FI86744C - Foerfarande foer framstaellning av eglinfoereningar - Google Patents

Description

86744

Menetelmä egliiniyhdisteiden valmistamiseksi Förfarande för framställning av eglinföreningar

Keksintö perustuu egliini-nimisiä proteaasien inhi-biittoreita koodittaviin DNA-sekvensseihin, tällaisia DNA-sekvenssejä sisältäviin yhdistelmävektoreihin ja tällaisilla yhdistelmävektoreilla transformoituneisiin isäntiin. Tällaiset transformoituneet isännät tuottavat uusia egliiniyhdisteitä ja keksintö koskee erityisesti menetelmää egliinien valmistamiseksi transformoituneiden mikro-organismien avulla.

Saksalaisesta hakemusjulkaisusta no. 2808396 tunnetaan kaksi verijuotikkaasta (Hirudo medicinalis) eristettyä proteaasien inhibiittoria, joista käytetään nimiä egliini B ja egliini C (Eglin B ja Eglin C). Kumpikin näistä polypeptideistä koostuu 70 aminohaposta, niiden molekyylipaino on noin 8100 ja ne ovat kymotryp-siinin, subtilisiinin, eläinten ja ihmisen granulosyyt-tien elastaasin ja katepsiini G:n sekä syöttösolujen ky-maasiproteaasin voimakkaita inhibiittoreita (1). Trypsii-ninkaltaiset proteaasit inhiboituvat vähemmän voimakkaasti .

Egliini C:n primäärirakenne on seuraava (2):

ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnA]aArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal ValAsnHisValProHisValGly

Egliini C ei, päinvastoin kuin useimmat tunnetut proteaasien inhibiittorit, sisällä disulfidisiltaa ja se on myös pienproteiiniksi epätavallisen vastustuskykyinen happojen, emästen ja lämmön denaturoivalle vaikutukselle ja proteolyyttiselle hajoamiselle. Egliini B:n primääri-rakenne eroaa egliini C:n vastaavasta siten, että aminohappo 35, tyrosiini, on korvattu histidiinillä.

2 86744

Egliinit kuuluvat voimakkaimpiin nykyään tunnettuihin ihmisen ja eläinten granylosyyttien sekä ihmisen gra-nulosyyttien katepsiini G:n ja subtilisiinityyppiä olevien bakteeriproteaasien inhibiittoreihin. Näiden solupro-teaasien kontrolloimaton tai liiallinen vapautuminen organismissa voi voimistaa tulehdusilmiötä ja kudosten hajoamista epäspesifisen proteolyysin seurauksena. Näin varsinkin siksi, että nämä solujensisäisestä ravitsemuksesta vastaavat entsyymit toimivat fysiologisessa ympäristössä (neutraalin ja heikosti emäksisen välillä) optimaalisesti ja kykenevät nopeasti tuhoamaan ja inakti-voimaan luontaisia kudosaineita (esim. elastiini) ja nesteiden tekijöitä (esim. verenhyytymis- ja komplementtite-kijöitä). Tähän mennessä tunnettujen ominaisuuksiensa perusteella ovat egliinit hyvin mielenkiintoisia lääketieteellisen hoidon kannalta (tulehdusten hoito, verenmyrky-tysshokin hoito, keuhkolaajentuman hoito, mucoviscidosik-sen hoito jne.).

Verijuotikkaissa muodostuu egliinejä vain hyvin vähäisiä määriä (noin 16 μg/juotikas). Tästä syystä on eg-liinien eristäminen ja puhdistaminen verijuotikkaista erittäin aikaavievää ja kallista eikä sitä voida tehdä kaupallisessa mittakaavassa.

Yhdistelmä-DNA-tekniikassa (tai geenitekniikassa) viime aikoina tapahtuneen suuren edistyksen myötä on tullut mahdolliseksi valmistaa mitä erilaisimpia fysiologisesti aktiivisia polypeptidejä.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on geeniteknisin keinoin saada aikaan ilmentämissysteemi, jolla voidaan mikrobien avulla tuottaa egliinejä teollisessa mittakaavassa. Tämä tehtävä on ratkaistu valmistamalla yh-distelmävektoreita, jotka sisältävät egliiniä koodittavan DNA-sekvenssin, jota ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee sillä tavalla, että tällä yhdistelmävektorilla transformoitunut isäntä tuottaa egliiniä.

3 86744

Egliiniä koodittavien DNA-sekvenssien valmistaminen

Keksintö perustuu DNA-sekvensseihin, jotka koodattavat egliiniä, esim. egliini B:tä tai egliini C:tä, sekä näiden osia.

Yleisnimityksellä "egliinit" tarkoitetaan tämän keksinnön puitteissa, ellei tarkemmin ole määritelty, pro-teinaasieninhibiittoriaktiivisuuden omaavia polypeptide-jä, joiden primäärirakenteet ovat pitkälle samat kuin egliini B:n tai egliini C:n primäärirakenne (rakennehomo-logia yleensä korkeintaan 80 %:inen), mutta jotka voivat olla N-päästään muunnettuja, esim. treoniinistä Na-asety-loituja.

Edelleen tämä keksintö perustuu menetelmiin sellaisten DNA-sekvenssien valmistamiseksi, jotka koodittavat egliiniä, esim. egliini B:tä tai erityisesti egliini C:tä, ja näiden osien valmistamiseksi siten, että juotik-kaan perimä-DNA:sta eristetään egliinin rakennegeeni tai juotikkaan mRNA:sta valmistetaan komplementaarinen kaksi-säikeinen egliini-DNA (egliini-ds-cDNA), tai vastaava egliinin rakennegeeni tai sen osia valmistetaan kemiallisilla ja entsymaattisilla menetelmillä.

Perimän egliini-DNA ja egliinin kaksisäikeinen cDNA saadaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Niinpä perimän egliini-DNA saadaan esim. juotikasgeenipankista, joka sisältää egliinigeenin, siten, että juotikkaan DNA-palaset kloonataan mikro-organismiin ja egliini-DNA:ta sisältävät kloonit tunnistetaan, esim. pesäkehybridisoinnilla käyttämällä radioaktiivisesti merkattua, egliini-DNA:lie spesifistä oligodeoksinukleotidia, joka sisältää vähintään 15, mielellään 15 - 30 deoksinukleotidia. Näin saadut DNA-palaset sisältävät egliinigeenin ohella tavallisesti muita ei-toivottuja DNA-jaksoja, jotka voidaan poistaa käsittelemällä sopivilla ekso- tai endonukleaaseilla.

Kaksisäikeinen egliini-cDNA voidaan valmistaa esim. siten, että eristetään mRNA sopivista, mielellään eglii-ninvalmistukseen indusoiduista juotikassoluista, näin saatu mRNA-seos rikastetaan sinänsä tunnetulla tavalla 4 86744 egliini-mRNA:n suhteen, tätä mRNA:ta käytetään templaat-tina yksisäikeisen cDNA:n valmistuksessa, tästä syntetisoidaan RNA:sta riippuvaisen DNA-polymeraasin avulla kaksisäikeinen cDNA, joka kloonataan sopivaan vektoriin. Egliini-cDNA:ta sisältävät kloonit tunnistetaan esim. edellä kuvatulla tavalla käyttämällä pesäkehybridisointia ja radioaktiivisesti merkattua, egliini-DNA:lie spesifistä oligodeoksinukleotidia.

Tällä tavalla saadun perimän egliini-DNA:n tai eg-liini-cDNA:n 5'- ja 3'-päähän liitetään mielellään synteettiset sidoksenmuodostajaoligodeoksinukleotidit, jotka sisältävät tunnistussekvenssin yhdelle tai useammille restriktioendonukleaaseille ja näin ollen helpottavat liittämistä sopiviin vektoreihin. Egliini-DNA:n tai -cDNA:n 5’-päähän sijoitettavassa sidoksenmuodostajamole-kyylissä pitää lisäksi olla luennanaloitussignaali (ATG). Luennanaloitussignaalin pitää sijaita siten, että eglii-nin ensimmäisen aminohapon kodoni seuraa sitä välittömästi .

Koska luontaisen egliinigeenin rakennetta ei tunneta ja sen syntetisointi nykyaikaisilla synteesimenetelmillä tarjoaa etuja varsinkin ajankäytössä, on viimeksimainittu tämän keksinnön edullinen toteutustapa.

Egliinigeenin kemiallinen synteesi Välivaiheena keksinnön toteuttamiseksi suoritetaan egliinin rakennegeenin tai sen osien valmistus, jolloin syntetisoidaan kemiallisesti osia egliinigeenin koodattavasta ja komplemetaarisesta säikeestä ja saadut segmentit täydennetään entsymaattisesti egliinin rakennegeeniksi tai sen osiksi.

Edelleen keksintö perustuu kaksisäikeisiin DNA-ket-juihin, jotka koodittavat egliiniä, esimerkiksi egliini B:tä tai egliini C:tä, tai niiden osia.

Mainitut DNA-ketjut sisältävät egliinien kodonien lisäksi luennanaloitussignaalit ja luennanlopetussignaa-lit, jotka mahdollistavat ilmentymisen sopivissa isän- 5 86744 täsoluissa, esimerkiksi E. colissa, ja lisäksi päissä nukleotidisekvenssejä, jotka soveltuvat vektoriin liittämiseen.

Keksinnön edullisessa toteutustavassa sisältää DNA 5'-päässä restriktioentsyymin katkaisukohdan ja sitä seuraa luennanaloitussignaali, egliinin kodonit, jotka mahdollisesti sisältävät yhden tai useampia restriktioent-syymien katkaisukohtia, luennanlopetussignaalin ja 3'-päässä restriktioentsyymin katkaisukohdan. Keksinnönmu-kaisesti käytettäviä restriktioentsyymejä ovat esimerkiksi EcoRI, BamHI, Hpall, PstI, Aval tai Hindlll.

Egliiniä koodittava kaksisäikeinen DNA koostuu yleisesti kaavan I mukaisesta nukleotidisekvenssistä ja komplementaarisesta nukleotidisekvenssistä

., Met B

5 (X) ATG D

n

Pro Glu Vai Vai Gly Lys Thr Vai Asp Gin

CCX GAM GTX GTX GGX AAM ACX GTX GAY CAM

Ala Arg Glu Tyr Ph e Thr Len llis Tyr Pro

CCX LGN GAM TAY TTY ACX YTZ CAY TAY CCX

Gin Tyr Asp Vai W Phe Leu Pro Glu Gly

CAM TAY GAY GTX YAY TTY YTZ CCX GAM GGX

Ser Pro Vai Thr Leu Asp Leu Arg Tyr Asn

QRS CCX GTX ACX YTZ GAY YTZ LGN TAY AAY

Arg Vai Arg Vai Phe Tyr Asn Pro Gly Thr

LGN GTX LGN GTX TTY TAY AAY CCX GGX ACX

Asn Vai Vai Asn B1 NON , AAY GTX GTX AAY D' TMK (X) 3 π (I), jossa on esitetty 5'-päästä alkava nukleotidisekvenssi ja ymmärtämisen helpottamiseksi kunkin tripletin koodittamat aminohapot on merkitty esiin, ja jossa D tarkoittaa suoraa sidosta tai egliinin N-pään aminohappoja koodittavaa 6 86744 nukleotidisekvenssiä ja B tarkoittaa suoraa sidosta tai vastaavia N-pään aminohappoja, jotka voidaan valita seu-raavien joukosta

Ser Phe Leu Lye Ser Phe Ser Glu Leu Lye

QRS TTY , YTZ AAM QRS TTY , QRS GAN YTZ AAM

Ser Phe Phe Gly Ser Glu Leu Lye Ser Phe

QRS TTY , TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY

tai

Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu Lys Ser Phe

A CX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY

ja D' tarkoittaa suoraa sidosta tai egliinin C-pään aminohappoja koodittavaa nukleotidisekvenssiä ja B' tarkoittaa suoraa sidosta tai vastaavia C-pään aminohappoja, jotka voidaan valita seuraavien joukosta

His Vai His Vai Pro His CAY GTX , CAY GTX CCX CAY tai

His Vai Pro His Vai Gly

CAY GTX CCX CAY GTX GGX

joissa symboleilla on seuraavat merkitykset: A deoksiadenosyyli, T tymidyyli, G deoksiguanosyyli, C deoksisytidyyli,

X A,T,C tai G

Y T tai C, Z A, T, C tai G, kun Y = C, tai Z = A tai G, kun Y = T, Q T tai A, R C ja S = A, T, C tai G, kun Q = T, 7 86744 tai R = G tai S = T tai C, kun Q = A, M A tai G,

L A tai C

N A tai G, kun L = A, tai N = A, T, C tai G, kun L = C, K A tai G, kun M = A, tai K = A, kun M = G, W Tyr tai His, ja (X)n ja (X)a ovat kumpikin mielivaltaisia nukleotidi-sekvenssejä, joissa n ja m ovat suurempia kuin 3, mutta pienempiä kuin 100, erityisesti suurempia kuin 5 ja pienempiä kuin 12, ja jotka restriktioentsyymit tunnistavat ja kykenevät katkaisemaan, sekä tällaisen kaavan I mukaisen kaksisäikeisen DNA:n osia.

Ensi sijassa tämä keksintö perustuu egliiniä koodattavaan kaavan I mukaiseen kaksisäikeiseen DNA:hän, jossa D on nukleotidisekvenssi ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY ja D’ on nukleotidisekvenssi CAY GTX CCX CAY GTX GGX ja muut symbolit ovat edellä kaavan I yhteydessä määriteltyjä.

Edullisessa toteutustavassa sisältää DNA-sekvenssi 5'-päässä EcoRI:n tunnistuskohdan, keskellä Hpallrn tun-nistuskohdan ja 3’-päässä BamHIrn tunnistuskohdan.

Keksintö perustuu ensi sijassa sellaiseen kaksisäikeiseen DNA:han, joka sisältää E. colin suosimia triplet-tejä, jotka koodittavat egliinien aminohappoja. Tällaisia triplettejä ovat seuraavat: glysiini (Gly) GGT

Alaniini (Ala) GCT

Väliini (Vai) GTT

Leusiini ( Leu) CTG

Seriini (Ser) TCT

Treoniini (Thr) ACT

Fenyylialaniini (Phe) TTC Tyrosiini (Tyr) TAC

Metioniini (Met) ATG

Asparagiinihappo (Asp) GAC

8 86744

Glutamiinihappo (Glu) GAA Lysiini (Lys) AAA

Arginiini (Arg) CGT

Histidiini (His) CAT

Proliini (Pro) CCG

Glutamiini (Gin) CAG

Asparagiini (Asn) AAC

Esillä olevassa keksinnössä käytetään fenyylialanii-nille myös kodonia TTT ja proliinille kodonia CCA tai CCT, jotta 5'-päässä olevan EcoRI:n tunnistuskohdan, 3'-päässä olevan BmHI:n tunnistuskohdan ja HpaII:n tunnistuskohdan lisäksi ei mainituille restriktioentsyymeille ole tarjolla muita katkaisukohtia. Edullinen lopetussig-naali (NON) on kodoni TAG.

Edullinen egliini C:n geenin toteutustapa edelläkuvatulla tavalla on kaavan Ha mukainen DNA

MetThrGIuPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRl)

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGGAAGGT CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCCTTCCA

(Hpall)

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgVal ArgValPheTyr AsnProGl yThrAsnVal TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG

CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC

(BamHl) (Ila),

ja edullinen egliini B:n geenin toteutustapa on kaavan Hb mukainen DNA

9 86744

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRl)

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValHisPheLeuProG]uGly GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGGAAGGT CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCCTTCCA

(Hpall)

SerProValThrLeuAs pLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG

CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC

(BamHl) (lib), joissa A, T, G ja C ovat kaavan I yhteydessä määriteltyjä, ja joissa ymmärtämisen helpottamiseksi on merkitty esiin aminohapot, joita kukin tripletti koodittaa, sekä restriktioentsyymien katkaisukohdat.

Edelleen voidaan käyttää egliinigeenien kaksisäi-keisiä DNA-jaksoja, joiden päät voidaan leikata restrik-tioentsyymeillä, ja jotka voidaan koota täydellisiksi eg-liinigeeneiksi. Tällaiset egliinigeenien kaksisäikeiset DNA-jaksot sisältävät erityisesti 30 - 70 emäsparia.

Keksinnössä voidaan käyttää esimerkiksi kaavan lila mukaista DNA-jaksoa /F1(C)/, kaavan lila' mukaista DNA:ta /FX(C')/, kaavan lila" mukaista DNA:ta /F^C")/, kaavan Illb mukaista DNA:ta /F1(B)/ ja kaavan IV mukaista DNArta (F2): 10 86744

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTT AAGTACTGACTT AAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

FjiC) (Ilia)

MetSerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

As pGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

FjCC') (Ilia')

MetLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

As pGlnAlaArgGl uTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

F^C") (Ilia")

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

As pGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValHisPheLeuPro

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC

fa(b) (Ulb)

ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgVa1ArgValPheTyrAsnProGly CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGT GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCA

ThrAsnValValAsnHisValProHisValGlyNON

ACTAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG

TGATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC

F2 (IV) il 86744

Keksinnössä voidaan käyttää myös egliinigeenien yk-sisäikeisiä DNA-jaksoja, jotka voidaan kemiallisilla ja/tai entsymaattisilla menetelmillä koota egliinigee-neiksi. Ensi sijassa käytetään yksisäikeisiä DNA-jaksoja, joissa on yli 20 nukleotidia, erityisesti 20 - 70 nukleotidia.

Erityisesti keksintö perustuu esimerkeissä kuvattuihin yksisäikeisiin ja kaksisäikeisiin DNA-jaksoihin.

S.A. Narang (11) on esittänyt yhteenvedon DNA:n synteesimenetelmistä. Ennestään tunnetuilla synteesi-menetelmillä voidaan valmistaa noin 20 emäksen pituisia polynukleotideja hyvällä saannolla, hyvin puhtaina ja suhteellisen lyhyessä ajassa. Sopivasti suojatut nukleotidit liitetään yhteen fosfodiesterimenetelmällä (12), tehokkaammalla fosfotriesterimenetelmällä (13) tai fos-fiitti-triesterimenetelmällä (14). Kiinteäfaasimenetelmä mahdollistaa oligo- ja polynukleotidien yksinkertaisemman synteesin, kun nukleotidiketjut sidotaan sopivaan polymeeriin. Itakura et ai. (15) käyttävät kiinteäfaasimene-telmässä yksittäisten nukleotidien tilalla fosfotriesterimenetelmällä yhteenliitettyjä trinukleotideja, jotka voidaan lyhyessä ajassa ja hyvillä saannoilla kondensoida esimerkiksi 31 emäksen polynukleotidiksi. Varsinainen . . kaksisäikeinen DNA voidaan rakentaa kemiallisesti valmis- ·* tetuista lyhyistä jaksoista entsymaattisesti. Khorana et ai. (16) käyttävät tähän tarkoitukseen päällekkäin ulot--·- tuvia kummankin DNA-säikeen polynukleotidisekvenssejä, jotka parikkiemästen muodostumisen kautta pysyvät oikeal-la tavalla yhdessä ja sen jälkeen liittyvät yhteen ke-: : : miallisesti DNA-ligaasientsyymin vaikutuksesta. Toinen mahdollisuus on inkuboida kulloinkin kummankin DNA-säi-: keen polynukleotidisekvenssiä, joissa on lyhyet toistensa yli ulottuvat päät, neljän tarvittavan deoksinukleosidit-rifosfaatin ja DNA-polymeraasin, esim. DNA-polymeraasi I:n, polymeraasi I:n Klenow-palasen tai AMV:n (linnun myeloblastosis-virus), läsnäollessa. Tällöin kumpikin polynukleotidisekvenssi pysyy parikkiemästen muodostuksen 12 86744 seurauksena oikeassa järjestyksessä ja entsyymi suorittaa täydentämisen tarvittavilla nukleotideilla täydelliseksi kaksisäikeiseksi DNA:ksi (17). Itakura et ai.

(18) selostavat, kuinka tällä periaatteella voidaan saada DNA-polymeraasi I:n (Klenow-palanen) läsnäollessa neljästä kemiallisesti syntetisoidusta, 39 - 42 emäksen pituisesta palasesta rakennetuksi ihmisen leukosyytti-interferoni j:n geenin 132 emäsparin pituinen jakso, jolloin saavutetaan 40 % säästö kemiallisissa synteeseissä verrattuna menetelmään, jossa käytetään pelkkää ligaasia.

Erityisesti valmistetaan sellaisia DNA-ketjuja, jotka koodittavat egliinejä ja jotka soveltuvat ilmentymiseen isäntäsoluissa, ja joiden päät mahdollistavat liittymisen vektoreihin, sekä näiden osia siten, että a) sopivasti suojattu deoksinukleosidi sidotaan kiinteään kantaja-aineeseen, b) valmistetaan sopivasti suojattuja di-, tri- tai tetra-nukleotideja fosfotriesteri- tai fosfiittimenetelmäl-lä, c) kantaja-aineeseen sidottuun deoksinukleosidiin tai oligodeoksinukleotidiin liitetään fosfotriesteri- tai fosfiittimenetelmää käyttäen sopivasti suojatut mono- tai (kohdan b mukaan valmistetut) di-, tri- tai tetranukleo-tidit, d) kohdassa c saadut kantaja-aineeseen sidotut oligo-deoksinukleotidit, joiden pituus on noin 20 - 70 emästä, irrotetaan kantaja-aineesta, mahdollisesti puhdistetaan, vapautetaan suojaryhmistä ja niiden vapaat 51-pään hyd-roksiryhmät fosforyloidaan, el) 2 oligodeoksinukleotidia, joiden kunkin pituus on noin 20 - noin 70 emästä, ja jotka muodostavat koodattavan ja komplementaarisen säikeen ja sisältävät vähintään 3, mielellään 8-15 päällekkäin ulottuvaa emäsparia, liitetään rinnakkain pariksi ja täydennetään DNA-polyme-raasin avulla neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa kaksisäikeisiksi DNA-jaksoksi (egliinigeenin osia), i3 86744 ja mahdollisesti 2 kaksisäikeistä DNA-jaksoa, joissa on sopivat kohdan d mukaisesti fosforyloidut päät, liitetään yhteen egliinin rakennegeeniksi tai 2 saatua kaksisäikeistä DNA-jaksoa alakloonataan sopiviin vektoreihin, sen jälkeen fosforyloidaan kohdan d mukaisesti ja liitetään ligaasin avulla egliinin rakennegeeniksi, tai e2) vaihtoehtoisesti 2 oligodeoksinukleotidia koodattavasta ja komplementaarisesta säikeestä, pituudeltaan esim. 20 - 70 emästä ja kukin sisältäen vähintään 3, mielellään 8-15 päällekkäin ulottuvaa emäsparia, liitetään rinnakkain pariksi, täydennetään DNA-polymeraasilla neljän deoksinukleotiditrifosfaatin läsnäollessa ja saadut palat liitetään ligaasilla egliinin rakennegeeniksi.

Menetelmä DNA-ketjujen valmistamiseksi on sinänsä tunnettu, mutta mahdollistaa egliiniä koodittavien DNA-ketjujen valmistuksen vasta oikeiden olosuhdeyhdistelmien ja keksinnöllisesti oleellisten parannusten kautta.

Vaiheessa a) voidaan käyttää mitä erilaisimpia kiinteitä kantaja-aineita, kuten ristisidosmäärältään ja tur-poamiskyvyltään vaihtelevia polystyreenejä, polyakryyli-amideja, polyakryyliamidikopolymeerejä, epäorgaaniselle materiaalille, kuten piimaalle, silikageelille tai alok-sille, levitettyjä polyamideja tai funktionalisoituja silaaneja. Keksinnön edullisessa toteutustavassa käytetään kiinteinä kantaja-aineina ristiliitoksilla varustettuja polystyreenejä, joihin liitetään kiinnitysryhmien ("spacer"), jotka voivat olla 2-12 hiiliatomia sisältäviä alkyleeniryhmiä, jotka ovat 1-5 polaarisen, kah-denarvoisen funktionaalisen ryhmän, kuten imino, okso, tio, oksokarbonyyli tai amidokarbonyyli, keskeyttämiä, kautta sinänsä tunnetulla tavalla deoksinukleosidi, jonka 5'-OH-ryhmä on suojattu. Erittäin edullista on saattaa kaavan V mukainen, 5'-asemastaan ja mahdollisesti emäsosastaan suojattu nukleosidi, jossa R1 on hapolla lohkaistavissa oleva suojaryhmä, kuten triaryylimetyylisuo-jaryhmä, esim. 4-metoksitrityyli- tai 4,4'-dimetoksitri-tyyliryhmä, tai trialempialkyylisilyylisuojaryhmä, esim.

14 86744 tert.-butyylidimetyylisilyyliryhmä, ja B on mahdollisesti suojattu emäs, joka voidaan valita tymyylin, sytosyylin, adenyylin ja guanyylin joukosta, reagoimaan meripihka-happoanhydridin kanssa mahdollisesti emäksen, kuten py-ridiinin, trietyyliamiinin tai dimetyyliaminopyridiinin läsnäollessa, jonka jälkeen seuraa reaktio 0,5-2 prosentilla divinyylibentseeniä ristisidotun, aminometyloi-dun polystyreenin kanssa käyttämällä apuna karboksyyli-happotähdettä aktivoivaa reagenssia, mielellään N-hydrok-simeripihkahappoimidiä tai p-nitrofenolia, ja vedensito-ja-ainetta, kuten karbodi-imidiä, esim. disykloheksyyli-karbodi-imidiä (kaavio 1).

Reaktio suoritetaan inertissä, ei-proottisessa liuottimessa, esim. pyridiinissä, tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, etikkahapon etyyliesterissä, kloroformissa, metyleenikloridissa, dimetyyliformamidissa tai dietyyli-asetamidissa tai jossakin näiden seoksessa, huoneenlämpötilassa tai hieman kohotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. lämpötila-alueella noin -10 - noin 50 °C, mielellään huoneenlämpötilassa, ja reaktio vettä-sitovan reagenssin läsnäollessa voi tapahtua mielellään myös alemmassa lämpötilassa, esim. noin 0°C:ssa.

li 15 86744

Kaavio 1 0 li i'\

B \ / B

II

o

-OH-->· —OCCH-CH COOH

R u KO li 2 2 \ \ 0 & · (V) o

II

/\^ 0—0 o - · / \ / \ 1. HO-N | , o N=C=H—o o \ / v/ v/

II

O

• — · / \ 2. H NCH —· •-Dölvstyreeni 2 2 \ / -

B

! / \ R O —OCCH CH CNHCH — · ·— polystyreeni \ Il 2 2II 2 \ / • o o ·=· (VI) ie 86744

Di-, tri- tai tetranukleotidien valmistuksessa vaiheen b mukaisesti saatetaan 5'-asemastaan ja mahdollisesti emäsosastaan suojatut, kaavan V mukaiset nukleosidit, jossa kaavassa R1 ja B ovat edellä määriteltyjä, reagoimaan mahdollisesti vettäsitovan aineen läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa kaavan VII mukaisen aktivoidun fos-foesterin kanssa, jossa kaavassa kukin ryhmistä X1 ja X2 voi toinen toisestaan riippumatta olla hydroksi tai siitä johdettu suola, halogeeni, imidatsolyyli, 1,2,4-triatsol- 1-yyli, tetratsolyyli tai 1-bents-triatsolyylioksi ja X2 voi lisäksi olla 2-syanoetyylioksi, 2-trihalogeenietyy-lioksi, 2-aryylisulfonyylietyylioksi, 2-alempialkyylitio-etyylioksi, 2-aryylitioetyylioksi tai 2-(4-nitrofenyyli)-etyylioksi, ja R2 on emäksellä tai nukleofiilillä, kuten ammoniumhydroksidillä, tiofenolaatilla tai aryylialdoksi-maatilla, poistettavissa oleva suojaryhmä, kuten fenyyli, joka voi olla substituoitu halogeenilla, nitrolla ja/tai alemmalla alkyylillä, metyyli tai bentsyyli, joka voi olla substituoitu nitrolla, tai metalli-ioneilla poistettavissa oleva suojaryhmä, kuten 8-kinolyyli tai 5-kloo-ri-8-kinolyyli.

Sitten saatetaan näin valmistettu kaavan VIII mukainen yhdiste, jossa R1, x2 ja R2 ovat edellä määriteltyjä, ensin reaqoimaan mahd. 2-substituoidun etanolin kanssa, joka muuntaa ryhmän X2 ryhmäksi OR3, jossa R3 on syanoetyy-li, 2-trihalogeenietyyli, 2-aryylisulfonyylietyyli, 2-alempi-alkyylitioetyyli, 2-aryylitioetyyli tai 2-(4-nit-rofenyyli)-etyyli, ja sen jälkeen poistetaan suojaryhmä R1 ja näin saatu kaavan IX mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan Vili mukaisen toisen yhdisteen kanssa mahdollisesti vedenpoistoaineen läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa niin, että saadaan dinukleotidi X (kaavio 2). Mahdollisesti muunnetaan kaavan Vili mukainen yhdiste emäksen ja veden kanssa tapahtuvalla reaktiolla toiseksi kaavan Vili mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X2 on hydroksi tai siitä johdettu suola.

Reaktiot suoritetaan jossakin edellämainituista 86 744 inerteistä liuottimista huoneenlämpötilassa tai hieman korotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. huoneenlämpötilassa .

