KR0139629B1

KR0139629B1 - 미니-프로인슐린, 이의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR0139629B1
Application number: KR1019890008687A
Authority: KR
Inventors: 되르슈그 미카엘; 하베르만 파울; 자입케 게르하르트; 울만 오이겐
Original assignee: 하인리히 벡커, 베른하르트 벡크; 훽스트 아크티엔게젤샤프트
Priority date: 1988-06-23
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 1998-07-01
Also published as: JPH0285298A; HU214704B; ES2061797T3; PT90939A; IL90694A0; IE62511B1; IL90694A; DE58906966D1; FI893046A; EP0347781B1; NO892597L; HK1006023A1; NO302376B1; FI102076B1; HUT52548A; HU211552A9; AU3671889A; EP0347781A2; FI102076B; CA1341211C

Abstract

내용 없음

Description

미니-프로인슐린, 이의 제조방법 및 용도

제1도(1a도 및 1b도 포함)는 이.콜라이 발현벡터 pIK10 및 pSW3의 작제도이다.

제2도(2a도 및 2b도 포함)는 효모 발현 벡터 pαfB102 또는 pαfB104의 작제도이다.

본 발명은 단쇄화되지 않은 B쇄가 아르기닌 잔기를 통하여 A쇄에만 결합된 신규한 미니-프로인슐린(mini - proinsulin)에 관한 것이다. 인간 인슐린을 복잡한 화학적 반응없이도 이러한 미니-프로인슐린으로부터 수득할 수 있다.

단쇄화된 C쇄를 갖는 미니-프로인슐린은 공지되었다. 문헌[참고:R. Wetzelet al., Gene 16(1981), 63-71]에는 6개의 아미노산으로 축소된 C쇄를 갖는 프로인슐린이 기술되어 있다. 유럽 공개특허공보(EP-A) 제0,055,945호에는 프로인슐린의 C쇄가 2개의 아미노산으로 축소된 상응하는 프로인슐린이 기술되어 있다.

EP-A 제0,163,529호에는, 단쇄화된 B쇄를 갖는 인슐린 전구체가 기술되어 있으며 이 전구체의 C쇄의 완전히 소실되었거나 1개의 아미노산으로 단쇄화되어있다. 이들 전구체는 α-트레오닌 에스테르를 사용하여 트립신-촉매된 펩티드 전이 반응에 의해 성숙한 인간 인슐린으로 전환된다.

반면, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 인간 데스-(32-65) 프로인슐린 또는 미니-프로인슐린에 관한 것이다.

B(1-30)-Arg-A(1-21)(Ⅰ)

상기식에서, B(1-30) 및 A(1-21)은 인간 인슐린의 B 및 A쇄를 나타낸다. 이 화합물은 유럽특허(EP-B) 제 0,132,769 및 0,132,770호에 기술된 소위 모노-Arg-인슐린인 인간 인슐린 Arg^B31-OH 및 인간 인슐린을 제조하기 위한 중간체로서 사용될 뿐만아니라, 이는 또한 그자체로 특정 인슐린의 활성을 나타낸다.

따라서 본 발명은 특히 진성 당뇨병 치료용 약제로서 사용하기 위한 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 약제, 및 약리학적으로 허용되는 부형제 및 일반식(Ⅰ)의 화합물로 이루어진 약제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 효소적 절단에 의한 일반식(Ⅱ)의 모노-Arg-인슐린및 인간 인슐린을 제조하기 위한 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

상기식에서, A(1-21) 및 B(1-30)은 상기 정의한 바와 같고, -S-S- 브릿지는 인슐린에서와 같이 배열된다. 원-포트(one-port)반응으로 일반식(Ⅰ)의 화합물이 즉시 인슐린으로 전환되는 반응이 특히 유리하다.

또한 본 발명은 숙주세포, 바람직하게는 이.콜라이와 같은 세균내에서 또는 특히 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모내에서 본 화합물을 암호화하는 유전자 구조물을 발현하고, 유전자 구조물이 융합 단백질을 암호화하는 경우, 융합 단백질로부터 일반식(Ⅰ)의 화합물을 유리시킴을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하는 DNA 서열외에, 이러한 DNA를 함유하는 유전자 구조물 또는 플라스미드, 및 이러한 유전자 구조물 또는 플라스미드를 함유하는 숙주세포, 특히 이.콜라이와 같은 세균 또는 특시 사카로마이세스 세레비지에 균주와 같은 효모세표에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 융합 단백질, 바람직하게는 일반식(Ⅰ)의 화합물이 브릿지원-Met-Ile-Glu-Gly-Arg-을 통해 융합 단백질의 밸러스트(ballast) 성분에 결합되어 있는 융합단백질에 관한 것이다.

또한 본 발명의 바람직한 태양은 하기에서 더욱 상세히 설명된다.

도면은 실시예를 설명하는데 사용된다. 도면에 작제된 이들 벡터는 미니-프로인슐린을 암호화한다.

미니-프로인슐린은 정확하게 폴딩되어(folding) 트립신으로 절단된 후에 모노-Arg 인슐린이 거의 정량적으로 형성된다는 것이 밝혀졌다. 이로써 놀라웁도록 간단하게 모노-Arg 인슐린이 제조된다. 인간 인슐린은 자체 공지된 방법으로 모노-Arg 인슐린으로 부터 제조할 수 있다. 모노-Arg 인슐린은 또한 약제중의 활성 화합물로서 사용된다.(EP-B 0,132,769)

발현 벡터 pK50은 EP-A 0,229,998 또는 상응하는 AU-A 66,760/86에 공지되어 있다. 미니-프로인슐린은 이러한 작제물에 상응하는 융합 단백질의 형태로 이.콜라이와 같은 세균내에서 제조할 수 있다.

