PT91189A - Processo para a producao de proteinas modificadas - Google Patents

Description

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Proteínas modificadas O presente invento está relacionado com proteínas modificadas, métodos para a sua produção composições farmacêuticas contendo tais proteínas e sua utilização na inibição de enzimas. A hirudina, o principio anticoa-gulante natural presente na sanguessuga Hirudo medicinalis é um polipeptideo de 65 aminoácidos com três pontes dissul-fureto. Conhecida durante muito tempo, desde as primeiras investigações sobre a saliva de sanguessuga em 1884 e do * trabalho pioneiro de Markwardt / Naturwissenschaften 42, 53 7 (19 55); methods Enzymol. J9; , 9 2 4 (19 70 ) 7 sò recentemente foi elucidada a estrutura da hirudina por Dodt e_t al, /-FEBS Lett. 165, 180 (19 84 ) 7. Os resultados mais recentes são que a hirudina existe em várias variantes, descritas como variante 1 da hirudina (HV1), variante 2 da hirudina (HV2), hirudina PA e outros análogos. A hirudina e o inibidor mais forte da trombina conhecido, ao mesmo tempo que outras enzimas da camada de coagulação, não são afectadas. Ao contrário da heparina que é o anticoagulante preferido na terapia anticoa-gulação convencional, a hirudina exerce a sua acção directa-mente sobre a trombina e, ao contrário da primeira não actua através da antitrombina III. A interseção entre a hirudina e a trombina ocorre com uma potência extremamente elevada. Esta potência é várias ordens de grandeza superior à ligação da trombina ao fibrinogénio, a plaquetas ou à antitrombina III. Portanto, mesmo concentrações baixas de hirudina são capazes de ultrapassar todas as interaeções da trobina e as suas consequências biológicas. Ainda, a hirudina tem uma toxicidade baixa, não é antigénica e é quase to- -4-

talmente eliminada pelos rins numa forma biologicamente activa.

Recentemente, cDNAs e genes sintéticos codificadores da hirudina ou variantes da hirudina foram clonados e expressos em hospedeiros microbianos tais como Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae (cf.

Pedidos de Patente Europeia NQ 158564 e 168342). Apesar de produtos de expressão não oossuirem o grupo monoéster de 6 3 sulfato na Tir - e terempor isso sido designados "dessul-fato-hirudinas" - apresentam aproximadamente a mesma acti-vidade biológicada hirudina natural na qual o residuo de tirosina está presente como monoéster de sulfato. A hirudina tem sido administrada no homem pelas vias intravenosa e subcutânea. Por via intravenosa a semi-vida média de eliminação observou-se ser de 0,84 h e aproximadamente 50% da dose administrada foi extraidaintacta na urina. Após administração subcutânea encontrou-se no plasmaniveis inibidores da hirudina durante pelo menos 4 h. A hirudina é portanto considerada como sendo de actuaçlo relativamente curta com uma duração de acção semelhante à da heparina. Considerando este entrave verifica-· -se uma forte necessidade de polipeptideos selectivos an-titromboliticamente activos tendo maior semi-vida in vivo.

Os correspondentes polipeptideos ao permitirem um tratamento uma vez ao dia terão vantagens relativamente às terapias existentes par-a as tromboses de veias profundas e arteriais. Constitui um objectivo do presente invento proporcionar tais polipeptideos com actividade antitrombolitica,

Existe também uma forte necessidade de compostos de hirudina que apresentem potência antitrom-· bòtica reduzida. A redução da potência antitrombbtica resulta numa redução da capacidade destes compostos de hirudina para evitar a interacção de tromòina com os seus ligandos -5-

'''W de maior afinidade, principalmente o receptor de plaquetas. No entanto, através da selecção cuidadosa da potência antitrombótica da hirudina ela mantêm a sua capacidade para inibir a coagulação do fibrinogênio, uma propriedade de baixa afinidade da trombina. Tais compostos de hirudina têm a vantagem de possuírem efeitos inibidores na trombose, um caso dominado pela fibrina, mas têm pouco efeito na hemostasia, um efeito dominado pelas plaquetas. Ê ainda objectivo do presente invento proporcionar tais compostos de hirudina com ootência antitrombótica reduzida.

Surpreendentemente encontrou-se que o aumento na hidrofobicidade das hirudinas que ocorre quando os resíduos de aminoacido acidicos (Asp, Glu) no extremo C são substituídos por aminoacidos lipofilicos e/ou o extremo C ê de outro modo modificado, por exemplo pela adição de resíduos de aminoacidos resistentes a pro-teases tais como Pro, conduz a uma potência antitrombótica reduzida e/ou a umasemi-vida maior in vivo.

Assim, o presente invento propor-cionanovos mutantes de dessulfato-hirudina tendo a sequência de aminoacidos: 10 H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly- 20 -Gln-Asn-Leu-Cys-^Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn- 30 -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- 40 -Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val- 50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser- 60 -His-Asn-Yi-Gly-Asp-Phe-Y2-Y3-Ile-Pro“

-Yu-Ys-Ye-Leu-YT-OH (I) onde representa Asp ou o radical de um arninoácido neutro geneticamente codificado, e independentemente um do outro representam Glu, Asn ou o radical de um arninoácido lipofilico geneticamente codificado, Y^ e Yg independentemente um do outro representam Glu ou o radical de um arninoácido neutro geneticamente codificado, Yg representa Tir ou o radical ae um arninoácido acidico geneticamente codi ficado e Y^ representa Gin ou o radical dipeptidilo GlnPro, com excepção dos compostos da fórmula I em que Y^ è Asp,

Yg é Tir, Y^ e Gin, Y2 e Y^ são Glu e um dos radicais Y4 e Yg é Gin e o outro e Glu e seussais. os mutantes de acordo com o invento diferem da dessulfato-hirudina nativa (Y^ é Asp, Y2 , Yg Y^ e Yg são cada um Glu, Yg é Tir e Y^ é Gin) relativamente -7- s> -7- s>

\ a 1 - 4 radicais de aminoacidos, em particular 1 ou 2.

Aminoàcidos neutros geneticamente codificados são os seguintes L-aminoãcidos: Ala, Ser, Tre, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Met, Fen, Trp e Pro , e ainda o aminokcido Gli,

Aminoacidos lipofilicos geneticamente codificados são os seguintes L-aminoácidos: Ala, Vai, leu, Ile, Fen e Gli.

Aminoacidos acidicos geneticamente codificados são Asp e Glu.

Em particular o invento está relacionado com mutantes de dessulfato-hirudina da fórmula I em que é Asp, Ala, leu ou Asn, Y2 e Y^ independentemente um do outro representam Glu, leu ou Asn, Y^ e Y^ independentemente um do outro representam Glu, Gin, Asn ou Leu, Υβ é Tir, Asp ou Glu e Y^ e Gin ou o radical dipeptidilo GlnPro com excepção dos compostos da fórmula I em que Y^ é Asp,

Yr e Tir, Y_ é Gin, Y0 e Y-, são cada um Glu e um dos radi-6 '7 '23 caisY4 e Y5 é Gin e o outro é Glu e seus sais. São exemplos de tais mutantes de dessulfato-hirudina, / Gin ' _7-dessulfato-hirudina, /~Leu^’^ 7-dessulf ato-hirudina , / Asn^'*^ 7-dessulfato -hirudina, /~leu '^^_7-dessulf ato-hirudina ,' /~Asn^^^^^ 7-dessulfato-hirudina, / Ala^_7-dessulf a- * 6 3 63 to-hirudina, /~Asp 7-dessulfato-hirudina, / Glu° 7-des- Z 6 5 ” sulfato-hirudina e /"Pro _7-dessulfato-hirudina.

Os compostos do invento podem existir na forma livre e também na forma dos seus sais.

Uma vez que contêm grupos amina livres em vários resíduos -8-

de aminoácidos, os compostos do invento podem existir ainda na forma de sais de adição ácida. Sais de adição ácida adequados saõ em particular sais farmacológicamente aceitáveis com ácidos convencionais terapêuticamente aceitáveis. São sais inorgânicos representativosos ácidos hidro hálicos (tais comoácido clorídrico) e também ácido sulfúri-co, ácido fosfórico e ácido pirofosfõrico. ácidos orgânicos representativoss são em oarticular os ácidos arenossulfó-nicos (tais como ácido benzenossulfònico ou p-toluenossul-fónico) ou ácidos alcanossulfónicos inferiores (como seja o ácido metanossulfònico)", assim como ácidos carboxilicos tais como o ácido acético, ácido láctico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido málico. ácido tartárico. ácido as-còrbico e ácido cítrico. Como no entanto os compostos de acordo com o invento também contêm grupos carboxilo livres em vários resíduos de aminoácidos . grupos carboxilo esses que conferem caracter acidico a todo o peptideo, eles podem estar também na forma de sais com bases inorgânicas ou orgânicas, e.g. sais de sódio, potássio, cálaio ou magnésio, ou também sais de amónio derivados de amónia ou uma base orgânica contendo azoto que seja farmacológicamente aceitável. No entanto, uma vez que contêm ao mesmo tempo grupos carboxilo livres e gruposamina livres, eles podem existir também na forma de sais internos. São preferidos os sais farmacológicamente aceitáveis.

0 método para a preparação de mutantes da dessulfato-hirudina de acordo com o invento compreende a cultura de uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada com um vector hábrido compreendendo uma cassete de expressão constituída por um promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peotideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA -9-

codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição e isolamento do mutante da dessulfato-hirudina e, caso se pretenda, conversão de um polipeptideo obtido tendo grupos amina e/ou carboxilo livres num sal ou conversão de um sal obtido no composto livre.

Estirpes hospedeiras microbianas adequadas incluem, por exemplo, estirpes de Bacillus subti-lis, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

As estirpes hospedeiras microbianas transformadas são cultivadas num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgâ nicos, aplicando métodos conhecidos. 1

Podem ser usadas várias fontes de carbono. São exemplos de fontes de carbono preferidas, os açucares assimiláveis, como seja glucose, maltose. manito frutose ou lactose ou um acetato como seja acetato de sódio, o qual pode ser usado sozinho ou em misturas, adequadas Pontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos tais como casaminoacidos. peptideos e proteínas e seus produtos de degradação, como seja triptona, peptona ou extractos de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço, assim como também sais deamònio, como sejacloreto sulfato ou nitrato deamònio os quais podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. São inorgânicos que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Em adição, o meio nutritivo pode também conter substâncias promotoras de crescimento. Substâncias que promovem o crescimento incluem, por exemplo, micro-nutrientes, tais como ferro, zinco manganês e similares ou aminoácidos inidividuais„ -10-

Células hospedeiras microbianas transformadas com vectores hibridos tendem a perder este último. Tais células têm da crescer em condições selectivas i.e. condições que requerem a exoressão de um gene codificador por um vector híbrido para o crescimento. A maior parte das marcas selectivas normalmenta usadas e presentes nos vectores hibridos de acordo com o invento (infra) são genes codificadores de enzimas da biosintese de aminoácidos ou purinas Isto torna necessário o uso de meios mínimos sintéticos deficientes no correspondente aminoácido ou base purina. No entanto, os genes que conferem resistência a um biocida adequado podem igualmente ser usados /~e .g. um gene que confere resistência ao aminoglicosido G418_7. As células hospedeiras transformadas com vectores contendo genes de resistência a antibióticos sãoccultivadas em meios complexos contendo o correspondente antibiótico pelo que são atingidas velocidades de crescimento mais rápidas e maiores densidades celulares.

