PT85560B

PT85560B - Processo para o isolamento, para a preparacao por tecnicas recombinantes e para a purificacao, de um receptor fce-humano de baixa afinidade

Info

Publication number: PT85560B
Application number: PT85560A
Authority: PT
Original assignee: Kishimoto Tadamitsu
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1987-08-20
Publication date: 1990-05-31
Also published as: NO873512D0; IL83594A0; JPS6427496A; EP0259615A1; DK434287D0; FI873614A0; AU7716587A; NZ221501A; FI873614A; PT85560A; DK434287A; NO873512L; HUT44620A

Description

Os receptores para a porção Fe de imunoglobulinas (FcR) são expressos por várias linhagens de células hematopoiéticas e fornecem uma importante ligação entre moléculas de anticorpo e as suas funções de execução, tais como intemalização dos complexos ligando-receptor, citólise mediada por anticorpo de células visadas e a libertação de mediadores inflamatórios, A expressão de receptores Fc tem sido também demonstrada nos linfócitos T e B, sugerindo um papel possível para os FcR na regulação da resposta imunitária bem como o en volvimento de factores de ligação de imunoglobulina (lg),tais como factores de ligação de IgE, IgA e IgG, em regulação espe cífica isotípica da resposta de anticorpo. Até agora nenhuns receptores Fc ou genes que codificam para receptores Fc foram ainda isolados, apesar de serem conhecidas duas espécies de receptores Fc para IgE (Fc£ r) que diferem em estrutura e função , nomeadament e

a) Receptores Fc^ de alta afinidade nos basófilos e bastone- 1 r ¹

tes e

b) Receptores Fc de baixa afinidade nos linfócitos e monócitos.

Verificou-se que o receptor Fc^ de baixa afinidade era uma proteína de membrana insolúvel com a inabitual e inesperada característica de ter um terminal N no citoplasma e um terminal C fora da célula, ao contrario dos receptores conhecidos. Além disso, um aumento de FcgR solúvel em água (uma parte do conjunto do receptor Fcg· de baixa afinidade) na forma de um complexo com IgE foi observada no soro de pacientes atópicos.

Esta invenção diz respeito ao receptor Fcg. de baixa afinidade humano cuja parte solúvel em água, começa com aminoácidos a partir de cerca de 50 até cerca de 150 do conjunto do receptor Fc^, de preferência com a sequência Met-Glu-^eu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Vai- N-terminal e seus derivados glicosilados, o seu isolamento e purificação, pelo que os seguintes aspectos são descritos em pormenor a seguir:

a) Isolamento e purificação da parte solúvel em água, do facctor de ligação IgE (Fc^R) secretado ou libertado pelas células linfoblastoides;

b) Sequenciação parcial da parte solúvel em água, do receptor Fc£ de baixa afinidade humano isolado de acordo com a) por meio de hidrólise, isolamento dos fragmentos assim obtidos e determinação das sequências dos fragmentos assim obtidosj

c) Preparação de duas sondas de hibridação:

Sonda 1: Preparação de cADN específico de transformante de célula L Fc£⁺ usando uma substracção cíclica múltipla com mARN de células Ltk ;

Sonda 2: Preparação de um oligonucleótido que codifica para uma das ditas sequências parciais isoladas de acordo oom b), de preferência de uma mistura de oligonucleótidos da fórmula τ

3'-TTç ACC TAG ττ£ AAç GT -5'

A .

que codifica para a sequência de aminoácidos da fórmula

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln;

d) Isolamento e identificação de veículos de expressão conten do o gene que codifica para o receptor Fc^ de baixa afinidade humano, compreendendo as fases de síntese de cADN a partir de uma matriz de ARN derivada de células linfoblastoides que produzem mARN de receptor Fc^, incorporação do dito cADN sinetisado em veículos de expressão para formar um banco de veículos de expressão, hibridação do dito cADN incorporado para identificar esses veículos de expressão que contêm um gene que codifica para re ceptor Fcg , com duas sondas marcadas compreendendo cADN específico para células L Fc^R⁺ e um oligonucleótido comum para o gene do receptor Fc^ de baixa afinidade, e replicação do gene de receptor Fc£ assim obtido;

e) Expressão do cADN de Fc^R;

f) Determinação do gene que codifica para o receptor Fc^ de baixa afinidade humano, utilizando uma sequência de cADN isolado obtida dos veículos da operação e) de acordo com os meto dos de sequenciação de Sanger et al. e o método de clivagem química de Maxam e Gilbert;

g) Expressão de mARN de Fc^R;

h) Preparação de um vector de expressão contendo as sequências de ADN que codificam para o fragmento solúvel em água do rece ptor Fc_£ , os seus derivados O-glicosilados e expressão do dito fragmento solúvel em microorganismos ou em células de mamí feros; e

i) Uso de polipeptideos expressos para o tratamento de reacções alérgicas IgE locais e sistémicas e as composições fama-

- 3 cêuticas que contêm esses polipeptideos.

a) Isolamento e purificação da parte solúvel em água de Fcg.R

As células linfoblastoides B humanas tais como as células RPMI 8866 segregam F<^R de cerca de 46 kd na sua superfície e libertam uma espécie de cerca de 25 kd no sobrenadante da cultura. Verificou-se que a actividade de Fc^R segregado ou libertado pelas células linfoblastoides, p. ex.,ce lulas RPMI-8866, como detectado pelo método de ELISA (Figura 1) utilizando dois anticorpos monoclonais diferentes (ver Pedido de Patente Europeia NS 86 110 420.6 do mesmo requerente, registado em 29 de Julho de 1986) era mais alta no sobrenadan te da cultura concentrada quando comparada com receptores de membrana solubilizados por detergente NP-40 mesmo que um núme ro igual, p. ex., 10^ células/ml, fosse utilizado para preparar Fc^R. Além disso, quando os sobrenadantes purificados por afinidade foram cromatografados por SDS-PAGE sob condições não redutoras e a actividade de Fc^R foi eluída de porções de gel correspondendo a pesos moleculares definidos, observava-se ac tividade (Figura 2) nas regiões de 45-46 kd e de 24-25 kd. De facto, os sobrenadantes de cultura concentrada continham uma proporção de actividade mais alta na região de 25 kd. Por con seguinte os sobrenadantes de cultura livres de soro foram usa dos como fonte do receptor.

Para a purificação por imunoafinidade sequencial de Fc^ R com um peso molecutar de cerca de 25 kd usaram-se colunas de imunoafinidade que foram preparadas utilizando 10 mg/ml de anticorpo monoclonal purificado acoplado a esferas de Sapharose 4b (Pharmacia, Piscataway, N.J.) como descri to pelo fabricante,

A adsorção sequencial de sobrenadante de cultura concentrado 200-250 x em BSA-Sepharose, em transferrina-Sepharose e IgG de rato normal-Sepharose deu origem a cerca de 7θ por cento da actividade original sem contudo melhorar a

actividade específica. Como se mostra no Quadro 1, a seguir à pré-adsorção o material receptor foi deixado ligar-se a uma coluna de 3-5-Sepharose durante 4-16 horas, a actividade total do eluido com ácido acético foi reduzida mas a actividade específica aumentou até 83 unidades/jig e a pureza aumentou IPO vezes. Purificação posterior do receptor por cromatografia de fase reversa por HPLC em coluna C-4 usando um gradiente linear de 0-65% de acetonotrilo e 0,1% de ácido trifluoroacético aumentou a actividade específica para 1630 unidades/ p.g e o receptor foi purificado 3710 vezes. Contudo a recupera ção final foi somente 33 por cento do original. Como se vê no Quadro 1 usou-se um esquema de purificação semelhante para Fc^R de membrana solubilizado por detergente mas a actividade específica obtida foi consistentemente mais baixa do que a observada com os sobrenadantes da cultura. É importante notar que a escolha do tampão de eluiçao era crítica para o nível da recuperação, eluiçao com ácido acético a 2,5 por cento com rápida neutralização foi importante no rendimento final do re ceptor.

Como indicado no Quadro 1 a purificação por imunoafinidade de Fc^R utilizando os anticorpos monoclonais específicos na fase solida não foi suficiente para obter o re ceptor puro, como medido por uma banda simples em SDS-PAGE. Contudo, o Fc^R eluido de fresco foi posteriormente purificado por meio de Purificação de Fase Reversa por HPLC. O Fc^R eluido de fresco foi carregado preparativamente numa coluna C-4 e cromatografado, utilizando um gradiente linear de aceto nitrilo de O-65 por cento; o perfil cromatográfico é apresentado na Figura 3, fracções obtidas a vários tempos de retenção foram testadas por ELISA para a actividade de Fc^R. Verificou-se que o grosso do Fc^.R foi eluido pelo acetonitrilo a uma concentração entre 44 e 45 por cento. Quando se recolheram amostras de 0,5 ml a actividade de FcgR correspondia ao pico tracejado indicado na Figura 3* A análise cromatográfica repetida da fracção activa mostrou um pico aguçado simples in ’ dicando a presença de uma mistura homogénea de receptor. As • fracções obtidas a diferentes tempos de retenção foram também

monitorizadas por análise SDS-PAGE.

Por conseguinte, o sobrenadante de cultura concentrado (sob bruto) contendo o suposto Fc^R e o material eluido de imunoafinidade e da coluna de HPLC C-4 foram testados depois de diálise e liofilização numa SDS-PAGE a 10% como descrito abaixo. Os resultados indicam a presença de bandas múltiplas na pista do sob concentrado bruto. Pode ver-se uma banda larga correspondendo a 22-24 kd.

A metade de receptor recolhida depois de purificação sequencial em geis de imunoafinidade não específica e específica mostra ainda bandas múltiplas ainda que a activi dade de tais eluídos seja substancialmente mais alta do que a do material bruto. A actividade de Fc^ R (Figura 4) obtida depois de purificação por HPLC C-4 mostrou uma única banda correspondendo a 25 kd e o material purificado deste modo mos trou actividade muito alta na análise ELISA utilizando os anticorpos monoclonals. Ê importante notar que a banda de 25 kd corresponde à espécie menor de Fc^R detectado pelos mesmos an ticorpos monoclonais depois de iodinaçao de superfície e imunoprecipitação do Fc^R utilizando os mesmos anticorpos, sugerindo que as metades 46 e 25 kd são antigenicamente idênticas, sendo a última a parte solúvel em água de Fc^R.

Como a purificação da actividade de ligação de IgE a partir de sobrenadantes de cultura de células RPMI-8866 implica várias fases, foi necessário verificar a activi dade imunológica do suposto Fc R nas várias fases da purifica ção. Quantidades iguais de Fc^R purificado por HPLC foram apili cadas de novo em géis de 3-5-imunoafinidade específicos e de IgRN-Sepharose não específicos e a actividade foi monitorizada no efluente e no eluido desses géis. Os resultados apresen tados no Quadro 2 indicam que o material purificado òbviamente liga-se à. coluna específica e quase toda a actividade é re colhida no eluido, comparado com o gel não específico onde to • da a actividade disponível se encontra no efluente e uma porção menor no eluido. Pode também ver-se que uma boa porção da actividade é fracamente associada ao gel não específico e é perdida durante a lavagem.

b) Sequeneiação parcial da parte solúvel em água de Fc^R

Fc£R preparado depois de purificação sequen ciai do sobrenadante da cultura de células concentrado utilizando géis de imunoafinidade e HPLC C-4 correspondendo a uma banda única em SDS-PAGE e activa na análise de ELISA foi submetido a uma sequeneiação de atninoácidos. Duas preparações proteolíticas diferentes foram feitas utilizando tripsina e lisilendopeptidase. Um total de 11 e 12 fragmentos foram obti dos com o tratamento de tripsina e de lisilendopeptidase respectivamente. O perfil de HPLC da fragmentação de lisilendope ptidase mostrado na Figura 5 indica 12 picos maiores correspondendo a fragmentos definidos de Fc^R. Foram obtidos os seguintes fragmentos seleccionados:

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-(N-terminal),

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-AsnTrp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-,

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-LeuAsp-Leu-Lys- e

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-.

c) Preparação das sondas de hibridação

Sonda I (cADN específico para células L positivas de F<^ R) s

Células L deficientes em timidina-quinase, cé lulas Ltk”, foram co-transfectadas com ADN de elevado peso mo lecular a partir de células RPMI-8866 e de gene TK derivado do vírus Herpes-simplex. Depois de selecção HAT os transformantes positivos TK foram corados com anticorpo (8-30) de anti-Fcu R biotinado e avidina ITCE e seleccionadas por um seleç cionador de células. As células L positivas Fc^R foram enriquecidas por vários ciclos de selecçao. Duas linhas transformadas de células L, L-V-8-30 e L-VI-8-30 que expressam Ec^R detectado por anti-Ec R(8-3O), foram estabelecidas a partir de duas experiências de transfecção independentes, A Fig. 6 mostra análises FACS dessas duas linhas transformadas que foram coradas com anti-Fc^R bem como com IgE humana.

ARN total foi preparado a partir de células L-V-8-30 pelo método de isocianato de guanidina/cloreto de cé sio (ver Biochemistry 18, 529^ (1979))· θ ADN complementar do mARN das células L-V-8-30 foi sintetisado usando a enzima transcriptase inversa sobre um iniciador oligo (dt). O cADN 32 foi marcado por incorporação de 0(e- P-deoxi-CTP nesta reacção. 32 cADN marcado com P foi misturado e hibridado com ARN po1í(a)⁺ derivado de células Ltk num excesso de 10 vezes. A mis tura citada foi aplicada numa coluna de hidroxiapatite e o cADN de cadeia simples não terminal foi de novo hibridado com Po1í(a)⁺ ARN de células Ltk . 0 cADN de cadeia simples que é

Sonda II5 Uma mistura de oligonucleótidos da fórmula T y-ττΐ acc tag τί£ AAÍ^- GT -5' v . Ir tr

A foi sintetisada por meio de um sintetisador ADI ao nível de 0,2 ^iMol de acordo com métodos conhecidos. 0 oligonucleótido obtido que codifica parcialmente para a sequência de aminoáci dos da fórmula

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln foi usado como sonda marcada para detectar o gene para receptor Fc^ num veículo de expressão.

d) Isolamento e identificação de veículos de expressão conten~ do o gene que codifica para o Fc_f R de baixa afinidade humano

Células RPMI-8866 em crescimento exponencial, são desintegradas em solução de isocianato de guanídio. Isola -se o mARN por centrifugação num gradiente de cloreto de césio, extracção com fenol e precipitação com etanol. Depois, o ARN poli(A)⁺ é isolado por cromatografia de celulose oligo (dt) .

A construção de cADN de dupla cadeia é realizada de acordo com Gubler e Hoffman (Gene 25, 2ó3 (1983))· 0

ARN poli(A)⁺ é usado como uma matriz para a preparação de cACN de dupla cadeia usando transcriptase inversa e um iniciador oligo (dt). Depois de tratamento com RNase H, a segunda cadeia de ADN é sintetisada por meio de polimerase I de ADN. A sínte se da primeira e da segunda cadeia de ADN foi realizada numa solução contendo uma mistura de trifosfatos de deoxinucleótidos de adenosina, timidina, guanosina e citidina. A mistura de cADN de dupla cadeia obtida foi depois modificada por meio da enzima polimerase de ADN T4 para remover quaisquer pequenas saliências 3' restantes da primeira cadeia.de ADN. Os ligantes EcoRI foram adicionados e ligados ao cADN de dupla cadeia usando a enzima ligase T4. Os cADN mais compridos que 1000 pb são fraccionados e os ligantes em excesso foram removidos por uma coluna de cromatografia de Bio-Gel A-50 m. Os cADN fraccionados em função da dimensão foram ligados ao ADN de vector fago Xgt 10 digerido por EcoRI. Os vectores de Aã'*' 10 contendo o cADN foram carregados in vitro e foram infectados com uma estirpe de Escherichia coli OóOO hfl.

De entre as placas assim obtidas, aquelas que contêm sequências específicas para Fc&R foram identificadas por hibridação de colónia, para o que se usaram duas sondas diferentes:

1. cADN de transformante específico de Ec^R⁺.

2. Oligonucleótidos sintéticos marcados radioactivamente da fórmula

T y-rr? ACC TAG tt£ aa£ GT -5' v . li u·

A í

I

Foram identificados 23 de aproximadamente

300 000 clones que hibridam com ambas as sondas e todas as in serções de cADN hibridavam-se umas com as outras. De entre os cADN*s nesses clones, elegeu-se a maior inserção cADN (apròxi madamente 1600 kb).

A inserção EcoRI do clone de ADN recombinante de Xgt 10 foi marcada por translação de ^wnick^M usando 0C- P-dCTP e analisado por hibridação de Northem com mARN de várias células incluindo RPMI-8866, Daudi, CEM, células L Fc^R* e células Ltk. A inserção hibridou somente com mARN de células de FcçR positivas tais como RPMI-8866 e células L Fc^R · Esta inserção foi clonada num sítio mega Biotec), designada por pFc^R-1

EcoRI de vector pGEM4 (Pro e propagada.

e) Expressão do cADN de Fc^R

A inserção de EcoRI contendo cADN de Fc^R que foi isolada do clone àgt 10 acima descrito, foi ligada ao vector plasmídico pGEM^í· digerido com EcoRI (ver Fig. 9)» desi gnado por LE392 e depositado em E.coli em 1 de Agosto de 1936 sob o número FERM BP-1116 (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Tecnology, Japan) de acordo com a convenção de Budapest. Uma vez que este vector contém ambos os promotores SP6 e T7 em orientação oposta um em relação ao outro, cADN de FctR pode ser fàcilmente transcrito em mARN seja por ARN-polimerase SP6 ou T7. Portanto, pGEM4 contendo cADN de Fc^R foi digerido com BamHl e o plasmídio ADN obtido foi usado como um molde para sintetisar o mARN pela po limerase de ARN SP6, eo ARN resultante (5 Jig) foi injectado em cócitos de Xenopus. Depois de 2 dias de incubação, os cóci tos foram lisados e a presença de Fc^R foi determinada por uma análise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA) utilizan do dois anticorpos de anti-FcgR, 3”5 e 8-30, que reconhecem diferentes epítetos em Fc^.R. Como se mostra na Fig. 9» o lisa do de 10 cócitos injectados com a transcrição de ARN de pFc^-l mostrou níveis de Fc^R comparáveis aos derivados de 1x10^ células RPMI-8866, Por outro lado, o lisado de cócitos injecta do em falso não mostrou qualquer actividade. Este resultado indica que o produto de cADN de pFcfR-1 partilha os dois determinantes antigénicos diferentes com Fc^R reconhecido pelos anticorpos monoclonais.

Um vector de expressão adicional, por exemplo pDE2 (ver Publicação de Patante Japonesa 1986/88879 d® 7 de Maio de 1986), que contam dois promotores precoces se SV4o em orientação oposta um em relação ao outro para garantir a expressão de cADN em qualquer das orientações (Fig. 8) foi empregue para confirmar que pFc^ R-l inclui a sequência de codificação inteira de Fc^R. O segmento de ADN entre os dois promotores precoces Sv4o foi removido pela digestão de EcoRI e substituido com a inserção cADN de pFc^R-1 (pDE2-FC£R-l). As células Cos7 foram transfectadas com 2 pg/ml de pDE2 contendo cADN de Fc^R pelo método destrano DEAE. Depois de dois dias de cultura, as células foram duplamente coradas com anti-Fc^R e IgE humano e analisadas com um FACS de laser dual. Gomo se mostra na Fig. 8’, aproximadamente 30$ das células transfecta das com pDE2-Fc£ R-l foram marcadas por ambos anti-Fc^R e IgE humano. Além disso a coloração com anti-Fc^R e com IgE humano estavam bem correlacionados, demonstrando que anhos anti-Fc^R e IgE humano confinam com a mesma molécula(s) que é expressa de novo na superfície de células transfectadas. Na verdade, células transfectadas com o vector pDE2 de controle contendo oADN de TfN-$ humano não coram com qualquer dos anti-Fc^R ou IgE humano. Estes resultados confirmam que o cADN isolado actualmente codifica para a molécula Fc^R.

f) Determinação da sequência de nucleotido completa do cADN de Fc^R e da sequência de proteína deduzida

A sequência de nucleótido completa da inserção de EcoRI de pFcpR-l foi determinada usando o método de te_r minação dideoxi (ver Sanger et al. in Proc. Natl. Acad. Sei.