난용성 융합 단백질은 중성 완충액으로 세척함으로써 농축시킬 수 있다. 미니-프로인슐린은 할로겐화시안으로 절단시킴으로써 유리된다.[참고문헌:E. Gross and B. Wittkop, J. Am. Chem. Soc. 82(1961) 1510-1517]/ 이러한 미니-프로인슐린은 생물학적 활성 형태로 존재하지 않으며, 여러가지 분자간 및 분자내 디설파이드 브릿지를 갖는, 또한 가능하게는 다른 단백질 단편을 함유하는 비균질 혼합물로 이루어진다. S-설포네이트 형태의 분자가 화학적으로 균일한 비교적 안정한 유도체로서 제조된다[참고문헌: P.G. Katsoyannis et al., Biochemistry 6(1967)2635-2641]. 이러한 유도체는 이온교환 크로마토그라피에 의해 매우 용이하게 정제할 수 있고 정확한 디설파이드 브릿지가 형성된 천연 공간 구조로 폴딩(folding)하기 위한 출발물질로서 입증되었다[참고문헌: Y.C. Du et al., Sci. Sin. 15(1965) 229-236; H.P. Gattner et al., Hoppe- Seylers Z. Physiol. Chem. 362(1981) 1943-1049; B. H. Frank et al. in: Peptides: Synthesis-Structure-Function, D. H. Rich and E. Gross, Publishers, (1981) 1043-1049]. 폴딩의 성공은 에스. 아우레우스 프로테아제 V8로 절단한 후 형성된 단편을 HPLC로 분석함으로써 입증된다.[참고 문헌: U. Grau. Diabetes 34(1985) 1174-1180]. 모노-Arg 인슐린 또는 인슐린을 트립신 또는 카복시펩티다제 B의 작용 또는 동일한 작용을 갖는 효소[참고 문헌: W. Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246(1971) 2780-2795]에 의해 유리시키는 것은 명백하게 단순한 방법으로 진행되는데, 이는 정상적인 프로인슐린과 비교하여 가능한 절단부위의 수가 감소되는 것이 이러한 목적에 특히 유리하기 때문이다. 이런 이유때문에, 절단은(Des-B30 인슐린 또는 Desocta-B23-B30 인슐린의 제조시에서와 같은 부산물 형성 측면에서) 대조그룹보다 상당히 단순하다. 모노-Arg 인슐린과 인슐린 둘다는 이온 교환크로마토그라피에 의해 매우 순수한 형태로 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 인슐린 및 모노-Arg 유도체의 형성, 최종 생성물의 정제 및 정량과정은 통상의 RP-HPLC 방법[참고문헌: G. Seipke et al., Angew. Chem. 98 (1986) 530-548]으로 확인한다.

놀랍게도, 천연 프로인슐린과는 대조적으로 미니-프로인슐린의 절단시 어떠한 인슐린 Des-B30도 형성되지 않았다. 천연 프로인슐린은 인슐린으로부터 매우 어려운 방법으로 분리될 수 있기 때문에, 트립신 절단의 주 생성물인 인슐린-Arg^B31-Arg^B32및 모노-Arg 인슐린을 공지된 방법으로 이온 교환기를 통해 인슐린Des-B30으로부터 먼저 분리한 수 카복시펩티다제 B(EP-B 0,195,691)를 사용하여 절단하여 인간 인슐린을 수득하는 투-포트 반응(tow-pot reaction)이 천연 프로인슐린으로부터 인슐린의 제조시 바람직하다. 이에 비해, 미니-프로인슐린은 동시에 트립신 및 카복시펩티다제 B 또는 동일한 작용을 갖는 효소를 사용하는 원-포트반응(one-pot reaction)과 같은 이상적인 방법으로 인간 인슐린으로 전환될수 있다.

효모내에서 일반식(Ⅰ)의 화합물의 발현과 연속적인 분비가 특히 유리한데, 이는 정확하게 폴딩된 프로인슐린 유도체가 직접적으로 분리될 수 있기 때문이다. 효모는 예를들어 EP-A 0,248,227에서 기재된 바와 같이, 숙주계로서 사용되며 이들의 예로는 비.피키아 파스토리스(B. Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르피스(Hansenuls polymorphis), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 있다.

효모내에서의 발현 벡터는 여러가지가 공지되어 있다. 본 발명에 따른 인슐린 유도체의 제조방법은 다른 발현 시스템은 또한 그자체로 공지된 방법으로 사용 할 수 있기 때문에 효모 α-인자 시스템을 사용하여 하기에서 기술되는데, 이는 단지 실시예로서 예시되는 것이다.

효모 페로몬 유전자 MFα의 구조는 문헌[참고 문헌:Kurjan and Herskovitz, Cell 30 (1982) 933-943]으로부터 공지되었고, 여기에서 다른 유전자의 발현의 가능성 및 유전자 생성물의 분비 또한 논의되었다. 이와 관련되 참고문헌으로 하기를 들수 있다.[참고 문헌 : Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984), 4642-4646].

또다른 방도로서, 효모 킬러톡신(Killertoxin) 시스템을 사용하거나 산성 포스파타제 또는 인버타제 시스템을 통한 분비를 이용할 수도 있다.