As células hospedeiras contendo vectores hibridos com um promotor constitutivo expressam o gene mutante dessulfato-hirudina controlado pelo referido promotor sem indução. No entanto se o gene mutante da dessulf ato-hirudina estiver sob o controle de um promotor regulado a composição do meio de crescimento tem de ser adaptada de modo a obter-se niveis máximos de mRNA produto da trans crição, i e. quando se usa o promotor PH05 em levedura o meio de crescimento deve conter uma concentração baixade fosfato inorgânico para desreoressão deste promotor. A cultura e efectuada empregando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperatura. pH do meio e tempo de fermentação são selecciona dos de modo a serem produzidos niveis máximos de mutantes de dessulfato-hirudina. Uma levedura ou estirpe de £. coli -11

escolhida e de preferência cultivada em condições de aero-biose em culturas submersa com agitação a uma temperatura de cerca de 25° a 35°C de preferência a cerca de 28°C, a um valor de pH entre 4 e 7. oor exernplo aoroximadamente pH5 e durante pelo menos 12 horas a 3 dias, de preferência durante um periodo que dê produções satisfatórias dos mutantes de dessulfato-hirudina_

Independentemente da estirpe hospedeira, promotor e sequência sinal usada, a maior parte do mutante de dessulfato-hirudina produzido é secretado para o meio de cultura ou para o espaço periplasmatica enquanto que apenas uma pequena parte permanece associada ao interior da célula. A proporção precisa (compostos secretados/compos-tos associados à célula) depende das condições de fermentação .

Os mutantes de dessulfato-hirudina podem ser isolados por meios convencionais. Por exemplo, o primeiro passo consiste geralmente na separação das células do meio de cultura pormeio de centrifugação., 0 sobrenadante resultante pode ser enriquecido em mutantes do dessulfato--hirudina secretados por tratamento com polietileneimina de modo a remover a maiorparte do material não proteico e precipitação das proteínas por saturação da solução com sulfato de amónio As proteínas do hospedeiro, se presentes, podem também ser precipitadas por meio de acidificação com acido acético (por exemplo, 0,1%. pH 4-5). Um posterior enriquecimento no mutante de dessulfato-hirudina pode ser conseguido por extracção do sobrenadante de acido acético com n-butanol. Outros passos de purificação incluem, por exemplo, remoção de sais, processos cromatograficos, tais como cromatografia de permuta iònica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de partição, HPLC, HPLC de fase reversa e similares. A separação dos constituintes da mistura de proteínas é também efectuada por diálise, de -12- -ν C33 acordo corn a carga por meio de electroforese em gel ou elec-troforese seu veiculo, de acordo com o peso molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada, por cromatografia de afinidade, por exemplo com anticorpo3, especialmente anticorpos monoclonais ou com trombina acoplada a um veiculo adequado para cromatograf ia de afinidade ou por outros processos, especialmente os conhecidos de literatura.

Caso se pretenda isolar mutantes de dessulfato-hirudina que se tenham acumulado no espaço pe-riplasmatico são necessários alguns pasoss de purificação suplementares; os mutantes de dessulfato-hirudina são recuperados por remoção enzimática da parede celular (infra) ou por tratamento com agentes químicos, e.g. reagentes de tiol ou EDTA ou submetendo a parede celular a choques osmòticos que dão origem a danificação da parede celular permitindo a libertação do produto. 0 teste com anticorpos anti- w -hirudina ou anti-dessulfato-hirudina (por exemplo anticorpos monoclonais obtidos a partir de células de hibridoma), o teste de trombina /**M.V. oergmeyer (ed. ) , Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, p.314-316, Verlag Chemie, Weinheim (PRG) 1983 7 ou o teste da coagulação do sangue / P. Markwardt et al., Thromb. Haemost. AT_, 226 (19 82|7 podem ser usados para detectar a actividade do mutante da dessulfato-hirudina em fracções obtidas no decurso do processo de purificação.

Dependendo do método empregue, os compostos do invento são obtidos na forma livre ou na forma de sais de adição acida, sais internos ou sais com bases. O composto livre pode ser o.otido de modo conhecido a partir dos sais de adição acida ou sais com bases, por outro lado sais de adição acida terapêuticamente aceitáveis podem ser obtidos a partir dos compostos livres por reacção .X. -13- \ com ácidos, e.g. com os ácidos que formam os sais atrás referidos e por evaporação ou liofilização. Os sais internos podem ser obtidos ajustando o pH a um ponto neutro ade quado.

As células hospedeiras micro bianas transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo os passos de: - preparação de um vector hibrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num ptomotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura adequada a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessul-fato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição. - transformação de uma estirpe hospedeira microbiana com o referido vector hibrido. - e selecção das células hospedeiras microbianas transformadas de entre as células hospedeiras não transformadas. -14-

Vectores de expressão

Os vectores híbridos de acordo com o invento compreendem uma cassete de expressão consistindo num promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo-sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DMA codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição. A selecção de um vector adequado e determinada pela célula hospedeira microbiana escolhida para a transformação. São hospedeiros adequados os especificados atrás, especialmente estirpes de Saccharomyces cere-visiae e estirpes bacterianas. especialmente estirpes de Escherichia coli e Bacillus subtilis. s São exemplos de vectores adequado para a expressão do gene mutante da dessulfato-hirudina numa estirpe de £. coli os oacteriofagos, por exemplo derivados do bacteriòfago A, ou plasmideos tais como o plasmideo colEl e seus derivados. por exemplo pMB9 , pSF2124, pBR317 ou pBR322. Os vectores adequados contêm, um replicão completo e um gene marcador . que tornam possível a selecção e identificação dos microorganismos transformados pelos plasmideos de expressão através de uma caracteristica fenotípica. os genes marcadores adequados conferem ao microorganismo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos tais como ampicilina ou tetraciclina e similares. Vários promotores podem ser usados para a regulação da cassete de expressão de Ξ!. coli São usados especialmente promotores de genes fortemente expressos. -15-

São promotores adequados os promotores lac, tac, trp e lpp, ainda o promotor do fago \ N ou do fago\pL e outros. No presente invento, o promotor preferido para usar em E. coli é o lpp e o promotor lac.

Os vectores adequados para a replicação e expressão em _S. cerevisiae contêm uma origem de replicação de levedura e uma marca genetica selectiva s para levedura.. Os vectores híbridos que contêm uma origem de replicação de levedura por exemplo os segmentos de replicação autónoma cromossòmicos, são mantidos extracromos-sòmicamente dentro da célula de levedura após transformação e são replicados autonomamente durante a mitose. Também podem ser usados os vectores hÍPridos que contêm .sequências homólogas do DNA do plasmideo 2 p de levedura. Tais vectores híbridos são integrados por recombinação em plasmideos 2 ju já presentes na célula ou replicam-se autonomamente. São genes marcadores adequados para levedura especialmente aqueles que conferem resistência a antibióticos ao hospedeiro ou no caso de mutantes de levedura auxotròficos, genes que complementem as lesões do hospedeiro. Como correspondente conferem, por exemplo, resistência ao antibiótico ciclo--heximida ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotròfico, por exemplo o gene URA3, LEU2, HIS3 ou TRPI.

De preferência os vectores híbridos de levedura contêm uma origem de replicação e um gene marcador para um nospedeiro .oacteriano, especialmente E. coli, de modo que a construção e a clonagem dos vectores híbridos e seus precursores pode ser efectuada em E. coli São promotores adequados a expressão em levedura, por exemplo, os do gene ADHI ADHII ou pH05 e também promotores envolvidos, na glicòlise, por exemplo o promotor PGK. -16- Λ A sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal (‘sequência sinal") deriva de um gene do hospedeiro microbiano codificador de um polipeptideo que normalmente é secrstado. Ouando se usa E. coli como microorga nismo hospedeiro pode ser escolhida a sequência sinal de ompA lpp, proteína de ligação a maltose, receptorX, proteína de ligação a leucina ou da ^-lactamase. para usarem levedura pode ser escolhida a sequência sinal da hirudina obtida a partir de DNA genòmico de elevedura. As sequências sinal mais preferidas para usar em levedura são, por exemplo, as sequências sinal e prepro dos genes da invertase delevedu-ra, factor <*(. , f eromona-peptidase (KEX1), "toxina assamina" e fosfatase acida reprimível (PHQ5) e a sequência sinal da glucoamilase de Aspergillus awamori. Como alternativa pode-se construir sequências sinal fundidas ligando parte da sequência sinal (se presente) 3o gene naturalmente ligado ao promotor usado (por exemplo PH05) com parte da seguência sinal da hirudina. São fevorecidas as combinações que permitem a clivagem precisa entre a sequência sinal e a sequência de aminoãcidos ia dessulfato-hirudina mutante. Sequências adicionais, tais como sequências oro ou espaçadoras que podem ou não ser portadoras de sinais de processamento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar o processamento oreciso de moléculas precursoras. A sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição é de preferência a sequência delimitante 3' de um gene derivado do hospedeiro microbiano seleccionado que contem sinais correctos para terminação da transcrição. As sequências delimitantes 3' são, por exemplo, as do gene naturalmente ligado ao promotor usado.

Os vectores híbridos de acordo com o invento podem ser preparados oor métodos conhecidos , -17- -17-

\ 'Λ por exemplo ligando a cassete de expressão consistindo num promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante de dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição ou os constituintes da caseete de expressão aos fragmentos de DNA oontendo marcas genéticas selectivas e origens de replicação para o hospedeiro microbiano seleccionado na ordem predeterminada. 0 DNA codificador dos mutantes da dessulfato-hirudina de acordo com o invento pode ser produzido por métodos conhecidos. Os métodos para a produção do DNA incluem excisão de uma porção do DNA compreendendo os codões dos residuos de aminoácidos indesejados do gene parenteral da dessulfato-hirudina e sua substituição por um segmento de DNA em que os referidos codões foram substituídos por tripletos de desoxirribonucleotideos codificadores dos residuos de aminoácidos pretendidos ou realização de mutação por meio de mutagénese dirigida. para a preparação do DNA codificador do mutante de dessulfato-hirudina, a excisâo de uma porção do DNA da dessulfato-hirudina pode ser efectuada usando enzimas de restrição. Um pré-requisito deste método é a disponibilidade de sítios de restrição adequados na vizinhança dos codões a serem alterados. Por exemplo, um pequeno fragmento de restrição contendo o codão de um ami-noàcido não desejado è removido por clivagem com endonuclea-ses. Uma sequência de DNA de acdeia dupla correspondente é preparada, por exemplo por meio de sintese quimica, na qual são usados tripletos codificadores dos aminoácidos pretendidos. 0 fragmento de DNA é ligado na orientação correcta ao restante fragmento grande para dar uma sequência de DNA de cadeia dupla codificadora do mutante. Por V 18- Τ

conveniência e para facilitar a manipulação do gene mutante este último está vantajosamente contido num fragmento de DNA maior dotado de adaptadores adequados que permitem a inserção e clonagem do segmento num vector de clonagem.

Numa execução preferida do presente invento a preparação de DNAs codificadores dos mutan-tes de dessulfato-hirudina é efectuada por mutagénese dirigida, este método éuum processo de mutagénese In vitro pelo qual um sitio definido dentro de uma região de DNA clonado pode ser alterado /~cf. os artigos de revisão de M.J. Zoller e M. Smith, Methods Enzymol, 100 , 468 (19 83); D. Botstein e D. Shortle , Science 229 , 119 3 (19 8 5 ) 7- A mutagénese pode ser efectuada no gene completo da dessulfato hirudina ou em partes funcionais dele contendo o(s) codão (ões) do(s) aminoácido(s) indesejado(s). Após a mutagénese a parte funcional mutagenizada é ligada às outras partes do gene da dessulfato-hirudina para dar o DNA completo da dessulfato-hirudina mutante. O método de mutagenização do gene da dessulfato-hirudina ou parte funcional dele é aaracterizado por o gene de cadeia simples ou um DNA de cadeia simples compreendendo o gene da dessulfato-hirudina ou parte dele ser hibridado com um oligodesoxirribonucleoti-deo iniciador que é complementar da região do gene hibrido a ser mutagenizada excepto no(s) sitio(s) de desemparelha-mento que dirige(m) a mutação, O oligodesoxirribonucleotideo hibridado é usado como iniciador para iniciar a sintese da cadeia de DNA complementar, o DNA resultante (parcialmente) de cadeia dupla é usado para transformar uma estirpe de microorganismo rsipiente , a estirpe de microorganismo é cultivada e seleccionados os transformantes contendo DNA do gene modificado (mutante) da dessulf ato-hirudina. -19- ΐf5 ι

Hospedeiros microbianos transformados 0 invento diz ainda respeito a uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada com um vector hibrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num promotor de levedura, operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA contendo sinais de termirfação da transcrição e ao método para a sua produção, compreendendo transformação da referida estirpe hospedeira microbiana com o referido vector hibrido.