74. 5463-5467 (1977)) e o método de clivagem química (ver Maxam e Gilbert in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 500-564

(1977))· A sequência de nucleótido completa e a sequência de aminoácidos deduzida são apresentados no Quadro 3, em que a sequência de codificação apresenta a seguinte fórmula:

10 15

Met

Glu

Gly

Gin

Tyr

Ser

Glu

11 e

Glu

Leu

Pro

Arg

ATG

GAG

GAA

GGT

CAA

TAT

TCA

GAG

ATC

GAG

CTT

CCC

AGG

TAC

CTC

CTT

CCA

GTT

ATA

AGT

CTC

TAG

CTC

GAA

GGG

TCC

20

25

30

Arg

Cys

Arg

Gly

Thr

Gin

11 e

Vai

Leu

Gly

Leu

Vai

GGG

TGT

TGC

AGG

CGT

GGG

ACT

CAG

ATC

GTG

CTG

GGG

CTG

GTG

GCC

ACA

ACG

TCC

GCA

CCC

TGA

GTC

TAG

CAC

GAC

CCC

GAC

CAC

35

4o

45

Thr

Ala

Leu

Trp

Ala

Gly

Leu

Thr

Leu

Trp

ACC

GCC

GCT

CTG

TGG

GCT

GGG

CTG

ACT

CTG

CTT

CTC

CTG

TGG

CGG

CGA

GAC

ACC

CGA

CCC

GAC

TGA

GAC

GAA

GAG

GAC

ACC

50

55

60

His

Trp

Agp

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Gin

Leu

Glu

Arg

Ala

CAC

TGG

GAC

ACC

ACA

CAG

AGT

CTA

AAA

CAG

CTG

GAA

GAG

AGG

GCT

GTG

ACC

CTG

TGG TGT

GTC

TCA

GAT

TTT

GTC

GAC

CTT

CTC

TCC

CGA

65

70

75

Ala

Arg

Asn

Vai

Ser

Gin

Vai

Ser

Lys

Asn

Leu

Glu

Ser

His

GCC

CGG

AAC

GTC

TCT

CAA

GTT

TCC

AAG

AAC

TTG

GAA

AGC

CAC

CGG

GCC

TTG

CAG

AGA

GTT

CAA

AGG

TTC

TTG

AAC

CTT

TCG

GTG

80

85

90

Gly

Asp

Gin

Met

Ala

Gin

Lys

Ser

Gin

Ser

Thr

Gin

11 e

Ser

Gin

GGT

GAC

CAG

ATG

GCG

CAG

AAA

TCC

CAG

TCC

ACG

CAG

ATT

TCA

CAG

CCA

CTG

GTC

TAC

CGC

GTC

TTT

AGG

GTC

AGG

TGC

GTC

TAA

AGT

GTC

95

100

105

Glu

Leu

Glu

Leu

Arg

Ala

Glu

Gin

Arg

Leu

Lys

Ser

Gin

GAA

CTG

GAG

GAA

CTT

CGA

GCT

GAA

CAG

AGA

TTG

AAA

TCT

CAG

CTT

GAC

CTC

CTT

GAA

GCT

CGA

CTT

GTC

TCT

AAC

TTT

AGA

GTC

110

115

120

Asp

Leu

Glu

Leu

Ser

Trp

Asn

Leu

Asn

Gly

Leu

Gin

Ala

Asp

Leu

GAC

TTG

GAG

CTG

TCC

TGG

AAC

CTG

AAC

GGG

CTT

CAA

GCA

GAT

CTG

AAC

CTC

GAC

AGG

ACC

TTG

GAC

TTG

CCC

GAA

GTT

CGT

CTA

GAC

^er

125

130

135

Ser

Phe

Lys

Ser

Gin

Glu

Leu

Asn

Glu

Arg

Asn

Glu

Ala

Ser

AGC

TTC

AAG

TCC

CAG

GAA

TTG

AAC

GAC

AGG

AAC

GAA

GCT

TCA

TCG

AAG

TTC

AGG

GTC

CTT

AAC

TTG

CTC

TCC

TTG

CTT

CGA

AGT

14o

145

150

Asp

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Glu

Vai

Thr

Lys

Leu

Arg

Met

GAT

TTG

CTG

GAA

AGA

CTC

CGG

GAG

GTG

ACA

AAG

CTA

AGG

ATG

CTA

AAC

GAC

CTT

TCT

GAG

GCC

CTC

CAC

TGT

TTC

GAT

TCC

TAC

155 16ο 165

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAG

TTG

CAG

GTG

TCC

AGC

GGC

TTT

GTG

TGC

AAC

ACG

TGC

COT

GAA

CTC

AAC

GTC

CAC

AGG

TCG

CCG

AAA

CAC

ACG

TTG

TGC

ACG

GGA

CTT

170

175

180

Lys

Trp

11 e

Asn

Phe

Gin

Arg

Lys

Cys

Tyr

Phe

Gly

Lys

Gly

AAG

TGG

ATC

AAT

TTC

CAA

CGG

AAG

TGC

TAC

TTC

GGC

AAG

GGC

TTC

ACC

TAG

TTA

AAG

GTT

GCC

TTC

ACG

ATG

AAG

CCG

TTC

CCG

185

190

195

Thr

Lys

Gin

Trp

Vai

His

Ala

Arg

Tyr

Ala

Cys

Asp

Met

Glu

ACC

AAG

CAG

TGG

GTC

CAC

GCC

CGG

TAT

GCC

TGT

GAC

ATG

GAA

TGG

TTC

GTC

ACC

CAG

GTG

CGG

GCC

ATA

CGG

ACA

CTG

TAC

CTT

200

205

210

Gly

Gin

Leu

Vai

Ser

11 e

His

Ser

Pro

Glu

Gin

Asp

Phe

Leu

GGG

CAG

CTG

GTC

AGC

ATC

CAC

AGC

CCG

GAG

CAG

GAC

TTC

CTG

CCC

GTC

GAC

CAG

TCG

TAG

GTG

TCG

GGC

CTC

GTC

CTG

AAG

GAC

215

220

225

Thr

Lys

His

Ala

Ser

His

Thr

Gly

Ser

Trp

11 e

Gly

Leu

Arg

Asn

ACC

AAG

CAT

GCC

AGC

CAC

ACC

GGC

TCC

TGG

ATT

GGC

CTT

CGG

AAC

TGG

TTC

GTA

CGG

TCG

GTG

TGG

CCG

AGG

ACC

TAA

CCG

GAA

GCC

TTG

230

235

240

Leu

Asp

Leu

Lys

Gly

Glu

Phe

11 e

Trp

Vai

Asp

Gly

Ser

His

Vai

TTG

GAC

CTG

AAG

GGA

GAG

TTT

ATC

TGG

GTG

GAT

GGG

AGC

CAT

GTG

AAC

CTG

GAC

TTC

CCT

CTC

AAA

TAG

ACC

CAC

CTA

CCC

TCG

GTA

CAC

245

250

255

Asp

Tyr

Ser

Asn

Trp

Ala

Pro

Gly

Glu

Pro

Thr

Ser

Arg

Ser

Gin

GAC

TAC

AGC

AAC

TGG

GCT

CCA

GGG

GAG

CCC

ACC

AGC

CGG

AGC

CAG

CTG

ATG

TCG

TTG

ACC

CGA

GGT

CCC

CTC

GGG

TGG

TCG

GCC

TCG

GTC

2Ó0

265

270

Gly

Glu

Asp

Cys

Vai

Met

Arg

Gly

Ser

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

GGC

GAG

GAC

TGC

GTG

ATG

CGG

GGC

TCC

GGT

CGC

TGG

AAC

GAC

CCG

CTC

CTG

ACG

CAC

TAC

GCC

CCG

AGG

CCA

GCG

ACC

TTG

CTG

275

280

285

Ala

Phe

Cys

Asp

Arg

Lys

Leu

Gly

Ala

Trp

Vai

Cys

Asp

Arg

Leu

GCC

TTC

TGC

GAC

CGT

AAG

CTG

GGC

GCC

TGG

GTG

TGC

GAC

CGG

CTG

CGG

AAG

ACG

CTG

GCA

TTC

GAC

CCG

CGG

ACC

CAC

ACG

CTG

GCC

GAC

290

295

300

Ala

Thr

Cys

Thr

Pro

Ala

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

Glu

Ser

Met

GCC

ACA

TGC

ACG

CCG

CCA

GCC

AGC

GAA

GGT

TCC

GCG

GAG

TCC

ATG

CGG

TGT

ACG

TGC

GGC

GGT

CGG

TCG

CTT

CCA

AGG

CGC

CTC

AGG

TAC

305 310 315

Gly

Pro

Asp

Ser

Arg

Pro

Asp

Pro

Asp

Gly

Arg

Leu

Pro

Thr

Pro

GGA

CCT

GAT

TCA

AGA

CCA

GAC

CCT

GAC

GGC

CGC

CTG

CCC

ACC

CCC

CCT

GGA

CTA

AGT

TCT

GGT

CTG

GGA

CTG

CCG

GCG

GAC

GGG

TGG

GGG

Ser

Ala

Pro

Leu

His

Ser

TCT

GCC

CCT

CTC

CAC

TCT

TGA

AGA

CGG

GGA

GAG

GTG

AGA

ACT

quadro de leitura livre único de grande dimensão começa na posição 186 e prolonga-se por 9^3 nucleótidos, que codificam para 321 aminoácidos. As sequências de ami noácidos parciais isoladas de três fragmentos de peptídeos e a sequência Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val- N-terminal isolada de Fc^R purificado confirma que o quadro mais com prido é a sequência de codificação da proteína de FcgR. A sequência terminal N hidrofílica constituida por 21 aminoácidos é seguida de uma região hidrofóbica que consiste em 26 aminoácidos sem carga (22-47). A sequência de sinal, tipicamente localizada na extremidade N-terminal da maior parte das proteínas ligadas à membrana ou de secreção, não foi encontrada. Por conseguinte, a extensão hidrofóbica de 26 aminoácidos é provável ser uma região embebida na membrana, visto que os re síduos subsequentes são na paior parte hidrofílicos e nenhuma outra parte da sequência parece ser provável atravessar a mem brana. A extensão hidrofílica de extremidade N-terminal è finalizada por um grupo de resíduos de aminoácidos muito básicos (Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Arg-Arg). Este grupo de aminoácidos básicos que se encontra normalmente no lado citoplásmico das proteínas de membrana é sabido ser uma sequência de paragem de transferência que tem um papel importante na integração na dupla camada de lípidos (ver Blobel in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22» 1496-1500 (1980) e Schneider et al. em Nature 211» ⁶75 -678 (1984)). Há um sítio de adição de hidrato de carbono N-ligado suposto na posição 63 que poderia ser localizado na região extra-celular para proteínas de membrana. Todos estes resultados demonstram que FcgR está orientado com a extremida de N-terminal no lado citoplásmico e com a extremidade C-terminal fora da célula.

Quantidades relativamente grandes de Fc^jR de 25 kd solúvel encontraram-se no sobrenadante da cultura de ce lulas RPMI-8866, 0 resíduo de aminoácido N-terminal (Met) do Fc^R solúvel foi encontrado na posição 150, e o resíduo que o precede, arginina 4 um alvo comum para as proteases do tipo da trlpsina. A região C-terminal (150-321) contém dois grupos de cisteinas (160, 163, 174 e 191 e 259, 274, 282 e 288) que formam provavelmente ligações dissulfureto e resulta numa estrutura dobrada firmemente que será resistente às enzimas pro teolíticas. A região C-terminal (150-321) corresponde por con sequência, ao Fc^R solúvel que é um produto de clivagem proteolítica do Fc^R ligado à membrana.

g) Expressão do mARN de Fc^R:

poli(A)⁺ ARN foi preparado a partir de vários tipos de células e analisado no que diz respeito à expies são de mARN de Fc£R por análise de mancha de Northem, tendo a maior banda de 1 700 b sido detectada em linhas de células linfoblastáides B (RPMI-8866, RPMI-1788), linha de células pré-B transformada por vírus Epstein Barr derivado de fígado fetal (FL^ 8-2) e dois transformantes de células L Pc^R*, mas não em células Fc^R incluindo duas linhas de linfoma de Burkitt (Daudi e Jijoye), uma linha de células T (CEM) e um trans formante de células L o qual expressa um outro antigene de cé lulas B (CD20), Além disso, mARN de Fc/R não foi detectado em células T normais, enquanto que as células B normais expressa vam um nível comparável de mARN de Fc^R com o das linhas linfoblastoides B.

h) Preparação dum vector de expressão contendo as sequências de ADN que codificam para o fragmento solúvel em água do reoptor Fcp

Os codões que codificam para a parte insolúvel em água do receptor Fcg , de preferência os codões para os • aminoácidos a partir de cerca de 50 até 150, de preferência a

partir de cerca de 150» foram removidos do gene obtido para o receptor Fo^ (ver quadro 3) por meio duma endonuclease adequa da. Quando se introduzem os genes de receptor Fc^ encurtado obtidos em organismos sob condições que conduzem a altos rendimentos deste, foram obtidos os desejados polipeptideos solúveis em água sem os aminoácidos acima citados. Por conseguinte a parte solúvel em água do receptor Fc^ contém pelo me nos a sequência seguinte:

Met

ATG

TAC

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAG

TTG

CAG

GTG

TCC

AGC

GGC

TTT

GTG

TGC

AAC

ACG

TGC

CCT

GAA

CTC

AAC

GTC

CAC

AGG

TCG

CCG

AAA

CAC

ACG

TTG

TGC

ACG

GGA

CTT

Lys

Trp

11 e

Asn

Phe

Gin

Arg

Lys

Cys

Tyr

Phe

Gly

Lys

Gly

AAG

TGG

ATC

AAT

TTC

CAA

CGG

AAG

TGC

TAC

TTC

GGC

AAG

GGC

TTC

ACC

TAG

TTA

AAG

GTT

GCC

TTC

ACG

ATG

AAG

CCG

TTC

CCG

Thr

Lys

Gin

Trp

Vai

His

Ala

Arg

Tyr

Ala

Cys

Asp

Met

Glu

ACC

AAG

CAG

TGG

GTC

CAC

GCC

CGG

TAT

GCC

TGT

GAC

ATG

GAA

TGG

TTC

GTC

ACC

CAG

GTG

CGG

GCC

ATA

CGG

ACA

CTG

TAC

CTT

Gly

Gin

Leu

Vai

Ser

11 e

His

Ser

Pro

Glu

Gin

Asp

Phe

Leu

GGG

CAG

CTG

GTC

AGC

ATC

CAC

AGC

CCG

GAG

CAG

GAC

TTC

CTG

CCC

GTC

GAC

CAG

TCG

TAG

GTG

TCG

GGC

CTC

GTC

CTG

AAG

GAC

Thr

Lys

His

Ala

Ser

His

Thr

Gly

Ser

Trp

11 e

Gly

Leu

Arg

Asn

ACC

AAG

CAT

GCC

AGC

CAC

ACC

GGC

TCC

TGG

ATT

GGC

CTT

CGG

AAC

TGG

TTC

GTA

CGG

TCG

GTG

TGG

CCG

AGG

ACC

TAA

CCG

GAA

GCC

TTG

Leu

Asp

Leu

Lys

Gly

Glu

Phe

11 e

Trp

Vai

Asp

Gly

Ser

His

Vai

TTG

GAC

CTG

AAG

GGA

GAG

TTT

ATC

TGG

GTG

GAT

GGG

AGC

CAT

GTG

AAC

CTG

GAC

TTC

CCT

CTC

AAA

TAG

ACC

CAC

CTA

CCC

TCG

GTA

CAC

Asp

Tyr

Ser

Asn

Trp

Ala

Pro

Gly

Glu

Pro

Thr

Ser

Arg

Ser

Gin

GAC

TAC

AGC

AAC

TGG

GCT

CCA

GGG

GAG

CCC

ACC

AGC

CGG

AGC

CAG

CTG

ATG

TCG

TTG

ACC

CGA

GGT

CCC

CTC

GGG

TGG

TCG

GCC

TCG

GTC

Gly

Glu

Asp

Cys

Vai

Met

Arg

Gly

Ser

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

GGC

GAG

GAC

TGC

GTG

ATG

CGG

GGC

TCC

GGT

CGC

TGG

AAC

GAC

CCG

CTC

CTG

ACG

CAC

TAC

GCC

CCG

AGG

CCA

GCG

ACC

TTG

CTG

Ala

Phe

Cys

A_Sp

Arg

Lys

Leu

Gly

Ala

Trp

Vai

Cys

Asp

Arg

Leu

GCC

TTC

TGC

GAC

CGT

AAG

CTG

GGC

GCC

TGG

GTG

TGC

GAC

CGG

CTG

CGG

AAG

ACG

CTG

GCA

TTC

GAC

CCG

CGG

ACC

CAC

ACG

CTG

GCC

GAC

Ala

Thr

Cys

Thr

Pro

Ala

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

Glu

Ser

Met

GCC

ACA

TGC

ACG

CCG

CCA

GCC

AGC

GAA

GGT

TCC

GCG

GAG

TCC

ATG

CGG

TGT

ACG

TGC

GGC

GGT

CGG

TCG

CTT

CCA

AGG

CGC

CTC

AGG

TAC

Gly

Pro

Asp

Ser

Arg

Pro

Asp

Pro

Asp

Gly

Arg

Leu

Pro

Thr

Pro

GGA

CCT

GAT

TCA

AGA

CCA

GAC

CCT

GAC

GGC

CGC

CTG

CCC

ACC

CCC

CCT

GGA

CTA

AGT

TCT

GGT

CTG

GGA

CTG

CCG

GCG

GAC

GGG

TGG

GGG

Ser

Ala

Pro

Leu

His

Ser

TCT

GCC

CCT

CTC

CAC

TCT

TGA

AGA

CGG

GGA

GAG

GTG

AGA

ACT

Além disso verificou-se que a região do Fc^R que transpõe a membrana não funciona como uma sequência de si. nal nos habituais processos de recombinação e por conseguinte para a secreção da proteína de receptor solúvel em água a par tir dum hospedeiro adequado, é necessário usar uma sequência de sinal eucariática apropriada. Tal sequência de sinal pode ser fornecida adieionalmente e numa posição em frente do ADN que codifica para a parte solúvel em água.

Por conseguinte, um aspecto preferido da presente invenção consiste num processo para a preparação de um novo fragmento recombinante solúvel em água, tendo pelo menos um sítio de O-glicosilação, de preferência um fragmento acompanhado por O-glicosilação nativa, os novos plasmídeos conten do essas sequências de ADN, e a sua preparação (ver p. ex, Figura 18: esquemas de pFc^R-1 (ver também Figura 17) e psRj^R-1 (ver também Figura 19))·

Um fragmento de Fc^R solúvel em água O-glicosilado preferido contém os aminoácidos 150 a 321 como se mostra no quadro 3·

Numa sequência de ADN nova de acordo com a presente invenção, o cADN para pelo menos parte dos aminoácidos 1 a 1U8 do F<> R, em particular a sequência que codifica

para a região citoplásmica N-terminal está ausente por isso p. ex, somente a sequência que codifica para a porção de proteína que transpões a membrana e a porção que codifica para a parte solúvel em água do cADN do conjunto do receptor está pre sente.

Nesta sequência de cADN nova pelo menos uma parte da sequência de cADN que codifica para os aminoácidos 1 a 148 e substituída por um adequado fragmento de cADN que codifica para uma sequência de sinal eucariótica usando endonucleases e ligases de restrição adequadas.

Por exemplo, um plasmídeo contendo uma inserção cADN que codifica para o Fc^R é modificado substituindo pelo menos uma parte da sequência de codificação para os aminoácidos 1 a 148 p. ex. os aminoácidos 1 a 134 por uma sequên cia de sinal de cADN eucariótica p. ex. uma sequência de sinal de cADN de interleuquina p. ex. pela sequência de sinal BSF-2. Assim, no exemplo abaixo descrito um plasmídeo correspondente p. ex. o plasmídeo LE 392 ou pGEM4 (pFcg R-l) (ver Fi gura 17) descrito em Cell 47, 659 (1986) foi digerido com HindIII, pelo que um fragmento HindIII de 1,0 kpb foi obtido contendo a sequência de codificação para os aminoácidos 134 a 321 do cADN de Fc^R integral. As extremidades 3’ reentrantes deste fragmento foram então preenchidas com o fragmento Klenow de polimerase de ADN e subsequentemente o ADN digerido com PstI. 0 fragmento obtido foi então clonado num vector adequado, de preferência com um plasmídeo pBSF2-L8 digerido por Bam HI-PstI. 0 vector é convenientemente preparado como se segue:

A inserção EcoRI-RamHI BSF-2 de cADN de 1,2 kpb foi preparada por digestão de pBSF-2,38 (ver Nature 324, 73-76 (1986)) com HindIII e BamHI. 0 fragmento obtido contendo um cADN de BSF-2 integral foi então digerido com Hinfl e as extremidades 3* reentrantes preenchidas com o fragmento Klenow de polimerase de ADN. Depois de digestão por Kpnl, o fragmen- * to Kpnl-Hinfl 110 pb obtido contendo a sequência guia BSF-2 • foi clonado no sítio de clonagem múltipla de pGEM4 digerido prèviamente com Kpnl e Smal. Um dos clones seleccionado propagado e designado por pBSF2-L8 (ver Figura 20).

pBSF2-L8 foi digerido com BamHI e as extremidades 3' reentrantes preenchidas com o fragmento de polimerase de ADN. Depois do preenchimento do sítio de BamHI, o aci ma mencionado cADN de Fc^R HindIII-PstI foi clonado em pBSF2-L8 digerido com BamHI-PstI como mencionado atrás. Um dos cio nes seleccionado foi propagado e designado por psFc R-l (ver Figura 19)·

Para comparar a actividade biológica das proteínas produzidas pelos clones pFc^R-1, psFc^R-1, pANFcg R-l (Exemplo c) e pZNFc^R-2 (Exemplo D) (ver Figura 18) estes pias mídeos foram linearizados por digestão com as enzimas apropriadas, p. ex. pFc^R-l e psFc^R-1 com BamHI e p^NFc^ R-l e p^NFc£ R-2 com EcoRI, e os fragmentos obtidos usados como um molde para sintetisar mARN com polimerase de ARN SPó. Os mARN’s resultantes foram injectados em oócitos de Xenopus lea vis. Depois de dois dias de incubação, as actividades de Fc^,R nos sobrenadantes da cultura e nos lisados de oócitos foram determinados por uma análise de imunoabsorvente ligado a enzi ma (ELISA) utilizando anticorpos 3-5 e 8-30 de anti-FcgR (ver Pedido de Patente Europeia 86 111 488.2 registado em 19 de Agosto de 1986), que reconhece dois epítopos diferentes em Fc^R. Como se mostrou na Figura 21 a actividade de FcgR foi determinada para o lisado NP-40 de oócitos, em lisado PBS de oócitos e no sobrenadante da cultura de oócitos. Verifica-se que enquanto não se pode detectar em lisado PBS e em sobrenadante de cultura de oócitos injectados com transcrições de pFc^.R-1, p^NFc^R-1 e p^NFc^R-2 qualquer actividade, foi detectada actividade de Fc^ R em sobrenadantes e

C de injecção com fragmentos de psFc^R-1.

lisados PBS depois

Além disso determinámos que ereção do fragmento solúvel em água de FcgR tos tem a propriedade de se ligar a IgE por o produto de sea partir de oócimeio de uma ELISA

- 19 modificada usando anticorpo 3-5 de Fc^R, IgE e IgE AP-anti-hu manos 0 sobrenadante da cultura de oócitos injectados com mARN de psFc£R-l foi incubado em placas revestidas com anticorpo

3-5 que foram então incubados com IgE humano e finalmente com AO-anti-IgE. Os resultados estabeleceram claramente que o Fb^R secretado de oócitos formavam um complexo com IgE (ver Figura 22). A ligação com sobrenadante de oócito não transformado, tampão, e sobrenadante de RPMI 8866 foram realizados como con trole.