효모벡터로서, 세균 플라스미드 및 효모 플라스미드 복제원 및 또한 양 숙주계내에서 선별을 위한 유전자 또는 유전자들을 갖는 소위 셔틀(shuttle) 벡터를 사용하는 것이 유리하다. 또한 이러한 벡터는 외래 유전자의 발현에 필요한 프로모터 서열 및, 필요한 경우 수율을 증가시키기 위한 터미네이터 서열을 함유함으로써 편의상 분비시그날에 융합된 히영 유전자는 프로모터와 터미네이터 사이에 배열 된다. 이러한 벡터는 예를들어 US-A 4,766,073에 기술되었다.

공지된 바와 같이, 유전자 암호는 축퇴되는데, 예를들어 단지 2개의 아미노산에 대해서만 단일 뉴클레오티드 서열이 암호화하도, 잔여의 18개의 암호화가능한 아미노산은 2 내지 6개의 삼중자로 암호화된다. 미니-프로인슐린을 위한 유전자를 합성하기 위하여, 다양한 코돈 조합이 선택될 수 있다. 미니-프로인슐린을 암호화하는 DNA 서열 Ⅰ[이는 2개의 유전자 단편 IK I(표1) 및 IK II(표2)의 형태로 표에서 재현된다]은 효모 및 이.콜라이 모두의 코돈용으로 적합하기 때문에 특히 유리하다는 것이 본 발명에 이르러 밝혀졌다.

제한 엔도뉴클레아제 KppI에 상응하는 돌출DNA 서열은 DNA 서열 Ⅰ의 암호화 쇄의 5'말단에 설정된다. 이에 비해, 제한효소 Hind Ⅲ에 상응하는 일본쇄 서열은 암호화새의 3'말단에서 돌출되었다. 이들 2개의 다른 인지서열은 DNA 서열 Ⅰ을 목적하는 방향으로 플라스미드내에 삽입할 수 있게 한다. 2개의 해독/종결코돈(정지코돈)은 암호화 서열내의 아스파라긴에 대한 삼중자 65번 다음에 온다. 제한 효소Pst Ⅰ(코돈 41/42)에 대한 내부의 독특한 절단부위는 pUC18 또는 이들 플라스미드의 유도체와 같은 잘 연구된 플라스미드내로 혼입될 수 있는 2개의 유전자 단편의 서브 클로닝을 가능하게 한다.

추가로, 제한효소에 대한 또한 수많은 추가의 독특한 인지 서열을 구조유전자내에 혼입할 수 있으며, 이는 한편으로는 프로인슐린의 부분 서열에 접근할 수 있게 하고 다른 한편으로는 돌연변이가 수행될 수 있게 한다.

DNA 서열 Ⅰ은 특정지점에서 천연 서열과 달리 변형된다. 이러한 방법으로, 제한효소에 대한 수많은 독특한 절단부위의 삽입이 가능하다.

DNA 서열 Ⅰ은 쇄길이가 47내지 96개의 뉴클레오티드 단위인 총 6개의 올리고뉴클레오티드로부터 작제될 수 있다. 이런 목적을 위한 방법이 하기에 기술되어 있다.

유전자 단편 IK I(표1)은 쇄길이가 47내지 74개의 뉴클레오타이드 단위인 4개의 올리고뉴클레오티드를 먼저 화학적으로 합성한 다음 이들을 3개의 튜클레오티드의 점성말단을 통하여 효소적으로 연결시킴으로써 작제할 수 있다. 점성 말단은 제한 효소 Dra Ⅲ의 점성말단에 상응하며, 이는 나중의 변형에 유리하다.

유전자 단편 IK Ⅱ(표2)은 쇄길이가 88 및 96개의 뉴클레오티드 단위인 2개의 화학적으로 합성되 올리고뉴클레오티드로부터 수득할 수 있다.

[실시예 1]

a) 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성

DNA 빌딩 블럭의 합성은 올리고뉴클레오티드 4(표1)를 예로서 사용하여 설명된다. 고상합성을 위하여, 3'말단의 뉴클레오사이드, 예를들어 본 경우에서는 아데닌(뉴클레오티드 제 125번)을 3'-하이드록실 작용기를 통하여 지지체에 공유결합하는데 사용한다. 지지체는 장쇄 아미노알킬 라디칼로 작용화된 CPG(조절된 공극 유리)이다.

하기 합성단계에서, 염기성분은 β-시아노에틸 N,N'-디알킬-5'-0-디메톡시-트리틸뉴클레오사이드-3'-포스포르아미디트로서 사용되며, 이때 아데닌이 N⁶-벤조일 화합물로서 존재하고, 시토신이 N⁴-벤조일 화합물로서 존재하며, 구아닌이 N²-이소부틸 화합물로서 존재하며 티민은 보호그룹없이 존재한다.

결합된 5'-0-디메톡시트리틸-N⁴-벤조일-2'-데스옥시아데노신 0.2μmol을 함유하는, 중합체성 지지체 25mg 연속적으로 하기 시약으로 처리한다:

A)아세토니트릴

B)디클로로메탄중의 3% 트리클로로아세트산

C)아세토니트릴

D)무수 아세토니트릴 0.15㎖중의 적절한 뉴클레오사이드-3'-0-포스파이트 5μmol 및 테트라졸 25μmol

E)아세토니트릴

F)40% 루티딘 및 10% 디메틸아미노피리딘을 함유하는 테트라하이드로푸란중의 29% 아세트산 무수물

G)아세토니트릴

H)용적비 5:4:1의 루티딘/물/테트라하이드로푸란중의 3% 요오드.

이와 관련하여, 포스파이트란 용어는 β-시아노-에틸2'-데스옥시리보오스-3'-모노포스파이트를 의미하고, 디이소프로필아미노 라디칼에 의해 3가가 충족된다. 각각의 합성단계의 수율은 각각의 경우 496nm 의 파장에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡수를 측정함으로써 탈트리틸화 반응 B)에 의해 분광학적으로 측정될 수 있다.