As estirpes hospedeiras microbia nas são as especificadas atrás. A transformação com os vectores hibridos de acordo com o invento é efectuada por exemplo, como descrito na literatura para J>. cerevisiae /“A. Hinnen et al. , proc. Natl. Acad. Sei. USA J75, 19 29 (19 78) 7, B. subtilis /"Analogamente Anagnostopoulos et al, J. Bacteriol. 81, 741 (19 61) 7 e E. coli /-M. Mandei et al. , J. Mol. Biol. 53_, 159 (19 70 ) 7. O isolamento das células hospedeiras transformadas è efectuado com vantagem a partir de um meio nutritivo selectivo ao qual foi adicionado, por exemplo, o biocida contra o qual o gene marcador v y contido no plasmideo de expressão confere resistência. Se,

R por exemplo, os vectores hibridos possuirem o gene amp , adiciona-se pois ampicilina ao meio nutritivo. As células que não contêm o vector híbrido são destruidas em tal meio. -20-

Composições farmacêuticas

Os novos mutantes de dessulfa-to-hirudina obtidos de acordo com o presente invento têm importantes propriedades farmacológicas e podem, tal como a hirudina extraida de sanguessugas ser usados em profilaxia ou, especialmente, em terapia. _y

Os mutantes de dessulfato-hiru-dina de acordo com o invento são, tal como a hirudina natural, iniubidores potentes da trombina, Eles possuem, por exemplo, um valor de K. (constante de dissociação do com- 1 -9 plexo mutante de dessulfato-hirudina-trombina) de 10 Ma -12 10 M. Os mutantes de dessulfato-hirudina são totalmente específicos para a trombina e não apresentam interacções com outras proteinases do sistema de coagulação do sangue. A toxicidade é extremamente baixa. De modo semelhante não se observaram reacções de hipersensibilidade ou reacções alérgicas. Ainda, os mutantes do invento têm uma duração de acção iji vivo comparável ou melhor do que a da dessul-fato-hirudina nativa.

J

Os novos mutantes da dessulfato--hirudina de acordo com o invento podem portanto ser usados de modo análogo a hirudina natural para a terapia e profilaxia de tromboses e tromboembolias, incluindo a profilaxia de tromboses pòs-operatorias, para terapia de choque agudo /“por exemplo para choque séptico ou politraumático7 pura a terapia de coagulopatias, em hemodiálises, hemo-separa-ção e na circulação de sangue fora do corpo. O invento também está relacionado com composições farmacêuticas que contêm pelo menos um dos compostos de acordo com o invento ou um seu sal, “Λ farmacêuticamente aceitável, facultativamente juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável e/ou aditivos.

Estas composições podem ser usadas especialmente nas indicações atrás referidas, quando são administradas, por exemplo, parenteralmente, como seja por via intravenosa, intracutânea, subcutânea ou intramuscular ou topicamente. 0 invento também está relacionado com a utilização dos novos compostos de acordo com o invento e com composições farmacêuticas contendo-os para o tratamento profilático e terapêutico de seres humanos ou animais, especialmenteno caso dos síndromas clinicos atrás referidos, em particular para inibição da coagulação do sangue dentro e fora do corpo humano e de animais. A dosagem depende especialmente da forma especifica de administração e da finalidade da terapia ou profilaxia. 0 tamanho das doses individuais e o regime de administração pode ser melhor determinado pela avaliação individual do caso particular de doença; os métodos de determinação dos factores sanguineos importantes necessários para este fim são faàliares para os que estão dentro do tema. Normalmente, no caso de uma injecção, a quantidade terapêuticamente eficaz dos compostos de acordo com o invento está numa gama de dosagem entre aproximadamente 0 ,00 5 e aporximadamente 0 ,1 mg/kg de peso de corpo. £ preferida uma gama entre aproximadamente 0,02 e 0,05 mg/kg de peso do corpo. A administração é efectuada por injecção intramuscular, intravenosa ou subeutânea. Assim, as composições farmacêuticas para administração parentérica na forma de monodose contem por dose, dependendo do modocfe administração, entre aproximadamente 0 ,4 e aproximadamente 7,5 mg do composto de acordo com o invento. -22-

Alem do ingrediente activo estas composições farmacêuticas geralmente contêm também um tampão por exemplo um tampão de fosfatos, destinado a manter o valor do pH entre aproximadamente 3,5 e 7, e também cloreto de sódio, manitol ou sorbitol para ajustamento da isotonici-dade. Elas podem estar na forma liofilizada ou dissolvida, sendo possivel que as soluções contenham um preservativo com actividade antibacteriana, por exemplo entre 0,2 e 0,3¾ de éster metilico ou éster etilico do ácido 4-hidroxibenzòico.

Uma composição para aplicação tópica pode estar na forma de uma solução aqsuosa, loção ou gel, uma solução oleosa ou suspensão ou especialmente, pomada emulsionada. Uma composição na forma de solução aquosa è obtida, por exemplo, dissolvendo os ingredientes activos de acordo com o invento, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável, numa solução tampão aquosa entre pH4 e pH 6,5 e, caso se pretenda, adição de um outro ingrediente activo, por exemplo um agente anti-inflamatòrio e/ou um polímero ligante por exemplo polivinilpirrolidona e/ou um preservativo, h concentração do ingrediente activo é entre aproximadamente 0,1 e 1.5 mg, de preferência entre 0 ,25 e 1,0 mg, em 10 ml de uma solução ou 10 g de um gel.

Uma forma oleoaa de administração para aplicação tópica é obtida, por exemplo, suspendendo os ingredientes activos de acordo com o invento ou um seu sal terapêuticamente aceitável, num óleo, facultativamente com a adição de agentes que incham, como seja estearato de alumínio e/ou tensioiotivos ("tensides") tendo valor de HLB ("equili-brio-hidrofilico-lipofilico") abaixo de 10, como sejam mono-ésteres de ácidos gordos de álcoois poli-hidricos, por exemplo monostearato de glicerina, monolaurato de sorbitano, monos-tearato de sorbitano ou mono-pleato de sorbitano. Uma pomada contendo gordura é obtida, por exemplo, suspendendo um ingrediente activo de acordo com o invento, ou um seu sal, numa -23

base gorda espalhável, facultativamente com a adição de um tensioectivo tendo um valor de HLB abaixo de 10. Uma pomada emulsionada é obtida por trituração de uma solução aquosa do ingrediente activo de acordo com o invento, ou um seu sal, numa base macia espalhável com a adição de um tensioactiv tendo um valor de HLB abaixo de 10 _ Todas estas formas para aplicação tópica podem conter também preservativos- A concentração do ingrediente activo vai de aproximadamente 0,1 a 1,5 mg, de preferência de 0,25 a 1,0 mg, em aproximadamente 10 g de base.

Além das composições descritas atrás destinadas ao uso directo em medicina no corpo humano ou de animal, o presente invento relaciona-se também com composições farmacêuticas para uso medicinal fora do corpo humano ou de animais. Tais composições são usadas especialmente como aditivos anticoagulantes no sangue sujeito a circulação ou tratamento fora do corpo (por exemplo circulação fora do corpo ou diálise em rins artificiais), preservação ou modificação (por exemplo hemo-separação). Tais composições, como sejam soluções "stock" ou como alternativa composições da forma de monodose, são semelhantes em composição às composições para injecção descritas atrás; no entanto a quantidade ou concentração de ingrediente activo é com vantagem baseadas no volume de sangue a ser tratado ou, mais precisamente, no seu teor em trombina. Em relação a isto deve-se fazer a ideia de que os ingredientes activos de acordo com o invento (na forma livre) desactivam totalmente cerca de 5 vezes a quantidade por peso de trombina são fisio-logicamente inofensivos mesmo em quantidades relativamente grandes de modo que não existe o risco de sobredosahgem, mesmo, por exemplo, durante transfusões. Dependendo do fim especifico, a dose adequada é entre aproximadamente 0,01 e aproximadamente 1,0 mg do ingrediente activo/litro de sangue se bem que o limite superior possa ainda ser excedido sem risco. -24-

0 invento relaciona-se especial mente com mutantes de dessulfato-hirudina, vectores híbridos estirpes hospedeiros microbianas transformadas com tais vectores híbridos ecom os processos para a sua produção como descrito nos Exemplos.

Breve Descrição dos desenhos

Na secção experimental que se segue são descritas várias realizações do presente invento com referência aos desenhos juntos em que:

Fig. 1 ilustra esquematicamente a construção do plasmideo pML 350 ,

Fig. 2 mostra esquematicamente o mapa do plasmideo pJDB207/ /GAPFL-HIR.

Fig. 3 ilustra esquematicamente a construção do plasmideo 63 pJDB207/GAPFL-HIR (Asp ).

Secção Experimental

Exemplo 1: Construção do plasmideo pML350 (ver Fig. 1) a) Digestão do DMA do plasmideo pIN-III-ompA-2 10 yg de plasmideo pIN-III- -ompA~2 Γ J. Ghrayeb ejt al. , EMBO-J. 3_, 2437 (1984) 7foram dissolvidos em 25 yl de 100 mM tris-HCl pH 7,5, 50 FíM NaCl e 100 yg/ml de gelatina com as endonucleases de restrição Eco RI e Bam Hl. A solução foi ajustada para TNE e extraída com fenol/clorofòrmio. O DNA foi precipitado com etanol. Após electroforese em gel de agarose o DNA vector pIN-III--omp Α-2/EcoRI / Bam Hl foi isolado por eluição do gel. b) Digestão do DNA do plasmideo pML310 20 yg do plasmideo pML310 (ver Pedido de patente Europeia No. 158342) foram digeridos em 50 y 1 de 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl e 100 yg/ml de gelatina com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI. A solução foi ajustada para TNE e extraída com fenol/clorofórmio. O DNA foi precipitado com etanol. O F^-F2~DNA (gene da hirudina) foi isolado após electroforese em gel de agarose e eluição a partir do gel. -26-

c) Ligação do F^-F2~DNA (gene da hirudina) de pML310 com o DNA vector pIN-III-ompA-2/EcoRI/Bam Hl 1 yg de Fi”F2“DNA (gene da hirudina) /EcoRI/Bam Hl e 30 ug do DNA vector pIN-III-ompA--2/EcoRI/BamHI foram dissolvidos em 50 yl de XOOmM Tris-HCl pH 7,5, 50 itiM NaCl e 100 ug/ml ou gelatina, ajustado para TNE. A solução foi extraída com fenol/clorofórmio e o DNA precipitado com etanol. 0 precipitado de DNA foi dissolvido em 20 yl de uma solução de 50mM Tris-HCl (pH 7,8), lQmM MgCl2 , lOmMDTT, 0,5mM ATP e 100 yg/1 de gelatina e tratado com 25 unidades/yl de DNA-ligase de T4 (Biolabs) a 15°C durante 3 h. Deste modo criou-se o plasmideo recombinante pML350, o qual contem o F1-F2-DNA (gene da hirudina) inserido .

d) Transformação de E. coli HB101 com o plasmideo pML35Q

As células de E„ coli MB101 pré-tratadas com cálcio que foram preparadas como descrito por mandei et al, /~J. Mol. Biol. 53 , 159 (19 70 ) _7 · A solução obtida em c), a qual contem o plasmideo recombinante pML350, foi aquecida a 65QC durante 20 min, , de modo a inactivar a DNA-ligase de T4 e foi então arrefecida até 37QC„ 10 yl da mistura de reacção resultante foram adicio nados a 150 ul de células E. coli HB101 tratadas com cálcio em 10 mM MgC^ e 10 mM Tris HC1 (pH 7,5) num volume total de 200 yl,

Subsequentemente esta mistura foi arrefecida em gelo durante 30 min., aquecida durante 2 min., a 42°C e depois deixada durante 50 min., em 1 ml de -27- -27-