No sentido de avaliar a propriedade de ligação IgE do fragmento de Fc^ R solúvel derivado de oócitos inje ctados com mARN de psFc^R-1, o sobrenadante de oócito foi méis tarde analisado pela sua capacidade de inibir a formação de rosácea entre ORBC revestido de IgE humano e células SKW6-CL4 contendo Fc^R na sua superfície. A presença de Fc^R solúvel reduziu o número de células que formam rosácea às quais mais de 20 ORBC estavam ligados indicando que o receptor solúvel está em competição com o Fc^R da membrana da célula para o IgE ligada na superfície de ORBC (ver Figura 23).

Os genes correspondentes obtidos de acordo com a invenção podem ser introduzidos nos organismos sob condições que conduzem a seus rendimentos elevados, como mencionado antes. São bem conhecidos dos especialistas na matéria, hospedeiros e vectores úteis, e é feita referência, por exemplo, à Publicação de Patente Europeia 0 039 619 publicada em 9 de Nó vembro de 19θ3·

No geral preferem-se procariontes para expres são. Por exemplo, a estirpe de E. coli K12 294 (ATCC NS 31446) é particularmente útil. Outras estirpes microbianas que podem ser usadas incluem E. coli X1776 (ATCC N® 31537)· As estirpes atrás mencionadas, bem como E. coli W3110 (F , lambda”, proto trófico, ATCC N2 27325), bacilos tais como Bacillus subtilis. e outras enterobactériáceas tais como Salmonella Typhimurium ou Serratia marcenses, e várias espécies de Pseudomonas podem ser usadas.

Em geral, vectores plasmídicos contendo sequên cias de replicação e de regulação que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usadas em conecção com estes hospedeiros. 0 vector contém vulgarmiente um sítio de replicação bem como sequências de marcação que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transfor madas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformado usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie Esoherichia coli (Bolivar, et. al., Gene 2*. 95 (1977))· O pBR322 contém genes para a resistência à ampicilina e à tetracilina e por isso proporciona facilmente meios para identificação de células transformadas. 0 plasmídio pBR322, ou outros plasmideos micro bianos devem também conter, ou ser modificados para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão. Esses promotores mais comumente usados em construção de ADN recombinante inclui os sistemas de beta-lactama se (penicilinase) e de promotor de lactose (Chang et al., Nature 275, 615 (197θ)ί Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)? Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) e sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0 036 776). Enquanto que estes são os mais comumente usados outros promotores microbianos têm sido desco bertoé e utilizados.

Por exemplo a sequência genética para FcgR po de ser posta sob controlo do promotor esquerdo do bacteriófago Lambda (P_L). Este promotor é um dos promotores mais fortes conhecidos que pode ser controlado. 0 controle é exercido pelo repressor lambda, e conhecem-se sítios de restrição adjacentes. Um alelo deste géne -repressor sensível à temperatura pode ser colocado no vector que contém a sequência de Fc^R completa. Quando a temperatura atinge os 42°C, o repressor é inactivado e o promotor exprime-se no seu nível máximo. A quan tidade de mARN produzido sob estas condições deverá ser o suficiente para resultar numa célula que contém cerca de 10% do seu ARN sintetisado de novo originado a partir do promotor P_T . Neste esquema, é possível estabelecer um banco de clones no

qual uma sequência Fc^ R funcional e colocada adjacente a uma sequência de ligação ribosómica, e a várias distâncias do pro motor P_T lambda. Estes clones podem então ser sujeitos a sele cção e o que dá maior rendimento ser seleccionado.

A expressão e tradução da sequência de Fc^R pode também ser colocada sob o controle de outros reguloes que podem ser homólogos ao organismo no seu estado não transforma do. Por exemplo, o ADN cromossomal de E. coli dependente de lactose contém um operão lactose ou operão lac que serve de medianeiro á digestão de lactose por expressão da enzima beta -galactosidase, Os elementos de regulação do lac podem ser ob tidos do bacteriófago lambda plaC5, que é infeccioso para E. coli. 0 operão lac do fago pode ser derivado por transducção das mesmas espécies bacterianas. Podem derivar-se regulões adequados para uso no processo da invenção a partir do ADN plasmídeo nativo do organismo. 0 sistema promotor-operador de lac pode ser induzido por ÍPTC.

Outros sistemas promotores operadores ou suas porções podem também ser empregues. Por exemplo o operador de arabinose, o operador Colicina E^, o operador de galactose, o operador de fosfatase alcalina, o operador de trp, o operador de xilose A, o promotor tac e semelhantes podem ser usados.

Os genes podem ser expressos mais vantajosamente em Escherichia coli quando se usa o sistema promotor-operador de plasmídeo pER 103 (ver E. Rastl-Dworkin et al. , em Gene 21, 237-248 e EP-A-0 115 613) depositado na German Collection of Micoorganisms, Grisebachstrasse 8, D-34OO Gottingen, em 27 de Outubro de 1983 sob DSM 2773 de acordo com o Tratado de Budapeste.

Um plasmídeo de expressão correspondente, por exemplo, para exprimir a parte solúvel em água do receptor

Fc^ humano de baixa afinidade com os aminoácidos 150 a 321 (ver quadro 3) pode ser preparado como se segue:

Um plasmídeo contendo o sistema promotor operador acima mencionado, por exemplo o plasmídeo pRH 100 (ver Exemplo B) foi digerido com SstI. Subsequentemente as saliências 3’ foram removidas e o plasmídeo linearizado foi desfosforilado. Depois de purificação, p. ex. por extracção com fenol /clorofórmio, electroforese, electroeluição e precipitação, o vector linearizado é ligado com uma inserção obtida como se segue:

Um plasmídeo contendo parte do gene do receptor Fc£ humano de baixa actividade, por exemplo pGEM^-Fc^R, que foi obtido por digestão da inserção EcoRI do plasmídeo LE392 com HindIII e por reinserção do maior fragmento EcoRI/ /HindIII em pGEMU (Promega Biotec, Madison, WI53711, USA) foi digerido com EcoRI e HindIII. Subsequentemente os terminais salientes 5’ foram truncados por adição do fragmento Klenow de polimerase I de ADN e de todos os quatro dXTP* s, e os grupos fosfato 5' foram removidos. Depois da purificação do fragmento obtido, este foi cortado de novo com Sau3A e o fragmen to maior foi isolado. Uma vez que este procedimento remove não somente a região a montante 5’ mas também os nucleótidos para os primeiros 18 aminoácidos N-terminais da desejada parte solúvel em água, dois oligodeoxinucleótidos de fórmulas

EBI-49ÓÍ

5’ GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3’

EBI-497:

3’ CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5’ Sau3A foram sintetisados para restaurar os codões correspondentes da fórmula

GluL e uGl n Vai S e r S θ r G1 y Ph e Vai C y s A snTh rC y s Pro GluLy sTr p

5’ GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3'

3' CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACÇTAG 5’

Sau3A

(sem ο codão ATG porque este codão está contido no sistema de ligação promotor/operador/ligante do plasmídeo pER 103).

Cada um dos oligodeoxinucleótidos preparados foi temperado e ligado ao gene do fragmento solúvel em água de Fc^R acima obtido. Depois de desnaturação pelo calor da li gase de ADN T4 usada, polinucleótidoquinase T4 e ATP foram adicionados para fosforilar as extremidades 5’ do ADN.

Depois da purificação da inserção por meio de electroforese de gel de agarose, esta inserção foi ligada com o vector de ADN linearizado. A solução de ligação obtida foi transformada em E. coli HB 101 e isolaram-se algumas das colo nias resistentes à ampicilina. Estes plasmídeos foram verificados por meio de análise de enzima de restrição no que respeita à correcção da sua construção. Seleccionou-se um plasmí deo e designou-se por pRH 246 (ver Fig. 16).

Além de procariontes também se podem usar micróbios eucarióticos, tal como culturas de leveduras. 0 Saccharomyces cerevisiae é o mais comumente usado entre os micro organismos eucarioticos, apesar de que uma quantidade de outras espécies são vulgarmente viáveis. Para expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo (Stinchcomb, et al., Nature 282. 39» (1979)» Kingsman et al., Gene 2» 141 (1979)J Tschumper, et al., Gene 10, 157 (198θ)), o plasmídeo YEpll3 (Bwach et al., Gene 8., 121-133 (1979) e o plasmídeo pJDB207 (ver V. D. Beggs et al., em Gene cloning in Yeast, Ed. R. Williamsons Genetic Engineering Vol. 2, 175-203 (1981), Acade mic Press, London; depositado em 28 de Dezembro de 1984 sob o DSM 3131 ^na German Collection of Microorganisms, Grisebachstrasse 8, D-34OO GSttingen, de acordo com o tratado de Budapeste) são vulgarmente usados. 0 plasmídeo YRp7 contém o gene TRP1 que proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura carecendo da capacidade de crescer em tri ptofano, por exemplo ATCC N§ 44076. A presença da lesão TRP1 • como uma característica do genoma de célula hospedeira de le

vedura proporciona assim um meio efectivo para detectar a trans formação por crescimento na ausência de triptofano. Semelhantemente, o plasmídeo YEpl3 contém o gene LEU2 de levedura que pode ser usado para complementação de uma estirpe mutante LEU2 meno s.

Uma sequência promotora adequada em vectores de levedura inclui a região de contorno 5' dos genes para ADH I (Ammerer, G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-fosfogliceratoquinase (Hitzemann, et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Kawasaki e Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)), tais como enolase,gli ceraldeido-3-fosfato-deidrogenase, piruvato-decarboxilase,fos fofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, fosfoglucose-iso merase, e glucoquinase . Na construção de plasmídeos de expres são adequados, as sequências de terminação associadas com estes genes estão também ligadas ao terminal 3’ do vector de ex pressão da sequência que se deseja expressar, para proporcionar poliadenilação do mARN e terminação.

Outros promotores que têm a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento são as regiões de promotores dos genes para álcool-deidrogena se-2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo do azoto, a gliceraldeído-3-fosfato-deidrogenase acima mencionada e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose, Os promotores que são regulados pelo local de tipo de emparelhamento da levedura, tais como os promotores dos genes BARI, MR-alfa-1, STE2, STE3, STE5 podem ser usados para sistema de regulação de temperatura usando mutações siv dependentes da temperatura (Rhine, Ph.

D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979)» Herskowitz e Oshima em The Molecular Biology of the Yeast Sacharo myces, Part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Estas mutações influenciam directamente as expressões de bloco integrado do tipo de emparelhamento silencioso de levedura e portanto indirectamente os promotores dependentes do tipo de emparelhamento.

Geralmente, contudo, qualquer vector plasmídi co contendo um promotor compatível de levedura, origem de sequências de replicação e de terminação é adequado.

Contudo os genes, de preferência os genes para a parte solúvel em água do receptor Fcj. humano de baixa ac tividade com os aminoácidos 150 a 321 (ver quadro 3)> podem ser expressos em levedura com mais vantagem quando se usa o promotor ADHI junto com o terminador ADHI. Por exemplo, a pre paração de um vector de expressão de levedura adequado pode ser executada preparando

a) um plasmídeo contendo o terminador ADHI de levedura,

b) um plasmídeo contendo o promotor ADHI de levedura e o terminador ADHI de levedura (ver J. Biol. Chem. 257, 3θ183θ25 (1982)),

c) um plasmídeo contendo o promotor ADHI de levedura, um gene que codifica para o peptídeo guia do factor de emparelhamento de levedura (sequência guia (ver Cell 30, 933-9^3 (19θ2)), um sítio de clonagem múltipla e o terminador ADHI de levedura-

d) um plasmídeo contendo o promotor ADHI, a sequência de codi ficação para a parte solúvel em água do receptor Fc^. humano de baixa afinidade e o terminador ADHI,

e) um plasmídeo contendo o promotor ADHI, o gene guia do facto r(\ de emparelhamento de levedura, o gene para a parte solú vel em água do receptor Fc humano de baixa actividade, um sí tio de clonagem múltipla e o terminador ADHI de levedura e

f) transformar o ADN plasmídico obtido num vector de levedura adequado, pelo que um plasmídeo contendo o bloco integrado de expressão sem a sequência guia MFÍk e um plasmídeo contendo o bloco integrado de expressão com a sequência guia MBK são obtidos.

. Descrição dos procedimentos a a f

a) 0 terminador ADHI pode ser isolado de um plasmídeo que con tém esse promotor, por exemplo do plasmídio pJD14 (ver J. L. Bennetzen et al. em J. Biol. Chem. 257, 3018-3025 (1982)). 0 terminador ADHI foi subclonado no plasmídeo pUCL8 (Pharmacia P-L, /27-4949-01) como fragmento HindIII-Sphl. Durante a subclonagem, o sítio de HindlII foi destruido por uma reacção de enchimento e, depois da adição do ligante Sall, o plasmídeo pWS214s4 foi obtido. Depois da digestão de pWS214s4 com Sphl e Sall, o fragmento mais pequeno foi isolado por meio de electrofores© de gel de agarose, electroeluição e precipitação de acordo com métodos conhecidos.

fragmento isolado contendo o terminador ADHI foi ligado com ADN de vector obtido de preferência por digestão de Bluescribe M13 (ver Stratagene, San Diego, CA 92121, USa) com Sall e Sphl e depois de purificação do ADN de vector obtido por meio de electroforese de gel de agarose, electroeluição e precipitação de acordo com métodos conhecidos.

A solução de ligase obtida foi transformada em E. coli JM101 e o plasmídeo de uma das colónias resistentes a ampicilina foi designada como pRH241 (ver Fig. 10) contendo um fragmento de aproximadamente 340 pb de comprimento com o terminador ADHI.

b) 0 promotor ADHI pode ser isolado de um plasmídeo que conte nha esse promotor, por exemplo do plasmídeo pY-JDB-HuIFN-omegal (ver Exemplo A e o Pedido de Patente Alemã P 36 35 867*3, registado em 22 de Outubro de 1986) que é subsequentemente in serido num vector adequado, como seja o plasmídeo pRH241.

A inserção necessária foi preparada por diges tão do plasmídeo pY-JDB-HuIFN-omegal com Sphl, removendo a sa liência 3' usando polimerase I de ADN de E. coli na presença de dGTP e cortando de novo com Xhol. Depois de isolar os fragmentos obtidos por meio de electroforese de gel de agarose, • por electroeluição e precipitação de acordo com os métodos co

4

nhecidos, a extremidade truncada do fragmento de 400 pb de com primento foi convertida por ligação com o par adaptador da for mula

EBI-41O: 5’ AATTGGAAGGATC 3’

EBI-429: 3' CCTTCCTAG-p 5' e a extremidade coesiva por ligação com o par adaptador da fór mula

EBI-418: 5' p-TCGAGCACGTGGTAC 3’

EBI-424 3' CGTGCAC 5’

As ligações foram realizadas simultaneamente e depois da purificação do produto da ligação por meio de ele ctroforese de gel de agarose, foi ligado com um ADN de vector linearizado adequado, de preferência com ADN de vector linearizado obtido por digestão do plasmídeo pRH241 com EcoRI e Kpnl. A solução de ligase obtida foi transformada em E. coli, as colónias resultantes foram verificadas no que diz respeito à presença de um plasmídeo com a construção correcta de acordo com métodos conhecidos. Seieccionou-se um plasmídeo designado por plasmídeo pRH242 (ver Fig. 11).

Depois da síntese química do peptídeo guia do factor de emparelhamento de levedura (ver J. Iíurian et al. , em Cell 30. 933-9^3 (1982)), preparou-se a inserção como se segue depois da síntese dos seguintes oligodeoxinucleótidos

No me S equênc ia

MF 1 TCGAGCCTGATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTITGTT (50 bases)

MF 2 Afi^AfíOGAACAAAAOAGGAGTGAAAATAGATGGGAATGTCATTGATATGA

GGC (53 bases)

MF 3 CGGTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACG

AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70 bases)

A

MF	4	CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTGTTCAGTAGTAGTGTTGACT GGAGCAGCGAAAGCGGAGGA (70 bases)
MF	5	GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48 bases)
MF	6	GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA ( 48 bases)
MF	7	GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC ACTACTATTGCATCGATTGCT (69 bases)
MF	8	CCTTAGGAGCAATGGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG TTAGTGGAGTTGGAGAATG (69 bases)
MF	9	GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49 bases)
MF	10	CTAGAGAATTGCTGCAGAGGCCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT (46 bases)

Cada um dos oligonucleótidos MF2 a MF9 foram fosforilados. Depois de parar as reacçôes por aquecimento,pre pararam-se as seguintes misturas: ®1 e MF2; MF3 e MF4; MF5 e MFÓJ MF7 e MF8; MF9 e MF1O, Então, depois de aquecer e arrefe cer, as cinco soluções resultantes foram combinadas e ligadas. Um ADN de vector linearizado, de preferência obtido por diges tão de pBH242 com Xhol e Xbal depois de purificação por meio de electroforese, electroeluição e precipitação de acordo com métodos conhecidos, foi adicionada â solução acima. Esta solu ção de ligação foi usada para transformar E. coli JM101, os plasmídeos das colónias resultantes foram verificados por digestão com Xhol e Xbal, pelo que aqueles plasmídeos contendo uma inserção de cerca de 290 pb (ver Fig. 12) foram depois ca racterizadas por subclonagem da inserção em M13mp8 e por sequenciação de acordo com o método de terminação da cadeia dideoxi de Sanger (ver Proc. Natl. Acad. Sei. 5463-5467

(1977))· Um plasmídeo contendo a inserção correcta foi seleccionado e designado por pRH243 (ver Fig. 13)·

d) A sequência de codificação para a parte solúvel em água do receptor Fc^ humano de baixa afinidade foi isolada do plasmídeo pGEMU por digestão com HindIII e EcoRI, adicionalmente as extremidades coesivas foram preenchidas usando o fragmento de Klenow da Polimerase I de ADN de E. coli e os quatro deoxinucleosidotrifosfatos. 0 fragmento maior foi desfosforilado e purificado de acordo com métodos conhecidos.

Já que HindIII corta o cADN de Fc Ra cerca de 50 pb a montante do primeiro aminoácido, a inserção é nova mente cortada com Sau3A. Uma vez que este procedimento remove não somente a região a montante 5’ mas também os nucleótidos para os primeiros 18 aminoácidos N-terminais do fragmento solúvel em água começando no aminoácido 150 do receptor Fc com pleto, dois oligodeoxinucleótidos de fórmulas

EBI-4915

5’ TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT

GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-495:

3’ CGAGTATATGTTACC TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA

AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG

Sau3A foram sintetisados para restaurar o gene completo usando a se quência de utilização de codão da fórmula

Met

5’ TCGAGCTCATATACA ATG

3' ____ÇGAGTATATGT TAC

155

16o

Xhol

165

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAA

TTG

CAA

GTT

TCC

TCT

GGT

TTC

GTT

TGT

AAC

ACT

TGT

CCA

GAA

CTT

AAC

GTT

CAA

AGG

AGA

CCA

AAG

CAA

ACA

TTG

TGA

ACA

GGT

CTT

Lys Trp

AAG TG 3'

TTC ACC TAG 5'

Sau3A

Os oligodeoxinucleótidos preparados foram tem perados, o fragmento Sau3A-EcoRI foi adicionado e ligado usan do ADN de ligase TU. 0 fragmento resultante foi purificado por electroforese, electroeluição e precipitação de acordo com me todos conhecidos.

Esta inserção foi ligada com um ADN de Vector linearizado adequado, de preferência com o fragmento maior ob tido por digestão de pRH2^2 com Xbal (preenchido) e Xhole por purificação adicional de acordo com métodos conhecidos.

