HU203784B - Process for producing egline and egline derivatives and pharmaceutical compositions containing them and testcit for determining egline - Google Patents

Process for producing egline and egline derivatives and pharmaceutical compositions containing them and testcit for determining egline Download PDF

Info

Publication number
HU203784B
HU203784B HU844308A HU430884A HU203784B HU 203784 B HU203784 B HU 203784B HU 844308 A HU844308 A HU 844308A HU 430884 A HU430884 A HU 430884A HU 203784 B HU203784 B HU 203784B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
eglin
dna
formula
acetyl
xiv
Prior art date
Application number
HU844308A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT36864A (en
Inventor
Sefik Alkan
Hans Fritz
Manfred Liersch
Francois Meyer
Werner Rittel
Ursula Seemueller
Hans Rink
Peter Sieber
Walter Maerki
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HUT36864A publication Critical patent/HUT36864A/hu
Publication of HU203784B publication Critical patent/HU203784B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás az eglinként elnevezett proteáz-inhibitorokat kódoló DNS-szekvenciák, az ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó hibridvektorok az ilyen hibridvektorokkal transzformált gazdasejtek, az ilyen transzformált gazdasejtekkel termelt proteázgátló-hatású új polipeptidek, ezeknek a DNS-szekvenciáknak, hibridvektoroknak és transzformált gazdasejteknek az előállítására és az eglinek transzformált mikroorganizmusok segítségével történő előállítására.
A 2 808 396 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratból ismert két, orvosi piócából (Hidrudo medicinalis) izolált proteáz-inhibitor, az eglin-B és eglin-C. Ezek a polipeptidek egyenként 70 ami5 nosavból épülnek fel, molekulasúlyuk kb. 8100 és erősen gátolják a kimotripszint, szubtilizint, az állati és emberi granulocita-proteáz-elasztázt és katepszin G-t, valamint a hízósejt-proteáz-kimázt (1). Kevésbé gátolják a tripszinhez hasonló proteázokat
Az eglin-C primer struktúrája (2) az alábbi:
ThrGluPheGly SerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProglniyrAspValTyrPheLeu ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgiyrAsnArgValArgValPhe TyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly
Az eglin-C a legtöbb ismert proteázgátlóval ellentétben nem tartalmaz diszulfidhidat és olyan minifehérjének bizonyul, amely szokatlanul stabil a sav, lúg vagy hő hatására történő denaturálással és a proteolitikus lebontással szemben. Az eglin-B primer struktúrája annyiban különbözik az eglin-C struktúrájától, hogy a 35. pozícióban tirozin helyett hisztidint tartalmaz.
A humán és állati eredetű granulocita-elasztázok, valamint a humán granulocita-katepszin G és a szubtilizin típusú bakteriális proteázok ma ismert legerősebb inhibitorai az eglinek. A szervezetben ezeknek a proteázoknak szabályozatlan, ill. feleslegben való képződése gyulladási folyamatot fokozhat és nemspecifikus proteolízissel szövetlebomlást idézhet elő. Ez különösen azért lehetséges, mert hatásuk az intracelluláris emésztésben résztvevő enzimekre fiziológiás (semlegestől enyhén alkálikusig) környezetben optimális és az eredeti szövetalkotókat (pl elasztin) és humoralis faktorokat (pl. véralvadási és kiegészítő faktorok) gyorsan elbontják és inaktiválják. Az eddig megismert tulajdonságok alapján az eglinek alkalmazása az orvosi terápiában (gyulladást gátló szerek, gyulladást csökkentő szerek, szeptikus sokk, tüdőtágulás, mucoviscidosis stb.) nagy érdeklődésre tarthat számot.
Az orvosi piócában csak nagyon kis mennyiségben (kb. 16 pg/pióca) képződnek eglinek. Az eglinek izolálása és tisztítása orvosi piócából ezért nagyon időigényes és költséges és kereskedelmi méretekben nem kivihető. Az úgynevezett rekombináns DNS-technológia (vagy géntechnológia) rohamos fejlődése lehetővé teszi különböző élettanilag aktív polipeptidek előállítását ezzel a technológiával.
A találmány célja, hogy géntechnológiai eszközök segítségével olyan expressziós rendszert bocsásson rendelkezésre, ami az eglinek mikrobiális előállítását ipari méretben lehetővé teszi. Ezt a feladatot a találmány eglingént tartalmazó hibridvektorok elkészítésével oldja meg, amit azután egy expressziós kontroliszekvencia oly módon szabályoz, hogy a hibridvektorokkal transzformált gazdában az eglingén kifejeződik.
Eglint kódoló DNS-szekvenciák előállítása
A találmány az eglint, pl. az eglin-B-t és különösen az eglin-C- t, vagy módosított eglint, pl. módosított eglin-B-t vagy különösen módosított eglin-C-t mimellett a módosítás lényegében az eglin primer struktúrájának megrövidítését jelenti az eglinaktivitás megőrzése mellett - kódoló DNS-szekvenciákra és ezek fragmentumaira vonatkozik.
A találmány keretében „eglin” általános elnevezés alatt, ha külön nincs definiálva, olyan proteinázgátlóhatású polipeptideket értünk, amelyek primer struktúrája messzemenő (általában 80%-ig terjedő struktúrhomológia) azonosságot mutat az eghn-B vagy -C primer struktúrájával, az N-terminális azonban módosított, például a treoninon Na-acetílezett, N“-metionilezett vagy Na-acetil-metionilezett is lehet.
Az eglinek módosítása előnyösen a természetes eglinek primer struktúrájának az N-terminálison például 1-10, különösen 1-6 aminosavval és/vagy a C-terminálison 1-6, különösen 2 aminosavval való megrövidítését jelenti, mimellett itt is beleértendők az N-terminálison módosított, például acetilezett és metionilezett vagy N-acetíl-metionilezett származékok.
A találmány továbbá eljárás az eglint, például az eglin-B-t vagy különösen az eglin-C-t, vagy módosított eglint, például módosított eglin-B-t vagy különösen módosított eglin-C-t kódoló DNS-szekvenciák és azok fragmentjeinek előállítására azzal jellemezve, hogy a piócagenomből izoláljuk az eglin-struktúrgént vagy az eglin-m-RNS-ről komplementer kettős szálú DNS-t (eglin-ds cDNS) készítünk, és a módosított eglint kódoló DNS-szekvenciák előállításához az eglin-struktúrgént vagy az eglin-cDNS-t megfelelő nukleázokkal kezeljük, vagy a megfelelő (módosított) eglin-struktúrgént vagy annak fragmentjeit kémiai és enzimatikus eljárásokkal állítjuk elő.
Az eglin-DNS-t és az eglin-cDNS-t például önmagában ismert módszerekkel kapjuk. így az eglingént piócagénbankból kapjuk, oly módon, hogy a piócaDNS-fragmentumokat mikroorganizmusban klónozzuk és az eglin-DNS-t tartalmazó kiónokat, például kolónia- hibridizálással azonosítjuk, amihez olyan radioaktív jelzett eglin-DNS specifikus oligodezoxinukleotídot alkalmazunk, amely legalább 15, előnyösen 15-30 dezoxinukleotidot tartalmaz. Az így kapott DNS-fragmentumok az eglingén mellett rendszerint még további nemkívánatos DNS-szakaszokat tartalmaznak, amiket
HU 203 784 Β megfelelő exo- vagy endonukleázos kezeléssel hasíthatunk le.
A kettős szálú eglin-cDNS-t például úgy állíthatjuk elő, hogy alkalmas, előnyösen eglintermelés céljából indukált piócasejtekből mRNS-t izolálunk, a kapott 5 mRNS-keveréket önmagában ismert módon eglinmRNS-re nézve dúsítjuk, ezt a mRNS-t templátként alkalmazzuk, az egyfonalas cDNS előállításához, amelyből DNS-függő DNS-polimeráz segítségével kettős szálú cDNS-t szintetizálunk és ezt alkalmas vektor- 10 ba klónozzuk. Az eglin-cDNS-t tartalmazó kiónokat például a fent leírt módon kolónia-hibridizálással, radioaktív jelzett eglin-DNS specifikus oligodezoxinukleotid alkalmazásával azonosítjuk.
A módosított eglineket kódoló DNS-szekvenciák 15 előállításához a genomból kapott eglin-DNS-t vagy az eglin-cDNS-t megfelelő exo- és endonukleázokkal kezelhetjük, amelyek az N-, ill. C-terminális aminosavakat kódoló DNS-szakaszokat lehasítják.
A genomból ily módon kapott eglin-DNS-t vagy az 20 eglin-cDNS-t előnyösen az 5’- és 3’-végen, olyan kémiailag szintetizált adapter-oligodezoxinukleotidokkal kapcsoljuk össze, amelyek egy vagy több különböző restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáit tartalmazzá és ezáltal a megfelelő vektorokba való beépítést megkönnyítik. Az eglin-DNS, ill. -cDNS 5’-végéhez kapcsolt adaptermolekulának tartalmaznia kell még a transzláció startjelét (ATG). A transzláció startjele olyan elhelyezkedésű legyen, hogy közvetlenül az eglin első amlnosavának kodonja kövesse.
Mivel a természetes eglingén struktúrája nem ismeretes és az eglingén kémiai szintézise a modem szintézislehetőségek alapján előnyökkel jár, utóbbi a találmány előnyös kiviteli formáját képezi.
5’ Met B (X)„ ATG D
Az eglingén kémiai szintézise
A találmány eljárás különösen az eglin vagy módosított eglin struktúrgénjének vagy annak fragmentjeinek előállítására azzal jellemezve, hogy az eglingén vagy módosított eglingén kódoló és komplementer szálának szegmentjeit kémiailag szintetizáljuk és a kapott szakaszokat enzimetikusan az eglin vagy a módosított eglin struktúigénjévé vagy annak fragmentjeivé alakítjuk.
A találmány továbbá olyan kettős szálú DNS-ekre vonatkozik, amelyek az eglineket, például az eglin-B-t vagy eglin-C-t, módosított eglineket, például módosított eglin-B-t vagy módosított eglin-C-t, vagy azok fragmentjeit kódolják.
A találmány szerinti DNS-ek az eglinek, ill. módosított eglinek kodonjain kívül tartalmazzák a transzláció start- és stopjeleit - amik alkalmas gazdasejtben például E.coliban lehetővé teszik az expressziót - továbbá a végeken olyan nukleotidszekvenciákat, amelyek vektorba történő beépítésre alkalmasak. A találmány egyik előnyös kiviteli formája olyan DNS-re vonatkozik, amelyben az 5’-végen levő, restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvenciát a transzláció startjele, az eglin vagy a módosított eglin kodonjai - amelyek adott 25 esetben egy vagy több helyen lehetővé teszik a restrikciós enzimmel történő hasítást - a transzláció stopjele és a 3’-végen egy restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvencia követik. A találmány szerint alkalmazható restrikciós enzimek például az EcoRI, Bam30 Hl, Hpall, PstI, Aval vagy Hindin.
A találmány eljárás, különösen olyan eglint kódoló (I) általános képletű nukleotidszekvencíából és a komplementer nukleotidszekvencíából álló, kettős szálú DNS
Pro Glu Val Val Gly Lys Thr Val Asp Gin
CCX GAM GTS GTX GGX AAM ACX GTX GAY CAM
Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro
GCX LGN GAM ΤΑΥ ΤΓΎ ACX YTZ CAY TAY CCX
Gin Tyr Asp Val W Phe Leu Pro Glu Gly
CAM TAY GAY GTX YAY TTY YTZ CCX GAM GGX
Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu Arg Tyr Asn
QRS CCX GTX ACX YTZ GAY YTZ LGN ΤΑΥ AAY
Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro Gly Thr
LGN GTX LGN GTX TTY TAY AAY CCX GGX ACX
Asn Val Val Asn B’ NON
AAY GTX GTX AAY D’ TMK (X)n 3’ (I), ahol a képletben a nukleotidszekvenciát az 5’-végtől kezdődően tüntettük fel és jobb megértés kedvéért megadtuk a tripletek által kódolt aminosavakat, és ahol D jelentése egyes kötés vagy az eglin N-terminális 60 aminosavát kódoló nukleotidszekvencia és B jelentése egyes kötés vagy az alábbi csoportból választott megfelelő N-terminális aminosavak,
HU 203 784 Β
Ser Phe Leu Lys Ser Phe Ser Glu Leu Lys
QRS TTY YTZ AAM QRS TTY QRS GAM YTZ AAM
Ser Phe Phe Gly Ser Glu Leu Lys Ser Phe
QRS TTY TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY
vagy
Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu Lys Ser Phe
ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY
és D’ jelentése vegyértékvonal vagy az eglin-C ter- jelentése vegyértékvonal vagy i
minális aminosavát kódoló nukleotidszekvencia és B’ lasztott megfelelő C-terminális
His Val His Val Pro His
CAY GTX CAY GTX CCX CAY vagy
His Val Pro His Val Gly
CAY GTX CCX CAY GTX GGX
és ahol a képletekben 20
A dezoxiadenozil,
T timidil,
G dezoxiguanozil,
C dezoxicitidil,
XA,T, CvagyG, 25
Y T vagy C,
Z A, T, C vagy G, ha Y-C, vagy Z-A vagy G, ha Y-T,
QTvagyA,
R C és S-A, T, C vagy G, ha Q-T, 30 vagy R-G és S-T vagy C, ha Q-A,
M A vagy G,
LA vagy C,
N A vagy G, ha L-A, vagy N-A, T, C vagy G, ha L-C, 35
K A vagy G, ha M-A, vagy K-A, ha M-G,
W tyr vagy his jelentésű és (X)„ és (X)m egyenként olyan tetszés szerinti nukleotidszekvenciákat jelentenek, amelyek- 40 ben n és m nagyobb, mint 3 és kisebb, mint 100, különösen nagyobb, mint 5 és kisebb, mint 12 - előállítására, amit egy restrikciós enzim képes felismerni és elhasítani, továbbá az (I) általános képletű kettős szálú DNS-fragmentjeinek előállítására. 45
A találmány különösen olyan eglint kódoló kettős szálú (I) általános képletű DNS-re vonatkozik, ahol a képletben D jelentése az YTZ QRS TTY, QRS GAM YTZ AAM QRS TTY és ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY csoportból választott nukleotidszekvencia és D’ jelentése a CAY GTX CCX CAY GTX GTX nukleotidszekvencia és a többi szimbólum az (I) általános képletnél megadott jelentésű.
A találmány elsősorban olyan (I) általános képletű, eglint kódoló kettős szálú DNS-re vonatkozik, ahol a képletben D jelentése az ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY nukleotidszekvencia és D’ jelentése a CAY GTX CCX CAY GTX GGX nukleotidszekvencia és a többi szimbólum az (I) általános képletnél megadott jelentésű.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában a DNS-szekvencia az 5’-végen EcoRI-gyel hasítható, a közepén Hpall-vel hasítható és a 3’-végen BamHI-gyel hasítható nukleotidszekvenciát tartalmaz.
A találmány elsősorban olyan kettős szálú DNS-re vonatkozik, amely az eglinek, ill. módosított eglinek aminosavait kódoló, E.coli által előnyben részesített tripleteket tartalmaz. Ilyen tripletek a következők:
Glicin (Gly) GGT
Alanin (Alá) GCT
Valin (Val) GTT
Leucin (Leu) CTG
Szerin (Ser) TCT
Treonin (Thr) ACT
Fenilalanin (Phe) TTC
Tirozin (Tyr) TAC
Metionin (Met) ATG
Aszparaginsav (Asp) GAC
Glutaminsav (Glu) GAA
Lizin (Lys) AAA
Arginin (Arg) CGT
Hisztidin (His) CAT
Prolin (Pro) CCG
Glutamin (Gin) CAG
Aszparagin (Asn) AAC
A találmány a fenilalaninra a iTf kodont is és a
prolinra a CCA vagy CCT kodont is alkalmazza, ezáltal az 5'-végen található EcoRI hasítási helyén, a 3'-végen található BamHI hasítási helyén, és egy Hpall hasítási helyén kívül az említett restrikciós enzimekre semmilyen további hasítási helyet nem tartalmaz. Előnyös stopjel (NON) a TAG kodon.
A fent bemutatott módon az eglin-C-gén előnyös kiviteli formája a (Ha) általános képletű DNS, az eglin-B-gén előnyös kiviteli formája a (Hb) általános képletű DNS, és a módosított (N- terminálison rövidített) eglin-C-polipeptid génjeinek előnyös kiviteli formái a (He) és (Hd) általános képletű DNS-ek, ahol a képletekben A, T, G, C jelentése az (I) általános képletnél megadott és jobb megértés kedvéért megadtuk a tripletek által kódolt aminosava60 kát és a restrikciós enzimek hasítási helyeit.
HU 203 784 Β
MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRl)
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlhTyrAspValTyrPheLeuProGluGly
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTITACTTCCTGCCGGAAGGT
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCCTTCCA (HPaH)
SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal
TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT
AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA
ValAsnHisValProHisValGlyNON
GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI) (Ha),
MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCrGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRl)
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValHisPheLeuProGluGly GACCAGGCTCGTGAArACTTCACTCrGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGGAAGGT CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCCTTCCA (HpaH)
SerPro ValThrLeu Asp Leu ArgTyrAsnArgVal ArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal
TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT
AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGITGGGTCCATGATTGCAA
ValAsnHisValProHisValGlyNON
GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI) (Hb),
MetSerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRl)
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGGAAGGT
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCCTTCCA (HpaH)
SerPro ValThrLeu AspLeu ArgTyrAsnArgVal ArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal
TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT
AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA
ValAsnHisValProHisValGlyNON
GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI) (He),
HU 203 784 Β
MetLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGCAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRI)
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGGAAGGT
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCCTTCCA (Hpall)
SerPro ValThrLeuAspLeu ArgTyrAsnArg Val Arg ValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal
TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT
AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGA'ITGCAA
ValAsnHis ValProHis ValGlyNON
GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI) (Dd),
A találmány továbbá az eglingének olyan kettős szálú DNS- ftagmentjeire vonatkozik, amelyeknek végét restrikciós enzimek hasították és amelyek teljes eglin- vagy módosított eglingénekké illeszthetők össze. Az eglingének ilyen kettős szálú DNS- fragmentjei különösen 30-70 bázispárt tartalmaznak.
Például a találmány vonatkozik a (Dia) Fi(C) általános képletű, a (Ea’) Fi(C’) általános képletű, a (Illa”) Fi(C”) általános képletű, a (Eb) Fi(B) általános képletű és a (IV) (F2) általános képletű DNS- fragmentumokra.
MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACrGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyr Asp ValTyrPheLeuPro
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTCAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
Fi(C) (Ea)
MetSerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACAGACTTGACnTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
A spGln A la ArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValTyrPheLeuPro
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCTTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
Fi(C’) (Ea’)
MetLeuLysSerPheProGluVal ValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTrCAACAACCATTTrGACAA
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValTyrPheLeuPro
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
F,(C”) (Ea”)
MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGlu Val ValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATnTGACAA
HU 203 784 Β
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValHisPheLeuPro
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC
F,(B) (Hlb)
ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly
CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTnTCTACAACCCAGGT
GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCA
ThrAsn ValValAnsHis ValProHisValGlyNON
ACTAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
TGATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC
F2 (TV)
A találmány az eglin- és módosított eglingének 15 egyes szálú DNS-fragmentjeire is vonatkozik, különösen azokra, amelyek kémiai és/vagy enzimatikus módszerekkel eglin-, ill. módosított eglingénekké illeszthetők össze. A találmány elsősorban húsznál több, különösen 20-70 nukleotidot tartalmazó egyes szálú DNS- 20 fragmentekre vonatkozik.
A találmány legelsősorban a példákban leírt egyes és kettős szálú DNS-fragmentekre vonatkozik.
A DNS-szintézis módszereit S. A. Narang (11) foglalta össze. Az új szintézistechnikák mintegy 20 bázis 25 hosszúságú pollnukleotidok előállítását teszik lehetővé jó kitermeléssel, nagy tisztaságban és viszonylag rövid idő alatt. A foszfodiészter módszerrel (12), a még hatékonyabb foszfotriészter módszerrel (13) vagy a foszfittriészter módszerrel (14) alkalmas védett nukleotidokat 30 kapcsolunk össze egymással. Az oligo- és polinukleotidok szintézise a szilárd fázisú módszerrel egyszerűsíthető, amelyben a nukleotidláncot alkalmas polimerhez kötjük. Itakura et al. (15) a szilárd fázisú szintézisben egyes nukleotidok helyett foszfotriészter módszerrel 35 kapcsolt trinukleotidokat alkalmaznak, amelyek így rövid idő alatt és jó kitermeléssel, például 31 bázist tartalmazó polinukleotiddá kondenzálhatnak. A tulajdonképpeni kettős szálú DNS kémiailag előállított rövid szegmentekből enzimatikusan állítható össze. Kho- 40 rana et al. (16) ehhez mindkét DNS-szálból származó átfedő polinukleotid-szekvenciákat alkalmaznak, amelyek helyes elrendezését a bázispárosodás biztosítja és ezeket utána a DNS-ligáz-enzim kapcsolja össze. További lehetőséget jelent az, ha mindkét DNS-szálból 45 származó rövid átfedő szegmentet tartalmazó egy-egy polinukleotid-szekvenciát a négy szükséges dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz-I-gyel, a polimeráz-I Klenowfragmentjével, T« DNS-polimerázzal vagy AMV (avian 50 myeloblastosis vírus) reverz transzkriptázzal Inkubálunk. Eközben a bázispárosodás a két polinukleotidszekvenciát a helyes elrendezésben tartja össze és azt az enzim a szükséges nukleotidokkal teljes kettős szálú DNS-sé egészíti ki (17). Itakura és munkatársai leírják 55 (18), hogy ezen az elvi alapon DNS-polimeráz-I (Klenow-fragment) jelenlétében 4 kémiailag szintetizált 39-42 bázishosszúságú fragmentumból a humán leukocita-interferon a2-gén 132 bázispár hosszúságú szegmentje állítható össze, mimellett a kémiai szinté- 60 zisben 40%-os megtakarítást értek el a csak ligázt alkalmazó módszerrel szemben.
A találmány mindenekelőtt eljárás olyan DNS-ek, amelyek az eglineket vagy a módosított eglineket kódolják, a gazdasejtekben expresszióra alkalmasak és végeik vektorokba történő beépítést tesznek lehetővé, és ffagmentjeik előállítására azzal jellemezve, hogy
a) valamely alkalmas védett dezoxinukleotidot szilárd hordozóhoz kapcsolunk,
b) alkalmas védett di-, tri- vagy tetranukleotidokat állítunk elő a foszfor-triészter vagy a foszfit módszerrel,
c) a hordozóhoz kötött dezoxinukleotidot vagy oligodezoxinukleotidot alkalmas, védett mono- vagy [a b) pont szerint előállított] di-, tri- vagy tetranukleotiddal kapcsolunk össze a foszfotriészter vagy a foszfit módszer segítségével,
d) a c) pont szerint előállítható, hordozóhoz kötött kb. 20-70 bázishosszúságú oligodezoxinukleotidokat a hordozóról lehasítjuk, adott esetben tisztítjuk, a védőcsoportokat eltávolítjuk és az 5’-végen a szabad hidroxicsoportot foszforizáljuk, el) a kódoló és a komplementer szál két, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó oligodezoxinukleotidját anelláljuk és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal kettős szálú DNS-szegmentekké (az eglin- vagy módosított eglingén fragmentumaivá) egészítjük ki, és adott esetben 2, a d) eljárásváltozat szerint foszforilált alkalmas végekkel rendelkező kettős szálú DNS-szegmentet ligázzal eglin- vagy módosított eglin-struktúrgénné kapcsolunk össze, vagy 2 előállítható, kettős szálú DNS-szegmentet alkalmas vektorokban szubklónozunk, majd a d) eljárásváltozat szerint foszforilálunk és ligázzal az eglin vagy módosított eglin struktúrgénjévé kapcsoljuk össze, vagy e2) alternatív módon a kódoló és a komplementer szál 2, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó oligodezoxinukleotidját anelláljuk, a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal feltöltjük és ligázzal az eglin vagy a módosított eglin struktúrgénjévé kapcsoljuk össze.
HU 203 784 Β
A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az eglint kódoló DNS-ek előállítását.
Az a) lépésben nagyszámú szilárd hordozóanyag, így különböző téihálósodású és duzzadóképességű polisztirol, poliakrilamid, poliakrilamid-kopolimer, szervetlen anyagra, így kovafóldre, kovasavgélre vagy aloxra vitt poliamid vagy funkcionalizált szilán alkalmazható. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában szilárd hordozóanyagként térhálósított polisztirolt alkalmazunk, amit egy „spacer”-en, így 1-5 poláros kétértékű funkciós csoporttal, például imino-, oxo-, tio-, oxo-karbonil- vagy amido-karbonil-csoporttal megszakított 2-12 szénatomos alkiléncsoporton keresztül önmagában ismert módon az 5’-hidroxicsoporttal alkalmasan védett dezoxinukleoziddal összekapcsolunk. Különösen előnyös az (V) általános képletű 5’helyzetben és adott esetben a bázisrészben védett nukleozidok - a képletben Rí jelentése savval lehasítható védócsoport, így triaril-metil-védőcsoport, például 4metoxi-tritil- vagy 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport vagy tri(rövidszénláncú alkil)-szilil-védőcsoport, például terc-butil-dimetil-szilil-csoport és B jelentése adott esetben védett bázis, a timil-, citozil-, adenil- vagy guanilcsoport közül az egyik - reakciója borostyánkősavanhidriddel adott esetben bázisok, így piridin-, trietil-amin vagy dimetil-amino-piridin jelenlétében, amit a 0,5-2% divinil-benzollal térhálósított, amino-metilezett polisztirollal való, és karbonsavmaradék aktiváló reagensek előnyösen N-hidroxi-szukcinimid vagy pnitro-fenol és vízelvonó szerek, így karbodiimid, például diciklohexil-karbodiimid segítségével lefolytatott reakció követ (1. reakcióvázlat).
A reakciót inért, aprotonos oldószerben, például piridinben, tetrahidrofuránban, dioxánban, etil-acetátban, kloroformban, metilén-kloridban, dimetil-formamidban vagy dietil-acetamidban vagy ezek elegyében, szobahőmérsékleten vagy kissé megemelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például kb. -10-50 ’C hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten, vízelvonó szer jelenlétében alacsony hőmérsékleten is, például 0 ’C-on folytatjuk le.
A di-, tri- vagy tetranukleotidok találmány szerinti előállításában a b) eljárásváltozat szerint az (V) általános képletű 5’-helyzetben és adott esetben a bázisrészen védett nukleozidokat - a képletben R1 és B jelentése a fenti - (VH) általános képletű aktivált foszforsav-észterekkel - a képletben X1 és X2 egymástól függetlenül hidroxicsoportot vagy abból levezetett sókat, halogénatomot, imidazolil-, 1,2,4-triazol-Ι-il-, tetrazolil- vagy 1-benztriazolil-oxi-csoportot és X2 kiegészítőleg 2-ciano-etil-oxi-, 2-trihalogén-etil-oxi-, 2-aril-szulfonil-etil-oxi-, 2-(rövidszénláncú alkil)-tio-etil-oxi-, 2aril-tio-etil-oxi- vagy 2-(4-nitro-fenil)-etil-oxi-csoportot is jelent és R2 jelentése bázissal vagy nukleofil reagenssel, így ammónium- hidroxiddal, tiofenoláttal vagy arilaldoximáttal lehasítható védőcsoport, így adott esetben halogénatommal, nitro- és/vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport, metilcsoporttal vagy adott esetben nitrocsoporttal szubsztituált benzilcsoport, vagy fémionnal lehasítható védőcsoport, például 8- kinolil- vagy 5-kloro-8-kinolilcsoport - reagáltatjuk adott esetben vízelvonó szerek vagy bázisok jelenlétében.
Ezután az így kapott (VIII) általános képletű vegyületet - a képletben R1, X2 és R2 jelentése a fenti, először adott esetben 2-helyzetben szubsztituált etanollal reagáltatjuk, ez az X2-csoportot OR3-csoporttá alakítja - a képletben R3 jelentése ciano-etil-csoport, 2-trihalogénetil-csoport, 2-aril-szulfonil-etil-csoport, 2-(rövidszénláncú alkil)-tio-etil-csoport, 2-aril-tio-etil-csoport, vagy 2-(4-nitro-fenil)-etil-csoport - majd az R'-védőcsoportot lehasítjuk és az így kapott (IX) általános képletű vegyületet egy másik (VIII) általános képletű vegyülettel, adott esetben vízelvonó szer vagy bázis jelenlétében (X) általános képletű dinukleotiddá reagáltatjuk (2. reakcióvázlat). Adott esetben valamely (VIII) általános képletű vegyületet bázisokkal és vízzel reagáltatva egy másik (VIII) általános képletű vegyületté alakítunk, ahol a képletben X2 jelentése hidroxicsoport vagy abból levezetett só.