합성이 종결된 후에, 디메톡시트리틸 그룹의 절단은 A) 내지 C)에서 기술된바와 같이 수행된다. 올리고뉴클레오티드는 암모니아로 처리함으로써 지지체로 부터 절단되고 β-시아노에틸 그룹이 동시에 제거된다. 염기의 아미노 보호그룹은 50℃에서 16시간동안 농 암모니아로 올리고머를 처리함으로써 정량적으로 절단된다. 이같이 수득된 조생성물은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제된다.

올리고뉴클레오티드 1내지 3(표1), 5 및 6(표2)는 유사한 방법으로 제조된다.

b) 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 효소적 결합

5'말단에서 올리고뉴클레오티드를 효소적으로 인산화하기 위하여, 각각 1μmol의 올리고뉴클레오티드 1 및 4를 37℃에서 30분동안 20μℓ`의 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6) 10mM 염화마그네슘및 10mM 디티오트레이톨(DTT)중의 4 단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리한다. 효소는 95℃에서 5분동안 가열함으로써 불활성화된다. 돌출일본쇄 서열을 형성하는 올리고뉴클레오티드 2 및 3은 인산화되지 않는다. 이는 연속되는 결합반응에서 대형 유전자 단편의 형성을 방지한다.

올리고뉴클레오티드 1 내지 4는 하기와 같이 결합된다.: 각각 1μmol의 올리고뉴클레오티드 1 및 2 또는 3 및 4는 각각의 경우 이들을 20μℓ`의 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6), 10mM 염화 마그네슘 및 10mM DTT 중에 용해시키고, 이 용액을 95℃에서 5분동안 가열하고 2시간내에 실온까지 냉각시킴으로써 쌍으로 하이브리드화된다. 이러한 목적을 위해, 올리고 뉴클레오티드 1및 4는 이의 5'-포스페이트의 형태로 사용된다. 형성된 이중나선의 DNA 단편을 더욱 결합시키기 위하여, 이들 용액을 합하고 15분동안 60℃까지 가온한 다음 실온까지 냉각시킨다. 그후 0.1M DDT 2μ1, 2.5mM 아데노신 트리포스페이트(pH7) 16μ1 및 T4 DNA 리가제 1μ1(400단위)를 가하고 혼합물을 22℃에서 16시간동안 항온 처리한다.

이와 같이 수득된 유전자 단편(표1 및 2)의 정제는 10% 농도의 폴리아크릴 아미드 겔(우레아 부가없음, 40×20×0.1㎝)상에서 겔 전기영동에 의해 수행되고, Hinfi을 사용하여 절돤된 φ×174 DNA (BRL) 또는 Hae Ⅲ을 사용하여 절단된 pBR322를 표지화 물질로서 사용한다.

[실시예 2]

a) 합성된 DNA 단편의 클로닝

시판되는 플라스미드 pUC 19를 제한효소 KpnI 및 PstI를 사용하여 개환시키고 대형단편(1)을 0.8% 농도의 씨플라크(Seaplaque) 겔을 통하여 분리한다. 이 단편을 표1에 따라 합성된DNA(2)를 사용하여 T4 DNA 리가제와 반응시키고 결합 혼합물을 컴피턴트 이.콜라이 79/02 세포와 함께 항온 처리한다. 형질전환 혼합물을 20mg/l의 앰피실린을 함유하는 IPTG/XgaL 플레이트상에 도말한다. 플라스미드 DNA을 백색 콜로니로부터 분리하고 제한 및 DNA 서열분석으로 특성화한다. 목적하는 플라스미드를 pIK1이라 한다.

따라서, 표2에 따른 DNA(5)를, PstI 및 Hind Ⅲ(4)를 사용하여 개환된 pUC19내로 결합시킨다. 플라스미드 pIK2(6)을 수득한다.

b) 미니-프로인슐린 유전자의 작제

표1 및 2에 따른 DNA 서열(2) 및 (5)를 플라스미드 pIL1(3) 및 pIK2(6)으로 부터 재분리하고 KpnI 및 Hind Ⅲ(7)을 사용하여 개환시킨 pUC 19와 결합시킨다. 변형된 인간 인슐린 서열을 암호화하는 플라스미드 pIK3(8)이 수득된다.

프라스미드 pIK3(8)을 MluI 및 SpeI을 사용하여 개환시키고 대형단편(9)를 분리한다. 이를, B쇄(B30)의 최종 코돈에 하나의 아르기닌 코돈을 보충하고 절단된 코돈을 A쇄의 처음 7개의 아미노산으로 대체하며 A쇄의 아미노산 8 및 9에 대한 코돈을 보충하는 DNA 서열(10)과 결합시킨다.

따라서 플라스미드 pIK4(11)가 수득되고, 이는 본 발명에 따른 인간 미니-프로인슐린을 암호화한다.

c)미니-프로인슐린에 대한 발현 벡터

pIKI: EP-A 0,229,998(실시예 3: 제 3도(33))에 공지되어 있는 플라스미드 pK50(12)을 EcoRI 및 Hind Ⅲ를 사용하여 절단한다. 단편(13) 및 (14) 둘다를 분리한다. IL-2 부분 서열을 함유하는 소형단편(14)을 연속하여 MluI로 절단하고 IL-2 부분 서열(15)을 분리한다.

