balb/c-hiiriin (8 viikon ikäisiä, saatu Sisselnin eläinfarmilta Sveitsistä) injektoidaan laskimonsisäisesti 100 yg CGRP II-liuosta, joka on tehty puskuroituun suolaliuokseen. Neljä vuorokautta myöhemmin otetaan pernat fuusiointia varten.

B) Hybridooman valmistus ja vasta-ainetesti

Hybridoomasolut valmistetaan fuusioimalla näin saadut pernasolut myeloomasolulinjaan X63-Ag8.6.5.3 (J.F.

Kearney et ai., J. Immunol. 123, 1548 (1979)). Tähän 8 7 käytetään 10 pernasolua ja 10 myeloomasolua. Fuusiointi suoritetaan julkaisussa S. Alkan et ai., Mol. Immunol. 20, 203 (1983) kuvatulla tavalla.

CGRP II:n vasta-aineen määritys emäliuoksista tapahtuu radioimmunologisesti (RIA, T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North Holland Pubi. Comp, Amsterdam 1978).

C) CGRP II:n vasta-aineen eristäminen ja puhdistaminen askites-nesteestä

Balb/c-hiiret esikäsitelläänvatsaontelonsisäisesti 0,4 ml:11a Pristania (Carl Roth). Viikon kuluttua inji- - - β soidaan vatsaontelonsisäisesti 2 - 5 x 10 kloonattua hybridoomasolua. Jokaiselta hiireltä otetaan askites-nestettä toistuvasti ja se jäädytetään -80°C:een.Kerätty neste sulatetaan ja sentrifugoidaan 30 minuuttia 4 °C:ssa nopeudella 16 000 1/min. Rasva imetään pois ja jäljelle jääneeseen jätevapaaseen emäliuokseen lisätään tipoittain 0°C:eessa samalla sekoittaen 0,9 tilavuusek-vivalenttia tyydytettyä ammoniumsulfaattiliuosta. Saatu epäpuhdas immunoglobuliinijae lasketaan Sepharyl G 2000:n (Pharmacia) läpi käyttämällä 0,1 M Tris.HCl (pH 8,2). Aktiiviset jakeet puhdistetaan ja väkevöidään Amicon XM50-suodattimella (Amicon).

si 86547 b. Testipakkaus kompetitiivista radioimmunomääritystä varten

Esimerkin 3aC) mukaisesti valmistettu anti-CGRP II-vasta-aineliuos laimennetaan fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS-liuos) pitoisuuteen 1 yg per 100 yl. 100 yl tätä liuosta inkuboidaan 2 tuntia 37°C:ssa muoviputkissa tai muovisissa mikrotitrauslevyissä, jolloin vasta-aineet adsorboituvat muovipintaan epäspesifisesti. Jotta muovin pinnassa vielä jäljellä olevat vapaat aktiiviset kohdat saadaan tukituiksi, suoritetaan jälkikäsittely naudan seerumialbumiiniliuoksella (BSA-liuos).

Näyteliuoksesta tai standardiliuoksesta tehdään sarjalaimennukset BSA-liuokseen ja ku unkin lisätään 50 μΐ sinänsä tunnetulla tavalla (29) radioaktiivisella jo-125 dilla I leimattua CGRP II:ta, jonka aktiivisuus on 10 000 cpm per 50 μΐ, ja sen jälkeen inkuboidaan muovi-pinnalla 2 tuntia 37°C:ssa ja 12 tuntia 4°C:ssa. Putket tai mikrotitrauslevyt pestään fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ja radioaktiivisuus mitataan. Näy-teliuoksen CGRP II-pitoisuus määritetään standardiliuok-sen avulla mitatulta standardikäyrältä.