A reakciót a fenti inért oldószerek egyikében szobahőmérsékleten vagy kissé emelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például szobahőmérsékleten folytatjuk le.
Az R’-védőcsoportot savval, így ásványi savakkal, például sósavval vagy kénsavval, karbonsavakkal, például ecetsavval, tiiklór-ecetsavval, vagy hangyasavval, szulfonsavakkal, például metán- vagy p-toluolszulfonsavval, vagy különösen Lewis-savakkal, például cinkkloriddal, cink-bromiddal, alumínium-kloriddal, dialkil-alumínium-halogeniddel, például dibutil- vagy dietil-alumínium-kloriddal, vagy bór-trifluoriddal hasítjuk le 10-50 'C- on, különösen szobahőmérsékleten. A dialkil-alumínium-halogeniddel való hasítást lipofil oldószerben, különösen toluolban, a fenti Lewis-savak közül egy további alkalmazásával, halogén-szénhidrogénből, például metilén-kloridból és rövidszénláncú alkanolból, például etanolból vagy izopropanolból álló oldószerelegyben végezzük.
A (X) általános képletű dinukleotidok találmány szerinti előállítása magában foglalja az (V) általános képletű nukleozidok - a képletben R1 és B jelentése a fenti - (VIIA) általános képletű foszfitokkal - a képletben X1 jelentése halogénatom, különösen klóratom, X2 jelentése halogénatom, különösen klóratom, vagy di(rövidszénláncú alkil)-amino-csoport, különösen dimetil-amino- vagy diizopropil-amino-csoport, vagy morfolino-, piperidino- vagy pirrolidino-csoport és R2 jelentése a (VII) általános képletnél megadott, különösen metilcsoport - való reagáltatását adott esetben alkalmas bázis jelenlétében. A találmány szerint előállítható (VniA) általános képletű vegyületeket egyrészt 2-helyzetben szubsztituált etanollal reagáltatjuk, ami az X2-csoportot OR3- csoporttá alakítja - a képletben R3 jelentése a fenti - majd oxidálószerrel, például jóddal valamilyen bázis jelenlétében, foszfáttá oxidáljuk és az R1-védőcsoportot lehasítjuk, mimellett (IX) általános képletű vegyület képződik, másrészt valamely (IX) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, majd oxidálószerrel, például jóddal valamilyen bázis jelenlé-81
HU 203 784 Β tében (X) általános képletű vegyületté oxidáljuk (3. reakcióvázlat).
A trinukleotidok találmány szerinti előállításához a (X) általános képletű dinukleotidokról - a képletben R*. R2 és R3 jelentése a fenti és B* és B2 jelentése egymástól függetlenül timil-, citozil-, adenil- vagy guanilcsoport - az R'-védőcsoportot lehasítjuk és a kapott vegyületet (VHI) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, adott esetben vízelvonó szer és bázis jelenlétében, vagy egy (VIHA) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk és ezt követően oxidáljuk, mimellett (XI) általános képletű vegyület képződik (4. reakcióvázlat). Az R'-védőcsoport lehasítását és a (XI) általános képletű trinukleotidokká kondenzáltatást a (X) általános képletű dinukleotidok előállításánál leírt módon végezzük
A tetranukleotidok találmány szerinti előállításához a (XI) általános képletű trinukleotidokat a (X) általános képletű dinukleotidokra fent leírt módon reagáltatjuk.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában R1védőcsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot, R2-védőcsoportként klórral szubsztituált fenilcsoportot, különösen 2-klór-fenil-csoportot, és R’-védőcsoportként 2-cianoetil-csoportot alkalmazunk. A (VH) általános képletű vegyületben az X1- és X2-csoport előnyös jelentése 1-benztriazolil- oxi-csoporL
A (XI) általános képletű trinukleotidokat előnyösen oly módon állítjuk elő, hogy a (X) általános képletű dinukleotidokban az R'-védőcsoportot lehasítjuk és a kapott vegyületet (VÜI) általános képletű vegyülettel a képletben X2 jelentése hidroxicsoport vagy abból levezetett csoport - reagáltatjuk vízelvonó szer jelenlétében (4. reakcióvázlat).
A találmány szerinti vízelvonó szer például a 2,4,6trimetil- vagy triizopropil-benzoszulfonil-klorid, -imidazolid, -tetrazolid vagy -1,2,4-triazolid, amely adott esetben nitrocsoporttal szubsztituált lehet Előnyös vízelvonó szer a (ΧΠ) képletű 2,4,6-trimetil-benzolszulfonil-3-nitro-1,2,4-triazolid.
Előnyösen olyan nukleozidokat alkalmazunk, amelyekben a bázisrészen található szabad aminocsoport védett. Előnyös védőcsoport adeninre a benzoilcsoport, citozinra a benzoil- vagy 4-metoxi-benzoil-csoport, guaninra az izobutiril- vagy difenil- acetil-csoport. A timint előnyösen védőcsoport nélkül alkalmazzuk.
Az oligonukleotidok c) reakciólépésnek megfelelő találmány szerinti előállításában önmagában ismert félautomatikus vagy teljesen automatikus mikroproceszszoros oldószer- és reagensadagoló rendszerrel ellátott készüléket alkalmazunk. Az a) reakciólépés szerint előállított (VI) általános képletű vegyületben az R’-védőcsoportot a fent leírt módon lehasítjuk, majd vagy (VIII) általános képletű vegyülettel, vagy (VULA) általános képletű vegyülettel, vagy (X) vagy (XI) általános képletű vegyülettel, amelyben előzőleg az R3- védőcsoportot bázissal lehasítottuk (a 2-ciano-etil-csoport jelentésű R3-at például tri(rövidszénláncú alkil)-aminnal, pl. trietil-aminnal, a fenti inért oldószerek vagy oldószerelegyek egyikében 10-40 *C-on, különösen szobahőmérsékleten, adott esetben vízelvonó szer vagy bázis jelenlétében reagáltatjuk. A találmány azokra a reakciókra is vonatkozik, amelyekben (X) általános képletű dinukleotid vagy (XI) általános képletű trinukleotid helyett a b) reakciólépésben előállított tetranukleotidot alkalmazunk. Ha (VIHA) általános képletű foszfitot alkalmazunk, akkor utána oxidálószerrel, például bázis jelenlétében jóddal való kezelés következik. Az ily módon előállított (ΧΙΠ) általános képletű vegyülettel - a képletben R1 és R2 és B jelentése a fenti és n jelentése az 1-4 egész szám - annyiszor ismételjük meg a (VI) általános képletű vegyületre leírt reakciólépéseket (R‘ lehasítása, a (VÜI), (VHIA), (X), (XI) általános képletű vegyületekkel vagy megfelelő tetranukleotiddal való reagáltatás, adott esetben ezt követő oxidatív kezeléssel), amíg (XM) általános képletű vegyület képződik, amelyben n jelentése kb. 19 és 69 közötti tetszés szerint választott szám.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában R'védőcsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk és a cink-bromidos hasítást CH- vagy NH-sav jellegű vegyület, különösen 1,2,4-triazol vagy tetrazol jelenlétében végezzük. Például az 1,2,4-triazol alkalmazása a 4-metoxi-tritil-védőcsoport lehasítására új, és meglepő módon gyors, nagy hozam és mellékreakciók nélküli hasítást eredményez. Különösen előnyös a cink-bromid és az 1,2,4-triazol 20:1 és 100:1 közötti mólarányban való alkalmazása aprotonos oldószerből és alkoholból, például metilén-kloridból és 2-propanolból álló oldószerelegyben.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában valamely (VI) vagy (ΧΙΠ) általános képletű vegyületet, amelyben az R'-védőcsoportot lehasítottuk, (XI) általános képletű trinukleotiddal - amelyben az R3-védőcsoportot lehasítottuk - reagáltatunk vízelvonó szer, például 2,4,6-trimetil- vagy triizopropil-benzolszulfonilklorid, -imidazolid, -tetrazolid vagy -1,2,4-triazolid, amelyek adott esetben nitrocsoporttal szubsztituáltak, jelenlétében. Különösen előnyös a (ΧΠ) képletű 2,4,6trimetil-benzolszulfonil-3-nitro-13,4-triazolid.
Az a különösen előnyös kombináció, amely szerint R1- védőcsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk, R‘-et 12,4-triazol jelenlétében cink-bromiddal hasítjuk le és a (XM) általános képletű nem védett oligonukleotid-polisztirolgyanta (XI) általános képletű nem védett trinukleotiddal való reakciójához (ΧΠ) képletű triazolidot alkalmazunk vízelvonó szerként, lehetővé teszi, hogy meglepő módon kb. 40-70 bázishosszúságú nukleotidláncokat is rövid idő alatt, nagy kitermeléssel és nagy tisztaságban állítunk elő.
Az oligodezoxinukleotidoknak a hordozóról való találmány szerinti lehasításához és a védőcsoportok d) reakciólépés szerinti eltávolításához önmagában ismert eljárásokat alkalmazunk. A hordozóról történő lehasításhoz és az előnyös 2-klór-fenil-védőcsoport eltávolításához különösen előnyösen alkalmazható reagens valamilyen arilaldoximát, például az 1,1,3,3-tetrametilguanidinum-2-nitro-benzaldoximát. A reakciót a fenti inért oldószerek egyikében, amelyhez előzőleg kevés vizet adunk, például 95%-os piridinben, szobahőmérsékleten végezzük. Utána ammónium-hidroxiddal rea9
HU 203 784 Β gáltatjuk szobahőmérsékleten, például 20-70 ”C-on, különösen 50 'C-on.
A találmány szerinti oligodezoxinukleotidok összekapcsolásához 5’-végen lévő hidroxicsoportra foszfátcsoportot viszünk. A foszfátcsoport bevitele (foszforilálás) önmagában ismert módon T4 polinukleotid-kináz segítségével ATP jelenlétében történik.
A kódoló és a komplementer szálból a találmány szerint előállított oligodezoxinukleotidok átfedő szekvenciákat tartalmaznak, amelyek legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmaznak. Ha ilyen oligodezoxinukleotidokat összekeverünk, a köztük kialakuló hidrogénkötések összetartják őket Az elálló, ragadós végek az el) és e2) reakciólépésnek megfelelően mátrixként (templátként) szolgálnak a második (komplementer) szál felépítéséhez, amit DNS-polimeráz, például DNS-polimeráz I, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentje vagy T4 DNS-polimeráz,vagy AMV reverz transzkriptáz végez a négy dezoxinukleozid-trifoszfát (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) jelenlétében. A kiegészítésnél képződő DNS-duplexek, amelyek alatt különösen a (módosított) eglingén (el eljárás változat) vagy a teljes (módosított) eglingén (e2 eljárásváltozat) értendő, tompa végűek.
A (módosított) eglingén el. eljárásváltozattal kapott fragmentjei a végeken olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaznak, amelyeket a restrikciós endonukleázok képesek felismerni és elhasítani. A nukleotidszekvenciák és ennek megfelelően a restrikciós endonukleázok megválasztásától függően a a hasításnál teljesen bázispárosodott (tompa) végek („Blunt ends”) vagy ragadós DNSszálat tartalmazó végek („staggered ends) képződnek. A restrikciós felismerési szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy a tompa végeket képző restrikciós endonukleázokkal kezelt DNS- fragmentek összekapcsolása, illetve a kohézív végek végek bázispárosodása és a ragadós DNSszálakat tartalmazó DNS- fragmentek ezt kővető összekapcsolása teljes (módosított) eglin- struktúigént eredményezzen. Két kettős szálú DNS-fragment összekapcsolása a donor-ffagment 5’-végén foszfátcsoportot, az akceptor-fragment 3’-végén szabad hidroxicsoportot igényel. A keletkező DNS-fragmentek már az 5’-végen foszforiláltak és ezeket önmagában ismert módon ligázzal, különösen T4 DNS-ligázzal kapcsoljuk össze.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában a leírt módon állítjuk elő az eglin-C- vagy B-gén két ffagmentjét, az eglin-C-gén esetében különösen a (Illa), ill. (IV) általános képletű Fj(C) és F2 ffagmenteket és az eglin-B-gén esetében különösen a (Illb), ill. (IV) általános képletű Fi(B) és F2 fragmenteket. A szükség esetén alkalmas vektorok szubklónozható fragmentek a kapcsolódó végeken előnyösen mindig egy restrikciós endonukleáz, különösen Hpall, felismerési szekvenciáját tartalmazzák, ami miatt az említett restrikciós enzimmel való hasítás és a két ffagment összekapcsolása után a korrekt eglint kódoló DNS-szekvencia képződik. Az 1. ffagment a transzláció startjele (ATG) előtt és a 2. ffagment a transzláció stopjele (pl. TAG) után kiegészítőleg „terminális” restrikciós helyeket tartalmaz, amelyek a (módosított) eglingén, ill. a (módosí10 tott) eglingén ffagmentjeinek alkalmas vektorba történő beépítését megengedik.
A találmány különösen az eglin-C-gén (Illa), ill. (IV) általános képletű Fi(C) és F2 fragmentekből való előállítására vonatkozik, amely a Hpall restrikciós enzimmel való hasítás és összekapcsolás után korrekt eglin-C DNS-szekvenciát eredményez és amelyben Fi(C)-n a transzláció startjele előtt egy EcoRI restrikciós hely és F2-n a transzláció stopjele után egy BamHI restrikciós hely található.
Egy másik kiviteli formában (e2 reakciólépés) kétkét oligodezoxinukleotidot, amelyek alternatív módon a kódoló és a komplementerszálból származnak, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 komplementerbázissal anelláljuk, DNS-polimerázzal, például a fentiek egyikével feltöltjük és T4 DNS-ligázzal (módosított) eglin-struktúigénné kapcsoljuk össze.
Eglingént tartalmazó expressziós vektorok előállítása
A találmány továbbá olyan expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek az eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazzák, amelyeket egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy ezzel az expressziós vektorral transzformált gazdában eglinaktivitású polipeptid termelődik.
A találmány szerinti expressziós vektorok eglin-B-t, módosított eglin-B-t, módosított eglin-C-t vagy különösen eglin-C-t kódoló szekvenciát tartalmaznak.
A találmány szerinti expressziós vektorokat például oly módon állítjuk elő, hogy az expressziós kontroliszekvenciát tartalmazó vektor-DNS-be oly módon illesztjük az eglint vagy módosított eglint kódoló DNSszekvenciát, hogy ezt az expressziós kontrollszekvencia szabályozza.
Az alkalmas vektor megválasztása a transzformációhoz tervbe vett gazdasejtekből következik. Alkalmas gazdák például a mikroorganizmusok, így az élesztők, például Sacharomyces cerevisiae, és különösen azok a baktériumtörzsek, amelyek nem tartalmaznak restrikciós vagy modifikációs enzimet, mindenekelőtt az Escherichia coli törzsek, például az E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli W3110, E.coli HB1O1/LM1O35, E.coli JA221 (37) vagy E.coli K12 törzs 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus és mások, továbbá magasabb organizmusok sejtjei, különösen az elfogadott humán vagy állati sejtvonalak. Előnyös gazdamikroorganizmusok az E.coli említett törzsei, például az E.coli HB101 és E.coli JA221, továbbá a Saccharomyces cerevisiae.
Alapvetően minden olyan vektor alkalmas, amely a találmány szerint DNS-szekvenciát a választott gazdában implikálja és kifejezi.
Például az eglin- vagy módosított eglingént E.coli törzsben kifejező vektorként alkalmasak a bakteriofágok, például a λ-bakteriofág származékai, vagy plazmidok, így különösen a ColEl plazmid és származékai, például a pMB9, pSF2l24, pBR317 vagy pBR322. A találmány szerinti előnyös vektorokat a pBR322 plazmidból vezetjük le. Az alkalmas plazmidok teljes repli-101
HU 203 784 Β kációs kontrollszekvenciát tartalmaznak és egy markergént, ami az expressziós plazmiddal transzformált gazda szelekcióját és azonosítását egy fenotipusos bélyeg alapján lehetővé teszi. Az alkalmas maikergének a gazdának például rezisztenciát kölcsönöznek nehézfémekkel, antibiotikumokkal és hasonlókkal szemben. Továbbá a találmány szerinti előnyös vektorok a replikációs kontrollszekvencián és markergén- területeken kívül tartalmazzák a restrikciós endonukleázok felismerési szekvenciáit, úgyhogy ezekre a helyekre az eglingén és adott esetben az expressziós kontrollszekvencia beilleszthető. Az előnyös vektor, a pBR322 plazmid, intakt replikációs kontrollszekvenciát, tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztenciát kölcsönző maikeigéneket (tét· és amp·) és egy sor csak egyszer előforduló felismerési szekvenciát tartalmaz restrikciós endonukleázok például PstI (az amp*-génben hasít, a tet*-gén érintetlen marad), BamHI, HindlII, Sáli (mind a tet®-génben hasítanak, az amp*-gén érintetlen marad), Nrul és EcoRI számára.
A génexpresszió szabályozásához több expressziós kontrollszekvencia alkalmazható. Különösen a transzformálandó gazda erősen kifejeződő génjeinek expressziős kontrollszekvenciáit alkalmazzuk. A pBR322, mint hibridvektor és az E.coli, mint gazdamikroorganizmus esetében például a laktóz operon, triptofán operon, arabinóz operon és hasonlók a β-laktamázgén expressziós kontrollszekvenciái (amelyek többek között a promotert és a ribószomális kötőhelyet is tartalmazzák), a λ-fág N génjének vagy az fd-fág burokfehérjegénjének megfelelő szekvenciái és mások alkalmasak. Míg a pBR322 plazmid már tartalmazza a β-laktamazgén β-lac-gén) promoterét, a többi expressziós kontrollszekvenciát be kell vinni a plazmidba. A találmány szerint előnyös a triptofán operon (trp po) expressziós kontrollszekvenciája.
A replikációra és expresszióra élesztőben alkalmas vektorok élesztő-replikációs origót és az élesztő számára szelektív genetikai markert tartalmaznak. Az élesztő reprikációs origóját, például a kromoszómális autonóm replikálódó szegmentjét (ars) tartalmazó hibridvektorok, a transzformáció után az élesztősejten belül extrakromoszómálisak maradnak és a mitóziskor önállóan replikálódnak. Továbbá alkalmazhatunk az élesztő 2 μ-plazmid-DNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó hibridvektorokat Ezek a hibridvektorok rekombinációval a sejten belül már meglévő 2 μ-plazmidokba épülnek be vagy önállóan replikálódnak. A 2 μ-szekvenciák, különösen a nagy transzformáció-gyakoriságú plazmidokhoz alkalmasak és nagyszámú másolat képzését biztosítják. Az élesztőhöz alkalmas jelzőgének mindenekelőtt azok, amelyek antibiotikus rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében, a gazda defektusát komplementáló gének. Megfelelő gének például cikloheximid antibiotikum elleni rezisztenciát kölcsönöznek vagy gondoskodnak a prototrofiáról auxotróf élesztőmutánsokban, ilyen például az URA3-, LEU2-, HIS3- vagy mindenekelőtt a TRP 1-gén. Továbbá az élesztő-hibridvektorok előnyösen a baktériumgazda, különösen E.coli számára replikációs origót és egy markergént tartalmaznak, így a hibridvektorok és prekurzoraik konstruálása és klónozása egy baktériumgazdában történhet. Az élesztőben expresszióra alkalmas expressziós kontrollszekvenciák például a TRP1-, ADH1-, ADHII-, PHO3-, vagy PHOS-gétt kontrollszekvenciái, továbbá a glükolizisben részt vevő promoterek, például a PGKés a GADP/f-promoter.
A találmány különösen olyan replikációra és fenotípusos szelekcióra alkalmas expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek expressziós kontrollszekvenciát és eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mimellett az említett DNS-szekvencia a transzkripció start- és stopjelével, valamint a transzláció start- és stopjelével együtt az említett expressziós kontrollszekvencia szabályozása alatt az említett expressziós plazmidban olyan elrendezésű, hogy az említett plazmiddal transzformált gazdában eglinaktivitású polipeptid fejeződik ki.
Hatékony expressziót akkor érünk el, ha a struktúrgén az expressziós kontrollszekvenciához képest megfelelő leolvasási fázisban helyezkedik el. Az expressziős kontrollszekvenciát előnyös a fő-mRNS-start és a gént kódoló szekvencia ATG-je közötti tartományban, amely természetesen az expressziós kontrollszekvenciával össze van kötve (pl. a β-lac-kódszekvencia, ha β-lac-promotert alkalmazunk), előnyösen a saját transzlációs startjelét (ATG) és transzlációs stopjelét (pl. TAG) tartalmazó eglin- (ill. módosított eglin-) génnel összekapcsolni. Ez biztosítja a hatékony transzkripciót és transzlációt
Például egy vektort, különösen a pBR322-t, restrikciós endonukleázzal hasítunk és adott esetben az így kapott linearizált vektor modifikálása után abba megfelelő restrikciós végekkel ellátott expressziós kontrollszekvenciát juttatunk. Az expressziós kontrollszekvencia a 3’-végen (a transzláció irányába) egy restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáját tartalmazza, úgy, hogy az expressziós kontrollszekvenciát tartalmazó vektor az említett restrikciós enzimmel emészthető és az illeszkedő végekkel rendelkező eglin- (vagy módosított eglin-) struktúigén beilleszthető. Ekkor két hibridplazmid keveréke képződik, amelyek a gént megfelelő, ill. nem megfelelő orientációban tartalmazzák. Előnyös az expressziós kontrollszekvenciát már tartalmazó vektort még egy második restrikciós endonukleázzal a vektor-DNS-en belül elhasítani és a képződött vektorfragmentbe a megfelelő végekkel ellátott struktúrgént beilleszteni. A vektoron előnyösen minden műveletet olyan módon végzünk, hogy a replikon és legalább egy maikergén működőképes, érintetlen maradjon.
A találmány egyik előnyős kiviteli formájában egy pBR322-ből származó vektort, amely expressziós kontrollszekvenciával, különösen a triptofán operonéval (trp po) - amely a 3’-végen (a fő-mRNS-start és az első ATG között) egy előnyös kohéziv végeket képző restrikciós endonukleáz, pl. EcoRI felismerési szekvenciáját hordozza - rendelkezik, az említett restrikciós endonukleázzal és a vektor-DNS részben egy tompa
-111
HU 203 784 Β vagy előnyösen kohézív végeket képző második restrikciós endonukleázzal, például BamHI-gyel emésztünk, majd az így linearizált vektort a megfelelő végekkel rendelkező eglin- (vagy módosított eglin-) génnel (például EcoRI-véggel az ATG-startkodon előtt és BamHI-véggel a transzláció stopkodonja után) összekapcsoljuk. Az összekapcsolás ismert módon a komplementer (kohézív) végek párképzésével és például T« DNS-ligázzal való kezeléssel történik.
A mRNS-úton át, a genomból származó DNS-ből vagy szintetikusan előállított, megfelelő kohézív (különösen EcoRI- és BamHl) végekkel ellátott eglin- (vagy módosított eglin-) gén az expressziós plazmidba való bevitel előtt egy vektorban, például pBR322-ben szintén klónozható, hogy nagyobb mennyiségű struktórgént kapjunk, például szekvenciaanalízis céljára.
A hibridplazmidot tartalmazó kiónokat például eglinspecifikus, radioaktív jelzett oligodezoxinukleotidpróbával (lásd fent) izoláljuk. Az eglin- (ill. módosított eglin-) gén jellemzése például Maxam és Gilbert (3) eljárásával történik.
A találmány egyik előnyös kiviteli formájában az eglin- vagy módosított eglingén két fragmentjét, például az eglin-C-gén két fragmentjét szintetizáljuk. A gén 1. részét tartalmazó 1. fragment az ATG előtt és a végen mindig kohézív végeket képező restrikciós endonukleázok, például az ATG előtt EcoRI és a végen Hpall felismerési szekvenciáját tartalmazza. A gén következő részét tartalmazó 2. fragment megfelelő felismerési szekvenciákat tartalmaz, a fragment elején pél- 30 dául Hpall és transzláció stopjele (pl. TAG) után BamHI felismerési szekvenciát A fragmenteket a külső felismerési szekvenciánál (az 1. fragmentet például EcoRI-gyel és a második fragmentet megfelelően BamHI-gyel) hasítjuk és egy megfelelően hozzájuk 35 hasított vektorban (pl. pBR322) szubklónozzuk. A fragmenteket tartalmazó kiónok azonosítása és a fragmentek jellemzése a fenti módon történik. A fragmenteket ezután a megfelelő restrikciós endonukleázokkal kihasítjuk a hibridvektorokból (az 1. fragmentet példá- 40 ul EcoRI-gyel és Hpall-vel és a 2. fragmentet például Hpaü-vel és BamHI-gyel) a kohézív végeiken, különösen Hpaü-végeiken keresztül összekapcsoljuk ezeket, mimellett a teljes eglin- (ill. módosított eglin-) gént kapjuk, amit a megadott módon vektor-DNS- be illesz- 45 tünk.
A gazdasejt transzformációja
A találmány eljárás transzformált gazda előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdát, exp- 50 ressziós kontrollszekvenciával szabályozott, eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmiddal transzformálunk.
Az alkalmas gazdák baktériumok vagy élesztők, például a fenti mikroorganizmusok, így a Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis és különösen az Escherichia coli törzsei. A transzformációt a találmány szerinti expressziós plazmiddal, például az irodalomban leírt 5 módon végezzük, például S.cerevisiae-n (4), B.subtilis-K (5) és E.coli-rz (6). A transzformált gazdát előnyösen szelektív táptalajból izoláljuk, amelyhez olyan biocid anyagot adunk, amivel szemben az expressziós plazmidban található jelzőgén rezisztenciát kölcsönöz. 10 Ha előnyösen az expressziós plazmid amp*-gént tartalmaz, akkor ennek megfelelőén a tápleveshez ampicillint adunk. Az expressziós plazmidot nem tartalmazó sejtek ilyen táplevesben elpusztulnak.
A találmány az említett úton előállított gazdára is 15 vonatkozik.
A transzformált gazda tenyésztése és eglin előállítása
A transzfromált gazda eglin és módosított eglin elő20 állítására alkalmazható. A találmány tárgya eljárás egűnek és módosított eglinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzformált gaidát tenyésztjük és a terméket a gazdasejtből szabaddá tesszük és izoláljuk.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány sze25 rinti transzformált gazdák eglinaktivitású polipeptidek keverékét termelik. A keverékből természetes eglineket metionil-eglineket és az N-terminálison acetilezett eglineket lehet izolálni. Az E.coli transzformált törzsei különösen olyan eglinaktivitású polipeptideket termelnek, amelyek a természetes eglin-B-től és -C-től az N-terminális treoninon található N-acetilcsoporttal különböznek, más transzformált gazdák túlnyomórészt természetes eglineket és a harmadik típusú gazdák mindenekelőtt olyan polipeptideket fejeznek ki, amelyek pontosan a gazdába bevitt eglin-DNS-eknek felelnek meg, azaz N-terminális aminosavak metionin. Különösen az Na-acetilezett termékek képződése meglepő. Géntechnológiai módszerekkel ilyen polipeptidek képződését ugyanis eddig még nem figyelték meg. Még maga az α-timozin, amely természetes álapotban N-terminálison acetilezett megfelelő genetikailag módosított gazdából nem acetilezett formában fejeződik ki (35).