Suojaryhmä R1 poistetaan esim. hapon, kuten mineraa-lihapon, esim. suolahapon tai rikkihapon, karboksyyliha-pon, esim. etikkahapon, trikloorietikkahapon tai muurahaishapon, sulfonihapon, esim. metaani- tai p-tolueeni-sulfonihapon, tai erityisesti Lewis-hapon, esim. sinkki-kloridin, sinkkibromidin, alumiinikloridin, dialkyyli-alumiinihalogenidin, esim. dibutyyli- tai dietyylialumii-nikloridin, tai booritrifluoridin avulla 10 - 50°C:ssa, erityisesti huoneenlämpötilassa. Kun käytetään dialkyy-lialumiinihalogenidia, tapahtuu poistuminen lipoiiilises-sä liuottimessa, erityisesti tolueenissa, ja käytettäessä jotakin muuta mainituista Lewis-hapoista, tapahtuu poistuminen liuotinseoksessa, joka koostuu halogeenihiilive-dystä, kuten metyleenikloridista, ja alemmasta alkoholista, kuten etanolista tai isopropanolista.

B B B

Ooo 1 1 II 2 1 II 2 II 3

R 0 -OH + X -P-X---> r‘o -0-P-X -> HO -O-P-0RJ

\ I 2 \ I 2 \ I 2 o 0R · OR o OR"4

V VII VIII IX

B1 B2 0 0

Il II 3

VIII + IX -> -0-P -0-P-0R X

! 2I\ I 2

R O R O 0 0R

\ \ • ·

Menetelmä kaavan X mukaisten dinukleotidien valmistamiseksi kattaa myös kaavan V mukaisen nukleosidin, jossa kaavassa R1 ja B ovat edellä määriteltyjä, reaktion is 8 6 7 44 kaavan VIIA mukaisen fosfiitin kanssa, jossa kaavassa X1 on halogeeni, erityisesti kloori, tai dialempialkyyliami-no, erityisesti dimetyyliamino tai di-isopropyyliamino, tai morfolino, piperidino tai pyrrolidino, ja R2 on sama kuin edellä kaavassa VII, erityisesti metyyli, mahdollisesti sopivan emäksen läsnäollessa. Saatu kaavan VIHA mukainen yhdiste saatetaan ensin reagoimaan 2-substituoi-dun etanolin kanssa, jolloin ryhmä X2 muuttuu ryhmäksi OR3, jossa R3 on edellämääritelty, ja sen jälkeen suoritetaan reaktio hapettimen, esim. jodin kanssa, emäksen läsnäollessa, jolloin tapahtuu hapettuminen fosfaatiksi, ja suojaryhmä R1 poistetaan, jolloin saadaan kaavan IX mukainen yhdiste, ja toisaalta kaavan VIIIA mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan IX mukaisen yhdisteen kanssa, sitten suoritetaan reaktio hapettimen, esim. jodin, kanssa emäksen läsnäollessa, niin, että tapahtuu hapettuminen kaavan X mukaiseksi yhdisteeksi (kaavio 3). Kaavio 3

B B

1. R3OH

i 7 , 2. hapetus —OH + x -p-x -» -O-P-x -> (IX)

R 0 I 2 r10 I

\ OR \ OK 3. R1 poisto • · (V) (VIIA) (VIIIA)

1. LX

2. hapetus (X)

Trinukleotidien valmistamiseksi kaavan X mukaisesta dinukleotidistä, jossa R1, R2 ja R3 ovat edellämääritelty-jä ja kukin ryhmistä B1 ja B2 voi toinen toisestaan riippumatta olla tymyyli, sytosyyli, adenyyli tai guanyyli, I; f i9 8 6 744 poistetaan suojaryhmä R1 ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa mahdollisesti vedenpoistoreagenssin läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa tai kaavan VIHA mukaisen yhdisteen kanssa, jonka jälkeen suoritetaan hapetus, jolloin saadaan kaavan XI mukainen yhdiste (kaavio 4). Suojaryhmän R1 poistaminen ja kondensaatio kaavan XI mukaiseksi trinukleotidiksi tapahtuu samalla tavalla kuin edellä on kuvattu kaavan X mukaisen dinukleotidin valmistuksen yhteydessä.

Kaavio 4 B1 B2 0 0

Il II , viii x-> —0-P —0-Ρ-0ΙΓ -----> H0V I 7 tai l. vi ia \ R 0 o OR 2 hapetus * \ B3 B1 B2 0 0 0

Il II II 3 -O-P -0-P —O-P-OR (XI) R ° 2I\ 2l\ I ,

\ R 0 0 RO 0 0RZ

\ \ o ·

Tetranukleotidien valmistamiseksi saatetaan kaavan XI mukaiset trinukleotidit reagoimaan samoin kuin edellä on kuvattu kaavan X mukaisten dinukleotidien reaktioiden kohdalla.

Keksinnön edullisessa toteutustavassa käytetään suo-jaryhmänä R1 4-metoksitrityyliryhmää, suojaryhmänä R2 kloorilla substituoitua fenyyliryhmää, erityisesti 2-kloorifenyyliä, ja suojaryhmänä R3 2-syanoetyyliryhmää. Kaavan VII mukaisessa yhdisteessä on 1-bentstriatsolyyli-oksiryhmä edullinen ryhmiksi X1 ja X2.

Kaavan XI mukaiset trinukleotidit on edullista valmistaa siten, että kaavan X mukaisesta dinukleotidista 20 86 744 poistetaan suojaryhmä R1 ja näin saatu yhdiste saatetaan vettäsitovan reagenssin läsnäollessa reagoimaan kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa, jossa X2 on hyd-roksyyli tai siitä johdettu suola (kaavio 4). Vettäsito-via aineita ovat esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyylibentseenisulfonyylikloridi, -imidatsolidi, -tetratsolidi tai -1,2,4-triatsolidi, joka voi olla subs-tituoitu nitrolla. Etusijalle asetettava vedenpoisto-reagenssi on kaavan XII mukainen 2,4,6-trimetyylibentso-sulfonyyli-3-nitro-l,2,4-triatsolidi.

ch3

/ N NO

//~\ /V

CH -· »—SO -N | (XII) \ / 2 \ » \/ \ CH3

Mielellään käytetään nukleosideja, joiden emäsosan vapaa aminoryhmä on suojattu. Edullisia suojaryhmiä ovat bentsoyyli adeniinilla, bentsoyyli tai 4-metoksibentsoyy-li sytosiinilla ja isobutyryyli tai difenyyliasetyyli guaniinilla. Tyrniini käytetään mielellään ilman suojaryh-mää.

Oligonukleotidien valmistuksessa vaiheen c mukaisesti käytetään sinänsä tunnettua laitetta, jossa on puoliautomaattinen tai täysautomaattinen, mikroprosessorioh-jattu liuottimien ja reagenssien syöttö. Vaiheen a mukaisesti valmistetusta, kaavan VI mukaisesta yhdisteestä poistetaan suojaryhmä R1, kuten edellä on selostettu, ja näin saatu yhdiste saatetaan reagoimaan joko kaavan VIII tai kaavan VIHA mukaisen yhdisteen kanssa tai kaavan X tai kaavan XI mukaisen yhdisteen kanssa, joista sitä ennen on poistettu suojaryhmä R3 emäksen avulla (ryhmänä R3 oleva 2-syanoetyyliryhmä voidaan poistaa esim. trialem- 2i 86744 pialkyyliamiinilla, esim. trietyyliamiinilla, jossakin edellämainituista liuottimista tai liuotinseoksista 10 -40°C:ssa, erityisesti huoneenlämpötilassa), ja reaktio suoritetaan mahdollisesti vedensitojan läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa. Keksintö kattaa myös reaktiot, joissa kaavan X mukaisen dinukleotidin tai kaavan XI mukaisen trinukleotidin tilalla käytetään vaiheen b mukaisesti valmistettua tetranukleotidia. Jos käytetään kaavan VIHA mukaista fosfiittia, suoritetaan jälkikäsittely hapettimella, esimerkiksi jodilla, emäksen läsnäollessa. Näin saadulle kaavan XIII mukaiselle yhdisteelle, jossa R1, R2 ja B ovat edellämääriteltyjä ja n on kokonaisluku 1-4, suoritetaan kaavan VI mukaiselle yhdisteelle kuvatut reaktiovaiheet (R1 :n irrotus, reaktio kaavan VIII, VIIIA, X tai XI mukaisen yhdisteen kanssa tai vastaavan tetranukleotidin kanssa ja mahdollinen hapettava jälkikäsittely) , kunnes syntyy kaavan XIII mukainen yhdiste, jossa n on mielivaltainen välillä noin 19 - noin 69 oleva luku.

B B

0 ·-· i II // \ R o —0-P —OCCH CH CNHCH—· ·— polystyreeni \ 2I\ Il 2 2II 2 \ / \ RO 000 ·=· \ \

N

\ o n

XIII

Edullisessa toteutustavassa käytetään suojaryhmänä R1 4-metoksitrityyliä ja irrotus suoritetaan sinkkibromidil-la CH- tai NH-happaman yhdisteen, erityisesti 1,2,4-tri-atsolin tai tetratsolin läsnäollessa. Esim. 1,2,4-triat-solin käyttö 4-metoksitrityylisuojaryhmän irrottamisessa on uutta ja johtaa yllättäen siihen, että lohkeaminen tapahtuu nopeasti suurilla saannoilla ja ilman sivureak- 22 86744 tioita. Erittäin edullista on käyttää sinkkibromidia ja 1,2,4-triatsolia moolisuhteessa, joka on välillä 20:1 -100 :1, liuotinseoksessa, joka koostuu aproottisesta liuottimesta ja alkoholista, esimerkiksi metyleeniklori-dista ja 2-propanolista.

Edullisessa toteutustavassa saatetaan kaavan VI tai kaavan XIII mukainen yhdiste, joista on poistettu suoja-ryhmä R1, reagoimaan kaavan XI mukaisen trinukleotidin kanssa, josta on poistettu suojaryhmä R3, vedenpoisto-reagenssin läsnäollessa, joka voi olla esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyylibentseenisulfonyyliklori-di, - imidatsolidi, - tetratsolidi tai -1,2,4-triatsoli-di, joka mahdollisesti on substituoitu nitrolla. Kaavan XII mukainen 2,4,6-trimetyylibentseenisulfonyyli-3-nit-ro-1,2,4-triatsolidi on erityisen edullinen.

Erittäin edullinen yhdistelmä, jossa suojaryhmänä R1 käytetään 4-metoksitrityyliryhmää ja ryhmän R1 irrottamisessa käytetään sinkkibromidia 1,2,4-triatsolin läsnäollessa ja kaavan XIII mukaisen suojauksesta vapautetun oligonukleotidi-polystyreenihartsin ja kaavan XI mukaisen, suojauksesta vapautetun trinukleotidin välisessä reaktiossa käytetään vedensitoja-aineena kaavan XII mukaista triatsolidia, mahdollistaa sen, että yllättäen voidaan valmistaa myös pitkiä nukleotidiketjuja, joiden pituus on noin 40 - noin 70 emästä, lyhyessä ajassa, suurilla saannoilla ja hyvin puhtaassa muodossa.

Oligodeoksinukleotidien irrottamisessa kantaja-aineesta ja suojaryhmän poistamisessa vaiheen d mukaisesti käytetään sinänsä tunnettuja menetelmiä. Erittäin edullinen reagenssi kantaja-aineesta irrottamisessa ja edullisen 2-kloorifenyylisuojaryhmän poistamisessa on aryylial-doksimaatti, esimerkiksi 1,1,3,3-tetrametyyliguanidini-um-2-nitrobentsaldoksimaatti. Reaktio suoritetaan jossakin edellämainituista inerteistä liuottimista, johon on lisätty hieman vettä, esim. 95-prosenttisessa pyridii-nissä, huoneenlämpötilassa. Sitten suoritetaan reaktio vesipitoisen ammoniakin kanssa huoneenlämpötilassa tai 23 8 6 7 44 korotetussa lämpötilassa, esim. 20 - 70°C:ssa, erityisesti 50°C:ssa.

Oligodeoksinukleotidien yhteenliittämistä varten tuodaan 5'-pään hydroksiryhmään fosfaattitähde. Fosfaat-titähteen liittäminen (fosforylointi) suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla käyttämällä apuna T4-polynukleotidiki-naasia ATP:n läsnäollessa.

Edellä esitetyn mukaisesti valmistetut koodittavan DNA-säikeen ja komplementaarisen DNA-säikeen oligodeoksi-nukleotidit sisältävät päällekkäin ulottuvia sekvenssejä, joissa on vähintään 3, mielellään 8-15 päällekkäin pa-rikeiksi ulottuvaa emästä. Sekoituksen tuloksena tällaiset oligodeoksinukleotidiparit pysyvät yhdessä vetysil-lanmuodostuksen tuloksena. Ulkopuolelle jäävät yksisäi-keiset päät toimivat vaiheiden el ja e2 mukaisesti matriiseina (templaatteina) toisen (komplementaarisen) säikeen rakentamisessa, joka tapahtuu DNA-polymeraasilla, esim. DNA-polymeraasi I, DNA-polymeraasi I:n Klenow-pala-nen tai T4-DNA-polymeraasi, tai AMV-käänteiskopioijaent-syymillä, neljän deoksinukleosiditrifosfaatin (dATP, dCTP, dGTP ja TTP) läsnäollessa. Täydentämisessä syntyy kaksisäikeisiä DNA-ketjuja, jotka ovat egliinigeenin osia (menetelmä el) tai täydellisiä egliinigeenejä (menetelmä e2), ja joilla on tylpät päät.

Menetelmävaiheen el mukaisesti valmistettavissa olevat egliinigeenin osat sisältävät päissään nukleotidi-sekvenssejä, jotka restriktioendonukleaasit kykenevät tunnistamaan ja katkaisemaan. Riippuen valituista nuk-leotidisekvensseistä ja niitä vastaavista restriktioen-donukleaaseista syntyy katkaisussa täydelliset emäsparit omaavia päitä (tylpät päät, "blunt ends") tai ulkonevia päitä omaavia DNA-säikeitä ("staggered ends"). Tunnistus-kohdat valitaan siten, että liitettäessä yhteen DNA-jak-soja, jotka on käsitelty tylppiä päitä tuottavilla restriktioendonukleaaseilla, tai joissa on parikkiemäksiä sisältävät kohesiiviset päät, saadaan aikaan täydellisiä egliinirakenteita. Kahden kaksisäikeisen DNA-jakson yh- 24 86744 teenliittäminen vaatii 5'-pään fosfaattiryhmän luovuttajassa ja vapaan 3'-pään hydroksiryhmän vastaanottajassa. Saadut DNA-jaksot on jo fosforyloitu 5'-päästään ja liitetään yhteen sinänsä tunnetulla tavalla ligaasin, erityisesti T<-DNA-ligaasin avulla.

Esillä olevan keksinnön edullisen toteutustavan mukaan valmistetaan kuvatulla tavalla kaksi egliini C- tai egliini B-geenin jaksoa, egliini C-geenin tapauksessa erityisesti kaavojen lila ja IV mukaiset jaksot FX(C) ja Fz ja egliini B-geenin tapauksessa kaavojen IIIb ja IV mukaiset jaksot FX(B) ja F2. Jaksot, jotka tarvittaessa voidaan alakloonata sopivaan vektoriin, sisältävät kukin mielellään yhteenliittämispäässä restriktioensyymin, erityisesti Hpallrn, tunnistuskohdan, josta syystä mainitulla entsyymillä tapahtuneen katkaisun ja kummankin palan yhteenliittämisen jälkeen syntyy oikealla tavalla koodattava egliini-DNA-sekvenssi. Lisäksi osa 1 sisältää ennen luennanaloitussignaalia (ATG) ja osa 2 sisältää luennan-lopetussignaalin (esim. TAG) jälkeen vielä terminaalisen tunnistuskohdan, joiden avulla egliinigeeni tai egliini-geenin osa voidaan liittää sopivaan vektoriin.

Keksintö koskee erityisesti egliini C-geenin valmistusta kahdesta kaavojen lila ja IV mukaisesta osasta Fx(C) ja F2, jotka restriktioentsyymillä Hpall tapahtuneen katkaisun ja yhteenliittämisen jälkeen antavat oikean egliini C-DNA-sekvenssin, ja joissa Fx(C):ssa on ennen luennanaloitussignaalia EcoRI:n tunnistuskohta ja F2:ssa on luennanlopetussignaalin jälkeen BamHI:n tunnistuskohta.

Toisen toteutustavan mukaan (vaihe e2) liitetään kaksi oligodeoksinukleotidia, jotka vaihtoehtoisesti ovat peräisin koodattavasta ja komplementaarisesta säikeestä, yhteen vähintään 3, mielellään 8-15 komplementaarisen parikkiemäksen avulla, täydennetään DNA-polymeraasia, esim. jotakin edellämainituista käyttämällä, ja liitetään yhteen (muunnetuksi) egliinirakennegeeniksi DNA-ligaasin avulla.

25 86744

Egliinigeenin sisältävien ilmentämisvektorien valmistus

Keksinnön toteuttamiseksi valmistetaan lisäksi il-mentämisvektoreita, jotka sisältävät egliiniä koodattavan DNA-sekvenssin, jota ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee sillä tavalla, että tällä ilmentämisvektorilla transformoitunut isäntä tuottaa polypeptidejä, joilla on eglii-niaktiivisuus.

Esillä olevan keksinnön mukaiset ilmentämisvektorit sisältävät egliini B:tä, tai erityisesti egliini C:tä koodittavan sekvenssin.

Esillä olevan keksinnön mukaiset ilmentämisvektorit valmistetaan esim. siten, että ilmentymisenohjaussek-venssin sisältävään vektori-DNA:hän liitetään egliiniä koodittava sekvenssi siten, että ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee mainittua DNA-sekvenssiä.

Sopivan vektorin valinta riippuu transformointiin valitusta isäntäsolusta. Sopivia isäntiä ovat esim. mikro-organismit, kuten hiivat, esim. Saccharomyces cerevisiae, ja erityisesti bakteerikannat, joihin re-striktio- tai muuntoentsyymit eivät vaikuta, erityisesti Escherichia coli-kannat, esim. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. COli HB101/LM1035, E. coli JA221(37) tai E. coli K12 kanta 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus jne., ja lisäksi korkeampia organismien solut, erityisesti ihmisen tai eläinten itsenäiset so-lulinjat. Edullisia isäntäorganismeja ovat mainitut E. coli-kannat, esim. E. coli HB101 ja E. coli JA221, sekä Saccharomyces cerevisiae.

Periaatteessa ovat kaikki sellaiset vektorit sopivia, jotka monistavat ja ilmentävät keksinnönmukaisia DNA-sekvenssejä valitussa isännässä.

Esimerkkejä vektoreista, jotka soveltuvat egliinigeenin ilmentämiseen E. coli-kannassa, ovat bakteriofaa-git, esim. bakteriofaagi λ:η johdannaiset, tai plasmidit, 26 86744 erityisesti plasmidi colEl ja sen johdannaiset, esim. pM B9, pSF2124, pBR317 tai pBR322. Esillä olevan keksinnön mukaiset edulliset plasmidit ovat plasmidin pBR322 johdannaisia. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja merkkigeenin, joka mahdollistaa ilmentämis-plasmideilla transformoituneiden isäntien valinnan ja tunnistamisen fenotyyppiSten tunnusmerkkien avulla. Sopivat merkkigeenit antavat isännälle esim. vastustuskyvyn raskasmetallien, antibioottien tms. suhteen. Esillä olevan keksinnön kannalta edulliset vektorit sisältävät replikoni- ja merkkigeenialueiden lisäksi resktriktioen-donukleaasien tunnistuskohtia niin, että egliinigeeni ja mahdollisesti ilmentymisenohjaussekvenssi voidaan sijoittaa näihin kohtiin. Edullinen vektori, plasmidi pBR322, sisältää ehjän replikonin, tetrasykliinille ja ampisil-liinille vastustuskyvyn antavat merkkigeenit (tetR ja ampR) ja joukon vain kerran esiintyviä restriktioendonuk-leaasien tunnistuskohtia, esim. PstI (leikkaa ampR-geenin kohdalta, tetR-geeni säilyy ehjänä), BamHI, Hindlll, Sali (kaikki tetR-geenissä, ampR-geeni säilyy ehjänä), NruI ja EcoRI.

Geenin ilmentymisen säätelyssä voidaan käyttää useampia ilmentymisenohjaussekvenssejä. Erityisesti käytetään transformoitavan isännän voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvenssejä. Kun käytetään yh-distelmävektorina pBR322:ta ja isäntämikro-organismina E. colia ovat sopivia esimerkiksi laktoosioperonin, tryp-tofaanioperonin, arabinoosioperonin tms., tai β-laktamaa-sigeenin ilmentymisenohjaussekvenssit (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribosomaalisen sidoskohdan) ja λΝ-faagigeenin ja fd-faagin kerrosproteiinigeenin vastaavat sekvenssit, β-laktamaasigeenin promoottori (β-lac-geeni) on jo valmiina plasmidissa pBR322, kun taas muut ilmentymisenohjaussekvenssit pitää liittää tähän plas-midiin. Tämän keksinnön kannalta edullinen ilmentymisenohjaussekvenssi on tryptofaanioperonin ilmentymisenohjaussekvenssi (trp po).

27 86 744

Hiivoissa tapahtuvaan replikoitumiseen ja ilmentymiseen sopivat vektorit sisältävät hiivan soveltuvan repli-koitumisen alkukohdan ja hiivaa varten tarkoitetun geneettisen valintamerkin. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hiivaan soveltuvan replikoitumisen alkukohdan, esim. kromosomaalisen autonomisesti replikoitavan segmentin (ars), säilyvät transformoitumisen jälkeen hiivasolussa ekstrakromosomaalisesti ja replikoitavat mitoosissa autonomisesti. Myös voidaan käyttää hiivan homologisia 2M-plasmidi-DNA-segmenttejä. Tällaiset yhdistelmävektorit yhtyvät rekombinoitumalla solun sisällä ennestään oleviin 2/u-plasmideihin tai replikoitavat autonomisesti. 2μ-3β^ venssit sopivat erityisesti suuren transformointitaajuu-den omaaviin plasmideihin ja antavat suuren kopiomäärän. Sopivia hiivan merkkigeenejä ovat ennen kaikkea sellaiset, jotka antavat isännälle vastustuskyvyn antibiootin suhteen, tai auksotrofisten hiivamutanttien kohdalla geenit, jotka täydentävät isännän vajavuuksia. Vastaavat geenit antavat esim. vastustuskyvyn sykloheksimidianti-biootin suhteen tai antavat prototrofian auksotrofiselle hiivalle, esim. URA3-, LEU2-, HI53- tai ennen kaikkea TRPl-geeni. Hiivan hybridivektorit sisältävät mielellään lisäksi bakteeri-isäntään, erityisesti E. coliin, soveltuvan replikoitumisen aloituskohdan ja merkkigeenin, jotta yhdistelmävektorien ja niiden esiasteiden rakentaminen ja kloonaus voi tapahtua bakteeri-isännässä. Hiivassa ilmentymiseen sopivia ilmentymisenohjaussekvenssejä ovat esim. TRP1-, ADHl-, ADHII-, PH03- tai PH05-geenin vastaavat sekvenssit ja lisäksi glykolyyttiseen hajoamiseen liittyvät promoottorit, esim. PGK- ja GAPDH-promoottori.

Erityisesti keksinnössä käytetään sellaisia repli-koitumiskykyisiä ja valintakelpoisia ilmentämisvektorei-ta, jotka sisältävät ilmentymisenohjaussekvenssin ja eg-liiniä koodittavan DNA-sekvenssin siten, että mainittu DNA-sekvenssi on transkriptionaloitussignaalin ja -lope-tussignaalin sekä luennanaloitussignaalin ja -lopetussig-naalin kanssa sijoitettu mainittuun ilmentämisplasmidiin 28 86 7 44 mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyn alaisuuteen tavalla, joka mahdollistaa egliiniaktiivisuuden omaavan polypeptidin tuotannon mainitulla ilmentämis-plasmidilla transformoituneella isännällä.

Jotta saavutettasiin tehokas ilmentyminen, pitää ra-kennegeenin sijaita oikealla tavalla ("faasissa") ilmentymisenohjaussekvenssin kanssa. On edullista liittää il-mentymisenohjaussekvenssi pää-mRNA-alun ja geeniä koodattavan sekvenssin ATG:n väliin, joka luonnostaan sijaitsee ilmentymisenohjaussekvenssissä (esim. /J-lac-koo-disekvenssi 0-lac-promoottoria käytettäessä), jota seuraa egliinin geeni, joka mielellään tuo mukanaan oman luen-nanaloitussignaalinsa (ATG) ja luennanlopetussignaalinsa (esim. TAG). Näin saavutetaan tehokas transskriptio ja luenta.

Toimitaan esimerkiksi niin, että vektori, erityisesti pBR322, leikataan restriktioendonukleaasilla ja näin saatuun, mahdollisesti vielä modifioituun lineaariseen vektoriin liitetään vastaavilla tunnistuspäillä varustettu ilmentymisenohjaussekvenssi. Ilmentymisenohjaussek-venssi sisältää 3'-päässä (luennan suunnassa) restriktio-endonukleaasin tunnistussekvenssin niin, että ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisältävä vektori voidaan leikata mainitulla restriktioentsyymillä ja sen jälkeen liittää vektoriin sopivilla päillä varustettu egliinin rakenne-geeni. Näin syntyy kahden yhdistelmäplasmidin seos, joista toinen sisältää geenin oikeassa ja toinen väärässä suunnassa. On edullista katkaista ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisältävä vektori vielä toisella restriktioendonukleaasilla vektori-DNA:n sisältä ja liittää näin syntyneeseen vektoripalaseen oikeilla päillä varustettu rakennegeeni. Kaikki vektoriin kohdistuvat operaatiot tapahtuvat mielellään niin, että replikonin tai ainakin merkkigeenin toiminta säilyvät muuttumattomina.

Esillä olevan keksinnön edullisen toteutustavan mukaan leikataan pBR322:sta johdettu vektori, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin, erityisesti sellaisen, jos- l< 29 86 7 44 sa on tryptofaanioperoni (trp op) ja 3'-päässä (pää-mRNA-aloituskohdan ja ensimmäisen ATG:n välissä) restriktioen-donukleaasin, mielellään kohesiivisia päitä muodostavan, esim. EcoRI, tunnistuskohta, tästä kohdasta mainitulla restriktioendonukleaasilla ja vektori-DNA-osastaan toisella restriktioendonukleaasilla, joka muodostaa tylppiä tai mielellään kohesiivisia päitä, esim. BamHI:llä, jonka jälkeen näin linearisoituun vektoriin liitetään vastaavilla päillä varustettu egliinigeeni. Yhteenliittäminen tapahtuu tunnetulla tavalla muodostamalla komplementaaristen (kohesiivisten) päiden väliset parikit ja yhdistämällä esim. T4-DNA-ligaasilla.

mRNA-tietä perimän DNA:sta tai synteettisesti saatu, vastaavilla kohesiivisilla (erityisesti EcoRI- ja BamHI-) päillä varustettu egliinigeeni voidaan ennen ilmentämis-plasmidiin liittämistä kloonata myös vektoriin, esim. pBR322, jotta rakennegeeniä saataisiin aikaan suurempia määriä esim. sekvenssianalyysiä varten. Yhdistelmäplas-midin sisältävän kloonin eristäminen suoritetaan esim. egliinin suhteen spesifisen, radioaktiivisesti merkatun oligodeoksinukleotidikoettimen (ks. edellä) avulla. Eg-liinigeenin tunnistaminen suoritetaan esim. Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (3).

Keksinnön edullisessa toteutustavassa syntetisoidaan kaksi egliini C:n geenin osaa. Osa 1, joka muodostaa geenin 1. osan, sisältää ennen ATG-kodonia sekä päässä kohesiivisia päitä muodostavan restriktioendonukleaasin tunnistussekvenssin, esim. EcoRI-kohdan ennen ATGrtä ja Hpall-kohdan päässä. Osa 2, joka muodostaa geenin jälkiosan sisältää vastaavat tunnistussekvenssit, alussa esim. HPaII:n ja luennanlopetussignaalin (esim. TAG) jälkeen BamHI:n. Osat leikataan ulompien tunnistussekvenssiensä kohdista (osa 1 esim. EcoRI:llä ja osa 2 vastaavasti BamHI:llä) ja alakloonataan vastaavasti leikattuun vektoriin (esim. pBR322). Osat sisältävien kloonien ja osien tunnistaminen tapahtuu edelläkuvatulla tavalla. Sitten osat leikataan irti yhdistelmävektoreista vastaavilla 30 86 744 restriktioendonukleaaseilla (osa 1 esim. EcoRlrllä ja Hpallrlla ja osa 2 esim. Hpallrlla ja BamHIrllä) ja liitetään yhteen kohesiivisten päidensä, erityisesti Hpall-päiden, kautta, jolloin syntyy täydellinen egliinigeeni, joka sijoitetaan vektori-DNArhan edelläkuvatulla tavalla.

Isäntäsolujen transformointi

Keksinnön toteuttamiseksi valmistetaan myös transformoitunut isäntä siten, että isäntä transformoidaan ilmentymisplasmidilla, joka sisältää ilmentymisenohjaus-sekvenssin säätelemän, egliiniä koodittavan DNA-sekvens-sin.

Sopivia isäntiä ovat esimerkiksi edellämainitut mikro-organismit, kuten Saccharomyces cerevisiae- , Bacillus subtilis- ja erityisesti Escherichia coli-kan-nat. Transformointi keksinnönmukaisilla ilmentämisplas-mideilla tapahtuu esim. siten kuin kirjallisuudessa on selostettu, S. cerevisiae (4), B. subtilis (5) ja E. coli ( 6). Transformoituneen isännän eristäminen tapahtuu mielellään selektiivisestä ravinneliuoksesta, johon on lisätty biosidia, jota vastaan ilmentämisplasmidin sisältämä merkkigeeni antaa vastustuskyvyn. Jos, kuten on edullista, ilmentämisplasmidit sisältävät ampR-geenin, lisätään ravintoalustaan ampisilliinia. Solut, jotka eivät sisällä ilmentämisplasmidia, tuhoutuvat tällaisessa alustassa.