Kyseiseen radioimmunomääritykseen soveltuva koe-pakkaus sisältää: 2 ml liuosta, jossa on esimerkin 3aC) mukaista anti- CGRP II-vasta-ainetta pitoisuutena 1 - 10 mg per ml, 100 ml fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS-liuos), 100 ml 0,3 % naudan seerumialbumiinia ja 0,1 % natrium-atsidia PBS-liuoksessa (BSA-liuos), 2 ml liuosta, jossa on radioaktiivista CGRP II:ta, jonka aktiivisuus on 200 000 cpm/ml, 2 ml standardiliuosta, joka sisältää 100 ng/ml hirudii-nia (Hirudin), 1 ml:n muovisia putkia tai mikrotitrauslevyjä.

Esimerkki 4: Liivateliuos

Steriilisuodatettu CGRP II:n vesiliuos sekoitetaan 82 86547 steriileissä olosuhteissa kuumennuksen avulla steriiliin liivateliuokseen, joka sisältää säilöntäaineena fenolia, niin, että 1,0 ml:n liuosmäärällä on seuraava koostumus: CGRP II 10,0 pg liivate 150,0 mg fenoli 4,7 mg tislattu vesi määrään 1,0 ml Lääkepullot täytetään seoksella aseptisesti määrään 1,0 ml.

Esimerkki 5: Steriili, kuivattu aine injektioita var ten 5 yg CGRP litta liuotetaan 1 mitään vesiliuosta, jossa on 20 mg mannitolia. Liuos steriloidaan ja sillä täytetään 2 ml tn ampullit aseptisissa olosuhteissa, syvä-jäädytetään ja lyofilisoidaan. Ennen käyttöä lyofilisaat-ti liuotetaan 1 mitään tislattua vettä tai 1 mitään fysiologista suolaliuosta. Liuos käytetään lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti. Formulaatio voidaan myös sijoittaa kaksikammioruiskeampulleihin (Doppelkammer-spritzampullen).

Esimerkki 6t Nenäsuihke

Seokseen, jossa on 3,5 ml "Miglyol 812":ta ja 0,08 g bentsyylialkoholia, suspendoidaan 200yg hienoksi jauhettua (<5,0 μ) CGRP litta. Tämä suspensio sijoitetaan annosteluventtiilillä varustettuun säiliöön. Sitten säiliöön tuodaan venttiilin kautta paineen alaisena 5,0 ml "Freon 12". Ravisteltaessa "Freon" sekoittuu Miglyol-bentsyylialkoholiseokseen, joka sisältää esimerkin 1 mukaisesti saadun tuotteen.

Esimerkki 7t Otetaan 2 ml 0,6 M ammoniumasetaatti/0,1 M KC1/1 mM EDTA-liosta ja säädetään sen pH väkevällä am-moniakkiliuoksella arvoon pH = 8 ja lisätään 100 μί CGRP Ilatn (ks. esimerkki 2) 1M vesiliuosta. Sitten lisätään 0,7 mg karboksipeptidaasi Y:tä (Carlsberg Bio- 83 86547 technology Ltd., Kööpenhamina, Tanska). Kun on inku-boitu 30 minuuttia 25°C:ssa, säädetään pH 6 M suolahapolla arvoon 1. Reaktiotuote puhdistetaan HPLC:n avulla kohdassa 1.7 kuvatuissa olosuhteissa ja erotetaan. Näin saadaan kaavan III mukainen CGRP II, joka on identtinen esimerkin 1 mukaisesti saadun tuotteen kanssa.

Esimerkki 8: Kun toimitaan esimerkin 2 mukaisesti ja kasvatetaan Escherichia coli-klooneja, joissa on kaavan XVII mukaisen DNA-sekvenssin sisältäviä plasmi-de ja

MetAlaCyaAsnThrAlaThrCysValThrHlsArgLeuAlaGlyLeuLeuSer d(GAATTCATGGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCTGGTCTGCTGTCT d(CTTAAGTACCGAACGTTGTGGCGATGGACGCAATGGGTGGCAGACCGACCAGACGACAGA

ArgSerGlyGlyMetValLyeSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPhe

CGTTCTGGTGGTATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGACCAACGTTGGTTCTAAAGCTTTC

GCAAGACCACCATACCAATTTAGATTGAAGCAAGGCTGGTTGCAACCAAGATTTCGAAAG

GlyNON

GGTTAGGATCC) (XVII) CCAATCCTAGG) ja suoritetaan vastaava jatkokäsittely, saadaan kaavan XIX mukainen CGRP Hb.