플라스미드 pIK4(11) EcoRI 및 HpaI를 사용하여 절단하고 대형 단편(16)을 분리한다. 이것을 IL-2 부분 서열(15) 및 합성 DNA(17)와 결합하여 플라스미드 pIK8(18)을 수득한다.

이는, IL2의 처음 38개의 아미노산 다음에 브릿지원 Met-Ile-Glu-Gly-Arg 이후 미니-프로인슐린의 아미노산 서열이 위치하는 융합 단백질을 암호화한다.

상술된 융합단백질을 암호화하는 EcoRI-Hind Ⅲ단편을 플라스미드 pIK8(18)로부터 절단한다. 이 단편을 pK50 절단시 수득된 대형 단편(13)과 결합시킨다. 이로써 상기와 같이 특성화된 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터 pIK10(20)을 수득한다.

pSW3: bom 부위를 포함하는 NdeI-BstEⅡ 단편이 벡터 pIK10(20)으로부터 제거되는 경우, bom 부위의 손실로 인해 비교적 높은 복제수로 세포내에 존재하는 벡터가 수득되어 더이상 결합 플라스미드에 의해 움직일 수 없게 된다.

이러한 목적을 위하여, pIK10(20)을 BstEⅡ 및 NdeI을 사용하여 절단하고, 이를 에탄올을 사용하여 침전시키며, DNA 폴리머라제 완충액중에 옮긴 다음 클레나우 폴리머라제 반응에 적용시킨다. 이같이 형성된 절돤된 DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하고 대형단편(21)을 분리한다. 이를 결합시켜 벡터 pSW3(22)을 수득한다. 컴피턴트 이.콜라이-Mc1061 세포를 형질전환하고 증폭시킨후에, 플라스미드 pSW3(22)를 분리하고 특성화한다.

[실시예3]

균주 이.콜라이 W3110내에서의 발현

플라스미드 pIK10(20)또는 pSW3(22)을 함유하는 이.콜라이 세포의 밤새 배양물을 50μg/ml 앰피실린 함유하는 LB 배지(J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harnor Laboratory, 1972)를 사용하여 약 1:100의 비로 희석하고 성장은 OD 측정법에 따라 측정한다. OD=0.5에서, 배양물을 1mM IPTG로 조절하고 150 내지 180분후에 세균을 원심분리한다. 세균을 완충혼합물(7M우레아, 0.1% SDS, 0.1M 인산나트륨, pH 7.0)중에서 5분동안 끓이고 샘플을 SDS 겔 전기영동 플레이트에적용시킨다. 겔 전기영동으로 분석한후, 기대되는 융합 단백질에 상응하는 약 10kd의 영역에서 추가의 밴드를 관측한다. 웨스터 블럿 시험에서 이 밴드는 인슐린에 대해 유도된 항체와 반응한다. 세포를 압력하에 붕해시키고 파편을 운심분리하는 경우, 융합단백질은 다른 불용성 세포 성분과 함께 침전물중에서 발견되다.

지시된 유도 조건을 진탕배양에 적용시킨다.; 대규모 발효시에는 예를 들어 변화된 OD 값을 수득하기 위하여 다른 배지 및 조건을 선택하는 것이 편리하다.

[실시예 4 ]

a) 모노-Arg 인슐린의 제조

원심분리시키고 인산염 완충액(pH7) 또는 물(건조 물질 함량 약 25%)로 세척함으로써 농축된 융합 단백질 40g을 98내지 100% 농도의 인산 75ml중에 용해시키고 BrCN 5g을 가한다. 실온에서 6시간동안 반응시킨후, 물 2ℓ을 혼합물에 가하고 이를 동결건조시킨다.

단편 혼합물(10g)을 완충액(8M 우레아, 0.2M 트리스-HCl(pH 8.5)) 1ℓ중에 용해시키고 30℃까지 가온하며 아황산나트륨 10g 및 나트륨 테트라티오네이트 2.5g을 가한다. 30℃에서 90분 후에, 냉수 3ℓ를 가하고 pH를 7.0으로 조절한다. 생성된 침전물을 원심분리한다. 미니-프로인슐린의 헥사-S- 설포네이트를 pH를 3.5까지 조절함으로써 상등액으로부터 침전시킨다. 4℃에서 15시간동안 항온 처리한 후 혼합물을 원심분리한다. 침전물을 물 200ml로 세척하고 동결건조시킨다. RP HPLC에 의해 측정된 미니-프로인슐린 함량이 900mg인 물질 혼합물 4.8g을 수득한다. S-설포네이트의 농축은 2단계로 수행된다.

1. 3M 우레아; 0.05M 트리스-HCl(pH 8.3)중의 프락토겔(

Fractogel) TSK DEAE 650M을 함유하는 5×60㎝ 컬럼을 통하여 음이온 교환 크로마토그라피를 수행한다. 0.05 내지 0.5M NaCl(각각 6ℓ) 구배를 사용하여 용출한다. 용출물을 등전점 포커싱에 의해 분석한후, 생성물을 1M 우레아로 희석하고 pH를 3.5로 조절하여 합한 분획으로부터 침전시킨다.

2. 고분자량 및 저분자량의 불순물을 3M 우레아, 0.05M 트리스-HCl, 0.05M NaCl(pH 8.3)중의 세파크릴(

Sephacryl) S200을 통하여 겔여과시킴으로써 제거한다. 분획의분석 및 생성물의 분리를 상술한 단계에서와 같이 수행한다. 침전물을 물 20ml으로 세척하고 동결건조시킨다. 69%순도까지 농축된 생성물 1.10g을 수득한다.