Transformoituneen isännän viljely ja egliinien talteenotto

Transformoitunutta isäntää voidaan käyttää egliinien tuotantoon. Egliinien tuotanto tapahtuu siten, että transformoitunutta isäntää viljellään ja tuote vapautetaan isäntäsoluista ja eristetään.

Nyt on yllättäen havaittu, että keksinnössä käytettävät transformoituneet isännät tuottavat egliiniaktii-visuuden omaavien polypeptidien seoksia. Seoksista voidaan eristää luonnonmukaisia egliinejä ja N-päästään ase- 3i 86744 tyloituja egliinejä. Transformoituneet E. coli-kannat tuottavat erityisesti egliiniaktiivisuuden omaavia poly-peptidejä, jotka eroavat luontaisesta egliini B:stä ja C:stä N-pään aminohappo treoniinin N-asetyylitähteen suhteen, toiset tuottavat pääasiassa luonnonmukaisia egliinejä ja kolmannet ennen kaikkea sellaisia polypepti-dejä, jotka vastaavat tarkalleen isäntään tuotuja eglii-ni-DNA-ketjuja, so. niissä on N-päässä metioniiniamino-happo. Erityisesti N°-asetyloitujen tuotteiden tuotanto on yllättävää. Tällaisten polypeptidien tuottamista geenitekniikan menetelmin ei nimittäin tähän mennessä ole tunnettu. Niinpä vastaavasti geneettisesti muunnetut isännät tuottavat α-tymosiinia asetyloitumattomassa muodossa, vaikka se luonnossa on N-päästään asetyloitunut (35).

N-päästään asetyloituneiden egliinien tuotanto on suuri etu, koska tällaiset yhdisteet ovat stabiilimpia isäntäsolujen sisältämien aminopeptidaasien suhteen, jolloin siis N-päästä lähtevä (osittainen) proteolyyttinen hajoaminen estyy ja saannot kohoavat. Lisäksi yksinkertaistuu puhdistus huomattavasti, koska haluttu tuote ei sisällä epäpuhtauksina proteolyyttisen hajoamisen tuloksena syntyneitä palasia.

Näin ollen keksintö koskee erityisesti menetelmää kaavan XIV mukaisten egliiniyhdisteiden valmistamiseksi VGluPheGlySerGluLeuLyeSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValVa1AsnHisValProHis ValGly (XIV), jossa kaavassa V on Thr tai N-asetyyli-Thr ja W on Tyr tai His, sekä tällaisten yhdisteiden suolojen valmistamiseksi siten, että ilmentämisplasmidilla, jossa on ilmen-tymisenohjaussekvenssin säätelemä, egliiniä koodittava 32 86744 DNA-sekvenssi, transformoitunutta isäntäorganismia viljellään nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, ja egliini vapautetaan mikro-organismisoluista ja eristetään, ja saatu egliini, jossa V on N-asetyyli-Thr ja W on edellämääritel-ty, muunnetaan haluttaessa egliiniksi, jossa V on Thr, ja menetelmän mukaisesti saatu kaavan XIV mukaisten yhdisteiden seos erotetaan haluttaessa yksittäisiksi kompo-nenteikseen ja/tai saatu suola muunnetaan haluttaessa vapaaksi polypeptidiksi tai saatu polypeptidi muunnetaan suolakseen.

Kaavan XIV mukaisissa yhdisteissä tarkoittaa W ennen kaikkea Tyr-tähdettä (egliini C-yhdisteet).

Keksintö koskee aivan erityisesti menetelmää egliini C:n, egliini B:n ja Na-asetyyli-egliini C:n valmistamiseksi .

Keksinnönmukaisten transformoituneiden isäntien viljelyssä voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Esimerkkejä edullisista hiililähteistä ovat assimiloituvat hii-lilähteet, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli ja laktoosi tai asetaatti, jota voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esim. aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai li-hauutteet; edelleen hiivauutteet, mallasuute, ammonium-suolat, esim. ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan käyttää yhtä hyvin ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.

Alusta sisältää lisäksi esim. kasvua edistäviä aineita, kuten hivenaineita, esim. rautaa, sinkkiä, mangaania tms., ja mielellään aineita, jotka saavat aikaan valintapaineen ja estävät sellaisten solujen kasvua, jotka ovat menettäneet ilmentämisplasmidin. Niinpä alustaan lisätään esim. ampisilliiniä, jos ilmentämisplasmidi sisältää ampR-geenin. Tällainen antibioottiaineiden lisää- i 33 86744 minen aiheuttaa myös sen, että kontaminoivat, antibiooteille herkät mikro-organismit kuolevat.

Kasvatus tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Kasvuolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH ja fermentoin-ti-aika valitaan siten, että saavutetaan mahdollisimman korkea egliinitiitteri. Niinpä E. coli-kantaa kasvatetaan mielellään aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen lämpötilassa, joka on noin 20 - 40°C välillä, mielellään noin 30°C:ssa, ja pH-arvos-sa 4 - 9, mielellään pH-arvossa 7, noin 4-20 tuntia, mielellään 8-12 tuntia. Tällöin ilmentymistuote (eglii-ni) kertyy solujen sisälle.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, kasvatus keskeytetään ja egliini vapautetaan isäntäsoluista, esim. käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, kuten SDS:llä tai Tritonilla, tai lysotsyymillä tai vastaavalla tavalla vaikuttavalla entsyymillä. Vaihtoehtoisesti tai lisänä voidaan käyttää mekaanisia voimia, kuten hierto-voimaa (esim. X-puristinta, ranskalaista puristinta, Dy-no-myllyä) tai ravistelua lasikuulien tai alumiinioksidin kanssa tai vuorottelevaa jäädytystä, esim. nestemäisessä typessä, ja sulatusta, esim. 30 - 40°C:een, sekä ultraääntä solujen rikkomiseksi. Näin saatu seos, joka sisältää proteiineja, nukleiinihappoja ja solunosia, rikastetaan sentrifugoinnin jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla proteiinien, egliini mukaanluettuna, suhteen.

Niinpä esim. suurin osa ei-proteiiniaineosista erottuu polyetyleeni-imiinikäsittelyllä ja proteiinit, egliini mukaanluettuna, seostetaan esim. kyllästetyllä ammonium-sulfaattiliuoksella tai muulla suolaliuoksella. Baktee-riproteiinit voidaan saostaa myös lisäämällä etikkahap-poa (esim. 0,1 %, pH 4-5). Lisärikastus egliinin suhteen voidaan saada aikaan uuttamalla etikkahapon happa-moittaraa jäännös n-butanolilla. Jatkopuhdistuksessa voidaan käyttää esim. geelielektroforeesia, kromatografisia menetelmiä, kuten ioninvaihtokromatografiaa, koko-ekskluusiokromatografiaa, HPLCrtä, käänteisfaasi-HPLC:tä 34 86744 tms., seoskomponenttien erottamista toisistaan molekyylikoon perusteella käyttämällä sopivaa Sephadex-pylvästä, dialyysiä, affiniteettikromatografiaa, esim. vasta-aine-affiniteettikromatografiaa, erityisesti käyttämällä mono-klonaalisia vasta-aineita tai käyttämällä affiniteetti-kromatografiaa anhydrokymotrypsiinipylväässä, ja käyttämällä muita, erityisesti kirjallisuudesta tunnettuja menetelmiä .

Ilmentyneen egliinin eristäminen käsittää esimerkiksi seuraavat vaiheet:

Solujen erottaminen kasvuliuoksesta sentrifugoimalla; raakauutteen valmistus rikkomalla solut esim. käsittelemällä lysoivalla entsyymillä ja/tai suorittamalla vuorotteleva jäädytys ja sulatus; liukenemattomat aineosat sentrifugoidaan pois; DNA:n saostus lisäämällä polyetyleeni-imiiniä; proteiinien, egliini mukaanluettuna, saostus ammoniumsulfaatilla; liuotetun sakan affiniteettikromatografia egliinin mono-klonaalisia vasta-aineita sisältävässä pylväässä tai anhydrokymotrypsiinipylväässä; suolanpoisto näin saadusta liuoksesta dialyysillä tai kromatografoimalla Sephadex G25-pylväässä.

Vaihtoehtoisesti voidaan bakteeriproteiinit seostaa DNA:n erottamisen jälkeen 0,l%:isella etikkahapol-la, uuttaa egliini happamasta jäännöksestä n-butanolilla tai suorittaa happamalle jäännökselle suoraan ionin-vaihtokromatografia (esim. karboksimetyyliselluloosalla). Muita puhdistusvaiheita ovat mm. geelisuodatus Sephadex G50:llä (tai G7S:llä) ja käänteisfaasi-HPLC. Suolanpoisto tapahtuu jälleen Sephadex GZ5:llä.

Egliiniaktiivisuus voidaan todeta egliinin vasta-aineilla (esim. kaniineista saaduilla tai hybridoomaso-luista saaduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) tai toteamalla egliinin aiheuttama inhibitio ihmisen leu-kosyyttielastaasin (HLE) tai katepsiini G:n (Cat G) (1) suhteen.

35 8 6744

Kaavan XiV mukaisen yhdisteen, jossa N-pään aminohappo on vapaassa muodossa, muuntaminen vastaavaksi kaavan XIV mukaiseksi yhdisteeksi, jossa N-pään aminohappo on N-asetyloitunut, suoritetaan erityisesti entsymaattisesti. Niinpä asetyyliryhmän liittäminen voidaan suorittaa esim. E. colista, kaniinin retikulosyyteistä tai veh-nänalkioista (8) saadulla Na-asetyylitransferaasilla (puhtaana, uutteena tai sopivan mikro-organismin lysaattina tai elinuutteena) asetyylikoentsyymi A:n läsnäollessa.

Keksinnönmukaisesti saatavat kaavan XIV mukaiset yhdisteet voidaan sinänsä tunnetulla tavalla muuntaa toisiksi kaavan XIV' mukaisiksi yhdisteiksi.

Niinpä voidaan saaduista kaavan XIV mukaisista yhdisteistä, joissa on N-päässä asetyloitunut aminoryhmä, poistaa asetyyliryhmä. Asetyyliryhmän poistaminen voidaan suorittaa esim. entsymaattisesti, kuten sopivilla asylaa-seilla, joita saadaan esim. sianmunuaisista tai sopivista mikro-organismeista, tai sopivilla asetyylitransferaa-seilla koentsyymi A:n läsnäollessa, jolloin puhtaan ent-syymipreparaatin tilalla voidaan käyttää myös mikro-organismeista tai elimistä saatuja uutteita tai lysaatteja, jotka sisältävät tällaisia entsyymejä (käytettäessä E. coli HBlOl-kantaa Na-asetyyli-egliini B:tä tai C:tä tuottavana kantana, voidaan käyttää esim. E. coli HB101-ly-saattia).

Keksinnönmukaisesti saatu kaavan XIV mukaisten yhdisteiden seos, joka koostuu esimerkiksi kaavan XIV mukaisista yhdisteistä, joissa V on joko Thr tai asetyyli-Thr, voidaan sinänsä tunnetulla tavalla erottaa yksittäisiksi komponenteikseen. Sopivia erotusmenetelmiä ovat esim. kromatografiset menetelmät, kuten adsorptiokroma-tografia, ioninvaihtokromatografia, HPLC tai käänteisfaa-si-HPLC, ja lisäksi multiplikatiivinen jakaminen tai elektroforeettiset menetelmät, kuten elektroforeesi sel-luloosa-asetaatilla tai geelielektroforeesi, erityisesti polyakryyliamidigeelielektroforeesi ("PAGE").

Keksintö koskee myös keksinnönmukaisella menetelmä!- 36 86744 lä saatavia uusia peptidejä, joilla on egliiniaktiivi-suus, tällaisten peptidien seoksia ja tällaisten yhdisteiden suoloja.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa erityisesti kaavan XIV mukaisia uusia yhdisteitä VGluPheGlySerGluLeuLyeSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAenHisValProHis ValGly (XIV), jossa kaavassa V on N-asetyyli-Thr ja W on Tyr tai His, sekä tällaisten yhdisteiden suoloja.

Aivan erityisesti keksintö koskee Na-asetyyli-egliini C:n ja sen suolojen valmistusta.

Keksinnönmukaisesti valmistettavissa olevat ja uudet kaavan XIV' mukaiset yhdisteet voivat olla vapaassa muodossa tai suolamuodossa, erityisesti farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina. Koska keksinnönmukaiset yhdisteet sisältävät useampia aminohappoja, joissa on vapaita aminoryhmiä tai guanidinoryhmiä, ne voivat olla happo-additiosuolojen muodossa. Happoadditiosuoloina tulevat kysymykseen fysiologisesti sopivat suolat, jotka ovat muodostuneet terapeuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa; epäorgaanisista hapoista voidaan mainita halo-geenivedyt (kuten kloorivety), rikkihappo, fosfori- ja pyrofosforihappo; orgaanisista hapoista voidaan mainita ensisijassa sulfonihapot (kuten bentseeni- tai p-tolu-eenisulfonihappo tai alempialkaanisulfonihapot, kuten metaanisulfonihappo) sekä karboksyylihapot, kuten etik-kahappo, maitohappo, palmitiini- ja steariinihappo, ome-nahappo, viinihappo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska egliiniyhdisteet sisältävät myös aminohappotähteitä, joissa on vapaita karboksyyliryhmiä, jotka tekevät koko peptidin happamaksi, voivat ne myös muodostaa metal- l: 37 86744 lisuoloja, erityisesti alkalimetalli- tai maa-alkalime-tallisuoloja, kuten natrium-, kalium-, kalsium- tai mag-nesiumsuoloja, tai ammoniumsuoloja, jotka on johdettu ammoniakista tai fysiologisesta hyväksyttävästä orgaanisesta, typpipitoisesta emäksestä. Koska ne sisältävät myös samanaikaisesti vapaita karboksyyliryhmiä ja vapaita aminoryhmiä (ja amidinoryhmiä), voivat ne myös esiintyä sisäisinä suoloina.

Työtavasta riippuen saadaan keksinnönmukaiset yhdisteet vapaassa muodossa tai happoadditiosuoloina, sisäisinä suoloina tai emästen kanssa muodostuneina suoloina. Happoadditiosuoloista voidaan saada vapaat yhdisteet sinänsä tunnetuilla tavoilla. Viirneksimainituista voidaan puolestaan happojen tai emästen kanssa, esim. sellaisten kanssa, jotka muodostavat edellämainittuja suoloja, tapahtuvalla reaktiolla ja haihduttamalla tai lyofili-soimalla saada fysiologisesti hyväksyttäviä happoaddi-tiosuoloja tai metallisuoloja. Sisäiset suolat saadaan aikaan säätämällä pH sopivaan neutraalipisteeseen.

Egliinien monoklonaalisia vasta-aineita ja tällaisia vasta-aineita sisältäviä testipakkauksia

Vasta-aineiden kyvylle sitoa spesifisiä antigeenejä löytyy kehon ulkopuolella käyttöä kvantitatiivisessa määrityksessä (immunomääritys) ja antigeenien puhdistuksessa (immunoaffiniteettikromatografia). Immunisoitujen eläinten seerumi sisältää normaalisti lukuisia erilaisia vasta-aineita, jotka reagoivat eri affiniteetilla saman antigeenin eri kiinnittymiskohtien kanssa, ja lisäksi myös vasta-aineita muille antigeeneille, jotka peilaavat yksilön aikaisempia kokemuksia. Vasta-aineiden menestyksekäs käyttäminen antigeenien määrittämisessä ja puhdistamisessa vaatii kuitenkin korkeaa spesifisyyttä ja toistettavuutta.

Homogeenisia vasta-aineita, jotka täyttävät nämä vaatimukset, on saatu käyttöön Köhlerin ja Milsteinin (26) esittämän hybridoomatekniikan avulla. Periaatteessa 38 86744 tekniikka perustuu siihen, että immunisoitujen eläinten vasta-aineita erittävät B-lymfosyytit, esim. pernasta saadut, sulatetaan ("fuusioidaan") yhteen kasvain-solujen kanssa. Muodostuneissa hybridoomasoluissa yhtyvät kyky lisääntyä jakaantumalla rajattomasti ja kyky tuottaa ja erittää vasta-ainetta samantyyppisenä. Kun suoritetaan viljely selektiivisessä väliaineessa, jossa fuusioitumattomat kasvainsolut kuolevat, mutta hybri-doomasolut lisääntyvät, ja suoritetaan sopivia toimenpiteitä, voidaan saada aikaan klooneja, so. solupopulaatioita, jotka polveutuvat yhdestä ainoasta hybridoomaso-lusta ja ovat geneettisesti identtisiä ja solujen tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet voidaan erottaa.

Esillä olevan keksintöön liittyvät egliinien monoklonaaliset vasta-aineet, hybridoomasolut, jotka tuottavat tällaisia vasta-aineita, ja menetelmät niiden valmistamiseksi. Edullisia ovat hybridoomasolulinjat ja näiden erittämät monoklonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti egliini B:n tai egliini C:n tai näiden johdannaisten, esim. Na-asetyyliegliini C:n tai B:n kanssa. Egliinin monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen tapahtuu siten, että hiiret immunisoidaan egliinillä, tällä tavalla immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, näin muodostuneet hybridoomasolut kloonataan sitten in vitro tai injektoimalla hiiriin ja viljelmistä eristetään vasta-aineet.

Keksinnön käyttöön liittyvät myös näitä vasta-aineita sisältävät immunoaffiniteettikromatografiapylväät ja immunomäärityksiin tarkoitetut testipakkaukset.

Käytetyssä menetelmässä immunisoidaan hiiret, esim. Balb/c-hiiret, sinänsä tunnetulla, mutta spesifisellä tavalla. Immunisointi onnistuu yllättäen, vaikka egliinit ovat suhteellisen pienimolekyylisia proteiineja. Edullisessa toteutustavassa injektoidaan subkutaanisti 50 -500, erityisesti 100 pg egliini B:tä tai C:tä erityisesti täydelliseen ja epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin ja puskuroituun suolaliuokseen tehtynä liuoksena viikoit- I: 39 86 744 tain tai pitemmin väliajoin useamman viikon ajan, esim. 5 - 12 viikon aikana, kunnes on muodostunut riittävä määrä vasta-aineita tuottavia B-lymfosyyttejä.

Immunisoiduilta hiiriltä otetaan B-lymfosyyttejä sisältäviä elimiä, esim. pernasoluja, ja ne fuusioidaan sellaisten myeloomasolujen kanssa, jotka sisältämänsä mutaation vuoksi eivät kasva selektiivisessä kasvualustassa. Tällaisia myeloomasoluja tunnetaan ennestään ja niitä ovat esim. seuraavat: X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 ja erityisesti SP 2/0. Edullisessa toteutustavassa fuusioidaan immunisoitujen hiirten pernasolut solulinjan SP 2/0 myeloomasolujen kanssa.

Fuusio suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla sekoittamalla keskenään B-lymfosyyttejä ja myeloomasoluja ja lisäämällä solujenfuusioimisainetta, kuten polyetylee-niglykolia, Sendai-virusta, kalsiumkloridia tai lysolesi-tiiniä. Fuusiointi suoritetaan mielellään polyetyleeni-glykolin läsnäollessa, jonka molekyylipaino on esim. 500. Fuusioinnin jälkeen viljellään saatuja hybridejä sinänsä tunnetulla tavalla selektiivisessä kasvualustassa, joka on täydennetty hypoksantiinilla, aminopteriinilla ja ty-midiinillä (HAT-alusta). Fuusioitumattomat myeloomasolut eivät kykene kasvamaan tässä alustassa ja kuolevat samoin kuin normaalit lymfosyytit.

Hybridoomaviljelmien liuoksista voidaan sinänsä tunnetulla tavalla, kuten immunoradiometrisellä määrityksellä tai agglutinoinnilla, tutkia spesifisten vasta-aineiden läsnäolo. Näin on voitu yllättäen todeta, että kuvatulla menetelmällä saadaan aikaan hybridoomasoluja, jotka erittävät egliini B:n tai egliini C:n suhteen spesifisiä vasta-aineita. Nämä vasta-aineet reagoivat myös ^-asetyy-liegliini C:n ja B:n kanssa.

Ne hybridoomasolut, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, valitaan fuusioinnin läpikäyneestä mitä erilaisimpien hybridoomasolujen seoksesta. Tässä käytetään apuna sinänsä tunnettua menetelmää, jota 40 86744 nimitetään "rajoittavaksi laimentamiseksi" ("limiting dilution"), ja jossa tehdään viljelmät lähtien yhdestä ainoasta kasvavasta solusta.

Tällä tavalla saatiin kolme hybridoomasolulinjaa, jotka on taltioitu Pasteur-instituuttiin Pariisiin, Ranskaan numeroilla 299S18-20, 299S22-1 ja 299S22-10.

Massatuotantoa varten viljellään hybridoomasolu-klooneja, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, sinänsä tunnetuissa alustoissa tai ne injektoidaan hiiriin lisääntymistä varten. Edullisessa toteutustavassa injektoidaan hybridoomasolut Pristanilla esikäsiteltyihin hiiriin, otetaan askitesneste ja siitä seostetaan talteen vasta-aineet ammoniumsulfaattisaostuk-sella.

Näiden hybridoomasolujen avulla saatuja monoklonaa-lisia vasta-aineita voidaan sinänsä tunnetulla tavalla käyttää immunoaffiniteettikromatografiapylväiden valmistukseen. Keksinnön edullisessa toteutustavassa saatetaan sopiva kantaja-aine (puskuriliuokseen suspendoituneena) reagoimaan vasta-aineliuoksen kanssa, kiinnittymätön aine huuhdellaan sen jälkeen pois ja kantaja-aineen vapaat kohdat tukitaan.

Hybridoomasolujen avulla saatuja vasta-aineita voidaan sinänsä tunnetulla tavalla käyttää testipakkausten valmistuksessa. Nämä testipakkaukset voivat perustua erilaisiin menetelmiin, kuten immunoradiometriseen diffuusioon, lateksiagglutinointiin, täplätesteihin, kompeti-tiiviseen tai voileipäimmunoradiomääritykseen, entsyymi-immunomääritykseen, immunofluoresenssiin tai immunoke-miallisiin entsyymimenetelmiin, joita ovat esim. ELISA ja tandem-ELISA. Tällaiset pakkaukset voivat mitä erilaisinta alkuperää olevien vasta-aineiden lisäksi sisältää vas-ta-ainekonjugaatteja, jotka ovat muodostuneet entsyymien tai fluoresenssikantaja-aineiden kanssa, ja lisäksi eg-liiniä, esim. egliini B:tä, egliini C:tä tai Na-asetyyli-egliini C:tä, radioaktiivisella isotoopilla kuten J125:llä merkittynä tai entsyymiin, kuten piparjuuriperoksidaasiin 8674 4 tai emäsfosfataasiin, konjugoituna, ja edelleen entsyymien substraatteja, sopivia puskureita, geelejä, latekseja, polystyreeniä tai muita täyteaineita ja kantaja-aineita.

Serologiset kokeet voidaan suorittaa esim. seuraavasti :

Kompetitiivisen RIA-menetelmän ohella voidaan käyttää suoraa sitoutumiskoetta egliini C:n vastaisen vasta-aineaktiivisuuden toteamiseksi. Tätä tarkoitusta varten kiinnitetään egliini C yön yli inkuboimalla mikrotiitte-rilevyjen koloihin (200 ng/kolo) ja sen jälkeen inkuboi-daan hybridoomaviljelynesteen kanssa ja tehdään näkyväksi joko radioaktiivisesti merkityllä 125J:llä (kiinteäfaasi RIA) tai emäsfosfataasilla merkityillä (kiinteäfaasi ELISA) vuohen anti-hiiri-Ig-vasta-aineilla.

Valitut kolme monoklonaalista vasta-ainetta soveltuvat ei-radioaktiiviseen tandem-ELISA-menetelinään, jonka avulla voidaan määrittää egliinit kehon nesteistä.

Sopivat vasta-aineparit valittiin kompetitiivisen RIA-menetelmän avulla. Monoklonaaliset vasta-aineet 299S18-20, 299522-1 ja 299S22-10 (200-300 ng/kolo, joka oli saatu seostamalla askites-nesteestä ammoniumsulfaatilla) ja polyklonaalinen kanin anti-egliini-C-vasta-aine (200 - 300 ng/kolo, saatu seerumista) kiinnitettiin mik-rotiitterilevyjen koloihin. 125J:llä merkityn egliini C:n sitoutumisen estyminen tutkittiin ristikkäisesti.

Kokeet osoittivat, että monoklonaaliset vasta-aineet 299S18-20 ja 299S22-10 estävät vastavuoroisesti egliini C:hen sitoutuessaan, mistä voidaan päätellä, että kumpikin sitoutuu samaan epitooppiin egliini C-molekyylissä.

Monoklonaaliset vasta-aineet 299S18-20 ja 299S22-1 eivät inhiboi vastavuoroisesti. Tämä merkitsee, että ne sitoutuvat egliini C-molekyylin eri epitooppeihin.

299S22-10:n suhteellinen sitoutumiskapasiteetti on suurin ja 299S18-20:n pienin, kun mitataan se kiinnittyvän radioaktiivisesti merkityn egliini C:n määrä, jonka kiinnittyneet vasta-aineet sitovat.

42 86 744

Kun suoritettiin tandem-ELISA-kokeet, joissa monoklonaaliset vasta-aineet tutkittiin pareittain siten, että toinen vasta-aine kiinnitettiin aina kiinteäksi faasiksi mikrotitrauslevyyn ja toinen oli nestefaasissa entsyymillä, esim. emäsfosfataasilla, merkittynä, voitiin todeta, että ei-ristikkäinreagoivat parit 299S18-20/ 299S22-1 ja 299S22-1/299S22-10 soveltuvat parhaiten sellaiseen kvantitatiiviseen määritykseen, jossa ensimmäistä mainittujen monoklonaalisten vasta-aineparien vasta-aineista eli heikommin egliini C:hen sitoutuvaa käytetään kiinteänä faasina.

Egliini C:n kvantitatiivisessa määrityksessä voidaan myös käyttää kiinteänä faasina keksinnönmukaisia monoklo-naalisia vasta-aineita ja nestefaasina polyklonaalista anti-egliini-C-vasta-ainetta, joka on saatu esim. lampaasta .

Tandem-ElISA-menetelmän herkkyys on noin 1 - 10 ng egliini C:tä näytemillilitraa kohti.

Farmaseuttiset valmisteet

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetuilla ennestään tunnetuilla (esim. egliini B ja egliini C) ja uusilla egliineillä (esim. Ne-asetyyliegliini B ja -egliini C) on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia ja niitä, samoin kuin verijuotikkaista uutettuja egliinejä (vrt. saksalainen hakemusjulkaisu no. 2 808 396) voidaan käyttää ennaltaehkäiseviin tai erityisesti hoitotarkoi-tuksiin.

Keksinnönmukaiset uudet egliiniyhdisteet, kuten N°-asetyyliegliini B ja Na-asetyyliegliini C estävät erittäin voimakkaasti ja spesifisesti ihmisen leukosyyttien elastaasia (HLE), leukosyyttien katepsiinia (H.Cat.G) ja kymotrypsiiniä. Seuraavassa taulukossa on esitetty assosioitumis-nopeusvakiot (ke,e) ja tasapainovakiot (Kj^) muodostuneille entsyymi-inhibiittorikomplekseille reaktioissa, joissa Na-asetyyliegliini C tai kaksi luontaisesti esiintyvää proteaasien inhibiittoria, αχ- 43 8 6 7 4 4 proteinaasi-inhibiittori (c^PI, aikaisempi nimi αχ-antitrypsiini) ja a2-makroglobuliini (a2M), reagoivat HLE:n tai H.Cat.G:n kanssa.

Taulukko: Kineettiset parametrit valittujen protei- naasien vuorovaikutukselle inhibiittorina toimivan Na-asetyyliegliini C:n, ο^Ρϋη tai a2M:n kanssa

Proteiini inhibiittori ^ass^M *se^ 1 K^ [M] HLE α^ΡΙ 1.5*107 irreversiibeli a2M 1.0·107 irreversiibeli

Na-asetyyliegliini 1.4·107 8·10-11

C

H.Cat.G α^ΡΙ 1.0*10® irreversiibeli 3.5*10® irreversiibeli

Na-asetyyliegliini 2.0*10® 5*10-11

C

Olosuhteet: Assosioitumis-nopeusvakiot määritettiin menetelmällä Bieth et ai. (36). Na-asetyyliegliini C:n ja HLE:n tai M.Cat.G:n välinen vuorovaikutus laskettiin va-kiotilan reaktionopeuksista olettaen, että vuorovaikutukset ovat reversiibelejä. Kaikki arvot määritettiin 37 °C:ssa pH-arvossa 7,4.

Tulokset osoittavat, että assosioitumis-nopeusvakiot reaktioissa, joissa N°-asetyyliegliini C tai luontaisesti esiintyvät inhibiittorit axPI ja a2M reagoivat HLE:n tai H.Cat.G:n kanssa, ovat samaa suuruusluokkaa. Na-asetyyli-egliini-entsyymikompleksien suuri stabiilisuus (Kj-ar-vot!), egliinien osoittama erittäin pieni toksisuus, niiden spesifisyys (merkitsevää vuoro-vaikutusta muiden ni-säkäsproteinaasien, erityisesti verenhyytymisjärjestelinään, fibrinolyysijärjestelmään tai komplementtijärjestelmään kuuluvien kanssa, ei ole havaittavissa), niiden 44 86744 N-pään asetyyliryhmästä johtuva stabiilisuus aminopepti-daasien aiheuttaman proteolyyttisen hajoamisen suhteen ja niiden helppo saatavuus keksinnönmukaisen menetelmän avulla verrattuna kehon omiin tekijöihin αχΡΙ ja a2M tekevät näistä yhdisteistä houkuttelevia arvioitaviksi farmakologisesti sellaisissa sairauksissa, joille on ominaista HLE:n aiheuttamat kudosvauriot.