?-?

Ala-Cy-Aan-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-GIy-Lau-

Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lye-Ser-Asn-Phe-Val-Pro- (XIX)

Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lye-Ala-Phe-Gly-OH

Lähtöaineet saadaan vastaavasti kuin esimerkissä 2.

Esimerkki 9: 4 mg CGRP Ilbrtä (ks. esimerkki 8) inku- boidaan 37°C:ssa 1 ml:ssa liuosta, jossa on 20 mM NaCl ja 5 mM natriumfosfaattia, pH 7,20, 20 tuntia amidointi-entsyymin kanssa, joka on eristetty 10 g:sta sian aivolisäkettä julkaisussa A.F. Bradbury, M.D.A Finnie ja D.G. Smyth, Nature 298, 686-688 (1982) kuvatulla tavalla.

Sitten seos tehdään happamaksi lisäämällä 100 yl 1 M HCl.

84 86547

Reaktiotuote puhdistetaan HPLC:llä kohdan 1.7 mukaisissa olosuhteissa ja eristetään. Näin saadaan kaavan III mukainen CGRP II, joka on identtinen esimerkin 1 mukaisesti saadun tuotteen kanssa.

Esimerkki 10: Kohdassa 10.2 saatu seuraavan kaavan mukainen peptidiamidi f-f

Boc-Ala-Cy-Aen-Thr( tBu)-Ala-Thr( tBu)-Cy-Val-Thr( tBu)-Hie-Arg(Mtr)-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser( tBu)-Arg(Mtr)-Ser( tBu)-Gly-Gly-Het-Val-Lya(Boc)-Ser(tBu)-Aan-Phe-Val-Pro-Thr(tBu)-Aan-Val-Gly-Ser(tBu)-Lya(Boc)-Ala-Phe-NH2 liuotetaan 2,8 ml:aan trifluorietikkahappo-vesiseosta (9:1), saostetaan 1,5 tuntia huoneenlämpötilassa 30 ml: 11a kylmää dietyylieetteriä ja suodatetaan. Sakka liuotetaan 5,2 ml:aan trifluorietikkahappo-vesiseosta (95:5), pidetään 50 minuuttia 50°C:ssa, jäähdytetään huoneenlämpötilaan, lisätään 60 yl 1 M ammoniumjodidia ja jätetään 10 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Peptidiamidi saostetaan lisäämällä tipoittain 30 ml kylmää dietyylieetteriä. Suodatettu ja kuivattu peptidiamidi liuotetaan 3 ml:aan 0,1 M etikkahappoa ja jodijäämät pelkistetään lisäämällä 15 yl 1 M natriumtiosulfaattia. Saa-

R

tu liuos suodatetaan ioninvaihtopylvään (Amberlite IRA 93, asetaattimuoto 1,2 x 8 cm) läpi ja eluoidaan 0,1 M etikkahapolla. Haihdutetaan kuiviin ja jäännös liuotetaan 3 ml:aan kahdesti tislattua vettä, jätetään yön ajaksi huoneenlämpötilaan argonin alle ja saatu liuos puhdistetaan preparatiivisella HPLC:llä; olosuhteet: pylväs: Vydac 5 ym C18, 250x10 mm (The Separations Group, Hesperia, California, USA), gradientti, joka koostuu liuoksista: A (0,1 til.-% trifluorietikkahappoa vedessä) ja 25 - 30 til.-% B (0,1 % trifluorietikkahappoa asetonitriilissä) 30 minuutissa sekä A ja 30 - 40 til.-% B 5 minuutissa; läpivirtaus: 4 ml/min.; detektointi:210 nm.