Az N-terminálison acetilezett eglinek termelése nagy előnnyel jár, mert ezeknek a vegyűleteknek nagyobb a stabilitása a gazdasejtekben található aminpeptidázokkal szemben, ami az N-terminálisról kiinduló (részleges) proteolízist gátolja és ennek következtében a kitermelést növeli. Továbbá a tisztítási eljárás ezzel lényegesen egyszerűsödik, mert a kívánt tennék proteolízissel képződött fragmentekkel nem szennyezett
A találmány, ennélfogva eljárás (XIV) általános képletű eglinszármazékok 12 (Met),-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaAigGlu
TyrPheThrLeuHis'iyrProGlniyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp
LeuArgTyrAsnArgValArgValPheiyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B’ (XIV)
-121
HU 203 784 Β a képletben B jelentése kovalens kötés vagy a természetes eglinek N-terminálisától számított 1-10 aminosavat tartalmazó peptidcsoport, például a SerPhe-, LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe-, PheGlySerGluLeuLysSerPhe- vagy ThiiGluPheGlySeiGluLeuLysSerPhe-csoportok közül választott, és B’jelentése semmi vagy a természetes eglinek C-tenninálisától számított 1-6 aminosavat tartalmazó peptidcsoport, például a
- HisVal-, -HisValProHis- vagy -HisValProHisValGlycsoportból választott, W jelentése Tyr vagy His, és r 10 jelentése 0 vagy 1, mimellett azokban a (XIV) általános képletű vegyületekben, ahol a képletben r jelentése
0, az N-terminális aminosav adott esetben N-acetilezett
- és ezek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely expressziós plazmiddal - ami valamely exp- 15 ressziós kontrollszekvencia által szabályozott eglint kódoló DNS- szekvenciát tartalmaz - transzformált gazdát valamilyen asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztünk és a terméket a gazdasejtekből szabaddá tesszük és izoláljuk, vagy a (XIV) általános képletű származékok - a képletben r jelentése 0 és az N-terminális aminosav N-acetilezett - előállítására oly módon, hogy a (XIV) általános képletű, az N-teiminálison szabad aminocsoportot tartalmázó vegyületet acilezzük, és kívánt esetben a kapott (XTV) általános képletű eglinszármazékokat másik (XTV) általános képletű eglinszármazékká alakítjuk, és ha szükséges az eljárás szerint kapott (XTV) általános képletű vegyületek keverékét szétválasztjuk az egyes komponensekre, és/vagy kívánt esetben a kapott sót szabad polipeptiddé és a kapott polipeptidet annak sójává alakítjuk.
A találmány előnyös eljárás a (XTV’) általános képletű eglinszármazékok VGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValSapGlnAlaArgGlu
TyrPheThrLeuHisTyrProGlniyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp
LeuArgiyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHis
ValGIy (XIV’) a képletben V jelentése Thr, N-acetil-Thr vagy MetThr és W jelentése Tyr vagy His - és sóik előállítására azzal jellemezve, hogy valamely expressziós plazmiddal - amely valamely expressziós kontrollszekvencia által szabályozott eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz - transzformált gazdát valamilyen asszimilálha- 30 tó szén- és nitrogénforrást tartalmazó, folyékony tápközegben tenyésztünk és a mikrooiganizmussejtekből az eglint szabaddá tesszük és izoláljuk, és kívánt esetben a kapott eglint - ahol a képletben V jelentése N-acetil-Thr vagy Met-Thr és W jelentése a fenti - 35 eglinné - a képletben V jelentése Thr - alakítjuk, és ha szükséges, az eljárás szerint kapott (XIV’) általános képletű vegyületek keverékét az egyes komponensekre szétválasztjuk, és/vagy kívánt esetben a kapott sót szabad polipeptiddé és a kapott polipeptidet annak sójává 40 alakítjuk.
A találmány eljárás különösen (XIV) általános képletű eglin-C-származékok - a képletben B jelentése a LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe- vagy ThrGluPheGlySeiGluLeuLysSerPhe-csoportból az egyik pép- 45 tidcsoport és B’ jelentése a -HisValProHisValGly-csoport, W jelentése a -HisValProHisValGly-csoport, W jelentése Tyr és r jelentése 0 vagy 1 egész szám továbbá eljárás a (JQV) általános képletű eglin-B-származékok - a képletben B jelentése a ThrGluPheGly- 50 SerGluLeuLysSerPhe-peptidcsoport és B* jelentése a -HisValProHisValGly-peptidcsoport, W jelentése His és r jelentése a 0 vagy 1 egész szám, mimellett azokban a (XIV) általános képletű vegyületekben, ahol a képletben r jelentése 0, az N-terminális aminosav adott eset- 55 ben N-acilezett - és sóik előállítására.
A (XTV) általános képletű vegyületekben W előnyös jelentése Tyr (eglin-C-vegyületek).
A találmány elsősorban eljárás (XIV) általános képletű eglin-C-vegyületek - a képletben B jelentése N- 60 acetil-SerGluLeuLysSerPhe-, ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe - vagy N-acetil-ThiGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-csoport, és B’ jelentése a -HisValProHisValGly-csoport, W jelentése Tyr és r jelentése 0 - és sóik előállítására.
A találmány különösen az eglin-C, eglin-B, N“-acetil-eglin-C és az eglin-C’ és eglin-C’ módosított eglinC-vegyületek előállítására vonatkozik.
A találmány szerinti transzformált gazdák tenyésztéséhez különböző szénforrásokat alkalmazhatunk. Például előnyös szénforrások az asszimilálható szénhidrátok, így a glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen acetát, amely vagy önmagában vagy alkalmas keverékben alkalmazható. Alkalmas nitrogénforrások, például az aminosavak, így a kazein- hidrolizátumok, peptidek és fehérjék és lebomlási termékeik, például a tripton, pepton vagy húskivonatok; továbbá az élesztőkivonatok, malátakivonatok, és ammóniumsók is, például ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket önmagukban vagy alkalmas keverékekben alkalmazhatunk. Hasonlóképpen szervetlen sókat is alkalmazhatunk, például a nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-szulfátot, -kloridot, -foszfátot és -karbonátot.
Továbbá a közeg tartalmaz növekedést elősegítő anyagokat, így nyomelemeket, például vasat, cinket, mangánt és hasonlókat, és előnyösen olyan anyagokat, amelyek szelekciós nyomást fejtenek ki és gátolják azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek az expressziós plazmidot elvesztették. így a közeghez például ampicillint adagolnak, ha az expressziós plazmid amp®-gént tartalmaz. Ha ilyen antibiotikus hatású anyagokat adunk a közeghez, akkor a szennyező, antibiotikum-érzékeny mikroorganizmusok elpusztulnak.
A tenyésztés önmagában ismert eljárásokkal történik. A tenyésztés feltételeit, például a hőmérsékletet, a
-131
HU 203 784 Β közeg pH-értékét és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy maximális eglin-titert kapjunk így előnyös valamely E.coli törzset aerob körülmények között süllyesztett kultúrában rázás vagy keverés közben 2040 'C hőmérsékleten, előnyösen 30 ’C-on, és pH 4-9en, előnyösen pH 7- en, 4-20 órán át, előnyösen 8-12 órán át tenyészteni. Az expressziós termék (Eglin) intracellulárisan gyűlik össze.
Ha a sejtsűrűség megfelelő értéket ért el, a tenyésztést megszakítjuk és a gazdasejtekből az eglint szabaddá tesszük. Ebből a célból a sejteket elroncsoljuk, például detergenses, így SDS-es vagy Triton-os kezeléssel, vagy a sejtfalat lizozimmal vagy hasonló hatású enzimmel oldjuk. Alternatív vagy kiegészítő módon mechanikus erőt, például nyíróerőt (például X-Press, French-press, Dyno-malom), vagy üveggyönggyel vagy alumínium-oxiddal való rázást, vagy váltakozó lefagyasztást, például folyékony nitrogénben és felengedést, például 30-40 ‘C-ra, valamint ultrahangot alkalmazhatunk a sejtek feltárásához.
A kapott elegyet, amely fehérjéket, nukleinsavakat és egyéb sejtalkotókat tartalmaz, centrifugálás után önmagában ismert módon fehérjére nézve, beleértve az eglint, töményítjük. így például a nemfehérje-alkotók legnagyobb részét polietilénimines kezeléssel leválasztjuk és a fehérjéket, beleértve az eglint, például az oldat ammónium-szulfátos vagy más sóval történő telítésével kicsapjuk. A bakteriális fehérjék ecetsavas savanyítással (pl. 0,1%, pH 4-5) is kicsaphatok. Az eglin további töményítése az ecetsavas maradék n-butanolos extrakciójával érhető el. További tisztítási lépések például a gélelektroforézis, a kromatográfiás eljárások, például az ioncserélő kromatográfia, a gélkromatográfia, nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia RPHPLC és hasonlók, az elegy komponenseinek molekulanagyság szerinti elválasztása alkalmas Sephadexoszlopon, dialízis, affinitáskromatográfia, például antitest-, különösen monoklonális antitest-affinitáskromatográfia vagy affinitáskromatográfia anhidrokimotripszin-oszlopon, és további, különösen az irodalomból ismert eljárások.
Például a kifejeződött eglin izolálása a következő lépésekből áU:
A sejtek elválasztása a tápoldatból centrifugálással:
Nyerskivonat előállítása a sejtek elroncsolásával, például oldóenzimmel való kezeléssel és/vagy váltakozó lefagyasztással és újrafelengedéssel:
Az oldhatatlan alkotórészek lecentrifugálása:
A DNS-kicsapás polietiléniminnel:
A fehérjék, beleértve az eglint, kicsapása ammónium-szulfáttal:
Az oldott csapadék affinitáskromatográfiája monoklonális anti-eglin-antitest-oszlopon vagy anhidrokimotripszin-oszlopon:
Az így kapott oldat sómentesítése dialízissel vagy Sephadex G 25 kromatográfiával.
Alternatív módon a DNS leválasztása után a bakteriális fehérjéket 0,1%-os ecetsavval kicsaphatjuk, a savas felülúszőból az eglint extrahálhatjuk vagy a savas felülúszót közvetlenül ioncserés kromatográfiának (például karboxi-metil-cellulózon) vethetjük alá. További tisztítási lépésnek számít a Sephadex G 50 (vagy G 75)-tel végzett gélszűrés és a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia. A sómentesítés ismét Sephadex G 25-ön történik
Az eglinaktivitás kimutatására az anti-eglin-antitestekkel (például házinyúlból kapható, vagy hibridomasejtekből kapható monoklonális antitestek) végzett teszt vagy a humán-leukocita-elasztáz (HLE) vagy katepszin G (Cat G) (1) proteázok eglinnel való gátlása használható.
Valamely (XIV) általános képlet átalakítása - a képletben r jelentése 0 és az N-terminálison szabad aminocsoport található - a megfelelő (XIV) általános képletű vegyűletté különösen enzimatikus úton történik. Például az acetilcsoportot E.coli-böl, házinyúl-retikulocitákból vagy búzacsírákból (8) származó N“-acetil-transzferáz (tiszta formában, alkalmas mikroorganizmus kivonata vagy oldata formájában vagy szervkivonat formájában) segítségével acetil-koenzim-A jelenlétében vihetjük be.
A találmány szerint előállítható (XIV) általános képletű vegyületeket önmagában ismert módon más (XIV) általános képletű vegyületekké alakíthatjuk.
így a kapott (XTV) általános képletű vegyületben, amely N-terminális aminosavként metionint vagy Nterminális acetilezett aminosavat tartalmaz, a metionint vagy az acetilcsoportot lehasíthatjuk. Például a találmány szerint előállítható N-terminális metionilcsoportot tartalmazó eglinszármazékokat ilyen csoportot nem tartalmazó eglinszármazékokká alakíthatjuk oly módon, hogy a terminális metionilcsoportot a szokásos módon bróm-cianiddal lehasítjuk. A bróm-cianidos reagáltatást például vizes-savas közegben, így híg sósavbanl például 0,1-0,3 N sósavban, vagy erős szerves savban, például 50-70%-os hangyasavban, szobahőmérsékleten vagy kissé emelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például 15-25 ’C-on 24 órán át végezzük. Megfelelően az eljárás szerint kapott, N-terminális acetilezett aminocsoportot tartalmazó (XIV) általános képletű vegyületben az acetilcsoport lehasítható. Az acetilcsoportot, például enzimatilöisan hasíthatjuk le, így alkalmas acilázzal, például disznóveséből vagy alkalmas mikroorganizmusokból előállítottal, vagy alkalmas acetiltranszferázzal, koenzim A jelenlétében, mimellett tiszta enzimkészítmények helyett mikroorganizmusok kivonatait vagy lizátumait, ill. szervkivonatokat is alkalmazhatunk, amelyek ilyen enzimeket tartalmaznak (ha N°-acetil-eglin-B-t vagy -C-t termelő törzsként E.coli HBlOl-et alkalmazunk, akkor például E.coli HB101 lizátumot).
A találmány szerint előállított (XTV) általános képletű vegyületek keverékét, például, amely olyan (XIV) általános képletű vegyületekből áll, ahol a képletben V jelentése Thr vagy acetil-Thr, önmagában ismert módon szétválaszthatjuk az egyes komponensekre.
Alkalmas elválasztási eljárások, például a kromatográfiás eljárások, például az adszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, nagynyomású folyadékkro-141
HU 203 784 Β matográfía vagy a fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia, továbbá a többszörös megosztás vagy elektroforetikus módszerek, például cellulóz-acetáton végzett elektroforézis vagy gélelektroforézis, különösen poliakrilamid-gélelektroforézis („PAGE”).
A találmány továbbá vonatkozik a találmány szerint előállítható új eglinaktivitású peptidekre, az ilyen peptidek keverékeire és sóikra.
A találmány továbbá eljárás az új (XIV) általános 5 képlett! vegyületek, (MetX-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaAigGlu
TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWpheLeuProGluLysSerProValThrLeuAsp
LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B’ (XIV) a képletben r jelentése 1, B jelentése kovalens kötés vagy peptidcsoport, amely a természetes eglin 1-10 N-terminális aminosav építőkövét tartalmazza, például a Ser-Phe-, LeuLysSerPhe-, SerGluLeu-LysSerPhe-, 15 PheGlySerGluLeuLysSerPhe- vagy ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe közül valamelyik a B’ jelentése semmi vagy a természetes eglin 1-6 C-terminális aminosav építőkövét tartalmazó peptidcsoport, például a -HisVal, -HisValProHis vagy -HisValProHisValGly kö- 20 zül valamelyik, és W jelentése Tyr vagy His, vagy a képletben r jelentése 0, B jelentése N-terminális acetilezett peptidcsoport, például az Ν-acetil-SerPhe-, Nacetil-LeuLysSerPhe-, N-acetil-SerGluLeuLysSeiPhe-, N-acetil-PheGlySerGluLeuLysSerPhe- vagy N-acetil- 25
ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe - közül valamelyik, és B 'jelentése a fenti, és W jelentése Tyr vagy His - és sóik előállítására.
A találmány különösen a (XIV) általános képlett! vegyületekre - a képletben r jelentése 0, B jelentése az N-acetil-SeiGluLeuLysSerPhe- vagy N-acetil-ThrGluPheGlySeiGluLeuLysSerPhe-peptidcsoport és B’ jelentése a -HisValProHisValGly-peptidcsoport és W jelentése Tyr - és azok sóira vonatkozik.
A találmány előnyösen a (XTV’) általános képlett! eglinszármazékokra - a képletben V jelentése N-acetilThr vagy Met-Thr és W jelentése Tyr vagy His - és azok sóira vonatkozik.
VGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu
TyrPheThrLeuHis'iyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp
LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHis
ValGly (XIV’)
A találmány különösen az N°-acetil-eglm-C-re és annak sóira vonatkozik. A találmány szerint előállítható vegyületek, ill. az új (XIV) általános képletű vegyületek nem csak szabad formában fordulhatnak elő, hanem sóik, különösen farmakológiailag elfogadható sóik formájában is. Mivel több, szabad aminocsoportot, ill. guanidinocsoportot tartalmazó aminosavmaradékkal rendelkeznek, a találmány szerinti vegyületek, például savaddíciós sókat képezhetnek. Savaddíciós sóként különösen a szokásos terápiásán elviselhető savakkal képezett élettanilag elviselhető sók jönnek számításba; anorganikus savként a hidrogén a hidrogén-halogenidek (így a hidrogén-klorid), de a kénsav és foszfor-, ill. pirofoszforsav is említhető; a szerves savak közül elsősorban a szulfonsavak (Így a benzolvagy p-toluolszulfonsav vagy rövidszénláncú alkánszulfonsavak, például metánszulfonsav), valamint karbonsavak, például ecetsav, tejsav, palmitin- és szterainsav, almasav, borkősav, aszkorbinsav és citromsav alkalmasak. Mivel az eglinszármazékok szabad karboxilcsoportokat tartalmazó aminosavmaradékokat is tartalmaznak, amelyek az egész pepiidnek savas jelleget kölcsönöznek, ezek fémsókat is, különösen alkálifémvagy alkáliföldfémsókat, például nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnéziumsót vagy ammóniából vagy fiziológiailag elviselhető, szerves nitrogéntartalmú bázisból levezetett ammóniumsót képezhetnek. Mivel egyidejűleg szabad karboxilcsoportokat és szabad amino(amidino)-csoportokat tartalmaznak, belső sókat is képezhetnek.
Az előállítás módjától függően a találmány szerinti vegyületeket szabad formában, belső sók vagy bázisokkal képezett sók formájában kapjuk. A savaddíciós sókból önmagában ismert módon kaphatjuk meg a szabad vegyületeket. Az utóbbiakból például a fenti sókat képző savakkal vagy bázisokkal való ismételt reagáltatással, bepárlással vagy liofilizálással terápiásán alkalmazható savaddíciós sókat vagy fémsókat kaphatunk. A belső sókat a pH megfelelő semleges pontra való állításával állíthatjuk elő.
Eglin elleni monoklonális antitestek és ilyen antitesteket tartalmazó tesztkitek
Az antitesteknek az a tulajdonsága, hogy specifikus antigéneket kötnek meg, a szervezeten kívül a gyakorlatban az antigének kvantitatív meghatározására (ímmunassay) és tisztítására (immun-affinitáskromatográfia) alkalmazhatók.
Immunizált állatok széruma rendesen nagyszámú különböző antitestet tartalmaz - amelyek ugyanazzal az antigénnel a különböző kötőhelyeken eltérő affinitással reagálnak - ráadásul más antigének elleni antitesteket is, amelyek az egyed korábbi tapasztalatait tükrözik. Az antitestek sikeres alkalmazása az antigének meghatározására és tisztítására azonban nagy specifítást és reprodukálhatóságot igényel. Ezeket a köve15
-151
HU 203 784 Β telményeket teljesítő homogén antitestek a Köhler és Milstein (26) által leírt hibridomatechnikával hozzáférhetők. A technika elve az, hogy immunizált állatok antitestet kiválasztó B-limfocitáit, például a lépből, tumorsejtekkel összeolvasztjuk („fuzionáljuk”). A képződött hibridomasejtek egyesítik az osztódás általi korlátlan szaporodás képességét azzal a képességgel, hogy egységes típusú antitestet képezzenek és válasszanak ki. Szelektív médiumban - amelyben a nem fuzionált tumorsejtek elpusztulnak, a hibridomasejtek azonban szaporodnak - történő tenyésztéssel és alkalmas manipulációkkal kiónokat, azaz egyetlen hibridomasejtből levezetett és genetikailag azonos sejtpopulációkat kaphatunk és tenyészthetünk és a sejtek által termelt monoklonális antitesteket izolálhatjuk.
A találmány eglinszármazékok vagy módosított eglinszármazékok elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridomasejtekre és előállítási eljárásukra vonatkozik. Előnyösek azok a hibridomasejtvonalak és az ezekből kiválasztott monoklonális antitestek, amelyek az eglin-B-vel vagy eglin-C-vei vagy ezek származékaival, például N°-acetil-eglin-Cvel vagy -B-vel, vagy az N°-metionil- eglin-C-vel vagy -B-vel specifikusan reagálnak. A találmány eljárás monoklonális anti-eglin-antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy egereket eglinnel vagy módosított eglinnel immunizálunk, az így immunizált állatok B-limfocitáit myelomasejtekkel fuzionáljuk, a képződött hibridomasejteket klónozzuk, majd in vitro vagy egérbe injektálva tenyésztjük és a kultúrából antitestet izolálunk.
A találmány továbbá immun-affinitáskromatográfiás oszlopokra és ezeket az antitesteket tartalmazó, immunassay kitekre vonatkozik.
A találmány szerinti eljárással egereket, például Balb/c-egereket önmagában ismert, de specifikus módon immunizálunk. Meglepő módon az immunizálás sikerült, bár az eglinek viszonylag kis fehérjemolekulák. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában 50-500 pg, előnyösen 100 pg eglin-B vagy -C oldatát, előnyösen komplett és inkomplett Freund adjuvánsban és pufferrel készített sóoldatban oldva, hetenként vagy több hét, például 5-12 hét alatt nagyobb időközökben szubkután injektáljuk, míg elegendő számú antitesttermelő B-limfocita képződik.
Az immunizált egerek B-limfocitákat tartalmazó szerveit, például a lépsejteket, kivesszük és olyan myelomasejtekkel fuzionáltatjuk, amelyek mutáció miatt szelektív tápközegben nem növekednek. Ilyen myelomasejtek ismeretesek éspedig, például az X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 vagy különösen az SP 2/0 jelzésiek. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában immunizált egerek lépsejtjeit az SP 2/0 sejtvonal myelomasejtjeivel fuzionáltatjuk.
A fúziót önmagában ismert eljárás szerint a B-limfociták és a myelomasejtek sejtfúziót kiváltó szer, például polietilénglikol, Sendai-vírus, kalcium-klorid vagy lizolecitin, hozzáadása közben történő összekeverésével végezzük. A fúzió előnyösen polietilénglikol, pél16 dául 500 molekulasúlyú, jelenlétében történik. A fúzió után a képződött hibrideket önmagában ismert eljárás szerint hipoxantinnal, aminopterinnel és timidinnel (HAT-médium) kiegészített szelektív tápközegben tenyésztjük. A nem fuzionált myelomasejtek ebben a közegben nem képesek növekedni és ugyanúgy elpusztulnak, mint a normál limfociták.
A megmaradt hibridomakultúrák specifikus antitesttartalmát önmagában ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk, például radioimmunassay-vel és agglutinációval. Meglepő módon azt találtuk, hogy a leírt eljárással olyan hibridomasejteket kaphatunk, amelyek eglin -B vagy eglin-C elleni specifikus antitesteket választanak ki. Ezek az antitestek az N“-acetil-eglin-C-vel és -B-vel és az N°-metionil-eglin-C-vel és -B-vel is reagálnak.
A kívánt specifitású antitesteket termelő hibridomasejteket a fuzionálással előállított legkülönbözőbb hibridomasejtek keverékéből klónozással szelektáljuk ki. Ehhez önmagában ismert eljárással, amit határhígításnak („limiting dilution”) neveznek, egyetlen növekvő sejből kiinduló kultúrákat képezünk.
üymódon az a három hibridoma-sejtvonal állítható elő, amit a Pasteur intézetben 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 jelzéssel letétbe helyeztek. Tömegtermelés céljából a kívánt specifitású antitesteket termelő hibridoma-sejtklónokat vagy önmagában ismert közegekben in vitro tenyésztjük, vagy szaporítás céljából egerekbe injektáljuk. A találmány előnyös kiviteli formájában a hibridomasejteket Pristan-nal előkezelt egerekbe injektáljuk, az ascites folyadékot levesszük és abból ammónium-szulfát-oldattal való kicsapással antitestet izolálunk.
A hibridomasejtek segítségével kapott monoklonális antitesteket önmagában ismert módon immun-affinitáskromatográfiás oszlopok előállítására alkalmazhatjuk. A találmány előnyös kiviteli formájában alkalmas hordozóanyagot (pufferoldatban szuszpendálva) antitestoldattal elegyítünk, a nem kötődött részeket ezt követően kimossuk és a hordozóanyag el nem foglalt helyeit blokkoljuk
A hibridomasejtek segítségével kapott monoklonális antitesteket önmagában ismert módon tesztkitek előállítására alkalmazhatjuk. Ezek különböző módszereken alapuló tesztkitek lehetnek, például radio-immundiffúzió, latex-agglutináció, foltpróbák, kompetitív vagy „szendvics”-radioimmunassay, enzim-immunassay, immun- fluoreszcens vagy enzim-immunanalitika, például ELISA (heterogén enzim-immunanalitika, fáziselválasztással) vagy tandem-ELISA. Az ilyen kitek a különböző eredetű szokásos antitestek mellett enzimekkel vagy fluoreszcens reagensekkel kapcsolt antitesteket tartalmazhatnak, ezenkívül eglint vagy módosított eglint, például eglin-B-t, eglin-C-t vagy N-acetileglin-C-t, amely aktív izotóppal, például 123I-tel jelzett vagy enzimmel, például torma-peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal kapcsolt, továbbá szubsztrátot, alkalmas puffért, géleket, latexet, polisztriolt vagy más töltőanyagot és hordozóanyagot.
A szerológiai tesztet, például a kővetkezőképpen végezhetjük: az anti-eglin-C antitestaktivitás megálla-161
HU 203 784 Β pításához kompetitív RIA mellett közvetlen kötéstesztet használhatunk. Ebből a célból az eglin-C-t mikrotitráló lapok vájataiban egy éjszakán át történő inkubálással rögzítjük (200 ng vájat), majd hibridomakultúra folyadékával inkubáljuk és, vagy radioaktív jelzett (I2SI)-(szilárd fázisú RIA)-val, vagy alkalikus foszfatázzal jelzett (szilárd fázisú ELISA)-val a kecske antiegér Ig-antitesteket láthatóvá tesszük.
A kiválasztott három monoklonális antitest nemradioaktív tandem ELISA-hoz alkalmazható, amelynek segítségével az eglinszármazékok a testnedvekben mennyiségileg meghatározhatók.
Az alkalmas antitestpárokat kompetitív RIA segítségével a következőképpen választjuk ki:
a 299S18-20, 299S22-1 és 299S22-10 jelzésű monoklonális antitesteket (200-300 ng vájat, amit ascites folyadék ammőnium-szulfátos kicsapásával kaptunk) és egy poliklonális nyúl anti-eglin-C antitestet (200300 ng vájat, szérumból kaptuk) a mikrotitráló lapok vájataiban rögzítjük. A 123I-tel jelzett eglin-C kötődésének gátlását keresztvizsgáljuk.
A kísérletek azt eredményezték, hogy a 299S18-20 és 299S22-10 jelzésű monoklonális antitestek az eglinC-hez való kötődéskor kölcsönösen gátolják egymást, amiből következik, hogy az eglin-C-molekulán mindkettő ugyanarra az epitopra kapcsolódik.
A 299S18-20 és 299S22-1 jelzésű monoklonális antitestek kölcsönösen nem gátolják egymást. Ez azt jelenti, hogy az eglin-C-molekula különböző epitopjaira kapcsolódnak.
A relatív kötőkapacitás, amit a rögzített antitesthez kötődött radioaktív jelzett eglin-C mennyiségéből határozunk meg, legnagyobb a 299S22-10 jelzésű és legkisebb a 299S18-20 jelzésű antitestre.
A tandem ELISA kísérletek alapján, amelyek során a monoklonális antitesteket páronként teszteljük, miniellett az egyik antitest mindig a mikrotitráló lapokon volt rögzítve és a másik folyadékfázis formájában enzimmel, például alkalikus foszfatázzal volt jelezve, megállapítottuk, hogy a nem keresztreaktív párok - a 299S18-20/299S22-1 és a 299S22-1/299S22-10 - a legalkalmasabbak kvantitatív assay-hez, mimellett az említett monoklonális antitestpár első tagját, amely gyengén kötődik az eglin-C-hez, kell szilárd fázisként alkalmazni.
A találmány szerinti monoklonális antitesteket - szilárd fázisként alkalmazva - folyadékfázisként alkalmazott poliklonális anti-eglin-C-antitesttel, például birkából, is kvantitatíve meghatározhatjuk. A tandem ELISA érzékenysége 1-10 ng eglin-C/ml minta.
Gyógyszerkészítmények
A találmány szerint előállítható ismert (pl. eglin-B és -C) és új (pl. Na-acetil-eglin-B és -C, metionil-eglinC és -eglin-B) eglinszármazékok és módosított eglinszármazékok értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak és mint az orvosi piócából extrahálható eglinszármazékok (vö. 2 808 396 számú NSZK-beli nyilvánosságra hozatali irat) profilaktikus vagy terápiás kezelésre alkalmazhatók.
A találmány szerinti új eglinszármazékok, például az N°-acetil-eglin-B és Na-acetil-eglin-C a humán-leukocita-elasztáz (HLE), a leukocita-katepszin G (H.Kat.G) és a kimotripszin igen erős és specifikus inhibitorai. A következő táblázatban feltüntettük az N’-acetil-eglin-C és két természetben előforduló proteáz-inhibitor, az ai-proteináz-inhibitor (ctiPI, korábbi elnevezése ai-antitripszin) és a2-makroglubin (a2M) HLE-vel és H.Kat.G-vel lejátszódó reakcióira a képződött enziminhibitor komplexek asszociációs-sebességi állandóit (kjua) és egyensúlyi állandóit (Ki):
Táblázat
Kiválasztott proteinázok és NMcetil-eglin-C, ctiPI és a2M inhibitorok kölcsönhatásának kinetikai paraméterei
Fehérje Inhibitor k^fM^sec'1] Ki[M]
HLE αιΡΙ 1,5.10’ irreverzibilis
a2M l,0*107 irreverzibilis
Na-acetil-eglin-C 1,4·107 8.10·11
H.Cat.G a,Pl 1,0-106 irreverzibilis
a2M 3,5-106 irreverzibilis
Na-acetil-eglin-C 2,0.106 5-10-*1
Feltételek: Az asszociációs-sebességi állandókat Bieth et al. (36) szerint határoztuk meg. Az N-acetil-eglin-C HLE-vel és H. Kat.G-vel való kölcsönhatására a Ki-értékeket a „steady State” reakciósebességekből azzal a feltételezéssel számoltuk, hogy a kölcsönhatás reverzibilis. Az összes értéket 37 °C-on és pH 7,4-en határoztuk meg.