\\ meio L (triptona, bacto 10 g/l; extracto de levedura Bacto 5 g/l; NaCl 5 g/l; glucose 5 g/l; ampicilina 0,1 g/l) a 372C. A mistura foi então espalhada em quantidades de 0,2 ml sobre 5 placas de agar (McConkey Agar, Difco) que contem 60 gg/ml de ampicilina (Serva). As placas de agar foram então mantidas a 37QC durante 16-18 horas. Obtiveram-se 185 colónias resistentes à ampicilina de células E. coli HB101 transformadas.

e) Despioste das colónias que contêm F^-F2~DNA 6 colonias transformadas (Exemplo ld) foram transferidas para filtro de nitrocelulose B85 (Schleicher and Schull) De acordo com Grunstein e Hogness /"proc. natl . Acad . Sei USA /72. 39 61 {19 Ή ) as colónias foram lisadas e o seu DMA desnaturado foi fixado no filtro. Subsequentemente a pré-hibridação dos filtros foi efectuada em 20 ml (por filtro) de 4 κ SET /""= solução de 30 mM Tris. HC1 (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA_7 0 ,15É (p/v) Ficoll 400 (Pharmacia) , 0 ,5% SDS, 50 yg/ml de DNA desnaturado de timo de vitela durante 4 h a 64QC. Subnsequentemente os filtros de nitrocelulose foram tratados em 20 ml (por filtro) de 5 x SET (p/v), 0,1% (p/v) Ficoll 400, 0,2% SDS e 50 yg/ml

de DNA desnaturado de timo de vitela durante 16 h a 642C 32 com a sonda marcada radioactivamente com P (aproximadamen-3 4 te 10 -10" cpm Cerencov por filtro). Uma mistura consistindo nos oligonucleotideos complementares 46/64, 1/58, 96/67 e 154/ /64 (ver Pedido de patente Europeia Nõ 168342) foi usada como sonda. -28-

Subsequentemente os filtros foram lavados duas vezes em 2xSET, 0,2% SDS à temperatura ambiente, depois duas vezes com 2 κ SET, 0,5% SDS a 60°C (primeiro durante 30 min.. depois durante 60 min,). os filtros foram então secos entre papel 3MM (Whatman) e colocados a -80QC num filme de raios X (Fugi) com um écran intensifica-dor (Ilford) durante 1-2 dias. 0 autoradiograma resultante mostrou 5 colónias positivas (clones) que puderam ser usadas para posterior processamento, uma das quais recebeu a designa_ ção pML350. EXEMPLO 2

Construção do plasmideo pBHl09

Uma vez que o plasmideo pML350 deriva do plasmideo pIN-III-ompA-2 incluindo um adaptador de multi-clonagem (sítios EcoRI, HindIII, Bam Hl) ele contem 12 pares de bases adicionais antes do gene da hirudina madura codificadores de Ala, Glu, Fen, met = Para que haja expressão da dessulfato-hirudina madura estes 12 pares de bases são removidos por mutagénese in vitro fazendo usocfe um oligonucleotideo de 27 meros -29 -

-29 - L Ί\ _ ^425533552¾¾^ a) Preparação de pML 350/Xbal/Bam Hl (SI) 5 yg do plasmideo pML350 foram digeridos com as endonucleases Xbal e bamHI. 0 maior dos dois fragmentos Xbal-BamHI (SI) foi isolado por eluição do gel após electroforese em agarose e dissolvido em 1 mM Tris--HC1 pH 7,5, 0,1 mM EDTA. b) Preparação de pML350/Pvu I (SII) 5 yg do plasmideo pML 350 foram digeridos com a endonuclease Pvu I. O DNA linearizado de pML350/Pvu I foi suosequentemente digerido com 3 unidades de fosfatase alcalina de intestino (Boehringer) durante 30 min a 373C, A enzima foi inactivada aquecendo a solução durante 60 min a 652C„ O DNA linear de pML350/Pvu I (SII) foi isolado por eluição do gel após electroforese em agarose e dissolvido em 1 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 fhM EDTA. c) Preparação do oligonucleotideo (27 mero) 127 por analogia com o processo descrito no Pedido de Patente Europeia N3 168342 sintetizou-s o fragmento de DNA quesse segue (designado 127); -30-

5 ' -GTA GCG CAG GCC G'TT GTT TAC ACC GAC-3 12 7 - 32 A fosforilaçao dos extremos 5' foi feita com / - P 7- -ATP e polinucleotideo-cinase de T4 (Boehringer) como descrito /"Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al), Cold Spring Harbor Lab„ (1982) p.125 7. d) Construção do plasmideo pBH!09 DNA SI e DNA SII , 0.3 ug de cada. foram misturados com 40 pmoles do fragmento de DNA 127 fosforilado em 27 ul de 1 mM Tris-HCl pH 7.5. 0,lmM EDTA. A mistura adicionou-se 3 ul de tampão polimerase-li-gase 10 x xl MNaCl, 65 mM Tris-HCl pH 7,5, 80 mM MgC^ e 10 mM B-mercaptoetanol). Esta mistura foi aquecida durante 3 min., num banho-maria fervente para desnaturar os fragmentos de DNA. Subsequentemente, a mistura foi gradualmente arrefecida (cerca de lôC/min) até 30 QC e incubada a esta temperatura durante 30 min. A .mistura foi ainda incubada a 4QC durante 30 min e depois durante 10 min em gelo. 12 ul dos quatro fosfatos de desoxirribonucleotideo (7,5 mM cada), 6 yl de 10 mM ATP, 6 yl de DNA-ligase de T4 (2,5 U/yl) e 1,12 yl de DNA poli-merase klenow (Boehringer, 50/yl) foram adicionados e a mistura de DNA (volume total de 55 yl) foi incubada durante 16 h a 12,5ôc. -31- -31- \\

Jt> A mistura de DNA foi digerida com 2 unidades de endonuclease EcoRI durante lha 372C para destruir o plasmideo de partida inalterado pML350.

Com este processo formou-se o plasmideo pBH109 . 0 plasmideo pBH109 contém o promotor Ipp e o promotor/operador lac operacionalmente ligado a sequência sinal ompA-2 ligada na mesma grelha de leitura ao gene codificador da dessul-fato-hirudina madura, e) Transformação de E. coli HB101 com o plasmideo p3H109 A transformação com células E. coli HB101 tratadas com cálcio foi feita como descrito no Exemplo ld. A mistura de reacção total usada foi de 55 μΐ, f) Despiste das colonias que contêm o plasmideo pBH109 100 colónias transformadas foram cultivadas, a partir de cada uma das colónias preparou--se DNA de plasmideo e digeriu-se com EcoRI. Todos os DNAs de plasmideo, que não são digeríveis com EcoRI são potenciais plasmideos pBHl09 que não possuem o sitio EcoRI.

Foram identificadas duas colónias positivas idênticas. Uma delas foi seleccionada e designada pBH109. -32- C=E3=

A sequência correcta do F^- -F2-DNA a seguir à sequência lider ompA-2 foi confirmada por sequenciação. EXEMPLO 3:

Mutação dos resíduos GluSl . Gluõ2 da hirudina para GI116I , Gln62 usando M13mpl9/hirudina de cadeia simples 56 58 60 61 62 64 sequência codi Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu ficadora da hirudina 5' . . . TTC GAA GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG 3' iniciador muta- 3' CTT CTT TAC GGC GTT GTT ATG GAC GTC 5' génicolcadeia codificadora mutagenizada 5’.. .TTC GAA GAA ATC CCG CAA CAA TAC CTG CAG 3' Phe Glu Glu Ile Pro Gin Gin Tyr Leu Gin -33-

Sintetizaram-se iniciadores mutagénicos usando o método fosforamideto /~M.H. Caruthers, em Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen e A. Lang, Eda) Verlag Chemie, Weinheim, Federal republic of Germany) 7 num sintetizador Applied Biosystems (Modelo 380B) .

I. Preparação de M13 mp!9/hirudina A· DNA de M13mpl9 cortado com Xbal-BamHI A 5 yl de DNA de M13 mpl9 o de cadeia dupla (dsDNA; 0 1 yg/ml: BRL) adicionou-se 2 yl React 2 (500 mM Tris-HCl. pH 8,0; 100 mM MgCl^, 500 mM NaCl) (BRL). 1 yl Xbal (10 U/yl). 0,5 yl Bam Hl (100/yl) e 12 yl H20. Após incuòacão a 3 72C durante 1,5 h adicionou-se 0.5 yl de Bam Hl. 2,5 yl de React 3 (500 mM Tris--HC1, pH 8,0; 100 mM MgCl2; 1000 mM NaCl) (BRL) e 2 yl de H20 e a incubação continuou a 37QC durante 1 h. Completou-se o volume para 100 yl com Η2O, O ds-DNA foi isolado por extracção com fenol e precipitação com etanol e dissolvic em 30 yl de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). B. DNA inserido

Cinco yg do plasmideo pBH109 foram cortados com Xbal e BamHI como descrito atrás e o prodiito da digestão foi sujeito a electroforese durante 3 h a 150 volts usando um gel de 3.5% de poliacrilamida com tampão TBE 1 x (tampão TBE 10x: 108 g de Tris, 55 g de ácido bòri- -34- \\

Á

W

V co , 9,3 g de EDTA. 2^0/1) . 0 fragmento Xhal-Bamf-II contendo o gene da hirudina (250 pb) foi visualizado com luz UV após imersão do gel em 400 ml de tampão TBE lx contendo 10 yl de solução de brometo de etidio (10 yg/ml em água). A parte do gel contendo o fragmento de restrição foi cortada e colocada em tubo de diálise com 500 yl de TBE 0,5x e o DNA foi electroeluido num aparelho de electroforese para minigéis BIO-RAD usando TBE 0,.5x como tampão de corrida a 170 volts durante 30 min. 0 DNA foi aplicado numa coluna Elatip-d (Sc^leicher & Schull) equilibrada com TBE 0,5x. A coluna foi lavada com 2 ml de TBE 0,5 x e o DNA eluido com 1M NaCl em TBE 0,5x (1 ml). Precipitou-se o DNA com etanol e redissolveu-se em 10 yl de tampão TE.

Co Ligação da inserção Xbiaí-BamHI contendo hirudina a M13mpl9 e preparação de DNA de cadeia simples

Cinco yl da inserção Xbal- -BamHI contendo hirudina, 2 yl de M13mpl9 cortado com Xbal-bamHI, 1 yl de tampão ligase 10 x (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgClg . 10 mM ditiotreitol) , 1 yl de ATP, 1,5 yl de DNA-ligase de T4 (3RL; lU/yl) foram misturados e incubados durante a noite a 14SC. Cinco ul da mistura de ligação foram usados pera transformar células competentes de E coli JM101 de acordo com o método de J Messing / Methods in Enzymology 101 21-78 (19 83 )_7. Doze placas transparentes foram repicadas e o DNA de cadeia simples (ss-DNA) foi preparado a partir de cada placa como descrito por J. Messing (supra). O DNA designado M13mpl9/hiru-dina foi redissolvido em 50 yl de tampão TE (0 ,1-0 ,5 yg/ /Vl). -35-

II· Mutagénese dirigida A. Fosforilação do iniciador mutagénico

J 200 pmoles (23 yl) de iniciador mutagénico 1 (ver atras) foi fosforilado pela adição de 3 yl de tampão cinase 10 x (1M Tris-HCl , 0,1M MgC^ , 0 ,1M ditiotreitol, pH 8.3) 3 ul 10 mM ATP e 1 yl polinucleoti-deo-cinase de T4 (BRL 10 u/yl) Apos incubação a 3 75C durante 1 h , a reacção foi parada por aquecimento a 659C durante 10 min.. B. Emparelhamento do iniciador mutagénico 1 com o molde de cadeia simples M13mpl9/hirudina