폴딩 및 디설파이드 브릿지 형성을 위하여, S-설포네이트를 pH 8.6에서 8M 우레아, 0.02M 트리스-HCl 50ml중에 용해시킨다. 옥탄올 수방울을 가한후, 정제된 질소를 15분동안 혼합물중에 통과시킨다. 2-머캅토 에탄올 1.1ml(16mMOL)을 가함으로써 실온에서 1시간동안 완전한 환원을 수행한다. 용액을 세파덱스(

Sephadex) G 25 컬럼(5×60㎝)에 적용시키고, 0.05M 글리신/NaOH(pH 10.6)을 사용하여 용출시킨다. 글리신 완충액 300ml중의 단백질 분획을 조사하고 필요한 경우, pH를 보정(10.6)한 후 4℃에서 2일동안 방치한다. 그후 용액을 pH 6.8조절하고 트립신(Merck, L-1-p-토실아미노-2- 페닐에틸클로로메틸케톤(TPCK)로 처리함) 1 mg(3.5U)과 함께 용액을 실온에서 4시간동안 항온 처리한다. 그후 pH를 3.5로 조절하고 대두 트립신 억제제(Sigma) 1mg 및 10% ZnCl 3ml을 가하고 용액을 pH 6.8까지 재조절 한다. 형성된 침전물을 원심분리하여 분리한다. 이를 50mM의 락트산 및 30% 이소프로판올로 이루어진 완충액(pH 3.5)중의 S-세파로우즈(S-Sepharose

)(2.5×40㎝)상에서 이온교환 크로마토그라피에 의해 정제한다. 0.05 내지 0.50M의 NaCl(각각 1ℓ)의 구배로 용출시킨다. 용출물을 HPLC에 의해 분석하고, 모노-Arg 인슐린을 H₂O로 1:1로 희석한후 1ℓ당 10% ZnCl₂10ml을 가하고 pH를 6.8까지 조절하여 생성물-함유 분획으로부터 침전시킨다. 원심분리에 의해 분리된 침전물을 1g/1의 폐놀, 10.5g/l의 시트르산 및 200mg/l의 ZnCl₂로 이루어진 완충액으로부터 pH6에서 결정화시킨다. 약간의 물로 세척된 결정을 동결건조시킨후 순도가 90%이상인 모노-Arg 인슐린 390mg을 수득한다.

[실시예 5]

인슐린의 제조

모노-Arg 인슐린 200㎎(실시예 4 참조)을 0.05M 트리스-HCl(pH 8.5) 100㎖중에 용해시킨다. 그후 카복시펩티다제 B 1U (약 4μg)을 가하고 용액을 실온에서 서서히 교반한다. 3시간후에 pH 3.5까지 산성화시키고 pH 5.5에서 10% ZnCl₂1ml를 가함으로써 인간 인슐린을 결정화시킨다. 순도가 85% 이상인 결정성 인슐린 200㎎을 수득한다. 이물질을 0.1%

Lutensol ON 100(BASF AG: 필수적으로 탄소수 12의 선형 포화 지방알콜의 옥세틸레이트); 0.05M 트리스-HCl(pH 8.3)중의 프락토겔 TSK DEAE 650M(2.5×40㎝)을 함유하는 컬럼상에서 이온 교환 크로마토그라피로 정제하고, 0 내지 0.4M NaCL(각 1ℓ)을 사용하여 구배용출시킨다. 인슐린은 10% ZnCl₂10ml 및 10% 시트르산 1ml을 가한후 HPLC에 의해 확인된 생성물-함유 분획으로부터 pH 5.5에서 결정화된다. 밤세 서서히 교반한후, 혼합물을 원심분리하고 수득된 침전물을 pH 5.5에서 5g/l의 시트르산, 125ml/l의 아세톤 및 200mg/l의 ZnCl₂로 이루어진 완충액 20ml으로부터 재결정화시킨다. 순도가 95% 초과인 인슐린 160mg을 수득한다.

[실시예 6]

트립신 및 카복시펩티다제 B를 함께 사용한 모노-Arg 인슐린으로부터 인슐린의 제조

모노-Arg 인슐린 5mg을 0.1M의 트리스-HCl(pH8.0) 20ml 중에 용해시키고 용액을 30℃까지 가온한다. 동시에, 트립신 용액(1U/ml) 2.5μl 및 카복시펩티다제 B용액(1U/ml) 150μl을 가한다. 3시간후에, 용액을 pH 3.5로 조절하고 트립신 억제 용액(1U/ml)2.5μl 및 10% 농도의 ZnCl₂용액 200μl를 가한다. 인간 인슐린을 pH6.8로 조절하여 침전시키고, 원심분리시킨 다음 실시예 5에서와 같이 결정화시킨다. 결정화된 인슐린의 순도는 95%초과이다.

[실시예7]

효모 발현 벡터의 작제

DNA서열(23)(표3)을 먼저 포스파이트 방법으로 합성한다. 이 DNA서열(23)은 MFα 전구체 단백질의 아미노산 49 내지 80을 암호화하고 이는 필수적으로 천연 DNA 서열에 상응한다.