Az adatok azt mutatják, hogy az Na-acetil- eglin-C, valamint az ctiPI és a2M természetes inhibitorok HLEvel, ill. H.Kat.G-vel lejátszódó reakciójának asszociációs-sebességi állandói ugyanabban a nagyságrendben vannak. Az N“-acetil-eglin-enzim-komplexek nagy stabilitása (K-értékek), az eglinszármazékok bizonyított, rendkívül kis toxicitása, valamint a specifitásuk (más emlős- proteinázokkal, különösen a véralvadási, fibrinolízis- és komplement-rendszerhez tartozókkal nem figyeltek meg szignifikáns kölcsönhatást), az N-temiinális acetücsoport következtében megnövekedett stabilitásuk az aminopeptidázok proteolitikus lebontásával szemben, és az ctiPI és a2M testi faktorokkal összehasonlítva a könnyű hozzáférhetőség nagy mennyiségben a találmány szerinti eljárással ezeket a vegyületeket alkalmassá teszi olyan kórképek farmakológiai kiértékelésére, amelyeket a HLE által okozott szövetlebomlás jellemez.
A találmány szerinti vegyületek hatását például a kísérleti emfizéma-modellen mutatjuk be. Egy órával azelőtt, hogy hörcsögben 0,3 mg HLE alkalmazásával emfizémát indukálunk, 0,5 mg, ill. 2 mg N’-acetil-eglin-C-t (8-8 állatba) alkalmazunk hasonlóképpen intratracheálisan. A nem védett (Na-acetil-eglin-C-vel nem előkezelt) állatoknál a két hónappal később végzett légzésfunkció-vizsgálat és hisztológiai vizsgálatok
-171
HU 203 784 Β szerint súlyos tüdőobstrukció és emfizéma mutatkozott. Ezzel ellentétben az N-acetil-eglin-C-vel kezelt mindegyik állat normális légzésíunkciót mutatott A tüdő hisztológiai vizsgálata a kisdőzisú csoport (05 mg N°-acetil-eglin-C) 8 állata közül csupán kettőnél mutatott ki kismértékű, lokális emfizémás elváltozásokat; a többi állaton nem mutatkozott elváltozás, ami az intratracheálisan adagolt N“-acetil-eglin-C védőhatását és egyidejűleg annak kis toxicitását bizonyítja.
A találmány szerinti új eglinszármazékokat, különösen az Na-acetil-eglin-származékokat, ennek megfelelően tüdőbetegségek, például leukocita-elasztázzal előidézett tüdőbetegségek, így emfizéma és ARDS („acute respiratory distress syndrome”), mucoviscidosis profilaktikus és terápiás kezelésére, továbbá szeptikus sokk esetében gyulladást csökkentő szerként és gyulladást gátló szerként alkalmazhatjuk.
A találmány tárgya hasonlóképpen a találmány szerinti új eglinszármazékok és farmakológiailag elviselhető sóik profilaktikus és terápis kezelésnél való alkalmazása az említett kórképek esetében.
A találmány tárgya hasonlóképpen olyan gyógyszerkészítmény, amely legalább egy találmány szerinti vegyületet vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját tartalmazza, adott esetben valamilyen farmakológiailag elfogadható hordozóval és/vagy segédanyagokkal együtt
Ezeket a gyógyszerkészítményeket különösen a fenti indikációkban alkalmazhatjuk, ha azokat például parenterálisan (így intravénásán vagy intrapulmonálisan) vagy helyileg adagoljuk. Az adagolás elsősorban a specifikus feldolgozási formától és a terápia, ill. profilaxis céljától függ.
Az adagolás intravénás injekcióban vagy intrapulmonálisan, inhaláciőval, például Bird-készülékkel történik. Ennek megfelelően a parenterális adagolású gyógyszerkészítmények egységdózis formája az alkalmazás módjától függően 10-50 mg találmány szerinti vegyületet tartalmaz dózisonként. A gyógyszerkészítmények a hatóanyag mellett az izotónia beállításához szokásos módon még nátrium-kloridot, mannitot vagy szorbitot tartalmaznak. Liofilizált vagy oldott formájúak lehetnek, mimellett az oldatok előnyösen antibakteriális hatású konzerválószert, például 0,2-0,3% 4-hidroxi-benzoesav-metil- észtert vagy -etil-észtert tartalmazhatnak.
A helyi alkalmazású készítmény lehet vizes oldat, borogatóvíz vagy zselé, olajos oldat vagy szuszpenzió, vagy zsírtartalmú, vagy különösen emulziós kenőcs. A készítményt vizes oldat formájában, például úgy kapjuk, hogy a találmány szerinti hatóanyagot vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját 4-7,5 pH-jú vizes pufferoldatban oldjuk és kívánt esetben további hatóanyagot, például gyulladásgátlót és/vagy polimer kötőanyagot, például polivinilpiirolidont és/vagy konzerválószert adunk hozzá.
Helyi adagolásra alkalmas olajos készítményt, például úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületet vagy annak farmakológiailag elfogadható sóját olajban szuszpendáljuk, adott esetben duzzasztószerek, így alumínium-sztearát, és/vagy felületaktív szerek (tenzidek), amelyek HLB-értéke („hydrophilic-lipophilic-balance”) 10 alatt van, így többértékű alkoholok zsírsav-monoésztereinek, például glicerin-monosztearát, szorbitan-monolaurát, szoibitan-monosztearát vagy szorbitan- monooleát. A zsírtartalmú kenőcsöt például a találmány szerinti hatóanyagok vagy farmakológiailag elfogadható sóik kenhető zsíralapban való szuszpendálásával állítjuk elő, adott esetben 10-nél kisebb HLB-értékű tenzid hozzáadása közben. Emulziós kenőcsöt a találmány szerinti hatóanyagok vagy sóik vizes oldatának lágy, kenhető zsíralapban való eldörzsölésével kapunk 10-nél kisebb HLB-értékű tenzid hozzáadása közben. Mindezek a helyi alkalmazási formák konzerválószert is tartalmazhatnak. A hatóanyag koncentrációja 0,1-5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg, körülbelül 10 g alapmasszában.
Intrapulmonális adagolás útján a légutak kezelésére alkalmas inhalációs készítmény, például az aeroszol vagy spray, amely a gyógyszerhatóanyagot oldat vagy szuszpenzió formájában képes szétoszlatni. A gyógyszerhatóanyagot oldat formájában tartalmazó készítmények ezenkívül alkalmas hajtógázt, továbbá, ha szükséges kiegészítő oldószert és/vagy stabilizátort tartalmaznak. A hajtógáz helyett sűrített levegőt is alkalmazhatunk, mimellett ezt alkalmas sűrítő- és expandálókészülék segítségével igény szerint állíthatjuk elő.
Különösen alkalmas adagolásra a Bird-respirátor, amely az orvostudományban bevezetett és ismert; ennél a hatóanyag oldatát a készülékbe adjuk, kis túlnyomáson köddé porlasztjuk és a lélegeztetett páciens tüdejébe juttatjuk
A kortól, egyéni állapottól és a betegség fajtájától függően kb. 70 kg súlyú melegvérűnek (ember vagy állat) intrapulmonális adagolás esetében egy inhaláció alkalmával 10-30 mg-ot (napota egyszer-kétszer) és intravénás adagolás esetében, például tartós infúzióval naponta 10-1000 mg-ot adagolunk.
Az immunológiai eljárással, például ELISA-val meghatározható terápiás hatású köpet- és plazmakoncentrációk 10 és 100 pg/ml (kb. 1-10 pmól/l) között találhatók.
A találmány különösen a példákban leírt eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciákra, ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó expressziós plazmidokra, ilyen expressziós plazmidokkal transzformált mikroorganizmusokra, eglin elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridomasejtekre, és ilyen antitesteket tartalmazó immunassay tesztkitekre, ezeknek a példákban leírt előállítási eljárására és a példákban az eglinszármazékok transzformált mikroorganizmusok segítségével történő előállítási eljárására, valamint a példákban említett új eglinszármazékokra vonatkozik.
A találmány néhány kiviteli formáját, amit a következő kísérleti részben írtunk le, kísérő rajzok segítségével szemléltetjük.
Az 1. ábra az eglin-C-gén Fi(C) és F2 ffagmentjeinek szintézisét ábrázolja vázlatosan.
A 2. ábra az eglin-C-gén Fi(C) fragmentjét klónozó vektor, a pML87 plazmid előállítását mutatja.
-181
HU 203 784 Β
A 3. ábra ennek megfelelően az eglin-C-, ill. -B-gén F2 fragmentjét klónozó vektor, a pML136 plazmid előállítását mutatja.
A 4. ábra az Fi(C)-F2-DNS-t tartalmazó klónozó vektor szerkesztését szemlélteti. 5
Az 5. ábra a trp-promotert tartalmazó pHRil48 vektor előállítását szemlélteti vázlatosan.
A 6. ábra a pML147 expressziós plazmid előállítását mutatja vázlatosan, amely a trp-prömoter kontrollja alatt az eglin-C-gént [Fi(C)-F2-DNS] tartalmazza. 10
A 7. ábra az N-acetil-eglin-C aminosavszekvenciáját tartalmazza.
A 8-11. ábrák a találmány szerinti eljárás végrehajtását szemléltetik reakcióvázlatokon.
A következő példák kapcsán részletesen ismertetjük 15 a találmányt a korlátozás szándéka nélkül.
Kísérleti rész
A példákban használt rövidítések jelentése a követ-
kező: 20 -(P) 5’-(4-metoxi-tritil)-
TNE oldat, amely 100 mmól NaCl-t, 50 mmól Tris«HCl-t (pH 75) és 5 mmól EDTA-t tartalmaz -trimidinből, töltő ttség 92 pmól/g MMT-0-Gib-OCOCH2CH2CONHCH.
SDS nátrium-dodecil-szulfát -(P) 5’-(metoxi-tritil)-N-
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav 25 -izobutiril-dezoxiguanozin-
DTT BSA 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butándiol) marha-szérumalbumin ból, töltöttség 75 pmól/g
EtBr etidium-bromid 3. példa
Tris trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán A trinukleotid szintézise
Tris«HCl a Trisz monohidro-kloridja 30 a) A dinukleotid szintézise
1. példa
Védett nukleozid-polisztirolgyanta előállítása ml absz. piridinben oldott 3,1 g (5 mmól) 5’-(4metoxi-tritil)-N-benzoil-dezoxicitidint 750 mg borostyánkősavanhidriddel és 910 mg 4-dimetil-amino-piridinnel elegyítünk és 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A piridines oldat bepárlása után 200 ml etil-acetátban felvesszük, kétszer egyenként 200 ml 0,1 M foszfátpufferrel, telített konyhasóoldat hozzáadása közben kirázzuk, még egyszer mossuk konyhasóoldattal, szárítjuk, bepároljuk és hexánt csepegtetünk hozzá. A kivált terméket elválasztjuk és kétszer éterrel eldörzsöljük, majd 300 ml etil-acetátban oldjuk és 0 ’C-on 180 ml (pH 25-ös) 0,1 M kálium- hidrogén-szulfáttal kirázzuk. Vízzel kétszer mossuk, majd az etil-acetátos oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, 05 ml piridinnel elegyítjük, bepároljuk és cseppenként hexánnal hígítjuk. A kivált borostyánkősav-származékot leszűrjük.
Ebből a vegyületből 1,17 g-ot 190 mg N-hidroxiszukcinimiddel együtt 4 ml etil-acetátban és 2 ml dimetil-formamidban oldunk és 0 ’C-on 370 mg NJí’-diciklohexil-karbodiimiddel elegyítünk. Egy éjszakán át hűtőszekrényben való állás után a kívánt NJi’- diciklohexil-karbamidot leszűrjük, a szűrletet etil-acetáttal hígítjuk, hideg 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonáttal s vízzel extraháljuk, szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetáttal kovasavgélen kromatografáljuk.
VRK: Rf 0,58 diklór-metán:metanol (9:1) elegyben.
Ebből az N-szukcinimidoil-borostyánkősav-észterből 88 mg-ot 1 g amino-metil-polisztirollal (amintartalom 110 pmól/g) 2 ml diklór-metán és 4 ml dimetil-formamid elegyében 20 órán át keverünk. A polimeigyantát leszűrjük és dimetil-formamiddal, metanollal, diklór-metánnal és metanollal kimossuk. Szárítás után a nem reagált aminocsoportokat acetilezzük oly módon, hogy a gyantát 6 ml piridinben 1 ml ecetsavanhidriddel és 100 mg 4-dimetil-amino-piridinnel 30 percen át keverjük. A polimergyantát diklór-metánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és diklór-metánnal kimossuk és súlyállandóságig szárítjuk. A spektroszkópiai metoxitritil(MMT)-meghatározás 85 pmől/g töltöttséget ad.
2. példa
Az 1. példával azonos módon állítjuk elő a következő védett nukleozid-polisztirolgyantákat: mmt-o-t-ocooh2ch2conhch27,73 g (15 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-O-T-OH) absz. piridinnel kétszer bepároljuk. A maradékot 20 ml absz. tetrahidrofuránban oldjuk és keverés közben a nedvesség kizárása mellett 80 ml, tetrahidrofuránnal készített 0,2 M 2-klór-fenil-di(lbenztriazolil)-foszfát-oldatot csepegtetünk hozzá és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kapott 2-klór-fenil-l-benztirazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát-oldatot három részre osztjuk.
a) Hidrolízis trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4metoxi-tritil)-timidin-3 ’-foszfáttá;
A 2-klór-fenil-1 -benztriazolil-5 ’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát fenti oldatának egyharmadához hűtés közben 100 ml 0,5 M trietil-ammónium-bikarbonátot adunk. 15 perc elteltével diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános oldatot vízzel mossuk, bepároljuk és cseppenként petroléterrel elegyítjük. A kapott csapadékot vákuumban szűrjük, 1:1 arányú éter-petroléter eleggyel kimossuk és vákuumban szárítjuk.
VRK: Rf 0,35 diklór-metán/metanol/víz (75:22:3) elegyben.
β) 2-ciano-etil-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)- timidin-3’-foszfáttá észterezés és a 4-metoxi-tritil-védőcsoport lehasítása:
A 2-klór-fenil-l-benztriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-foszfát-oldat harmadához 1,3 ml 2-ciano-etanolt és 2 ml piridint adunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és több60 szőr kirázzuk 0,1 M foszfátpufferrel (pH 7) és vízzel. A
-191
HU 203 784 Β szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánba csepegtetjük. A csapadékot leszűrjük, 50 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegyben oldjuk és 0 ’C-on 3,8 g p-toluolszulfonsav-monohidrát 75 ml diklór-metán/metanol 7:3 arányú elegyével készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítjuk és hideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kirázzuk. A szerves fázist bepároljuk és hexánnal elegyítjük. A kivált 2ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3 ’-foszfátot kovasavgélen diklór-metán/metanollal (96:4) kromatografáljuk.
VRK: Rf 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1). γ) Kondenzáció 5’-(4-metoxi-tritil)-3’-ciano-etilbisz-timidin-dinukleotiddá:
2,2 g 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3’-foszfátot kétszeri absz. piridines bepárlással vízmentesítünk, 20 ml absz. tetrahidrofuránban oldunk és a 2-klór-fenil-lbenztriazolil-5 ’ -(4-metoxi-tritil)-timidin-3 ’ -foszfát-oldatmaradék harmadához adunk. A reakcióelegyhez 18 óra elteltével szobahőmérsékleten jeges hűtés közben 10 ml vizet és 200 ml etil-acetátot adunk. A szerves fázist többször mossuk nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel, nátrium-szulfáton szárítjuk és kis térfogatra bepároljuk. A foszfátrészben és az 5’-, ill. 3'-végen védett dinukleotidot 1:1 arányú éter/hexán elegybe való becsepegtetéssel csapjuk ki.
VRK: Rf 0,48 diklór-metán/metanolban (9:1).
b) A trinukleotid szintézise A fenti teljesen védett dinukleotid 1,17 g-ját (1 mmól) 30 m 7:3 arányú diklór-metán/metanol elegyben oldjuk és jeges hűtés közben 1,9 g p-toluolszulfonsavmonohidrát 20 ml 7:3 arányú diklór-metán/metanollal készített oldatával elegyítjük. 2 óra elteltével jéghideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és hexánban csepegtetjük. A kivált, nyers, szabad, 5’-hidroxi-csoportot tartalmazó dinukleotidot kovasavgélen diklór-metán/2-8% metanol gradienssel kromatografáljuk.
VRK: Rf 0,33 diklór-metán/metanolban (9:1).
850 mg 5’-hidroxi-dinukleotidot és 1,06 g trietil-ammónium-2-klór-fenil-5 ’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3 ’-foszfátot (vö. a/α szakasz) kétszer piridinnel bepárlunk, utána 10 ml absz. pirídinben oldunk és 560 mg mezitilénszulfonil-3-nitro-l,2,4-triazoliddal (MSNT) elegyítünk. Két óra eltelte után 2 ml jéghideg vizet adunk hozzá és további egy óra múlva diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-hidrogén- karbonáttal és vízzel mossuk, szárítjuk, bepároljuk és éterrel elegyítjük. A kivált trinukleotidot kovasavgéles kromatográfiával tisztítjuk. Rf 0,45 diklór-metán/metanolban (9:1).
4. példa
A 3. példával analóg módon előállítjuk a következő (XIII) általános képletű, rövidítve B‘B2B3 védett trinukleotidokat. AB1, B!, B3 nukleozidokra a következő rövidítéseket használjuk.
A - N-benzoil-dezoxiadenozin
C - N-benzoil-dezoxicitidin
G - N-benzoil-dezoxiguanozin
T - timidin
Vegyület Rf Vegyület Rf
TTT 0,45 ATG 0,48
TTC 0,55 ACT 0,53
TCT 0,46 ACC 0,48
TAC 0,56 AAT 0,49
TAA 0,53 AAC 0,46
TAG 0,60 AAA 0,51
TGT 0,42 AGT 0,45
TGG 0,43 AGA 0,49
CTG 0,46 GTT 0,45
CCT 0,45 GCT 0,55
CCG 0,47 GCA 0,49
CAT 0,55 GCG 0,48
CCA 0,52 GAT 0,44
CAG 0,44 GAC 0,48
CGT 0,49 GAA 0,50
GGA 0,44 GGT 0,46
*’ Vékonyréteg-kromatogramm kovasavgélen diklór-metán/metanolban (9:1).
5. példa
A komplementer DNS-szál (172/61 komplementer)
172. számú bázisától a 232. számú bázisáig terjedő 61 bázishosszúságú DNS- fragment szintézise
a) A trinukleotid 2-ciano-etil-védőcsoportjának lehasítúsa
A 3. vagy 4. példa szerint előállított trinukleotidból μτηόΐ-t a nedvesség kizárása mellett 60 μΐ 1:1:1 arányú piridin/acetonitril/trietil-amin elegyben oldunk. 1 óra eltelte után szobahőmérsékleten 0,7 ml peroxidmentes étert csepegtetünk hozzá és a csapadékot lecentrifugáljuk. A nyers trietil-ammónium-sót 50 μΐ piridinben oldjuk, 0,5 ml éterrel még egyszer kicsapjuk, lecentrifugáljuk és 15 órán át nagyvákuumban szárítjuk.
b) A részlegesen védett trinukleotidok kapcsolása a polisztirolgyantához kötött oligonukleotidlánccal
Az összes műveletet a nedvesség kizárása mellett egy 280 μΐ űrtartalmú és mikroprocesszorral vezérelt oldószer- és reagensadagolású reakcióedényben végezzük. A reakcióedénybe előre beteszünk 17,6 mg (1,5 μτηόΐ) citidin-polisztirolgyantát (1. példa) és a következő műveleteknek vetjük alá.
1. Metilén-klorid, 2 ml/perc, 5 perc.
2. Metilén-klorid/izopropanol (85:15), 2 ml/perc, 2 perc.
3. Cink-bromid 1M és 1,2,4-triazol 0,02 M metilénklorid/izopropanolban (7:3), 1 ml/perc, 2-3,5 perc.
4. Metilén-klorid/izopropanol (85:15), 2 ml/perc, 3 perc.
5. Trietil-ammónium-acetát 0,5 M DMF-ben, 2 ml/perc, 10 perc.
6. Molekulaszitán szárított piridin, 2 ml/perc, 5 perc.
7. Tetrahidrofurán (peroxidmentes, molekulaszitán szárított) 2 ml/perc, 5 perc.
8. Nitrogénáram, 10 perc.
-201
HU 203 784 Β
9. 160 μΐ piridinben oldott 15 pmól AAA trinukleotid [trimetil-ammónium-só az a) szakaszból] és 13,3 mg (45 pmól) mezitilén-szulfonil-3-nitro1,2,4-triazolid (MSNT) injektálása.
10. 40’C, 30 perc. 5
11. Piridin, 2 ml/perc, 5 perc.
12. 5% acetanhidrid és 2,5% 4-dimetil-amino-piridin/piridinben, 2 ml/perc, 5 perc.
13. Piridin, 2 ml/perc, 5 perc.
14. Piridin/izopropanol (1:1), 2 ml/perc, 3 perc.
Mind a 14 műveletet 19-szer ismételjük, mimellett a
9. műveletnél AAA helyett mindig a trietil-ammóniumsó formában levő következő trinukleotidot [a) szakasz] alkalmazzuk. AGA, TGT, GGT, CTG, TAC, TAG, CGT, CAA, TAA, GGT, CAT, GAA, GCG, CAT, CAA, AAC, CCT, GAT, CAG. A közepes kapcsolási kitermelés 96%. A végtermék struktúrája a következő:
MMT-CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAAGTACCTGGGTTGTAGAAAACpolisztirol.
c) A DNS-fragment lehasítása a hordozóról és a védőcsoportok lehasítása:
40(2 mg (kb. 0,66 pmól) komplementer DNS-szintézisgyantát (172/61) 66 mg (0,40 mmól) o-nitro-benzaldoximmal és 50 μΐ (0,40 mmól) 1,1,3,3-tetrametil-guanidinnel 400 μΐ 95%-os piridinben 3 órán át 50 ‘C-on és 12 órán át szobahőmérsékleten tartunk. A piridin nitrogénnel való eltávolítása után a maradékot 1,6 ml vizes ammóniával (33%) elegyítjük és zárt edényben 24 órán át 50 ’C-on tartjuk.
Az elválasztott folyadékfázist vákuumban megszabadítjuk az ammóniától és 3-szor, egyenként 3 ml peroxidmentes dietil-éterrel mossuk. A kismolekulájú alkotórészek Biogel P6 oszlopon [100-200 mesh, 3*66 cm, 0,01 mól trimetil-ammónium-hidrogén-karbonát (pH 7,5), 1,5 ml/perc] történő elválasztása után 285 OD-nyi (260 nm) DNS-t izolálunk. Összesen 60 OD mennyiséget HPLC-oszlopon választunk el (PRP-l/Hamilton, 250*4,6 mm). Giádiens [A oldat: 0,05 M trietil-ammó15 nium-acetát (pH 7,0); B oldat: A oldat/acetonitril 1:1]: 30% B A-ban 60% B A-ban 20 perc múlva 50 ’C-on, 2 ml/perc. A lipofil főcsúcsot (retenciós idő kb. 14 perc) gyűjtjük, DE52-cellulózoszlopon (Whatman) koncentráljuk, eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A 4-metoxi-tritil-védőcsoport lehasításához a csapadékot 50 pl ecetsav/HíO-ban (4:1) oldjuk és 45 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióterméket liofilizáljuk, etanollal kicsapjuk és 8%-os poliakrilamid gélen (7 M karbamid) elektroforetikus elválasztással tisztítjuk. A várt DNS-méretnek megfelelő sávokat kivágjuk, a terméket elektroeluláljuk, DE52-cellulózoszlopon koncentráljuk és az 5’- CAGGATCCTAACCAACATGCGGAA -CATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTA-GAAAAC-3’ struktúrájú DNS-t etanollal kicsapjuk.
6. példa
Az 5. példával analóg módon állítjuk elő a következő (5*—3 ’) DNS-fragmenteket:
1/40
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTT
30/37 komplementer
AACAGTTTTACCAACAACTTCTGGGAAAGATTTCAGT
67/34
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACC
91/37 komplementer (C)
CCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG
91/37 komplementer (B)
CCGGCAGGAAATGAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG
124/61
CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACC
Továbbá a következő rövidített fragmenteket állítjuk elő:
1/40 (Δ12) (C)
CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTT és 1/40 (Δ 18) (C”) CTGGAATTCATGCTGAAATCTT
7. példa 55
A 30/37,67/34,124161 és 172/61 fragmentek foszforilálása
Az 5’-végek foszforilálása és radioaktív jelölése (γ32P/ATP-vel és T4 polinukleotid-kinázzal (Boehringer)] az irodalomban (19) leírt módon történik.
8. példa
Polimerizáció duplex Ill-má (az eglin-C- és eglin-Bgének Fifragmentje)
50-50 pmól kinázzal kezelt 124/61 fragmentet és kinázzal kezelt 172/61 fragmentet 24 pl vízben oldunk, az oldatot 3 perc alatt 90 ’C-ra melegítjük és 5 percen
-211
HU 203 784 Β belül 12 ’C-ra lehűtjük. 4 pl Endo-R puffer (0,1 M Tris.HCl (pH 7,5), 66 mM MgCU, 66 mM β-merkaptoetanol, 0,6 M NaCl) hozzáadás után 10 pl dezoxinukleozid-trifoszfát eleggyel (dATP, dCTP, dGTP, TTP egyenként 2·10'3 mólos, ammóniával pH 7-re beállított) és 2 pl (10 egység) DhB|x)limeráz I, Klenowfragmenttel (Boehringer) 30 percen át 12 ’C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 ’C-ra való melegítéssel állítjuk le és az elegyet további feldolgozásig -80 ’C-on tartjuk.
Az 1/40 és 30/37, 67/34 és 91/37 (C) és 67/34 és 5 91/37 (B) fragmenteket analóg módon polimerizáljuk duplex I, II (C)-vé, ill. Π (B)-vé. A duplex I-ΙΠ szerkezete a következő:
Duplex I
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
Duplex Π (C)
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
Duplex II (B)
GACCAGGCTCGTGAATACTrCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTCAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC
Duplex ΙΠ (F2 Eglin -C és Eglin -B)
CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTrCGTGTnTCTACAACCCAGGTAC
GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGITGGGTCCATG
TAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG
ATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC
Az 1/40 (Δ 12) (C’) és 30/37 fragmenteket, valamint módon polimerizáljuk duplex I (C’)-sé és I (C”)-sé.
az 1/40 (Δ 18) (C”) és 30/37 fragmenteket azonos 30 A duplex I (C*) és I (C”) szerkezete a következő:
Duplex I (C’)
CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGITGGTAAAACTGTT
GACCTrAAGTACAGACTTGACTrTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
Duplex I (C”)
CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCAITTTGACAA
9. példa 40
A duplex I összekapcsolása a duplex II (C)-vel, az eglin-C-gén Fif C)fragmentjének előállítása 60-60 pmól duplex I-et és duplex Π (C)-t (vö. 8.
példa: csak az A és G 5’-végeken kinázzal kezelt) 54 pl ligáz-pufferben [66 mM Tris«HCl (pH 7,5), 6,6 mM 45 MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP] oldunk, 6 pl (-6 egység) T« DNS-ligázzal (Boehringer) elegyítünk és 21 órán át 20 ’C-on inkubálunk. A reakciót 5 perces ’C-ra való hevítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformos extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk.
Az elegy 8%-os poliakrilamid-gélen (natív) végzett elektroforetikus elválasztása után a 122-132 bázispárt tartalmazó kapcsolási termékeket elektroeluláljuk, DE52-cellulózoszlopon koncentráljuk és eluálás után etanolos kicsapással izoláljuk.
Az eglin-C-gén Fi(C) ffagmentjének szerkezete a következő:
CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCrGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATnTGACAA
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGCACGGCC
Analóg módon kapcsolunk össze 60-60 pmól duplex I (C’)-t, illetve I (C”)-t és duplex Π-t a rövidített eglin-C-gén Fi(C’), ill. Fi(C”) fragrnentjeivé.