Keksinnönmukaisten yhdisteiden vaikutus ilmenee esimerkiksi kokeellisessa emphysemamallissa. Tuntia ennen emphyseman indusointia antamalla henkitorvensisäisesti hamsterille 0,3 mg HLE:tä annettiin samoin henkitorvensisäisesti 0,5 mg tai 2 mg Na-asetyyliegliini C:tä (kullekin 8 eläimestä). Suojaamattomilla eläimillä (joille ei ollut annettu etukäteen Na-asetyyliegliini C:tä) havaittiin kahden kuukauden kuluttua suoritetussa keuhkojentoi-mintakokeessa ja histologisissa tutkimuksissa vaikeita keuhkontukkeutumisia ja emphysema. Sitä vastoin kaikilla Na-asetyyliegliini C:llä esikäsitellyillä eläimillä oli normaali keuhkojen toiminta. Keuhkojen histologisessa tutkimuksessa löytyi vain kahdesta eläimestä, jotka kuuluivat alemman annoksen (0,5 mg N°-asetyyliegliini C:tä) saaneeseen kahdeksan eläimen ryhmään, paikallisia emphy-semamuutoksia ja muissa eläimissä ei havaittu mitään muutoksia, mikä osoitti, että henkitorvensisäisesti annetulla N°-asetyyliegliini C:llä oli suojavaikutus ja samanaikaisesti sen toksisuus oli vähäinen.

Näin ollen tämän keksinnön mukaisia uusia egliini-yhdisteitä, erityisesti Na-asetyyliegliiniyhdisteitä, voidaan käyttää haluttaessa ennaltaehkäistä ja hoitaa keuhkosairauksia, esim. leukosyyttielastaasin aikaansaamia keuhkosairauksia, kuten keuhkoemphysemaa ja ARDS:ää ("acute respiratory distress syndrome") tai mucoviscidosis ta, ja edelleen verenmyrkytysshokkia ja tulehdussairauksia.

Edelleen voidaan valmistaa farmaseuttisia seoksia, jotka sisältävät vähintään yhtä keksinnönmukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa sekä I: 45 86744 mahdollisesti myös farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta ja/tai apuaineita.

Näille seoksille voi löytyä käyttöä varsinkin edellä-mainituissa tarkoituksissa, kun ne annetaan esim. parente-raalisesti (kuten intravenoosisesti tai intrapulmonaali-sesti) tai paikallisesti. Annostus riippuu ensi sijassa antotavasta ja hoito- tai ennaltaehkäisytarkoituksesta.

Anto voi tapahtua intravenoosisena injektiona tai intrapulmonaalisesti sisäänhengittämällä, esim. Bird-laitteella. Näin ollen parenteraalisesti annettaviksi tarkoitetut farmaseuttiset valmisteet sisältävät yksik-köannoksina antotavasta riippuen noin 10 - 50 mg kek-sinnönmukaisia yhdisteitä annosta kohti. Tehoaineen lisäksi sisältävät nämä farmaseuttiset seokset tavallisesti vielä natriumkloridia, mannitolia tai sorbitolia isotoo-nisuuden säätämistä varten. Ne voivat olla kylmäkuivatussa muodossa tai liuosmuodossa, jolloin liuokset sisältävät mielellään antibakteerisesti vaikuttavaa säilöntäainetta, esim. 0,2 - 0,3 % 4-hydroksibentsoehapon metyyli-esteriä tai etyyliesteriä.

Paikalliseen käyttöön tarkoitettu valmiste voi olla vesiliuoksena, nesteenä tai geelinä, öljypitoisena liuoksena tai suspensiona tai rasvapitoisena tai erityisesti emulsiovoiteena. Vesiliuoksen muodossa oleva valmiste saadaan esim. siten, että keksinnönmukaiset tehoaineet tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat liuotetaan vesipitoiseen puskuriliuokseen, jonka Ph on 4 -7,5, ja mahdollisesti lisätään vielä muuta tehoainetta, kuten tulehduslääkettä, ja/tai polymeeristä tartuketta, kuten polyvinyylipyrrolidonia, ja/tai säilöntäainetta. Tehoainetta käytetään 10 ml:ssa liuosta tai 10 g:ssa geeliä noin 0,1-5 mg, mielellään 0,25 - 1,0 mg.

Paikalliseen käyttöön tarkoitettu öljyvalmiste saadaan aikaan suspendoimalla keksinnönmukaiset tehoaineet tai niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat öljyyn ja lisäämällä mahdollisesti turvotusaineita, kuten alumiini-stearaattia, ja/tai pinta-aktiivisia aineita (tensidejä), 46 86 744 joiden HLB-arvo ("hydrophiliclipophilic balance") on alle 10, kuten useampiarvoisten alkoholien rasvahappomonoes-tereitä, esim. glyseriinimonostearaattia, sorbitaanimono-lauraattia, sorbitaanimonostearaattia tai sorbitaanimono-oleaattia.

Rasvapitoinen voide saadaan esim. suspendoimalla keksinnönmukaiset tehoaineet tai niiden suolat levitettävissä olevaan voidepohjaan ja lisäämällä mahdollisesti tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiovoide saadaan homogenoimalla keksinnönmukaisten aineiden tai nii den suolojen vesiliuos pehmeään, levitettävissä olevaan voidepohjaan ja lisäämällä tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nämä paikalliset antomuodot voivat sisältää myös säilöntäainetta. Tehoaineen määrä noin 10 g:ssa perusmassaa on noin 0,1 - noin 5 mg, mielellään 0,25 - 1,0 mg.

Sisäänhengityspreparaatit, joilla voidaan käsitellä hengitystiet intrapulmonaarista antotapaa käyttäen, ovat esim. aerosoleja tai suihkeita, joissa farmakologinen tehoaine on jakautuneena liuos- tai suspensiopisaroihin. Valmisteet, joissa farmakologinen tehoaine on liuoksena, sisältävät lisäksi sopivaa ponneainetta ja tarvittaessa lisäliuotinta ja/tai stabilointiainetta. Ponnekaasun tilalla voidaan myös käyttää paineilmaa, joka voidaan saada aikaan sopivan paineistus- ja jännityksenpäästölaitteen avulla.

Erittäin hyvin soveltuvia antolaitteita ovat Bird-sisäänhengityslaitteet, joita käytetään lääketieteessä, ja jotka näin ollen ovat ennestään tunnettuja, tehoaineen liuos sijoitetaan laitteeseen ja sumutetaan pienellä ylipaineella ja viedään hengittämällä potilaan keuhkoihin.

Iästä, yksilöllisestä tilasta ja sairauden laadusta riippuen on lämminverisillä (ihmiset tai eläimet), noin 70 kg painavilla sopiva annos intrapulmonaarisesti annettuna noin 10 - noin 30 mg sisäänhengitystä kohti (kerran tai kahdesti vuorokaudessa) ja intravenoosisesti annettu- I; 47 8 6 7 4 4 na noin 10 - noin 1000 mg vuorokaudessa.

Terapeuttisesti tehoavat sputumin ja plasman sisältämät pitoisuudet, jotka voidaan määrittää immunologisilla menetelmillä, kuten ELISAlla, ovat välillä 10 - 100 pg/ml (noin 1-10 pmol/l).

Keksinnön toteutuksessa käytetään erityisesti esimerkeissä kuvattuja egliiniä koodittavia DNA-sekvenssejä, tällaisia DNA-sekvenssejä sisältäviä ilmentämisplasmide-ja, tällaisilla ilmentämisplasmideilla transformoituneita mikro-organismeja, egliinienvastaisia monoklonaalisia vasta-aineita, hybridoomasoluja, jotka tuottavat tällaisia vasta-aineita, ja immunomäärityksiin tarkoitettuja testipakkauksia, ja keksintö koskee erityisesti esimerkeissä kuvattua menetelmää esimerkeissä mainittujen uusien egliiniyhdisteiden valmistamiseksi transformoituneiden mikro-organismien avulla.

Liitteenä olevissa kuvissa on esitetty joitakin tämän keksinnön toteutustapoja, joita selostetaan seuraa-vassa kokeellisessa osassa.

Kuva 1 on kaavioesitys egliini C-geenin osien Fj(C) ja F2 syntetisoinnista.

Kuva 2 esittää plasmidin pML 87 rakentamista, joka on egliini C-geenin osan F^C) kloonausvektori.

Kuva 3 esittää vastaavasti plasmidin pML 136 rakentamista, joka on egliini C- ja egliini B-geenin osan F2 kloonausvektori.

Kuva 4 esittää kloonausvektorin pML141 rakentamista, joka sisältää F1(C)-F2-DNA:n.

Kuva 5 on kaavioesitys vektorin pHRil48 valmistamisesta, joka sisältää trp-promoottorin.

Kuva 6 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin pML 147 rakentamisesta, joka sisältää egliini C-geenin /F1(C)-F2-DNA/ trp-promoottorin ohjauksessa.

Keksintöä valaistaan, mutta ei millään tavalla rajoiteta seuraavilla esimerkeillä.

48 S6744

Kokeellinen osa

Esimerkeissä käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset : TNE Liuos, joka sisältää 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 5 mM EDTA SDS natriumdodekyylisulfaatti EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo DTT 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaanidioli) BSA naudan seerumialbumiini

EtBr etidiumbromidi

Tris tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani

Tris.HCl Tris:n monohydrokloridi

Esimerkki 1: Suojatun nukleosidi-polystyreenihartsin valmistus

Bz /Λ MMT-O-C -0-C0CHoCH„C0-NHCHo—· ·—( P) 2 2 2 \ / ·=·

Liuokseen, jossa on 3,1 g (5 mmol) 51 -(4-metoksi-trityyli)-N-bentsoyyli-deoksisytidiiniä 20 mltssa absoluuttista pyridiiniä, lisätään 750 mg meripihkahappo-anhydridiä ja 910 mg 4-dimetyyliaminopyridiiniä ja saadun seoksen annetaan olla huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Pyridiiniliuos haihdutetaan pieneen tilavuuteen ja sekoitetaan 200 ml:aan etikkahapon etyyliesteriä, ravistellaan kaksi kertaa 200 ml:n kanssa (yhteensä 400 ml) 0,1 M fosfaattipuskuria, johon oli lisätty 10 ml kyllästettyä ruokasuo1 a 1iuosta, ja sen jälkeen pestään vielä kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaania. Saostunut tuote ero 49 86744 tetaan ja hierretään kaksi kertaa eetterin kanssa ja liuotetaan sen jälkeen 300 mlraan etikkahapon etyyliesteriä ja ravistellaan 0°C:ssa 180 ml:n kanssa 0,1 M kaliumve-tysulfaattia, jonka pH on 2,5. Etikkaesteriliuos pestään kahdesti vedellä, kuivataan natriumsulfaati1la, suodatetaan, lisätään 0,5 ml pyridiiniä, haihdutetaan ja laimennetaan lisäämällä heksaania tipoittain. Saostunut meripihkahappojohdannainen suodatetaan talteen.

1,17 g tätä yhdistettä sekä 190 mg N-hydroksimeri-pihkahappoimidiä liuotetaan seokseen, jossa on 4 ml etikkahapon etyyliesteriä ja 2 ml dimetyyljformamidia, ja 0°C:ssa lisätään 370 mg N,N'-disykloheksvy1ikarbodi-imidiä. Seoksen annetaan seisoa yön yli jääkaapissa ja tänä aikana saostunut N,N'-disykloheksyvlivirtsa-aine suodatetaan pois, suodos laimennetaan etikkahapon etyyliesterillä, uutetaan kylmällä 0,1 M natriumvety-karbonaatilla ja vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä. Jäännös kromatografoidaan etikka-hapon etyyliesterillä silikageelissä. TLC: 0,58 dikloorimetaani-metanoliseoksessa (9:1).

88 mg tätä N-sukkinimidoyylimeripihkahappoesteriä sekoitetaan 20 tuntia 1 g:n kanssa aminometyylipoly-styreeniä (amiinipitoisuus 110 ymol/g) seoksessa, jossa on 2 ml dikloorimetaania ja 4 ml dimetyyliformamidia. Polymeerihartsi suodatetaan talteen ja pestään dime-tyyliformamidilla, metanolilla, dikloorimetaanilla ja metanolilla. Kuivaamisen jälkeen reagoimattomat amino-ryhmät asetyloidaan siten, että hartsia sekoitetaan 30 minuuttia etikkahappoanhydridin (1 ml) ja 4-dimetyvli-aminopyridiinin (100 mg) kanssa 6 mlrssa pyridiiniä. Polymeerihartsi pestään dikloorimetaanilla, dimetyyli-formamidilla, metanolilla ja dikloorimetaanilla ja kuivataan vakiopainoon. Spektroskooppinen metoksitri-tyylimääritys (MMT) antaa lataukseksi 85 ymol/g.

Esimerkki 2: Seuraavat suojatut nukleosidi -polystyreeni- hartsit valmistetaan esimerkin 1 mukaisesti: 50 86744 • -· // \ MMT-O-T-OCOCH-CH CONHCH —· *—(P) 2 2 2 \ / ·-· 51 - (4-metoksitrityyli)-tymidiinistä, lataus 92 ymol/g.

ib MMT O G -0C0CH2CH2C0NHCH —· ._(p) \ / • - · 5'-(4-metoksitrityyli)-N-isobutyryyli-deoksiguano-siinista, lataus 75 ymol/g.

Esimerkki 3: Trinukleotidin synteesi 0

II

MMT-O——T -o P—0--CH2CH2CN

1 ·—· I / \ o-· · \ /

• SO

/ L Cl J3 a) Dinukleotidin synteesi 7,73 g (15 mmol) 5(4-metoksitrityyli)-tymidiiniä (MMT-O-T-OH) haihdutetaan kahdesti absoluuttisen pyri-diinin kanssa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan absoluuttista tetrahydrofuraania ja lisätään tipoittain sekoituksen alaisena ja kosteudelta suojattuna 80 ml:aan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotriatsolyyli)-fosfaatin 0,2 M tetrahydrofuraaniliuosta ja saatua reaktioseosta sekoitetaan 1 tunti huoneenlämpötilassa. Näin saatu 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-51 -(4-metoksitrityyli)-tymidiini-31-fosfaattiliuos jaetaan kolmeen osaan.

l! 51 86744 a) Hydrolysointi trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-51 -(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatiksi

Kolmasosaan edellä saatua 2-kloorifenyyli-1-bentso-triatsolyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattiliuosta lisätään jäähdytyksen alaisena 100 ml 0,5 M trietyyliammoniumbikarbonaattia. 15 minuutin ku luttua uutetaan dikloorimetaanilla. Dikloorimetaani-liuos pestään vedellä, haihdutetaan ja lisätään tipoittaan petrolieetteriä.i Saatu sakka otetaan talteen, pestään eetteri-petrolieetteriseokse1la (1:1) ja kuivataan vakuumissa. TLC: 0,35 dikloorimetaani-metanoli- vesiseoksessa (75:22:3).

β) Esteröinti 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-5’-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatiksi ja 4-metoksi-trityylisuojaryhmän poistaminen

Kolmasosaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5 ' -(4-metoksitrityyli)-tymidiini-fosfaattia lisätään 1,3 ml 2-syanoetanolia ja 2 ml pyridiiniä. Seos jätetään yön ajaksi huoneenlämpötilaan. Liuottimet haihdutetaan pois vakuumissa ja jäännös liuotetaan etikkahapon etyyli-esteriin ja ravistellaan useaan kertaan 0,1 M fosfaatti-puskurilla, pH7, ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin.

Sakka suodatetaan talteen, liuotetaan 50 ml:aan dikloo-rimetaani-metanoliseosta (7:3) ja saatuun liuokseen lisätään 0°C:ssa liuos, jossa on 3,8 g p-tolueenisulfoni-happomonohydraattia 75 ml:ssa dikloorimetaani-metanoli-seosta (7:3). 2 tunnin kuluttua reaktioliuos laimen netaan dikloorimetaanilla ja ravistellaan kylmän nat-riumvetykarbonaattiliuoksen kanssa. Orgaaninen faasi haihdutetaan ja siihen lisätään heksaania. Saostunut 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfaatti kro-mafografoi dann silikageelissä dikloorimetaani-metanoii-seoksella (96:4). TLC: 0,45 dikloorimetaani-metano- liseoksessa (9:1).

52 86744 γ) Kondensointi 5'-(4-metoksitrityyli)-3'-syanoetyy1i) -bis-tymidiini-dinukleotidiksi 2,2 g:sta 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-31-fosfaattia poistetaan vesi haihduttamalla kahdesti absoluuttisen pyridiinin kanssa, liuotetaan 20 ml:aan aosol. tetrahydrofuraania ja lisätään jäijelläolevaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-metoksitri-tyyli)-tymidiini-3'-fosfaattiliuoksen kolmannekseen.

Kun reaktioliuosta on pidetty 18 tuntia huoneenlämpötilassa, siihen lisätään jääjäähdytyksessä 10 ml vettä ja 200 ml etikkahapon etyyliesteriä. Orgaaninen faasi pestään useaan kertaan natriumvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen. Fosfaattiosasta ja 5'- tai 3'-pääs tä suojattu dinukleotidi saostetaan lisäämällä tipoit-tain eetteri-heksaaniseokseen (1:1). TLC: 0,48 di- kloorimetaani-metanoliseoksessa (9:1).

b) Trinukleotidin synteesi 1,17 g (1 mmol) edelläkuvattua täysin suojattua di-nukleotidia liuotetaan 30 ml:aan dikloorimetaani-meta-noliseosta (7:3) ja saatuun liuokseen lisätään jää-jäähdytyksessä liuos, jossa on 1,9 g tolueenisulfoni-happomonohydraattia 20 ml:ssa dikloorimetaani-metanoli-seosta (7:3). 2 tunnin kuluttua lisätään jääkylmää natriumvetykarbonaattiliuosta ja uutetaan dikloorimetaa-nilla. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin. Saostunut epäpuhdas dinukleotidi, jonka 5'-hydroksiryhmä on vapaa, kromato-grafoidaan silikageelissä gradientissa, jossa on 2 - 8 % metanolia dikloorimetaanissa. TLC: 0,33 dikloori- metaani-metanoliseoksessa (9:1).

850 mg tätä 5'-hydroksi-dinukleotidia ja 1,06 g trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattia (vrt. kohta a)a) haihdutetaan kahdesti pyridiinin kanssa ja liuotetaan sen jälkeen 10 53 8 6 7 4 4 mlraan absoluuttista pyridiiniä ja lisätään 560 mg me-sityleenisulfonyyli-3-nitro-1, 2,4-triatsolidia (MSNT) 2 tunnin kuluttua lisätään 2 ml jääkylmää vettä ja tästä tunnin kuluttua uutetaan dikloorimetaanilla. Orgaaninen faasi pestään kyllästetyllä natriumvetykarbonaa-tilla ja vedellä, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään eetteriä. Saostunut trinukleotidi puhdistetaan kromatografisesta silikageelillä. 0,45 dikloorimetaani- metanoliseoksessa (9:1).

Esimerkki 4: Esimerkin 3 mukaisesti valmistetaan seu- raavat trinukleotidit, joiden kaava on seuraava 0 0 0 , Il , Il , Il

MMT—0—B —0—P—0—B—0—P—0—B—0—P —OCH.CH CN

• — · · — · · — ·

/ \ / \ // W

0—· · 0—· · 0—· · \ / \ / \ / 1=1 ·'· I-· / / /

Cl Cl Cl 12 3 12 3 lyhennettynä B B B . Nukleosideista B , B ja B käytetään seuraavia lyhenteitä: A = N-bentsoyyli-deoksiadenosiini C = N-bentsoyyli-deoksisytidiini G = N-isobutyryyli-deoksiguanosiini T = tymidiini a) a)

Yhdiste Rf Yhdiste Rf TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 AAT 0,49 TAA 0,53 AAC 0,46 TAG 0,60 AAA 0,51 54 8 6744 TGT 0,42 AGT 0,45 TGG 0,43 AGA 0,49 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GCT 0,55 CCG 0,47 GCA 0,49 CAT 0,55 GCG 0,48 CAA 0,52 GAT 0,44 CAG 0,44 GAC 0,48 CGT 0,49 GAA 0,50 GGA 0,44 GGT 0,46 a) Ohutkerroskromatogrammi silikageelillä käyttämällä dikloorimetaani-metanoliseosta (9:1).

Esimerkki 5: 61 emäksen pituisen DNA-jakson synte tisointi, joka ulottuu komplementaarisen DNA-säikeen emäksestä no. 172 emäkseen no. 232 (172/61 komplementaarinen ) a) Trinukleotidin 2-syanetyylisuojaryhmän poistaminen 15 ymol esimerkin 3 tai 4 trinukleotidia liuotetaan kosteudelta suojattuna 60 yl:aan pyridiini-asetonitriili-trietyyliamiiniseosta (1:1:1). Seosta pidetään 1 tunti huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen lisätään tipoittain 0,7 ml peroksiditonta eetteriä ja sakka sentrifugoidaan talteen. Epäpuhdas trietyyliammoniumsuola liuotetaan 50 ui:aan pyridiiniä ja saostetaan uudestaan 0,5 ml: 11a eetteriä, sentrifugoidaan talteen ja kuivataan 15 tuntia suurtyhjössä.

b) Osittain suojatun trinukleotidin liittäminen polystyreenihartsiin sidottuun oligonukleotidiketjuun

Kaikki toimenpiteet suoritetaan kosteudelta suojattuina 280 μ1:η vetoisessa reaktioastiassa käyttämällä mikroprosessoriohjattua liuottimien ja reagenssien lisäystä. 17,6 mg (1,5 Umol) sytidiini-polystyreenihart-sia (esimerkki 1) laitetaan etukäteen reaktioastiaan 55 86744 ja sitten suoritetaan seuraavat toimenpiteet: 1. metyleenikloridi, 2 ml/min, 5 min; 2. metyleenikloridi-isopropanoliseos (85:15), 2 ml/min, 2 min; 3. sinkkibromidi 1M ja 1,2,4-triatsoli 0,02 M metylee-nikloridi-isopropanoliseoksessa (7:3), 1 ml/min, 2 - 3,5 min; 4. metyleenikloridi-isopropanoliseos (85:15), 2 ml/min, 3 min; 5. trietyyliammoniumasetaatti 0,5 M DMF:ssä, 2 ml/min, 10 min; 6. molekyyliseulalla kuivattu pyridiini, 2 ml/min, 5 min; 7. tetrahydrofuraani (peroksidivapaa, molekyyliseu-lalla kuivattu), 2 ml/min, 5 min; 8. typpivirta, 10 min; 9. injektoidaan 15 umol trinukleotidia AAA (trimetyy-liammoniumsuola kohdasta a)) ja 13,3 mg (45 umol) mesi-tyleenisulfonyyli-3-nitro-1,2,4-triatsolidia (MSNT) liuotettuna 160 uljaan pyridiiniä; 10. 40°C, 30 min; 11. pyridiini, 2 ml/min, 5 min; 12. asetanhydridi 5 % ja 4-dimetyyliaminopyridiini 2,5 % pyridiinissä, 2 ml/min, 5 min; 13. pyridiini, 2 ml/min, 5 min; 14. pyridiini-isopropanoliseos (1:1), 2 ml/min, 3 min.

Kaikki 14 toimenpidettä toistetaan 19 kertaa, mutta 9. toimenpiteessä käytetään AAA:n tilalla järjestyksessä seuraavia trinukleotideja (kohta a)) trietyyli-ammoniumsuoloinaan: AGA, TGT, GGT, CTG, TAC, TAG, CGT, CAA, TAA, GGT, CAT, GAA, GCG, CAT, CAA, AAC, CCT, GAT, CAG. Keskimääräinen yhteenliittymissäänkö on 96 %. Lopputuotteen rakenne on seuraava: MMT-CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAAC- polystyreeni 56 86744 c) DNA-jakson irrottaminen kantaja-aineesta ja suoja-ryhmien poistaminen

Seosta, jossa on 40,2 mg (noin 0,66 ymol) DNA-synteesihartsi /172/61 komplementaarista, 66 mg (0,40 mmol) o-nitrobentsaldoksiimia ja 50 yl(0,40 mmol) 1,1,3,3-tetrametyyliguanidiinia 400 Oi;ssa 95-prosenttista py-ridiiniä, pidetään 3 tuntia 50°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Pyridiini puhalletaan pois typellä ja jäännökseen lisätään 1,6 ml ammoniakin vesiliuosta (33 %) ja pidetään suljetussa astiassa 24 tuntia 50°C:ssa.

Erottuneesta nestefaasista poistetaan ammoniakki vakuumissa ja pestään kolme kertaa peroksidittomalla di-etyy1ieetteri1lä (3x3 ml). Pienimolekyyliset aineosat erotetaan Biogel P6-pylväässä (100 - 200 mesh, 3 x 66 cm, 0,01 M trimetyyliammoniumvetykarbonaatti, pH 7,5, 1,5 ml/min) ja sen jälkeen eristetään 285 ODs (260 nm) DNA.

Kaikkiaan eristetään 60 ODs HLPC-pylväässä (PRP-1/ Hamilton, 250 x 4,6 mm). Gradientti (liuos A: 0,05 M trietyyliammoniumasetaatti, pH 7,0; liuos B: liuos A: asetonitriili 1:1) 30 % B:tä A:ssa—9-60 % B:tä A:ssa, 20 min 50°C:ssa, 2 ml/min. Lipofiilinen pääpiikki kerätään (retentioaika noin 14 min), konsentroidaan DE52-selluloosapylväässä (Whatman), eluoidaan ja saostetaan etanolilla. 4-metoksitrityylisuojaryhmän irrottamiseksi sakka liuotetaan 50 μl:aan etikkahappo-vesiseosta (4:1) ja liuosta pidetään 45 minuutia huoneenlämpötilassa. Reaktiotuote lyofilisoidaan, saostetaan etanolilla ja puhdistetaan elektroforeettisesti 8% polyak-ryyliamidigeelillä ( 7M urea). Odotettua DNA-kokoa vastaava kaista leikataan irti, tuote elektroeluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosapylväässä ja saostetaan etanolilla DNA, jonka rakenne on seuraava: 5' -CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAAC-3' li 57 86 744

Esimerkki 6: Seuraavat DNA-jaksot (5' - 3') valmiste taan esimerkin 5 mukaisesti: 1/40

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTT

30/37 komplementaarinen

AACAGTTTTACCAACAACTTCTGGGAAAGATTTCAGT

67/34 GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACC 91/37 komplementaarinen (C)

CCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

91/37 komplementaarinen (B)

CCGGCAGGAAATGAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

124/61

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACC

Lisäksi valmistetaan seuraavat lyhennetyt jaksot: 1/40 (Δ 12) (C)

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTT

ja 1/40 (Δ18) (C")

CTGGAATTCATGCTGAAATCTT

Esimerkki 7: Jaksojen 30/37, 67/34, 124/61 ja 172/61 fosforylointi 5'-päiden fosforylointi ja radioaktiivinen merkit- 32 seminen suoritetaan /y- P/ATP:llä ja T^-polynukleo-tidikinaasilla (Boehringer), kuten viitteessä (19) on selostettu.

Esimerkki 8: Polymerointi kahdenteeksi lii (egliini C- ja egliini B-geenin osa F^) 50 anoi jaksoa 124/61/kinasoitu ja jaksoa 1 72/61 /kinasoitu 58 86744 liuotetaan kumpaakin 24 ui :aan vettä, liuosta kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:Ssä ja jäähdytetään 5 minuutin kuluessa 12°C:een. Lisätään 4 μ1 Endo-R-puskuria (0,1 M Tris. HC1, pH 7,5, 66 mM MgC^/ 66 mM β-merkaptoetanolia, 0,6 M NaCl), 1 0 μι deoksinukleosiditrifosfaattiseosta -3 (dATP, dCTP, dGTP, TTP, kutakin 2.10 M, pH säädetty NH^rlla arvoon 7,0) ja 2 μ1(10 yksikköä) DNA-poly-meraasi I:n Klenow-palasta ja saatua seosta inkuboi-daan 30 minuuttia 12°C:ssa. Reaktio katkaistaan kuumentamalla 3 minuutia 90°C:ssä ja saatua seosta säilytetään jatkokäyttöä varten -80°C:ssa.

Vastaavalla tavalla polymeroidaan jaksot 1/40 ja 30/ 37, 67/34 ja 91/37 (C) tai 67/34 ja 91/37(B) kaksois-säikeiksi I, II (C) tai II (B).

Kaksoissäikeiden I - III rakenteet ovat seuraavat:

Kaksoissäie I

s

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGCTCTTCAACAACCATTTTCACAA

Kaksoissäie II (C)

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

Kaksoissäie II (B)

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC

Kaksoissäie III (egliini C- ja egliini B-geenin osa F )

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTAC

GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATG

59 86744

Samalla Lavalla polymeroidaan osista 1/40 (Λ12) (C’)ja 30/37 sekä osista 1/40 ( Δ 18) (C") ja 30/37 kaksois- säikeet I (C') ja ( (C").

Kaksoissäikeiden I (C) ja I (C") rakenteet ovat seuraavat:

Kaksoissäie I (C)

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

Kaksoissäie I (C")

CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTAGGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

Esimerkki 9: Kaksoissäikeen I liittäminen kaksoissäi- keeseen II (C), egliini C-geenin osan (C) valmistaminen

Kaksoissäiettä I ja kaksoissäiettä II (C) (vrt. esimerkki 8; kinasoitu vain A ja G 5'-päistä) liuotetaan kumpaakin 60 pmol 54 plraan ligaasipuskuria (66 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgC^r 10 mM ditiotreitolia, 5 mM ATP), lisätään 6 μΐ (= 6 yksikköä) T^-DNA-ligaa-sia (Boehringer) ja inkuboidaan 21 tuntia 20°C:ssa.