A solução de ligação obtida foi transformada em E. coli JM101, os plasmídeos de algumas das colónias resul tantes foram verificados com várias enzimas de restrição de acordo com métodos conhecidos. Um plasmídeo contendo a inserção correcta foi seleccionado e designado por pRH244 (ver Fig. 1U).

e) A sequência de codificação para a parte solúvel em água do receptor Fc^humano de baixa afinidade foi isolada do plasmídeo pGEM4-Fc£R por digestão com HindIII e EcoRI adicionalmente os terminais coesivos foram preenchidos usando o fragmento de Klenow de ADN-Polimerase I e os quatro deoxinucleosidotrifosfatos. 0 fragmento mais pequeno assim obtido foi desfosforilado e purificado de acordo com métodos conhecidos. Uma vez que HindIII corta o cADN de FcgR cerca de 50 pb a montante do primeiro aminoácido, a inserção é novamente cortada com Sau3A. Uma vez que este procedimento remove não sòmente a região a montante 5’ mas também os nucleótidos dos 18 primeiros aminoácidos N-terminais do fragmento solúvel em água, dois oligodeoxinucleótidos de fórmulas

ΕΒΙ-430:

5’ ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC

TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437í

3' TACCTTAAGGTTCAAAGGAGACCAAAG TAC CTT AAC GTT CAA AGG

AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG 5'

Sau3A foram sintetizados para restaurar o gene completo usando a se quência de utilização de codão de fórmula

Met

5' ATG

3' TAC

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAA

TTG

CAA

GTT

TCC

TCT

GGT

TTC

GTT

TGT

AAC

ACT

TGT

CCA

GAA

CTT

AAC

GTT

CAA

AGG

AGA

CCA

AAG

CAA

ACA

TTG

TGA

ACA

GGT

CTT

Lys Trp

AAG TG 3’

TTC ACC TAG 5’

Sau3A

Ambos os oligodeoxinucleótidos foram temperados, o fragmento Sau3A-EcoRI foi adicionado e ligado usando ADN-ligase T4. 0 fragmento resultante foi purificado por electroforese, electroeluição e precipitação de acordo com métodos conhecidos.

Esta inserção foi ligada com um ADN de vector linearizado adequado, de preferência com o fragmento maior ob tido por digestão do plasmídeo pRH243 com EcoRI e StuI e por purificação adicional por meio de electroforese, electroeluição e precipitação por métodos conhecidos.

A solução de ligação obtida foi transformada em E. coli JM1O1, os plasmídeos de algumas das colónias resul

tantes foram verificados com algumas enzimas de restrição de acordo com métodos conhecidos. Um plasmídeo contendo a inserção correcta foi seleccionado e designado por pRH245 (ver Fig. 15).

f) Os blocos integrados de expressão do plasmídeo pRH244 e pRH245 consistindo num promotor ADHI, gene guia (somente no caso de pRH245), gene do Fc^ R solúvel em água e o terminador ADHI foram isolados por digestão com HindIII e BamHI e li gado com um plasmídeo de levedura, por exemplo com ADN de vector linearizado adequado tal como o plasmídeo pJDB2O7 ou o YEpl3·

Além dos microorganismos, culturas de células derivadas de organismos multicelulares podem também ser usadas como hospedeiros. Em princípio, qualquer cultura de células é trabalhável quer cultura de vertebrados quer de inverte brados. Contudo o interesse tem sido maior em células de vertabrados, e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tomou-se um procedimento de rotina nos anos recentes (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973))· Exemplos de tais linhas de células hospedeiras úteis são células VERO e HeLa, linhas de células de ovário de hamster Chinês e linhas de células W138» BHK, COS-7 e MDCK.

Vectores de expressão para tais células inclui normalmente (se necessário) uma origem de replicação, um promotor localizado em frente do gene a ser expresso, em conjunto com quaisquer sí tios de ligação de ribosoma necessário, sítios de encaixe de ARN, sítio de poliadenilação e sequências de terminador sequencial .

Para uso em células de mamíferos, as funções de controle nos vectores de expressão são muitas vezes preparadas por genomas virais. Por exemplo, os promotores usados vulgarmente são derivados de polioma, Adenovírus 2 e mais fre quentemente vírus de SÍmio 40 (SV4o). Os promotores precoces • e tardios de SV^O são particularmente úteis porque ambos são

facilmente obtidos a partir do vírus como um fragmento que tam bém contém a origem virai Sv4o de replicação (Fiers et al.,Na ture 273» 113 (1978)). Fragmentos Sv4o maiores ou mais pequenos podem também usar-se, contanto que esteja incluida a sequência de aproximadamente 250 pb estendendo-se a partir do sítio HindIII em direcção â localização de sítio Bgl na origem virai da replicação. Além disso, é também possível, e mui tas vezes desejável desejável, utilizar sequências de promotor ou de controle normalmente associadas com a sequência do gene desejada, contanto que tais sequências de controle sejam compatíveis com os sistemas de células do hospedeiro.

Uma origem de replicação pode ser preparada quer por construção do vector para incluir uma origem exógena, tal como a que pode ser derivada de SV4o ou outra fonte virai (p. ex., Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc.) ou pode ser preparada pelo mecanismo de replicação cromossomal de células do hos pedeiro. Se o vector é integrado no cromossoma da célula do ’ hospedeiro, o último é muitas vezes suficiente.

Contudo, mais preferentemente, um veículo de clonagem (plasmídeo lançadeira) é usado, o que permite a replioação em eucariontes bem como em procariontes. A capacidade dos plasmídeos para replicar em procariontes proporciona meios fáceis para a manipulação da sequência de ADN e conseguindo grandes quantidades de ADN de plasmídeos necessários para a transfecção em células de mamífero.

Um tal plasmídeo lançadeira contém motivos de ADN procariótico bem como sequências de ADN derivadas de euca riontes.

A parte procariótica do plasmídeo consiste nu ma origem de replicação usualmente derivada do plasmídeo pBR322 (Mulligan R. C. et al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78» 2072-2076 (1981)) e um gene marcador facilitando a selecçao * no meio que contém antibiótico. Os genes mais largamente usaq dos para selecção são aqueles que são mediadores de resistên- 34 cia quer â ampicilina, tetraciclina ou cloranfenicol (Mulligan R.C. et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78. 2072-2076 (1981)).

A parte eucariótica do plasmídeo lançadeira tem de conter uma origem de replicação, usualmente derivada de genomas virais tal como vírus de Símio 40 (Mulligan R. C. et al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 28, 2072-2076 (1981))ou VÍrus Bovine Papilloma (DiMaio D. et al., in Mol. Cell. Biol. 4, 340-350 (1984)). Em segundo lugar, um gene marcador seleccionável é necessário para permitir às células abrigar o pias mídio lançadeira para crescer sob condições selectivas no sen tido de manter o plasmídeo nas células. Este gene marcador po de ser quer de origem procariotica quer de origem eucariótica (p. ex. genes procarióticos: gene gpt que codifica para xanti na-guanina-fosforibosiltransferase (Mulligan R.C. et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78» 2072-2076 (1981), Mulligan R.C. et al. in Science 209, 1422 (198o)), gene neo que codifica para uma fosfatase bacteriana mediadora da resistência ao derivado da neomicina G418 (Southern P. et al., in J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 (1982), Scholer U. et al. in Cell 36, 1422(1984), gene CAT que codifica para o cloranfenicol-acetiltransferase (Gorman C. in Mol. Cell. Biol. 2, 1044 (1982)); genes eucarió ticos; gene que codifica para a timidina-quinase (Wigler M.et al., in Cell 11, 223 (1977))· 0 terceiro, o motivo de ADN eucariótico que permite a expressão do gene clonado de interesse é uma sequência de promotor, que pode ser quer constituida ou induzível (p. ex. o promotor constitutivos vírus de símio 4o ou vírus de sarcoma rous (Mulligan R.C, et al., in Science 209» 1422 (1980), Laimons L. et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22» 6453 (1982)); o promotor induzível! promotor de vírus de tumor mamário de rato (Chapman A. B. et al·, in Mol. Cell. Biol. 1421-1429, promotor de proteína térmico (Pelham H. et al., in EMBO J. 1, 1473 (19θ2)), promotor de metalotioneína (Mayo K. et al. in Cell 22, 99 (1982), Karin M. et al., in Na ture 299, 797 (1982)).

Uma maneira de conseguir relativamente gran

des quantidades da parte solúvel da proteína do receptor Fcg em eucariontes superiores é temperar a parte solúvel do gene do receptor de Fc^ para o promotor SV 40 (constitutivo) e cio nar este gene híbrido num plasmídeo contendo o gene que codifica para a diidrofolat-redutase (dhfr). Sob pressão selectiva o gene dhfr e as sequências de ADN adjacentes são amplificadas para mil vezes, elevando o rendimento não sòmente do ge ne dhfr mas da parte do receptor Fc^ solúvel também (EP-A-0 093 619).

i) 0 receptor Fc^ humano de baixa afinidade preparado de acor do com a invenção, de preferência a sua parte solúvel começan do cerca do aminoácido 50 até cerca do 150 do total do receptor Fc^ , é adequado para o tratamento ou profilaxia de reacções alérgicas e locais induzidas pelo IgE e pode ser incorpo rado em composições farmacêuticas tais como soluções ou sprays.

Os plasmídeos p^NFO^R-1 e p^NFc^R-2 usados como plasmídeos de comparação (ver Figura 21) foram preparados como se segue:

plasmídeo LE 392 ou pGEM4 (pFc^R-1) (ver Fi gura 17) foi digerido com HindIII e EcoRI. 0 fragmento de cADN isolando começando com o nucleótido 584 como se mostra na Figura 17 foi clonado em pGEM4 digerido com HindIII e EcoRI. Um dos clones seleccionados é propagado e designado por p^NFc^.R-1.

Os plasmídeos acima mencionados LE 392 ou pGEM4 (pFc^R-1) foi digerido com EcoRI, e obteve-se um fragmento contendo o cADN de Fc^ R integral ~1,7 Kpb. O fragmento EcoRI obtido foi então parcialmente digerido com Sau3A para remover a sequência cADN que codifica para o domínio citoplás mico suposto, p. ex. para os aminoácidos 1 a 23 e um fragmento cADN começando com o nucleótido 254 como se mostra na Figu ra 17 foi obtido, o qual foi ligado com um ligante palindrómi co de 26 bases da fórmula

5'-GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA-3 *

para restaurar um codão de partida ATG no terminal 5’ e um sí tio de restrição Kpnl. 0 fragmento ligado assim obtido foi di gerido com Kpnl e clonado em pGEM4 digerido com Kpnl e EcoRI. Sómente estes clones foram seleccionados por hibridação de co lónia em que a região para o domínio citoplásmico suposto estava omissa. Seleccionou-se um clone e propagou-se designando -se por paNFcçR-2.

Os exemplos que se seguem, que não são exaustivos, destinam-se a ilustrar a presente invenção mais em por menor:

Materiais e Métodos Gerais

Os anticorpos monoclonais anti-Fcp R 3“ 5 (^ ) e 8-30 (p.) foram preparados por hibridação do mieloma P3U1 com células de ratos Balb/c imunizados com células RPMI-8866 (ver Pedido de Patente Europeia n’ 86 110 420.6 do mesmo requerente, pedida em 29 de Julho de 1986). 0 anticorpo 8-30 re cõnhece o epítopo perto do sítio de ligação de IgE a Fc^R e não pode bloquear de modo efectivo a ligação da IgE aos seus receptores. Estes anticorpos precipitam polipeptideos de 46kd e de 25 kd sob condições redutoras e não redutoras. Os anticorpos monoclonais foram purificados a partir de ascites por precipitação com sulfato de amónio a 50% da saturação seguida por filtração por gel usando Sepharose 6B (Pharmacia Fine Che micals, Uppsala, Suécia) para a classe IgM ou cromatografia de permuta iónica usando QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) para a IgGl. A IgG policlonal de rato IgG foi isolada do mesmo modo. Os conjugados anti-rato IgM-fosfatase alcalina foram adquiridos a Tago (Burlingame, CA).

A cromatografia de HPLC de fase reversa foi le vada a efeito usando um sistema Waters HPLC com uma coluna Hi-Pore, RP-304 (250 x 4,6 mm) (Bio-Rad). 0 Fc^ R purificado por imunoafinidade foi aplicado à coluna de fase reversa equilibrada com água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e eluiu

-se com um gradiente linear de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (ATFA). 0 material eluido foi congelado e liofilizado antes de se submeter à análise da respectiva actividade por ELISA.

NaDodSO^/PAGE

Fracções de Fcg R brutas, purificadas por imunoafinidade e purificadas por HPLC foram analisadas por electroforese num gel de poliacrilamida a 10% com 1% de NaDodSO^ (Fig. 4) e determinaram-se as proteínas por coloração com pra ta usando corante de prata Daiichikagaku (Daiichi-Kagaku, Tá quio). Para medir a actividade de Fc^R depois da electroforese, o gel foi cortado em tiras de 4 mm, fragmentado e eluido com tampão lisogénico durante a noite à temperatura ambiente com agitação, o material eluido foi reunido após centrifugação e foi analisada a actividade por ELISA.

As reacções enzimáticas são realizadas de acordo com procedimentos normais (ver Molecular cloning - a laboratory manual; T. ^niatis et al. (1982), Ed. Cold Spring Harbour) ou seguindo as instruções dos fornecedores. Os mapas de restrição dos plasmídeos descritos e os esquemas de reacção não estão desenhados à escala. Os oligonucleótidos foram sintetisados usando um sintetisador de ADN Applied Biosystems modelo 381A e foram purificados por electroforese em gel de poliacrilamida (acrilamida a 12%, bisacrilamida a 0,6%, ureia 8 M, tampão de TBE 1 x), eluição e eliminação de sais usando uma coluna de Sephadex G25·

Exemplo A

Preparação do plasmídeo pY-JDB-HuIFN-omegal

a) Preparação do fragmento de promotor de levedura ADHI , Digerem-se 80 pg do plasmídeo pES103 (deposi• tado de acordo com o Tratado de Budapeste na Deutsche Sammlung

von Mikroorganismen sob o número DMS 4-013 em 27 de Fevereiro de 1987) em 500 pl com BamHI e Xhol. Separa-se o fragmento do promotor com um comprimento de cerca de 14-50 pares de bases (pb) do vector num gel de agarose a 1%, isola-se do gel por electroeluição e precipita-se. Suspende-se o fragmento em 4o pl de tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).-0 plasmídeo pES103 (acima referido) usado foi preparado por inserção do fragmento BamHI-Xhol de aproximadamente 1450 pb de comprimento do plasmídeo AX (ver G. Ammerer em Methods Enzymology 101, 192-201 (1983)) no plasmídeo pUC18 (ver Pharmacia P-L, n? 27-4949-OI).

b) Preparação do vector pJDB 207

Cortam-se 10 yug do plasmídeo pJDB 207 em 100 jil de solução com BamHI obtendo-se deste modo o plasmídeo linearisado. A fim de evitar que o plasmídeo linearlsado se tor ne a ligar, removem-se os grupos fosfato 5’ terminais por tra tamento com fosfatase de intestino de vitela (FIV) . A forma linear é separada de eventuais resíduos de plasmídeo não dige rido num gel de agarose a 1%, isolando-se por electroeluição e precipitando-se. O ADN do vector precipitado é dissolvido em 20 pl de tampão TE.

c) Expressão do vector para IFN-omegal

Linearizaram-se por corte com HindIII 50 pg do plasmídeo pRHW12 (ver EP-A-0 170 204) em 600 pl de solução. As extremidades reentrantes resultantes foram convertidas em extremidades de cadeias coincidentes por adição do fragmento de Klenow de ADN-polimerase I (10 unidades) e dos trifosfatos dos quatro desoxinucleósidos, cada um numa concentração de 25 pM, e por incubação à temperatura ambiente. A forma linear foi purificada por electroforese em gel de agarose e isolamen to subsequente. 0 fragmento foi suspenso em 50 pl de tampão TE.

A fim de obter extremidades compatíveis com o fragmento promotor, liga-se um adaptador Xhol às extremidades

do plasmídeo pRHW12 linear. Submetem-se a fosforilação 3 pl de adaptador Xhol (0D_OKn , Pharmacia P-L, n^e 27-7758-01, de fórmula d/CCTCGAGG_7 em 20 pl de solução usando 5 unidades de polinucleotidoquinase T4 e rATP. Depois de inactivação da enzima por aquecimento a 7θ°θ durante 10 minutos, combinam-se 5 μΐ d esta solução com 10 pl do plasmídeo pRHW12 linear e subme tem-se um total de 20 pl da solução reaccional a ligação usan do ADN-ligase T4 (durante 16 horas a 14°C. Em seguida a ligase é inactivada por aquecimento a 70°C durante 10 minutos e o volume da reacção é preenchido até 150 pl com tampão de meio | 1 x (Tris 10 mM, pH 7,5» NaCl 50 mM, MgClg 10 mM) ,

Formam-se as extremidades 5* coesivas específicas em relação a Xhol por tratamento com 100 unidades de Xhol e purificado por elecrtoforese em gel de agarose e electroeluido do gel. Antes da precipitação, adicionam-se 5 pl de fragmento promotor (da secção a)). Depois da precipitação, suspende-se o ADN em 14,5 pl de tampão TE, adicionam-se tampão de ligase e 5 unidades de ADN-ligase T4 e leva-se a efeito a ligação durante 16 horas a 14°C. Após inactivação da enzima preenche-se o volume a 200 pl e corta-se o ADN por meio de BamHI. 0 ADN é obtido por purificação em gel de agarose e é dissolvido em 20 pl de tampão TE.

d) Ligação dos fragmentos vector final de expressão é obtido por tratamento de 5 pl dos fragmentos obtidos com BamHI (promotor e gene de IFN-omegal) com 1 pl do vector pJDB207 linearizado (terminador 2 p de levedura e origem de replicação 2 de levedura, marcador Leu2, origem de replicação de E. coli, gene de resistência à ampicilina) em 10 pl de solução na presença de 1 unidade de ADN-ligase T4.

e) Transfo rmacão ’ Transformaram-se 10 pl de células competentes • de E. coli HB101 por adição de 5 pl de solução de ligase e

cultivaram-se em placas de LB-agar contendo 100 pg/ml de ampi cilina. Seleccionaram-se 12 dos clones resultantes e isolaram -se os plasmídeos. Depois de cortar os plasmídeos com várias enzimas de restrição e se ter submetido a electroforese em gel de agarose, seleccionou-se um plasmídeo que se verificou conter a construção correcta; designou-se este plasmídeo por pY- JDB-HuIFN-o m egal.

Exemplo B

Construção do plasmídeo de expressão pRH 100

Linearizaram-se 7 pg do plasmídeo pER 103 (ver Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21, 237248 (19θ3) e EP-A-0 115 613)) em 50 pl de meio reaccional com a endonuclease de restrição HindIII. Depois de incubar durante 1 hora a 37°C, adicionaram-se 50 jjlI de tampão FIV 2 x (tampão FIV 2 x = Tris 20 mM, pH 9,2, EDTA 0,2 mM). Depois da adição de 2 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (FIV) removeram-se os resíduos de fosfato 5’ terminais; levou-se a efeito uma incubação durante 30 minutos a 45°C. Fez-se parar a reacção por meio da adição de 4 pl de solução de EDTA 0,5 e da adição de 10 jil de solução de Tris 1 M a pH=8,0. As proteínas foram removidas por extracção duas vezes com fenol e uma vez com fenol/clorofórmio. 0 ADN foi precipitado a partir da fase aquosa depois da adição de 0,1 volumes de solução de acetato de sódio 3 M a pH=5,5 e de 250 pl de etanol e o precipitado de ADN, depois de centrifugado, foi lavado uma vez com solução de etanol a 70%. 0 ADN foi seco e o sólido resultante foi em seguida dissolvido em 20 jil de tampão TE (Tris 10 mM a pH= 8,01, EDTA 1 mM).

Fosforilaram-se fracções de 1 p.1 dos oligodeo xinucleótidos sintéticos d(AGCTTAAAGATGAGCT) e d(CATCTTTA) em 10 ^ul de solução reaccional com a adição de 10 unidades de PNQ-/4 (polinucleótido-quinase) e rATP 1 mM. A reacção teve . lugar a 37°C e demorou 45 minutos. Fez-se parar a reacção por aquecimento a 7θ°0 durante 10 minutos.

Misturaram-se em conjunto 5 pl da solução de plasmídeo e o oligonucleótido fosforilado e aqueceu-se a 7Q°C durante 5 minutos. Em seguida a solução foi arrefecida a 0 C e adicionaram-se 2 pl de tampão de ligase 10 x (Tris 500 mM, pH=7,5)» MgCl_o 100 mM, DDT (ditiotreitol) 200 mM, rATP 1 mM, 500 jig/ml de ASB (albumina de soro de bovino), 2 pl de água e 10 unidades de ADN-ligase Τ4. A reacção demorou 4o horas e foi efectuada a 4°C . Foi feita parar por aquecimento a 70°C durante 10 minutos.

Digeriram-se 2 /11 da solução proveniente da reacção com ligase num total de 30 pl de solução com 10 unida des da endonuclease de restrição Saci (New England Biolabs) durante 3 horas a 37°C· Fez-se parar a reacção por aquecimento a 70°C durante 10 minutos. Ligaram-se 5 F¹ desta mistura reaccional num total de 30 jul por adição de 10 unidades de PNQ-T4 a 14°C durante 16 horas.

Misturaram-se 200 yul de E. coli HB101 competente com 10 pl desta solução proveniente da reacção com liga se. As bactérias foram conservadas em gelo durante 45 minutos e em seguida aquecidas a 42°C durante 2 minutos a fim de permitir a absorção do ADN. Incubou-se ainda a suspensão bacteriana a 0°C durante 1θ minutos. Em seguida cultivaram-se as bactérias transformadas em placas de agar LB contendo 50 pl/ ml de ampicilina.