DNA 서령(23)을 먼저 α인자에 대한 유전자를 분리하기 위한 프로브로서 사용하고 이런 목적을 위해³²P로 표지화시킨다. 이런 프로브의 도움으로, 게놈 λgt11 효모 유전자 뱅크[클론테크 래보러토리즈사(Clontech Laboratories Inc.,4055 Fabin Way, Palo Alto, CA4303)로부터 시판되어 입수가능]로부터 유전자를 분리한다. 이러한 목적을 위해 α인자 유전자를 운반하는 λgt11 파아지를 플라크 하이브리드화 실험에서 동정한다. 양성으로 확인된 플라크로부터의 파아지를 분리하고, 복제한 다음 DNA을 수득한다. 이를 EcoRI를 사용하여 절단하고 0.8% 농도의 아가로스겔 상에서 분석한다. 막을 써던(Southern) 이동실험으로³²P-표지화된 DNA서열(23)에 대해 하이브리드화한다. DNA서열(23)에 대해 하이브리드화된 약 1.75kb 단의 (24)을 함유하는 파아지 DNA을 효소로 다시 절단하고 상응하는 단편(24)을 분리한다. 벡터 pUC19를 EcoRI를 사용하여 개환하고(25) T4 리가제를 사용하여 1.75kb 단편(24)와 반응시킨다. 클로닝 벡터(26)를 수득한다.

균주 이.콜라이 79/92를 결합 혼합물을 사용하여 형질전환시킨다. 백색 콜로니를 분리하고, 이들로부터 플라스미드 DNA을 수득하고, 1.75kb EcoRI 단편을 함유하는 플라스미드(26)을 확인한다.

MFα에 대한 전구체 단백질의 천연 DNA 서열은 아미노산 8 내지 10의 영역에 Pst I 절단부위 및 아미노산 48/49의 영역에 TaqI 절단부위를 함유한다. 분리된 플라스미드 DNA(26)로부터, MFα 전구체 서열의 아미노산 9 내지 48을 암호화하는 단편(27)을 PstI 및 TaqI와 반응시킴으로써 분리한다. 벡터 pUC18을 PstI 및 KpnI을 사용하여 개환하고 PstI-TapI 단편(27) 및 T₄리가제를 사용하여 합성 DNA 서열(23)과 반응시킨다. 이.콜라이 79/92를 결합혼합물을 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환된 혼합물을 IPTH-Xgal-Ap-플레이트상에 도말한다. 백색 콜로니를 분리하고 이 콜론의 프라스미드 DNA을 제한분석에 의해 특성화한다. MFα전구체 서열의 아미노산 8 내지 80을 암호화하는 클로닝 벡터(29)가 수득된다.

상술된 암호화 서열(30)을 PstI 및 KpnI과 반응시켜 클로닝 벡터(29)로부터 절단시켜 하기 기술된 결합물에 혼입시킨다. 이러한 목적으로, 클로닝 벡터(26)을 EcoRI 및 부분적으로 PstI와 반응시키고, MFα전구체 서열의 처음 8개의 아미노산에 대한 암호화 서열을 포함하는 단편(31)을 분리한다. 또한 벡터 pUC19를 EcoRI 및 KpnI(32)를 사용하여 개환하고 2개의 단편(30) 및 (31)과 결합하여 클로닝 벡터(33)을 형성한다. 이는 80개 이하의 아미노산을 갖는 MFα의 전체 전구체 서열을 암호화한다.

클로닝 벡터(33)를 KpnI 및 Hind Ⅲ를 사용하여 개환하고 대항 단편(34)을 분리한다. 이를 KpnI-HindⅢ 단편(35)을 사용하여, 미니-프로인슐린을 암호화하는 플라스미드(11)에 결합시킨다. 이로써 제한 분석에 의해 구조가 확인된 플라스미드 pIK20(36)이 수득된다.

플라스미드 Yep13[참고문헌 : Broach et al., Gene 8(1979) 121]을 BamHI를 사용하여개환하고 돌출말단을 클레나우 폴리머라제(38)로 충전시킨다. DNA을 에탄올을 사용하여 침전시키고 소의 알칼리성 포스파타제로 처리한다.

인슐린 유도체 및 MFα의 전구체 서열을 암호화하는 단편을 HindⅢ 및 EcoRI를 사용하여 클로닝 벡터(36)로부터 절단하고 돌출말단을 상술된 바와 같이 충전시킨다.(37)

2개의 절단된 DNA 서열(37) 및 (38)을 서로 결합시켜, 플라스미드 pαfB102(39) 및 pαfB104(40)을 형성한다. 이들 2개의 플라스미드는 삽입된 단편의 방향만 다르다.

EP-A 0,171,024에서 기술된 바와 같이, 터미네이터는 삽입된 서열 뒤에 삽입 될 수 있다(EP-A 0,171,024의 제 4내지 6도). 이런 목적을 위하여, NcoI 및/또는 BamHI 절단부위가 적합하다.

이.콜라이 MM294내에서 플라스미드 DNA을 증폭시킨 후, 플라스미드 pαfB102(39)를 로이신 요구 효모균주 Y79(α, trp1, leu 2-1)[참고문헌 : Cantrell et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 82(1985) 6250] 및 DM6-6(α/α leu 2-3, 112::ura 3⁺/leu 2::lys2⁺, trpl^-/trpl^-, his3-11, 15/his3-11, 15, ura3^-/ ura3^-,lys2^-/lys2^-, arg4-17/arg4⁺, adel/adel⁺)[참고문헌 : Maya Hanna, Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA]내에서 문헌[참고문헌: Ito, H. et al., J. Bacteriol., 153(1983) 163]의 리튬방법으로 형질전환시킨다. 로이신을 가하지 않은 선별배지상에서 성장할 수 있는 콜로니를 분리하고 합한다. 효모 최소 배지에 각각의 콜로니를 접종하고 28℃에서 24시간 동안 배양한다. 세포를 원심분리하고 상등액을 RIA 시험에서 인슐린 활성에 대해 시험한다. 플라스미드 DNA을 이의 상등액이 인슐린 활성을 나타내는 효모 클론으로부터 재문리하고, 제한분석으로 특성화한다. 형질전환된 효모 균주를 하기 발현에 사용한다.