Reaktio pysäytetään kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa ja DNA saostetaan fenoli/kloroformiuuton jälkeen etanolilla.

Seos erotetaan03^83 elektroforeesilla 8% polyakryy-liamidigeelillä (natiivi), 122 - 132 emäsparia sisältävät yhteenliittymistuotteet elektroeluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosapylväässä ja saostetaan eluoinnin jälkeen etanolilla.

Egliini C-geenin osan F^ (C) rakenne on seuraava:

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

60 8 6744

Vastaavalla tavalla liitetään kaksoissäie I (C') tai I (C") ja kaksoissäie II, kutakin 60 pmol·, lyhennetyn egliini C-geenin osiksi F1 (C) tai F1 (C").

Osien F^ (C') ja F^ (C") rakenteet ovat seuraavat:

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

F1 (C)

CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

F1 (C " )

Esimerkki 10; Kaksoissäikeen I liittäminen kaksoissäi-keeseen II (B), egliini B-geenin osan F^ (B) valmistaminen

Esimerkissä 9 kuvatulla tavalla liitetään yhteen kaksoissäie I ja kaksoissäie II (B), 60 pmol kutakin. Egliini B-geenin osan F^ (B) rakenne on seuraava:

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTCACTTTACAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC

Esimerkki 11: Plasmidin pML87 rakentaminen, joka si sältää egliini C-geenin F^(C)-DNA:n (kuva 2) li 61 86744 a) Linearisoidun vektorin pBR322/EcoRI/BalI rakentaminen 30 \iq pBR322-plas nidi-DNA:ta leikataan 5 yksiköllä restriktioendonukleaasia Ball (Biolabs) 5 tuntia 37°C: ssa 200 Ulrssa liuosta, jossa on 100 pg/ml gelatiinia. Sitten liuoksen pitoisuudeksi säädetään 100 mM Tris.

HC1 (pH 7,5) ja 50 mM NaCl ja DNArta leikataan 2 tuntia 37°C:ssa 30 yksiköllä EcoRI-restriktioendonukleaasia (Biolabs). Sitten liuos säädetään TNE-pitoisuuteen, uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja kloroformia ja pilkottu DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia yön aikana -20°C:ssa.

pBR322-DNA:sta irti leikattu vektori (pBR322/EcoRI/ Ball, 2916 emäsparia) erotetaan pienestä DNA-jak-sosta (1445 emäsparia) tiheysgradienttisentrifugoinni1-la käyttämällä 5 - 23 ?. sakkaroosia liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 36 000 1/min TST 41-roottorissa (Kontron AG) 16 tunnissa 15°C:ssa. Sitten sentrifugoi-dusta liuoksesta otetaan 0,2 ml:n jakeita ISCO-gradi-entinkerääjällä. Ne jakeet, jotka sisältävät suurta DNA-jaksoa (2916 öBasparia) , yhdistetään ja DNA saostetaan alkoholilla. Sakka liuotetaan 100 plraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 8) ja 0,1 mM EDTA, ja säilytetään kloonausvektorina käyttöön asti -20°C:ssa. Näin saadaan 5,1 yg (= 10,5 pmol päitä ) DNArta.

b) F^(C)-DNA/EcoRI:n valmistus 16 ng (= 0,84 pmol päitä) kemiallisesti syntetisoitua (ks. esimerkki 9) (C)-DNA:ta leikataan 1 tunti 37°C:ssa 5 yksiköllä restriktioendonukleaasia EcoRI (Biolabs) 50 Ulrssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl ja 100 Ug/ml gelatiinia. Sitten liuokseen lisätään 0,5 yg( = 1 pmol päitä) li-nearisoitua vektoria pBR322/EcoRl/BalI (esimerkki 11a). Entsyymi inaktivoidaan 10 min. kuluttua kuumentamalla 65°C:een ja saatu liuos säädetään TNE-pitoisuuteen 62 86744 ja uutetaan fenoli/kloroformilla DNA seoste taan alkoholilla. Saostunutta DNA:ta säilytetään alkoholin ajLla -20°C:ssa jatkokäyttöön asti.

c) pBR322/EcoRl/BalI-vektori-DNA:n liittäminen {C)— DNA/EcoRI-jaksoon ja plasmidin pML87 rakentaminen

Esimerkissä 11b) saatu DNA-sakka, joka sisältää molemmat mainitut DNA-jaksot, liuotetaan 30 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja käsitellään 25 yksiköllä/μΐ T^-DNA-ligaasia (Biolabs) 16 tuntia 15°C:ssa. Näin liuoksessa syntyy yhdistelmäplas-midi pML87, joka sisältää (C)-DNA:n.

d) E. coli HB 101:n transformointi plasmidilla pML87

Transformoinnissa tarvittavat kalsiumilla esikäsi-tellyt E. coli HB101-solut valmistetaan menetelmällä Mandel et ai. (6).

Kohdassa c) saatua liuosta, joka sisältää yhdistel-mäplasmidin pML87, kuumennetaan 10 minuuttia 65°C:ssa T^-DNA-ligaasin inaktivoimiseksi ja sen jälkeen jäähdytetään 37°C:een. 10 μΐ tätä reaktioseosta lisätään 150 ylraan kalsiumilla esikäsiteltyjä E. coli HB101-soluja, jotka ovat liuoksessa, jonka pitoisuus on 10 mM MgCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), liuoksen kokonaistilavuuden ollessa 200 μΐ.

Sitten tätä seosta jäähdytetään 30 minuuttia jäässä, kuumennetaan 2 minuuttia 42°C:ssa ja sen jälkeen jätetään 50 minuutiksi seisomaan 37°C:ssa 1 ml:aan L-alustaa (vert. esimerkki 21). Sitten seos levitetään 0,2 ml:n erissä 5 agarlevylle (McConkey-agar, Difco), jotka sisältävät 60 ug/ml ampisilliiniä (Serva). Sitten agarlevyjä pidetään 16-18 tuntia 37°C:ssa. Näin saadaan 470 ampisilliinille vastustuskykyistä, transformoitunutta E. coli HB 101-pesäkettä.

li 63 86744 e) F^ (C)-DNA:ta sisältävien pesäkkeiden seulonta 470 transformoitunutta pesäkettä (esimerkki 11d) painetaan nitroselluloosasuodattimelle B85 (Schleiher & Schull). Pesäkkeet lysoidaan menetelmällä Grunstein ja Hogness (24) ja niiden denaturoitunut DNA kiinnitetään suodattimeen. Sitten seuraa suodattimen esi-hybridisointi käsittelemällä 4 tuntia 64°C:ssa 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 4 x SET /= liuos, jossa on 30 mM Tris.HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA/, 0,1 % (paino/tilav) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5 % SDS ja 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkor-van DNA:ta. Sitten nitroselluloosasuodattimia käsitellään 16 tuntia 64°C:ssa "^Prllä radioaktiivisesti mer- 3 4 kityllä koettimella (noin 10 - 10 Cerenkov-yksikköä

per suodatin) 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 5 x SET, (paino/tilav) Fj.col] 400, 0,2 Z SDS

ja 50 ug/ml denaturoitua vasikan kateenkorvan DNA:ta. Koettimena käytetään 91/37 komplementaarista (C)-oligonukleotidia (ks. esimerkki 6).

Sitten suodattimet pestään ensin kaksi kertaa huoneenlämpötilassa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,2 % SDS, ja seuraavaksi kaksi kertaa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,5 % SDS, 60°C:ssa (ensin 30 minuuttia ja sitten 60 minuuttia). Sitten suodattimet kuivataan 3 MM paperin (Whatman) välissä ja sijoitetaan -80°C: ssa 1 - 2 vuorokaudeksi röntgenfilmille (Fuji) käyttäen vahvistus foliota (Intensifying screen, Ilford).

Saadussa autoradiogrammissa näkyy 71 positiivista pesäkettä (kloonia), joita voidaan käyttää jatkotyöskentelyssä, ja joista yhdelle annetaan nimi pML87.

Vastaavalla tavalla leikataan kemiallisesti syntetisoitu F^ (C')-DNA tai F^ (C")-DNA (v^t. esimerkki 9) EcoRI:llä ja liitetään yhteen linearisoidun vektorin pBR322/EcoRl/BalI kanssa, jolloin saadaan plasmidi pML87 (C1), joka sisältää (C)-DNA:n, tai plasmidi pML87 (C"), joka sisältää F^ (C")-DNA:n. E. coli HB101- 64 86744 transformoidaan plasmidilla pML87 (C') tai pML (C") ja suoritetaan viljely ampisiHiinia sisältävillä agarlevyillä. Näin saadaan 95 ja 120 ampisiniinille vastustuskykyistä pesäkettä vastaavasti. Kun suoritetaan transformoituneiden pesäkkeiden seulonta 91/37 komplementaarisella (C)-oligonukleotidilla, löydetään 37 F^(C')-DNA:n ja 58 F1 (C")-DNA:n sisältävää pesäkettä vastaavasti.

Esimerkki 12: Plasmidin pML90 valmistaminen, joka si sältää egliini B-geenin F^(B)-DNA:n

Samoin kuin esimerkissä 11b) on kuvattu, 16 yg kemiallisesti syntetisoitua F^ (B)-DNA:ta leikataan 5 yksiköllä restriktioendonukleaasia EcoRI ja sekoitetaan pBR322/EcoRI/Ball:n kanssa, joka on sitä ennen linea-risoitu. Entsyymi inaktivoidaan ja DNA seostetaan alkoholilla. DNA-sakka käsitellään esimerkin 11c) mukaisesti T^-DNA-ligaasilla, jolloin syntyy plasmidi, joka sisältää F.j (B)-DNA:n.

Yhdistelmäplasmidin sisältävä liuos käytetään esimerkin 11d) mukaisesti E. coli HB101-solujen transfor-mointiin, jotka on sitä ennen käsitelty kalsiumilla. Näin saadaan 310 ampisilliinille vastustuskykyistä, transformoitunutta E. coli HB101-pesäkettä.

Näistä 310 pesäkkeestä tutkitaan F^(B)-DNA:n läsnäolo samoin kuin esimerkissä 11e) käyttämällä koettimena 91/37 komplementaarinen (B)-oligonukleotidia. Saadusta autoradiogrammista löytyy 55 positiivista jatkokäsittelyyn kelpaavaa kloonia. Yhdelle niistä annetaan nimi pML90.

Esimerkki 13: Plasmidin pML136 valmistus, joka sisäl tää F2~DNA:n (kuva 3) a) Linearisoidun vektorin pBR322/BamHI/NruT valmistani i non 15 yg pBR322 plasmidi-DNA:ta leikataan 30 minuut- 65 86744 tia 37°C:ssa 30 yksiköllä restriktioendonukleaasia Helini 11' liuoksessa, jossa on 100 mM NaCl, 6 mM Tris.

HC1 (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 yg/ml gelatiinia.

Sitten liuokseen lisätään 15 yksikköä restriktioendonukleaasia NruI ja leikataan 2 tuntia 37°C:ssa.

Reaktioseosta kuumennetaan 10 minuuttia 70°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi. Sitten molemmat DNA-jak-sot erotetaan toisistaan geelielektroforeesilla käyttämällä 1-prosenttista matalalla sulavaa agaroosia Tris-asetaatti-EDTA-puskurissa, pH 8. Agaroosigeelin sisältämä DNA värjätään EtBrillä ja sen jälkeen geelistä leikataan irti se kohta, jossa on pBR322/BamHI/NruI-vektorin (= 3766 emäsparia) kaista, ja tämä pala nes-tcytetään pitämällä 10 minuuttia 65°C:ssa. Sitten nes-teytettyyn agaroosigeelipalaan lisätään 2 tilavuutta 100 mM Tris.HCl:ää (pH 8,7) ja seos jäähdytetään 37°C: een. Tämän seoksen annetaan reagoida 30 minuuttia 37°C:ssa 0,5 yksikön kanssa vasikansuolesta saatua emäsfosfataasia (Boehringer). Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65°C:ssa.

Tähän fosfataasilla käsiteltyyn DNA-liuokseen lisätään 20 tilavuutta TNE:tä ja DNA puhdistetaan menetelmällä Mueller et ai. (23) käyttämällä DE-52-kromato-grafiaa, uutetaan fenoli/kloroformi11a ja DNA

saostetaan yön kuluessa alkoholilla -20°C:ssa. DNA-sakka liuotetaan 50 μΐ:aan liuosta, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,1 nM EDTA, ja säilytetään käyttöön asti -20°C:ssa. Näin saadaan 1,5 lxj (= 2,4 pmol päitä) DNA:ta.

b) F2-DNA/BamHI:n valmistus 1,6 ug (= 90 pmol päitä) kemiallisesti synteti-• ' soitus F2_DNA:ta (esimerkki 8) leikataan 30 minuuttia 37°C:ssa 16 yksiköllä restriktioendonukleaasia BamHI (Biolabs) 20 ulissa liuosta, jossa on 150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgC^ ja 100 ug/ml gelatiinia. Sittfen liuokseen lisätään 60 ng (= 96 nmol 66 86744 päitä) linearisoitua vektoria pBR322/BamHI/NruI (esimerkki 13a), koko liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja uutetaan fenoli/klorofromilla ja DNA saos- tetaan 2 tilavuudella alkoholia. Saostettua DNA: ta säilytetään jatkokäsittelyä varten alkoholin alla -20°C:ssa.

c) pBR322/BaniHl/NruI-vektori-DNA:n liittäminen F^-DNA/BamHI-jaksoon ja plasmidin pML136 rakentaminen

Esimerkissä 13b) saatu DNA-sakka, joka sisältää molemmat mainitut DNA-palat, liuotetaan 20 ui:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 100 ug/ml gelatiinia, ja käsitellään 3 tuntia 15°C:ssa 15 yksiköllä/ml T^-DNA-ligaasia (Biolabs). Tällä tavalla liuokseen syntyy yhdistelmäplasmidi pML136, joka sisältää F2-DNA:n.

d) E. coli HB101:n transformointi plasmidilla pML136

Kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointi suoritetaan esimerkissä 11d) kuvatulla tavalla. Käytetään 10 μΐ esimerkissä 13c) saatua reaktio-seosta. Näin saadaan 65 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä.

e) F2~DNA-jakson sisältävien pesäkkeiden seulonta Näistä 65 transformoituneesta pesäkkeestä (esimerkki 13d) tutkitaan F2~DNA:n läsnäolo esimerkissä 11e) kuvatulla tavalla. Radioaktiivisena koettimena käytetään komplementaarista 172/61-oligonukleotidia (vrt. esimerkki 5). Autoradiogrammista saadaan 2 positiivista pesäkettä, joista yhdelle annetaan nimi pML136.

Esimerkki 14: Kloonien pML87, pML90 ja pML136 karak terisointi

Yhdistelmäplasmidien pML87, pML90 japML136 DNA:t eristetään menetelmällä Ish-Horowitz (25). F^(C)-DNA-, 67 86 744 F^(B)-DNA- ja F^-DNA-liitännäisten nukleotidisekvenssit määritetään menetelmällä Maxam ja Gilbert (3). Tätä tarkoitusta varten leikataan 10 yg plasmidi-DNA:ta pML87: stä ja pML90:stä kustakin restriktioendonukleaasi11a EcoRI ja 10 yg plasmidi-DNA:ta pML136:sta restriktio-endonukleaasilla BamHI ja linearisoidut DNA:t eristetään käyttämällä geelieluointia agaroosigeelissä (vrt. esimerkit 11a) ja 13a)). Sitten eristetyt DNA:t käsitellään enäsfosfataasilla ja kromatografoidaan DE-52: 11a (vrt. esimerkki 13a). Sitten DNA:t merkitään 5'- 32 päästään radioaktiivisesti /γ - P/ATP:llä (ominais-aktiivisuus > 5000 Ci/mmol, Amersham) käyttämällä T^-polynukleotidikinaasia (P-L-Biochemicals).

Radioaktiivisesti merkityt DNA:t katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla (PvuII). Saadut DNA-jaksot eristettiin käyttämällä geelieluointia agaroosigeelissä. Sitten pML87:n ja pML90:n tapauksessa määritetään PvuII-EcoRI*-jaksosta (noin. 2190 emäsparia) F^(C)— ja (B)-DNA:n nukleotidisekvenssi ja pML136:n tapauksessa määritetään F^-DNA PvuII-BamHI*-jaksosta (noin 1815 emäsparia). (* ilmoittaa sen DNA-pään, joka on merkitty radioaktiivisesti).

F^(C)-DNA:n, F^(B)-DNA:n ja F2~DNA:n nukleotidisek-venssit ovat identtiset esimerkeissä 8-10 esitettyjen kanssa.

Esimerkki 15: Plasmidin pML141 valmistus, joka si sältää F,j (C) -F2-DNA-jakson (kuva 4) a) Linearisoidun vektorin pBR322/EcoRI/BamHI valmistus 10 yg pBR322 plasmidi-DNA:ta leikataan 1 tunti 37°C: ssa restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI (Biolabs, kumpaakin 10 yksikköä) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ja. 100 yg/ml gelatiinia. Sitten tämä liuos säädetään TNE-pitoisuuteen, uutetaan yhdellä tilavuudella fenolia ja kloroformia ja DNA seostetaan 2 tilavuudella alkoholia yön kuluessa -20°C:ssa.

68 86744 pBR322-DNA:sta irti leikattu vektori (pBR322/EcoRl/ Ball, 3986 emäsparia) erotetaan pienemmästä DNA-jaksosta (376 emäsparia) tiheysgradienttisentrifugoimalla liuoksessa, jossa on 5 - 23 % sakkaroosia, 50 mM Tris.

11CI (pH 8) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 30 000 1/min TST 41-roottorissa (Kontron AG) 15 tunnissa 15°C:ssa. Sitten sentrifugoidusta liuoksesta otetaan 0,2 ml:n jakeet ISCO-gradientinkerääjällä.

Ne jakeet, jotka sisältävät suuren DNA-jakson (3986 emäsparia) yhdistetään ja DNA saostetaan alkoholilla. Sakkaa käsitellään 0,3 yksiköllä vasikansuolen emäs-fosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa 100 μΐ: ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8). Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 1 tunti 65°C:ssa. Sitten liuos uutetaan fenoli/CHCl^:Ha ja DNA saostetaan yön aikana alkoholilla -20uC:ssa. Sakka liuotetaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 8) ja 0. 1 mM EDTA, ja säilytetään kloonausvektorina käyttöä varten -20°C:ssa. Näin saadaan 3,75 yg DNArtä (= 5,7 pmol päitä).

b) F1(C)-DNA/EcoRI/Hpall-jakson ja F2-DNA/BamHI/HpaII-jakson valmistaminen 1. F^(C)-DNA/EcoRI/Hpall-jakson valmistaminen 10 yg pML87:n plasmidi-DNA:ta leikataan ensin 10 yksiköllä restriktioendonukleaasia Hpall 100 ulissa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6 mM KC1, 10 mM MgCl2f 1 mM DTT ja 100 g/ml gelatiinia. Sitten liuos uutetaan fenoli/kloroformilla ja saadut DNA-jaksot saostetaan alkoholilla -20°C:ssa.

Sitten DNA-jaksoseos erotetaan elektroforeesilla käyttämällä 6-prosenttista polyakryyliamidigeeliä Tris-asetaatti-EDTA-puskurissa, pH 8. Suurin jakso (= 586 emäsparia) eristetään geelieluutiolla ja sen jälkeen leikataan restriktioendonukleaasilla EcoRI (vrt. esimerkki 11a). Syntyneelle DNA-jaksoseokselle suori 69 86744 tetaan uudestaan elektroforeesi 8-prosenttise 1 la po-lyäkryy1iamidigeelillä. Näin saadaan eristetyksi 40 ng Fi(C)-DNA/EcoRI/HpalI-jaksoa (127 emäsparia).

II. F2_DNA/BamHI/HpaII-jakson valmistus 20 pg pML136:n plasmidi-DNA:ta leikataan 20 yksiköllä restriktioendonukleaasia BamHI. Erä (1 pg) tätä linearisoitua plasmidi-DNA/BamHI:tä eristetään suorittamalla geelieluointi agaroosigeelissä (vrt. esimerkki 32 13a) ja merkitään radioaktiivisesti /γ- P/ATP:llä (vrt. esimerkki 14). Sitten pääosa plasmidi-DNA./BamHI: tä sekoitetaan tämän radioaktiivisesti merkityn DNA:n kanssa, leikataan restriktioendonukleaasilla PvuII ja PvuII-BamHl*-DNA-jakso (1203 emäsparia) eristetään suorittamalla geelielektroforeesi 1-prosenttisessa agaroosissa. 14 pg PvuI-BamHI*-jaksoa leikataan restriktioendonukleaasilla Hpall (ks. edellä) ja sen jälkeen suoritetaan DNA-seok-sen erottaminen 8-prosenttisen polyakryyliamidigeelin avulla elektroforeettisesti ja geelieluutiolla erote-aan 150 ng F2“DNA/BamHI*/HpaII-jaksoa (109 emäsparia).

c) (C)-DNA-jakson liittäminen F2-DNA-jaksoon ja plas-midin pML141 rakentaminen 10 ng (= 473 nmol päitä) (C)-DNA/EcoRI/HpalI-jak soa ja 9 ng (= 495 nmol päitä) F2~DNA/BamHI/HpaII käsitellään 20 pl:n tilavuudessa T^-DNA-ligaasi11a, kuten edellä on selostettu esimerkissä 13c). Sitten seos uutetaan fenoli-kloroformilla ja DNA saoste- taan alkoholilla. Sitten DNA-sakka liuotetaan kuten esimerkissä 13a) on kuvattu ja leikataan restriktioen-donukleaaseilla BroRI ja BamHI. Sitten liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja lisätään 30 ng (= 50 nmol päitä) vektori-DNA:ta pBR322/EcoRI/BamHI (vrt. esimerkki 15a). Sitten liuos uutetaan uudestaan fenoli-kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Saostunut DNA-seos käsitellään esimerkissä 13c) kuvatulla tavalla 70 8 6 7 4 4 T^-DNA-ligaasilla (Biolabs). Tällä tavalla liuokseen syntyy yhdistelmäplasmideja, jotka sisältävät liitännäisenä (C)-F2~DNA:n (egliini C-geeni).

d) E. coli HB101:n transformointi plasmidilla pML141

Kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB 101-solujen trans-formointi suoritetaan esimerkissä 11d) kuvatulla tavalla. Käytetään 10 μΐ esimerkissä 15c) saatua reaktio-seosta. Näin saadaan 2586 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä.

e) Sellaisten kloonien seulonta, jotka sisältävät F^(C)-F^-DNA-jakson 18 transformoituneesta pesäkkeestä (esimerkki 15d) tutkitaan esimerkissä 11e) kuvatulla tavalla, sisältävätkö ne F^(C)-F2~DNA-jakson. Radioaktiivisena koettimena käytetään esimerkeissä 5 ja 6 kuvattujen oli-gonukleotidien seosta. Autoradiogrammista saadaan 13 positiivista pesäkettä, joista neljä nimetään seuraavasti: pML141, pMLI43, pMLl44, pMLl45.

Vastaavasti leikataan plasmidi pML87(C') ja pML87(C") restriktioendonukleaaseilla Hpall ja EcoRI ja syntyneet F1(C')-DNA/EcoRI/Hpall- ja F1(C")-DNA/EcoRl/Hpall-jakso liitetään vastaavasti yhteen F2-DNA/BamHI/HpalI-jakson kanssa ja saadut F.| (C ')-F2-DNA/EcoRI/BamHI ja (C")-F2-DNA/EcoRI/BamHI-jakso liitetään vastaavasti vektoriin pBR322/EcoRI/BamHI. Saaduilla plasmideilla, jotka sisältävät F^(C')-F2~DNA-jakson tai F^(C")-F2-DNA-jakson, transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HB101-solut. Transformoitujen solujen viljelyssä saadaan,850 ja 585 ampisilliinille vastustuskyskyis-tä pesäkettä vastaavasti. Transformoituneista pesäkkeistä tutkitaan 91/37 komplementaarinen C-oligonuk-leotidilla F^(C')-F2~DNA-jakson ja F^(C")-F2~DNA-jakson läsnäolo vastaavasti. Näin saadaan 18 pesäkettä, jotka sisältävät F^(C')-F2~DNA-jakson ja 31 pesäkettä, 71 86744 jotka sisältävät F (C")-F2-DNA-jakson. Kummastakin lajista valitaan yksi pesäke, joille annetaan vastaavasti nimet pMLl41(C') ja pML141(C").

Esimerkki 16: Plasmidin pMLl60 valmistaminen, joka si sältää F1(B)-F2~DNA-jakson a. F^(B)-DNA/EcoRl/Hpall-jakson valmistaminen

Samoin kuin F^(C)-DNA/EcoRI/Hpall:n kohdalla selostettiin (esimerkki 15bl), leikataan 10 μg pML90:n plasmidi-DNA:ta ensin HpaII:lla ja sen jälkeen EcoRI: llä. Jaksoseos puhdistetaan kuvatulla tavalla PAGE: llä.

b. F (B)-DNA-jakson liittäminen F2~DNA-jaksoon ja yhdistelmäplasmidin rakentaminen

Yhteenliittäminen tapahtuu esimerkissä 15c kuvatulla tavalla lähtemällä 10 yg:sta F (B)-DNA/EcoRI/Hpall-jaksoa (ks. edellä) ja 9 pg:sta F2-DNA/BamHI/HpaII-jak soa Xesimerkki 15bII). Muodostunut F^(B)-F2-DNA/EcoRI/ BamHI liitetään edelläkuvatulla tavalla yhteen 30 ug:n kanssa vektori-DNA:ta pBR322/EcoRI/BamHI (vrt. esimerkki 1 5a) .

Näin saadulla yhdistelmäplasmideja sisältävällä liuoksella transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HBl01-solut. 15 transformoituneesta kloonista tutkitaan F^(B)-F2~DNA-jakson läsnäolo esimerkissä 11e) kuvatulla tavalla. Radioaktiivisena koettimena käytetään jälleen esimerkeissä 5 ja 6 kuvattujen oligonukleo-tidien seosta. Autoradiogrammista saadaan 6 positiivista kloonia, joista yhdelle annetaan nimi pML160.

Esimerkki 17: Kloonien pML141 ja pML160 karakterisointi 10 μ g kumpaakin plasmidi-DNA:ta pML141 ja pMLl60 leikataan restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI (vrt. esimerkit 11 a ja 13a). pMLl41:n ja pML160:n i 72 86744 karakterisointi suoritetaan esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.

F ^(C)-F^-DNA-jaksolle ja F1(B)-F2~DNA-jaksolle saadut sekvenssit ovat identtisiä edellämainittujen synteettisten egliini C- ja egliini B-geenin vastaavien jaksojen kanssa.

Esimerkki 18: Ilmentämisplasmidin pML147 valmistami nen a) Linearisoidun vektorin pHRi148/EcoRI/BamHI rakentaminen, joka sisältää trp-promoottorioperaattorin (kuvat 5 ja 6) A. Plasmidin p159 rakentaminen 10 ug plasmidia pBRHfcrp (21) leikataan 50 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) 60 minuuttia 37°C:ssa, reaktioseos uutetaan fenolilla ja sen jälkeen fraktioidaan sakkaroo-sitiheysgradientissa (5 - 23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,9) ja 1 mM EDTA, TST41-roottorissa (Kontron AG). Sentrifugointi kestää 14 tuntia nopeudella 40 000 1/min 15°C:ssa. 0 ,3 ml:n jakeet kootaan ISCO-gradientinkerääjällä nopeudella 1 ml/min. Yhdistetään jakeet, jotka sisältävät pienemmän jakson, liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. DNA liuotetaan Eppendorf-sentifu-gissa tapahtuneen sentrifugoinnin jälkeen 100 yliaan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA. 5 yg tätä DNA-jaksoa leikataan 5 yksiköllä BglII:ta (giolabs) 60 minuuttia 37°C:ssa. Reaktioseos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja DNA:ta inkuboidaan 10 minuuttia -80°C:ssa 2 tilavuuden kanssa etanolia ja DNA-sakka sentrifugoidaan talteen ja liuotetaan uudestaan 50 viiraan 50 mM Tris. HCl-liuosta (pH 8,0). Tästä liuoksesta otetaan 2 yl (0,2 yg DNA:ta) ja DNA:n väkevyyden ollessa 10 ng/yl 50 mM Tris.HCl-liuoksessa (pH 8,0) inkuboidaan 1 yksikön kanssa vasikan sisäelinten emäsfos-fataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi t.

73 86744 inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65°C: ssa. Otetaan 0,04 yg DNA:ta ja sen 5'-pää käsitellään 10 yCirllä /γ-^Ρ/-ΑΤΡ (>500 Ci/mmol, Amersham) ja 5 yksiköllä -polynukleotidikinaasia (P-L Biochemicals)

20 μ 1:ssa reaktioliuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH

9,5), 10 mM MgC^ ja 5 mM DTT, 30 minuuttia 37°C:ssa. Radioaktiivinen koetin sekoitetaan ei-radioaktiivisen koettimen kanssa (ks. edellä) ja DNA-jaksot fraktioidaan TST60-roottorissa 5 - 23-prosenttisessa sakkaroosi-gradientissa liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi kestää 5 tuntia 15°C: ssa nopeudella 60 000 1/min. Kootaan 0,2 ml:n fraktiot. Jokaisen jakeen radioaktiivisuus määritetään mittaamalla Cerenkov-säteily ja samalla jakeet tunnistetaan. Halutut jakeet, jotka sisältävät pienen DNA-jakson, yhdistetään, DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia ja liuotetaan sentrifugoinnin jälkeen 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA.