Seis yl (0,5 yg) de M13mpl9 hirudina de cadeia simples (Secção I-C) foi incubado com 3 yl (20 pmoles) do oligodesoxirribonucleotideo mutagénico fosforilado (6,6 pmoles/yl/ e 1 yl de tampão A (0,2 M Tris--HC1, pH 7,5, 0 ,1M MgCl2 , 0,5M NaCl, 0,01 MDtt) a 70 ec durante 5 min e arrefecido lentamente à temperatura ambiente durante cerca de 30 min. C. Reacção de extensão-ligação A mistura atras emparelhada adicionou-se 1 yl de tampão 3 (0 2M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1M MgCl^ , 0 ,01 MDTT) . 1 yl 10 mM ATP 4 yl mistura de dNTP 2 mM 5 yl de DNA-polimerase de T4 (Boehringer, 1 U/yl), 5 yl de DNA-ligase de T4 (BRL, lU/yl). Esta mistura foi incubada -36-

a 16SC durante 3 h. Parou-se a reacção incubando-a a 55S durante 10 min . D. Transformação e preparação de DMA mutante de cadeia simples A mistura de ligação foi diluída a 1:20 com estéril e 1 yl , 5 ul e 1 ul da mistura de ligação não diluída foi usado para transformar células competentes E. coli 3M9 71-81 mut S / B. Kramer, W. Kramer e H. J Fritz , Cell 3_3 879 -887 (19 84 )_7. As cé lulas foram semeadas como descrito no "M13 cloning and sequencing Handbook" (publicado pela Amersham). repicaram--se doze placas incolores e preparou-se ss-DNA como descrito na secção I-C. E. Despiste de DNA mutante de cadeia simples

Para fazer o despiste de DNA de cadeia simples mutagenizado, cada uma das 12 amostras de ss-DNA foi sequenciada pelo método de terminação de cadeias com didesoxinucleotideos /~F. Sanger, S. Nicklen e A „ R. Coulson, Proc, Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 (19 77) 7. Inicialmente, apenas o didesoxinucleotideo complementar da base mutagenizada esperada foi usado na reacção. Subsequentemente, o ss-DNA de vários mutantes positivos foi sequenciado para estabelecer a sequência completa do mutante usando DNA-polimerase de T7 (Sequenase, USB) seguindo o método de Tabor e Richardson /~Proc. Natl. Acad. -3 7- \_ A»

Sei. USA 8_4. 4 76 7-4 771 (19 8 7) 7 As alterações de .cases esperadas codificadoras da mutação Glu - Gin nas posições 61 e 52 da hirudina recombinante foram observadas na sequência de DNA. D DMA fágico tendo a sequência esperada foi designado M13mpl9 /hirudina S61. 62 Q.

F. Preparação de DNA forma replicativa (RF) a partir do DNA fágico de cadeia simples H13rripl9 /hirudina E61,62Q Células E. coli JM 101 foram transformadas com 10-20 ng de DNA mutante de cadeia simples da hirudina E61, 620 e preparou-se ds-DNA como descrito no "M13 cloning and sequencing Handbook" (publicado pela Amersham). Obteve-se um rendimento de 40-50 yg de ds-DNA a partir de 100 ml de cultura G. Isolamznto da inserção Xòal-BamHI de hirudina mutante A inserção Xbal-BamHI de hirudina mutagenizada foi removida de 25 yg de ds-DNA e purificada como descrito na secção IB 0 DíMA foi dissolvido em 20 yl de agua estéril - -38- ·$

H. Preparação de DNA vactor pIN-III-ompA-2 cortado Xbal-BamHI

Aproximadamente 1,5 yg do plasmideo pIN-III-ompA-2 foi digerido através da adição de 6 yl de tampão React 2 (3RL), 2 yl (20 unidades) Xbal. 1 yl BamHI (10 unidades), 1 yl de EcoRI (10 unidades) e 37 yl de H^O (volume total de 50 yl) e incubação durante 3 h a 379C. Adicionou-se 1 yl (10 unidades) de BamHI, 1 yl (10 unidades) de EcoRI, 5 ul de React 3 (BRL) e 12 yl de H2O e a incubação continuou durante lha 37QC,

I, Ligação do DNA da inserção Xbal-BamHI da hirudina aiu-tante E61.62Q ao olasmideo pIN-III-ompA-2 cortado com Xbal-BamHI

Nove yl de DNA da inserção

Xbal-BamHI da hirudina E6i,62Q, 2 yl de DNA do vector pIN-III-ompA-2 cortada com Xbal-Bam Hl, 3 yl de tampão de ligação 10 X (BRL) e 1 yl (lU/yl) de DNA-ligase de T4 (BRL) foram misturados e incubados a 14SC durante 16-20h. \ 39 - C:

III. Expressão do mutante em E. coli JM101 /"Gin 61,62 7-dessulfato-hirudina A. Transfecção de E coli estirpe JM101

Cinco ul da mistura de ligação foi usada para transformar 0:3 ml de células competentes de E- coli JM 101 de acordo com o método de J. Messing (supra). A amostra adicionou-se três ml de 2xYT/Ampieillin (50 y.g de ampicilina/ml de 2xYT) e as células foram incubadas 1 h à temperatura ambiente. Uma amostra de 1 ml da cultura foi então removida e espalhada sobre uma placa de LB/Ampicillin (50 çg deumpicilina/ml de agar LB) e crescida durante a noite a 37QC.

Λ 1 /* Q B.

Selecção de colónias expressando /"Gin01'7-dessulfato--hirudina

Dez colónias bacterianas das placas LB/Ampicillin foram repicadas e cultivadas separadamente durante 5 h a 37QC em 5 ml de LB/Ampicillin (50 ug de ampicilina/val de LB) De cada um dos tubos com culturas removeram-se amostras de 1 ml e as células foram recuperadas por centrifugação (3000 4g durante 5 min ) . cada uma das amostras de células foi sujeita a choque osmòtico por tratamento com 100 ul de 10 mM Tris-HCl. pH 8,1. durante 30 minutos a OSC para libertar o material para o espaço periplasmático da bactéria. As células foram removidas por centrifugação como anteriormente e o sobrenadante testado "40 \

ΊΓ~" quanto a actividade de hirudina como descrito na Seccão V-B. A amostra que deu maior actividade inibidora foi se-leccionada para cultura em "batch". C. e isolamento de

Cultura em "batch” f ato-hirudina /-/,< 61,62-1 . , / Gin _/ -dessul- A restante quantidade (4 ml) de células da amostra meãs activa foi usada para inocular 1 1 de LB/Ampicillin (50 ug de ampicilina/ml de LB) A cultura foi crescida durante a noite a 37°C e as células recuperadas por centrifugação (3000 xg durante 15 min). O sedimento de células foi sujeito a choque osmótico por ressuspensão em 50 ml de 10 mM Tris-HCl . pH 8 ,1 a OôC durante lh, As células f oram removidas da fracção periplas-màtica por centrifugação a 6000xg durante 10 min.

D

Purificação de / Gln^'^ 7-dessulfato-hirudina O pH da fracção periplasmá- tica foi ajustada a 6,5 com 0 ,1 M naCl e filtrado através de um filtro de 0.45 um (Nalgene). A proteina foi aplicada num sistema de FPLC com coluna Mono-Q (Fast protein Liquid Chromatography, Pharnacia-LKB) equilibrada com tampão 50mM bis-Tris-HCl pH 5 5 0 mutante de dessalfato-hirudina foi eluido da coluna usando um gradiente salino linear de NaCl 0-300 mM em bis-Tris-HCl pH 6,5 durante 45 min. 41-

xJ

Colheram-s© fracçSss áe ô,l ml <3© eluat© d« coluna a testaram-se quanto a actividade de hirudina como descrito na Secção III-B, As fracções contendo a dessulfato-hirudina mutante foram reunidas, filtradas como atrás e cromatografa-das num sistema de HPLC Millipore-Waters usando uma coluna de HPLC em fase reversa Biownlee Labs C8 equilibrada com 0,09% (v/v) de ácido trifluoroacético em H^O. O mutante de hirudina foi eluido da coluna com um gradiente linear de 7 a 28% (v/v) de acetonitrilo em 0,09% (v/v) de ácido tri-fluoroacético em HgO. /~Gln^'^2 7-dessulfato-hirudina tendo um grau de pureza de cerca de 98% ou mais elui como um pico isolado aos 28 minutos. S, Caracterização quimiea da proteína 7-Dessulfato- is-· -hirudina purificada foi earaeteriaada por determinação da sua composição em aminoaeidos, sequência N-terminal e por mapeament© do pqtitfcs.

xJ

Duas a cinco ϊ|§ de proteina foram hidrolisaãas em tubos de vidro a© vapor de HCl 6N a 1102C /~R.L. Henrikson © S.C. Meredith, Anal, Biochem„

KJ 136, 65-74 |19 84|J7« Os aminoâuidos foram secos sob vácuo, deriwatizados com fenilisotiocianato © separados nua» coluna de fase reversa /~B.A, Bidlingneyer, S.A. Cohen © T.L. Taruin, J, Chromactography 336 , 9 3-10 4 (19 84 ) 7 · A composição em aminoácidos foi calculada usando um peso molecular de 6889 D, -4a-

Aproxirnadamente 50 pmoles 62 de / Gin ' _7-dessulfato-hiru&ina foram sujeitos a 5 ciclos de degradação automatizada de Edman, usando um sequen-ciador de fase gasosa Applied Biosystems 4 70A /”M. W, Hun-kapiller e L.E. Hood, Methods in Enzymology, 9JL, 486-494 (1983) 7 para estabelecer a sequência de aminoàcidos N--terminal, 0â aminoàcidos de feniltio-hidantoina resultantes foram separados num sistema de HPLC de fase reversa /~R.M. Herwick, M.®„ Hunkapiller. L.E. Ktocd e W.J. Dreyer, d,

Biol. Chem. 25S, B98-79-Í7 (19 §!)_?, usando um analisador Applied Biosystems típo lli , para se obter um ®mpa de — 1 fí *7 peptideos da /Gin ' ^7-dessulfato-hirudina, 50 yg da proteina foram secos sob vácuo e tratados com ácido perfór-mico durante lha 37°C /"c.H.W. Hirs» "Methods in Enzymology 11, 19 7-199 (19 6 7) 7· Adicionou-se 45 yl de água fria à mistura de reacçSo, congelou-se e secou-se sob vácuo (duas vezesj, O mutante de hirudlna oxidado foi dissolvido em 50 yl de 50 mM NH^HCO^ e digerido com 1 yg de termolisina (Boehringer) durante 4 h a 3 7QC, Antes do fracciona men to o produto da digestão foi seco sob vácuo e dissolvido em 0,1% de ácido trifluoroacético (v/v) em Η^Ο, Os peptideos foram purificados por HPLC de fase reversa* usando uma coluna Vydac Cl8, equilibrada, em 0,1% de ácido trifluoroacético em H20. Os peptideos foram eluidos com um gradiente linear de 0-28% de acetonítrilo durante 90 mxn., a um fluxo de 1 ml/min., A sequência de aminoàcidos do peptideo contendo as mutaç-ies foi sequeneiada como descrito atrás -para confirmar as sutostituiçSes de aminoàcidos Glu §1, Glu 62 -? Gin 61» Gin 62.

EXEMPLO 4 n cj iutação dos resíduos Gin §1*62 de /~Gln ' 7-dessulfato-«hirudina para Leu 61,62

.V 56 58 60 62 64 sequência codificadora da hirudina Phe Glu Glu Ile O u Pa Gin Gin Tyr L< íU Gin 5’TTC GAA GAA ATC GGG CAA CAA tac c: fG CAG 3’ -;í iniciador mutagénico 2 cadeia codificadora mutagenizada 3' CTT CTT TAG GGC GAT GAT ATG GAC GTC 5'TTC SM GAA ATC CCG CTA CTA TAC CTG CAG Phe Glu Glu Ile Pro Leu Leu Tyr Leu Gin 5’ 3' - »·-1ΑS- . ·:' · • ó '

Efectuou-se mutagénese dirigida usando o iniciador mutagénico 2 e M13mpl9/hirudina Eli, 62Q exactamente como descrito no Exemplo 3 (Secções I b II). A proteina atufcanfce foi expressa em E. coli & purificada como descrito no Exemplo 3 (Secção III). A identidade da proteina mutante em que Gin 61,62 foi substituída por leu 61,62 foi confirmada por composição em aminoácidos e análise de sequenciação Mi-terminal (Exemplo 3, Secção E} m determinadas as suas propriadades inibidoras (Exemplo ** * j— Λ 14). 0 mutante foi designado /"Leu6'11"'"/ 7-dessuifãto-feirudi-na* . -44-

EXEMPLO 5

Mutação dos resíduos Glu 61,62 da hirudina para Asn 61,62 56 58 60 62 64 sequência codificadora da hirudina

Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin 5'TTC GAA GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG 3' iniciador mulageníco 3 3' CTT CTT TAG GGC TTA TTA ATG GAC GTC 5' cadeia codificadora mutagenizada 5’TTC GAA GAA ATC CCG AAT AAT TAC CTG CAG 3' Phe Glu Glu Ile Pro Asn Asn Tyr Leu Gin os processos descritos atrás para os Exemplos 3 e 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 3 para se obter e caracterizar a proteína mutante pretendida em que Glu 61,62 foram substitui-dos por Asn 61,62. O mutante foi designado /~Asn ' _7- -dessulfato-hirudina.