es 86547 Pääpiikki havaitaan jakeista ja niiden puhtaus määritetään analyyttisellä HPLCrllä. Olosuhteet: Pylväs:

Vydac 5 Pm C18, 250x4,6 mm; gradientti A ja B: 20 -45 % B:tä 45 minuutissa; A ja B kuten edellä. Puhtaat jakeet haihdutetaan. Trifluorietikkahappo poistetaan ioninvaihdolla kuten edellä ja kaavan III mukainen CGRP II saadaan lyofilisoimalla; retentioaika edellä kuvatussa analyyttisessä HPLC:ssa 24 minuuttia. FAB/MS: MH+ 3794 (laskettu molekyylipaino 3793,4), R^ (silika-geeli) = 0,57 (n-butanoli:pyridiini:jääetikka:vesi = 35:35:7:23), R^ (selluloosa) = 0,64 (n-butanoli:pyri-diini:jääetikka:vesi = 38:24:8:30), R^ (selluloosa) = 0,55 (n-butanoli:pyridiini:väk. ammoniakki:vesi = 42: 24:4:30).

Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 10.1: Esimerkin 1 kohdassa 1.4 saatu pep tidi-hartsi käsitellään seuraavalla tavalla, jotta suojattu peptidi saadaan irrotetuksi hartsista ja terminaalinen karboksyyliryhmä amidoiduksi: Autoklaa viin sijoitetaan 325 mg peptidi-hartsia ja 10 ml dimetyyli-formamidia, tiivistetään 6 g ammoniakkia -70°C:ssa ja annetaan reagoida 20 tuntia huoneenlämpötilassa. Ammoniakki tislataan pois ja jäljelle jääneeseen suspensioon lisätään 50 ml dietyylieetteriä. Sakka suodatetaan 2 tunnin kuluttua 0°C:ssa. Suojattu peptidiamidi uutetaan jääetikalla hartsista (5x5 ml), etikkahappo poistetaan lyofilisoimalla ja jäännös suspendoidaan 20 ml:aan metanoli-vesiseosta (9:1). Kun sentrifugoidaan, pestään ja kuivataan, saadaan 77 mg suojattua peptidi-amidia .

Vaihe 10.2: Liuos, jossa on 69 mg kohdassa 10.1 saatua tuotetta 14 ml:ssa jääetikka-vesiseosta (4:1), lisätään disulfidiksi muuntamista varten huoneenlämpötilassa sekoittaen 4 minuutin aikana tipoittain liuokseen, jossa on 164 mg jodia, 34 ml jääetikkaa ja 16 ml vettä. 10 minuuttin kuluttua reaktio pysäytetään lisäämällä 1,4 ml 1 M natriumasetaattia ja 0,68 ml 86 86547 1 M askorbiinihappoa. Suolat erotetaan Biogel P2-pylväässä (2,5 x 34 cm, jääetikka:vesi (6:4)). Pepti-dipitoinen jae haihdutetaan ja lyofilisoidaan ja jäännös suspendoidaan 5 ml:aan metanolia ja liukenematon, suojattu peptidiamidi sentrifugoidaan talteen ja kuivataan.