Escolheram-se ao acaso 12 das colónias bacterianas e isolaram-se os plasmídeos destas colónias em microscala (ver Bimboim et al. em Nucl. Acids Res. 2» 1513-1523 (1979)· 0 ADN resultante foi cortado com a endonuclease de res trição Saci e separou-se o ADN em gel de agarose (1%, 1 x iam pão TBE). A migração do ADN sob a forma duma molécula linear de 4 400 pb confirmou que tinha sido inserido no plasmideo um sítio de reconhecimento de Saci. Seleccionou-se um destes pias mídeos aleatoriamente. Transformou-se novamente E. coli HB101 • com o ADN proveniente da respectiva minipreparação. A partir

das bactérias resultantes seleccionou-se uma colónia que se cultivou numa escala maior. Cortou-se o plasmídeo isolado a partir desta cultura com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI, separou-se o ADN num gel de agarose a 1% e isolou-se o fragmento menor a partir do gel por electroeluição. Este fragmento de ADN EcoRI-BamHi, com cerca de 460 pb de comprimento, foi sequenciado de acordo com Sanger (ver Sanger et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. £4, 5463-5467 (1977)). 0 plasmídeo analisado deste modo foi designado por pRH 100.

I Exemplo C

Construção do plasmídeo p^NFc^R-1

Digeriram-se 10 /ig de ADN do plasmídeo pTb^R-1 com 20 unidades de HindIII em 50 ^ul dum meio de tampão salino (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgClg 10 mM, DTT 1 mM) durante 1 hora e em seguida com 20 unidades de EcoRI em 100 p.1 de tampão de alta concentração salina (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgClg 10 mM, DTT 1 mM) durante 1 h, obtendo-se o fragmen to HindIII-EcoRI contendo uma região de 100 kpb de cADN de Fc^R solúvel (ver Figura 17*. início no nucleótido 5θ4) . O ADN digerido foi aplicado numa electroforese preparativa de agaro se a 1% e os fragmentos de cerca de 1 kpb HindIII-EcoRI foram electroeluidos a partir de geis fragmentados e precipitados em etanol a 70% a -80°C durante 1 h. Digeriu-se 1 pg do plasmídeo pGEM4 (Promega Biotec) com 2 unidades de HindIII e 2 unidades de EcoRI como descrito acima, extraiu-se com fenol fe precipitou-se com etanol a -80°C durante 1 h. 0 fragmento HindIII-EcoRI e o plasmídeo pGEM4 digerido com HindIII-EcoRI foram incubados com 200 unidades de ligase T4 em 10 ^1 de tam pão de ligase (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgClg 10 mM, DTT 10 mM, espermidina 1 mM, ATP 1 mM, ASB 0,1 mg/ml) a 4°C durante 16 h e transfectou-se em E. coli (MC1065). Seleccionou-se um clone, propagou-se e após confirmação da respectiva construção designo u- s e NFc^ R-l.

• • Exemplo D

P^NFcêR-2

Construção do plasmídeo

Digeriram-se 200 yg do plasmídeo pFc^R-1 com 400 unidades de EcoRI em 200 jal dum tampão de alta concentração salina durante 2 h a 37° θ e submeteu-se a electroforese num gel de agarose a 1% preparativo. Electroeluiu-se em fragmento EcoRI de cerca de 1,7 kb e precipitou-se por etanol a -80°C durante 1 h. Digeriram-se 4 jig do fragmento com 10 unidades de Accl a 37°0 durante 3 h β® 4θ ^1 dum tampão de baixa concentração salina e digeriram-se parcialmente com 0,4 unida Q des de Sau3A a 37 C durante 20 min., extraiu-se com fenol e precipitou-se com etanol a fim de obter o fragmento Sau3A-EcoRI (ver Figura 17: início no nucleótido 254). 0 fragmento de ADN foi ligado a um adaptador sintético de 1,7 yg (5'-GA.TCTGAGTCATGGTACCATGACTCAGATCGTGCTG-3’) com 200 unidades de ligas e T4 em 10 pl de tampão de ligação a 4°C durante 16 horas, em seguida extraiu-se com fenol e precipitou-se com etanol ,0s fragmentos foram dissolvidos, digeridos com 24 unidades de Kpnl em 40 yl dum tampão de baixa concentração salina a 37°C durante 3 h, extraídos com fenol e precipitados com etanol. 0 excesso de adaptador foi removido por cromatografia em gel com uma coluna Biogel A50m. Os fragmentos foram precipitados com etanol.

Separadamente digeriu-se 1 pg de pGEMÚ com 8 unidades de Kpnl em 20 yl dum tampão de baixa concentração sa lina a 37°C durante 2 h, incubando-se em seguida com 8 unidades de EcoRI em 4o yl dum tampão de alta concentração salina a 37°C durante 2 h.

Os fragmentos que tinham sido previamente ligados a adaptadores sintéticos foram em seguida ligados ao plasmídeo pGEM4 digerido com Kpnl-EcoRI por incubação com 200 unidades de ligase T4 em 10 yul de tampão de ligação a 4°C durante 16 h e transfectados em E. coli (MCIO65). Por meio duma técnica de hibridaçao de colónias, isolou-se o clone p^NFcpR-2 no qual está ausente apenas o domínio citoplasmático, propa gando-se em seguida.

Exemplo 1

a) Isolamento de Fcp R impuro do sobrenadante de culturas

Cultivaram-se células RPMI-8866 em meio RPMI164o suplementado com 10% de soro fetal de vitela e com antibióticos (100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina) numa densidade de 1x10^ células/ml e com uma viabi lidade das células de 95 a 99% em garrafas de Spinner. Recolheram-se as células após 5 minutos de centrifugação a 5 OOO rpm, lavaram-se 3 vezes com BSS de Hank e cultivaram-se na mes ma densidade em meio isento de soro durante 48 horas em garra fas de Spinner. 0 sobrenadante da cultura foi separado e adicionou-se fluoreto de fenilmetil-sulfonilo (FFMS) (1 m M) ,0,02% de azida de sódio (NaN^) e 200 unidades/ml de aprotenina. Durante a concentração os sobrenadantes da cultura foram conser vados a 4°C.

A concentração de sobrenadantes de culturas de células RPMI-8866 foi levada a efeito por meio dum sistema de filtração Amicon usando um filtro DIAFLO YM1O. O material concentrado 200 a 300 vezes foi em seguida centrifugado a 85 000 x G durante 4o min a 4°C a fim de eliminar o material insolúvel, obtendo-se deste modo uma preparação de Fc^R impuro .

b) Isolamento de FcgR a partir de lisados celulares

Lavaram-se 4 vezes células RPMI-8866 (2 xlO^ células) com PBS e lisaram-se em 10 ml de tampão lisogénico (PBS contendo 0,5% de Nonindet Ρ-4θ (NP-4o) e FFMS 1 mM duran te 45 min em gelo com agitação periódica em vórtice. Adiciona ram-se 10 ml adicionais de tampão lisogénico e continuou-se a lisar as células durante mais 30 min em gelo. 0 lisado foi centrifugado a 37 000 rptn durante 45 min a 4°C. A camada de lípidos foi retirada cuidadosamente e o sobrenadante foi isolado e conservado a -70°C .

Exemplo 2

Purificação· por í muno afinidade

Adsorveram-se sequencialmente o concentrado do sobrenadante duma cultura (ver Exemplo la) equivalente a 5 a 10 litros de cultura em 2 ml geis de ASB-Sepharose, Sepharo se-transferrina humana e Sepharose-Ig de rato normal (igRN)du rante uma hora cada a 4°C com rotação. 0 efluente recolhido do último gel de imunoafinidade foi em seguida aplicado em 2 ml de anti-Fc^R(3“5) acoplado a Sepharose. Deixou-se continuar a iminoadsorção durante cerca de 4 a 16 horas a 4°C com rotação. 0 gel foi deitado numa coluna, recolheu-se o efluente e lavou-se o gel sequencialmente com 150 ml de tampão A (Tris-HC1, 10 mM, pH 7,5, NaCl, 0,5 M, NP-40 a 0,5%), 150 ml de ta_m pão B (Tris-HCl, 10 mM, pH 7,5, NP-40 a 0,1%) e 150 ml de tam pão C (Tris-HCl, 10 mM, pH 7,5), eluiu-se com 25 ml de ácido acético a 2,5% (v/v) e neutralizou-se imediatamente em Tris-HC1 2 M a pH 8,0. Conservou-se o produto obtido a -80°C quan do não usado imediatamente para purificação adicional usando HPLC. Em seguida fraccionou-se o eluido por HPLC de fase reversa numa coluna C4 utilizando um gradiente linear de O a 65% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético.

Exemplo 3

Análise por imunosorvente ligado a enzima (ELISA)

Determinou-se a actividade de Fc^ R por intermédio da respectiva capacidade para se ligar aos anticorpos monoclonais 3-5 e 8-30 e mediu-se utilizando uma análise por imunosorvente ligado a enzima (ELISA) com dois anticorpos. Co meçou-se por revestir placas de microtitulação de 96 alvéolos com o anticorpo monoclonal 3“5 na quantidade de 100 jil/alveolo (10 /ig/ml) em tampão de revestimento (NaHCO^ 0,1 M, pH 9,6) e em seguida incubou-se durante a noite a 4°C. As placas foram em seguida lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento cons • “* • tituido por tampão de pH de fosfato de Dulbecco contendo 0,005%

de Tween 20, adicionando-se em seguida 100 pl da amostraa ana lisar diluida em tampão de diluição (Tris-HCl 0,005 M, pH 8,1, MgClg 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 a 0,05% (v/v), NaN^ 0,02 %, ASB 1%). As placas de microtitulação foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente e lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento, adicionando-se em seguida 100 jil de conjugados pretitulares e diluidos de IgM de cabra anti-rato-fosfatase alcalina. As placas foram incubadas durante duas horas â temperatura ambiente e lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento. Na fase final adicionaram-se 10θ μΐ de tampão de substrato (NaHCO^ 0,05 M, pH 9,8, MgClg * 6 H^O, 10 mM) e mediu-se a reacção oolorimétrica de 30 em 30 min durante duas horas a 405 e a 620 nm.

Exemplo 4

Hidrólise do receptor Fc^ por meio de lisilendopeptidase e separação de peptídeos

Fc^R purificado foi digerido com lisilendopeptidase de Achromobacter lyticus em tampão de Tris-HCl 50mM a pH 9,5 durante 6 horas a 35°C com uma proporção de enzima para substracto de 1:500 (p/p). Os fragmentos de peptídeo lio filizados foram purificados por HPLC.

Separação dos peptídeos por HPLC de fase reversa

Efectuou-se a separação dos peptídeos por HPLC usando uma coluna C4 num cromatógrafo de líquido Hitachi 655 equipado com um processor de gradiente 655-60 e um injector de amostra Rheodyne com um ciclo de amostra de 100 jil. A eluição dos peptídeos foi levada a efeito com um gradiente linear de

2-propanol!acetonitrilo = 7^3 (v/v) de 0 a 35% durante 1 hora em ácido trifluoroacético a 0,1% e com um caudal de 1,0 ml/min. Os peptídeos fraccionados foram recolhidos manualmente por de terminação contínua da absorvância a 215 nm.

• Análise de ácidos aminados e determinação da sequência

- 47 As análises de ácidos aminados foram levadas a efeito num analisador de ácidos aminados Hitachi 835-5 após hidrólise dos fragmentos peptídicos em HC1 5,7 a 110°C em tubos selados sob vácuo durante 22 a 24 horas. Efectuou-se uma degradação de Edman automática com um sequenciador de proteínas 470 A (Applied Biosystems, Inc. CA) usando um programa normal para a sequenciação. Os ácidos aminados derivatizados com feniltio-hidantoina (FTH) foram determinados por HPLC de fase reversa com eluição isocrática (ver Tsunawasa et al. em J. Biochem. 22» 701-704 (1985)).

Detectaram-se as seguintes sequências de ácidos aminados:

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn-Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-,

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu-Asp-Leu-Lys- e

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-,

Exemplo 5

Preparação dum oligonucleótido da fórmula

T T A A

3’-TT ACC TAG TT AA GT -5'

C A G G oligonucleótido foi sintetizado usando um sintetizador ADI ao nível de 0,2 pMol.

oligonucleótido resultante foi desmetilado com tiofenol/trietilamina/dioxano (1:2:2) à temperatura ambien te em 90 minutos e foi lavado com metanol (10 x 1 ml de metanol ).

Depois de remover o oligonucleótido desmetila

do a partir de vidro de poro controlado (controlled pore glass = CPG) e de retirar o grupo protector com amónia concentrada durante 1 hora à temperatura ambiente e 16 horas a 55°C , se(R) cou-se o oligonucleótido por meio de Speedvac'' ,

Levou-se a efeito uma purificação adicional sobre um gel de acrilamida a 20%/ureia 8 Mol com tampão TBE (10,9 g de tris (hidroximetil)-aminometano, 5,5 g de ácido bó rico e 9,3 g de sal dissódico do ácido etilenodinitrilo-tetra acético em 1 1).

A electroforese em gel subsequente (40 cm x

0,1 cm) foi levada a efeito a 50 Watt. Separou-se por corte a banda correspondente ao oligonucleótido de 17 bases, eluiu-se com água e eliminaram-se os sais numa coluna de 0,9 x 13 cm de meio Sephadex g 25 em água.

Recolheram-se e combinaram-se as fracções con tendo o oligonucleótido de 17 bases e secou-se este. Rendimento: 7,7 DO^^^ (aproximadamente 285 pg).

Exemplo 6 / +

Estabelecimento de transformantes de células L Fcg R

Um milhão de células Ltk foi co-transfectado com 150 ng do gene tk derivado do vírus de Herpes simplex e 20 yug de ADN de células RPMI-8866 genómico de alto peso molecular (ver Wigler et al. em Cell 16, 777-785 (1978))· Seleccionaram-se as células depois de serem conservadas em meio HAT durante 10 dias. Recolheram-se as células L que demonstraram resistência a HAT, coraram-se com anti-Fc R (8-3θ) biotinado e com avidina conjugada com isotiocianato de fluoresceina (iTCF) e separaram-se por FACS. Foram levados a efeito vários ciclos de separação para cada transfecção. Foram obtidas duas linhas transformantes, L-V-8-90 e L-VI-8-30, a partir de trans fecções independentes.

Exemplo 7

Clonagem do cADN de Ec^R

a. Sonda I: Isolou-se o ADN total a partir do transformante L-V-8-30 de células L Fc^ R⁺ pelo método de guanidínio/cioreto de césio (ver Chirgwin et al. em Biochemistry 18, 5294-5299 (1979))· Preparou-se poli(A)⁺ ARN por cromatografia em oligo-dT-celulose. Sintetizou-se cADN marcado por isótopos radioactivos a partir de poli(A) ARN usando P-dCTT (ver Davis et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 2194-2198 (1984)). 0 cADN marcado foi temperado com um excesso de poli(A)⁺ ARN de células Ltk não transformadas e foi aplicado a uma coluna de hidroxiapatite. Recolheu-se o cADB de cadeia simples que foi usado como sonda I.

b. Sonda II; Os oligonucleótidos de 17 bases complementares da sequência de mARN que codifica para o fragmento de ácidos aminados Lys-Trp- -Ile-Asn-Phe-Gln, contendo uma mistura das 24 sequências possíveis, foram marcados com γ-^²Ρ-ΑΤΡ por polinucleótido-quinase T4.

Sintetizou-se cADN de dupla cadeia a partir de poli(A)⁺ ARN derivado de células RPMI-8866 usando um siste ma de síntese de cADN Amersham (Amersham, Reino Unido) (ver Gubler e Hoffman em Gene 25, 263-269 (1983))· Após tratamento com EcoRI-metilase e com ADN-polimerase T4, clonou-se o cADN de dupla cadeia de comprimento superior a 1000 pb no sítio EcoRl de J(gtlO usando adaptadores de EcoRl e acondicionando-se in vitro usando um sistema Gigapack (sistemas de clonagem de vectores). Fizeram-se dois conjuntos de filtros de réplica de placas fágicas. Um conjunto de filtros foi hibridado com oligonucleótidos com o comprimento de 17 bases marcados com ³²P (sonda II) (ver Wood et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 1585-1588 (1985)). Um outro conjunto de filtros foi hibri dado com cADN subtraído marcado com ^J P específico em relação * a células L positivas Fc^R (sonda i) durante a noite em SSC 6 g X a 68°c e foi lavado com SSC 0,1 x e SDS a 0,1% durante 2 ho

ras. As placas que hibridaram com ambas as sondas foram isola das.

Exemplo 8

Expressão de cADN de Fc^R

a) Para a expressão de cADN de Fc£,R em pGEM4 usando o promo tor SPón sintetizou-se mARN com ARN-polimerase SP6 usando como molde pFc^R-1 digerido por BamHI (ver melton et al. Acids. Res. 12, 7035-7056 (1984)). Injectaram-se 10 ng num oacito e, para testemunho negativo, preparou-se de similar e injectou-se noutro oócito mARN BSF-1 mutino. de 2 dias de incubação em meio de Barth a 20°C, in íwl.

de mARN modo

Depois lisaram-se os oócitos em 50 pl de tampão lisogénico (Tris-HCl 10 mM, pH 7»5» NaCl 0,5 M e NP40 0,5%). Os lisados de oocitos foram experimentados para verificação da actividade de FcgR usando um método de ELISA constituído por uma técnica desandwich e uti lizando dois anticorpos anti-Fc^R 3~5 e 8-30. Como testemunho positivo usou-se o sobrenadante concentrado de uma cultura de células RPMI-8866.

b) Para a expressão de cADN de Fc^R em células Cos-7» clonou -se a inserção de pFcg.R-1 no sítio EcoRI do vector pDE2 (ver Publicação de Patente Japonesa 1986/88879 de 7 de Maio de 1986). Inocularam-se células Cos-7 (5xlO^J) em placas de 60 mm um dia antes da transfecção. Levou-se a efeito a transfecção com 2 jug de ADN plasmídico em 1 ml de Tris-HCl 25 mM (pH 7,5)» NaCl 137 mM, KC1 5 mM, Na HPO^ 0,6 mM, MgClg, CaCl^ 0,7 mM e 500 jig de DEAE-dextrano (Phamacia Fine Chemical). Depois de 1 hora de incubação a 37°C, substituiu-se a solução com FCS a 10% contendo DMEM e cloroquina 150 jiM, incubou-se a 37°C durante 3 horas e em seguida renovou-se a solução dom FCS a 10% contendo DMEM. 48 horas mais tarde coraram-se as células com anticorpo anti-FcgR 3~5 conjugado com fitocianina e com IGE bio finada, revelou-se com ITCF-avidina e analisou-se por um FACS de laser duplo (ver Kikutani et al. em J. Exp. enuimpressão (1986)).

Exemplo 9

Determinação da sequência de nucleótidos do cADN do Fc^R

A inserção de pFc^R-1 foi digerida com as enzimas de restrição HindIII e PvuII. O ADN digerido foi subclo nado em Ml 3 e sequenciado (ver Sanger et al, em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 (1977)) e confirmado pelo procedimento de Maxam e Gilbert (ver Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 (1977))·

Exemplo 10

Análise de mancha Northern do mARN do Fc^R

Separaram-se 3 microgramas de poli(A)⁺ ARN de várias células em gel de agarose a 1%, transferiram-se para papéis de nitrocelulose e hibridizaram-se com uma inserção de pFc^R-1 submetida a uma translação de entalhe (ver Th®mas et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22» 5201-5205 (198θ)). Para indução de BSF-1, cultivou-se um milhão de células B ou T com ou sem 10 pg/ml de IgE e 50 p/ml de BSF-1 humano recombinante (ver Yokota et al. em Proc. N_atl. Acad. Sei. USA em publicação (1986)) durante 24 horas e extrairam-se 10 pg de ARN total que se analisaram pela técnina de mancha de Northern eomo descrito acima.

Exemplo 11

Expressão em levedura da parte solúvel em água do receptor hu mano Fc^ de baixa actividade

Part e Ii

Preparação dos plasmideos pJDB-244 e pJDB-245

a) Preparação do plasmídeo pRH 241 contendo o terminador de levedura ADHI:

Preparação do vector

Digeriram-se duplamente 10 pg de Bluescribe M13+ (Stratagene, San Diego, CA92121, USA) com 2θ unidades de cada uma das enzimas de restrição Sall e Sphl. Terminou-se a reacção por adição de 1/25 vol. de EDTA 0,5 M (sal dissódico do ácido etilenodinitrilotetraacético) e aquecimento a 7θ°0 durante 10 minutos. O vector cortado foi purificado por electrof orese em gel de agarose (1% de agarose, tampão de TBE 1 x (tampáo de TBE 1 x: 6,05 g/1 de tris-(hidroxi lamino metano ), 3,1 g/1 de ácido bárico, 0,37 g/1 de EDTA); contendo 0,5 jug/ml de brometo de etídio; electroforese a 4 V/cm). Depois de loca lizar a banda de ADN por meio de luz ultra-violeta (254 nm) electroeluiu-se o ADN usando papel DE81 e purificou-se por uma precipitação final com etanol. Dissolveu-se o ADN em 10 pl de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).

Preparação da inserção

Digeriram-se 10 pg de pWS214s4 usando 20 unidades de cada uma das enzimas de restrição Sphl e Sall. Isolou-se o fragmento menor contendo o terminador ADHI por electrof orese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Por fim dissolveu-se o ADN em 10 ^il de TE.