32 P:llä merkitty EcoRI-BgllI-DNA-jakso leikataan osittain 37°C:ssa 0,2 yksiköllä TaqI-entsyymiä (Bio-labs) 10 minuutin ajan 50 yl:ssa liuosta. Reaktio-seoksen pitoisuudeksi säädetään 0,2 % SDS, 10 % glyse-riiniä, 10 mM EDTA ja 0,05 % bromifenolisinistä ja DNA-jaksot erotetaan toisistaan 6-prosenttisessa polyak-ryyliamidigeelissä Tris-boraatti-EDTA:ssa (22). Auto-radiogrammista tunnistetaan halutun EcoRI-TagI-jakson sisältävä kaista (suurin osajakso). Tämä jakso uutetaan geelistä(L, ks. kuva 5) ja puhdistetaan (23) ja liuotetaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA.

Vastaanottajaplasmidina käytetään plasmidia pBR322, joka on leikattu Clal:llä ja EcoRI:llä: 2 yg pBR322:ta saatetaan reagoimaan 4 yksikön kanssa Clalrtä (Biolabs)

60 minuutin ajan 37°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta. Proteiini uutetaan fenolilla ja sen jälkeen DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutin aikana. DNA

74 86744 sentrifugoidaan talteen ja saatetaan sen jälkeen reagoimaan 10 yksikön kanssa EcoRI:tä (Biolabs) 30 minuuttia 37°C:ssa 20 μ1:η reaktiotilavuudessa. Sitten liuokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1M Tris.HCl (pH 8,7) ja inkuboidaan 1 yksikön kanssa vasikan emäsfosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 60 minuuttia 65°C:ssa.

100 ng vastaanottajaplasmidia inkuboidaan 2 tuntia 5 μ1:η kanssa L-DNA-jaksoa 15 μ1:η reaktiotilavuudessa, jossa on 10 mM MgC^/ 20 mM Tris.HCl (pH 7,8) , 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, käyttämällä 30 yksikköä DNA-ligaa-sia (Biolabs) per μΐ reaktiotilavuutta.

5 y1 tätä liuosta lisätään seokseen, jossa on 150 ui kalsiumkloridilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja (6) liuoksessa, jonka pitoisuus on 10 mM MgCl^, 10 mM CaC^ ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), ja transformoitavan liuoksen kokonaistilavuus on 200 μΐ. Seosta jäähdytetään 20 minuuttia jäässä, kuumennetaan 1 minuutiksi 42°C:een ja inkuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisätään 1 ml Tryptonialustaa (Tryptonialusta sisältää 10 g Bacto-tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoo sia; 8 g NaCl ja 294 mg CaCl2-2H20 1 litrassa tislattua vettä) ja saatua seosta ravistellaan 30 minuuttia 37°C:ssa nopeudella 300 kierr./min. Seos levitetään kahdelle agarlevylle (McConkey, Difco; 0,6 ml(levy), joihin on lisätty 50 yg/ml ampisilliiniä (Sigma). Levyjä inkuboidaan 12 - 17 tuntia 37°C:ssa.

Plasmidi-DNA erotetaan seuraavalla tavalla 10 eri pesäkkeestä:

Pesäkkeillä siirrostetaan 25 ml:n Erlenmeyer-kolveissa 10 ml Tryptonialustaa, johon on lisätty 50 μ9/ιτι1 ampis i 11 i i.ni.a . Viljelmiä ravistellaan 15 -18 tuntia 37°C:ssa nopeudella 300 kierr./min. Solut sentrifugoidaan talteen (Sorval, HS-4-roottori, 10 min., 4000 1/min, 4°C). Näin saadaan noin 0,1 g soluja ja nämä suspendoidaan uudestaan 1 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään 0,25 ml i 75 86744 lysotsyymiliuosta (10 mg/ml liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ;( lysotsyymi on saatu Sigmalta) ja, kun on inkuboitu 10 minuuttia 0°C:ssa, lisätään 0,15 ml 0,5 m EDTA (pH 7,5). Kun on inkuboitu vielä 10 minuuttia 0°C:ssa, lisätään 60 yl 2-prosenttista Triton X-100:aa (Merck). Näytettä pidetään 30 minuuttia 0°C:ssa ja sen jälkeen sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 15 000 1/min Sorvali SA-600-root-torissa. Jäännöksestä poistetaan proteiini 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE:hen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla (Sorval HB-4-roottori) 10 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 5000 1/min. Ylempi faasi uutetaan kahdesti 1 tilavuudella kloroformia. Haiman RNAaasi A:ta (Sigma; 10 mg/ml TNE:ssä, esikuumennettu 10 minuuttia 85°C:ssa) lisätään loppuväkevyyteen 25 yg/ml ja saatua seosta inkuboidaan 40 minuuttia 37°C: ssa. Sitten seoksen pitoisuudeksi säädetään 1 M NaCl ja 10 % polyetyleeniglykoli 6000 (Fluka, käsitelty 20 min autoklaavissa 120 °C:ssa) ja inkuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka kerätään Sorval HB-4-roottorilla (20 min nopeudella 10 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNE:tä. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia 10 minuutin kuluessa -80°C:ssa. Sakka kerätään sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugilla ja DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 ml:n viljelmästä saadaan 8 - 10 yg plasmidi-DNA:ta.

Plasmidi-DNA:t analysoidaan seuraavilla restrik-tioentsyymeillä tapahtuneen leikkauksen jälkeen: 0,5 yg kutakin plasmidi-DNA:ta leikataan entsyymin-valmistajien ohjeiden mukaan tavalliseen tapaan Hpal:llä (Biolabs) sekä Hpalrllä (Biolabs) ja EcoRIrllä (Biolabs) ja Clal:llä' (Biolabs). DNA:t fraktioidaan 1-prosentti-sella agaroosigeelillä, jossa on 40 mM Tris.asetaat-tia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Halutut plasmidit sisältävät Hpal-kohdan ja antavat 76 86744 3-kertaisen katkaisun jälkeen suuren jakson ohella 2 pienempää jaksoa, jotka ovat suurempia kuin pBR322:n pieni EcoRI-Clal-jakso. Yhdelle näistä plasmideista annetaan nimi p159 (ks. kuva 5).

B. Plasmidin pHRi145 rakentaminen 2 yg p159-DNA:ta leikataan 10 yksiköllä EcoRI-.tä (Biolabs) 30 minuuttia 37°C:ssa. DNA uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan sentrifugoin-nin jälkeen 10 yliaan liuosta, jossa on 10 mM Tris.

HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. EcoRI:llä leikattua DNA:ta käsitellään sen jälkeen 15 minuuttia 12°C:ssa 5 yksiköllä DNA-polymeraasia (KleRow-palanen) (Boehringer) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2/ 10 mM β-merkapto-etanolia, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals) ja 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals). Sitten polymeraasi in-aktivoidaan inkuboimalla 5 minuuttia 85°C:ssa. Reak-tioseos laimennetaan 10-kertaisesti liuoksella, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP (Sigma), ja lisätään 30 yksikköä T^-DNA-ligaasia per μΐ reaktioseosta ja inkuboidaan 1 tunti 15°C:ssa.

50 ng DNA:ta transformoidaan E.coliin (kuten edellä on selostettu) ja viljellään McConkey-agarlevyillä, joissa on 50 yg/ml ampisilliiniä.

10 eri pesäkkeestä eristetään plasmidi-DNA edelläkuvatulla tavalla. Plasmidi-DNA:t analysoidaan leikkaamalla EcoRI:llä. Halutut plasmidit ovat EcoRI:lle vastustuskykyisiä. Analyysi tapahtuu edelläkuvatulla tavalla. Yhdelle halutuista plasmideista annetaan nimi HRi145 (kuva 5).

C. Plasmidin pHRi148 rakentaminen 2 yg pHRil4 5-DNA:ta käsitellään 5 yksiköllä Clalrtä (Boehringer) 60 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen proteiini poistetaan fenoliuutolla. DNA saostetaan eta 77 86744 nolilla ja liuotetaan sen jälkeen 20 Ul:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 raM EDTA. Ulostyöntyvät päät täytetään edelläkuvatulla tavalla käyttämällä apuna DNA polymeraasi I:tä (Klenow-palanen) paitsi, että dATP ja dTTP korvataan dCTP:llä (P&L Biochemicals) ja dGTP:llä (P&L Biochemicals). Polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 5 minuuttia 85°C: ssa. Reaktioseokseen lisätään 2 tilavuutta o,1 M Tris. HCl (pH 8,7) ja inkuboidaan 0,5 yksikön kanssa vasikan fosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Reak-tioseoksesta poistetaan proteiini uuttamalla fenolilla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan 8 tl:aan luosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA.

Kemiallisesti syntetisoitu sidoksenmuodostaja, jonka kaava on 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosfory1 oidaan 5'-päästään siten, että 8 pmol sidok-scnmuodostujaa inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa 5 tCi:n kanssa ti -^P/-ATP:tä (5500 Ci.mmol \ Amers-ham) 8 tl:ssa liuosta, joka sisältää 0,1 mM rATP:tä (Sigma), 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ja 2 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia(P&L Biochemicals) . Reaktio pysäytetään jäädyttämällä -80°C: een.

Sitten radioaktiivisesti merkitty sidoksenmuodosta-ja käsitellään 1 pg:lla Clalitä ja fosfataasilla ja liitetään yhteen pHRi145:n kanssa (vrt. edellä) 20 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 ja 800 yksikköä T4~DNA-ligaasia (Biolabs). In-kubointi kestää 2 tuntia 15°C:ssa. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Sitten lisätään 2 tilavuutta vettä, keittosuolaväkevyys säädetään 10 mMiksi ja lisätään 20 yksikköä Kpnl-entsyymiä (Biolabs) 30 minuutin kuluessa 37°C:ssa. Seos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja fraktioidaan 0,9-prosent-tisella matalalla sulavalla agaroosigeelillä (Biorad), 78 867 44

jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA

ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. UV-säteilyllä näkyväksi tuleva kaista, jolla on sama liikkuvuus kuin samankokoisella merkki-DNA:11a, leikataan irti leikkausveit-sellä. Geelipalaa sulatetaan 5 minuuttia 65°C:ssa ja sen jälkeen jäähdytetään 37°C:een. Näin saadaan tilavuudeksi noin 20 yl. Tätä liuosta otetaan 5 yl ja inkuboidaan 12 tuntia 15°C:ssa 400 yksikön kanssa T^-ligaasia (Biolabs) 10 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM

Tris.HCl (pH 7,8). Ligaasiseokseen (kiinteytyy 15°C: ssa) lisätään 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 ja 100 mM MgCl2, ja inkuboidaan 5 minuuttia 65°C:ssa. Sitten liuos käytetään kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointiin edelläkuvatulla tavalla. Viljely suoritetaan McConkey-agarlevyillä, joissa on 50 yg/ml ampisilliiniä.

10 eri pesäkkeen plasmidi-DNA eristetään edelläkuvatulla tavalla ja analysoidaan käyttämällä seuraavia restriktioentsyymejä: 0,5 yg kutakin plasmidi-DNA:ta leikataan peräkkäisesti restriktioentsyymeillä Kpnl (Biolabs), Ncol (Biolabs) ja EcoRI (Biolabs) noudattamalla entsyyminvalmistajien ohjeita. Katkeamistuot-teet analysoidaan 1-prosenttisessa agaroosigeelissä, jossa on 40 mM Tris-asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 vjg/ml etidiumbromidia. Kaikki plasmidit sisältävät kukin yhden näistä entsyymin katkaisukohdista, kuten halutaankin. Yhdelle plasmidille annetaan nimi HRi148.

Plasmidi HRi148 sisältää tryptofaanipromoottorioperaat-torin ja ribosomaalisen sidoskohdan ATG-kodoniin asti, se mukaanluettuna. Egliini C-geeni samoin kuin muut heterologiset geenit voidaan liittää plasmidiin sen ainoan EcoRI-, Ncol- tai Kpnl-kohdan välityksellä. Lisäksi tämä rakenne mahdollistaa heterologisten geenien suoran liittämisen ja ilmentymisen ilman kyseisen geenin sisältämää tarvittavaa luennanaloituskodonia ATG.

li 79 86744 Tämä voidaan saada aikaan helposti leikkaamalla NcoI:llä ja täyttämällä ulkonevat päät DNA-polymeraasi I:n avulla, kuten edellä on selostettu, tai leikkaamalla Kpnl: llä ja poistamalla ulostyöntyvät päät nukleaasilla S^. Plasmidi HRi148 on näin ollen valmis käytettäväksi il-mentämisplasmidina.

D. Linearisoidun vektorin pHRi148/EcoRI/BamHI rakentaminen 5 μ9 pHRi148-plasmidi-DNA:ta leikataan restriktio-endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI, kuten esimerkissä 15a on kuvattu. Irti leikattu vektori pHRi148/EcoRI/

BamHI eristetään tiheysgradienttisentrifugoinnilla (vrt. esimerkki 15a).

b) F.j (C)-F2_DNA/EcoRI/BamHI-jakson valmistaminen (kuva 6) 5 ^ig pML141:n plasmidi-DNA: ta leikataan rostrik-tioendonuk1 faaseilla EcoRI ja BamHI, kuten esimerkeissä 11a) ja 13a) on selostettu. Fenoli/kloroformiuuton ja alkoholisaostuksen jälkeen erotetaan F^(C)-F^-DNA/EcoRI/ BamHI-jakso plasmidista (pBR322/EcoRI/BamHI) suorittamalla geelielektroforeesi 1-prosenttisella matalalla-sulavalla agaroosilla (Biorad) (esimerkki 13a) ja tekemällä näkyväksi EtBrrllä. Sitten geelistä leikataan irti se kohta, joka sisältää F^(C)-F2-DNA-jakson (= 236 emäsparia) ja nesteytetään 65 C:ssa 10 minuutissa.

c) pHRil48/EcoRI/BamHI-vektori-DNA:n liittäminen yhteen F^(C)-F2~DNA/EcoRI/BamHI-jakson kanssa ja plasmi-din pML147 rakentaminen (kuva 6) 100 ng (noin 100 nmol päitä) plasmidi-DNA:ta pHRi148/ EcoRI/BamHI ja 28 ng (713 nmol päitä) F1(C)-F2~DNA/ EcoRI/BamHI-jaksoa (liuotettuna 10 iil:aan esimerkissä 18b) saatua nestemäistä geeliä) sekoitetaan keskenään 37°C:ssa 20 μ1:η tilavuudessa ja käsitellään esimerkissä 13c) kuvatulla tavalla T4-DNA-ligaasilla 16 tuntia 15°C: 80 86744 ssu. Tällä tavalla seokseen syntyy ilmentämisplasmi-di pML147, joka sisältää egliini C-geenin DNA) .

d) E. coli HB10l:n transformointi plasmidilla pML147 10 μΐ plasmidia pML147 sisältävää seosta (esimerkki 18c) nesteytetään 10 minuuttia 65°C:ssa ja se käytetään kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointiin. Näin saadaan noin 6000 ampisillii-nille vastustuskykyistä pesäkettä.

e) Sellaisten pesäkkeiden seulonta, jotka sisältävät (C)-F^-DNA-jakson

Transformoituneista pesäkkeistä (esimerkki 18d) tutkitaan F^(C)-F2~DNA-jakson läsnäolo esimerkissä 15e) kuvatulla tavalla. Näin saadaan 7 positiivista pesäkettä, joille annetaan nimet pML147 - pML153.

Vastaavalla tavalla valmistetaan F^(C)-F2~DNA/ EcoRI/BamHI ja F1(C")-F2-DNA/EcoRI/BamHI plasmi-deista pML147(C') ja pML147(C") ja liitetään yhteen pHBil48/EcoRI/BamHI:n kanssa. Näin syntyy plasmideja, jotka sisältävät egliini C-geenin /F^(C')-F2“DNA/ tai egliini C"-geenin /F^(C")-F2-DNA/ vastaavasti. Näillä plasmideilla transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HB101-solut. Transformoitujen solujen viljelyllä saadaan 940 ja 1080 ampisilliinilie vastustuskykyistä pesäkettä vastaavasti. Pesäkkeistä tutkitaan 91/37 komplemantaarinen (C)-oligonukleotidilla F^(C')-F2~DNA-jakson ja F^(C")-F2~DNA-jakson läsnäolo vastaavasti. Näin löytyy 9 pesäkettä, jotka sisältävät F.j (C' ) -F2~DNA:n (egliini C-geeni), ja 17 pesäkettä, jotka sisältävät F^(C")-F2~DNA:n (egliini C"-geeni). Kustakin ryhmästä valitaan yksi pesäke, joille annetaan nimet pML147(C) ja pML147(C").

Il si 86 744

Esimerkki 19: IImentämisplasmidin pML199 valmistaminen a. (B)-F^-DNA/EcoRI/BamHI-jakson rakentaminen Esimerkin 18b) mukaisesti leikataan 5 ug pML.160- plasmidi-DNA:ta restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. F^(B)-F^-DNA/EcoRI/BamHI-jakso erotetaan edelläkuvatulla tavalla geelielektroforeesilla.

b. pHRi148/EcoRI/BamHI-vektori-DNA:n liittäminen F^(B)-F2_DNA/EcoRl/BamHI-jaksoon ja yhdistelmäplasmidien rakentaminen 100 tg plasmidi-DNA:ta pHRil48/EcoRl/BamHI (vrt. esimerkki 18ap) liitetään yhteen 28 ug:n kanssa F^(B)-F2~DNA/EcoRl/BamHI:tä esimerkin 18c) mukaisesti. Näin saadulla liuoksella, joka sisältää yhdistelmäplas-midin, transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HB101-solut. Transformoituneista pesäkkeistä tutkitaan F^(B)—F2_DNA-jakson läsnäolo esimerkissä 15e) kuvatulla tavalla. Näin saadaan 6 positiivista pesäkettä, joille annetaan nimet pMLl99 - 204.

Esimerkki 20: Kloonien pML147 ja pML199 karakteri sointi F_|(C)-F2~ ja F^ (B)-F2_DNA-sekvenssit, jotka ovat plasmideissa pMLl47 ja pML199, karakterisoidaan määrittämällä F_|(C)-F2_ ja F^ (B)-F2~DNA:n sekvenssit menetelmällä Maxam ja Gilbert (3), kuten esimerkissä 17 on kuvattu. 10 h g plasmidi-DNA:ta tutkitaan. F^(C) DNArn nukleotidisekvenssi on identtinen mainitun synteettisen egliini C-geenin sekvenssin kanssa ja F^(B)-F2-DNA on identtinen mainitun synteettisen egliini B-geenin sekvenssin kanssa.

82 867 44

Esimerkki 21: Egliiniaktiivisuuden omaavien polypep- tidien synteesi käyttämällä E. coli-soluja, joissa on yhdistetyn egliinigeenin sisältäviä plasmideja a. Egliini C-aktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi 7 kloonista, jotka sisältävät yhdistetyn egliini-C-geenin, nimittäin E. coli HB101 pHL 147 E. coli HB101 pML 148 E. coli HB101 pML 149 E. coli HB101 pML 150 E. coli HB101 pML 151 E. coli HB101 pML 152 E. coli HB101 pML 153 E. coli HB101 pML 147 (O E. coli HB101 pML 147 (C”) .tutkitaan jokaisesta kyky tuottaa egliini C-aktiivi-suutta.

Tätä tarkoitusta varten viljellään edellämainittuja klooneja yön yli (16 tuntia) 5 ml:ssa L-alustaa 37°C:ssa ravistelunopeudella 250 kierr/min. L-alustan koostumus on seuraava:

Bacto-tryptoni 10 g

Bacto-hiivauute 5 g

NaCl 5 g glukoosi 5 g ampisilliini 0,1 g 1 ml tätä yön yli kasvanutta viljelmää siirretään seuraavana päivänä 25 ml:aan M9-alustaa. M9-alustan koostumus on seuraava:

Na2HP04.7H20 13,25 g KH2PC>4 3,0 g 83 867 44

NaCl 0,5 g NH4C1 1 ,0 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgSo4-7H20 0,25 g kasaminohappoja 2,5 g vitamiini 0,0099 g glukoosia 5,0 g ampisilliinia 0,1 g

Viljellään 37°C:ssa ravistelunopeudella 250 kierr/min, kunnes bakteerisuspension optinen tiheys (°D623^ on saa_ vuttanut arvon noin 0,9 - 1,0. Sitten solut otetaan talteen (5ml kasvavaa viljelmää) ja bakteerit suspendoi-daan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Sitten liuoksen lysot-syymipitoisuudeksi (Boehringer) säädetään 1 mg/ml ja pidetään 30 minuuttia jäällä. Bakteerit rikotaan vuorotellen jäähdyttämällä nestetypessä ja sulattamalla 37°C:ssa. Tämä toimenpide toistetaan 5 kertaa ja sen jälkeen seosta sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 16000 1/min. Jäännöksestä tutkitaan egliini C-aktiivisuus mittaamalla ihmisen leukosyyttielastaa-sin inhiboituminen (1).

Näin saadaan seuraavat aktiivisuusarvot:

Bakteeriuute Egliini C-aktiivisuus μσ/ml viljelmää E. coli HB101 pML 147 3,3 E. coli HB101 pML 148 3,3 E. coli HB101 pML 149 3,4 E. coli HB101 pML 150 3,3 E. coli HB101 pML 151 3,3 E. coli HB101 pML 152 3,5 E. coli HB101 pML 153 3,3 E. coli HB101 pML 147 (O 3,0 E. coli HB101 pML 147 (C") 3,1 84 86744 b. Egliini B-aktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi

Samoin kuin esimerkissä 21 a) on kuvattu, tutkitaan kustakin 6 kloonista, jotka sisältävät yhdistetyn egliini B-geenin, nimittäin E. coli HB101 pML 199 E. coli HB101 pML 200 E. coli HB101 pML 201 E. coli HB101 pML 202 E. coli HB101 pML 203 E. coli HB101 pML 204 kyky tuottaa egliini B-aktiivisuutta.

Mainittuja klooneja viljellään edelläkuvatulla tavalla L-alustassa ja sen jälkeen ne siirretään M9-alus-taan. Kun on saavutettu optinen tiheys (°Dg23^ noin 0,9 - 1,0, solut otetaan talteen, lysoidaan ja rikotaan vuorotellen jäädyttämällä ja sulattamalla. Seokset sentrifugoidaan ja jäännöksistä mitataan egliini B-aktiivisuus määrittämällä ihmisen leukosyyttielastaa-sin inhiboituminen (1).

Näin saadaan seuraavat aktiivisuusarvot:

Bakteeriuute Egliini B-aktiivisuus yg/ml viljelmää E. coli HB101 pML 199 3,2 E. coli HB101 pML 200 3,1 E. coli HB101 pML 201 3,8 E. coli HB101 pML 202 3,5 E. coli HB101 pML 203 3,3 E. coli HB101 pML 204 3,3 I; 85 86744

Esimerkki 22: E. coli HB101 pMLI47-kannan viljely 20 ml:aan L-alustaa (ks. esimerkki 21) siirroste-taan E. coli HB101 pML147-soluja hyvin kasvaneelta agarlevyltä ja viljelmää ravistellaan kiertoravistelu-laitteessa nopeudella 150 kierr/min 37°C:ssa 12 tuntia.

5 ml tätä esiviljelmää siirretään 120 ml:aan M9-alus-taa. Tätä viljelmää ravistellaan 37°C:ssa nopeudella 250 1/min. Noin 8-10 tunnin kuluttua on viljelmä saavuttanut suurimman egliini C-aktiivisuuden omaa-vien polypeptidien tiitterin.

Esimerkki 23: Egliini C-aktiivisuuden toteaminen

Noin 5 - 10 ui näytettä, joka sisältää egliini C-aktiivisuuden omaavia polypeptidejä (vrt. esimerkit 2 21 ja 22), tiputetaan nitroselluloosapaperille (NZ)(1 cm ) (Biorad) ja kuivataan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten nitroselluloosapaperia inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa liuoksessa, jossa on 3 % seerumialbumiinia, 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 % NaCl.

Sitten nitroselluloosapaperia pestään 30 minuuttia liuoksessa, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 %

NaCl. Tällöin liuos vaihdetaan 5 kertaa. Sitten tätä pestyä nitroselluloosapaperia käsitellään 2 tuntia 25°C:ssa liuoksessa, jossa on 3 % seerumialbumiinia, 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 % NaCl sekä 2 pg/ml egliini C:n vastaisia vasta-aineita (kaniinista valmistettuja tai monoklonaalisia vasta-aineita). Sitten nitroselluloosapaperi pestään edelläkuvatulla tavalla.

Sitten nitroselluloosapaperia käsitellään 2-3 tuntia 25°C:ssa liuoksella, jossa on 3 % seerumialbumiinia, 0,01 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 % NaCl sekä 0,2 UCi/ml 1 2 5 I-proteiini A:ta (ominaisaktiivisuus 89,8 uCi/mg) (NEN).Sitten nitroselluloosapaperi pestään vioiä kerran edelläkuvatulla tavalla, kuivataan ja sitoutunut radioaktiivisuus mitataan gammalaskimella (Multi Gamma, 1260 gamma counterLKB, Wallace); tämä on nitroselluloosapa-perissa olevan egliini C-aktiivisuuden omaavan poly- 86 86 7 44 peptidimäärän mitta.

Vaihtoehtoisessa menetelmässä suoritetaan edellä-mainitulle näytteelle SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesi (vrt. (7)). PAGE-elektroferogrammi siirretään sähköimulla (Elektro-Blotting) nitroselluloosapaperiin. Sitten nitroselluloosapaperi käsitellään edelläkuvatulla tavalla ja/tai autoradiografoidaan yön yli rönt-genfilmin (Fuji) kanssa. Ne nitroselluloosapaperin kohdat, jotka sisältävät egliini C-aktiivisuuden omaa-via polypeptidejä, näkyvät filmillä mustina täplinä.

Esimerkki 24: Na-asetyyli-egliini C:n eristäminen ja puhdistaminen käyttämällä apuna monoklonaalista vas-ta-ainepylvästä a. Polypeptidiliuoksen valmistaminen monoklonaalista vasta-ainepylvästä varten 150 ml kasvustoa (saatu esimerkin 22 mukaisesti) jäähdytetään 4°C:een ja solut erotetaan sentrifugoi-malla (5000 1/min, 15 min, Sorvali RC 3B). Kirkas emä-liuos ei sisällä lainkaan egliini C-aktiivisuutta.

Sitten solut suspendoidaan 12 ml:aan lysointipus-kuria (50 mM Tris.HCl, pH 8, 30 mM NaCl). Tähän liuo-seen lisätään 15 mg lysotsyymiä (Boehringer) ja seosta pidetään sen jälkeen 30 minuuttia 4°C:ssa. Sitten solut rikotaan suorittamalla 4 kertaa jäädytys neste-typessä ja sulatus 37°C:ssa. Seuraavaksi sentrifugoi- daan 30 minuuttia nopeudella 16 000 1/min 4°C:ssa. Emä- ex liuos sisältää N -asetyyli-egliini C-aktiivisuuden. Sitten emäliuokseen (15 ml) liuotetaan 7,7 g kiinteätä ammoniumsulfaattia. Samea seos jätetään seisomaan 30 minuutiksi 4°C:een ja sentrifugoidaan sen jälkeen (ks. edellä). Märkä pohjasakka liuotetaan 1 ml:aan 0,05 mM Tris.HCl-puskuria (pH 8), jolloin saadaan haluttu poly-peptidiliuos.

87 86744

Ct b. N -asetyyli-egliini C:n puhdistaminen monoklonaa-lisessa vasta-ainepylväässä

Monoklonaalinen vasta-ainepylväs 1K-F299-22-10 (imu-tilavuus 0,8 ml, ks. jäljempänä) tasapainotetaan 0,05M Tris.HCl-liuoksella (pH 8). 0,5 ml:n erät edelläsaatua polypeptidiliuosta tuodaan 4°C:ssa pylvääseen virtausnopeudella 7 ml/h. Sitten pestään 10 ml :11a 0,05M Tris.HCl-liuosta (pH 8). Ensimmäiset jakeet sisältävät adsorboitumattomat polypeptidit, jotka heitetään pois. Sitten pylväs pestään 5 ml:11a 5M natriumtiosyanaattia (Merck), joka on tehty 0,05 M Tris.HCl-liuokseen (pH 8) ja saaduista jakeista tutkitaan Na-asetyyli-egliini C-aktiivisuus HLE-kokeella (1). Polypeptidejä sisältävät jakeet määritetään mittaamalla OD280nm‘ Jakeet 19 ja 20 sisältävät Na-asetyyli-egliini C-aktiivisuuden; niitä säilytetään -20°C:ssa tai jatkokäyttöä varten jäähau-

QL

teella. N -asetyyli-egliini C-aktiivisuus on jakeessa 19 61 tig/ml ja jakeessa 20 49 μg/m] . Sitten jakeet dinlysoidaan tai niistä poistetaan suola Sephadex-G25: llä (Pharmacia). SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee-si (7) antaa Na^asetyyli-egliini C:n molekyylipainoksi noin 8100 daltonia.

Vastaavalla tavalla puhdistetaan N -asetyyli-egliini B, egliini C ja egliini B käyttämällä monoklonaa-lista vasta-ainepylvästä 1K-F299-22-10.

c. Monoktonaalisen vasta-ainepylvään 1K-F299-22-10 valmistaminen A) Hiirten immunisointi

Lyofilisoidussa muodossa oleva puhdas luonnonegliini C (6 mg) liuotetaan pieneen määrään 0,1% etikkahappoa, sen jälkeen täydennetään fosfaattipuskuroidulla keittosuola-liuoksella ja pH säädetään arvoon 7,2 siten, että lop-pyväkevyydeksi tulee 2 mg/ml. Tämän antigeeniliuoksen eriin sekoitetaan samat määrät täydellistä Freundin adjuvanttia, epätäydellistä Freundin adjuvanttia tai fosfaattipuskuruoitua suolaliuosta ja emulgoidaan.