Esimerkki 11 : 1 g H-Ala-Cye(M0B)-A8n(XANT)-Thr(BZL)-Ala-Thr(BZL)-Cys(MOB)-Val-Thr(BZL)-Hie(TOS)-Arg(TOS)-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser(BZL)-Arg(TOS)-Ser(BZL)-Gly-Gly-Met-Val-Lys{2CZ))-Ser(BZL)-Aen(XANT)-Phe-Val-Pro-Thr(BZL)-Aan(XANT)-Val-Gly-Ser(BZL)-Lys(2CZ)-Ala-Phe-MBHA-hartsi)a 1 ml anisolia ja 10 ml kuivaa fluorivetyä sekoitetaan 1 tunti 0°C:ssa teflon-laitteessa. HF tislataan pois, kuivataan suurtyhjös-sä ja jäännös uutetaan 5 kertaa 10 ml:11a dietyylieet-teriä. Peptidi uutetaan kaasuttomalla 0,1 N etikkaha-polla hartsista, laimennetaan kaasuttomalla vedellä 500 ml:ksi ja pH säädetään ammoniakilla arvoon 8,4. Kun sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa, ei merkaptoryh-miä ole enää lainkaan havaittavissa. Liuos haihdutetaan hyvin vähiin, lyofilisoidaan ja jäännös puhdistetaan pre-paratiivisella HPLC:llä, kuten esimerkissä 10 on selostettu. Saatujen jakeiden puhtaus tutkitaan ohutkerros-kromatografisesti käyttämällä silikageeliä ja n-butanoli-pyridiini-jääetikka-vesisysteemiä (35:35:7:23) (Rf = 0,57) ja tarvittaessa puhdistetaan uudestaan HPLC:llä. Yhdistetyt puhtaat jakeet haihdutetaan kuiviin tyhjössä ja jäännös lyofilisoidaan vedestä. Näin saadaan kaavan III mukainen CGRP II; R^ (selluloosa) = 0,64 (n-butanoli:pyri-diini:jääetikka:vesi = 38:24:8:30).

Lähtöaine saadaan seuraavalla tavalla:

Vaihe 11.1: 1 g MBHA-polystyreeni-hydrokloridia (divinyylibentseenillä silloitettu polystyreenihartsi, jossa muutamissa fenyyliryhmissä on amino-(4-metyyli-fe-nyyli)-metyylisubstituentti; valmistaja Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Dr., Foster City, CA 94404, USA; lataus 0,57 mmol/g) käsitellään esimerkin 1 kohdassa 1.3 kuvatussa laitteessa seuraavalla tavalla (kulloinkin 87 86547 noin 20 ml): 3 kertaa 0,5 min dimetyyliasetamidi, kaasuton, 3 kertaa 2 min 10 % di-isopropyylietyyliamiinia dimetyyli-asetamidissa, 6 kertaa 0,5 min dimetyyliasetamidi, tislattu, 1 kerta 120 min Liittäminen: 455 mg (1,7 mmol) Boc-Phe, 230 mg hydroksibentsotriatsolia, 385 mg disyklohek-syylikarbodi-imidiä seoksessa, jossa on 0,36 ml etyleenikloridia ja 4 ml dimetyyliasetamidia, 120 minuuttia huoneenlämpötilassa, 1 kerta 5 min 10 ml asetamidi-pyridiini-dimetyyliasetami-diseosta (10:10:80), 1 kerta 0,5 min dimetyyliasetamidi, kaasuton, 1 kerta 1 min isopropanoli, 2 kertaa 0,5 min etyleenikloridi, 2 kertaa 0,5 min dimetyyliasetamidi, 1 kerta 1 min isopropanoli, 3 kertaa 0,5 min etyleenikloridi-etaaniditioliseos (99:1), 2 kertaa 5 min, 1 kerta 15 min trifluorietikkahappo- etyleenikloridi-etaaniditioli (50:49:1) Boc-ryhmän poistamiseksi, 3 kertaa 0,5 min etyleenikloridi-etaaniditioli (99:1). Tämän jälkeen kierros alkaa uudestaan.