Az Fi(C’) és Fi(C”) fragmentek szerkezete a következő:
-221
HU 203 784 Β
CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
Fi(C’)
CTGGAATTCATGCTGAAATCmCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC
F,(C”)
10. példa
A duplex I összekapcsolása a duplex II (B)-vel, az eglin-B-gén Fi(B) fragmentjének előállítása
A 9. példában leírttal megegyező módon 60-60 pmól duplex I-et és duplex Π (B)-t kapcsolunk egymással.
Az eglin-(B)-gén Fi(B) fragmentjének szerkezete a következő:
CTGGAATrCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT
GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA
GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG
CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC
11. példa
Az eglin-C-gén Fi(C) fragmentjét (2. ábra) tartalmazó pML 87 plazmid előállítása
a) A linearizált pBR322/EcoRI/BalI vektor előállítása pg pBR322 plazmid-DNS-t 5 egység Ball restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 100 pg/ml zselatint tartalmazó oldat 200 μΐ-ében 5 órán át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldatot 100 mM Tris«HCl-re (pH 7,5), 50 mM NaCl-ra beállítjuk és a DNS-t 30 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 2 órán át 37 ’C-on emésztjük. Ezután az oldatot TNE-re állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a megemésztett DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 ’C- on egy éjszakán át kicsapjuk.
A pBR322 DNS-ből kimetszett vektort (pBR322/EcoRI/BaU, 2916 bázispár) sűrűséggradienscentrifugálással - szaharóz (5-23%) 50 mM Tris«HClben (pH 8) és 1 mM EDTA - választjuk el a kis DNSfragmentektől (1445 bázispár). A centrifugálást 36 000 f/p-en TST 41 rotorban (Kontron AG) 15 ’C-on 16 órán át végezzük. Utána a lecentrifugált oldatból ISCO-gradiens-gyűjtővel 0,2 ml-es frakciókat szedünk. A nagy DNS-fragmentet (2916 bázispár) tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 100 pl 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és klónozó vektorként való alkalmazásáig -20 ’C-on tartjuk, 5,1 pg (-10,5 pmól vég) DNS-t kapunk.
b) Az Fi(C)-DNS/EcoRI előállítása ng (-0,84 pmól vég) kémiailag szintetizált Fi(C)DNS-t (lásd 9. példa) 5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 50 pl 100 mM Tris*HCl (pH 75) 50 mM NaCl és 100 pg/ml zselatin összetételű pufferben 1 órán át 37 ’C-on emésztünk. Utána az oldathoz
0,5 pg (-1 pmól vég) linearizált pBR322/EcoRI/BalI vektort (lásd 11.: példa) adunk. Ezt követően az enzimet 65 ’C-on való 10 perces hevítéssel inaktiváljuk, az oldatot TNE-re állítjuk és fenol/kloroformmal extraháljuk. A DNS-t alkohollal csapjuk ki. A kicsapott DNS-t alkohol alatt -20 ’C-on további feldolgozásig tároljuk.
c) A pBR322/EcoRl/Ball vektor-DNS kapcsolása az Fi(C)-DNS/EcoRI-gyel és a pML87 plazmid megszerkesztése
A 11. b) példában kapott DNS-csapadékot, amely a két említett DNS-fragmentet tartalmazza, 30 pl 50 mM Tris«HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2> 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 25 egység/pl T4 DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 ‘C-on 16 órán át. Ily módon az oldatban Fi(C)DNS-t tartalmazó pML87 rekombináns plazmid képződik.
d) Az E.coli HB10I transzformációja a pML87 plazmáddal
A transzformációhoz szükséges kalciummal előkezelt E.coli HB101 sejteket Mandel és munkatársai (6) által leírt módon állítjuk elő.
A c) pont szerint kapott oldatot, amely a rekombináns pML87 plazmidot tartalmazza, 10 percen át 65 ‘C-on melegítettük, hogy a T4 DNS-ligázt inaktiváljuk, majd 37 ’C-ra lehűtöttük. Ebből a reakcióelegyből 10 pl-t adunk 150 pl kalciummal kezelt E.coli HB101 sejthez 10 mM MgCb és 10 mM Tris«HCl (pH 75) összetételű oldatban, 200 pl össztérfogatban. Utána az elegyet 30 percen keresztül jégben hűtjük, 2 percre 42 ’C-ra melegítjük és utána 50 percen át 1 ml L-közegben (vő. 21. példa) 37 ’C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet 0,2 ml-es alikvotokban 5 agarlemezre (McConkey-Agar, Difco) kenjük, amelyek 60 pl/ml ampicillint (Serva) tartalmaznak. Az agarlapokat utána
-231
HU 203 784 Β ’C-on 16-18 órán át állni hagyjuk. A transzformált
E.coli HB101 470 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk.
e) AzFi(C)-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen” -elése
470 transzformált kolóniát [11. d) példa] B 85 nitrocellulóz-szűrőre (Schleicher und Schüll) nyomatunk Grunstein és Hogness (24) szerint a kolóniákat oldjuk és denaturált DNS-üket rögzítjük a szűrőn. Utána a szűrőt 20 ml (szűrőnként) 4*SET [-30 mM Tris*HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oldata], 0,1% (g/tf) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 pg/ml denaturált borjútimusz-DNS összetételű oldatban 4 órán át 64 “C-on előhibridizáljuk. Ezután a nitrocellulóz-szűrőt 20 ml (szűrőnként) 5*SET (g/tf) Ficoll 400, 0,2% SDS és 50 pg/ml denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 16 órán át 64 ’C-on 32P-radioaktív jelzett mintával (kb. ÍO’-IO4 Cserenkov beütés szűrőnként) kezeljük. Mintaként a 91/37 komplementer (C) oligonukleotidot (vö. 6. példa) alkalmazzuk. Ezt követően a szűrőt 2«SET, 0,2% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten kétszer mossuk, majd kétszer 2«SET, 0,5% SDS összetételben 60 ’C-on (először 30 percig, majd 60 percig). Utána a szűrőt 3 MM papír (Whatman) között szárítjuk és -80 ’C-on erősítőfóliás (Intensifying screen) röntgenfilmre (Fuji) helyezzük 1-2 napra.
A kapott autoradiogramm 71 pozitív kolóniát (kiónok) mutat, amelyek a további munkához alkalmazhatók, ezek közül az egyik kapja a pML87 jelölést
Analóg módon a kémiailag szintetizált Fi(C’)-DNSt, ill. Fi(C”)-DNS-t (vö. 9. példa) EcoRI-gyel emésztjük és a linearizált pBR322/EcoRI/BalI plazmidot összekapcsoljuk, mimellett az Fi(C)-DNS-t tartalmazó pML87 (C’) plazmid, ill. az Fi(C”)-DNS-t tartalmazó pML87 (C”) plazmid képződik. E.coli HB101 sejteket pML87 (C’), ill. pML87 (C”) plazmiddal transzformálunk és ampicillin tartalmú agarlemezeken tenyésztünk. 95, ill. 120 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. A transzformált kolóniák 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal történő „screenelése” 37 Fi(C’)-DNS-t tartalmazó kolónia, ill. 58 Fi(C”)-DNS-t tartalmazó kolónia azonosítását eredményezi.
12. példa
Az eglin-B-gén Fi(B)-DNS-ét tartalmazó pML90 plazmid előállítása
A 11. b) példában leírttal analóg módon 16 pg kémiailag szintetizált Fi(B)-DNS-t 5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztünk és linearizált pBR322/EcoRI/BalI vektorral keverünk. Az enzimet inaktiváljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNScsapadékot a 11. c) példa szerint T< DNS-ligázzal kezeljük, mimellett Fi(B)-DNS-t tartalmazó plazmid képződik.
Arekombináns plazmidot tartalmazó oldatot a 11. d) példának megfelelően kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált E.coli HB 101 310 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk.
A 310 kolóniát a 11. e) példával megegyező módon megvizsgáljuk az Fi(B)-DNS előfordulására, mimellett próbaként 91/37 komplementer (B) oligonukleotidot alkalmazunk. A kapott autoradiogrammon 55 pozitív, további munkához alkalmazható klón ismerhető fel. Egyikük kapja a pML90 jelölést.
13. példa
Az Fz-DNS-t tartalmazó pML136 plazmid előállítása (3. ábra)
a) A linearizált pBR322/BamfflfNruI vektor előállítása pg pBR322 plazmid-DNS-t 30 egység BamHI restrikciós endonukleázzal 30 percen át 37 °C-on 100 mM NaCl, 6 mM Tris«HCl (pH 7,9) mM MgCl2 és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban emésztünk. Utána az oldathoz 15 egység Nrul restrikciós endonukleázt adunk és 2 órán át 37 ’C-on emésztjük.
A reakcióelegyet 10 percre 70 ’C-ra melegítjük, hogy az enzim inaktiválódjon. Utána a két DNS-fragmentet 1%-os alacsony olvadáspontú agrózon Tris-acetát-EDTA-pufferben (pH 8) végzett gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól. Az agarózgélben a DNS EtBr-os festése után a gélből kivágjuk a pBR322/BamHI/NruI vektor (-3766 bázispár) DNS-sávjának megfelelő helyet és 65 ’C-on 10 percen át elfolyósítjuk. Ezután az elfolyósított agarózgéldarabhoz 2 térfogat 100 mM Tris«HCl-t (pH 8,7) adunk és az elegyet lehűtjük 37 ‘C-ra. Ezt a DNS-keveréket 05 egység borjúbél alkálikus foszfatázzal (Boehringer) emésztjük 30 percen át 37 ’C-on. Az oldat 60 percen át 65 'C-ra való hevítésével az enzimet inaktiváljuk. Ehhez a foszfatázzal kezelt DNS-oldathoz 20 térfogat ΊΝΕ-t adunk és a DNS-t Mueller et al. (23) szerint DE-52 kromatográfiával tisztítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t -20 ’C-on egy éjszakán át alkohollal kicsapjuk A DNS- csapadékot 50 pl 0,01 M Tris’HCl (pH 8) 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és a felhasználásig -20 ‘C-on tartjuk. 15 pg (-2,4 pmól vég) DNS-t kapunk.
b) Az Fi-DNS/BamHI előállítása
1,6 pg (-90 pmól vég) kémiailag szintetizált F2DNS-t (8. példa) 16 egység BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 20 pl 150 mM NaCl, 6 mM Tris’HCl (pH 7,9), 6 mM MgCb és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 ’C-on emésztünk. Utána az oldathoz 60 ng (-96 mmól vég) linearizált pBR322/BamHI/NruI vektort [13. a) példa] adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t további feldolgozásig -20 ‘C-on alkohol alatt tároljuk.
c) A pBR322IBamHIINruI vektor-DNS kapcsolása az F2-DNSIBamHI-gyel és a pML136 plazmid megszerkesztése
A 13. b) példában kapott DNS-csapadékot, amely mindkét említett DNS-fiagmentet tartalmazza, 20 pl 50 mM Tris«HCl (pH 7,8), 10 mM MgCk, 10 mM DTT, 05 mM ATP, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/pl T4 DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 ’C-on 3 órán át. Ily módon az oldat-241
HU 203 784 Β bán az F2-DNS-t tartalmazó rekombinált pML136 plazmid képződik.
d) E.coli transzformációja a pML136 plazmiddal
A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a 11. d) példában leírt módon történik. 10 gl 13. c) példában kapott reakcióelegyet alkalmazunk. 65 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.
e) AzFrDNS-t tartalmazd kolóniák, „screen”-elése transzformált kolóniát [13. d) példa] a 11. e) példában leírt módon megvizsgálunk F2-DNS-re. Radioaktív próbaként 172/61 komplementer oligonukleotidot (vö. 5. példa) alkalmazunk. Az autoradiogrammon két pozitív kolóniát kapunk, egyikük a pML136 jelölést kapja.
14. példa
A pML87, pML90 és pML136 kiónok karakterizálása
A rekombinált pML87, pML90 és pML136 plazmidok DNS-eit Ish- Horowitz szerint izoláljuk (25). A beillesztett Fi(C)-DNS, Fi(B)-DNS és F2-DNS nukleotidszekvenciáját Maxam és Gilbert eljárásával határozzuk meg (3). Ebből a célból 10-10 gg pML87 és pML90 plazmid-DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal és 10 gg pML90 plazmid-DNS-t BamHl restrikciós endonukleázzal hasítunk és a linearizált DNS-eket agarózgélből gélelúcióval izoláljuk [vö. 11. a), ill. 13.
a) példák]. Utána az izolált DNS-eket alkalikus foszfatázzal emésztjük és DE-52 kromatográfiával tisztítjuk [vö. 13. a) példa]. Ezután a DNS- eket az 5’-végen [y-3íP]ATP-vel (fajlagos aktivitás>5000 Ci/mmól, Amersham) és T«-polinukleotid-kinázzal (P-L-Biochemicals) radioaktívan jelöljük. A radioaktívan jelölt DNS-eket ezután egy második restrikciós endonukleázzal (PvuII) hasítjuk. A képződött DNS-fragmenteket agarózból gélelúcióval izoláljuk. A pML87 és pML90 esetében a PvuII- EcoRI* fragmentből (kb. 2190 bázispár) az Fi(C)-, ill. Fi(B)-DNS nukleotidszekvenciáját, a pML136 esetében az F2-DNS szekvenciáját a PvuIIBamHTfragmentben (kb. 1815 bázispár) határozzuk meg. (*a radioaktívan jelzett DNS-véget adja meg). Az FKO-DNS-re, Fi(B)-DNS-re és F2-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a 8-10. példákban leírtakkal.
15. példa
Az FfO-Fz-DNS-t tartalmazó plazmid előállítása (4. ábra)
a) A linearizált pBR322/EcoRI/BamHI vektor előállítása gg pBR322 plazmid-DNS-t 10-10 egység EcoRI és BamHl restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 100 gl 50 mM Tris«HCl (pH 75), 50 mM Tris«HCl (pH 75), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2 és 100 gg/ml zselatin összetételű oldatban 1 órán át 37 ’C-on emésztünk. Utána az oldatot TNE-ie állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 ’C-on egy éjszakán át kicsapjuk.
A pBR322-DNS-ből kimetszett vektort (pBR322^coRI/BalI, 3986 bázispár) sűrűséggradienscentrifugálással - szaharóz (5-23%) 50 mM Tris«HClben és 1 mM EDTA - választjuk el a kisebb DNSfragmentektől (376 bázispár). A centrifugálist 30 000 f/p-en TST 41 rotorban (Kontron AG) 15 ’C-on 15 órán át végeztük. Utána a lecentrifugált oldatból ISCO-gradiens-gyűjtővel 02 ml-es frakciókat szedünk. A nagy DNS-fragmentet (2916 bázispár) tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 100 gl 50 mM Tris*HCl-ben (pH 8) 0,3 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 ’C-on emésztjük. Az oldatot 1 órán át 65 ’C-ra melegítve az enzimet inaktiváljuk. Ezután az oldatot fenol/kloroform eleggyel extraháljuk és a DNS-t egy éjszakán át -20 ’C-on alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 50 gl 10 mM Tris«HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és klónozó vektorként való alkalmazásáig -20 ’C-on tartjuk. 3,75 gg DNS-t (-5,7 pmól vég) kapunk
b) Az Fi(C)-DNSIEcoRI/Hpall és az FrDNS/BamHI/Hpall előállítása
I. AzFi(C)-DNSIEcoRIIHpalI előállítása gg pML87 plazmid-DNS-t először 100 gl 10 mM Tris’HCl (pH 7,4), 6 mM KC1,10 mM MgCU, 1 mM DTT és 100 gg/ml zselatin összetételű oldatban 20 egység Hpall restrikciós endonukleázzal emésztünk. Ezt követi az oldat fenol/kloroformos extrakciója és a képződött DNS-fragmentek kicsapása alkohollal -20 ’C-on.
A DNS-fragmentek keverékét utána 6%-os poliakrilamidgélen Tris-acetát-EDTA-pufferben (pH 8) végzett elektroforézissel szétválasztjuk. A legnagyobb DNSfragmentet (-586 bázispár) gélelúcióval izoláljuk és ezt követően EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk [vö. 11. a), példa]. A képződött DNS-fragmentek keverékét 8%-os poliakrilamidgélen még egyszer elektroforetizáljuk. Ebből 40 ng Fi(C)-DNS/EcoRI/Hpaü-t (127 bázispár) izolálunk.
II. Az Fi-DNSIBamHIIHpall előállítása gg pML136 plazmid-DNS-t 20 egység BamHl restrikciós endonukleázzal hasítunk. Ennek a linearizált plazmid- DNS/BamHI-nek egy alikvotját (1 gg) agarózgélből gélelúcióval izoláljuk [vö. 13. a) példa] és [γ- 32P]ATP-vel radioaktívan jelöljük (vö. 14. példa). Aplazmid-DNS/BamHI főtömegét utána ezzel a radioaktív jelölt DNS-sel keverjük. PvuII restrikciós endonukleázzal emésztjük és a PvuII-BamH? DNS-fragmentet (1203 bázispár) 1% agarózon gélelektroforézissel izoláljuk. 14 gg PvuII-BamHI* fragmentet Hpall restrikciós endonukleázzal emésztünk (lásd fent), majd a DNS-keveréket 8% poliakrilamid- gélelektroforézissel szétválasztjuk és 150 ng F2-DNS/BamHI7HpaII-t (109 bázispár) gélelúcióval izolálunk.
c) Az Fi(C)-DNS összekapcsolása az FrDNS-sel és a pML14I plazmid megszerkesztése ng (-473 nmól vég) F,(C)-DNS/EcoRI/HpaII-t és 9 ng (-495 nmól vég) F2-DNS/BamHI/HpaII-t 20 gl térfogatban T« DNS-ligázzal kezelünk a 13. c) példában már leírt módon. Ezt követően az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot ezután a 13. a) példában
-251
HU 203 784 Β leírt módon oldjuk és EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Az oldatot TNE-re állítjuk és 30 ng (-50 nmól vég) pBR322/EcoRI/BamHI vektor-DNS-t [vő. 15. a) példa] adunk hozzá. Az oldatot ismét fenol/kloroform eleggyel extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-keveréket a 13. c) példában megadott módon T« DNS- ligázzal (Biolabs) kezeljük. Ezen a módon az oldatban olyan rekombináns plazmidok képződnek, amelyek beillesztett Fi(C)-F2-DNS-t (eglin-C-gén) tartalmaznak.
d) E.coli HB101 transzformációja pML141 plazmiddal
A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a 11. d) példában leírt módon történik. A 15. c) példában kapott reakcióelegyből 10 μΐ-t alkalmazunk. 2586 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.
e) Az Fi(C)-Fi-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen-elése
A 11. e) példában leírt módon megvizsgáljuk 18 transzformált kolónia [15. d) példa] Fi(C)-F2-DNS-tartalmát. Radioaktív próbaként az 5. és 6. példákban leírt oligonukleotidok keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammon 13 pozitív kolóniát kapunk, ezek közül négy a pML141, pML143, pML144, pML145 jelzést kapja.
Analóg módon a pML87 (C’)> ül. pML87 (C”) plazmidot Hpall és EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, a kapott Fi(C’)-DNS/EcoRI/HpaII-t, ül. Fi(C”)DNS/EcoRI/Hpaü-t F2-DNS/BamHI/Hpan-vel összekapcsoljuk és a képződött Fi(C’)- F2-DNS/EcoRI/BamΗΙ-t, ill. Fi(C”)-F2-DNS/EcoRI/BamHI-t a linearizált pBR322/EcoRI/BamHI vektorral összekapcsoljuk A kapott plazmidokat, amelyek az Fi(C’)-F2-DNS-t, ill. Fi(C”)-F2-DNS-t tartalmazzák, a kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. A transzformált sejtek tenyésztése 850, ill. 585 ampicillin-rezisztens kolóniát eredményez. A transzformált kolóniákat 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal vizsgáljuk F,(C’)-F2-DNS, ill. F,(C”)-F2-DNS előfordulására. 18 Fi(C’)-F2-DNS-t tartalmazó, és 31 Fi(C”)F2-DNS-t tartalmazó kolóniát azonosítunk. Mindig kiválasztunk egy kolóniát és a pML141(C’), ill. pML141(C”) jelzést kapja.
16. példa
Az Fi(B)-Fi-DNS-t tartalmazó pML160 plazmid előállítása
a) Az F,(B)-DNSIEcoRIIHpaII előállítása
Az Fi(C)-DNS-EcoRI/HpaII-re leírttal [15. b) I. példa] analóg módon 10 pg pML90 plazmid-DNS-t először Hpaü-vel, majd EcoRI-gyel hasítunk. A fragmentkeveréket a leírt módon PAGE-vel tisztítjuk.
b) Az Fi(B)-DNS összekapcsolása az Fí-DNS-sel és rekombináns plazmid készítése
A 10 pg Fi(B)-DNS/EcoRI/HpaII-ből (lásd fenti) és 9 pg F2-DNS/BamHI/Hpan-ből [15. b) Π. példa] kiinduló kapcsolás 15. c) példában leírt módon történik. A képződött Fi(B)-F2-DNS/EcoRI/BamHI-t a leírt módon 30 pg pBR322/EcoRI/BamHI vektor-DNS-sel [vö. 15.
a) példa] kapcsoljuk.
A képződött rekombináns plazmidot tartalmazó oldatot kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 15 transzformált kiónt vizsgálunk meg Fi(B)-F2-DNS-tartalomra a 11. e) példában leírt módon. Radioaktív próbaként ismét az 5. és 6. példákban leírt oligonukleotidok keverékét használjuk. Az autoradiogrammon 6 pozitív kolóniát kapunk, közülük egy a pML160 jelzést kapja.
17. példa
A pML141 és pML160 klánok jellemzése
10—10 pg pML141 és pML160 plazmid-DNS-t mindegyik esetben EcoRI, ill. BamHI restrikciós endonukleázzal emésztünk [vö. 11. a), ill. 13. a) példa]. A pML141 és pML160 karakterizálása a 14. példában már leírt módon történik. Az Fi(C)-F2-DNS-re és Fi(B)-F2-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a fenti szintetikus eglin-C- és eglin-B-gén szekvenciákkal.
18. példa
A pML147 expressziós plazmid előállítása
a) A trp-promoter-operátor-t tartalmazó linearizált pHRil48/EcoRI/BamHI vektor készítése (5. ábra és 6. ábra)
A. A pl 59 plazmid készítése pg pBRHap (21) plazmidot 50 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 60 percen át 37 “C-on hasítunk, és az emésztett keveréket fenolos extrakció után szaharóz-sűruséggradiensen - (5-23%) 50 mM Tris»HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA - TST 41 rotorban (Kontron AG) frakcionáljuk. A centrifugálás 40 000 f/p-en és 15 ’C-on 14 órán át tart. ISCO-gradiensgyűjtővel 1 ml/perc áramlási sebességgel 0,3 ml-es frakciókat szedünk. A kisebb fragmentet tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatot TNE-re állítjuk és 2 térfogat etanollal -20 ’C-on kicsapjuk. A DNS-t centrifugálás után Eppendorf-centrifugában 100 pl 10 mM Tris«HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA-ban oldjuk. Ebből a DNS-fragmentből 5 pg-ot 5 egység BglII-vel (Biolabs) hasítunk 60 percen át 37 ’C-on. A reakcióelegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 ’C-on 10 percen át inkubáljuk, a DNS-t centrifugálással gyűjtjük és újra 50 pl 50 mM Tris«HCl (pH 8,0-ban) oldjuk. Ebből az oldatból kiveszünk 2 pl-t (0,2 pg DNS) és 50 mM Tris’HCl-ben (pH 8,0) 10 ng/pg DNS-koncentráció mellett 1 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 30 percen át 37 ’C-on. Az oldat 60 percen át 65 ’C-ra való melegítésével az enzimet Ínaktiváljuk. Kiveszünk 0,04 pg DNS-t és az 5’véget 10 pCi [y-3JP]ATP-vel (>5000 Ci/mmól, Amersham) és 5 egység T4-polinukleotid-kinázzal (P-L Biochemicals) 20 pl reakciótérfogatban 50 mM Tris«HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2,5 mM DTT összetételű oldatban 30 percen át 37 ‘C-on inkubálva jelölünk. A radioaktív próbát a nem jelölt próbával (lásd fent) keverjük és a DNS-ffagmenteket 5-23% szacharóz-sűrűséggradiensen - 50 mM Tris«HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA TST 60 rotorban frakcionáljuk. A centrifugálást 60 000 f/p-ben 15 ‘C-on 5 órán át végezzük. 0,2 ml-es frakció-261
HU 203 784 Β kát gyűjtünk. Mindegyik frakció aktivitását a Cserenkov-sugárzás mérésével határozzuk meg és ezzel azonosítjuk a fragmenteket. A kis DNS-fragmentet tartalmazó kívánt frakciókat egyesítjük, a DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk és centrifugálás után ismét 20 pl 10 mM Tris-HCl (pH 73), 03 mM EDTA oldatban oldjuk.
A 32P-jelzett EcoRI-BglH DNS-fragmentet 0,2 egység Taql- gyei (Biolabs) 50 pl térfogatban 10 percen át 37 *C- on részlegesen hasítjuk. A reakcióelegy összetételét 0,2% SDS-re, 10% glicerinre, 10 mmól EDTA-ra, 0,05% brómfenol-kékre állítjuk és a DNS-fragmenteket 6%-os poliakrilamidgélen Tris-borát-EDTA-pufferben (22) szétválasztjuk. Az autoradiogrammon azonosítjuk a kívánt EcoRI-Taql fragmentet (a legnagyobb részfragment) tartalmazó sávot. Ezt a fragmentet (L, lásd 5. ábra) a gélből extraháljuk és tisztítjuk (23) és 10 pl 10 mM Tris-HCl (pH 73), 1 mM EDTA oldatban oldjuk.
Akceptor-plazmidként Clal-gyel és EcoRI-gyel hasított pBR322-t alkalmazunk: 2 pg pBR322-t 4 egység Clal-gyel (Biolabs) 20 pl reakciótérfogatban 60 percen át 37 ’C-on emésztünk. A fehéijét fenollal extraháljuk, majd a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 'C-on 10 perc alatt kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással gyűjtjük, majd 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen keresztül 37 ’C-on 20 pl reakciótéifogatban emésztjük. Utána az oldatot 2 térfogat 0,1 M Tris-HCl-lel (pH 8,7) elegyítjük és 1 egység borjúból alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 'C-on inkubáljuk. A foszfatázt ezután 65 ’C-on 60 perces inkubálással inaktiváljuk.
100 ng akceptor-plazmidot 5 pl L-DNS-fragmenttel 15 pl reakciótérfogatban 10 mM MgCL, 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 03 mM ATP összetételű oldatban reakciótérfogat pl-enként 30 egység T< DNS- ligázzal (Biolabs) 2 órán át inkubálunk. Ebből az oldatból 5 pl-t adunk egy olyan 200 pl végtérfogatú elegyhez, amely 150 pl kalcium-kloriddal kezelt E.coli HB101 sejtet (6) tartalmaz 10 mM MgCb, 10 mM CaCb és 10 mM Tris-HCl (pH 73) összetételű oldatban. Az elegyet 20 percen át jégben hűtjük, 1 percre 42 ’C-ra melegítjük és 10 percen át 20 ‘C-on inkubáljuk. 1 ml Trypton-médiumot [a Trypton-médium 10 g Bacto-Tryptont (Difco); 1 g élesztőkivonatot (Difco); 1 g glükózt; 8 g NaCl-ot és 294 mg CaCb-2H2O-t tartalmaz 1 I desztillált vízben] adunk hozzá és az elegyet 30 percen át 37 ’C-on rázás közben, 300 f/p, inkubáljuk. Az elegyet két, 50 pg/ml ampicillinnel (Sigma) kiegészített agarlemezre (McConkey agar, Difco; 0,6 ml/lap) visszük fel. A lemezeket 12-17 órán át 37 ’C-on inkubáljuk.
különböző kolónia plazmid-DNS-ét a következőképpen izoláljuk; A kolóniákat 25 ml-es Erlenmeyerlombikokban lévő, 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített 10-10 ml Trypton táptalajba oltjuk. A kultúrákat 15-18 órán át 37 ’C-on és 300 f/p-cel rázzuk. A sejteket centrifugálással (Sorval, HS-4 rotor, 10 perc, 4 000 f/p-en, 4 ’C) gyűjtjük össze. Kb. 0,1 g sejtet kapunk és ezt 1 ml 50 mM Tris-HCl-ben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk. 0,25 ml lizozimoldatot [10 mg/ml 50 mM Tris-HCl-ben (pH 8,0); a lizozimot a Sigma hozza forgalomba] adunk hozzá és 0 ’C-on való 10 perces inkubálás után 0,15 ml 03 M EDTA-t (pH 73) adunk hozzá. 0 ’C-on való további 10 perces inkubálás után 60 pl 2%-os Triton Χ-100-at (Merck) adunk hozzá. 30 perces 0’C-on való állás után a mintát 30 percen át 4 ’C-on 15 000 f/p-en Sorval SA-600 rotorban centrifugáljuk. A felülúszót fenollal (telített TNE-vel) fehérjementesítjük. A fázisokat 10 percen át 5 000 f/p-en 4 ’C-on végzett centrifugálással (Sorval HB-4 rotor) választjuk szét. A felső fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. 25 pg/ml végkoncentráció eléréséig pancreas RN-ázt (Sigma: 10 mg/ml TNE-ben 10 percig 85 ’C-on előmelegítve) adunk hozzá és az elegyet 40 percen át 37 ’C-on inkubáljuk. Az oldatot utána 1 M NaCl-ra és 10% polietilénglikol 6000-re (Fluka, 20 percig 120 ’C-on autoklávba kezelt) állítjuk és 2 órán át -10 ’C-on inkubáljuk. A csapadékot Sorval HB-4 rotorban (20 perc, 10 000 f/p, 0 ’C) gyűjtjük és újból 100 pl TNE-ben oldjuk A DNS-oldatot 1 térfogat fenollal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal 10 percen át -80 ’C-on kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf-centrifugában történő centrifugálással gyűjtjük és a DNS-t 20 pl 10 mM Tris-HCl (pH 73) és 03 mM EDTA összetételű oldatban ismét oldjuk. 10 ml kultúrából 8-10 pg plazmid-DNS-t kapunk.