Ligaram-se 1 pl do ADN vector e 1 pl do ADN da inserção em 10 pl de solução usando ADN-ligase T4. Usaram-se 3 pl da solução de ligação para transformar E. coli JM101 (SupE, thi. del (lacproAB), F'/traD36, proAB, laclq, lacZ-delMlló/, lambda menos). Algumas das colónias resultantes de pois de selecção por ampicilina foram cultivadas à escala de 1 ml. Os plasmideos foram isolados (ver Bimbiom H. et al. em Nucl. Acids Res. 2» 1513 (1979)) θ foram digeridos com Sphl e Sall. Os fragmentos foram separados num gel de agarose. A pre sença do fragmento terminador ADHI foi confirmada por um fragmento de ADN de aproximadamente 34o pb (pares de bases). Um dos plasmideos foi seleccionado para utilização adicional e foi designado por pRH 241 (mapa de restrição: ver Fig. 10).

b) Preparação do plasmideo pRH 242 contendo o promotor ADHI

de levedura e o terminador ADHI de levedura (ver J. L. Bennetzen et al. em J. Biol. Chem. 257. 3018-3025 (1982)):

Preparação do vector

Submeteram-se a digestão dupla 10 pg de pRH 241 com EcoRI e Knpl. Libertou-se a parte do vector do fragmen to menor por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Por fim dissolveu-se o vector em 10 pl de TE.

Preparação da inserção

Cortaram-se com Sphl 10 ug do plasmídeo pY-JDB-Hu-IEN-omegal (ver exemplo A e pedido de Patente Alemã P 36 35 867.3» depositzdo em 22 de Outubro de 1986). A saliên cia na extremidade 3* foi removida por adição de 5 unidades de ADN-polimerase I de E. coli na presença de dGTP. Cortou-se ainda o ADN com Xhol e isolaram-se os fragmentos resultantes por meio de electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. A extremidade romba do fragmento de 4oO pb de comprimento contendo o promoter ADHI foi convertida por ligação do seguinte par de adaptadores·.

EBI-4-10: 5’ AATTGGAAGGATC 3*

EBI-429: 3' CCTTCCTAG-p 5'

A extremidade coesiva do fragmento de restrição foi convertida usando o par de adaptadores:

EBI-418 5’ p-TCGAGCACGTGGTAC 3'

EBI-429: 3’ CGTGCAC 5'

Depois de ligação simultânea dos dois adaptadores, purificou-se novamente o fragmento promotor ADHI por meio de electroforese em gel de agarose. Dissolveu-se o ADN em 5 pl de TE.

Ligaram-se 1 ;ul de vector e 5 P--L da inserção num total de 10 pl de solução usando ADN-ligase 74. Por ligação da inserção no vector são destruídos os sítios EcoRIe Kpnl

Usaram-se 3 pl da solução de ligação para transformar E. coli JM 101. Foram verificadas várias colónias à microscala com o fim de detectar a presença do plasmídeo com a construção pretendida por meio de restrição dos plasmídeos com várias enzimas de restrição. Foi seleccionado um plasmídeo e designado por pRH 2^2 (mapa de restrição; ver Figura 11).

c) Preparação do plasmídeo pRH 2^3 contendo o promotor ADHI de levedura, um gene que codifica para o peptídeo guia do factor de emparelhamento de levedura (F^E) (ver J. Kurjan et al. em Cell 30, 933-9^3 (1982)), um sítio de clonagem múltipla e o terminador ADHI de levedura;

gene do peptídeo do guia do FftE foi sinteti zado quimicamente por meio do codão de utilização de levedura (ver J. L. Benetzen et al. em J. Biol. Chem. 257, 3026-3031 (1982)).

Preparação do vector

Submeteu-se 1 jag do plasmídeo pRH24-2 a digestão dupla com Xhol e Xbal. 0 fragmento vector foi purificado por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipi tação . 0 ADN foi dissolvido em 30 jil de TE.

Preparação da inserção

Preparou-se, usando um sintetizador de ADN Applied Biosystems 381A, um conjunto de 10 oligodeoxinucleáti do s *

Nome Sequência

MF 1 TCCAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT (50 bases)

MF 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATATGA

GGC (53 bases) • MF 3 CGCTGCTTCGTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACG • AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70 bases)

MF 4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACT GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (?0 bases)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48 bases)

MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAACTCAGAGTAACCGATGA (48 bases)

MF 7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC

ACTACTATTGCATCGATTGCT (69 bases)

MF 8 CCTTAGCAGCAATGGATGGAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG

TTAGTGGAGTTGGAGAATG (69 bases)

MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCGTCTGCAGGAATTCT (49 bases)

MF 10 CTAGAGAATTCGTGCAGAGGCCTCTTGTCCAAAGAAACAGCTTCTT (46 bases)

Fosforilaram-se 60 pmol de cada oligonucleóti do excepto MF 1 e MF 10 em 5 pl de solução usando polinucleotidoquinase T4 (PNQ). As reacções foram feitas parar por aque cimento das amostras a 100°C durante 1° minutos. Combinaram-se 5 pl de MF 1 (6θ pmol) com a solução MF 2, bem como as so luções de MF 3 com MF 4; MF 5 com MF 6; MF 7 com MF 8 e 5 pl de MF 10 foram adicionados à solução de MF 9· As soluções com binadas foram aquecidas novamente a 100 C e arrefecidas lenta mente até à temperatura ambiente. Depois desta fase de têmpera, as quatro soluções foram combinadas, adicionaram-se 20 unidades de ligase T4 e levou-se a efeito a ligação a 14°C du rante 16 horas.

Por fim combinaram-se 0,5 pl do ADN vector com 7 pl da reacção de ligação referida acima e ligaram-se usando 5 unidades de ligase t4. Transformou-se E. coli JM101 com 3 pl desta solução de ligação. Isolaram-se os plasmídeos de vá. rias colonias, submeteram-se a dupla restrição com Xhol a Xbal

e purificaram-se por electroforese em gel de agarose. Os pias mídeos que continham uma inserção da dimensão esperada (290 pb) foram caracterizados adicionalmente por subclonagem da in serção em M13mp8 e sequenciação usando o método de terminação de cadeia dideoxi de Sanger (ver Sanger F. et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463-5467 (1977))· Um plasmídeo contendo a inserção pretendida (ver Fig. 12) foi designado por pRH 243 (mapa de restrição: ver Fig. 13)·

d) Preparação do plasmídeo pRH 244 contendo o promotor ADHI, a sequência que codifica para o fragmento solúvel em água de Fc^R e o terminador ADHI (ver Fig. 15)·

Preparação da inserção

Foram cortados 20 pg de pGEM4-Fc£R (plasmídeo pGEM (Promega Biotec, Madison, ΉΙ53711, EUA) contendo o fragmento maior HindIII-EcoRI do cADN de Fc^R) com 40 unidades de cada uma das enzimas de restrição EcoRI e HindlII e as extremidades coesivas foram preenchidas utilizando o fragmento Kle now de ADN-polimerase I do E, coli e os trifosfatos dos quatro deoxinucleásidos (dXTP*s), 0 ADN foi desfosforilado utili zando 10 unidades de fosfatase de intestino de vitela (CIP, Boehringer Manheim), liberto das proteínas através de duas eg trações com fenol/clorofórmio e foi separado num gel de agaro se. Após electroeluiçao e precipitação, o fragmento contendo a região que codifica para o fragmento solúvel em água de Fc/R foi dissolvido em 10 pl de TE.

Uma vez que o HindlII corta o cADN de Fc^R cerca de 50 pb acima do primeiro ácido aminado do fragmento solúvel (Met-150), a inserção de pGEM4-Fc^R é novamente corta da com Sau3A. Este procedimento não só remove a região a montante em 5’ mas também os nucleótidos que codificam para os primeiros 18 ácidos aminados N-terminais do fragmento solúvel. Dois oligodeoxinucleótidos ligantes de fórmula

ΕΒΙ-491:

5' TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TGC TCT

GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-495:

3* CGAGTATATGTTACC TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA

AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG

Sau3A foram sintetizados para restaurar o gene completo utilizando a sequência de utilização de codão de levedura da fórmula

Met

5' TCGAGCTCATATACA ATG 3'__CGAGTATATGT TAC

Xhol

155

160

165

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAA

TTG

CAA

GTT

TCC

TCT

GGT

TTC

GTT

TGT

AAC

ACT

TGT

CCA

GAA

CTT

AAC

GTT

CAA

AGG

AGA

CCA

AAG

CAA

ACA

TTG

TGA

ACA

GGT

CTT

Lys Trp
AAG TG	3’
TTC ACC TAG	5’
Sau3A

Temperaram-se em conjunto 25 pmol de cada um dos oligodeoxinucleótidos e adicionaram-se a aproximadamente 3 jug do fragmento de Sau3A (5' Fosf ato)-EcoRI (preenchido e des fosforilado) e ligado num total de 20 ^11 utilizando ADN-ligase Τ4. 0 fragmento XhoI-(EcoRIó resultante foi purificado por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Este fragmento foi dissolvido em 20 jil de TE.

Preparação do vector

Foram cortados 10 jil do plasmideo pRH 242 com • Xbal e as extremidades foram tornadas nao salientes pela reac

ção de preenchimento de Klenow. O ADN foi mais uma vez cortado com Xhol e o fragmento maior foi isolado por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Foi dissolvido em 100 pl de TE.

Ligaram-se 1 pl de vector e 1 pl da inserção num total de 10 pl utilizando ADN-ligase T4 (a ligação dum sí tio EcoRI preenchido num sítio Xbal preenchido restaura tanto o sítio EcoRI como o sítio Xbal). Foram usados 3 pl da reacção de ligação para transformar Em cloi JM101. Isolaram-se plasmídeos de várias colónias e analizaram-se usando várias enzimas de restrição para detectar a presença eventual do gene do fragmento solúvel em água de Fc^R. Um dos plasmídeos foi em seguida seleccionado e o fragmento Xhol-Xbal foi parcialmente sequenciado a fim de confirmar a correcção da. junção entre o promotor ADHI e o gene humano. Este plasmídeo foi designado por pRH 244 (ver Fig. 14).

e) Preparação do plasmídeo pRH 245 contendo o promotor ADHI de levedura, o gene do guia do factor de emparelhamento de levedura, o gene para o fragmento solúvel em água de Fc^R e o terminador ADHI (ver Fig. 15).

Preparação do vector

Submeteram-se 10 pg do plasmídeo pRH 243 a di gestão dupla com EcoRI e Stul. 0 fragmento maior foi purifica do por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. 0 ADN foi em seguida dissolvido em 100 pl de TE.

Preparação de inserção

Submeteram-se 20 pg do plasmídeo pG-EM4-Fc£R a digestão dupla com EcoRI e HindIIT e em seguida a desfosforllação. A inserção foi de novo cortada com Sau3A e o fragmento maior foi isolado. A fim de restaurar a região completa que . codifica para o fragmento solúvel da fórmula

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAA

TTG

CAA

GTT

TCC

TCT

GGT

TTC

GTT

TGT

AAC

ACT

TGT

CCA

GAA

CTT

AAC

GTT

CAA

AGG

AGA

CCA

AAG

CAA

ACA

TTG

TGA

AGA

GGT

CTT

Lys Trp

AAG TG 3’

TTC ACC TAG 5'

Sau3A

sintetizaram-se dois oligonucleótidos	da fórmula
EBI-430;
5’ ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC	ATG	GAA	TTG	CAA	GTT	TCC
TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT	CCA	GAA	AAG	TG
Θ EBI-437:
3’ TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG	TAC	CTT	AAC	GTT	CAA	AGG
AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA	GGT	CTT	TTC	ACC	TAG	5’

Sau3A

Temperaram-se em conjunto 25 pmol de cada um dos oligodeoxinucleótidos e adicionaram-se a aproximadamente 3 pg do fragmento de Sau3A-EcoRI. Efectuou-se uma ligação em 20 pl de solução utilizando ADN-ligase Τ4. 0 ADN resultante foi purificado por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Este ADN foi dissolvido em 20 pl de TE.

Ligaram-se 1 pl do fragmento vector e 1 pl do fragmento inserção num total de 10 pl utilizando ADN-liga.se Τ4. Foram usados 3 pl da reacção de ligação para transformar

E. coli JM101. Isolaram-se plasmídeos de várias colónias e analisaram-se usando várias enzimas de restrição para detectar a presença eventual do gene do fragmento solúvel em água de FcgR. Um dos plasmídeos foi em seguida seleccionadoeo fra gmento Clal-Xbal foi parcialmente sequenciado a fim de confir mar a correcção da junção entre a porção do factor de emparelhamento e o gene humano. Este plasmídeo foi designado por pRH 245 (ver Fig. 15).

f) Preparação dos vectores de leveduras

Os plasmídeos pRH 244 e pRH 245 foram construí dos usando um vector de E. coli (Bluescribe M13+) que facilita a sequenciação das inserções. A fim de expressar ambas as versões do gene do fragmento solúvel em água de Fc^R em levedura, toma-se necessário cortar ambos os plasmídeos recombinantes com HindIII e BamHI, o que liberta o bloco integrado constituído por promotor ADHI, gene de guia de FpcE (no caso de pRH245). gene do fragmento solúvel em água de FcgR e termi nador ADHI. Estes ADN’s podem ser ligados em pràticamente qualquer vector de levedura que possua os sítios de restrição por enzimas adequados. Como exemplo escolheu-se o plasmídeo pJDB2O7 (ver V.D. Beggs em Gene cloning in yeast , Ed. R. Williamsons Genetic engineering 2, 175-203 (1982), depositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen sob o número DSM 3181)). 0 plasmídeo pJDB2O7 contém uma origem de replicação 2μ e um marcador de selecção leu2. Este plasmídeo replica-se extracromossomicamente em levedura.

Preparação dos_vectores de leveduras

Submeteram-se 10 pg do plasmídeo pJDB2O7 a du pia digestão com HindIII e BamHI. 0 fragmento maior foi isola do por electroforese em gel de agarose, electroeluição e precipitação. Este ADN foi dissolvido em 50 pl de TE.

Preparação dos vectores de leveduras

Submeteram-se 10 pg dos plasmídeos pRH 244 e pRH 245 a dupla digestão com HindIII e BamHI. Os blocos integrados de expressão foram igualmente isolados por electrofore se em gel de agarose. As inserções foram dissolvidas em 10 pl

de TE.

Ligaram-se 1 pl do fragmento vector e 1 pl do fragmento inserção num total de 10 pl utilizando ADN-ligase T4. Transformou-se E. coli JH101 com 3 pl da solução de ligação. Isolaram-se plasmídeos de algumas das colónias resultantes e analisaram-se usando várias enzimas de restrição para verififiar a correcção da construção. Foi seleccionado um pias mídeo de cada tipo e designaram-se por:

pJDB-244, contendo o bloco integrado de expres I são sem a sequência guia do Fp^E e pJDB-245 contendo o bloco integrado de expressão com a sequência guia do F^E.

Isolaram-se ambos os plasmídeos em maior esca la e usaram-se para transformar (ver Beggs J.D. em Nature 275, 104 (1978)) a estirpe de levedura WS21-3 (¢(., leu2, his3, ura3, pep4).

Part e II:

Preparação dos plasmídeos 289al e 289b3

Digeriu-se 1 pg do plasmídeo de levedura YEpl3 ) com 5 unidades de HindIII e BamHI a 37° C durante 3 horas em tampão Core (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, MgCl^ 10 mM, NaCl 50 mM). 0 vector linearizado foi isolado por meio de electroforese em gel de agarose usando 0,7% de gel de agarose (ver Dretzen et al. em Anal. Biochem. 112, 295)·

Digeriu-se 1 pg de cada um dos plasmídeos pRH244 e pRH245 com HindIII e BamHI. Isolaram-se o fragmento de 1650 pb de comprimento do plasmídeo pRH244 e o fragmento de 1900 pb de comprimento do plasmídeo pRH245 de acordo com o procedimento descrito acima.

Ligaram-se 50 ng do vector linearizado e 200 * ng de cada um dos blocos integrados de expressão a 14°C em 20 * pg do tampão de ligase (Tris-HCl 66 mM a pH 7,6, MgClg 6,6 mM,

DTT 10 mM, rATP 1 mM e 0,1 mg/ml de ASB) na presença de 1 uni dade de ADN-ligase TU durante a noite.

Usaram-se 10 pl da mistura de ligação para a transformação de E. coli HB101 (ver Maniatis et al. em Molecu lar Cloning - A Laboratory Manual, página 250) e seleccionaram-se as colónias transformadas pela resistência à ampicilina.

Os plasmídeos de algumas das colónias resultantes foram verificados por análise de restrição a fim de confirmar a correcção da construção. Dois plasmídeos derivados respectivamente dos plasmídeos pRH244 e pRH24-5 foram desi gnados por plasmídeo 289al (derivado do pia smídeo pRH244) e por plasmídeo 289b3 (derivado do plasmídeo pRH245).

Transformou-se a levedura WS21-1 (a leu2 his3 trpl pep4) com os plasmídeos 289al e 289b3 (ver Nature 275,104 (1978)).

Exemplo 12

Expressão do fragmento solúvel de Fcg.R em E. coli

Preparação do vector

Digeriram-se com 10 jig do plasmídeo pRH 100 (ver Exemplo B e Himmler A., Hauptman R., Adolf G, e Swetly P. em J. Interferon Res. (1986), em publicação). Removeram-se as saliências 3’ por adição de 5 unidades de' ADN-polimerase I de E. coli e dGTP. 0 plasmídeo linearizado foi desfosforilado por adição de 10 unidades de FIV e por incubação a 37°C durante 30 minutos. Depois de duas extracções com fenol/clorofórmio, purificou-se adicionalraente o ADN por electroforese, electroeluição e precipitação. Dissolveu-se o vector linearizado em 10 yil de TE.

Preparação da inserção _ 63 -

Submeteram-se a dupla digestão com EcoRI e HindIII 20 pg do plasmídeo pGEM4-FcgR (plasmídeo GEM4 (Promega Biotec, Madison, W1537H, USA) contendo o fragmento maior HindlII-EcoRI do cADN de FcgR). As extremidades 5’ salientes foram tornadas alinhadas por adição do fragmento de Klenow de ADN-polimerase I e dos quatro dXTPs. Os grupos fosfato em 5’ foram removidos por meio de FIV. Depois de purificação em gel de agarose tornou-se a cortar com Sau3A o fragmento contendo o fragmento solúvel de Fc^R e isolou-se o fragmento maior.

Temperaram-se em 10 /ul de solução 50 pmol de cada um dos nligonucleótidos.

EBI-496í

5' GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3'

ΕΒΙ-497:

3’ CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACÇTAG 5’ Sau3A restaurando o quadro de leitura com início no segundo codão (Glu) do gene do fragmento solúvel de FcgR e usando codões preferidos de Ε. coli (Sharp P.M., Li W.-H. Nucl. Acids Res. 14, 7737-7749 (1086)) por aquecimento a 100°C e arrefecimento lento. Os oligodeoxinucleótidos e a inserção de ADN foram ligados usando ADN-ligase T4. Após desnaturação por aquecimento da enzima, adicionaram-se polinucleotidoquinase T4 e ATP a fim de fosforilar as extremidades 5' da inserção. Depois de purificação em gel de agarose, dissolveu-se o ADN em 10 jil de TE.

Combinaram-se e ligaram-se 1 jul do ADN vector linearizado e 5 pl do ADN da inserção. Metade da mistura resultante foi usada para transformar E. coli HB 101 (F-, hsdS20 (rb-, mb-), recA13, ara-14 proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (resistente a Sm), xyi-5, mtl-1, supE44, lambda menos). Isolaram-se • os plasmídios de algumas das colónias resistentes à ampicili. na e a correcção da construção foi verificada por analise de

restrição. Um plasmídeo foi seleccionado e analisado adicionalmente por sequenciação de ADN da junção promotor de Trp

- gene do fragmento solúvel de Fc£R. Depois desta prova final, o plasmídeo foi denominado pRH 246 (ver Fig. 16).