Seuraavat aminohapot kondensoidaan ketjuun peräkkäisessä järjestyksessä:

Boc-Ala, Boc-Lys(2CZ), Boc-Ser(BZL), Boc-Gly, Boc-Val,

Boc-Asn(XANT), Boc-Thr(BZL), Boc-Pro, Boc-Val, Boc-Phe,

Boc-Asn(XANT), Boc-Ser(BZL), Boc-Lys(2CZ), Boc-Val, Boc-Met,

Boc-Gly, Boc-Gly, Boc-Ser(BZL), Boc-Arg(TOS), Boc-Ser(BZL), Boc-Leu, Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Ala, Boc-Leu, Boc-Arg(TOS), Boc-Hla(TOS), Boc-Thr(BZL), Boc-Val, Boc-Cys(MOB), Boc-Thr(BZL), Boc-Ala, Boc-Thr(BZL), Boc-Asn(XANT), Boc-Lye(MOB) ja Boc-Ala. Liitosreaktion täydellisyys tutkitaan kvalitatiivisesti Kaiserin kokeella. Jos koetulos on positiivinen, liittäminen toistetaan. Kun Boc-ryhmä on poistettu viimeisestä alaniinista, hartsi kuivataan suurtyhjössä.

Claims (8)

88 865 4 7

1. Menetelmä sydänverenkiertoon tai luuston aineenvaihduntaan farmakologisesti vaikuttavan peptidin valmistamiseksi, jossa on korkeintaan 90 aminohappoa käsittävän suuremman peptidin osasekvenssinä tai yksinomaisena sekvenssinä kaavan I mukainen aminohapposekvenssi -AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSer-ArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySer- (I) LysAlaPhe- jolioin kysteiinitähteet voivat muodostaa molekyylinsisäi-siä tai molekyylien välisiä disulfidisiltoja, tai tällaisen yhdisteen johdannaisen valmistamiseksi, jossa on ami-doitu terminaalinen karboksyyliryhmä ja/tai asyloitu terminaalinen aminoryhmä, tai tällaisen yhdisteen suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) tällaisen yhdisteen sisältämä amidisidos muodostetaan saattamalla tämän yhdisteen osa, jossa on vapaa karboksyyliryhmä, tai joka on tämän osan reaktiokykyinen karboksyy-lihappojohdannainen, reagoimaan vapaan aminoryhmän sisältävän komplementaarisen osan tai sen reaktiokykyisen johdannaisen kanssa, jolloin mainittujen osien vapaat funktionaaliset ryhmät ovat reaktioon osallistuvia ryhmiä lukuunottamatta reaktion aikana tarvittaessa suojattuna, ja mahdollisesti läsnä olevat suojaryhmät poistetaan, tai b) edellä mainitun yhdisteen valmistamiseksi, jossa on mo-lekyylinsisäinen tai molekyylien välinen disulfidisilta, jokin edellä mainituista yhdisteistä, jossa kysteiinitäh-teiden merkaptoryhmät ovat vapaassa muodossa, tai jonka sisältämien merkaptoryhmien suojaryhmät poistuvat reaktio-olosuhteissa, hapetetaan sopivalla hapettimella, tai S r- / »*? 89 b 6 o ^ / c) tällaisesta peptidistä, peptidiamidista tai näiden n-asyloidusta johdannaisesta, jossa vähintään yksi funktionaalinen ryhmä on suojatussa muodossa, poistetaan suoja-ryhmä, tai d) edellä mainittujen peptidien valmistamiseksi viljellään E. coll -soluja, jotka ovat transformoituneet ilmentämis-vektorilla, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin säätelemän, haluttua aminohappojärjestystä koodittavan DNA-sekvenssin, nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, tuote vapautetaan tarvittaessa E. coli -soluista ja eristetään ja mahdollisesti saatu dimeeri tai polymeeri käsitellään tarvittaessa disulfidisidosten katkaisuun soveltuvalla pelkisti-mellä ja saatu pelkistetty tuote käsitellään tarvittaessa disulfidisidosten uudelleenmuodostamiseen soveltuvalla ha-pettimella, tai e) jonkun edellä mainitun peptidiamidin valmistamiseksi sellainen peptidi, jossa halutun peptidiamidin aminohappo-sekvenssin C-päässä on lisäaminohappo AS°, joka voidaan katkaista entsymaattisesti halutun peptidiamidin