A plazmid-DNS-eket a következő restrikciós enzi-. mekkel való emésztéssel analizáljuk:
03-03 pg plazmid-DNS-t Hpal-gyel (Biolabs), valamint Hpal-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs) Clal-gyel (Biolabs) az enzimelőállitó adatainak megfelelő standard-előírás szerint hasítunk. A DNS-eket 1%os agarózgélen 40 mM Tris-acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 pg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt plazmidok egy Hpal- helyet tartalmaznak és a háromszori emésztés után a nagy DNS- fragment mellett 2 kisebb fragmentet eredményeznek, amelyek nagyobbak, mint a pBR322 kis EcoRl-Clal-fragmentje. Ezeknek a plazmidoknak az egyikét pl59-cel jelöljük (lásd 5. ábra).
B. A pHRil45 plazmid előállítása pg pl59-DNS-t 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen át 37 ’C-on emésztünk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és centrifugálás után 10 pl 10 mM Tris-HCl (pH 73), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. Az EcoRI-gyel emésztett DNS-t ezután 15 percen át 12 °C-on 5 egység DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) (Boehringer) kezeljük 10 mM MgCb, 10 mM β-merkapto-etanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals) 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) összetételű oldatban. A polimerázt 5 perces 85 ’C-on való inkubálással inaktiváljuk. A reakcióelegyet 20 mmól Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCb, 10 mM DTT, 03 mM ATP (Sigma) összetételű oldatban tízszeresre hígítjuk és reakcióelegy pl-enként 30 egység T< DNS-ligázzal 1 órán át 15 'C-on inkubáljuk.
ng DNS-sel E.coU-t transzformálunk (a fenti módon) és 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített McConkeyagarlemezeken szélesztjük.
-271
HU 203 784 Β különböző kolóniából a fenti módon izoláljuk a plazmid-DNS-t. A plazmid-DNS-eket EcoRI-gyel való emésztéssel analizáljuk. A kívánt plazmidok EcoRI-rezisztensek. Az analízist a fent leírt módon végezzük. A kívánt plazmid egyikét HRil45-tel jelöljük (5. ábra).
C. A pHRil48 plazmid előállítása pg pHRil45-DNS-t 5 egység Clal-gyel (Boehringer) 60 percen át 37 ’C-on kezelünk, majd fenolos extrakcióval fehéijementesítünk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, és utána 20 pl 10 mM Tris«HCl (pH 75), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. A ragadós végeket a fenti módon DNS polimeráz I (Klenow- fragment)-tel töltjük fel azzal a változtatással, hogy dATP és dTTP helyett dCTP-t (P&L Biochemicals) és dGTP-t (P&L Biochemicals) alkalmazunk. A polimerázt 5 perces melegítéssel 85 ’C-on inaktiváljuk. A reakcióelegyet 2 térfogat 0,1 M Tris*HCllel (pH 8,7) elegyítjük és 05 egység borjú-foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 ’C-on inkubáljuk. A reakcióelegyet fenolos extrakcióval fehéqementesítjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 8 μΐ 10 mM Tris*HCl (pH 75), 05 mM EDTA oldatban oldjuk A kémiailag szintetizált 5’-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3’képletű linker (kapcsoló)-DNS-t az 5’-végen foszforiláljuk oly módon, hogy 8 pmól linkért 5 pCi [γ-32Ρ] ATP-vel (5500 Ci- mmól·1 Amersham) inkubálunk 0,1 mM ATPvel (Sigma), 50 mM Tris*HCl-lel (pH 95), 10 mM MgCb-vel, 5 mM DTT-vel és 2 egység T4-polinukleotidkinázzal (P&L Biochemicals) 8 μΐ reakciótérfogatban 30 percen át 37 ’C-on. A reakciót -80 'C-on való befagyasztással állítjuk le.
A radioaktív jelzett linkért utána 1 pg Clal-gyel és foszfatázzal kezeljük és pHRil45-DNS-sel (lásd fenti) kapcsoljuk 20 pl reakciótérfogatban, amely 05 mM rATP-t (Sigma), 10 mM DTT-t (Calbiochem), 20 mM Tris’HCl-t (pH 7,8), 1 mM MgCb-t és 800 egység T4 DNS-ligázt (Biolabs) tartalmaz. Az inkubálás 15 ’C-on 2 órán át történik. A ligázt 10 perces inkubálással 85 ’C-on inaktiváljuk Utána 2 térfogat vizet adunk hozzá, a konyhasó-koncentrációt 10 mM-ra állítjuk és 20 egység KpnI-et (Biolabs) adunk hozzá 30 perc alatt 37 ’C-on. Fenolos és kloroformos extrakció után az elegyet 0,9%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (Biorad) 40 mM Tris*acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 pg/ml etidium-bromid összetételű pufferben ffakcionáljuk. Az UV-sugárzásban látható, az azonos nagyságú marker-(jelző)-DNS-sel megegyező mozgékonyságú sávokat szikével kivágjuk. A géldarabokat 65 ’C-on 5 perc alatt megolvasztjuk, majd 37 ’C-ra hűtjük. Kb. 20 μΐ térfogatú oldatot kapunk. Az oldatból 5 pl-t kiveszünk és 400 egység T4-ligázzal (Biolabs) inkubáljuk 10 μΐ reakciótérfogatban, amely 0,5 mM ATP-t, 10 mM DTT-1, 10 mM MgCk-t, 20 mM Tris«HCl-t (pH 7,8) tartalmaz, 12 órán át 15 ’C-on. 100 mM Tris«HCl-t (pH 75), 100 mM CaCl2-t és 100 mM MgCh-t tartalmazó oldatból 1/10 térfogatnyit ligázelegyhez (15 ’Con megszilárdul) adjuk és 65 ’C-on 5 percig inkubáljuk. Utána az oldatot a fenti módon kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 50 pg/mg ampicillinnel kiegészített McConkey-agarlemezeken szélesítjük.
különböző kolónia plazmid-DNS-ét a fenti módon izoláljuk és a DNS-t a következő restrikciós enzimekkel analizáljuk: 0,5-05 pg plazmid-DNS-t egymás után KpnI-gyel (Biolabs) Ncol-gyel (Biolabs) és EcoRl-gyel (Biolabs) hasítunk az enzim- előállító előírásai szerint. A hasítási termékeket 1% agarózgélen 40 mM Tris«acetát (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 pg/ml etidiumbromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt módon mindegyik plazmid mutat egy-egy a fenti enzimekhez tartozó hasítási helyet. Az egyik plazmidot HRÍ148 jelöléssel látjuk el. A HRÍ148 plazmid triptofán-promoter-operátort és riboszomális kötőhelyet tartalmaz. Az eglin-C-gént akár csak más heterológ géneket közvetlenül a plazmidban egyszer előforduló EcoRI-, Ncol-, KpnI-helyekre kapcsolhatjuk. Ez a szerkesztés lehetővé teszi a heterológ gének közvetlen összekapcsolását és kifejeződését anélkül, hogy az iniciációhoz és a transzlációhoz szükséges ATG jelenléte a megfelelő génen szükséges lenne. Ezt Ncol-gyel való hasítással és a ragadós végek DNS-polimeráz I-gyel való feltöltésével a leírt módon, vagy KpnI-gyel történő hasítással és a ragadós végek Si-nukleázzal való eltávolításával könnyen elérhetjük. A HRÍ148 plazmid így egy széles körben alkalmazható expressziós plazmid.
D. A linearizált pHRil48/EcoRIIBamHI vektor előállítása pg pHRil48 plazmid-DNS-t a 15. a) példában leírt módon EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A kimetszett pHRil48/EcoRI/BamHI vektort sűrűséggradiens- centrifugálással [vö. 15. a) példa] izoláljuk.
b) Az Ft(C)-F2-EcoRIIBamHIIDNS (6. ábra) előállítása pg pML141 plazmid-DNS-t a 11. a) és 13. a) példákban leírt módon EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. Fenol/kloroformos extrakció és alkoholos kicsapás után az Fi(C)-F2-EcoRI/BamHI/DNS'* 1% alacsony olvadáspontú agarózon (Biorad) végzett gélelektroforézissel [13. a) példa] a plazmidtól (pBR322/EcoRI/BamHI) elválasztjuk és EtBr- dal láthatóvá tesszük. Utána az Fi(C)-F2-DNS (-236 bázispár) sávját tartalmazó géldarabot kivágjuk és 65 ’C-on 10 perc alatt elfolyósítjuk.
c) A pHRil48/EcoRl/BamHI vektor-DNS összekapcsolása az Fi(C)-Fi-DNS-sellEcoRIIBamHI és a pML147 plazmid (6. ábra) előállítása
100 ng (kb. 100 nmól vég) pHRil48/EcoRI/BamHI plazmid-DNS-t és 28 ng (713 nmól vég) Fi(C)-F2-EcoRI/BamHI/DNS-t [10 pl 18. b) példában kapott folyékony gélben oldva] 37 ’C-on 20 pl térfogatban egymással összekeverünk és a 13. c) példában leírt módon T4 DNS-ligázzal 15 ’C-on 16 órán át kezelünk. Ily módon az elegyben az eglin-C-gént (Fi(C)-F2-DNS) tartalmazó pML147 expressziós plazmid képződik.
d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML147 plazmiddal pl pML147 plazmidot tartalmazó elegyet [18. c) példa] 10 perc alatt 65 'C-on elfolyósítunk és kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjához
-281
HU 203 784 Β alkalmazzuk. Kb. 6000 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.
e) Az Fi(Cj-Fj-DNS-t tartalmazó kolóniák „serem -elése
A transzformált kolóniákat [18. d) példa] a 15. e) példában leírt módon megvizsgáljuk az Fi(C)-F2-DNS előfordulására. 7 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a pML147-pML153 jelzést kapják.
A pML141 (C’)t ill. pML141 (C”) plazmidokból előállított Fi(C)-F2-DNS/EcoRl/BamHI-t, ill. F2(C”)F2/EcoRI/BamHI/DNS-t analóg módon pHRil48/EcoRI/BamHI vektorral kapcsoljuk össze. Ily módon az eglin-C’-gént [F,(C’)-F2-DNS], ill. eglin-C”-gént [Fi(C”)-F2-DNS] tartalmazó plazmidok képződnek. A plazmidokat kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált sejtek tenyésztése 940, ill. 1080 ampicillin-rezisztens kolóniát eredményez. A kolóniákat 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal vizsgáljuk Fi(C’)-DNS, ill. Fi(C”)F2-DNS előfordulására. 9 F,(C’)- F2-DNS-t (eglin-C’gén) tartalmazó kolóniát és 17 Fi(C”)-F2-DNS-t (eglinC”-gén) tartalmazó kolóniát azonosítunk. Mindegyik esetben kiválasztunk egy kolóniát és ezek a pML147 (C’), ül. pML147 (C) jelölést kapják.
19. példa
A pML199 expressziét plazjnid előállítása
a) Az F,(B)-F2IEcoRllBamHIIDlbS előállítása
A 18. b) példával analóg módon 5 pg pML160 plazmid- DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. Az Fi(B)-F2/EcoR]/BamHI/DNS-t a leírt módon gélelektroforézissel választjuk el.
b) A pHRil48IEcoRHBamHI vektor-DNS összekapcsolása az Fi(B)-FilEcoRllBamHIIDNS-sel és rekombináns plazmidok előállítása
100 pg pHRil48/EcoRI/BamHI plazmid-DNS-t [vö. 18. a) D. példa] 28 pg Fi/Bj-Fj/EcoRI/BamHI/DNS-sel kapcsolunk össze a 18. c) példa szerint A rekombináns plazmidokat tartalmazó oldatot kalciummal kezelt E.coli HB 101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált kolóniákat a 15. e) példában leírt módon megvizsgáljuk Fi(B)-F2- DNS előfordulására. 6 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a pML199-204 jelzést kapják.
20. példa
A pML147 és pML199 klánok jellemzése
A pML147 és pML199 rekombináns plazmidokban az Fi(C)- F2-, ill. Fi(B)-F2-DNS-szekvenciák karakterizálása az Fi(C)-F2-, ül. F,(B)- F2-DNS Maxam és GÜbert (3) szerinti szekvenálásával történik a 17. példában leírt módon. 10 pg plazmid-DNS-t vizsgálunk. Az Fi(C)-F2-DNS nukleotidszekvenciája a szintetikus eglin-C-génre leírttal, az Fj(B)-F2-DNS pedig a szintetikus eglin-B-génre leírttal azonos.
21. példa
Eglinaktivitású polipeptídek szintézise olyan E.coli sejtekkel, amelyek rekombináns eglingéneket tartalmazó plazmidokat tartalmaznak
a) Eglin-C-aktivitású polipeptídek szintézise
A rekombináns eglin-C-gént tartalmazó 7 klón mindegyikét, éspedig
£.<»//HB 101 pML147
E.coli HB 101 pML148 E.coli HB101pML149 £.co/i HB 101 pML 150 £.co/í HB101 pML151 E.coli HB 101 pML152 E.coli HB101 pML153 E.coli HB101 pML147 (C’)
E.coli HB 101 pML147 (C) megvizsgáljuk eglin-C-aktivitás kéződés szempontjából. Ebből a célból a fenti kiónokat 5 ml L-táptalajban egy éjszakán át (16 óra) 37 “C-on és 250 f/p-en tenyésztjük.
Az L-táptalaj összetétele a következő:
Bacto Tryptone 10 g
Bacto élesztőkivonat 5g
NaCl 5g
glükóz 5g
ampicillin 0,1 g
A16 órás kultúrából 1 ml-t a következő napon 25 ml M9-közegbe viszünk át. Az M9-közeg összetétele a
következő: Na2HPO4«7H2O 13,25 g
KH2PO4 3,0 g
NaCl 05g
NH4CI 1,0 g
CaCl2«2H2O 0,015 g
MgSO4«7H2O 0,25 g
kazein-hidrolizátum 2,5 g
Bi-vitamin 0,0099 g
glükóz 5,0 g
ampicillin 0,1 g
A tenyésztést 37 ’C-on és 250 f/p-en addig folytatjuk, amíg a baktériumszuszpenzió kb. 0,9-1,0 optikai
sűrűséget (OD^) el nem ér. Utána a sejteket össze-
gyűjtjük (a szaporítókultúra 5 ml-e) és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris’HCl (pH 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozim-koncentráciőjúra (Boehringer) állítjuk és 30 percre jég közé tesszük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyasztásával és 37 ’C-ra való felengedésével a baktériumokat szétroncsoljuk. Ezt a műveletet ötször ismételjük, utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 ’C-on centrifugáljuk. A felülúszót megvizsgáljuk eglin-C- aktivitásra oly módon, hogy a humán leukocita-elasztáz
(1) gátlását mérjük.
A következő aktivitásértékeket kapjuk: Baktériumkivonat Eglin-C-aktivitás pg/ml kultúra
E.coli HB101 pML147 3,3
E.coli HB101 pML148 3,3
E.coli HB101pML149 3,4
E.coli HB101 pML150 3,3
E.coli HB101 pML151 3,3
HB101 pML152 35
E.coli HB101 pML153 3,3
E.coli HB101 pML147 (C’) 3,0
E.coli HB101 pML147 (C”) 3,1
-291
HU 203 784 Β
b) Eglin-B-aktivitású polipeptidek szintézise A 21. a) példában leírttal analóg módon a rekombinált eglin-B-gént tartalmazó 6 klón mindegyikét, éspedig
E.coli HB101 pML199 E.coli HB101 pML200 E.coli HB101 pML201 E.coli HB101 pML202 E.coli HB101 pML203 E.coli HB101 pML204 megvizsgáljuk eglin-B-aktivitás képződésére.
Az említett kiónokat a leírt módon L-közegben tenyésztjük és utána M9-közegbe visszük át. 0,9-1,0 optikai sűrűség elérése után a sejteket összegyűjtjük, oldjuk és váltakozó lefagyasztással és felengedéssel elroncsoljuk. Az elegyeket centrifugáljuk, és a felülúszót humán leukocita-elasztáz (1) gátlásának mérésével vizsgáljuk eglin-B-aktivitásra.
A kővetkező aktivitásértékeket kapjuk: Baktériumkivonat Eglin-B-aktivitás pg/ml kultúra
E.coli HB101 pML 199 3,2
£.co/í HB101 pML200 3,1
E.coli HB 101 pML 201 3,8
£.co/iHB101pML202 3,5
E.coli HB 101 pML 203 3,3
E.coli HB101 pML204 3,3
22. példa
E.coli HB101 pML147 törzs tenyésztése ml L-közegbe (ld. 21. példa) jól kinőtt agarlemezről E.coli HB101 pML147 sejteket oltunk és rázógépre (körkörös) tett rázólombikban 150 f/p-en 37 ’Con 12 órán át rázzuk. Ebből az előtenyészetből 5 ml-t 120 ml M9-tápközegbe viszünk. Ezt a kultúrát 250 f/p-en és 37 ’C-on rázzuk. Kb. 8-10 óra után eglinC-aktivitású polipeptidre a kultúra eléri a legnagyobb titert és összegyűjtjük a sejteket.
23. példa
Az eglin-C-aktivitás kimutatása
Eglin-C-aktivitású polipeptidet tartalmazó mintából (vö. 21. és 22. példa) kb. 5—10 μΐ-t 1 cm2-es nitrocellulóz-papírra (NZ) (Biorad) cseppentünk és 30 percen át szobahőmérsékleten szárítjuk. Utána az NZ-t 1 órán át 37 ’C-on 0,01 M Tris-HCl (pH 8) és 0,9% NaCl-oldattal készített 3% szérumalbuminnal inkubáljuk.
Ezt követően az NZ-t 0,01 M Tris-HCl (pH 8) és 0,9% NaCl oldatában mossuk 30 percen keresztül, majd az oldatot ötször cseréljük. Utána a mosott NZ-t 25 ’C-on 2 órán át olyan 0,01 M Tris-HCl (pH 8) és 0,9% NaCl-oldattal készített 3% szérumalbumin- oldattal inkubáljuk, amely 2 pg/ml eglin-C elleni antitestet (nyúlból előállított, vagy monoklonális antitest) tartalmaz. Utána az NZt a fenti módon mossuk. Ezt követően az NZ-t 2-3 órán át 25 ’C-on 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris-HCl (pH 8) és 0,9% NaCl összetételű oldattal kezeljük, amely 0,2 pCi/ml „123I-Protein-A”-t (radioaktív jód-125 izotóppal jelzett Protein-A készítmény, fajlagos aktivitás 89,8 pCi/mg, gyártó: New England Nuclear Corporation, USA) tartalmaz. Utána az NZ-t a fenti módon ismét mos30 suk, szárítjuk és gamma-számlálóban (Multi Gamma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace) meghatározzuk a kötött radioaktivitást, ami az NZ-n lévő eglin-C-aktivitású polipeptid mértéke.
Egy alternatív eljárásban a fenti mintát SDS-poliakrilamid- gélelektroforézisnek (PAGE) vetjük alá [vö. (7)]. A PAGE- elektroforetogrammot elektroblottinggal NZ-re visszük át. Utána az NZ-t a fenti módon kezeljük és/vagy egy éjszakán át röntgenfilmmel (Fuji) autoradiografáljuk. Az NZ-n eglin-C-aktivitású polipeptideket tartalmazó helyek a filmen fekete foltokként jelennek meg.
24. példa
Na-acetil-eglin-C izolálása és tisztítása monoklonális antitest-oszlop segítségével
a) Polipeptidoldat készítése a monoklonális antitestoszlophoz
150 ml táplevest (a 22. példa szerint kaptuk) 4 ’C-ra hűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó nem tartalmaz eglin-C-aktivitást. Ezt követően a sejteket 12 ml oldópufferben [50 mM Tris-HCl (pH 8)], 30 mM NaCl-lel szuszpendáljuk. Ehhez az elegyhez 15 mg lizozimot (Boehringer) adunk és utána 30 percen át 4 ’C-on tartjuk. Utána a sejteket négyszeri lefagyasztással folyékony nitrogénben és ezt követő felengedéssel 37 ’C-ra elroncsoljuk. Ezt követően 30 percen át 16 000 f/p-en 4 ‘C-on centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza az N“- acetil-eglin-C aktivitást. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátot oldunk. A zavaros elegyet 4 ’C-on 30 percre állni hegyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris-HCl (pH 8) pufferben oldjuk és megkapjuk a kívánt polipeptidoldatot.
b) Az bP-acetil-eglin-C tisztítása monoklonális antitest-oszlopon
Az 1K-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlopot (ágytérfogat 0,8 ml, lásd alább) 0,05 mól Tris-HCl-lel (pH 8) hozzuk egyensúlyba. A fenti polipeptidoldatot 0,5 ml-es adagokban 4 ’C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 10 ml 0,05 M Tris-HCl (pH 8) pufferrel mossuk. Az első frakciók a nem adszorbeált polipeptideket tartalmazzák, ezeket eldobjuk. Ezt követően az oszlopot 0,05 M Tris-HClben (pH 8) oldott 5 ml 5 M nátrium-tiocianáttal (Merck) mossuk és a kapott frakciókat HLE-teszttel (1) vizsgáljuk N“-acetil-eglin-C aktivitásra. A polipeptideket tartalmazó frakciókat OD28o méréssel határozzuk meg. A 19. és 20. frakciók tartalmazzák az N“-acetileglin-C aktivitást: ezeket -20 ’C-on vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben tartjuk. Az N°-acetil-eglin-C aktivitás a 19. frakcióban 61 pg/ml és a 20. frakcióban 49 pg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex-G 25-ön (Pharmacia) sómentesítjük. Az SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis (7) az N-acetil-eglin-C molekulasúlyára kb. 8100 daltont adott.
Az 1K-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlop segítségével az N“-acetil-eglin-B, eglin-C és eglin-B tisztításával analóg módon tisztítható.
-301
HU 203 784 Β
c) Az IK-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlop készítése
A) Egerek immunizálása
Liofílizált, tiszta, természetes eglin-C-t (6 mg) kevés 0,1 %-os ecetsavban oldunk és utána foszfátpufferrel készített konyhasóoldattal egészítjük ki és a pH-t 7,2-re állítjuk úgy, hogy a végkoncentráció 2 mg/ml legyen. Ennek az antigénoldatnak az adagjait azonos mennyiségű Freund adjuvánssal, inkomplett Freund adjuvánssal vagy foszfátpufferrel készített sóoldattal elegyítjük és emulgeáljuk. Balb/c nőstény egereket (8-14 hetesek, a sisselni állatfaimról származók, Svájc) 100 pg eglint tartalmazó emulzió mancsba adott injekciójával immunizálunk. A következő hat hét folyamán minden héten további 100 pg eglint emulgeálunk a fenti módon, de inkomplett Freund adjuvánsban subcutan és végül 200 pg eglint foszfátpufferrel készített sóoldatban intravénásán injektálunk. Négy nappal később kivesszük a lépet a fúzióból.
B) A hibridoma és az antitest-teszt előállítása
A hibridomasejteket a kapott lépsejtek SP 2/0 myeloma-sejtvonallal való összeolvasztásával állítjuk elő. 10* lépsejtet és 107 myelomasejtet alkalmazunk. A fúziót a leírt módon (9,26) végezzük.
Az anti-eglin-C aktivitást a hibridoma felülúszóban kompetitiv radioimmunassay segítségével határozzuk meg [RIA, (10)]. Ebből a célból az eglin-C-t a szokásos klóramin-T módszerrel radioaktív 123I-dal jelöljük (30 000 beütés/perc). Egy éjszakán át tartó inkubálással polisztirol mikrotitrálólemez vájataiban poliklonális nyúl anti-eglin-C antitestet rögzítünk Hozzávetőleg a radioaktív eglin-C 50-70%-át ehhez a szilárd fázisú antitesthez kötjük A kapott 45 hibridomakultúra közül 32-nek a felülúszója ezt a kötődést több, mint 50%-ban szignifikánsan gátolta. Az erősen gátló felülúszók közül kettőt, ill. ezek hibridomasejtjeit 299S18 és 299S22 jelöléssel látjuk el és további karakterizálásra kiválasztjuk Ezeket először a határhígítási módszerrel klónozzuk mimellett a 299S18 négy és a 299S22 kilenc pozitív kiónt eredményez, amelyek közül kiválasztjuk a 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 kiónokat és azokat közelebbről karakterizáljuk. Az említett hibridomasejtvonalak Igi kappa szubtípusú monoklonális antitesteket (ugyanolyan jelöléssel) termelnek
C) Az anti-eglin-C antitest izolálása és tisztítása ascitesből
Balb/c egereket 0,4 ml Pristan-nal (Cári Roth) intraperitonálisan előkezelünk. Egy héttel később 2-5· 106 klónozott hibridomasejtet injektálunk intraperitonálisan. Mindegyik egérből ismételten ascites folyadékot veszünk és -80 ‘C-on lefagyasztjuk. Az összegyűjtött folyadékot felengedjük és 30 percen át 4 ‘C-on 16 000 f/p-en centrifugáljuk. A zsírt leszívjuk és a visszamaradó törmelékmentes felülúszóhoz lassú keverés közben 0 ‘C-on 0,9 térfogatekvivalens telített ammónium-szulfát-oldatot csepegtetünk. A kapott nyers immunglobulin-frakciót 0,1 M Tris’HCl (pH 8,2) pufferrel Sephadex-G 200 (Pharmacia) oszlopon visszük át a gyártó adatai szerint. Az aktív frakciókat egyesítjük és Amicon XM-50 szűrővel (Amicon) koncentráljuk. Ilyen módon a 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 monoklonális anti-eglin- C antitesteket kapjuk.
D) Az IK-F299-22-10 antitest-oszlop előállítása
Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) a gyártó adatai szerint hideg desztillált vízzel és pH 8-as kapcsolópufferrel (0,1 M NaHCOí) mosunk. A gél kapcsolópufferrel (1 ml) készített 50%-os szuszpenzióját műanyag csőbe viszszük, azonos mennyiségű, tisztított antitest-oldattal (19 mg 299S22-10 monoklonális anti- eglin-C antitest) elegyítjük és 4 órán át szobahőmérsékleten forgatjuk a csövet. Utána a gélt kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad, aktív helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gélt ml- énként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-lel (ph 8,0) kezeljük, majd foszfátpufferrel készített, gél mlenként 10 mmól nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 ‘C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15-30 mg antitest/ml gél. A monoklonális 1K-F29922-10 antitest-oszlop készítéséhez 0,8 ml képződött immungélt alkalmazunk.