CTG CAG Leu Gin 3'

EXEMPLO 6

Mutação doa resíduos Glu 57, 58, SI, 51 da hirudina para Leu 87, 58 * 61, 62 56 58 60 62 64 ^ Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin codif ícador a -**— -—- —— da hirudina 5’GTT GAC ttc GAA GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG 3' iniciador 3'CCA CTG ÂAS GAT GAT TAG ®3C GAT GAT ATG GAC GTC 5' mutagértico 4

cadeia 5'GGT GAC TTC ÇTA ÇTA ATC CCG CTA CTA TAC codifica- dora mutage- ly Gly Phe hm hm He Pro Leu Leu Tyr nizada

Os processos descritos atrás para os Exemplos 3 © 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 4 para se obter e caracterizar a proteína mu-tante pretendida em que Glu 57,< 58, 61, 62 foram substituídos por Leu 57. 58, 61, 62. O mutante foi designado /“Leu57,58'61'62 7-dessulfato-hirudina,

EXEMPLO 7

Mutação dos resíduos Glu 57, 58, 61, 62 da hirudina para Asn 57, 58, 61, 62 54 56 58 60 62 64 sequência codifica-dora da hirudina

Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin 5’GGT GAC TTC GAA GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG 3’ iniciador 3’CCA CTG AAG TTA TTA TAG GGC TTA TTA ATG GAC GTC 5' mutagénico 5 cadeia 5' codificadora mut. agenizada GGT GAC TTC MT MT ATC CCG MT MT TAC Gly Asp Phe Asn Asn Ile Pro Asn Asn Tyr CTG CAG 3' Leu Gin

Os processos descritos atrás para os Exemplos 3 e 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 5 para se obter e caracterizar a proteina mutante pretendida em que Glu 57,58,61,62 foram substituídos — 57 58 por Asn 57, 58, 61,62. O mutante foi designado / Asn ' * 7_<3essuifato-hirudina.

EXEMPLO 8

Mutação do mBÍAm Asp 53 da hirudina para Ala 53 50 52 54 56

Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu cõdifiça dora da hirudina 5'TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA 3’ iniciador 3'AGA GTG TTG CGC CCA CIG AAG CTT 5’ mutagénico 6 cadeia codificadora 5'TCT CAC AAC GÇÇ GGT GAC TTC GAA 3' mutageniza-

Ser His Asn Ala Gly Asp Phe Glu

Os processos descritos atrás para os Exemplos 3 e 4 foram repetidos usando o iniciador mutagénico 6 para se obter e caracterizar a proteína mutan- te pretendida em que Asp 53 foi substituído por Ala 53« 53 O mutante foi designado /~Ala 7-dessulfato-hirudina. -48-

EXEMPLO 9

Mutação do resíduo Tir 13 de dessulfato-hirudina para Asp S3 ou Glu 63 (ver Fig. 1| A mutação do resíduo de ami-noàcidos Tir 63 da dessulfato-hirudina para Asp ou Glu foi conseguida por inserção na sequência codificadora de um oligonucleotideo adaptador que tem o codão TAC para Tir 63 substituído por GAC (codificador de Asp) ou GA A (codificador de Glu), Os polipeptideos resultantes foram referi-dos como /"Asp _7-dessulfato-hirudina e / Glu _7-dessul-fato—hirudina, respectivamente, 0 plasmideo de expressão em levedura pJDB20 7/GAPPL-HIR (ver Fig. 2 ; Pedido de Patente Europeia NS 225633) foi digerido com as endonucleases de restrição Sal I e Eco RI. 0 fragmento Sal I - Eco RI de 478 pb foi separado num gel preparativo de 0,8% de aga-rose em tampão TBE (base Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM 2,5 mM EDTA pH 8,3). O fragmento corado com brometo de eti-dio foi isolado do gel. 0 DNA foi electroeluido em tampão 0,2X TBE durante 45 min a 100 mA e purificado por cromato-grafia de permuta iónica em DÉS2 (Whatman). O DNA foi elui-do da coluna de DE52 com um tampão de concentração salina elevada (1,5 M naCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0 , 1 mM EDTA) precipitado com etanol e redissolvido em f^O numa concentração de 0,1 pmoles/ul. O fragmento de 478 pb SalI-EcoRI contem a sequência SalI-BamHI do pBR322 fundido com o fragmento BglII-EcoRI do promotor GAPFL, 0 plasmideo pJDB207/GAPFL-HIR foi digerido com BamHI e Sal I. O fragmento grande vector m

-49- de 6,7 kb foi isolado gomo descrito atras. O fragmento pequeno SalI-BamHI de 740 pb foi também isolado. Ele contem a sequência do fragmento SalI-EcoRI de 478 pb (ver atrás) além da sequência sinal de PH05 fundida na mesma grelha de leitura com a sequência codificadora de dessulfato--hirudina. O fragmento de 740 pb foi digerido com Asn II. 0 DNA foi extraido com fenol/clorofòrmio, precipitado com etanol e redissolvido em t^O. téticos da fórmula (1) 5'-CGAAGAAATCCCGGAAGAAGACCTGCAGTAG -3' (2) 3'- TTCTTTAGGGCCTTCTTCTGGACGTCATCCTAG -5'

Glu (3) 5'-CGAAGAAATCCCGGAAGAAGAACTGCAGTAG -3' (4) 3'- TTCriIAGGGCCTTCTTCTTGACGTCATCCTAG -5' foram fosforilados individualmente em 40 ul de 60 mM Tris--HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT, $,5mM ATP e 27 V de polinucleotideo-cinase de T4 (Boehringer) durante 45 min a 372C. As misturas de reacção para os oligonucleotideos (1) e (2) foram combinadas assim como as misturas de reac-ção para (3) e (4). Ambas as misturas foram aquecidas durante 10 min a 75QC e deixadas arrefecer até à temperatura ambiente. Os oligonucleotideos adaptadores emparelhados (1 2) e (3 4) foram guardados a -20QC.

-50-

0,85 ug (3,1 pmoles) do DNA digerido com Asn II foram incubados durante 16 h a 15QC com um excesso de 100 vezes do oligonucleotideo adaptador fosforilado e emparelhado relativamente aos extremos de DNA em 150 gl de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM Dtt, 3,5 mM ATP e 1200 0 de DNA-ligase de T4 (Biolabs).

Após inactivaçao da DNA-ligase de T4 durante 10 min a 85SC os adaptadores em excesso forem removidos por precipitação do DNA na presença de 10 mM EDTA, acetato de sódio 300 mM pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. O DNA foi digerido com EcoRi e Bam Hl. Os fragmentos resultantes foram separados num gel preparartivo de 2% de agarose em tampão TBE. 0 fragmento de 262 pb foi recuperado do gel por electroeluição e precipitação com etanol. O DNA foi ressus-penso numa concentração de 0 ,1 pmoles/ul. © fragmento Eco-RI-BamHI contem a sequência codificadora da dessulfato--hirudina com os tripletos GAC ou GAA codificadores de Asp 63 ou Glu 63, respectivamente.

Três fragmentos de DNA, isolados como descrito atras, foram ligados na seguinte reac-piot 0,2 pmoles do fragmento SalI-EcoRI de 478 pb, 0 .2 pmoles do fragmento EcoRI-BamHI de 262 pb (contendo a se-quência GAC ou GAA, respectivamente) e 0,1 pmoles do fragmento vector de 6,7 kb foram ligados em 10 yl de 60 mM Tris-HCl pH 7,5 10 mM MgCl2 , 5 «M DTTf 1 mM ATP e 200 0 de DNA-ligase de T4 durante 6 h a 159C. Uma amostra de um yl de cada uma das misturas de reacção foi adicionada a 100 yl de células E . coll HB101 tratada com cálcio e competentes para a trraasformafl®* 12 colónias transformadas resistentes ã ampicilina foram cultivadas em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. O DNA de plasmídeo foi preparado /"Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (19 81), 19 3 7

e analisado por digestão dupla com Bam Hl e Eco RI. A presença das mutações no DNA foi confirmada por sequenciaçãc de DNA / Sanger ©t ãl, , proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (19 77] 54637. Um clone com o codão GAC no gene estrutural da hi-rudina foi referido como pJDB207 /GAPFL-HIR (Asp 63). Um clone com a sequência codificadora GAA dâ Glu na posição 63 da hirudina foi referido como pJDB20 7/GAPFL-HIR (Glu 63). EXEMPLO 10

Construção de um plasmideo de expressão em levedura codificador de /"pro° 7-dessulfato-hirudina A sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina foi prolongada pelo oligo-nucleotideo CCA, o qual codifica prolina. A nova dessulfa-to-hirudina resultante foi expressa em levedura. Ela possui 66 aminoàcidos com uma prolina no seu extremo C-terminal. Este polipeptideo é referido como /~Pro _7-dessulfato-'-hirudina. O plasmideo pJDB20 7/GAPFL- -HIR (Pro 661 foi construído tal como no Exemplo 9 excepto na utilização dos seguintes oligodesoxinucleotideos

Pr ο (5) 5’-CGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGGAGCCATAG -3* (6) 3'- TTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCGGTATCCTAG -5’

Um clone de DNA com a extensão CCA na sequência codificadora da hirudina foi referido como pJDB20 7/GAPFL-HIR (Pro 66) . EXEMPLO 11

Transformação de Saccharomyces cerevisiae estirpes GRF18 e HTR46

Saccharomyces eerevisiae estirpes GFR18 (DSM 3665j fhig 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) e HT246 (a, leu 2-3 , leu 2-112, prb) (DSM 40 84) foram transformadas com os plasmideos: pJDB207/GAPFL-HIR (Asp 63) pJDB20 7/GÂPFL-H1R (Glu 63) pJDB207/GAPFL-HIR (Pro 66) usando o protocolo de transformação descrito por Hinen et al., /"proc. aatl, Acad. Sei. USA 75 s 19 29 (19 78 )_7. ASi células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio minimo para levedura deficiente em leuci- na. Colónias de leveduras transformadas foram isoladas e ref erid as como:

Saccharoniyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR (Asp 63), SacchaTomvees cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR (Glu 63), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR (Pro 66), Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPFL-HIR (Asp 63), Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPFL—HIR (Glu 63), Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPFL-HIR (Pro 66). EXEMPLO 12

Recuperação de mutantes de dessulfato-hirudina a partir de £>. cerevisiae a) Cultura dos transformantes

Transformantes de células de S. cerevisiae GRF18 e HT246 (Exemplo 11) foram pre--cultivados duas vezes por agitação em 10 ml de meio mini-mo para leveduras (difco Yeast Nitrogen Base sem aminoacidos com a adição de 1% de glucose, 10 mg/ml de L-asperagina e 10 mg/1 ou L-histidina) a 28QC m cultivados até uma den- η y sidade celular de 3x 10 células/ml. Estas células foram então usadas para inoculação de culturas de 50 ml em meio completo. O meio completo foi preparado com a composição: Difco Yeast Extrâct 10 g/1, Bacto-peptone 5,0 g/1, glucose

20 g/1, δ (+) sacarose «0 g/1 (NH4)2S04 3,0 g/l, KH2P04 2,0 g/1, MgS04 0 ,3 g/1, NaCl 0,1 g/1 e ÇaCl2.2H20 0 ,1 g/1. As culturas foram inoculadas em meio completo até uma densidade

6 Q celular de 4 x 10 células/ml e agitadas a 282C durante 48 h a 250 revs/min. b) Isolamento de mutantes de dessulfato-hirudina a partir do meio de cultura

Após a fermentação colheu-se o meio de cultura (1 1) e centrifugou-se (1000 xg, 30 min) para separar as células do sobrenadante. Adicionou-se aceto-nitrilo 5 % (v/v) ao sobrenadante e a solução resultante foi apliaada numa coluna semi-preparativa de RP-HPLC Cl8 a um fluxo de 24 ml/min. A coluna foi lavada com 90¾ de tampão de eluição A/10% de tampão de eluição B durante 10 min e iniciado o gradiente (Condições NS 1).