terminaalisen amidiryhmän NH2-ryhmäksi tai substituoida ammoniakilla sopivan entsyymin läsnäollessa, käsitellään sopivan entsyymin avulla mahdollisesti ammoniakin läsnäollessa, ja haluttaessa missä tahansa menetelmävaihtoehdossa a) - e) saatu suola muutetaan vapaaksi yhdisteeksi tai saatu vapaa yhdiste muutetaan suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan siten, että saadaan valmistetuksi korkeintaan 72 aminohappotähdettä ja kaavan II mukaisen sekvenssin 90 86547 AspTyrValGlnMetLysAlaSerGluLeuLysGlnGluGlnGluThr-GlnSerSerSerSerAlaAlaGlnLysArgAlaCysAsnThrAlaThr-CysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyMet- (II) ValLysSerAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheGly-ArgArgArgSerAspLeuGluAla sisältävä peptidi tai sen johdannainen, jossa on C-terminaalinen karbamoyyliryhmä ja/tai N-terminaalinen asetyyli-aminoryhmä, tai näiden suola.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan siten että saadaan valmistetuksi kaavan lii mukainen peptidiamidi tai sen suola S-S Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser- (III) Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan siten, että saadaan valmistetuksi kaavan XV mukainen peptidi tai sen suola S-S Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys- (XV) Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-Tyr-OH.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan siten, että saadaan valmistetuksi kaavan XIX mukainen peptidi tai sen suola 91 86547 s--s Ala-Cy-Asn-Thr-Ala-Thr-Cy-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys— (XIX) Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-Gly-OH.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan siten, että saadaan valmistetuksi farmaseuttisesti käyttökelpoinen suola.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmävaihtoehdos-sa d) mainittu DNA-sekvenssi sisältää kaavan IV mukaisen sekvenssin d(GCETGYAAYACXGCEACXTGYGTXACXCAYNGKYTZGCEGGXYTZYTZ AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeu QRSNGKQRSGGXGGXATGGTXAAMQRSAAYTTLGT XCCXACXAAYGTX (IV) SerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThrAsnVal GGXQRSAAMGCETTL) GlySerLysAlaPhe johon on merkitty vain koodittavan säikeen deoksinukleoti-disekvenssi alkaen 5'-päästä ja alle kunkin tripletin koodittansa aminohappo, ja jossa a = adenosyyli, T = tymidyyli, G = guanosyyli, C = sytidyyli, E = A, T, C tai G, K = A, T, C tai G, kun N = C, tai A tai G, kun N = A, L = T tai C, 92 86547 M = A tai G, N = A tai C, Q = T tai A, R,S: R = C ja S = A, T, C tai G, kun Q = T; tai R = G ja S = T tai C, kun Q = A, X = A, T, C tai G, Y = T tai C ja Z = A, T, C tai G, kun Y = C, tai A tai G, kun Y = T, ja ennen sulkeita oleva "d" tarkoittaa, että sulkeissa olevat nukleosidit ovat 2-deoksi-nukleosideja.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmävaihtoehdossa d) mainittu DNA-sekvenssi sisältää kaavan ivb mukaisen DNA-sekvenssin, jolloin on merkitty näkyviin vain koodittavan säikeen sekvenssi 5'-päästä alkaen ja ymmärtämisen helpottamiseksi myös kunkin tripletin koodittama aminohappo AlaCysAsnThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeu d(GCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGCTGGTCTG LeuSerArgSerGlyGlyMetValLysSerAsnPheValProThr (IVb) CTGTCTCGTTCTGGTGGTATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGACC AsnValGlySerLysAlaPhe AACGTTGGTTCTAAAGCTTTC). 93 86 547