88 8 6 7 4 4

Naaraspuoliset Balb/c-hiiret (8-14 viikon ikäiset, saatu Sisseln-eläinfarmilta Sveitsistä) immunisoidaan injektoimalla käpälänpohjiin tällaista emulsoita, joka sisältää 100 yg egliiniä. Seuraavien 6 viikon aikana emulgoidaan joka viikko vielä 100 yg egliiniä, mutta annetaan epätäydellisessä Freundin adjuvantissa sub-kutaanisti ja lopuksi annetaan 200 yg egliiniä fosfaat-tipuskuroidussa suolaliuoksessa intravenoosisesti. 4 vuorokautta myöhemmin otetaan perna fuusiota varten.

B) Hybridoomasolujen valmistus ja vasta-ainekoe

Hybridoomasolujen valmistus tapahtuu sulattamalla saadut pernasolut yhteen myeloomasolulinjän SP 2/0 8 7 kanssa. Tässä käytetään 10 pernasolua ja 10 myeloo-masolua. Fuusio suoritetaan viitteissä (9,26) kuvatulla tavalla.

Hybridoomaemäliuosten sisältämä anti-egliini C-ak-tiivisuus määritetään käyttämällä apuna kompetitiivis-ta radioimmuunimääritystä (RIA (10)).

Tätä tarkoitusta varten egliini C merkitään tavallista kloramiini T-menetelmää käyttämällä radioak-125 tiivisella J:llä (30 000 cpm). Yön yli inkuboimal-la kiinnitetään polyklonaaliset kanin anti-egliini C-vasta-aineet polystyreenimikrotiitterilevyn koloihin. Näihin immobilisoituihin vasta-aineisiin sitoutuu noin 50 - 70 % radioaktiivisesta egliini C:stä. Saaduista 45 hybridoomaviljelmästä inhiboi 32 emäliuosta tätä sitoutumista yli 50 % merkitsevyydellä. Kahdelle voimakkaasti inhiboivalle emäliuokselle ja niiden hybri-doomasoluille annetaan nimet 299S18 ja 299S22 ja niille suoritetaan jatkokarakterisointi. Seuraavaksi ne kloonataan rajoittavalla laimennusmenetel- mällä, jolloin saadaan 299S18:sta neljä ja 299S22:sta yhdeksän positiivista kloonia, joista valitaan kloonit 299S18-20, 299S22-1 ja 299S22-10 tarkempaa analyysiä varten. Mainitut hybridoomasolulinjat tuotta-

II

m 86744 vat monoklonaalisia vasta-aineita (sama nimi), joiden alatyyppi on Ig^ kappa.

C) Anti-egliini C-vasta-aineiden eristäminen ja puhdistaminen askites-nesteestä

Balb/c-hiiret esikäsitellään vatsaontelonsisäisesti 0,4 mlrlla Pristania (Carl Roth). Viikon kuluttua injektoidaan vatsaontelonsisäisesti 2 - 5x10 kloonattua hybridoomasolua. Jokaiselta hiireltä otetaan askites-nestettä toistuvasti ja se jäädytetään -80°C: een. Kerätty neste sulatetaan ja sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 16 000 1/min. Rasva imetään pois ja jäljellejääneeseen hiukkasista vapaaseen emäliuokseen lisätään sekoituksen alaisena 0°C: ssa 0,9 tilavuusekvivalenttia kyllästettyä ammonium-sulfaattiliuosta. Saatu raaka immunoglubuliinijae lasketaan käyttämällä 0,1m Tris.HCl-liuosta (pH 8,2) Sepharyl G200:n läpi (Pharmacia) valmistajan ohjeita noudattaen. Aktiiviset jakeet yhdistetään ja väke-vöidään Amicon XM50-suodattimella (Amicon). Tällä tavalla saadaan monoklonaaliset anti-egliini C-vasta-ai-neet 299S18-20, 299S22-1 ja 299S22-10.

D) Vasta-ainepylvään 1K-F299-22-10 valmistaminen

Affi-Gel 10 (Bio-Rad) pestään valmistajan ohjeiden mukaan kylmällä tislatulla vedellä ja liittämispus-kurilla (pH 8,0, 0,1 M NaHCO^-lios). Geelin 50-pro-senttinen suspensio, joka on tehty liittämispuskuriin (1 ml), siirretään muoviputkeen, sekoitetaan mukaan sama määrä puhdistetun vasta-aineen liuosta (19 mg mo-noklonaalista anti-egliini C-vasta-ainetta 299S22-10) ja pyöritetään 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten geeli pestään liittämispuskurilla. Vielä vapaana olevien aktiivisten kohtien sulkemiseksi käsitellään geeli 0,1 mlrlla 1M etanoliamiini-HCl:ää (pH 8,0) per ml geeliä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, 90 86744 joka sisältää 10 mM natriumatsidia per ml geeliä, ja säilytetään siinä 4°C:ssa. Liittymisaste määritetään mittaamalla ekstinktio 280 nm:ssä ja määräksi saadaan 15 - 30 mg vasta-ainetta per ml geeliä. Näin saatua immunogeeliä käytetään 0,8 ml monoklonaalisen vasta-ai-nepylvään 1K-F299-22-10 valmistukseen.

Esimerkki 25: Na-asetyyli-egliini C:n eristäminen ja puhdistaminen käyttämällä apuna anhydrokymotrypsiini-pylvästä a. Polypeptidiliuokssi valmistus anhydrokymotrypsii-nipylvästä varten 150 ml kasvustoa (saatu esimerkin 22 mukaisesti) jäähdytetään 4°C:een ja solut sentrifugoidaan erilleen (5000 1/min, 15 min, Sorvali RC 3B). Kirkas emäliuos ei sisällä egliini C-aktiivisuutta.

Sitten solut suspendoidaan 12 ml:aan lysointipusku-ria (50 mM Tris.HCl, pH 8, 30 mM NaCl). Tähän seokseen lisätään 15 mg lysotsyymiä (Boehringer) ja saatua seosta pidetään 30 minuuttia 4°C:ssa. Sitten solut rikotaan 4 kertaa jäädyttämällä nestetypessä ja sulattamalla 37°C:ssa. Seuraavaksi sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 16000 1/min. Emäliuos si- et sältää N -asetyyli-egliini C-aktiivisuuden. Emäliuok-seen (15 ml) lisätään 7,7 g kiinteätä ammoniumsulfaat-tia. Samea seos jätetään seisomaan 30 minuutiksi 4°C: een ja sentrifugoidaan (ks. edellä). Märkä pohjasakka liuotetaan 1 ml:aan 0,05 mM Tris.HCl-puskuria, pH 8, jolloin saadaan haluttu polypeptidiliuos.

ot b. N -asetyyli-egliini C:n puhdistaminen anhydrokymo-trypsiinipylväässä (AnCht)

AnCht-pylväs (imutilavuus 4 ml) tasapainotetaan 0,05 M Tris-HCl-liuoksella, pH 8. 2,5 ml:n erät edel lä saatua polypeptidiliuosta tuodaan 4°C:ssa pylvääseen viratusnopeudella 7 ml/h. Sitten pestään 25 ml: 11a 0,05 M Tris.HCl-liuosta, pH 8. Ensimmäiset jakeet 91 86744 sisältävät absorboitumattomat polypeptidit, jotka heitetään pois. Sitten pylväs pestään 10 ml:11a, liuosta, jossa on 5 M natriumtiosyanaattia (Merck) 0,05 M Tris.HCl:ssä (pH 8), ja saaduista jakeista tutkitaan O.

N -asetyyli-egliini C-aktiivisuus HLE-kokeella (1).

Ne jakeet, jotka sisältävät polypeptidejä, todetaan mittaamalla OD^^mn. Jakeet 30 ja 31 sisältävät Na-asetyyli~ egliini C-aktiivisuuden; niitä säilytetään -20°C: ssa tai jatkokäyttöä varten jäähauteessa. Na-asetyy-liegliiniaktiivisuus on jakeessa 30 30 μ1/m1 ja jakeessa 31 64 Ug/ml. Sitten jakeet dialysoidaan tai niis tä poistetaan suola Sephadex G25:llä (Pharmacia). SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (7) antaa Na-asetyy-li-egliini C:n ^kDlekyylipainoksi noin 8100 daltonia.

c. Anhydrokymotrypsiinipylvään valmistus A. Anhydrokymotrypsiinin valmistus

AnCht valmistetaan seuraavalla tavalla menetelmällä Ako et ai. (27): 500 mg kymotrypsiiniä (Merck) liuotetaan 50 ml: aan 0,1 M Tris-HCl-puskuria (pH 8), joka sisältää 0,1 M NaCl, 0,12 M CaC^ ja 13 % (tilavuusosina) meta-nolia. Tähän liuokseen lisätään seitsemän kertaa 0,1 ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) (Fluka, liuoksena, jonka pitoisuus on 7 mg/ml asetonissa) samalla sekoittaen ja joka kerta määritetään kymotrypsiiniak-tiivisuuden väheneminen (28). Kun kymotrypsiiniaktii-visuus on laskenut alle 1 prosenttiin, liuosta dialysoidaan 4°C:ssa yön yli 1 mM HC1-liuoksessa (3 x 10 litraa) ja sen jälkeen lyofilisoidaan.

Näin saatu fenyylimetyylisulfonyylikymotrypsiini (PMS-Cht) liuotetaan 100 ml:aan jääkylmää 0,1 M KOH-liuosta, jätetään 1 tunniksi jäähän ja sen jälkeen pH säädetään arvoon 3 lisäämällä 6 N suolahappoa. Saatua liuosta dialysoidaan yön yli 4°C:ssa 1 mM suolahappoa vasten (3 x 10 litraa) ja sen jälkeen lyofili- 92 86744 soidaan. AnCht saostuu valkoisena jauheena (120 mg).

B. AnCht-pylvään valmistus

Affi-Gel (Bio-Rad) pestään valmistajan ohjeiden mukaan kylmällä tislatulla vedellä ja liittämispus-kurilla pH 8,5 (0,1 M NaHC0^/Na2C02~liuos). Geelin 50-prosenttinen liuos, joka on tehty liittämispusku-riin (4 ml) viedään muoviputkeen ja mukaan sekoitetaan sama määrä anhydrokymotrypsiiniliuosta (120 mg 4 ml: ssa liittämispuskuria) ja pyöritetään yön yli 4°C: ssa. Sitten geeli pestään liittämispuskuri1la. Vielä vapaana olevat aktiiviset kohdat tukitaan siten, että geeliä käsitellään 3 tuntia 4°C:ssa 0,1 ml:lla 1 M etanoliamiini-HCl-liuosta (pH 8,0) per ml geeliä ja sen jälkeen pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 10 mM natriumatsidia per ml geeliä, ja pidetään tässä 4°C:ssa. Liittymisaste määritetään mittaamalla ekstinktio 280 nm:ssä ja määräksi saadaan 15 - 30 mg AnCht per ml geeliä.

Saatua AnCht-geeliä käytetään 4 ml affiniteetti-pylvään valmistukseen.

Vastaavalla tavalla voidaan puhdistaa Na-asetyyli-egliini B, egliini C ja egliini B.

et

Esimerkki 26: Vaihtoehtoisia menetelmiä N -asetyyli- egliini C:n puhdistamiseksi

Vaihtoehtoisesti tai lisänä edelläoleviin puhdistus-menetelmiin (vrt. esimerkit 24 ja 25) voidaan käyttää seuraavia puhdistusvaiheita: a. Lysaatin uutto butanolilla

Kun on suoritettu lyysi neljä kertaa jäädyttämällä ja sulattamalla (vrt. esimerkki 24a) , lisätään etikkahap- poa (lopullinen väkevyys 0,1 %; pH 4,5). Saostuneet ex bakteeriproteiinint sentrifugoidaan erilleen. N -ase-tyyli-egliini C jää emäliuokseen.

Kaksifaasiseosta, joka sisältää n-butanoli-jää- 93 86 744 etikka-vesiseosta (5:1:4, 25 ml), sekoitetaan voimakkaasti. Sen jälkeen seoksen annetaan tasapainottua 2 tuntia huoneenlämpötilassa, jolloin seos erottuu kahdeksi faasiksi. 0,5 ml 0,1-prosenttista etikkahappo- lysaattinäytettä (ks. edellä) laimennetaan 250 yl:lla et alempaa faasia ja N -asetyyli-egliini C uutetaan 750 yl:lla ylempää faasia (5 min. Vortex, Fa. Bender Hobein). Sitten faasit erotetaan toisistaan sentrifugoimalla 60 minuuttia (5400 1/min) huoneenlämpötilassa (Hettich Tischzentrifuge EBA 3S). Näyte haihdutetaan suur-tyhjössä Fa. Savantin laitteessa (Speed Vac Concentrator) kuiviin. Na-asetyyli-egliini C osoitetaan HLE-kokeella, RP-HPLC- ja SDS-geelielektroforeesi11a.

b. Geelisuodatus Sephadex G50:llä 31 mg näin saatua materiaalia suspendoidaan 600yl: aan 30% etikkahappoa, sentrifugoidaan 5 minuuttia huoneenlämpötilassa nopeudella 5000 1/min ja kirkas emä-liuos siirretään Sephadex-pylvääseen (G50 fine) (Pharmacia) (pylvään mitat: 1,5 x 30 cm; Ilmaisin: LKB8300 Uvicord II; 254 nm, transmissio 500 mM; virtaus: 0,4 ml/min). Eluointi tapahtuu 50 ml:lla 2% etikkahappoa.

a N -asetyyli-egliini C saadaan jakeissa 6-8 (2,5 ml). Saanto: 3 mg puhdasta lyofilisaattia, puhtausaste noin 95 %.

ex c) Anioninvaihtokromatografia DEAE-selluloosalla N -asetyyli-egliini C:n ja egliini C:n saamiseksi 100 ml emäliuosta, josta proteiini on saostettu pois etikkahapolla (vrt. esimerkki 26a), väkevöidään ja sille suoritetaan anioninvaihtokromatografia DEAE-53:11a (Whatman) pHrssa 6,6 (kromatografiaolosuhteet: pylväs 1,5 x 80 cm; eluointipuskuri:30 mM ammoniumase-taatti, pH 6,6, virtaus 15 ml/h; jakeiden tilavuudet 3,5 ml). Pylväs tasapainotetaan eluointipuskurilla ja kehitetään, kunnes ensimmäinen piikki (egliini C) 94 867 44 on eluoitunut jakeiden 18 - 25 välissä. Jakeesta 50 lähtien jätetään pois lineaarinen suolagradientti, jossa on 300 ml eluointipuskuria ja 0,06 M ammoniumasetaat-tia/0,4 M NaCl pH 4,5. N a-asetyyli-egliini C eluoi-tuu jakeiden 70 - 85 välissä. Toteaminen tapahtuu RP-HPLC:llä, PAGE:llä ja HLE-kokeella. Tuotteiden puhtausaste on noin 90% proteiinipitoisuuden perusteella laskettuna.

IP (yhdistetyt jakeet 18 - 25): 6,5 IP (yhdistetyt jakeet 70 - 85): 5,4 ot Tällä tavalla voidaan myös N -asetyyli-egliini B, egliini B ja muut egliiniyhdisteet (metioniini-eglii-ni C mm. biosynteesistä saatu) erottaa ja puhdistaa.

Ct

Esimerkki 27: N -asetyyli-egliini C:n rakenteen osoit taminen ja fysikaalis-kemiallinen karakterisointi a. Aminohappokoostumuksen määrittäminen ex 200 pg N -asetyyli-egliini C:tä hydrolysoidaan 6N suolahapolla 110°C:ssa 24 tuntia ja analysoidaan sen jälkeen menetelmällä S. Moore et ai. (29). Hydroly-saatin koostumus on seuraava:

Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti

Asn 7.2 (7) Met 0 (0)

Thr 4.6 (5) Leu 5.3 (5)

Ser 3.5 (3) Tyr 4.9 (6)

Gin 7.8 (7) Phe 4.9 (5)

Pro 5.4 (6) Lys 2.3 (2)

Gly 5.7 (5) His 2.5 (3)

Ala 1.6 (1) Trp 0 (0)

Vai 10.1 (11) Arg 4.5 (4)

Yhteensä (70) 95 36744 et b. N -asetyyli-egliini C:n peptidikartta

Seuraavassa kaaviossa on Na-asetyyli-egliini C:n aminohapposekvenssi ja trypsiinin ja Staphylococcus aureus-proteaasin (V8) pilkkomiskohdat (vrt. viite 31):

T T

1 1 10 20 [Ac^ThrGluPheGlySerGluLeu Lys ]SerPheProG 1 uVal ValGl y(_Lys]Th rVa 1 AspGln I-Tl-Tl---T2-----—-Tl------T3-->

T V8 V8 T

11 11

30 AO

A1 a [~Arg~l G1 u TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValTyr Ph <>Lp uP r oG 1 uGl y .....-Jl-......._________________-TA.............................

I_________________>

V8 T TT

1111 50

SerProValThrLeuAsp Leul Arg]TyrAsn|~ArgJVa 1 fArglVal PheTyrAsn --X4-11—T5—- - IL-TS Il---> --TAa-1 60 70

ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly -T7--1 T on trypsiinin pilkkomiskohta ja V8 on Staphylococcus aureus-proteaasin (V8) pilkkomiskohta I) Na-asetyyli-egliini C:n pilkkominen trypsiinillä

Na-asetyyli-egliini C (9,6 mg, 1,18 Unol) suspen-doidaan 2 ml:aan 0,1 N ammoniumasetaattipuskuria, jos-sa on 10 M CaC^» ja pH säädetään laimennetulla ammoniakilla arvoon 7,5 ja seosta inkuboidaan TPCK-tryp-siinin (Worthington, 500 Pg) kanssa 90 tuntia 37°C: ssa. Entsyymireaktio pysäytetään lisäämällä 50 yl jääetikkaa. Trypsiinijae (T4) erotetaan sentrifugoi- 86744 maila, ja sen jälkeen kaanteistaasi-HPLCrn aVulla kirkkaasta jäännöksestä muut trypsiinijakeet (T^ - ) (vrt.

edelläesitettyä kaaviota). Analyysi suoritetaan FAB- kartoituksella (30). et N -asetyyli-egliini C:n (200 pmol) pilkkominen trypsiinillä ja DABTC-peptidien mikropreperatiivinen RP-HPLC-erottaminen menetelmällä R. Knecht et ai.

(32) sekä vertaaminen luonnonmukaiseen egliini C: hen vahvistaa trypsiinin pilkkomistuotteina syntyneiden peptidien T2, T^, T^, T^, Tg ja identiteetin (vrt. edelläolevaa kaaviota).

Peptidillä (N-päässä treeniini) on kummassakin kokeessa eri retentioaika HPLC-analyysissä verrattuna luonnonmukaiseen egliini C:hen (Nucleosil 5/C18, 4,6 x 120 mm; 1,2 ml/min? eluointiaine 0,1 % trifluo-rietikkahappo; asetonitriili-vesiseos 8:2, jossa on 0,07 % trifluorietikkahappoa):

Rfc 9,44 min ( luonnonmukaisen egliini C:n R on 7,34 min) a II. Staphylococcus aureus V8:n suorittama N -asetyy-liegliini C:n tryptisen jakeen hajottaminen a

Noin 100 ug N -asetyyli-egliini C:n tryptistä jaetta (ks. edellä) pilkotaan Staphylococcus aureus-proteaasilla V8 4 tuntia 100 μl:ssa 0,1 M ammoniumase-taattia pH 8,0. Pilkkominen antaa odotetut jaksot (vrt. edelläolevaa kaaviota; seoksen analyysi FAB-MS:n avulla) c. Osittainen sekvenssianalyysi I) Edman-pilkkominen

Edmanin klassisen sekvenssianalyysin epäonnistuminen standardi olosuhteissa (33) (mitään N-pään aminohappotähteitä ei tunnisteta) viittaa muunnettuun ex (salvattuun) N-päähän N -asetyyli-egliini C:ssä.

97 86744 II) Sekvenssinmääritys FAB-MS:n avulla N-pään tryptisen jakson "T^" nimellinen mole-kyylipaino on 951 FAB ("fast atom bombardment")-MS-menetelmän mukaan. Tämä on näin ollen 42 suurempi kuin luonnonmukaisen egliini C:n vastaavan -jakson molekyylipaino (909). Massaeron perusteella pitää N-pään aminohapon muunnoksen olla treoniini.

Muiden edelläolevassa kokeessa (esimerkki 27bl) saatujen tryptisten jakeiden molekyylipainot vastaavat odotuksia.

d) N -asetyyli-egliini C:n molekyylipainonmääritys (verrattuna luonnonmukaiseen egliini C:hen) Näyte 1 (Na-asetyyli-egliini Näyte 2: (luonnonmukainen C) egliini C verijuotik- kaista)

Bruttokaava: Bruttokaava: C375H522N96°108 C373H550N96°107 kemiallinen molek.paino kemiallinen molek.paino löydetty; 8133,1 löydetty: 8091,4 laskettu: 8133,06 laskettu: 8091,03

Kemialliset molekyylipainot ovat 3 eri mittauksen keskiarvoja (C 12,011; H 1,0079; N 14,0067; O 15,9994)

Koeolosuhteet: Noin 30 pg näytettä liuotetaan suo raan matriisina käytettyyn tioglyseriiniin näytteen-syöttölaitteessa ja mitataan ZAB-HF (Auflösung 1000)-massaspektrometrillä (VG-Analytical Ltd. Manchester): ksenon-pommitus, ionienergia 3 keV; lineaarinen skan-naus; kalibrointi: CsI/Rbl-referenssiseos.

e. Isoelektrinen fokusointi

Isoelektrinen piste IP Na-asetyyli-egliini C 5,4 IP luonnonmukainen egliini C 6,5 Olosuhteet: 20 pg näytettä levitetään 2 pl:ssa vettä.

PAGplate LKB-Ampoline pH 3,5 - 9,5, 5 % PAG 1 mm.

98 86744

Elektrolyytti: Anodi (+) 1M H^PO^, katodi (-) 1N NaOH, 20 mM, 700 V, 2,5 tuntia. Värjäys 10-prosentti-sella (paino/tilavuus) trikloorietikkahappoliuoksella tai Coomassie Brilliant Blue R-250- värillä tavalliseen tapaan.

f. Selluloosa-asetaattielektroforeesi (nouseva)

Na-asetyyli-egliini C: 4,7 cm alusta katodin suuntaan egliini C: 5,8 cm alusta katodin suuntaan

Olosuhteet: 2 yg kutakin näytettä levitetään 2 yl:ssa vettä Cellogel 8 x 17 cm foliolle (Chemetron, Milano): Horiphor Flachbettelektroforesekammer (Innovativ Labor), elektrolyytti pH 9,1, 250 V, 1 tunti; osoittaminen tavallisilla värireagenssei1la, kuten TDM:llä, ninhydriinillä tai Ponceau S-liuoksella (Biotec-Fisher).

Ot g. N-asetyyliryhmän osoittaminen N -asetyyli-egliini C: stä ex I) 100 yg N -asetyyli-egliini C:tä hydrolysoidaan osittain 16 tuntia 110°C:ssa 100 ylissa 0,03 N suolahappoa. Kaasukromatografian avulla havaitaan yli 0,5 ekvivalenttia etikkahappoa (34).

II) Asetyylifunktio tunnistetaan yksiselitteisesti tryp-tisestä jaksosta "T^" (vrt. esimerkki 27B) käyttämällä apuna 360 MHz:n protoniresonanssispektroskopiaa. 400 yg ex N -asetyyli-egliini C:n jaksoa "T^" kuivataan 2 tuntia suurtyhjössä ja liuotetaan 1 ml:aan D_0:ta. 360 MHz:n 1 * H-NMR-spektri mitataan 297 K:ssä 4000 SW:llä yön aikana.

Referenssinä 11^0 (6 4,95 ppm) .

6 2,15 ppm singletti (3H) CH^ N-asetyyliryhmästä.

δ 1,2 ppm dupletti (3H, J = 7 Hz) γ-CH^ treoniinista

Esimerkki 28: Erilaisten E. coli-kantojen transfor- mointi plasmidilla pMLl47 ja transformoituneiden isän-täsolujen viljely 99 86744

Kannat E. coli LM1035, E. coli JA221 ja E. coli W3110 trpR, trpÄED24 (vrt. viite 38) transformoidaan esimerkissä 18d kuvatulla tavalla plasmidilla pML147. Transformoituneista pesäkkeistä tutkitaan F1(C)-ΓΟΝΑ: n läsnäolo esimerkissä 15e kuvatulla tavalla. Näin saadaan 3, 5 ja 3 positiivista pesäkettä vastaavasti ja niille annetaan seuraavat nimet: E. coli LM1033/pML147/l E. coli LMl035/pML147/2 E. coli LM1035/pML147/3 E. coli JA22l/pML147/l E. coli JA22l/pML147/2 E. coli JA22l/pML147/3 E. coli JA27l/pML147/4 E. coli JA22l/pMLl47/5 E. coli W3Il0trpR, /\ trpED24/pML147/l E. coli W31lOtrpR, /\ trpED24/pML147/2 E. coli W31lOtrpR, /\ trpED24/pMLl47/3

Mainittuja klooneja viljellään muunnetussa M9-alus-tassa, jonka koostumus on seuraava:

Na2HP04./H20 9,0 g KH2P04 3,0 g

NaCl 0,5 g NH4C1 3,5 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgS04-7H20 0,25' g kasaminohappoja 7,0 g hiivauutetta 5,0 g -vitamiinia 0,0099 g rauta(3)sitraattia 0,006 g MOPS (3-morfolinopropaani-1- (sulfonihappoa) 34,0 g glukoosia 20,0 g ampisilliinia 0,1 g 100 86744

Viljellään niin pitkään 37°C:ssa nopeudella 180 kierr/min, että bakteerisuspension optinen tiheys (OD,~-.) saavuttaa arvon noin 13,0. Sitten solut ote- b / o taan talteen (5 ml kasvavaa viljelmää)ja bakteerit sus-pendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Sitten suspension lysotsyymipitoisuudeksi säädetään 1 mg/ml (Boehringer) ja sijoitetaan 30 minuutiksi jäälle. Bakteerit rikotaan vuorotellen jäädyttämällä suspensio nestetypessä ja sulattamalla se 37°C:ssa. Tämä toistetaan 5 kertaa.

Sitten seosta sentrifugoidaan 30 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 16 000 1/min.

Jokaisesta kloonista tutkitaan egliini C-aktiivisuuden tuotanto kuten esimerkissä 21 on kuvattu. Bakteeriuut-teista saadaan egliini C-aktiivisuutta 3,0 - 13 ug/ml viljelmää. Saadaan esimerkiksi seuraavat aktiivisuudet :

Kanta egliini C-aktiivisuus (jjg/ml kasvuliuosta) E. coli LM1035/pML147/1 3,0 E. coli JA 221/pML147/1 6,0 E. coli W3110trpR,trp Δ ED2 4/pML147/1 11,0

Esimerkki 29: Transformoituneen kannan E. coli W3110trpR

trpAED24/pML147/1 fermentointi ja viljelmän käsittely

Esimerkissä 28 kuvatulla tavalla viljellään 5000 l:n fermentorissa E. coli W311OtrpR,trpAED24/pML147/1-soluja 3000 litrassa muunnettua M9-alustaa, kunnes suspension optinen tiheys on saavuttanut arvon (°Dg23^ n°in 1° ~ 13.

Kasvusto (pH 7,4) jäähdytetään 10°C:een ja solut kerätään Alfa-Laval BRPX-207-keräyslaitteella. Kirkas emäliuos ei sisällä egliiniaktiivisuutta. Lietteen poiston aikana poistetaan lietettä jatkuvasti osittain 101 86744 lietetilasta lyysipuskurilla A (50 mM Tris.HCl, 30 mM NaCl, pH säädetty suolahapolla arvoon 8,0) ja lopuksi sentrifugin säiliön (7 1) sisältö työnnetään ulos lyysipuskurilla A. Saadun solumassan tilavuus säädetään puskurilla A 375 litraksi ja sen pH on 7,6. Suspensio jäähdytetään 5 - 10°C:een ja johdetaan Dyno-myllyn läpi (Tyyppi KD5), joka on varustettu 4,2 litralla lasikuulia, joiden halkaisija on 0,5 - 0,75 mm. Tällöin solut rikkoutuvat. Saatuun suspensioon lisätään etikkahappoa niin, että pitoisuudeksi tulee 2 % (tilavuusosina) ja saatua seosta sekoitetaan yön yli 10°C:ssa. Suspensiosta, jonka pH on 3,9, poistetaan liete edelläkuvatulla tavalla. Kirkas emäliuos, jonka tilavuus on 300 1, väkevöidään laskevatilmihaihduttimessa (teho tunnissa 60 1 vettä) 35 litraksi. Hieman samea konsentraat-ti sentrifugoidaan ja näin saatu kirkas emäliuos dia-suodatetaan 2% etikkahappoa vasten ultrasuodattimessa DDS = Lab 35, jossa on GR 81 PP-kalvo (pinta-ala 2,5 m^). Lopputilavuus on 31 1.

2 litran erä tätä kirkasta proteiiniliuosta siirretään Sephadex G-50-pylvääseen (KS 370 Pharmacia), jonka täytteen tilavuus on 96 1, jolloin pylväs tasapainotetaan etikkahapolla. Eluaatin (15 1) sisältämä pääjae väkevöidään ultrasuodatuksella ja sen jälkeen diasuodatetaan vettä vasten. Näin saatu kirkas vesi-liuos lyofilisoidaan.Jäännös sisältää puhtaita egliini C-yhdisteitä.