Colheram-se as fracções entr 5 30 e 65 min do gradiente. A fracçto contendo o mutante da hi-rudina com interesse, conforme identificado por meio do ehsai > de inibição da trombina /“Griessbach, U. et al, Thromb. Res. 24 , 221-224 (19 84)_7, analise por FPLC analítica (condições NQ 2) e analise por HPLC analítica (condições ISIS 3) foi lio-filizada. O sólido resultarte foi dissolvido em H20 e filtrado (0,2 çm) antes da separação por FPLC semi-preparativa num permutador aniónico forte (Mono--Q) eluindo com um gradiente de pH (condições Nô 2). O pico contendo a maioria da proteína foi colhido como uma única fracção e liofilizado duas vezes a partir de H20.

Num passo de pwrificaçle fánal e remoção do sal, o material liofilizado foi solubi-lizado em água, injectado numa coluna semi-preparativa de RP-HPLC C18 e eluido (condições N3 1). 0 mutante da dessul, fato-hirudina puro foi colhido manualmente como um hnico pico e liofilizado dando um sólido branco.

Método: Cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa (RP--HPLC) de fase reversa e eluição com gradiente.

Tipo de cultura: LiChrosorb RP-16 (E. MERK,

Darmstadt, FRG)

Tamanho das particulas: 10 pn

Dimensões: 16 x 250 mm

Volume dê amostra: 1000 ml

Quantidade de protaisa/ injecção: Fluxo: Pressão: Detecção: Eluente A: Eiueote B: 5-50 mg 24 ml/min 100-120 bar a 215 mm agua (Analyzed HPLC leagettt, BAKER Chemicals, Deventer, lollandl com 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacé-tico (TFA)

acetonitrilo (para HPLC, Fluka Chemie AG, Buchs , Switzerland) com 0 ,0 1% (v/v) TFA

-5 Ι tempo(min) Ο 10 m 30 45 65

#S 70 75 % B (v/v) 10 10

If 18 35 35 100 100 10

Condições experimentais NS 2\ Método: cromatografia liquida rápida de proteínas (FPLC) utilizando croma-tografia de permuta iónica numa fase estacionária de permutador aniónico forte e eluição com gradiente de

Tipo de cultura: Mono-Q iM^macia, Uppsala, Suécia)

Dimensões; 5 x 10 mm

Volume de amostra: 4 ml iseai-preparatlva) 200 pl (analítica)

Quantidade de proteína/ injecção: 2-3 mg (semi-preparativa ) 500-600 pg/ml 25-200 pg (analítica)125-1000 pg/ml

Fluxo: Pressão: detecção: Eluente A; Eluente Bí 2,0 ml/min 30-35 bar a 2 80 mm 50 mM HC00NH4 pH « 4,5 50 mM HCOONH4 pH = 3,5

Condições de eluição: Tempo (mm) _% B (v/v) 0 0 5,0 0 19 ,5 100 22 ,0 100 22,1 0 25,0 0

Condições Experimentais NQ 3 Método: cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC) analítica com eluição de gradiente

Tipo de coluna: Nucleosil 100-5 C-^g (Macherey-Nagel, Diren, FRG)

Tamanho das partículas: 5 ym -59-

Dimensões: 4 x 120 mm

Volume de amostra: Quantidade de proteína/ injecção: Fluxo: Pressão: detecção í 50 yl 2,5-10 yg (50-200 yg/ml) 1,5 ml/mia 120-150 toar a 215 nm

Eluente A: agua (Analyzed HPLC Reagent, BAKER

Chemicals, Deventer, Ho11and) com 0 ,1% (v/v) de ácido trifluoroacé-tico (TFA)

Eluente B: acetonitrilo (para HPLC, Fluka

Chemie AG, Buchs, Switzerland) com 0 ,0 7% (v/v) de TFA % B (v/v) 10 20 20 31 95 100 10 tempo (min) 0 1 8 18 20 21,5 23

MglgLO 13

Caracterização de / Pr©' _7^dessulfato-hirudina e /“Glu ^ 7 dessulfato-hirudina

Amostras de dessulfato-hí- — 6 6 rudina recombinante (cpd.l) / Pro _7-dessulfato-hirudina „ g 3 (cpd.2) e / Glu 7-dessulfato-hirudina (cpd.3) foram sujeitos ao ensaio de inibição da trombina (Chromozyme-TH como substracto cromogénio’ Griessbach, U. et al., Thromb. Res. 2j4, 221-224 (19 84)) e a um ou mais métodos analiticos (ver condições experimentais, exemplo 12), Os resultados estão compilados na tabela que se segue para comparação.

Tempo de retenção (min)

Condição —-———-—-—-—

Experimentai N2 cpd. 1 cpd .2 cpd.3 2. FPLC 16.0 14.7 17.5 3. RP-HPLC 15.6 16.4 10.7 inibição da trombina (%) ~ 100 ~60 ~ 35 a) Determinação da composição em aminoácidos 2 ,5 yg 40 QC com Knecht e

Aproximadamente da dessulfato-hirudina pura foram hidrõlisadas a o vapor de 6N HC1 e analisados como descrito por Chang /""Anal. Chem. 58. 23 75 (19 86) 7.

Os foidrolisados têm a seguinte composição /'Pro 6 6 7-dessulfato-hirudina ASX Glx 8 ,9 5 12,77 (9 ) (13) Ile Leu 2,1 4,49 (2) (4) Ser 4,14 (4) Fen 1,23 (1) Tre 4 20 (4) Lis 3,31 (3) Gli 9 ,11 (9 ) His 1,09 (1) Pro 4,46 (4) Tir 2,29 (2) Vai 2,44 (4) Cis 4,7 (6) Total (66) -62-

A analise e idêntica com dessulf ato-hirudina recombinante /“Grossenbacher , H» et ãl * |; Thromb. Res. Suppl. 1_, 33 (19 87) 7 excepto no que respeita 1 adição de um residuo prolina. ^ 63 /”Glu _7-dessulfato-hirudina

Asx Glx Ser Tre Gli Pr® Vai 8,79 13,31 3,86 4 ,19 8,42 3,11 2,73 (9 ) (14 (4) (4) (9 ) (3)

Ile Leu Fen Lis His Tir Cis Total 1,9 5 4,26 1,17 3,36 1,32 1,29 5,82 (65) (2) (4) (D (3) (1)li) A análise e idêntica com dessulfato-hirudina recombinante excepto no que respeita a adição de um residuo alutamato e a ausência de um residuo tirosina. 63-

b) Análise parcial da sequência

Para estabelecer a sequência de aminoácidos N-terminal os mutantes de desulfato--hirudina puros foram sujeitos a degradação de Edman convencional usando um sistema automatizado e os aminoácidos de feniltio-hidantoina N-terminais foram separados por meio de HPLC em fase reversa,

Resultados — gg /"pro 7-dessulfato-hirudina 1 5 10

Amino acido

Aminoácidó

Vai-Val~ftr-Tre-âsp-n.d«-Tre-Glu-Ser-Gli 11 15

Gln-Asn-Leu-n,d,-Leu-n,d* 10 _ £ > / Glu 7-dessnlfaie-Mrudina I 5

Aminoácido fal-?ãl~Tir-Tre-Asp~s„d . -Tre-Glu-Ser-Gli II 15

Aminoácido Gln-Isn-teta-n .d, -Leu-n ,d * n .d. = não determinado

As Sequências de aminoácidos N-terminais dos mutantes de deseulfato-hirudina conforme apresentadas são idênticas à da dessulfato-hirudina autêntica . c) Análise C-terminal

Os mutantes da dessulfato- -hirudina puros foram diferidos com carboxipeptidase à temperatura ambiente, os aminoácidos libertados foram deri-vatizados com DABS-Cl e determinados num analisador de aminoácidos /~Chang, Y. J. et ai., Biocheai* J. 20 3, 803--80 6 (19 82 ) _7 ·

Resultadas* /”Pro66_7-dessulfato-hirudina

Aminoácidos C-terminais; «-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Z^Tir -lmu~Gltt-Pr© 7 — Q3 /~Glu 7-dessulfato-hi rudina

Aminoácidos C-termiaaisi «-G1u-Glu-/ Ile-Pro7-Glu-Glu-G1u-/~Leu- -Gin 7 A ordem exacta da sequência de rtndácidos entre parêntesis aio pode ser determinada. i.;

d) Determinação do peso molecular

Determinação por espectro- metria de massa coe bombardeamento de átomos rápidos para iões positivos (FAB-MS).

Instrumento: Espectrometro de massa 2AB-HF (V G- An a 1/y t ica 1 Ltd . , Manchester); matrix: tiogliçerol; bombardearoen t.o com Xenon; energia dos iões 10 Kev.

Resultados ^*proW.7-a«wulf«te-hirudiia Fórmula empirica G29 2H44 7N80°111S6 peso molecular (calc. ): 70 60 ,64 piiSQ molecular (encontrado ) 70 64,2

Determinação por tempo de 252 desaboorção de Cf plasma de espectrometria de vôo 252 ("flight" ) Cf PD TOF-MS) (Sunquist, B. e Macfarlane, R.D* (19 85) Mass Spectrom. Rev. 4, 421). Instrumento: Bio--Ion (Nordic AG. Uppsala. Sweden)· matrix: água, potencial de aceleração 10 KeV. -6 7-

Resultados — 6 6 /~Pro 7-dessulfato-hirudina Fórmula empírica C2g 2H44 7Ngo0111S6 peso molecular (calc . ) : 70 60,64 peso molecular (encontrado) 70 60 ,7 — 63 /~Glu 7-dessulf ato-hirudina Fórmula empírica C283H438N80°111S6 peso molecular (calc.): 69 29,4 6 peso molecular (encontrado) 69 29,8

Os mutantes de dessulfato- -hirudina descritos nos exemplos 3-9 foram caracterizados de modo analogo.