Exemplo 13

Construção do plasmídeo psFc^R-1

a) Digeriram-se 35θ jhg do plasmídeo pBSF2-38 (ver Nature 324, 73-7ú (1986)), o qual contém o cADN de BSF-2 no sítio Smal do plasmídeo pGEM4, com 7θθ unidades de EcoRI e BamHI em 5θΟ yã. de tampão de alta concentração salina (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, MgCl₂ 10 mM, DTT 1 mM) durante 2 horas a 37°C. 0 ADN digerido foi aplicado sobre uma placa de electroforese em gel de agarose a 1% e o fragmento EcoRI-BamHI contendo o cADN integral de BSF-2 de 1,2 kpb foi electroeluido do gel, precipitado com 7θ% de etanol e dissolvido a uma concentração de 1 jpg/ml em tampão TE. Digeriram-se 20 jug deste fragmento com 4θ unidades de Hinfl em 50 jil de tampão de alta concentra ção salina durante 1 hora, extraiu-se com fenol e precipitou-se com etanol. Os ADNs digeridos foram dissolvidos em 25 fíl de tampão de translação de encaixe (Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, MgSO^ 10 mM, DTT 0,1 mM, 50 ug/ml de ASB) e incubou-se com 1 ml de 8,2 unidades/ml de fragmento de Klenow e dNTP 1 mM a 2(? C durante 3θ minutos. A reacção de preenchimento foi terminada por incubação a 7°°C durante 5 min. 0 fragmento resultante de 127 pb de extremidades alinhadas foi extraído por fenol, digerido com 40 unidades de Kpnl em 50 jul dum tampão de baixa concentração salina (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgClg 10 mM, DTT 1 mM) durante 1 hora a 37°C, incubado com 2,5 unidades de fos fatase alcalina bacteriana a 65°C durante 30 min e em seguida aplicado sobre uma placa preparativa de gel de agarose a 1% e submetido a electroforese. 0 fragmento de 110 pb contendo a sequência guia de BSF-2 foi electroeluido e precipitado com etanol. - 0 fragmento de 110 pb foi dissolvido em 10 μΐ de • tampão de ligação (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCl_Q 10 mM, DTT . 10 mM, espermidina 1 mM, ATP 1 mM, 0,1 mg/ml de ASB), foi li- 65 -

gado com 1 jog de pGEM4 digerido com Kpnl e Smal por incubação com 200 unidades de ligase T4 a 4°C durante 16 h e foi transfectado em E. coli (MC10Ó5). A partir das colónias obtidas co lheram-se 4 colónias, seleccionou-se um clone, propagou-se e, após confirmação de que o plasmídeo deste clone seleccionado continha apenas a sequência guia, denominou-se pBSF2-L8 (ver Figura 20).

b) Digeriram-se 80 jig de plasmídeo LE-392 ou pGEM4 (pFcfR-1) com 150 unidades de HindIII em 200 pl de um tampão de baixa concentração salina (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgClg 10 mM, DTT 1 mM) a 37°C durante 1 hora, aplicando-se em seguida sobre uma placa de electroforese preparativa de gel de agarose a 1%. 0 fragmento HindIII contendo a região solúvel de Fc^R foi ele ctroeluida do gel, precipitada por etanol e dissolvida a uma concentração de 1 jig/^il em tampão TE. Incubou-se 1 yag do fragmento HindIII com 8,2 unidades de fragmento de Klenow e dNTP mM em 10 pl de tampão de translação de encaixe 1 x a 20 C durante 30 min a fim de preencher as extremidades 3’ recessivas, extraiu-se com fenol e precipitou-se com etanol. Os fragmentos HindIII com as extremidades 3’ preenchidas foram dige ridos com 2 unidades de PstI em 10 jul de tampão de média concentração salina (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgCl^ 10 mM, DTT 1 mM) a 37° C durante 1 hora, incubou-se com 0,25 unidades de fosfatase alcalina bacteriana a 65°C durante 3θ min e precipitou-se por etanol. Em separado, digeriu-se 1 pg de plasmídeo pBSF2-L8 com 2 unidades de BamHI em 20 pl de tam pão de alta concentração salina a37°C durante 1 hora, extraiu -se por fenol e precipitou-se com etanol. 0 plasmídeo pBSF2-L8 digerido por BamHI foi dissolvido em 10 jil de tampão de translação de encaixe 1 x e foi incubado com 8,2 unidades de

O fragmento de Klenow e dNTP 1 mM a 20 C durante 3° minutos a fim de preencher as extremidades 3’ recessivas, extraído com fenol e precipitado com etanol. 0 precipitado foi dissolvido em 20 pl dum tampão de alta concentração salina, digerido com unidades de PstI a 37°C durante 1 hora, extraído com fenol • e precipitado com etanol. 0 fragmento digerido por PstI con66

tendo a região que codifica para o FcgR solúvel e o plasmídeo pBSE2-L8 digerido por PstI foram ligados por incubação com 200 unidades de ligase T4 em 10 pl de tampão de ligação a 4^o C durante 16 horas e transfectados em E. coli (MC10Ó5). Tomaram-se 8 colónias de entre as colónias obtidas. Um dos clones foi seieccionado, propagado e, após confirmação da respectiva cons trução do plasmídeo, denominado psFcgR-1. 0 psFcg.R-1 contém sete bases da clonagem múltipla em pGEM4 entre o guia de BSF-2 e as sequências de Fc^R em quadro (ver Figura 17: nucleóti dos 137 a 143).

Exemplo 14

Expressão do cADN de Fc^R plasmídeo psFc^.R-1 contendo o cADN de FcgR modificado foi linearizado por digestão com a enzima de restrição BamHI. Sintetizou-se mARN com ARN-polimerase SPÓ usando o ADN do plasmídeo linearizado como molde de acordo com a técnica de Melton et al.. Injectaram-se cerca de dez nanograrnas de mARN em cada oócito de Xenopus leavis e incubaram-se os oócitos a 20°C em meio de Barth modificado suplementado com 100 jig/ml de penicilina e 1 yg/ml de estreptomicina. Depois de incubar durante 2 dias, o sobrenadante da cultura foi recolhido e os oócitos foram homogeneizados em PBS de Bulbecco contendo PMSF 1 mM. 0 lisado de PBS foi separado por centrifu gação de alta velocidade a 15 000 rpm durante 10 minutos. Os sólidos foram extraídos com NP-40 a fim de solubilizar o rece ptor ligado à membrana (0,5% de NP-4o, NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5).

Exemplo 15

Analise por SDS-PAG-E de Fc^R em oócitos

Dez oócitos que tinham sido injectados com mARN foram incubados com 100 ul de meio de Barth modificado o

contendo 150 uCi de ^S-metionina durante 24 horas a 20 C. Os

oócitos marcados foram lisados em 1 ml de tampão lisogénico (O,5% de NP-4O, NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7»5) e separa dos por centrifugação a 15 000 g durante 10 minutos. 0 lisado límpido e o sobrenadante da cultura foram preclarifiçados com Ig de rato normal ligada a esferas de Sepharose 4b e em seguida incubado com anticorpo (igGl) 3-5 ligado a esferas sOde Sepharose 4b durante 6o min. com agitação frequente em gelo. As esferas foram lavadas 2 vezes com tampão lisogénico e 2 vezes com tampão de alta concentração salina (NP-4o a 0,5¹% NaCl 0,5 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0) e por fim lavadas com tam pão lisogénico. Os imunoprecipitados foram eluidos com tampão de diluição de amostras SDS por aquecimento durante 2 min. As amostras foram analisadas por PAGE com SDS a 9% (ver Figura 24).

Exemplo 16

Detecção de Fc^R

A actividade de Fc^R foi medida por meio duma análise por imunosorvente ligado a enzima de duplo anticorpo (ELISA) usando dois diferentes anticorpos monoclonais anti-Fc^R, 3-5(lgGl) e 8-30 (igM.) que reagem com dois epítopos di ferentes no Fc^R. Pré-revestiram-se placas de microtitulação de 96 alvéolos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) com 100 yil/alvéolo de anticorpo 3-5 (10 jig/ml) em tampão de revestimento (tampão de carbonato 0,1 M, pH 9>6 a 0,02%) e foram incubados durante a noite a 4°C. As placas foram em seguida lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento (tampão de fosfato de Dulbecco, pH 7»4 contendo 0,05% (v/v) de Tween 20), seguindo-se a adição de 100 μΐ das amostras diluidas com tampão de diluição (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,1 com MgClg 1 mM, NaCl 0,15 M, 0,05% de Tween 20, 1% de ASB e 0,02% de NaN^). As placas foram incubadas durante duas horas à temperatura ambiente e lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento, adicionando-se em seguida 100 ml de conjugado de anticorpo 8-248-fosfatase alcalina (0,75 mg/ml). Após'4 horas de incubação, as placas foram lavadas 4 vezes e a reacção enzimática foi iniciada pela adição de 100 ul por ~Λ

alvéolo de fosfato de p-nitrofenilo a 1 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em tampão de substrato (tampão de carbona to 0,05 M, pH 9,8, MgClg 10 mM). Após incubação adequada (6θ a 90 min) as absorvâncias foram medidas com um leitor de micro-ELISA automático (Nippon Inter. Med., Tóquio, Japão) aos comprimentos de onda de 405 e a 620 nm (ver Figuras 21 e 22).

Exemplo 17

Determinação da ligação de Fc^R a IgE

As placas revestidas por anticorpo 3-5 foram incubadas com amostras de 100 jil durante 2 horas, lavadas 4 vezes com tampão de enxaguamento, adicionando-se em seguida 10 pg/ml de IgE humana monoclonal (mielorna PS). Depois de 2 horas de incubação à temperatura ambiente, as placas foram la vadas 4 vezes e incubadas novamente com anti-IgE humana monoclonal conjugada com fosfatase alcalina e em seguida reveladas por adição de substrato de fosfato de p-nitrofenilo conforme descrito anteriormente.

Exemplo 18

Formação de rosácea de IgE

É possível detectar Fc^R em linfócitos por una análise que usa RBC de bovino (ORBC) revestido com IgE humana (Gonzalez-Molina A. e Spielberg, H.L. J. Clin. Invest 59, 616 (1977)). 0 número de células que formam rosácea de IgE é esti mado depois de subtrair o número de ligação não específica com ORBC revestido com albumina de soro de bovino. Para inibição de formação de rosácea de IgE, misturaram-se 25 P.1 de células ^zcontendo Fc^R (5 x 10 /ml com um volume específico (p. ex.100 jil) da amostra a analisar ou de meio de comparação e incuba-se durante 1 hora a 4°C. Conta-se o número de rosáceas com 3 ou mais ORBC..Nas experiências I e III as células contendo Fc^R são células RPMI8866 e na experiência II são células * SKW6-CL4. 0 meio de comparação é o sobrenadante dos oócitos • de comparação, isto é, dos oócitos não transformados.

Nos resultados dos ensaios anteriores pode ve rificar-se que a) a análise por SDS-PAGE põe em evidência o produto de psFc^R-1 de oócitos que é reconhecido tanto pelo anticorpo 3-5 como pelo 8-30, que possui actividade de ligação a IgE e deu origem a bandas largas de proteínas (ver Figu ra 24) e b) o produto de p^NFc£R-l de oócitos que por compara ção carecem da região que atravessa a membrana N-terminal, po de ser reconhecido pelo anticorpo 3,5 mas não pelo anticorpo 8-30 e que não possui actividade de ligação de IgE. Estes resultados indicam que o produto de pjjNFc^R-l, que não possui uma sequência de sinal, não é processado convenientemente e que um processamento adequado, como no clone psFcgR-1 cria o epítopo que é reconhecido pelo anticorpo 8-30 e possui activi dade de ligação a IgE.

A expressão da parte solúvel em água do receptor Fcg. pode ser levada a efeito por cultura do respectivo E. coli ou levedura ou outros organismos usando técnicas de fermentação normais, seguida de concentração e de purificação do fragmento solúvel em água pretendido usando técnicas descritas anteriormente na secção a) isolamento e purificação da parte solúvel em água de Fc^R .

Por exemplo, cultivou-se levedura WS21-1 trans formada com o plasmídeo 289b3 (WS21-l/289be) durante cerca de 4θ horas em meio YHK8 num fermentador até que se atingiu uma densidade óptica (546 nm) de cerca de 45 (p eso seco das células: 13 g/1).

Após separação das células por centrifugação, determinou-se o rendimento de FcgR no sobrenadante obtido usan do uma técnica de ELISA específica.

Rendimento: 2,5 U/ml de Fc^ R (1 U/ml de FcgR corresponde à actividade dum sobrenadante de 1 x lCr de células RPMl/ml).

Composição de 1 1 de meio YHK8:

8,00	g de (NH₄)SO₄,
2,56	g de (NHjJPOO^,
1,16	g de KC1,
0,60	g de MgSO^ x 7 H₂0,
0,56	g de CaCl₂ x 2 H₂0,
o,o4	g de biotina,
80,0	mg de m-inosina,
4o, 0	mg de pantotenato de Ca,
8,0	mg de tiamina,
2,0	mg de piridoxina
3,1	mg de CuSO^ x 5 HgO,
19,0	mg de FeCl^ x 6 HgO,
12,0	mg de ZnSO^ x 7 HgO,
i4,o	mg de MnSO^ x HgO,
5,0	mg de ácido bórico,
1,0	mg de Kl,
3,0	mg de NaMoO^ x 2 HgO,
1,0	g de extracto de levedura,
0,5	g de ácido cítrico,
0,2	g de uracilo,
0,1	g de adenina,
15,0	g de ácido glutâmico,
0,5	g de triptofano,
0,2	g de histidina,
100, 0	g de glucose.

Embora em relação com o fragmento solúvel em água do receptor Fc se tenham sido acima descritos com algum pormenor a construção de vectores, a transformação de organis mos hospedeiros com esses vectores e a expressão do fragmento para o fragmento solúvel em água que começa no ácido aminado 150 do receptor Fcg. integral, é evidente que as operações de construção, transformação e expressão podem ser levadas a efei to de modo similar a fim de obter outros fragmentos solúveis

em água começando, por exemplo, nos ácidos aminados 50 a 149 do receptor Fc^ integral.

A Figura 1 apresenta a actividade de FcgR derivada de células RPMI-8866 solubilizadas por detergente NP-4o e sobrenadantes de cultura isenta de soro (0----0) e de lisado celular

A Figura 2 apresenta Fc^R solúvel purificado por imunoafinidade. Analisou-se Fc^R solúvel purificado por imunoafinidade derivado de sobrenadantes de uma cultura de ce lulas RPMI-8866 por NaDodSO^/PAGE sob condições não redutoras. Depois de submeter a electroforese, cortaram-se tiras de 4 mm de largura, trituraram-se e eluiram-se em tampão lisogénico durante a noite à temperatura ambiente. A actividade de Fc^R foi determinada por um método de ELISA utilizando dois anticorpos monoclonais específicos.

A Figura 3 apresenta a purificação de Fc^R so lúvel em água. Cone entraram-se 200 x em Amicon YM10 sobrenadantes de cultura isenta de soro de células RPMI-8866. Pré-adsorveu-se de forma sequencial em ASB-Sepharose, Transferri na-Sepharose, IgRN-Sepharose, seguindo-se cromatografia de imunoafinidade específica em 3~5-Sepharose, aplicação do eluí do numa coluna de HPLC C-4 e eluição com um gradiente linear de acetonitrilo de 0 a 65% contendo 0,1% de ácido trifluoroacético. As fracções contendo actividade de FcgR estão indica das por tracejado.

A Figura 4 mostra o receptor Fc^ solúvel em água purificado com um peso molecular de cerca de 25 kD. 0 Fc^ R solúvel purificado foi examinado por análise de SDS-PAGE, apresentando-se uma fotografia do gel corado com prata.

A

A Figura 5 apresenta o mapa de peptídeos do Fc^R solúvel em água depois de digestão com lisilendopeptida- * se e foi obtida após cromatografia por imunoafinidade com pre* • ·* — • -adsorção extensiva e HPLC.

A Figura 6 apresenta a análise por FACS de transformantes de células L. Os dois transformantes independentes de células L, L-V-8-30 (a) e L-VI-8-30 (b) foram corados com anticorpo de IgG humana biotinado de comparação (a, d), IgG humana (b, e) e anti Fc£R 8-30 (c, f) e revelados com ITCF-avidina. As células não coradas apresentaram o mesmo padrão do que as coradas com anticorpos de comparação (a e d). Os eixos x e y representam logaritmos de intensidades de fluo rescência e número relativo de células, respectivamente.

A Figura 7 apresenta a estratégia para clonagem de cADN.

A Figura 8 mostra a inserção de EcoRI no pias mídeo pDE2, denominada como vector pDE2-Fc£R-l.

A Figura 8' mostra a expressão de cADN de Rs^R em células Cos-7 transfectadas. As células Cos-7 transfectadas foram coradas com anticorpo anti-Fcg.R 3~5 conjugado com fitocianina e IgE biotinada, reveladas com ITCF-avidina e ana lisadas por uma análise por FACS de duplo laser; a) células transfectadas com pDE2 contendo cADN de IFN-/3 humano; b) células transf ectadas com pDE-2-Fcg.R-l. As projecções de contor no representam a expressão de correlação de dois determinantes de superfície mostrando linhas de pico contendo igual per centagem de células com a distribuição dos dois parâmetros.Os eixos X e Y representam respectivamente os logaritmos das intensidades de fluorescência verde e vermelha.

A Figura 9 mostra a inserção de EcoRI no pias mídeo pGEM-4.

A Figura 9¹ mostra a expressão de cADN de Fc^R em oócitos de Xenopus. Os oocitos injectados com transcrito de mARN de pFc^R-1, mARN de comparação ou com mARN de células 8866 foram incubados durante 2 dias e lisados, tendo os ní. veis de Fc^R nos lisados sido medidos por ELISA.

Figura 21: Oócitos de Xenopus foram injectados com transcritos de mARN de pFc^R-1, p^N-FcgR-1, p^N-FcgR-2 e psFcgR-1. Depois de 2 dias de incubação determinou-se a actividade de Fc^R no lisado de PBS, lisado de NP-4o e sobrenadante das culturas por ELISA utilisando anticorpos 3-5 β 8-30 anti-Fc_ÊR.

A Figura 22 mostra a ligação de IgE de Fc R solúvel derivado de oócitos injectados com mARN de psFc R-l. Os sobrenadantes das culturas destes oócitos foram incubados na placa revestida com anticorpo 3-5, seguido de IgE humana e por fim com AP-anti-IgE.

A Figura 23 mostra a inibição de formação de rosácea de IgE. Incubaram-se sobrenadantes ou sobrenadantes de comparação de oócitos injectados com mARN de psFc^R-1 com ORBC revestido de IgE humana e células SKW6-C14 (Exp. Il) e células RPMI 8866 (Exp. I e III) , representando os eixos xe y o número de ORBC ligado às células e o número relativo de células que formam rosácea, respectivamente.

A Figura 21 apresenta a análise por SDSA-Page de lisados por NP-4o e de sobrenadantes de culturas de expres são de oócitos de pFc^.R-1, p^N-Fc£R-l, p^N-Fc^R-2 e psFc^R-1. 0 marcador de peso molecular está indicado à esquerda.

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Lisado 117.000 6.160 0,05 100 c elular

1mpuro

Q.uadro 1i (continuação) Purificação de Fc.R de células RPMI-8866

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Material 3^-5~Sepharose IgRN-Sepharose IgE-Sepharose

EIuido Efluente Eluido Efluente Eluido Efluente

Purificado por HPLC 2,470 4,5 85,5 1.170

Quadro 3

CTCCT GCTTAAACCT GAGGA CGAATTTGGA

CAATCGCTCT GGTCGACCCC AACACACTAG

GTTAGCGAGA CCAGCTGGGG TTGTGTGATC

AACTCGACTA AGTGACCAGA GCTGTGATTG

TTGAGGTGAT TCACTGGTCT CGACACTAAC

TTGTCAGGGA GTGAGTGCTC CATCATCGGG

AACAGTCCCT CACTCACGAG GTAGTAGCCC

CTGTCTCTGA GACAGAGACT	CGGTCCCTGC GCCAGGGACG	35
GAGGACAGAC CTCCTGTCTG	ACAGGCTCCA TGTCCGAGGT	85
TGCCCGCTGA ACGGGCGACT	GTGGACTGCG CACCTGACGC	135
AGAATCCAAG	CAGGACCGCC	185

TCTTAGGTTC GTCCTGGCGG

10 15

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Gly

Gin

Tyr

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Ile

Glu

Leu

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GAG

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GGT

CAA

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AGG 230

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30

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GTG 275

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GTC

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CCC

GAC

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35

4o

45

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Leu

Trp

Ala

Gly

Leu

Thr

Leu

Trp

ACC

GCC

GCT

CTG

TGG

GCT

GGG

CTG

ACT

CTG

CTT

CTC

CTG

TGG 320

TGG

CGG

CGA

GAC

ACC

CGA

CCC

GAC

TGA

GAC

GAA

GAG

GAC

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50

55

60

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Trp

Asp

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Gin

Ser

Leu

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Gin

Leu

Glu

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GAC

ACC

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AGT

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CTG

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CTG

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TGT

GTC

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GTC

GAC

CTT

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TCC

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65

70

75

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Ser

Gin

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GCC

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GTC

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CAA

GTT

TCC

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AAC

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CAC

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GCC

TTG

CAG

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GTT

CAA

AGG

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AAC

CTT

TCG

GTG

80

85

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Gin

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Gin

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Gin

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Gin

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Ser

Gin

GGT

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ATG

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CAG

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CAG

TCC

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CAG

ATT

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66A

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GTC

TAC

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GTC

TTT

AGG

GTC

AGG

TGC

GTC

TAA

AGT

GTC

95

100

105

Glu

Leu

Glu

Leu

Arg

Ala

Glu

Gin

Arg

Leu

Ly s

Ser

Gin

GAA

CTG

GAG

GAA

CTT

CGA

GCT

GAA

CAG

AGA

TTG

AAA

TCT

CAG 500

CTT

GAC

CTC

CTT

GAA

GCT

CGA

CTT

GTC

TCT

AAC

TTT

AGA

GTC

110

115

120

Asp

Leu

Glu

Leu

Ser

Trp

Asn

Leu

Asn

Gly

Leu

Gin

Ala

Asp

Leu

GAC

TTG

GAG

CTG

TCC

TGG

AAC

CTG

AAC

GGG

CTT

CAA

GCA

GAT

CTG 54-5

CTG

AAC

CTC

GAC

AGG

ACC

TTG

GAC

TTG

CCC

GAA

GTT

CGT

CTA

GAC

125

130

135

Ser

Phe

Lys

Ser

Gin

Glu

Leu

Asn

Glu

Arg

Asn

Glu

Ala

Ser

AGC

TTC

AAG

TCC

CAG

GAA

TTG

AAC

GAG

AGG

AAC

GAA

GCT

TCA 590

TCG

AAG

TTC

AGG

GTC

CTT

AAC

TTG

CTC

TCC

TTG

CTT

CGA

AGT

140

145

150

Asp

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Glu

Val

Thr

Lys

Leu

Arg

Met

GAT

TTG

CTG

GAA

AGA

CTC

CGG

GAG

GTG

ACA

AAG

CTA

AGG

ATG 635

CTA

AAC

GAC

CTT

TCT

GAG

GCC

CTC

CAC

TGT

TTC

GAT

TCC

TAC

155

160

165

Glu

Leu

Gin

Vai

Ser

Gly

Phe

Vai

Cys

Asn

Thr

Cys

Pro

Glu

GAG

TTG

CAG

GTG

TCC

AGC

GGC

TTT

GTG

TGC

AAC

ACG

TGC

CCT

GAA 680

CTC

AAC

GTC

CAC

AGG

TCG

CCG

AAA

CAC

ACG

TTG

TGC

ACG

GGA

CTT

170

175

180

Lys

Trp

11 e

Asn

Phe

Gin

Arg

Lys

Cys

Tyr

Phe

Gly

Lys

Gly '