Esimerkki 30: E. coli W311OtrpR,trpAED24/pML147/1:n fermentoinnissa saadun tuoteseoksen analyysi

Esimerkissä 29 saadulle, egliini C-yhdisteitä sisältävälle jäännökselle tehdään HPLC-analyysi.

Koeolosuhteet: Vydac 218 TP510-RP-HPLC-pylväs, 10 x 250 mm; 1 mg egliiniyhdisteitä per erotus; AUFC: 220 nm; läpivirtausnopeus 2 ml/min; eluentti: A: 0,1 % trifuorietikkahappo, B: asetonitriili-vesiseos 8:2 + 0,07 % trifluorietikkahappo, 1 min 40 % B:tä, sitten 102 86744 nostetaan 30 minuutin kuluessa 60 %:ksi B:tä.

Tulos: Tunnistetuksi saadaan 7 tuotetta, jotka fraktioidaan, ja joille suoritetaan HLE-koe yksitellen. Lisäksi määritetään isoelektriset pisteet (IP; isoelektrinen fokusointi esimerkissä 27e kuvatulla tavalla, LKB-amfoliini pH 4,0 - 6,5). Saadut tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

Retentioaika ip hle (min) FO 28,2 6,5 + F‘ 29,1 F1A 30,0 5,3 F2 31,2 5,4 + F3 33,8 4,8 + F4 34,6 \ 4,8 F4A 35.4 / +

Isoelektrisen pisteen, HPLC-arvon ja tarkistuksen vuoksi määritetyn molekyylipainon (havaittu molekyyli-paino 8133,2) on päätuote (jae F2) Na-asetyyli-egliini C. Jakeen 0 (F0) sisältämä aine on luonnon-egliini C, kuten isoelektrinen piste, HPLC-arvo ja tarkistuksen vuoksi mitattu molekyylipaino (havaittu molekyylipaino 8091,2) osoittavat.

Esimerkki 31: Muunnettujen egliini C-yhdisteiden synteesi E. coli HBl01-soluilla, jotka ovat transformoituneet plasmidilla pMLl47(C') tai pML147(C")

II

103 86744

Kantoja E. coli HB101 pML147(C') ja E. coli HB101 pML147(C") viljellään esimerkissä 22 kuvatulla tavalla ja solujen käsittelyn jälkeen kasvuliemi puhdistetaan anhydrokymotrypsiinipylväässä (vrt. esimerkki 25).

Kun suoritetaan HPLC-erotus (ks. esimerkissä 30 käytettyjä olosuhteita) E. coli HB101 pML147(C'):n kasvu-liemelle, saadaan erilleen kaksi tuotetta (A ja B). Tuotteen A R^-arvo on 0,42 kiekkoelektroforeesissa (pH 8,9, 15 %:inen geeli; vastaa Maurer-systeemiä no.

2). Trypsiinillä pilkottaessa saadaan 7 jaksoa, jois-ta 6 on identtisiä N -asetyyli-egliini C:n pilkkomisessa saatujen jaksojen kanssa (vrt. esim. 27 b). Jakso 7, joka vastaa peptidin N-päätä, koostuu Edmanin aminohapposekvenssianalyysin (33) perusteella sekvenssistä Ser-Glu-Leu-Lys. Näin ollen tuotteella on odotettu egliini C':n rakenne:

SerGluLeuLysSerPheProGluValVaiG1yLysThrVal

As pGl nAl aArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGInTyrAspValTyrPheLeuPro GluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly ThrAsnValVaiAsnHisValProHisValGly.

Tuote B antaa trypsiinillä pilkottaessa samoin 7 jaksoa. Eroavuus tuotteeseen A verrattuna on vain N-pään jaksossa, jossa on lisä-A-asetyyliryhmä serii-nitähteessä, ja näin ollen sekvenssi on N-asetyyli-Ser-Glu-Leu-Lys. Näin ollen tuote B voidaan nimetä

(X

N -asetyyli-egliini C':ksi.

Kun viljellyt E. coli HB101pML147(C")-solut käsitellään ja suoritetaan kromatografia anhydrokymotrypsii-nipylväässä ja tarkempi puhdistus HPLC:llä, saadaan vain yksi tuote (tuote C). Tuotteen R^-arvo elektroforeesissa (vrt. olosuhteita edellä) on 0,30. Pilkkominen trypsiinillä antaa N-pään jaksoksi dipeptidin Leu-Lys ja muut jaksot ovat identtisiä niiden jaksojen kanssa, jotka saatiin pilkottaessa N -asetyyli-egliini 104 86744 C trypsiini 1 lä. Näin ollen tuotteella on odotettu egliini C":n rakenne.

LeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHi sTyrProGlnTyrAs pValTyrPheLeuPro GluGlySerProValThrLeuAs pLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly ThrAsnValValAsnHisValProHisValGly.

. ex

Esimerkki 32: N -asetyyli-egliini C:n entsymaattinen synteesi 8 mg:aan (1 μπιοί) egliini C:tä (saatu esimerkin 2c mukaisesti, johon liittyy tarkempi puhdistus HPLC: llä) lisätään 0,06 M fosfaattipuskurissa pH 7,5 0,5 umol asetyylikoentsyymi A:ta ja noin 200 ug Na-asetyylitransferaasia sisältävää E. coli HB101-uutetta . Inkubointi suoritetaan 37°C:ssa. 3 tunnin kulut tua entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 60°C:een ja seos puhdistetaan HPLC:llä. Saatu Na-asetyyli-egliini C on identtinen biosynteettisen tuotteen kanssa (vrt. esimerkki 26c).

Esimerkki 33: Testipakkaus, joka sisältää anti-egliini- C-vasta-aineita egliini C:n määrittämiseksi, kompeti-tiivinen radioimmuunimääritys

Esimerkin 24cC) mukaisesti valmistettu anti-eglii-ni-C-vasta-aineliuos laimennetaan fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS-liuos) väkevyyteen 1 yg per 100 μΐ. 100 μΐ tätä liuosta inkuboidaan 2 tuntia 37°C: ssa muoviputkessa tai muovisissa mikrotitrauslevyissä, jolloin vasta-aineet adsorboituvat muovin pintaan epäspesifisestä. Muovin pinnassa vielä vapaina olevien aktiivisten kohtien kyllästämiseksi suoritetaan jälkikäsittely naudanseerumialbumiiniliuoksella (BSA-liuos).

105 86 744 Näyteliuoksen ja standardi liuoksen laimennussar-joihin, jotka on tehty BSA-liuokseen, lisätään kuhunkin mittaukseen 50 μΐ tunnetulla tavalla (20) radio-125 aktiivisella J:llä merkattua egliini C:tä sisältävää liuosta, jonka aktiivisuus on 10 000 cpm per 50 μΐ, ja sen jälkeen muovin pintaa inkuboidaan ensin 2 tuntia 37°C:ssa ja 12 tuntia 4°C:ssa. Putket tai mikrotit-rauslevyt pestään fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ja radioaktiivisuus mitataan. Näyteliuoksen egliini C-pitoisuus määritetään käyttämällä standardi-liuoksen avulla saatua pitoisuuskäyrää.

Edelläkuvatun radioimmuunimäärityksen edellyttämä testipakkaus sisältää: 2 ml esimerkin 24cC) mukaista antiegliinivasta-aine-liuosta, jonka väkevyys on 1 - 10 mg/ ml; 100 ml fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS-liuos); 100 ml liuosta, jossa on 0,3 % naudan seerumialbumiinia ja 0,1 % natriumatsidia PBS-liuoksessa (BSA-liuos); 2 ml radioaktiivisen egliini C:n liuosta, jonka aktiivisuus on 200 000 cpm/ml; 2ml standardiliuosta, joka sisältää egliini C:tä 100 ng/ml; 1 ml:n muovisia putkia tai mikrotitrauslevyjä.

Esimerkki 34: Testipakkaus tandem-ELISAa varten, jossa käytetään monoklonaalisia anti-egliini-C-vasta-aineita

Mikrotiitterilevyihin kiinnitetään yön yli inku-boimalla 4°C:ssa 300 ng/kolo monoklonaalista vasta-ainetta 299S18-20 liuotettuna natriumbikarbonaattikiinnityspus-kuriin (pH 9,6). Levyt pestään kolme kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 0,005 % Tween 20 (pH 7,2) ja sen jälkeen kolot käsitellään yön aikana 4°C:ssa 200 μ 1:11a per kolo fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, jossa on 0,2 % gelatiinia ja 0,02 % natriumatsidia (PBS + gelatiini+A). Pestään kolme kertaa samoin kuin edellä. Lisätään eri 106 86 744 pitoisuuksina PBS+gelatiini+A-liuokseen laimennettuna egliini C:tä ja inkuboidaan 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Pestään kolme kertaa samoin kuin edellä ja sen jälkeen lisätään 100 μΐ/kolo seosta, jossa on toista monoklonaalista vasta-ainetta (299S22-1) liitettynä emäsfosfataasiin optimaalisessa tiitterissä (0,5 mg/ml konjugaattia,koetta varten laimennettuna 1:200 PBS+ge-latiini+A-liuokseen) ja inkuboidaan 2 tuntia huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen kehitetään väri lisäämällä 150 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia dietanoliamiini-puskurissa (pH 9,8). Värin intensiteetti (OD^^-) mitataan 1 tunnin kuluessa 15 minuutin välein Multiscan ELISA-lukulaitteella.

Käyttämällä apuna standardikäyrää, joka sisältää tunnetuille luontaisen egliini C:n määrille, esim.

1 3 10 - 10 ng/ml, saadut arvot saadaan mitatuista OD4o5_ arvoista selville tutkittavan näytteen sisältämä egliini C-pitoisuus.

Menetelmää voidaan käyttää myös egliini B:n tai muiden egliinien, esim. N -asetyyli-egliini C:n, määrittämiseen, ja se on myös käyttökelpoinen haluttaessa määrittää egliinit plasmasta, esim. rotan-, kissan-tai kaniininplasmasta.

Tätä tamdem-ELISAa varten tarkoitettu testipakkaus sisältää tähän tarvittavat reagenssit, erityisesti monoklonaaliset antiegliinivasta-aineet, esim. 299S18-20 ja 299S22-1, mahdollisesti käytettyyn puskuriin tehtynä liuoksena, käytetyt puskurit, substraatin puskurit mukaanluettuina, pesuliuokset, p-nitrofenyylifosfaatin substraattina, standardiliuoksen, joka sisältää määritettävää egliiniä, esim. egliini C:tä, muovisen mik-rotiitterilevyn ja/tai mahdollisesti taulukon tai standardikäyrän, kuten seuraavat, jotka on saatu edellä kuvatulla tandem-ELISA-menetelmällä: 107 86744 luontainen egliini C 405 _(ng/rol)___ 10° 0.09 101 0.18 102 0.73 103 1.23

Na-asetyyliegliini (ng/ml) C 00405 10° 0.08 101 0.32 102 1.00 103 1.26

Esimerkki 35: Farmaseuttinen valmiste, joka sisäl tää Na-asetyyli-egliini C:tä parenteraalisesti annettavaksi ex

Esimerkin 24 tai 25 mukaisesti valmistettu N -asetyyli-egliini C:tä sisältävä liuos dialysoidaan 0,9-prosenttista NaCl-liuosta vasten. Liuoksen väkevyys säädetään sen jälkeen samalla NaCl-liuoksella laimentamalla arvoon 1 mg/ml tai 10 mg/ml. Nämä liuokset steriloidaan ultrasuodattamalla (kalvot, joissa on 0,22 ym:n huokoset).

Steriloidut liuokset ovat suoraan käyttökelpoisia intravenoosisesti, tiputusinfuusiolla tai sisäänhengi-tyslaitteella sumuttamalla (esim. Bird) annettaviksi.

Keksinnönmukaisesti saadut monoklonaalisia anting! iinivasta-ainoita tuottavat hybridoomasolut taltioitiin 6. marraskuuta 1984 "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes"-kokoelmiin, Pasteur-insti-tuuttiin, Pariisiin, Ranskaan seuraavilla numeroilla: 299S18-20 n:o 1-361, 299S22-1 n:o 1-362 ja 299S22-10 n:o 1-363.

ioe 86744

Esimerkki 36: Egliinin ilmentyminen hiivassa Järjestelmä, joka soveltuu vieraiden geenien ilmentymiseen hiivassa, vaatii voimakkaan hiivapromoottorin, mieluimmin indusoitavan promoottorin ja hiiva-transkriptio-lopetus-signaalin, jotka ovat kytkeytyneet peräkkäin ja niitä erottaa toisistaan kerran esiintyvä, vieraan geenin liittämiseen soveltuva restriktiokohta. Ilmentymisvektori sisältää lisäksi hiivan DNA-sekvenssejä, jotka mahdollistavat autonomisen replikoitumisen hiivassa ja johtavat plasmidin suureen kopio-lukumäärään. Nämä sekvenssit ovat edullisesti hiiva-2y-sek-venssejä. Vektori sisältää edelleen hiiva-valintageenin, edullisesti hiivan LEU2-geenin, ja pBR322-DNA-sekvenssit, jossa on replikoitumisen aloituskohta ja ampisilliini-resis-tenssigeeni lisääntymistä varten E. colissa.

Sopiva ilmentymisjärjestelmä, joka täyttää esitetyt vaatimukset, on selitetty EP-patenttihakemuksessa n:o 100,561 ja se on osoittautunut hyvin suorituskykyiseksi hiivassa. Vieraita geenejä muodostuu hiivan hapanfosfataasin indusoitavan PH05-promoottorin säätelemänä. PH05-promoottori, vieras geeni ja PH05-transkriptio-lopetussignaali ovat järjestäytyneet peräkkäin pJDB207-plasmidissa. Plasmidi sisältää hiiva-2y-sekvenssejä, hiivan LEU2-geenin ja replikoitumisen aloituskohdan ja E. colin ampisilliini-resistenssigeenin.

Ilmentymisplasmidi pJDB207R/PH05-EGL valmistetaan seuraavasti : a) pJDB207:n vektorijakson eristäminen: 6 yg plasmidia pJDB207R/IF (a-3) (EP 100,561) leikataan täydellisesti restriktioendonukleaasilla BamHI. Näin saatavat DNA-jaksot, joiden pituus on 6,85 kb ja 1,15 kb saoste-taan etanolilla ja suspendoidaan uudelleen 400 yltään 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Lisätään 4,5 yksikköä vasikan suolen emäs-fosfataasia (Boehringer, Mannheim). Seosta inkuboidaan 1 tun ti 37 °C:ssa. Sen jälkeen fosfataasi inaktivoidaan inkuboi-malla 65 °C:ssa 1,5 tuntia. Liuos säädetään 150 mM:seen NaCl-pitoisuuteen. DNA-liuos pannaan DE-52-anioninvaihtajaan (Whatman) (100 yl patsas), joka on tasapainotettu 10 mM Tris- !09 86744 HClillä, pH 7,5, joka sisältää 150 mM NaClia ja 1 mM EDTAita. Kun on pesty samalla puskurilla, DNA eluoidaan 400 piillä 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 kb:n BamHI-jakso erotetaan pienestä jaksosta 0,6%iisella alhaalla sulavalla agaroosigeelillä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3.

b) 534 bp PH05-promoottorijakson eristämineni 10 pg plasmidia p31/R (EP 100,561) leikataan restriktio-endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Näin saatavat 3 jaksoa erotetaan 0,6 %isella alhaalla sulavalla agaroosigeelillä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3. Eristetään 534 bp BamHI-EcoRl-jakso, joka sisältää PH05-promoottorin, mukaanlukien mRNA-aloituskohdan.

c) Egliiniä koodittavan sekvenssin sisältävän 221 bp DNA-jakson eristäminen 8 pg plasmidia pML 147 leikataan restriktioendonukleaa-seilla BamHI ja EcoRI. Näin saatavat kaksi DNA-jaksoa erotetaan 0,6%iisella alhaalla sulavalla agaroosigeelillä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3. Eristetään 221 bp-jakso.

d) DNA-jaksojen liittäminen

Kolme ylläkuvattua ja sopivia kohesiivisia päitä sisältävät DNA-jaksot liitetään yhdellä reaktiolla. Liitetään 0,1 pmoolia (0,45 pg) 6,85 kbin BamHI-vektorijaksoa, 0,2 pmoolia (70 ng) 534 bp BamHI-EcoRI-PH05-promoterijaksoa ja 0,2 pmoolia (29 ng) 221 bp EcoRI-BamHI-jaksoa pML 147istä. Nämä 3 DNA-jaksoa ovat pienissä alhaalla sulavan agaroosin geeli-palasissa. Nämä kolme agaroosigeelipalasta yhdistetään, nes-teytetään 65 °Cissa ja laimennetaan kaksinkertaiseksi. Liittäminen suoritetaan 270 piissä 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 16 yksikön kanssa T4-DNA-ligaa-sia (Boehrlnger, Mannheim) 15 °Cissa 16 tunnin aikana. Erä liitäntäseosta (10 pl) lisätään 100 ylraan kalsiumkäsitelty-jä, transformointikykyisiä E. coli-HB10l-soluja.

24 transformoitua, ampR-pesäkettä viljellään erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 pg/ml ampisilliinia. Plasmidi- 110 86744 DNA saadaan menetelmällä Holmes et ai. [Anal. Blochem. 114, 193 (1981)] ja analysoidaan Hindlll/EcoRI-kaksoisleikkauksel-la. 600 bp-EcoRI-Hindlll-jakson löytyminen osoittaa, että PH05-promoottori-egliini C-DNA-jakson rakentaminen ilmentä-misvektorissa on tapahtunut oikeassa järjestyksessä. Kuten odotettua, on noin 50 % liitännäisen klooneista oikeassa järjestyksessä. Yksi näistä klooneista eristetään ja sille annetaan nimi pJDB207/PHO5-EGL.

e) Saccharomyces cerevisiae GRF 18:n transformointi

Plasmidi pJDB207R/PHO5-EGL siirretään Saccharomyces cere-visiae-kantaan GRF 18 (a, his 3-11, his 3-15, leu2-3, leu2-112, canR) Hinnen et al.:n (4) esittämän transformointimal-lin mukaisesti. Transformoidut hiivasolut valitaan hiiva-mi-nimaalialustamaljoilla (ilman leusiinia). Yksittäiset transformoidut hiivapesäkkeet eristetään ja niille annetaan nimi Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PH05-EGL.

f) S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-EGL:n fermentointi S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-EGL-soluja viljellään ravistellen 30 °C:ssa 24 tuntia 1 litran Erlenmeyer-kolvissa 300 mlrssa hiivan minimaalialustaa (Difco "Yeast Nitrogen Base", jossa ei ole aminohappoja ja johon on lisätty 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) solutiheyteen 3 x 107 solua/ ml. Solut pestään 0,9%:isella NaCl:lla ja ne lisätään 3 litraan alhaisen P^-pitoisuuden omaavaa minimaalialustaa, joka on valmistettu samoin kuin Difco'n "Yeast Nitrogen Base"-alusta (ilman aminohappoja) ja johon on lisätty 0,03 g/1 KH2P04, 1 g/1 KC1 10 g/1 L-asparagiinia (NH4)2S04:n sijasta, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Alustan optinen tiheys (OD60o) säädetään arvoon 0,25. Soluja viljellään 24 tuntia MBR mini-bioreaktorissa sekoittaen (500 rpm) 30 °C:ssa ja otetaan talteen kun optinen tiheys (OD60q) on 1,9.

Esimerkki 37: Egliini C:n ja Na-asetyyli-egliini C:n talteenotto transformoidusta Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB-207R/PHO5-EGL:stä ui 86744

Egliini C ja Na-asetyyli-egliini C eristetään Saccharo-myces cerevisiae-kannasta, joka on transformoitu egliini C-rakennegeenin sisältävällä plasmidilla. Tuotteet saadaan suhteessa 2:1 (w/w) ja käänteisfaasi-HPLC:n perusteella saanto on 15-20 mg kasvatusliuoksesta. S. cerevisiae-soluja viljellään solutiheyteen 1,9 (O.D. 600 nm:ssä), kuten esimerkissä 36f on selitetty.

Transformoitujen hiivasolujen viljelyalusta (3 1) jäähdytetään 4 °C:seen ja sentrifugoidaan. Sentrifugointisakassa olevat solut suspendoidaan uudelleen 150 ml:aan puskuria [50 mM fosfaatti, pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem.)] ja murskataan lasihelmillä. Homogenoitu liuos sentrifugoidaan ja supernatantti laimennetaan samalla tilavuudella 2-prosenttis-ta etikkahappoa. Suspensiota sentrifugoidaan 15 min. 4000 upm:n nopeudella, sakka erotetaan ja sameata supernatanttia sentrifugoidaan uudelleen 60 min. 12000 upm:n nopeudella. Kirkas supernatantti lasketaan kationinvalhtopylvään läpi (karboksimetyyliselluloosa, patsaan tilavuus 32 ml) pH 4:ssä (1 patsaan tilavuus lähtöpuskurina). Eluutio suoritetaan lineaarisella suolagradientilla, jossa on 5 patsaan tilavuutta puskuria A ja 5 patsaan tilavuutta puskuria B (puskuri A: 20 mM ammoniumasetaatti, pH 4,0; puskuri B: 200 mM ammoniumase-taatti, pH 6,5; läpivirtaus 43 ml/tunti; fraktion koko 14 ml). Na-asetyyli-egliini C saadaan talteen fraktioista 29-31 (15 mg) ja kuten selitettiin, puhdistetaan edelleen semipre-paratiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä (saanto 8 mg). Egliini C saadaan fraktioista 32-33 (24 mg), lyofilisoidaan ja kro-matografoidaan edelleen dietyyliamino-etyyliselluloosapylvääs-sä (DE 53, Whatman, patsaan tilavuus 32 ml). Tuote liuote-: taan 15 ml:aan lähtöpuskura (pH 7,6), pannaan pylvääseen ja pestään yhdellä patsaan tilavuudella puskuria A. Enemmän kuin 90 % (laskettuna kokonaisproteiinimäärästä) puhdasta egliini C:tä eluoituu fraktioissa 48-54, jolloin käytetään hyödyksi lineaarista suolagradienttia [puskuri A: 20 mM ammoniumasetaatti, pH 7,6, 5 patsaan tilavuutta; puskuri B: 200 mM am- 112 86744 moniumasetaatti, pH 5,0, 5 patsaan tilavuutta; läpivirtaus 42 ml/tunti, fraktion koko 3,8 ml (5 min.)]. Puhtaat fraktiot (isoelektrisen fokusoinnin perusteella) yhdistetään ja lyo-filisoidaan kolmasti (saanto 18 mg).

Molemmat saadut egliinit tutkitaan ja karakterisoidaan kemiallisesti, kuten esimerkeissä 27-30 on selitetty.

Tulokset:

Egliini C isoelektrinen piste 6,5 molekyylipaino (FAB-MS) 8091 N-terminaalinen aminohappo Thr HLE-inhibointi + N -asetyyli- isoelektrinen piste 5,4 egliini C molekyylipaino (FAB-MS) 8133 N-terminaalinen aminohappo Na-asetyyli-

Thr HLE-inhibointi +

Transformoiduista hiivasoluista saadulla egliini C:llä on samat retentioajat HPLC:ssä kuin luonnollisella egliinil-lä, jota saadaan verijuotikkaista. Na-asetyyli-egliinillä on samat retentioajat kuin vastaavalla E. colista saatavalla peptidillä. Aminohappokoostumukset ja muut tiedot olivat odotettuj a.

Esimerkki 38: Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-EGL:n fermentointi 30 l:n fermentorissa

Kantaa Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-EGL viljellään seuraavassa ravintoalustassa (alhainen P^-pitoi-suus), kunnes solutiheys (O.D. 600 nm:ssä) on 1,87 (konsen-traatiot g tai mg liuoslitraa kohti): 113 86744 L-asparagiini*H20 10 'g L-histldiini 1,0 g KH2P04 0,03 g

MgS04‘7H20 0,5 g

NaCl 0,1 g KC1 1,0 g

CaCl2*2H20 0,1 g

Cerelose (erikseen steriloitu) 20 g boorihappo 50 mg

CuS04 5 mg kaliumjodidi 10 mg

Fed g 20 mg

MnS04 40 mg natriummolybdaatti 20 mg

ZnS04 40 mg kalsiumpantotenaatti 40 mg foolihappo 5 mg inositoli 200 mg nikotiinihappo 40 mg para-aminobentsoehappo 20 mg pyridoksaalifosfaatti 40 mg riboflaviini 20 mg tiamiini 40 mg biotiiniliuos (10 mg/100 ml 50 % etanoli)

Olosuhteet: pH-säätö NaOH:lla; alaraja pH 4,6; lämpötila 30 °C.

Koenäytteitä (yhteensä 8, kulloinkin 100 ml kasvatusliuos-ta) otettiin joka kuudes tunti. Solut hajotettiin mekaanisesti ja kirkkaat supernatantit tutkittiin etikkahappokäsit-telyn jälkeen RP-HPLC:llä, PAGE:11a ja HLE-inhiboinnilla. 36 tunnin fermentoinnin jälkeen saatiin optimaaliset saannot (4,4 mg Na-asetyyli-egliini C:tä ja 13,6 mg egliini C:tä kas-vatusliuoslitraa kohti). PAGE:n osoittamat molekyylipainot vastaavat odotuksia.

114 86744

Kun pH-säädössä oli alaraja pH 5, ja fermentointi kesti 30 tuntia samoissa olosuhteissa, näiden kahden tuotteen suhde siirtyy egliini C:n hyväksi (saanto: 6,4 mg/1; Na-asetyy-li-egliini C:n saanto: 0,1 mg/1). Hiivan egliini C ja hiivan Na-asetyyli-egliini C otetaan talteen ja puhdistetaan homogeeniseksi esimerkissä 29 esitetyllä tavalla.

115 8 6 7 4 4

Kirjallisuusviitteet 1. U. Seemiiller et ai, Hoppe-Sey 1 er1 s Z. Physiol. Chem. 358, 1 105 (1977) 2. R. Knecht et ai., Anal. Biochem. 130, 65 (1983) 3. A.M. Maxam ja W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 560 (1977); katso myös Meth. Enzym. 6^5, 499 (1980) 4. A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_5, 1 929 (1978) 5. Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. 8_1^, 741 ( 1961 ) 6. M. Mandel et al.t J. Mol. Biol. 5J3, 159 (1970) 7. U.K. Laeramli, Nature 227, 680 (1970) 8. S. Tsunasaua ja F. Sakiyama, in Methods Enzyraol. 106, 165 (1984) 9. S. Alkan et ai., Mol. Immunol. 2Ot 203 (1983) 10. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Hoi 1 and Pubi. Corap., Amsterdam 1978 11. S.A. Narang, Tetrahedron 39_, 3 ( 1983) 12. K.L. Agarwal et al. , Angew. Chem. 84^, 489 (1972) 13. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 14. R.L. Letsinger ja W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98^, 3655 (1976) 15. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 16. H.G. Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976) 17. S.A. Narang et al., Anal. Biochera. 121, 356 (1982) 18. K. Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982) 19. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125 20. A.E. Bolton ja W.M. Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973) 21. DE-OS 3 111 405 (Genentech) 22. A.C. Peacock et al., Biochemistry 6, 1818 (1967) 23. W. Muller et al . , J. Mol. Biol. m., 343 (1978) 24. M. Grunstein ja D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979) 25. Ish-Horowitz, in loc. cit. 19), S. 368 26. Kohler ja Milstein, Nature 256, 495 (1975) 116 86744 27. H. Ako et ai., Biochem. Biopbys. Res. Connn., 1639 (1972) 28. H. Fritz et ai., in: "Methoden der enzymatischen Analyse" (Hrsgb. H.U. Bergmeyer), 3. painos» Weinheira 1974, S. 1105 29. S. Moore et ai., J. Biol. Chera. 192, 663 (1951), D.H. Spadman et ai., Anal. Chera. 30, 1190 (1958) 30. H. Morris et ai., Biochem. Biophys. Res. Comra. 117, 299 (1983) 31. U. Seemiiller et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chera. 361, 1841 (1980) 32. R. Knecht et ai., Analyt. Biochem. 130, 65 (1983) 33. W.F. Brandt et ai., Z. Physiol. Chera. 357, 1505 (1976) 34. A. Goldstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA ^4» 725 (1977) 35. R. Wetzel ja D.V. Goeddel, in "The Peptides" (Hrsgb. E. Gross ja J. Meienhofer), Academic Press, New York 1983, S. 1-64 36. J.G. Bieth, Bull, europ. physiopath. respirat. J^6 (suppl.), 183 (1980) 37. L. Clarke ja J. Carbon, J. Mol. Biol.120, 517 (1978) 38. D.S. Oppenheira ja C. Yanofsky, J. Mol. Biol. 144, 143 (1980)

Claims (2)

117 86744

1. Menetelmä kaavan XIV mukaisen egliiniyhdisteen valmistamiseksi VGluPheClySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu Tyr PheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySe rProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHis ValGly (XIV), jossa kaavassa V on Thr tai N-asetyyli-Thr ja W on Tyr tai His, ja sen suolojen valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että ilmentymisenohjaussekvenssin säätelemän, egliiniä koodittavan DNA-sekvessin sisältämällä ilmentä-misplasmidilla transformoitunutta Escherichia coli- tai Saccharomvces cerevisiae-kantaa viljellään sellaisessa nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, ja mainittu egliiniyhdiste vapautetaan mikro-organismisoluista ja eristetään, ja mikäli tarpeellista, keksinnön mukaisesti saatu kaavan XIV mukaisten yhdisteiden seos erotetaan yksittäisiksi komponenteiksi, ja/tai saatu suola muutetaan haluttaessa vapaaksi polypeptidiksi tai saatu polypeptidi muutetaan suolakseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan egliini C;tä. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N“-asetyyli-egliini C:tä. 118 86744