EXEMPLO 14

Caracterização cinética A. Preparação e caracterização da trombina A trombina foi purificada e caracterizada como descrito por S.R. Stone e J. Hofsteenge /‘"Biocteaistry 25, 4622-4628 (19 86) 7 * A concentração de trombina activa foi determinada por titulação de sitios activos com 4-metil-umbeliferil-p-guanidinobenzoato /~Ja-meson, G.W. Robertst D. V. , Adams, R.WL Kyle, W.S.A., e EImore, D.T., Biocbemistry J* 131, 101-117 (19 73 )_7- B. Ensaios_enziffisticos A libertação de p-nitroanilL na que resulta da hidrólise dos subetractos peptidil-p--nitroanilina pela trombina è seguida de medição do aumento de absorvância a 40 5 mm com um espectrofotòmetro Shimadzu UV 240 . os ensaios são efectuados em cuvetes de polistireno a 3 7SC em tampão 0 ,0 5 M Tris-HGl, pH 7,8, o qual contem 0,1% de polietilenoglicol 6000 , 0 ,1M NaCl e substracto p-nitroanilida. O substracto D-¥al-Leu-Arg-p-nitroanilida {S-2266; Kabi-Vitir»m) foi usado numa concentração de 300 çM em experiências de titulação de ligação forte, as quais são usadas para determinar a concentração de hirudina mu-tantes. para tais ensaios é usada uma concentração de trombina de 1,0 nM. 0 substracto B-Pen-pipecolil-Arg-p-nitro* anilida (S-2238; Kabi Vitrum) numa concentração de 100 çM e uma concentração de trombina de 20 a 50 pM foram usados em experiências de inibição lenta da ligação para determinar IS-

as caracteristicas cinéticas das hirudinas mutantes (ver abaixo). Os ensaios são iniciados pela adição de trombina^ & quantidade de produto formado foi calculada usando um coeficiente de absorção de 9 ,9 20 M ^ cm ^ para p-nitroani-lina a 405 nm e a concentração do substracto foi determinada por espectrofotometria a 342 nm usando um coeficiente de absorção de 8270 M ^ cm-^ /~Lottenberg, R. & Jackson C,M. Biochim. Biophys. Acta 742, 558-564 (19 83)_7. C. Teoria cinética e análise de dados Titulação de ligação forte: A inibição de uma enzima na presença, de um substracto pode ser representada pelo seguinte mecanismo (Esquema 1):- k

£ + S + I fy k2 EI

ES

-7 E + P (KT) éigual a K„/K, 1 £. 1 A dissociação do inibidor Se a ligação do inibidor à enzima provocar um abaixamento significativo na concentração do inibidor livre, a variação da velocidade do estado estacionário (V ) com a concentração total de inibidor (I.) S· t será descrita pela equação (1) /~Mor.rison , J. F * , Biochim . Biophys . Acta 185 , 269 -286 (19 69 ); Henderson, P. J.F. , 70

aiochem, J. 127, 321-333 (l§?21_Js v vs = --- ísqr S 2E t

!' * ** " V* * «rV - (*r * It - B )J onde V é a velocidade observada na ausência do inibidor o

Efc é a concentração total de enzima e é a constante rente de inibição , Se o inibidor e o substracto competirem para e sitio activo, está relacionado com a constante de dissociação do inibidor (R-j.) pela equação (2): KIt * πχ d - s/Km) (2) onde S é a concentração de substracto e km á a sua constante de Michaelis. Bê a concentração da ensina ou inibidor não for conhecida com precisão* um factor adicional pode ser incorporado na equação (1) para ter em conta este facto / Williams, J.W. , e Morrison, J,!8* , Methods Enzymol. 63 43 7-46 7 (19 79 )_7. Para a inifeiçfto da trombifta pela hirudina a concentração de trombina e conhecida a partir da titulação do sitio activo mas a concentração de hirudina e conhecida apenas pelo peso e os resultados podem ser analisados de acordo com a equação (3): -11-

= --- [sqr((Κ^, + *Ιχ

+ 4KrEt) -

X + xl

onde l fe a concentração do inibidor em termos de peso por volume e x é um factor que, quando multiplicado juntamente com i, dará a concentração molar do inibidor.

Nas experiências de titula- ção de ligação forte, a constante de dissociação para a hirudina e a sua concentração é determinada mantendo a concentração de trombina constante e variando as concentrações de hirudina numa gama que inclui várias concentrações que são inferiores à concentração de trombina e varias concentrações que são inferiores a concentração de trombina e várias concentrações que são superiores» 0 numero total de pontos de resultados è geralmente entre 7 e 10 * As velocidades de faee estacionária obtidas para cada concentração de hirudina è então adaptado à equação (3) por regrei; são não linear pesada. Para a regressão, os valores observados para a velocidade do estado estacionário são pesados de acordo com o inverso do seu valor. Este tipo de pesagem verificou-se empiricamente dar os melhores resultados /~Stone, S.R., e Hofsteenge, J. Biochemistry 25, 4622-£·* "·" ! 1 -4628 (19 86) 7- -72-

fníbição lenta da ligação fortei ie a velocidade da inter- acção do inifeidor com a enzima for lenta de modo que a velocidade do estado estacionário inibida è apenas lentamente conseguida, a curva do progresso da formação do produt<}> para o mecanismo do gsquema 1 será descrita pela equação (4) '/"cha, S. , Biochem. Pharraaeol, |5, 2« 3-2 70 2 (19 76); Williams, J.W, Morrinson, J.F., e Duggleby, R♦G* Bioche-mistry 18, 2567-2573 (19 79 ) 7í

d.exPC-k*.t) 1 - d -) onde P é a quantidade de produto formada no tempo t, de uma função de , 1^ e k^, e k‘ são uma função destes parâmetros e a. constante de velocidade de associação de segunda ordem ÍX^ } para a interacção entre o inibidor e a enzima (Cha et al. supra 1 para determinar os parâmetros cinéticos dos mutantes de hirudina, os dados de curva-progresso obtidos com pelo menos seis eoneentraçSes diferentes de hirudina foram adaptados à equação (4) por regressão não linear, leia análise dá estimativas para 'Vj e a constante de velocidade de dissociação obser vada (K2,). Foi prfeviamente demonstrado que o valor de ' è independente da ligação do substracto, no sitio activo mas que os valores observados de K21 e 1 deverão ser divididos por (1 /~S 7/ Km) de modo a obter-se os verdadeiros valores (K2 e S.R. Stone e J. Hopsteenge,

Biochemistry 254622-4628 (19 86); Stone* S.R. , Braun, P. J. e Hopsteenge, J. Biochemistry 26, 4617-4624 13587) 7« -73-

Para ©ates cálculos foi usado o valor prèviaffieriie determinado de 3.6 uM para o de D-Fen-pipecolil-ârf«p-nitroanilida /“Hofsteenge. J. Taguchl, 8. e Stone, 1,1. , Biochea. J. 23 7, 243-251 (19 86 ) 7*

Usando estes métodos cinéticos obtiveram-se os seguintes valores para k^ e K^: forma de dessulfato- 10 ~8, kj KI -hirudina (=H) M .s X Cpi! dessulfato-hirudina recombinante 1.37 - 0 ,0 3 0 ,231 t 0 ,006 /"Gin61,62 7-H ($— — ·—» —·» —“ —) ·— —i * — 1—· < — :·*—>*· 0 ,45 í 0 ,01 0 ,90 7 ± 0 ,042 /"Ala5^7-H n.d. 0 ,810 - 0 ,160 /"Pro56 7-H 1.09 í 0 ,13 0 ,252 í 0 ,013 n.d. = não determinado

EXEMPLO 15

Composição farmacêutica contendo um mutant© de dessslfato· -hirudina para administração parentérica

Uma solução contendo um mutante de dessulfato-hirudina de acorda com qualquer um dos Exemplos precedentes foi dialisada contra uma solução de 0 ,9% de NaClA concentração da solução f oi então ajustada por diluição com a mesma solução de NaCl para Q,2 mg/ /ml ou 2 mg/ml. Estas soluções foram esterilizadas por ultrafiltração (membranas com poros 0,22 çm).

As soluções esterilizadas podem ser usadas directamente, por exemplo para administra*-* ção intravenosa.

Depósito de microorganismos

Os microorganismos que se seguem forara depositados na Deutsche Sammlanf von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb. D-3300 Sraussehmeif (ERG).

Microorganismo data de depósito No-de acesso

Saccharomyces cerevisiae GRF18 i âe Março, 3SÍS D SM 3665

Saccharomyces cerevisiae HT246 15 de Abril f 19 8 7 D SM 40 84

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES: 1-* - Processo para a produção de mutantes de dessulfato-hirudina tendo a sequência de amino-àcidos - ...................... 10 H-Val-Val-Tir-Tre-Asp-Cis-Tre-Glu-Ser-Gli- 20 -Gln-Asn-Leu-Cis-Leu-Çis-Glu-Gli-Ser-Asn- 30 -Val-Cis-Gli-Gln-Gli-Asn-Lis-Cis-Ile-Leu- 40 -G1i-Ser-Asp-Gli-Glu-Lis-Asn-Gln-Cis-Val- 50 -Tre-Gli-Glu-Gli-Tre-Pro-Lis-Pro-Gln-Ser- 60 -His-Asn-Y^-Gli-Asp-Fen-Yg-Yg-Ile-Pro- onde Y representa Asp ou o radical de um aminoácido neutro genáticamente codificado, Yg e independentemente um do outro representam Glu, Asn ou o radical de um aminoácido lipo-filico geneticamente codificado, Y^ e Y^ independentemente um do outro representam Glu ou o radical de um aminoácido neutro geneticamente codificado. Yg representa Tir ou o radical de um aminoácido geneticamente codifiçado e Y^ representa Gin ou o radical dipeptidilo GlnPro, com execpçao dos compostos da fórmula I em que Y^ é Asp, Yg é Tir, Y^ é Gin, ^2 e Y3 são Glu e um dos radicais Y^ e Yg é Gin e o outro

   é Glu e seus sais, caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada com UiíJ vector hibrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num, promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição e isolamento do mutante da dessulfato-hirudina e'| caso se pretenda, conversão de um polipeptideo obtido tendo grupos carboxilo e/ou amino livres num sal ou conversão de um sal obtido no composto livre. la, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzirem mutantes da dessulfato-hirudina da fórmula I, em que , e Asp, Ala, Leu ou Asn, e Y^ independentemente um do outro representam Glu, Leu ou Asn, Y4 e Y^ independentemente um do outro representam Glu, Gin, Asn ou Leu, Yg e Tir, Asp ou Glu e Y| é Gin ou o radical dipeptidilo GlnPro, com excep- ção dos compostos da fórmula I, em que Y^ é Asp, Ygé Tir, Y^ è Gin, Y^ e Y^ são cada um Glu e um dos radicais Y^e Yg e Gin e 0 outro e Glu e seus sais. 3ã. - Processo de acordo com a — 61 62 reivindicação 1, caracterizado por se produzir /_Gln ' J--dessulfato-hirudina. 4§. - Processo de acordo com a r* 61 62 reivindicação 1, caracterizado por se produzir /**Asn ' _7--dessulf ato-hirud ina» 5ã. - Processo dg acordo com a — 6 7 5 8 reivindicação 1, caracterizado por se produzir ΓLeu° ' 7„dessulfato-hirudina. Processo de acordo com a reivindicação 1, Garacterizado por se produzir / Leu~* ^,58,61,62 y_desgu^f&te~fo&xwâina» 71* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir /“Asn57,58’61’62_7-dessulfato-hirudina. 81. * Processo de acordo com a -53 reivindicação 1, caracterizado por se produzir / Ala 7--dessulfato-hirudina.
2. 91. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir / Asp 7--dessulfato-hirudina. 10 ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir /~Glu8^7--dessulfato-hirudina» llâ» - Processo de acordocom a reivindicação 1, caracterizado por se produzir / Pro 7--dessulf ato-hirudina *
3. 121. - Processopara a produção de uma composição farmacêutica que se caracteriza por se misturar um mutante da dessulfato-hirudina da fórmula I, que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal farmacêuticamente aceitfcvel, com um veiculo e/ou aditivo farmacêuticamenteaceitãvel, de modo a obter-se uma concentração final de 0,001-75^.
4. 131. - Método para a utilização de um mutante da dessulf ato-hirud ina da fórmula I, que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1, para o tratamento profilático ou terapêutico do corpo humano ou -78-

   ή. de animal caracterizado por se administrar 0,001 a 20 mg do referido composto por kgdo peso do corpo por dia.
5. 145. - Método para a utilização de um mutante da dessulfato-hirudina da fórmula I, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido mutante ser usado no tratamento de tromboses, tromboembolismos, coagulopatias e choque agudo. 155. - frocesso para a produção de um vector hibrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um polipeptideo sinal ligado na grelha de leitura corfecta a uma segunda sequência de DNA codificadora de ura mutante da dessulfato--hirudina que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1 e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição, caracterizado por se compreender a ligação da cassete de expressão consistindo num promotor operacional-mente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição, ou os constituintes da cassete de expressão a fragmentos de DNA contendo marcas genéticas selectivas e origens de replicaçlo para o hospedeiro microbianoseleccionado na ordem predeterminada. 165. - processo para a produção de uma estirpe hospedeira microbiana que foi transformada com um vector hibrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num promotor de elevedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNAcodificandoum peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora do mutante da dessulfato--hirudina, que pode ser produzido de aGofdo com a reivindi- -79- cação 1, e uma sequência de DNA contendo sinais de termina ção da transcrição, cãracterizado por compreender a transformação de uma estirpe hospedeira microbiana com o referido vector híbrido. Lisboa, 17 de Julho de 19 89

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