AAG

TGG

ATC

AAT

TTC

CAA

CGG

AAG

TGC

TAC

TTC

GGC

AAG

GGC 725

TTC

ACC

TAG

TTA

AAG

GTT

GCC

TTC

ACG

ATG

AAG

CCG

TTC

CCG

185

190

195

Thr

Lys

Gin

Trp

Vai

HLs

Ala

Arg

Tyr

Ala

Cys

Asp

Met

Glu

ACC

AAG

CAG

TGG

GTC

CAC

GCC

CGG

TAT

GCC

TGT

GAC

ATG

GAA 770

TGG

TTC

GTC

ACC

CAG

GTG

CGG

GCC

ATA

CGG

ACA

CTG

TAC

CTT

200

205

210

Gly

Gin

Leu

Vai

Ser

11 e

His

Ser

Pro

Glu

Gin

Asp

Phe

Leu

GGG

CAG

CTG

GTC

AGC

ATC

CAC

AGC

CCG

GAG

CAG

GAC

TTC

CTG 8L5

CGC

GTC

GAC

CAG

TCG

TAG

GTG

TCG

GGC

CTC

GTC

CTG

AAG

GAC

215

220

225

Thr

Lys

His

Ala

Ser

His

Thr

Gly

Ser

Trp

11 e

Gly

Leu

Arg

Asn

ACC

AAG

CAT

GCC

AGC

CAC

ACC

GGC

TCC

TGG

ATT

GGC

CTT

CGG

AAC 860

TGG

TTC

GTA

CGG

TCG

GTG

TGG

CCG

AGG

ACC

TAA

CCG

GAA

GCC

TTG

230

235

24o

Leu

Asp

Leu

Lys

Gly

Glu

Phe

11 e

Trp

Val

Asp

Gly

Ser

His

Val

TTG

GAC

CTG

AAG

GGA

GAG

TTT

ATC

TGG

GTG

GAT

GGG

AGC

CAT

GTG 9®

AAC

CTG

GAC

TTC

CCT

CTC

AAA

TAG

ACC

CAC

CTA

CCC

TCG

GTA

CAC

245

250

255

Asp

Tyr

Ser

Asn

Trp

Ala

Pro

Gly

Glu

Pro

Thr

Ser Arg

Ser

Gin

GAC

TAC

AGC

AAC

TGG

GCT

CCA

GGG

GAG

CCC

ACC

AGC

CGG

AGC

CAG 950

CTG

ATG

TCG

TTG

ACC

CGA

GGT

CCC

CTC

GGG

TGG

TCG

GCC

TCG

GTC

260

265

270

Gly

Glu

Asp

Cys

Vai

Met

Arg

Gly

Ser

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

GGC

GAG

GAC

TGC

GTG

ATG

CGG

GGC

TCC

GGT

CGC

TGG

AAC

GAC 995

CCG

CTC

CTG

ACG

CAC

TAC

GCC

CCG

AGG

CCA

GCG

ACC

TTG

CTG

275

280

285

Ala

Phe

Cys

Asp

Arg

Lys

Leu

Gly

Ala

Trp

Vai

Cys

Asp

Arg

Leu

GCC

TTC

TGC

GAC

CGT

AAG

CTG

GGC

GCC

TGG

GTG

TGC

GAC

CGG

CTG 1O4C

CGG

AAG

ACG

CTG

GCA

TTC

GAC

CCG

CGG

ACC

CAC

ACG

CTG

GCC

GAC

290

295

300

Ala

Thr

Cys

Thr

Pro

Ala

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

Glu

Ser

Met

GCC

ACA

TGC

ACG

CCG

CCA

GCC

AGC

GAA

GGT

TCC

GCG

GAG

TCC

ATG 1085

CGG

TGT

ACG

TGC

GGC

GGT

CGG

TCG

CTT

CCA

AGG

CGC

CTC

AGG

TAC

305

310

315

Gly

Pro

Asp

Ser

Arg

Pro

Asp

Pro

Asp

Gly

Arg

Leu

Pro

Thr

Pro

GGA

CCT

GAT

TCA

AGA

CCA

GAC

CCT

GAC

GGC

CGC

CTG

CCC

ACC

CCC 1130

CCT

GGA

CTA

AGT

TCT

GGT

CTG

GGA

CTG

CCG

GCG

GAC

GGG

TGG

GGG

Ser

Ala

Pro

Leu

HLs

Ser

TCT

GCC

CCT

CTC

CAC

TCT

TGA

GCATGGATA CAGCCAGGCC

CAGAGCAAGA H80

AGA

CGG

GGA

GAG

GTG

AGA

ACT

CGTACCTAT GTCGGTCCGG GTCTCGTTCT

CCCTGAAGAC ccccaaccac ggcctaaaag GGGACTTCTG GGGGTTGGTG CCGGATTTTC

CCCTGTGACA TTTTCTGCCA CCCAAACGGA GGGACACTGT AAAAGACGGT GGGTTTGCCT

CTCCTCTATG GCCCCTGCCT TCCCAGGAGT GAGGAGATAC CGGGGACGGA AGGGTCCTCA

CCAGATGGGA GTGCCCCCAA CAGCACCCTC GGTCTACCCT CACGGGGGTT GTCGTGGGAG

AACAGCACCC TCTCCAGATG CAGCCCCATC TTGTCGTGGG AGAGGTCTAC GTCGGGGTAG

GAGTATCCCC AGCTCAGGTG GTGAGTCCTC CTCATAGGGG TCGAGTCCAC CACTCAGGAG

AAATGGGGCA GTGATGGCCT CCCA

TTTACCCCGT CACTACCGGA GGGT

CCTCTTTGTG GGAGAAACAC	GCTGAAAGGT CGACTTTCCA	1230
GGCAGCTGAC CCGTCGACTG	ACATCTCCCG TGTAGAGGGC	1280
ACACCCCAAC TGTGGGGTTG	AGCACCCTCT TCGTGGGAGA	1330
TCCAGATGAG AGGTCTACTC	AGTACACCCC TGATGTGGGG	1380
TCCTCAGCAC AGGAGTCGTG	CCCAGGACCT GGGTCCTGGA	1430
CTGTCCAGCC GACAGGTCGG	TGCATCAATA ACGTAGTTAT	1480
		1504

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1& Processo para a preparação de um receptor Fc^ humano de baixa afinidade com um domínio N-terminal citoplasmático, um domínio C-terminal extracelular e um peso molecular de cerca de 46 kd bem como dos respectivos derivados glicosilados caracterizado por compreender a transformação dum organismo hospedeiro adequado com um vector de expressão contendo num sítio apropriado uma sequência de codificação constituída por uma molécula de ADN recombinante contendo a infor mação genética apropriada para a expressão ou um seu derivado degenerativo e por em seguida se isolar o polipeptideo preten dido dos transformantes resultantes.

-

2S -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o receptor Fcg humano de baixa afinidade obti do conter as seguintes sequências parciais de ácidos aminados: Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu-Asp-Leu-Lys- e

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-.

- 3^a 80

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o receptor Fc^ humano de baixa afinidade obtido ter a seguinte sequência de ácidos amina dos:

Met Glu Glu Gly Gin Tyr Ser Glu Ile Glu Glu Leu Pro Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gin Ile Vai Leu Leu Gly Leu Vai Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp His Trp Asp Thr Thr Gin Ser Leu Lys Gin Leu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn Vai Ser Gin Vai Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly Asp Gin Met Ala Gin Lys Ser Gin Ser Thr Gin Ile Ser Gin Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gin Gin Arg Leu Lys Ser Gin Asp Leu Glu Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gin Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys Ser Gin Glu Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu Vai Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gin Vai Ser Ser Gly Phe Vai Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp 11 e Asn Phe Gin Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gin Trp Vai His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Glu Leu Vai Ser 11 e His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Vai Asp Gly Ser His Vai Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin Gly Glu Asp Cys Vai Met Met¹ Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Vai Cys Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser

opcionalmehte O-glicosilada e/ou N-glicosilada no ácido amina do 63.

- 4* _

Processo para a preparação de uma fracção solúvel em água dum receptor Fc£ humano de baixa afinidade e dos respectivos derivados glicosilados caracterizado por se proce der de acordo com umaqualquer das reivindicações 1 a 3 conten do o vector de expressão referido uma sequência de codificação apropriada

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a fraeção solúvel em água do receptor Fcg humano de baixa afinidade, ou um seu derivado glicosilado, come çar em 50 e terminar em 150 da sequência de ácidos aminados referida na reivindicação 3·

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5 caraeterizado por a fraeção solúvel em água do receptor Fc^ humano de baixa afinidade, ou um seu derivado 0-glicosilado, conter a sequência de ácidos aminados da fórmu las

Met

Glu Leu Gin Vai Ser Ser Gly Phe Vai Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp 11 e Asn Phe Gin Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gin Trp Vai His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gin Leu Vai Ser 11 e His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp 11 e Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe 11 e Trp Vai Asp Gly Ser His Vai Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin Gly Glu Asp Cys Vai Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Vai Cys Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6 caraeterizado por a fraeção solúvel em água do receptor fc^ humano de baixa afinidade ter a fórmula referida na reivindicação 6 ou ser um seu derivado O-glicosilado.

- 8& Processo de acordo com qualquer das reivindi- cações 1 a 7 caracterizado por o receptor Fc humano de baixa afinidade, a respectiva fracção ou os respectivos derivados glicosilados serem obtidos por técnicas recombinantes essencialmente livres de outras proteínas de origem humana.

Processo para a preparação de um receptor Fc humano de baixa afinidade recombinante idêntico ao ddfinido de acordo com a reivindicação 8 ou dos respectivos derivados glicosilados caracterizado por se provocar a expressão de uma sequência de ADN da fórmula:

ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG ATC GAG GAG CTT CCC AGG AGG TAC CTC CTT CCA GTT ATA AGT CTC TAG CTC CTC GAA GGG TCC TCC CGG TGT TGG AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG CTG GTG GCC ACA ACG TCC GCA CCC TGA GTC TAG CAC GAC GAC CCC GAC CAC ACC GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG TGG TGG CGG CGA GAC ACC CGA CCC GAC GAC TGA GAC GAA GAG GAC ACC CAC TGG GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT GTG ACC CTG TGG TGT GTC TCA GAT TTT GTC GAC CTT CTC TCC CGA GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG TTC TTG AAC CTT TCG GTG GTG GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG CCA CTG GTC TAC CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC GAC TTG GAG CTG TCC TGG AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG CTG AAC CTC GAC AGG ACC TTG GAC TTG CCC GAA GTT CGT CTA GAC AGC AGC TTC AAG TCC CAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA TCG TCG AAG TTC AGG GTC CTT AAC TTG CTC TCC TTG CTT CGA AGT GAT TTG CTG GAA AGA CTC CGG GAG GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG CTA AAC GAC CTT TCT GAG GCC CTC CTC CAC TGT TTC GAT TCC TAC GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT

1b

AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG ACA CTG CTG TAC CTT GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTG GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC CTA CCC TCG GTA CAC GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

ou dum seu derivado degenerativo.

- 10* Processo para a preparação de uma fracção recombinante solúvel em água dum receptor Ec^ humano de baixa afinidade idêntico ao definido de acordo com a reivindicação 8 ou dos respectivos derivados O-glicosilados caracterizado por provocar a expressão de uma sequência de ADN com início no codão na posição aproximada de 50 e com fim no codão da posição aproximada de 150 da sequência de ADN referida na reivindicaÇao 9.

11®

Processo para a preparação de uma fracção recombinante solúvel em água dum receptor Fc^ humano de baixa afinidade idêntico ao definido de acordo com a reivindicação 8 ou dos respectivos derivados O-glicosilados caracterizado por se provocar a expressão de uma sequência de ADN contendo pelo menos a sequência da formulai

ATG TAC

GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG TTG TGC AGG GGA CTT AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG ACA CTG CTG TAC CTT GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC CTA CCC TCG GTA CAC GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

ou um seu derivado degenerativo.

12»

Processo para a preparação de uma fracção recombinante solúvel em água dum receptor Fcg humano de baixa afinidade idêntico ao definido de acordo com a reivindicação 8 ou dos respectivos derivados O-glicosilados caracterizado por se provocar a expressão da sequência de ADN referida na reivindicação 11.

- 13- Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por a sequência de ADN ser constituída pela sequência integral do cADN do Fc^R tal como referida na reivindicação 9 na qual pelo menos uma fracçao da sequência de codi ficação para es ácidos aminados 1 a 148 ter sido substituída por uma sequência de sinal eucariótica ou um seu derivado de generativo .

- 14* Processo de acordo com a reivindicação 13» ca racterizado por a sequência de sinal eucariótica ser a sequên cia de sinal de pBSF-2.38 ou um seu derivado degenerativo.

Processo para a preparação de uma molécula de

ADN recombinante contendo a informação genética referida em qualquer das reivindicações 1 a 14 ou um seu derivado degenerativo caracterizado por se digerir um vector apropriado com uma ou várias endonucleases de restrição apropriadas e por se isolar o ADN pretendido.

- 16â Processo de acordo com a reivindicação 15, ca racterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter adicionalmente as sequências do replicão e de regulação neces sárias para a expressão.

- 17^& -

Processo de acordo com a reivindicação 16, ca racterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter as sequências do replicão e de regulação para expressão em pro cariontes e em eucariontes.

- 18 & -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 16 ou 17 caracterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter as sequências do replicão e de regulação para expressão em E, coli ou numa levedura.

- 19Processo de acordo com a reivindicação 18, ca racterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter • como sequências do replicão e de regulação as respectivas se- 87 -

H quências do plasmídeo pER103«

- 20& Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter como sequência de replicao a origem de 2ji e como sequências de regulação o promotor de ADHI e o terminador de ADHI,

- 21- Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter como sequências do replicão e de regulação as respectivas sequências do plasmídeo pGEMU.

- 22& Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a molécula de ADN recombinante obtida conter adicionalmente a sequência do guia do factor de emparelhamento&.

- 23- 88

Processo para a preparação de um vector conten do uma molécula de ADN recombinante caracterizado por se inse rir num vector apropriado uma sequência de ADN obtida de acor do com qualquer das reivindicações 15 a 22.

Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o vector ser um vector plasmídico.

- 25- Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o vector ser um plasmídeo contendo uma sequên cia de codificação de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 22.

- 2ÓSProcesso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o plasmídeo ser o plasmíseo LE392 depositado em E, çoli sob FERM BP-llló contendo a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 9 dentro do plasmxdeo pGEM __ 4 sob a forma de uma inserção de EcoRI.

Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo pDE2-FcgR-I contendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 9 den tro do plasmídeo pDE2 sob a forma de uma inserção de EcoRI.

- 28 & Processo de acordo com a reivindicação 25, ca- racterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo pRH244 contendo as sequências de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 19 dentro do plasmídeo pBR322 sob a forma de uma inserção de EcoRI com o mapa de restrição apresentado na Fig. 16.

- 29^a Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo pRH244 contendo as sequências de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 20 dentro do plasmídeo Bluescribe Ml3+ sob a forma de uma inserção de BamHl/HindIII com o mapa de restrição apresen tado na Fig. 14.

- 30^a -

Processo de acordo com a reivindicação 25» caracterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo pRH245 contendo as sequências de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 20 dentro do plasmídeo Bluescribe Ml3+ sob a forma de uma inserção de Bam/HindTII com o mapa de restrição apresenta do na Fig. 15.

- 31^a -

Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo psFc^R-1 contendo a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 11 com o mapa de restrição apresentado na Fig. 19·

90 - 32^a -

Processo de acordo com a reivindicação 24, ca racterizado por o vector obtido ser um vector de levedura con tendo uma sequência de acordo com qualquer das reivindicações 29 ou 30.

- 33^â Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o vector obtido, designado por pJDB-244, conter o ADN de codificação de acordo com a reivindicação 29 sob a forma de uma inserção de BamHl/HindIII dentro do plasmídeo pJDB2O7.

- 34» -

Processo de acordo com a reivindicação 32, ca racterizado por o vector obtido, designado por pJDB245, conter o ADN de codificação de acordo com a reivindicação 3θ sob a forma de uma inserção de BamHl/HindIII dentro do plasmídeo pJDB2O7.

- 35- -

Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o vector obtido, designado por 289al, conter o ADN de codificação de acordo com a reivindicação 29 sob a forma de uma inserção de BamHl/HindIII dentro do plasmídeo YEpl3.

- 36a 91

Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o vector obtido, designado por 289b3, conter o ADN de codificação de acordo com a reivindicação 3θ sob a forma de uma inserção de BamHl/HindIII dentro do plasmídeo YEpl3·

- 37* Processo para a preparação de um organismo hos pedeiro transformado por um vector de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 26 caracterizado por se inserir uma sequência de ADN de acordo com qualquer das 15 a 22 num vector ad equado.

- 38 & Processo para a preparação de um oligonucleótido que codifica para uma sequência parcial de ácidos aminados de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se pro ceder à síntese do referido oligonucleótido por adição dos nu cleótidos correspondentes por meio dum oligo-sintetizador.

- 39* Processo de acordo com a reivindicação 38, ca racterizado por o oligonucleótido ter a fórmula

T Τ' A A

3'-TT2, ACC TAG ΤΊΤ aa gt -5’ ,

U A G tr o qual codifica para a sequência parcial de ácidos aminados da fórmula Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln- de acordo com a reivindicação 2.
4ο&

Processo de acordo com qualquer das reivindi cações 8 a 14 caracterizado por o vector de expressão usado ser obtido de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 36.

41&

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7 caracterizado pors cultivarem-se células linfoblastoides B e separar-se o Fc^R a partir do sobrenadante ou a partir das células lisadas por pu rificação sequencial de imunoafinidade.

- 42* Processo de acordo com a reivindicação 42, ca racterizado por as células linfoblastoides usadas serem células RPMI-8866.

- 43* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 41 ou 42 caracterizado por se absorver sequencialmente uma solução contendo Fc^R em Sepharose BSA, em Sepharose com transferrina humana ou em Sepharose-Ig de rato normal, por se aplicar o efluente a uma coluna de afinidade anti-FcgR e por se purificar adicionalmente por HPLC.

• • _ 44* 93 -

Processo de acordo com a reivindicação 43, ca racterizado por se preparar a coluna de imunoafinidade por acoplamento dum anticorpo correspondente a Sepharose.

- 45^a Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se submeter um receptor de Fc^. quando preparado de acordo com a reivindicação 43 a tratamento com tripsina ou com lisilendopeptidase e subsequente separação por meio de HPLC.

- 46& Processo para a identificação de veículos de expressão contendo genes que codificam para FcgR obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 caracterizado por compreender as fases dei sintetizar cADN a partir duma matriz de ARN derivado de células linfoblastoides produtoras de tnARN de Fc^R, incorporar o cADN assim sintetizado em veículos de expressão de modo a formar um banco de veículos de expressão, hibridar o referido cADN incorporado para identificar os veículos de expressão que contêm um gene que codifica para FcgR, com duas sondas marcadas contendo cADN específico para células Fc£R⁺L e um oligonucleótido comum do gene de Fc^R.

Processo de acordo com a reivindicação 46, ca * racterizado por a referida sonda I ser sintetizada a partir • “* • duma matriz de ARN isolado a partir de células Fc£R⁺L.

- 48*

Processo de acordo com a reivindicação 46, ca racterizado por a referida sonda II ser sintetizada a partir duma matriz de ARN contendo sequências de FcgR e por o referi do oligonucleótido, obtido de acordo com qualquer das reivindicações 37 ou 38, ser um iniciador.

- 49» -

Processo de acordo com a reivindicação 46, c racterizado por as referidas células linfoblastoides serem c lulas da linha RPMI-8866.

- 50* -

Processo de acordo com a reivindicação 46, ca racterizado por as referidas células Fc£R⁺L serem obtidas por transfecção de células Ltk com gene tk derivado de vírus de Herpes simplex e com ADN genómico de alto peso molecular de células RPMI-8866.

- 51* -

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de reacções alérgicas a IgE locais ou sistémicas caracterizado por se incorporar um polipeptideo quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14.

- 52* -

- 95 Processo de acordo com a reivindicação 51, ca racterizado por o polipeptideo ser incorporado numa quantidade efectiva em conjunto com um ou mais excipientes.

0 requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na Patente Europeia em 21 de Agosto de 1986, 23 de Setembro de 1986, 5 de Dezembro de 1986 e em 11 de Abril de 1987, sob os n^ss. 86 111 581.4,