[실시예8]

효모에서의 발현

실시예 7에 따라 수득된 선별 배지 균주의 신선한 밤새 배양한 배양물로부터 세포를, 광학 밀도 0D₆₀₀이 0.1이 되는 방식으로 효모 완전 배지 10ml 접종한다. 배양물을 28℃에서 8시간 동안 진탕한 후 90ml의 신선한 배지를 가한다. 그후 배양물을 추가로 20시간동안 진탕한다. 세포를 원심분리하고 상등액중의 인슐린 농도를 측정한다. 대규모 발효시에는 예를들어 신선한 배지를 연속적으로 가하는 바와 같이 조건을 변형시킨다.

[실시예9]

효모 상등액으로부터 모노-Arg 인슐린의 정제

발효 상등액을 스티렌과 디비닐벤젠(

Diaion HP20)의 공중합체로 이루어진 다공성 흡수 수지를 함유하는 흡수컬럼을 통하여 가한다. 컬럼을 먼저 20내지 50mM 아세테이트 완충액(pH5)으로 평형화시킨다. 트리스 완충액(pH8)으로 세척한후, 이소프로판올 구배(0 내지 50%)를 10배 칼럽 용적을 사용하여 적용시킨다. 인슐린-함유 분획은 pH6까지 조절하고,

MATREX CELLUFINE AM(Amicon)을 가하며, 혼합물을 교반하고 흡입여과시킨 다음 50mM 아세테이트 완충액(pH 6)으로 세척한다. 세척 분획 및 주 분획을 합하고, 락트산을 사용하여 pH3.5까지 조절한 다음 50mM락트산(pH 5)/30% 이소프로판올을 사용하여 평형화시킨 S-세포로즈 컬럼을 통하여 가한다.

0내지 0.6M NaCl 구배를 사용하여 용출시킨다. 미니-프로인슐린은 0.25 내지 0.3M 범위에서 용출된다.

프로인슐린-함유 분획을 1/4 용적으로 농축시키고 6% 아세트산(pH2)중에서 평형화시킨 Biogel P10(Bio-Rad)을 함유하는 컬럼을 통하여가한다. 인슐린-함유 용출물을 동결건조시키고 예비 역상 HPLC 단계를 통해 정제한다.(RP 18물질, 0.1% TFA, 아세토니트릴 구배 20 내지 40%). 이어서 동결건조후, 동결건조물을 트리스 완충액(pH 6.8)중에 용해시키고 모노-Arg 프로인슐린 g당 4단위의 트립신과 함께 실온에서 3 내지 5시간 동안 항온 처리한다. 반응 과정을 역상분석으로 확인한다. 모노-Arg 인슐린은 거의 정량적으로 형성된다는 것이 밝혀졌다. 반응 말기에, pH를 3.5로 조절하고 반응을 등량의 트립신 억제제를 가함으로써 종결시킨다. 그후 염화아연 농도를 0.21g/l까지 조절하고 pH를 6.8로 조절한다. 락트산 완충액중에 용해된 솜털형 침전물을 수득한다. 성분을 S-세파로우즈 크로마토그라피로 서로 분리한다. 모노-Arg 인슐린을 함유하는 분획을 합하고 1:1의 비로 물과 혼합한다. 그후 1ℓ당 10% ZnCl₂100ml를 용액에 가한다. 모노-Arg 인슐린을 pH6.8에서 침전시키고 공지된 방법(인슐린에 대해)으로 재결정화한다.

[실시예 10]

인간 인슐린의 제조

실시예 9에 따라 제조된 모노-Arg 인슐린은 카복시펩티다제 B절단을 위한 출발물질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 인슐린 유도체를 트리스 완충액(pH8.5)중에 용해시키고 모노-Arg 인슐린 g당 5단위의 카복시펩티다제를 가한다. 반웅은 실온에서 서서히 교반하면서 3시간에 걸쳐 수행된다. 그후 생성물을 실시예9에서 기술된 바와 같이 ZnCl₂로 침전시킨다. 인간 인슐린을 공지된 방법(DE-B 2,629,568)으로 정제한다.

Claims

일반식(I)의 화합물.

B(1-30)-Arg-A(1-21) (I)

상기식에서, B(1-30) 및 A(1-21)은 인간 인슐린의 B 및 A쇄를 나타낸다.
제 1항에 따르는 일반식(I)의 화합물을 원-포트 반응(one-pot reaction)으로 효소처리하여 절단시킴을 특징으로 하여, 일반식(II)의 화합물 또는 인슐린을 제조하는 방법

상기식에서, A(1-21) 및 B(1-30) 인간 인슐린의 A 및 B쇄를 나타내고, -S-S- 브릿지는 인슐린에서와 같이 배열된다.
세균 또는 효모 숙주세포내에서 일반식(I)의 화합물을 암호화하는 유전자 구조물을 발현시키고, 유전자 구조물이 융합 단백질을 암호화하는 경우, 수득된 융합 단백질로부터 일반식(I)의 화합물을 유리시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따르는 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법.
제1항에 따르는 일반식(I)의 화합물을 암호화하는 DNA.
제 4항에 청구된 DNA을 함유하는 유전자 구조물 또는 플라스미드.
제5항에 청구된 유전자 구조물 또는 프라스미드를 함유하는 세균또는 효모 숙주 세포
브릿지원 -Met-Ile-Glu-Gly-Arg-을 통하여 융합 단백질의 밸러스트 성분에 결합된 제1항에 따르는 일반식(I)의 화합물을 함유하는 융합 단백질.