25. példa
Na-acetil-eglin-C izolálása és tisztítása anhidrokimotripszin-oszlop segítségével
a) Polipeptidoldat előállítása az anhidrokimotripszin-oszlophoz
150 ml táplevest (amit a 22. példa szerint kaptunk) ‘C-ra hűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó. nem tartalmaz eglin-C-aktivitást Ezt követően a sejteket 12 ml oldópufferben [50 mM Tris*HCl (pH 8),. 30 mM NaCl] szuszpendáljuk. Ehhez az elegyhez mg lizozimot (Boehringer) adunk és 30 percen át. 4 ‘C-on tartjuk Ezt követően a sejteket négyszer folyékony nitrogénben való lefagyasztással és ezt követő felengedéssel 37 ‘C-ra elroncsoljuk. Utána 30 percen át
000 f/p-en 4 ‘C-on centrifugáljuk. Az N°-acetil-eglin-C aktivitást a felülúszó tartalmazza. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátot oldunk. A zavaros elegyet 4 ‘C-on 30 percig állni hagyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris»HCl-ben (pH 8) oldjuk és a kívánt polipeptidoldatot kapjuk.
b) ÍP-acetil-eglin-C tisztítása anhidrokimotripszin(AnCht)-oszlopon
Az AnCht-oszlopot (ágytérfogat 4 ml) 0,05 M Tris«HCl-lel (pH 8) egyensúlyba hozzuk. A fenti polipeptidoldatot 25 ml-es adagokban 4 “C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 25 ml 0,05 M Tris’HCl-lel (pH 8) mossuk. Az első frakciók tartalmazzák a nem adszorbeált polipeptideket, amelyeket eldobunk. Ezt követően az oszlopot 10 ml, 0,05 M Tris*HCl-ben (pH 8) oldott 5 M nátrium-tiocianáttal (Merck) mossuk és a kapott frakciókat a HLE-teszttel (1) N“-acetil-eglin-C aktivitásra vizsgáljuk. A polipeptideket tartalmazó frakciókat ODíeo-méréssel határozzuk meg. A 30. és 31. frakció tartalmaz N°-acetil-eglinC aktivitást, ezeket -20 ‘C-on vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben tartjuk. Az N“-acetil-eglin-C aktivitás a 30. frakcióban 30 pg/ml és a 31. frakcióban
-311
HU 203 784 Β pg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex G 25-őn (Pharmacia) sómentesítjük. Az SDS-poliakrilamid-gélelektrofoiézis (7) az Na-acetil-eglin-C-re kb. 8100 Dalton molekulasúlyt ad.
c) Az anhidrokimotripszin-oszlop készítése
A. Anhidrokimotripszin előállítása (AnCht)
Az AnCht-t Ako et al. (27) szerint állítjuk elő: 500 mg kimotripszint (Merck) 50 ml 0,1 M Tris*HCl-pufferben (pH 8), amely 0,1 M NaCl-t, 0,12 M CaCU-t és 13% (v/v) metanolt tartalmaz, oldunk. Ehhez az oldathoz hétszer fenil-metán-szulfonil-fluorid (PMSF), (Fluka, 7 mg/ml acetonos oldat) 0,1 ml-es alikvotjait adjuk keverés közben és minden alkalommal meghatározzuk a kimotripszin-aktivitás csökkentését (28). Miután a kimotripszin-aktivitás 1% alá süllyedt, az oldatot 1 mM HCl-lel szemben egy éjszakán át 4 ’C-on dializáljuk (3· 10 liter) és ezt kővetően liofilizáljuk. A képződött fenil-metán-szulfonil-kimotripszint (PMSCht) 100 ml jéghideg 0,1 M KOH-ban oldjuk, egy órán át jégben állni hagyjuk és utána a pH-ját 6 N HCl-lel pH 3-ra állítjuk. A kapott oldatot egy éjszakán át 4 ’C-on 1 mM HCl-lel szemben dializáljuk (3*10 liter) és utána liofilizáljuk. Az AnCht-t fehér por formájában kapjuk (120 mg).
B. AzAnCht-oszlop előállítása
A gyártó adatai szerint Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) hideg deszt. vízzel és pH 84-ös kapcsolópufferrel (0,1 M NaHC03-oldat) mosunk. A gél kapcsolópufferrel (4 ml) készített 50%-os szuszpenzióját műanyag csőbe visszük, azonos mennyiségű anhidrokimotripszin-oldattal (120 mg 4 ml kapcsolópufferben) elegyítjük és egy éjszakán át 4 ’C-on forgatjuk a csövet. A gélt utána kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad aktív helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gélt gél ml-enként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-lel (pH 8) 3 órán át 4 ’C-on kezeljük, majd foszfátpufferrel készített, gél ml-enként 10 mM nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 ’C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15-30 mg AnCht/ml gél. A kapott AnCht-gélből 4 ml-t alkalmazunk az affinitás-oszlop készítéséhez. Megegyező módon tisztíthatjuk az Na-acetil-eglint, -eglin-C-t és -eglin-B-t is.
26. példa
Alternatív eljárás azl^-acetil-eglin-C tisztítására
Az előző tisztítási eljárással alternatív vagy azt kiegészítő módon (vö. 24. és 25. példák) alkalmazhatjuk a következő tisztítási lépéseket:
a) Az oldott anyag butanolos extrakciója
Az oldás után négyszeres lefagyasztással és felengedéssel elroncsolt sejteket [vö. 24. a) példa] ecetsavval [végkoncentráció 0,1%, pH 4,5] elegyítjük. A kicsapódott bakteriális fehérjét centrifugálással választjuk el. Az Na-acetil-eglin-C a felülúszóban marad.
Az n-butanol/ecetsav/víz 5:1:4 (25 ml) kétfázisú elegyet erőteljesen előkeverjük. Utána 2 órán át hagyjuk egyensúlyba jutni, mimellett az elegy két fázisra válik szét. 04 ml 0,1% ecetsavas oldott anyag mintát (ld. fent) 250 pl alsó fázissal hígítunk és az N-acetil-eglin32
C-t 750 μΐ felső fázissal extraháljuk (5 perc Vortex, Fa. Bender Hobein). Ezt követően szobahőmérsékleten 60 perces centrifugálással (5400 f/p) választjuk szét a fázisokat. (Hettich asztali centrifuga EBA 3S). A mintát Fa. Savant készülékkel (Speed Vác Concentrator) nagyvákuumban szárazra pároljuk. Az Na-acetil-eglin-C-t HLE-teszttel, RP-HPLC-vel és SDS-gélelektroforézissel mutatjuk ki.
b) Gélszűrés Sephadex G 50-en
A kapott anyagból 31 mg-ot 600 pl 30%-os ecetsavban szuszpendálunk, 5 percen át szobahőmérsékleten 5000 fip-en centrifugáljuk és a tiszta felülúszót Sephadex-oszlopra, G 50 fine (Pharmacia) visszük (az oszlop méretei: 1,5 cm · 30 cm; detektálás: LKB 8300 Uvicord II; 254 nm, transzmisszió 500 mV; áramlás 0,4 ml/perc). 50 ml 2%-os ecetsavval eluálunk. Az N“-acetil-eglin-C-t a 6-8. frakciókban (24 ml) kapjuk. Kitermelés: 3 mg tiszta liofilizátum, tisztaság kb. 95%.
c) Az hP-acetil-eglin-C és eglin-C anioncserélő kromatográfiája DEAE-cellulózon
Az ecetsavas fehérjekicsapás után kapott felülúszóból 100 ml-t [vö. 26. a) példa] töményítünk és DEAE53-n (Whatman) pH 6-on anioncserélő kromatográfiának vetjük alá (kromatográfiás körülmények: oszlop, 14·80 cm, eluáló puffén 30 mM ammónium-acetát, pH 6,6, áramlás 15 ml/óra, frakciótérfogat 34 ml). Az oszlopot eluáló pufferrel egyensúlyba hozzuk és megkezdjük a kromatografálást, míg az első csúcs (eglinC) a 18-25. frakciók között eluálódik. Az 50. frakciótól egyenként 300 ml eluáló pufferből és 0,06 M ammónium-acetát/0,4 M NaCl-ből (pH 44) álló lineáris sógradienst alkalmazunk. Az N°-acetil-eglin-C a 70-85. frakciók között eluálódik. RP-HPLC-vel, PAGE-vel és HLE-teszttel mutatjuk ki. A termék tisztasága kb. 90% a fehérjetartalomra vonatkoztatva.
IP (összegyűjtött frakciók 18-25.): 64
IP (összegyűjtött frakciók 70-85.): 5,4
27. példa
Az fP-acetil-eglin-C szerkezet bizonyítása és fizikaikémiai jellemzése
a) Az armnosavösszetétel meghatározása
200 pg N-acetil-eglin-C-t 6 N sósavval 110 ’C-on 24 órán át hidrolizálunk és utána S. Moore et al. (29) szerint analizáljuk. A hidrolizátum összetétele a következő:
Aminosav Hidrolizátum Aminosav Hidrolizátum
Asn 7,2(7) Met 0 (0)
Thr 4,6(5) Leu 5,3 (5)
Ser 3,5 (3) Tyr 4,9 (6)
Gin 7,8(7) Phe 4,9(5)
Pro 5,4(6) Lys 2,3 (2)
Gly 5,7(5) His 24(3)
Alá 14(1) Trp 0 (0)
Val 10,1 (11) Arg Összes: 44(4) (70)
-321
HU 203 784 Β
b) Az hP-acetil-eglin-C peptidtérképe
A 7. ábrán bemutatott vázlat az N-acetil-eglin-C aminosav-szekvenciáját tartalmazza, amelyen megjelöltük a tripszin és Staphylococcus aureus-proteáz (V8) hasítási helyeit (vö. 31. irodalmi hivatkozás): 5
T: tripszin hasítási helyek; V8: Stephylococcus aureus-proteáz hasítási helyek (V8).
I) Az hP-acetil-eglin-C tripszines bontása
Na-acetil-eglin-C-t (9,6 mg, 1,18 pmól) 2 ml 0,1 N ammónium-acetát-puffer/10·3 M CaCl2-ben szuszpen- 10 dálunk, a pH-t híg ammónium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk és 90 órán át 37 ’C-on TPCK-tripszinnel (Worthington, 500 pg) inkubáljuk. Az enzimreakciót 50 pl jégecet hozzáadásával állítjuk le. Centrifugálással eltávolítunk egy triptikus fragmentet (T<) és utána fordított 15 fázisú HPLC-vel a tiszta felülúszóból szétválasztjuk a szokásos triptikus fragmenteket (Tj-T?) (vö. fenti vázlat). Az analízis FAB-térképpel történik (30).
Az N“-acetil-eglin-C (200 pmól) tripszines bontása és a DABTC-peptidek mikropreparatív RP-HPLC-vel 20 való izolálása R. Knecht et al. szerint (32), valamint a természetes eglin-C-vel való összehasonlítása megerősítik a T2, Tj, T4, T3, Tí és T7 triptikus peptidek azonosságát (vö. fenti vázlat).
A Tj peptid (az N-terminálison treonin) mindkét 25 kísérletben a természetes eglin-C-től eltérő retenciós időt mutat a HPLC-analízis során (Nucleosil 5/C18, 4,6*120 mm; 1,2 ml/perc; eluens: 0,1% trifluor-ecetsav; acetonitril-víz 8:20,07% trifluor- ecetsavval) R,
9,44 perc (összehasonlításul a természetes eglin-C-nél 30 kapott Ti-é: R, 7,34 perc).
II) Az N-acetil-eglin-C T< triptikus fragmentjének bontása
Staphylococcus aureus-proteázzal V8
Az N°-acetiI-eglin-C (lásd fent) T4 triptikus ffag- 35 mentjéből kb. 100 pg-ot Staphylococcus aureus-proteázzal V8 bontunk 100 pl 0,1 M ammónium- acetátban (pH 8), 37 'C-on 4 órán át A lebontás a várt fragmenteket eredményezi (vö. fenti vázlat: keverékanalízis FAB- MS-sel). 40
c) Részleges szekvenciaanalízis
I) Edman-leboruás
A standard körülmények között (33) végzett klasszikus Edman- lebontás sikertelensége (egyetlen N-terminális aminosavmaradékot sem azonosítunk) 45 az N°-acetil-eglin-C módosított (blokkolt) N-terminálisára utal.
II) Szekvenciameghatározás FAB-MS-sel
FAB („fást atom bombardment”)-MS-sel mérve a „Ti” N-terminális triptikus fragment névleges moleku- 50 latömege 951. Ez 42-vel nagyobb, mint a természetes eglin-C-ből származó megfelelő Ti fragmenté (909). A tömegkülönbség alapján az N- terminális aminosav treoninra módosul.
A fenti kísérletből származó [27. b) I. példa] többi 55 triptikus fragment molekulatömege megfelel a várakozásnak.
d) Az Na-acetil-eglin-C molekulatömegének meghatározása (Összehasonlítás a természetes eglin-C-vel) 60 minta (N“-acetil-eglin-C)
Összegképlet: C375Hj22N9íOi08 kémiai molekulatömeg talált: 8133,1 számított: 8133,06 minta (természetes eglin-C orvosi piócából)
Összegképlet:
C373H550N96O107 kémiai molekulatömeg talált: 8091,4 számított 8091,03
A kémiai molekulatömegeket 3 különböző mérésből határoztuk meg (C 12,011; H 1,0079; N 14,0067; O 15,9994).
Kísérleti körülmények:
Kb. 30 pg mintát közvetlenül tioglicerin próbaadagoló mátrixban oldunk, és ZAB-HF(feloldás 1000)-tömegspektrométerben (Fa. VG-Analytical Ltd. Manchester) mérjük: xenon bombázás; ionenergia 3 keV; scanning(pásztázó) lineáris üzemmód; hitelesítés: CsI/RbI referenciakeverék.
e) Izoelektromos fókuszálás:
Izoelektromos pont IP N-acetil-eglin-C 5,4
IP természetes eglin-C 6,5
Körülmények:
pl vízben oldott 20-20 pg mintát viszünk fel. PAG-lap LKB-Ampholine pH 3,5-9,5,5% PAG 1 mm. Elektrolit anód (+) 1 M H3PO4, katód (-) 1 N NaOH, 20 mA, 700 V, 2,5 óra. Festés 10% (w/v) triklór-ecetsav-oldattal vagy Coomassie Brilliant Blue R-250-nel a szokásos módon.
f) Cellulózacetát-elektroforézis (felszálló)
N“-acetil-eglin-C: a starttól 4,7 cm-re a katód irányába
Eglin-C: a starttól 5,8 cm-re a katód irányába
Körülmények:
Egyenként 2 pl vízben oldott 2 pg-os mintákat viszünk fel 8*17 cm cellogél fóliára (Chemotron, Milano): Horiphor lap-elektroforetikus kamra (Innovatív Labor), elektrolit pH 1,9, 250 V, 1 óra; kimutatás a szokásos színreagensekkel, így TDM-mel, ninhidrinnel, Ponceau-oldattal (Biotec-Fischer).
g) Az N-acetil-csoport kimutatása az N-acetil-eglin-C-ben
I) 100 pg N“-acetil-eglin-C-t 100 pl 0,03 N sósavban 16 órán át 110 ’C-on részlegesen hidrolizálunk és nagyvákuumban szárítjuk. Gázkromatográfiával több, mint 0,5 ekvivalens ecetsavat azonosítunk (34),
II) A „Ti” fragmentben [vö. 27. b) I) példa] az acetilcsoportot 360 MHz proton mágneses magrezonancia-spektroszkópiával azonosítjuk egyértelműen: az Na-acetil-eglin-C-ből származó „Ti” fragmentből 400 pg-ot nagyvákuumban 2 órán át szárítunk és 1 ml D2O-ban oldunk. A 360 MHz-es Ή-NMR-spektrumot 297 K-on 4000 spektrumszélességgel egy éjszakán át mérjük. Referencia H2O (δ 4,95 ppm). δ 2,15 ppm szinglett (3H) y-CH3 az N-acetil-csoportból δ 1,2 ppm dublett (3H) J-7 Hz/y-CH3 a treoninból.
-331
HU 203 784 Β
28. példa
A különböző E.coli törzsek transzformációja a pML147 plazmiddal és a transzformált gazdasejtek tenyésztése
A 18. d) példában leírttal analóg módon az E.coli LM1035, E.coli JA221 és E.coli W3110 üpR, trpAED24 törzseket (vö. 38. hivatkozás) a pML147 plazmiddal transzformáljuk. A transzformált kolóniákat a 15. e) példában leírt módon megvizsgáljuk Fi(C)Fj-DNS előfordulására. 3,5, ill. 3 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a következő jelöléseket kapják:
E.coli LM1035/pML147/l
E.coli LM1035/pML147/2
E.coli LM1035/pML147/3
E.coli JA221/pML 147/1
E.coli JA221/pML 147/2
E.coli JA221/pML 147/3
E.coli JA221/pML 147/4
E.coli JA221/pML 147/5
E.coli W3110 trpR, AtrpED24/pML 147/1
E.coli W3110 trpR, AtrpED24/pML147/2
E.coli W3110trpR, AtipED24/pML147/3
Az említett kiónokat módosított M9-közegben te-
nyésztjük, amelynek az összetétele a következő:
Na2HPO4*7H2O 9g
kh2po4 3g
NaCl 0,5 g
NH.C1 3,5 g
CaCl2*2H2O 0,015 g
MgSO4*7H2O 0,25 g
kazein-hidrolizátum 7,0 g
élesztőkivonat 5,0 g
Bi-vitamin 0,0099 g
vas(III)-citrát 0,006 g
MOPS (3-morfolino-propán-l-
-szulfonsav) 34,0 g
glükóz 20,0 g
ampicillin 0,1 g
C-on és 180 Fp-en addig folytatjuk a tenyésztést, amíg a baktériumszuszpenzió optikai sűrűsége (OD^ kb. 13,0-at el nem ér. Ezt követően a sejteket (az 5 ml tenyészet) összegyűjtjük és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris«HCl (pH 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozim (Boehringer) koncentrációra állítjuk és 30 percre jég közé helyezzük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben való váltakozó lefagyasztásával és 37 ’C-ra való felengedésével a baktériumokat elroncsoljuk. Ezt a folyamatot ötször ismételjük. Utána az elegyet 30 percen át 16 000 Fp-en 4 ’C-on centrifugáljuk.
Mindegyik kiónt a 21. példában leírt módon teszteljük eglin-C- aktivitás képződésére. A baktériumkivonatok 3,0-13 pg/ml kultúra eglin-C-aktivitást tartalmaznak.
Például a következő aktivitásokat kapjuk:
Törzs Eglin-C-aktivitás (pg/ml tápoldat)
E.coli LM1035/pML147/l 3,0
E.coli JA221/pML147/l 6,0
E.coli W3110 trpR, trpAED24/pML147/l 11,0
29. példa
A transzformált E.coli W3110 trpR, trpAED24lpML147ll törzs fermentálása és a tápleves feldolgozása
A 28. példában leírt módon egy 50001-es fermentorban 3000 1 módosított M9-közegben E.coli W3110 trpR, tipÁED24/pML 147/1 sejteket tenyésztünk, amíg a szuszpenzió 10-13-as optikai sűrűséget (ODen) el nem ér.
A táplevest (pH 7,4) 10 ’C-ra hűtjük, és a sejteket Alfa-Laval BRPX-207 iszaptalanító berendezéssel kezeljük. A tiszta felülúszó nem tartalmaz eglinaktivitást, ezt eldobjuk. Az iszaptalanítás folyamán az iszapteret A oldópufferrel (50 mM Tris»HCl, 30 mM NaCl, HCl-lel pH 8-ra állítva) folyamatosan résziszaptalanítjuk és végül a centrifugahüvely tartalmát (7 I) A oldópuffenel való teljes iszaptalanítás közben kiürítjük. A kapott sejttömeg térfogatát A pufferrel 375 1-re állítjuk, a pH-ja 7,6. 5-10 ’C-ra való hűtés után a szuszpenziót Dyno-malmon (Tyr KD5) vezetjük keresztül, ami 4,2 1 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyönggyel van megtöltve. Ezzel elroncsoljuk a sejteket. Az így kapott szuszpenziót ecetsavval 2% ecetsavtartalmúra (v/v) állítjuk és egy éjszakán át 10 ’C-on keverjük. A 3,9 pH-jú szuszpenziót a fenti technikával iszaptalanítjuk. A 300 1 tiszta felülúszót ejtőfilmbepárlóban (teljesítmény 60 1 víz/óra) 35 1-re koncentráljuk. Az enyhén zavaros koncentrátumot centrifugáljuk és így kapott tiszta felülúszót GR 81 PP membránnal (2,5 m2 felület) felszerelt DDS LÁB 35 ultraszűrő berendezésben 2% ecetsavval szemben diafiltráljuk. A végtérfogat 311.
A tiszta fehérjeoldat 21-es alikvotját 961 ágytérfogatú Sephadex G 50 oszlopra (KS 370 Pharmacia) viszszük, mimellett az oszlopot 2% ecetsavval hozzuk egyensúlyba. A151 eluátumban kapott főfrakciót ultraszűréssel töményítjük, majd vízzel szemben diafiltráljuk. A kapott tiszta, vizes oldatot liofilizáljuk. A maradék tiszta eglin-C-ből áll.
30. példa
Az E.coli W3110 trpR, trpEED24lpML147ll fermentációjával kapott termékkeverék analízise A 29. példában kapott, eglin-C-ből álló maradékot
HPLC- analízisnek vetjük alá.
Kísérleti feltételek:
Vydac 218 TP510RP-HPLC-oszlop, 10*250 mm;
mg eglin elválasztásonként; AUFS: 2,0 220 nm-en; átfolyási sebesség: 2 ml/perc; Eluens: A: 0,1% trifluorecetsav, B: acetonitril/víz 8:2 + 0,07% trifluor-ecetsav, 1 percig 40% B, majd 30 perc alatt 60% B-re nő.
Eredmény: Hét terméket azonosítunk, ezeket frakcionáljuk és egyenként HLE-tesztnek vetjük alá. Ezenkívül meghatározzuk az izoelektromos pontokat [IP: izoelektromos fókuszálás, mint a 27. e) példában leírtuk, LKB-Ampholine pH 4,0-6,5]. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza:
-341
HU 203 784 Β
Frakció Retenciós idő IP HLE (perc)
F0 282 6,5 +
FI 29,1 6,4 6,3 +
FIA 30,0 5,3
F2 312 5,4 +
F3 33,8 4,8 +
F4 34,6 35,4 4,8 +
A mért ízoelektromos pont, a HPLC-érték és az ellenőrzésként végzett molekulatömeg-meghatározás (talált molekulatömeg: 8133,2) alapján a főtennék (F2) N“-acetil-eglin-C. Az Ízoelektromos pont, a HPLC-érték és az ellenőrzésként végzett molekulatömeg-meghatározás (talált molekulatömeg: 8091,2) alapján a 0 frakcióban (FO) kapott anyag természetes eglin-C.
31. példa
Módosított eglin-C előállítása pML147 (C’)t ill. pML147 (C”) plazmid transzformált E.coli HB101 sejtekkel
Az E.coli HB101 pML147 (C’) és E.coti HB101 pML147 (C”) törzseket a 22. példában leirt módon tenyésztjük és a sejtfeltárás után a táplevest anhidrokimotripszin-oszlopon (vö. 25. példa) végzett kromatográfiával tisztítjuk. HPLC elválasztással (a feltételeket lásd a 30. példában) az E.coti HB101 pML147 (C’) táplevesből két terméket (A és B) izolálunk. Discelektroforézissel (pH 8,9, 15%-os gél; Nr. 2 Maurerrendszemek megfelelő) elválasztva az A tennék Rf-értéke 0,42. A tripszines lebontás 7 fragmentet eredmé15 nyez, ezek közül 6 azonos az N°-acetil-eglin-C lebontásakor kapott fragmentekkel [vö. 27. b) példa]. A peptid N-terminális részének megfelelő 7. fragment szekvenciája Edman szerint (33) végzett aminosavanalízis szerint Ser-Glu-Leu-Lys. Az A termék szerkezete az eglin-C’ szerkezetének felel meg:
SerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro
GluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly
ThrAsnValValAsnHisValProHisValGly.
A B tennék tripszines lebontásával szintén 7 fragmentet kapunk. Az A termékhez képest csak az N-terminális fragmentben találunk különbséget, amely a szerin-gyökön kiegészítő N-acetilcsoportot tartalmaz 30 és így a szekvenciája N-acetil-Ser-Glu-Leu-Lys. A B termék így N’-acetil-eglin-C’-ként jellemezhető.
A tenyésztett E.coli HB101 pML147 (C”) sejtek homogenátumából anhidrokimotripszin-oszlopon végzett kromatográfia és HPLC-s finomtisztítás után csak egy termék azonosítható (C termék). Disc-elektroforézissel elválasztva (körülmények mint fent) a C tennék Rrértéke 0,30. A tripszines bontáskor N-terminális fragmentként a Leu-Lys dipeptidet kapjuk; a többi fragment az N°-acetil-eglin-C tripszines bontásánál izolált megfelelő fragmenttel azonos. A C tennék így az eglin-C”-re várt szerkezettel rendelkezik:
LeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro
GluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnAigValArgValPheTyrAsnProGly
ThrAsnValValAsnHisValProHisValGly.
32. példa
Az AP-acetil-eglin-C enzimatikus szintézise mg (1 pmól) eglin-C-t [a 26. c) példa szerinti előállítást követő HPLC-s finomtisztítással kapjuk]
0,06 M foszfátpufferben (pH 7,5) 0$ pmól acetü-ko- 45 enzim A-val és N°-acetil-transzferázt tartalmazó E.coli HB101 kivonat kb. 200 pg-jával elegyítjük. Az elegyet 37 ’C-on inkubáljuk. 3 óra eltelte után az enzimet 60 ’C-ra való melegítéssel inaktiváljuk és az elegyet HPLC-vel tisztítjuk. Az elválasztott Ne-acetil-eglin-C a 50 bioszintetikus termékkel [vö. 26. c) példa] azonos.
33. példa
Monoklonális anti-egtin-C antitestet tartalmazó tesztkit eglin-C meghatározására, kompetitív rádió- 55 immunassay
Anti-eglin-C antitestek 24. c) C) példa szerint előállított oldatát foszfátpufferrel készített konyhasóoldattal (PBS-oldat) 1 pg/100 pl koncentrációra hígítjuk. Ebből az oldatból 100 pl-t 2 órán át 37 ’C-on műanyag csőben 60 vagy műanyag mikrotitráló-lemezen inkubálunk, mimellett az antitestek nem specifikusan a műanyagfelületre adszorbeálódnak. A műanyagfelületen a még szabad, aktív helyeket marhaszérum- albumin-oldattal (BSA-oldat) való kezeléssel telítjük. A vizsgálandó mintaoldat vagy a standard oldat BSA-oldattal készített hígítási sorát egyenként 50 pl ismert módon (20) radioaktív 123I-dal jelzett, 50 pl-enként 10 000 beütés/perc aktivitású eglin-Coldattal elegyítjük és utána a múanyagfelületen 2 órán át 37 ’C-on és ezt követően 12 órán át 4 ‘C-on inkubáljuk. A csöveket vagy mikrotitráló-lapokat foszfátpufferrel készített sóoldattal mossuk, és mérjük a radioaktivitást. A mintaoldat eglin-C-koncentrációját standardoldattal mért kalibrációs görbével határozzuk meg.
A leírt radioimmunassay-hez alkalmas tesztkit tartalmaz:
ml anti-eglin antitest oldatot [a 24. c) C) példa szerint], amelynek a koncentrációja 1-10 mg/ml,
100 ml foszfátpufferrel készített sóoldatot (PBS-oldat),
-351
HU 203 784 Β
100 ml 0,3% marhaszérum-albumint és 0,1% nátrium-azidot PBS-oldatban (BSA-oldat), ml radioaktív eglin-C-oldatot, amelynek aktivitása 200 000 beütés/perc, ml standardoldatot, amely 100 ng/ml eglin-C-t tartalmaz 1 ml-es műanyag csöveket vagy műanyag mikrotitráló-lapokat.
34. példa
Tesztkit monoklonális anti-eglin-C antitesteket alkalmazó tandem ELISA-hoz Mikrotitráló-lapokon vájatonként 300 ng, nátriumbikarbonát rögzítópufferben (pH 9,6) oldott 299S1820 monoklonális antitestet rögzítünk egy éjszakán át történő inkubálással 4 °C-on. A lemezeket 0,005% Tween 20-at tartalmazó, foszfátpufferrel készített konyhasóoldattal (pH 7,2) háromszor mossuk és a vájatokat ezt követően egy éjszakán át 4 ’C-on vájatonként 200 μΐ, 0,2% zselatint és 0,02% nátrium-azidot tartalmazó foszfátpufferrel készített konyhasóoldattal (PBS + zselatin + A) kezeljük. Háromszor mossuk, mint korábban. PBS + zselatin + A oldattal hígított különböző koncentrációjú eglin-C-t teszünk a vájatokba és 4 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Háromszori mosás után, mint korábban, vájatonként 100 μΐ optimális titerű alkalikus foszfatázhoz (0,5 mg/ml konjugátum, a teszthez l:200-ra hígítva PBS + zselatin + A-val) kapcsolt második monoklonális antitesttel (229S22-1) elegyítjük és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, utána 150 μΐ dietanol-amin-pufferben (pH 9,8) oldott p-nitro-fenil-foszfáttal hívjuk elő a színt. A színintenzitást (OD«s) egy órán keresztül 15 percenként meghatározzuk Multiscan Elisa leolvasókészülékkel. A mért OD«5 és ismert mennyiségű, pl. ΙΟΙ 03 ng/ml természetes eglin-C-vel felvett kalibrációs görbe összehasonlítása alapján meghatározzuk a vizsgálandó minta eglin-C-tartalmát.
A módszer az eglin-B vagy más eglinszármazék, például Na-acetil-eglin-C meghatározására is alkalmas és akkor is alkalmazható, ha a meghatározandó eglinplazmában patkány-, macska- vagy nyúlplazmában található.
A tandem ELISA tesztkit tartalmazza a szükséges reagenseket, különösen a monoklonális anti-eglin antitesteket, például a 299S18-20 és 299S22-1 jelűeket, adott esetben a használandó pufferrel készített oldat formájában, a használandó puffereket, beleértve a szubsztrátpuffert, mosóoldatokat, p-nitro-fenil-foszfát szubsztrátot, a meghatározandó eglint, például eglin-
C-t tartalmazó standard oldatot, egy műanyag mikrotitráló-lemezt és/vagy adott esetben táblázatot vagy kalibrációs görbét, például a következőt: a fenti tandem
ELISA-ra kaptuk:
Természetes eglin-C OD405
KP 0,0
10' 0,18
102 0,73
103 1,23
N-acetil-eglin-C (ng/ml) OD405
1(P 0,08
101 0,32
102 1,00
103 1,26
35. példa
Parenterális adagolásra alkalmas Na-acetil-eglinC-t tartalmazó gyógyszerkészítmények
A 24. vagy 25. példa szerint előállított, N“-acetil-egIin-C-t tartalmazó oldatot 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal szemben dializálunk. Az oldat koncentrációját utána ugyanazzal a nátrium-klorid-oldattal történő hígítással 1 mg/ml-re vagy 10 mg/ml-re állítjuk. Ezeket az oldatokat ultraszűréssel (0,22 pm pórusátmérőjű membrán) sterilizáljuk. A sterilizált oldatok közvetlenül alkalmazhatók intravénás adagolásra, tartós cseppinfúzióra, valamint inhalációs készülékben (pl. Bírd) való porlasztásra.
A találmány szerint előállított monoklonális anti-eglin antitesteket termelő hibridomasejteket 1984. november 6-án a Pasteur Intézet „Collection Nationale des Cultures des Microorganizmes”-ében*, Franciaország, a következő számok alatt helyeztük letétbe:
299S18-20 Nr. 1-361 299S22-1 Nr. 1-362,299S2210 Nr. 1-363, mimellett az első szám a hibridomasejtekre és a második a letétbe helyezési számra vonatkozik.
* A mikroorganizmus kultúrák nemzeti gyűjteménye
36. példa
Eglin expressziója élesztőben
Az idegen gének élesztőben történő expresziójára alkalmas rendszer erős élesztőpromotert, előnyösen indukálható promotert, és élesztő transzkripciós stopjelet igényel, amelyek egymás után vannak kapcsolva és, amelyeket az idegen gének bevitelére alkalmas egyszer előforduló restrikciós helyek választanak el egymástól. Az expressziós vektor ezenkívül élesztő DNS-szekvenciákat tartalmaz, amelyek az élesztőben az autonóm replikációt megengedik és nagyszámú plazmid másolathoz vezetnek. Ezek a szekvenciák előnyösen élesztő-2p-szekvenciák. A vektor tartalmaz továbbá egy élesztőszelekciós gént, előnyösen az élesztő LEU2-génjét, továbbá a replikáció kezdőpontját és az ampicillin-rezisztencia gént tartalmazó pBR322-DNS-szekvenciákat, amelyek az E.coli-ban történő sokszorozáshoz szükségesek.
Az ismertetett követelményeket teljesítő alkalmas expressziórendszer leírása a 100 561 számú európai szabadalmi leírásban található és élesztőben nagyon teljesítőképesnek bizonyult. Az idegen gének expreszszióját az élesztő savanyú foszfatázának indukálható PHO5 promotere szabályozza. A pJDB207 plazmidban a PH05 promotor, az idegen gén és a PHO5 transzkripciós stopjel egymást követő elrendezésű. A plazmid tartalmazza az élesztő-2p-szekvenciákat, az élesztő LEU2-génjét és az E.coli replikációs kezdetét és az ampicillin- rezisztencia gént.
A pJDB207R/PHO5-EGL expressziős plazmidot a következőképpen állítjuk elő:
-361
HU 203 784 Β
a) A pJDB207 vektorfragment izplálása μ pJDB207R/IF (a-3) plazmidot (EP 100 561) BamHl restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A kapott 6,85 kb. és 1,15 kb. nagyságú DNS-fragmenteket etanollal kicsapjuk és 400 μΐ 50 mM Tris«HCl (pH 8,0) pufferben újraszuszpendáljuk. 4,5 egység borjúbél-alkálikus-foszfetázt (Boehringer Mannheim) adunk hozzá. Az elegyet 1 órán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd a foszfatázt 1,5 órán át 65 ’C-on ínkubálva inaktiváljuk. Az oldatot 150 mM NaCl koncentrációjúra állítjuk. A DNS-oldatot egy előzőleg 150 mM NaCl-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM Tris«HCl (pH 7(5) pufferrel egyensúlyba hozott DE 52 (Whatman) anioncserélő oszlopra (100 μΐ ágytérfogat) visszük. Ugyanazzal a pufferrel való mosás után a DNS-t 400 μΐ 1,5 M NaCl, 10 mM Tris«HCl (pH 7,5) 1,5 mM EDTA összetételű puffénál eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A nagy kb. 6,85 BamHI-fragmentet Trisborát-EDTA-pufferrel (pH 8,3) készített 0,6%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen választjuk el a kis ffagmenttől.
b) Az 534 bp PHO5 promoterfragmertí izolálása pg p31/R (EP 100 561) plazmidot EcoRl és BamHl restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A kapott 3 fragmentet Tris-borát-EDTA-pufferrel (pH 8,3) készített 0,6%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen választjuk el. A PHO5-promotert az mRNS- starttal együtt tartalmazó 534 bp BamHI-EcoRI-fragmentet izoláljuk.
c) Az eglint kódoló szekvenciát tartalmazó 221 bp DNS-fragment izolálása pg pML147 plazmidot BamHl és EcoRl restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A kapott 2 DNS-ffagmentet Tris-borát- EDTA-puffenel (pH 8,3) készített 0,6%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen választjuk el. A 221 bp fragmentet izoláljuk.
d) A DNS-fragmentek összekapcsolása
A három fenti és összeillő ragadós végeket tartalmazó DNS- fragmentet egy reakcióban kapcsoljuk össze. 0,1 pmól (0,45 pg) 6,85 kb BamHI-vektorfragmentet, 0,2 pmól (70 ng) 534 bp BamHI-EcoRI-PHO5-promoterfragmentet és 0,2 pmól (29 ng) pML147 plazmidból származó 221 bp EcoRI-BamHI-fragmentet kapcsolunk össze. A 3 DNS-fragmentet az alacsony olvadáspontú agaróz kis géltömbjei tartalmazzák. A három agarózgél tömböt egyesítjük, 65 ’C-on elfolyósítjuk és
2-szeresre hígítjuk. A kapcsolást 270 pl térfogatú, 60 mM Tris«HCl (pH 7,5), 10 mM MgCb, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 16 egység T< DNS- ligáz (Boehringer Mannheim) összetételű oldatban 15 ’C-on 16 órán át végezzük. Akapcsolóelegy alikvotját (10 pl) 100 pl kalciummal kezelt, transzformációra alkalmas E.coli HB101 sejthez adjuk.
transzformált amp* kolóniát 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben külön tenyésztünk. A plazmid DNS-t Holmes et al. [Anal. Biochem. 114,193 (1981)] módszerével kapjuk és HindIH/EcoRI-kettős emésztéssel analizáljuk. A 600 bp EcoRI-HindlII-fragment megtalálása bizonyítja, hogy a PHO5- promotereglin-C DNS-fragment helyes orientációban épült be az expressziós vektorba. A várakozásnak megfelelően a kiónok kb. 50%-a a közbeiktatott részt helyes orientációban tartalmazza. Egy ilyen kiónt izolálunk és pJDB207/PHO5-EGL-lel jelöljük.
e) A Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása
A pJDB207R/PHO5-EGL plazmidot Hinnen és munkatársai (4) transzformációs eljárásával visszük be a Saccharomyces cerevisiae GRF 18 törzsbe (a, his
3- 11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can*). A transzformáit élesztősejteket élesztő minimálközeget tartalmazó lapokon (leucin nélkül) szelektáljuk. Az egyes transzformáit élesztőkolóniákat izoláljuk és Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PHO5-EGL jelzéssel látjuk el.
f) A S.cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PHO5-EGL fermentálása
S.cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PHO5-EGL sejteket 300 ml élesztő minimálközegben (Difco Yeast Nitrogén Alapközeg, aminosavak nélkül, amelyhez 2% glükózt és 20 mg/1 L-hisztidint adtunk) 1 1- es Erlenmeyer-lombikban rázatva 30 ‘C-on 24 órán át 3*10’ sejt/ml sűrűség eléréséig tenyésztünk A sejteket 0,9% NaCl oldattal mossuk, majd azokhoz 3 1 alacsony Pjtartalmú minimálközeget, amit a Difco Yeast Nitrogén Alapmédium (aminosavak nélkül) - 0,03 g/1 KH2PO4, 1 g/1 KC1, 10 g/1 L-aszparagin (NID2SO4 helyett, 2% glükóz és 1 g/1 L-hisztidin - előírása szerint készítettünk, adunk. A közeget 0,25 optikai sűrűségre (ODeoo) állítjuk. A sejteket MBR Mini-Bioreaktorban 24 órán át keverés közben (500 f/p) 30 ‘C- on tenyésztjük és 1,9 optikai sűrűség (OD«») elérésekor gyűjtjük.
37. példa
Eglin-C és N^-acetil-eglin-C kinyerése transzformáit Saccharomyces cerevisiae GRF 18lpJDB207R/PHO5-EGL sejtekből Ai eglin-C-t és N°-acetil-eglin-C-t az eglin-Cstruktúrgént tartalmazó plazmiddal transzformált Saccharomyces cerevisiae törzsből izoláljuk. A termékek 2:1 (s/s) arányban és fordított fázisú HPLC alapján 15-20 mg-os kitermeléssel fejeződnek ki a táplevesben. Az S.cerevisiae sejteket 1,9 (OD«»)-hoz tartozó sejtsűrűség eléréséig tenyésztjük a 36. f) példában leírt módon.
A transzformált élesztősejtek táplevesét (31) 4 ’C-ra hűtjük és centrifugáljuk. A kicentrifugált csapadékban levő sejteket 150 ml pufferben [50 mM foszfát (pH 7,4), 4 mM Zwittergent (Calbiochem)] újraszuszpendáljuk és üveggolyókkal elroncsoljuk. A homogenátumot centrifugáljuk és a felülúszót azonos térfogatú 2%-os ecetsavval hígítjuk A szuszpenziót 15’-en át 4000 f/perccel centrifugáljuk, a csapadékot elkülönítjük és a zavaros felülúszót kationcserélő- oszlopra (karboxi-metil-cellulóz, ágytérfogat 32 ml) visszük pH
4- en (1 ágytérfogat startpuffer). Az elúciót 5 ágytérfogat A pufferrel és 5 ágytérfogat B pufferrel képzett lineáris sógradienssel hajtjuk végre [A puffén 20 mM ammónium-acetát, (pH 4); B puffén 200 mM ammónium-acetát (pH 6,5); áramlási sebesség 43 ml/óra; frak37
-371
HU 203 784 Β ciótérfogat 14 ml]. Az N“- acetil-eglin-C-t a 29-31. (15 mg) frakciókban kapjuk és a leírt módon félpreparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk tovább (kitermelés: 8 mg).
Az eglin-C-t a 32-33. (24) frakciókban kapjuk, liofilizáljuk és DEAE-cellulóz-oszlopon (DE 53, Whatman, 32 ml ágytérfogat) tovább tisztítjuk. A terméket 15 ml startpufferben (pH 7,6) oldjuk, az oszlopra viszszűk és egy ágytérfogat A pufferrel mossuk. Több, mint 90% (az összfehérje-tartalomra vonatkoztatott) tiszta eglin- C eluálódik a 48-54. frakciókkal, mimellett lineáris sógradienst alkalmazunk [A puffén 20 mM ammónium-acetát (pH 7,6), 5 ágytérfogat; B puffén 200 mM ammónium-acetát (pH 5,0), 5 ágytérfogat; áramlási sebesség 42 ml/óra, frakciótérfogat 3,8 ml (5 perc)]. A tiszta frakciókat (izoelektromos fókuszálás alapján) egyesítjük és háromszor liofilizáljuk (kitermelés 18 mg). A kapott két eglint megvizsgáljuk és kémiailag jellemezzük a 27-30. példákban leírt módon.
Eredmények:
Eglin-C izoelektromos pont 6,5 molekulasúly (FAB-MS) 8091
N-terminális aminosav Thr
HLE-gátlás +
N°-acetil- izoelektromos pont 5,4
-eglin-C molekulasúly (FAB-MS) 8133 N-terminális aminosav Na-acetil-Thr
HLE-gátlás +
A transzformált élesztősejtekből kapott eglin-C HPLC-s retenciós ideje megegyezik az orvosi piócából kapott eglin-C retenciós idejével. A transzformált élesztősejtekből származó N“-acetiI-eglin-C és az E.coli-ból származó párjának retenciós ideje azonos. Az aminosavösszetétel és a többi adatok megfelelnek a várakozásnak.
38. példa
Saccharomyces cerevisiae GRF
18lpJDB207IPHO5-EGL fermentálása 30 l-es fermentorban
A Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB 207R/PHO5-EGL törzset 1,87 (OD«x>) értékhez tartozó sejtsűrűségig tenyésztjük az alábbi tápközegben (alacsony P() (koncentráció g vagy mg/1 oldatban kifejezve):
L-aszparagin«H2O 10 g
L-hisztidin 1,0 g
KH2PO4 0,03 g
MgSO4*7H2O 0,5 g
NaCl 0,1 g
KC1 1,0 g
CaCl2*2H2O 0,1 g
Cerelose (külön sterilizált) 20 g bórsav 50 mg
CuSO« 5 mg kálium-jodid 10 mg
FeCb 20 mg
MnSO4 40 mg nátrium-molibdenát 20 mg
ZnSO< 40 mg
kalcium-pantotenát 40 mg
folsav 5 mg
inozitol 200 mg
nikotinsav 40 mg
p-amino-benzoesav 20 mg
piridioxál-foszfát 40 mg
riboflavin 20 mg
tiamin 40 mg
biotinoldat (lOmg/lOOml 50%-os etanol).
Körülmények: pH-kontroll NaOH-dal; alsó határ pH 4,6, hőmérséklet 30 ’C.
óránként ellenőrzőmintákat (összesen 8, minden alkalommal 100 ml tápleves) veszünk. A sejteket mechanikailag elroncsoljuk és a tiszta felülúszókat ecetsavas kezelés után RP-HPLC-vel, PAGE-vel és HLE-gátlásra viszgáljuL óra fermentációs idő után optimális kitermelést érünk el (4,4 mg Na-acetil-eglin-C és 13,6 mg eglin-C 1 1 táplevesben). A PAGE-vel meghatározott látszólagos molekulasúly megfelel a várakozásnak.
A pH 5 alsó határérték ellenőrzése mellett és azonos körülmények között végzett 30 órás fermentációnál a két tennék aránya az eglin-C javára tolódik el (kitermelés: 6,4 mg/1; No-acetil-eglin-C kitermelés: 0,1 mg/1). A kapott élesztő-eglin-C-t és élesztő-N“-acetileglin-C-t homogenitásig tisztítjuk a 29. példában leírt módon.
IRODALOMJEGYZÉK
1. U. Seemüller et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 358,1105(1977)
2. R. Knecht et al., Anal. Biochem. 130,65 (1983)
3. AM. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977); siehe auch Meth. Enzym. 65, 499 (1980)
4. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)
5. Anagnostopoulos. et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)
6. M. Mandel et al., J. Mól. Bioi. 53,159 (1970)
7. U.K. Laemmli, Natúré 227,680 (1970)
8. S. Tsunasawa und F. Sakiyama, in Methods Enzymol. 106,165 (1984)
9. S. Alkan et al.. Mól. Immunoi. 20,203 (1983)
10. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam (1978)
11. S.A. Narang, Tetrahedron 39,3 (1983)
12. KL. Agarwal et al., Angew. Chem. 84, 489 (1972)
13. C.B. Reese, Tetrahedron 34,3143 (1972)
14. RL. Letsinger and W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98,3655 (1976)
15. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)
16. H.G. Khorana et al., J. Bioi. Chem. 251, 565 (1976)
17. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)
-381
HU 203 784 Β
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
K. Itakura et al., J. Bioi. Chem. 257,9226 (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Haibor Láb., 1982,
S. 125
A.E. Bolton und W.M. Hunter, Biochem. J. 133, 5 529 (1973)
DE-OS 3 111 405 (Genentech)
A.C. Peacock et al., Biochemistry 6,1818 (1967)
W. Müller et al., J. Mól. Bioi. 124,343 (1978)
M. Grunstein und D.S. Hogness, Proc. Natl. 1( Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979)
Ish-Horowitz, in loc. cit. 19), S. 368 Köhler und Milstein, Natúré 256,495 (1975)
H. Ako et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm., 46,1639(1972) 1í
H. Fritz et al., in: „Methoden dér enzymatischen Analyse” (Hrsgb. H.U. Bergmeyer), 3. Auflage, Weinheim 1974, S. 1105
S. Moore et al., J. Bioi. Chem. 192, 663 (1951), D.H. Spadman et al., Anal. Chem. 30, 1190 2( (1958)
30. H. Morris et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 117,299 (1983)
31. U. Seemüller et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 361,1841 (1980)
32. R. Knecht et al., Analyt. Biochem. 130, 65 (1983)
33. W.F. Brandt et al., Z. Physiol. Chem. 357, 1505 (1976)
34. A. Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 725 (1977)
35. R. Wetzel und D.V. Goeddel, in „The Peptides” (Hrsgb. E. Gross und J. Meienhofer), Academic Press, New York 1983, S. 1-64
36. J.G. Bieth, Bull. europ. physiopath. respirat. 16 (suppl.), 183 (1980)
37. L. Clarké und J. Carbon, J. Mól. Bioi. 120, 517 (1978)
38. D.S. Oppenheim und C. Yanofsky, J. Mól. Bioi. 144,143 (1980)

Claims (10)

1. Eljárás (XIV) általános képletű eglinszármazékok (MeOr-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu
TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B’
- a képletben B jelentése egyes kötés vagy a természetes eglin-N- terminálistól számított 1—10 aminosavgyököt tartalmazó csoport, például a SerPhe-, LeuLysSerPhe-, SeiGluLeuLysSerPhe-, PheGlySeiGluLeuLysSerPhe- vagy ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhecsoportok közül az egyik, és B’ jelentése semmi vagy peptidcsoport, amely a természetes eglin-C-teiminálisától számított 1-6 aminosav építőkövet tartalmaz, például a -HisVal-, -HisValProHis- vagy -HisValProHisValGly-csoportok közül az egyik, W jelentése Tyr vagy His, és r jelentése 0 vagy 1, mimellett azokban a (XIV) általános képletű vegyületekben, ahol a képletben r 40 jelentése 0, az N-terminális aminosav adott esetben acetilezett - és sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, baktériumokban, illetve élesztőkben működő expressziós kontrollszekvencia által szabályozott eglinstruktúigént tartalmazó expressziós plazmiddal transz- 45 formált baktérium vagy élesztőgazda-sejtet asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztünk és a terméket a gazdasejtekből szabaddá tesszük és izoláljuk, és kívánt esetben a (XIV) általános képletű vegyületek - ahol a képletben r je- 50 lentése 0 és az N-terminális aminosav acilezett - előállítására, valamely szabad N-tenninális aminocsoportot tartalmazó, a fenti eljárás szerint kapott (XIV) általános képletű vegyületet acetilezünk, és kívánt esetben a kapott (XIV) általános képletű N-terminális me- 55 tionilcsoportot tartalmazó eglinszármazék metionilcsoportját brúm-ciánnal lehasítjuk, és/vagy kívánt esetben a kapott (XTV) általános képletű, N-terminális acetilezett aminocsoportot tartalmazó vegyület acetilcsoportját enzimesen lehasítjuk, és ha szükséges, az eljárás 60 szerint kapott (XIV) általános képletű vegyületek keverékét az egyes komponensekre szétválasztjuk, és/vagy kívánt esetben a kapott sót szabad polipeptidekké vagy a kapott polipeptidet annak sójává alakítjuk. (Elsőbbsége: 1984. 11. 20.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (XIV) általános képletű vegyületek és sóik előállítására, amelyeknek képletében B jelentése a LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe- vagy ThiGluPheGlySeiGluLeuLysSerPhe-peptidcsoportok közül az egyik, és B’ jelentése a -HisValProHisValGly-csoport, W jelentése Tyr és r jelentése 0 vagy 1, továbbá olyan (XTV) általános képletű eglin- B-származékok és sóik előállítására, amelyeknek képletében B jelentése a ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-peptidcsoport és B’ jelentése a -HisValProHisValGly-peptidcsoport, W jelentése His és r jelentése 0 vagy 1, mimellett azokban a (XIV) általános képletű vegyületekben, ahol a képletben r jelentése 0, az N-terminális aminosav adott esetben acilezett, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárást alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984.11.20.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (XIV) általános képletű vegyületek és sóik előállítására, amelyeknek képletében B jelentése N-acetil-SerGluLeuLysSerPhe-, ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- vagy Nacetil-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- és B’jelentése -HisValProHis ValGly, W jelentése Tyr és r jelentése 0, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárást alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984.11.20.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás eglin előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárást alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1983.11.21.)
-391
HU 203 784 Β
5 hordozó- és/vagy segédanyagokkal keverjük. (Elsőbbsége: 1984.04.13.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás N“-acetil- eglin-C előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárást alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 04. 13.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott N-terminális metionilcsoportot tartalmazó (XIV) általános képletű vegyületben a metionilcsoportot brómciánnal lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1984. 04. 13.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott N-terminális acetílezett aminocsoportot tartalmazó (XIV) általános képletű vegyületben az acetilcsoportot enzimatikusan lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1984.04.13.)
8. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (XTV) általános képletű vegyületeket vagy azok farmakológiailag elviselhető sóit farmakológiailag elviselhető
9. Tesztkit eglin-proteáz inhibitorok meghatározására, azzal jellemezve, hogy hibridomasejtekben termeltetett monoklonális anti-eglin antitesteket, puffereket,
10 szubsztrátot, standardokat, továbbá adott esetben mikrotitráló-lemezt és/vagy adott esetben táblázatot vagy kalibrációs görbét tartalmaz. (Elsőbbsége: 1983.11.21.)
HU844308A 1983-11-21 1984-11-20 Process for producing egline and egline derivatives and pharmaceutical compositions containing them and testcit for determining egline HU203784B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH642283 1983-11-21
CH186384 1984-04-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT36864A HUT36864A (en) 1985-10-28
HU203784B true HU203784B (en) 1991-09-30

Family

ID=25688872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU844308A HU203784B (en) 1983-11-21 1984-11-20 Process for producing egline and egline derivatives and pharmaceutical compositions containing them and testcit for determining egline

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20020142414A1 (hu)
EP (1) EP0146785B1 (hu)
JP (1) JPH0730119B2 (hu)
KR (1) KR850004791A (hu)
AR (1) AR241800A1 (hu)
CA (1) CA1297437C (hu)
DE (1) DE3481320D1 (hu)
DK (1) DK550984A (hu)
ES (1) ES8608580A1 (hu)
FI (1) FI86744C (hu)
GR (1) GR80965B (hu)
HU (1) HU203784B (hu)
IE (1) IE57895B1 (hu)
IL (1) IL73569A (hu)
NO (1) NO172547C (hu)
NZ (1) NZ210267A (hu)
PT (1) PT79519B (hu)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61152695A (ja) * 1984-12-26 1986-07-11 Nippon Shinyaku Co Ltd 長鎖ｄｎａの合成法
JPS6339414U (hu) * 1986-08-29 1988-03-14
EP0263072B1 (en) 1986-10-03 1994-03-23 Ciba-Geigy Ag Novel lymphokine related peptides
EP0332576B1 (de) * 1988-03-07 1994-04-06 Ciba-Geigy Ag Modifizierte Proteine
US5180667A (en) * 1988-03-07 1993-01-19 Ciba-Geigy Corporation Genes encoding eglin C mutants
DE3939801A1 (de) * 1989-12-01 1991-06-06 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
US5604201A (en) * 1993-01-08 1997-02-18 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University, A Non-Profit Organization Methods and reagents for inhibiting furin endoprotease
JP2013192526A (ja) * 2012-03-22 2013-09-30 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物
CN108456708A (zh) * 2018-06-20 2018-08-28 齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司 一种发酵制备苏氨酸的培养基
EP4225337A1 (en) * 2020-10-06 2023-08-16 Mayo Foundation for Medical Education and Research Methods and materials for treating gastrointestinal disorders
US11187700B1 (en) * 2021-01-28 2021-11-30 Eckhard Kemmann Closed system for enlarging viral and bacterial particles for identification by diffraction scanning

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2808396C2 (de) * 1978-02-27 1984-04-19 Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn Protease-Inhibitoren

Also Published As

Publication number Publication date
FI86744C (fi) 1992-10-12
ES537829A0 (es) 1986-06-16
US20020142414A1 (en) 2002-10-03
CA1297437C (en) 1992-03-17
ES8608580A1 (es) 1986-06-16
IE842966L (en) 1985-05-21
GR80965B (en) 1985-03-20
FI844545L (fi) 1985-05-22
DE3481320D1 (de) 1990-03-15
IL73569A (en) 1991-05-12
PT79519A (en) 1984-12-01
JPH0730119B2 (ja) 1995-04-05
DK550984D0 (da) 1984-11-20
JPS60192592A (ja) 1985-10-01
EP0146785A1 (de) 1985-07-03
NO844617L (no) 1985-05-22
NO172547C (no) 1993-08-04
AU596347B2 (en) 1990-05-03
NO172547B (no) 1993-04-26
AU3571884A (en) 1985-05-30
NZ210267A (en) 1988-11-29
DK550984A (da) 1985-05-22
EP0146785B1 (de) 1990-02-07
HUT36864A (en) 1985-10-28
AR241800A1 (es) 1992-12-30
PT79519B (en) 1986-12-11
FI844545A0 (fi) 1984-11-19
KR850004791A (ko) 1985-07-27
IE57895B1 (en) 1993-05-05
FI86744B (fi) 1992-06-30
IL73569A0 (en) 1985-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR920009522B1 (ko) 트롬빈 억제제의 제조방법
KR920002267B1 (ko) 하이브리드 인터페론의 제조방법
FI86547B (fi) Foerfarande foer framstaellning av en peptid som verkar farmakologiskt pao hjaercirkulationen eller skelettaemnesomsaettningen.
JPH09188698A (ja) 新規リンホカイン関連ペプチド
HU203784B (en) Process for producing egline and egline derivatives and pharmaceutical compositions containing them and testcit for determining egline
US6875589B1 (en) Mini-proinsulin, its preparation and use
WO1994001461A9 (en) BOVINE PANCREATIC TRYPSIN INHIBITOR DERIVED INHIBITORS OF FACTOR Xa
HU209146B (en) Method for producing desulphato-hydrudine
EP0651766A1 (en) BOVINE PANCREATIC TRYPSIN INHIBITOR DERIVED INHIBITORS OF FACTOR Xa
US5869264A (en) Immunoassays for and immunopurification of interferon-induced human protein
JPH0356499A (ja) 新規なサイトカイン
US6342373B1 (en) Process for preparing recombinant eglin, protease inhibitor
CA1340289C (en) Interferon-induced human protein in pure form, monoclonal antibodies thereto, and test kits containing these antibodies
JPH0272877A (ja) Ｄｎａおよびその用途
US6407209B1 (en) Interferon-induced human protein in pure form, monoclonal antibodies thereto and test kits containing these antibodies
EP0339285A2 (en) Recombinant endonexin II
DD233853A5 (de) Verfahren zur herstellung von eglin-verbindungen

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG (NOVARTIS SA, NOVARTIS INC.), CH

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee